KR20130143229A - 틴달화 락토바실루스 아시도필루스 사균체 조제방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 틴달화 락토바실루스 아시도필루스 사균체 원료 조제시 발생되는 카라멜 당과 색소로 인한 원료의 갈변현상을 제거하기 위한 최적조건을 확립하고 틴달화과정에서 발생되는 밀라드반응의 부산물인 당단백을 제거하는 방법을 적용하여 원료조제시 갈변화가 없는 안정한 틴달화 락토바실루스 아시도필루스 사균체 원료 제조방법에 관한 것이다. 또한 틴달화 균체제조를 상압과 감압농축하에서 틴달화하는 2단계 틴달화공정을 개발 도입함으로써 항균력과 유해세균억제물질 생산을 극대화하였다. 본 발명을 통해 개발된 틴달화 락토바실루스 아시도필루스 사균체 제조방법은 조제과정 중 갈변화 원인을 단계별로 제거하여 궁극적으로는 보관 중 발생되는 갈변현상이 없는 안정한 틴달화 락토바실루스 아시도필루스 사균체 원료를 제조할 수 있으며 기존의 발효여액과 틴달화균체를 각각 건조하여 분말화한 후 혼합하는 방식의 이원화 건조방법을 일원화함으로써 제조공정을 효율적으로 운용할 수 있어 산업적으로 유용한 방법이다.
Description
본 발명은 틴달화 락토바실루스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus) 사균체의 안정성과 품질을 개선한 조제법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 본 발명은 틴달화 과정에서 발생되는 카라멜화반응(caramelization)과 밀라드반응(Maillard reaction)을 통해 생성된 비가역 카라멜 색소와 당단백질을 흡착제와 여과방법으로 제거하여 원료상에서 갈변과 인습문제를 해소한 항균용 틴달화 락토바실루스 아시도필루스 사균체 제조방법에 관한 것이다.
락토바실루스 아시도필루스는 당분을 발효하여 젖산(lactic acid)을 대량으로 생산하고 항균성 펩타이드인 박테리오신(bacteriocin) 등 여러가지 항균성 물질을 생산하고 있다. 락토바실루스 아시도필루스의 발효산물 중 젖산은 장내 산도를 증가시킴으로서 소장과 대장의 연동을 촉진시킴으로써 소화흡수와 설사를 예방한다. 또한 락토바실루스 아시도필루스가 생산하는 박테리오신은 대부분 음이온성이고 소수성이며 양친매성 펩타이드로서 20~60개의 아미노산으로 구성되어 있다. 이러한 항균성분은 장내 병원성균인 급성 설사를 일으키는 대장균 및 식중독을 유발하는 살모넬라 등에 유효 항균력을 나타낸다.
락토바실루스 아시도필루스의 발효산물 외에 생균(live cells, 生菌)은 장내 유해세균과 경쟁적 부착저해능을 발휘하여 장내 세균총을 형성하는데 기여를 한다. 사균(dead cells, 死菌)의 경우 생균과 같이 직접적인 경쟁적 부착저해효능을 나타내지 않으나, 균체 틴달화로 세포벽이 파괴되면서 용출된 세포벽 구성성분인 lipoteichoic acid가 장내 유해세균이 장점막에 정착하는 것을 방해한다. 락토바실루스 아시도필루스의 세포벽 구성성분으로 흡착억제효과를 나타내는 lipoteichoic acid의 작용으로 장내 유해세균인 대장균과 살모넬라 등은 장내 환경에서 표면에 흡착하지 못하고 장분비액과 장연동에 의해 씻겨 내려가게 된다.
따라서 현재 식약청 고시에는 의약품 락토바실루스 아시도필루스는 생균 또는 사균체(사균+발효농축물) 규격으로 구분되어져 있다. 이때 사균체는 사균수로 300 억 cells/g 이상이 포함되어 있으며, 항균력으로는 살모넬라 파라티피 A (Salmonella paratyphi A)에 대해 틴달화 락토바실루스 아시도필루스 사균체 원료의 최소저해농도 (MIC, Minimum Inhibitory Concentration)를 8.5% (w/v)로 정의하고 있다.
락토바실루스 아시도필루스의 생균을 사균화하는 방법으로 틴달화라는 간헐멸균법으로 행해지고 있으며 보다 상세하게는 60 ~ 160℃에서 10 ~ 60분간 가열하고 20 ~ 40℃ 또는 20℃ 이하로 급속 냉각시키는 방법이다. 이와 같은 사균체 제조방법은 대한민국 특허출원 제 10-2000-0046149에 개시하고 있다. 구체적인 상기 제조방법은 원심분리하여 수득한 엔테로코카스 페카리스 (Enterococcus faecalis)균괴를 생리식염수에 현탁시키고 가용성 전분을 투입하고 110℃에서 15분간 열처리한 후 살균하는 방법을 사용하거나 초음파(sonocation)방법으로 균을 파쇄하는 방식을 사용하는 것을 특징으로 한다.
그러나 상기 방법은 균체의 특정성분, lipoteichoic acid 과 같은 성분을 통해 장내 유해세균의 장정착을 방해하려는 목적이며, 직접적인 항균성분이 함유되어 있는 발효물을 사용하지 않았기 때문에 발효를 통해 생성된 박테리오신 등의 항균작용을 기대하기는 어려운 문제점이 있다.
또 다른 사균체 제조방법으로 생균과 발효물을 모두 사용하는 방법이 대한민국 특허출원 제 10-2011-0110381에 개시되어 있다. 구체적인 내용으로는 발효액을 직접적으로 틴달화하면 카라멜화 반응과 밀라드반응이 일어나 품질에 영향을 미치므로 이를 유산균 발효액을 원심분리과정을 통해 발효여액과 균체 포함액으로 구분하고 발효여액은 틴달화 및 유동층건조를 통해 농축하여 분말화한 틴달화 여액건조물을 조제하고 균체 포함액은 틴달화 및 동결건조를 통해 틴달화 사균체분말을 만들어 혼합하는 방식을 사용하는 것을 특징으로 한다.
그러나 상기 방법은 단순히 균체와 발효여액을 분리하였을 뿐, 틴달화 방법을 각각 적용하여 진행하기 때문에 고온 농축과정에서 발효여액에 함유되어 있는 당성분이 카라멜화되거나 석출된 단백질과 반응하여 카라멜당이 되는 밀라드반응이 일어나 발효농축액의 색상이 짙어지는 갈변 문제를 일으키고, 저온으로 낮추는 과정에서 비가역적인 당단백등이 과포화되고 이러한 성분을 기반으로 조제한 틴달화 유산균 사균체는 인습과 갈변문제를 일으키게 된다. 또한 상기 개시된 방법은 배양액을 균체와 여과액으로 분리하여 각각을 다른 방식으로 건조하여 분말화하기 때문에 균체분말과 발효여액농축분말의 수분활성(water activity)의 불균형을 가져와 장기보관시 인습과 갈변문제를 유발하기 쉽고 이원화된 틴달화 균체분말과 발효여액농축분말 조제하고 이를 적당한 비율로 혼합할 수 있다고 개시하고 있으나 매 생산 롯트별 색상이나 항균력의 차이를 나타내 품질 밸리데이션의 문제점이 여전히 지적되어 왔다.
이에 본 발명자들은 락토바실루스 아시도필루스 발효액을 균체와 발효여액으로 분리한 후, 발효여액에 흡착제와 여과법을 적용하여 발효여액에 포함되어 있는 카라멜화 색소와 과포화 침전 당단백질을 효율적으로 제거함으로써 인습과 갈변문제를 근본적으로 해결하고 균체 틴달화 방법으로 1차 단독 틴달 후, 갈변 유발물질을 제거한 여액과 혼합하여 감압농축조건에서 2차 틴달화를 진행함으로써 갈변화문제를 해결한 일원화된 제조프로세스를 갖는 틴달화 락토바실루스 아시도필루스 사균체 원료의 조제방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은
(a) 락토바실루스 아시도필루스 발효여액의 카라멜화 색소와 당단백질을 제거하는 단계;
(b) 락토바실루스 아시도필루스 발효균체를 1차 틴달화하는 단계;
(c) 상기 (a)와 (b)단계의 여과액과 1차 틴달화한 락토바실루스 아시도필루스를 혼합하여 감압농축조건에서 2차 틴달화하여 락토바실루스 아시도필루스 사균체 원료의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기의 제조 방법으로 제조된 경시적 안정성이 우수한 틴달화 락토바실루스 아시도필루스 사균체 원료를 제공한다.
이하, 본 발명의 인습과 갈변현상이 제거된 틴달화 락토바실루스 아시도필루스 사균체 원료의 제조방법을 상세히 설명한다.
(a) 락토바실루스 아시도필루스 발효여액의 카라멜화 색소와 당단백질을 제거하는 단계:
본 발명자들이 사용한 락토바실루스 아시도필루스 발효여액은 식약청 DMF (Drug Master File) 고시 유산균으로 이 락토바실루스 아시도필루스 발효액의 종료 pH는 4.0~4.3 으로 산성 pH를 나타낸다. 이는 락토바실루스 아시도필루스가 젖산을 발효산물로 생산하는 homofermentative lactic acid bacteria 군의 유산균이기 때문에 다른 유산균에 비해 산도(acidity)가 높은데 기인한다. 젖산과 같은 유기산(organic acid)의 생성으로 낮아진 pH 환경은 잔류 당의 카라멜화를 가속시키고 석출된 단백질과 밀라드 반응을 일으켜 카라멜색소를 유발시켜 항균용 틴달화 유산균 원료의 색상을 짙게 하여 품질을 떨어뜨리고 비가역적으로 생성된 카라멜당은 외부 습기를 흡수하여 인습문제를 일으킨다. 따라서 배지멸균(autoclave), 틴달화, 감압농축(evaporation) 과정에서 발생되는 카라멜화 반응을 제거하는 것이 중요하다.
(a) 단계에서 락토바실루스 아시도필루스 배양액에 흡착제를 혼합하여 탈색한다. 인습과 갈변현상의 원인인 카라멜화 색소를 제거하기 위한 탈색공정은 중요한 항목이다. 탈색을 위한 흡착제에는 구체적으로 이에 한정되지는 않지만, 규조토, 활성탄, 산화알루미나, 실리카겔, 활성알루미나겔이 포함될 수 있으며 바람직하게는 규조토 또는 활성탄이며 더욱 바람직하게는 활성탄을 말한다. 상기 탈색 목적의 활성탄은 락토바실루스 아시도필루스 배양액에 1% (w/v) ~ 10% (w/v) 첨가한 비율로 가장 바람직하게는 4~5% (w/v)의 첨가비율이다. 본 발명의 일시시예에서는 락토바실루스 아시도필루스 배양액의 틴달화과정에서 생성된 카라멜 색소를 효과적으로 제거함과 동시에, 틴달화 락토바실루스 아시도필루스 의약품원료의 항균력 측정 시험균주인 살모넬라 파라티피 A에 대한 기준역가에 부합되고 항균력을 소실시키지 않는 흡착제 종류를 결정하였다(표 1 참조). 그 결과, 활성탄을 사용하였을 때 카라멜 색소의 제거효과가 가장 좋았으며 원료조제시 항균력에 미치는 영향 또한 거의 없었다. 또한 활성탄을 농도별로 혼합하여 색소제거를 한 결과, 활성탄 4~5% (w/v)로 첨가하였을 때 카라멜 색소제거 효과가 가장 뛰어났다(표 1, 도면 3 참조).
상기 카라멜 색소를 흡착제 처리로 제거한 락토바실루스 아시도필루스 여액에 잔류하는 당단백질은 2차틴달화과정에서 잔류 당과 밀라드 반응을 일으켜 2차 갈변화할 수 있다. 따라서 산성 pH를 나타내는 상기 여액을 농축하고 다시 저온에서 냉각하면서 침전된 당단백질을 여과법으로 제거하였다. 당단백질의 제거에는 구체적으로 이에 한정되지는 않지만 원심분리 (centrifugation), 필터프레스(filter press), 뎁스필터여과(depth filtration), 한외여과가 포함되며, 바람직하게는 한외여과와 마이크로필터여과이며 더욱 바람직하게는 한외여과법을 말한다(표 3 참조).
(b) 락토바실루스 아시도필루스 발효균체를 1차 틴달화하는 단계;
락토바실루스 아시도필루스 발효균체를 틴달화하기 위해 온도를 60~120℃까지 10~60분의 범위로 세분화하여 틴달화 조건을 설정하였다. 생균을 사균화하는 가장 중요한 목적은 락토바실루스 아시도필루스 세포 구조물에 포함되어 있는 대표성분인 lipoteichoic acid 등의 유해세균 부착저해물질을 용출시키는데 있으므로 Caco-2 cells에 대한 살모넬라 티피뮤리움 KCTC 2054 (Salmonella typhimurium KCTC 2054)의 부착저해능을 평가하여 1차 틴달화 조건을 확립하였다.
그 결과, 락토바실루스 아시도필루스 균액을 80℃, 60분간 열처리하였을 때, 살모넬라 티피뮤리움 KCTC 2054의 Caco-2 cells로의 부착저해율이 상대적으로 가장 뛰어났다 (표 4 참조).
(c) 상기 (a)와 (b)단계의 여과액과 1차 틴달화한 락토바실루스 아시도필루스를 혼합하여 감압농축조건에서 2차 틴달화하여 락토바실루스 아시도필루스 사균체 원료를 제조하는 단계;
상기 여과한 락토바실루스 아시도필루스 여과액과 1차 틴달화한 락토바실루스 아시도필루스 사균체를 감압농축조에서 혼합한 후 60℃ 조건으로 2차 틴달화 농축하고 농축액을 전분과 같은 캐리어(carrier)와 혼합한 후 과립제형을 만들고 이를 동결건조 또는 유동층건조를 하여 인습과 갈변화하지 않는 틴달화 락토바실루스 아시도필루스 사균체 원료를 조제하였다. 일실시예에서 상기 조건으로 조제한 원료를 카라멜화 당과 색소를 제거하지 않은 원료와 함께 KFDA 고시의 기준 및 시험법에 따른 항온항습조건에서 경시적 안정성을 평가하였다. 그 결과, 카라멜화 당과 색소를 제거하지 않은 락토바실루스 아시도필루스 틴달화 원료는 갈변화가 발생한 반면, 상기 조제방법으로 제조한 원료의 경우 갈변화가 일어나지 않았다.
따라서 본 발명은 틴달화 락토바실루스 아시도필루스 사균체 원료 제조공정에서 발생되는 인습과 갈변의 원인이 되는 카라멜화 당과 당단백질, 카라멜 색소를 활성탄과 한외여과법을 이용하여 제거한 후 1차 틴달화 균체와 여과액을 혼합하여 감압조건에서 2차 틴달화 농축공정으로 만든 건조분말은 외부 수분에 대해 안정성을 갖는다. 또한 기존의 개선된 틴달화 락토바실루스 아시도필루스 사균체 원료 제조방법에서 상기와 같은 문제점을 해결하지 못했던 것은 흡착제 사용시 항균성분의 제거로 인한 의약품 기준에 항균력이 미달될 수 있기 때문이다. 본 발명에서는 인습과 갈변의 문제를 유발하는 원인을 근본적으로 제거함과 동시에 최적화 과정에서 살모넬라 파라티피 A 에 대한 항균력 기준에 부합되는 조건을 확립함으로써 우수 품질의 틴달화 락토바실루스 아시도필루스 사균체 원료 제조방법을 완성하였다.
도 1은 종래 기술에 따른 틴달화 유산균 원료 제조방법을 나타내는 공정도이다.
도 2는 본 발명에 따른 틴달화 락토바실루스 아시도필루스 사균체 제조방법을 나타내는 공정도이다.
도 3은 틴달화 발효여액에서 카라멜화 색소를 제거하기 위해 첨가한 활성탄 농도에 따른 탈색효과를 나타낸 사진이다.
도 4는 도 2의 제조방법으로 제조한 틴달화된 락토바실루스 아시도필루스의 전자현미경사진이다.
도 5는 도 2의 제조방법으로 제조한 틴달화 락토바실루스 아시도필루스 사균체 원료를 나타낸 사진이다.
도 6은 도 2의 제조방법으로 제조한 항균용 틴달화 락토바실루스 아시도필루스 원료의 살모넬라 파라티피 A 균주에 대한 항균력을 나타낸 사진이다.
도 2는 본 발명에 따른 틴달화 락토바실루스 아시도필루스 사균체 제조방법을 나타내는 공정도이다.
도 3은 틴달화 발효여액에서 카라멜화 색소를 제거하기 위해 첨가한 활성탄 농도에 따른 탈색효과를 나타낸 사진이다.
도 4는 도 2의 제조방법으로 제조한 틴달화된 락토바실루스 아시도필루스의 전자현미경사진이다.
도 5는 도 2의 제조방법으로 제조한 틴달화 락토바실루스 아시도필루스 사균체 원료를 나타낸 사진이다.
도 6은 도 2의 제조방법으로 제조한 항균용 틴달화 락토바실루스 아시도필루스 원료의 살모넬라 파라티피 A 균주에 대한 항균력을 나타낸 사진이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<
실시예
1>
틴달화
락토바실루스
아시도필루스
사균체
원료 조제
<1-1> 최적 흡착제의 결정
락토바실루스 아시도필루스 발효액은 1차 틴달화 후, 발효 배지 내의 잔류 당과 pH 산성화에 따른 밀라드반응으로 침전된 단백질과 반응하여 갈변화가 촉진되고 이 원인 물질이 항균용 틴달화 유산균 원료 제조시, 원료의 갈변을 일으키거나 끈적거림등의 물성변화를 일으켜 제품의 품질을 떨어뜨리게 되어 이를 제거하는 방법을 고안하였다. 본 발명에서 사용한 흡착제는 다공성 입자성을 가진 기제로 규조토, 활성탄, 산화알루미나, 실리카 겔, 활성 알루미나 겔을 포함한다. 구체적으로는 상기 흡착제를 1차 틴달화된 락토바실루스 아시도필루스 발효 여액 200 mL 당 2g 내지 20g을 첨가하고 상온에서 일정속도로 16시간 교반시켜 반응시켰다. 반응이 끝나면 10,000 RPM, 10분 동안 원심분리한 후 회수한 상등액은 400 nm에서 흡광도를 측정하여 탈색정도를 상대비교하였다. 항균용 틴달화 유산균 원료는 품질도 중요하지만, 의약품 기준 및 시험법의 지시균인 살모넬라 파라티피 A에 대한 항균력을 포함하고 있어야 하므로 탈색과정에서의 항균력 소실 여부를 판단하기 위해 탈색된 각각의 상등액을 감압농축기(evaporator)를 사용하여 10 mL까지 농축하고 이를 틴달화된 균체와 혼합 후, 건조 분말로 20g 조제하여 의약품 기준 및 시험법에 준한 항균력 평가를 하여 부합 여부를 판정 후, 흡착제를 최종 선발하였다. 세부 시험방법은 다음과 같다.
* 세균성장 저지력 측정시험 (
KFDA
의 기준 및 시험방법 제
3개정
)
1) 살모넬라 파라티피 A 시험균 용액조제
살모넬라 파라티피 A 시험균 용액 조제 Tryptic soy agar에서 자란 살모넬라 파라티피 A 균체를 1 loop 취하여 멸균된 시험균 부유용액 5 mL에 현탁하여 O.D. 620 nm값 0.15로 조정한다. 이 용액을 시험균 용액으로 사용한다.
2) 조작법
- 아시도필루스 틴달화동결건조물 1.7g (검액 A), 2.4g (검액 B)을 시험균 부유용액 20 mL에 각각 넣고 5~10분간 교반하면서 현탁한다.
- 현탁액을 원심분리 (5,000 RPM/ 15분)한 후, 상등액을 membrane filter (0.45 um)로 여과멸균한다.
- 검액 A, B의 여과멸균액 각 5 ml를 멸균된 시험관에 넣고 살모넬라 파라티피 A 시험균 용액 0.1 ml를 접종한다.
- 검액 A, B에 살모넬라 파라티피 A 용액 0.1 ml 대신 시험균 부유용액 배지 0.1 ml를 접종한 것을 대조군으로 한다.
- 37℃에서 배양하면서 균의 성장을 관찰한다.
3) 판정
배양 5~6시간 후에 검액 A(1.7g), B(2.4g)에서는 균이 성장하지 않고 대조군에서는 균의 성장이 관찰되어야 하며, 24시간 후 대조군에서는 균의 성장이 왕성해야 하고 검액 A에서는 약간의 균 성장이 관찰되며 검액 B에서는 균의 성장이 관찰되어서는 안된다.
4) 시험균부유용액 배지 (PYB)
Peptone 0.5%, yeast extract 0.15%, beef extract 0.15%, sodium chloride 0.35%, glucose 0.1%, K2HPO4 0.368%, KH2PO4 0.132%
|
농도
(w/v, %) |
400 nm 에서의 흡광도 | ||||
| 규조토 | 활성탄 | 산화알루미나 | 실리카겔 |
활성
알루미나겔 |
|
| None | 2.837 | ||||
| 1 | 1.122 | 0.712 | 2.426 | 1.855 | 1.941 |
| 2 | 0.534 | 0.245 | 1.323 | 1.289 | 1.354 |
| 3 | 0.216 | 0.103 | 1.224 | 1.056 | 1.117 |
| 4 | 0.105 | 0.073 | 1.004 | 0.951 | 0.989 |
| 5 | 0.091 | 0.071 | 0.828 | 0.557 | 0.654 |
| 7 | 0.082 | 0.068 | 0.754 | 0.451 | 0.569 |
| 10 | 0.078 | 0.065 | 0.668 | 0.312 | 0.421 |
흡착제와 그 농도별 흡착효과를 비교한 결과, 표 1에서 보는 바와 같이 활성탄과 규조토가 상대적으로 높은 흡착율을 나타내었으며, 농도 의존적인 탈색효과를 보였다.
|
농도
(w/v, %) |
세균성장저지력(살모넬라 파라티피 A)/ 원료갈변여부 | ||||
| 규조토 | 활성탄 | 산화알루미나 | 실리카겔 |
활성
알루미나겔 |
|
| None | +/+ | ||||
| 1 | +/+ | +/+ | +/+ | +/+ | +/+ |
| 2 | +/+ | +/+ | +/+ | +/+ | +/+ |
| 3 | +/+ | +/+ | +/+ | +/+ | +/+ |
| 4 | +/- | +/- | +/+ | +/+ | +/+ |
| 5 | +/- | +/- | +/+ | +/+ | +/+ |
| 7 | -/- | -/- | -/+ | -/+ | -/+ |
| 10 | -/- | -/- | -/+ | -/+ | -/+ |
* 세균성장저지력 :
KFDA
의 기준 및 시험법 제
3개정판
**세균성장저지력 + :
effective
, - :
ineffective
*** 갈변도 + : 갈변, - :
비갈변
또한 각각의 흡착제와 그 농도별로 원료조제 후, KFDA의 기준 및 시험법 중 항균력 평가를 진행하여 흡착제 사용에 따른 유효 항균성분이 흡착제거되어 원료의 항균력을 낮출 가능성에 대해 고찰하였다. 그 결과, 표 2에서 보는 바와 같이 활성탄과 규조토는 항균력은 1~5% (w/v) 사용하였을 때 유지가 되었으나, 7~10% (w/v) 사용시 항균성분이 흡착제거되어 기준 및 시험법에 부적합한 것으로 나타났다. 원료의 갈변여부는 1~3% (w/v)사용시 갈변화를 보여 낮은 농도에서는 흡착효과가 떨어지는 것으로 확인되었다. 따라서 상기와 같은 결과에 따라 활성탄 또는 규조토 4~5% (w/v) 첨가가 의미있는 결과였으며, 그 중 4% (w/v) 사용이 가장 바람직하였다.
<1-2> 당단백질 제거
활성탄을 사용하여 항균역가 소실이 없으면서 카라멜 색소가 제거된 여액을 감압 농축을 진행하면서 당단백질의 침전을 유도하였다. 이렇게 침전된 당 당백질을 효율적으로 제거하기 위한 물리적 여과법을 적용하였다. 물리적 여과법에 따라 원료의 갈변화와 항균력에 미치는 영향을 각각의 방법별로 평가하였다. 원료의 갈변화는 육안관찰에 의해 평가하였으며, 항균력은 의약품 기준 및 시험법의 지시균인 살모넬라 파라티피 A에 대한 항균력 평가기준에 부합되는지 여부를 판단하였다. 침전된 당단백질의 제거에 따른 항균력 소실 여부를 판단하기 위해 침전된 당단백질을 제거한 각각의 상등액 또는 여과액을 감압농축기(evaporator)를 사용하여 10 mL까지 농축하고 이를 틴달화된 균체와 혼합 후, 건조 분말로 20g 조제하여 의약품 기준 및 시험법에 준한 항균력 평가를 하여 부합 여부를 판정 후, 여과법을 최종 선발하였다. 또한 잔류 단백질의 양을 정량하기 위해 280 nm에서 흡광도를 측정하여 상대비교하였다.
| 여과방식 |
원심분리
( centrifugation ) |
필터
프레스 ( filter press ) |
뎁스필터
여과 ( depth filtration ) |
한외여과
( ultra filtration ) |
마이크로필터
여과 ( microfiltration ) |
| 항균력/ 원료갈변 | +/+ | +/+ | +/+ | +/- | +/- |
|
여과액 단백질 정량
(흡광도 280 nm ) |
0.87 | 1.32 | 0.95 | 0.52 | 0.61 |
* 세균성장저지력 :
KFDA
기준 및 시험법 (제
3개정판
)
**세균성장저지력 + :
effective
, - :
ineffective
*** 갈변도 + : 갈변, - :
비갈변
그 결과는 표 3에서 보는 바와 같이, 한외여과법과 마이크로필터여과법이 가장 원료 갈변을 일으키지 않았으며, 특히 한외여과법은 막여과방식으로 분자량의 크기에 따라 분리와 제거를 할 수 있으므로 침전 단백질을 효율적으로 제거할 수 있는 것으로 판단되어 진다.
<1-3> 균체
틴달화
조건
락토바실루스 아시도필루스의 세포벽에 존재하는 lipoteichoic acid는 장내 유해세균인 대장균과 살모넬라 등이 장막표면에 부착하는 것을 저해하는 특성을 갖는다. 따라서 생균인 락토바실루스 아시도필루스를 사균화하는 공정인 틴달화 조건에 따라 lipoteichoic acid의 용출양이 달라지고 결과적으로는 장내 유해세균의 부착저해능이 달라질 수 있다. 따라서 온도와 시간에 따른 틴달화 조건을 최적화하고 이를 Caco-2 cells에 대한 살모넬라 티피뮤리움 KCTC 2054 (Salmonella typhimurium KCTC 2054)의 부착저해능을 평가하여 최적조건을 선발하였다. 보다 상세한 시험방법은 다음과 같다.
락토바실루스 아시도필루스 균체를 60~120℃까지 10분, 20분, 30분, 40분, 50분, 60분까지 세분화하여 열처리 한 후, 30℃로 냉각시켜 시험샘플로 사용하였다. Caco-2 cells에 대한 부착능 시험에서 지시균은 살모넬라 티피뮤리움 KCTC 2054을 사용하였다. 부착능 시험은 살모넬라 티피뮤리움 KCTC 2054를 Caco-2 cells에 먼저 부착시킨 후, 각각의 조건의 틴달화 락토바실루스 아시도필루스 균체를 처리하였을 때, Caco-2 cells에 부착되어 있는 살모넬라 티피뮤리움 KCTC 2054의 균수를 측정하여 이를 저해율로 환산하는 방법을 사용하였다.
보다 더 구체적으로는 Caco-2 cell monolayer는 Caco-2 cells를 10% (v/v) fetal calf serum과 20 uL/mL의 gentamicin을 첨가한 Dulbecco`s Modified Eagle`s Medium (DMEM, Hyclone, USA)에 1.2 x 105 cells/mL 농도로 접종하고 six-well tissue culture plate (Becton, Dickinson and Company, USA) well 당 1 mL 분주하여 7일간 배양한 후, phosphate buffered saline (PBS, pH 7.2)으로 2회 세척하여 제조하였다. 살모넬라 티피뮤리움 KCTC 2054의 시료는 각각 brain heart infusion (BHI, BD, USA) 배양액 10 mL를 원심분리하여 균체를 회수하고 PBS로 2회 세척한 다음 1 mL PBS에 재현탁하고 serum-free DMEM에 1 x 108 CFU/mL 농도로 희석하여 조제하였다. 틴달화 락토바실루스 아시도필루스 각 조건별 샘플 1 mL와 살모넬라 티피뮤리움 KCTC 2054 시료액 1 mL를 각각 혼합하고 Caco-2 monolayer가 형성된 각 wells에 혼합액 1 mL를 넣어 90분간 반응시켰다. 대조군으로는 틴달화 락토바실루스 아시도필루스 샘플 대신, DMEM 1 mL 사용한 것으로 하였다. 반응 후 상층액을 제거하고 Caco-2 cells를 PBS로 2회 세척하여 부착되지 않은 살모넬라 티피뮤리움 KCTC 2054를 제거하였다. Tween 80 0.04% (w/v) 1 mL를 가하여 Caco-2 cells에 부착된 살모넬라 티피뮤리움 KCTC 2054를 회수하고 생균수를 측정하였다. 살모넬라 티피뮤리움 KCTC 2054의 부착 저해율은 다음과 같이 계산하였다.
살모넬라 티피뮤리움 부착저해율 (%)
=[1-(틴달화 락토바실루스 아시도필루스 샘플 처리시의 살모넬라 티피뮤리움 부착균수/ DMEM 처리시의 살모넬라 티피뮤리움 부착균수)] x 100 (%)
| 구분 |
살모넬라
티피뮤리움
부착저해율 (%)
틴달화 온도 |
||||
| 60℃ | 80℃ | 100℃ | 120℃ | ||
| 틴달화 시간 | 10분 | 8% | 16% | 25% | 28% |
| 20분 | 15% | 31% | 32% | 36% | |
| 30분 | 24% | 42% | 40% | 41% | |
| 40분 | 29% | 51% | 46% | 46% | |
| 50분 | 31% | 74% | 51% | 48% | |
| 60분 | 35% | 88% | 54% | 53% | |
생균을 사균화하는 가장 중요한 목적은 세포 구조물에 포함되어 있는 성분이 유해세균의 장점막 부착을 방해하기 때문이다. 따라서 틴달화라는 온도와 시간의 변수로 이 세포 구조물에 포함되어 있는 대표성분인 lipoteichoic acid 등 부착저해물질을 용출시키는데 있다. 따라서 표 4에서 보는 바와 같이, 락토바실루스 아시도필루스의 틴달화 조건은 80℃, 60분 처리시 가장 부착저해 효율을 나타내었다.
| 구분 |
살모넬라
티피뮤리움
부착저해율 (%)
틴달화 온도 |
|||
|
1차
틴달조건
(60℃,60분) |
1차
틴달조건
(80℃,60분) |
1차
틴달조건
(100℃,60분) |
1차
틴달조건
(120℃,60분) |
|
|
2차
틴달조건
(60℃, 100 mmHg ) |
56% | 92% | 73% | 70% |
락토바실루스 아시도필루스 균체만을 단독으로 틴달화한 경우보다 이를 압력을 주어 농축하는 방식인 감압농축조건(100mmHg)으로 2차 틴달을 유도하였을 때, 표 5에서 보는 바와 같이 유해세균 부착저해효율이 전체적으로 상승하는 것을 확인할 수 있었다. 이는 상압 조건에서 온도만을 올렸을 때 보다 진공도를 주어 온도를 상승시켜 틴달화를 유도하였을 때 유해세균 부착저해물질의 용출이 용이함을 확인할 수 있었다. 이를 전자현미경 사진으로 관찰하였을 때 정상 세포의 구조(간균, rod type)가 파괴되어 무정형의 성상을 나타냄을 확인할 수 있었다(도 4). 이러한 결과로 판단할 때, 틴달화 최적조건으로 세포파괴가 극대화되어야만 유해세균 부착저해효과가 높은 것으로 예상할 수 있다.
<1-4> 제조방법
안정성이 우수한 틴달화 락토바실루스 아시도필루스 사균체 원료의 제조방법은 대량 생산을 통해 최적화하였다. 보다 상세하게 생산규모는 3톤 발효탱크에서 37℃, 24시간 overnight 배양을 하였다. 락토바실루스 아시도필루스 배양종료액 2,400L를 basket type centrifugation으로 2회 원심분리한 후 균체와 균체가 제거된 여과액을 분리하였다. 회수한 여과액에 활성탄 4% (w/v)를 처리하고 원심분리하여 활성탄을 제거하였다. 회수한 여액의 잔류 단백질을 제거하기 위해 한외여과를 하였으며, 이와 별도로 락토바실루스 아시도필루스 생균을 80℃에서 60분간 열처리하여 틴달화하였다. 이렇게 틴달화된 균체를 한외여과액과 다시 혼합현탁한 후 60℃에서 감압농축하여 2차 틴달화 및 과립 건조하여 최종 원료를 조제하였다. 상세한 조제공정은 도 2에서 보는 바와 같으며, 이렇게 제조된 원료는 도 6과 같다.
<
실시예
2>
원료의 안정성
틴달화 락토바실루스 아시도필루스 사균체 원료의 갈변화를 측정하기 위해 도 2의 제조공정과 도 1의 탈색 및 한외여과방법을 사용하지 않은 공정으로 제조된 원료를 식약청 고시 안정성 시험기준에 따른 조건인 가속 조건 (40℃, 75% 상대습도)과 장기 조건 (25℃, 60% 상대습도)으로 알루미늄 팩과 PE 용기 조건으로 구분하여 측정하였다. 갈변화 측정은 최초 원료 조제시 색상을 기준으로 변화를 육안으로 관찰하여 평가하였다.
| 보관 조건 |
가속조건 (40℃, 75% 상대습도)
6개월 |
장기 조건 (25℃, 60% 상대습도)
12개월 |
||
| 알루미늄 파우치보관 | PE 용기 보관 | 알루미늄 파우치보관 | PE 용기 보관 | |
| 탈색 및 한외여과 비적용원료 | 갈변 | 갈변 | 비갈변 | 갈변 |
| 탈색 및 한외여과 적용 원료 | 비갈변 | 비갈변 | 비갈변 | 비갈변 |
관찰 결과 표 6에서 보는 바와 같이, 활성탄과 한외여과를 하지않은 틴달화 락토바실루스 아시도필루스 사균체 원료는 가속조건과 장기조건에서 원료 색상이 갈변화가 일어났으며, 그 중 알루미늄 파우치 포장조건에서 장기조건에서 갈변화가 일어나지 않았다. 반면, 본 발명의 조제방법을 적용한 틴달화 락토바실루스 아시도필루스 사균체 원료는 가속과 장기조건에서 갈변화가 일어나지 않아 안정된 성상을 유지하였다.
또한 가속 및 장기 보관에 따른 항균력 소실을 평가하기 위해 각각의 샘플군에 대한 세균 성장저지력을 식약청의 의약품 등 기준 및 시험방법에 따라 수행하였다.
| 보관 조건 |
가속조건 (40℃, 75% 상대습도)
6개월 |
장기 조건 (25℃, 60% 상대습도)
12개월 |
||
| 알루미늄 파우치보관 | PE 용기 보관 | 알루미늄 파우치보관 | PE 용기 보관 | |
| 탈색 및 한외여과 비적용원료 | 기준 부적합 | 기준 부적합 | 기준 적합 | 기준 부적합 |
| 탈색 및 한외여과 적용 원료 | 기준 적합 | 기준 적합 | 기준 적합 | 기준 적합 |
그 결과, 표 7에서 보는 바와 같이 탈색 및 한외여과 비적용한 틴달화 락토바실루스 아시도필루스 사균체 원료의 가속조건과 장기조건에서 기준에 미달되는 항균력을 나타내었다. 반면, 본 발명의 조제방법으로 제조한 틴달화 락토바실루스 아시도필루스 사균체 원료의 경우 가속과 장기조건에서 모두 기준에 적합하였다. 이러한 결과는 카라멜화된 당이 단백질과 아미노산과 반응하여 갈변현상을 일으키는데 이러한 현상이 항균역가를 떨어뜨리는 결과를 나타냈을 것으로 예상할 수 있다.
Claims (4)
- (a) 락토바실루스 아시도필루스 발효여액의 카라멜화 색소와 당단백질을 제거하는 단계;
(b) 락토바실루스 아시도필루스 발효균체를 1차 틴달화하는 단계;
(c) 상기 (a)와 (b)단계의 여과액과 1차 틴달화한 락토바실루스 아시도필루스를 혼합하여 감압농축조건에서 2차 틴달화하는 것을 특징으로 하는 틴달화 락토바실루스 아시도필루스 사균체 원료의 제조방법
- 제 1항에 있어서,
발효여액의 카라멜 색소를 제거하기 위하여 활성탄 또는 규조토를 흡착제로 사용하는 것을 특징으로 하는 틴달화 락토바실루스 아시도필루스 사균체 원료의 제조방법
- 제 1항 또는 2항에 있어서,
카라멜화 색소 제거 후, 탈색된 발효여액의 당단백질을 물리적 제거하기 위하여 한외여과법 또는 마이크로필터여과법을 사용하는 것을 특징으로 하는 틴달화 락토바실루스 아시도필루스 사균체 원료의 제조방법
- 제 1항에 있어서,
(b) 단계에서 락토바실루스 아시도필루스 균체를 온도조건으로 80℃ ~ 120℃에서 30분 ~ 60분간 1차 틴달화하고,
(c) 단계에서 갑압농축하에 60℃에서 2차 틴달화하는 것을 특징으로 하는 틴달화 락토바실루스 아시도필루스 사균체 원료의 제조방법
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2017048098A1 (ko) * | 2015-09-14 | 2017-03-23 | 일동제약(주) | 기능성 수화 히알루론산 및 이를 이용한 장 점막부착능이 우수하고 선택적 길항작용을 하는 코팅 유산균의 제조방법 |
| WO2018101611A1 (ko) * | 2016-11-30 | 2018-06-07 | 주식회사 락토메이슨 | 막 필터를 이용한 고농도 사균의 제조방법 및 이의 제조방법으로 제조된 사균 |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| KR101688224B1 (ko) * | 2015-05-01 | 2016-12-20 | 일동바이오사이언스(주) | 관절염 예방 및 치료 효과를 갖는 아이디-씨비티5101(id-cbt5101) 및 이의 용도 |
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|---|---|---|---|---|
| KR100903734B1 (ko) * | 2007-10-31 | 2009-06-19 | 이순덕 | 생과일 막걸리 제조방법 |
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| KR100983720B1 (ko) * | 2010-03-09 | 2010-09-24 | 황토나누리영농조합법인 | 살균사과막걸리 |
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Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2017048098A1 (ko) * | 2015-09-14 | 2017-03-23 | 일동제약(주) | 기능성 수화 히알루론산 및 이를 이용한 장 점막부착능이 우수하고 선택적 길항작용을 하는 코팅 유산균의 제조방법 |
| CN108779431A (zh) * | 2015-09-14 | 2018-11-09 | 日东制药株式会社 | 功能性水合透明质酸及其制备具优良肠粘膜粘附能力和选择性拮抗作用的包衣乳酸菌的方法 |
| US10894086B2 (en) | 2015-09-14 | 2021-01-19 | Ildong Pharmaceutical Co., Ltd. | Functional hydrated hyaluronic acid and method for producing coated lactic acid bacteria having excellent intestinal mucoadhesive ability and selective antagonistic action using same |
| CN108779431B (zh) * | 2015-09-14 | 2022-06-07 | 日东生物科学有限公司 | 功能性水合透明质酸及其制备具优良肠粘膜粘附能力和选择性拮抗作用的包衣乳酸菌的方法 |
| WO2018101611A1 (ko) * | 2016-11-30 | 2018-06-07 | 주식회사 락토메이슨 | 막 필터를 이용한 고농도 사균의 제조방법 및 이의 제조방법으로 제조된 사균 |
| US11685896B2 (en) | 2016-11-30 | 2023-06-27 | Lactomason Co., Ltd. | Method for preparing highly concentrated killed bacteria using membrane filter and killed bacteria prepared thereby |
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