WO2017048098A1 - 기능성 수화 히알루론산 및 이를 이용한 장 점막부착능이 우수하고 선택적 길항작용을 하는 코팅 유산균의 제조방법 - Google Patents

기능성 수화 히알루론산 및 이를 이용한 장 점막부착능이 우수하고 선택적 길항작용을 하는 코팅 유산균의 제조방법 Download PDF

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hyaluronic acid
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강대중
강재훈
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Definitions

  • the present invention relates to a functional hydrated hyaluronic acid and a method for producing coated lactic acid bacteria having excellent intestinal mucosa adhesion and selective antagonism using the same, and more particularly, the present invention is a lactic acid bacteria fermentation component is collected in hyaluronic acid which is a natural polymer material.
  • Probiotics are microorganisms that live in the gastrointestinal tract of humans and animals and have beneficial effects on humans and animals, including Lactobacilli, Bifidobacteria and Enterococci.
  • Intestinal physiological activities of lactic acid bacteria include balance of intestinal flora, inhibition of growth of harmful bacteria, prevention of diarrhea, protection of intestinal epithelial cells, inhibition of absorption of toxic substances, and inhibition of carcinogenesis.
  • lactic acid bacteria In order for lactic acid bacteria to act as probiotics, they must bind to intestinal mucosa and proliferate, and have an antagonistic activity against harmful bacteria. In order for the lactic acid bacteria to adhere to the host intestinal mucosa, the lactic acid bacteria must be attached through competition with the host flora.
  • Nurmi and Rantala first introduced a competitive it exclusion of harmful microorganisms and reported that salmonella infection was reduced as a result of inoculation of chicken intestinal contents with freshly hatched chicks.
  • Normal intestinal microbes in chickens adhered better to the adsorption portion of the barrier surface cells, produced fatty acids and other antimicrobial substances, and reported an advantage in competition for nutrients.
  • Lactic acid bacteria are known to be adsorbed on the intestinal mucosa of the host because l ipoteichoic acid, polysaccharides, proteins, etc., the cell wall components of lactic acid bacteria are involved in the intestinal mucosa.
  • the cell structure of lactic acid bacteria consists of a cell membrane and a cell wall surrounding it.
  • the cell wall functionally shows the shape of lactic acid bacteria and surrounds the cell membrane to protect the lactic acid bacteria from the external environment.
  • the four important components of the cell wall are peptidoglycan, teichoic acid, S-layer, and polysaccharides, which are involved in binding to the extracel lular matrix (ECM) of the intestinal mucosa.
  • ECM extracel lular matrix
  • Lactobacillus binds to dendritic cells (dendritic cel l, DC) of the intestinal mucosa, and then transmits various cell signals including intestinal action to prevent immune diseases.
  • lactic acid bacteria When lactic acid bacteria adhere to smooth membranes through competitive exclusion, they produce a variety of substances that affect other microorganisms in the intestine. Among them, lactic acid acidifies the contents of the intestines to inhibit the survival of other microorganisms. In general, lactic acid bacteria should have better binding ability with harmful membranes than harmful bacteria such as Escherichia coli and Salmonella. However, lactic acid bacteria classified as gram-positive bacteria than Gram-negative bacteria such as Escherichia coli and Salmonella should be relatively more effective with intestinal membranes. Cohesion falls. In addition, lactic acid bacteria also show a difference in adhesion ability according to the separation source.
  • lactic acid bacteria of the genus Lactobaci l lus have good adhesion affinity with small intestinal mucosa and probiotic bacteria of bi f idobacter ium genus have good affinity with colonic mucosa.
  • probiotic bacteria of bi f idobacter ium genus have good affinity with colonic mucosa.
  • conventional lactic acid bacteria coating technology has been divided according to survival rate in the gastrointestinal tract from the first generation to fourth generation. The first generation was uncoated lactic acid bacteria, the second generation was enteric coated lactic acid bacteria, the third generation was microencapsulated lactic acid bacteria, and the fourth generation was protein coated lactic acid bacteria.
  • hyaluronic acid-based quadruple coated lactic acid bacteria referred to as the fifth generation coating technology (refer to Korea Patent Registration 10-1280232), compared to conventional single to triple coated lactic acid bacteria, significantly improved heat resistance, acid resistance and bile resistance, and thus survival rate of lactic acid bacteria. Contributed greatly.
  • Conventional four-coated lactobacillus manufacturing technology based on hyaluronic acid has significantly improved heat resistance, acid resistance and bile resistance compared to conventional single to triple coated lactic acid bacteria by using a hyaluronic acid, a natural polymer, as a coating agent.
  • the present inventors have overcome the limitations of the conventional lactic acid bacteria coating technology, researches to develop a lactic acid bacteria coating technology that significantly improved the intestinal mucosa adhesion efficiency, intestinal mucosa fixation time, competitive inhibition effect against intestinal harmful bacteria Over and over.
  • a "functional hydrated hyaluronic acid” which is a lactic acid bacteria fermented ingredient collected in hyaluronic acid which is a natural polymer substance, and confirmed that the functional hydrated hyaluronic acid showed a growth inhibition action against harmful bacteria and a growth promoting action against beneficial bacteria.
  • the present invention was completed by paying attention to the fact that it can be used as a lactic acid bacterium coating agent exhibiting the desired effect.
  • an object of the present invention is the lactic acid bacteria fermented material prepared by the method of adding a hyaluronic acid in a ratio of 0.001 parts by weight to 1 parts by weight with respect to 100 parts by weight of the lactic acid bacteria culture medium, and then dissolved by stirring at 30 to 60 ° C. To provide the collected functional hydrated hyaluronic acid.
  • Another object of the present invention is to provide a lactic acid bacteria coated with the functional hydrated hyaluronic acid.
  • Another object of the present invention is the step of (a) mixing the primary coating by mixing the water-soluble polymer with lactic acid bacteria; (b) a second coating by mixing a functional hydrated hyaluronic acid with the primary coated lactic acid bacteria in step (a); (c) mixing the coating agent having a porous particle in the secondary coated lactic acid bacteria in step (b) and tertiary coating; And (d) it is to provide a method for producing a four-coated lactic acid bacteria characterized in that it comprises the step of mixing the protein to the third coated lactic acid bacteria in step (c).
  • Another object of the present invention is to provide a quadruple coated lactic acid bacteria prepared according to the method of producing a quadruple coated lactic acid bacteria.
  • the present invention is a lactic acid bacteria prepared by the method of adding a hyaluronic acid in a ratio of 0.001 part by weight to 1 part by weight with respect to 100 parts by weight of lactic acid bacteria culture medium, and then stirred and dissolved at 30 to 60 ° C. It provides a functional hydrated hyaluronic acid in which the fermentation material is collected.
  • a lactic acid bacteria coated with a functional hydrated hyaluronic acid is a lactic acid bacteria coated with a functional hydrated hyaluronic acid.
  • step (a) the first step of mixing the water-soluble polymer in lactic acid bacteria; (b) mixing a second functional coating with a functional hydrated hyaluronic acid in the first coated lactic acid bacteria in step (a); (c) mixing the coating agent having porous particles with the secondary coated lactic acid bacteria in step (b) and tertiary coating; And (d) in the step (c) provides a method for producing a quadruple coated lactic acid bacteria, characterized in that the step of the fourth coating by mixing the protein to the third coated lactic acid bacteria.
  • the present invention provides a quadruple coated lactic acid bacteria prepared according to the method for producing a quadruple coated lactic acid bacteria.
  • the present invention provides a functional hydrated hyaluronic acid in which the lactic acid bacterium fermentation material prepared by the method of adding hyaluronic acid to a ratio of 0.001 part by weight to 1 part by weight with respect to 100 parts by weight of the lactic acid bacteria culture medium is collected and dissolved.
  • the functional hydrated hyaluronic acid is a lactic acid bacteria culture medium is collected in hyaluronic acid, exhibits the growth inhibitory effect on harmful intestinal bacteria, does not have any effect on beneficial bacteria or collects the components that help its growth Means.
  • the inventors of the present invention is a lactic acid bacteria representative bacteria of bacteria classified as beneficial bacteria intestinal bacteria, so the lactic acid bacteria do not affect or to use the lactic acid bacteria fermented product to extract the components to help the growth of lactic acid bacteria, and this to hyaluronic acid By collecting, a coating agent having a desired effect has been developed.
  • the functional lactic acid hyaluronic acid was produced by collecting the lactic acid bacteria fermentation product to be promoted in hyaluronic acid.
  • the functional hydrated hyaluronic acid is prepared by adding a hyaluronic acid in a ratio of 0.001 part by weight to 1 part by weight with respect to 100 parts by weight of the lactic acid bacteria culture medium, followed by stirring and melting at 30 to 60 ° C. Can be.
  • the lactic acid bacterium fermentation material may be collected in hyaluronic acid to exhibit antibacterial activity against harmful intestinal bacteria and at the same time, to promote growth of beneficial bacteria.
  • the culture medium of lactic acid bacteria is harmful bacteria such as lpoteichoic acid (l ipoteichoic acid) and peptidoglycan, which are representative components of lactic acid bacteria or its culture by pressurizing and tyndal li zat ion.
  • the lactic acid bacteria culture medium in the present invention may be a tyndal (tyndal li zat ion), preferably the lactic acid bacteria culture medium may be prepared by the following steps have:
  • step (b) subjecting the culture medium subjected to pressurized heat treatment in step (a) to 25 to 35 ° C .;
  • step (c) pressurized heat treatment of the culture solution cooled in step (b) at 105 to 115 ° C for 8 to 12 minutes;
  • step (d) cooling the pressurized heat-treated culture to 25 to 35 ° C. in step (c); '
  • the lactic acid bacterium for producing functional hydrated hyaluronic acid is a lactic acid bacterium producing a fermentation product of antimicrobial component, Lactobacillus ⁇ Lactobacillus sp. ), Bifidobacterium sp. ), The genus Streptococcus— (Streptococcus sp. ), Lactococcus sp. ), Enterococcus sp. ), Genus Pediococcus (Pediococcus sp.
  • Lactococcus J act is subsp. cremoris, Pediococcus ac idol act ici i, Pediococcus pentosaceus, Leuconostoc carnosum, Leuconostoc citreum, Leuconostoc gasicomitatum, Leuconostoc gellidum, Leuconostoc inhae, Leuconostoc kimchii, Leuconostoc 1 act me, Leenteconostoc.
  • the functional hydrated hyaluronic acid in which the lactic acid bacteria culture was collected was found to not only inhibit the intestinal mucosa adhesion of Salmonella typhimurium, which can be seen as an intestinal harmful bacterium, but also inhibit the growth. (Example 2 and Example 3).
  • Lactobacillus rhamnosus ⁇ (Lactobacillus rhamnosus), represented by lactic acid bacilli, bifidus, lactobacillus to evaluate the effect of functional hydrated hyaluronic acid on the growth of enteric beneficial bacteria, Bifidobacterium ⁇ Bifidobacte un] longum) and Enterococcus pesium (r7 e / (?
  • functional hydrated hyaluronic acid can be used as a coating agent to increase the intestinal mucosa adhesion and adhesion time of lactic acid bacteria by showing selective antagonism that promotes the growth of enteric beneficial bacteria and inhibits the growth of harmful bacteria.
  • the present invention provides a lactic acid bacterium coated with the functional hydrated hyaluronic acid.
  • the present invention also provides excellent intestinal mucosa adhesion and selective antagonism using the functional hydrated hyaluronic acid.
  • step (b) adding a functional hydrated hyaluronic acid to the primary coated lactic acid bacteria in step (a).
  • Secondary coating
  • step (c) mixing the coating agent having porous particles with the secondary coated lactic acid bacteria in step (b) and tertiary coating;
  • step (d) characterized in that it comprises a step of the fourth coating by mixing the protein to the third coating lactic acid bacteria in step (c).
  • step (b) a second coating by mixing a functional hydrated hyaluronic acid with the primary coated lactic acid bacteria in step (a);
  • step (c) mixing the coating agent having porous particles with the secondary coated lactic acid bacteria in step (b) and tertiary coating;
  • step (d) characterized in that it comprises a step of the fourth coating by mixing the protein to the third coating lactic acid bacteria in step (c).
  • step (b) a second coating by mixing a functional hydrated hyaluronic acid with the primary coated lactic acid bacteria in step (a);
  • step (c) tertiary coating by mixing maltodextrin (maltodextr in, MD) having porous particles in the secondary coated lactic acid bacteria in step (b);
  • step (d) characterized in that it comprises a step of the fourth coating by mixing the protein to the third coating lactic acid bacteria in step (c).
  • step (b) a second coating by mixing a functional hydrated hyaluronic acid with the primary coated lactic acid bacteria in step (a);
  • step (c) mixing the coating agent having porous particles with the secondary coated lactic acid bacteria in step (b) and tertiary coating;
  • step (d) characterized in that it comprises a step of the fourth coating by mixing whey protein to the third coating lactic acid bacteria in step (c).
  • step (b) mixing a second functional coating with a functional hydrated hyaluronic acid in the first coated lactic acid bacteria in step (a);
  • step (c) mixing maltodextrin D having porous particles with the secondary coated lactic acid bacteria in step (b) and tertiary coating;
  • step (d) mixing the whey protein to the third coated lactic acid bacteria in step (c), characterized in that it comprises the step of fourth coating.
  • the water-soluble polymer was selected by evaluating crosslinking ability with functional hydrated hyaluronic acid in order to increase the lactic acid bacteria surface bonding strength.
  • the water-soluble polymer having excellent cross-linking ability of the functional hydrated hyaluronic acid while being used as the cell thin film coating agent of the present invention is not limited thereto, but is not limited thereto, carboxymethyl cellulose (CMC), hydroxyethyl cellulose (hydroxyethykellulose, HEC), xantha gum (XG), guar gum (GG), polyvinylpyrroridone (PVP), chitosan, arabia gum, carbopol, Sodium alginate (sodium alginate), propylene glycol alginate (propylene glycol alginate) is preferably selected from the group consisting of.
  • carboxymethyl cellulose Preferably carboxymethyl cellulose (CMC), hydroxyethyl cellulose (HEC), xantha gum (XG), guar gum (GG), polyvinyl Pyridone (polyvinylpyrroridone (PVP), chitosan, arabia gum, carbopol), more preferably carboxymethyl cellulose (loose (carboxymethyl cellulose, CMC), polyvinylpyrrolidone (polyvinylpyrroridone (PVP), chitosan, arabia gum, carbopol), most preferably carboxymethyl cellulose (CMC).
  • the water-soluble polymer is mixed in a ratio of 0.1 parts by weight to 10 parts by weight with respect to 100 parts by weight of the lactic acid bacteria culture medium is first coated.
  • the mixing ratio of the water-soluble polymer 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5..8, 5.9, 6,, 0, 6.1, 6.2 '6.3, 6.4, 6.5, 6.6,
  • the water-soluble polymer is mixed with 0.1 part by weight to 5 parts by weight with respect to 100 parts by weight of the lactic acid bacteria culture medium, and most preferably with 0.1 part by weight to 0.5 parts by weight.
  • carboxymethyl cellulose may be mixed with the primary coating by mixing 0.1 parts by weight to 10 parts by weight with respect to 100 parts by weight of the lactic acid bacteria culture medium.
  • the mixing ratio of CMC 0.1, 0.2, 0 • 3, 0.4, 0.5, 0.6,
  • the water-soluble polymer is mixed with CMC 0.1 parts by weight to 5 parts by weight with respect to 100 parts by weight of lactic acid bacteria culture medium, most preferably 0.1 parts by weight to 0.5 parts by weight.
  • CMC carboxymethyl cellulose
  • step (b) a second coating by mixing a functional hydrated hyaluronic acid with the first lactic acid bacteria in step (a):
  • step (b) the functional coating of the first coating 3 ⁇ 4 lactic acid bacteria in step (a) is mixed with a second functional hyaluronic acid.
  • the functional hydrated hyaluronic acid when inhibiting intestinal harmful bacteria
  • the key is the antibacterial lactic acid bacteria fermentation is collected to control the intestinal harmful bacteria.
  • the functional hydrated hyaluronic acid is mixed with 0.001 part by weight to 1 part by weight of functional hydrated hyaluronic acid relative to 100 parts by weight of the lactic acid bacteria culture medium. Specifically, for example, the mixing ratio of functional hydrated hyaluronic acid, 0.001, 0.002,
  • the amount is within the range of 0.001 part by weight to 1 part by weight with respect to the weight part, the number is not limited.
  • the functional hydrated hyaluronic acid is mixed in an amount of 0.001 part by weight to 0.05 parts by weight relative to 100 parts by weight of the lactic acid bacteria culture medium, and more preferably 0.001 parts by weight to 0.005 parts by weight.
  • step (c) mixing the coating agent having porous particles with the secondary coated lactic acid bacteria in step (b) and tertiary coating:
  • the porous coating agent is a base coating agent having porous granularity in the cells, and serves to block the inflow of external moisture and wet air.
  • the porous particles may be used as the tertiary coating agent, and the alginate, maltodextrin (MD), polyethyleneglycol (PEG), triacetin (triaetin), but are not limited thereto. ), Acetyl triethyl citrate or triethyl citrate, preferably alginate, maltodextrin (MD), polyethyleneglycol, PEG), most preferably maltodextrin (MD).
  • the porous coating agent is 0.1 parts by weight to 10 to 100 parts by weight of lactic acid bacteria culture medium In proportions by weight. Specifically, for example, the mixing ratio of the porous coating agent, 0.1, 0.2, 0, 3, 0, .4, 0.5, 0.6, 0. .7, 0.8, 0.9,
  • the porous coating agent is mixed in an amount of 0.1 parts by weight to 5 parts by weight with respect to 100 parts by weight of the lactic acid bacteria culture medium, and more preferably in an amount of 0.1 parts by weight to 0.5 parts by weight.
  • maltodextrin may be mixed at a ratio of 0.1 part by weight to 10 parts by weight with respect to 100 parts by weight of the lactic acid bacteria culture medium.
  • the mixing ratio of MD for example, 0.1 to 100 parts by weight of lactic acid bacteria culture medium,
  • ⁇ 3, 5, 9. 6, 9. 7, 9.8, 9.9, 10.0 days- ⁇ is not limited to the above value if it is within the range of 0.1 parts by weight to 10 parts by weight relative to 100 parts by weight of ⁇ acid bacteria culture medium.
  • MD as the porous coating agent compared to 100 parts by weight of lactic acid bacteria culture medium
  • step (d) mixing the protein with the third coating of lactic acid bacteria in step (c) and performing fourth coating:
  • the protein is mixed to fill the pores of the tertiary coating agent having a porous particle structure in the tertiary coated lactic acid bacteria, but is not limited thereto.
  • the protein is selected from the group consisting of skim milk powder, whey protein, and soy protein. Make whey Say hundred.
  • the fourth coating protein is mixed in a ratio of 1 part by weight to 30 parts by weight of protein to 100 parts by weight of lactic acid bacteria culture medium, specifically, the mixing ratio of the fourth coating agent protein, for example, 1, 2 to 100 parts by weight of lactic acid bacteria culture medium , 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 , 28, 29, 30, and may be within the range of 1 part by weight to 30 parts by weight relative to 100 parts by weight of the lactic acid bacteria culture medium is not limited thereto.
  • the fourth coating agent is mixed with 1 part by weight to 10 parts by weight with respect to 100 parts by weight of lactic acid bacteria culture medium, and most preferably with 5 parts by weight to 10 parts by weight.
  • the whey protein may be mixed at a ratio of 1 part by weight to 30 parts by weight of the protein relative to 100 parts by weight of the lactic acid bacteria culture medium.
  • the mixing ratio of the whey protein may be compared with 100 parts by weight of the lactic acid bacteria culture medium. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 It may be 26, 27, 28, 29, 30, it is not limited to the numerical value if it is within the range of 1 part by weight to 30 parts by weight with respect to 100 parts by weight of lactic acid bacteria culture medium.
  • the whey protein is mixed as 1 to 10 parts by weight with respect to 100 parts by weight of the lactic acid bacteria culture medium, and preferably 5 to 10 parts by weight as the fourth coating agent.
  • the quadruple coated lactic acid bacteria prepared by the method of the present invention is superior in intestinal mucosa adhesion ability compared to conventional uncoated, single coated, double coated, triple coated lactic acid bacteria as well as quadruple coated lactic acid bacteria.
  • lactic acid bacteria coated with a functional hydrated hyaluronic acid was found to be superior in intestinal mucosa adhesion in vitro and in vivo compared to the conventional four-coated lactic acid bacteria.
  • the coated lactic acid bacteria in order for the coated lactic acid bacteria to adhere to the intestinal mucosa after reaching the host's intestine, it must compete with the host's flora.
  • the four-coated lactic acid bacteria of the present invention preferably exhibit the effect of inhibiting the growth of harmful bacteria and promoting the growth of beneficial bacteria.
  • Conventional uncoated, single coated, double coated, triple coated and 4 Compared to the heavy coated lactic acid bacteria can be said to be very good.
  • the four-coated lactic acid bacteria using the functional hydrated hyaluronic acid is very excellent competitive inhibition of adhesion with harmful bacteria compared to conventional uncoated or quadruple coated lactic acid bacteria, It was found that even in the present situation, the intestinal mucosa adhesion of lactic acid bacteria could be improved.
  • functional hydrated hyaluronic acid which is a secondary coating base of lactic acid bacteria coated with quadruple according to the method of the present invention, was found to have an effect of inhibiting proliferation against harmful bacteria, while promoting the growth of beneficial bacteria. It was found that antagonistic activity was selectively shown only against harmful bacteria.
  • the four-coated lactic acid bacteria of the present invention is structurally stable due to the four-coated coating, which effectively blocks external environmental factors such as moisture and air, resulting in high stability over time. It can be represented, the acid and bile acid resistance is very excellent.
  • the four-coated lactic acid bacteria of the present invention is characterized in that it is prepared by the above method. Therefore, the quadruple coated lactic acid bacteria of the present invention is excellent in inhibiting harmful bacteria in the intestinal flora compared to the uncoated, quadruple coated lactic acid bacteria while maintaining the excellent acid resistance and bile resistance of the conventional four-coated lactic acid bacteria.
  • double or triple coated lactic acid bacteria using functional hydrated hyaluronic acid showed the same degree of acid resistance and bile acid resistance compared to double or triple coated lactic acid bacteria using general hyaluronic acid.
  • the protective effect of lactic acid bacteria inherent in hyaluronic acid remains the same.
  • the lactic acid bacteria coated with the functional hydrated hyaluronic acid of the present invention not only show the same degree of acid resistance and bile resistance as compared with the lactic acid bacteria coated with general hyaluronic acid, but also have excellent intestinal mucosa adhesion and harmful bacteria.
  • the functional hydrated hyaluronic acid of the present invention has a selective antagonistic effect by showing a proliferation inhibitory effect on harmful bacteria and a growth promoting action on beneficial bacteria
  • the lactic acid bacteria coated with the functional hydrated hyaluronic acid of the present invention may be prepared by using general hyaluronic acid. Compared with the coated lactic acid bacteria, it has the effect of showing good intestinal mucosa adhesion and selective antagonism against harmful bacteria.
  • the lactic acid bacteria coated with the functional hydrated hyaluronic acid of the present invention are quadruple coated with a water-soluble polymer, a functional hydrated hyaluronic acid, a coating agent having a porous particle, and a protein to the lactic acid bacteria. Not only does it show excellent intestinal mucosa adhesion and selective antagonism against harmful bacteria, but it does not lose its physiological activity. It works.
  • 1 is a photograph showing the shape of the functional hydrated hyaluronic acid.
  • Figure 3 is a photograph evaluating the growth promoting effect of the functional hydrated hyaluronic acid raw material cultured Lactobacillus asidophilus IDCC 3302 on Lactobacillus rhamnosus (A: general hyaluronic acid treatment control, B: functional hydration) Hyaluronic acid treatment group).
  • Figure 4 is a photograph evaluating the growth-promoting effect of the functional hydration hyaluronic acid raw material containing the culture medium of Lactobacillus asidofiltus IDCC 3302 on the Bifidobacterium dagger (A: general hyaluronic acid control control, B: Functional hydrated hyaluronic acid treatment group).
  • Figure 5 is a photograph evaluating the growth promoting effect of Enterococcus pesium of the functional hydrated hyaluronic acid material of the culture medium of Lactobacillus asidophilus IDCC 3302 (A: general hyaluronic acid treatment control, B: functional Hydrated hyaluronic acid treatment group).
  • FIG. 6 shows intestinal fixability of the double coated Lactobacillus acido palus IDCC 3302 with functional hydrated hyaluronic acid, the double coated Lactobacillus acidophilus IDCC 3302 with uncoated and normal hyaluronic acid. This is a comparative drawing.
  • FIG. 8 shows intestinal fixability of Lactobacillus asidophilus IDCC 3302 coated with functional hydrated hyaluronic acid, Lactobacillus asidophilus IDCC 3302 coated with uncoated and normal hyaluronic acid. This is a drawing comparing.
  • Lactobacillus asidophilus IDCC 3302 triple coated with functional hydrated hyaluronic acid, Lactobacillus asidophilus IDCC 3302 coated with uncoated and normal hyaluronic acid intestinal Salmonella This is a diagram evaluating the effect on the growth of chicks.
  • FIG. 10 compares intestinal fixability of tetracoated lactobacillus acidophyllus IDCC 3302 with functional hydrated hyaluronic acid, quadruple coated lactobacillus acidophilus IDCC 3302 with uncoated and normal hyaluronic acid. It's a limit.
  • Figure 11 shows the growth of Lactobacillus acidophyllus IDCC 3302 with four coats using functional hydrated hyaluronic acid, and four coats of Lactobacillus acidophyllus IDCC 3302 coated with uncoated and normal hyaluronic acid. It is the figure which evaluated the influence on the.
  • FIG. 12 is a SEM photograph showing the shape of the uncoated Lactobacillus asidophilus IDCC 3302 used in the present invention.
  • FIG. 13 is a SEM photograph showing the shape of a primary coated lactic acid bacterium by mixing carboxymethylcellose with Lactobacillus asidophilus IDCC 3302.
  • FIG. 14 is a SEM photograph showing the shape of a lactic acid bacterium coated with a functional hydrated hyaluronic acid mixed with Lactobacillus asidophilus IDCC 3302 first coated with carboxymethyl salose.
  • FIG. 16 is a SEM photograph showing the shape of a lactic acid bacterium coated with whey protein by mixing lactobacillus asidophilus IDCC 3302 coated with carboxymethyl cellulose, functional hydrated hyaluronic acid, and maltodextrin 3rd.
  • Lactobacillus acidophilus IDCC 3302 (Lactobacillus acidophilus IDCC 3302), a representative lactic acid bacterium, is a representative component of Lactobacillus asidophilus IDCC 3302 by tyndalizing fermented cells.
  • the aim of this study was to capture hyaluronic acid (L ipoteichoic acid) and peptidoglycan such as lactic acid bacteria fermentation products that inhibit the growth of harmful bacteria and harmful bacteria, and promote the growth of beneficial bacteria.
  • a layer of sufficiently Lactobacillus know also pilru IDCC 3302's broth to m ° C-5 bungan pressure heat treatment incubation (the pressure gauge 1.2 atm), and then cooling the broth to 30 ° C.
  • In vitro model was used to evaluate the inhibitory effect of harmful hydrate hyaluronic acid on the adhesion of harmful bacteria to human intestinal epithelial cells.
  • In vitro models of Caco-2 cell lines show polar i zat ions, functional brush borders and hydrolases Mature intestinal cell characteristics such as secretion are well represented. Because lactic acid bacteria are required to interact with specific receptors for lactic acid bacteria to bind to enteric mucosal cells, intestinal Caco-2 cells are one of the most useful in vitro models for studying the intestinal fixability of lactic acid bacteria. Known as one (Microbiol. 59 (12): 4121-4128, Gut. 35: 483-489, FEMS microbiology. Lett. 91: 213-218, etc.).
  • the Ca «)-2 cell monolayer was prepared at a concentration of 1.2 x 10 5 eel ls / ml in DMEM added Caco-2 eel Is with 10% (v / v) fetal calf serum and 20 ul / ml gentamicin. Inoculated, 6 ml of 6-well tissue culture plate (BD, USA) wells were incubated for 7 days, and then washed twice with phosphate buffered saline (PBS, pH 7.2).
  • PBS phosphate buffered saline
  • 0.5 ml of a functional hydrated hyaluronic acid solution was added to each well in which Caco-2 monolayers were formed and reacted for 90 minutes.
  • hyaluronic acid solution was used as a control.
  • 0.5 ml (1 ⁇ 10 8 cfu / ml) of Salmonella typhimurium KCTC 2054 sample was added and reacted for 90 minutes. After reaction, the supernatant was removed and Cac 2 eel Is was washed twice with PBS to remove unattached Salmonella typhimurium KCTC 2054.
  • 1 ml of Tween 80 0.04% (w / v) was added to recover Salmonella typhimurium KCTC 2054 attached to Caco-2 cells, and the number of viable cells was measured. The results are shown in Table 1 below.
  • Salmonella typhimurium KCTC 2054 with functional hydration hyaluronic acid As shown in Table 1, in the case of the normal hyaluronic acid as a control group, the adhesion inhibition rate of Salmonella typhimurium was hardly exhibited, whereas in the case of functional hydrated hyaluronic acid, it was confirmed that the adhesion inhibition rate was 46%. Ie functional hydrated hyaluronic When acid was used as a coating for lactic acid bacteria, lactic acid bacteria could be attached to the intestinal mucosa and help the competitive removal of intestinal harmful bacteria.
  • the Minimum Inhibitory Concentrat ion (MIC) for Salmonella typhimurium KCTC 2054 was obtained and compared with the effects on harmful bacteria in the intestinal flora.
  • the test method was used by modifying the bacterial growth inhibition test contained in the pharmaceuticals other than the Korean Pharmacopoeia. Details are as follows.
  • Salmonella typhimurium KCTC 2054 test solution 1 loop of Salmonella typhimurium KCTC 2054 grown in Brain Heart Infusion agar (BHI agar, BD, USA) was taken and suspended in 5 ml of sterile BHI broth. The 620 nm value was adjusted to 0.15. This solution was used as test bacteria solution.
  • BHI agar Brain Heart Infusion agar
  • Functionally hydrated hyaluronic acid powder was added to 20 ml of BHI liquid medium to a concentration of 1% (w / v) to 10% (w / v), and suspended with stirring for 5 to 10 minutes. After the suspension was centrifuged (5,000 RPM / 15 minutes), the supernatant was filtered and sterilized by membrane filter (0.45 um). 2 ml of each concentration of the filter sterilization solution was placed in a sterile 4 ml test tube and inoculated with 2% (v / v) of Salmonella typhimurium KCTC 2054 test bacteria solution. Normal hyaluronic acid was used as a control instead of the functional hydrated hyaluronic acid sample. After inoculation, the bacteria were grown for 24 hours at 37 ° C.
  • the concentration at which the growth of the bacteria was observed was confirmed, and the concentration value at that time was determined as the MIC value.
  • Lactic acid bacillus, bifidus bacillus to assess the effect of functional hydrated hyaluronic acid on enteric beneficial bacteria Lactobacillus rhamnosus
  • Bifidobacterium ⁇ Bifidobacterium longum
  • Enterococcus faeciuni Enterococcus faeciuni
  • the most suitable coating crosslinking agent was selected by evaluating the crosslinking ability of the water-soluble polymer and the functional hydrated hyaluronic acid forming the lactic acid cell surface thin coating. More specifically, a solution in which functional hydrated hyaluronic acid is dissolved in tertiary distilled water at a concentration of 4 g / l and a solution in which water-soluble polymer is dissolved in tertiary distilled water at a concentration of l% (w / v) in a ratio of 1: 1 (v / v) The mixture was mixed at a volume ratio and vigorously stirred for 1 minute, and then left at room temperature for 30 minutes.
  • Crosslinking affinity was determined by comparing only the tertiary distilled water with the result of mixing with the functional hydrated hyaluronic acid.
  • the average molecular weight of the functional hydrated hyaluronic acid increases to increase the viscosity of the solution.
  • Viscosity is measured in a 24 ° C thermostatic bath with the time taken for the descent to pass through a section using a ViscoClock (SI Analyt ics) with a solution placed in a viscometer (Ubbelogdevisc oraeter, SI analyt ics) that increases with increasing viscosity. The viscosity was measured and the viscosities were compared (Table 3).
  • the functional hydrated hyaluronic acid formed a good crosslink with all of the water-soluble polymers used in the test, and among them, the most preferred form of crosslinking with carboxymethylcellose (CMC). appear.
  • the concentration of CMC was 0. (w / v) in a solution of 4 g / L dissolved in tertiary distilled water. ) To 0.4% (w / v) to prepare a solution and compare the viscosity by measuring the descent time passing through a section using ViscoClock (SI Analyt ics), which can compare cross-link formation relatively. It was. The results are shown in Table 4 below.
  • the secondary coating agent ⁇ Example 1
  • a functional hydrated double coated lactic acid bacterium was prepared using a functional hydrated hyaluronic acid prepared in As a control, double-coated lactic acid bacteria were prepared using general hyaluronic acid instead of functional hydrated hyaluronic acid.
  • lactobacillus After oral ingestion of lactobacillus, it is exposed to gastric juice when it passes through the stomach in the digestive tract of the human body. A similar environment is created under in vitro conditions, and functional hydrated hyaluronic acid double-coated lactobacillus. The acid resistance was evaluated by comparing the survival rates of the common hyaluronic acid double coated lactic acid bacteria group.
  • the lactic acid bacteria used in the experiment is Lactobacillus. ⁇ Lactobacillus sp. 12 species, genus Bifidobacterium sp. ) 4 species, Streptococcus sp. 1 species, Enterococcus sp. ( 1 species, Lactococcus sp. 1)
  • the functional hydration double coating lactic acid bacteria and hyaluronic acid double coating lactic acid bacteria were prepared and compared.
  • the survival rates of the functional hydrated hyaluronic acid double coated lactic acid bacteria and hyaluronic acid double coated lactic acid bacteria when exposed to bile acids were compared in vitro. More specifically, the medium to which 0.3% bile acid was added and the medium not to be used were sterilized, and each medium was inoculated with a functional hydrated hyaluronic acid double-coated lactic acid bacterium and a control sample of normal hyaluronic acid double-coated lactic acid bacteria, respectively. After reacting for 5 hours, viable cell number analysis was performed to compare bile acid resistance.
  • Caco-2 cel l mono layer was prepared using Dulbecco ⁇ with Caco-2 cel ls (Korea Cell Line Bank) added 10% (v / v) fetal cal f serum and 20 ul / ml gentamicin.
  • the double-coated lactic acid bacteria was prepared according to the method for preparing double-coated lactic acid bacteria in Korean Patent Registration No. 10-1280232.
  • the adhesion efficiency of hyaluronic acid double-coated lactobacillus was relatively superior to the non-coated lactobacillus when assessing the adhesion ability to Caco-2 eel Is similar to the mesangial membrane, and the functional hydrated hyaluronic acid double-coated
  • the adhesion efficiency of lactic acid bacteria was improved overall compared to hyaluronic acid double coated lactic acid bacteria.
  • lactic acid bacteria should have better binding ability with the viscera than harmful bacteria such as Escherichia coli and Salmonella, but lactic acid bacteria, which are classified as Gram-positive bacteria, than Gram-negative bacteria Escherichia coli and Salmonella, should be combined with viscera. Power falls. Therefore, the present inventors tried to evaluate the adhesion ability of lactic acid bacteria in the presence of the flora to determine more clearly whether the functional hydrated hyaluronic acid double-coated lactic acid bacteria can exhibit beneficial physiological activity in the intestine.
  • the Caco-2 cel l monolayer is composed of Dulbecco v s Modi f ied Eagle's with CaO-2 eel Is added with 1OT (v / v) fetal cal f serum and 20 ul / ml gentamicin.
  • Inoculate Medium (DMEM, Hyclone, USA) at a concentration of 1.2 x 10 5 cel ls / ml, incubate 1 ml per wel for 6 days using a 6-wel lssue culture plate, and incubate for 7 days. Prepared by washing.
  • Samples of Salmonella typhimurium KCTC 2054 were collected by centrifuging 10 ml of brain heart infusion (BHI, BD, USA) cultures, washed twice with phosphate buffer solution, and resuspended in 1 ml phosphate buffer solution. 1 x 10 was prepared in 8 CFU / ml dilution in sea bass road -free DMEM. 0.5 ml of the Salmonella typhimurium KCTC 2054 sample solution, which is a fungus, was added to each well formed with Caco-2 mono layer and reacted for 60 minutes. After reaction, lactic acid bacteria samples (1 ⁇ 10 8 CFU / ml) were treated in the same amount and reacted for 90 minutes.
  • the adhesion inhibition rate of Salmonella typhimurium KCTC 2054 was calculated as follows.
  • the test period was 6 weeks and the first 0.5 weeks were the test period of experimental animals. After the end of the course, the week 1 was given ampi ci ll in antibiotic dose in 0.4g / l ampici ll in daily drinking water. It was. Lactobacillus was orally administered for the next two weeks, and the number of bacteria was 1 X 10 10 CFU / g. As a control, PBS was orally administered in place of lactic acid bacteria. For the next 2.5 weeks, Lactobacillus was discontinued and intestinal flora change was observed.
  • the fecal samples were collected from each experimental group twice a week during the entire test period, and the difference in proliferation was analyzed by Lactobacilli extract bacteria using LBS (Lactobacillus select ive media, BD, USA) agar medium. The results for this are shown in FIG. 6.
  • the lactobacillus bacteria are detected in feces until 2.5 weeks after discontinuation in the hyaluronic acid double-coated lactic acid bacteria and functional hydrated hyaluronic acid double-coated lactobacillus administration group than the uncoated lactic acid bacteria
  • both groups showed similar intestinal fixation patterns because the coated lactic acid bacteria had a structure based on hyaluronic acid alone, which was vulnerable to gastric acid and bile acid.
  • KCTC 2054 (1 X 10 8 CFU / ml) was orally administered at 200 ul / mouse / day for the first 3 days of the sample period and four samples were orally administered at 200 ul / mouse / day for 2 weeks.
  • the bile acid resistance of the functional hydrated hyaluronic acid triple-coated lactic acid bacteria when exposed to bile acid for 5 hours is comparable to that of the bile acidic acid of the hyaluronic acid triple-coated lactic acid bacteria. Indicated. This result is due to the fact that the characteristic of hyaluronic acid that protects lactic acid bacteria was not destroyed during the production of functional hydrated hyaluronic acid.
  • the adhesion efficiency of the functional hydrated hyaluronic acid and hyaluronic acid triple-coated lactic acid bacteria was relatively superior to the uncoated lactic acid bacteria in the evaluation of adhesion ability to Caco-2 eel I s similar to the mesangial membrane.
  • the adhesion efficiency of the functional hydrated hyaluronic acid triple-coated lactic acid bacteria showed an overall improved adhesion efficiency compared to the hyaluronic acid triple-coated lactic acid bacteria.
  • the present invention is intended to evaluate the adhesion ability of lactic acid bacteria in the presence of flora. -5> was carried out in the same manner. The results are shown in Table 12 below.
  • Example ⁇ 7-6> In vivo intestinal fixation of functional hydrated hyaluronic acid tri-coated lactic acid bacteria Same as Example ⁇ 6-6> of the present invention for the in vivo intestinal fixability test of functional hydrated hyaluronic acid triple-coated lactic acid bacteria It was carried out. The results for this are shown in FIG. 8.
  • Fig. 8 As shown in Fig. 8—as seen in water 7—no coated and lactobacillus than hyaluronic acid 3-coated lactic acid bacteria and functionally hydrated hyaluronic acid triple-coated lactobacillus groups, up to 2.5 weeks after discontinuation. It was confirmed that Lactobacillus bacteria were detected in feces and the effect was found to be the best in the functional hydrated hyaluronic acid triple coated lactic acid bacteria. On the other hand, lactobacillus bacteria were detected in feces only up to 1 week after the discontinuation of the administration, and the functional hydrated hyaluronic acid triple-coated lactobacillus group was detected for an additional 1.5 weeks.
  • the uncoated, hyaluronic acid triple coated lactic acid bacterium which serves as a simple competitive exclusion, inhibited the growth through competition with Salmonella typhimurium KCTC 2054, and the functionally hydrated hyaluronic acid triple coated lactic acid bacterium It has been shown to more effectively inhibit Salmonella typhimurium KCTC 2054 for a long time.
  • a functional hydrated hyaluronic acid quadruple coated lactic acid bacterium was prepared by using hyaluronic acid, maltodextr in as a tertiary coating, and coating with whey protein as the final quaternary coating.
  • Functional Hydration Hyal as Control Hyaluronic acid quadruple coated lactic acid bacteria were prepared using general hyaluronic acid instead of luronic acid.
  • Quad-coated lactobacillus was prepared based on the preparation method of the four-coated lactobacillus of the Korean registered patent (No. 10-1280232).
  • the same evaluation as in Example ⁇ 6-4> of the present invention was performed to evaluate the non-competitive adhesion ability. The results are shown in Table 15 below.
  • the adhesion efficiency of hyaluronic acid triple-coated lactic acid bacteria was significantly superior to the uncoated lactic acid bacteria in the evaluation of adhesion capacity for Cac 2 eel Is, which is similar to the superior membrane, and functional hydrated hyaluronic acid 4
  • the adhesion efficiency of the heavy coating lactic acid bacteria showed the same adhesion efficiency as the hyaluronic acid quadruple coating lactic acid bacteria.
  • the present invention is intended to evaluate the adhesion ability of lactic acid bacteria in the presence of flora. -5> was carried out in the same manner. The results are shown in Table 16 below.
  • the properties of the functional hydrated hyaluronic acid 4-coated lactobacillus asidophilus IDCC 3302 prepared in Example 1 were structurally analyzed by electron microscopy according to the preparation process.
  • the functional hydrated hyaluronic acid quadruple coated lactic acid bacteria preparation step was shown in FIGS. 12 to 16 by electron microscope structural analysis. As shown in FIGS. 12 to 16, when CMC-Na was mixed with lactic acid bacteria, it was observed that the surface of the lactic acid bacteria was coated with CMC-Na forming a thin film like film (FIG. 13).
  • the functional hydrated hyaluronic acid of the present invention has an effect of showing selective antagonism by showing a growth inhibitory effect on harmful bacteria and a growth promoting action on beneficial bacteria
  • the four-coated lactic acid bacteria coated by the method of the present invention is a water-soluble polymer
  • Functional hydration hyaluronic acid, coatings with porous particles, and protein coatings are combined to quadruple coatings to prevent intestinal mucosa adhesion and harmful bacteria that are not found in conventional uncoated, single, double, triple and quadratic lactic acid bacteria.
  • it is also excellent in acid resistance and bile resistance, so that it does not lose the physiological activity of the lactic acid bacteria is very good industrial availability.

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Abstract

본 발명은 기능성 수화 히알루론산 및 이를 이용한 장 점막부착능이 우수하고 선택적 길항작용을 하는 5세대 코팅 유산균의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 유산균 발효성분이 천연고분자 물질인 히알루론산에 포집된 기능성 수화히알루론산 및 이를 이용하여 코팅 유산균을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 기능성 수화 히알루론산을 이용하여 코팅된 4중코팅 유산균은 수용성 폴리머, 기능성 수화 히알루론산, 다공성 입자를 가지는 코팅제 및 단백질로 4중 코팅되어 장 점막부착능이 우수하고 장내 유해세균에 대해서는 항균작용을 나타내고 장내 유익균에 대해서는 생장촉진역할을 하는 효과가 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
기능성 수화 히알루론산 및 이를 이용한 장 점막부착능이 우수하고 선택적 길항작용을 하는 코팅 유산균의 제조방법
【기술분야】
본 발명은 기능성 수화 히알루론산 및 이를 이용한 장 점막부착능이 우수하 고 선택적 길항작용을 하는 코팅 유산균의 제조방법에 관한 것으로， 보다 상세하게 는 본 발명은 유산균 발효성분이 천연고분자 물질인 히알루론산에 포집된 "기능성 수화 히알루론산" 및 이를 이용하여 코팅 유산균을 제조하는 방법， 특히 수용성 폴리머， 기능성 수화 히알루론산， 다공성 입자를 가지는 코팅제 및 단백질로 코팅 된 장 점막부착능이 우수하고 선택적 길항작용을 하는 기능성 코팅 유산균을 제조 하는 방법에 관한 것이다.
【배경기술】
본 출원은 2015년 9월 14일에 출원된 대한민국 특허출원 제 10-2015-0129986 호를 우선권으로 주장하고, 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다. 인체의 장내에는 Bacteroides, Eubacteria, Bifidobacteria, Lactobacilli 등 400여종 이상의 미생물들이 서식하고 있다. 건강한 사람의 장에는 유산균으로 대표되는 유익균과 유해균이 균형 (mi crof lora)을 이루고 서식하고 있는데 유해환 경， 비위생적인 음식섭취， 항생제 복용 등으로 장내균총이 교란되면서 유산균은 감 소하고 대장균， 살모넬라 같은 유해균은 증가하게 된다. 프로바이오틱스는 사람이나 동물의 위장관에 서식하면서 사람이나 동물에 유익한 효과를 나타내는 미생물제제로 Lactobacilli, Bifidobacteria, Enterococci 등이 여기에 속한다. 유산균의 장내 생리활성기능으로는 장내 세균총의 균형유지， 유해세균의 증 식억제， 설사예방, 장내 상피세포보호， 독성물질의 흡수 저해， 발암 억제 등이 있 다. 유산균이 프로바이오틱스로 작용하기 위해서는 장 점막세포에 결합하여 증식하 면서 유해세균에 대한 길항력이 있어야 한다. 유산균이 숙주의 장 점막에 부착되기 위해서는 숙주의 상재균총과의 경쟁을 통해 부착을 해야한다. Nurmi와 Rantala는 유해 미생물의 경쟁적 배제 (compet i t ive exclusion)를 처음으로 도입하였으며 갓 부화된 병아리에게 닭의 장 내용물을 접종 한 결과， 살모넬라 감염이 감소하였다고 보고하였다. 닭의 정상 장내 미생물들은 장벽 표면 세포의 흡착부분에 더 잘 부착되었고， 지방산과 다른 항균성 물질을 생 산하였으며, 영양소를 위한 경쟁 등에서 유리한 것으로 보고하였다. 유산균은 숙주의 장 점막에 흡착하는 특성이 있으며 이는 유산균의 세포벽 구성성분인 l ipoteichoic acid, 다당류， 단백질 등이 장 점막에 부착에 관여하기 때문인 것으로 알려지고 있다.
유산균의 세포구조는 세포막과 그 위를 둘러싼 세포벽으로 구성된다. 세포벽 은 기능적으로 유산균의 모양을 나타내며 세포막을 둘러싸 외부환경으로부터 유산 균을 보호한다. 세포벽의 4가지 중요성분에는 펩티도글리칸 (pept idoglycan) , 테이 코익산 (teichoic acid) , S- layer , 다당류가 있으며， 장 점막의 extracel lular matrix (ECM)와의 결합에 관여한다. ECM은 상피세포와 내피세포의 근간이 되는 안 정한 거대분자 조직이다. 유산균은 장점막의 수지상세포 (dendri t ic cel l , DC)와 결 합한 후 정장작용을 비롯한 여러가자 세포적 신호를 전달하여 면역질환 등을 예방 한다.
유산균이 경쟁적 배제를 통해 장점막에 원활하게 부착되면 장내에서 다른 미 생물들에게 영향을 미치는 여러가지 물질을 생산하고 이 중, 젖산 ( lact ic acid)은 장 내용물을 산성화시켜 다른 미생물의 생존올 억제한다. 일반적으로 유산균이 장내에서 정장작용을 발휘하기 위해서는 유해균인 대장 균과 살모넬라 등 보다 장점막과의 결합력이 우수해야 하나 그람음성 세균인 대장 균과 살모넬라보다 그람양성 세균으로 분류되는 유산균이 상대적으로 장점막과의 결합력이 떨어진다. 또한 유산균도 분리원에 따라 부착능이 차이를 보인다. 또한 Lactobaci l lus속의 유산균은 소장점막과 부착친화력이 상대적으로 우수하고 Bi f idobacter ium속의 프로바이오틱스균은 대장점막과 친화력이 우수하다. 또한 식 물 유래의 프로바이오틱스는 식물체 표면에 부착되어 공생하여 진화되어 왔기 때문 에 동물의 장 점막에 부착효율이 떨어지게 된다. 한편， 종래의 유산균의 코팅기술은 1세대부터 4세대까지 위장관 통과시 생존 율에 따라 구분해왔다. 제 1세대는 비코팅 유산균, 2세대는 장용코팅 유산균， 3세대 는 마이크로캡슐화 유산균, 4세대 유산균은 단백질 코팅 유산균으로 위장관 통과시 얼마나 많은 수의 유산균이 장에 도달하는가에 초점을 두었다. 또한， 5세대 코팅기 술로 일컬어지는 히알루론산 기반의 4중코팅 유산균은 (한국 등록특허 10-1280232 참조) 기존의 단일 내지 3중코팅 유산균과 비교해 내열성， 내산성 및 내담즙성이 현저히 향상되어 유산균의 생존율에 크게 기여하였다. 히알루론산을 기반으로 한 종래의 4중코팅 유산균 제조기술은 천연고분자인 히알루론산을 코팅제로 사용하여 종래 단일 내지 3중 코팅 유산균과 비교해 내열 성， 내산성 및 내담즙성 등이 현저히 개선되었으나, 장 점막 부착효율， 정착시간， 그람음성 병원성균주를 경쟁적으로 배제하는 효과에 있어서는 여전히 한계가 있었 다.
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
이에， 본 발명자들은 상기 종래의 유산균 코팅 기술들이 갖고 있는 한계점을 극복하여， 장 점막 부착효율, 장 점막 내 정착시간， 장내 유해균에 대한 경쟁적 억 제 효과가 현저히 향상된 유산균 코팅기술을 개발하기 위해 연구를 거듭하였다. 그 결과， 유산균 발효성분이 천연고분자 물질인 히알루론산에 포집된 "기능성 수화 히알루론산" 을 개발하였고, 상기 기능성 수화 히알루론산이 유해균에 대해서는 증 식 억제작용， 유익균에 대해서는 증식 촉진 작용을 나타냄을 확인한 후 목적하는 효과를 발휘하는 유산균 코팅제로서 사용될 수 있음에 착안하여 본 발명을 완성하 게 되었다. 따라서， 본 발명의 목적은 유산균 배양액 100 중량부 대비 히알루론산을 0.001 중량부 내지 1 중량부의 비율로 첨가하고 교반하여 녹인 후 30 내지 60°C에 서 감압농축하는 방법에 의해 제조된 유산균 발효물질이 포집된 기능성 수화 히알 루론산을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 상기 기능성 수화 히알루론산으로 코팅된 유산균을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 (a) 유산균에 수용성 폴리머를혼합하여 1차 코팅하 는 단계; (b) 상기 (a)단계에서 1차 코팅된 유산균에 기능성 수화 히알루론산을 흔 합하여 2차 코팅하는 단계; (c) 상기 (b)단계에서 2차 코팅된 유산균에 다공성 입 자를 가지는 코팅제를 흔합하여 3차 코팅하는 단계; 및 (d) 상기 (c)단계에서 3차 코팅된 유산균에 단백질을 흔합하여 4차 코팅하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 4증 코팅된 유산균의 제조방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 상기 4중 코팅된 유산균의 제조방법에 따라 제조된 4 중 코팅된 유산균을 제공하는 것이다.
【기술적 해결방법】
상기의 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 유산균 배양액 100 중량부 대비 히알루론산을 0.001 중량부 내지 1 중량부의 비율로 첨가하고 교반하여 녹인 후 30 내지 60°C에서 감압농축하는 방법에 의해 제조된 유산균 발효물질이 포집된 기능성 수화 히알루론산을 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 기능성 수화 히알루론산으로 코팅된 유산균을 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여， (a) 유산균에 수용성 폴리머를 흔 합하여 1차 코팅하는 단계; (b) 상기 (a)단계에서 1차 코팅된 유산균에 기능성 수 화 히알루론산을 흔합하여 2차 코팅하는 단계; (c) 상기 (b)단계에서 2차 코팅된 유산균에 다공성 입자를 가지는 코팅제를 흔합하여 3차 코팅하는 단계; 및 (d) 상 기 (c)단계에서 3차 코팅된 유산균에 단백질을 흔합하여 4차 코팅하는 단계를 포함 하는 것을 특징으로 하는 4중 코팅된 유산균의 제조방법을 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 상기 4중 코팅된 유산균 의 제조방법에 따라 제조된 4중 코팅된 유산균을 제공한다. 이하, 본 발명을상세히 설명한다. 본 발명은 유산균 배양액 100 중량부 대비 히알루론산을 0.001 중량부 내지 1 중량부의 비율로 첨가하고 교반하여 녹인 후， 농축하는 방법에 의해 제조된 유산 균 발효물질이 포집된 기능성 수화 히알루론산을 제공한다. 본 발명에서 상기 기능성 수화 히알루론산은 유산균 배양액을 히알루론산에 포집시킨 것으로， 장내 유해균에 대해서는 생육 억제작용을 나타내며， 유익균에 대 해서는 아무런 영향을 미치지 않거나 이의 증식을 도와주는 성분을 포집하고 있는 히알루론산을 의미한다. 한편, 본 발명자들은 장내 세균총 증 유익균으로 분류되는 세균의 대표적 균 주는 유산균이므로 유산균에는 영향을 미치지 않거나 또는 유산균의 증식에 도움이 되는 성분을 추출하기 위해 유산균 발효물을 이용하고자 하였고， 이를 히알루론산 에 포집시킴으로써 목적하는 효과를 나타내는 코팅제를 개발하고자하였다.
즉， 세포 구조물에 포함되어 있는 대표성분인 리포테이코익산 ( l ipoteichoi c acid) , 펩티도글리칸 (pept idoglycan)등의 유해세균 부착저해물질 및 유해세균의 증 식을 억제하고 유익균의 생육을 증진시키는 유산균 발효산물을 히알루론산에 포집 시켜 기능성 수화 히알루론산을 제작하였다. 구체적으로， 본 발명에서 상기 기능성 수화 히알루론산은 유산균 배양액 100 중량부 대비 히알루론산을 0.001 중량부 내지 1 중량부의 비율로 첨가하고 교반하 여 녹인 후 30 내지 60°C에서 감압농축하는 방법에 의해 제조될 수 있다. 보다 바 람직하게는, 유산균 배양액 100 중량부 대비 히알루론산 0.001 중량부 내지 0.5 중 량부로 흔합하고, 가장 바람직하게는 0.001 중량부 내지 0.25 중량부로 흔합하여 제조한다. 상기와 같은 방법에 의해 유산균 발효물질이 히알루론산에 포집되어 장 내 유해세균에 대해서는 항균작용을 나타냄과 동시에 유익균에 대해서는 증식 촉진 작용을 나타낼 수 있다. 특히 유산균 배양액은 가압 및 틴달화 (tyndal l i zat ion)함 으로써 유산균 또는 이의 배양물에 포함되어 있는 대표성분인 리포테이코익산 ( l ipoteichoic acid) , 펩티도글리칸 (pept idoglycan)등의 유해세균 부착저해물질 및 유해세균의 증식을 억제하고유익균의 생육을 증진시키는 효과를 나타낼 수 있다. 한편， 본 발명에서 상기 유산균 배양액은 틴달화 (tyndal l i zat ion)된 것일 수 있으며， 바람직하게는 상기 유산균 배양액은 다음과 같은 단계에 의해 제조될 수 있다:
(a) 유산균 배양액을 110 내지 135°C에서 3 내지 7분간 가압열처리하는 단 계;
(b) 상기 (a) 단계에서 가압열처리된 배양액을 25 내지 35°C로 넁각하는 단 계;
(c) 상기 (b)단계에서 냉각된 배양액을 105 내지 115°C에서 8 내지 12분간 가압열처리하는 단계;
(d) 상기 (c) 단계에서 가압열처리된 배양액을 25 내지 35°C로 냉각하는 단 계; '
(e) 상기 (d) 단계에서 넁각된 배양액을 75 내지 85°C에서 20 내지 40분간 열처리한 후 25 내지 35°C로 최종냉각하는 단계. 기능성 수화 히알루론산을 제조하기 위한 상기 유산균은 항균성분의 발효물 을 생산하는 유산균으로, 락토바실루스 ^ Lactobacillus sp . ) , 비피도박테리움 속 {Bifidobacterium sp . ) , 스트렙토코커스 속—{Streptococcus sp . ) , 락토코커스 속 {Lactococcus sp . ) , 엔테로코커스 속 Enterococcus sp . ) , 페디오코커스 속 {Pediococcus sp. ) 류코노스톡 ^{Leuconostoc sp. ) , 바이셀라 ^{ Weissella sp. ) 으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유산균이며, 바람직하게는 Lactobacillus acidophi lus IDCC 3302, Lactobaci 1 lus bulgaricus , Lactobaci 1 lus case/, Lactobaci 1 lus ferment urn, Lactobaci 1 lus gasseri , Lactobaci 1 lus helveticus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobaci 1 lus Johnson/ /, Lactobaci 1 lus paracasei , Lactobaci 1 lus pi ant arum, Lactobaci 1 lus reuteri , Lactobaci 1 lus sal ivarius, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infant is, Bifidobacterium 1 act is, Bifidobacterium longum, Enterococcus faecium, Enterococcus faecal is, Streptococcus faecium, Streptococcus faecal is, Streptococcus thermophi lus, Lactococcus 1 act is subsp. 1 act is, Lactococcus J act is subsp. cremoris, Pediococcus ac idol act ici i , Pediococcus pentosaceus, Leuconostoc carnosum, Leuconostoc citreum, Leuconostoc gasicomitatum, Leuconostoc gellidum, Leuconostoc inhae, Leuconostoc kimchii , Leuconostoc 1 act is, Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides, Leuconostoc par awe sen t eroides , Weissella cibaria, Weissella con f us a, Weissella koreensis, Weissella soli , Weissella vi'ri'descensS. 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유산균， 더 바람직하게는 Lactobacillus acidophilus IDCC 3302 일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일실시예에 따르면， 유산균 배양액이 포집된 기능성 수화 히알루 론산은 장내 유해세균으로 볼 수 있는 살모넬라 티피뮤리움의 장 점막 부착능을 저 해할뿐만 아니라， 생육을 저해하는 효과를 나타내는 것으로 확인되었다 (실시예 2 및 실시예 3) .
본 발명의 다른 일실시예에 따르면， 본 발명자들은 기능성 수화 히알루론산 이 장내 유익균의 성장에 미치는 영향을 평가하기 위해 유산간균, 비피더스균, 유 산구균으로 대표되는 락토바실루스 시 ^ {Lactobacillus rhamnosus) , 비피도박 테리움 ^^ Bifidobacte un] longum) 및 엔테로코커스 페시움 ( r7 e/ (?o a/s faeciumn] 기능성 수화 히알루론산을 처리하였고， 그 결과 기능성 수화 히알루론 산을 처리한 군에서 각각의 미생물의 증식이 현저히 촉진되는 것을 확인하였다 (실 시예 4) . 한편, 본 발명의 상기 일실시예에 따르면, 일반적인 히알루론산은 이러한 유해균 저해효과 및 유익균 증식 촉진효과를 나타내지 못하는 것으로 확인되어 본 발명에 따른 기능성 수화 히알루론산이 유산균 발효물질을 포집함으로써 독특한 기 능적 특성을 나타낸다는 것을 알 수 있었다. 상기한 바와 같은 실험 결과를 통해, 기능성 수화 히알루론산이 장내 유익균 의 증식은 촉진하면서 유해균의 성장은 저해할 수 있는 선택적 길항작용을 나타내 어 유산균의 장 점막 부착능과 부착시간을 증대시킬 코팅제로 사용될 수 있다는 것 을 알 수 있었다. 따라서 , 본 발명은 상기 기능성 수화 히알루론산으로 코팅된 유산균을 제공 한다. 본 발명은 또한 상기 기능성 수화 히알루론산을 이용하여 장 점막부착능이 우수하고 선택적 길항작용을 하는 4중 코팅된 유산균 제조방법을 제공한다. 구체적 으로，
본 발명의 4중 코팅된 유산균의 제조방법은
(a) 유산균에 수용성 폴리머를 흔합하여 1차 코팅하는 단계;
(b) 상기 (a)단계에서 1차 코팅된 유산균에 기능성 수화 히알루론산을 흔합 하여 2차코팅하는 단계；
(c) 상기 (b)단계에서 2차 코팅된 유산균에 다공성 입자를 가지는 코팅제를 흔합하여 3차코팅하는 단계 ; 및
(d) 상기 (c)단계에서 3차코팅된 유산균에 단백질을 흔합하여 4차코팅하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한본 발명의 4중 코팅된 유산균의 제조방법은
(a) 유산균에 카르복시메틸셀를로오스 (carboxymethyl cel lulose, CMC)를 흔 합하여 1차코팅하는 단계 ;
(b) 상기 (a)단계에서 1차 코팅된 유산균에 기능성 수화 히알루론산을 흔합 하여 2차코팅하는 단계 ;
(c) 상기 (b)단계에서 2차 코팅된 유산균에 다공성 입자를 가지는 코팅제를 흔합하여 3차코팅하는 단계 ; 및
(d) 상기 (c)단계에서 3차코팅된 유산균에 단백질을 흔합하여 4차코팅하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한본 발명의 4중 코팅된 유산균의 제조방법은
(a) 유산균에 수용성 폴리머를 흔합하여 1차코팅하는 단계 ;
(b) 상기 (a)단계에서 1차 코팅된 유산균에 기능성 수화 히알루론산을 흔합 하여 2차코팅하는 단계 ;
(c) 상기 (b)단계에서 2차 코팅된 유산균에 다공성 입자를 가지는 말토텍스 트린 (maltodextr in,MD)올흔합하여 3차코팅하는 단계; 및
(d) 상기 (c)단계에서 3차코팅된 유산균에 단백질을 흔합하여 4차코팅하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한본 발명의 4중 코팅된 유산균의 제조방법은
(a) 유산균에 수용성 폴리머를 흔합하여 1차코팅하는 단계 ;
(b) 상기 (a)단계에서 1차 코팅된 유산균에 기능성 수화 히알루론산을 흔합 하여 2차코팅하는 단계 ;
(c) 상기 (b)단계에서 2차 코팅된 유산균에 다공성 입자를 가지는 코팅제를 흔합하여 3차코팅하는 단계 ; 및
(d) 상기 (c)단계에서 3차코팅된 유산균에 유청단백을흔합하여 4차코팅하 는 단계를포함하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는 본 발명의 4중 코팅된 유산균의 제조방법은
(a) 유산균에 카르복시메틸셀를로오스 (carboxymethyl cel lulose, CMC)를 흔 합하여 1차코팅하는 단계 ;
(b) 상기 (a)단계에서 1차 코팅된 유산균에 기능성 수화 히알루론산을 흔합 하여 2차 코팅하는 단계 ;
(c) 상기 (b)단계에서 2차 코팅된 유산균에 다공성 입자를 가지는 말토덱스 트린 (maltodextrin D)을 흔합하여 3차 코팅하는 단계; 및
(d) 상기 (c)단계에서 3차 코팅된 유산균에 유청단백을 흔합하여 4차 코팅하 는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
(a) 유산균에 수용성 폴리머를 흔합하여 1차 코팅하는 단계;
상기 수용성 폴리머는 유산균 표면 접합력을 증대시키기 위해 기능성 수화 히알루론산과의 가교 형성능을 평가하여 선정하였다. 구체적으로 본 발명의 균체 박막코팅제로 사용되면서 기능성 수화 히알루론산의 가교형성능이 우수한 수용성 폴리머는 이에 한정되지는 않지만, 카르복시메틸셀를로오스 (carboxymethyl cellulose, CMC), 하이드록시에틸셀를로오스 (hydroxyethykellulose, HEC), 잔탄검 (xantha gum, XG), 구아검 (guar gum, GG), 폴리비닐피롤리돈 (polyvinylpyrroridone, PVP) , 키토산 (chitosan)， 아라비아검 (arabia gum), 카보폴 (carbopol), 소듐알기네이트 (sodium alginate), 프로필렌글리콜 알기네이트 (propylene glycol alginate)으로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하다. 바 람직하게는 카르복시메틸셀를로오스 (carboxymethyl cellulose, CMC), 하이드록시에 틸셀를로오스 (hydroxyethyl cellulose, HEC), 잔탄검 (xantha gum, XG), 구아검 (guar gum, GG), 폴리비닐피를리돈 (polyvinylpyrroridone, PVP), 키토산 (chitosan)， 아라 비아검 (arabia gum), 카보폴 (carbopol)이며, 더욱 바람직하게는 카르복시메틸셀를 로오스 (carboxymethyl cellulose, CMC) , 폴리비닐피를리돈 (polyvinylpyrroridone, PVP), 키토산 (chitosan), 아라비아검 (arabia gum), 카보폴 (carbopol)이며， 가장 바 람직하게는 카르복시메틸셀를로오스 (carboxymethyl cellulose, CMC)이다. 상기 수용성 폴리머는 유산균 배양액 100 중량부 대비 0.1 중량부 내지 10 중량부의 비율로 흔합하여 1차 코팅한다. 구체적으로는 수용성 폴리머의 흔합 비율 을 예로 들면， 유산균 배양액 100 중량부 대비 0.1， 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8， 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5， 1.6， 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1， 2.2, 2.3， 2.4， 2.5, 2.6， 2.7, 2.8， 2.9， 3.0, 3.1， 3.2， 3.3， 3.4， 3.5, 3.6， 3.7， 3.8, 3.9, 4.0， 4.1, 4.2， 4.3, 4.4， 4.5, 4.6, 4.7， 4.8, 4.9, 5.0， 5.1， 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5..8, 5.9， 6, ,0, 6.1, 6.2' 6.3, 6.4， 6.5, 6.6，
6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7, .3, 7.4, 7. .5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1,
8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8, .8, 8.9, 9. .0, 9.1, 9.2， 9.3, 9.4， 9.5, 9.6,
9.7, 9.8, 9.9, 10.0일 수 있으며， 유산균 배양액 100 증량부 대비 0.1 중량부 내 지 10 중량부 범위 이내라면 상기 수치에 제한되지 않는다. 바람직하게는 수용성 폴리머를 유산균 배양액 100 중량부 대비 수용성 폴리머 0.1 중량부 내지 5 중량부 로흔합하고, 가장 바람직하게는 0.1 중량부 내지 0.5중량부로 흔합한다.
바람직하게는， 상기 수용성 폴리머로서 카르복시메틸셀를로오스 (carboxymethyl cellulose, CMC)를 유산균 배양액 100 중량부 대비 0.1 중량부 내 지 10 중량부의 비율로 흔합하여 1차 코팅할 수 있다. 구체적으로는 CMC의 흔합 비 율을 예로 들면, 유산균 fl양액 100 중량부 대비 0.1, 0.2, 0 • 3, 0 .4, 0.5, 0.6,
0.7, 0.8, 0.9, 1.0， 1.1， 1.2， 1.3, , 1.4, 1.5， 1.6， 1.7, 1 • 8, 1 .9, 2.0， 2.1，
2.2, 2.3， 2.4, 2.5, 2.6， 2.7, 2.8, , 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3 • 3, 3 .4， 3.5, 3.6,
3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, , 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4 .8, 4 .9, 5.0, 5.1，
5.2, 5.3， 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, , 5.9, 6.0, 6.1， 6.2, 6 .3, 6 • 4， 6.5, 6.6，
6.7, 6.8, 6.9, 7.0， 7.1, 7.2, 7.3, , 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7 .8, 7 .9, 8.0, 8.1,
8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, , 8.9, 9.0, 9.1, 9.2, 9. .3, 9, .4, 9.5, 9.6,
9.7， 9.8, 9.9, 10.0일 수 있으며， 유산균 배양액 100 중량부 대비 1 3.1 중량부 내 지 10 중량부 범위 이내라면 상기 수치에 제한되지 않는다. 바람직하게는， 상기 수 용성 폴리머로서 CMC를 유산균 배양액 100 증량부 대비 CMC 0.1 중량부 내지 5 중 량부로 흔합하고， 가장 바람직하게는 0.1 중량부 내지 0.5중량부로 흔합한다. 본 발명의 일시시예에서는 카르복시메틸셀를로오스 (carboxymethyl cellulose, CMC)이 2차 코팅제인 기능성수화 히알루론산과의 가교형성능이 우수함 을 확인하였다 (표 3참조).
따라서 이 기제를 농도별로 0. (w/v)부터 0.4%(w/v)로 적용하였올 때， 0.2%(w/v)사용시 가장높은 가교 형성능을 나타내었다 (표 4참조).
(b) 상기 (a) 단계에서 1차코팅된 유산균에 기능성 수화 히알루론산을 흔합 하여 2차코팅하는 단계 ：
상기 (b) 단계에서 (a) 단계의 1차코팅 ¾유산균에 기능성 수화 히알루론산 을 흔합하여 2차 코팅한다. 상기 기능성 수화 히알루론산은 장내 유해균을 억제시 키는 항균용유산균 발효물이 포집되어 있어 장내 유해균을 제어한다. 상기 기능성 수화 히알루론산은 유산균 배양액 100 중량부 대비 기능성 수화 히알루론산 0.001 중량부 내지 1 중량부를 흔합한다. 구체적으로는 기능성 수화 히 알루론산의 흔합비율을 예로 들면， 유산균 배양액 100 중량부 대비 0.001， 0.002,
0.003, 0. .004, 0. .005， 0, ,006， 0. .007， 0. ,008, 0. 009， 0. 010， 0.011, 0. ,012, 0.013,
0.014， 0, .015, 0, .016， 0, ,017, 0. .018, 0. ,019, 0. 020， 0. 021, 0.022, 0. .023, 0.024,
0.025, 0. .026, 0. .027, 0. ,028, 0. ,029, 0. 030， 0. 031, 0. 032, 0.033， 0. 034， 0.035,
0.036, 0. .037, 0. .038, 0. .039， 0. ,040， 0. ,041, 0. 042， 0. 043， 0.044, 0. 045, 0.046,
0.047， 0, .048, 0. .049, 0. .050， 0. .051, 0. ,052, 0. 053, 0. 054， 0.055, 0. 056, 0.057,
0.058, 0. .059, 0. .060, 0. .061， 0. ,062, 0. 063, 0. 064, 0. 065, 0.066, 0. 067, 0.068,
0.069， 0. .070, 0. .071, 0. ,072, 0. ,073， 0. 074, 0. 075, 0. 076, 0.077, 0. 078, 0.079,
0.080， 0. .081, 0. ,082, 0. ,083, 0. ,084, 0. 085, 0. 086， 0. 087， 0.088, 0. 089, 0.090，
0.091, 0 .092, 0 .093， 0 .094， 0 .095, 0 .096, 0 .097， 0 .098， 0.099， C ).100 증¾부丁 등으로 흔합할 수 있으며， 유산균 배양액 100 중량부 대비 0.001 증량부 내지 1 중 량부 범위 이내라면 상기 수치에 제한되지 않는다. 바람직하게는 상기 기능성 수화 히알루론산을 유산균 배양액 100 중량부 대비 0.001 중량부 내지 0.05 중량부로 흔 합하고, 더욱 바람직하게는 0.001 중량부 내지 0.005중량부로 흔합한다.
(c) 상기 (b)단계에서 2차 코팅된 유산균에 다공성 입자를 가지는 코팅제를 흔합하여 3차코팅하는 단계 ：
상기 다공성 코팅제는 균체에 다공성 입자성을 가진 기제의 코팅제로서， 외 부 수분 및 습윤 공기의 유입을 차단시키는 역할을 한다. 다공성 입자를 가지는 것 은 상기 3차 코팅제로 사용가능하며， 구체적으로는 이에 한정되지는 않지만 알기네 이트 (alginate), 말토덱스트린 (maltodextrin, MD), 폴리에틸렌글리콜 (polyethyleneglycol, PEG), 트리아세틴 (triaetin), 아세틸트리에틸 시트레이트 (acetyl triethyl citrate) 또는 트리에틸 시트레이트 (triethyl citrate)이 포함되 며， 바람직하게는 알기네이트 (alginate), 말토덱스트린 (maltodextrin, MD), 폴리에 틸렌글리콜 (polyethyleneglycol, PEG)일 수 있으며， 가장 바람직하게는 말토덱스트 린 (maltodextrin, MD)을 말한다. 상기 다공성 코팅제는 유산균 배양액 100 중량부 대비 0.1 중량부 내지 10 중량부의 비율로 흔합된다. 구체적으로는 다공성 코팅제의 흔합비율을 예로 들면， 유산균 배양액 100 중량부 대비 0.1， 0.2， 0. ,3, 0, .4, 0.5, 0. 6, 0. .7, 0.8, 0.9,
1.0, 1. .1, 1.2, , 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1 .8, 1 .9, , 2.0, 2. .1, 2, .2, 2.3, 2.4,
2.5, 2, .6， 2.7, , 2.8, 2.9, 3.0， 3.1, 3.2， 3 • 3, 3 • 4, , 3.5， 3. .6, 3, ■ 7, 3.8, 3.9,
4.0, 4. .1， 4.2, , 4.3， 4.4, 4.5, 4.6， 4.7, 4 .8, 4 • 9, , 5.0, 5. ,1, 5, .2, 5.3, 5.4，
5.5, 5. ,6， 5.7, , 5.8, 5.9, 6.0， 6.1， 6.2, 6 .3, 6 .4, , 6.5， 6. .6, 6, .7, 6.8, 6.9，
7.0, 7, .1， 7.2, , 7.3， 7.4, 7.5， 7.6， 7.7, 7. .8, 7 .9, , 8.0, 8. .1， 8, ■ 2, 8.3, 8.4,
8.5, 8. .6, 8.7, 8.8， 8.9, 9.0， 9.1, 9.2， 9, .3, 9 .4, , 9.5， 9. ,6， 9. ■ 7, 9.8, 9.9,
10.0일 수 있으며， 유산균 배양액 100 중량부 대비 0. 1 중량부 내지 10 중량부 범 위 이내라면 상기 수치에 제한되지 않는다. 바람직하게는 상기 다공성 코팅제를 유 산균 배양액 100 중량부 대비 0.1 중량부 내지 5중량부로 흔합하고, 더욱 바람직하 게는 0.1중량부 내지 0.5중량부로 흔합한다.
바람직하게는 상기 다공성 코팅제로서 말토텍스트린 (maltodextrin, MD)을 유 산균 배양액 100 중량부 대비 0.1 중량부 내지 10중량부의 비율로 흔합할 수 있다. 구체적으로는 MD의 흔합비율을 예로 들면， 유산균 배양액 100 중량부 대비 0.1，
0.2， 0, ■ 3, 0 .4， 0 • 5, 0 .6, 0 .7, 0.8, 0.9， 1.0, 1 .1, 1, .2 ， 1. .3, 1.4， 1.5， 1.6,
1.7, 1. .8, 1, .9, 2, .0， 2, .1， 2 .2, 2.3, 2.4, 2.5, 2 • 6, 2. .7 , 2. .8, 2.9, 3.0, 3.1,
3.2， 3, .3, 3, .4, 3 • 5, 3 .6, 3 .7, 3.8, 3.9, 4.0， 4 .1， 4. .2 , 4, .3, 4.4， 4.5, 4.6，
4.7, 4, .8， 4, .9, 5, .0, 5 .1， 5 ■ 2, 5.3， 5.4, 5.5， 5 .6, 5. .7 ， 5. .8, 5.9, 6.0, 6.1,
6.2， 6, .3， 6, .4, 6 • 5, 6 .6, 6 ■ 7, 6.8, 6.9, 7.0, 7 .1， 7. .2 , 7. .3, 7.4, 7.5, 7.6,
7.7, 7. .8, 7, .9, 8, .0, 8, .1, 8 ■ 2, 8.3， 8.4' 8.5, 8 .6, 8. ,7 , 8. ,8' 8.9, 9.0, 9.1,
9.2, 9. 9. 4, 9. ᄋ
■ 3, 5， 9. 6, 9. 7, 9.8, 9.9, 10.0일 - 丁 이으며， ΤΓ산균 배양액 100 중량부 대비 0.1 중량부 내지 10 중량부 범위 이내라면 상기 수치에 제한되지 않는 다. 바람직하게는， 상기 다공성 코팅제로서 MD를 유산균 배양액 100 중량부 대비
0.1 중량부 내지 5 중량부로 흔합하고, 더욱 바람직하게는 0.1 중량부 내지 0.5 중 량부로흔합한다.
(d) 상기 (c)단계에서 3차코팅된 유산균에 단백질올 흔합하여 4차코팅하는 단계 ：
상기 단백질은 3차 코팅된 유산균에 다공성 입자구조를 가진 3차 코팅제의 공극을 채우기 위하여 흔합되며， 이에 한정되지는 않지만 바람직하게는 탈지분유, 유청단백， 분리대두단백으로 이루어진 군에서 선택된 단백질， 바람직하게는 유청단 백을 말한다. 상기 4차 코팅제인 단백질은 유산균 배양액 100 중량부 대비 단백질 1 중량 부 내지 30 중량부의 비율로 흔합되며， 구체적으로는 4차 코팅제인 단백질의 흔합 비율을 예로 들면， 유산균 배양액 100 중량부 대비 1， 2, 3， 4, 5, 6, 7， 8, 9， 10， 11, 12, 13， 14, 15, 16， 17, 18， 19, 20， 21, 22, 23, 24, 25， 26， 27， 28, 29, 30 일 수 있으며， 유산균 배양액 100 중량부 대비 1 중량부 내지 30 중량부 범 위 이내라면 상기 수치에 제한되지 않는다. 바람직하게는 4차 코팅제인 단백질을 유산균 배양액 100 중량부 대비 1 중량부 내지 10 중량부로 흔합하고， 가장 바람직 하게는 5중량부 내지 10중량부로 흔합한다.
바람직하게는 4차코팅제로서 유청단백을 유산균 배양액 100 중량부 대비 단 백질 1 중량부 내지 30중량부의 비율로 흔합할 수 있으며， 구체적으로는 유청단백 의 흔합비율을 예로 들면， 유산균 배양액 100 중량부 대비 1, 2, 3， 4， 5， 6, 7， 8， 9, 10, 11, 12， 13， 14, 15, 16, 17, 18， 19, 20, 21， 22， 23, 24, 25， 26, 27, 28， 29, 30 일 수 있으며， 유산균 배양액 100 중량부 대비 1 중량부 내지 30 중량 부 범위 이내라면 상기 수치에 제한되지 않는다. 바람직하게는 4차 코팅제로서 유 청단백을 유산균 배양액 100 중량부 대비 1 중량부 내지 10 중량부로 흔합하고， 가 장바람직하게는 5중량부 내지 10중량부로흔합한다. 상기 본 발명의 방법으로 제조된 4중 코팅된 유산균은종래 비코팅 , 단일 코 팅, 2중 코팅， 3중 코팅된 유산균뿐만 아니라 4중 코팅된 유산균에 비하여 장 점막 부착능이 매우 우수하다. 본 발명의 일실시예에 따르면， 기능성 수화 히알루론산을 이용하여 4중 코팅된 유산균은 종래 4중 코팅 유산균과 비교해 in vitro 및 in vivo 상에서 장 점막 부착능이 우수한 것으로 나타났다. 이러한 효과는 인간의 장 점막과 유사한 환경이라고 할 수 있는 상재균이 존재하는 조건에서도 우수하게 나 타났다는 점에서 그 의미가 매우 크다고 할수 있다. 한편, 코팅된 유산균이 숙주의 장에 도달한 이후에 장 점막에 부착되기 위해 서는 숙주의 상재균총과의 경쟁을 통해야만 한다. 뿐만 아니라, 유산균이 장 점막 에 부착되어 유익한 생리학적 활성을 나타내기 위해서는 장 점막의 유해균의 증식 은 억제하고 유익균의 증식은 촉진하는 효과를 나타내는 것이 바람직하다는 점에서 본 발명의 4중 코팅된 유산균은 종래 비코팅, 단일 코팅, 2중 코팅， 3중 코팅 및 4 중 코팅된 유산균과 비교해 매우우수하다고 할수 있다.
구체적으로， 본 발명의 일실시예에 따르면 기능성 수화 히알루론산을 이용하 여 4중 코팅된 유산균은 종래의 비코팅 또는 4중 코팅된 유산균에 비해 유해균과의 경쟁적 부착 저해능이 매우 우수하여, 상재균이 존재하는 상황에서도 유산균의 장 점막 부착능을 향상시킬 수 있다는 것을 알 수 있었다. 뿐만 아니라， 본 발명의 방 법에 따라 4중 코팅된 유산균의 2차 코팅기제인 기능성 수화 히알루론산은 유해균 에 대해서는 증식을 억제하는 효과가 있는 반면， 유익균의 증식은 촉진하는 효과가 있는 것으로 확인되어， 유해균에 대해서만 선택적으로 길항작용을 나타낸다는 것을 알수 있었다. 본 발명의 4중 코팅된 유산균은 우수한 장 점막부착능 및 유해균에 대한선 택적 길항작용 이외에도， 4중 코팅으로 인해 구조적으로 안정하여 수분， 공기 등의 외부 환경인자를 효율적으로 차단시켜 높은 경시적 안정성을 나타낼 수 있으며， 내 산성 및 내담즙산성이 매우 우수하다. 또한 본 발명의 4중 코팅된 유산균은 상기와 같은 방법으로 제조된 것을 특 징으로 한다. 따라서， 본 발명의 4중 코팅된 유산균은 종래의 4중 코팅된 유산균이 가지는 우수한 내산성 및 내담즙성을 유지하면서， 비코팅， 4중코팅된 유산균에 비 하여 장내 균총 중 유해세균 억제능이 우수하여 유해세균 증가시 효율적으로 정상 화 시킬 수 있다. 또한 장내 균총 중 유익균인 유산균총의 증식을 도와 효율적인 장내 균총 정상화에 기여한다. 한편， 본 발명의 다른 일실시예에 따르면 본 발명의 가능상수화 히알루론산 은 4중코팅된 유산균뿐만 아니라 2중 또는 3중 코팅된 유산균에 코팅제로 사용되었 을 경우에도, 일반 히알루론산을 이용하여 유산균올 코팅하였을 때와 비교해 월등 히 향상된 장 점막 부착능을 나타내었다는 점에서 기능성 수화 히알루론산이 그 자 체로서 우수한 장 점막 부착능 및 유해세균에 대한 길항작용을 나타내는 코팅제로 사용될 수 있음을 알수 있었다.
뿐만 아니라， 기능성 수화 히알루론산을 이용하여 2중 또는 3중 코팅된 유산 균은 일반 히알루론산을 이용하여 2중 또는 3중 코팅된 유산균과 비교해 동등한 정 도의 내산성 및 내담즙산성을 나타내는 것으로 보아， 기능성 수화 히알루론산을 제 조하는 과정에서 히알루론산 고유의 유산균 보호 효과는 그대로 유지되는 판단할 수 있었다. 상기한 바와 같이， 본 발명의 기능성 수화 히알루론산으로 코팅된 유산균은 일반 히알루론산을 이용하여 코팅된 유산균과 비교해 동등한 정도의 내산성 및 내 담즙성을 나타낼 뿐만 아니라， 우수한 장 점막 부착능 및 유해세균에 대한 선택적 길항작용을 나타내며， 이러한 유산균 코팅제 및 유산균 코팅방법에 대해서는 종래 에 보고된 바가 없는 것으로, 본 발명자가 기능성 수화 히알루론산을 유산균의 코 팅에 이용함으로써 나타난 효과인 바, 이는 본 발명에서 최초로 보고하는 것이다.
【유리한 효과】
본 발명의 기능성 수화 히알루론산은 유해균에 대해서는 증식 억제작용 및 유익균에 대해서는 증식 촉진 작용을 나타내어 선택적 길항작용을 나타내는 효과가 있으며， 본 발명의 기능성 수화 히알루론산을 이용해 코팅된 유산균은 일반 히알루 론산을 이용해 코팅된 유산균과 비교해 우수한 장 점막 부착능 및 유해균에 대한 선택적 길항작용을 나타내는 효과가 있다.
특히， 본 발명의 기능성 수화 히알루론산을 이용해 4중 코팅된 유산균은 유 산균에 수용성 폴리머， 기능성 수화 히알루론산， 다공성 입자를 가지는 코팅제， 단 백질을 흔합하여 4중 코팅함으로써， 종래 비코팅， 단일, 2중， 3중 및 4중 코팅 유 산균에서는 나타나지 않은 우수한 장 점막 부착능 및 유해세균에 대한 선택적 길항 작용을 나타낼 뿐만 아니라, 내산성 및 내담즙성도 매우 우수하여 유산균 본래의 생리활성 기능을 소실하지 않는 효과가 있다.
【도면의 간단한설명】
도 1은 기능성 수화 히알루론산의 형상을 나타낸사진이다.
도 2는 기능성 수화 히알루론산의 살모넬라 티피뮤리움 KCTC 2054에 대한 생 육 저해능을 평가한 결과이다.
도 3은 락토바실루스 아시도필루스 IDCC 3302의 배양액이 포집된 기능성 수 화 히알루론산원료의 락토바실루스 람노서스에 대한 증식 촉진효과를 평가한 사진 이다 (A : 일반 히알루론산처리 대조군， B : 기능성 수화 히알루론산 처리군) .
도 4는 락토바실루스 아시도필투스 IDCC 3302의 배양액이 포집된 기능성 수 화 히알루론산원료의 비피도박테리움 통검에 대한 증식 촉진효과를 평가한 사진이 다 (A: 일반히알루론산처리 대조군， B: 기능성 수화 히알루론산 처리군) . 도 5는 락토바실루스 아시도필루스 IDCC 3302의 배양액이 포집된 기능성 수 화 히알루론산원료의 엔테로코커스 페시움에 대한 증식 촉진효과를 평가한 사진이 다 (A: 일반 히알루론산 처리 대조군， B: 기능성 수화 히알루론산 처리군) .
도 6은 기능성 수화 히알루론산을 이용하여 2중 코팅된 락토바실루스 아시도 팔루스 IDCC 3302， 비코팅 및 일반 히알루론산을 이용하여 2중 코팅된 락토바실루 스 아시도필루스 IDCC 3302의 장내 정착성을 비교한도면이다.
도 7은 기능성 수화 히알루론산을 이용하여 2중 코팅된 락토바실루스 아시도 필루스 IDCC 3302 , 비코팅 및 일반 히알루론산을 이용하여 2중 코팅된 락토바실루 스 아시도필루스 IDCC 3302가 장내 살모넬라균의 생육에 미치는 영향을 평가한 도 면이다.
도 8은 기능성 수화 히알루론산을 이용하여 3중 코팅된 락토바실루스 아시도 필루스 IDCC 3302 , 비코팅 및 일반 히알루론산을 이용하여 3중 코팅된 락토바실루 스 아시도필루스 IDCC 3302의 장내 정착성을 비교한도면이다.
도 9는 기능성 수화 히알루론산을 이용하여 3중 코팅된 락토바실루스 아시도 필루스 IDCC 3302 , 비코팅 및 일반 히알루론산을 이용하여 3중 코팅된 락토바실루 스 아시도필루스 IDCC 3302가 장내 살모넬라균의 생육에 미치는 영향을 평가한 도 면이다.
도 10은 기능성 수화 히알루론산을 이용하여 4중 코팅된 락토바실루스 아시 도필루스 IDCC 3302, 비코팅 및 일반 히알루론산을 이용하여 4중 코팅된 락토바실 루스 아시도필루스 IDCC 3302의 장내 정착성을 비교한도면이다.
도 11은 기능성 수화 히알루론산을 이용하여 4중 코팅된 락토바실루스 아시 도필루스 IDCC 3302 , 비코팅 및 일반 히알루론산을 이용하여 4중 코팅된 락토바실 루스 아시도필루스 IDCC 3302가 장내 살모넬라균의 생육에 미치는 영향을 평가한 도면이다.
도 12는 본 발명에 사용된 비코팅된 락토바실루스 아시도필루스 IDCC 3302의 형상을 나타낸 SEM사진이다.
도 13은 락토바실루스 아시도필루스 IDCC 3302에 카르복시메틸셀를로오스를 흔합하여 1차코팅된 유산균의 형상을 나타낸 SEM사진이다.
도 14는 카르복시메틸샐를로오스로 1차 코팅된 락토바실루스 아시도필루스 IDCC 3302에 기능성 수화 히알루론산을 흔합하여 2차 코팅된 유산균의 형상을 나타 낸 SEM사진이다.
도 15는 카르복시메틸셀를로오스 및 기능성 수화 히알루론산으로 2차코팅된 락토바실루스 아시도필루스 IDCC 3302 에 말토덱스트린을 흔합하여 3차 코팅된 유 산균의 형상을 나타낸 SEM사진이다.
도 16은 카르복시메틸셀를로오스, 기능성 수화 히알루론산 및 말토덱스트린 으로 3차 코팅된 락토바실루스 아시도필루스 IDCC 3302 에 유청단백을 흔합하여 4 차 코팅된 유산균의 형상을 나타낸 SEM사진이다.
【발명의 실시를 위한 형태】
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단， 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐， 본 발명의 내용이 하기 실 시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
기능성 수화 히암루론산 조제
대표적 유산균인 락토바실루스 아시도필루스 IDCC 3302 {Lactobacillus acidophilus IDCC 3302) 발효균체를 틴달화 (tyndal l izat ion)함으로써 락토바실루스 아시도필루스 IDCC 3302 세포 구조물에 포함되어 있는 대표성분인 리포테이코익산 ( l ipoteichoic acid)，펩티도글리칸 (pept idoglycan)등의 유해세균 부착저해물질 및 유해세균의 증식을 억제하고 유익균의 생육을 증진시키는 유산균 발효산물을 히알 루론산에 포집시키고자 하였다. 이를 위해 층분히 배양된 락토바실루스 아시도필루 스 IDCC 3302 균액을 m°C-5분간 가압열처리 (압력게이지상 1.2기압) 한 후， 균액 을 30°C로 냉각하였다. 이를 다시 1K C-10분간 가압열처리 (압력게이지상 0.8기 압) 한 후， 균액을 30°C로 넁각한 후, 다시 80°C-30분간 열처리한 후, 30°C로 최종 냉각하여 부착저해 유산균액을 준비하였다.
이 배양액을 6(rc에서 초기 부피의 1/10까지 감압농축하고 여기에 히알루론 산 0.01~1% (w/v)을 넣어 충분히 교반하여 녹인 후， 50°C에서 추가적인 감압농축하 고 건조하여 도 1에서 보는 바와 같이 기능성 수화히알루론산원료를 조제하였다.
<실시예 >
기능성 수화 히암루론산의 부착저해능
기능성 수화 히알루론산의 유해균 부착저해능을 평가하기 위해서， 인체 장내 상피세포 계열인 Caco-2 세포주 in vitro 모델을 사용하였다. Caco-2 세포주 in vitro 모델은 분극화 현성 (polar i zat ion) , 기능성 brush border 및 가수분해효소 분비 등 성숙한 장 세포 특성을 그대로 잘 나타낸다. 유산균이 장내 점막세포와 결 합하는 데에는 유산균의 리간드가 특정 수용체와 상호 작용하는 것이 필요하기 때 문에, 장내의 Caco-2 세포는 실제적으로 유산균의 장 정착성을 연구하는데 있어서 가장 유용한 in vitro 모델 중 하나로 알려져 있다 (Microbiol .59(12) :4121-4128， Gut.35:483— 489， FEMS microbiology. Lett.91:213—218등). 구체적으로， 기능성 수화 히알루론산을 Caco-2 eel Is에 먼저 처리한 후, 살 모넬라 티피뮤리움 KCTC 2054를 부착시켰을때 Cac으 2 eel Is에 부착되어 있는 살모 넬라 티피뮤리움 KCTC 2054의 균수를 측정하여 이를 저해율로 환산하는 방법을 사 용하였다.
이때 대조군으로 기능성 수화 히알루론산 샘풀 대신， 일반 히알루론산을 사 용하였다. 보다 구체적으로는 Ca«)-2 cell monolayer는 Caco-2 eel Is를 10% (v/v) fetal calf serum과 20 ul/ml의 gentamicin을 첨가한 DMEM에 1.2 x 105 eel ls/ml농 도로 접종하고 6-well tissue culture plate (BD, USA) well 당 1 ml 분주하여 7일 간 배양한 후， phosphate buffered saline (PBS, pH 7.2)으로 2회 세척하여 제조하 였다. Caco-2 monolayer가 형성된 각 well에 기능성 수화 히알루론산 용액 0.5 ml 를 넣어 90분간 반웅시켰다. 대조군은 히알루론산 용액을 사용하였다. 살모넬라 티 피뮤리움 KCTC 2054 샘플 0.5ml (1 x 108 cfu/ml)를 넣어 90분간 반응시켰다. 반웅 후, 상층액을 제거하고 Cac으 2 eel Is를 PBS로 2회 세척하여 부착되지 않은 살모넬 라 티피뮤리움 KCTC 2054를 제거하였다. Tween 80 0.04% (w/v) 1 ml를 가하여 Caco-2 cells에 부착된 살모넬라 티피뮤리움 KCTC 2054를 회수하고 생균수를 측정 하였다. 이에 대한 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
【표 11
기능성 수화 히알루론산의 살모넬라 티피뮤리움 KCTC 2054부착저해능
Figure imgf000020_0001
상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 대조군인 일반 히알루론산의 경우 살모넬라 티피뮤리움의 부착저해율은 거의 나타나지 않은 반면， 기능성 수화 히알루론산의 경우 46%의 부착 저해율올 나타내는 것으로 확인되었다. 즉, 기능성 수화 히알루론 산을 유산균 의 코팅제로 사용할 경우, 유산균이 장 점막에 부착됨은 물론 장내 유 해균과의 경쟁적 제거에 도움이 될 것으로 판단되었다.
<실시예 3>
기능성 수화 히암루론산의 유해규 김함작용
기능성 수화 히알루론산의 장내 유해세균에 대한 항균력을 평가하기 위해 살 모넬라 티피뮤리움 KCTC 2054에 대 해 최소저지농도 (Minimum Inhibitory Concentrat ion, MIC)를 구하여 장내 세균총 중 유해균에 미치는 영향을 비교하였 다. 실험방법은 대한약전 외 의약품에 수재되어 있는 세균성장저지력 시험을 변형 하여 사용하였다. 세부내용은 다음과 같다.
1) 살모넬라 티피뮤리움 KCTC 2054 시험균 용액조제
살모넬라 티피뮤리움 KCTC 2054 시험균 용액 조제를 위해 Brain Heart Infusion agar (BHI agar , BD, USA)에서 자란 살모넬라 티피뮤리움 KCTC 2054 균체 를 1 loop 취하여 멸균된 BHI 액상배지 5 ml에 현탁하여 O.D. 620 nm 값 0.15 로 조정하였다. 이 용액을 시험균 용액으로 사용하였다.
2) 조작법
기능성 수화 히알루론산 분말 을 1% (w/v)~10% (w/v)의 농도가 되게 BHI 액 상배지 20 ml에 각각 넣고 5~10분간 교반하면서 현탁하였다. 현탁액을 원심분리 (5,000 RPM/15분)한 후, 상등액을 membrane f i lter (0.45 um)로 여과멸균 하였다. 각각 농도의 여과멸균액을 2 ml를 멸균된 4 ml 시험관에 넣고 살모넬라 티피뮤리움 KCTC 2054 시험균 용액을 2% (v/v) 접종하였다. 대조군으로 기능성 수화 히알루론 산 샘플 대신， 일반 히알루론산을 사용하였다. 접종이 끝나면 37°C에서 24시간 동 안 배양하면서 균의 생장을 관찰하였다.
3) 판정
배양 24시간 후에 균의 생장이 관찰된 농도를 확인하여 그 때의 농도값을 MIC 값으로 정하였다.
이에 대한 결과를 하기 표 2 및 도 2에 나타내었다.
【표 2】
기능성 수화 히알루론산의 살모넬라 티피뮤리움 KCTC 2054에 대한 길항작용 구분 대조군-히일"루론산 기능성수화 히일루론산
살모넬라티피뮤리움 > 10% 4% (w/v)
최소생육저지농도 상기 표 2 및 도 2에 나타낸 바와 같이 기능성 수화 히알루론산으로 살모넬 라 티피뮤리움 KCTC 2054 균주에 대한 MIC값을 평가한 결과， 기능성 수화 히알루론 산은 4%(w/v)의 농도에서 최소저지농도 (MIC)를 나타내어 유해균에 대한 증식 억제 효과를 나타냄을 확인할수 있었다.
<실시예 4>
기능성 수화 히암루론산의 유익균 증식촉진작용
기능성 수화 히알루론산의 장내 유익균에 대한 영향력을 평가하기 위해 유산 간균, 비피더스균; 유산구균으로 대표되는 락토바실루스 ^노^스^ Lactobacillus rhamnosus) , 비피도박테리움 ^^ {Bifidobacterium longum) , 엔테로코커스 페시움 {Enter ococcus faeciuni)^ 사용하였다 . 보다 상세하게는 장내 유익균 3종의 시험 균 용액 조제를 위해 de Man-Rogosa-Sharpe agar (MRS, BD, USA)에 서 자란 유익균 3종의 균체를 취하여 멸균된 MRS 액상배지 현탁한 후， 이 용액올 시험균 용액으로 사용한다 .
락토바실루스 아시도필루스 IDCC 3302의 기능성 수화 히알루론산 분말을 4% (w/v)의 농도가 되게 M RS 액상배지 20 ml에 각각 넣고 5~10분간 교반하면서 현탁 한다. 대조군으로 기능성 수화 히알루론산 분말 대신 일반 히알루론산을 사용하였 다.
현탁액올 원심분리 (5, 000 RPM/15분)한후, 상등액을 membrane f i l ter (0.45 um)로 여관멸균―한ᅳ다. 여 t멸ᅭ균 _ 을ᅳ 2JU_를ᅳ멸 _균된ᅳ 4—ml 시—험—관쇄ᅳ넣一고 _유ᅳ의ᅳ균ᅳ 3종 을 각각 2% (v/v)씩 접종한다. 접종이 끝나면 37°C에서 24시간 동안 배양하면서 균 와 생장을 현미경관찰을 통해 대조군과 증식도를 비교하여 도 3 내지 도 5에 나타 내었다. 도 3 내지 도 5에 나타낸 바와 같이 , 본 발명에 따른 기능성 수화 히알루론 산을 처리한 락토바실루스 람노서스
Figure imgf000022_0001
rhamnosus) 도 3)， 비피도박테 리움 ^^ Bifidobacterium longum) 도 4)， 엔테로코커스 페시움 ( >2 e/ i c /s faecium ) (도 5)에서， 일반 히알루론산 처리한 대조군과 비교해 각각의 균의 성장 이 촉진되는 것을 확인할수 있었다. <실시예 5>
유산규 표면박막코팅 가교제 선정
유산균체 표면박막코팅을 이루는 수용성폴리머와 기능성 수화 히알루론산의 가교형성능을 평가하여 가장 최적의 코팅 가교제를 선정하였다. 보다 상세하게는 기능성 수화 히알루론산을 3차 증류수에 4g/l의 농도로 녹인 용액과 수용성폴리머 를 3차 증류수에 l%(w/v) 농도로 녹인 용액을 1 ： 1 (v/v)의 부피비로 흔합하고 1 분간 강하게 교반 후, 상온에서 30분간 방치하였다. 3차 증류수만을 기능성 수화 히알루론산과 흔합한 결과와 비교하여 가교친화성을 판단하였다. 가교가 형성되었 을 경우， 기능성 수화 히알루론산의 평균 분자량이 증가하여 용액의 점도가 증가 하게 된다. 점도의 측정은 24 °C 항온수조에서 점도 증가에 따라 측정시간이 증가하 는 점도계 (Ubbelogdevisc oraeter , SI analyt ics)에 용액을 넣고 ViscoClock (SI Analyt ics)를 이용하여 일정 구간을 통과하는 하강 소요시간을 측정하여 점도를 상 대적으로 비교하였다 (표 3) .
하기 표 3에서 볼 수 있는 바와 같이， 기능성 수화 히알루론산은 시험에 사 용된 모든 수용성폴리머와 가교결합을 잘 형성하였으며， 그 중에서 특히 카르복시 메틸셀를로오스 (CMC)와가교결합을 가장 잘 형성하는 것으로 나타났다.
【표 3]
기능성 수화 히알루론산과의 가교형성을 위한 최적 코팅가교제 선정
Figure imgf000023_0001
기능성 수화 히알루론산과 가교결합을 가장 잘 형성하는 코팅 가교제인 CMC 의 최적농도를 결정하기 위해 기능성 수화 히알루론산을 3차 증류수에 4g/L의 농도 로 녹인 용액에 CMC 농도를 0. (w/v)부터 0.4%(w/v)까지 첨가하여 용액을 제조하 고 가교 형성을 상대적으로 비교할 수 있는 ViscoClock (SI Analyt ics)를 이용하여 일정 구간을통과하는 하강소요시간을 측정하여 점도를 상대적으로 비교하였다. 이에 대한 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
【표 4】 기능성 수화 히알루론산과의 가교형성을 위한 최적 CMC 농도
Figure imgf000024_0001
상기 표 4에 나타낸 바와 같이， 기능 성 수화 히알루론산과의 가교형성을 위 한 최적 CMC 농도 결정실험에서는 0. (w/v)사용시 632초의 하강시간을 나타내어 상대적으로 가교형성능력이 우수한 농도로 나타났다.
<실시예 6>
기능성 수화 2중코팅 유산균
<6-1> 기능성 수화 2중 코팅 유산균의 조제
본 발명에서는 한국 등록특허 (제 10-1280232호)의 명세서 실시예에 기재된 코 팅 유산균의 조제방법을 토대로 유산균의 표면박막코팅제이면서 1차 코팅제로 CMC- Na, 2차 코팅제로 상기 <실시예 1>에서 조제한 기능성 수화 히알루론산을 사용하여 기능성 수화 2중 코팅 유산균을 조제하였다. 대조군으로 기능성 수화 히알루론산 대신 일반 히알루론산을 사용하여 2중 코팅 유산균을 조제하여 사용하였다.
<6-2> 기능성 수화 2중 코팅 유산균의 내산성 (acid tolerance)
유산균이 경구로 섭취된 이후에 인체의 소화기관 중 위 (stomach)를 통과할 때 위산 (gastr i c juice)에 노출되게 되는데， 이와 유사한 환경을 시험관 조건에서 조성하고, 기능성 수화 히알루론산 2중 코팅 유산균과 일반 히알루론산 2중 코팅 유산균군의 생존율을 비교하여 내산성을 평가하였다.
보다 상세하게는 MRS 배지에 10% HC1올 적하하여 pH를 2.3 , 2.5으로 적정한 다음 멸균하여 사용하였으며， 시료 lg을 각각의 pH로 보정된 MRS 배지에 넣어 0시 간, 1시간， 2시간 동안 반웅시킨 후, 생균수 분석을 하였다. 이때， 실험에 사용한 유산균은 락토바실러스 쏙 {Lactobacillus sp . ) 12종， 비피도박테리움 속 {Bifidobacterium sp . ) 4종, 스트렙토코커스 속 Streptococcus sp . ) 1종， 엔테로 코커스 속 ( :nterococcus sp . ) 1종， 락토코커스 쏙 actococcus sp . ) 1종을 기능성 수화 2중코팅 유산균과 히알루론산 2중 코팅유산균을 제조하여 비교하였다.
이에 대한 결과를 하기 표 5에 나타내었다. 【표 5】
기능성수화히팥루론산 2중코 S유산균의내산성결과
Figure imgf000025_0001
상기 표 5에 나타낸 바와 같이， 기능성 수화 히알루론산 2중코팅 유산균과 일반 히알루론산 2중코팅 유산균의 내산성을 비교한 결과， 각 실험군에서 유사한 내산성을 나타내었다.
이러한 결과는 기능성 수화 히알루론산이 제조되는 과정 중 유산균을 보호하 는 히알루론산고유의 특성이 파괴되지 않았기 때문으로사료된다. <6-3>기능성 수화 2중코팅 유산균의 내담즙산성 (bi le tolerance) 담즙산 (bi le acid)은 간 ( l iver )에서 만들어져 담도로 빠져나와 소장 (smal l intest ine)으로 홀러나오고 소장 말단의 회장 ( i leum)에서 다시 95% 흡수되어 다시 간으로 들어가는 장관순환을 한다. 이 과정에서 소장에 정착한 유산균에 영향을 미 친다.
따라서 담즙산에 노출되었을 때 기능성 수화 히알루론산 2중 코팅 유산균과 히알루론산 2중 코팅 유산균군의 생존율을 시험관 환경에서 비교하였다. 보다 상세 하게는 담즙산 0.3%가 첨가 된 배지와 첨가되지 않은 배지를 멸균하여 사용하였으 며 각각의 배지에 기능성 수화 히알루론산 2중코팅 유산균, 대조군인 일반 히알루 론산 2중코팅 유산균 시료 lg 을 각각 접종하고 5시간 동안 반응시킨 후, 생균수 분석을 하여 내담즙산성을 비교하였다.
이에 대한 결과를 하기 표 6에 나타내었다.
【표 6]
기능성수화히알루론산 2중코팅유산균의 내담줍산성결과
Figure imgf000027_0001
상기 표 6에 나타낸 바와 같이， 기능성 수화 히알루론산 2중코팅 유산균과 히알루론산 2중코팅 유산균의 내담즙산성을 비교한 결과, 각 실험군에서 거의 차이 없이 유사한 내담즙산성을 나타내었다. 따라서 기능성 수화 히알루론산은 제조과정 중 그 히알루론산의 고유의 특성이 파괴되지 않아 유산균에 코팅 후에도 유사한 효 과를 나타낸 것으로 판단된다. <6-4> 기능성 수화 2중 코팅 유산균의 비경쟁 부착능 (Non-compet i t ive a dhesion)
Caco-2 cel l mono layer는 Caco-2 cel ls (한국세포주은행)를 10% (v/v) fetal cal f serum과 20 ul/ml농도의 겐타마이신 (gentamicin)을 첨가한 Dulbecco^
Modi f ied Eaglet s Medium (DMEM, Hyclo ne, USA)에 1.2 x 105 cel ls/ml 농도로 접종 하고 6-wel l t issue culture plate을 사용하여 wel l 당 1 ml 분주하여 7일간 배양 한후， 인산완층용액으로 2회 세척하여 제조하였다.
Caco-2 mono la yer가 형성된 각 wel l에 비코팅 유산균과 히알루론산 2증코 팅 유산균， 기능성 수화 히알루론산 2중코팅 유산 균 샘플 1 ml를 넣어 90분간 반 응시켰다. 상기 2중 코팅 유산균은 한국 등록특허 (제 10-1280232호)의 2중코팅 유산 균조제방법올토대로 제조하였다.
반응 후 상층액을 제거하고 Tween 80 0.04% (w/v) 1 ml를 가하 여 Caco-2 eel Is에 부착된 유산균 샘플을 회수하고 헤모사이토메터를 이용한 관찰 균수를 측 정하였다. 초기 균수 대비한부착균수의 비율로부착효율을 계산하였다. 이에 대한 결과를 하기 표 7에 나타내었다 .
하기 표 7에서 볼 수 있는 바와 같이， 장점막과 유사한 Caco-2 eel Is에 대한 부착능 평가시 비코팅 유산균보다 히알루론산 2중코팅 유산균의 부착효율이 상대적 으로 우수하였으며， 기능성 수화 히알루론산 2중코팅 유산균의 부착효율은 히알루 론산 2중코팅 유산균과 비교해 전반적으로 더 향상된 부착효율을 나타내었다.
【표 7】
기능성 수화 히알루론산 2중 코팅된 유산균의 비경쟁 부착능
Figure imgf000029_0001
Streptococcus therwophi lus 14 26 32 장 점막 세포에 유산균과 경쟁하는 미생물이 존재하지 않을 때， 기본 장 점 막 부착능은 기능성 수화 히알루론산 2중코팅 유산균이 일반적인 히알루론산 2중코 팅 유산균과 비교해 전반적으로 향상된 부착효율을 나타냈다. 이러한 결과로부터 기능성수화 히알루론산의 장 점막 정착효과는 일반 히알루론산과 동등 또는 향상된 효과를 보였기에 기능성 수화 히알루론산 제조과정 중 히알루론산의 고유의 장 점 막 점착력이 파괴되지 않았음을 알 수 있었다.
<6-5> 기능성 수화 2증 코팅 유산균의 경쟁적 부착저해능 (ComDet i t ive exclusion)
일반적으로 유산균이 장내에서 정장작용을 발휘하기 위해서는 유해균인 대장 균과 살모넬라 등 보다 장점막과의 결합력이 우수해야 하나 그람음성세균인 대장균 과 살모넬라보다 그람양성세균으로 분류되는 유산균이 상대적으로 장점막과의 결합 력이 떨어진다. 따라서， 본 발명자들은 기능성 수화 히알루론산 2중 코팅된 유산균 이 장내에서 유익한 생리학적 활성을 나타낼 수 있는지 여부를 보다 명확히 판단하 기 위해서， 상재균이 존재하는 조건에서 유산균의 부착능을 평가하고자 하였다. 상재균 존재시 부착능 비교실험은 살모넬라 티피뮤리움 KCTC 2054를 지시균 으로 사용하여 Caco-2 cel ls에 먼저 부착시킨 후， 비코팅, 히알루론산 2중 코팅된 유산균， 기능성 수화 히알루론산 2중 코팅 유산균을 처리하였을 때 Caco- 2 cel ls 에 부착되어 있는 살모넬라 티피뮤리움 KCTC 2054의 균수를 측정하여 이를 저해율 로 환산하는 방법을 사용하였다.
보다 더 구체적으로는 Caco-2 cel l monolayer는 Caco-2 eel Is를 1OT (v/v) fetal cal f serum과 20 ul/ml의 gentamicin을 첨가한 Dulbeccov s Modi f ied Eagle' s
Medium (DMEM, Hyclone, USA)에 1.2 x 105 cel ls/ml 농도로 접종하고 6-wel l t i ssue culture plate올 사용하여 wel l 당 1 ml 분주 하여 7일간 배양한 후， 인산완층용액 으로 2회 세척하여 제조하였다.
살모넬라 티피뮤리움 KCTC 2054의 시료는 각각 brain heart infusion (BHI , BD, USA) 배양액 10 ml를 원심분리하여 균체를 회수하고 인산완층 용액으로 2회 세 척한 다음 1 ml 인산완층용액에 재현탁하고 serum-free DMEM에 1 x 108 CFU /ml 농 도로 회석하여 조제하였다. 상재균인 살모넬라 티피뮤리움 KCTC 2054 시료액 0.5 ml를 Caco-2 mono la yer가 형성된 각 wel l에 넣고 60분간 반웅시켰다. 반웅 후， 유 산균 샘플 (1 X 108 CFU/ml )을 동량 처리하여 90분간 반웅시켰다.
Caco-2 cel ls에 부착된 살모넬라 티피뮤리움 KCTC 2054의 생 균수 측정을 위해 Tween 80 0.04% (w/v) 1 ml를 가하여 Caco-2 eel Is로부터 부착된 상재균인 살 모넬라 티피 뮤리움 KCTC 2054를 회수하고 BG agar 배지에서 생균수를 측정하였다. 살모넬라 티피뮤리움 KCTC 2054의 부 착 저해율은 다음과 같이 계산하였다.
[살모넬라 티피뮤리움 부착저해율 (%) ]
= [1- (시험군 처리시의 살모넬라 티피뮤리움 부착균수 / DMEM처리시의 살모넬 라 티피뮤리움 부착균수) ] X 100 (%) 이에 대한 결과를 하기 표 8에 나타내었다.
하기 표 8에서 볼 수 있는 바와 같이， 장점막과 유사한 Cac으 2 eel 1?에 유해 균인 살모넬라 티피뮤리움 KCTC 2054를 먼저 부착시킨 후， 비코팅， 히알루론산 2중 코팅， 기능성 수화 히알루론산 2중코팅된 유산균의 경쟁 유해균의 제거율을 비교한 결과， 기능물질이 포함되지 않은 비코팅 유산균은 경쟁제거의 방법으로 살모넬라 티피뮤리움 KCTC 2054를 제거하기 때문에 상대적으로 가장 낮은 제거효율을 보였으 며, 기능성 수화 히알루론산 2중코팅된 유산균은 비코팅보다는 상대적으로 높은 유 해균 제거효율을 나타냈다.
한편， 기능성 수화 히알루론산 2중코팅된 유산균은 경쟁적 제거 이외에도 기 부착된 살모넬라 티피뮤리움 KCTC 2054에 직접 항균력을 나타냄으로써 Caco-2 cel l s로부터 살모넬라 티피뮤리움을 원활하게 제거하고， 히알루론산에 의해 유해균 이 탈착된 부위에 잘정착하는 것으로 나타났다.
한편， 상기한 기능성 수화 히알루론산 2중코팅된 유산균의 효과는 락토바실 루스 아시도필루스 IDCC 3302의 결과만을 보더라도 비코팅 유산균보다는 47% 우수 한 효과를 나타내었고， 일반 히알루론산 2중코팅 유산균과 비교해도 33¾> 이상 우수 한 효과를 나타내는 것으로 확인되었다. 즉， 기능성 수화 히알루론산을 유산균의 코팅제로 사용한다면， 종래의 일반적인 유산균 코팅제들과 비교해 장내 유해균 저 해능이 현저히 향상된다는 것을 알수 있었다.
【표 8]
기능성 수화 히알루론산 2중코팅된 유산균의 경쟁적 부착저해능
Figure imgf000031_0001
<6-6> 기능성 수화 히알루론산 2중 코팅 유산균의 in vivo장 정착성 기능성 수화 히알루론산 2중 코팅 유산균의 in vivo장 정착성 실험을 위해 서 4주령된 ICR 마우스를 시험군당 5마리씩 사용하였다. 특히 이 실험에서는 항생 제 투여를 통해 장내 세균총을 교란시킨 후 장내 세균총 중 lactob acilli 수복 에 효과적인 실험군을 선발할목적으로 진행하였다. 실험군으로 비코팅 유산균， 히알루론산 2중코팅 유산균, 기능성 수화 히알루 론산 2중 코팅 유산균 투여군， 유산균을 투여하지 않은 대조군으로 구성하였다. 시 험기간은 총 6주로 첫 0.5주간은 실험동물의 적웅기로 하였으며, 적웅기가 끝난 다 음 1주는 ampi ci l l in 항생제 투여기간으로 매일 0.4g/ l의 ampici l l in을 음용수에 넣어 섭취하게 하였다. 다음 2주간은 유산균을 경구투여 하였으며， 이때 균수는 1 X 1010 CFU/g을 사용하였다. 대조군으로는 유산균을 대신하여 PBS를 경구투여 하였다. 다음 2.5주 간은 유산균 투여를 중단하고 장내 균총변화를 관찰하였다. 전 시험기간 동안 매주 2회 각각의 실험군에서 분변샘플을 회수하여 Lactobacilli엑 균수를 LBS {Lactobacillus select ive media , BD, USA) agar배지로 실험군별로 증식도의 차이 를 분석하였다. 이에 대한결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에서 볼 수 있는 바와 같이， 비코팅 유산균보다 히알루론산 2중 코팅된 유산균과 기능성 수화 히알루론산 2중 코팅 유산균 투여군에서 투여 중단 후， 2.5 주까지 분변에 서 락토바실루스 균이 검출되는 것을 확인할 수 있었다, 그러나 코 팅유산균의 형태가 히알루론산 단독으로 기반한 구조여서 위산과 담즙산 등에 취약 한구조이기 때문에 두개군이 모두 유사한장내 정착성 패턴을 나타내었다.
<6-7>기능성 수화 히알루론산 2증코팅 유산균의 in vivo유해세규억체능
In >o에서 기능성 수화 히알루론산 2중 코팅 유산균의 유해세균 억제능을 확인하기 위해， 살모넬라 티피뮤리움 KCTC 2054를 감염시킨 마우스 모델에서 항균 력을 조사하였다. 6주령된 female ICR마우스 5마리 /cage를 1개군으로 샘플은 비코 팅 유산균, 히알루론산 2중 코팅 유산균， 기능성 수화 히알루론산 2중 코팅 유 산 균, PBS투여군 (vehi cle)의 총 4개군으로 구분하였다. 계류기간이 끝난 마우스를 대 상으로 0. (w/v) 테트라싸이클린을 200 ul/mouse/day씩 1주일간 투여하여 마우스 고유의 장내 세균총을 억제 및 교란시켰다. 1주일 경과 후， 살모넬라 티피뮤리움
KCTC 2054 (1 X 108 CFU/ml )를 시료 투여기간 초기 3일간 200 ul/mouse/day씩 경구 투여하고 4가지 샘폴도 2주동안 200 ul/mouse/day씩 경구투여하였고， 이때 균수는
1 X 1010 CFU/g을 사용하였다 다음 2.5주간은 샘플 투여를 중단하고 유해균의 생장 억제변화를 관찰하였다. 전 시험기간 동안 매주 2회 각각의 실험군에서 분변샘플을 회수하여 살모넬라 균수를 BG agar배지로 분석하였다. 이에 대한 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에서 볼 수 있는 바와 같이， 장내 상재균총을 항생제로 억제시킨 후 살 모넬라 티피뮤리움 KCTC 2054로 감염시킨 마우스 모델에 비코팅， 히알루론산 2중코 팅, 기능성 수화 히알루론산 2중코팅 유산균 샘플을 투여한 결과， 단순경쟁 배제역 할을 하는 비코팅， 히알루론산 2중 코팅된 유산균은 살모넬라 티피뮤리움 KCTC 2054와 경쟁을 통해 생육을 억제함을 알 수 있었으며， 기능성 수화 히알루론산 2중 코팅 유산균은 살모넬라 티피뮤리움 KCTC 2054에 대해 길항작용과 경쟁적 배제작용 을 동시에 함으로써 10배 이상 효율적으로 살모넬라 티피뮤리움 KCTC 2054를 억제 하는 것으로 확인되었다.
<실시예 7>
기능성 수화 3중코팅 유산규
<7-1> 기능성 수화 3중 코팅 유산균의 조제
본 발명에서는 한국 등톡특허 (제 10-1280232호)의 명세서 실시예의 유산균 코 팅방법을 토대로 유산균의 표면박막코팅제이면서 1차 코팅제로 CMC-Na, 2차 코팅제 로 상기 <실시예 1>에서 조제한 기능성 수화 히알루론산을 사용하고 3차 코팅제로 말토덱스트린 (maltodextrin)을 사용하여 기능성 수화 3중 코팅 유산균을 조제하였 다. 대조군으로 기능성 수화 히알루론산 대신 일반 히알루론산올 사용하여 히알루 론산 3중 코팅 유산균을 조제하여 사용하였다.
<7-2> 기능성 수화 3중 코팅 유산균의 내산성 (acid tolerance)
내산성은 인체의 소화기관 중 위 (stomach)에 유산균이 통과할 때 위산 (gastric juice)에 노출되게 되는데 이러한 환경을 시험관 조건에서 기능성 수화 히알루론산 3중 코팅 유산균과 히알루론산 3중 코팅 유산균군을 비교하였다 [표 9] 실험방법은본 발명의 실시예 <6-2>와동일하게 진행하였다.
이에 대한 결과를 하기 표 9에 나타내었다.
【표 9】
기능성수화히알루론산 3중코 S유산균의 내산성결과 코¾
히알루
론산
3증
코¾
기능성
수회—
히알루
론산
3증
코¾
Figure imgf000034_0001
상기 표 9에 나타낸 바와 같이， 기능성 수화 히알루론산 3중코팅 유산균을 조제하여 내산성을 비교한 결과 일반 히알루론산을 사용한 3중코팅 유산균과 동등 한 효과를 나타내었다. 이러한 결과는 기능성 수화 히알루론산이 제조되는 과정 중 유산균을 보호하는 히알루론산고유의 특성이 파괴되지 않았기 때문으로사료된다. 한편, 상기 표의 결과 중 락토바실루스 아시도필루스 IDCC 3302 결과만을 비 교해 봤을 때， 일반 히알루론산을 사용한 3증코팅 유산균은 60% (pH 2.3)， 64% (pH 2.5) 의 내산성을 나타내었으며， 이는 상기 실시예 <6-2>의 히알루론산 2중코팅 유 산균의 50% 대 내산성 보다 높게 평가되어 코팅의 효과가 내산성과의 상관관계에 있음을 알 수 있었다. 즉， 2증코팅보다는 3중코팅에서 내산성이 우수하게 나타나 코팅의 보호효과가내산성 생존율에 반영된 것을 확인하였다.
<7-3>기능성 수화 3증코팅 유산균의 내 담즙산성 (bi le tolerance) 담즙산 (bi le acid)에 노출되었을 때 기능성 수화 히알루론산 3중코팅 유산균 과 히알루론산 3중 코팅 유산균군을 시험관 환경에서 비교하였다. 실험방법은 본 발명의 실시예 <6-3>와동일하게 진행하였다.
이에 대한 결과를 하기 표 10에 나타내었다.
【표 10]
기능성수화히알루론산 3중코팅유산균의 내담줍산성결과
Figure imgf000036_0001
상기 표 10에서 볼 수 있는 바와 같이, 5시간 담즙산에 노출하였을 때 기능 성 수화 히알루론산 3중 코팅 유산균의 내담즙산성을 히알루론산 3중 코팅 유산균 의 내담즙산성과 비교하였을 때， 70% 대의 유사한 생존율을 나타내었다. 이러한 결 과는 기능성 수화 히알루론산이 제조되는 과정 중 유산균을 보호하는 히알루론산 고유의 특성이 파괴 되지 않았기 때문으로사료된다.
<7-4> 기능성 수화 3중 코팅 유산균의 비경쟁 부착능 (Non- compet i t ive adhesion) 경쟁관계의 미생물이 존재하지 않은 상태에서 부착능을 비교하기 위해 상기 3중 코팅 유산균은 한국 등록특허 (제 10-1280232호)의 3중코팅 유산균 조제방법을 토대로 제조하였다. 또한 비경쟁적 부착능을 평가하기 위해 본 발명의 실시예 <6-4> 와 동일하게 실시하였다. 이에 대한 결과를 하기 표 11에 나타내었다.
하기 표 11에서 볼 수 있는 바와 같이 , 장점막과 유사한 Caco-2 eel I s에 대 한 부착능 평가시 비코팅 유산균보다 기능성 수화 히알루론산 및 히알루론산 3중코 팅 유산균의 부착효율이 상대적으로 우수하였으며， 기능성 수화 히알루론산 3중코 팅 유산균의 부착효율은 히알루론산 3중코팅 유산균과 비교해 전반적으로 더 향상 된 부착효율을 나타내었다.
【표 11】
기능성 수화 히알루론산 3중코팅 유산균의 비경쟁 부착능
Figure imgf000037_0001
<7-5> 기능성 수화 3중 코팅 유산균의 경쟁적 부착저해능 (Conroet i t ive exc lus ion)
기능성 수화 히알루론산 3중 코팅된 유산균이 장내에서 유익한 생리학적 활 성을 나타낼 수 있는지 여부를 보다 명확히 판단하기 위해서， 상재균이 존재하는 조건에서 유산균의 부착능을 평가하고자 본 발명의 실시예 <6-5>와 동일한 방법으 로실시하였다. 이에 대한 결과를 하기 표 12에 나타내었다.
하기 표 12에서 볼 수 있는 바와 같이， 장점막과 유사한 Caco-2 eel I s에 유 해균인 살모넬라 티피뮤리움 KCTC 2054를 먼저 부착 시킨 후, 비코팅 , 히알루론산 3중코팅， 기능성 수화 히알루론산 3중코팅된 유산균의 경쟁 유해균의 제거율을 비 교한 결과， 기능물질이 포함되지 않은 비코팅 유산균은 경쟁제거의 방법으로 살모 넬라 티피뮤리움 KCTC 2054를 제거하기 때문에 상대적으로 가장 낮은 제거효율을 보였으며, 기능성 수화 히알루론산 3중코팅된 유산균은 비코팅 및 히알루론산 3중 코팅 유산균보다 현저히 우수한유해균 제거효율을 나타냈다. 한편， 이러한 기능성 수화 히알루론산 3중코팅된 유산균의 효과는 락토바실 루스 아시도필루스 IDCC 3302의 결과만을 보더라도 비코팅 유산균보다는 51% 우수 한 효과를 나타내었고， 일반 히알루론산 3중코팅 유산균과 비교해도 27% 이상 우수 한 효과를 나타내는 것으로 확인되었다. 즉， 기능성 수화 히알루론산을 유산균의 코팅제로 사용한다면， 종래의 일반적인 유산균 코팅제들과 비교해 장내 유해균 저 해능이 현저히 향상된다는 것을 알수 있었다.
【표 12】
기능성 수화 히알루론산 3중코팅된 유산균의 경쟁적 부착저해능
Figure imgf000039_0001
Streptococcus thermoDhi lus 13 47 56
<7-6>기능성 수화 히앞루론산 3증 코팅 유산균의 in vivo장 정착성 기능성 수화 히알루론산 3중 코팅 유산균의 in vivo 장 정착성 실험을 위해 서 본 발명의 실시예 <6-6>과동일하게 실시하였다. 이에 대한 결과를 도 8에 나타내었다.
ᅳ도 8에서—볼 -수—았는 바와ᅳ같어7 비—코팅ᅳ유ᅳ산균보다ᅳ히알루론산ᅳ 3—중 코팅된 유산균과 기능성 수화 히알루론산 3중 코팅 유산균 투여군에서 투여 중단 후， 2.5 주까지 분변에서 락토바실루스 균이 검출되는 것을 확인할 수 있었으며 그 효과는 기능성 수화 히알루론산 3중코팅 유산균에서 가장우수한 것으로 확인되었다. 반면 비코팅 유산균은 투여 중단 후, 1주까지만 분변에서 락토바실루스 균이 검출되었으며, 기능성 수화 히알루론산 3중 코팅 유산균 그룹이 1.5주 더 연장되어 검출됨으로써 장 정착성이 가장우수한 것으로 확인되었다. 특히， 기능성 수화 히알루론산 3중코팅 유산균의 경우 경쟁적 배제 (compet i t ive exclusion)를 통한 장 점막의 부착뿐만 아니라， 증식 또한 활발해져 1x10 CFU 수준으로 락토바실루스 쏙 {Lactobacillus sp . )이 검출됨으로써 항생제 및 살모넬라 티피뮤리움으로 교란된 장내 균총 중 유익균을 증식시키는 역할을 하는 것으로 판단되었다.
<7-7> 기능성 수화 히알루론산 3중 코팅 유산균의 in vivo유해세균억제능
In r/ra에서 기능성 수화 히알루론산 3중 코팅 유산균의 유해세균 억제능을 확인하기 위해， 살모넬라 티피뮤리움 KCTC 2054를 감염시킨 마우스 모델에서 항균 력을 본 발명 실시예 <6-7>과 동일하게 실시하였다. 이에 대한 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에서 볼 수 있는 바와 같이， 장내 상재균총을 항생제로 억제시킨 후 살 모넬라 티피뮤리움 KCTC 2054로 감염시킨 마우스 모델에 비코팅 , 히알루론산 3중코 팅, 기능성 수화 히알루론산 3중 코팅 유산균 샘플을 투여한 결과， 단순경쟁 배제 역할을 하는 비코팅 , 히알루론산 3중 코팅된 유산균은 살모 넬라 티피뮤리움 KCTC 2054와 경쟁을 통해 생육을 억제함을 알 수 있었으며， 기능성 수화 히알루론산 3중 코팅 유산균이 더 효율적으로 오랜기간 살모넬라 티피뮤리움 KCTC 2054를 억제하는 것으로 확인되었다. 이러한 결과는 항생제와 경쟁균인 살모넬라 티피뮤리움 KCTC 2054로 교란된 마우스의 장내 균총을 항균작용과 경쟁배제 역할을 기능성 수화 히알루론산 3중코 팅된 유산균이 수행함으로써 유해균 증식은 항균력과 경쟁 배제의 원리로 낮추고 유익균의 증식을 늘림으로써 장내환경을 빠르게 정상화하는 것으로 확인되었다.
<실시예 8>
기능성 수화 히암루론산 4중코팅 유산규
<8-1> 기능성 수화 히알루론산 4증 코팅 유산균의 조제
본 발명에서는 한국 등특특허 (제 10- 1280232호)의 4중코팅 유산균 조제방법을 토대로 유산균의 표면박막코팅제이면서 1차 코팅제로 CMC— Na, 2차 코팅제로 상기 < 실시예 1〉에서 조제한 기능성 수화 히알루론산을 사용하고 3차 코팅제로 말토덱스 트린 (mal todextr in)을 사용하고 마지막 4차 코팅제로 유청단백으로 코팅하여 기능 성 수화 히알루론산 4중 코팅 유산균을 조제하였다. 대조군으로 기능성 수화 히알 루론산 대신 일반 히알루론산을 사용하여 히알루론산 4중 코팅 유산균을 조제하여 사용하였다.
<8-2>기능성 수화 히알루론산 4중 코팅 유산균의 내산성 (acid tolerance) 내산성은 인체의 소화기관 중 위 (stomach)에 유산균이 통과할 때 위산 (gastr i c jui ce)에 노출되게 되는데， 이와 유사한 환경을 시험관 조건에서 조성하 여 기능성 수화 히알루론산 4중 코팅 유산균과 히알루론산 4중 코팅 유산균의 내산 성을 생존율을 통해 비교하였다. 실험방법은 본 발명의 실시예 <6-2>와 동일하게 진행하였다.
이에 대한 결과를 하기 표 13에 나타내었다.
【표 13]
J
증산 51알루론산 4중코 g유산균의 내산성결과
pH 2.3 (xlOsCFU/g) pH 2.5 (xlOs CFU/g) 코¾
히알루 코¾
기능성
수회—
히알루
Figure imgf000042_0001
상기 표 13에 나타낸 바와 같이， 기능성 수화 히알루론산을 이용한 4중코팅 유산균의 내산성은 종래의 2중， 3중 코팅 유산균보다 높은 내산성을 나타내었으며， pH 2.5 조건에서 더 높은 내산성을 나타내었다. 이러한 결과는 4중코팅 유산균 본 래의 높은 내산성 효과에 기인한 것으로 판단되며， 기능성 수화 히알루론산 4중코 팅 유산균 또한 종래의 4중코팅 유산균의 내산성과 유사 패턴을 나타냄으로써 구조 적으로 안정한 형태임을 예상할수 있었다.
<8-3>기능성 수화 히알루론산 4중코팅 유산균의 내담즙산성 (bi le toleran ce)
담즙산 (bi le acid)에 노출되었을 때 기능성 수화 히알루론산 4중 코팅 유산 균과 히알루론산 4중 코팅 유산균의 생존율을 시험관 환경에서 비교하였다. 실험방 법은본 발명의 실시예 <6-3>와동일하게 진행하였다.
이에 대한 결과를 하기 표 14에 나타내었다.
【표 14】
기능성수화히¾루론산 4중코 g유산균의 내담줍산성결과
Figure imgf000044_0001
상기 표 14에 나타낸 바와 같이， 기능성 수화 히알루론산을 이용한 4중코팅 유산균의 내담즙산성에 대한 효과는 종래의 4중코팅 유산균과 큰 차이를 보이지 않 아구조적으로 안정한 형태를 유지하는 것으로 판단된다.
<8-4> 기능성 수화 히알루론산 4중코팅 유산균의 비경쟁 부착능 (Non¬ compet i t ive adhesion) 경쟁관계의 미생물이 존재하지 않은 상태에서 부착능을 비교하기 위해 상기
4중코팅 유산균은 한국 등록특허 (제 10-1280232호)의 4중코팅 유산균 조제방법을 토대로 제조하였다. 또한 비경쟁적 부착능을 평가하기 위해 본 발명의 실시예 <6-4〉 와동일하게 실시하였다. 이에 대한 결과를 하기 표 15에 나타내었다.
하기 표 15에서 볼 수 있는 바와 같이， 장점막과유사한 Cac으 2 eel Is에 대 한부착능 평가시 비코팅 유산균보다 히알루론산 4중코팅 유산균의 부착효율이 상 대적으로우수하였으며, 기능성 수화 히알루론산 4중코팅 유산균의 부착효율은 히 알루론산 4중코팅 유산균과동등한부착효율을 나타내었다.
【표 15】
기능성 수화 히알루론산 4중코팅된 유산균의 비경쟁 부착능
Figure imgf000045_0001
기능성 수화 히알루론산을 이용한 4중코팅 유산균의 단순 부착능은 코팅수에 따라 더 부착효율이 높아진 것을 확인할 수 있었다. 즉, 락토바실루스 아시도필루 스 IDCC 3302의 결과만을 평가해 봤을 때， 기능성 수화 히알루론산 2중코팅 유산균 (48% 부착율) , 기능성 수화 히알루론산 3중코팅 유산균 (56% 부착율)， 기능성 수화 히알루론산 4중코팅 유산균 (66% 부착율)로 코팅수에 따라 20%이상 부착율이 높아졌 다. 이러한 결과는 3차， 4차 코팅제인 말토덱스트린과 유청단백이 산성환경에 유산 균의 노출을 최소화하고 2차 코팅제 또한 일정시간 노출시간을 줄여줌으로써 점막 과의 상호작용을 최대화하였기 때문으로 예상된다.
<8-5> 기능성 수화 히알루론산 4중코팅 유산규의 경쟁적 부착저해능 (Compet it ive exclusion)
기능성 수화 히알루론산 3중 코팅된 유산균이 장내에서 유익한 생리학적 활 성을 나타낼 수 있는지 여부를 보다 명확히 판단하기 위해서, 상재균이 존재하는 조건에서 유산균의 부착능을 평가하고자 본 발명의 실시예 <6- 5>와 동일한 방법으 로실시하였다. 이에 대한 결과를 하기 표 16에 나타내었다.
하기 표 16에서 볼 수 있는 바와 같이 , 장점막과 유사한 Caco-2 eel Is에 유 해균인 살모넬라 티피뮤리움 KCTC 2054를 먼저 부착시킨 후, 비코팅， 히알루론산 4 중코팅， 기능성 수화 히알루론산 4중코팅된 유산균의 경쟁 유해균의 제거율을 비교 한 결과， 기능물질이 포함되지 않은 비코팅 유산균은 경쟁제거의 방법으로 살모넬 라 티피뮤리움 KCTC 2054를 제거하기 때문에 상대적으로 가장 낮은 제거효율을 보 였으며， 기능성 수화 히알루론산 4중코팅된 유산균은 비코팅 및 일반 히알루론산 4 중코팅 유산균보다 현저히 높은유해균 제거효율을 나타냈다. 한편, 이러한 기능성 수화 히알루론산 4중코팅된 유산균의 효과는 락토바실 루스 아시도필루스 IDCC 3302의 결과만을 보더라도 비코팅 유산균보다는 57% 우수 한 효과를 나타내었고, 일반 히알루론산 4중코팅 유산균과 비교해도 31% 이상 우수 한 효과를 나타내는 것으로 확인되었다. 즉, 기능성 수화 히알루론산을 유산균의 코팅제로 사용한다면， 종래의 일반적인 유산균 코팅제들과 비교해 장내 유해균 저 해능이 현저히 향상된다는 것을 알수 있었다.
【표 16】
기능성 수화 히알루론산 4중코팅된 유산균의 경쟁적 부착저해능
Figure imgf000047_0001
Streptococcus thermoohi lus 13 49 77 기능성 수화 히알루론산의 4중코팅 유산균의 경쟁적 부착저해능은 상기 실 시예 <8-4>에서 평가한 단순 부착능보다 효율이 30% 정도로 향상되었다. 이러한 결 과는 종래의 4중코팅 유산균이 경쟁배제를 통한 부착효율을 높여 증식한 것이라면, 기능성 수화 히알루론산 4중코팅 유산균은 경쟁배제를 항균력과 같이 접목함으로써 경쟁 균주인 살모넬라 티피뮤리움의 활성도를 낮춤으로써 부착기회를 늘렸기 때문 인 것으로 예상되었다.
<8-6> 기능성 수화 히암루론산 4중 코팅 유산균의 in vivo장 정착성 기능성 수화 히알루론산 3중 코팅 유산균의 in vivo장 정착성 실험을 위해 서 본 발명의 실시예 <6-6>과 동일하게 실시하였다. 이에 대한 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에서 볼 수 있는 바와 같이 , 비코팅 유산균보다 히알루론산 4중 코팅된 유산균과 기능성 수화 히알루론산 4중 코팅 유산균 투여군에서 투여 중단 후, 2.5 주까지 분변에서 락토바실루스 균이 검출되는 것을 확인할 수 있었으며 그 효과는 기능성 수화 히알루론산 4중 코팅 유산균에서 가장 우수한 것으로 확인되었다. 반면 비코팅 유산균은 투여 중단 후, 1주까지만 분변에서 락토바실루스 균이 검출되어， 기능성 수화 히알루론산 4중 코팅 유산균 그룹이 1.5주 더 연장 되어 검 출됨으로써 장 정착성이 상대적으로 우수한 것으로 확인되었다.
<8-7> 기능성 수화 히암루론산 4중 코팅 유산균의 in vivo 유해세균억제능
In 에서 기능성 수화 히알루론산 4중 코팅 유산균의 유해세균 억제능을 확인하기 위해， 살모넬라 티피뮤리움 KCTC 2054를 감염시킨 마우스 모델에서 항균 력을 본 발명 실시예 <6-7>과 동일하게 실시하였다. 이에 대한 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11에서 볼 수 있는 바와 같이, 장내 상재균총을 항생제로 억제시킨 후 살 모넬라 티피뮤리움 KCTC 2054로 감염시킨 마우스 모델에 비코팅， 히알루론산 4중코 팅,, 기능성 수화 히알루론산 4중코팅 산균 샘플을 투여한 결과， 단순경쟁 배제역 할을 하는 비코팅， 히알루론산 4중 코팅된 유산균은 살모넬라 티피뮤리움 KCTC 2054와 경쟁을 통해 생육을 억제함을 알 수 있었으며, 기능성 수화 히알루론산 4중 코팅 유산균이 더 효율적으로 오랜기간 살모넬라 티피뮤리움 KCTC 2054를 억제하는 것으로 확인되었다. 한편， 항균력과 생균의 경쟁배제 역할을 모두 갖춘 기능성 수화 히알루론산 4중코팅된 유산균은 살모넬라 티피뮤리움 KCTC 2054의 감염 후 처음부터 생육을 억 제함으로써 유산균이 유해균인 살모넬라 티피뮤리움 KCTC 2054의 영향을 덜 받게 해주어 유산균의 증식으로 개체수를 늘릴 수 있고 늘어난 유산균의 개체수로 인해 투여 중단 2.5주 후까지도 정상균총을 유지할 수 있도록 도와주었다.
<실시예 9>
전자현미경 (FE-SEM) 구조 분석
상기 실시예 1에서 조제한 기능성 수화 히알루론산 4중 코팅된 락토바실루스 아시도필루스 IDCC 3302의 성상을 조제공정에 따라 전자현미경 촬영을 통해 구조적 분석을 하였다. 기능성 수화 히알루론산 4중 코팅된 유산균 조제공정을 단계적으로 전자현미경 구조분석을 하여 도 12 내지 도 16 에 나타내었다 . 도 12 내지 도 16에 나타낸 바와 같이， 유산균에 CMC-Na를 흔합하는 경우에， 유산균체 표면을 CMC-Na가 필름과 같은 박막을 형성하면서 코팅된 것을 관찰할 수 있었다 (도 13) . 또한， CMC-Na와 기능성 수화 히알루론산이 흔합되면서 구조적으로 기능성 수화 히알루론산 구조가 더욱 조밀해지는 현상을 관찰할 수 있었으며 (도 14)， 다공성 입자인 말토덱스트린올 첨가하여 외부 수분과 온도가 쉽게 균체에 전 달되지 않게 하고 (도 15)， 마지막으로 유청단백으로 코팅을 진행하면서 균체가 외 부로 노출되지 않도록 하였다 (도 16) .
즉， 1차 내지 4차코팅제가순차적으로 첨가될수록 각각의 코팅제가유산균 을코팅하면서 보다조밀하고 견고하게 유산균이 보호되는 것을 확인할수 있었다.
【산업상 이용가능성】
본 발명의 기능성 수화 히알루론산은 유해균에 대해서는 증식 억제작용 및 유익균에 대해서는 증식 촉진 작용을 나타내어 선택적 길항작용을 나타내는 효과가 있으며， 본 발명의 방법으로 코팅된 4중 코팅된 유산균은 유산균에 수용성 폴리머， 기능성 수화 히알루론산， 다공성 입자를 가지는 코팅제， 단백질을 흔합하여 4중 코 팅함으로써， 종래 비코팅， 단일， 2중， 3중 및 4중 코팅 유산균에서는 나타나지 않 은 우수한 장 점막 부착능 및 유해세균에 대한 선택적 길항작용을 나타낼 뿐만 아 니라， 내산성 및 내담즙성도 매우 우수하여 유산균 본래의 생리활성 기능을 소실하 지 않는 효과가 있어 산업상 이용가능성이 매우 우수하다.

Claims

【청구의 범위】
【청구항 1】
유산균 배양액 100 중량부 대비 히알루론산을 0.001 증량부 내지 1 중량부의 비율로 첨가하고 교반하여 녹인후， 농축하는 방법에 의해 제조된 유산균 발효물질 이 포집된 기능성 수화 히알루론산.
【청구항 2】
제 1항에 있어서， 상기 유산균 배양액은 다음과 같은 단계에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 기능성 수화 히알루론산:
(a) 유산균 배양액을 110 내지 135°C에서 3 내지 7분간 가압열처리하는 단 계;
(b) 상기 (a) 단계에서 가압열처리된 배양액을 25 내지 35°C로 넁각하는 단 계;
(c) 상기 (b)단계에서 냉각된 배양액을 105 내지 115°C에서 8 내지 12분간 가압열처리하는 단계 ;
(d) 상기 (c) 단계에서 가압열처리된 배양액을 25 내지 35°C로 넁각하는 단 계;
(e) 상기 (d) 단계에서 넁각된 배양액을 75 내지 85°C에서 20 내지 40분간 열처리한후 25 내지 35°C로 최종넁각하는 단계.
【청구항 3】
제 1항 또는 제 2항에 있어서， 상기 유산균은 락토바실루스 쏙 {Lactobacillus sp.), 비피도박테리움 쏙 Bifidobacterium sp.), 스트렙토코커스 녹 {Streptococcus sp.), 락토코커스 속 Lactococcus sp.), 엔테로코커스 쏙 Enterococcus sp.), 페디 오코커스
Figure imgf000050_0001
sp.) 류코노스록 쏙 Leuconostoc sp.), 바이셀라 속 {¥eissella sp.)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유산균인 것을 특징으로 하는 기능성 수화 히알루론산.
【청구항 4】
제 1항 또는 제 2항의 기능성 수화 히알루론산으로 코팅된 유산균.
【청구항 5】 (a) 유산균에 수용성 폴리머를 흔합하여 1차 코팅하는 단계;
(b) 상기 (a)단계에서 1차 코팅된 유산균에 제 1항의 기능성 수화 히알루론산 을 흔합하여 2차 코팅하는 단계；
(c) 상기 (b)단계에서 2차 코팅된 유산균에 다공성 입자를 가지는 코팅제를 흔합하여 3차코팅하는 단계 ; 및
(d) 상기 (c)단계에서 3차 코팅된 유산균에 단백질을 흔합하여 4차 코팅하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 4중 코팅된 유산균의 제조방법.
【청구항 ,6】
제 5항에 있어서, 상기' (a)단계에서 수용성폴리머는 카르복시더 Ϊ틸셀를로오스 (carboxymethyl eel lulose,CMC) , 하이드록시에틸셀를로오스
(hydroxyethylcellulose.HEC), 잔탄검 (xanthan gum, XG), 구아검 (guar gum,GG), 폴 리비닐피를리돈 (polyvinylpyrroridone, PVP), 카보폴 (carbopol )， 소듐알기네이트 (sodium alginate), 프로필렌 글리콜 알기네이트 (propylene glycol alginate)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 4중 코팅된 유산균의 제 조방법 .
【청구항 7】
제 5항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 기능성 수화 히알루론산은 유산균 배양 액 100 중량부 대비 히알루론산을 0.001 중량부 내지 1 중량부의 비율로 첨가하고 교반하여 녹인후 30 내지 60°C에서 감압농축하는 방법에 의해 제조된 유산균 발효 물질이 포집된 것임을 특징으로 하는 4증 코팅된 유산균의 제조방법.
【청구항 8】
제 5항에 있어서, 상기 (c)단계에서 다공성 입자를 가지는 코팅제는 알지네이 트 (alginate), 말토덱스트린 (maltodextrin,MD)， 키토산 (chitosan)， 전분 (starch), 폴리에틸렌글리콜 (polyethyleneglycol, PEG), 트리아세틴 (triacet in) , 프로필렌 글 리콜 (propylene glycol), 아세틸트리에틸 시트레이트 (acetyl triethyl citrate), 트리에틸 시트레이트 (triethyl citrate), 또는 글리세린 (glycerin)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 4중 코팅된 유산균의 제조방법.
【청구항 9] 제 5항에 있어서， 상기 (d)단계에서 단백질은 탈지분유， 유청단백, 분리대두 단백으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 4중 코팅된 유 산균의 제조방법 .
【청구항 10】
제 5항에 있어서 , 상기 유산균은 락토바실루스 쏙 LactobaciUus sp.), 비피 도박테리움
Figure imgf000052_0001
sp.), 스트렙토코커스 쏙 Streptococcus sp.), 락 토코커스 쏙 actococcus sp.), 엔테로코커스 속 Enterococcus sp.), 페디오코커스 ^{Pediococcus sp.), 류코노스톡 ^-{Leuconostoc sp.), 이셀라 ^-{Weissella sp.)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 4중 코팅된 유 산균의 제조방법 .
【청구항 111
제 5항에 있어서, 상기 (a)단계에서 상기 수용성 폴리머는 유산균 배양액 100 증량부 대비 0.1중량부 내지 10중량부의 비율로 흔합하여 1차 코팅하는 단계;
상기 (b)단계에서 상기 히알루론산은 유산균 배양액 100 중량부 대비 0.001 중량부 내지 0.5중량부의 비율로 흔합하여 2차 코팅하는 단계;
상기 (c)단계에서 상기 다공성 입자를 가지는 코팅제는 유산균 배양액 100 중량부 대비 0.1중량부 내지 10중량부의 비율로 흔합하여 3차 코팅하는 단계; 및 상기 (d)단계에서 상기 단백질은 유산균 배양액 100 중량부 대비 1중량부 내 지 30중량부의 비율로 흔합하여 4차 코팅하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 4중 코팅된 유산균의 제조방법.
【청구항 12】
제 5항의 제조방법으로 제조된 4중 코팅된 유산균. 【청구항 13】
제 12항에 있어서， 상기 유산균은 락토바실루스 쏙 {Lactobacillus . )， 비피 도박테리움 ^ Bifick)bactenum sp.), 스트랩토코커스 쏙 Streptococcus sp.), 락 토코커스 쏙 actococcus sp.), 엔테로코커스 속 Enterococcus sp.), 페디오코커스 ^■{Pediococcus sp.), 류코노스록 ^-{Leuconostoc sp.), 이셀라 ^-{Weissel la sp.)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 4중 코팅된 유
IS
Sll70lO/9lOZaM/X3d
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DK16846919.5T DK3351618T3 (da) 2015-09-14 2016-09-19 Funktionel hydreret hyaluronsyre og fremgangsmåde til fremstilling af belagte mælkesyrebakterier med fremragende intestinal mycoadhæsiv evne og selektiv antagonistisk virkning under anvendelse deraf
EP16846919.5A EP3351618B1 (en) 2015-09-14 2016-09-19 Functional hydrated hyaluronic acid and method for producing coated lactic acid bacteria having excellent intestinal mucoadhesive ability and selective antagonistic action using same
BR112018004949A BR112018004949A8 (pt) 2015-09-14 2016-09-19 Ácido hialurônico hidratado funcional, bactérias do ácido láctico e método para preparar uma bactéria do ácido láctico quadruplamente revestida
JP2018533599A JP6876705B2 (ja) 2015-09-14 2016-09-19 機能性水和ヒアルロン酸及びこれを利用した優れた腸粘膜付着能及び選択的拮抗作用を有するコーティング乳酸菌の製造方法
US15/760,166 US10894086B2 (en) 2015-09-14 2016-09-19 Functional hydrated hyaluronic acid and method for producing coated lactic acid bacteria having excellent intestinal mucoadhesive ability and selective antagonistic action using same
CN201680066522.9A CN108779431B (zh) 2015-09-14 2016-09-19 功能性水合透明质酸及其制备具优良肠粘膜粘附能力和选择性拮抗作用的包衣乳酸菌的方法

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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109652335A (zh) * 2019-01-10 2019-04-19 山东晨彰生物科技有限公司 一种饲用固态乳酸菌高活性菌剂的制备方法
CN112375696A (zh) * 2020-06-27 2021-02-19 石河子大学 一种驴乳源戊糖片球菌及其应用

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102139024B1 (ko) 2020-02-24 2020-07-28 에스케이바이오랜드 주식회사 용암해수 유래 소수성 단백질 코팅 파라프로바이오틱스의 제조방법 및 이를 이용하여 제조한 면역활성이 우수한 용암해수 유래 소수성 단백질 코팅 파라프로바이오틱스와 면역증강용 조성물
KR102009731B1 (ko) 2019-04-15 2019-08-12 주식회사 쎌바이오텍 단백질 가수분해물을 이용한 단백질-다당류 이중코팅 유산균의 제조방법
US11141442B2 (en) 2019-06-06 2021-10-12 Compound Solutions, Inc. Tributyrin compositions and methods therefor
KR102149102B1 (ko) * 2019-07-05 2020-08-27 에스케이바이오랜드 주식회사 피부보습 및 피부재생 기능이 있는 더모바이오틱스 블록 조성물의 제조방법
CN110878266B (zh) * 2019-11-21 2021-04-20 中国农业科学院兰州兽医研究所 一株约氏乳杆菌及其用途
CN112772903B (zh) * 2021-01-18 2021-11-26 欧麦香（福建）食品有限公司 一种乳酸菌发酵液及其应用
KR20230071305A (ko) 2021-11-16 2023-05-23 주식회사 에치와이 셀레늄을 이용한 유산균 코팅 공법
KR102430949B1 (ko) * 2021-12-08 2022-08-11 일동바이오사이언스(주) 생산성과 안정성이 우수한 다중코팅 유산균

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20090082035A (ko) * 2008-01-25 2009-07-29 정명준 3중 코팅 유산균의 제조방법 및 나노 입자 코팅 방법, 그방법으로 제조된 3중 코팅 유산균 및 이를 포함하는 제품
KR20120046676A (ko) * 2010-11-02 2012-05-10 주식회사 쎌바이오텍 다중 코팅층을 갖는 유산균 및 이의 제조방법
KR20120047792A (ko) * 2010-11-04 2012-05-14 주식회사 쎌바이오텍 항균용 유산균 사균체 및 이의 제조방법
KR20130067682A (ko) * 2011-12-14 2013-06-25 일동제약주식회사 4중 코팅 유산균의 제조방법 및 그 방법으로 제조된 4중 코팅 유산균
KR20130143229A (ko) * 2012-06-21 2013-12-31 일동제약주식회사 틴달화 락토바실루스 아시도필루스 사균체 조제방법

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1273838A (zh) * 2000-04-26 2000-11-22 济南三株药业有限公司 含有死的益生菌共生发酵培养物的营养组合物
JP3711377B2 (ja) * 2001-01-31 2005-11-02 共栄化学工業株式会社 乳化剤及び乳化化粧料並びにその製造法
KR100782984B1 (ko) * 2006-04-21 2007-12-07 (주)케비젠 유산균 다중 마이크로캡슐의 제조방법, 이 방법에 의해제조된 마이크로캡슐 및 이를 포함하는 제품
SE533700C2 (sv) 2009-03-24 2010-12-07 Transic Ab Bipolär transistor i kiselkarbid
JP2011115541A (ja) * 2009-10-30 2011-06-16 Toshiba Corp 回転清掃体ユニット、吸込口体および電気掃除機
KR101365063B1 (ko) * 2012-06-21 2014-02-19 곽장해 방화문 프레임
CN103571767B (zh) * 2012-07-26 2016-03-02 细胞生物技术公司 利用食用琼脂的双重涂布乳酸菌粉及其制备方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20090082035A (ko) * 2008-01-25 2009-07-29 정명준 3중 코팅 유산균의 제조방법 및 나노 입자 코팅 방법, 그방법으로 제조된 3중 코팅 유산균 및 이를 포함하는 제품
KR20120046676A (ko) * 2010-11-02 2012-05-10 주식회사 쎌바이오텍 다중 코팅층을 갖는 유산균 및 이의 제조방법
KR20120047792A (ko) * 2010-11-04 2012-05-14 주식회사 쎌바이오텍 항균용 유산균 사균체 및 이의 제조방법
KR20130067682A (ko) * 2011-12-14 2013-06-25 일동제약주식회사 4중 코팅 유산균의 제조방법 및 그 방법으로 제조된 4중 코팅 유산균
KR20130143229A (ko) * 2012-06-21 2013-12-31 일동제약주식회사 틴달화 락토바실루스 아시도필루스 사균체 조제방법

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP3351618A4 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109652335A (zh) * 2019-01-10 2019-04-19 山东晨彰生物科技有限公司 一种饲用固态乳酸菌高活性菌剂的制备方法
CN112375696A (zh) * 2020-06-27 2021-02-19 石河子大学 一种驴乳源戊糖片球菌及其应用

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