WO2024143582A1 - 바이구아나이드 화합물 기반 관절질환 치료용 주사 치료제 조성물 - Google Patents

바이구아나이드 화합물 기반 관절질환 치료용 주사 치료제 조성물 Download PDF

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WO2024143582A1
WO2024143582A1 PCT/KR2022/021385 KR2022021385W WO2024143582A1 WO 2024143582 A1 WO2024143582 A1 WO 2024143582A1 KR 2022021385 W KR2022021385 W KR 2022021385W WO 2024143582 A1 WO2024143582 A1 WO 2024143582A1
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WO
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bone disease
pharmaceutical composition
expression
preventing
clause
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Application number
PCT/KR2022/021385
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Inventor
조미라
김석중
박성환
나현식
전주연
이선영
엄인규
이정수
조근형
Original Assignee
가톨릭대학교 산학협력단
Filing date
Publication date
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Definitions

  • the purpose of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating bone disease comprising a compound represented by the following formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof:
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating bone disease comprising a compound represented by the following formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof:
  • Figure 1 is a diagram showing the results of measuring the degree of improvement in arthritis pain according to the SD282 treatment of the present invention in seconds and weight from the time to endure when a certain pain is applied (A: from the time of inducing osteoarthritis, B: from the start of osteoarthritis) Mean pain outcomes through endpoint, day 25).
  • Figure 4 quantifies the degree of cartilage damage in an osteoarthritis animal model according to SD282 treatment of the present invention.
  • Figure 5 is a diagram confirming the infiltration of inflammatory factors in the synovial tissue of an animal model of osteoarthritis following SD282 treatment of the present invention by immunohistochemical staining (A: immunohistochemical staining results, B: quantification of the level of inflammatory factors).
  • Figure 7 is a diagram quantifying MCP-1 expression in osteoarthritis patient cartilage cell lines according to SD282 treatment of the present invention (A: expression confirmed by IL-1 ⁇ treatment, B: expression according to IL-1 ⁇ and IL-17 treatment check).
  • Figure 8 is a diagram quantifying the expression of IL-10, an anti-inflammatory factor, in cartilage cell lines of patients with osteoarthritis according to SD282 treatment of the present invention (A: expression confirmed by IL-1 ⁇ treatment, B: IL-1 ⁇ and IL-17 Confirmation of expression according to treatment).
  • Figure 10 is a diagram quantifying the expression of chondrogenesis markers SOX9 and Aggrecan in cartilage cell lines of osteoarthritis patients treated with SD282 of the present invention (A: expression confirmed by IL-1 ⁇ treatment, B: IL-1 ⁇ and IL-17 Confirmation of expression according to treatment).
  • Figure 11 is a diagram confirming the pain control effect in an osteoarthritis animal model following oral administration of SD282 of the present invention (A: Paw withdrawal latency improved, B: Paw withdrawal threshold improved, C: Weight on right hind rimb improved ).
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating bone disease comprising a compound represented by the following formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof:
  • the compound of Formula 1 is SD282 (N-Ethyl-4-fluorophenyl biguanide), and may be a derivative of biguanide.
  • prevention used in the present invention refers to all actions that suppress the symptoms or delay the progression of a specific disease by administering the composition of the present invention.
  • the pharmaceutically acceptable salt may include an acid addition salt formed by a pharmaceutically acceptable free acid, and the free acid may be an organic acid or an inorganic acid.
  • the organic acids include citric acid, acetic acid, lactic acid, tartaric acid, maleic acid, fumaric acid, formic acid, propionic acid, oxalic acid, trifluoroacetic acid, benzoic acid, gluconic acid, metasulfonic acid, glycolic acid, succinic acid, 4-toluenesulfonic acid, glutamic acid, aspartic acid, etc. It may include, but is not limited to this. Additionally, the inorganic acid may include hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, phosphoric acid, etc., but is not limited thereto.
  • injection refers to a method of administering medicine by injecting a drug solution into a part of the body using a syringe and a needle for the purpose of acting locally or systemically, and is more effective than conventional oral administration, suppository administration, or topical administration. It is a method of administration that allows the effect of the drug to be obtained accurately and quickly, and can effectively deliver the drug to the body even in cases where the drug cannot be administered orally or in situations where the drug is denatured by digestive juices and absorption is difficult. Injection is largely intradermal. There are injections, subcutaneous injections, intramuscular injections, intravenous injections, and intraarterial injections.
  • Injectables for use in the above injections refer to aqueous, water-soluble, oily, suspended, emulsified, solid (administration after dissolution) formulations, and are formulated for injection purposes to administer drugs so that they act directly in the body without passing through the digestive tract. It means a standardized product.
  • the conditions for injections are 1) free of excipients, 2) completely sterile, 3) not containing pyrogenic substances, 4) having an osmotic pressure similar to serum osmolality, 5) having a pH similar to serum pH, and 6) If it is a preparation that does not chemically react with components of body tissue, it can be used as an injection.
  • the above injection may contain solvents, solubilizers, buffers, isotonic agents, stabilizers, sulfating agents, analgesics, and suspending agents as additives according to the Ministry of Food and Drug Safety drug additive guidelines.
  • “Additives” that can be mixed into injections are substances other than the active ingredients contained in the preparation and are used for the purposes of increasing the usefulness of the medicine, facilitating formulation, stabilizing the preparation, and improving the appearance. Additives include excipients, stabilizers, preservatives, buffers, coagulants, suspending agents, emulsifiers, fragrances, solubilizers, colorants, thickeners, etc., as needed.
  • the additives used do not have direct pharmacological effects at the dosage of the preparation, are safe, and do not change the therapeutic effect of the preparation or interfere with the test, and can be summarized as follows.
  • the compound may inhibit cartilage damage.
  • the compound may increase the expression of SOX9 (SRY-Box Transcription Factor 9) or Aggrecan, which are cartilage formation markers.
  • SD282 of the present invention can be administered at a concentration of 0.1 to 100 mg/kg, and preferably at a concentration of 30 to 50 mg/kg.
  • the health functional food in the form of a tablet is made by granulating a mixture of the active ingredient of the present invention with excipients, binders, disintegrants and other additives in a conventional manner, and then adding a lubricant and compression molding, or The mixture can be directly compression molded.
  • the health functional food in the form of tablets may contain flavoring agents, etc., if necessary.
  • hard capsules can be manufactured by filling a regular hard capsule with a mixture of the active ingredient of the present invention with additives such as excipients
  • soft capsules can be prepared by mixing the active ingredient of the present invention with additives such as excipients. It can be manufactured by filling the mixture with a capsule base such as gelatin.
  • the subject is applicable to any mammal, and the mammal includes humans and primates, as well as domestic animals such as cattle, pigs, sheep, horses, dogs and cats.
  • the compound represented by Formula 1 of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof can be administered to mammals such as rats, mice, livestock, and humans through various routes. All modes of administration are contemplated, for example, oral, rectal or by intravenous, intramuscular, subcutaneous, intrathecal or intracerebroventricular injection.
  • MCP-1 monocyte chemoattractant protein 1
  • IL-1 ⁇ a bone disease factor, compared to the Vehicle group
  • the cells were treated at a concentration of ng/ml, and SD282 was treated at 200, 500, and 1000 ⁇ M, respectively, to confirm the expression of MCP-1.
  • the above cartilage cell line was treated with 20 ng/ml of IL-1 ⁇ and 10 ng/ml of IL-17, and treated with SD282 at the same concentration as above. After culturing for 24 hours, supernatant was obtained and the expression of MCP-1 was tested by ELISA. It was confirmed.

Abstract

본 발명은, 바이구아나이드 화합물 기반 관절질환 치료용 주사 투여 및 경구 치료제 조성물에 관한 것으로서, 본 발명의 신규한 화합물인 SD282는 골관절염이 유도된 렛트에 주사 및 경구 투여하면, 골관절염에 의한 통증 정도가 감소하고, 연골 손상을 보호하는 것을 확인하였다. 또한, 염증인자인 IL-1β, IL-6 및 TNF-α의 발현과, 골질환 인자인 MCP-1의 발현을 억제하는 것을 확인하였다. 또한, 항염증 인자인 IL-10과, 연골 재생 인자인 TIMP1 및 TIMP3, 연골 형성 마커인 SOX9 및 Aggrecan의 발현을 증가시켜, 관절염으로 유도되는 연골 손상을 억제하는 것을 확인하였다.

Description

바이구아나이드 화합물 기반 관절질환 치료용 주사 치료제 조성물
본 발명은, 바이구아나이드 화합물 기반 관절질환 치료용 주사 및 경구 치료제 조성물에 관한 것이다.
골관절염(osteoarthritis)은 퇴행성 관절염으로 칭해지기도 하는 관절염의 일종으로서, 윤활관절에서 연골과 주위골에 퇴행성 변화가 나타나서 생기는 관절염을 말한다. 즉, 골관절염은 관절 연골의 점차적인 소실과 더불어 연골 하방에 위치한 뼈의 비대, 관절 가장자리 부위의 골 생성, 및 비특이적인 활막 염증을 특징으로 하는 질환이다. 골관절염은 노화나 과도한 물리적 압박(예를 들어, 비만, 외상 등)에 의해서 연골이 손상되어 발생하는 질환이다. 따라서, 골관절염은 체중을 많이 받는 관절, 즉, 무릎(슬)관절, 엉덩이(고)관절 등에 심한 통증과 운동 장애를 나타내며, 장기간 방치할 경우에는 관절의 변형까지 초래하게 된다.
골관절염은 연골내 수분 함량이 증가되어 부종을 일으키는 연골 변화 단계 (1 단계), 연골이 파괴되면서 연골표면이 갈라지고 찢어지면서 손상되어 뼈가 드러나고 관절강이 좁아지는 원섬유화 (fibrillation) 단계(2 단계), 연골세포가 연골을 회복하기 위해 연골 생성을 시작하지만 연골 생성보다 연골 파괴가 더 빠르게 일어나기 때문에 전반적으로 연골이 줄어들게 되는 단계 (3 단계), 뼈가 변형되어 관절 기형 및 기능장애를 초래하는 뼈 변화단계 (4 단계), 및 연조직 (soft tissue) 이 두꺼워지는 관절 연조직 변화 단계 (5 단계) 로 진행되게 된다.
골관절염과 다른 분류에 속하는 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis)은 활막 세포의 염증과 증식을 특징으로하는, 만성 자가면역 질환(autoimmune diseases)으로서, 골관절염과 달리 관절 주위 뼈의 골다공증 및 골미란 등이 발생한다. 류마티스 관절염은 활막(synovial membrane)의 염증이 관절막(joint capsule)과 인대(ligament), 건(tendon)으로 퍼지는 단계(1 단계), 관절연골(joint cartilage)의 점차적인 파괴로 관절 간격이 좁아지고 관절막과 인대의 장력이 소실되는 단계(2 단계), 염증이 뼈로 침범하여 뼈의 부분적 침식이 발생하는 단계(3 단계), 및 관절기능이 소실되는 단계(4 단계)로 진행되게 된다. 따라서, 골관절염과 류미티스 관절염은 그 발명 원인 및 진행단계가 전혀 상이하며, 이에 대한 치료 방법도 상이하다.
현재 골관절염의 치료를 위해서는, 아세트아미노펜(acetaminophen), 트라마돌(tramadol), 비스테로이드성 항염제(nonsteroidal antiinflammatory drugs,NSAIDs), 디아세린(diacerin), 글루코사민(glucosamine)등의 약물이 사용되고 있다. 이들 가운데 비스테로이드성 항염제는 위, 십이지장 궤양 등의 위장관 부작용이 문제점으로 지적되고 있다. 따라서, 위장관 부작용의 위험인자를 가지고 있는 골관절염 환자에게 상기 약물들을 투여할 경우, 레바미피드 등의 점막 보호제(cytoprotective agent)나 시메티딘, 라니티딘 등의 H2-수용체 길항제, 오메프라졸 등의 프로톤 펌프 저해제등이 동시에 처방되고 있다.
이에 본 발명자들은, 골관절염을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있는 소재를 모색하던 중, 새로이 합성한 신규 화합물이 골관절염을 효과적으로 치료할 수 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다:
[화학식 1]
Figure PCTKR2022021385-appb-img-000001
본 발명의 다른 목적은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 골질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 골질환의 치료 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다:
[화학식 1]
Figure PCTKR2022021385-appb-img-000002
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 골질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 골질환의 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 신규한 화합물인 SD282는 골관절염이 유도된 렛트에 주사 투여 및 경구 투여하면, 골관절염에 의한 통증 정도가 감소하고, 연골 손상을 보호하는 것을 확인하였다. 또한, 염증인자인 IL-1β, IL-6 및 TNF-α의 발현과, 골질환 인자인 MCP-1의 발현을 억제하는 것을 확인하였다. 또한, 항염증 인자인 IL-10과, 연골 재생 인자인 TIMP1 및 TIMP3, 연골 형성 마커인 SOX9 및 Aggrecan의 발현을 증가시켜, 관절염으로 유도되는 연골 손상을 억제하는 것을 확인하여, 관련 산업에 유용하게 이용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 SD282 처리에 따른 관절염 통증개선 정도를 일정한 통증이 가해졌을때에 견디는 시간까지의 초와 무게를 측정한 결과를 나타낸 도이다(A: 골관절염 유도시점부터, B: 골관절염 시작부터 종료 시점인 25일까지 통증 결과의 평균).
도 2는 본 발명의 SD282 처리에 따른 골관절염 동물모델에서 아픈다리에 힘을 덜 가하는 원리를 이용해 양발의 균형을 잘 이루고 있는지 조사한 결과로 골관절염 유도된 오른쪽 발에 힘이 잘 들어가는지 확인하고(weight on right hind rimb), Vehicle 대비 SD282 투여에 의해 양발의 균형이 잘 유지되어 통계적 유의성이 있음을 확인한 도이다(A: 골관절염 유도시점부터, B: 골관절염 시작부터 종료 시점인 25일까지 결과의 평균).
도 3은 본 발명의 SD282 처리에 따른 골관절염 동물모델의 연골 손상 정도를 Safranin O 염색으로 확인한 도이다.
도 4는 본 발명의 SD282 처리에 따른 골관절염 동물모델의 연골 손상 정도를 정량화한 것이다.
도 5는 본 발명의 SD282 처리에 따른 골관절염의 동물모델의 활막조직에서, 염증인자의 침윤을 면역조직화학염색으로 확인한 도이다(A: 면역조직화학염색 결과, B: 염증인자 정도 정량화).
도 6은 본 발명의 SD282가 골관절염 환자 연골 세포주에서의 IL-1β 처리에 따른 IL-6 발현을 정량화한 도이다.
도 7은 본 발명의 SD282 처리에 따른 골관절염 환자 연골 세포주에서의 MCP-1 발현을 정량화한 도이다(A: IL-1β 처리에 따른 발현 확인, B: IL-1β 및 IL-17 처리에 따른 발현 확인).
도 8은 본 발명의 SD282 처리에 따른 골관절염 환자 연골 세포주에서 항염증 인자인 IL-10의 발현을 정량화한 도이다(A: IL-1β 처리에 따른 발현 확인, B: IL-1β 및 IL-17 처리에 따른 발현 확인).
도 9는 본 발명의 SD282 처리에 따른 골관절염 환자 연골 세포주에서 연골 재생인자인 TIMP1 및 TIMP3의 발현을 정량화한 도이다(A: TIMP1 발현 확인, B: TIMP3 발현 확인).
도 10은 본 발명의 SD282 처리에 따른 골관절염 환자 연골 세포주에서 연골형성 마커인 SOX9 및 Aggrecan의 발현을 정량화한 도이다(A: IL-1β 처리에 따른 발현 확인, B: IL-1β 및 IL-17 처리에 따른 발현 확인).
도 11은 본 발명의 SD282의 경구 투여에 따른 골관절염 동물모델에서의 통증 제어 효과를 확인한 도이다(A: Paw withdrawal latency 개선 확인, B: Paw withdrawal threshold 개선 확인, C: Weight on right hind rimb 개선 확인).
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다:
[화학식 1]
Figure PCTKR2022021385-appb-img-000003
보다 바람직하게 상기화학식 1의 화합물은 SD282(N-Ethyl-4-fluorophenyl biguanide)이며, 바이구아나이드(biguanide)의 유도체 일 수 있다.
종래의 면역 억제제들은 일반적으로 세포독성, 면역저하로 인한 감염, 당뇨병, 진전(tremor), 두통, 설사, 고혈압, 오심, 신기능 장애 등의 부작용을 동반하기 때문에 장기간 치료 효과가 지속되기 어렵다는 단점이 있다. 이에, 심각한 부작용을 줄이고 면역억제 치료 효과를 높이기 위해 특히 관절염 분야에서 서로 다른 작용기작의 면역억제제를 투여하거나 대체하는 방법들이 시도되어 오고 있으나, 최적화된 면역억제제의 투여는 아직 미비한 상태이다. 따라서 기존 면역억제제의 부작용을 줄이고 치료 효과는 향상시킬 수 있는 새로운 면역억제 또는 면역조절 요법의 개발과 더욱 안전하고 부작용이 적은 새로운 면역억제제 후보 물질의 발굴이 시급한 실정이다. 이에 본 발명자들은 상기의 신규한 화합물인 SD282가 골관절염을 억제하고, 종래의 면역 억제제의 부작용등을 줄이면서 효과적으로 골관절염을 예방 및 치료함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명에서 사용되는 용어 "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 특정 질환의 증상을 억제하거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "치료"는 본 발명의 조성물의 투여로 특정 질환의 증상을 호전 또는 이롭게 변경시키는 모든 행위를 의미한다.
상기 약학적으로 허용가능한 염은 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염을 포함할 수 있으며, 상기 유리산은 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산, 아스파르트산 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 무기산은 염산, 브롬산, 황산, 인산 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 약학 조성물에는 유효성분 이외에 보조제(adjuvant)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 보조제는 당해 기술분야에 알려진 것이라면 어느 것이나 제한 없이 사용할 수 있으나, 예를 들어 프로인트(Freund)의 완전 보조제 또는 불완전 보조제를 더 포함하여 그 효과를 증가시킬 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 유효성분을 약학적으로 허용된 담체에 혼입시킨 형태로 제조될 수 있다. 여기서, 약학적으로 허용된 담체는 제약 분야에서 통상 사용되는 담체, 부형제 및 희석제를 포함한다. 본 발명의 약학 조성물에 이용할 수 있는 약학적으로 허용된 담체는 이들로 제한되는 것은 아니지만, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀전, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액(주사제)의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 바람직하게는 주사용액(주사제)이나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에서 사용하는 용어 "주사"는 주사기와 침을 사용하여 신체의 일부에 약액을 주입하여, 국소적 또는 전신적으로 작용시킬 목적으로 행하는 투약법으로서, 종래의 경구투여, 좌제투여 또는 외용제투여보다 약제의 효과를 정확하고 빠르게 얻을 수 있고, 입으로 약제를 투여할 수 없는 경우나, 소화액에 의하여 약제의 변성, 흡수가 어려운 상황에서도 효과적으로 약제를 신체에 전달할 수 있는 투약 방법이다, 주사는 크게 피내주사, 피하주사, 근육주사, 정맥주사 또는 동맥주사가 있다. 피내주사는 흡수가 느리고 반응을 눈으로 볼 수 있는 것이 특징으로서, 질병의 진단 또는 예방에 실시하거나, 수술 전 항생제 부작용을 확인할 수 있는 주사법이다. 피하주사는 피하 결합조직에 약제를 투약하는 방법으로서 흡수가 빠르며, 근육주사는 둔부(臀部) 또는 위팔의 근육조직 내에 주사하고, 근육의 높은 혈관 분포에 의하여, 약제가 신속히 흡수되도록 주사하는 방법이다. 정맥주사는 정맥 내에 직접 약제를 투여하는 방법으로서, 약제의 신속한 작용이 가능하고, 정확한 양을 투약할 수 있는 주사방법이며, 약제의 자극성으로 근육 또는 피하에 주사할 수 없는 경우에 이용하는 투약방법으로써, 많은 양의 약제를 투약할 수 있다. 동맥주사는 환부 국소에 유입되는 동맥 내에 약제를 주사하는 방법으로서, 약제의 환부에 직접적인 효과를 기대할 수 있다.
한편, 정형외과적 시술로서 상기의 주사를 제외하고, 관절강 내에 직접적으로 약물을 주입하는 관절강 주사가 시행되고 있으며, 무릎연골연화증(chondromalacia of the patella), 반원상 연골 파열(Meniscal Tear), 무릎 염증 또는 관절염(arthritis)의 수술 전 치료법으로서 관절강 주사를 이용한 약제 투여 방법이 각광을 받고 있다. 관절강 주사는, 관절강 내 약물을 직접 투약함으로서, 관절 내 통증을 빠르게 개선시키고, 연골, 관절 염증 및 골 손상의 빠른 회복을 유도할 수 있다.
상기의 주사에 이용하기 위한 주사제는 수성, 수용성, 유성, 현탁성, 유탁성, 고형(용해 후 투약)의 제형을 뜻하며, 약품이 소화관을 거치지 않고 직접 체내에 작용하도록 투약하기 위하여 주사목적으로 제형화된 제제를 뜻한다. 주사제의 조건으로는 1) 부형물이 없고, 2) 완전하게 무균이며, 3) 발열성 물질을 포함하지 않으며, 4) 혈청 삼투압과 유사한 삼투압을 가지며, 5) 혈청 pH와 유사한 pH이며, 6) 체조직의 성분과 화학적으로 반응하지 않는 제제라면, 주사제로 이용할 수 있다.
또한, 상기의 주사제에는 식약처 의약품 첨가제 가이드라인에 따른 첨가제로서 용제, 용해보조제, 완충제, 등장화제, 안정제, 황산화제, 무통화제, 현탁화제가 혼입될 수 있다. 주사제에 혼입될 수 있는 "첨가제"는 제제에 함유된 유효성분 이외의 물질로서 의약품의 유용성을 높이고 제제화를 용이하게 하며 제제의 안정화를 도모하고 외관을 좋게 하는 등의 목적으로 사용하는 것이다. 첨가제로는 필요에 따라 부형제, 안정화제, 보존제, 완충제, 교미제, 현탁화제, 유화제, 방향제, 용해보조제, 착색제, 점증제 등을 쓸 수 있다. 다만, 사용하는 첨가제는 그 제제의 투여량에서 직접적인 약리작용을 나타내지 않고 안전하며, 그 제제의 치료효과를 변하게 하거나 시험에 지장을 주지 않는 것을 의미하며, 다음과 같이 요약할 수 있다.
1) 안정성, 생체이용률 등 향상
2) 보존 또는 사용 중 제제의 품질 유지
3) 의약품의 물리적인 성상을 조절하여 약물경제성 증진
상기 첨가제로 혼입될 수 있는, "용제"는 주사용 증류수, 0.9%염화나트륨주사액, 링겔주사액, 덱스트로스주사액, 덱스트로스+염화나트륨주사액, 피이지(PEG), 락테이티드 링겔주사액, 에탄올, 프로필렌글리콜, 비휘발성유-참기름, 면실유, 낙화생유, 콩기름, 옥수수기름, 올레인산에칠, 미리스트산 이소프로필, 안식향산벤젠 등이 혼입될 수 있다. "용해보조제"로는 안식향산나트륨, 살리실산나트륨, 초산나트륨, 요소, 우레탄 모노에칠아세트아마이드, 부타졸리딘, 프로필렌글리콜, 트윈류, 니정틴산아미드, 헥사민, 디메칠아세트아마이드 등이 혼입될 수 있다. "완충제"로는 약산 및 그 염(초산과 초산나트륨), 약염기 및 그 염(암모니아 및 초산암모니움), 유기화합물, 단백질, 알부민, 펩톤, 검류 등이 혼입될 수 있다. "등장화"제로는 염화나트륨이 혼입될 수 있으며, "안정제"로는 중아황산나트륨(NaHSO3), 이산화탄소가스, 메타중아황산나트륨(Na2S2O3), 아황산나트륨(Na2SO3), 질소가스(N2), 에칠렌디아민테트라초산 등이 혼입될 수 있다. "황산화제"로는 소디움비설파이드 0.1%, 소디움포름알데히드, 설폭실레이트, 치오우레아, 에칠렌디아민테트라초산디나트륨, 아세톤소디움비설파이트 등이 혼입될 수 있다. "무통화제"로는 벤질알코올, 클로로부탄올, 염산프로카인, 포도당, 글루콘산칼슘 등이 혼입될 수 있으며, "현탁화제"로는 시엠시나트륨, 알긴산나트륨, 트윈80, 모노스테아린산알루미늄 등이 혼입될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은, 제제화할 경우에는 통상 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 그러한 고형 제제는 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 칼슘 카르보네이트, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 일반적으로 사용되는 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수용성용제, 현탁제로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 개체에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식이 예상될 수 있는데, 예를 들면 경구, 정맥, 근육, 피하, 복강내 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물의 투여량은 개체의 연령, 체중, 성별, 신체 상태 등을 고려하여 선택된다. 상기 약학 조성물 중 포함되는 유효성분의 농도는 대상에 따라 다양하게 선택할 수 있음은 자명하며, 바람직하게는 약학 조성물에0.01 ~ 5,000 ㎍/ml의 농도로 포함되는 것이다. 그 농도가 0.01 ㎍/ml 미만일 경우에는 약학 활성이 나타나지 않을 수 있고, 5,000 ㎍/ml를 초과할 경우에는 인체에 독성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 화합물은 관절 통증을 경감시키는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 화합물은 연골 손상을 억제하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 화합물은 염증인자의 발현을 억제시키는 것일 수 있으며, 상기 염증 인자는 IL-1β, IL-6 및 TNF-α로부터 이루어진 군에서 선택된 인자인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 화합물은 골질환 인자인 MCP-1(Monocyte Chemoattractant Protein-1)의 발현을 억제시키는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 화합물은 항염증 인자인 IL-10의 발현을 증가시키는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 화합물은 연골 재생 인자인 TIMP1(Tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 1) 또는 TIMP3(Tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 3)의 발현을 증가시키는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 화합물은 연골 형성 마커인 SOX9(SRY-Box Transcription Factor 9) 또는 Aggrecan의 발현을 증가시키는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 골질환은 골관절염(Osteoarthritis)인 것일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명의 SD282는 0.1 ~ 100 mg/kg의 농도로 투여 될 수 있고, 바람직하게는 30 ~ 50 mg/kg의 농도로 투여될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 골질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "개선"은 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 식품 조성물은 본 발명의 유효성분을 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 향미제는 천연 향미제 (타우마틴), 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 상기 약학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등이 있다.
또한 상기 식품 조성물은 유효성분인 추출물 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
본 발명의 기능성 식품 조성물은 골질환의 예방 또는 치료 목적으로, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공될 수 있다. 본 발명에서 '건강기능성 식품 조성물'이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다. 상기 '식품 첨가물 공전'에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료 제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다. 예를 들어, 정제 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다. 캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 본 발명의 유효성분을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다. 환 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다. 과립 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분의 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 골질환의 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 치료 방법은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 치료적 유효량으로 개체에 투여하는 것을 포함한다. 특정 개체에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 개체의 연령, 체중, 일반건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다. 일일 투여량은 본 발명의 약학조성물의 양을 기준으로 0.0001 내지 100 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.01 내지 100 ㎎/㎏이며, 하루 1 ~ 6 회 투여될 수 있다. 다만, 각 유효성분의 복용량 또는 투여량이 각 유효성분의 함량을 지나치게 높게 포함하여 부작용을 초래하지 않을 정도이어야 함은 당업자에게 자명하다. 따라서 본 발명의 목적에 적합한 조성물의 유효량은 전술한 사항을 고려하여 결정하는 것이 바람직하다.
상기 개체는 임의의 포유동물에 적용가능하며, 상기 포유동물은 인간 및 영장류뿐만 아니라, 소, 돼지, 양, 말, 개 및 고양이 등의 가축을 포함한다.
본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은, 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
<제조예 1> SD282의 합성
본 발명의 신규한 화합물인 SD282를 합성하였다. 구체적으로, 밀봉반응기에 아닐린 화합물(1.0 mmol)을 아세토나이트릴 용매에 녹인 후 다이시아노다이아마이드(1.0 mmol)와 진한 황산(1.0 mmol)을 첨가하고 밀봉한 후 175 ℃에서 1시간 교반하였다. 이후실온으로 식혀 흰색 고체를 생성하였고, 용매를 제거한 후 헥산과 이소프로필알콜로 세척하여 흰색 고체 형태의 하기 화합물(SD-282)을 합성하였다. 합성된 화합물에 대해서는 H-NMR 분석을 통해 각 화합물을 동정하였고 그 결과는 다음과 같다.
Figure PCTKR2022021385-appb-img-000004
[표 1]
Figure PCTKR2022021385-appb-img-000005
1H-NMR 분석 결과 상기 SD282 화합물은 1H-NMR (600MHz, DMSO) δ(ppm) : 7.36-7.34 (m, 2H), 7.31-7.28 (m, 2H) 7.105 (s, 2H) 6.89 (s,4H) 3.69 (t, 2H, J=7.2Hz), 1.07 (t, 3H, J=7.2 Hz), MS (m/z) : [M+H]+ 224의 결과를 얻었다.
<실시예 1> 골관절염 동물모델
<1-1> 골관절염 동물모델 제작
본 발명의 골관절염 동물모델을 제작하기 위하여, 5주령 수컷 Wistar 렛트(rat)를 21~22℃의 온도에서 명암주기(light-dark cycle)를 12시간 간격으로 사육하였고 살균한 물과 사료를 공급하여 키웠다. 이후 골관절염 유도를 위해 렛트(rat)의 오른쪽 무릎에 3mg/50μl의 용량으로 모노소듐 아이도아세테이트(Monosodium iodoacetate, MIA, Sigma, ST. Louis, MO)를 투여하여 골관절염을 유도하였다. MIA는 생리식염수에 용해시켜 투여하였다. 이 후 렛트를 아무 약물도 투여하지 않고 약물의 부형제를 투여한 Vehicle 군;과, 본 발명의 신규 화합물인 SD282를 투여한 SD282군;으로 분류하였으며, 동물모델에는 골관절염 유도 후 매일 주 6회 SD282 투여군의 25mg/kg의 농도로 SD282를 실험 종료 시점까지 주사 투여(관절강 투여) 하였다.
<1-2> 관절염 통증 평가
상기 실시예 1-1에서 제작된 동물모델에서 SD282의 주사 투여(관절강 투여)가 관절 통증 억제효과가 있는지 확인하고자 하였다. 구체적으로 통증은 Dynamic plantat aesthsiometer(Ugo Basile, Comerio, Italy)를 이용하여 측정하였고, 기계의 통증 측정 방법은 측정 기계 위에 그물로 된 판을 얹고 그 위에 아크릴로 된 동물고정틀 안에 렛트(rat)을 넣은 후, 측정기계로 약물이 주입된 오른발에 찔러 주었다. 찌른 후에 기계가 자동적으로 발을 떼는데 걸리는 시간(Paw withdrawal latency(발 철수 시간))(s, 초)과 얼마만큼의 무게를 주었을 때 발을 떼는지(Paw withdrawal threshold(발 철수 무게))(g)를 측정하여 그때 나오는 시간과 무게를 확인하였다. 또한, 관절염이 유도에 따른 무게 균형의 변화를 확인하기 위하여, 오른쪽 뒷다리의 무게(weight on right hind rimb)를 측정하여, 체중 대비 무게를 확인하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 SD282를 주사한 렛트의 통증반응 정도가 회복된 것을 확인하였으며, 도 2에 나타낸 바와 같이, SD282를 주사한 렛트에서는 weight on right hind rimb가 증가하여, 무게 균형이 증가한 것을 확인하였다.
<실시예 2> SD282의 관절 연골 보호 효과
본 발명의 SD282가 골관절염 동물모델에서 관절 파괴를 억제하는지 확인하고자 하였다. 구체적으로는 상기 실시예 1-2의 골관절염이 유도된 렛트를 인도적으로 희생하고, 관절 조직을 수득하였으며, 수득된 조직을 사프라닌 오(Safranin O) 염색으로 조직의 손상 정도를 관찰하였다. Safranin O로 연골 조직에 존재하는 산성 proteoglycan을 염색되는데 연골의 glucosaminoglucan과 결합하여 염색상에 오렌지색을 띠어 연골에서 발색이 된다. SD282 주입군에서 Vehicle과 비교하였을 때 연골 손상이 억제되어 있는 것을 확인 하였다.
그 결과, 골관절염이 유도된 렛트에서는 관절 조직의 OARSI score 및 Total Mankin score가 증가하여, 연골 손상이 관찰되었으나, SD282가 처리된 렛트에서는 관절 조직에서는 OARSI score 및 Total Mankin score가 현저히 감소하여, 연골 손상이 억제된 것을 확인하였다(도 3 및 도 4).
<실시예 3> SD282의 면역 조절 효과 확인
본 발명의 SD282가 골관절염 동물모델에서 활막 조직 내 염증인자에 대한 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 1-2의 렛트의 관절 조직을 얻어 파라핀 블록으로 제작 하고, 각각의 관절 절편을 면역조직화학염색으로 염색하여 확인하였다. DAB 발색 positive 세포를 수치화하여 구체적으로, IL-1β, IL-6 및 TNF-α의 면역 양성 세포를 확인하였으며, 이를 정량화 하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, Vehicle군과 비교하여, SD282를 처리한 렛트의 활막조직에서는 염증성 사이토카인인 IL-1β, IL-6 및 TNF-α의 발현양이 현저히 감소한 것을 확인하였다.
<실시예 4> 골관절염 환자 연골에서의 SD282 효과 확인
<4-1> 골관절염 환자 연골세포주에서의 SD282의 IL-6 억제 효과 확인
본 발명의 SD282가 골관절염 환자의 연골 세포에서 염증인자인 IL-6의 발현을 억제하는지 확인하고자, 골관절염 환자의 관절 교체수술시에 cartilage에 얻어 collagenase 처리 하여 chondrocyte의 single 세포로 분리 하였다. 본 실험에서는 chondrocyte의 성질을 잃지 않는 passage 4까지의 세포로 실험을 진행하였다. chondrocyte를 24well에 5x104의 세포로 seeding 하였다. seeding 후 starvation 과정을 거친 후 연골세포에 IL-1β 20 ng/ml 처리하여 병인 상태로 조장 하고. 또 IL-1β 20 ng/ml + IL-17 10 ng/ml로 처리하여 관절 병인사이토카인이 추가되어 더 심각한 병인상태로 조장한 조건 각각에 SD282을 200, 500 및 1000 μM 각각 처리하고 24시간 배양 후 얻어진 supernatant에서 염증성 사이토카인인 IL-6의 발현을 ELISA로 측정 하였다.
그 결과 도 6에 나타낸 바와 같이, 대조군인 Vehicle 군과 비교하여, SD282를 처리한 연골세포주에서 IL-6의 발현이 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다.
<4-2> 골관절염 환자 연골세포주에서의 SD282의 MCP-1 억제 효과 확인
본 발명의 SD282가 Vehicle군과 비교하여, 골질환 인자인 MCP-1(monocyte chemoattractant protein 1)의 발현을 감소시키는지 확인하기 위하여, 상기 실시예 4-1의 연골세포주에, IL-1β를 20 ng/ml의 농도로 처리하고, SD282를 200, 500 및 1000 μM 각각 처리하여, MCP-1의 발현을 확인하였다. 또한 상기의 연골세포주에 IL-1β 20 ng/ml 및 IL-17 10 ng/ml을 처리하였으며, 상기와 동일한 농도의 SD282를 각각 처리하여, 24시간 배양후 supernatant를 얻어 MCP-1의 발현을 ELISA로 확인하였다.
그 결과, Vehicle 군과 비교하여, SD282를 처리하면, IL-1β 또는 IL-1β 및 IL-17에 의해 유도된 MCP-1의 발현이 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다(도 7).
<4-3> 골관절염 환자 연골세포주에서의 SD282의 IL-10 증가 효과 확인
본 발명의 SD282가 Vehicle군과 비교하여, 항염증 인자인 IL-10의 발현을 증가시키는지 확인하기 위하여, 상기 실시예 4-1의 연골세포주에, IL-1β를 20 ng/ml의 농도로 처리하고, SD282를 200, 500 및 1000 μM 각각 처리하여, IL-10의 발현을 확인하였다. 또한 상기의 연골세포주에 IL-1β 20 ng/ml 및 IL-17 10 ng/ml을 처리하였으며, SD282 1000 μM을 처리하여, 24시간 배양 후 IL-10의 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, Vehicle 군과 비교하여, SD282를 처리하면, IL-1β 또는 IL-1β 및 IL-17에 의해 감소된 IL-10의 발현이 농도의존적으로, 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다.
<4-4> 골관절염 환자 연골세포주에서의 SD282의 연골 재생인자 증가 확인
본 발명의 SD282가 Vehicle군과 비교하여, (단백 동화 경로, Anabolic pathway)인 TIMP1(Tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 1) 및 TIMP3의 발현을 증가시키는지 확인하기 위하여, 상기 실시예 4-1의 연골세포주에, IL-1β 20 ng/ml을 처리하고, SD282를 200, 500 및 1000 μM 각각 처리하여, TIMP1 및 TIMP3의 발현을 각각 real time PCR로 확인하였다.
그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, IL-1β의 처리로 감소된 연골 재생 인자인 TIMP1 및 TIMP3의 발현이 Vehicle 군과 비교하여, SD282를 처리한 군에서 유의적으로 증가한 것을 확인하였다.
<4-5> 골관절염 환자 연골세포주에서의 연골형성 마커 발현 확인
본 발명의 SD282가 Vehicle군과 비교하여 연골형성 마커의 발현을 증가시키는지 확인하였다. 구체적으로 연골 분화 마커로 알려진 SOX9(SRY-Box Transcription Factor 9)과 연골 매트리스 상호작용 인자인 Aggrecan의 발현을 확인하였다. 상기 실시예 4-1의 연골세포주에 IL-1β 20 ng/ml을 처리하고, SD282를 200, 500 및 1000 μM 각각 처리하여, real time PCR로 연골형성 마커인 SOX9 및 Aggrecan의 발현을 확인하였다. 또한, IL-1β 20 ng/ml 및 IL-17 10 ng/ml을 처리하고 SD282를 500 μM를 처리하여 연골형성 마커인 SOX9 및 Aggrecan의 발현을 추가로 확인하였다.
그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, 골관절염 환자 연골 세포주에서, IL-1β 또는 IL-1β 및 IL-17의 처리로 감소된 연골형성 마커인 SOX9 및 Aggrecan의 발현이 Vehicle 군과 비교하여, SD282을 처리한 군에서 유의적으로 증가되는 것을 확인하였다.
<실시예 5> 주사 투여(관절강 투여)와 경구 투여의 비교에 따른 SD282의 통증 제어효과 확인
본 발명의 SD282가 골관절염으로 유도되는 통증을 제어하는지 추가적으로 확인하였으며, 투여 방법(주사투여(관절강 투여) 및 경구 투여)에 따른 통증 제어를 비교하였다. 구체적으로, 상기 실시예 1에서와 같이, 관절염이 유도된 동물모델에 SD282를 25 mg/kg의 농도로 경구투여 한 후, Dynamic plantat aesthsiometer(Ugo Basile, Comerio, Italy)를 이용하여 통증을 측정하였다. 기계의 통증 측정 방법은 측정 기계 위에 그물로 된 판을 얹고 그 위에 아크릴로 된 동물고정틀 안에 렛트(rat)을 넣은 후, 측정기계로 약물이 주입된 오른발에 찔러 주었다. 찌른 후에 기계가 자동적으로 발을 떼는데 걸리는 시간(s, 초, Paw withdrawal latency)과 얼마만큼의 무게를 주었을 때 발을 떼는지(g, Paw withdrawal threshold)를 측정하여 그때 나오는 시간과 무게를 확인하였다. 또한, 관절염이 유도에 따른 무게 균형의 변화를 확인하기 위하여, 오른쪽 뒷다리의 무게(weight on right hind rimb)를 측정하여, 체중 대비 무게를 확인하였다. 대조군으로는 관절염을 유도하지 않은 정상 대조군(Healthy Control)과 관절염을 유도하고 약물을 처리하지 않은 Vehicle군을 이용하였다.
그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, 투여 방법 별로, 경구 투여한 동물모델의 Vehicle 군에서는 정상 대조군과 비교하여, Paw withdrawal latency, Paw withdrawal threshold 및 weight on right hind rimb가 현저히 감소하였으나, SD282를 경구 투여한 군에서는 Paw withdrawal latency, Paw withdrawal threshold 및 weight on right hind rimb가 유의적으로 증가하여, 관절염으로 유도된 통증이 개선되는 것을 확인하였다.
또한, 투여 방법별로, 주사 투여(관절강 투여)와 경구 투여군을 비교하였을 때, 약물 주입 7 ~ 8일 이후에서 주사 투여군의 Paw withdrawal latency는 15 초(S)로 유지되고, Paw withdrawal threshold 30 내지 35 g이였으나, 경구 투여군에서는 Paw withdrawal latency는 10 내지 12 초(S) 및 Paw withdrawal threshold 20 내지 25 g인 것을 확인 하여, 주사 투여군이 골관절염 유도 통증 개선에 더욱 효과적인 것을 확인하였다. 따라서, 신규한 동일 약물일지라도, 투여 방법에 따라 골관절염의 치료 효과에 차이가 있음을 확인하였다(도 1 및 도 11).
따라서, 본 발명의 신규한 화합물인 SD282는 골관절염이 유도된 렛트에 주사 투여 및 경구 투여하면, 골관절염에 의한 통증 정도가 감소하고, 연골 손상을 보호하는 것을 확인하였다. 또한, 염증인자인 IL-1β, IL-6 및 TNF-α의 발현과, 골질환 인자인 MCP-1의 발현을 억제하는 것을 확인하였다. 또한, 항염증 인자인 IL-10과, 연골 재생 인자인 TIMP1 및 TIMP3, 연골 형성 마커인 SOX9 및 Aggrecan의 발현을 증가시켜, 관절염으로 유도되는 연골 손상을 억제하는 것을 확인하였다.

Claims (14)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2022021385-appb-img-000006
    .
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 화합물은 관절 통증을 경감시키는 것을 특징으로 하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 화합물은 연골 손상을 억제하는 것을 특징으로 하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 화합물은 염증인자의 발현을 억제시키는 것을 특징으로 하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 염증인자는 IL-1β, IL-6 및 TNF-α로부터 이루어진 군에서 선택된 인자인 것을 특징으로 하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 화합물은 골질환 인자인 MCP-1(Monocyte Chemoattractant Protein-1)의 발현을 억제시키는 것을 특징으로하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 화합물은 항염증 인자인 IL-10의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 화합물은 연골 재생 인자인 TIMP1(Tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 1) 또는 TIPM3(Tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 3)의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. 제 1항에 있어서,
    상기 화합물은 연골 형성 마커인 SOX9(SRY-Box Transcription Factor 9) 또는 Aggrecan의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 제 1항에 있어서,
    상기 골질환은 골관절염(Osteoarthritis)인 것을 특징으로 하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  11. 제 1항에 있어서,
    상기 조성물은 멸균 주사용액, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀전, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제 또는 좌제로 이루어진 군에서 선택된 제형인 것을 특징으로 하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  12. 제 1항에 있어서,
    상기 조성물은 경구투여, 관절강주사, 정맥주사, 근육주사, 피하주사, 복강내주사로 이루어진 군에서 선택된 방법으로 투여되는 것을 특징으로 하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  13. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 골질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2022021385-appb-img-000007
    .
  14. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 골질환의 치료 방법:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2022021385-appb-img-000008
    .
PCT/KR2022/021385 2022-12-27 바이구아나이드 화합물 기반 관절질환 치료용 주사 치료제 조성물 WO2024143582A1 (ko)

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