KR102275313B1 - Dec1의 발현 및 활성 조절 물질을 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 골관절염 예방 또는 치료용 조성물, 진단용 조성물, 진단을 위한 정보제공방법 및 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명으로 골관절염의 진단이 가능할 것으로 기대되며, 본 발명의 마커인 DEC1의 발현 및 활성을 조절하여 골관절염 치료제 개발에 유용하게 사용할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

DEC1의 발현 및 활성 조절 물질을 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing and treating arthritis comprising a DEC1 expression and activity modulator}
본 발명은 골관절염 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
골관절염(osteoarthritis, OA)이란 퇴행성 관절염이라고도 불리며, 관절을 보호하고 있는 연골의 점진적인 손상이나 퇴행성 변화로 인해 관절을 이루는 뼈와 인대 등에 손상이 일어나서 염증과 통증이 생기는 질환이다.
연골 조직은 연골 세포만으로 이루어진 조직으로서, 관절 내 정상적 연골세포는 대사적 활성이 있고 증식 및 연골기질분자의 합성이나 분해 등이 매우 느리게 일어나는 특징을 가진다. 또한, 연골 조직은 혈관과 신경 조직이 없어 영양과 산소 공급이 원활하지 않기 때문에 손상 부위의 재생이 느리다. 따라서, 현재까지 골관절염은 인공관절 치환법 외에 근본적인 치료법이 확립되지 않은 질병이다.
한편, 생체주기 조절인자 발현의 증감은 노화에 따라 그 폭이 감소하여 대사과정의 변화를 야기하고, 조직의 성장과 복구가 감소하여 노화에 따를 퇴행성 질환을 야기하는 것으로 여겨진다. 연골 조직에서 발현하는 유전자 중 약 3.9%에 달하는 유전자의 발현이 생체주기에 따라 조절되는 것으로 알려져 있으며, 이는 연골기질 분해 및 연골 퇴행이 생체주기에 따라 조절될 수 있음을 암시한다.
다만, 아직까지 골관절염에 대해 생체리듬 조절인자의 기능과 역할을 규명한 연구는 없는 실정이다.
국내공개특허 제10-2014-0118457호
본 발명자들은 골관절염 예방 또는 치료 효과를 나타내는 생물-화학적인 물질을 찾고자 노력하였다. 그 결과, DEC1의 발현 억제 시 연골기질 분해효소 및 연골퇴행 유도 인자들의 발현이 감소함을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 DEC1(Differentiated embryo chondrocyte expressed gene 1)의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 골관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 DEC1(Differentiated embryo chondrocyte expressed gene 1)의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 제제를 포함하는 골관절염 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 골관절염 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 골관절염 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 골관절염 예방 또는 치료 효과를 나타내는 생물-화학적인 물질을 찾고자 노력하였다. 그 결과, DEC1의 발현 억제 시 연골기질 분해효소 및 연골퇴행 유도 인자들의 발현이 감소함을 규명하였다.
본 발명은 DEC1의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 골관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 DEC1의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 제제를 포함하는 골관절염 진단용 조성물에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 양태는 DEC1(Differentiated embryo chondrocyte expressed gene 1)의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 골관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 사용되는 용어, "예방"이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 골관절염을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 골관절염에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 조성물에 의한 예방, 치료 대상 질병인 골관절염은 퇴행성 관절염이라고도 불리며, 관절을 보호하고 있는 연골의 점진적인 손상이나 퇴행성 변화로 인해 관절을 이루는 뼈와 인대 등에 손상이 일어나서 염증과 통증이 생기는 질환을 의미한다. 본 발명의 조성물은 유전자 표적 치료의 일환으로서, DEC1을 표적으로 하는 골관절염 치료제를 제공한다.
상기 DEC1(Differentiated embryo chondrocyte expressed gene 1) 유전자는 생체리듬의 핵심 조절인자인 조절인자인 BMAL1(Arntl aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator-like) 및 CLOCK(Circadian locomotor output cycles kaput) 이형이량체의 활성을 조절하여 생체리듬을 조절하는 전사체로 알려져 있으나, DEC1의 발현 또는 활성 억제를 통한 골관절염 치료에 대해서는 아직 보고된 바가 없다.
상기 유전자의 뉴클레오티드 서열을 서열번호 1에 나타내었다. 또한, 상기 유전자는 뉴클레오티드 서열이 유전자 은행에 등록되어 있으므로 당업자라면 쉽게 입수가 가능할 것이다.
상기 DEC1의 발현 억제제는 DEC1에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA, microRNA 및 리보자임으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있으나, 유전자의 발현을 억제시킬 수 있는 제제라면 제한 없이 포함될 수 있다.
또한, 상기 DEC1 활성 억제제는 DEC1에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 단백질, 앱타머 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있으나, 유전자의 활성을 억제시킬 수 있는 제제라면 제한 없이 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 이때, 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세 결정성셀룰로스, 폴리비닐피로리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효량은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로 본 발명의 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1kg 당 0.001 내지 150mg, 바람직하게는 0.01 내지 100mg을 매일 또는 격일 투여하거나, 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감 될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양태는 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 골관절염 치료방법에 관한 것이다.
상기 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는, 인간 또는 비-인간인 영장류, 마우스(mouse), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.
본 발명의 또 다른 양태는 DEC1(Differentiated embryo chondrocyte expressed gene 1)의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 제제를 포함하는 골관절염 진단용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 사용되는 용어, "진단"이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 병리 상태, 즉 골관절염의 존재 또는 특징을 확인하는 행위를 의미한다.
본 발명에서, DEC1의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 제제는 DEC1에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브, 단백질 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있으나, 유전자의 발현 또는 활성 수준을 측정할 수 있는 제제라면 제한 없이 포함될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 하기 단계를 포함하는 골관절염 진단을 위한 정보제공방법에 관한 것이다.
생물학적 시료에 존재하는 DEC1(Differentiated embryo chondrocyte expressed gene 1)의 발현 또는 활성 정도를 측정하는 단계; 및
DEC1의 발현 또는 활성 정도를 정상 대조군의 발현 또는 활성 정도와 비교하는 단계.
상기 DEC1의 발현 또는 활성 정도가 정상 대조군의 발현 또는 활성 정도와 비교하여 증가하는 경우 이를 골관절염으로 판정할 수 있다.
상기 방법은 포유류, 특히 인간을 대상으로 포함한다.
구체적으로는, 상기 인간은 골관절염이 발병했을 것으로 의심되는 사람 또는 의심되지 않는 사람으로 골관절염 진단여부가 필요한 사람을 포함한다.
상기 "생물학적 시료"는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 시료는 검출에 사용하기 전에 전처리할 수 있으며, 예를 들어, 여과, 증류, 추출, 농축, 방해 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등을 포함할 수 있다. 또한, 상기 시료로부터 핵산 및 단백질을 분리하여 검출에 사용할 수 있다.
상기 DEC1의 발현 또는 활성 정도를 측정하는 단계는 중합효소반응(PCR), 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블롯팅(Northern blotting), DNA 칩, 웨스턴 블롯팅(Western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선 면역 분석(Radioimmunoassay, RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 단백질 칩, 및 In vitro kinase assay(IKKB)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 방법으로 측정할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 양태는 개체 내 DEC1(Differentiated embryo chondrocyte expressed gene 1)의 발현 또는 활성 정도를 감소시키는 물질을 선별하는 단계를 포함하는 골관절염 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
상기 방법에서 개체 내 DEC1의 발현 또는 활성 정도를 측정하고 골관절염 치료용 후보물질 투여 시, 상기 DEC1의 발현 또는 활성 정도가 기존 대비 감소되는 경우 상기 후보물질은 골관절염 치료제로 이용될 수 있다.
상기 방법은 개체에 대상 물질 처리 전에 개체 내 DEC1의 발현 또는 활성 정도를 측정하고 처리 후에 이를 측정하여 비교할 수도 있고, 여러 개체 중 일부 개체에 대상 물질을 처리하여 비교군과 상기 발현 또는 활성 정도를 비교할 수도 있다.
상기 DEC1의 발현 또는 활성 정도를 측정하는 단계는 중합효소반응(PCR), 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블롯팅(Northern blotting), DNA 칩, 웨스턴 블롯팅(Western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선 면역 분석(Radioimmunoassay, RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 단백질 칩, 및 In vitro kinase assay(IKKB)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 방법으로 측정할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 방법에서 개체에 대상 물질을 처리하는 방법은 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 개체로부터 얻어진 생물학적 시료에 처리할 수 있다. 생물학적 시료는 전술한 바의 시료일 수 있다.
상기 방법에서 "대상 물질"은 본 발명의 DEC1의 발현 또는 활성 정도에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 대상 물질은 화학물질, 뉴클레오타이드, 안티센스-RNA, siRNA(small interference RNA) 및 천연물 추출물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 골관절염 예방 또는 치료용 조성물, 진단용 조성물, 진단을 위한 정보제공방법 및 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명으로 골관절염의 진단이 가능할 것으로 기대되며, 본 발명의 마커인 DEC1의 발현 및 활성을 조절하여 골관절염 치료제 개발에 유용하게 사용할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1a 및 1b는 본 발명의 일 실시예에 따라 DEC1 녹아웃(knockout) 마우스의 연골조직에서의 연골손상 정도 및 DEC1 발현을 확인한 도이다.
도 2a 및 2b는 본 발명의 일 실시예에 따라 IL-1b에 의한 염증 유도에 따른 연골세포에서의 DEC1 발현을 확인한 도이다.
도 2c 및 2d는 본 발명의 일 실시예에 따라 TNF-α에 의한 염증 유도에 따른 연골세포에서의 DEC1 발현을 확인한 도이다.
도 3a 및 3b는 본 발명의 일 실시예에 따라 연골조직 및 연골세포에서 DEC1 과발현에 따른 효과를 확인한 도이다.
도 3c 및 3d는 본 발명의 일 실시예에 따라 연골조직 및 연골세포에서 DEC1 발현 억제에 따른 효과를 확인한 도이다.
도 4a 및 4b는 본 발명의 일 실시예에 따라 DEC1 과발현에 따른 연골조직에서의 연골손상 정도를 확인한 도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
준비예. 샘플 준비
DEC1 녹아웃(knockout) 마우스 및 야생형 마우스는 JACKSON LAB(미국)에서 구입하였다.
실험예 1. DEC1 녹아웃(knockout) 마우스의 연골조직에서의 DEC1 발현 확인
9주령 마우스(DEC1 녹아웃 마우스 및 야생형 마우스)의 무릎 관절의 아래 쪽 연골인 반월판 파괴를 유도시켜(destabilization of medial meniscus; DMM) 관절염(연골 손상)을 유도하였다. 8주 경과 후, 관절조직을 채취하여 하기와 같이 실험하였다. 이때, 각 DEC1 녹아웃 마우스 및 야생형 마우스 그룹에서 DMM을 수행하지 않은 마우스를 대조군(Sham 마우스)으로 사용하였다.
먼저, 관절조직을 4% 파라포름알데하이드로 고정시킨 후, 0.5 M EDTA 용액으로 3일 간 탈회(decalcification) 과정을 진행하였다. 그 다음, 조직을 30%, 50%, 70%, 90%, 95% 및 100% 에탄올에 담가 탈수 과정을 진행한 후, 자일렌 및 파라핀을 침투시켰다. 조직을 5 um 두께로 잘라 슬라이드 위에 올려 보관하였다.
자일렌, 각 100%, 95%, 90%, 70%, 50% 및 30% 에탄올, 및 물의 순서로 재수화(rehydration) 과정을 거친 조직 절편을 페마톡실린(hematoxylin), 0.1% 패스트그린(fast green) 및 0.1% 사프라닌 O(safranin O) 용액으로 염색하고 70%, 90%, 95% 및 100% 에탄올, 및 자일렌에 담근 후, 고정액을 뿌려 고정하였다. 현미경으로 염색된 정도를 확인하여 연골조직의 손상 정도를 OARSI(Osteoarthritis Research Society International grade) 가이드라인에 따라 점수화하였다.
다음으로, 상기 재수화 과정을 거친 조직 절편을 3% H2O2 용액에 5분 간 담가 조직 내 퍼옥시다아제(peroxidase) 활성을 억제하고, 0.1 % 트립신 및 0.1% 트리톤 X-100 용액에 각각 5분 간 담가 조직 내 항원을 노출시켰다. 이후 1% 소 혈청 알부민(bovine serum albumin; BSA) 용액에 1시간 동안 담가 블로킹 시키고, DEC1 일차 항체(Sigma aldrich)에 2시간 동안 반응시켰다. 세척 후, 이차 항체-스트렙트아비딘-HRP 용액(Dako EnVision HRP)에 30분 간 반응시키고, AEC substrate chromogen 용액(DAKO)에 10분간 반응시켜 발색을 진행하였다. 세척 후 고정하여 현미경으로 DEC1의 발현을 확인하였다.
도 1a 및 1b에서 확인할 수 있듯이, 야생형(Wild Type) Sham 마우스와 DMM을 수행한 마우스의 연골 손상 정도 차이에 비하여, DEC1 녹아웃(DEC1 KO) Sham 마우스와 DMM을 수행한 마우스의 연골 손상 정도 차이가 보다 감소함을 알 수 있었다. 또한, DEC1 녹아웃 마우스에 비하여, 야생형 마우스의 연골 손상을 유도한 연골조직에서 DEC1 단백질의 발현이 증가함을 알 수 있었다.
실험예 2. 염증 유도에 따른 연골세포에서의 DEC1 발현 확인
5일령 마우스의 무릎 조직을 채취하고, 0.2% 제2형 콜라게나아제(type II collagenase)(Sigma Aldrich) 및 0.02% 트립신을 3시간 동안 처리하여 무릎 조직의 피부 및 근육을 제거하였다. 그 다음, 연골조직만을 분리하여 0.2% 제2형 콜라게나아제로 조직을 녹여 연골세포를 확보한 후, DMEM 배양액을 사용하여 3x105 개/1 dish의 농도로 연골세포를 배양하였다. 배양 이틀째에 DMEM 배양액을 교체하고, 각 IL-1b 또는 TNF-α를 24시간 처리 후 세포를 수거하였다.
상기 연골세포에 트리졸 용액을 첨가하고 클로로포름 용액을 첨가 후 원심분리(13,000rpm, 15분)하여 조직 내 단백질을 분리하였다. mRNA가 녹아 있는 수용액에 아이소프로판올을 첨가 후 원심분리(13,000rpm, 15분)하여 수분을 제거하였다. 수분이 제거된 침전물에 75% 에탄올을 첨가 후 원심분리(13,000rpm, 10분)하여 남아 있는 유기용매를 녹여 제거한 후, 공기 중에서 건조시켜 에탄올을 증발시켰다. 확보한 RNA에 역전사효소(reverse transcriptase)를 첨가하여 cDNA를 수득하고, cDNA에 SYBR, DEC1 및 생체주기(circadian clock) 유전자들의 프라이머(BMAL1; Forward 5'-AATCGCAAGAGGAAAGGCAGTG-3', Revers 5'-TGCTTCTGTGTATGGGTTGGTG-3', CLOCK; Forward 5'-GGCTGAAAGACGGCGAGAAC-3', Revers 5'-AAATGCTGTCTGGGAGGAGTGC-3', PER2; Forward 5'-TGGAGCAGGTTGAGGGCATTAC-3', Revers 5'-TCTCATTCTCGTGGTGTTTCCC-3')를 각각 첨가 후 qRT-PCR(정량적 real time-polymerase chain reaction)을 진행하여 DEC1을 포함한 생체주기 유전자들의 발현 정도를 정량화하였다.
도 2a 내지 2d에서 확인할 수 있듯이, 사이토카인(IL-1b 및 TNF-α)을 처리한 연골세포에서 DEC1 mRNA의 발현이 증가함을 알 수 있었다.
실험예 3. 연골조직 및 연골세포에서 DEC1 발현 조절에 따른 효과 확인
5일령 마우스의 무릎 조직을 채취하고, 0.2% 제2형 콜라게나아제 및 0.02% 트립신을 3시간 동안 처리하여 무릎 조직의 피부 및 근육을 제거하였다. 그 다음, 연골조직만을 분리하여 0.2% 제2형 콜라게나아제로 조직을 녹여 연골세포를 확보한 후, DMEM 배양액을 사용하여 3x105 개/1 dish의 농도로 연골세포를 배양하였다.
먼저, 배양 3일째에 DEC1 아데노바이러스를 2시간 동안 감염시키고, 24 시간 후 연골세포로부터 cDNA를 확보하였다. 그 다음, DEC1, Mmp3, Mmp13, Ptgs2, Il6 및 Adamts4의 프라이머(Mmp3; Forward 5'-CTGTGTGTGGTTGTGTGCTCATCCTAC-3', Revers 5'-GGCAAATCCGGTGTATAATCCACAATC-3', Mmp13; Forward 5'-TGATGGACCTTCTGGTCTTCTGGC-3', Revers 5'-CATCCACATGGTTGGGAAGTTCTG-3', Ptgs2; Forward 5'-CCAAACCAGCAGACTCATACTCATAG-3', Revers 5'-CATCTCTCTGCTCTGGTCAATGGAG-3', Il6; Forward 5'-AGAGATACAAAGAAATGATGGATGC-3', Revers 5'-CTAGGTTTGCCGAGTAGATCTC-3', Adamts4; Forward 5'-CATCCGAAACCCTGTCAA-3', Revers 5'-GCCCATCATCTTCCACAA-3')를 이용하여 qRT-PCR을 진행하여 해당 유전자를 증폭시켰다.
도 3a 및 3b에서 확인할 수 있듯이, 연골세포에서 DEC1의 과발현에 따라 연골기질 분해효소인 Mmp3, Mmp13 및 Adamts4, 및 염증 매개인자인 IL6 및 Ptgs2의 발현이 증가함을 알 수 있었다.
다음으로, 상기 배양된 연골세포에 DEC1 siRNA를 48시간동안 형질전환시켜 cDNA를 확보하였다. 그 다음, DEC1, Mmp3, Mmp13, Ptgs2, Il6 및 Adamts4의 프라이머(Mmp3; Forward 5'-CTGTGTGTGGTTGTGTGCTCATCCTAC-3', Revers 5'-GGCAAATCCGGTGTATAATCCACAATC-3', Mmp13; Forward 5'-TGATGGACCTTCTGGTCTTCTGGC-3', Revers 5'-CATCCACATGGTTGGGAAGTTCTG-3', Ptgs2; Forward 5'-CCAAACCAGCAGACTCATACTCATAG-3', Revers 5'-CATCTCTCTGCTCTGGTCAATGGAG-3', Il6; Forward 5'-AGAGATACAAAGAAATGATGGATGC-3', Revers 5'-CTAGGTTTGCCGAGTAGATCTC-3', Adamts4; Forward 5'-CATCCGAAACCCTGTCAA-3', Revers 5'-GCCCATCATCTTCCACAA-3')를 이용하여 qRT-PCR을 진행하여 해당 유전자를 증폭시켰다.
도 3c 및 3d에서 확인할 수 있듯이, 연골세포에서 DEC1의 발현 억제에 따라 연골기질 분해효소인 Mmp3, Mmp13, Adamts4, 및 염증 매개인자인 Il6의 발현이 감소함을 알 수 있었다.
추가적으로, 8주령 마우스의 무릎에 1x109 PFU 분량(10ul)의 DEC1 아데노바이러스를 1주에 한번씩 총 3번 주입하고, 4주 후 무릎 조직을 확보하였다. 그 다음, 상기 실험예 2의 방법으로 사프라닌 O 염색을 진행하여 연골조직의 손상 정도를 OARSI(Osteoarthritis Research Society International grade) 가이드라인에 따라 점수화하였다.
도 4a 및 4b에서 확인할 수 있듯이, DEC1의 과발현에 의해 연골조직의 손상이 증가하여 관절염이 발병함을 알 수 있었다.
<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> Composition for preventing and treating arthritis comprising a DEC1 expression and activity modulator <130> PN190012 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1236 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Differentiated embryo chondrocyte expressed gene 1 <400> 1 atggaacgga tccccagcgc gcaaccacct cctacctgcc tgcccaaagc tccagggctg 60 gagcacggag acctgtcagg gatggatttt gcccacatgt accaagtgta caagtccagg 120 cggggaataa aacggagcga agacagcaag gaaacttaca aactgccgca ccggctgatt 180 gagaaaaaga gacgtgaccg gattaacgag tgcattgccc agctgaagga tctcctaccc 240 gaacatctca aacttactac tttgggtcac ttggaaaaag cagtggttct ggagcttacg 300 ttgaagcacg tgaaagcatt gacaaatcta attgatcagc agcagcagaa aatcattgcc 360 ctgcagagcg gtttacaagc tggtgatttg tcgggaagaa atctcgaggc agggcaagaa 420 atgttctgct caggtttcca gacttgtgcc cgtgaggtac ttcagtacct ggcgaagcat 480 gagaacactc gggacctgaa atcttcccag ctcgtcactc atctccatcg tgtggtctcg 540 gagctgctgc agggtggtgc ttccaggaaa ccattggact cggctcccaa agccgtggac 600 ttgaaagaga agcccagctt cctagccaag ggatcagaag gccctgggaa aaactgtgtg 660 ccagtcatcc agcggacttt tgctccctcg ggtggggagc agagcggcag tgacacggac 720 acagacagtg gctatggagg tgaattggag aagggggact tgcgcagtga gcagccgtac 780 ttcaaaagcg accatggacg caggttcgcc gtgggagaac gtgtcagcac aattaagcaa 840 gaatccgaag agccccccac caaaaagagc cgaatgcagc tctcagaaga ggaaggccac 900 ttcgcgggca gtgatctgat gggttcccca tttcttgggc cacacccaca tcagcctcct 960 ttttgccttc ccttctatct catcccacca tcggccactg cctacctgcc tatgctggag 1020 aaatgctggt accccacctc tgtgccagtg ttatacccag gcctcaacac ctcagctgca 1080 gccctctcca gcttcatgaa cccagacaag ataccgactc ccttgcttct gccccagaga 1140 ctcccttctc ctttggcaca ttcgtccctc gactcttcgg ccttgctcca ggctttgaag 1200 cagatccctc ctttaaactt agaaaccaaa gactaa 1236

Claims (8)

  1. DEC1(Differentiated embryo chondrocyte expressed gene 1)의 발현 또는 활성 억제제인 50 nM DEC1 siRNA를 유효성분으로 포함하는 인간의 골관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 인간 내 DEC1(Differentiated embryo chondrocyte expressed gene 1)의 발현 또는 활성 억제제인 50 nM DEC1 siRNA를 선별하는 단계를 포함하는 골관절염 치료제의 스크리닝 방법.
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