WO2018034328A1

WO2018034328A1 - プテロスチルベン配糖体を含む外用組成物

Info

Publication number: WO2018034328A1
Application number: PCT/JP2017/029571
Authority: WO
Inventors: 博喜濱田; 大介上杉; 恵下田
Original assignee: 香港友池有限公司
Priority date: 2016-08-17
Filing date: 2017-08-17
Publication date: 2018-02-22
Also published as: KR20180032526A; EP3501490B1; KR101932877B1; EP3501490A4; EP3501490A1

Abstract

しわや皮膚のたるみなどの防止または改善する効果を発揮する外用組成物および美白効果を発揮する外用組成物のどちらか一方またはそれらの両方を提供することを課題とし、プテロスチルベン配糖体を含む外用組成物を提供することで、斯かる課題を解決する。

Description

プテロスチルベン配糖体を含む外用組成物

　本発明はプテロスチルベン配糖体を含む外用組成物に関する。

　特許文献１には、カロテノイドおよびプテロスチルベンを有効成分として含有する組成物が開示されている。斯かる組成物は、しわや皮膚のたるみなどの防止または改善効果を奏することが記載されている。

　特許文献２には、タンパク質粒子およびプテロスチルベンを有効成分として含有する組成物が開示されている。斯かる組成物は、メラニン産生抑制効果を発揮し、美白剤として用いることができることが記載されている。

　特許文献１に記載される組成物が奏する、しわや皮膚のたるみなどの防止または改善効果は、市場にとっては非常に魅力的な効果ではあるが、改善されるべき余地が存在する。特許文献２に記載される組成物が奏する美白効果についても、市場が満足するレベルには到達していない。

特開２０１３－２２７２７５号公報特開２０１３－０７５８５０号公報

　本発明は、しわや皮膚のたるみなどの防止または改善する効果を発揮する外用組成物および美白効果を発揮する外用組成物のどちらか一方またはそれらの両方を提供することを課題とする。

　本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、プテロスチルベンに対して特定の処理を施してプテロスチルベン配糖体を作製したところ、この配糖体が、しわや皮膚のたるみなどの防止または改善作用に関して、優れた効果を発揮することを見出した。また、上記する配糖体が優れた美白効果を発揮することも見出した。
　本発明は斯かる知見を基にして完成されたものであり、下記に示す態様の発明を広く包含するものである。

　項１　プテロスチルベン配糖体を有効成分として含む、外用組成物。

　項２　前記プテロススチルベン配糖体が、プテロスチルベン多糖体又はプテロスチルベンモノグリコシドである、項１に記載する外用組成物。

　項３　前記プテロスチルベン多糖体が、下記式（１）

（式中のｎは、１～９の整数である。）
にて表される、項２に記載する外用組成物。

　項４　前記ｎが１又は２である、項３に記載する外用組成物。

　項５　前記プテロスチルベンモノグリコシドが、プテロスチルベンモノグルコシドである項２に記載する外用組成物。

　項６　前記プテロスチルベンモノグルコシドが、下記式（２）

にて表される、項５に記載する外用組成物。

　項７　項１～項６の何れか１項に記載する外用組成物であって、該外用組成物中にカロテノイド化合物を含まない、外用組成物。

　項８　項１～項７の何れか１項に記載する外用組成物であって、該外用組成物の有効成分が、実質的にプテロスチルベン配糖体のみからなる、外用組成物。

　項９　４型コラーゲンの産生を促進させる用途に用いられる、項１～項８の何れか１項に記載する、外用組成物。

　項１０　肌にはりを与える用途に用いられる、項１～項９の何れか１項に記載する、外用組成物。

　項１１　チロシナーゼ活性を阻害する用途に用いられる、項１～項１０の何れか１項に記載する、外用組成物。

　項１２　美白用途に用いられる、項１～項１１の何れか１項に記載する、外用組成物。

　項１３　化粧料組成物である、項１～項１２の何れか１項に記載する、外用組成物。

　項１４　プテロスチルベン配糖体と、外用組成物に添加することが許容される成分とを混合する工程を含む、項１～項１３の何れか１項に記載する、外用組成物の製造方法。

　項１５　肌のたるみ防止、肌のはり付与、および美白からなる群より選択される少なくとも１つの効果を求めるヒトに対して、プテロスチルベン配糖体を肌または頭皮に適用する工程を含む、美容方法。

　項１６　プテロスチルベン配糖体の、肌のたるみ防止、肌のはり付与、および美白からなる群より選択される少なくとも１つの用途に用いられる外用組成物の製造のための使用。

　本発明の外用組成物は、４型コラーゲンの産生を促進する効果を発揮する。このような効果に基づき、本発明の外用組成物は肌のたるみを防止する用途及び肌にはりを与える用途のどちらか一方又はそれらの両方において、有用である。

　本発明の外用組成物、特にプテロスチルベンモノグリコシドは、チロシナーゼ活性を阻害する。このような効果に基づき、本発明の外用組成物は美白効果を与える用途に有用である。

皮膚細胞における４型コラーゲン遺伝子の発現量を、マイクロアレイ法によって確認した実験結果を示す図（実験例１）。図中のＡは陰性対象実験の結果、Ｂはプテロスチルベンモノグルコシドを添加した結果を示す。図中のグラフの縦軸は、Ａの４型コラーゲン遺伝子の発現量に対する、４型コラーゲン遺伝子の発現量の相対値を示す。三次元皮膚モデルにおける４型コラーゲンの発現量を、ウエスタンブロッティングによって確認した実験結果を示す図（実験例２）。図中のグラフ縦軸は、皮膚３次元モデル中の４型コラーゲンの量を、α－チューブリンを内部標準としたデンシトメトリーによる計算値を示す。図中のグラフ横軸の単位は、それぞれｍＭである。インビトロでのチロシナーゼ阻害実験結果を示す図（実験例３）。図中のＡはプテロスチルベン、Ｂはプテロスチルベンモノグリコシド、そして図中のＣはアルブチンを添加した時の結果を示す。図中のグラフの縦軸は、チロシナーゼのＩＣ_５０値（単位：ｍＭ）を示す。実験例４に示すプテロスチルベン多糖配糖体の製造結果を示す図。図中のＡはプテロスチルベンモノグリコシドをシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼの存在下で可溶性デンプンと反応させた反応物を、ＨＰＬＣにて解析した結果のチャートを示す。なお、図中の「mono-」とは「プテロスチルベン単糖配糖体」を、「di-」とは「プテロスチルベン二糖配糖体」を、「Tri-」とは「プテロスチルベン三糖配糖体」を、「tetra-」とは「プテロスチルベン四糖配糖体」を、「penta-」とは「プテロスチルベン五糖配糖体」を、「hexa-」とは「プテロスチルベン六糖配糖体」を、hepta-」とは「プテロスチルベン七糖配糖体」を、そして「octa-」とは「プテロスチルベン八糖配糖体」を表す。図中のＢはチャートの保持時間を基に、プテロスチルベン二糖配糖体を単離したことを示すチャートである。図中のＣは、同様にプテロスチルベン三糖配糖体を単離したことを示すチャートである。三次元皮膚モデルにおける４型コラーゲンの発現量を、ウエスタンブロッティングによって確認した実験結果を示す図（実験例５）。図中の写真像はウエスタンブロットの結果を示す。また、図中のグラフの縦軸はウエスタンブロットの結果を基に、α－チューブリンを内部標準としたデンシトメトリー解析による４型コラーゲンの発現量を示す。

外用組成物
　本発明の外用組成物はプテロスチルベン配糖体を有効成分として含む。

　このようなプテロスチルベン配糖体は、本発明の課題を解決する範囲において、特に限定されない。例えば、プテロスチルベン多糖体又はプテロスチルベンモノグリコシドを挙げることができる。

プテロスチルベン多糖体
　上記するプテロスチルベン多糖体とは、プテロスチルベン（ＩＵＰＡＣ名：４－［（Ｅ）－２－（３，５－Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｅｔｈｅｎｙｌ］ｐｈｅｎｏｌ）の３位の水酸基に対して、二つ以上の糖からなる多糖による修飾が施された配糖体である。

　このようなプテロスチルベン多糖体に含まれる糖残基は、本発明の課題を解決する範囲において、特に限定はされない。例えば、グルコース、トレオース、リキソース、アロース、プシコース、セドヘプツロース、およびボレミトールなどに代表される単糖に由来する糖残基を挙げることができる。これらの糖残基の中でも、グルコースが好ましい。

　上記する糖残基の種類は、本発明の課題を解決する範囲において、全て同一の種類とすることもでき、それぞれ異なる種類とすることもできる。例えば、全て同一の種類の糖残基とすることが好ましい。

　上記するプテロスチルベン多糖体に含まれる糖残基の個数は、本発明の課題を解決する範囲において、特に限定されない。例えば、２個～１０個の何れかを挙げることができる。好ましくは、２個または３個であり、３個が最も好ましい。

　上記するプテロスチルベン多糖体における多糖を構成する単糖間のグリコシド結合の種類は、本発明の課題を解決する範囲において、特に限定されない。例えば、１－４グリコシド結合、１－３グリコシド結合、１－６グリコシド結合等を挙げることができる。好ましくは、１－４グリコシド結合である。また、α－グリコシド結合とすることもでき、β－グリコシド結合とすることもできる。好ましくはα－グリコシド結合とすることである。

　なお、上記する多糖におけるグリコシド結合が複数である場合のグリコシド結合の種類は、それぞれ同一の種類とすることもできるし、異なる種類とすることもできる。好ましくは同一の種類とすることである。

　上記するプテロスチルベン多糖体に含まれる糖残基を構成する単糖の立体配置は、本発明の課題を解決する範囲において、特に限定されない。例えば、Ｄ体とすることもでき、Ｌ体とすることもできる。好ましくはＤ体である。

　このようなプテロスチルベン多糖体の中でも、下記式（１）

で表される化合物が最も好ましい。

　ここで、ｎは１～９の整数を意味する。好ましくは１～５であり、より好ましくは１～２である。

　上記するプテロスチルベン多糖体における、プテロスチルベンの３位の水酸基と、糖との結合様式は、本発明の課題を解決する範囲において、特に限定はされない。例えば、α－グリコシド結合とすることもでき、β－グリコシド結合とすることもできる。好ましくはβ－グリコシド結合とすることである。

　上記するプテロスチルベン多糖体は、プテロスチルベンと上記の単糖とを原料に、ケーニッヒ・クノール反応等を利用した化学的合成によって製造した、後記するプテロスチルベン単糖配糖体と糖とを、シクロデキストリントランスフェラーゼ等の酵素を用いることによる製造方法；または両者の原料と共に、ＰａＧＴ２などの配糖化酵素を用いて生合成に供する方法；またはブドウ類などの果実を含む植物体から公知の方法を採用した抽出法に供する方法によって製造することができる。

プテロスチルベンモノグリコシド
　上記するプテロスチルベンモノグリコシドとは、プテロスチルベン（ＩＵＰＡＣ名: ４－［（Ｅ）－２－（３，５－Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｅｔｈｅｎｙｌ］ｐｈｅｎｏｌ）の３位の水酸基に対して、単糖が修飾がされた誘導体である。
　単糖とは、純単糖とも呼ばれる、これ以上加水分解されない糖類のことをいい、これは本発明の課題を解決する範囲において、特に限定はされない。例えば、グルコース、トレオース、リキソース、アロース、プシコース、セドヘプツロース、およびボレミトールなどを挙げることができる。

　これらの単糖の中でも、グルコースが好ましい。よって、上記するプテロスチルベンモノグリコシドは、プテロスチルベンモノグルコシドとすることが好ましい。

　上記の単糖の立体配置は、本発明の課題を解決する範囲において、特に限定されない。例えば、Ｄ体とすることもでき、Ｌ体とすることもできる。好ましくはＤ体である。

　プテロスチルベンモノグリコシドにおける、プテロスチルベンの３位の水酸基と、単糖との結合様式は、本発明の課題を解決する範囲において、特に限定はされない。例えば、αーグリコシド結合とすることもでき、βーグリコシド結合とすることもできる。好ましくは、βーグリコシド結合である。

　このようなプテロスチルベンモノグリコシドの中でも、下記式（２）

で表されるプテロスチルベンモノグルコシドが最も好ましい。

　本発明の外用組成物には、プテロスチルベン多糖体以外の、任意の成分を包含することができる。しかし、任意の成分としてカロテノイド化合物は、本発明の外用組成物に包含されないことが好ましい。

　カロテノイド化合物とは、化学式Ｃ_４０Ｈ_５６の化学構造を有する化合物の誘導体であり、炭素および水素のみで形成されるカロテンと、炭素および水素以外の元素を含むキサントフィルとに分類される化合物である。具体的なカロテンは、本発明の課題を解決する範囲において、特に限定されない。例えば、α－カロテン、β－カロテン、γ－カロテン、δ－カロテン、リコピンなどの化合物を挙げることができる。

　キサントフィルは、化学式Ｃ_４０Ｈ_５６の化学構造を有する化合物の誘導体であって、炭素、水素、およびそれ以外の元素で形成される化合物である。具体的なキサントフィルは、本発明の課題を解決する範囲において、特に限定はされない。例えば、アスタキサンチン、ゼアキサンチン、ルテイン、クリプトキサンチン、ツナキサンチン、サルモキサンチン、パラシロキサンチン、ビオラキサンチン、アンテラキサンチン、ククルビタキサンチン、ディアトキサンチン、アロキサンチン、ペクテノール、ペクテノロン、マクトラキサンチン、カプサンチン、カプサンチノール、フコキサンチン、フコキサンチノール、ペリジニン、ハロシンチアキサンチン、アマロウシアキサンチン、カンタキサンチン、エキネノン、ロドキサンチン、ビキシン、ノルビキシンなどを挙げることができる。上記のキサントフィルには、これらのモノエステル体およびジエステル体も包含される。

　好ましくは、本発明の外用組成物は有効成分として実質的にプテロスチルベン配糖体のみを含有するものである。

　ここで有効成分とは、本発明の外用組成物が発揮する効果として後述する、４型コラーゲン産生を促進する効果およびチロシナーゼ活性を阻害する効果のどちらか一方又はそれらの両方を奏する成分を意味する。つまり、本発明の外用組成物は、プテロスチルベン配糖体以外に、４型コラーゲン産生促進作用及びチロシナーゼ活性阻害作用のいずれか少なくとも一方の作用を有する成分を含有しないものであることが好ましい。

　本発明の外用組成物に含まれるプテロスチルベン配糖体の含有量は、本発明の外用組成物が本発明の効果を奏することを限度として、特に限定されない。例えば、１００質量％の外用組成物に対する有効成分の配合量と、通常は０．００１質量％～１００質量％程度とすることができる。

　下記の実施例（例えば、実験例２）に示すように、プテロスチルベン配糖体を有効成分として含む組成物は、優れた４型コラーゲン産生促進効果を発揮する。このことから、プテロスチルベン配糖体も、同様に優れた４型コラーゲン産生促進効果を発揮すると考えられる。したがって、プテロスチルベン配糖体を有効成分とする組成物は、４型コラーゲンの産生を促進させる用途に好適に用いられる。

　４型コラーゲンとはセラミドトランスファープロテイン（ＣＥＴＲ）とも呼ばれ、皮膚の基底膜に存在し、基底膜において細胞外マトリックス同士の結合に関与することが知られている。プテロスチルベン配糖体を外用することにより、基底膜の４型コラーゲンが亢進すると共に、老化などによる肌のたるみを抑え、肌にはりを与える効果を発揮する。

　以上に鑑みて、本発明の外用組成物は、これをヒトに適用（外用）することによって、肌のたるみを抑え、はりを与える効果を奏することが期待される。

　下記の実施例（例えば、実験例３）に示すように、プテロスチルベンモノグルコシドは、優れたチロシナーゼ阻害活性を発揮する。このことから、同様に、その他のプテロスチルベン配糖体も、優れたチロシナーゼ阻害活性を発揮することが期待される。したがって、テロスチルベン配糖体を有効成分とする組成物は、チロシナーゼ活性を阻害する用途に好適に用いられる。

　チロシナーゼとはメラニン合成に関わる酵素であり、この活性を阻害する組成物は美白効果を奏することが知られている。よって、本発明の外用組成物は、これをヒトに適用（外用）することによって、美白効果を奏することが期待できる。つまり、美白剤として有用である。

　本発明の外用組成物の適用対象としては、上記のような効果を必要とするヒトであれば特に限定されることはない。

　本発明の外用組成物の使用量は、上記のような効果を期待できる範囲内の使用量である限り、特に限定はされない。例えば、後述する本発明の外用組成物の１形態である化粧料組成物、または医薬組成物などにおける使用量から、適宜決定することができる。具体的には、外用組成物に含まれるプテロスチルベン配糖体の量に換算して、肌または頭皮の１ｃｍ^２あたり、通常１ｍｇ～５ｍｇ程度の量とすることができる。

　本発明の外用組成物の形態は、本発明の課題を解決する範囲において、特に限定はされない。例えば、化粧料組成物、または医薬組成物を挙げることができる。中でも、化粧料組成物が好ましい。

化粧料組成物
　本発明の外用組成物は、化粧料組成物の形態とすることができる。本発明の化粧料組成物には、薬用化粧品などの医薬部外品も包含する。

　化粧料組成物に含まれるプテロスチルベン配糖体の配合量は、本発明の課題を解決する範囲において、特に限定されない。例えば、１００質量％の化粧料組成物に対する有効成分の配合量として、通常は０．００１質量％～１００質量％程度とすることができる。

　化粧料組成物の具体的な態様は、本発明の課題を解決する範囲において、特に限定されない。例えば、ファンデーション、頬紅、白粉などのメイクアップ化粧料；化粧水、乳液、スキンクリーム、ローション、オイル、パックなどの基礎化粧料；洗顔料、クレンジング、ボディソープなどの皮膚洗浄料；シャンプー、リンス、コンディショナー、整髪剤、育毛剤などの毛髪化粧料；バスソルト、バスタブレット、バスリキッドなどの入浴剤、マッサージ剤、清拭剤などの態様を挙げることができる。

　化粧料組成物の形状は、本発明の課題を解決する範囲において、特に限定はされない。例えば、ローション状（液状）、ムース状、ジェル状、ゼリー状、乳液状、懸濁液状、クリーム状、軟膏状、シート状、エアゾール状、スプレー状などを挙げることができる。このような種類の形状とすることで、皮膚のみならず、頭皮にも適用することができる。

　化粧料組成物の適用量は、本発明の課題を解決する範囲において、特に限定はされない。具体的には、適用対象者の性別や年齢、当該化粧料組成物の適用形態、所望する効果の程度などに基づいて適宜設定することができる。例えば、化粧料組成物に含まれるプテロスチルベン配糖体の量に換算して、肌または頭皮の１ｃｍ^２あたり、通常１ｍｇ～５ｍｇ程度の量とすることができる。肌とは、ヒトにおいて頭皮以外の外部に露出した粘膜以外の領域の事を意味する。

医薬組成物
　本発明の外用組成物は、医薬組成物の形態とすることができる。

　医薬組成物に含まれるプテロスチルベン配糖体の配合量は、本発明の課題を解決する範囲において、特に限定されない。例えば、１００質量％の医薬組成物に対する有効成分の配合量として、通常は０．００１質量％～１００質量％程度とすることができる。

　医薬組成物の剤形は、本発明の課題を解決する範囲において、特に限定はされない。たとえば、エアゾール剤、液剤、エキス剤、（眼）軟膏剤、経皮吸収型製剤、懸濁剤、乳剤、酒精剤、貼付剤、チンキ剤、パップ剤、芳香水剤、リニメント剤、流エキス剤、ローション剤などの、主として外用される剤形を挙げることができる。

　このような医薬組成物の投与量は、本発明の課題を解決する範囲において、特に限定はされない。具体的には、適用対象者の性別や年齢、当該医薬組成物の適用形態、所望する効果の程度などに基づいて適宜設定することができる。例えば、医薬組成物に含まれるプテロスチルベン配糖体の量に換算して、ヒト成人の一日あたりで、通常１～５ｍｇ／ｃｍ^２程度の量とすることができる。

外用組成物の製造方法
　本発明の外用組成物の製造方法は、プテロスチルベン配糖体と、外用組成物に添加することが許容される成分とを混合する工程を含む。

　プテロスチルベン多糖体とは、上記のとおりである。

　外用組成物に添加することが許容される成分とは、本発明の課題を解決する範囲において、特に限定されない。例えば、上記の外用組成物の一つの形態として挙げた、化粧料組成物、または医薬組成物に添加することが許容される成分とすることができる。

　以下に、本発明をより詳細に説明するための実施例を示す。なお、本発明が以下に示す実施例に限定されないのは言うまでもない。

＜実験例１＞
下記の下記式（２）

で表されるプテロスチルベンモノグルコシドを、マイスターバイオ社から入手し、以下の実験に用いた。

　ｈｔｅｒｔ遺伝子を導入して不死化したヒト皮膚細胞を準備し、これを所定の培地であるPrigrow III（ＡＰＢ）中で馴化した。その後、馴化培地に５０μＭの上記プテロスチルベンモノグルコシドを添加し、５日間、３７℃の５％ＣＯ_２環境下で培養した。

　培養後の細胞からＲＮＡを回収し、４型コラーゲンｍＲＮＡの発現量の変化を、マイクロアレイ法によって調べた。結果を図１に示す。なお、馴化培地にプテロスチルベンモノグルコシドを添加しない陰性対象実験も行った。

　図１に示すように、プテロスチルベンモノグリコシドを添加することによって（図中のＡ）、ヒト皮膚細胞に含まれる４型コラーゲン遺伝子の発現量が、陰性対象実験（図中のＢ）と比較して、１．３５倍程度に増大することが明らかとなった。

＜実験例２＞
　プテロスチルベンモノグリコシドは、皮膚細胞における４型コラーゲン遺伝子の発現量を亢進させることが、上記の実験例１から明らかになったので、同様に、プテロスチルベンモノグリコシドによる皮膚細胞における４型コラーゲンのタンパク質レベルでの発現量の亢進も期待された。

　そこで、ヒト皮膚角化細胞およびヒト線維芽細胞から構成される皮膚３次元モデルの作製キット（ＥＦＴ－４００；クラボウ社）を用いた、ウエスタンブロッティング法による実験を行った。

　キットのプロトコルに沿って皮膚３次元モデルを作製し、これを上記キットに付属する培地を用いて馴化した。馴化培地に上記のプテロスチルベンモノグルコシド（終濃度で２５μＭおよび１００μＭ）を添加して、７日間培養した。

　培養後の細胞を回収し、そのライセートを抗ヒトコラーゲン抗体（ＣＯＬ４Ａ３ＢＰ；アブカム社）を用いたウエスタンブロッティング法に供し、４型コラーゲンタンパク質の発現量を検討した。なお、内部標準として抗α－チューブリン抗体を用いたウエスタンブロッティングも行い、得られた画像データをデンシトメトリー解析に供した。これらの結果を図２に示す。

　図２に示すように、プテロスチルベンモノグルコシドは、皮膚三次元モデル内の４型コラーゲンの発現量を、添加濃度依存的に、コントロールと比べて最大で２．５倍程度に増大させることが明らかとなった。よって、プテロスチルベンモノグルコシドを有効成分として含む組成物は、皮膚細胞における４型コラーゲンの増大に起因する各種効果（例えば、基底膜の肥厚による、肌にはりを与える効果など）に関連することが明らかとなった。

＜実験例３＞
　プテロスチルベンモノグルコシドによるチロシナーゼ阻害効果（ＩＣ_５０値の測定）を、一般的に知られる方法（例えば、Expert Opin Ther Pat. 2016;26(3):347-62.）に基づいて行った。チロシナーゼとしてＳＩＧＭＡ社のチロシナーゼ（Ｃａｔ　Ｎｏ．Ｔ３８２４）を用い、プテロスチルベン（東京化成工業社製；図中のＡ）、上記のプテロスチルベンモノグルコシド（図中のＢ）、およびポジティブコントロールとしてアルブチン（図中のＣ）を用いた。これらの結果を図３に示す。

　図３に示すように、プテロスチルベンモノグルコシド（図中のＢ）は、そのアグリコンであるプテロスチルベン（図中のＡ）と比較して、優れたチロシナーゼ阻害活性を有することが明らかとなった。両者をＩＣ_５０値で比較すると、プテロスチルベンモノグルコシドの方が、５．５倍近く優れたチロシナーゼ阻害効果を発揮することが明らかとなった。

＜実験例４＞
　上記の実験例１～３にて用いたプテロスチルベンモノグルコシドを原料に、プテロスチルベン多糖体を作製した。

　具体的には、上記する化学式（２）で表される１ｇのプテロスチルベンモノグリコシドを４０ｍＬの蒸留水に溶解させた。このようにして作製した溶解液に、４ｇの可溶性デンプン（ナカライテスク）を加え、０．５ｍのシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ（アマノエンザイム）の存在下で、６０℃で２４時間インキュベートした。

　この酵素は、グルコース分子を有する化合物に対して、他のグルコース分子を１－４グリコシド結合させる反応を触媒する酵素である。このようにして得られた反応物をＨＰＬＣに供した。結果（ＨＰＬＣチャート）を図４Ａに示す。ＨＰＬＣの条件は以下のとおりである。

・使用カラム：ＹＭＣ－Ｐａｃｋ　Ｒ＆Ｄ　ＯＤＳ（φ２０×１５０ｍｍ）
・展開液　　：アセトニトリル３５％水溶液
・流速　　　：１ｍｌ／分
・測定温度　：４０℃

　図４Ａに示すように、上記の反応物には、プテロスチルベン配糖体であるプテロスチルベン単糖配糖体、およびこれに１～７個程度のグルコースがα（１－４）結合したプテロスチルベン多糖体が含まれることをＨＰＬＣにて確認した。保持時間が短くなるほど、プテロスチルベンに付加されるグルコース数が増える傾向となることが示唆された。

　更に、この反応物からプテロスチルベン二糖配糖体およびプテロスチルベン三糖配糖体を、ＨＰＬＣを繰り返し行って単離した。単離した後のＨＰＬＣチャートをそれぞれ図４Ｂ（プテロスチルベン二糖配糖体）および図４Ｃ（プテロスチルベン三糖配糖体）に示す。

　また、単離したプテロスチルベン二糖配糖体およびプテロスチルベン三糖配糖体の質量分析データは以下のとおりである。なお、質量分析はESI^-法を用いて行った。

プテロスチルベン二糖配糖体：実測値５７９．２；推定値５８０．３
プテロスチルベン三糖配糖体：実測値７４１．２；推定値７４２．３

＜実験例５＞
　上記の実験例４にて単離したプテロスチルベン二糖配糖体およびプテロスチルベン三糖配糖体を用い、プテロスチルベン多糖体が皮膚３次元モデルに対して、４型コラーゲンタンパク質の発現量を亢進させるかどうかを確認する実験を行った。

　具体的には、実験例２と同様に実験を行い、プテロスチルベンモノグルコシドに代えて、上記するプテロスチルベン二糖配糖体およびプテロスチルベン三糖配糖体のＤＭＳＯ溶液（共に５０μＭ）を作製し、これらを皮膚３次元モデルに添加して、７日間培養した。培養後の細胞のライセートを抗ヒトコラーゲン抗体を用いたウエスタンブロッティング法に供し、細胞内での４型コラーゲンの発現量を検討した。陰性コントロール（Ｃｔｒｌ）として、ＤＭＳＯ溶液のみを皮膚３次元モデルに添加した実験を行った。

　なお、内部標準として抗α－チューブリン抗体を用いたウエスタンブロッティングも行い、得られた画像データをデンシトメトリー解析に供した。これらの結果を図５に示す。

　図５に示す結果から、陰性コントロール（ＤＭＳＯ）と比較して、プテロスチルベン二糖配糖体の添加によって、皮膚３次元モデルにおける４型コラーゲンの発現量が約１．３７倍程度に上昇することが明らかとなった。そして、プテロスチルベン二糖配糖体の添加によって、皮膚３次元モデルにおける４型コラーゲンの発現量が約１．９７倍程度に上昇することが明らかとなった。

　よって、プテロスチルベン多糖体を有効成分として含む組成物も、皮膚細胞における４型コラーゲンの増大に起因する各種効果（例えば、基底膜の肥厚による、肌にはりを与える効果など）に関連することが明らかとなった。

［処方例］
　以下の表１～４に示す配合例に従って、各種化粧料組成物を製造する。なお、プテロスチルベン配糖体とは、下記式（１）

（式中のｎは１～９の何れかであり、３糖が好ましい。また、式中のグルコース間のグリコシド結合は全て１－４結合であって、プテロスチルベンの３位とグルコースとの結合様式およびグルコース間のグリコシド結合は、共にα－結合である。）にて表される化合物及び下記式（２）

にて表される化合物のどちらか一方又はそれらの両方である。

Claims

　　プテロスチルベン配糖体を有効成分として含む、外用組成物。
　　前記プテロススチルベン配糖体が、プテロスチルベン多糖体又はプテロスチルベンモノグリコシドである、請求項１に記載する外用組成物。
　　前記プテロスチルベン多糖体が、下記式（１）

（式中のｎは、１～９の整数である。）
にて表される、請求項２に記載する外用組成物。
　　前記ｎが１又は２である、請求項３に記載する外用組成物。
　　前記プテロスチルベンモノグリコシドが、プテロスチルベンモノグルコシドである請求項２に記載する外用組成物。
　　前記プテロスチルベンモノグルコシドが、下記式（２）

にて表される、請求項５に記載する外用組成物。
　　請求項１～６の何れか１項に記載する外用組成物であって、該外用組成物中にカロテノイド化合物を含まない外用組成物。
　　請求項１～７の何れか１項に記載する外用組成物であって、該外用組成物の有効成分が、実質的にプテロスチルベン配糖体のみからなる外用組成物。
　　４型コラーゲンの産生を促進させる用途に用いられる、請求項１～８の何れか１項に記載する外用組成物。
　　肌のたるみを防止する用途および肌にはりを与える用途のいずれか少なくとも一方の用途に用いられる、請求項１～９の何れか１項に記載する外用組成物。
　　チロシナーゼ活性を阻害する用途に用いられる、請求項１～１０の何れか１項に記載する外用組成物。
　　美白用途に用いられる、請求項１～１１の何れか１項に記載する外用組成物。
　　化粧料組成物である、請求項１～１２の何れか１項に記載する外用組成物。
　　プテロスチルベン配糖体と、外用組成物に添加することが許容される成分とを混合する工程を含む、請求項１～１３の何れか１項に記載する外用組成物の製造方法。
　　肌のたるみ防止、肌のはり付与、および美白からなる群より選択される少なくとも１つの効果を求めるヒトに対して、プテロスチルベン配糖体を肌または頭皮に適用する工程を含む美容方法。
　　プテロスチルベン配糖体の、肌のたるみ防止、肌のはり付与、および美白からなる群より選択される少なくとも１つの用途に用いられる外用組成物の製造のための使用。