CN108265007B - 深海真菌3a00421及其发酵化合物的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了深海真菌Graphostroma sp.3A00421及其发酵化合物的应用。本发明深海真菌Graphostroma sp.3A00421，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2017637，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2017年10月30日。本发明深海真菌Graphostroma sp.3A00421的发酵化合物具有抗过敏和抗炎活性，可用于制备抗过敏药物或抗炎药物。本发明不仅为研发抗过敏及抗炎药物提供了新化合物来源，对我国海洋药物开发具有重要意义，还可促进深海微生物资源的有效应用，具有良好的应用前景。

Description

深海真菌3A00421及其发酵化合物的应用
技术领域
本发明属于海洋真菌提取化合物的应用领域，更具体地说，本发明涉及深海真菌Graphostroma sp.3A00421及其发酵化合物的应用。
背景技术
食物过敏，是指某些人在吃了某种食物之后，引起身体某一组织、某一器官甚至全身的强烈反应，以致出现各种各样的功能障碍或组织损伤。食物过敏在过去几十年内其发病率逐渐增加，给人类生命健康带来威胁。食物过敏反应主要是血清免疫球蛋白(immunoglobulin E，IgE)介导的，而这种过敏反应通常伴随着特异型免疫球蛋白IgE含量的提高。
目前还未有抑制致敏食物抗原的活性药物，当前治疗食物过敏的方案只有避免接触过敏原或进行脱敏疗法。采用膳食干预法应对食物过敏，会对人体的营养摄入和生活质量产生负面影响；使用抗组胺类药物或激素类药物容易产生耐药性等副作用。在这种背景下，寻找新型抗食物过敏活性化合物尤为重要。
炎症是具有血管系统的活体组织对内外环境中各种损伤因子的刺激所产生的防御反应，典型的炎症反应有红、肿、热、痛等多种临床症状，是一种复杂的生理和病理反应。炎症反应既是机体的一种保护性防御反应，又是许多疾病发生及发展的基础。研究表明，炎症反应参与人体感染、肿瘤、心脑血管、神经退行性、过敏性疾病等许多重大疾病的发生和发展过程。炎症是临床常见的病理症状，抗炎药物是仅次于抗感染药物的第二大类临床药物。临床上应用的抗炎药物主要有甾体类抗炎药和非甾体类抗炎药。由于现有的化学合成抗炎药物尚具有无法避免的不良反应，从天然产物中寻找、开发新型抗炎药物也越来越引起研究者的重视。
天然化合物是创新药物研究的重要源泉，从1981年到2014年共三十多年的时间里通过批准的小分子药物中天然产物及其衍生物所占比例高达65％。对陆地微生物持续五十多年的集中研究和开发导致陆地微生物次级代谢产物发现的重复率越来越高，在这种背景下，海洋微生物来源的次级代谢产物正迅速成为药物研发的新源泉。目前已有多种海洋微生物来源的次级代谢产物被开发成用于治疗多种疾病的药物。
由于炎症过程也是过敏性疾病的重要疾病过程，将抗过敏活性与抗炎活性结合考察，从海洋微生物中筛选发现具有抗食物过敏及抗炎活性的天然产物，对海洋药物的研发具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于：克服现有技术中存在的上述问题，提供一种深海Graphostroma属真菌Graphostroma sp.3A00421及其经发酵提取得到发酵化合物在制备抗过敏及抗炎药物中的应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供了深海真菌Graphostroma sp.3A00421，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2017637，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2017年10月30日。
本发明深海真菌Graphostroma sp.3A00421的发酵化合物可用于制备抗过敏药物或抗炎药物。
本发明深海真菌Graphostroma sp.3A00421的发酵化合物，其结构式如式(I)～式(XXV)所示，其中，式(I)～式(XVII)为聚酮类化合物，式(XVIII)～式(XXV)为愈创木烷倍半萜化合物：
Figure BDA0001513071270000021
Figure BDA0001513071270000031
总共41个化合物，其中，式(I)对应的化合物为化合物1；式(II)对应的化合物为化合物2；式(III)对应的化合物为化合物3；式(IV)中，R为H时，对应的化合物为化合物4，R为Ac时，对应的化合物为化合物5；式(V)对应的化合物为化合物6；式(VI)对应的化合物为化合物7；式(VII)对应的化合物为化合物8；式(VIII)对应的化合物为化合物9；
式(IX)对应的化合物10-16如
表1所示；式(X)对应的化合物为化合物17；式(XI)对应的化合物为化合物18；式(XII)对应的化合物为化合物19；式(XIII)对应的化合物为化合物20；式(XIV)中，R为OH时对应的化合物为化合物21，R为H时对应的化合物为化合物22；式(XV)对应的化合物为化合物23；式(XVI)对应的化合物24-27如表2所示；式(XVII)对应的化合物为化合物28；式(XVIII)中，R为OH时对应的化合物为化合物29，R为H时对应的化合物为化合物30；式(XIX)中，R为OH时对应的化合物为化合物31，R为酮基时对应的化合物为化合物32；式(XX)中，R为H时对应的化合物为化合物33，R为OH时对应的化合物为化合物34；式(XXI)中，R为Ac时对应的化合物为化合物35，R为H时对应的化合物为化合物38；式(XXII)对应的化合物为化合物36；式(XXIII)对应的化合物为化合物37；式(XXIV)中，R为H时对应的化合物为化合物39，R为OH时对应的化合物为化合物40；式(XXV)对应的化合物为化合物41。
表1化合物10-16在式(IX)的取代情况表
Figure BDA0001513071270000032
表2化合物24-27在式(XVI)的取代情况表
Figure BDA0001513071270000041
化合物10-16和24-27具体取代基的取代方案如下文字表示：
式(IX)中，R1为H、R3为H时，R2为OMe或OH；R1为Me、R2为OMe时，R3为H或OH；R1为H、R3为OH时，R2为OMe或H；R1为H、R2为H时，R3为OH或CH(OH)CH3；
式(XVI)中，R1、R2为Me时，R3为CH2OH或Me；R1、R3为Me时，R2为H或Me；R2、R3为Me时，R1为Me或COOH。
本发明深海真菌Graphostroma sp.3A00421的发酵化合物的制备方法包括如下步骤：
S1、将深海真菌Graphostroma sp.3A00421进行液体或固体发酵培养，得到发酵物；
S2、将发酵物萃取，所得萃取物经分离纯化，得到深海真菌Graphostromasp.3A00421的发酵化合物；
所述深海真菌Graphostroma sp.3A00421，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2017637，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2017年10月30日。
为了实现上述发明目的，本发明还提供了一种抗过敏药物，其包括有效剂量的作为活性成分的深海真菌Graphostroma sp.3A00421的发酵化合物及其盐类中的一种或几种的组合，以及药学上可以接受的载体；
所述深海真菌Graphostroma sp.3A00421，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2017637，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2017年10月30日。
为了实现上述发明目的，本发明还提供了一种抗炎药物，其包括有效剂量的作为活性成分的深海真菌Graphostroma sp.3A00421的发酵化合物及其盐类中的一种或几种的组合，以及药学上可以接受的载体；
所述深海真菌Graphostroma sp.3A00421，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2017637，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2017年10月30日。
相对于现有技术，本发明深海真菌Graphostroma sp.3A00421的发酵化合物为一类聚酮类化合物和一类愈创木烷类倍半萜化合物，具有抗过敏和抗炎活性，可用于制备抗过敏或抗炎药物。本发明为研发抗过敏和抗炎药物提供了新化合物来源，对我国海洋药物开发具有重要意义，还可促进深海微生物资源的有效应用，具有良好的应用前景。
菌种保藏信息:
深海真菌Graphostroma sp.3A00421，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2017637，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2017年10月30日。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明，实施例的参数、比例等可因地制宜做出选择而对结果并无实质性影响。
实施例1
本实施例以深海真菌Graphostroma sp.3A00421为材料，制备式(I)～式(XXV)所示的深海真菌Graphostroma sp.3A00421的发酵化合物，具体步骤如下：
(1)菌株在PDA平板培养基中25℃下培养3天，然后切下新鲜的菌丝体接种于1L锥形瓶中(30个)，每个锥形瓶中装有80g大米和120mL蒸馏水，这些锥形瓶放置在25℃条件下，静止培养28天，发酵结束后萃取得到发酵产物；
(2)将步骤(1)得到的发酵产物采用乙酸乙酯分别萃取3次，得到有机提取物；
(3)将步骤(2)中所得有机提取物浓缩至干后用甲醇重新溶解，然后通过石油醚(PE)萃取3次，最后将甲醇层减压蒸发至干，得到脱脂提取物(7g)；
(4)将步骤(3)中得到的脱脂提取物通过反相ODS硅胶柱以甲醇-水梯度洗脱(5％→100％)，得到24个组分(Fr.1-Fr.24)；
(5)将步骤(4)中得到的组分Fr.6(309mg)使用Sephadex LH-20柱色谱以甲醇洗脱，然后反复使用正相硅胶柱色谱首先以用氯仿:甲醇(15:1)洗脱，然后以乙酸乙酯:甲醇(50:1)洗脱，得到化合物38(48.4mg)和40(10.2mg)；
(6)将步骤(4)中得到的组分Fr.7(624mg)通过Sephadex LH-20(甲醇)柱色谱分离，得到4个亚组分(Fr.7-1-7-4)；
(7)将步骤(6)中得到的亚组分Fr.7-1通过正相硅胶柱色谱以氯仿-甲醇(15:1)洗脱得到Fr.7-1-1和Fr.7-1-2；Fr.7-1-1进一步使用正相硅胶柱色谱以石油醚：丙酮(3:1)洗脱得到化合物28(26.7mg)；Fr.7-1-2使用制备型硅胶板(20×20cm)(PTLC)以乙酸乙酯-甲醇(300:1)为展开剂得到化合物8(9.6mg)。Fr.7-2首先使用正相硅胶柱色谱分离(氯仿-甲醇，15:1)，然后以半制备型HPLC采用甲醇-水(32:68)洗脱，得到化合物1(13.2mg)和2(17.5mg)。Fr.7-3采用反复正相硅胶柱色谱分离(石油醚-丙酮5:1以及氯仿-甲醇20:1)得到化合物13(23.2mg)，15(18.6mg)和21(4.5mg)。Fr.7-4采用正相硅胶柱以PE-丙酮(1:1)进行洗脱得到化合物19(18.2mg)；
(8)将步骤(4)中得到的组分Fr.8(312mg)使用Sephadex LH-20柱以甲醇进行洗脱得到3个亚组分(Fr.8-1-8-3)；
(9)将步骤(8)中得到的亚组分Fr.8-1进行硅胶柱色谱分离，首先使用氯仿-甲醇(100:1)洗脱，然后采用PTLC以乙酸乙酯-甲醇(200:1)进行洗脱，得到化合物24(13.2mg)。Fr.8-2通过硅胶柱色谱以氯仿-甲醇(20:1)洗脱得到化合物6(32.6mg)。Fr.8-3经HPLC以甲醇-水(35:65)洗脱得到化合物11(6.1mg)和14(15.9mg)；
(10)将步骤(4)中得到的组分Fr.9(420mg)通过Sephadex LH-20柱以甲醇洗脱得到3个亚组分(Fr.9-1-9-3)；
(11)将步骤(10)中得到的亚组分Fr.9-1反复采用硅胶柱色谱分离，首先用石油醚-丙酮(3:1)，然后以石油醚-乙酸乙酯(2:1)进行洗脱，得到化合物5(44.8mg)和25(2.8mg)。Fr.9-2通过正相硅胶柱分别以氯仿-甲醇(100:1)和氯仿-甲醇(150:1)进行洗脱得到化合物7(35.8mg)和27(78.5mg)。Fr.9-3通过正相硅胶柱分别以氯仿-甲醇(10:1)以及石油醚-丙酮(5:1)进行洗脱得到化合物10(11.6mg)，16(18.9mg)，17(26.2mg)和22(25.4mg)。Fr.9-4在甲醇溶液中通过重结晶得到化合物4(7.8mg)；
(12)将步骤(4)中得到的组分Fr.10(603mg)通过正相硅胶柱以氯仿-甲醇梯度洗脱得到5个亚组分(Fr.10-1-10-5)；
(13)将步骤(12)中得到的亚组分Fr.10-1在甲醇-水(200:1)溶液中重结晶得到化合物18(68.2mg)。将Fr.10-2使用Sephadex LH-20柱(甲醇)分离得到化合物20(3.5mg)和26(38.6mg)。Fr.10-3通过硅胶柱分别以石油醚-丙酮(5:1)洗脱，然后采用PTLC(乙酸乙酯-丙酮，30:1)进行分离得到化合物23(3.6mg)。Fr.10-4反复采用正相硅胶柱以石油醚-丙酮(20：1)和氯仿-甲醇(50:1)进行洗脱得到化合物3(4.0mg)和12(24.5mg)。Fr.10-5首先使用Sephadex LH-20柱以甲醇洗脱进行分离，然后进一步通过正相硅胶柱以氯仿-甲醇30:1洗脱得到化合物9(8.2mg)；
(14)将步骤(4)中得到的组Fr.11(420mg)使用Sephadex LH-20柱(甲醇)分离得到3个亚组分(Fr.11-1-11-3)；
(15)将步骤(14)中得到的亚组分Fr.11-1使用正相硅胶柱以石油醚：丙酮(5:1)进行洗脱，然后使用PTLC以用氯仿:甲醇(8:1)洗脱得到化合物35(12.6mg)。Fr.11-3采用正相硅胶柱以氯仿:甲醇(15:1)洗脱得到化合物36(8.2mg)；
(16)将步骤(4)中得到的组分Fr.12(603mg)首先通过Sephadex LH-20柱(甲醇)进行分离，然后通过反复正相硅胶柱分别以石油醚：丙酮(3:1)和石油醚：乙酸乙酯(3:1→1:1)进行洗脱得到化合物34(18.8mg)和41(24.2mg)；
(17)将步骤(4)中得到的组分Fr.14(389mg)采用正相硅胶以石油醚：乙酸乙酯(1:0→0:1)进行洗脱得到7个亚组分(Fr.14-1-Fr.14-7)；
(18)将步骤(17)中得到的亚组分Fr.14-2使用SephadexLH-20柱(甲醇)进行色谱分离得到化合物32(26.0mg)。Fr.14-3通过PTLC纯化(石油醚：丙酮，2:1)得到化合物29(14.7mg)。Fr.14-5采用PTLC以乙酸乙酯:丙酮(30:1)为流动相洗脱，得到化合物31(10.2mg)。Fr.14-6使用SephadexLH-20柱(甲醇)进行分离，然后通过正相硅胶柱以氯仿:甲醇(20:1)洗脱得到化合物39(39.2mg)；
(19)将步骤(4)中得到的组分Fr.16(462mg)采用Sephadex LH-20(甲醇)进行柱色谱分离，然后反复采用正相硅胶柱色谱分离(氯仿-甲醇100:1→1:1；乙酸乙酯:甲醇200:1→10:1以及石油醚：丙酮5:1)，得到化合物30(23.0mg)，33(15.5mg)和37(11.6mg)。
将上述所得化合物通过1H NMR、13C NMR以及2D NMR谱进行结构鉴定。
化合物1为白色粉末。高分辨质谱HRESIMS显示正离子峰为m/z 292.0365[M+Na]+，该峰是其同位素峰m/z 294.0328[M+2+Na]+的3倍高度，提示存在1个氯原子，确定分子式为C12H12NO4Cl，不饱和度为7。1H NMR谱中存在ABX苯基信号(δH 7.04,7.47,7.67)，3个次甲基(δH 7.44,4.29,3.93)，1个双峰甲基(δH 1.19)以及3个活泼氢(δH 4.76,5.80,10.57)。13CNMR谱中显示12个碳信号，其中6个对应于ABX苯基(δC153.6s,125.9d,124.4d,120.8s,120.6s,117.6d)，3个sp3碳(δC72.1d,68.7d,20.4q)，剩余3个为sp2碳(δC 164.3s,149.7s,121.4d)。在COSY谱中，H-11与11-OH和H-12相关；H-12与12-OH和13-Me相关，据此确定存在1,2-丙二醇结构片段。由于1个芳香单元和3个sp2碳原子共占6个不饱和度，所以化合物1中应还含有除苯环之外的单环。在HMBC谱中，从H-8与C-7和C-10的相关信号并结合分子式确定存在噁唑环。综上，化合物1含有3个结构片段：包括1个ABX苯、1个1,2-丙二醇、1个噁唑基团。在HMBC谱中，H-11/H-12与C-10以及H-2/H-6与C-7相关，可连接将上述3个片段推出化合物1的平面结构。通过改良的Mosher反应，确定11S和12R绝对构型。因此，化合物1鉴定为(1S,2R)-1-(5-(3-chloro-4-hydroxyphenyl)oxazol-2-yl)propane-1,2-diol，并命名为graphostrin A。
化合物2的高分辨质谱HRESIMS负离子峰为m/z 239.0909[M-H]-，分子式为C12H16O5。1H NMR谱中显示1个ABX苯环信号(δH 6.23,7.37,7.77)以及2个含氧次甲基(δH3.19,3.39)。13C NMR谱中存在12个碳信号，包括4个季碳，5个次甲基，2个亚甲基以及1个甲基。这些NMR数据与caproylresorcinol非常相似，区别为已知物中的2个亚甲基被2个含氧次甲基取代(δC 70.1,74.5)，结合分子式推出化合物2中存在2个额外羟基。在COSY谱中，H2-8通过H2-9与H-10/H-11/H3-12相关信号确定该2个羟基分别位于C-10和C-11位，其绝对构型通过改良的Mosher反应确定为10R和11S。因此化合物2结构鉴定为(10R,11S)-10,11-dihydroxycaproylresorcinol，并命名为graphostrin B。
化合物3的高分辨质谱HRESIMS显示负离子峰为m/z 219.0654[M-H]-，分子式为C12H12O4。化合物3的1D NMR数据与3-hydroxy-2-isopropenyl-dihydrobenzofuran-5-carboxylic acid methyl ester非常相似，其区别为化合物3中少掉1个甲氧基。通过详细的2D NMR谱分析，化合物3鉴定为(2S,3R)-3-hydroxy-2-(prop-1-en-2-yl)-2,3-dihydrobenzofuran-5-carboxylic acid，命名为graphostrin C。
化合物4的高分辨质谱HRESIMS显示负离子峰为m/z 237.0763[M-H]-，分子式为C12H14O5。其1H和13C NMR数据与(+)-5-formyl-2-(1′,2′-dihydroxypropyl)-2,3-dihydrobenzofuran的数据非常相似。唯一区别为化合物4中C-5位为羧基而非醛基基团。为了确定C-9绝对构型，我们制备了化合物4的Mo2(OAc)4金属络合物，通过ECD谱324nm波长处的正Cotton效应确定9R构型。基于以上证据，化合物4鉴定为(R)-2-((R)-1,2-dihydroxypropan-2-yl)-2,3-dihydrobenzofuran-5-carboxylic acid，命名为graphostrin D。
化合物5的高分辨质谱HRESIMS中显示负离子峰为m/z 279.0872[M-H]-，分子式为C14H16O6。其1H和13C NMR数据与化合物4非常相似，区别为化合物5比4多了1个乙酰基信号(δH2.04；δC 21.1,170.7)。通过HMBC谱中的H2-10与乙酰基的羰基碳的相关信号确定乙酰氧基连在C-10位。因此，化合物5结构鉴定为4的C-10位乙酰氧基化衍生物，命名为graphostrinE。
化合物6的高分辨质谱HRESIMS中显示负离子峰为m/z 221.0808[M-H]-，分子式为C12H14O4。化合物6的1H和13C NMR数据与4-hydroxy-3-prenyl-benzoic acid极其相似，唯一不同之处为C-10位多1个羟基基团。该推断通过HMBC谱中的11-Me与C-8/C-9/C-10的相关信息得到证实。因此，化合物6鉴定为(E)-4-hydroxy-3-(4-hydroxy-3-methylbut-2-en-1-yl)benzoic acid，命名为graphostrin F。
化合物7的高分辨质谱HRESIMS中显示负离子峰为m/z 221.0811[M-H]-，分子式为C12H14O4，分子不饱和度为6。1HNMR谱中存在1个甲氧基，2个甲基，2个次甲基，1个亚甲基以及1个活泼氢。13C NMR显示12个碳信号，包括6个季碳，2个次甲基，3个甲基和1个亚甲基。这些核磁数据与(3R)-7-hydroxy-5-methylmellein非常相似，不同点为化合物7中C-3位连接甲氧基基团(δH 3.71,s；δC 60.9q)而非羟基基团。该推断通过HMBC谱中4-OH(δH 9.32)与C-3/C-4/C-5的相关信号得到证实。因此化合物7鉴定为(R)-7-hydroxy-8-methoxy-3,5-dimethylisochroman-1-one，命名为graphostrin G。
化合物8为白色粉末，高分辨质谱HRESIMS显示正离子峰为m/z 219.0631[M+Na]+，分子式为C10H12O4。化合物8的1H和13C NMR数据非常类似于gulypyrone B，不同之处在于gulypyrone B中的甲氧基被羟基取代。该推断得到2D NMR谱验证。因此，化合物8结构确定为3-demethylgulypyrone B，并命名为graphostrin H。
化合物9的高分辨质谱HRESIMS显示负离子峰为m/z 291.1608[M-H]-，分子式为C17H24O4。1HNMR谱中显示存在6个烯质子，1个含氧次甲基，1个甲氧基以及1个双峰甲基；而13CNMR谱中存在17个碳信号，包括3个季碳，7次甲基，5个亚甲基以及2个甲基。这些1H和13C NMR数据与crotonpyrone B及其相似，不同之处为化合物9的C-15位存在1个额外羟基，此外化合物9还存在两个双键分别位于Δ6,Δ8位而非1个双键位于Δ10位。基于耦合常数值(3JH6/H7＝15.3Hz；3JH8/H9＝15.4Hz)确定双键构型为6E和8E。因此确定化合物9结构鉴定为(6E,8E)-10,11-dihydro-6,8-dien-15-hydroxycrotonpyrone B，并命名为graphostrin I。
化合物1-9的1H NMR和13C NMR数据如表3和表4所示。
通过与文献中的NMR和MS数据进行比较，19个已知化合物(10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28)分别鉴定为reticulol,6,7,8-trihydroxy-3-methyl-isocoumarin,8-hydroxy-6,7-dimethoxy-3-methyl-isocoumarin,6,8-dihydroxy-7-methoxt-3-hydroxymethylisocoumarin,8-hydroxy-6,7-dimethoxy-3-hydroxymethylisocoumarin,6,8-dihydroxy-3-hydroxymethyl-1H-2-benzopyran-1-one,orthosporin,7,8-dihydroxy-3-methyl-3,4-dihydroisocoumarin,5-methylmellein,scytalone,RF-3192C,hydroxysulochrin,sulochrin,hydroxyemodin,phomopyrone A,3-methyl-4-hydroxy-6-(1-methyl-trans-1-propenyl)-2-pyrone,nectriapyrone,acropyrone,phomopyronol。
化合物29为无色油状物。高分辨质谱HRESIMS显示正离子峰为m/z 239.2044[M+H]+，推测其分子式为C15H26O2，分子不饱和度为3。13C NMR谱中存在15个碳信号，其中包括3个甲基(δC 14.4,Me-15；19.9,Me-12；29.4,Me-14)，5个亚甲基(1个末端烯碳，δC 107.8)，5个次甲基(1个含氧，δC 77.4)以及2个季碳。因此分子结构中存在双环。1HNMR谱中存在3甲基(δH1.40,1.76,1.08)，1个末端烯质子(δH 4.83,4.72)以及1个含氧次甲基(δH 4.22)。在COSY谱中，从H-1(δH 2.93)通过H2-2(δH 2.22)到H2-9(δH 2.11,1.80)以及从H-4(δH 2.29)到H3-15(δH 1.08)相关信号确定其结构片段。在HMBC谱中，Me-14(δH 1.40)与C-1(δC 53.0),C-9(δC37.8),C-10(δC 73.0)的相关信号表明C-1和C-9通过C-10(δC 73.0)相连构成七元环。此外，在HMBC谱中，由Me-12至C-7/C-11(δC 152.7)/C-13(δC 107.8)的交叉峰确定异丙烯基位于C-7位。因此，化合物29的平面结构确定为愈创木烷类型倍半萜。最终，化合物29的绝对构型通过X-射线单晶衍射实验(Cu Kα辐射)获得的Flack参数值-0.1(3)确定。因此，化合物29的结构确定为(1R,3R,4R,5S,7R,10R)-11(13)-en-3,10-dihydroxyguaiene，并命名为graphostromane A。
化合物30的高分辨质谱HRESIMS显示正离子峰为m/z 223.2057[M+H]+，结合13CNMR数据推测分子式为C15H26O。1H和13C NMR核磁数据与29非常相似，其不同之处在于化合物30少掉1个3-OH基团。该推断通过HMBC以及COSY谱得以验证。因此，化合物30结构鉴定为(1R,4S,5S,7R,10R)-11(13)-en-10-hydroxyguaiene，并命名为graphostromane B。
化合物31的高分辨质谱HRESIMS显示正离子峰为m/z 261.1829[M+Na]+，与化合物29具有相同的分子式，并且它们的NMR数据也非常相似。通过对其1H,13C,HSQC,COSY,HMBC谱分析确定化合物31的平面结构与29一致。然后通过NOESY谱验证它们为一对立体异构物，其相对构型确定为1R*,3S*,4R*,5R*,7R*和10R*。最后通过改良的Mosher反应确定C-3位绝对构型为S。因此，化合物31的结构确定为(1R,3S,4R,5R,7R,10R)-11(13)-en-3,10-dihydroxyguaiene，并命名为graphostromane C。
基于高分辨质谱HRESIMS和13C NMR谱，化合物32的分子式确定为C15H24O2。NMR数据与31非常相似，不同点为化合物32中存在1个酮羰基基团取代化合物31中的C-3位含氧次甲基。该推断通过分子式以及2D NMR谱得以验证。因此，化合物32的结构鉴定为(1R,4S,5S,7R,10R)-3-oxo-11(13)-en-10-hydroxyguaiene，并命名为graphostromane D。
高分辨质谱HRESIMS显示化合物33的正离子峰为m/z 261.1833[M+Na]+，与化合物29具有相同的分子式C15H26O2，而且它们的NMR数据也非常相似。不同之处为化合物33中C-1(ΔδC+9.7)和C-2(ΔδC+38.4)化学位移明显的偏向低场，而C-3(ΔδC-34.3)和C-4(ΔδC-11.0)则明显偏向高场，表明化合物33中的羟基位于C-2位而非化合物29中的C-3位。该推断得到COSY谱H-1(δH 2.07)/H-2(δH 4.27)/H2-3(δH 1.70)/H-4(δH 2.21)/Me-15(δH 0.89)的相关信号证实。同样采用改进的Mosher反应确定2S构型。因此，化合物33的结构确定为(1S,2S,4S,5S,7R,10R)-11(13)-en-2,10-dihydroxyguaiene，命名为graphostromane E。
化合物34的高分辨质谱HRESIMS显示正离子峰为m/z 277.1767[M+Na]+，分子式为C15H26O3，其13C NMR数据与化合物33非常相似，区别为化合物34在C-12位连有1个羟基基团。该假设在HMBC谱中从H2-13(δH 5.47,5.08)到C-7(δC 43.7),C-11(δC 157.9),C-12(δC64.1)的相关信号以及分子式得到支持。因此，化合物34的结构鉴定为(1S,2S,4S,5S,7R,10R)-11(13)-en-2,10,12-trihydroxyguaiene，命名为graphostromane F。
基于正离子模式下的高分辨质谱HRESIMS确定化合物35的分子式为C17H30O5。化合物35的NMR数据与已知化合物38((1S,2S,4S,5S,7R,10R)-guaiane-2,10,11,12-tetraol)非常相似，不同之处为化合物35中存在1个乙酰基信号(δH 1.99；δC 20.6,170.7)。在HMBC谱中，通过H2-12(δH 4.42)和Me-2’(δH 1.99)到乙酰基中的羰基碳C-1’(δC 170.7)相关信号确定乙酰氧基连接于C-12(δC 70.6)。同样采用改良的Mosher反应将C-2位绝对构型确定为S。幸运的是化合物35最终获得单晶，然后通过X射线单晶实验获得的Flack参数0.04(7)进一步证实了化合物35的绝对构型。因此，化合物35的结构确定为(1S,2S,4S,5S,7R,10R,11R)-12-acetyl-2,10,11-trihydroxyguaiane，命名为graphostromane G。
基于高分辨质谱HRESIMS确定化合物36的分子式为C15H28O4。NMR数据与已知物38非常相似。不同之处在于化合物36中少1个含氧次甲基，与此同时多1个含氧sp3季碳，这些信号提示化合物38中的羟基基团从C-2位转移到C-4位。该推测通过HMBC谱的Me-15(δH1.54)到C-3(δC 39.6),含氧季碳C-4(δC 80.9),以及C-5(δC 54.5)相关信号得以验证。因此，化合物36的结构确定为(1R,4R,5R,7R,10R,11R)-4,10,11-trihydroxyguaiane，命名为graphostromane H。
通过HRESIMS确定化合物37的分子式为C15H26O3。1H和13C NMR数据与已知化合物39((1R,4S,5S,7R,10R,11S)-guaiane-10,11,12-triol9)非常相似。不同之处为化合物39中的羟甲基被羧基基团取代，以此同时少掉C-11位羟基基团。该推断通过分子式以及HMBC谱的Me-13(δH 1.10)到C-7(δC 41.4),C-11(δC 47.0)和C-12(δC 180.2)的相关信号得以验证。因此化合物9的结构确定为(1R,4S,5S,7R,10R,11R)-10-hydroxyguai-12-oic acid,命名为graphostromane I。
化合物29-37的1H NMR和13C NMR数据如表5和表6所示。
通过与文献中的1H,13C以及OR数据比较，化合物38-41鉴定为已知愈创木烷倍半萜，结构分别为(1S,2S,4S,5S,7R,10R)-guaiane-2,10,11,12-tetraol,(1R,4S,5S,7R,10R,11S)-guaiane-10,11,12-triol,(1R,3S,4R,5S,7R,10R,11S)-guaiane-3,10,11,12-tetraol,(1R,4S,5S,7S,9R,10S,11R)-guaiane-9,10,11,12-tetraol.
表3化合物1-9的1H NMR核磁数据(400MHz)(δH in ppm,J in Hz)
Figure BDA0001513071270000111
Figure BDA0001513071270000121
表4化合物1-9的13C NMR数据(100MHz)
Figure BDA0001513071270000122
Figure BDA0001513071270000131
表5化合物29-37的1H NMR数据(400MHz)(δH in ppm，J in Hz)
Figure BDA0001513071270000132
表6化合物29-37的13C NMR数据(100MHz)
Figure BDA0001513071270000133
Figure BDA0001513071270000141
实施例2实施例1制备得到的化合物体外抗食物过敏活性筛选
本实施例选择以IgE介导的RBL-2H3细胞模型，检测细胞致敏后的脱颗粒效率，计算化合物样品对细胞脱颗粒效率的抑制率，从而检测实施例1中化合物抗食物过敏活性。
本实施例分以下5组：
(1)未激活组；
(2)DNP-BSA激活组；
(3)阳性对照组，berberine；
(4)阳性对照组，loratadine；
(5)深海真菌Graphostroma sp.3A00421的发酵化合物实验组：实施例1中所得深海真菌Graphostroma sp.3A00421的发酵化合物；
本实施例采用如下操作：
(1)将RBL-2H3细胞以每孔1.0×105个细胞的密度接种于96孔板中，并在37℃下用anti-DNP-IgE(0.1μg/mL)孵育16h；
(2)用PBS洗孔3遍，将样品溶于PBS中，分别取5μL样品加95μL Tyrode’s缓冲液混匀，未激活组以及DNP-BSA激活组添加5μL PBS+95μL Tyrode’s缓冲液；
(3)分别取95μL加到培养板中，继续培养1h，DNP-BSA激活组及深海真菌Graphostroma sp.3A00421的发酵化合物实验组用5μL DNP-BSA(终浓度为1μg/mL)刺激RBL-2H3细胞1h，未激活组添加5μL PBS继续培养1h；
(4)用4-methylumbellife-ryl-N-acetyl-β-d-glucosaminide(β-氨基己糖苷酶底物)测量β-氨基己糖苷酶活性，活性结果表示为上清液中β-氨基己糖苷酶活性相对于相应细胞裂解物中β-氨基己糖苷酶活性的百分比；
(5)活性的测定：在去除上清液之前先用0.1％Triton-X 100裂解细胞，将上清液(25μL)和细胞裂解液(25μL)分别放入96孔板中，在37℃与4-methylumbellife-ryl-N-acetyl-β-d-glucosaminide(100μL)混合反应30min，通过使用具有360nm激发和450nm发射的分光荧光计检测荧光强度来量化β-氨基己糖苷酶活性。
(6)脱颗粒效率计算公式：
脱颗粒效率＝(上清的荧光值/(上清的荧光值+细胞裂解液的荧光值))×100％。
(7)抗过敏抑制率计算公式
化合物抗过敏抑制率＝(DNP-BSA激活组的脱颗粒效率-深海真菌Graphostromasp.3A00421的发酵化合物实验组的脱颗粒效率)/(DNP-BSA激活组的脱颗粒效率-未激活组的脱颗粒效率)×100％。
IC50表示为抑制率为50％时的化合物浓度。
结果显示深海真菌Graphostroma sp.3A00421的发酵化合物有较明显的抗过敏活性，可用于制备相应的抗过敏药物。
表7化合物1-41抗过敏活性IC50数据
Figure BDA0001513071270000151
实施例3实施例1制备得到的化合物的体外抗炎活性筛选
本实施例通过检测脂多糖激活的巨噬细胞中的NO含量来反映实施例1制备得到的化合物的抗炎活性。
本实施例采用以下操作：
(1)将RAW 264.7巨噬细胞接种到24孔细胞培养板(每孔105个细胞)中，将细胞与实施例1制备得到的化合物和脂多糖(LPS，1mg/mL)共同孵育24h；
(2)上清液(100mL)依次用50mL 1％的对氨基苯磺酰胺和50mL 0.1％的萘乙二胺的2.5％磷酸溶液进行温育，通过用Griess试剂测定培养上清液中的亚硝酸盐浓度来评估NO产生量；
(3)使用酶标仪读取570nm处的吸光度。
IC50表示为抑制率为50％时的化合物浓度。
表8化合物1-41抗炎活性IC50数据
Figure BDA0001513071270000161
根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行适当的变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。

Claims (2)

1.结构式如式(IX)所示的聚酮类化合物在制备抗过敏药物中的应用；
Figure FDA0002455163330000011
其中，R1为H、R2为OMe、R3为H。
2.一种抗过敏药物，其特征在于，包括有效剂量的作为活性成分的结构式如式(IX)所示的聚酮类化合物，以及药学上可以接受的载体；
Figure FDA0002455163330000012
其中，R1为H、R2为OMe、R3为H。
CN201711366810.9A 2017-12-18 2017-12-18 深海真菌3a00421及其发酵化合物的应用 Active CN108265007B (zh)

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