CN109970698B - 具有抗氧化作用的化合物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有抗氧化作用的化合物及其制备方法和用途。本发明的化合物为芫荽内酯‑1，其结构式为：

其具有抗氧化作用，能应用到制备抗衰老药物上。

Description

具有抗氧化作用的化合物及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于化合物制备技术领域，具体涉及一种具有抗氧化作用的化合物及其制备方法和用途。

背景技术

衰老是机体各种生化反应的综合表现，也是体外许多因素共同作用的结果如环境污染、精神紧张、遗传等。研究表明氧化自由基是其发生的主要机制，机体内时刻产生自由基，但同时又具有自由基清除系统，使体内自由基维持在正常水平。随着年龄的增长，这种平衡被逐渐破坏，造成自由基过剩。而过量的自由基通过过氧化作用使细胞膜上的不饱和脂肪酸产生脂质过氧化反应，核酸及蛋白质分子交联，DNA基因突变或复制异常及生物酶活力下降，最终导致细胞功能严重受损以至衰老、死亡。因此，防止过氧化及消除体内过氧化产生的羟自由基及活性氧自由基是抗衰老的关键，从而加大了具有抗氧化作用的化合物的需求。

发明内容

本发明根据目前市场需求，提供一种具有抗氧化作用的化合物，通过从芫荽果中提取到的芫荽内酯-1化合物，具有很好的抗氧化作用，有利于用到抗衰老药物中，满足市场需要。

本发明提供一种具有抗氧化作用的化合物，其为芫荽内酯-1，简称HG-1，其结构式为：

优选的是，具有抗氧化作用的化合物的制备方法，包括步骤如下：

步骤一、将干燥的芫荽果药材粉碎，用石油醚用索氏提取法提取掉芫荽果的挥发油，去掉挥发油，将剩余的药渣再用甲醇进行索氏提取，加热挥干至无醇味，得到药材甲醇提取液流浸膏，用蒸馏水将流浸膏分散，然后依次用石油醚和二氯甲烷萃取，将萃取液经减压回收溶剂，去掉石油醚萃取物，得到二氯甲烷萃取物；

步骤二、将二氯甲烷萃取物经减压硅胶柱层析后，依次用石油醚：乙酸乙酯的体积比递变3次进行梯度洗脱，分别得到第一洗脱部分Fr.A1，第二洗脱部分Fr.A2和第三洗脱部位Fr.A3，将第三洗脱部位Fr.A3经减压硅胶柱层析后，用石油醚：乙酸乙酯的体积比为70-90:20洗脱，得到第四洗脱部位Fr.B1，然后通过ODS反相中压柱，依次用甲醇：水的的体积比递变7次进行梯度洗脱，得到7个馏分，将7个馏分点板后，与主斑点成分相同的进行合并得到甲醇部位Fr.C，再通过ODS反相中压柱，依次用甲醇：水的体积比递变5次进行梯度洗脱，分别得到第一馏分、第二馏分、第三馏分、第四馏分和第五馏分，将第四馏分和第五馏分合并得到合并馏分部位Fr.D，最后用半制备高效液相进行纯化得到化合物芫荽内酯-1；

其中，硅胶柱层析的减压柱为200～300目。

优选的是，具有抗氧化作用的化合物的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、将干燥的芫荽果药材粉碎，用石油醚用索氏提取法提取掉芫荽果的挥发油，去掉挥发油，将剩余的药渣再用甲醇进行索氏提取，加热挥干至无醇味，得到药材甲醇提取液流浸膏，用蒸馏水将流浸膏分散，然后依次用石油醚和二氯甲烷萃取，将萃取液经减压回收溶剂，去掉石油醚萃取物，得到二氯甲烷萃取物；

步骤二、将二氯甲烷萃取物经减压硅胶柱层析后，依次用石油醚：乙酸乙酯的体积比为90:10、80:20和70:30进行洗脱，分别得到第一洗脱部分Fr.A1，第二洗脱部分Fr.A2和第三洗脱部位Fr.A3，将第三洗脱部位Fr.A3经减压硅胶柱层析后，用石油醚：乙酸乙酯的体积比为80:20洗脱，得到第四洗脱部位Fr.B1，然后通过ODS反相中压柱，依次用甲醇：水的体积比为20:80、30:70、40:60、50:50、60:40、70:30和80:20进行洗脱，得到7个馏分，将7个馏分点板后，与主斑点成分相同的进行合并得到甲醇部位Fr.C，再通过ODS反相中压柱，依次用甲醇：水的体积比为20:80、30:70、40:60、50:50和60:40进行洗脱分别得到第一馏分、第二馏分、第三馏分、第四馏分和第五馏分，将第四馏分和第五馏分合并得到合并馏分部位Fr.D，最后用半制备高效液相进行纯化得到化合物芫荽内酯-1；

其中，硅胶柱层析的减压柱为200～300目。

优选的是，具有抗氧化作用的化合物的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、将干燥的芫荽果药材40kg粉碎，用石油醚用索氏提取法提取掉芫荽果的挥发油，去掉挥发油6L，将剩余的药渣再用甲醇进行索氏提取，加热挥干至无醇味，得到药材甲醇提取液流浸膏，用1-2L蒸馏水将流浸膏分散，然后依次用石油醚和二氯甲烷萃取，将萃取液经减压回收溶剂，去掉石油醚萃取物700.0g，得到二氯甲烷萃取物192.5g；

步骤二、将二氯甲烷萃取物经减压硅胶柱层析后，依次用石油醚：乙酸乙酯的体积比为90:10、80:20和70:30进行洗脱，分别得到第一洗脱部分Fr.A1，第二洗脱部分Fr.A2和27.0g第三洗脱部位Fr.A3，将第三洗脱部位Fr.A3经减压硅胶柱层析后，用石油醚：乙酸乙酯的体积比为80:20洗脱，得到13.5g第四洗脱部位Fr.B1，然后通过ODS反相中压柱，依次用甲醇：水体积比为20:80、30:70、40:60、50:50、60:40、70:30和80:20进行洗脱，得到7个馏分，将7个馏分点板后，与主斑点成分相同的进行合并得2.98g甲醇部位Fr.C，再通过ODS反相中压柱，依次用甲醇：水的体积比为20:80、30:70、40:60、50:50和60:40进行洗脱分别得到第一馏分、第二馏分、第三馏分、第四馏分和第五馏分，将第四馏分和第五馏分合并得到198mg合并馏分部位Fr.D，最后用半制备高效液相进行纯化得到化合物芫荽内酯-1；

其中，硅胶柱层析的减压柱为200～300目。

优选的是，具有抗氧化作用的化合物用于制备抗衰老药物的用途。

本发明至少包括以下有益效果：本发明通过从从芫荽果中提取的化合物芫荽内酯-1(HG-1)，具有很好的抗氧化作用，能够有效清除线粒体ROS，减少脂质过氧化物MDA的生成，抑制ROS引发的脂质过氧化反应，防止氧化损伤的发生。

附图说明

图1是本发明化合物HG-1的高分辨率质谱图；

图2是本发明化合物HG-1的核磁共振氢谱图；

图3是本发明化合物HG-1的核磁共振碳谱图；

图4是本发明化合物HG-1的HSQC谱图；

图5是本发明化合物HG-1的HMBC谱图；

图6是本发明化合物HG-1的COSY谱图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

本发明公开一种具有抗氧化作用的化合物，其为芫荽内酯-1，简称HG-1，其结构式为：

本发明芫荽内酯-1(HG-1)的结构鉴定如下：

化合物HG-1为淡黄色粉末，图1的高分辨率质谱图(HR-ESI-MS)给出其准分子离子峰m/z 193.1234[M-H₂O+H]⁺，结合图2和图3的二维核磁共振谱图，推测其分子式为C₁₂H₁₈O₃(计算值为193.1229[M-H₂O+H]⁺)，不饱和度为4。

在图3的核磁共振碳谱图中共显示有12个碳信号，结合图2的核磁共振氢谱图和图4的HSQC谱图分析归属出HG-1化合物共含有2个甲基碳、3个亚甲基碳、5个次甲基碳、以及2个季碳。进一步观察图3的核磁共振碳谱图的低场区，可以推测该化合物含有一个酯基、一个碳碳双键。根据化合物的不饱和度为4，可以推测该化合物还含有两个环。

在图2的核磁共振氢谱图中，结合图4的HSQC谱图数据，其中在低场区可以观察到1个明显的双键碳的氢信号δ_H6.54(1H,td,J＝3.1,0.8Hz)，还可以观察到2个明显的含氧碳上的氢信号δ_H4.02(1H,ddd,J＝8.9,7.3,5.4Hz)、δ_H4.4(1H,qd,J＝6.4,3.6Hz)，2个甲基碳上的氢信号δ_H1.40(3H,m)、δ_H0.94(3H,m)，结合图4的HSQC谱中的数据及化合物分子式，可以确定该化合物含有一个酯基、一个碳碳双键，根据化合物的不饱和度为4，可以确定该化合物含有两个环。

结合该化合物的图2和图3的二维核磁共振谱图分析，对该化合物中各碳、氢的化学位移进行了归属(见表1)，具体解析过程如下所述：

表1 HG-1的NMR数据(CD₃OD,500MHz)

从图6的COSY谱图中发现，δ_H4.4(1H,qd,J＝6.4,3.6Hz)与δ_H2.19(1H,m)、δ_H1.49(1H,m)相关，δ_H6.54(1H,td,J＝3.1,0.8Hz)与δ_H2.62(1H,m)相关，δ_H2.62(1H,m)与δ_H4.02(1H,ddd,J＝8.9,7.3,5.4Hz)、δ_H1.46(1H,m)相关，δ_H4.02(1H,ddd,J＝8.9,7.3,5.4Hz)与δ_H1.76(1H,m)相关，δ_H1.76(1H,m)与δ_H0.94(3H,m)相关，δ_H2.1(1H,ddd,J＝11.9,5.1,2.3Hz)与δ_H1.43(1H,m)相关，结合图4的HSQC谱图中给出的碳氢归属信息，可以确定δ_C66.6与δ_C31.0相连，δ_C135.7与δ_C43.2相连，δ_C43.2与δ_C85.6、δ_C25.8相连，δ_C85.6与δ_C33.8相连，δ_C33.8与δ_C13.0相连，δ_C25.8与δ_C27.3相连。

从图5的HMBC谱图中我们还发现，δ_H4.4(1H,qd,J＝6.4,3.6Hz)与δ_C31.0、δ_C133.3相关，δ_H2.19(1H,m)、δ_H1.49(1H,m)与δ_C135.7、δ_C133.3、δ_C66.6、δ_C43.2、δ_C22.2相关；δ_H6.54(1H,td,J＝3.1,0.8Hz)与δ_C170.3、δ_C43.2、δ_C31.0相关；δ_H2.62(1H,m)与δ_C135.7、δ_C133.3、δ_C85.6、δ_C33.8、δ_C25.8相关；δ_H4.02(1H,ddd,J＝8.9,7.3,5.4Hz)与δ_C43.2相关；综合图6的COSY谱图给出的信息，可以确定δ_C66.6与酯基、δ_C31.0相连，且该碳为连氧碳，所以该碳上连接一个羟基。因此，我们确定了C-7位δ_C170.3、C-8位δ_C66.6、C-9位δ_C31.0、C-10位δ_C133.3、C-11位δ_C135.7、C-4位δ_C43.2、C-5位δ_C85.6。又因为在图4的HSQC谱图中我们发现了δ_C133.3为季碳，且在图5的HMBC谱图中，δ_H1.40(1H,m)与δ_C43.2、δ_C31.0相关，所以，确定δ_C22.2连接在C-10位上，故C-12位δ_C22.2。

从图5的HMBC谱图中发现，δ_H4.02(1H,ddd,J＝8.9,7.3,5.4Hz)与δ_C27.3、δ_C25.8相关，δ_H2.1(1H,ddd,J＝11.9,5.1,2.3Hz)与δ_C135.7相关，δ_H1.76(1H,m)、δ_H1.43(1H,m)与δ_C13.0、δ_C33.3、δ_C43.2、δ_C85.6相关，综合图6的COSY谱图给出的信息，我们确定了C-1位δ_C33.8、C-2位δ_C27.3、C-3位δ_C25.8、C-6位δ_C13.0。综上所述，我们鉴定其结构式如下：

本发明的化合物制备方法如下：

步骤一、将干燥的芫荽果药材40kg粉碎，用石油醚用索氏提取法提取掉芫荽果的挥发油，去掉挥发油6L，将剩余的药渣再用甲醇进行索氏提取，加热挥干至无醇味，得到药材甲醇提取液流浸膏，用1-2L蒸馏水将流浸膏分散，然后依次用石油醚和二氯甲烷萃取，将萃取液经减压回收溶剂，去掉石油醚萃取物700.0g，得到二氯甲烷萃取物192.5g；

步骤二、将二氯甲烷萃取物经减压硅胶柱层析后，依次用石油醚：乙酸乙酯的体积比为90:10、80:20和70:30进行洗脱，分别得到第一洗脱部分Fr.A1，第二洗脱部分Fr.A2和27.0g第三洗脱部位Fr.A3，将第三洗脱部位Fr.A3经减压硅胶柱层析后，用石油醚：乙酸乙酯的体积比为80:20洗脱，得到13.5g第四洗脱部位Fr.B1，然后通过ODS反相中压柱，依次用甲醇：水体积比为20:80、30:70、40:60、50:50、60:40、70:30和80:20进行洗脱，得到7个馏分，将7个馏分点板后，与主斑点成分相同的进行合并得2.98g甲醇部位Fr.C，再通过ODS反相中压柱，依次用甲醇：水的体积比为20:80、30:70、40:60、50:50和60:40进行洗脱分别得到第一馏分、第二馏分、第三馏分、第四馏分和第五馏分，将第四馏分和第五馏分合并得到198mg合并馏分部位Fr.D，最后用半制备高效液相进行纯化得到化合物芫荽内酯-1；

其中，硅胶柱层析的减压柱为200目。

本发明的化合物具有抗氧化作用的动物试验如下：

1.材料

1.1实验动物

SPF级健康SD雌性大鼠50只，其中22月龄40只，体质量330g～340g,6月龄青年健康雌性大鼠10只，体质量250g～258g，由苏州大学实验动物中心提供，所有实验动物均饲养于可控环境中，室温18～24℃、湿度40％～50％，实验期间动物自由进食、饮水，昼夜节律正常。

1.2主要药品和试剂

HG-1(通过本发明的制备方法制备得到)；葡聚糖硫酸钠(美国Sigma公司)；多聚甲醛，氯化钠、二水合柠檬酸钠、氢氧化钾、羧甲基纤维素钠(国药分析纯)；0.9％氯化钠注射液(山东齐都药业有限公司)；SOD、GSH-Px、MAD、MAO测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

电子天平FA2104S(上海精工产；数字式移液器枪(Olympus CX31显微镜)；高速离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；-20度冰箱(Sanyo产品)；

2.试验过程

2.1动物模型的建立与分组

SPF级SD雌性大鼠50只，其中22月龄40只，体质量330g～340g,随机分为4组，具体为A、B、C、D组，其中，A组为老年对照组，B、C、D组为HG-1(5、10、20mg/kg)给药组，6月龄10只，体质量250g～258g，E组作为青年对照组。HG-1给药组每日给予5、10、20mg/kg剂量HG-1，老年对照组和青年对照组每日给予生理盐水。各组每日灌胃给药及生理盐水45天。于实验结束前大鼠空腹12h，麻醉后颈总动脉取血，检测超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)及丙二醛(MDA)的含量。取脑组织部分测定脑组织SOD、GSH-Px、MDA及单胺氧化酶(MAO)含量。取肝脏组织线粒体检测活性氧(ROS)、MDA水平。

2.2血清中SOD、GSH-Px、MDA检测

动物麻醉后颈动脉取血7～8mL静置1h,2000r/min,离心15min，取上清。SOD、GSH-Px、MAD严格按照试剂盒说明书测定。

2.3脑组织中SOD、GSH-Px、MDA及MAO检测

取血后，立即取脑组织，冰冷生理盐水洗净，滤纸吸干称重，冰裕条件下制成10％匀浆，4℃离心(200×g，15min)，取上清。SOD、GSH-Px、MAD、MAO严格按照试剂盒说明书测定。

2.4肝脏线粒体ROS、MDA检测

取血后，立即肝脏组织，冰冷生理盐水洗净，滤纸吸干称重，每克肝加9mL冷的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液将肝脏组织匀浆化，4℃离心差速分离600g×5min，去除细胞核，12000g×10min分离出线粒体。将提取出的线粒体检测ROS、MAD，严格按照试剂盒说明书测定。

2.5统计学处理

采用STATA8.0统计软件进行单因素方差分析和t检验,数据，以P<0.05为差异有统计学意义，且P越小作用效果越好。

3.结果

3.1 HG-1对血清中SOD、GSH-Px、MDA的影响

HG-1给药组与老年对照组比较，HG-1组大鼠血清中MDA含量显著降低，而SOD和GSH-Px活性显著升高，见表2。

表2血清脂质过氧化水平结果

注：*和**为与A组比较，分别为*P＜0.05，**P＜0.01

3.2 HG-1对脑组织中SOD、GSH-Px、MDA及MAO的影响

HG-1给药组与老年对照组比较，HG-1给药组的大鼠组织中MDA含量、MAO活性显著降低，而SOD和GSH-Px活性显著升高，见表3。

表3脑组织脂质过氧化水平结果

注：*和**为与A组比较，分别为*P＜0.05，**P＜0.01

3.3 HG-1对肝脏线粒体ROS、MDA的影响

HG-1给药组与老年对照组比较，HG-1给药组大鼠肝脏线粒体中ROS生成及MDA含量显著降低，见表4。

表4肝脏线粒体ROS生成、MDA结果

注：*和**为与A组比较，分别为*P＜0.05，**P＜0.01

现代医学研究表明，防止过氧化及消除体内过氧化产生的羟自由基及活性氧自由基成为抗衰老的关键。从表2、表3和表4的数据表明，HG-1具有抗氧化作用，本发明探究HG-1对衰老雌性大鼠的抗氧化作用及线粒体自由基生成的影响，为其抗氧化抗衰老作用提供实验依据。

MDA含量的增高会引起细胞损伤，通过测定MDA值来评价机体抗氧化能力。本发明结果表明，HG-1可以显著降低脑组织和血清中的MDA，提高大鼠机体抗氧化能力。同时HG-1给药组大鼠血清及脑组织中SOD和GSH-Px酶活性显著高于老年对照组，提示HG-1能提高机体抗氧化酶的生物合成并能提高其活性，从而提高机体的抗氧化能力。MAO在正常的肝脏、大脑、肾脏中有较强的活性，研究表明MAO的活性随着年龄的增长而显著的增加，与脑衰老密切相关。本实验表明HG-1能显著降低MAO的活性，延缓脑功能衰老。人和动物组织中氧自由基的产生和清除是一个平衡过程。线粒体是维持细胞及整个机体生理活动的能源基础，同时也是ROS生成的主要场所。而过多ROS的生成会引起脂质过氧化，导致线粒体的变性、渗漏和破裂都是细胞衰老的重要原因。本实验结果表明HG-1能够有效清除线粒体ROS，减少脂质过氧化物MDA的生成，抑制ROS引发的脂质过氧化反应，防止氧化损伤的发生。

综上所述，HG-1具有抗氧化作用，其抗衰老作用与其氧自由基清除作用减轻氧自由基损伤和脂质过氧化，并减少线粒体损伤有关。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (4)

1.具有抗氧化作用的化合物，其特征在于，所述化合物为芫荽内酯-1，其结构式为：

2.一种如权利要求1所述的具有抗氧化作用的化合物的制备方法，其特征在于，包括步骤如下：

步骤一、将干燥的芫荽果药材粉碎，用石油醚用索氏提取法提取掉芫荽果的挥发油，去掉挥发油，将剩余的药渣再用甲醇进行索氏提取，加热挥干至无醇味，得到药材甲醇提取液流浸膏，用蒸馏水将流浸膏分散，然后依次用石油醚和二氯甲烷萃取，将萃取液经减压回收溶剂，去掉石油醚萃取物，得到二氯甲烷萃取物；

步骤二、将二氯甲烷萃取物经减压硅胶柱层析后，依次用石油醚：乙酸乙酯的体积比为90:10、80:20和70:30进行洗脱，分别得到第一洗脱部分Fr.A1，第二洗脱部分Fr.A2和第三洗脱部位Fr.A3，将第三洗脱部位Fr.A3经减压硅胶柱层析后，用石油醚：乙酸乙酯的体积比为80:20洗脱，得到第四洗脱部位Fr.B1，然后通过ODS反相中压柱，依次用甲醇：水的体积比为20:80、30:70、40:60、50:50、60:40、70:30和80:20进行洗脱，得到7个馏分，将7个馏分点板后，与主斑点成分相同的进行合并得到甲醇部位Fr.C，再通过ODS反相中压柱，依次用甲醇：水的体积比为20:80、30:70、40:60、50:50和60:40进行洗脱分别得到第一馏分、第二馏分、第三馏分、第四馏分和第五馏分，将第四馏分和第五馏分合并得到合并馏分部位Fr.D，最后用半制备高效液相进行纯化得到化合物芫荽内酯-1；

其中，硅胶柱层析的减压柱为200～300目。

3.如权利要求2所述的具有抗氧化作用的化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、将干燥的芫荽果药材40kg粉碎，用石油醚用索氏提取法提取掉芫荽果的挥发油，去掉挥发油6L，将剩余的药渣再用甲醇进行索氏提取，加热挥干至无醇味，得到药材甲醇提取液流浸膏，用1-2L蒸馏水将流浸膏分散，然后依次用石油醚和二氯甲烷萃取，将萃取液经减压回收溶剂，去掉石油醚萃取物700.0g，得到二氯甲烷萃取物192.5g；

步骤二、将二氯甲烷萃取物经减压硅胶柱层析后，依次用石油醚：乙酸乙酯的体积比为90:10、80:20和70:30进行洗脱，分别得到第一洗脱部分Fr.A1，第二洗脱部分Fr.A2和27.0g第三洗脱部位Fr.A3，将第三洗脱部位Fr.A3经减压硅胶柱层析后，用石油醚：乙酸乙酯的体积比为80:20洗脱，得到13.5g第四洗脱部位Fr.B1，然后通过ODS反相中压柱，依次用甲醇：水体积比为20:80、30:70、40:60、50:50、60:40、70:30和80:20进行洗脱，得到7个馏分，将7个馏分点板后，与主斑点成分相同的进行合并得2.98g甲醇部位Fr.C，再通过ODS反相中压柱，依次用甲醇：水的体积比为20:80、30:70、40:60、50:50和60:40进行洗脱分别得到第一馏分、第二馏分、第三馏分、第四馏分和第五馏分，将第四馏分和第五馏分合并得到198mg合并馏分部位Fr.D，最后用半制备高效液相进行纯化得到化合物芫荽内酯-1；

其中，硅胶柱层析的减压柱为200～300目。

4.一种如权利要求1所述的具有抗氧化作用的化合物用于制备抗衰老药物的用途。

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