CN113766923A

CN113766923A - 益生菌生物膜组合物及其制备方法

Info

Publication number: CN113766923A
Application number: CN202080031956.1A
Authority: CN
Inventors: D·达布什; D·罗茨纳; S·科恩; H·埃利亚胡
Original assignee: Mybiotics Pharma Ltd
Current assignee: Mybiotics Pharma Ltd
Priority date: 2019-03-28
Filing date: 2020-03-29
Publication date: 2021-12-07
Also published as: SG11202110741YA; AU2020250170A1; EP3946392A4; CA3131165A1; WO2020194319A1; BR112021019437A2; IL286704A; KR20220016042A; EP3946392A1; MX2021011628A; JP2022535323A

Abstract

本发明涉及包括生物膜形式的益生菌的组合物，其中生物膜包括至少两种细菌种类。进一步提供了使用本发明的组合物的方法及其制备方法。

Description

益生菌生物膜组合物及其制备方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2019年3月28日提交的名称为“PROBIOTIC BIOFILM SUPPOSITORIES”的美国专利申请号16/368,030和2019年4月2日提交的名称为“BIOFILM COMPOSITIONS ANDMETHODS OF PREPARING SAME”的美国临时专利申请号62/827,931的优先权，其内容通过引用以其整体并入本文。

技术领域

本发明涉及益生菌递送领域。

背景技术

健康的微生物群需要细菌定殖，这为宿主提供多种益处，包括对广谱病原体的抗性、必需营养素的生物合成和吸收、以及维持健康肠道上皮和适当控制的全身免疫的免疫刺激。在生态失调或共生破坏的环境中，微生物群功能可能会丧失或紊乱，导致对病原体的易感性增加、代谢特征谱改变或诱导会导致局部或全身炎症或自身免疫的促炎信号。

就每年受感染的女性人数而言，泌尿生殖系统感染，比如酵母菌性阴道炎、细菌性阴道病和尿路感染仍然是一个主要的医学问题。这些疾病会影响与生殖系统相关的器官和组织。

对于40岁以下的所有女性，微生物群主要以乳酸杆菌为代表，在女性泌尿生殖道病理并发症中，微生物群落的微生物组成的特征在于乳酸杆菌数量减少，并且被病原性厌氧微生物替代。以乳酸杆菌减少为特征的阴道菌群变化似乎是引起细菌性阴道病综合征的主要因素。

尽管抗微生物治疗在根除这些感染方面通常是有效的，但是复发率仍然很高。患者的生活质量受到影响，许多女性对循环反复使用抗微生物药剂感到沮丧，由于微生物耐药性的增加，抗微生物药剂的有效性正在下降。

具有定殖阴道组织能力的乳杆菌菌株的定期施用可以是该问题的替代方案。已经显示，通过同时使用抗生素和益生菌的治疗可以获得有希望的结果。

下生殖道中最常见的乳杆菌属为惰性乳杆菌、卷曲乳杆菌、詹氏乳杆菌和加氏乳杆菌。近年来，多项研究指出乳杆菌在维持阴道健康和预防生殖道感染方面的重要作用。卷曲乳杆菌对结肠炎的有益作用也有报道。

然而，在众多研究中已经充分证实，商业益生菌——浮游生物粉和发酵食品的补充剂对健康影响很小甚至没有影响，并且缺乏将活菌直接输送到直肠区域或阴道区域的能力。

需要一种阴道栓剂制剂，其中益生菌在阴道条件下是有活力的，能够粘附到阴道上皮细胞以成功定殖。此外，重要的是，这种制剂对治疗中使用的常见抗生素具有抗性。

发明内容

根据第一方面，提供了一种组合物，其包括第一亲脂性载体、干燥生物膜形式的共培养益生菌——其包括卷曲乳杆菌和选自以下的至少一种另外的细菌种类：加氏乳杆菌、詹氏乳杆菌和鼠李糖乳杆菌，以及第一药剂，其包括：抗生素剂、pH调节剂或两者。

根据另一方面，提供了一种组合物，其包括：干燥生物膜形式的共培养益生菌，其包括：(i)普氏粪杆菌和选自以下的至少一种另外的细菌种类：卵形布劳特氏菌(Blautiaobeum)、球形布劳特氏菌(Bl.coccoides)、普通拟杆菌(Bacteroides vulgatus)和产甲酸多尔氏菌(产甲酸真杆菌)(Dorea(Eubacterium)formicigenerans)；(ii)卷曲乳杆菌和选自以下的至少一种另外的细菌种类：加氏乳杆菌、詹氏乳杆菌和鼠李糖乳杆菌；或(iii)青春双歧杆菌和选自以下的至少一种另外的细菌种类：长双歧杆菌长亚种和短双歧杆菌。

根据另一方面，提供一种用于调节有需要的受试者的菌群的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的本文公开的组合物，从而调节受试者的菌群。

根据另一方面，提供了一种制备本文公开的组合物的方法，方法包括以下步骤：(a)用卷曲乳杆菌接种包括颗粒的生长培养基；(b)将来自步骤(a)的颗粒与卷曲乳杆菌在适合于允许卷曲乳杆菌附着在颗粒上的条件下一起温育；(c)用至少一种另外的细菌种类接种步骤(b)的颗粒；以及(d)在适合于形成包括卷曲乳杆菌和至少一种另外的细菌种类的生物膜的条件下培养步骤(c)的接种的颗粒。

根据另一方面，提供了一种制备本文公开的组合物的方法，其包括以下步骤：

-用选自以下的第一细菌接种包括颗粒的生长培养基：(i)卷曲乳杆菌；(ii)青春双歧杆菌；(iii)普氏粪杆菌；

-在适合于允许第一细菌附着在颗粒上的条件下将颗粒与第一细菌一起温育；

-用至少一种另外的细菌种类接种颗粒；和

-在适合于形成包括以下的生物膜的条件下培养接种的颗粒：(i)卷曲乳杆菌；(ii)青春双歧杆菌；或(iii)普氏粪杆菌，和至少一种另外的细菌种类。

在一些实施方式中，干燥生物膜形式的共培养益生菌和包括抗生素剂的第一药剂均匀地分散在组合物中。

在一些实施方式中，干燥生物膜形式的共培养益生菌为总组合物的10％至50％(w/w)。

在一些实施方式中，干燥生物膜形式的共培养益生菌附着于颗粒。

在一些实施方式中，颗粒选自：种子、MCC、磷酸二钙、多糖及其任意组合。

在一些实施方式中，组合物进一步包括第二层。

在一些实施方式中，第二层包括第二亲脂性载体、第二药剂或两者。

在一些实施方式中，干燥生物膜形式的共培养益生菌的释放比第二药剂的释放慢。

在一些实施方式中，第一药剂和第二药剂中的任一种是抗生素。

在一些实施方式中，组合物用于治疗细菌性阴道病。

在一些实施方式中，组合物进一步包括稳定剂、防腐剂、润滑剂、粘度改性剂、缓冲剂、脂肪酸及其组合。

在一些实施方式中，组合物配制用于选自以下的递送途径：口服、阴道、直肠和局部。

在一些实施方式中，组合物是栓剂的形式。

在一些实施方式中，菌群是阴道菌群、肠道菌群或皮肤菌群。

在一些实施方式中，方法用于在有需要的受试者中预防或治疗与生态失调相关的病症或肠道或代谢疾病。

在一些实施方式中，生态失调相关病症或肠道和代谢疾病选自：细菌性阴道病、泌尿生殖道感染、溃疡性结肠炎、炎性肠病(IBD)、克罗恩病、结肠直肠癌、肥胖症、和乳糜泻。

在一些实施方式中，受试者患有细菌性阴道病、泌尿生殖道感染、生态失调、溃疡性结肠炎、炎性肠病(IBD)、克罗恩病或其任意组合，或处于发展上述疾病的风险。

在一些实施方式中，当第一细菌是卷曲乳杆菌时，至少一种另外的细菌种类选自：詹氏乳杆菌、加氏乳杆菌和鼠李糖乳杆菌。

在一些实施方式中，当第一细菌是青春双歧杆菌时。至少一种另外的细菌种类选自：长双歧杆菌长亚种和短双歧杆菌。

在一些实施方式中，当第一细菌是普氏粪杆菌时，至少一种另外的细菌种类选自：卵形布劳特氏菌、球形布劳特氏菌、普通拟杆菌和产甲酸多尔氏菌(产甲酸真杆菌)。

在一些实施方式中，第一细菌是普氏粪杆菌，并且接种步骤同时进行。

除非另有定义，本文使用的所有技术和/或科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管在本发明的实施方式的实践或测试中可以使用与本文所述的那些方法和材料相似或等效的方法和材料，但下文描述了示例性方法和/或材料。如果发生冲突，以专利说明书(包括定义)为准。此外，材料、方法和实施例仅是说明性的，并不旨在进行必要的限制。

从下文给出的详细描述中，本发明的其他实施方式和全部适用范围将变得显而易见。然而，应当理解，详细说明和具体实施例，虽然表明了本发明的优选实施方式，但仅作为说明给出，因为根据详细描述，在本发明的精神和范围内的各种变化和更改对于本领域技术人员来说将变得显而易见。

附图说明

图1A-1G呈现表1中呈现的不同栓剂制剂的照片(图1A-1F)，以及使用生物膜形式的细菌优化生物膜中细菌生长而进行的实验设计和测定的图以及以生物膜发育阶段的形式评估细菌。在pH抗性测定中使用pH 3.5确定为具有接近女性阴道中普遍存在的pH值(pH4 5)。还确定了浮游生物细菌对耐药性测定的敏感性，随后将结果与生物膜形式的细菌进行比较。CFU，菌落形成单位(图1G)。

图2呈现了惰性乳杆菌浮游生物细菌的耐酸性条形图。

图3呈现了在小规模设置中生长后生物膜形式的惰性乳杆菌的耐酸性的条形图。检查了需氧和厌氧条件以及曝气条件(静止与搅拌)。

图4呈现了在中等规模设置中生长后生物膜形式的惰性乳杆菌的耐酸性的条形图。

图5呈现了在中等规模设置中生长后生物膜形式的惰性乳杆菌的抗生素抗性的条形图。“对照”是指未暴露于抗生素的生物膜形式的细菌。x轴中的数字是以μg/mL为单位的抗生素浓度。

图6呈现了詹氏乳杆菌的浮游生物细菌的耐酸性条形图。

图7呈现了在小规模设置中生长后生物膜形式的詹氏乳杆菌的耐酸性条形图，同时检查了两种搅拌速度(70和130rpm)。

图8呈现了在中等规模设置中生长后生物膜形式的詹氏乳杆菌的耐酸性条形图，同时检查了两种搅拌速度(70和130rpm)。

图9呈现了在中等规模设置中生长后生物膜形式的詹氏乳杆菌的抗生素抗性的条形图。‘Ctrl’是指未暴露于抗生素的生物膜形式的细菌。x轴中的数字是以μg/mL为单位的抗生素浓度。

图10呈现了卷曲乳杆菌的浮游生物细菌的耐酸性条形图。

图11呈现了在小规模设置中生长后生物膜形式的卷曲乳杆菌的耐酸性的条形图，同时检查了搅拌和非搅拌条件。

图12呈现了在中等规模设置中生长后生物膜形式的卷曲乳杆菌的耐酸性条形图。

图13呈现了在中等规模设置中生长后生物膜形式的卷曲乳杆菌的抗生素抗性的条形图。‘Ctrl’是指未暴露于抗生素的生物膜形式的细菌。x轴中的数字是以μg/mL为单位的抗生素浓度。

图14呈现了加氏乳杆菌浮游生物细菌的耐酸性条形图。

图15呈现了在小规模设置中生长后生物膜形式的加氏乳杆菌的耐酸性的条形图，同时检查了两种搅拌速度(70和130rpm)。

图16呈现了在中等规模设置中生长后生物膜形式的加氏乳杆菌的耐酸性的条形图。

图17呈现了在中等规模设置中生长后生物膜形式的惰性乳杆菌的抗生素抗性的条形图。“Ctrl”是指未暴露于抗生素的生物膜形式的细菌。x轴中的数字是以μg/mL为单位的抗生素浓度。

图18呈现了鼠李糖乳杆菌的浮游生物细菌的耐酸性的条形图。

图19呈现了在小规模设置中生长后生物膜形式的鼠李糖乳杆菌的耐酸性的条形图，同时检查了两种搅拌速度(70和130rpm)。

图20呈现了在中等规模设置中生长后生物膜形式的鼠李糖乳杆菌的耐酸性的条形图。

图21呈现了在中等规模设置中生长后生物膜形式的鼠李糖乳杆菌抗生素抗性的条形图。‘Ctrl’是指未暴露于抗生素的生物膜形式的细菌。x轴中的数字是以μg/mL为单位的抗生素浓度。

图22呈现了蔓越莓对以生物膜形式在栓剂中存活两个月的细菌的影响的条形图。“cran”是指蔓越莓；“supp”是指栓剂。

图23呈现了在栓剂中1和3个月后以生物膜形式的湿细菌和干细菌存活的条形图。

图24呈现了在栓剂中生物膜形式的植物乳杆菌细菌的存活条形图，该栓剂含有分别为1:5或1:10的不同比例的生物膜形式的细菌:赋形剂。赋形剂由两种油基载体、植物油和可可油组成。“supp”是指栓剂。

图25呈现了不同颗粒对生物膜形式的加氏乳杆菌细菌生长的影响的条形图。

图26呈现了比较包括彼得斯安(Pentasa)与生物膜形式的细菌的组合的栓剂制剂的稳定性的条形图。“supp A”是指加氏乳杆菌和鼠李糖乳杆菌生物膜。“supp B”是指具有彼得斯安的加氏乳杆菌和鼠李糖乳杆菌生物膜。

图27呈现了从共培养实验中获得的鼠李糖乳杆菌(LRh)、詹氏乳杆菌(LJ)和加氏乳杆菌(LG)的菌落形态的图片。在平板接种到MRS琼脂平板上进行CFU计数之前，通过涡旋将细菌细胞从生物膜中释放出来。

图28A-28B呈现了细菌菌株共培养的条形图。在单独和一起菌株生长之间比较细菌种群生长和生物膜发育(pH抗性)。虚线是细菌抗性的阈值；在这一点之上存活的细菌种群被认为对所测试的治疗具有抗性。(28A)呈现了詹氏乳杆菌(LJ)与鼠李糖乳杆菌(LRh)共培养的条形图，(28B)呈现了加氏乳杆菌(LG)与鼠李糖乳杆菌(LRh)共培养的条形图。

图29呈现了从共培养实验获得的鼠李糖乳杆菌(LRh)、詹氏乳杆菌(LJ)、加氏乳杆菌(LG)和卷曲乳杆菌(LCr)的菌落形态的图片。在平板接种到MRS琼脂平板上进行CFU计数之前，通过涡旋将细菌细胞从生物膜中释放出来。细菌菌落的图像取自琼脂平板。

图30A-30B呈现了三种或四种细菌菌株共培养的条形图。将共培养(当前实验)中每个菌株的细菌种群生长和生物膜发育(pH抗性)与其单独生长(以前的实验)进行比较。虚线是细菌抗性的阈值；在这一点之上存活的细菌种群被认为对所测试的治疗具有抗性。(30A)呈现了鼠李糖乳杆菌(LRh)、詹氏乳杆菌(LJ)和加氏乳杆菌(LG)共培养的条形图，(30B)呈现了鼠李糖乳杆菌(LRh)、詹氏乳杆菌(LJ)、加氏乳杆菌(LG)、卷曲乳杆菌(LC)共培养的条形图。

图31呈现了显示加氏乳杆菌(LG)细菌种群对各种粒度的亲和力的条形图。

图32A-32C呈现了不同pH水平以及基于动物和基于非动物的生长培养基对LCr(32A)、LG(32B)和LJ(32C)培养物的生长和发育状态的影响的条形图。

图33A-33C呈现了基于动物的培养基和基于非动物1的培养基对LG(33A)、LRh(33B)和LCr(33C)细菌种群的生长和发育(pH和抗生素抗性)的影响的条形图。虚线是细菌抗性的阈值；在这一点之上存活的细菌种群被认为对测试的治疗具有抗性。

图34呈现了垂直条形图，其显示当与长双歧杆菌长亚种(BLL)和短双歧杆菌(BfBr)共培养72h后青春双歧杆菌(BfA)与其单独生长相比具有改善的生长。

图35呈现了显示当与BfB共培养24小时和72小时后BfA与其单独生长相比具有改善的生长。

图36呈现了显示当在添加BLL、动物双歧杆菌(BB-12)和BfBr之前24h添加BfA时，BfA具有更高的相对丰度(RA)的垂直条形图。BfA与BLL和BfBr(‘对照’)平行添加或在添加BLL和BfBr之前24h添加(‘BfA的优势’)。

图37A-37B呈现了显示与和其他双歧杆菌种类(‘对照’)平行添加BfA相比，在添加BLL、BB-12和BfBr之前24h添加BfA(‘BfA的优势’)时，BfA的生长改善(～1对数差异)的垂直条形图。相对丰度值(在图36中)标准化为细菌计数(对数标度)。

图38A-38B呈现了显示与和其他双歧杆菌种类(‘对照’)平行添加BfA相比，在添加BLL、BB-12和BfBr之前24小时添加BfA(‘BfA的优势’)时，BfA的生长改善(～1对数差异)的垂直条形图。相对丰度值(在图36中)标准化为细菌计数(CFU/mL)。

图39呈现了显示与其单独生长相比，当与卵形布劳特氏菌(BlO)、球形布劳特氏菌(BlC)或二者共培养时，普氏粪杆菌(FaP)显示改善的生长的垂直条形图。

图40呈现了显示与其单独的生长相比，当与普通拟杆菌(BaV)或BaV和普氏粪杆菌(DoF)共培养时，FaP表现出改善的生长的垂直条形图。

图41呈现了显示当与青春双歧杆菌(BfA)或多形拟杆菌(BaT)共培养时，FaP显示出改善的生长的垂直条形图。

图42呈现了显示与FaP仅与梭菌属共培养的生长(左栏)相比，其与拟杆菌属共培养(右栏)共培养时，观察到FaP生长的明显优势的垂直条形图。

图43A-43B呈现了显示在生长72小时期间，与浮游生物部分(43A)相比，FaP在生物膜(43B)中具有更高的相对丰度(RA)的垂直条形图。

具体实施方式

根据一些实施方式，本发明提供了一种组合物，其包括至少一种生物膜形式的细菌。

在一些实施方式中，生物膜是干燥生物膜的形式或粉末生物膜的形式。在一些实施方式中，生物膜是生物膜颗粒。

如本文所用，术语“生物膜颗粒”是指生物膜形式和颗粒形式的细菌(例如，益生菌)。

在一些实施方式中，组合物包括多种细菌。在一些实施方式中，多种是大于1的任何整数，例如，至少2、至少3、至少4、至少5、至少6等，或其间的任何值和范围。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。

在一些实施方式中，组合物中的至少一种细菌产生生物膜。在一些实施方式中，组合物中的所有细菌都产生生物膜。

在一些实施方式中，组合物包括浮游生物细菌。在一些实施方式中，浮游生物细菌不产生生物膜。在一些实施方式中，与产生生物膜的细菌相比，浮游生物细菌产生少量的生物膜。

在一些实施方式中，组合物包括浮游生物细菌和产生生物膜的细菌，其中浮游生物细菌粘附、截留、合并或嵌入在由产生生物膜的细菌产生的生物膜之下、之上或之内。

在一些实施方式中，本文公开的生物膜形式的益生菌包括浮游生物细菌和生物膜形式的细菌的混合物。

生物膜组合物

根据一些实施方式，提供了一种组合物，其包括第一亲脂性载体、干燥生物膜形式的共培养益生菌，其包括卷曲乳杆菌和选自以下的至少一种另外的细菌种类：加氏乳杆菌、詹氏乳杆菌和鼠李糖乳杆菌，以及第一药剂，其包括：抗生素剂、pH调节剂或两者。

根据一些实施方式，组合物包括生物膜形式的细菌，其包括：普氏粪杆菌和选自以下的至少一种另外的细菌种类：卵形布劳特氏菌、球形布劳特氏菌、普通拟杆菌、产甲酸多尔氏菌(产甲酸真杆菌)或其任意组合。

根据一些实施方式，组合物包括生物膜形式的细菌，其包括：卷曲乳杆菌和选自以下的至少一种另外的细菌种类：加氏乳杆菌、惰性乳杆菌、詹氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌或其任意组合。

根据一些实施方式，组合物包括生物膜形式的细菌，其包括：青春双歧杆菌和选自以下的至少一种另外的细菌种类：长双歧杆菌长亚种、短双歧杆菌及其组合。

如本文所用，术语“益生菌”是指有益的或需要的细菌菌株，其还可以刺激其他微生物的生长，尤其是具有有益特性的那些(比如，阴道菌群和肠道菌群的那些)。

在一些实施方式中，生物膜包括至少一种源自阴道微生物群的细菌菌株。在一些实施方式中，至少一种源自阴道微生物群的细菌菌株是益生菌。

在一些实施方式中，生物膜包括至少一种源自肠道微生物群的细菌菌株。在一些实施方式中，至少一种源自肠道微生物群的细菌菌株是益生菌。

在一些实施方式中，生物膜包括至少一种源自结肠的细菌菌株。在一些实施方式中，生物膜包括至少一种源自胃的细菌菌株。在一些实施方式中，生物膜包括至少一种源自小肠的细菌菌株。

在一些实施方式中，至少一种益生菌选自乳杆菌属、双歧杆菌属、酵母菌属、肠球菌属、链球菌属、粪杆菌属、片球菌属、明串珠菌属、芽孢杆菌属、大肠杆菌属或其任意组合。

肠源菌株的非限制性实例包括鼠李糖乳杆菌GG(LGG)、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、乳双歧杆菌、短双歧杆菌、长双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、粪肠球菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、弗氏丙酸杆菌、短双歧杆菌、罗伊氏乳杆菌、唾液乳杆菌、婴儿双歧杆菌、嗜热链球菌和普氏粪杆菌。

在一些实施方式中，生物膜包括至少一种乳杆菌细菌菌株。乳杆菌的非限制性实例包括卷曲乳杆菌、加氏乳杆菌、惰性乳杆菌、詹氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、鼠李糖乳杆菌GG、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、副干酪乳杆菌、德氏乳杆菌属保加利亚乳杆菌亚种(Lactobacillus delbrueckii ssp.Bulgaricus)。

在一些实施方式中，益生菌可定殖阴道组织。在一些实施方式中，与以浮游生物形式提供的类似细菌相比，益生菌更擅长定殖阴道组织。定殖的改善程度可以测量为在施用预定时间段后，与用基于浮游生物益生菌的栓剂处理的对照组织相比，用基于生物膜颗粒的栓剂处理的组织的样品中细菌数量的增加。

在一些实施方式中，本文提供的细菌使用如PCT/IB2016/000933和PCT/IL2017/050587中公开的方法产生，其通过引用以其整体并入本文。

在一个实施方式中，一种或多种本文提供的用于产生生物膜的细菌是从健康哺乳动物获得的。在一个实施方式中，细菌是从动物供体获得的。在一个实施方式中，可以针对供体的健康状况和营养习惯对供体进行筛选。在一个实施方式中，细菌源自细菌菌株。在一些实施方式中，细菌源自储存的细菌菌株。在一些实施方式中，多种细菌源自冷冻细菌菌株。在一些实施方式中，细菌源自冷冻生物膜。在一些实施方式中，细菌源自冻干的细菌菌株。

在一个实施方式中，生物膜包括至少一种源自储存的微生物群样品的细菌菌株。在一个实施方式中，生物膜包括至少一种源自细菌菌落的细菌菌株。

根据一些实施方式，组合物的CFU为10⁴至10¹⁵。根据一些实施方式，组合物的CFU为10⁴至10¹⁴。根据一些实施方式，组合物的CFU为10⁴至10¹³。根据在一些实施方式中，组合物的CFU为10⁴至10¹²。根据一些实施方式，组合物的CFU为10⁵至10¹⁵。根据一些实施方式，组合物的CFU为10⁵至10¹⁴。根据一些实施方式，组合物的CFU为10⁵至10¹³。根据一些实施方式，组合物的CFU为10⁵至10¹²。根据一些实施方式，组合物的CFU为10⁶至10¹⁵。根据一些实施方式，组合物的CFU为10⁶至10¹⁴。根据一些实施方式，组合物的CFU为10⁶至10¹³。根据一些实施方式，组合物的CFU为10⁶至10¹²。根据一些实施方式，组合物的CFU为10⁷至10¹⁵。根据一些实施方式，组合物的CFU为10⁷至10¹⁴。根据一些实施方式，组合物的CFU为10⁷至10¹³。根据一些实施方式，组合物的CFU为10⁷至10¹²。根据一些实施方式，组合物的CFU是10⁸至10¹⁵。根据一些实施方式，组合物的CFU为10⁸至10¹⁴。根据一些实施方式，组合物的CFU为10⁸至10¹³。根据一些实施方式，组合物的CFU为10⁸至10¹²。

根据一些实施方式，至少一种另外的细菌种类以10⁴至10¹⁵CFU的量存在于组合物中。根据一些实施方式，至少一种另外的细菌种类以10⁸至10¹²CFU的量存在于组合物中。

根据一方面，卷曲乳杆菌与至少一种另外的外细菌种类的比例选自1:100000-100000:1、1:10000-10000:1、1:1000-100:1、1:100-1000:1和1:100-100:1。

根据一些实施方式，生物膜具有选自以下的至少一种特征：耐酸、耐抗生素、耐温、及其任意组合。

在一些实施方式中，组合物进一步包括：(i)包括抗生素剂的第一药剂；(ii)第一种亲脂性载体，(iii)pH调节剂，或其任意组合。

在一些实施方式中，生物膜形式的至少一种益生菌均匀地分散在第一亲脂性载体、第一药剂或其任意组合内，从而形成第一层。

亲脂性载体

根据一些实施方式，本发明提供了一种组合物，其包括生物膜形式的至少一种益生菌和第一亲脂性载体，其中至少一种益生菌为总组合物的10％至50％(w/w)。

在一些实施方式中，至少一种益生菌为总组合物的12％至50％(w/w)、15％至50％(w/w)、20％至50％(w/w)、12％至48％(w/w)、12％至15％(w/w)、12％至42％(w/w)、12％至40％(w/w)、15％至48％(w/w))、15％至40％(w/w)、20％至50％(w/w)、20％至48％(w/w)、20％至45％(w/w)或20％至40％(w/w)。

在一些实施方式中，第一亲脂性载体和第二亲脂性载体在室温下为固体并且各自独立地特征在于熔点为至少25℃。在一些实施方式中，第一亲脂性载体和第二亲脂性载体在室温下为固体并且特征在于熔点为至少26℃、至少27℃、至少28℃、至少29℃、至少30℃、至少31℃或至少32℃，包括其间的任意值。

在一些实施方式中，第一亲脂性载体和第二亲脂性载体各自独立地具有在25℃至60℃范围内的熔点。在一些实施方式中，第一亲脂性载体和第二亲脂性载体各自独立地具有在27℃至60℃、30℃至60℃、25℃至58℃、25℃至55℃、27℃至58℃或27℃至5℃的范围内的熔点，包括其间的任意范围。

在一些实施方式中，第一亲脂性载体和第二亲脂性载体包括一种或多种饱和含量超过40％的脂肪酸。在一些实施方式中，第一亲脂性载体和第二亲脂性载体包括一种或多种饱和含量大于41％、大于45％、大于48％或大于50％的脂肪酸，包括其间的任意值。

在一些实施方式中，第一亲脂性载体和第二亲脂性载体包括一种或多种氢化脂肪。

如本文所用，术语“氢化脂肪”是指已被化学改变的脂肪酸。一般来说，氢化脂肪是化学结构发生变化而变成固体脂肪的油。

在一些实施方式中，第二亲脂性载体具有比第一亲脂性载体高至少5℃、至少6℃、至少7℃、至少10℃、至少12℃或至少15℃的熔点。

在一些实施方式中，第一亲脂性载体具有比第二亲脂性载体高至少5℃、至少6℃、至少7℃、至少10℃、至少12℃或至少15℃的熔点。

在一些实施方式中，通过控制氢化脂肪的比例来控制组合物的熔点。在一些实施方式中，益生菌的释放时间由组合物的熔点控制。在一些实施方式中，第一药剂的释放时间由组合物的熔点控制。在一些实施方式中，第二药剂的释放时间由组合物的熔点控制。

在一些实施方式中，生物膜形式的至少一种益生菌的释放比第二药剂的释放更慢。

在一些实施方式中，第一亲脂性载体和第二亲脂性载体包括可可脂、棕榈油、植物蜡、蔬菜蜡或其任意组合。

在一些实施方式中，第一亲脂性载体和第二亲脂性载体包括源自植物来源的原材料的脂肪酸。

在一些实施方式中，赋形剂通过脂肪酸与醇比如甘油、聚甘油、丙二醇和聚乙二醇的酯化以及通过植物油和脂肪与甘油、聚乙二醇和丙二醇的醇解获得。

药剂

在一些实施方式中，组合物包括生物膜形式的益生菌、亲脂性载体和第一层形式的第一药剂。在一些实施方式中，组合物进一步包括含有第二药剂的第二层。

在一些实施方式中，第一药剂和第二药剂中的任一种是改善阴道组织对益生菌定殖的接受性的药剂。例如，可以提高阴道组织对益生菌定殖的接受性的药剂可以是pH改性剂。在这种情况下，亲脂性载体用于释放一定量的pH改性剂，该一定量的pH改性剂足以降低阴道组织中的局部pH值。优选地，阴道pH应被改性为约4，这对于本发明的益生菌的定殖是最佳的。在一些实施方式中，pH改性剂可以是合成的。在一些实施方式中，pH改性剂可以是天然-生物的。

在一些实施方式中，第一药剂和第二药剂中的任一种是pH调节剂。在一些实施方式中，第一药剂和第二药剂中的任一种是能够将pH调节至4的pH调节剂。

根据本发明的pH调节剂的非限制性实例是碳酸氢钠、抗坏血酸、柠檬酸、乙酸、富马酸、丙酸、苹果酸、琥珀酸、葡糖酸、酒石酸、乳酸、硼酸和蔓越莓提取物。

在一些实施方式中，抗生素是用于治疗细菌性阴道病的任何抗生素。抗生素的非限制性实例包括甲硝唑(Flagyl)、克林霉素(Cleocin)和甲硝唑。

在一些实施方式中，首先释放抗生素。在一些实施方式中，益生菌在抗生素释放后释放。

本领域技术人员将理解，载体和药剂的顺序可以在各种实施方式中改变并且命名“第一亲脂性载体”、“第一药剂”和“第二亲脂性载体”、“第二药剂”在此使用以方便参考。例如，在一些实施方式中，可以选择第二药剂以与第一层中的一种或多种亲脂性载体和生物膜形式的益生菌混合。本领域技术人员将进一步理解，各种系统可包括多于两种亲脂性载体或药剂。

颗粒

在一些实施方式中，生物膜形式的益生菌附着在颗粒上。

在一些实施方式中，颗粒的平均直径在50微米至1,500微米(μm)的范围内。在一些实施方式中，颗粒的平均直径在50μm至1,200μm、50μm至1,100μm、50μm至1,000μm、55μm至1,200μm、55μm至1,000μm、57μm至1,200μm或60μm至1000μm的范围内，包括其间的任何范围。每种可能性代表本发明的单独实施方式。

在一些实施方式中，颗粒选自：MCC、磷酸二钙(DCP)、种子、多糖或其任何组合。

在一些实施方式中，种子选自：蔓越莓、百香果、草药、燕麦或其任意组合。

如本文所用，术语“多糖”包括由经由糖苷键彼此连接的单体单糖制成的任何碳水化合物聚合物。

在一些实施方式中，多糖包括藻酸盐或由藻酸盐组成。

在一些实施方式中，颗粒包括食品级颗粒或由食品级颗粒组成。

在一些实施方式中，食品级颗粒包括多糖、脂肪晶体、蛋白质或其任意组合或由多糖、脂肪晶体、蛋白质或其任意组合组成。

在一些实施方式中，包括脂肪晶体的食品级颗粒选自：单油酸甘油酯、甘油硬脂基柠檬酸酯或其组合。

在一些实施方式中，包括多糖的食品级颗粒选自：玉米淀粉、淀粉纳米晶体、纤维素纳米晶体、微晶纤维素、纳米纤维素或甲基纤维素、几丁质、壳聚糖或其任意组合。

在一些实施方式中，包括蛋白质的食品级颗粒选自：β-乳球蛋白、乳铁蛋白、乳铁蛋白-多糖、牛血清白蛋白、明胶、大豆分离蛋白、豌豆蛋白、玉米醇溶蛋白或其任意组合。

在一些实施方式中，食品级颗粒选自：类黄酮(银椴苷)、蜡、虫胶-黄原胶或其任意组合。

根据一些实施方式，本文描述的组合物中的颗粒适于、配置或适合于生物膜形成。

在一些实施方式中，组合物被配制用于阴道施用。在一些实施方式中，组合物被配制用于直肠施用。在一些实施方式中，组合物被配制用于阴道施用和直肠施用。

组合物的用途

在一些实施方式中，组合物适于定殖有需要的受试者的阴道。在一些实施方式中，组合物适于定殖有需要的受试者的直肠。

在一些实施方式中，组合物用于治疗阴道病，例如，细菌性阴道病。

在一些实施方式中，组合物用于治疗或预防泌尿生殖道感染、生态失调或两者。

在一些实施方式中，组合物用于治疗或预防与生态失调相关的病症或疾病。

如本文所用，术语“生态失调相关的病症或疾病”是其指特征在于生物体组织或身体的微生物菌群失衡的与其相关的任何疾病或病症或症状。

在一些实施方式中，与生态失调相关的病症或疾病选自：细菌性阴道病、泌尿生殖道感染、溃疡性结肠炎、炎性肠病(IBD)和克罗恩病。

在一些实施方式中，组合物用于治疗或预防有需要的受试者的酵母菌性阴道炎、病毒感染、真菌感染、细菌性阴道病、尿路感染或其任意组合。

在一些实施方式中，组合物用于在有需要的受试者的目标部位改变细菌组成，或恢复天然阴道菌群、肠道菌群或两者。

在一些实施方式中，改变受试者中的细菌组成是指减少或消除受试者中不想要的细菌。

在一些实施方式中，生物膜形式的至少一种益生菌是针对受试者个性化的。

在一些实施方式中，根据要治疗的受试者的概况确定或制备组合物(例如，个性化治疗)。

在一些实施方式中，组合物包括选自以下的一种或多种菌株：植物乳杆菌、副干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、德氏乳杆菌属保加利亚乳杆菌亚种、短双歧杆菌、长双歧杆菌和普氏粪杆菌。

在一些实施方式中，组合物是包括选自以下的一种或多种菌株的抗炎组合物：植物乳杆菌、副干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、德氏乳杆菌属保加利亚乳杆菌亚种、短双歧杆菌、长双歧杆菌和普氏粪杆菌。

在一些实施方式中，组合物被配制用于阴道施用。

在一些实施方式中，组合物被配制用于直肠施用。

在一些实施方式中，组合物以栓剂的形式提供。

在一些实施方式中，组合物以阴道栓剂、霜剂、片剂、胶囊剂、软膏剂、凝胶剂或微胶囊剂的形式提供。

在一些实施方式中，可以在有需要的受试者中施用组合物以治疗与遍及本文所述的任何疾病、医学病症或紊乱相关的医学病症。

在一些实施方式中，治疗与抗生素治疗组合。

在一些实施方式中，治疗是预防性的，即，在抗生素治疗之后。

在一些实施方式中，在施用栓剂之前用定殖剂预处理阴道组织，其中预处理提高阴道组织定殖益生菌的接受性。

方法

根据一些实施方式，提供了一种在有需要的受试者中预防或治疗与生态失调相关的病症或疾病的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的本文公开的组合物，从而预防或治疗受试者的生态失调相关病症或疾病。

根据一些实施方式，提供了一种用于在有需要的受试者中恢复天然菌群的方法，其包括向该受试者施用治疗有效量的本文公开的组合物，从而在受试者中恢复天然菌群。

在一些实施方式中，受试者患有细菌性阴道病、泌尿生殖道感染、生态失调、溃疡性结肠炎、炎性肠病(IBD)、克罗恩病或其任何组合，或处于发展上述疾病的风险。

根据一些实施方式，本发明提供了一种用于治疗受试者的泌尿生殖道感染、生态失调或两者或降低其风险的方法，其包括向受试者施用有效量的本文所述的组合物。

根据一些实施方式，本发明提供了一种用于治疗受试者的溃疡性结肠炎、炎性肠病(IBD)、克罗恩病或其任意组合或降低其风险的方法，其包括向受试者施用有效量的本文所述的组合物。

在一些实施方式中，生物膜形式的至少一种益生菌的释放由亲脂性载体和药剂控制。

在一些实施方式中，生物膜形式的至少一种益生菌的释放由亲脂性载体的熔化温度控制。在一些实施方式中，可以使用亲脂性载体的不同混合物以调控组合物的熔化温度。

生产方法

根据一些实施方式，本发明提供了一种生产如本文所述的组合物的方法。

在一些实施方式中，提供了一种制备本发明的组合物的方法，方法包括以下步骤：(a)用卷曲乳杆菌接种包括颗粒的生长培养基；(b)将来自步骤(a)的颗粒与卷曲乳杆菌在适合于允许卷曲乳杆菌附着在颗粒上的条件下一起温育；(c)用至少一种另外的细菌种类接种步骤(b)的颗粒；和(d)在适合于形成生物膜的条件下培养步骤(c)的接种的颗粒，生物膜包括：卷曲乳杆菌和至少一种另外的细菌种类。

在一些实施方式中，至少一种另外的细菌种类选自：詹氏乳杆菌、加氏乳杆菌和鼠李糖乳杆菌。

在一些实施方式中，用于制备本发明的组合物的方法包括以下步骤：

-用选自以下的第一细菌接种包括颗粒的生长培养基：(i)卷曲乳杆菌；(ii)青春双歧杆菌；或(iii)普氏粪杆菌；

-用至少一种另外的细菌种类接种颗粒；和

-在适合于形成生物膜的条件下培养接种的颗粒，该生物膜包括：(i)卷曲乳杆菌；(ii)青春双歧杆菌；或(iii)普氏粪杆菌和至少一种另外的细菌种类。

在一些实施方式中，当第一细菌是青春双歧杆菌时，至少一种另外的细菌种类选自：长双歧杆菌长亚种和短双歧杆菌。

在一些实施方式中，当第一细菌是普氏粪杆菌时，至少一种另外的细菌种类选自：球形布劳特氏菌、普通拟杆菌和产甲酸多尔氏菌(产甲酸真杆菌)。

在一些实施方式中，当第一细菌是普氏粪杆菌时，同时进行接种步骤。在一些实施方式中，同时是指颗粒同时接种普氏粪杆菌和至少一种另外的细菌。在一些实施方式中，同时是指用普氏粪杆菌和至少一种另外的细菌接种颗粒，其间没有另外的步骤。在一些实施方式中，同时是指用普氏粪杆菌和至少一种另外的细菌接种颗粒，其间没有温育时间。

在一些实施方式中，本发明提供了用于生产如本文所述的组合物的方法或工艺，其包括以下步骤(i)将生物膜形式的至少一种益生菌与第一亲脂性载体、以及任选地第一药剂混合，从而形成混合物，并且(ii)将混合物加热至第一加热温度。

在一些实施方式中，方法进一步包括(iii)添加第二亲脂性载体和第二药剂的步骤。

在一些实施方式中，生物膜形式的至少一种益生菌与第一亲脂性载体的比例在1:1至1:10、1:2至1:10、1:5至1:10、1:1至1:9、1:1至1:5的范围内，包括其间的任何范围。

在一些实施方式中，生物膜形式的至少一种益生菌与第一药剂的比例在1:0.1至10:1、1:0.5至10:1、1:1至10:1、1:2至10:1、1:0.1至9:1、1:0.1至8:1、1:0.1至1:1、1:0.1至2:1的范围内，包括其间的任何范围。

在一些实施方式中，第一亲脂性载体和第二亲脂性载体包括饱和含量为超过40％、超过41％、超过45％、超过48％或超过50％的一种或多种脂肪酸，包括其间的任何值。

在一些实施方式中，加热温度根据一种或多种氢化脂肪的熔化温度确定。

一般术语

如本文所用，术语“约”是指±10％。

术语“包括(comprise)”、“包括(comprising)”、“包括(include)”、“包括(including)”、“具有(having)”及其变化形式是指“包括但不限于”。

术语“由……组成”是指“包括并限于”。

术语“基本上由……组成”是指组合物、方法或结构可以包括另外的成分、步骤和/或部分，但前提是另外的成分、步骤和/或部分不实质上改变要求保护的组合物、方法或结构的基本和新颖特征。

词语“示例性”在本文中用于表示“用作实例、例子或说明”。描述为“示例性的”的任何实施方式不一定被解释为相对于其他实施例是优选的或有利的和/或排除其他实施方式的特征的结合。

词语“任选地”在本文中用于表示“在一些实施方式中提供而在其他实施方式中不提供”。本发明的任何特定实施方式可以包括多个“可选的”特征，除非这些特征冲突。

如本文所用，单数形式“一(a)”、“一个(an)”和“所述(the)”包括复数指代物，除非上下文另有明确规定。例如，术语“一种化合物”或“至少一种化合物”可包括多种化合物，包括其混合物。

贯穿本申请，可以以范围格式呈现本发明的各种实施方式。应当理解，范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应理解为对本发明范围的不灵活限制。因此，应该认为对范围的描述已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，对比如从1至6的范围的描述应被认为具有具体公开的子范围，比如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的单个数字，例如，1、2、3、4、5和6。无论范围的广度如何，这都适用。

无论何时在本文中指示数值范围，其意在包括该指示范围内的任何引用的数字(分数或整数)。短语“在第一指示数字和第二指示数字之间的范围内(ranging/rangesbetween)”和“从第一指示数字到第二指示数字的范围(ranging/ranges from……to……)”在本文中可互换使用并且意在包括第一和第二指示数字以及其间的所有小数和整数。

如本文所用，术语“方法”是指用于完成给定任务的方式、手段、技术和步骤，其包括但不限于已知的方式、手段、技术和步骤或者容易由化学、药理学、生物学、生化和医学领域的从业者从已知的方式、手段、技术和步骤开发的那些方式、手段、技术和步骤。

如本文所用，术语“治疗”包括消除、基本上抑制、减缓或逆转病症的进展，基本上改善病症的临床或美学症状或基本上防止病症的临床或美学症状的出现。

应当理解，为了清楚起见，在单独实施方式的上下文中描述的本发明的某些特征也可以在单个实施方式中组合提供。相反，为了简洁起见，在单个实施方式的上下文中描述的本发明的各种特征也可以单独地或以任何合适的子组合或在本发明的任何其他所描述的实施方式中适当地提供。在各种实施方式的上下文中描述的某些特征不被认为是那些实施方式的基本特征，除非实施方式在没有这些要素的情况下是不可操作的。

上文描述的和权利要求部分要求保护的本发明的各种实施方式和方面在以下实施例中得到实验支持。

实施例

通常，本文使用的命名法和本发明中使用的实验室步骤包括分子、生化、微生物和重组DNA技术。这些技术在文献中有详尽的解释。参见，例如，"Molecular Cloning:Alaboratory Manual"Sambrook et al.,(1989)；"Current Protocols in MolecularBiology"Volumes I-III Ausubel,R.M.,ed.(1994)；Ausubel et al.,"CurrentProtocols in Molecular Biology",John Wiley and Sons,Baltimore,Maryland(1989)；Perbal,"A Practical Guide to Molecular Cloning",John Wiley&Sons,New York(1988)；Watson et al.,"Recombinant DNA",Scientific American Books,New York；Birren et al.(eds.)"Genome Analysis:A Laboratory Manual Series",Vols.1-4,ColdSpring Harbor Laboratory Press,New York(1998)；methodologies as set forth inU.S.Pat.Nos.4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659and 5,272,057；"CellBiology:A Laboratory Handbook",Volumes I-III Cellis,J.E.,ed.(1994)；"Cultureof Animal Cells-A Manual of Basic Technique"by Freshney,Wiley-Liss,N.Y.(1994),Third Edition；"Current Protocols in Immunology"Volumes I-III ColiganJ.E.,ed.(1994)；Stites et al.(eds),"Basic and Clinical Immunology"(8thEdition),Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994)；Mishell and Shiigi(eds),"SelectedMethods in Cellular Immunology",W.H.Freeman and Co.,New York(1980)；专利和科学文献中广泛描述了可用的免疫分析方法，参见，例如，U.S.Pat.Nos.3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771and 5,281,521；"Oligonucleotide Synthesis"Gait,M.J.,ed.(1984)；“Nucleic Acid Hybridization"Hames,B.D.,and Higgins S.J.,eds.(1985)；"Transcription and Translation"Hames,B.D.,and Higgins S.J.,eds.(1984)；"Animal Cell Culture"Freshney,R.I.,ed.(1986)；"Immobilized Cells and Enzymes"IRL Press,(1986)；"A Practical Guide toMolecular Cloning"Perbal,B.,(1984)and"Methods in Enzymology"Vol.1-317,Academic Press；"PCR Protocols:A Guide To Methods And Applications",AcademicPress,San Diego,CA(1990)；Marshak et al.,"Strategies for Protein Purificationand Characterization-A Laboratory Course Manual"CSHL Press(1996)；其所有通过引用并入。

材料和方法

菌株和培养条件

本研究中使用的所有菌株均购自ATCC或DSMZ。本研究中使用的菌株有：卷曲乳杆菌(DSM 20584)、詹氏乳杆菌(DSM 20557)、加氏乳杆菌(DSM)、鼠李糖乳杆菌(DSM/ATCC)、长双歧杆菌长亚种、短双歧杆菌、青春双歧杆菌、普氏粪杆菌、卵形布劳特氏菌、球形布劳特氏菌、普通拟杆菌、产甲酸多尔氏菌(产甲酸真杆菌)、单形拟杆菌、活泼瘤胃球菌(Ruminococcus gnavus)、生产布劳特氏菌(Blautia producta)、柔嫩梭菌、拟球(布劳特氏)梭菌和卵形(瘤胃球菌)布劳特氏菌。

加氏乳杆菌和鼠李糖乳杆菌在基于动物的培养基(Himedia)或适合于工业生产的基于非动物的生长培养基(NuCel by Procelys，France)中有氧生长。

詹氏乳杆菌和卷曲乳杆菌厌氧生长(90％N₂、5％CO₂、5％H₂氛围)。厌氧实验在Bactron厌氧工作站中进行。

浮游生物培养物

在生物膜形式的细菌抗性测定之前，确定了对酸性和抗生素具有抗性的浮游生物细菌。对于低pH测定，基于特定菌株的生物膜中的细菌数量，将阴道细菌的过夜培养物稀释至每毫升10⁵-10⁹个菌落形成单位(CFU)。浮游生物细菌在37℃下暴露于不同的酸度1h，类似于对生物膜形式的细菌所做的程序。在温育结束时，将样品离心(最大速度，2min)并去除上清液。然后在平板接种和CFU计数之前将细菌沉淀重新悬浮在磷酸盐缓冲盐水(PBS)×1中。

对于抗生素测定，将过夜培养物稀释至0.13的光学起始密度(OD)。在应用抗生素MIC条(Himedia)之前，将100μl培养物均匀涂抹到琼脂平板中并放置15min以使其干燥。将平板在37℃下温育24h，然后确定最低抑菌浓度(MIC)值。

生物膜形式的细菌培养物

单一菌株(单培养物)

基于特定菌株，乳杆菌属的培养物从甘油原液(12.5％)开始，并在37℃、150-180rpm、有氧或无氧条件下温育过夜。将培养物稀释至OD600为0.05，用于最终生物膜培养物。生物膜形式的细菌培养物如WO2016181228A2中所述获得，通过引用以其全部并入本文。

生物膜形式的细菌在连续搅拌下在37℃下生长。无论是小规模(体积为30mL)还是中等规模(2L的发酵罐中的体积为250mL或500mL)，所有生物膜形式的细菌实验均在实验室规模的生产中进行。在总共72h期间，每24h温育，对生物膜形式的细菌生长进行分析。每天用新鲜培养基更换培养基，并对生物膜中的细菌数量进行定量。通过在琼脂平板上计数CFU来测量活细胞。另外，通过将生物膜形式的细菌暴露于极端条件(比如，低pH和抗生素)来测试生物膜形式的细菌发育阶段(对于进一步的细节，请参见‘pH值和抗生素抗性测定’部分)。稍后，将结果与浮游生物细菌进行比较，以证明生物膜形式的细菌优于自由存活的细菌。

进行了一些实验以获得生物膜形式的细菌生长的最佳条件(遵循上述方法)：

搅拌-在静止(无搅拌)和连续搅拌条件(70-80rpm)之间或在两种搅拌速度(70-80rpm和130rpm(基于实验)之间，比较生物膜形式的细菌的生长和发育(对pH的抗性)。

温育时间-在72h的时间段内每24h研究生物膜形式的细菌的生长和发育(对pH的抗性)。

粒度-检查了尺寸范围在80-1000μM之间的不同颗粒上生物膜形式的细菌生长：微晶纤维素(MCC)(80-150μM)、微晶纤维素：磷酸二钙(MCC:DCP)(1:1，～100μM)、蔓越莓(500-600μM)、海藻酸盐(1,000μM)。生物膜形式的细菌在24h内生长并评估其生长发育。

基质：培养基比——在24h内生物膜形式的细菌生长被评估为基质(MCC)与培养基之间比的函数。比较了基质与培养基的以下比：基质为培养基的2％、5％、10％或20％。

添加浮游生物细菌后搅拌VS.不搅拌-检查了混合对浮游生物细菌附着至基质的影响，以及随后生物膜形式的细菌的生长。在实验开始时在添加浮游生物细菌后比较了两种条件：所有实验期间的连续搅拌(24h温育)vs.前2小时的不搅拌(除了在此期间两次10sec的温和混合)然后连续搅拌直至实验结束。

pH值和抗生素抗性测定

将来自培养基-基质溶液的样品转移到管中，然后在RT下以500rpm离心3min。随后，弃去上清液，用PBS洗涤沉淀以除去离心期间沉淀的浮游生物细菌。样品在RT下再次以500rpm离心3min。离心后，去除上清液，对于每次处理(pH值或抗生素)，使用1g生物膜形式的细菌。对于pH抗性测定，在37℃、100rpm下将生物膜形式的细菌暴露于5mL不同酸度的PBS中1h：pH 2和3.5(使用2M HCl将PBS×1的pH值分别调节为2和3.5)。在相同条件下，在5mLPBS 7(环境pH)中温育的生物膜形式的细菌用作对照。对于抗生素测定，将1gr的生物膜形式的细菌暴露于远高于特定菌株的MIC值的3个连续浓度的抗生素中。将生物膜形式的细菌在含有或不含抗生素(后者用作对照)的5mL生长培养基中在37℃下温育24h。

在温育结束时，将生物膜形式的细菌用10mL PBS×1洗涤。离心(500rpm，3min)后，去除9mL，将1mL剩余PBS溶液中生物膜形式的细菌高速涡旋1.5min，以从附着在颗粒上的生物膜中释放细菌。

分析方法

在每个抗性测定结束时确定CFU。首先，进行系列稀释，并将细菌一式三份平板接种到MRS琼脂平板上。基于菌株生长条件(见上文)，在37℃下在需氧或厌氧条件下温育平板48-72h，然后进行CFU计数。

实验步骤

为了优化细菌生长，实践了两种类型的实验设计，小规模实验和中等规模实验。基于从小规模实验获得的结果，发明人限定了中等规模实验的条件。步骤简述：在72小时的总温育时间内，每温育24小时检查一次产生的细菌种群的生长和发育状态。每天，用新鲜培养基更换培养基，并对生物膜中的细菌数量进行定量(以下称为pH 7处理)。此外，通过将细菌种群暴露于极端条件，比如值接近女性阴道中普遍存在的pH(pH 4-5)的酸性pH(pH 3.5和2)和抗生素(CB，羧苄青霉素；CIP，环丙沙星；VAN，万古霉素；NVB，新生霉素)下，来测试颗粒上生物膜的形成和发展。每天进行pH抗性测定，并在温育48小时或72小时后进行抗生素测定。稍后，将这些测定的结果与相同种类的浮游生物细菌进行比较，以显示产生的细菌种群技术优于自由存活细菌的优势。此外，为了让细菌更好地附着在基质上，在向带有基质的发酵罐中添加浮游生物细菌后的第一天，将发酵罐保持在静止条件下，在37℃下保持2小时(1小时后轻轻混合)。细菌产量约1对数的变化被认为在细菌平板接种和CFU计数的技术误差范围内，并被视为非显著差异。测试的菌株见表1。

产生细菌种群

表1.测试的细菌菌株

细菌菌株共培养

当两种或更多种细菌菌株一起共培养时，将菌株分别添加到颗粒:培养基混合物中，在将每种细菌菌株添加到混合物中之间具有暂停时间。向混合物中添加细菌菌株后，将其充分混合，并在30min至1小时后添加另一种菌株。如果在同一混合物中共培养更多细菌菌株，则重复该步骤。细菌添加的顺序是基于厌氧/需氧菌株或缓慢/快速生长的菌株来决定的，由此厌氧或缓慢生长的菌株在需氧或快速生长的菌株之前添加。

单培养物

单一菌株

实验中使用的每种细菌菌株的培养物从-80℃原液(5％DMSO)开始，并在厌氧条件下在37℃下温育过夜。除非另有说明，将培养物稀释至0.05的OD600(FaP,0.03)，用于最终生物膜培养物。每个实验中的单培养物由生长培养基(BfA、双歧杆菌培养基或食品级+酪蛋白；FaP、YCFAC或RCM)、20％单培养物技术颗粒(MCC:DCP，1:1)和来自过夜培养基的浮游生物细菌组成。在连续搅拌条件(小规模，80rpm；发酵罐，300rpm)或静止条件(仅小规模)下，单培养物在37℃下生长。所有实验都在无氧手套箱中进行，然而，双歧杆菌属的生长培养基通常是需氧的，而对于粪杆菌属的实验则是无氧的。当采用连续搅拌时，容器首先在静止条件下放置5h，以使细菌附着在基质上。无论是小规模(体积为50或60mL)还是发酵(体积为3L)，所有单培养物实验均在实验室规模生产中进行。

每～24h温育进行单培养物生长的分析。除非另有说明，否则每天将培养基更换为新鲜培养基，并对生物膜中的细菌数量进行定量。通过在琼脂平板上计数CFU来进行活细胞的测量。在某些情况下，将结果与浮游生物细菌进行比较，以证明单培养技术相对于自由存活细菌的优势。

多细菌组合

当少数细菌菌株一起共培养时，对于每个菌株，以0.03或0.05的初始OD平行添加菌株。当时间为测试的参数时，缓慢生长的细菌在集群中的其他种类之前24h添加。当OD为实验中测试的参数时，缓慢生长的细菌的添加量是集群中其他细菌种类的10倍(初始OD0.5)。所有其他实验设置和分析都按照对单一菌株的描述进行。

通过滴法(drop assay)定量细菌

将来自培养基-基质溶液的样品转移到管中，然后在RT下以500rpm离心3min。随后，弃去上清液，用PBS洗涤小球以去除离心期间沉淀的浮游生物细菌。样品在RT下再次以500rpm离心3min。离心后，去除上清液，每次处理(pH值或抗生素)使用1g样品。第三次洗涤用10mL PBS×1进行。离心(500rpm，3min)后，去除9mL，将1mL剩余PBS溶液中的生物膜高速涡旋1.5min，以从附着在颗粒上的生物膜中释放细菌。

分析方法

为了确定CFU，进行了系列稀释，并且将细菌一式三份地铺在特定琼脂板上。在CFU计数之前，基于菌株生长条件(见上文)，将平板在37℃下在无氧条件下温育48-72h。

将共培养物样品送至NGS分析以获得共培养物中每种细菌菌株的相对丰度。当它适用时，相对丰度结果通过以下等式标准化为细菌计数(CFU/mL)：

“每种细菌的RA％*总细菌计数＝特定种类细菌计数”。

实施例1

栓剂制剂

栓剂的制剂由混合在药学上可接受的赋形剂(油基载体)和/或益生元药剂(比如，蔓越莓、抗坏血酸和抗生素)中的如上所述生长的生物膜形式的细菌组成。所用生物膜形式的细菌是生物膜形式的冻干(干)或湿细菌。在栓剂制剂中，植物(棕榈)脂和可可脂分别以1:5的比在50-52℃的热水浴中熔化。

对温度进行密切监测，以确保温度不超过会损害油脂的温度(超过60℃)。然后将两到三滴卵磷脂添加到熔化的油脂中以帮助混合均匀。将混合物冷却至25℃，然后以细菌与蜡(生物膜形式的细菌和益生元)的不同比例将生物膜(干燥)形式的细菌和/或益生元物质(比如蔓越莓、抗坏血酸等)分别添加至油脂。将最终组合物重新加热至30℃并倒入阴道栓剂模具中。栓剂在4℃下储存直至使用。为了模拟栓剂的溶解，将栓剂置于37℃的培养箱中。结果总结在表2和图1A-1F。

表2

实施例2

细菌生长优化

实验步骤：用两种类型的实验设计测试生物膜形式的细菌的施加，小规模实验，然后是中等规模实验(图1G)。基于从小规模实验获得的结果，发明人限定了中等规模实验的条件。步骤简述：在总共72h期间，每24h温育检查一次生物膜形式的细菌生长和发育状态。每天，用新鲜培养基更换培养基，并对生物膜中的细菌数量进行定量(以下称为pH 7处理)。此外，通过将生物膜形式的细菌暴露于比如酸性pH(pH 3.5和2)和抗生素(CB，羧苄青霉素；CIP，环丙沙星；VAN，万古霉素；NVB，新生霉素)等极端条件下，测试了颗粒上生物膜的形成和发展。每天进行pH抗性测定，并在温育48h或72h后进行抗生素测定。稍后，将这些测定的结果与相同种类的浮游生物细菌进行比较，以显示生物膜形式的细菌优于自由存活细菌的优势。

对于每种测试的细菌菌株，结果呈现如下：

-浮游生物生长；

-在小规模设置中生物膜形式的细菌生长优化；

-在中等规模设置中以生物膜形式的细菌生长优化。

在结果的描述中，细菌产量的～1对数的变化被认为在细菌平板接种和CFU计数的技术误差范围内，因此被解释为非显著差异。

浮游生物细菌在pH 7下产生约10⁶个细胞/mL的中等细菌产量(对照，图2)。pH 3.5的细菌产量与对照相当。然而，在较高酸性条件下(pH 2)，浮游生物细菌无法存活。最后，暴露于抗生素显示了MIC为64μg/mL CB和16μg/mL NVB和4μg/mL VAN(表3)。

表3.不同抗生素针对浮游生物LI.的MIC值以μg/mL表示

细菌\ABX	CB	NVB	VAN
				惰性乳杆菌	64	16	4

生物膜形式的惰性乳杆菌(LI)细菌-小规模实验

小规模实验的结果表明，在温和搅拌(100rpm)的有氧条件下，与基质一起温育48h后，细菌产量最高。与浮游生物细菌相比，生物膜形式的细菌在pH 2下存活，在搅拌和非搅拌条件下，生物膜中的细菌生长分别下降了1到3.8对数(图3)。然而，在无氧条件下，与浮游生物细菌相比，生物膜中的细菌在低pH值下没有表现出任何优势。

生物膜形式的LI细菌——中等规模实验

基于来自小规模实验的结果，LI在生物膜中生长所采用的条件是有氧温和搅拌。在这里，与48h相比，基质温育24h和72h后，细菌产量似乎略高。生物膜形式的细菌在两种酸性pH处理下都能存活，并且处理之间的存活率没有显著差异(图4)。

最后，测试生物膜形式的细菌对抗生素的抗性(图5)。虽然与浮游生物细菌相比，生物膜形式的细菌对所有三种类型的抗生素都具有抗性，但观察到对CB抗生素的抗性最高。当暴露于CB时，即使在温育24h后，细菌产量也不会受到抗生素浓度的影响或受到轻微影响。暴露于VAN和NVB抗生素的生物膜形式的细菌在温育天数之间显示出相似的细菌生长趋势：在初始减少约4对数后，细菌数量没有随着浓度的增加而显著变化。当将抗生素抗性数据汇总在一起时，似乎在48h后，发明人获得了生物膜对增加量的抗生素的最高抗性。

总之，基于所应用的实验条件，惰性乳杆菌生物膜中的最大细菌产量为10⁷-10⁸。生物膜形式的LI细菌能够在酸性pH值和抗生素存在的情况下存活和/或良好生长，从而证明生物膜形式的细菌性能优于自由存活细菌。

詹氏乳杆菌(LJ)

浮游生物LJ

在对照条件(pH 7，图6)下，浮游生物细菌产生约10⁶个细胞/mL的细菌产量。与对照相比，在pH 3.5下未观察到细菌产量的显著差异。然而，浮游生物细菌在暴露于pH 2时无法存活。

将浮游生物细菌暴露于CB和NVB以及VAN抗生素导致对抗生素的低细菌抗性，MIC分别为8μg/mL、2μg/mL和1.5μg/mL。然而，无论采用何种抗生素浓度，浮游生物细菌都对CIP不敏感，并且展现出细菌细胞的完全生长(表4)。

表4.不同抗生素针对浮游生物LJ的MIC值以μg/mL表示

细菌\ABX	CB	NVB	VAN	CIP
					詹氏乳杆菌	8	2	1.5	>256

生物膜形式的LJ细菌——小规模实验

生物膜形式的LJ细菌在小规模实验设置中的生长在两种搅拌条件(70rpm和130rpm)下是相似的(图7)。随着时间的推移，生物膜形式的细菌生长减少。温育24小时后观察到最大细菌产量为10⁷个细胞/mL，而在温育的第三天，记录到最低细菌产量(～10⁵个细胞/mL)。当生物膜形式的细菌暴露于pH 3.5时，不包括温育的第一天，与对照(pH 7)相比，细菌数量没有显著差异。然而，生物膜形式的细菌无法在最低pH处理(pH 2)下存活。一般来说，生物膜中细菌的生长与其自由存活形式没有显著差异。应当注意的是，进行了一项实验以测试不搅拌是否可以导致生物膜形式的细菌产量更高(RD206)。结果显示，与两种搅拌条件相比，细菌生长减少了约1对数。

因为没有关于哪种搅拌条件对生物膜形式的细菌生长具有最佳影响的明确结论，所以在以下中等规模的实验中，测试了两种搅拌条件。此外，由于中等规模实验的设置更类似于工业中使用的生长条件，因此决定也用这种类型的设置检查这两种搅拌速度。

生物膜形式的LJ细菌–中等规模实验

类似于小规模实验，生物膜中的细菌产量达到～10⁷CFU/mL的最大生长，然而，在所有3天的温育期间生长保持稳定(图8)。此外，在两种搅拌速度之间没有观察到显著差异。

与先前的实验不同，在暴露于pH 3.5后观察到CFU计数的较大下降(在温育的前两天结束时为2-2.3对数)(图8)。当测试生物膜形式的细菌对pH 2的抗性时，生物膜完全崩解(图8)。发明人推测，在温育的第3天，在pH 3.5下温育后细胞消失是由于技术错误。实际上，在以下实验中，72h下的结果与温育的前两天没有区别。

接下来，将生物膜形式的LJ细菌暴露于增加的抗生素浓度(图9)。与浮游生物细胞相比，生物膜形式的细菌对抗生素展现出高抗性，而施加的浓度远高于浮游生物细菌的MIC值。对于NVB和CB二者，尽管24小时后细菌生长开始减少，但无论抗生素浓度如何，产量都保持稳定。

总之，尽管生物膜形式的细菌导致酸性条件，但是当暴露于抗生素时，生物膜形式的LJ细菌展现出优于浮游生物细菌的明显优势。

虽然在当前的实验中搅拌条件没有差异，但在中等规模的设置下稍后进行的实验在低搅拌下对生物膜形式的细菌生长产生了更好的结果。因此，在此类实验中，生物膜形式的LJ细菌的搅拌设置为连续70-80rpm。此外，初步实验显示，在将浮游生物细菌添加到带有基质的发酵罐后的第一天，将发酵罐在37℃下在静止条件下保持2h(其中1小时后温和混合)，生物膜形式的细菌的生长是有利的。该步骤可以让细菌更好地附着在基质上，并在所有后续实验中都使用了该步骤，而不管使用的是哪种细菌菌株。

卷曲乳杆菌(LCr)

浮游生物LCr

当暴露于低pH处理和增加的抗生素浓度时，浮游生物LCr表现出与浮游生物LJ相似的结果(图10)。与对照(pH 7)相比，暴露于pH 3.5对细菌细胞没有显著影响，而在pH 2时细菌无法存活。

当用抗生素处理浮游生物LCr时，观察到CB、NVB和VAN的细菌抗性低，其中MIC值分别为4μg/mL、2μg/mL和1.5μg/mL(表5)。然而，无论采用何种抗生素浓度，浮游生物细菌都对CIP不敏感，并且显示出细菌细胞的完全生长。

表5.不同抗生素针对浮游生物LCr的MIC值以μg/mL表示

细菌\ABX	CB	NVB	VAN	CIP
					卷曲乳杆菌	4	2	1.5	＞256

生物膜形式的LCr细菌——小规模实验

无论生物膜形式的LCr细菌是否有规律地搅拌或不搅拌，使用LCr的小规模实验产生了5×10⁵个细胞/mL的最大细菌产量和～10⁴个细胞/mL的最低产量(图11)。在这两种处理中，与基质温育3天后，生物膜形式的细菌生长最高。令人惊讶的是，在中等酸性条件下(pH3.5)，无论如何处理，都观察到细菌产量增加约1-2对数。尽管如此，在pH值为2时，生物膜中的细菌数量或者减少2-4对数，或者完全减少。无法确定它们在这种酸性条件下的存活模式，将在以下中等规模的实验中重新检查它们对pH 2的抗性。

尽管两种搅拌条件的结果相似，但是当搅拌时生物膜形式的细菌生长似乎分别在pH 7和3.5下产生稍微更好的生长和存活。因此，在接下来的实验中采用温和搅拌(70-80rpm)。

生物膜形式的LCr细菌-中等规模实验

与小规模实验相比，在中等规模实验中生物膜中的细菌产量略高(～1-2对数)(图12)。然而，当暴露于pH 3.5时，生物膜形式的细菌增加与在小规模实验设置中观察到的相当。在第1次和第3次温育后，当暴露于最低pH处理时，记录了生物膜形式LCr细菌的高存活。在这两种实验设置中，在这种pH处理下生物膜形式的细菌在48h后死亡。

然后，研究了生物膜形式的LCr细菌对抗生素的抗性(图13)。与生物膜形式的LJ细菌相似，生物膜形式的LCr细菌对CB和NVB显示出高抗性，其中在暴露于NOVO后，生物膜形式的LCr细菌的生长略好(1对数)。

总而言之，生物膜形式的LCr细菌在低pH处理方面表现出优于它们的浮游生物对应物的中等优势，并且在针对抗生素进行测试时表现出高优势。此外，温育24h和72h后以及暴露于低pH处理后的生物膜细胞数量相当。

加氏乳杆菌(LG)

浮游生物LG

当暴露于酸性pH时，浮游生物LG的结果不同于浮游生物LI、LJ和LCr(图14)。虽然暴露于pH 3.5会略微减少浮游生物LG的数量，但在pH 2中温育会导致细菌的存活数量非常低。

当随后测试浮游生物LG对抗生素的敏感性时(表6)，确定MIC值；与LJ和LCr相似，浮游生物LG对CB、NVB和VAN高度敏感(分别为4μg/mL、2μg/mL和1.5μg/mL)，而对CIP细菌表现出完全抗性。

表6.不同抗生素针对浮游生物LG的MIC值以μg/mL表示

细菌\ABX	CB	NVB	VAN	CIP
					加氏乳杆菌	4	2	1.5	>256

生物膜形式的LG细菌——小规模实验

类似于生物膜形式的LCr和LJ细菌，在所测试的两种搅拌速度之间没有观察到显著差异(图15)。最高细菌产量为10⁷个细胞/mL。在48h，暴露于酸性pH后，生物膜形式的细菌展现出高活力；生物膜中的细菌数量在pH 3.5与对照之间没有差异，而在pH 2中接种的细菌中，分别在70rpm和130rpm时仅下降1.3和1.6对数。该结果表明生物膜细胞的性能优于浮游生物细胞，后者的细胞在pH 2时完全死亡。

生物膜形式的LG细菌——中等规模实验

当比较两种搅拌条件时，无论温育时间如何，在生物膜包埋的细菌细胞的数量上都没有检测到显著差异(图16)。此外，在两种处理中，在暴露于最低pH值处理后，观察到生物膜细胞的高存活。在这种pH处理下细胞活力的降低不超过3.2对数(在130rpm下温育48h后)。在其他实验中也观察到在pH 2下相对较大的存活(参见图22-24)。在pH 3.5下，与70rpm相比，在130rpm下生长时，生物膜形式的LG细菌的存活似乎略好。然而，在pH 2时，两种搅拌速度之间的生物膜形式的细菌存活没有检测到差异。

在随后的实验中，当再次测试相似的搅拌速度时，生物膜形式的LG细菌的生长速率在较低速度下得到更多增强(结果未显示)。因此，对于本项目中的先前菌株，选择混合速度为70-80rpm以备将来的实验。

生物膜形式的LG细菌能够在NVB抗生素的存在下存活并良好生长(图17)。然而，在存在CB的情况下，生物膜形式的细菌存活不太明显，其中只有少数菌落在暴露于这种抗生素后生长。低于阈值的存活菌落数被认为是显著的(图17；虚线)。

总之，LG浮游生物培养物和生物膜形式的细菌培养物在其对极端条件的抗性相关的两种生长模式之间表现出很大差异。因此，生物膜形式的LG细菌相对于悬浮细菌的优势是显而易见的。

鼠李糖乳杆菌(LRh)

浮游生物LRh

当暴露于增加的酸度时，浮游生物LRh细胞对本项目中描述的所有细菌菌株表现出相似的反应；暴露于pH 3.5在对照样品和生物膜形式的细菌之间没有检测到差异，而细胞在pH 2时消失(图18)。

当LRh的悬浮细胞暴露于CB和NVB抗生素时，还观察到对该项目中使用的其他乳杆菌属的类似反应(MIC值为4和2μg/mL；表7)。尽管如此，当在CIP和VAN抗生素存在下接种时，它们的反应与其他细菌菌株相反；浮游生物LRh对CIP高度敏感(0.25μg/mL)，而对VAN完全抗性(>256μg/mL)。

表7.不同抗生素针对浮游生物LRh的MIC值以μg/mL表示

细菌\ABX	CB	NVB	VAN	CIP
					鼠李糖乳杆菌	4	2	>256	2

生物膜形式的LRh细菌——小规模实验

生物膜包埋的细菌的最大数量为～1010CFU/mL(图19)。总体而言，经历70rpm的生物膜形式的LRh细菌的生长似乎略好于经历130rpm的生物膜形式的细菌；这表现在48h后它们在pH 2下的高存活(5.8对数)和在温育第3天在pH 3.5下的存活略有提高(与pH 7相比)。此外，在温育72h时，嵌入生物膜的细菌的数量略有减少。

基于该实验的结果，在接下来的实验中采用的搅拌为～70-80rpm。

生物膜形式的LRh细菌——中等规模实验

与先前的小规模实验不同，生物膜包埋的细菌的平均数量不超过10⁷CFU/mL(图20)。这种差异是由于方案中包括一个另外的洗涤步骤，以改善悬浮细菌与生物膜形式的细菌的分离。从这一点开始，此洗涤步骤然后用于所有实验设计中。随着时间的推移，生物膜形式的LRh细菌的生长速率保持不变。然而，在该实验中，生物膜形式的LRh细菌似乎在温育第二天结束时更好地抵抗低pH处理；在pH 2下观察到不超过2对数的减少。

在抗生素的存在下，当暴露于CB和CIP时，生物膜形式的LRh细菌存活并良好生长，但在高浓度的NVB(128和256μg/mL；MIC，2μg/mL，图21)中无法存活,。

生物膜形式的LRh细菌在CB和CIP抗生素存在下，在悬浮的浮游生物对应物完全消失的浓度下，显示出增加的存活和生长。

实施例3

栓剂制剂的评价

栓剂的制剂由混合在药学上可接受的赋形剂(油基载体)和/或补充剂中的生物膜形式的细菌组成。生物膜形式的细菌用作冻干(干燥)粉或生物膜形式的湿细菌(在72h温育结束时)。每月进行一次栓剂中生物膜形式的细菌存活的稳定性测定，持续6个月的时间段。每个月，将每个制剂中的一种栓剂在PBS(×1)中熔化，并平板接种细菌以进行CFU计数(参见分析方法)。

改善活性成分混合物

添加剂.高阴道pH与阴道病原体的增加有关，长期以来，阴道的酸度被认为是防止厌氧菌病原体定殖的保护机制，同时为乳杆菌创造有利的生长环境。检查不同添加剂(蔓越莓和抗坏血酸)对生物膜形式的细菌LP的影响(作为小规模的一部分)。在本文中，发明人检查了两种酸化剂，蔓越莓和抗坏血酸，其中还建议前者在预防和/或减少UTI感染复发方面起作用。目的是在栓剂组合物中将这些添加剂中的一种连同生物膜形式的细菌一起添加。因此，测试了它们对生物膜形式的细菌存活和生长的影响。在将生物膜形式的细菌LP暴露于蔓越莓粉(300mg)后，未记录到对生物膜形式的细菌存活和/或生长的显著影响(图27)。

有趣的是，当将蔓越莓粉与生物膜形式的冻干细菌一起包括在栓剂中时，与从栓剂中省略蔓越莓时相比，观察到细菌存活提高(高出1至1.6对数之间；图22)。此外，样品在栓剂中在两个月的时间段内是稳定的(图22)。将抗坏血酸(AA；维生素C)添加到栓剂中，产生了与添加蔓越莓相似的结果；在生物膜形式的细菌生长中仅观察到1到2对数的小幅减少。如所预期，AA和蔓越莓都将MRS溶液中的初始pH值降低到3.5-4。因为添加AA为栓剂提供了更均匀的混合物，所以决定在稍后的实验中使用它。

生物膜形式的细菌.研究了栓剂中生物膜形式的湿细菌(温育72h后)和生物膜形式的干细菌的存活情况。结果显示，在栓剂中1个月后，生物膜形式的干细菌的CFU计数与其在T0时的数量(小于1对数)没有显著差异。然而，生物膜形式的湿细菌存活减少了1.5对数。然而，3个月后，LRh的生物膜形式的湿细菌完全消失，而栓剂中生物膜形式的干细菌的CFU计数保持稳定。该结果清楚地表明，湿度对栓剂中生物膜形式的细菌存活产生负面影响，因此使用生物膜形式的干细菌粉末是必要的(图23)。

改进栓剂赋形剂混合物

经过几次小实验后，油基载体的基本制剂包括比例分别为1:5的植物(棕榈)脂和可可脂，以及几滴卵磷脂，以帮助提高混合物的均质性。接下来，本发明人旨在减少与生物膜形式的细菌相比油基载体的体积，从而增加栓剂中生物膜形式的细菌的数量。测试了两种生物膜形式的细菌与载体的两种比例，分别为1:5和1:10(图24)。结果显示两种比例之间生物膜形式的细菌生长没有差异，从而使我们能够提高栓剂组合物中生物膜形式的细菌数量。

添加补充剂比如蔓越莓或维生素C不影响生物膜形式的细菌生长，并且它们与生物膜形式的细菌一起施用对于治疗BV比单独施用每一种更有效。

粒度和生物膜形式的细菌对颗粒的亲和力

LG浮游生物细胞与不同颗粒温育24小时后，生物膜形式的LG细菌生长和发育如下：微晶纤维素：磷酸二钙(MCC:DCP)>MCC>藻酸盐>蔓越莓。基于这些结果，发明人提出，减小的粒度和基质类型二者的组合对生物膜形式的LG细菌生长和发育产生积极影响：(1)粒度-更小的粒度(更高的表面积与体积比)可以允许每个颗粒体积附着更多细菌，从而改善生物膜形式的细菌生长：与藻酸盐珠(1,000μm)相比，MCC或MCC:DCP组合(80-150μm)上的生物膜形式的细菌生长得到增强；(2)基质类型——不希望受任何特定理论的束缚，对于特定基质对生物膜生长和形成的贡献，发明人在此提出了两种可能的解释。尽管藻酸盐是蔓越莓的两倍大，但接种藻酸盐时，生物膜形式的LG细菌生长更高。一种假设是溶液中存在蔓越莓导致较低的pH值，这可能会对生物膜形式的细菌生长产生负面影响。另一种假设是基于藻酸盐是一种细菌多糖的事实，其已被证明对生物膜形成很重要。另一个实例是MCC与MCC:DCP之间LG生物膜细胞数量的差异。少数研究表明外源性钙离子可以促进生物膜的形成，因此可溶性DCP颗粒(磷酸二钙)的存在和随后的钙离子可能会促进LG生物膜的生长和发育。

实施例4

栓剂制剂

显示了细菌与作为直肠/阴道栓剂的Pentasa(抗炎剂)的新组合。

比较了两种制剂，具有生物膜形式的干细菌的制剂A和具有Pentasa和生物膜形式的细菌的组合的制剂B(表8)。

表8

	量	油/脂肪酸	干细菌	药物
					A	3个单位	8g	LG、LGG各自0.5g	---
B	3个单位	8g	LGG、LG各自0.66g	Pentasa 0.66g

当测试Pentasa与生物膜形式的干细菌的组合时，保持了细菌的稳定性(图26)。对具有Pentasa的浮游生物细菌观察到同样的情况。

实施例5

共培养的生物膜

与两种细菌菌株共培养

LJ和LG被鉴定为厌氧/缓慢生长的细菌，而LRh被鉴定为需氧/快速生长的细菌。当LJ或LG浮游生物细胞与LRh共同接种时，它们在添加LRh之前添加，在添加菌株之间间隔约1小时。与其作为单培养物的生长相比，没有记录到关于生物膜生长(最大1对数)和发育(对pH的抗性)的显著差异(图27)。生物膜包埋的细菌的数量在10⁶-10⁷CFU/mL之间。

LRh-LG共培养实验的结果后来通过在中等规模设置中重复实验被验证。这组实验表明，这两种细菌菌株组合(LJ&LRh或LG&LRh)的共培养在减少颗粒数量的同时增加生物膜中细菌的总数显示出明显的优势。当减小生物膜载体(例如，栓剂或片剂)的尺寸时，这是一个主要优势。

与两种以上的细菌菌株共培养

在该实验中，发明人接种了以下细菌组合：LRh-LJ-LG或LRh-LJ-LG-LCr(以下分别称为“组合-A”和“组合-B”；图7)。当LRh、LJ和LG一起培养时，每个菌株的生物膜中的细菌数量在10⁷到10⁸CFU/mL之间。在FG1肉汤中接种细菌菌株，因此与先前用MRS进行的共培养物实验相比，生物膜中细胞的数量更多。在pH 3.5时，无论培养时间长短，所有细菌菌株都表现出高耐受性。然而，LJ细菌种群对pH 3.5的抗性随着温育时间的延长而降低。在pH 2时，虽然LG存活与其在pH3.5时的存活没有显著差异，但LJ和LRh展现出较差的存活率。这些结果与先前单独培养细菌时的实验结果一致。这些结果表明这些菌株不会抑制或压制彼此的生物膜种群。

与组合-A相比，来自第二共培养物混合物组合-B的LRh、LJ和LG细菌种群在生长和对pH 3.5的抗性方面没有显示差异。然而，LJ和LRh似乎更能耐受pH 2，特别是在温育24小时后。另一方面，LCr细菌种群仅在温育的第二天出现在MRS琼脂平板上。LCr细菌种群的高活力与LJ细菌种群(10⁷CFU/mL)相似。可能地，其他细菌菌株的生长抑制了LCr在MRS琼脂平板上的生长(图29-30)。

接下来，将来自组合-B的细菌种群也平板接种在双歧杆菌琼脂平板上。

总之，在两种共培养组合中，在培养24小时后获得关于细菌种群生长和pH抗性的最佳结果。然而，在低pH处理下，来自组合B的LRh、LG和LJ的存活相对较高，这表明细菌菌株的这种特定组合(包括LCr)有助于这些细菌种群的生物膜发展(图29-30)。

共培养的顺序：

为了测试细菌添加到基质:培养基的混合物中的顺序，在温育开始时，发明人将较弱/生长缓慢的菌株的添加和随后较强/生长较快的菌株的添加与相反的组合(先强后弱)进行了比较。这表明添加到发酵中的菌株的顺序是否有利于较弱菌株形成生物膜。

在本实验中，LRh、LCr、LJ和LG的细菌培养物的制备与材料和方法部分中描述的相似，但进行以下调整：当将来自每个菌株的浮游生物细菌添加到生长培养基和基质的混合物中时，在实验开始时，每个菌株一个接一个地添加，它们之间有0.5-1小时的间隔。有两种处理方法：

1)首先添加厌氧/生长缓慢的菌株，然后添加需氧/生长较快的菌株，LCr→LJ→LG→LRh；

2)首先添加较强/生长较快的菌株，然后添加缓慢的较弱/生长较慢的菌株，LRh→LG→LJ→LCr。

在总共72h内，每24h温育进行一次细菌种群生长分析。

将在共培养中生长的细菌菌株与单培养生长进行比较，并使用代谢组学技术分析代谢物的差异。

作为共培养物一起生长或每个菌株单独生长的LRh、LCr、LJ和LG的细菌种群培养物如材料和方法部分中所述制备。在72小时温育结束时，将培养细菌种群的生长培养基以最大速度离心10min，以去除碎片和浮游生物细菌。将上清液转移到干净的试管中并再次离心(相同条件)。上清液保持在-80℃下直到进行代谢分析。此外，研究了在生长培养基中添加不同补充剂(例如，碳水化合物比如低聚果糖和微量元素比如铁)对共培养物生长与单培养相比的影响。

实施例6

粒度和细菌对颗粒的亲和力

LG浮游生物细胞与不同颗粒温育24小时后，LG细菌种群的生长和发育如下：微晶纤维素:磷酸二钙(MCC:DCP)>MCC>藻酸盐>蔓越莓。基于这些结果，发明人提出，减小的粒度和基质类型的组合对生物膜形式的LG细菌的生长和发育产生积极影响：1)粒度-较小的粒度(较高的表面积与体积比)可以允许每颗粒体积附着更多细菌，从而改善细菌种群生长：与藻酸盐珠粒(1000μm)相比，MCC或MCC:DCP组合(80-150μm)上的细菌数量增加；2)基质的类型——不希望受任何特定理论的束缚，对于特定基质对生物膜生长和形成的贡献，本发明人在本文中提出了两种可能的解释(图31)。

尽管藻酸盐是蔓越莓的两倍大，但当用藻酸盐接种时，LG细菌种群的增长更高。另一个实例是MCC与MCC:DCP之间LG生物膜细胞数量的差异。少数研究表明外源性钙离子可以促进生物膜的形成，因此可溶性DCP颗粒(磷酸二钙)的存在和随后的钙离子可能会促进LG生物膜的生长和发育。

实施例7

动物和非动物培养基对细菌种群生长的影响

评估了不同的基于动物和基于非动物的生长培养基对LG、LRh、LCr和LJ的细菌种群生长和发育状态的影响(图32A-32C)。乳杆菌属在基于动物的肉汤(以下称为动物)和/或基于非动物的肉汤(以下称为非动物1和非动物2)上生长。

在第一个实验中，在不同生长培养基中培养24小时后，LG和LCr的细菌种群生长及其对pH的抗性如下：非动物1>非动物2>动物，而LJ显示出如下的生长和抗性模式，其中非动物1＝非动物2>动物(图33A-33C)。基于此实验，FG1肉汤是在中等规模设置或不同菌株中进行测试的选择培养基。

下一组实验用于评价与动物肉汤相比非动物1肉汤对LRh、LG和LCr的生长和生物膜发育的影响。在此，测试了抗性测定、pH值和抗生素，并使用两种实验设计(小规模或中等规模设置；图12A-C)中的一个进行了这些实验。总体而言，存活生物膜细胞的数量在非动物1肉汤中生长时更明显；对于所有测试的细菌菌株，记录了～1-2对数的增加。尽管如此，与动物相比，在非动物1中培养时，LG在酸性pH和抗生素存在下的存活和/或生长要好得多。在暴露于pH 3.5和NVB抗生素(而非pH 2和CB抗生素)后，与基于动物的培养基相比，接种在基于非动物1的培养基中的LCr中嵌入LCr和LRh的生物膜细胞数量更高。该结果与生物膜细胞数量的增加(pH 7)相关。总之，在生物膜中的细菌数量和生物膜发育方面，非动物培养基的生长显示出明显优于动物培养基的优势。这是针对本申请中测试的所有阴道细菌记录的(图33)。

实施例8

青春双歧杆菌单培养物VS.共培养物

发明人检查了青春双歧杆菌(BfA)与其与短双歧杆菌和长双歧杆菌长亚种的生物膜共培养物生长相比在单培养物中的生长性能。当与BLL和BfBr共培养时，与其单独生长相比，BfA在72h后显示出改善的生长(图34)。当与BfBr共培养时，与其单独生长相比，BfA在24h和72h后显示出改善的生长(图35)。

发明人进一步检查了添加时间是否可以改善共培养物中的青春双歧杆菌的生长。BfA与BLL和BfBr平行添加(‘对照’)或在添加BLL和BfBr前24h添加(‘BfA的优势’)。在添加BLL、BB-12和BfBr之前24h添加BfA时，观察到BfA的相对丰度更高(图36)。在添加BLL、BB-12和BfBr之前24h添加BfA(BfA的优势)时，与其和其他双歧杆菌种类平行添加(对照；图37-38)相比，观察到BfA的生长改善(～1对数差异)。

实施例9

普氏粪杆菌单培养物VS.共培养物

发明人检查了普氏粪杆菌(FaP)与其和卵形布劳特氏菌(BlO)、球形布劳特氏菌(B1C)或两者的生物膜共培养物生长相比在单培养物中的生长性能。与其单独生长相比，FaP在与BlO、BlC或两者共培养48h时显示出改善的生长(图39)。与其单独生长相比，FaP在与普通拟杆菌(BaV)或BaV和产甲酸多尔氏菌(产甲酸真杆菌)(DoF)共培养时也显示出改善的生长(图40)。

与其和BLP、BfA或多形拟杆菌(BaT)一起生长相比，发明人进一步检查了FaP的生长。此外，发明人检查了FaP较高的初始OD对其生长的影响。当与BfA或BaT共培养48h时，发现FaP具有改善的生长(图41)。

当与来自梭菌科和拟杆菌科的少数种类共培养时，发明人进一步检查了在72h温育期间FaP的相对丰度。当FaP与拟杆菌属共培养时，与其仅与梭菌属共培养的生长相比，观察到明显的优势(图42)。

进一步地，当与来自梭菌科和拟杆菌科的少数种类共培养时，发明人检查了在72h温育期间浮游生物和生物膜相中的FaP相对丰度。与浮游生物形式(图43A)相比，发现FaP在生长72h期间在生物膜(图43B)中具有更高的相对丰度。

尽管已经结合其特定实施方式描述了本发明，但是很明显，许多替代、更改和变化对于本领域技术人员来说将是显而易见的。因此，其意图包括落入所附权利要求的精神和广泛范围内的所有这种替代、更改和变化。

本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用以其整体并入本说明书中，其程度与每个单独的出版物、专利或专利申请被具体地且单独地通过参考并入本文的程度相同。此外，本申请中对任何参考文献的引用或标识不应被解释为承认这种参考文献可作为本发明的现有技术。就使用章节标题而言，它们不应被解释为必然限制。

Claims

1.一种组合物，其包括第一亲脂性载体和干燥生物膜形式的共培养益生菌以及第一药剂，所述干燥生物膜包括卷曲乳杆菌和选自以下的至少一种另外的细菌种类：加氏乳杆菌、詹氏乳杆菌和鼠李糖乳杆菌，所述第一药剂包括：抗生素剂、pH调节剂或两者。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述干燥生物膜形式的共培养益生菌和包括抗生素剂的所述第一药剂均匀分散在所述组合物中。

3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述干燥生物膜形式的共培养益生菌为所述总组合物的10％至50％(w/w)。

4.根据权利要求1至3所述的组合物，其中所述干燥生物膜形式的共培养益生菌附着至颗粒。

5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述颗粒选自：种子、MCC、磷酸二钙、多糖、及其任意组合。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其进一步包括第二层。

7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述第二层包括第二亲脂性载体、第二药剂或两者。

8.根据权利要求7所述的组合物，其中所述干燥生物膜形式的共培养益生菌的释放比所述第二药剂的释放慢。

9.根据权利要求7或8所述的组合物，其中所述第一药剂和所述第二药剂中的任一种是抗生素。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的组合物，其进一步包括稳定剂、防腐剂、润滑剂、粘度改性剂、缓冲剂、脂肪酸及其组合。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的组合物，其用于治疗细菌性阴道病。

12.一种组合物，其包括：

干燥生物膜形式的共培养益生菌，其包括：

a.普氏粪杆菌和选自以下的至少一种另外的细菌种类：卵形布劳特氏菌、球形布劳特氏菌、普通拟杆菌和产甲酸多尔氏菌(产甲酸真杆菌)；

b.卷曲乳杆菌和选自以下的至少一种另外的细菌种类：加氏乳杆菌、詹氏乳杆菌和鼠李糖乳杆菌；或

c.青春双歧杆菌和选自以下的至少一种另外的细菌种类：长双歧杆菌长亚种和短双歧杆菌。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的组合物，其被配制用于选自以下的递送途径：口服、阴道、直肠和局部。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的组合物，其为栓剂形式。

15.一种用于调节有需要的受试者的菌群的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1至14中任一项所述的组合物，从而调节所述受试者的所述菌群。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述菌群是阴道菌群、肠道菌群或皮肤菌群。

17.根据权利要求15或16所述的方法，其中所述调节是恢复所述受试者的所述天然菌群。

18.根据权利要求15至17中任一项所述的方法，其用于预防或治疗有需要的受试者中生态失调相关的病症或肠道和代谢疾病。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述生态失调相关的病症或肠道和代谢疾病选自：细菌性阴道病、泌尿生殖道感染、溃疡性结肠炎、炎性肠病(IBD)、克罗恩病、结肠直肠癌、肥胖症和乳糜泻。

20.一种制备权利要求1所述的组合物的方法，其包括以下步骤：

a.用卷曲乳杆菌接种包括颗粒的生长培养基；

b.将来自步骤(a)的所述颗粒与卷曲乳杆菌在适合于允许卷曲乳杆菌附着于所述颗粒的条件下温育；

c.用至少一种另外的细菌种类接种步骤(b)的所述颗粒；和

d.在适合于形成生物膜的条件下培养步骤(c)的所述接种的颗粒，所述生物膜包括：卷曲乳杆菌和至少一种另外的细菌种类。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述至少一种另外的细菌种类选自：詹氏乳杆菌、加氏乳杆菌和鼠李糖乳杆菌。

22.一种制备权利要求12所述的组合物的方法，其包括以下步骤：

-在适合于允许所述第一细菌附着于所述颗粒的条件下将所述颗粒与所述第一细菌一起温育；

-用至少一种另外的细菌种类接种所述颗粒；和

-在适合于形成生物膜的条件下培养所述接种的颗粒，所述生物膜包括：(i)卷曲乳杆菌；(ii)青春双歧杆菌；(iii)普氏粪杆菌，和至少一种另外的细菌种类。

23.根据权利要求22所述的方法，其中当所述第一细菌是卷曲乳杆菌时，所述至少一种另外的细菌种类选自：詹氏乳杆菌、加氏乳杆菌和鼠李糖乳杆菌。

24.根据权利要求22所述的方法，其中当所述第一细菌是青春双歧杆菌时，所述至少一种另外的细菌种类选自：长双歧杆菌长亚种和短双歧杆菌。

25.根据权利要求22所述的方法，其中当所述第一细菌是普氏粪杆菌时，所述至少一种另外的细菌种类选自：卵形布劳特氏菌、球形布劳特氏菌、普通拟杆菌和产甲酸多尔氏菌(产甲酸真杆菌)。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述第一细菌是普氏粪杆菌，并且所述接种步骤是同时进行的。