WO2018056150A1 - 化合物又はその塩、抗炎症剤、肺がんに対する抗がん剤、化合物又はその塩の製造方法、炎症性疾患の治療方法及び肺がんの治療方法 - Google Patents

化合物又はその塩、抗炎症剤、肺がんに対する抗がん剤、化合物又はその塩の製造方法、炎症性疾患の治療方法及び肺がんの治療方法 Download PDF

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順博 戸田
康博 日高
明良 林
孝志 西澤
中村　振一郎
治 蟹江
芳樹 山口
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ティーエフケイ株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates

Definitions

  • the present invention relates to a compound or a salt thereof, an anti-inflammatory agent, an anticancer agent for lung cancer, a method for producing the compound or a salt thereof, a method for treating inflammatory diseases, and a method for treating lung cancer.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 Various anti-inflammatory agents and anti-cancer agents against lung cancer have been proposed (for example, see Non-Patent Documents 1 and 2).
  • an object of the present invention is to provide a new compound excellent in safety that can be used as an anti-inflammatory agent, an anticancer agent for lung cancer, and the like, and a method for producing the same.
  • the compound of the present invention or a salt thereof is a compound represented by the formula (A) or the formula (B) or a salt thereof.
  • X 1 is hexose or hydroxyl group
  • X 2 is a phosphate group or a hydroxyl group.
  • a method for producing the compound of the present invention or a salt thereof is obtained from at least one of Rhodobacter azotoforms BP0899 strain (Accession No. NITE BP-644) and a culture thereof using the formula (A) or the formula (B).
  • a crude extraction step of extracting a crude extract containing the compound represented by A purification step of isolating the compound represented by the formula (A) or the formula (B) or a salt thereof from the crude extract; It is characterized by including.
  • the present inventors have conducted a series of studies, and obtained a formula obtained from Rhodobacter azotoforms BP0899 strain (Accession No. NITE BP-644) or a culture thereof. It has been found that the compound represented by (A) or formula (B) or a salt thereof has an anti-inflammatory effect and an anti-cancer effect against lung cancer, and has reached the present invention.
  • the compound represented by formula (A) or formula (B) or a salt thereof is highly safe and can be administered over a long period of time.
  • FIG. 1 is a flowchart showing an example of a rough extraction step in the production method of the present invention.
  • FIG. 2 is a flowchart showing an example of the purification step in the production method of the present invention.
  • FIG. 3 is a graph showing the IL-8 concentration of the test solution in Example 3.
  • FIG. 4 is a graph showing the absorbance of the test solution in Example 4.
  • FIG. 5 is a graph showing the absorbance of the test solution in Example 5.
  • FIG. 6 is a graph showing the TNF- ⁇ concentration of the test solution in Example 6.
  • FIG. 7 is a graph showing the TNF- ⁇ concentration of the test solution in Example 7.
  • FIG. 8 is a graph showing the IL-6 concentration of the test solution in Example 8-1.
  • FIG. 9 is a graph showing the tumor volume of mice in Example 9.
  • FIG. 9 is a graph showing the tumor volume of mice in Example 9.
  • FIG. 10 is a mass spectrum when the methyl esterified product in Example 2 was subjected to GC-MS analysis.
  • FIG. 11 is a mass spectrum when the hydrolyzed methyl esterified product in Example 2 was subjected to GC-MS analysis.
  • FIG. 12 is a mass spectrum when the pyrrolidated product was subjected to GC-MS analysis in Example 2.
  • FIG. 13 is a mass spectrum when the hydrolyzed pyrrolidide-treated product in Example 2 was subjected to GC-MS analysis.
  • 14 is a mass spectrum when the compound of peak 4 in FIG. 12 was subjected to GC-MS analysis in Example 2.
  • FIG. FIG. 15 is a mass spectrum when the compound of peak D in FIG. 13 was subjected to GC-MS analysis in Example 2.
  • FIG. 16A is a part of the spectrum when the sample solution was subjected to 1 HNMR measurement in Example 2.
  • FIG. 16B is a part of the spectrum when the sample solution was subjected to 1 HNMR measurement in Example 2.
  • FIG. 16C is a part of the spectrum when the sample solution was subjected to 1 HNMR measurement in Example 2.
  • FIG. 16D is a part of the spectrum when the sample solution was subjected to 1 HNMR measurement in Example 2.
  • FIG. 17A is a part of the spectrum when the sample solution was subjected to 13 CNMR measurement in Example 2.
  • FIG. 17B is a part of the spectrum when the sample solution was subjected to 13 CNMR measurement in Example 2.
  • FIG. 17C is a part of the spectrum when the sample solution was subjected to 13 CNMR measurement in Example 2.
  • FIG. 17D is a part of the spectrum when the sample solution was subjected to 13 CNMR measurement in Example 2.
  • FIG. 18 is a spectrum when the sample solution was subjected to 31 PNMR measurement in Example 2.
  • FIG. 19 is a mass spectrum when the sample solution was subjected to GC-MS analysis in Example 2.
  • FIG. 21 is a mass spectrum when the sample solution was subjected to GC-MS analysis.
  • FIG. 24 was subjected to GC-MS / MS / MS / MS analysis in Example 2.
  • FIG. 27 is a graph showing the expression level of the PPAR ⁇ gene in Example 8-2.
  • FIG. 28 is a graph showing the gel filtration pattern of the sugar chain portion released by the 4 mol / L KOH treatment of the hydrazine degradation product in Example 2.
  • FIG. 29 is a spectrum obtained when the sample A was subjected to 1 HNMR measurement in Example 2.
  • FIG. 30 is a spectrum when the sample A was subjected to 2D DQF-COSY measurement in Example 2.
  • FIG. 31 is a spectrum when the sample A was subjected to 2D NOESY measurement in Example 2.
  • FIG. 32 is a spectrum obtained when the sample A was subjected to 2D 1 H- 31 P HMBC measurement in Example 2.
  • FIG. 33 is a schematic diagram of Sample A in Example 2.
  • the extraction process in the rough extraction step may be an extraction process using an organic solvent that insolubilizes proteins.
  • the extraction solvent may be phenol.
  • the color removal treatment of the dye may be a color removal treatment using at least one selected from the group consisting of acetone, methanol, and chloroform.
  • the crude extract may be filtered in the coarse extraction step.
  • the crude extract in the purification step, may be subjected to an enzyme treatment and an extraction treatment with an organic solvent that insolubilizes proteins.
  • the enzyme treatment may be an enzyme treatment with at least one of a nucleolytic enzyme and a proteolytic enzyme
  • the organic solvent may be phenol.
  • the extraction solution after the extraction treatment may be filtered.
  • the compound of the present invention or a salt thereof is a compound represented by the formula (A) or the formula (B) or a salt thereof.
  • the combination of X 1 and X 2 includes hexose and phosphate group, hydroxyl group and hydroxyl group, hexose and hydroxyl group, hydroxyl group and phosphate group, hexose and phosphate group.
  • a combination of a hydroxyl group and a hydroxyl group is preferred.
  • the compound of the present invention or a salt thereof is represented by the formula (A1) or the formula (B1) when X 1 and X 2 in the formula (A) or the formula (B) are hexose and phosphate groups, respectively. If X 1 and X 2 are both hydroxyl groups in formula (A) or formula (B), the compound represented by formula (A2) or formula (B2) or salt thereof Become.
  • the compound of the present invention or a salt thereof is also referred to as “the novel compound of the present invention”.
  • the novel compound of the present invention can be obtained, for example, by the production method described later. However, the manufacturing method described later is merely an example and does not limit the present invention.
  • the hexose may be, for example, glucose.
  • the novel compound of the present invention may be used for any application, but can be used, for example, as an anti-inflammatory agent described later, a material for an anti-cancer agent for lung cancer, and the like.
  • the novel compounds of the present invention include NF- ⁇ B (Nuclear Factor-kappa B), TNF- ⁇ (Tumor Necrosis Factor- ⁇ ), IL-6 (Interleukin-6) and the like. It has a function of suppressing the production of inflammatory cytokines.
  • the novel compound of the present invention also has a function of activating TLR4 (Toll-like receptor 4), which is a kind of Toll-like receptor, as demonstrated in Examples described later.
  • TLR4 Toll-like receptor 4
  • TLR4 Activation of TLR4 is known to promote the production of anti-inflammatory type I interferon (NinaNMaeshima and Rachel C. Fernandez, “Recognition of lipid A variants by the TLR4-MD-2 receptor complex”, Frontiers in Cellular and Infection Microbiology, February 2013, volume3, Article3, p.2, FIGURE 2). Therefore, the novel compound of the present invention has an anti-inflammatory effect. Furthermore, the novel compound of the present invention also has a function of suppressing the growth of lung cancer, as demonstrated in Examples described later.
  • the anti-inflammatory agent of the present invention suppresses inflammation due to the anti-inflammatory effect of the compound of the present invention or a salt thereof (the above-mentioned novel compound), and is not limited at all except that it contains the novel compound of the present invention.
  • diseases that can be suppressed by the anti-inflammatory agent of the present invention include inflammatory bowel diseases such as ulcerative colitis and Crohn's disease, inflammatory skin diseases such as psoriasis and dermatitis, encephalitis, hepatitis, nephritis, pneumonia, Examples include bronchitis, vasculitis, meningitis, thyroiditis, diabetes, inflammatory bile diseases, cancer with inflammation, etc., and are not particularly limited.
  • the analgesic effect of pain associated with inflammation is also exerted by the anti-inflammatory effect of the novel compound of the present invention.
  • the dosage form of the anti-inflammatory agent includes, for example, powders, fine granules, granules, tablets, coated tablets, capsules, troches, liquids and the like, and is not particularly limited.
  • the composition of the anti-inflammatory agent is not particularly limited, and in addition to the novel compound of the present invention, for example, excipients, binders, lubricants, disintegrants, absorption promoters, emulsifiers, stabilizers, antiseptics Various additives such as an agent may be included.
  • the said anti-inflammatory agent can be manufactured with the formulation technique etc. which are used normally.
  • the method for treating an inflammatory disease of the present invention includes a step of administering the anti-inflammatory agent of the present invention containing the novel compound.
  • “treatment” includes, for example, improving (improving) symptoms, eliminating (completely recovering) symptoms, preventing deterioration of symptoms, prevention, etc.
  • the animal species to which the anti-inflammatory agent is administered is not particularly limited, and examples thereof include humans, non-human mammals such as monkeys, cows, pigs, dogs, and cats, birds such as chickens, and seafood.
  • the administration method is not particularly limited, and examples thereof include oral administration and parenteral administration. Examples of the parenteral administration include transdermal absorption, injection, and suppository administration.
  • the dose of the anti-inflammatory agent can be appropriately set according to, for example, animal species, age, etc., and is not particularly limited.
  • the anticancer agent for lung cancer of the present invention suppresses the growth of lung cancer by the anticancer effect of the compound of the present invention or a salt thereof (the above-mentioned novel compound) against lung cancer, and contains the novel compound of the present invention.
  • the method for treating lung cancer of the present invention includes a step of administering an anticancer agent for lung cancer of the present invention comprising the novel compound.
  • the dosage form of the anticancer agent, the animal species to which the anticancer agent is administered, and the method for administering the anticancer agent include the dosage form of the antiinflammatory agent, the animal species to which the antiinflammatory agent is administered, and the anticancer agent. This is the same as the method for administering the inflammatory agent.
  • the method of producing the compound of the present invention or a salt thereof is produced from at least one of Rhodobacter azotoformans BP0899 strain (Accession No. NITE BP-644) and its culture.
  • the crude extraction step is represented by the formula (A) or the formula (B) from at least one of Rhodobacter azotoforms BP0899 strain (Accession No. NITE BP-644) and its culture. This is a step of extracting a crude extract containing the compound to be prepared or a salt thereof.
  • At least one of the Rhodobacter azotoforms BP0899 strain (Accession No. NITE BP-644) and its culture will be described.
  • At least one of the Rhodobacter azotoforms BP0899 strain (Accession No. NITE BP-644) and the culture thereof preferably have the following mycological characteristics (1) to (30).
  • the BP0899 strain was deposited under the accession number NITE P-644 at the Patent Organism Depositary Center of the National Institute of Technology and Evaluation (2-5-8 Kazusa-Kamashita, Kisarazu City, Chiba, Japan) (Accession date: 2008) In addition, the deposit was made internationally under the deposit number NITE BP-644 (transfer date: October 27, 2010).
  • the base sequence of 16S rRNA of the BP0899 strain is preferably the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • At least one of the BP0899 strain and its culture may further exhibit, for example, the properties shown in the following table (31) under aerobic culture conditions in a dark place.
  • Table (31) under aerobic culture conditions in a dark place.
  • “ ⁇ ” indicates no production
  • “+” indicates production.
  • the mycological characteristics may be evaluated, for example, from the result of further main culture after pre-culture.
  • the preculture may be performed, for example, by inoculating the BP0899 strain on a normal agar medium and culturing at 30 ° C. for 24 hours.
  • the conditions of the main culture can be appropriately set according to the evaluation method of each mycological feature.
  • the culture conditions of (1) to (5) are, for example, aerobic culture in a dark place at 30 ° C. using a normal agar medium, and the culture conditions of (6) to (7) Is, for example, an anaerobic culture at 30 ° C.
  • the culture conditions of (8) to (12) are, for example, each medium, preferably at 30 ° C. in a dark place.
  • (13), (14), (16), (17), (19) to (23), (25) oxidation test, (26), (29), (30) and (30) 31) is an aerobic culture in the dark, for example, the fermentation test of (15), (18), (24), (25), and (27) and (28) are, for example, in the dark Anaerobic culture.
  • the method for testing these mycological characteristics is not particularly limited, and a conventionally known method can be employed. Specifically, for example, Barrow G. et al. I. And Feltham R .; K. A.
  • Denitrification reaction is positive if growth and gas formation are observed under anaerobic culture conditions using 1% sodium nitrate broth.
  • a gas generation and a dark blue color determined under anaerobic culture conditions using the above-mentioned Giltay medium (pH 7.0 to 7.2) containing a Durham tube is positive as a denitrification reaction. To do.
  • the said Giltay medium is liquid A (KNO 3 1 g, asparagine 1 g, 1% bromothymol blue alcohol solution 5 mL and distilled water 500 mL) and liquid B (sodium citrate 8.5 g, MgSO 4 .7H 2 O 1 g, FeCl 3 ⁇ 6H 2 O 0.05 g, KH 2 PO 4 1 g, CaCl 2 ⁇ 6H 2 O 0.2 g and distilled water 500 mL).
  • At least one of the BP0899 strain and its culture may further have the following mycological characteristics (32) to (40), for example.
  • the method for testing the mycological characteristics of (32) to (40) is not particularly limited, and a conventionally known method can be adopted. Specifically, for example, the methods described in the above-mentioned documents and the like can be mentioned. Moreover, you may use a commercially available bacteria identification kit for the said test method, for example. Although it does not restrict
  • the collection source of the BP0899 strain is not particularly limited, and examples thereof include soil, seawater, river water, lake water, and marsh water.
  • examples of the soil include, but are not limited to, land, sea bottom, river bottom, lake bottom and marsh bottom soil, sand, and mud.
  • a method for isolating the BP0899 strain for example, a conventionally known collection method, culture method and the like can be used, and there is no particular limitation.
  • the isolation method for example, when the collection source is lake water, the collected lake water is filtered through a filter or the like, the filtrate is cultured on an agar medium or the like, and the BP0899 strain is isolated from the obtained colony. Good.
  • the collection source is mud
  • the collected mud is suspended in a buffer solution, etc., and then the suspension is centrifuged, and the obtained supernatant is cultured on an agar medium or the like.
  • the BP0899 strain may be isolated.
  • the isolated BP0899 strain may be further cultured in a liquid medium, for example.
  • the medium is not particularly limited.
  • a medium containing a lower fatty acid, a medium added with malic acid, a culture medium 802 “DAIGO” (manufactured by Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.) (Hiraishi and Kitagawa, Bulletin of the Japan Society of Scientific Fisheries, 1984, 50, 11, p. 1929-1937), modified MYS medium, growth medium and the like preferably, a medium containing lower fatty acids, Malic acid-added medium, L-dried culture medium 802 “DAIGO” (manufactured by Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.).
  • Examples of the lower fatty acid-added medium and malic acid-added medium include a medium obtained by adding biotin, vitamin B 1 , nicotinic acid, a lower fatty acid, or a sodium salt of malic acid to the basal medium shown in Table 1 below. Although it does not restrict
  • modified MYS medium and the growth medium include media having the compositions shown in Tables 2 and 3 below.
  • the temperature range is not particularly limited, but is, for example, 23 to 39 ° C. or 30 ° C.
  • the pH range is not particularly limited, but is, for example, pH 5.5 to 8.5, 6.0 to 8.5, or 7.0.
  • the culture may be performed, for example, under an aerobic condition or an anaerobic condition, and is not particularly limited, but is preferably an anaerobic condition.
  • the light conditions during the culture are not particularly limited, and may be, for example, dark conditions or illumination conditions, but preferably under an illuminance of 2000 lux to 10000 lux.
  • the culture may be performed, for example, in a sealed illumination type culture tank. Moreover, you may culture
  • the culture time is not particularly limited, and may be, for example, until the growth of the BP0899 strain reaches a stationary phase.
  • the culture time may be, for example, 72 hours.
  • the 16S rRNA base sequence of the BP0899 strain is preferably the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the base sequence of the 16S rRNA can be determined, for example, by extracting DNA from the BP0899 strain isolated and cultured by the method described above and using a primer or the like.
  • the method for extracting the DNA and determining the base sequence can be, for example, a conventional method and is not particularly limited.
  • the primer is not particularly limited, and examples thereof include the following primers.
  • Examples of the culture of the BP0899 strain include, but are not limited to, the cells of the BP0899 strain, the culture supernatant of the BP0899 strain, the cell extract of the BP0899 strain, and the like.
  • the culture may be, for example, a processed product of the bacterial cell, a processed product of the culture supernatant, a processed product of the bacterial cell extract, or the like, and is not particularly limited.
  • the treated product is not particularly limited.
  • the culture concentrate dried product, lyophilized product, solvent-treated product, surfactant-treated product, enzyme-treated product, protein fraction product, and sonicated product. , Milled products and the like.
  • the culture is, for example, a mixture of the cells, the culture supernatant, the cell extract, the processed product of the cell, the processed product of the culture supernatant, the processed product of the cell extract, etc. But you can.
  • the mixture can be mixed in any combination and ratio, and is not particularly limited.
  • the combination is not particularly limited, and examples thereof include a mixture of the cells and the culture supernatant.
  • the rough extraction process of the present example includes a decoloring process (step S11), an extraction process (step S12), and a filtering process (step S13).
  • step S11 First, the Rhodobacter azotoforms BP0899 strain (Accession No. NITE BP-644) or its culture is subjected to a decolorization treatment of the dye.
  • the color removal treatment of the dye is not particularly limited, and examples thereof include a color removal treatment with an organic solvent. Examples of the organic solvent include acetone, methanol, chloroform, and mixed solvents thereof.
  • the decolorization treatment can be performed, for example, by mixing the cells or the culture with the organic solvent.
  • acetone 25 mL to 150 mL of acetone is added to 10 to 60 g of lyophilized cells of the BP0899 strain in a beaker, and the mixture is sufficiently stirred using a stirrer.
  • the supernatant of the stirred solution is transferred to a 50 mL conical tube and centrifuged at 2000 rpm to 5000 rpm for 5 minutes to 10 minutes.
  • the resulting supernatant is removed, and 20 mL to 40 mL of acetone is added to the precipitate.
  • This operation is repeated until the color (brown) of the BP0899 strain is no longer visually recognized, and then the precipitate is dried under reduced pressure using an aspirator until a constant weight is obtained, thereby obtaining a decolored dry cell. .
  • step S12 the cell or culture after the decolorization treatment is treated with an organic solvent that insolubilizes the protein to remove the protein.
  • the organic solvent include phenol.
  • the extraction treatment for example, the cells or culture are mixed with the organic solvent and an aqueous solvent, and the protein insolubilized with the organic solvent is distributed to the phase of the organic solvent.
  • water for injection is added to 10 g to 60 g of decolorized dry cells in the beaker so that the concentration of the decolorized dry cells is 60 mg / mL to 90 mg / mL.
  • step S13 Next, the aqueous phase obtained by the extraction treatment is filtered, and the organic solvent mixed in the aqueous phase (organic solvent such as phenol used in the extraction treatment) is removed.
  • the filtration include ultrafiltration.
  • the molecular weight cut-off in the filtration is, for example, 7000, and it is preferable to remove molecules less than the molecular weight cut-off.
  • the recovered aqueous phase is put in a dialysis tube having a molecular weight cut off of 7000, and the external liquid is distilled water 1 L to 10 L, and dialysis is performed. The dialysis is repeated until the outer liquid no longer absorbs light at 270 nm, which is the absorption wavelength of phenol, and the inner liquid is recovered as a crude extract containing the novel compound of the present invention.
  • the purification process of the present example includes an enzyme treatment (step S21), an extraction treatment (step S22), and a filtration treatment (step S23).
  • Enzyme treatment is performed on the crude extract containing the novel compound of the present invention obtained in the crude extraction step.
  • the enzyme treatment is not particularly limited, and examples thereof include a treatment with a nucleolytic enzyme and a treatment with a proteolytic enzyme, which may be either one or both treatments. In the latter case, the order is not particularly limited. For example, after treatment with a nucleolytic enzyme, treatment with a proteolytic enzyme can be performed.
  • the nucleolytic enzyme is not particularly limited, and examples thereof include RNA degrading enzymes and DNA degrading enzymes.
  • the RNase is not particularly limited, and for example, Ribonuclease A manufactured by Sigma, Ribonuclease A manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ribonuclease A manufactured by Roche, and the like can be used.
  • the DNA degrading enzyme is not particularly limited, and for example, Deoxyribonuclease I from Sigma, Deoxyribonuclease I from Wako Pure Chemical Industries, Deoxyribonuclease I from Roche, etc. can be used.
  • 0.2 mg / mL to 1 mg / mL RNase and 1 ⁇ g / mL to 10 ⁇ g / mL DNA-degrading enzyme are added to the crude extract at 30 ° C. to 40 ° C. Incubate for 4-24 hours.
  • the proteolytic enzyme is not particularly limited.
  • Proteinase® K manufactured by Sigma, Proteinase® K manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Proteinase® K manufactured by Roche, and the like can be used.
  • 100 ⁇ g / mL to 300 ⁇ g / mL of proteolytic enzyme is added to the crude extract and incubated at 40 ° C. to 50 ° C. for 2 hours to 24 hours.
  • step S22 the crude extract is treated with an organic solvent that insolubilizes the protein to remove the protein.
  • the organic solvent include phenol.
  • the enzyme-treated extract is centrifuged under the conditions of 2000 rpm to 5000 rpm for 20 minutes to 60 minutes.
  • the precipitate fraction is put into an ultrafiltration tube having a molecular weight cut off of 50,000 to 100,000, and the external solution is distilled water. Make 5 to 15 mL and perform ultrafiltration.
  • the aqueous phase obtained after separating into a phase and an aqueous phase is collected in a 50 mL conical tube, and the phenol phase remaining in the centrifuge tube is charged with an amount of water for injection equivalent to the recovered aqueous phase,
  • the same operation as the first extraction is repeated (second extraction). Further, the same operation as the first extraction is repeated once more (third extraction). In this manner, a total of 60 mL to 120 mL of the aqueous phase of the three extraction operations is collected.
  • step S23 Next, the aqueous phase obtained by the extraction treatment is filtered, and the organic solvent mixed in the aqueous phase (organic solvent such as phenol used in the extraction treatment) is removed.
  • organic solvent such as phenol used in the extraction treatment
  • the filtration include ultrafiltration.
  • the fractionated molecular weight in the filtration is, for example, 50,000 to 100,000, and it is preferable to remove molecules less than the fractionated molecular weight.
  • the recovered aqueous phase is put into a dialysis tube having a molecular weight cut off of 7000, and the external solution is distilled water of 0.5 L to 1 L, and dialysis is performed for 24 hours to 96 hours.
  • the obtained internal solution is put into an ultrafiltration tube having a molecular weight cut off of 50,000 to 100,000, and the external solution is made 5 mL to 15 mL of distilled water, and ultrafiltration is performed.
  • a compound represented by the formula (A) or the formula (B) or a salt thereof, which is a novel compound of the present invention is obtained.
  • Example 1 The compound represented by Formula (A) and the compound represented by Formula (B) were manufactured by the following method.
  • step S11 Decoloring process 50 mL of acetone was added to 20.03 g of lyophilized cells of the BP0899 strain in a beaker, and the mixture was stirred for 10 minutes using a stirrer. Next, the supernatant of the stirred solution is transferred to a 50 mL conical tube, centrifuged at 2000 rpm for 5 minutes, the resulting supernatant is removed, 20 mL of acetone is added to the precipitate, and the mixture is returned to the beaker. It was. This operation was repeated until the color (brown color) of the BP0899 strain was not visually recognized. And the decolored deposit was dried under reduced pressure until it became constant weight using the aspirator, and the decolorized dry microbial cell was obtained.
  • step S12 Water for injection was added to 16 g of the decolorized and dried cells in a beaker so that the concentration of the decolorized and dried cells was 75 mg / mL. Next, 90% phenol was added in an amount equivalent to the water for injection, and the mixture was stirred on a hot stirrer at 65 ° C. to 70 ° C. for 30 minutes, and this was the first extraction. Then, after cooling the stirred solution to 10 ° C. or lower, it is separated into a phenol phase and an aqueous phase by centrifuging using a centrifuge tube at 15000 rpm for 40 minutes at 4 ° C.
  • the obtained aqueous phase is recovered in a 50 mL conical tube, and the phenol phase remaining in the centrifuge tube is charged with an amount of water for injection equivalent to the recovered aqueous phase, and the same operation as the first extraction is performed. Repeated (second extraction). Further, the same operation as the first extraction was repeated once more (third extraction). In this way, 450 mL of the aqueous phase for three extraction operations was recovered.
  • Step S13 450 mL of the recovered aqueous phase was placed in a dialysis tube having a molecular weight cut off of 7000, and the external solution was 2.5 L of distilled water, followed by dialysis. The dialysis is carried out 22 times until the absorption of light at 270 nm, which is the absorption wavelength of phenol, is not observed in the external liquid, and the crude extraction containing the compound represented by formula (A) and the compound represented by formula (B) 75 mL of internal liquid which is a liquid was collect
  • step S21 Enzyme treatment
  • 0.5 mg / mL RNase (trade name: Sigma) is added to the crude extract containing the compound represented by formula (A) and the compound represented by formula (B) obtained in the crude extraction step.
  • Ribonuclease A) and 5 ⁇ g / mL DNA-degrading enzyme (Deoxyribonuclease I manufactured by Sigma) were added and incubated at 37 ° C. for 6 hours.
  • 200 ⁇ g / mL proteolytic enzyme Proteinase K manufactured by Sigma was added to the crude extract, incubated at 50 ° C. for 4 hours, and then centrifuged at 3000 rpm for 30 minutes.
  • step S22 Extraction process (step S22) Among the precipitate fraction of about 3 mL or less and the supernatant fraction of about 72 mL obtained by centrifugation in the enzyme treatment, the precipitate fraction is put into an ultrafiltration tube having a molecular weight cut off of 100,000, and the external solution is distilled. Ultrafiltration was performed using 15 mL of water. 30 mL of water for injection and 30 mL of 90% phenol were added to the obtained internal solution, and the mixture was stirred at 65 ° C. to 70 ° C. for 30 minutes on a hot stirrer. Then, after cooling the stirred solution to 10 ° C.
  • aqueous phase is separated into a phenol phase and an aqueous phase by centrifuging using a centrifuge tube at 15000 rpm for 40 minutes at 4 ° C.
  • the obtained aqueous phase is recovered in a 50 mL conical tube, and the phenol phase remaining in the centrifuge tube is charged with an amount of water for injection equivalent to the recovered aqueous phase, and the same operation as the first extraction is performed. Repeated (second extraction). Further, the same operation as the first extraction was repeated once more (third extraction). In this manner, 80 mL of the aqueous phase for three extraction operations was recovered.
  • Step S23 The recovered aqueous phase was put into a dialysis tube having a molecular weight cut off of 7000, and the external liquid was 1 L of distilled water, followed by dialysis for 72 hours.
  • the obtained inner liquid was put into an ultrafiltration tube having a fractional molecular weight of 100,000, and the outer liquid was made 15 mL of distilled water, and ultrafiltration was performed.
  • the obtained internal solution was freeze-dried to obtain 164.53 mg of a purified product.
  • Example 2 The purified product was subjected to mass spectrometry and nuclear magnetic resonance (NMR) to identify its structure.
  • the degradation products were each subjected to the following treatments to prepare four types of sample solutions: methyl esterification treatment products, pyrrolidation treatment products, hydrolysis methyl esterification treatment products, and hydrolysis pyrrolidation treatment products.
  • FIG. 10 is a mass spectrum when the methyl esterified product is subjected to GC-MS analysis
  • FIG. 11 is a mass spectrum when the hydrolyzed methyl esterified product is subjected to GC-MS analysis. is there. 10 and 11, the vertical axis represents the detection intensity, and the horizontal axis represents the detection time (min).
  • peaks 1 to 11 were obtained from the methyl esterified product.
  • the compounds of peaks 1, 2, 4, 6 and 7 having high detection intensity were further subjected to GC-MS analysis under the same conditions as described above.
  • a library having a mass spectrum similar in shape to the obtained mass spectrum was searched by Auto Mode of a database (The NIST MassSpectral Seach Program for the NIST / EPA / NIH Mass Spectral Library).
  • the compounds of peaks 1, 2, 4 and 7 showed a high degree of similarity with the compounds of formulas (2) to (5), respectively.
  • the present inventors have found that the mass spectrum of the compound of peak 6 is Slingermatter et al. (Strittmatter W.
  • peaks A to I were obtained from the hydrolyzed methyl esterified product.
  • peaks A, B, and D are confirmed in FIG. 11 as peaks corresponding to the peaks 1, 2, and 4 of FIG. .
  • Each of these peaks A, B and D was further subjected to GC-MS analysis under the same conditions as described above.
  • a structure having a mass spectrum similar in shape to the obtained mass spectrum was searched using the database.
  • the peaks A, B, and D showed a high degree of similarity with the compounds of formula (7), formula (3), and formula (4), respectively.
  • FIG. 10 shows the result of subjecting the decomposed product to GC-MS analysis without hydrolysis
  • FIG. 11 shows only the substance separated by hydrolysis after hydrolysis of the decomposed product.
  • the peak confirmed in FIG. 11 is considered to be a peak of a compound having an ester bond that is hydrolyzed in the decomposition product. Therefore, it is presumed that the compounds of peaks 6 and 7 in FIG. 10 in which the corresponding peak in FIG. 11 was not confirmed are compounds having no ester bond to be hydrolyzed.
  • the compound of peak 1 in FIG. 10 was estimated to be the compound of formula (2) as a result of library search.
  • the compound of peak 1 is the compound of formula (2)
  • the peak should be observed at a shorter retention time (that is, the left side) than peak 1 in FIG.
  • the compound of peak A in FIG. 11 corresponding to peak 1 in FIG. 10 was estimated to be a compound of formula (7) as a result of library search.
  • the compound of peak A is the compound of formula (7), it is consistent with the result of peak A in FIG.
  • the compound of peak 1 in FIG. 10 was estimated to be the compound of formula (7).
  • the compound of peak 2 in FIG. 10 was estimated to be BHT (dibutylhydroxytoluene) of formula (3) as a result of library search.
  • the compound of peak B in FIG. 11 corresponding to peak 2 in FIG. 10 is also estimated to be BHT (dibutylhydroxytoluene) of formula (3) as a result of library search, as shown in FIG. 10 and FIG. The result was consistent with 11. For this reason, the compound of peak 2 in FIG.
  • BHT dibutylhydroxytoluene
  • the compound of peak 4 in FIG. 10 was estimated to be the compound of formula (4) as a result of library search.
  • the compound of peak D in FIG. 11 corresponding to peak 4 in FIG. 10 was also estimated to be a compound of formula (4) as a result of library search. For this reason, it was estimated that the compound of the peak 4 in FIG. 10 is a compound of Formula (4).
  • FIG. 12 is a mass spectrum when the pyrrolidide-treated product is subjected to GC-MS analysis
  • FIG. 13 is a mass spectrum when the hydrolyzed pyrrolidide-treated product is subjected to GC-MS analysis. 12 and 13, the vertical axis indicates the detection intensity, and the horizontal axis indicates time (min).
  • the decomposition product contains four types of compounds of formulas (4) to (7). Further, as described above, the compounds of formula (5) and formula (6) were analyzed by GC-MS analysis on only the substance obtained by hydrolysis of the decomposition product as described above. As a result, no peak was confirmed in FIG. It was estimated that the compound did not have
  • FIGS. 16A to 16D are spectra of 1 HNMR measurement
  • FIGS. 17A to 17D are spectra of 13 CNMR measurement
  • FIG. 18 is a spectrum of 31 PNMR measurement. 16 to 18, the vertical axis indicates the detected intensity, and the horizontal axis indicates the chemical shift value (ppm).
  • the decomposition product was a compound of the formula (9) containing the four kinds of compounds and two molecules of glucosamine.
  • the four compounds bonded to two molecules of glucosamine are, from the left, the compound of the formula (7), the compound of the formula (5), the compound of the formula (4), and the formula (7 ) And the compound of formula (6).
  • the numbers in the formula (9) correspond to the peak numbers in the spectrum of 1 HNMR measurement in FIG. 16, and the alphabet (upper case) in the formula (9) indicates the peak in the spectrum of 13 CNMR measurement in FIG.
  • the alphabet (lower case) in the formula (9) corresponds to the alphabet (lower case) of the peak in the spectrum of 31 PNMR measurement of FIG.
  • the solution obtained by diluting the chloroform solution prepared in (1) above so as to have a concentration of 30 mg / mL 40000 times with methanol was used as a sample solution and subjected to GC-MS analysis under the following conditions.
  • FIG. 19 is a mass spectrum when the sample solution was subjected to GC-MS analysis.
  • the vertical axis indicates the detected intensity
  • the horizontal axis indicates the m / z value.
  • the vertical axis indicates the detected intensity
  • the horizontal axis indicates the m / z value
  • the numerical value in parentheses indicates the m / z value.
  • the compound of peak 1 was estimated to be the compound of formula (9) as described above. Since the difference value obtained by subtracting the m / z value (1229) of the peak 2 from the m / z value (1417) of the peak 1 is 188, the compound of the peak 2 has a molecular weight of about 188 from the decomposition product. It was estimated that the compound of (7) was a separated compound. In the compound of peak 3, the difference value obtained by subtracting the m / z value (1194) of peak 3 from the m / z value (1417) of peak 1 is 223, so that the molecular weight is about 223 from the decomposition product. It was estimated that the compound of (4) was a separated compound.
  • the compound of peak 4 Since the compound of peak 4 has a difference value obtained by subtracting the m / z value (1042) of peak 4 from the m / z value (1417) of peak 1 is 375, the molecular weight is about 188 from the decomposition product. It was estimated that the compound of (7) was a separated compound. As described above, the compounds obtained by separating the compound of the formula (7) or the compound of the formula (4) from the compound of the formula (9) were confirmed as peaks 2 to 4. From this, it can be confirmed that the decomposition product contains at least two of the compound of formula (7) and the compound of formula (4), and the decomposition product estimated in the above (2). A result further supporting the estimated structural formula (9) was obtained.
  • FIG. 21 is a mass spectrum when the sample solution was subjected to GC-MS analysis.
  • the vertical axis indicates the detection intensity
  • the horizontal axis indicates the m / z value
  • the numerical value in parentheses indicates the valence of the ion to be detected.
  • FIGS. 22 to 26 show schematic diagrams of compounds presumed to correspond to each peak in addition to the mass spectrum.
  • P is the structural formula of Formula (10)
  • Hex is the structural formula of Formula (11)
  • Kdo is the structural formula of Formula (12)
  • HexU is the structure of Formula (13).
  • HexN represents the structural formula of formula (14)
  • F represents any of the four compounds estimated in the above (2).
  • Hex is glucose (Glc).
  • the latter phosphate group was specified as the correct structure for the following reason. That is, in the above (2), the purified product is subjected to a predetermined treatment to obtain the decomposed product. When a weak acid is used in this process, it is bound to glucosamine on the right side of two glucosamine molecules. This is because it is generally known that the phosphate group is dropped and replaced with the —OH group frequently.
  • sample A A collection of Fraction No. 14-18 in FIG. 28 (dry weight 4.8 mg) was dissolved in 500 ⁇ L of D 2 O (99.96% D), and a sample for NMR measurement (hereinafter referred to as “sample A”). Said.) NMR measurement was carried out under the following conditions.
  • Measurement condition Equipment: DRX500 and ADVANCE600 spectrometer (BrukerBioSpin) Probe: cryogenic TXI probe, TXI probe and BBO probe Probe temperature: 25 ° C Measurement method: 1D 1 H, 1D 1 H-selective TOCSY, 1 H-selective NOESY, 1 H-selective ROSEY, 1D 13 C, 1D 31 P, 2D 1 H- 1 H DQF-COSY, HOANA, NOESY, ROESY, 1 H- 13 C HSQC-TOCSY, 1 H- 13 C HSQC-NOESY, 1 H- 13 C HMBC, 1 H- 31 P HMBC
  • a signal (H1) derived from the anomeric position of each sugar residue is identified, and the signal within the residue (from the DQF-COSY, HOHANA, 1 H- 13 C HSQC-TOCSY spectrum ( H2-H6 was identified for glucose and glucosamine residues, and H2-H5) for glucuronic acid residues.
  • the results are shown in FIG. 29 and FIG. FIG. 29 is a spectrum when the sample A is subjected to 1 HNMR measurement
  • FIG. 30 is a spectrum when the sample A is subjected to 2D DQF-COSY measurement. 29 and 30, Glc is Hex in FIGS. 22 to 26, KDO is Kdo in FIGS. 22 to 26, GlcA is HexU in FIGS.
  • FIG. 31 is a spectrum when the sample A was subjected to 2D NOESY measurement.
  • the binding mode ( ⁇ / ⁇ ) of each sugar residue was determined by 1 J (C1, H1) as follows. 1 J (C1, H1) GlcN-1 174 Hz ( ⁇ ) GlcN-2 164 Hz ( ⁇ ) GlcA 171 Hz ( ⁇ ) Glc-1 173 Hz ( ⁇ ) Glc-2 171 Hz ( ⁇ )
  • FIG. 32 is a spectrum obtained when the sample A was subjected to 2D 1 H- 31 P HMBC measurement.
  • the two phosphate groups one was attached to position 1 of GlcN-1, and the other was attached to position 4 of GlcN-2.
  • the structure of the sample A was specified as shown in the schematic diagram of FIG. From this result, the compound before the hydrazine decomposition of the hydrazine decomposition product obtained in the above (4) is a compound in which X 1 and X 2 are both hydroxyl groups in the formula (A) and the formula (B) (formula (A2 ) And a compound represented by formula (B2)).
  • the structural formulas of these compounds using the monosaccharide symbols are as follows. Note that FIG. 33 shows a sugar chain structural formula based on a chair-type conformation.
  • Compound represented by formula (A2) Compound represented by formula (B2)
  • Example 3 It was confirmed that the compound represented by the formula (A1), the compound represented by the formula (B1), the compound represented by the formula (A2), and the compound represented by the formula (B2) have an anti-inflammatory effect. .
  • Example 1 Preparation of test solution Purified product obtained in Example 1 (compound represented by formula (A1), compound represented by formula (B1), compound represented by formula (A2) and formula (B2)
  • a solution of the compound represented by formula (1) is dissolved in water for injection to a concentration of 2 mg / mL and stored at 4 ° C., heated at 37 ° C. for 5 minutes, and subjected to ultrasonic waves at 37 ° C. for 1 minute. Processed. 10 ⁇ L of the solution after the ultrasonic treatment is added to 990 ⁇ L of a culture solution having the following composition and mixed well to prepare a solution having a concentration of the purified product of 20000 ng / mL.
  • a total of 6 types of test liquids 2000 ng / mL, 200 ng / mL, 20 ng / mL, 2 ng / mL and 0.2 ng / mL, were obtained.
  • the final concentrations of the purified products are 10,000 ng / mL, 1000 ng / mL, 100 ng / mL, 10 ng / mL, 1 ng / mL and 0.1 ng / mL.
  • DMEM medium 500mL Fetal calf serum 55.5mL Penicillin-streptomycin-glutamine (100 ⁇ ) 5.6 mL
  • test solution The culture solution is added to human fetal kidney cells (InvivoGen) into which human TLR4 gene has been introduced to prepare a solution with a concentration of 4 ⁇ 10 5 cells / mL. did.
  • the solution was seeded in a 96-well flat-bottom plate at 100 ⁇ L (ie, 4 ⁇ 10 4 cells / 100 ⁇ L / well). After seeding, the cells were cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 for 24 hours, and then the culture supernatant was removed, and 100 ⁇ L of fresh culture solution was added to each well. Next, 100 ⁇ L of the test solution was added to each well. After the addition of the test solution, the cells were cultured at 37 ° C. and 5% CO 2 for 24 hours.
  • the vertical axis indicates the concentration of IL-8
  • the horizontal axis indicates the concentration of the test solution.
  • the concentration of IL-8 increased depending on the concentration of the test solution.
  • the production amount of IL-8 is generally known to be an indicator of TLR4 activation, and as described above, the activation of TLR4 is a type I interferon having anti-inflammatory action. It has been reported to promote production. That is, an increase in the concentration of IL-8 means activation of anti-inflammatory action. Therefore, from these results, the purified product (the compound represented by the formula (A1), the compound represented by the formula (B1), the compound represented by the formula (A2), and the formula (B2) is represented.
  • Example 4 It was confirmed that the compound represented by the formula (A1), the compound represented by the formula (B1), the compound represented by the formula (A2), and the compound represented by the formula (B2) have an anti-inflammatory effect. .
  • test solution a solution having a concentration of the purified product of 20000 ng / mL was prepared, and this was designated as a culture solution having the following composition: In total, two types of test liquids of 100 ng / mL and 10000 ng / mL were obtained. In addition, since the two types of test solutions are diluted 100-fold when added to cells, the final concentrations of the purified products are 1 ng / mL and 100 ng / mL, respectively.
  • composition of culture solution RPMI1640 medium 500mL Non-immobilized fetal bovine serum 55.5 mL Penicillin-streptomycin-glutamine (100 ⁇ ) 5.6 mL
  • test solution The culture solution was added to mouse macrophage cells (RAW264.7, ATCC) to prepare a solution having a concentration of the cells of 1.067 ⁇ 10 6 cells / mL.
  • the solution was seeded in a 6-well plate at 3 mL (that is, 3.2 ⁇ 10 6 cells / 3 mL / well). After seeding, the cells were cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 for 2 hours, and 30 ⁇ L of the test solution was added to each well. After the addition of the test solution, the cells were cultured at 37 ° C. and 5% CO 2 for 24 hours. Next, the culture supernatant of each well was collected in a 15 mL tube.
  • recovered to the said 15 mL tube was repeated twice. Thereafter, the culture solution collected in the 15 mL tube is centrifuged at 1000 rpm for 3 minutes, and then the supernatant is removed. Further, 3 mL of a new culture solution at 37 ° C. is added and suspended, and again. Centrifugation was performed under the same conditions. After centrifugation, the supernatant was removed, and 2 mL of the new culture solution at 37 ° C. was added and suspended in the precipitate. Then, 2 mL of the suspension was added to each well in a state where 1 mL of the new culture solution was previously added.
  • culture solution addition step After the addition, after culturing at 37 ° C. under 5% CO 2 for 30 minutes, the culture supernatant of each well is collected in a 15 mL tube, centrifuged at 1000 rpm for 3 minutes, and the supernatant is removed by an aspirator. did. Further, 3 mL of cooled PBS (Phosphate buffered saline) / Phosphatase Inhibitors solution was added to each well of the 6-well plate from which the culture supernatant had been removed, the cells were detached by pipetting, and the cell suspension was put into the 15 mL tube. Added.
  • PBS Phosphate buffered saline
  • the 15 mL tube was centrifuged at 1000 rpm for 3 minutes, the supernatant was removed by an aspirator, and then the PBS / Phosphatase Inhibitors solution 0.5 mL was added to the 15 mL tube and suspended.
  • a cell suspension was prepared. Nuclear protein was extracted from the cell suspension using a Nuclear Extract kit (manufactured by Active Motif).
  • the confirmation result is shown in the graph of FIG.
  • the vertical axis indicates the absorbance
  • the horizontal axis indicates the concentration of the test solution.
  • the absorbance became lower as the concentration of the test solution was higher. Therefore, it was found that the amount of NF- ⁇ B in the nucleoprotein decreased as the concentration of the test solution was higher. It was. From this result, production of NF- ⁇ B, which is a kind of inflammatory cytokine, is suppressed by the purified product, that is, the purified product (compound represented by formula (A1), represented by formula (B1)). It was confirmed that the compound, the compound represented by the formula (A2) and the mixture represented by the formula (B2) have an anti-inflammatory effect.
  • a compound represented by formula (A1), a compound represented by formula (B1), a compound represented by formula (A2), or a compound represented by formula (B2) was used. However, equivalent results were obtained.
  • Example 5 It was confirmed that the compound represented by the formula (A1), the compound represented by the formula (B1), the compound represented by the formula (A2), and the compound represented by the formula (B2) have an anti-inflammatory effect. .
  • the experiment was performed in the same manner as in Example 4 except for the following two points, and the amount of NF- ⁇ B in the nucleoprotein was confirmed by measuring the absorbance. That is, in this example, three types of test liquids having concentrations of the purified product of 100 ng / mL, 10000 ng / mL, and 1000000 ng / mL were used as test liquids. In addition, since the three kinds of test solutions are diluted 100-fold when added to cells, the final concentrations of the purified products are 1 ng / mL, 100 ng / mL, and 10000 ng / mL, respectively.
  • LPS Lipopolysaccharide, Pantoea
  • Pantoea Purified from Pantoea agglomerans, which is a gram-negative bacterium having a final concentration of 100 ng / mL
  • LPSp 30 ⁇ L of the above culture solution containing agglomerans, manufactured by Innate Immunity Applied Technology Co., Ltd.
  • the confirmation result is shown in the graph of FIG.
  • the vertical axis indicates the absorbance
  • the horizontal axis indicates the concentration of the test solution.
  • the absorbance decreased as the concentration of the test solution increased, indicating that the amount of NF- ⁇ B in the nucleoprotein decreased as the concentration of the test solution increased. It was. From this result, production of NF- ⁇ B, which is a kind of inflammatory cytokine, is suppressed by the purified product, that is, the purified product (compound represented by formula (A1), represented by formula (B1)). It was confirmed that the compound, the compound represented by the formula (A2) and the mixture represented by the formula (B2) have an anti-inflammatory effect.
  • a compound represented by formula (A1), a compound represented by formula (B1), a compound represented by formula (A2), or a compound represented by formula (B2) was used. However, equivalent results were obtained.
  • Example 6 It was confirmed that the compound represented by the formula (A1), the compound represented by the formula (B1), the compound represented by the formula (A2), and the compound represented by the formula (B2) have an anti-inflammatory effect. .
  • composition of culture solution RPMI1640 medium 500mL Fetal calf serum 55.5mL Kanamycin sulfate 0.11mL Ampicillin sodium 0.134 mL
  • test solution The culture solution was added to mouse macrophage cells (RAW264.7, ATCC) to prepare a solution having a concentration of 4 ⁇ 10 5 cells / mL.
  • the solution was seeded in a 96-well flat-bottom plate at 100 ⁇ L (ie, 4 ⁇ 10 4 cells / 100 ⁇ L / well). After seeding, the cells were cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 for 2 hours until the cells adhered to the well bottom and spread. Next, 100 ⁇ L of the test solution was added to each well. After the addition of the test solution, the cells were cultured at 37 ° C. and 5% CO 2 for 24 hours.
  • culture solution addition step After culturing, the culture supernatant of each well is removed, and 150 ⁇ L of the culture solution is newly added (hereinafter, this step is referred to as “culture solution addition step”), and the reaction is performed at 37 ° C. under 5% CO 2 for 24 hours. Cultured.
  • TNF- ⁇ concentration After culturing, 50 ⁇ L of the culture supernatant of each well was collected, transferred to each well of a new 96-well flat bottom plate, and using a mouse TNF- ⁇ measurement kit (manufactured by Biolegend). Absorbance was measured and converted to TNF- ⁇ concentration.
  • the vertical axis indicates the TNF- ⁇ concentration
  • the horizontal axis indicates the concentration of the test solution.
  • the purified product suppresses the production of TNF- ⁇ , which is a kind of inflammatory cytokine, that is, the purified product (compound represented by formula (A1), represented by formula (B1)).
  • the purified product compound represented by formula (A1), represented by formula (B1)
  • the compound, the compound represented by the formula (A2) and the mixture represented by the formula (B2) have an anti-inflammatory effect.
  • a compound represented by formula (A1), a compound represented by formula (B1), a compound represented by formula (A2), or a compound represented by formula (B2) was used. However, equivalent results were obtained.
  • Example 7 It was confirmed that the compound represented by the formula (A1), the compound represented by the formula (B1), the compound represented by the formula (A2), and the compound represented by the formula (B2) have an anti-inflammatory effect. .
  • the experiment was performed in the same manner as in Example 6 except for the following two points, 50 ⁇ L of the culture supernatant in each well was collected, and the TNF- ⁇ concentration was measured. That is, in this example, five kinds of test liquids having a concentration of the purified product of 20 ⁇ g / mL, 2 ⁇ g / mL, 200 ng / mL, 20 ng / mL, and 2 ng / mL were used as test liquids.
  • the final concentrations of the purified products are 10 ⁇ g / mL, 1 ⁇ g / mL, 100 ng / mL, 10 ng / mL and 1 ng / mL.
  • 150 ⁇ L of the culture solution containing LPSp having a final concentration of 100 ng / mL was added instead of 150 ⁇ L of the culture solution.
  • the vertical axis represents the TNF- ⁇ concentration
  • the horizontal axis represents the concentration of the test solution.
  • the TNF- ⁇ concentration was lower as the test solution concentration was higher. Therefore, it was found that the production of TNF- ⁇ decreased as the test solution concentration increased. .
  • the purified product suppresses the production of TNF- ⁇ , which is a kind of inflammatory cytokine, that is, the purified product (compound represented by formula (A1), represented by formula (B1)). It was confirmed that the compound, the compound represented by the formula (A2) and the mixture represented by the formula (B2) have an anti-inflammatory effect.
  • a compound represented by formula (A1), a compound represented by formula (B1), a compound represented by formula (A2), or a compound represented by formula (B2) was used. However, equivalent results were obtained.
  • Example 8 It was confirmed that the compound represented by the formula (A1), the compound represented by the formula (B1), the compound represented by the formula (A2), and the compound represented by the formula (B2) have an anti-inflammatory effect. .
  • test solution In the same manner as in “(1) Preparation of test solution” in Example 3, a solution having a purified product concentration of 20000 ng / mL was prepared. By using and diluting stepwise, a total of three types of test liquids of 400 ng / mL, 4000 ng / mL and 40000 ng / mL were obtained. In addition, since the three kinds of test solutions are diluted 4-fold when added to cells, the final concentrations of the purified products are 100 ng / mL, 1000 ng / mL, and 10000 ng / mL, respectively.
  • composition of culture solution RPMI1640 medium 500mL Non-immobilized fetal bovine serum 55.5 mL Penicillin-streptomycin-glutamine (100 ⁇ ) 5.6 mL
  • test solution The culture solution is added to human peripheral blood monocyte-derived cells (THP-1, manufactured by DS Pharma Biomedical Co., Ltd.), and the concentration of the cells is 4 ⁇ 10 5 cells / mL.
  • a solution was prepared. The solution was seeded in a 24-well plate at 500 ⁇ L (that is, 2.0 ⁇ 10 5 cells / 500 ⁇ L / well). After seeding, 250 ⁇ L of the culture solution or 250 ⁇ L of the culture solution containing 40 ⁇ mol / L GW9662 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added to each well.
  • the GW9662 is an inhibitor of PPAR ⁇ (Peroxisome proliferator-activated receptor ⁇ ), which is a kind of nuclear receptor.
  • PPAR ⁇ Peroxisome proliferator-activated receptor ⁇
  • the cells were cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 for 1 hour. Thereafter, 250 ⁇ L of the test solution was added to each well and cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 for 22 hours. After culturing, the culture supernatant of each well was collected in a 2 mL tube. In addition, 0.5 mL of the new culture solution was added to each well, spread over the whole well, and collected in the 2 mL tube. To each emptied well, 0.49 mL of the new culture solution was added.
  • PPAR ⁇ Peroxisome proliferator-activated receptor ⁇
  • the culture solution collected in the 2 mL tube is centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes, the supernatant is removed, and 1 mL of the new culture solution is added and suspended, and centrifuged again under the same conditions. did. After centrifugation, the supernatant was removed, and 0.49 mL of culture solution in each well was added to the 2 mL tube and suspended, and returned to each well again. Then, 250 ⁇ L of the culture solution or 250 ⁇ L of the culture solution containing 40 ⁇ mol / L of the GW9662 was added to each well, and cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 for 1 hour. After the culture, 250 ⁇ L of a culture solution containing LPSp was added to each well so that the final concentration of LPSp was 100 ng / mL, followed by culturing at 37 ° C. under 5% CO 2 for 22 hours.
  • the vertical axis indicates the concentration of IL-6
  • the horizontal axis indicates the concentration of the test solution.
  • the IL-6 concentration became lower as the test solution concentration was higher. It was found that the higher the concentration of the test solution, the smaller.
  • the IL-6 concentration became lower as the test solution concentration was higher.
  • the purified product suppresses the production of IL-6, which is a kind of inflammatory cytokine, that is, the purified product (compound represented by formula (A1), represented by formula (B1)). It was confirmed that the compound, the compound represented by the formula (A2) and the mixture represented by the formula (B2) have an anti-inflammatory effect.
  • IL by the purified product a compound represented by the formula (A1), a compound represented by the formula (B1), a compound represented by the formula (A2), and a compound represented by the formula (B2). It was suggested that PPAR ⁇ is involved in the suppression of -6 production.
  • a compound represented by formula (A1), a compound represented by formula (B1), a compound represented by formula (A2), or a compound represented by formula (B2) was used. However, equivalent results were obtained.
  • Example 8-2 That the compound represented by the formula (A1), the compound represented by the formula (B1), the compound represented by the formula (A2), and the compound represented by the formula (B2) promote the expression of the PPAR ⁇ gene. This was confirmed by the CAGE (Cap Analysis of Gene Expression) method developed by RIKEN.
  • Example 8-2A A culture solution similar to that in Example 8-1 (2) was added to the THP-1 cells to prepare a solution having a concentration of the cells of 5 ⁇ 10 5 cells / mL.
  • the expression level of the PPAR ⁇ gene in this solution was measured by the CAGE method, it was 3.97 TPM (Tags Per Million).
  • the cell solution was divided into the following 4 groups. That is, a group (Example 8-2A) in which the purified solution was added to the cell solution to a final concentration of 1 ⁇ g / mL, and the purified solution to a final concentration of 10 ⁇ g / mL to the cell solution.
  • Example 8-2B a group in which nothing was added to the cell solution (Comparative Example 8-2A), and a group in which the LPSp solution was added to the cell solution at 100 ng / mL
  • Example 8-2A the expression level of the PPAR ⁇ gene was significantly increased from 3.97 TPM to 5.86 TPM in 3 hours, and in Example 8-2B, the expression level was 3 hours. In addition, the expression level of the PPAR ⁇ gene was significantly increased from 3.97 TPM to 5.90 TPM. On the other hand, in Comparative Example 8-2A, the expression level of the PPAR ⁇ gene slightly decreased from 3.97 TPM to 3.89 TPM in 3 hours, and in Comparative Example 8-2B, in 3 hours. Although the expression level of the PPAR ⁇ gene increased from 3.97 TPM to 4.31 TPM, the degree of increase was not significant.
  • the purified product (a compound represented by the formula (A1), a compound represented by the formula (B1), a compound represented by the formula (A2) and a mixture represented by the formula (B2)).
  • a compound represented by formula (A1), a compound represented by formula (B1), a compound represented by formula (A2), or a compound represented by formula (B2) was used instead of the purified product.
  • a compound represented by formula (A1), a compound represented by formula (B1), a compound represented by formula (A2), or a compound represented by formula (B2) was used.
  • equivalent results were obtained.
  • Example 9 The compound represented by formula (A1), the compound represented by formula (B1), the compound represented by formula (A2), and the compound represented by formula (B2) have an anticancer effect against lung cancer. It was confirmed.
  • the collagenase solution containing the tumor fragment was pipetted to obtain a finer tumor fragment, and the collagenase solution containing the tumor fragment was transferred to another 50 mL tube and cooled on ice. After cooling, 5 mL of collagenase solution was further added to the collagenase solution containing the tumor fragment, and the same operation was repeated 5 times until the tumor fragment could no longer be observed. Thereafter, the collagenase solution containing the tumor fragment was filtered with a cell strainer (mesh size 70 ⁇ m, manufactured by BD), and the filtrate was centrifuged at 1200 rpm for 7 minutes.
  • a cell strainer mesh size 70 ⁇ m, manufactured by BD
  • Example 9-2 (2) Administration of drug After dividing into groups, the substances shown in Table 5 were administered to each group.
  • the intake amount of the purified product in the mouse is 0.5 mg / 10 mL / kg.
  • free intake (po) in Example 9-3 and Example 9-4 use a water bottle containing a solution with a concentration of the purified product of 1 ⁇ g / mL to separate the groups. It started immediately after. The water bottles were replaced with new ones every 3 days.
  • Example 9-1 Administration of the physiological saline of Comparative Example 9-1 was performed once immediately after grouping so that the physiological saline intake of the mice was 10 mL / kg by ip.
  • Administration of CY cyclophosphamide, anticancer agent for lung cancer, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • CY cyclophosphamide, anticancer agent for lung cancer, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • Example 9-2, Example 9-4 and Reference Example 9-1 It was performed once immediately after grouping so that the CY intake was 100 mg / 10 mL / kg.
  • the vertical axis represents the tumor volume (mm 3 ), and the horizontal axis represents the number of days elapsed after grouping when the day of grouping is defined as day 0.
  • the tumor volume was small compared to Comparative Example 9-1 to which physiological saline was administered. From this, the purified product (a compound represented by the formula (A1), a compound represented by the formula (B1), a compound represented by the formula (A2), and a compound represented by the formula (B2)).
  • the purified product a compound represented by the formula (A1), a compound represented by the formula (B1), a compound represented by the formula (A2), and a compound represented by the formula (B2).
  • Example 9-2 and Example 9-4 to which CY was administered in addition to the purified product the tumor volume was small compared to Reference Example 9-1 to which only CY was administered.
  • the purified product a compound represented by the formula (A1), a compound represented by the formula (B1), a compound represented by the formula (A2), and a compound represented by the formula (B2).
  • the purified product a compound represented by formula (A1), a compound represented by formula (B1), a compound represented by formula (A2), or a compound represented by formula (B2) was used.
  • equivalent results were obtained.
  • the compound of the present invention or a salt thereof can be used as an anti-inflammatory agent, an anticancer agent for lung cancer, and the like. Since the compound of the present invention or a salt thereof is highly safe, it can be administered over a long period of time.

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Abstract

抗炎症剤及び肺がんに対する抗がん剤等として使用可能な、安全性に優れる新たな化合物を提供する。　本発明の化合物又はその塩は、式（Ａ）又は式（Ｂ）で表される化合物又はその塩であることを特徴とする。 【化Ａ】 【化Ｂ】 式（Ａ）及び式（Ｂ）において、 Ｘ１は、ヘキソース又は水酸基であり、 Ｘ２は、リン酸基又は水酸基である。

Description

化合物又はその塩、抗炎症剤、肺がんに対する抗がん剤、化合物又はその塩の製造方法、炎症性疾患の治療方法及び肺がんの治療方法
　本発明は、化合物又はその塩、抗炎症剤、肺がんに対する抗がん剤、化合物又はその塩の製造方法、炎症性疾患の治療方法及び肺がんの治療方法に関する。
　抗炎症剤及び肺がんに対する抗がん剤として、様々なものが提案されている（例えば、非特許文献１及び２参照）。
和田孝一郎、上崎善規著、「ＰＰＡＲγアゴニストの抗炎症作用　―基礎・臨床研究の最新動向－」、日本臨牀、２０１０年、第６８巻第２号、ｐ．２７８－２８３ Vincent T. DeVita, Jr. and Edward Chu, "A History of Cancer Chemotherapy", Cancer Res, November 1, 2008, Vol.68, issue.21, p.8643-8653
　しかしながら、抗炎症剤及び肺がんに対する抗がん剤等として使用可能な、安全性に優れる新たな化合物及びその製造方法が求められている。
　そこで、本発明は、抗炎症剤及び肺がんに対する抗がん剤等として使用可能な、安全性に優れる新たな化合物及びその製造方法の提供を目的とする。
　前記目的を達成するために、本発明の化合物又はその塩は、式（Ａ）又は式（Ｂ）で表される化合物又はその塩であることを特徴とする。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 式（Ａ）及び式（Ｂ）において、
Ｘ１は、ヘキソース又は水酸基であり、
Ｘ２は、リン酸基又は水酸基である。
　本発明の化合物又はその塩の製造方法は、ロドバクター・アゾトフォルマンス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ　ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ）ＢＰ０８９９株（受託番号　ＮＩＴＥ　ＢＰ－６４４）及びその培養物の少なくとも一方から、式（Ａ）又は式（Ｂ）で表される化合物又はその塩を含む粗抽出液を抽出する粗抽出工程と、
前記粗抽出液から式（Ａ）又は式（Ｂ）で表される化合物又はその塩を単離する精製工程と、
を含むことを特徴とする。
　前記目的を達成するために、本発明者らは、一連の研究を重ねたところ、ロドバクター・アゾトフォルマンス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ　ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ）ＢＰ０８９９株（受託番号　ＮＩＴＥ　ＢＰ－６４４）又はその培養物から得られる式（Ａ）又は式（Ｂ）で表される化合物又はその塩が、抗炎症効果及び肺がんに対する抗がん効果を有することを見出し、本発明に到達した。式（Ａ）又は式（Ｂ）で表される化合物又はその塩は、安全性が高く、長期にわたり投与可能である。
図１は、本発明の製造方法における粗抽出工程の一例を示すフローチャートである。 図２は、本発明の製造方法における精製工程の一例を示すフローチャートである。 図３は、実施例３における被験液のＩＬ－８濃度を示すグラフである。 図４は、実施例４における被験液の吸光度を示すグラフである。 図５は、実施例５における被験液の吸光度を示すグラフである。 図６は、実施例６における被験液のＴＮＦ－α濃度を示すグラフである。 図７は、実施例７における被験液のＴＮＦ－α濃度を示すグラフである。 図８は、実施例８－１における被験液のＩＬ－６濃度を示すグラフである。 図９は、実施例９におけるマウスの腫瘍体積を示すグラフである。 図１０は、実施例２において、メチルエステル化処理物をＧＣ－ＭＳ分析に供した際のマススペクトルである。 図１１は、実施例２において、加水分解メチルエステル化処理物をＧＣ－ＭＳ分析に供した際のマススペクトルである。 図１２は、実施例２において、ピロリジド化処理物をＧＣ－ＭＳ分析に供した際のマススペクトルである。 図１３は、実施例２において、加水分解ピロリジド化処理物をＧＣ－ＭＳ分析に供した際のマススペクトルである。 図１４は、実施例２において、図１２におけるピーク４の化合物をＧＣ－ＭＳ分析に供した際のマススペクトルである。 図１５は、実施例２において、図１３におけるピークＤの化合物をＧＣ－ＭＳ分析に供した際のマススペクトルである。 図１６Ａは、実施例２において、試料溶液を１ＨＮＭＲ測定に供した際のスペクトルの一部である。 図１６Ｂは、実施例２において、試料溶液を１ＨＮＭＲ測定に供した際のスペクトルの一部である。 図１６Ｃは、実施例２において、試料溶液を１ＨＮＭＲ測定に供した際のスペクトルの一部である。 図１６Ｄは、実施例２において、試料溶液を１ＨＮＭＲ測定に供した際のスペクトルの一部である。 図１７Ａは、実施例２において、試料溶液を１３ＣＮＭＲ測定に供した際のスペクトルの一部である。 図１７Ｂは、実施例２において、試料溶液を１３ＣＮＭＲ測定に供した際のスペクトルの一部である。 図１７Ｃは、実施例２において、試料溶液を１３ＣＮＭＲ測定に供した際のスペクトルの一部である。 図１７Ｄは、実施例２において、試料溶液を１３ＣＮＭＲ測定に供した際のスペクトルの一部である。 図１８は、実施例２において、試料溶液を３１ＰＮＭＲ測定に供した際のスペクトルである。 図１９は、実施例２において、試料溶液をＧＣ－ＭＳ分析に供した際のマススペクトルである。 図２０は、実施例２において、図１９における、ｍ／ｚ＝１４１７．９３のピークの化合物を、ＧＣ－ＭＳ／ＭＳ分析に供した際のマススペクトルである。 図２１は、試料溶液をＧＣ－ＭＳ分析に供した際のマススペクトルである。 図２２は、実施例２において、図２１におけるｍ／ｚ＝５３８．１５のピークの化合物をＧＣ－ＭＳ／ＭＳ分析に供した際のマススペクトルである。 図２３は、実施例２において、図２２におけるｍ／ｚ＝４７４．２７のピークの化合物をＧＣ－ＭＳ／ＭＳ／ＭＳ分析に供した際のマススペクトルである。 図２４は、実施例２において、図２２におけるｍ／ｚ＝６０１．１７のピークの化合物をＧＣ－ＭＳ／ＭＳ／ＭＳ分析に供した際のマススペクトルである。 図２５は、実施例２において、図２４におけるｍ／ｚ＝５５７．１９のピークの化合物をＧＣ－ＭＳ／ＭＳ／ＭＳ／ＭＳ分析に供した際のマススペクトルである。 図２６は、実施例２において、図２４におけるｍ／ｚ＝６４５．１２のピークの化合物をＧＣ－ＭＳ／ＭＳ／ＭＳ／ＭＳ分析に供した際のマススペクトルである。 図２７は、実施例８－２において、ＰＰＡＲγ遺伝子の発現量を示すグラフである。 図２８は、実施例２において、ヒドラジン分解物の４ｍｏｌ／ＬのＫＯＨ処理で遊離した糖鎖部分のゲルろ過パターンを示すグラフである。 図２９は、実施例２において、試料Ａを１ＨＮＭＲ測定に供した際のスペクトルである。 図３０は、実施例２において、試料Ａを２Ｄ　ＤＱＦ－ＣＯＳＹ測定に供した際のスペクトルである。 図３１は、実施例２において、試料Ａを２Ｄ　ＮＯＥＳＹ測定に供した際のスペクトルである。 図３２は、実施例２において、試料Ａを２Ｄ　１Ｈ－３１Ｐ　ＨＭＢＣ測定に供した際のスペクトルである。 図３３は、実施例２における試料Ａの模式図である。
　本発明の製造方法において、前記粗抽出工程における前記抽出処理が、タンパク質を不溶化する有機溶媒による抽出処理であってもよい。この場合において、前記抽出溶媒は、フェノールであってもよい。
　本発明の製造方法では、前記粗抽出工程において、前記抽出処理の前に、前記ロドバクター・アゾトフォルマンス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ　ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ）ＢＰ０８９９株（受託番号　ＮＩＴＥ　ＢＰ－６４４）及びその培養物の少なくとも一方について、色素の脱色処理を行ってもよい。この場合において、前記色素の脱色処理は、アセトン、メタノール及びクロロホルムからなる群から選択される少なくとも一つによる脱色処理であってもよい。
　本発明の製造方法では、前記粗抽出工程において、前記粗抽出液について濾過処理を行ってもよい。
　本発明の製造方法では、前記精製工程において、前記粗抽出液について、酵素処理と、タンパク質を不溶化する有機溶媒による抽出処理とを行ってもよい。この場合において、前記酵素処理は、核酸分解酵素及びタンパク質分解酵素の少なくとも一方による酵素処理であってもよく、前記有機溶媒は、フェノールであってもよい。
　本発明の製造方法では、前記精製工程において、前記抽出処理後の抽出液について濾過処理を行ってもよい。
　本発明について、以下に詳細に説明する。
＜新規化合物＞
　前述のとおり、本発明の化合物又はその塩は、式（Ａ）又は式（Ｂ）で表される化合物又はその塩であることを特徴とする。式（Ａ）及び式（Ｂ）において、Ｘ１とＸ２との組合せは、ヘキソースとリン酸基、水酸基と水酸基、ヘキソースと水酸基、水酸基とリン酸基の４通りあり、ヘキソースとリン酸基、水酸基と水酸基の組合せが好ましい。Ｘ１がヘキソースの場合、例えば、その２位の炭素における水酸基の酸素が、Ｘ１の結合先であるヘキソースの４位の炭素に結合している。本発明の化合物又はその塩は、式（Ａ）又は式（Ｂ）において、Ｘ１及びＸ２が、それぞれ、ヘキソース及びリン酸基であれば、式（Ａ１）又は式（Ｂ１）で表される化合物又はその塩となり、式（Ａ）又は式（Ｂ）において、Ｘ１及びＸ２が、いずれも水酸基であれば、式（Ａ２）又は式（Ｂ２）で表される化合物又はその塩となる。本発明の化合物又はその塩は、以下、「本発明の新規化合物」ともいう。本発明の新規化合物は、例えば、後述の製造方法で得ることができる。ただし、後述の製造方法は例示に過ぎず、本発明を限定するものではない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　本発明の新規化合物において、ヘキソースは、例えば、グルコースであってもよい。
　本発明の新規化合物は、いかなる用途に用いてもよいが、例えば、後述の抗炎症剤、肺がんに対する抗がん剤の材料等として利用可能である。本発明の新規化合物は、後述の実施例で実証されているように、ＮＦ－κＢ（Ｎuclear Ｆactor-kappa Ｂ）、ＴＮＦ－α（Tumor Necrosis Factor－α）及びＩＬ－６（Interleukin－６）等の炎症性サイトカインの生産を抑制する機能を有する。また、本発明の新規化合物は、後述の実施例で実証されているように、Toll様受容体の一種であるＴＬＲ４（Toll-like receptor 4）を活性化する機能も有する。ＴＬＲ４の活性化は、抗炎症作用を有するＩ型インターフェロンの産生を促すことが知られている（Nina Maeshima and Rachel C. Fernandez, “Recognition of lipid A variants by the TLR4-MD-2 receptor complex”, Frontiers in Cellular and Infection Microbiology, February 2013, volume3, Article3, p.2, FIGURE 2）。したがって、本発明の新規化合物は、抗炎症効果を有する。さらに、本発明の新規化合物は、後述の実施例で実証されているように、肺がんの増殖を抑える機能も有する。
＜抗炎症剤及び炎症性疾患の治療方法＞
　本発明の抗炎症剤は、本発明の化合物又はその塩（前記新規化合物）が有する抗炎症効果により炎症を抑えるものであり、本発明の新規化合物を含んでいる以外は、何ら制限されない。本発明の抗炎症剤により炎症を抑えられる疾患としては、例えば、潰瘍性大腸炎及びクローン病等の炎症性腸疾患、乾癬及び皮膚炎等の炎症性皮膚疾患、脳炎、肝炎、腎炎、肺炎、気管支炎、脈管炎、髄膜炎、甲状腺炎、糖尿病、炎症性胆汁疾患、炎症を伴う癌等があげられ、特に限定されない。本発明の抗炎症剤によれば、本発明の新規化合物の有する抗炎症効果により、炎症に伴う疼痛の鎮痛効果も発揮される。
　前記抗炎症剤の剤形は、例えば、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、被覆錠剤、カプセル剤、トローチ剤、液剤等が挙げられ、特に制限されない。また、前記抗炎症剤の組成は、特に制限されず、本発明の新規化合物以外に、例えば、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、吸収促進剤、乳化剤、安定化剤、防腐剤等の各種添加剤等を含んでいてもよい。また、前記抗炎症剤は、通常用いられる製剤化技術等により製造可能である。
　本発明の炎症性疾患の治療方法は、前記新規化合物を含む本発明の抗炎症剤を投与する工程を含む。本発明において、「治療」とは、例えば、症状を改善する（良くする）こと、症状を解消（完治）すること、症状の悪化を防止すること、予防等が含まれ、後述の肺がんの治療方法において同様である。前記抗炎症剤を投与する動物種としては、特に制限されないが、例えば、ヒト、又は、サル、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ等の非ヒトの哺乳類、ニワトリ等の鳥類、魚介類等が挙げられる。前記投与方法としては、特に制限されず、例えば、経口投与又は非経口投与があげられ、前記非経口投与は、例えば、経皮吸収、注射、座薬投与等が挙げられる。前記抗炎症剤の投与量は、例えば、動物種、年齢等に応じて適宜設定でき、特に制限されない。
＜肺がんに対する抗がん剤及び肺がんの治療方法＞
　本発明の肺がんに対する抗がん剤は、本発明の化合物又はその塩（前記新規化合物）の有する肺がんに対する抗がん効果により肺がんの増殖を抑えるものであり、本発明の新規化合物を含んでいる以外、何ら制限されない。また、本発明の肺がんの治療方法は、前記新規化合物を含む本発明の肺がんに対する抗がん剤を投与する工程を含む。前記抗がん剤の剤形、前記抗がん剤を投与する動物種及び前記抗がん剤の投与方法は、前記抗炎症剤の剤形、前記抗炎症剤を投与する動物種及び前記抗炎症剤の投与方法と同様である。
＜新規化合物の製造方法＞
　前述のとおり、本発明の化合物又はその塩（前記新規化合物）の製造方法は、ロドバクター・アゾトフォルマンス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ　ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ）ＢＰ０８９９株（受託番号　ＮＩＴＥ　ＢＰ－６４４）及びその培養物の少なくとも一方から、式（Ａ）又は式（Ｂ）で表される化合物又はその塩を含む粗抽出液を抽出する粗抽出工程と、
前記粗抽出液から式（Ａ）又は式（Ｂ）で表される化合物又はその塩を単離する精製工程と、
を含むことを特徴とする。
〔粗抽出工程〕
　前述のとおり、前記粗抽出工程は、ロドバクター・アゾトフォルマンス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ　ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ）ＢＰ０８９９株（受託番号　ＮＩＴＥ　ＢＰ－６４４）及びその培養物の少なくとも一方から、式（Ａ）又は式（Ｂ）で表される化合物又はその塩を含む粗抽出液を抽出する工程である。
　まず、前記ロドバクター・アゾトフォルマンス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ　ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ）ＢＰ０８９９株（受託番号　ＮＩＴＥ　ＢＰ－６４４）及びその培養物の少なくとも一方について説明する。前記ロドバクター・アゾトフォルマンス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ　ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ）ＢＰ０８９９株（受託番号　ＮＩＴＥ　ＢＰ－６４４）及びその培養物の少なくとも一方は、下記（１）～（３０）の菌学的特徴を有することが好ましい。なお、前記ＢＰ０８９９株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８）に受託番号　ＮＩＴＥ　Ｐ－６４４で寄託され（受託日：２００８年　９月１２日）、さらに、受託番号　ＮＩＴＥ　ＢＰ－６４４で国際寄託されている（移管日：２０１０年１０月２７日）。
（１）細胞の形：桿状形又は卵形
（２）多形性：なし
（３）細胞の大きさ：０．８μｍ×１．０μｍ
（４）運動性の有無：あり
（５）胞子の有無：なし
（６）普通寒天培養における光沢：あり
（７）普通寒天培養における色素産生：あり
（８）普通ブイヨン培養における表面発育の有無：なし
（９）普通ブイヨン培養における培地の混濁の有無：あり
（１０）ゼラチン穿刺培養におけるゼラチン液化：陰性
（１１）リトマス・ミルク培養における凝固：なし
（１２）リトマス・ミルク培養における液化：なし
（１３）グラム染色性：陰性
（１４）硝酸塩の還元：なし
（１５）脱窒反応：なし又はあり
（１６）ＭＲテスト：陰性
（１７）インドール産生：なし
（１８）硫化水素の生成：なし
（１９）デンプンの加水分解：なし
（２０）クエン酸の利用（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ）：なし
（２１）無機窒素源の利用（アンモニウム塩）：あり
（２２）カタラーゼの生成：陽性
（２３）オキシダーゼの生成：陽性
（２４）嫌気的生育性：あり
（２５）Ｏ－Ｆテスト（酸化／発酵）：陰性／陰性
（２６）β－ガラクトシダーゼ活性：陰性
（２７）アルギニンジヒドロラーゼ活性：陰性
（２８）リジンデカルボキシラーゼ活性：陰性
（２９）トリプトファンデアミナーゼ活性：陰性
（３０）ゼラチナーゼ活性：陰性
　前記ＢＰ０８９９株の１６Ｓ　ｒＲＮＡの塩基配列は、配列番号１で表される塩基配列であることが好ましい。
　前記ＢＰ０８９９株及びその培養物の少なくとも一方は、暗所での好気培養条件下で、さらに、例えば、下記（３１）の表に示す性質を示してもよい。なお、同表において、「－」は産生なしを、「＋」は産生ありを示す。
（３１）糖類からの酸産生及びガス産生
　　基質　　　　　酸産生／ガス産生
Ｌ－アラビノース　　　－／－
Ｄ－グルコース　　　　－／－
Ｄ－フラクトース　　　－／－
マルトース　　　　　　－／－
ラクトース　　　　　　－／－
Ｄ－ソルビトール　　　－／－
イノシトール　　　　　－／－
Ｄ－キシロース　　　　－／－
Ｄ－マンノース　　　　－／－
Ｄ－ガラクトース　　　－／－
サッカロース　　　　　－／－
トレハロース　　　　　－／－
グリセリン　　　　　　－／－
　前記菌学的特徴は、例えば、前培養後、さらに本培養した結果から評価してもよい。前記前培養は、例えば、普通寒天培地に前記ＢＰ０８９９株を植菌し、３０℃で２４時間培養して行ってもよい。前記本培養の条件は、各菌学的特徴の評価方法に応じて、適宜設定できる。具体的には、前記（１）～（５）の培養条件は、例えば、普通寒天培地を用い、３０℃、暗所での好気培養であり、前記（６）～（７）の培養条件は、例えば、普通ブイヨン培地を用い、３０℃、明所での嫌気培養であり、前記（８）～（１２）の培養条件は、例えば、各培地を用い、３０℃、暗所での好気培養であり、前記（１３）、（１４）、（１６）、（１７）、（１９）～（２３）、（２５）の酸化テスト、（２６）、（２９）、（３０）及び（３１）は、例えば、暗所での好気培養であり、（１５）、（１８）、（２４）、（２５）の発酵テスト、（２７）及び（２８）は、例えば、暗所での嫌気培養である。これらの菌学的特徴の試験方法としては、特に制限されず、従来公知の方法を採用できる。具体的には、例えば、Ｂａｒｒｏｗ　Ｇ．Ｉ．及びＦｅｌｔｈａｍ　Ｒ．Ｋ．Ａ．著「Ｃｏｗａｎ　ａｎｄ　Ｓｔｅｅｌ‘ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｂａｃｔｅｒｉａ．」（イギリス）３ｒｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ　１９９３年、坂崎ら著「新　細菌培地学講座・下」（東京）第二版　近大出版　１９８８年、長谷川編著「微生物の分類と同定（下）」（東京）学会出版センター　１９８５年、土壌微生物研究会編「新編　土壌微生物学実験」（東京）養賢堂　１９９２年等に記載の方法が挙げられる。前記（１５）の試験方法は、例えば、前記「微生物の分類と同定（下）」記載の駒形らの方法、Ｇｉｌｔａｙ培地を用いた前記「新編　土壌微生物学実験」記載の方法、ＰＹＮ培地を用いた下水法等を採用できる。前記駒形らの方法は、１％硝酸ナトリウム肉汁を用いた嫌気培養条件下で、生育及びガス形成が認められたものを脱窒反応陽性と判定する。前記Ｇｉｌｔａｙ培地を用いた方法は、ダーラム管入り前記Ｇｉｌｔａｙ培地（ｐＨ７．０～７．２）を用いた嫌気培養条件下で、ガス発生及び濃青色に呈色したものを脱窒反応陽性と判定する。なお、前記Ｇｉｌｔａｙ培地は、Ａ液（ＫＮＯ３　１ｇ、アスパラギン１ｇ、１％ブロモチモールブルー・アルコール溶液５ｍＬ及び蒸留水５００ｍＬ）及びＢ液（クエン酸ナトリウム８．５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　１ｇ、ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ　０．０５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４　１ｇ、ＣａＣｌ２・６Ｈ２Ｏ　０．２ｇ及び蒸留水５００ｍＬ）を混合した培地である。また、前記試験方法には、例えば、市販の細菌同定キットを使用してもよい。前記キットとしては、特に制限されないが、例えば、細菌同定キット　ＡＰＩ２０Ｅ（ビオメリュー社製）等を使用できる。
　前記ＢＰ０８９９株及びその培養物の少なくとも一方は、例えば、さらに、下記（３２）～（４０）の菌学的特徴を有してもよい。
（３２）コロニーの色：赤色
（３３）ゼラチン穿刺培養：生育しない
（３４）ＶＰテスト：陰性
（３５）クエン酸の利用（Ｋｏｓｅｒ）：あり
（３６）無機窒素源の利用（硝酸塩）：あり
（３７）ウレアーゼ活性：陰性
（３８）生育するｐＨ範囲：５～９
（３９）Ｄ－マンニトールからの酸産生：産生あり
（４０）Ｄ－マンニトールからのガス産生：産生なし
　前記（３２）～（４０）の菌学的特徴の試験方法としては、特に制限されず、従来公知の方法を採用できる。具体的には、例えば、前述の文献等に記載の方法が挙げられる。また、前記試験方法には、例えば、市販の細菌同定キットを使用してもよい。前記キットとしては、特に制限されないが、例えば、前述の細菌同定キット等を使用できる。
　前記ＢＰ０８９９株の採取源としては、特に限定されず、例えば、土壌、海水、川水、湖水、沼水等が挙げられる。また、前記土壌としては、例えば、陸地、海底、川底、湖底及び沼底の土、砂及び泥土等が挙げられ、特に限定されない。
　前記ＢＰ０８９９株の単離方法としては、例えば、従来公知の採取法、培養法等を用いることができ、特に制限されない。前記単離方法としては、例えば、採取源が湖水の場合、採取した湖水をフィルター等によりろ過し、このろ液を寒天培地等で培養し、得られたコロニーから前記ＢＰ０８９９株を単離してもよい。また、例えば、採取源が泥土の場合、採取した泥土を緩衝液等により懸濁後、この懸濁液を遠心分離し、得られた上清を寒天培地等で培養し、得られたコロニーから前記ＢＰ０８９９株を単離してもよい。前記単離したＢＰ０８９９株は、さらに、例えば、液体培地中で培養してもよい。
　前記ＢＰ０８９９株の培養において、培地は、特に限定されず、例えば、低級脂肪酸添加培地、リンゴ酸添加培地、Ｌ－乾燥標品復元用培養基８０２「ダイゴ」（日本製薬（株）製）、ＭＹＳ培地（平石及び北川、Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｊａｐａｎｅｓｅ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ、１９８４年、５０巻、１１号、ｐ．１９２９－１９３７）、改変ＭＹＳ培地、生育用培地等が挙げられ、好ましくは、低級脂肪酸添加培地、リンゴ酸添加培地、Ｌ－乾燥標品復元用培養基８０２「ダイゴ」（日本製薬（株）製）である。
　前記低級脂肪酸添加培地及び前記リンゴ酸添加培地としては、例えば、下記表１の基礎培地に、ビオチン、ビタミンＢ１、ニコチン酸、低級脂肪酸又はリンゴ酸のナトリウム塩を添加した培地が挙げられる。前記低級脂肪酸としては、特に制限されないが、例えば、酢酸、プロピオン酸、乳酸等が好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　前記改変ＭＹＳ培地、生育用培地としては、例えば、下記表２及び表３の組成の培地が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　前記培養において、温度範囲は、特に限定されないが、例えば、２３～３９℃、３０℃である。
　また、前記培養において、ｐＨ範囲は、特に限定されないが、例えば、ｐＨ５．５～８．５、６．０～８．５、７．０である。
　前記培養は、例えば、好気的条件下で行ってもよく、嫌気的条件下で行ってもよく、特に制限されないが、好ましくは、嫌気的条件下である。また、前記培養時の光条件も、特に制限されず、例えば、暗黒条件でもよく、照明条件でもよいが、好ましくは、２０００ルクス～１００００ルクスの照度下である。前記培養は、例えば、密閉照明式培養槽内で行ってもよい。また、前記密閉照明式培養槽内に備えられた撹拌装置を用いて、培養液を撹拌しながら培養してもよい。
　前記培養時間は、特に制限されず、例えば、前記ＢＰ０８９９株の増殖が定常期に達するまでであってもよい。前記ＢＰ０８９９株の増殖が、約７２時間以内に定常期に達する培養条件下の場合、前記培養時間は、例えば、７２時間であってもよい。
　前述のように、前記ＢＰ０８９９株の１６Ｓ　ｒＲＮＡの塩基配列は、配列番号１で表される塩基配列であることが好ましい。
　前記１６Ｓ　ｒＲＮＡの塩基配列は、例えば、前述の方法等により、単離及び培養した前記ＢＰ０８９９株から、ＤＮＡを抽出し、プライマー等を用いて決定できる。前記ＤＮＡの抽出及び前記塩基配列の決定方法は、例えば、常法を用いることができ、特に制限されない。また、前記プライマーは、特に制限されないが、例えば、以下のプライマー等が挙げられる。
（プライマー）
９Ｆ　　　　（配列番号２）
　　５’－ＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ－３’
３３９Ｆ　　（配列番号３）
　　５’－ＣＴＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧ－３’
７８５Ｆ　　（配列番号４）
　　５’－ＧＧＡＴＴＡＧＡＴＡＣＣＣＴＧＧＴＡＧＴＣ－３’
１０９９Ｆ　（配列番号５）
　　５’－ＧＣＡＡＣＧＡＧＣＧＣＡＡＣＣＣ－３’
５３６Ｒ　　（配列番号６）
　　５’－ＧＴＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧ－３’
８０２Ｒ　　（配列番号７）
　　５’－ＴＡＣＣＡＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴＣＣ－３’
１２４２Ｒ　（配列番号８）
　　５’－ＣＣＡＴＴＧＴＡＧＣＡＣＧＴＧＴ－３’
１５４１Ｒ　（配列番号９）
　　５’－ＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＣＣＡＧＣＣ－３’
　前記ＢＰ０８９９株の培養物としては、例えば、前記ＢＰ０８９９株の菌体、前記ＢＰ０８９９株の培養上清、前記ＢＰ０８９９株の菌体抽出物等が挙げられ、特に限定されない。
　前記培養物は、例えば、前記菌体の処理物、前記培養上清の処理物、前記菌体抽出物の処理物等でもよく、特に限定されない。前記処理物としては、特に限定されないが、例えば、前記培養物の濃縮物、乾燥物、凍結乾燥物、溶媒処理物、界面活性剤処理物、酵素処理物、タンパク質分画物、超音波処理物、磨砕処理物等が挙げられる。また、前記培養物は、例えば、前記菌体、前記培養上清、前記菌体抽出物、前記菌体の処理物、前記培養上清の処理物、前記菌体抽出物の処理物等の混合物でもよい。前記混合物としては、任意の組み合わせ及び比率で混合することができ、特に制限されない。前記組み合わせとしては、特に制限されないが、例えば、前記菌体及び前記培養上清の混合物等が挙げられる。
　図１のフローチャートに、前記粗抽出工程の一例を示す。図示のとおり、本例の前記粗抽出工程は、脱色処理（ステップＳ１１）と、抽出処理（ステップＳ１２）と、濾過処理（ステップＳ１３）と、を含む。
（１）脱色処理（ステップＳ１１）
　まず、前記ロドバクター・アゾトフォルマンス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ　ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ）ＢＰ０８９９株（受託番号　ＮＩＴＥ　ＢＰ－６４４）又はその培養物について、色素の脱色処理を行う。前記色素の脱色処理は、特に制限されず、例えば、有機溶媒による脱色処理があげられる。前記有機溶媒は、例えば、アセトン、メタノール、クロロホルム及びそれらの混合溶媒等があげられる。前記脱色処理は、例えば、前記菌体又は前記培養物を前記有機溶媒と混合することによって行える。具体的には、例えば、ビーカー内の前記ＢＰ０８９９株の凍結乾燥菌体１０ｇ～６０ｇに対し、アセトン２５ｍＬ～１５０ｍＬを加え、スターラーを用いて十分に撹拌する。つぎに、前記撹拌した溶液の上澄みを５０ｍＬコニカルチューブに移し、２０００ｒｐｍ～５０００ｒｐｍ、５分～１０分の条件で遠心分離し、得られた上清を除去し、沈殿物にアセトン２０ｍＬ～４０ｍＬを加え、前記ビーカーに戻す。この操作を、前記ＢＰ０８９９株の色素の色（褐色）を目視で認められなくなるまで繰り返した後、前記沈殿物を、アスピレーターを用いて恒量になるまで減圧乾燥し、脱色された乾燥菌体を得る。
（２）抽出処理（ステップＳ１２）
　つぎに、前記脱色処理後の菌体又は培養物を、タンパク質を不溶化する有機溶媒で処理し、タンパク質の除去を行う。前記有機溶媒は、例えば、フェノール等があげられる。前記抽出処理は、例えば、前記菌体又は培養物を、前記有機溶媒及び水性溶媒と混合し、前記有機溶媒により不溶化したタンパク質を前記有機溶媒の相に分配させ、前記水性溶媒の相に、目的とする前記化合物を分配させる。具体的には、例えば、前記ビーカー内の脱色乾燥菌体１０ｇ～６０ｇに、前記脱色乾燥菌体の濃度が６０ｍｇ／ｍＬ～９０ｍｇ／ｍＬとなるように、注射用水を加える。つぎに、９０％フェノールを前記注射用水と等量加え、ホットスターラー上で６５℃～７０℃で２０分～４０分撹拌し、これを初回の抽出とする。そして、前記撹拌した溶液を１０℃以下になるまで冷却した後、遠心分離用チューブを用いて、８０００ｒｐｍ～２００００ｒｐｍ、２０分～６０分、２℃～１０℃の条件で遠心分離することにより、フェノール相と水相とに分離し、得られた前記水相を５０ｍＬコニカルチューブに回収し、前記遠心分離用チューブに残ったフェノール相に、回収した水相と等量の注射用水を入れ、前記初回の抽出と同様の操作を繰り返す（２回目の抽出）。さらに、前記初回の抽出と同様の操作をもう一度繰り返す（３回目の抽出）。このようにして、３回分の抽出により得られた水相５００ｍＬ～１０００ｍＬを回収する。
（３）濾過処理（ステップＳ１３）
　つぎに、抽出処理で得られた水相に、濾過処理を施し、前記水相に混入した有機溶媒（前記抽出処理で用いたフェノール等の有機溶媒）を除去する。前記濾過としては、例えば、限外濾過等があげられる。前記濾過における分画分子量は、例えば、７０００であり、前記分画分子量未満の分子を除去することが好ましい。具体的には、例えば、前記回収した水相を、分画分子量７０００の透析チューブに入れ、外液を蒸留水１Ｌ～１０Ｌとし、透析を行う。外液にフェノールの吸収波長である２７０ｎｍにおける光の吸収が認められなくなるまで、前記透析を繰り返し行い、内液を、前記本発明の新規化合物を含む粗抽出液として回収する。
〔精製工程〕
　図２のフローチャートに、前記精製工程の一例を示す。図示のとおり、本例の前記精製工程は、酵素処理（ステップＳ２１）と、抽出処理（ステップＳ２２）と、濾過処理（ステップＳ２３）と、を含む。
（１）酵素処理（ステップＳ２１）
　前記粗抽出工程で得られた前記本発明の新規化合物を含む粗抽出液について、酵素処理を行う。前記酵素処理は、特に制限されず、例えば、核酸分解酵素による処理、タンパク質分解酵素による処理があげられ、いずれか一方の処理でもよいし、両方の処理でもよい。後者の場合、その順序は、特に制限されないが、例えば、核酸分解酵素による処理を行った後、タンパク質分解酵素による処理を行うことができる。
　まず、前記粗抽出液について、核酸分解酵素による処理を施す。前記核酸分解酵素は、特に制限されず、例えば、ＲＮＡ分解酵素、ＤＮＡ分解酵素があげられる。前記ＲＮＡ分解酵素としては、特に限定するものではないが、例えば、シグマ社製のRibonuclease A、和光純薬工業（株）製のRibonuclease A、ロシュ社製のRibonuclease A等を用い得る。前記ＤＮＡ分解酵素としては、特に限定するものではないが、例えば、シグマ社製のDeoxyribonuclease Ｉ、和光純薬工業（株）製のDeoxyribonuclease Ｉ、ロシュ社製のDeoxyribonuclease Ｉ等を用い得る。具体的には、例えば、前記粗抽出液に、０．２ｍｇ／ｍＬ～１ｍｇ／ｍＬのＲＮＡ分解酵素と、１μｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬのＤＮＡ分解酵素とを添加し、３０℃～４０℃で４時間～２４時間インキュベートする。
　つぎに、前記粗抽出液について、タンパク質分解酵素による処理を施す。前記タンパク質分解酵素としては、特に限定するものではないが、例えば、シグマ社製のProteinase K、和光純薬工業（株）製のProteinase K、ロシュ社製のProteinase K等を用い得る。具体的には、例えば、前記粗抽出液に、１００μｇ／ｍＬ～３００μｇ／ｍＬのタンパク質分解酵素を添加し、４０℃～５０℃で２時間～２４時間インキュベートする。
（２）抽出処理（ステップＳ２２）
　つぎに、前記粗抽出液を、タンパク質を不溶化する有機溶媒で処理し、タンパク質の除去を行う。前記有機溶媒は、例えば、フェノール等があげられる。具体的には、例えば、前記酵素処理後の抽出液を、２０００ｒｐｍ～５０００ｒｐｍ、２０分～６０分の条件で遠心分離する。そして、得られた沈殿画分約１ｍＬ～１０ｍＬと上清画分約５０ｍＬ～１００ｍＬとのうち、前記沈殿画分を、分画分子量５００００～１０００００の限外濾過チューブに入れ、外液を蒸留水５ｍＬ～１５ｍＬとし、限外濾過を行う。得られた内液に、注射用水１０ｍＬ～６０ｍＬと９０％フェノール１０ｍＬ～６０ｍＬとを加え、ホットスターラー上で６５℃～７０℃で２０分～４０分撹拌し、これを初回の抽出とする。そして、前記撹拌した溶液を１０℃以下になるまで冷却した後、遠心分離用チューブを用いて、８０００ｒｐｍ～２００００ｒｐｍ、２０分～６０分、２℃～１０℃の条件で遠心分離することにより、フェノール相と水相とに分離し、得られた前記水相は、５０ｍＬコニカルチューブに回収し、前記遠心分離用チューブに残ったフェノール相に、回収した水相と等量の注射用水を入れ、前記初回の抽出と同様の操作を繰り返す（２回目の抽出）。さらに、前記初回の抽出と同様の操作をもう一度繰り返す（３回目の抽出）。このようにして、３回分の抽出操作の水相を、計６０ｍＬ～１２０ｍＬ回収する。
（３）濾過処理（ステップＳ２３）
　つぎに、抽出処理で得られた水相に、濾過処理を施し、前記水相に混入した有機溶媒（前記抽出処理で用いたフェノール等の有機溶媒）を除去する。前記濾過としては、例えば、限外濾過等があげられる。前記濾過における分画分子量は、例えば、５００００～１０００００であり、前記分画分子量未満の分子を除去することが好ましい。具体的には、例えば、前記回収した水相を、分画分子量７０００の透析チューブに入れ、外液を蒸留水０．５Ｌ～１Ｌとし、２４時間～９６時間透析を行う。得られた内液を、分画分子量５００００～１０００００の限外濾過チューブに入れ、外液を蒸留水５ｍＬ～１５ｍＬとし、限外濾過を行う。得られた内液を凍結乾燥することにより、本発明の新規化合物である、式（Ａ）又は式（Ｂ）で表される化合物又はその塩が得られる。
　つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記の実施例に限定されない。市販の試薬は、特に示さない限り、それらのプロトコルに基づいて使用した。
〔実施例１〕
　下記方法により、式（Ａ）で表される化合物及び式（Ｂ）で表される化合物を製造した。
〔１．粗抽出工程〕
（１－１）脱色処理（ステップＳ１１）
　ビーカー内の前記ＢＰ０８９９株の凍結乾燥菌体２０．０３ｇに対し、アセトン５０ｍＬを加え、スターラーを用いて１０分撹拌した。つぎに、前記撹拌した溶液の上澄みを５０ｍＬコニカルチューブに移し、２０００ｒｐｍ、５分の条件で遠心分離し、得られた上清は除去し、沈殿物には、アセトン２０ｍＬを加え、前記ビーカーに戻した。この操作を、前記ＢＰ０８９９株の色素の色（褐色）を目視で認められなくなるまで繰り返した。そして、脱色された沈殿物を、アスピレーターを用いて恒量になるまで減圧乾燥し、脱色乾燥菌体を得た。
（１－２）抽出処理（ステップＳ１２）
　ビーカーに入れた前記脱色乾燥菌体１６ｇに、前記脱色乾燥菌体の濃度が７５ｍｇ／ｍＬとなるように、注射用水を加えた。つぎに、９０％フェノールを前記注射用水と等量加え、ホットスターラー上で６５℃～７０℃で３０分撹拌し、これを初回の抽出とした。そして、前記撹拌した溶液を１０℃以下になるまで冷却した後、遠心分離用チューブを用いて、１５０００ｒｐｍ、４０分、４℃の条件で遠心分離することにより、フェノール相と水相とに分離し、得られた前記水相は、５０ｍＬコニカルチューブに回収し、前記遠心分離用チューブに残ったフェノール相に、回収した水相と等量の注射用水を入れ、前記初回の抽出と同様の操作を繰り返した（２回目の抽出）。さらに、前記初回の抽出と同様の操作をもう一度繰り返した（３回目の抽出）。このようにして、３回分の抽出操作の水相４５０ｍＬを回収した。
（１－３）濾過処理（ステップＳ１３）
　前記回収した水相４５０ｍＬを、分画分子量７０００の透析チューブに入れ、外液を蒸留水２．５Ｌとし、透析を行った。外液にフェノールの吸収波長である２７０ｎｍにおける光の吸収が認められなくなるまで、前記透析を２２回行い、式（Ａ）で表される化合物及び式（Ｂ）で表される化合物を含む粗抽出液である内液７５ｍＬを回収した。
[２．精製工程]
（２－１）酵素処理（ステップＳ２１）
　まず、前記粗抽出工程で得た式（Ａ）で表される化合物及び式（Ｂ）で表される化合物を含む粗抽出液に、０．５ｍｇ／ｍＬのＲＮＡ分解酵素（商品名：シグマ社製のribonuclease A）と、５μｇ／ｍＬのＤＮＡ分解酵素（シグマ社製のDeoxyribonuclease I）とを添加し、３７℃で６時間インキュベートした。つぎに、前記粗抽出液に、２００μｇ／ｍＬのタンパク質分解酵素（シグマ社製のProteinase K）を添加し、５０℃で４時間インキュベートした後、３０００ｒｐｍ、３０分の条件で遠心分離した。
（２－２）抽出処理（ステップＳ２２）
　前記酵素処理における遠心分離により得られた、沈殿画分約３ｍＬ以下と上清画分約７２ｍＬとのうち、前記沈殿画分を、分画分子量１０００００の限外濾過チューブに入れ、外液を蒸留水１５ｍＬとし、限外濾過を行った。得られた内液に、注射用水３０ｍＬと９０％フェノール３０ｍＬとを加え、ホットスターラー上で６５℃～７０℃で３０分撹拌し、これを初回の抽出とした。そして、前記撹拌した溶液を１０℃以下になるまで冷却した後、遠心分離用チューブを用いて、１５０００ｒｐｍ、４０分、４℃の条件で遠心分離することにより、フェノール相と水相とに分離し、得られた前記水相は、５０ｍＬコニカルチューブに回収し、前記遠心分離用チューブに残ったフェノール相に、回収した水相と等量の注射用水を入れ、前記初回の抽出と同様の操作を繰り返した（２回目の抽出）。さらに、前記初回の抽出と同様の操作をもう一度繰り返した（３回目の抽出）。このようにして、３回分の抽出操作の水相８０ｍＬを回収した。
（２－３）濾過処理（ステップＳ２３）
　前記回収した水相を、分画分子量７０００の透析チューブに入れ、外液を蒸留水１Ｌとし、７２時間透析を行った。得られた内液を、分画分子量１０００００の限外濾過チューブに入れ、外液を蒸留水１５ｍＬとし、限外濾過を行った。得られた内液を凍結乾燥することにより、精製物１６４．５３ｍｇを得た。
〔実施例２〕
　前記精製物を、質量分析（mass spectrometry）及び核磁気共鳴（nuclear magnetic resonance、ＮＭＲ）に供し、その構造を特定した。
（１）精製物の分解物の質量分析
　前記精製物を以下のようにして分解し、前記精製物の分解物を調製した。まず、前記精製物を、１０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように、０．１ｍｏｌ／Ｌの塩酸に溶解し、前記溶解液を水浴中で９０分間加熱して、沈殿物と無色透明の上清とを得た。つぎに、前記沈殿物を回収し、クロロホルム抽出に供し、クロロホルム画分を回収した。前記クロロホルム画分に、３８ｍｇ／ｍＬの濃度となるように、クロロホルムを追加し、この溶解液６μＬを、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）に供した。なお、ＴＬＣプレートとしては、１０ｃｍ×１０ｃｍのシリカゲル６０Ｆ２５４ＴＬＣプレート（メルク社製）を、展開溶媒としては、クロロホルム：メタノール：蒸留水：トリエチルアミン＝３０：１３：２：０．１（体積比）の溶液を使用した。そして、展開後の前記ＴＬＣプレートに、５０％の硫酸を噴霧し、最も強く染まったスポットに対応するゲルをかき取り、再度前記展開溶媒に溶解した。そして、溶媒を取り除いた後に、溶媒以外の画分を回収し凍結乾燥し、これを前記精製物の分解物（以下、「分解物」という。）とした。
　前記分解物を、それぞれ、以下の処理に供し、メチルエステル化処理物、ピロリジド化処理物、加水分解メチルエステル化処理物及び加水分解ピロリジド化処理物の４種類の試料溶液を調製した。
＜メチルエステル化処理物の調製＞
（Ｉ）前記分解物濃度が、３０ｍｇ／ｍＬとなるように調製したクロロホルム溶液０．１ｍＬに、０．２ｍｇ／ｍＬ　ＢＨＴ（ジブチルヒドロキシトルエン）　クロロホルム溶液１ｍＬを添加し、乾固した。
（ＩＩ）前記乾固物に、５％塩酸・メタノール１ｍＬを添加し、８５℃で２４時間反応させた。
（ＩＩＩ）前記反応物を放冷後、ヘキサン１ｍＬ、水０．５ｍＬを添加し、ヘキサン相を回収した。
（ＩＶ）前記回収したヘキサン相を、窒素気流化で溶媒留去し、クロロホルム１ｍＬに再溶解し、メチルエステル化処理物の試料溶液を得た。
＜ピロリジド化処理物の調製＞
（Ｉ）前記メチルエステル化処理物の試料溶液２００μＬをガラス試験管に採取した。
（ＩＩ）前記ガラス試験管に、ピロリジン４００μＬ及び酢酸４０μＬを添加して、１００℃で３０分間反応させた。
（ＩＩＩ）反応終了後、前記反応物に、ジクロロメタン２ｍＬと５％酢酸水溶液２ｍＬを加えて振り混ぜた後、ジクロロメタン相を回収した。
（ＩＶ）前記回収したジクロロメタン相から、窒素気流下で溶媒を除去した後、クロロホルム２００μＬに再溶解し、ピロリジド化処理物の試料溶液を得た。
＜加水分解メチルエステル化処理物の調製＞
（Ｉ）前記分解物に対して、前記メチルエステル化処理物の調製における（Ｉ）と同様の処理を行い、乾固物を得た。
（ＩＩ）前記乾固物に、０．５ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＯＨ・メタノール１ｍＬを添加し、５０℃で１時間反応させた。
（ＩＩＩ）前記反応物を放冷後、ヘキサン１ｍＬ、１ｍｏｌ／Ｌ塩酸試液０．５ｍＬを添加し、ヘキサン相を回収した。
（ＩＶ）前記回収したヘキサン相に対して、前記メチルエステル化処理物の調製における（ＩＶ）と同様の処理を行い、加水分解メチルエステル化処理物の試料溶液を得た。
＜加水分解ピロリジド化処理物の調製＞
　前記加水分解メチルエステル化処理物に対して、前記ピロリジド化処理物の調製における（Ｉ）～（ＩＶ）と同様の処理を行い、加水分解ピロリジド化処理物の試料溶液を得た。
（１－１）メチルエステル化処理物及び加水分解メチルエステル化処理物のＧＣ－ＭＳ
　前記メチルエステル化処理物及び前記加水分解メチルエステル化処理物を、下記条件で、ＧＣ－ＭＳ（ガスクロマトグラフ－マススペクトロメトリー）分析に供した。
＜ＧＣ－ＭＳ条件＞
機器：ＪＭＳ－７００Ｖ（日本電子（株）製）
カラム：ＳＰＢ－１　３０ｍ×０．２５ｍｍ　膜厚０．２５μｍ
カラム温度：５０℃（１分保持）→３００℃（＋８℃／分で昇温、３０分保持）
注入口温度：２５０℃
検出器：水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）　３００℃
注入量：１μＬ（ｓｐｌｉｔｌｅｓｓ注入）
キャリアガス：ヘリウム（線速度３０ｃｍ／ｓｅｃ、定流量モード）
検出器：ＭＳ
　　　　イオン化法：ＥＩ（Electron Ionization）
　　　　イオン化電流：３００μＡ
　　　　イオン化エネルギー：７０ｅＶ
　　　　イオン化室温度：３００℃
　　　　電子加速電圧：１０ｋＶ
　　　　走査範囲：ｍ／ｚ＝３５～５００（ｓｅｃ／ｓｃａｎ）
　この結果を、図１０及び図１１に示す。図１０は、前記メチルエステル化処理物をＧＣ－ＭＳ分析に供した際のマススペクトルであり、図１１は、前記加水分解メチルエステル化処理物をＧＣ－ＭＳ分析に供した際のマススペクトルである。図１０及び図１１において、縦軸は、検出強度を示し、横軸は、検出時間（ｍｉｎ）を示す。
　図１０に示すように、前記メチルエステル化処理物から、ピーク１～１１が得られた。これらの中で、検出強度が高かったピーク１、２、４、６及び７の化合物を、それぞれ、さらに、上記と同様の条件でＧＣ－ＭＳ分析に供した。得られたマススペクトルに対して、形状が似ているマススペクトルを有する構造物を、データベース（The NIST MassSpectral Seach Program for the NIST/EPA/NIH Mass Spectral Library）のAuto Modeによりライブラリ検索した。その結果、ピーク１、２、４及び７の化合物は、それぞれ、式（２）～（５）の化合物と、高い類似度を示した。また、本発明者らは、ピーク６の化合物のマススペクトルが、Strittmatterら（Strittmatter W. et al (1983), Journal of Bacteriology, Vol.155, No.1, p.153-p.158, Fig2）に記載の3-oxo-tetradecanoic acid methyl esterのマススペクトルと酷似していることを発見した。このため、ピーク６の化合物は、式（６）の3-oxo-tetradecanoic acid methyl esterであると推定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
　また、図１１に示すように、前記加水分解メチルエステル化処理物から、ピークＡ～Ｉが得られた。ここで、図１０のマススペクトルと図１１のマススペクトルを比較すると、図１０のピーク１、２及び４に対応するピークとして、図１１においては、それぞれ、ピークＡ、Ｂ及びＤが確認された。これらのピークＡ、Ｂ及びＤを、それぞれ、さらに、上記と同様の条件でＧＣ－ＭＳ分析に供した。得られたマススペクトルに対して、形状が似ているマススペクトルを有する構造物を、前記データベースを用いて検索した。その結果、ピークＡ、Ｂ及びＤは、それぞれ、式（７）、式（３）及び式（４）の化合物と、高い類似度を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
　なお、図１０のピーク６及び７に対応するピークは、図１１においては確認されなかったが、これは、つぎの理由によるものと思われる。すなわち、図１０は、前記分解物を加水分解せずにＧＣ－ＭＳ分析に供した結果であるのに対し、図１１は、前記分解物を加水分解し、加水分解により分離した物質のみをＧＣ－ＭＳ分析に供した結果である。このため、図１１において確認されるピークは、前記分解物中で加水分解されるエステル結合を有する化合物のピークであると考えられる。したがって、図１１で対応するピークが確認されなかった図１０のピーク６及び７の化合物は、加水分解されるエステル結合を有しない化合物であると推定される。
　図１０及び図１１の結果をまとめて、図１０において検出強度が高かったピーク１、２、４及び７の化合物を推定すると、つぎの説明及び表４に示すとおりとなる。まず、図１０のピーク１の化合物は、前述のように、ライブラリ検索の結果、式（２）の化合物であると推定された。しかし、ピーク１の化合物が式（２）の化合物である場合、図１０におけるピーク１よりも、短い保持時間（すなわち、左側）にピークが観察されるはずであり、整合がとれない。一方、図１０のピーク１に対応する図１１のピークＡの化合物は、前述のように、ライブラリ検索の結果、式（７）の化合物であると推定された。ピークＡの化合物が式（７）の化合物である場合、図１１におけるピークＡの結果とも整合がとれる。このため、図１０におけるピーク１の化合物は、式（７）の化合物であると推定した。つぎに、図１０におけるピーク２の化合物は、前述のように、ライブラリ検索の結果、式（３）のＢＨＴ（ジブチルヒドロキシトルエン）であると推定された。また、図１０のピーク２に対応する図１１のピークＢの化合物も、前述のように、ライブラリ検索の結果、式（３）のＢＨＴ（ジブチルヒドロキシトルエン）であると推定され、図１０と図１１とで結果は一致した。このため、図１０におけるピーク２の化合物は、式（３）のＢＨＴ（ジブチルヒドロキシトルエン）であると推定されたが、これは、前記分解物に含まれる化合物ではなく、試料溶液の調製において添加したＢＨＴ（ジブチルヒドロキシトルエン）であると推定された。そして、図１０におけるピーク４の化合物は、前述のように、ライブラリ検索の結果、式（４）の化合物であると推定された。また、図１０のピーク４に対応する図１１のピークＤの化合物も、前述のように、ライブラリ検索の結果、式（４）の化合物であると推定された。このため、図１０におけるピーク４の化合物は、式（４）の化合物であると推定された。なお、式（４）の化合物の炭素間二重結合決定に関する考察は、以下の（１－２）において詳述する。さらに、図１０のピーク７の化合物は、前述のように、ライブラリ検索の結果、式（５）の化合物であると推定された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
（１－２）ピロリジド化処理物及び加水分解ピロリジド化処理物のＧＣ－ＭＳ
　つぎに、式（４）の化合物における炭素間二重結合位置の決定を目的に、前記ピロリジド化処理物及び前記加水分解ピロリジド化処理物を、下記条件で、ＧＣ－ＭＳ分析に供した。
＜ＧＣ－ＭＳ条件＞
機器：ＪＭＳ－７００Ｖ（日本電子（株）製）
カラム：ＳＰＢ－１　３０ｍ×０．２５ｍｍ　膜厚０．２５μｍ
カラム温度：１００℃（１分保持）→３００℃（＋１０℃／分で昇温、３０分保持）
注入口温度：２８０℃
検出器：水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）　３００℃
注入量：１μＬ（ｓｐｌｉｔｌｅｓｓ注入）
キャリアガス：ヘリウム（線速度３０ｃｍ／ｓｅｃ、定流量モード）
検出器：ＭＳ
　　　　イオン化法：ＥＩ
　　　　イオン化電流：３００μＡ
　　　　イオン化エネルギー：７０ｅＶ
　　　　イオン化室温度：３００℃
　　　　電子加速電圧：１０ｋＶ
　　　　走査範囲：ｍ／ｚ＝３５～５００（ｓｅｃ／ｓｃａｎ）
　この結果を、図１２及び図１３に示す。図１２は、前記ピロリジド化処理物をＧＣ－ＭＳ分析に供した際のマススペクトルであり、図１３は、前記加水分解ピロリジド化処理物をＧＣ－ＭＳ分析に供した際のマススペクトルである。図１２及び図１３において、縦軸は、検出強度を示し、横軸は、時間（ｍｉｎ）を示す。
　図１２におけるピーク４及び図１３におけるピークＤの化合物を、それぞれ、さらに、上記と同様の条件でＧＣ－ＭＳ分析に供した。その結果、ピーク４の化合物からは、図１４に示すマススペクトルが得られ、ピークＤの化合物からは、図１５に示すマススペクトルが得られた。図１４及び図１５において、縦軸は、検出強度を示し、横軸は、ｍ／ｚ値を示す。ここで、式（８）に示すように、ヒドラジンが結合した炭素から数えて、４番目と５番目の炭素間で切断された場合、分子量は１４０となる。このため、ヒドラジンが結合した炭素から数えて、７番目と８番目の炭素間で切断された場合、二重結合がなければ、ｍ／ｚ＝１８２が検出されるはずだが、この位置に二重結合があるため、ｍ／ｚ＝１８０が検出された。以上より、式（４）の化合物における炭素間二重結合は、カルボニル結合の炭素から数えて７番目と８番目の間に存在すると推定された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
　以上、前記（１－１）及び前記（１－２）の結果をまとめると、前記分解物中には、式（４）～（７）の４種の化合物が含まれることが推定された。また、式（５）及び式（６）の化合物は、前述のとおり、前記分解物を加水分解により分離した物質のみをＧＣ－ＭＳ分析したところ、図１１においてピークが確認されなかったため、エステル結合を有しない化合物であると推定された。
（２）精製物の分解物の構造分析
　前記（１）で得た分解物の濃度が、３０ｍｇ／ｍＬとなるように調製したクロロホルム溶液０．１ｍＬから、溶媒を除去し、重ＤＭＳＯ６００μＬを添加し、５ｍｍ試験管に移し、これを試料溶液とした。
＜１ＨＮＭＲ測定及び１３ＣＮＭＲ測定＞
　前記試料溶液を、下記測定条件で１ＨＮＭＲ測定及び１３ＣＮＭＲ測定に供した。
（測定条件）
装置：ＵＮＩＴＹ　ＩＮＯＶＡ　５００型（バリアン社製）
観測周波数：４９９．８ＭＨｚ（１Ｈ核）
　　　　　　１２５．７ＭＨｚ（１３Ｃ核）
溶媒：重ＤＭＳＯ
基準（※）：溶媒：１Ｈ核（２．４９ｐｐｍ）、１３Ｃ核（３９．７ｐｐｍ）
温度：７０℃に設定
測定法：１３ＣＮＭＲ、ＤＥＰＴ、ＮＯＥＳＹ、ＲＯＥＳＹ、ＣＯＳＹ、ＴＯＣＳＹ、ＨＳＱＣ、ＨＭＢＣ
※　７０℃での重ＤＭＳＯでのケミカルシフトの値は、Albaら(Alba S. et al(2004), Glycobiology, vol.14, No.9, p.805-p.815)に記載の値を使用した。
＜３１ＰＮＭＲ測定＞
　２００μＬの８５％リン酸が入った３ｍｍ試験管を、前記試料溶液の入った前記５ｍｍ試験管に挿入した。この際、観測された８５％リン酸由来のシグナルを０．０００ｐｐｍに合わせ、その後、前記３ｍｍ試験管を抜き、前記試料溶液を、下記測定条件で３１ＰＮＭＲ測定に供した。
（測定条件）
装置：ＵＮＩＴＹ　ＩＮＯＶＡ　５００型（バリアン社製）
観測周波数：４９９．８ＭＨｚ（３１Ｐ核）
溶媒：重ＤＭＳＯ
基準：８５％リン酸（外部標準）：０．０００ｐｐｍ
温度：２５℃に設定
　この結果を、図１６～図１８に示す。図１６Ａ～図１６Ｄは、１ＨＮＭＲ測定のスペクトルであり、図１７Ａ～図１７Ｄは、１３ＣＮＭＲ測定のスペクトルであり、図１８は、３１ＰＮＭＲ測定のスペクトルである。図１６～図１８において、縦軸は、検出強度を示し、横軸は、化学シフト値（ｐｐｍ）を示す。
　図１６～図１８のスペクトルから、前記分解物は、前記４種の化合物とグルコサミン２分子とを含む式（９）の化合物であると推定された。式（９）において、２分子のグルコサミンに結合している前記４種の化合物は、左から順に、式（７）の化合物、式（５）の化合物、式（４）の化合物、式（７）の化合物及び式（６）の化合物である。なお、式（９）中の数字は、図１６の１ＨＮＭＲ測定のスペクトルにおけるピークの数字に対応し、式（９）中のアルファベット（大文字）は、図１７の１３ＣＮＭＲ測定のスペクトルにおけるピークのアルファベット（大文字）に対応し、式（９）中のアルファベット（小文字）は、図１８の３１ＰＮＭＲ測定のスペクトルにおけるピークのアルファベット（小文字）に対応する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
 ・・・（９）
（３）精製物の分解物の質量分析
　前記分解物が、式（９）の化合物であることをさらに裏付けるべく、以下の分析を行った。
　前記（１）で得た分解物の濃度が、３０ｍｇ／ｍＬとなるように調製したクロロホルム溶液を、メタノールにより４００００倍希釈した溶液を試料溶液とし、下記条件で、ＧＣ－ＭＳ分析に供した。
＜ＧＣ－ＭＳ条件＞
機器：amaZon ETD (Bruker Daltonics社製)にESI interfaceを装着
測定モード：ＥＳＩ－ＩＴ－ＭＳ、Ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｍｏｄｅ
　この結果を、図１９に示す。図１９は、前記試料溶液をＧＣ－ＭＳ分析に供した際のマススペクトルである。図１９において、縦軸は、検出強度を示し、横軸は、ｍ／ｚ値を示す。図１９に示すように、複数のピークが確認されたが、前記分解物の推定化合物である式（９）の化合物の分子量に最も近いピークは、ｍ／ｚ＝１４１７．９３のピークである。このため、ｍ／ｚ＝１４１７．９３が前記分解物のピークであると判断し、このピークを、さらに、同様の条件で、ＧＣ－ＭＳ／ＭＳ分析に供した。
　この結果を、図２０に示す。図２０は、図１９における、ｍ／ｚ＝１４１７．９３のピークの化合物を、ＧＣ－ＭＳ／ＭＳ分析に供した際のマススペクトルである。図２０において、縦軸は、検出強度を示し、横軸は、ｍ／ｚ値を示し、かっこ内の数値は、ｍ／ｚ値を示す。
　図２０から、つぎのことが推定された。ピーク１の化合物は、前述のとおり、式（９）の化合物であると推定された。ピーク２の化合物は、ピーク１のｍ／ｚ値（１４１７）からピーク２のｍ／ｚ値（１２２９）を引いた差分値が１８８であることから、前記分解物から分子量が約１８８である式（７）の化合物が分離した化合物であると推定された。ピーク３の化合物は、ピーク１のｍ／ｚ値（１４１７）からピーク３のｍ／ｚ値（１１９４）を引いた差分値が２２３であることから、前記分解物から分子量が約２２３である式（４）の化合物が分離した化合物であると推定された。ピーク４の化合物は、ピーク１のｍ／ｚ値（１４１７）からピーク４のｍ／ｚ値（１０４２）を引いた差分値が３７５であることから、前記分解物から分子量が約１８８である式（７）の化合物が２つ分離した化合物であると推定された。このように、式（９）の化合物から式（７）の化合物又は式（４）の化合物が分離した化合物を、ピーク２～４として確認できた。このことから、前記分解物中には、少なくとも、式（７）の化合物及び式（４）の化合物の２つは含まれていることが確認でき、前記（２）において推定した前記分解物の推定構造式（９）をさらに支持する結果が得られた。
（４）精製物の質量分析
　前記精製物を、Leoneら（Serena Leone et al, “ Structural elucidation of the core-lipid A backbone from the lipopolysaccharide of Acinetobacter radioresistens S13, an organic solvent tolerant Gram-negative bacterium”, Carbohydrate Research, April 10, 2006, Vol.341, issue.5, p.582-590）に記載の方法によりヒドラジン分解し、ヒドラジン分解物１０５．４ｍｇを得た。前記ヒドラジン分解物濃度が、２．１ｍｇ／ｍＬとなるように蒸留水に溶解し、メタノールにより２００倍希釈した溶液を試料溶液とし、下記条件で、ＧＣ－ＭＳ分析に供した。
＜ＧＣ－ＭＳ条件＞
機器：amaZon ETD (Bruker Daltonics社製)にelectrospray ionization (ESI) interfaceを装着
測定モード：ＥＳＩ－ＩＴ－ＭＳ、Ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｍｏｄｅ
　この結果を、図２１に示す。図２１は、前記試料溶液をＧＣ－ＭＳ分析に供した際のマススペクトルである。図２１において、縦軸は、検出強度を示し、横軸は、ｍ／ｚ値を示し、かっこ中の数値は、検出されるイオンの価数を示す。
　図２１に示す複数のピークのうち、最も大きなピーク（ｍ／ｚ＝５３８．１５）の化合物を、同様の条件で、ＧＣ－ＭＳ／ＭＳ分析に供し、図２２に示すマススペクトルを得た。さらに、図２２に示す複数のピークのうち、ｍ／ｚ＝４７４．２７のピークの化合物及びｍ／ｚ＝６０１．１７のピークの化合物を、同様の条件で、それぞれさらに、ＧＣ－ＭＳ／ＭＳ／ＭＳ分析に供し、図２３及び図２４に示すマススペクトルを得た。さらに、図２４に示す複数のピークのうち、ｍ／ｚ＝５５７．１９のピークの化合物及びｍ／ｚ＝６４５．１２のピークの化合物を、同様の条件で、それぞれさらに、ＧＣ－ＭＳ／ＭＳ／ＭＳ／ＭＳ分析に供し、図２５及び図２６に示すマススペクトルを得た。図２２～図２６において、縦軸は、検出強度を示し、横軸は、ｍ／ｚ値を示し、かっこ中の数値は、検出されるイオンの価数を示す。
　図２２～図２６には、マススペクトルに加えて、各ピークに対応すると推定される化合物の模式図を示した。前記模式図において、Ｐは、式（１０）の構造式を、Ｈｅｘは、式（１１）の構造式を、Ｋｄｏは、式（１２）の構造式を、ＨｅｘＵは、式（１３）の構造式を、ＨｅｘＮは、式（１４）の構造式を、Ｆは、前記（２）で推定した４種の化合物のいずれかを示す。なお、図２２～図２６において、Ｈｅｘは、グルコース（Ｇｌｃ）である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
（５）まとめ
　前記（１）～（４）の結果をまとめると、前記精製物は、式（Ａ）及び式（Ｂ）において、Ｘ１及びＸ２が、それぞれ、ヘキソース及びリン酸基である化合物（式（Ａ１）で表される化合物及び式（Ｂ１）で表される化合物）を含むことが特定された。なお、前記（２）においては、式（９）に示すように、β－１，６－ジグルコサミン骨格の１位の炭素には、ヒドロキシル基が結合していると推定された。一方、前記（４）においては、図２１の模式図に示すように、β－１，６－ジグルコサミン骨格の１位の炭素には、リン酸基が結合していると推定された。これについては、つぎの理由により、後者のリン酸基が正しい構造であると特定した。すなわち、前記（２）においては、前記精製物に所定の処理を施し、前記分解物を得ているが、この過程で弱酸を用いる際、グルコサミン２分子の内の右側のグルコサミンに結合しているリン酸基が脱落し、－ＯＨ基に置き換わる頻度が高いことが一般的に知られているためである。
（６）糖鎖部分のＮＭＲ解析
　前記（４）で得たヒドラジン分解物を、４ｍｏｌ／ＬのＫＯＨで処理し、遊離した糖鎖部分を、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー（Bio-Rad社製のBio-gel P4 media Extra fine <45μｍ(wet):#150-4128）により分画・精製した。図２８のグラフに、そのゲルろ過パターンを示す。
　図２８におけるFraction No. 14-18をまとめたもの（乾燥重量４．８ｍｇ）を、５００μＬのＤ２Ｏ（９９．９６％　Ｄ）に溶解し、ＮＭＲ測定用の試料（以下、「試料Ａ」と言う。）とした。ＮＭＲ測定は、下記条件で実施した。
（測定条件）
装置：DRX500及びADVANCE600分光器（BrukerBioSpin社製）
プローブ：cryogenic TXI probe、TXI probe及びBBO probe
プローブ温度：２５℃
測定法：１Ｄ　１Ｈ、１Ｄ　１Ｈ－ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ＴＯＣＳＹ、１Ｈ－ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ＮＯＥＳＹ、１Ｈ－ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ＲＯＳＥＹ、１Ｄ　１３Ｃ、１Ｄ　３１Ｐ、２Ｄ　１Ｈ－１Ｈ　ＤＱＦ－ＣＯＳＹ、ＨＯＨＡＮＡ、ＮＯＥＳＹ、ＲＯＥＳＹ、１Ｈ－１３Ｃ　ＨＳＱＣ－ＴＯＣＳＹ、１Ｈ－１３Ｃ　ＨＳＱＣ－ＮＯＥＳＹ、１Ｈ－１３Ｃ　ＨＭＢＣ、１Ｈ－３１Ｐ　ＨＭＢＣ
　まず、各糖残基のアノマー位に由来するシグナル（Ｈ１）を同定し、アノマー位のシグナルを拠点として、ＤＱＦ－ＣＯＳＹ、ＨＯＨＡＮＡ、１Ｈ－１３Ｃ　ＨＳＱＣ－ＴＯＣＳＹスペクトルから残基内のシグナル（グルコース残基及びグルコサミン残基の場合は、Ｈ２－Ｈ６、グルクロン酸残基の場合は、Ｈ２－Ｈ５）を同定した。この結果を、図２９及び図３０に示す。図２９は、前記試料Ａを１ＨＮＭＲ測定に供した際のスペクトルであり、図３０は、前記試料Ａを２Ｄ　ＤＱＦ－ＣＯＳＹ測定に供した際のスペクトルである。なお、図２９及び図３０において、Ｇｌｃは、図２２～図２６におけるＨｅｘに、ＫＤＯは、図２２～図２６におけるＫｄｏに、ＧｌｃＡは、図２２～２６におけるＨｅｘＵに、ＧｌｃＮは、図２２～２６におけるＨｅｘＮに対応し、これ以降において同様である。ＫＤＯの場合は、３位のプロトン（Ｈ３ａｘ、Ｈ３ｅｑ）を拠点にして、ＫＤＯ残基内のシグナル（Ｈ４－Ｈ８）の帰属を行った。
　糖残基間の結合については、ＮＯＥＳＹスペクトル中で観測される糖残基間のＮＯＥシグナル（図３１）及び１Ｈ－１３Ｃ　ＨＭＢＣスペクトル中で観測される糖残基間の相関シグナルによって同定を行った。図３１は、前記試料Ａを２Ｄ　ＮＯＥＳＹ測定に供した際のスペクトルである。
　各糖残基の結合様式（α／β）については、１Ｊ（Ｃ１，Ｈ１）によって、下記のとおり決定した。
１Ｊ（Ｃ１，Ｈ１）
ＧｌｃＮ－１　１７４　Ｈｚ　（α）
ＧｌｃＮ－２　１６４　Ｈｚ　（β）
ＧｌｃＡ　　　１７１　Ｈｚ　（α）
Ｇｌｃ－１　　１７３　Ｈｚ　（α）
Ｇｌｃ－２　　１７１　Ｈｚ　（α）
　リン酸基の存在及び結合部位に関しては、１Ｄ　３１Ｐ及び１Ｈ－１３Ｃ　ＨＭＢＣにより明らかとした。この結果を、図３２に示す。図３２は、試料Ａを２Ｄ　１Ｈ－３１Ｐ　ＨＭＢＣ測定に供した際のスペクトルである。２つのリン酸基のうち、１つは、ＧｌｃＮ－１の１位に、もう１つは、ＧｌｃＮ－２の４位に結合していた。
　以上の結果から、前記試料Ａの構造は、図３３の模式図に示すものと特定された。この結果から、前記（４）で得たヒドラジン分解物のヒドラジン分解前の化合物は、式（Ａ）及び式（Ｂ）において、Ｘ１及びＸ２が、いずれも水酸基である化合物（式（Ａ２）で表される化合物及び式（Ｂ２）で表される化合物）を含むことが特定された。これらの化合物の単糖類の記号を用いた構造式は、下記のとおりである。なお、図３３には、イス型配座による糖鎖構造式を示している。
式（Ａ２）で表される化合物
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000028
 式（Ｂ２）で表される化合物
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000029
〔実施例３〕
　式（Ａ１）で表される化合物、式（Ｂ１）で表される化合物、式（Ａ２）で表される化合物及び式（Ｂ２）で表される化合物が、抗炎症効果を有することを確認した。
（１）被験液の調製
　実施例１で得た精製物（式（Ａ１）で表される化合物、式（Ｂ１）で表される化合物、式（Ａ２）で表される化合物及び式（Ｂ２）で表される化合物の混合物）を、２ｍｇ／ｍＬの濃度となるように注射用水に溶解し４℃で保存した溶液を、３７℃で５分加熱し、３７℃、１分の条件で超音波処理した。前記超音波処理後の前記溶液１０μＬを、下記の組成の培養液９９０μＬに添加して十分に混合し、前記精製物の濃度が、２００００ｎｇ／ｍＬの溶液を調製し、これを、前記培養液を用いて段階的に希釈することにより、２０００ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ及び０．２ｎｇ／ｍＬである計６種類の被験液を得た。なお、前記６種類の被験液は、細胞への添加の際に２倍希釈されるため、前記精製物の終濃度は、それぞれ、１００００ｎｇ／ｍＬ、１０００ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ及び０．１ｎｇ／ｍＬとなる。
[培養液の組成]
ＤＭＥＭ培地　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５００ｍＬ
ウシ胎児血清　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５５．５ｍＬ
ペニシリン－ストレプトマイシン－グルタミン（１００×）　５．６ｍＬ
（２）被験液の添加
　ヒトＴＬＲ４遺伝子を導入したヒト胎児由来腎臓細胞（InvivoGen社製）に、前記培養液を添加し、前記細胞の濃度が、４×１０５細胞／ｍＬとなる溶液を調製した。前記溶液を、９６ウェル平底プレートに、１００μＬずつ（すなわち、４×１０４細胞／１００μＬ／ウェル）となるように播種した。播種後、３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間培養した後、培養上清を除去し、新たな前記培養液を各ウェルに１００μＬずつ添加した。つぎに、前記被験液を各ウェルに１００μＬずつ添加した。前記被験液の添加後、３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間培養した。
（３）ＩＬ－８の濃度の測定
　各ウェルの培養上清を回収し、Human IL-8 ELISA MAX（登録商標） Standard（Biolegend社製）を用い、インターロイキン－8（Interleukin-8：IL－8）の濃度を測定した。
　測定結果を、図３のグラフに示す。図３において、縦軸は、ＩＬ－８の濃度を示し、横軸は、被験液の濃度を示す。図３に示すように、被験液の濃度依存的に、ＩＬ－８の濃度が上昇した。ここで、ＩＬ－８の生産量は、一般的に、ＴＬＲ４活性化の指標となることが知られており、また、前述のとおり、ＴＬＲ４の活性化は、抗炎症作用を有するＩ型インターフェロンの産生を促すことが報告されている。すなわち、ＩＬ－８の濃度の上昇は、抗炎症作用の活性化を意味する。このため、これらの結果から、前記精製物（式（Ａ１）で表される化合物、式（Ｂ１）で表される化合物、式（Ａ２）で表される化合物及び式（Ｂ２）で表される化合物の混合物）が、抗炎症作用を有することが確認された。なお、前記精製物に代えて、式（Ａ１）で表される化合物、式（Ｂ１）で表される化合物、式（Ａ２）で表される化合物又は式（Ｂ２）で表される化合物を用いても、同等の結果が得られた。
〔実施例４〕
　式（Ａ１）で表される化合物、式（Ｂ１）で表される化合物、式（Ａ２）で表される化合物及び式（Ｂ２）で表される化合物が、抗炎症効果を有することを確認した。
（１）被験液の調製
　実施例３における「（１）被験液の調製」と同様にして、前記精製物の濃度が、２００００ｎｇ／ｍＬの溶液を調製し、これを、下記の組成の培養液を用いて段階的に希釈することにより、１００ｎｇ／ｍＬ及び１００００ｎｇ／ｍＬである計２種類の被験液を得た。なお、前記２種類の被験液は、細胞への添加の際に１００倍希釈されるため、前記精製物の終濃度は、それぞれ、１ｎｇ／ｍＬ及び１００ｎｇ／ｍＬとなる。
[培養液の組成]
ＲＰＭＩ１６４０培地　　　　　　　　　　　　　　　　　　５００ｍＬ
非動化ウシ胎児血清　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５５．５ｍＬ
ペニシリン－ストレプトマイシン－グルタミン（１００×）　５．６ｍＬ
（２）被験液の添加
　マウスマクロファージ細胞（ＲＡＷ２６４．７、ＡＴＣＣ）に、前記培養液を添加し、前記細胞の濃度が、１．０６７×１０６細胞／ｍＬとなる溶液を調製した。前記溶液を、６ウェルプレートに、３ｍＬずつ（すなわち、３．２×１０６細胞／３ｍＬ／ウェル）となるように播種した。播種後、３７℃、５％ＣＯ２下で２時間培養した後、前記被験液を各ウェルに３０μＬずつ添加した。前記被験液の添加後、３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間培養した。つぎに、前記各ウェルの培養上清を、１５ｍＬチューブに回収した。そして、前記各ウェルに、新たな前記培養液１ｍＬを添加し、ウェル全体に行き渡らせた後、前記１５ｍＬチューブに回収する作業を２回繰り返した。その後、前記１５ｍＬチューブに回収した前記培養液を、１０００ｒｐｍ、３分の条件で遠心分離した後、上清を除去し、さらに、３７℃の新たな前記培養液３ｍＬを添加して懸濁し、再度同様の条件で遠心分離した。遠心分離後、上清を除去し、沈殿に、３７℃の新たな前記培養液２ｍＬを添加して懸濁した。そして、前記懸濁液を、２ｍＬずつ、新たな前記培養液１ｍＬが予め添加してある状態の各ウェルに添加した。その後、新たな前記培養液３０μＬを添加した（以下、この工程を、「培養液添加工程」という。）。添加後、３７℃、５％ＣＯ２下で３０分培養した後、前記各ウェルの培養上清を、１５ｍＬチューブに回収し、１０００ｒｐｍ、３分の条件で遠心分離し、上清をアスピレーターにより除去した。さらに、培養上清を除去した前記６ウェルプレートの各ウェルに、冷却したＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒｅｄ　ｓａｌｉｎｅ）／Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ液３ｍＬを添加し、ピペッティングにより細胞を剥がし、細胞懸濁液を前記１５ｍＬチューブに添加した。前記１５ｍＬチューブを、１０００ｒｐｍ、３分の条件で遠心分離し、上清をアスピレーターにより除去した後、前記１５ｍＬチューブに冷却した前記ＰＢＳ／Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ液０．５ｍＬを添加して懸濁することにより、細胞懸濁液を調製した。前記細胞懸濁液から、Ｎｕｃｌｅａｒ　Ｅｘｔｒａｃｔ　キット（アクティブ　モティフ社製）を用いて、核タンパク質を抽出した。
（３）核内ＮＦ－κＢ量の測定
　Ｔｒａｎｓ　ＡＭ　ＮＦ－κＢ　ｐ６５キット（アクティブ　モティフ社製）を用いて吸光度を測定することにより、前記核タンパク質中のＮＦ－κＢ量を確認した。
　確認結果を、図４のグラフに示す。図４において、縦軸は、吸光度を示し、横軸は、被験液の濃度を示す。図４に示すように、吸光度が、被験液の濃度が高い程、低い値となったことから、前記核タンパク質中のＮＦ－κＢ量は、被験液の濃度が高い程、少なくなることがわかった。この結果から、前記精製物により、炎症性サイトカインの一種であるＮＦ－κＢの産生が抑制される、すなわち、前記精製物（式（Ａ１）で表される化合物、式（Ｂ１）で表される化合物、式（Ａ２）で表される化合物及び式（Ｂ２）で表される化合物の混合物）が、抗炎症効果を有することが確認された。なお、前記精製物に代えて、式（Ａ１）で表される化合物、式（Ｂ１）で表される化合物、式（Ａ２）で表される化合物又は式（Ｂ２）で表される化合物を用いても、同等の結果が得られた。
〔実施例５〕
　式（Ａ１）で表される化合物、式（Ｂ１）で表される化合物、式（Ａ２）で表される化合物及び式（Ｂ２）で表される化合物が、抗炎症効果を有することを確認した。
　本例では、つぎの２点以外は、実施例４と同様にして実験を行い、吸光度を測定することにより、前記核タンパク質中のＮＦ－κＢ量を確認した。すなわち、本例では、被験液として、前記精製物の濃度が、１００ｎｇ／ｍＬ、１００００ｎｇ／ｍＬ及び１００００００ｎｇ／ｍＬである３種類の被験液を用いた。なお、前記３種類の被験液は、細胞への添加の際に１００倍希釈されるため、前記精製物の終濃度は、それぞれ、１ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ及び１００００ｎｇ／ｍＬとなる。また、本例では、実施例３における前記培養液添加工程において、前記培養液３０μＬに代えて、終濃度１００ｎｇ／ｍＬのグラム陰性菌であるパントエア　アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ　ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）から精製したＬＰＳ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，　Ｐａｎｔｏｅａ　ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ、自然免疫応用技研（株）製、以下、「ＬＰＳｐ」という。）を含む前記培養液３０μＬを添加した。
　確認結果を、図５のグラフに示す。図５において、縦軸は、吸光度を示し、横軸は、被験液の濃度を示す。図５に示すように、吸光度が、被験液の濃度が高い程、低い値となったことから、前記核タンパク質中のＮＦ－κＢ量は、被験液の濃度が高い程、少なくなることがわかった。この結果から、前記精製物により、炎症性サイトカインの一種であるＮＦ－κＢの産生が抑制される、すなわち、前記精製物（式（Ａ１）で表される化合物、式（Ｂ１）で表される化合物、式（Ａ２）で表される化合物及び式（Ｂ２）で表される化合物の混合物）が、抗炎症効果を有することが確認された。なお、前記精製物に代えて、式（Ａ１）で表される化合物、式（Ｂ１）で表される化合物、式（Ａ２）で表される化合物又は式（Ｂ２）で表される化合物を用いても、同等の結果が得られた。
〔実施例６〕
　式（Ａ１）で表される化合物、式（Ｂ１）で表される化合物、式（Ａ２）で表される化合物及び式（Ｂ２）で表される化合物が、抗炎症効果を有することを確認した。
（１）被験液の調製
　実施例３における「（１）被験液の調製」と同様にして、前記精製物の濃度が、２００００ｎｇ／ｍＬの溶液を調製し、これを、下記組成の培養液を用いて段階的に希釈することにより、２ｎｇ／ｍＬ、０．２ｎｇ／ｍＬ及び０．０２ｎｇ／ｍＬである計３種類の被験液を得た。なお、前記３種類の被験液は、細胞への添加の際に２倍希釈されるため、前記精製物の終濃度は、それぞれ、１ｎｇ／ｍＬ、０．１ｎｇ／ｍＬ及び０．０１ｎｇ／ｍＬとなる。
[培養液の組成]
ＲＰＭＩ１６４０培地　　　　　　　　　　　　　　　　　５００ｍＬ
ウシ胎児血清　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５５．５ｍＬ
硫酸カナマイシン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．１１ｍＬ
アンピシリンナトリウム　　　　　　　　　　　　　　　　０．１３４ｍＬ
（２）被験液の添加
　マウスマクロファージ細胞（ＲＡＷ２６４．７、ＡＴＣＣ）に、前記培養液を添加し、前記細胞の濃度が、４×１０５細胞／ｍＬとなる溶液を調製した。前記溶液を、９６ウェル平底プレートに、１００μＬずつ（すなわち、４×１０４細胞／１００μＬ／ウェル）となるように播種した。播種後、３７℃、５％ＣＯ２下で、前記細胞がウェルの底に接着して伸展するまで２時間培養した。つぎに、前記被験液を各ウェルに１００μＬずつ添加した。前記被験液の添加後、３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間培養した。培養後、各ウェルの培養上清を除去し、新たに前記培養液１５０μＬを添加し（以下、この工程を、「培養液添加工程」という。）、３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間培養した。
（３）ＴＮＦ－α濃度の測定
　培養後、各ウェルの培養上清５０μＬを回収し、新たな９６ウェル平底プレートの各ウェルへと移し、ｍｏｕｓｅ　ＴＮＦ－α測定キット（Biolegend社製）を用いて吸光度を測定し、ＴＮＦ－α濃度に換算した。
　測定結果を、図６のグラフに示す。図６において、縦軸は、ＴＮＦ－α濃度を示し、横軸は、被験液の濃度を示す。図６に示すように、ＴＮＦ－α濃度が、被験液の濃度が高い程、低い値となったことから、ＴＮＦ－αの産生は、被験液の濃度が高い程、少なくなることがわかった。この結果から、前記精製物により、炎症性サイトカインの一種であるＴＮＦ－αの産生が抑制される、すなわち、前記精製物（式（Ａ１）で表される化合物、式（Ｂ１）で表される化合物、式（Ａ２）で表される化合物及び式（Ｂ２）で表される化合物の混合物）が、抗炎症効果を有することが確認された。なお、前記精製物に代えて、式（Ａ１）で表される化合物、式（Ｂ１）で表される化合物、式（Ａ２）で表される化合物又は式（Ｂ２）で表される化合物を用いても、同等の結果が得られた。
〔実施例７〕
　式（Ａ１）で表される化合物、式（Ｂ１）で表される化合物、式（Ａ２）で表される化合物及び式（Ｂ２）で表される化合物が、抗炎症効果を有することを確認した。
　本例では、以下の２点以外は、実施例６と同様にして実験を行い、各ウェルの培養上清５０μＬを回収し、ＴＮＦ－α濃度を測定した。すなわち、本例では、被験液として、前記精製物の濃度が、２０μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ及び２ｎｇ／ｍＬである計５種類の被験液を用いた。なお、前記５種類の被験液は、細胞への添加の際に２倍希釈されるため、前記精製物の終濃度は、それぞれ、１０μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ及び１ｎｇ／ｍＬとなる。また、本例では、実施例５における前記培養液添加工程において、前記培養液１５０μＬに代えて、終濃度１００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳｐを含む前記培養液１５０μＬを添加した。
　測定結果を、図７のグラフに示す。図７において、縦軸は、ＴＮＦ－α濃度を示し、横軸は、被験液の濃度を示す。図７に示すように、ＴＮＦ－α濃度が、被験液の濃度が高い程、低い値となったことから、ＴＮＦ－αの産生は、被験液の濃度が高い程、少なくなることがわかった。この結果から、前記精製物により、炎症性サイトカインの一種であるＴＮＦ－αの産生が抑制される、すなわち、前記精製物（式（Ａ１）で表される化合物、式（Ｂ１）で表される化合物、式（Ａ２）で表される化合物及び式（Ｂ２）で表される化合物の混合物）が、抗炎症効果を有することが確認された。なお、前記精製物に代えて、式（Ａ１）で表される化合物、式（Ｂ１）で表される化合物、式（Ａ２）で表される化合物又は式（Ｂ２）で表される化合物を用いても、同等の結果が得られた。
〔実施例８〕
〔実施例８－１〕
　式（Ａ１）で表される化合物、式（Ｂ１）で表される化合物、式（Ａ２）で表される化合物及び式（Ｂ２）で表される化合物が、抗炎症効果を有することを確認した。
（１）被験液の調製
　実施例３における「（１）被験液の調製」と同様にして、前記精製物の濃度が、２００００ｎｇ／ｍＬの溶液を調製し、これを、下記組成の培養液を用いて段階的に希釈することにより、４００ｎｇ／ｍＬ、４０００ｎｇ／ｍＬ及び４００００ｎｇ／ｍＬである計３種類の被験液を得た。なお、前記３種類の被験液は、細胞への添加の際に４倍希釈されるため、前記精製物の終濃度は、それぞれ、１００ｎｇ／ｍＬ、１０００ｎｇ／ｍＬ及び１００００ｎｇ／ｍＬとなる。
[培養液の組成]
ＲＰＭＩ１６４０培地　　　　　　　　　　　　　　　　　　５００ｍＬ
非動化ウシ胎児血清　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５５．５ｍＬ
ペニシリン－ストレプトマイシン－グルタミン（１００×）　５．６ｍＬ
（２）被験液の添加
　ヒト末梢血単球由来細胞（ＴＨＰ－１、ＤＳファーマバイオメディカル（株）製）に、前記培養液を添加し、前記細胞の濃度が、４×１０５細胞／ｍＬとなる溶液を調製した。前記溶液を、２４ウェルプレートに、５００μＬずつ（すなわち、２．０×１０５細胞／５００μＬ／ウェル）となるように播種した。播種後、前記培養液２５０μＬ、又は、４０μｍｏｌ／ＬのＧＷ９６６２（和光純薬工業（株）製）を含有する前記培養液２５０μＬを、各ウェルに添加した。なお、前記ＧＷ９６６２は、核内受容体の一種であるＰＰＡＲγ（Peroxisome proliferator-activated receptor γ）の阻害剤である。添加後、３７℃、５％ＣＯ２下で１時間培養した。その後、前記被験液を各ウェルに２５０μＬずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ２下で２２時間培養した。培養後、各ウェルの培養上清を、２ｍＬチューブに回収した。また、各ウェルに新たな前記培養液０．５ｍＬを添加し、ウェル全体に行き渡らせ、前記２ｍＬチューブに回収した。空になった各ウェルには、新たな前記培養液０．４９ｍＬを添加しておいた。前記２ｍＬチューブに回収した前記培養液を、１０００ｒｐｍ、５分の条件で遠心分離し、上清を除去し、さらに、新たな前記培養液１ｍＬを添加して懸濁し、再度同様の条件で遠心分離した。遠心分離後、上清を除去し、各ウェル中の０．４９ｍＬの培養液を、前記２ｍＬチューブに添加して懸濁し、各ウェルに再び戻した。そして、各ウェルに、培養液２５０μＬ、又は、４０μｍｏｌ／Ｌの前記ＧＷ９６６２を含有する培養液２５０μＬを添加し、３７℃、５％ＣＯ２下で１時間培養した。培養後、各ウェルに対して、前記ＬＰＳｐの終濃度が１００ｎｇ／ｍＬとなるように、ＬＰＳｐを含む培養液２５０μＬを添加して、３７℃、５％ＣＯ２下で２２時間培養した。
（３）ＩＬ－８の濃度の測定
　培養後、各ウェルの培養上清をチューブに回収して遠心分離し、上清を１．５ｍＬチューブに回収し、Human IL-6 ELISA MAX Deluxe（Biolegend社）を用いて吸光度を測定し、インターロイキン－６（Interleukin6：IL－6）の濃度を換算した。
　測定結果を、図８のグラフに示す。図８において、縦軸は、ＩＬ－６の濃度を示し、横軸は、被験液の濃度を示す。図８に示すように、ＧＷ９６６２－の場合、すなわち、ＰＰＡＲγが阻害されていない時は、ＩＬ－６濃度が、被験液の濃度が高い程、低い値となったことから、ＩＬ－６の産生は、被験液の濃度が高い程、少なくなることがわかった。これに対して、ＧＷ９６６２＋の場合、すなわち、ＰＰＡＲγが阻害されている時も、ＩＬ－６濃度が、被験液の濃度が高い程、低い値となったことから、ＩＬ－６の産生は、被験液の濃度が高い程、少なくなることがわかったものの、その減少の程度は、ＰＰＡＲγが阻害されていない時ほど顕著ではなかった。この結果から、前記精製物により、炎症性サイトカインの一種であるＩＬ－６の産生が抑制される、すなわち、前記精製物（式（Ａ１）で表される化合物、式（Ｂ１）で表される化合物、式（Ａ２）で表される化合物及び式（Ｂ２）で表される化合物の混合物）が、抗炎症効果を有することが確認された。また、前記精製物（式（Ａ１）で表される化合物、式（Ｂ１）で表される化合物、式（Ａ２）で表される化合物及び式（Ｂ２）で表される化合物の混合物）によるＩＬ－６の産生抑制には、ＰＰＡＲγが関与していることが示唆された。なお、前記精製物に代えて、式（Ａ１）で表される化合物、式（Ｂ１）で表される化合物、式（Ａ２）で表される化合物又は式（Ｂ２）で表される化合物を用いても、同等の結果が得られた。
〔実施例８－２〕
　式（Ａ１）で表される化合物、式（Ｂ１）で表される化合物、式（Ａ２）で表される化合物及び式（Ｂ２）で表される化合物が、ＰＰＡＲγ遺伝子の発現を促進することを、理化学研究所が開発したCAGE（Cap Analysis of Gene Expression）法により確認した。
　前記ＴＨＰ－１細胞に、実施例８－１（２）と同様の培養液を添加し、前記細胞の濃度が、５×１０５細胞／ｍＬとなる溶液を調製した。この溶液のＰＰＡＲγ遺伝子の発現量を、前記CAGE法により測定したところ、３．９７ＴＰＭ（Ｔａｇｓ　Ｐｅｒ　Ｍｉｌｌｉｏｎ）であった。前記測定後、この細胞溶液を、つぎの４群に分けた。すなわち、前記細胞溶液に終濃度１μｇ／ｍＬとなるように前記精製物の溶液を添加した群（実施例８－２Ａ）、前記細胞溶液に終濃度１０μｇ／ｍＬとなるように前記精製物の溶液を添加した群（実施例８－２Ｂ）、前記細胞溶液に何も添加しなかった群（比較例８－２Ａ）、及び、前記細胞溶液に１００ｎｇ／ｍＬとなるようにＬＰＳｐ溶液を添加した群（比較例８－２Ｂ）の計４群である。前記４群を３時間培養後、前記CAGE法によりＰＰＡＲγ遺伝子の発現量を測定した。この結果を、図２７に示す。図２７は、ＰＰＡＲγ遺伝子の発現量を示すグラフである。図２７において、横軸は、培養時間を示し、縦軸は、ＰＰＡＲγ遺伝子の発現量（ＴＰＭ）を示す。図２７に示すように、実施例８－２Ａでは、３時間の間に、ＰＰＡＲγ遺伝子の発現量が３．９７ＴＰＭから５．８６ＴＰＭに大幅に増加し、実施例８－２Ｂでも、３時間の間に、ＰＰＡＲγ遺伝子の発現量が３．９７ＴＰＭから５．９０ＴＰＭに大幅に増加した。これに対して、比較例８－２Ａでは、３時間の間に、ＰＰＡＲγ遺伝子の発現量が３．９７ＴＰＭから３．８９ＴＰＭへと僅かに減少し、比較例８－２Ｂでは、３時間の間に、ＰＰＡＲγ遺伝子の発現量が３．９７ＴＰＭから４．３１ＴＰＭへと増加したものの、増加の程度は顕著ではなかった。この結果から、前記精製物（式（Ａ１）で表される化合物、式（Ｂ１）で表される化合物、式（Ａ２）で表される化合物及び式（Ｂ２）で表される化合物の混合物）が、ＰＰＡＲγ遺伝子の発現を促進することが確認された。なお、前記精製物に代えて、式（Ａ１）で表される化合物、式（Ｂ１）で表される化合物、式（Ａ２）で表される化合物又は式（Ｂ２）で表される化合物を用いても、同等の結果が得られた。
〔実施例９〕
　式（Ａ１）で表される化合物、式（Ｂ１）で表される化合物、式（Ａ２）で表される化合物及び式（Ｂ２）で表される化合物が、肺がんに対する抗がん効果を有することを確認した。
（１）担癌マウスの作製
　ルイス肺がん由来細胞株(Lewis lung carcinoma：3LL、ＪＣＲＢ細胞バンクより入手)の懸濁液を、1匹当たりのがん細胞投与量が２．５×１０５ｃｅｌｌｓ／２００μＬとなるように、６週齢の雄性Ｃ５７　ＢＬ／６Ｊマウス５匹の腹側部に皮下投与した。投与から２週間後、前記マウス１匹から腫瘍を摘出し、ディッシュ上でＰＢＳ（－）を用いて洗浄した。つぎに、洗浄した前記腫瘍を２ｍｍ角程度に細かくきざみ腫瘍断片とし、前記腫瘍断片を５０ｍＬチューブに移して、コラゲナーゼ液５ｍＬを添加し、３７℃で１０分温めた。その後、前記腫瘍断片を含むコラゲナーゼ液をピペッティングすることにより、さらに細かい腫瘍断片とし、前記腫瘍断片を含むコラゲナーゼ液を別の５０ｍＬチューブに移し、氷上で冷却した。冷却後、前記腫瘍断片を含むコラゲナーゼ液にさらにコラゲナーゼ液５ｍＬを添加し、同様の操作を、腫瘍断片を観察できなくなるまで５回繰り返した。その後、前記腫瘍断片を含むコラゲナーゼ液をセルストレイナー（メッシュサイズ７０μｍ、ＢＤ社製）でろ過し、ろ過液を１２００ｒｐｍ、７分の条件で遠心分離した。遠心分離後、上清を除去し、沈殿に、ＲＰＭＩ１２６０培地（血清無添加）２０ｍＬを添加し、転倒混和による懸濁後、１２００ｒｐｍ、７分の条件で遠心分離した。遠心分離後、上清を除去し、沈殿に、ＰＢＳ（－）を添加し２回洗浄した後、ＰＢＳ（－）１０ｍＬを添加し懸濁し、がん細胞懸濁液を調製した。前記がん細胞懸濁液を、１匹当たりのがん細胞投与量が２．５×１０５ｃｅｌｌｓ／２００μＬとなるように、前記マウス１２匹の腹側部に皮下投与した。投与から１４日後、前記マウス１０匹から腫瘍を摘出し、前述と同様の方法で、がん細胞懸濁液を調製した。前記がん細胞懸濁液を、１匹当たりのがん細胞投与量が２．５×１０５ｃｅｌｌｓ／５０μＬとなるように、前記マウス１０８匹の腹部皮内に投与した。投与後、各マウスの腫瘍サイズが直径５ｍｍ程度になった時点（投与後８日目）で、マウスを下記に示す６群（各群ｎ＝６）に分けた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000030
（２）薬剤の投与
　群分けした後、各群に、前記表５に示す物質を投与した。前記精製物の投与は、実施例９－１及び実施例９－２の腹腔内投与（ｉｐ）においては、マウスにおける前記精製物の摂取量が０．５ｍｇ／１０ｍＬ／ｋｇとなるように、群分け直後に１回行い、実施例９－３及び実施例９－４の自由摂取（ｐｏ）の場合は、前記精製物の濃度が１μｇ／ｍＬの溶液が入った給水瓶を用いて、群分け直後から開始した。なお、給水瓶は３日ごとに新しいものへと交換した。比較例９－１の生理食塩水の投与は、ｉｐにより、マウスの生理食塩水摂取量が１０ｍＬ／ｋｇとなるように、群分け直後に１回行った。実施例９－２、実施例９－４及び参考例９－１におけるＣＹ（シクロフォスファミド、肺がんに対する抗がん剤、和光純薬工業（株）製）の投与は、ｉｐにより、マウスのＣＹ摂取量が１００ｍｇ／１０ｍＬ／ｋｇとなるように、群分け直後に１回行った。
（３）腫瘍体積の計測
　群分けした日を０日目として、３日目、６日目及び９日目に、ノギスを用いて腫瘍の長径及び短径を測定し、それを基に腫瘍体積を算出した。腫瘍体積の算出は、Shime ら（Shime H, et al, “ Toll-like receptor 3 signaling converts tumor-supporting myeloid cells to tumoricidal effectors”, Proc Natl Acad Sci USA, February 7, 2012, Vol.109, no.6, p.2066-2071）に記載の方法に従い、計算式：長径(mm)×短径(mm)2×0.4＝腫瘍体積（mm3）により行った。
　計測結果を、図９のグラフに示す。図９において、縦軸は、腫瘍体積（ｍｍ３）を示し、横軸は、群分けした日を０日目とした時の、群分け後の経過日数を示す。図９に示すように、前記精製物を投与した実施例９－１及び実施例９－２では、生理食塩水を投与した比較例９－１と比較して、腫瘍体積が小さかった。このことから、前記精製物（式（Ａ１）で表される化合物、式（Ｂ１）で表される化合物、式（Ａ２）で表される化合物及び式（Ｂ２）で表される化合物の混合物）は、肺がんに対する抗がん効果を有することが確認された。また、前記精製物に加え、ＣＹを投与した実施例９－２及び実施例９－４では、ＣＹのみを投与した参考例９－１と比較して、腫瘍体積が小さかった。このことから、前記精製物（式（Ａ１）で表される化合物、式（Ｂ１）で表される化合物、式（Ａ２）で表される化合物及び式（Ｂ２）で表される化合物の混合物）は、ＣＹの肺がんに対する抗がん効果を増強する効果を有することが確認された。なお、前記精製物に代えて、式（Ａ１）で表される化合物、式（Ｂ１）で表される化合物、式（Ａ２）で表される化合物又は式（Ｂ２）で表される化合物を用いても、同等の結果が得られた。
　以上、実施形態及び実施例を参照して本発明を説明したが、本発明は、上記実施形態及び実施例に限定されるものではない。本発明の構成や詳細には、本発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をすることができる。
　この出願は、２０１６年９月２３日に出願された日本出願特願２０１６－１８６１１６及び２０１６年１２月８日に出願された日本特許出願２０１６－２３８８６３を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
　以上のように、本発明の化合物又はその塩は、抗炎症剤及び肺がんに対する抗がん剤等として使用可能なものである。本発明の化合物又はその塩は、安全性が高いため、長期にわたり投与できる。

Claims (15)

  1. 式（Ａ）又は式（Ｂ）で表されることを特徴とする、化合物又はその塩。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     式（Ａ）及び式（Ｂ）において、
    Ｘ１は、ヘキソース又は水酸基であり、
    Ｘ２は、リン酸基又は水酸基である。
  2. 請求項１記載の化合物又はその塩を含むことを特徴とする、抗炎症剤。
  3. 請求項１記載の化合物又はその塩を含むことを特徴とする、肺がんに対する抗がん剤。
  4. ロドバクター・アゾトフォルマンス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ　ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ）ＢＰ０８９９株（受託番号　ＮＩＴＥ　ＢＰ－６４４）及びその培養物の少なくとも一方から、式（Ａ）又は式（Ｂ）で表される化合物又はその塩を含む粗抽出液を抽出する粗抽出工程と、
    前記粗抽出液から式（Ａ）又は式（Ｂ）で表される化合物又はその塩を単離する精製工程と、
    を含むことを特徴とする、式（Ａ）又は式（Ｂ）で表される化合物又はその塩の製造方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     式（Ａ）及び式（Ｂ）において、
    Ｘ１は、ヘキソース又は水酸基であり、
    Ｘ２は、リン酸基又は水酸基である。
  5. 前記粗抽出工程における抽出処理が、タンパク質を不溶化する有機溶媒による抽出処理である、請求項４記載の製造方法。
  6. 前記有機溶媒が、フェノールである、請求項５記載の製造方法。
  7. 前記粗抽出工程において、前記抽出処理の前に、ロドバクター・アゾトフォルマンス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ　ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ）ＢＰ０８９９株（受託番号　ＮＩＴＥ　ＢＰ－６４４）及びその培養物の少なくとも一方について、色素の脱色処理を行う、請求項４から６のいずれか一項に記載の製造方法。
  8. 前記色素の脱色処理が、アセトン、メタノール及びクロロホルムからなる群から選択される少なくとも一つによる脱色処理である、請求項７記載の製造方法。
  9. 前記粗抽出工程において、前記粗抽出液について濾過処理を行う、請求項４から８のいずれか一項に記載の製造方法。
  10. 前記精製工程において、前記粗抽出液について、酵素処理と、タンパク質を不溶化する有機溶媒による抽出処理とを行う、請求項４から９のいずれか一項に記載の製造方法。
  11. 前記酵素処理が、核酸分解酵素及びタンパク質分解酵素の少なくとも一方による酵素処理である、請求項１０記載の製造方法。
  12. 前記有機溶媒が、フェノールである、請求項１０又は１１記載の製造方法。
  13. 前記精製工程において、前記抽出処理後の抽出液について濾過処理を行う、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の製造方法。
  14. 炎症性疾患の治療方法であって、
    請求項１記載の化合物又はその塩を含む抗炎症剤を投与する工程を含むことを特徴とする治療方法。
  15. 肺がんの治療方法であって、
    請求項１記載の化合物又はその塩を含む肺がんに対する抗がん剤を投与する工程を含むことを特徴とする治療方法。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019181826A1 (ja) * 2018-03-23 2019-09-26 ティーエフケイ株式会社 化合物、腸内細菌叢構成比率調整剤、医薬品、飲食品、食品添加物、腸内細菌叢構成比率の調整方法及び化合物の製造方法
WO2022182261A1 (en) 2021-02-24 2022-09-01 Uniwersytet Jagielloński An artificial trap-cage, its use and method of preparing thereof

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000042994A2 (en) * 1999-01-21 2000-07-27 North Shore-Long Island Jewish Research Institute Inhibition of bacterial dissemination
WO2011102035A1 (ja) * 2010-02-16 2011-08-25 ティーエフケイ株式会社 疾患の予防改善剤、持久力向上剤、抗疲労剤、並びにそれらを用いた医薬品および飲食品

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4152576B2 (ja) * 1999-09-30 2008-09-17 昇 金子 抗がん剤
WO2007043635A1 (ja) * 2005-10-07 2007-04-19 Takeda Pharmaceutical Company Limited 癌の予防・治療剤
JP2015117181A (ja) * 2012-02-22 2015-06-25 学校法人 城西大学 敗血症治療剤

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000042994A2 (en) * 1999-01-21 2000-07-27 North Shore-Long Island Jewish Research Institute Inhibition of bacterial dissemination
WO2011102035A1 (ja) * 2010-02-16 2011-08-25 ティーエフケイ株式会社 疾患の予防改善剤、持久力向上剤、抗疲労剤、並びにそれらを用いた医薬品および飲食品

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PERERA, P. Y. ET AL.: "Lipopolysaccharide and its analog antagonists display differential serum factor dependencies for induction of cytokine genes in murine macrophages", INFECTION AND IMMUNITY, vol. 66, no. 6, 1998, pages 2562 - 2569, XP055479421 *
See also references of EP3511419A4 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019181826A1 (ja) * 2018-03-23 2019-09-26 ティーエフケイ株式会社 化合物、腸内細菌叢構成比率調整剤、医薬品、飲食品、食品添加物、腸内細菌叢構成比率の調整方法及び化合物の製造方法
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