CN108779431A - 功能性水合透明质酸及其制备具优良肠粘膜粘附能力和选择性拮抗作用的包衣乳酸菌的方法 - Google Patents

功能性水合透明质酸及其制备具优良肠粘膜粘附能力和选择性拮抗作用的包衣乳酸菌的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种功能性水合透明质酸及其制备具优良肠粘膜粘附能力和选择性拮抗作用的第5代包衣乳酸菌的方法。更具体地说，本发明涉及乳酸菌发酵成分被天然高分子物质透明质酸捕集的功能性水合透明质酸，以及使用该透明质酸制备包衣乳酸菌的方法。根据本发明的利用功能性水合透明质酸包覆的四层包衣乳酸菌，使用水溶性聚合物、功能性水合透明质酸、具有多孔颗粒的包衣剂及蛋白质进行4层包覆，肠粘膜粘附能力优秀，对肠道内有害菌具有抗菌作用，并对肠道内有益菌具有促进生长的作用。

Description

功能性水合透明质酸及其制备具优良肠粘膜粘附能力和选择 性拮抗作用的包衣乳酸菌的方法
技术领域
本发明涉及一种功能性水合透明质酸及-制备具优良肠粘膜粘附能力和选择性拮抗作用的包衣乳酸菌的方法。更具体地说，本发明涉及乳酸菌发酵成分被天然高分子物质透明质酸捕集的“功能性水合透明质酸”，以及使用该透明质酸制备包衣乳酸菌的方法，特别涉及用水溶性聚合物、功能性水合透明质酸、具有多孔颗粒的包衣剂及蛋白质包覆的、具有优良肠粘膜粘附能力和选择性拮抗作用的功能性包衣乳酸菌的制备方法。
背景技术
本申请主张于2015年9月14日提交的韩国专利申请第10-2015-0129986号的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
人体肠内寄居着拟杆菌(Bacteroides)、真细菌(Eubacteria)、双歧杆菌(Bifidobacteria)、乳酸杆菌(Lactobacilli)等400多种微生物。在健康人的肠道中，有益菌如乳酸菌和有害菌形成均衡(microflora)寄居在体内。由于肠道微生物菌群受到有害环境、摄入不卫生食物和服用抗生素的干扰，乳酸菌减少，大肠杆菌和沙门氏菌等有害菌增加。
益生菌是寄居在人类和动物胃肠道的微生物制剂，对人类和动物有益，包括乳酸杆菌(Lactobacilli)、双歧杆菌(Bifidobacteria)和肠球菌(Enterococci)等。
乳酸菌的肠道生理活性功能包括维持肠道菌群的平衡、抑制有害细菌的生长、防止腹泻、保护肠上皮细胞、抑制有毒物质的吸收、抑制癌变等。为了使乳酸杆菌充当益生菌，它们必须能与肠粘膜结合并增殖并具有对有害细菌的拮抗力。
为了使乳酸菌粘附到宿主的肠粘膜上，它们必须通过与宿主常驻菌群竞争而粘附。Nurmi和Rantala首次引入了对有害微生物的竞争性排除(competitive exclusion)，并报告将鸡肠内容物接种到刚孵出的小鸡中时，沙门氏菌感染减少。据报告，鸡的正常肠道微生物群更好地附着于肠壁表面细胞的吸附部分，产生脂肪酸和其他抗菌性物质，并在竞争营养素等方面是有利的。
乳酸菌具有吸附于宿主肠粘膜的性质，已知这是由于作为乳酸菌细胞壁的组分的脂磷壁酸(lipoteichoic acid)、多糖和蛋白质等参与对肠粘膜的粘附而导致的。
乳酸菌的细胞结构由细胞膜和围绕细胞膜的细胞壁组成。细胞壁在功能上显示乳酸菌的形状并包裹细胞膜以保护乳酸菌免受外部环境的影响。细胞壁的四个主要组分是肽聚糖(peptidoglycan)、磷壁酸(teichoic acid)、S层(S-layer)和多糖，它们参与肠粘膜的细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的结合。ECM是稳定的大分子组织，是上皮细胞和内皮细胞的基础。乳酸菌与肠粘膜的树突细胞(dendritic cells，DC)结合，然后传递包括肠调节作用在内的各种细胞信号以预防免疫疾病。
当乳酸菌通过竞争性排斥顺利地粘附于肠粘膜时，它们产生多种影响肠内其他微生物的物质。其中，乳酸(lactic acid)通过酸化肠内容物来抑制其他微生物的存活。
一般来说，乳酸菌为了发挥肠道内调节作用，乳酸菌与肠粘膜结合的能力应该优于大肠杆菌和沙门氏菌结合肠粘膜的能力，然而分类为革兰氏阳性菌的乳酸菌与大肠杆菌和沙门氏菌等革兰氏阴性菌相比，与肠粘膜结合力更弱。另外，根据分离源，乳酸菌具有不同的粘附能力。乳杆菌属(Lactobacillus)乳酸菌对小肠粘膜具有较好的粘附亲和力，双歧杆菌属(Bifidobacterium)益生菌对大肠粘膜具有优良的粘附亲和力。此外，由于植物来源的益生菌附着于植物表面并共生进化，因此对动物肠粘膜的粘附效率降低。
另一方面，传统的用于乳酸菌的技术已经从第一代到第四代根据穿过胃肠道时的存活率进行了分类。第一代是无包衣乳酸菌，第二代是肠溶包衣乳酸菌，第三代是微囊化乳酸菌，第四代是蛋白包衣乳酸菌，这些全部一直关注于通过胃肠道时有多少乳酸菌到达胃肠道。另外，被称为第五代包衣技术的基于透明质酸的四层包衣乳酸菌(参见韩国专利第10-1280232号)与常规的单一至三层包衣相比显著改善了耐热性、耐酸性和耐胆汁性，对乳酸菌的存活率有很大贡献。
以透明质酸为基础的传统四层包衣乳酸菌制备技术，使用天然高分子透明质酸作为包衣剂，与传统的单层至三层包衣乳酸菌相比，耐热性、耐酸性、耐胆汁性显著提高，然而在肠粘膜粘附效率、停留时间、竞争性排除革兰氏阴性致病菌株的效果上仍然存在限制。
发明内容
因此，本发明人为了克服传统的乳酸菌包衣技术的局限性，并为了开发具有显著改善的肠粘膜粘附效率、肠粘膜停留时间、对肠道有害菌的竞争抑制效果，反复进行了研究。其结果是开发了乳酸菌的发酵成分被天然高分子物质透明质酸捕集的“功能性水合透明质酸”，并确认了所述功能性水合透明质酸对有害菌具有增殖抑制作用，对有益菌具有增殖促进作用之后，确认可作为发挥期望效果的乳酸菌包衣剂，从而完成了本发明。
因此，本发明的目的是提供通过在相对于100重量份的乳酸菌培养液中，以0.001重量份～1重量份的比例添加透明质酸并搅拌溶解后，在30～60℃下减压浓缩的方法制备的、乳酸菌发酵产物被捕集的功能性水合透明质酸。
本发明的另一个目的是提供用所述功能性水合透明质酸包覆的乳酸菌。
本发明的另一个目的是提供一种四层包衣乳酸菌的制备方法，其特征在于所述方法包括：(a)通过将水溶性聚合物与乳酸菌混合来进行第1次包覆的步骤；(b)通过将功能性水合透明质酸与所述步骤(a)的第1次包覆的乳酸菌混合来进行第2次包覆的步骤；(c)通过将具有多孔颗粒的包衣剂与所述步骤(b)的第2次包覆的乳酸菌混合来进行第3次包覆的步骤；和(d)通过将蛋白质与所述步骤(c)的第3次包覆的乳酸菌混合来进行第4次包覆的步骤。
本发明的另一个目的是提供根据所述四层包衣乳酸菌的制备方法制备的四层包衣乳酸菌。
为了达到所述目的，本发明提供通过相对于100重量份的乳酸菌培养基以0.001重量份～1重量份的比例添加透明质酸并搅拌溶解后，在30～60℃下减压浓缩的方法制备的乳酸菌发酵产物被捕集的功能性水合透明质酸。
为了达到本发明的另一个目的，本发明提供使用功能性水合透明质酸包覆的乳酸菌。
为了达到本发明的另一个目的，本发明提供一种四层包衣乳酸菌的制备方法，所述方法包括：(a)通过将水溶性聚合物与乳酸菌混合来进行第1次包覆的步骤；(b)通过将功能性水合透明质酸与所述步骤(a)的第1次包覆的乳酸菌混合来进行第2次包覆的步骤；(c)通过将具有多孔颗粒的包衣剂与所述步骤(b)的第2次包覆的乳酸菌混合来进行第3次包覆的步骤；和(d)通过将蛋白质与所述步骤(c)的第3次包覆的乳酸菌混合来进行第4次包覆的步骤。
为了达到本发明的另一个目的，本发明提供根据所述四层包衣乳酸菌的制备方法制备的四层包衣乳酸菌。
下面将对本发明进行详细说明。
本发明提供通过相对于100重量份的乳酸菌培养基以0.001重量份～1重量份的比例添加透明质酸并搅拌溶解后浓缩的方法制备的、乳酸菌发酵产物被捕集的功能性水合透明质酸。
本发明中的所述功能性水合透明质酸是将乳酸菌培养基捕集到透明质酸中的，即捕集了对肠内有害细菌具有增殖抑制作用和对肠内有益菌无影响或促进其生长的成分的透明质酸。
另外，由于肠内细菌菌群中分类为有益菌的代表性菌株是乳酸菌，本发明人为了提取对乳酸菌无任何影响或有助于其增殖的成分意图利用乳酸菌发酵物，并将其捕集到透明质酸来开发出具有期待效果的包衣剂。
即，将细胞结构中所含代表性成分脂磷壁酸(lipoteichoic acid)和肽聚糖(peptidoglycan)等的有害细菌粘附抑制物质及抑制有害细菌增殖和促进有益菌生长的乳酸菌发酵产物捕集到透明质酸，以此来制备功能性水合透明质酸。
更具体地说，本发明中的功能性水合透明质酸可以通过相对于100重量份的乳酸菌培养基以0.001重量份～1重量份的比例添加透明质酸，通过搅拌溶解，在30至60℃下减压浓缩方法来制备。更优选地，通过相对于100重量份的乳酸菌培养基混合0.001至0.5重量份的透明质酸并且最优选混合0.001至0.25重量份的透明质酸来制备透明质酸。通过所述方法，乳酸菌发酵产物被透明质酸捕集，显示出对肠内有害细菌的抗菌作用和对有益细菌的增殖促进作用。特别是，乳酸菌培养基通过加压和间歇灭菌(tyndallization)，具有作为乳酸菌或其培养基中所含代表性成分脂磷壁酸(lipoteichoic acid)和肽聚糖(peptidoglycan)等的有害细菌粘附抑制物质，可显示出抑制有害细菌增殖和促进有益细菌的生长的作用。
同时，在本发明中，所述乳酸菌培养基可以是间歇灭菌(tyndallization)的，优选通过以下步骤制备所述乳酸菌培养基：
(a)在110～135℃下加压热处理乳酸菌培养基3～7分钟的步骤；
(b)将所述步骤(a)的加压热处理的培养基冷却至25～35℃的步骤；
(c)将所述步骤(b)的冷却的培养基在105～115℃下加压热处理8～12分钟的步骤；
(d)将所述步骤(c)的加压热处理的培养基冷却至25～35℃的步骤；和
(e)将所述步骤(d)的冷却的培养基在75～85℃下热处理20～40分钟，然后最终冷却至25～35℃的步骤。
用于制备功能性水合透明质酸的所述乳酸菌是产生抗菌成分的发酵物质的乳酸菌，并且是选自由乳酸杆菌属(Lactobacillus sp.)、双歧杆菌属(Bifidobacterium sp.)、链球菌属(Streptococcus sp.)、乳球菌属(Lactococcus sp.)、肠球菌属(Enterococcussp.)、片球菌属(Pediococcus sp.)、明串珠菌属(Leuconostoc sp.)、魏斯氏菌属(Weissella sp.)组合的群中的一种以上乳酸菌，优选为选自由嗜酸乳杆菌IDCC 3302(Lactobacillus acidophilus IDCC 3302)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillusbulgaricus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)、格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、约氏乳杆菌(Lactobacillusjohnsonii)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、胚芽乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、短双歧杆菌(Bifidobacteriumbreve)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、乳双歧杆菌(Bifidobacteriumlactis)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎链球菌(Streptococcus faecium)、粪链球菌(Streptococcus faecalis)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、乳酸乳球菌乳亚种(Lactococcus lactis subsp.Lactis)、乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactissubsp.Cremoris)、乳酸片球菌(Pediococcus acidolacticii)、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)、肉色明串珠菌(Leuconostoc carnosum)、柠檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)、卡西口米塔塔姆明串珠菌(Leuconostoc gasicomatatum)、冷明串珠菌(Leuconostoc gellidum)、仁海明串珠菌(Leuconostoc inhae)、泡菜明串珠菌(Leuconostoc kimchii)、乳明串珠菌(Leuconostoc lactis)、肠膜明串珠球菌肠膜亚种(Leuconostoc mesenteroides subsp.Mesenteroides)、副肠系膜样明串珠菌(Leuconostoc paramesenteroides)、食窦魏斯氏乳酸菌(Weissella cibaria)、融合魏斯氏乳酸菌(Weissella confusa)、高丽魏斯氏菌(Weissella koreensis)、独魏斯氏菌(Weissella soli)、绿色魏斯氏菌(Weissella viridescens)组合的群中一种以上的乳酸菌，更优选为嗜酸乳杆菌IDCC 3302(Lactobacillus acidophilus IDCC 3302)，但不限于此。
根据本发明的一个实施例中，捕集乳酸菌培养基的功能性水合透明质酸，不仅可以抑制作为肠内有害细菌的鼠伤寒沙门氏菌的肠粘膜的粘附性能，而且抑制其生长(实施例2和3)。
根据本发明的另一实施例，为了评价功能性水合透明质酸对肠内有益菌生长的影响，对代表乳杆菌的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、代表双歧杆菌的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、代表肠球菌的屎肠球菌(Enterococcus faecium)，用功能性水合透明质酸进行处理。结果，确认在用功能性水合透明质酸处理的组中显著促进了每种微生物的增殖(实施例4)。另一方面，根据本发明的所述实施例，确认了常规的透明质酸不具有抑制有害菌并促进有益菌增殖的效果，因此可以知道，本发明的功能性水合透明质酸通过捕集乳酸菌发酵产物而显示出这种独特的功能特征。
通过所述实验结果可以确认，功能性水合透明质酸显示出促进肠内有益菌的增殖和抑制有害菌生长的选择性拮抗作用，可以用作增强乳酸菌的肠粘膜粘附性和加长粘附时间的包衣剂。
因此，本发明提供了使用所述功能性水合透明质酸包覆的乳酸菌。
本发明还提供一种利用所述功能性水合透明质酸制备具有优异的肠粘膜粘附性和选择性拮抗作用的四层包衣乳酸菌的方法。具体而言，
本发明的四层包衣乳酸菌的制备方法包括：
(a)通过将水溶性聚合物与乳酸菌混合来进行第1次包覆的步骤；
(b)通过将功能性水合透明质酸与所述步骤(a)的第1次包覆的乳酸菌混合来进行第2次包覆的步骤；
(c)通过将具有多孔颗粒的包衣剂与所述步骤(b)的第2次包覆的乳酸菌混合来进行第3次包覆的步骤；和
(d)通过将蛋白质与所述步骤(c)的第3次包覆的乳酸菌混合来进行第4次包覆的步骤。
另外，本发明的四层包衣乳酸菌的制备方法包括：
(a)通过将羧甲基纤维素(carboxymethyl cellulose，CMC)与乳酸菌混合来进行第1次包覆的步骤；
(b)通过将功能性水合透明质酸与所述步骤(a)的第1次包覆的乳酸菌混合来进行第2次包覆的步骤；
(c)通过将具有多孔颗粒的包衣剂与所述步骤(b)的第2次包覆的乳酸菌混合来进行第3次包覆的步骤；和
(d)通过将蛋白质与所述步骤(c)的第3次包覆的乳酸菌混合来进行第4次包覆的步骤。
另外，本发明的四层包衣乳酸菌的制备方法包括：
(a)通过将水溶性聚合物与乳酸菌混合来进行第1次包覆的步骤；
(b)通过将功能性水合透明质酸与所述步骤(a)的第1次包覆的乳酸菌混合来进行第2次包覆的步骤；
(c)通过将具有多孔颗粒的麦芽糊精(maltodextrin，MD)与所述步骤(b)的第2次包覆的乳酸菌混合来进行第3次包覆的步骤；和
(d)通过将蛋白质与所述步骤(c)的第3次包覆的乳酸菌混合来进行第4次包覆的步骤。
另外，本发明的四层包衣乳酸菌的制备方法包括：
(a)通过将水溶性聚合物与乳酸菌混合来进行第1次包覆的步骤；
(b)通过将功能性水合透明质酸与所述步骤(a)的第1次包覆的乳酸菌混合来进行第2次包覆的步骤；
(c)通过将具有多孔颗粒的包衣剂与所述步骤(b)的第2次包覆的乳酸菌混合来进行第3次包覆的步骤；和
(d)通过将乳清蛋白与所述步骤(c)的第3次包覆的乳酸菌混合来进行第4次包覆的步骤。
优选地，本发明的四层包衣乳酸菌的制备方法包括：
(a)通过将羧甲基纤维素(carboxymethyl cellulose，CMC)与乳酸菌混合来进行第1次包覆的步骤；
(b)通过将功能性水合透明质酸与所述步骤(a)的第1次包覆的乳酸菌混合来进行第2次包覆的步骤；
(c)通过将具有多孔颗粒的麦芽糊精(maltodextrin，MD)与所述步骤(b)的第2次包覆的乳酸菌混合来进行第3次包覆的步骤；和
(d)通过将乳清蛋白与所述步骤(c)的第3次包覆的乳酸菌混合来进行第4次包覆的步骤。
(a)通过将水溶性聚合物与乳酸菌混合来进行第1次包覆的步骤：
通过评价与功能性水合透明质酸的交联能力来选择所述水溶性聚合物以增加乳酸菌的表面结合强度。具体而言，用作本发明的菌体薄膜包衣剂并具有优秀的与功能性水合透明质酸的交联能力的水溶性聚合物包括但不限于选自羧甲基纤维素(carboxymethylcellulose，CMC)、羟乙基纤维素(hydroxyethylcellulose，HEC)、黄原胶(xanthan gum，XG)、瓜耳胶(guar gum，GG)、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone，PVP)、壳聚糖(Chitosan)、阿拉伯胶(arabica gum)、卡波姆(carbopol)、海藻酸钠(sodiumalginate)和海藻酸丙二醇酯(propylene glycol alginate)组合的群。优选为羧甲基纤维素(carboxymethylcellulose，CMC)、羟乙基纤维素(hydroxyethylcellulose，HEC)、黄原胶(xanthan gum，XG)、瓜耳胶(guar gum，GG)、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone，PVP)、壳聚糖(Chitosan)、阿拉伯胶(arabica gum)、卡波姆(carbopol)，更优选为羧甲基纤维素(carboxymethylcellulose，CMC)、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone，PVP)、壳聚糖(Chitosan)、阿拉伯胶(arabica gum)、卡波姆(carbopol)，最优选为羧甲基纤维素(carboxymethylcellulose，CMC)。
所述水溶性聚合物，与相对于100重量份的乳酸菌培养基以0.1重量份至10重量份的比例混合来进行第一次包覆。具体而言，水溶性聚合物的混合比例，相比100重量份的乳酸菌培养基举例可以是0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0,只要相对于100重量份的乳酸菌培养基满足0.1重量份至10重量份的范围，则不限于所述数值。优选为，相对于100重量份的乳酸菌培养基，水溶性聚合物以0.1重量份至5重量份混合，最优选为，以0.1重量份至0.5重量份混合。
优选地，可将作为所述水溶性聚合物的羧甲基纤维素(carboxymethylcellulose，CMC)，与相对于100重量份的乳酸菌培养基以0.1重量份至10重量份的比例混合来进行第一次包覆。具体而言，CMC的混合比例，相比100重量份的乳酸菌培养基举例可以是0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0,只要相对于100重量份的乳酸菌培养基满足0.1重量份至10重量份的范围，则不限于所述数值。优选为，相对于100重量份的乳酸菌培养基，作为水溶性聚合物的CMC以0.1重量份至5重量份混合，最优选为，以0.1重量份至0.5重量份混合。
在本发明的一个实施例中，确认了羧甲基纤维素(carboxymethylcellulose，CMC)与作为第二次包衣剂的功能性水合透明质酸的交联性良好(参照表3)。
因此，当该基质分别以0.1％(w/v)至0.4％(w/v)的浓度施用时，在0.2％(w/v)下显示出最高的交联性能(参照表4)。
(b)通过将功能性水合透明质酸与所述步骤(a)的第1次包覆的乳酸菌混合来进行第2次包覆的步骤：
所述步骤(b)将功能性水合透明质酸与所述步骤(a)的第1次包覆的乳酸菌混合进行第2次包覆。所述功能性水合透明质酸捕集到抑制肠内有害细菌的抗菌用乳酸菌的发酵物质，因此抑制肠内的有害菌。
所述功能性水合透明质酸，与相对于100重量份的乳酸菌培养基以0.001重量份至1重量份混合。具体而言，功能性水合透明质酸，相比100重量份的乳酸菌培养基举例可以以0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.010、0.011、0.012、0.013、0.014、0.015、0.016、0.017、0.018、0.019、0.020、0.021、0.022、0.023、0.024、0.025、0.026、0.027、0.028、0.029、0.030、0.031、0.032、0.033、0.034、0.035、0.036、0.037、0.038、0.039、0.040、0.041、0.042、0.043、0.044、0.045、0.046、0.047、0.048、0.049、0.050、0.051、0.052、0.053、0.054、0.055、0.056、0.057、0.058、0.059、0.060、0.061、0.062、0.063、0.064、0.065、0.066、0.067、0.068、0.069、0.070、0.071、0.072、0.073、0.074、0.075、0.076、0.077、0.078、0.079、0.080、0.081、0.082、0.083、0.084、0.085、0.086、0.087、0.088、0.089、0.090、0.091、0.092、0.093、0.094、0.095、0.096、0.097、0.098、0.099、0.100等重量份混合，只要相对于100重量份的乳酸菌培养基满足0.001重量份至1重量份的范围，则不限于所述数值。优选为，相对于100重量份的乳酸菌培养基，所述功能性水合透明质酸以0.001重量份至0.05重量份混合，最优选为，以0.001重量份至0.005重量份混合。
(c)通过将具有多孔颗粒的包衣剂与所述步骤(b)的第2次包覆的乳酸菌混合来进行第3次包覆的步骤：
所述多孔包衣剂是在菌体中具有多孔颗粒性质的基体的包衣剂，并且用于阻挡外部水分和湿润空气的流入。多孔颗粒可以用作所述第三次包衣剂，包括但不限于海藻酸盐(alginate)、麦芽糊精(maltodextrin，MD)、聚乙二醇(polyethyleneglycol，PEG)、三醋精(triacetin)、乙酰柠檬酸三乙酯(acetyl triethyl citrate)或柠檬酸三乙酯(triethylcitrate)，优选为海藻酸盐(alginate)、麦芽糊精(maltodextrin，MD)和聚乙二醇(polyethyleneglycol，PEG)，最优选为麦芽糊精(maltodextrin，MD)。
所述多孔包衣剂，与相对于100重量份的乳酸菌培养基以0.1重量份至10重量份的比例混合。具体而言，所述多孔包衣剂的混合比例，相比100重量份的乳酸菌培养基举例可以是0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0,只要相对于100重量份的乳酸菌培养基满足0.1重量份至10重量份的范围，则不限于所述数值。优选为，相对于100重量份的乳酸菌培养基，所述多孔包衣剂以0.1重量份至5重量份混合，最优选为，以0.1重量份至0.5重量份混合。
优选地，可将作为所述多孔包衣剂的麦芽糊精(maltodextrin，MD)，与相对于100重量份的乳酸菌培养基以0.1重量分至10重量份的比例混合。具体而言，所述多孔包衣剂的混合比例，相比100重量份的乳酸菌培养基举例可以是0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0,只要相对于100重量份的乳酸菌培养基满足0.1重量份至10重量份的范围，则不限于所述数值。优选为，相对于100重量份的乳酸菌培养基，所述多孔包衣剂MD以0.1重量份至5重量份混合，最优选为，以0.1重量份至0.5重量份混合。
(d)通过将蛋白质与所述步骤(c)的第3次包覆的乳酸菌混合来进行第4次包覆的步骤：
混合所述蛋白质用于填充三次包覆的乳酸菌的多孔颗粒结构的第三次包衣剂的空隙，优选但不限于选自由脱脂奶粉、乳清蛋白、分离的大豆蛋白组合的群的蛋白质，更优选为乳清蛋白。
作为所述第4次包衣剂的蛋白质，与相对于100重量份的乳酸菌培养基以1重量分至30重量份的比例混合。具体而言，所述蛋白质的混合比例，相比100重量份的乳酸菌培养基举例可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30，只要相对于100重量份的乳酸菌培养基满足1重量份至30重量份的范围，则不限于所述数值。优选为，相对于100重量份的乳酸菌培养基，所述作为第4次包衣剂的蛋白质以1重量份至10重量份混合，最优选为，以5重量份至10重量份混合。
优选地，可将作为所述第4次包衣剂的乳清蛋白，与相对于100重量份的乳酸菌培养基以1重量分至30重量份的比例混合。具体而言，所述乳清蛋白的混合比例，相比100重量份的乳酸菌培养基举例可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30，只要相对于100重量份的乳酸菌培养基满足1重量份至30重量份的范围，则不限于所述数值。优选为，相对于100重量份的乳酸菌培养基，所述作为第4次包衣剂的乳清蛋白以1重量份至10重量份混合，最优选为，以5重量份至10重量份混合。
与以往的未包衣、单层包衣、双层包衣，三层包衣乳酸菌以及四层包衣乳酸菌相比，通过本发明的方法制备的四层包衣乳酸菌对肠粘膜的粘附性更加优异。根据本发明的一个实施例，使用功能性水合透明质酸的四层包衣乳酸菌在体外和体内的肠粘膜粘附性都优于以往四层包衣乳酸菌。这种效果即使在存在常驻菌的、类似于人类肠粘膜的环境中也非常优秀，因此非常有意义。
同时，为了让包覆的乳酸菌在到达宿主肠后粘附到肠粘膜上，它们必须与宿主的常驻菌群竞争。不仅如此，为了使乳酸菌粘附于肠粘膜显示有益的生理活性，应优选显示出抑制肠粘膜中有害菌的增殖并促进有益菌的增殖的效果，而在这一点上，本发明的四层包衣乳酸菌与以往的未包衣、单层包衣、双层包衣，三层包衣以及四层包衣乳酸菌相比显著优秀。
具体而言，根据本发明的一个实施例，可以确认，与以往未包衣或四层包衣乳酸菌相比，使用功能性水合透明质酸的四层包衣乳酸菌对有害细菌具有优异的竞争性粘附抑制能力，而且在常驻菌群存在的情况下，仍可增强乳酸菌的肠粘膜粘附性。另外，确认根据本发明的方法制备的四层包衣乳酸菌，其第2次包衣剂即功能性水合透明质酸具有抑制有害菌增殖的作用同时具有促进有益菌的增殖的作用，因此发现其拮抗作用仅被选择性地施用于有害菌。
本发明的四层包衣乳酸菌除了具有优异的肠粘膜粘附性和对有害细菌的选择性拮抗作用外，还由于四层包衣具有结构稳定性，可有效地阻断水分和空气等外部环境因素，可显示出经时间的稳定性，并且耐酸性和耐胆汁酸性非常优秀。
本发明的四层包衣乳酸菌的特征还在于通过如上所述方法来制备。本发明的四层包衣乳酸菌不仅保持以往四层包衣乳酸菌的优异耐酸性和耐胆汁性，而且与以往的未包衣和四层包衣乳酸菌相比，具有优良的抑制肠道菌群中有害细菌的能力，因此当有害细菌增加时它可以有效地使肠道菌群正常化。它还通过帮助肠道菌群中的有益菌乳酸菌群的增殖，有效地为肠道菌群的正常化做出贡献。
根据本发明的另一个实施例，本发明的功能性水合透明质酸不仅作为四层包衣乳酸菌的包衣剂，当它作为双层或三层包衣乳酸菌的包衣剂时，仍比使用常规透明质酸包覆的乳酸菌显示出显著改善的肠粘膜粘附性，由此发现功能性水合透明质酸本身可以用作对肠粘膜具有优异粘附性和对有害细菌具有拮抗作用的包衣剂。
不仅如此，与使用常规透明质酸的双层或三层包覆的乳酸细菌相比，使用本发明的功能性水合透明质酸的双层或三层包覆的乳酸菌显示出等同程度的耐酸性和耐胆汁酸性，由此可以判断，在制备功能性水合透明质酸的过程中可保持透明质酸固有的乳酸菌保护效果。
如上所述，使用本发明的功能性水合透明质酸包覆的乳酸菌不仅具有与使用常规透明质酸包覆的乳酸菌相同程度的耐酸性和耐胆汁性，而且还表现出对肠粘膜的优异粘附性和对有害细菌的选择性拮抗作用。以往对这种乳酸菌包衣剂和乳酸菌包覆的方法没有过相关报告，这是本发明的发明人通过将功能性水合透明质酸用于乳酸菌包覆而产生的效果，即这是通过本发明最初报告的。
发明的效果：
本发明的功能性水合透明质酸显示出对有害菌的抑制增殖作用及对有益菌的促进增殖作用从而具有选择性拮抗作用。与使用常规透明质酸包覆的乳酸菌相比，使用本发明的功能性水合透明质酸包覆的乳酸菌具有优异的与肠粘膜的粘附性和对有害细菌的选择性拮抗作用。
特别地，本发明的使用功能性水合透明质酸四层包覆的乳酸菌，通过将乳酸菌与水溶性聚合物、功能性水合透明质酸、具有多孔颗粒的包衣剂和蛋白质混合而进行4层包覆，不仅显示出以往未包衣、单层、双层、三层、四层包衣乳酸菌未曾具有的优秀的肠粘膜的粘附性和对有害细菌的选择性拮抗作用，而且仍具有优异的耐酸性和耐胆汁性，没有失去乳酸菌固有的生理活性功能。
附图说明
图1是显示功能性水合透明质酸形状的照片；
图2显示出功能性水合透明质酸对鼠伤寒沙门氏菌KCTC 2054的生长抑制能力的评估结果；
图3是评价捕集嗜酸乳杆菌IDCC 3302的培养基的功能性水合透明质酸原料对鼠李糖乳杆菌的增殖促进效果的照片(A：常规透明质酸处理对照组，B：功能性水合透明质酸处理组)；
图4是评价捕集嗜酸乳杆菌IDCC 3302的培养基的功能性水合透明质酸原料对长双歧杆菌的增殖促进效果的照片(A：常规透明质酸处理对照组，B：功能性水合透明质酸处理组)；
图5是评价捕集嗜酸乳杆菌IDCC 3302的培养基的功能性水合透明质酸原料对屎肠球菌的增殖促进效果的照片(A：常规透明质酸处理对照组，B：功能性水合透明质酸处理组)；
图6是比较使用功能性水合透明质酸双层包覆的嗜酸乳杆菌IDCC 3302和未包覆及使用常规透明质酸双层包覆的嗜酸乳杆菌IDCC 3302的肠道内固定性的图；
图7是评价使用功能性水合透明质酸双层包覆的嗜酸乳杆菌IDCC 3302和未包覆及使用常规透明质酸双层包覆的嗜酸乳杆菌IDCC 3302对肠道沙门氏菌生长的影响的图；
图8是比较使用功能性水合透明质酸三层包覆的嗜酸乳杆菌IDCC 3302和未包覆及使用常规透明质酸三层包覆的嗜酸乳杆菌IDCC 3302的肠道内固定性的图；
图9是评价使用功能性水合透明质酸三层包覆的嗜酸乳杆菌IDCC 3302和未包覆及使用常规透明质酸三层包覆的嗜酸乳杆菌IDCC 3302对肠道沙门氏菌生长的影响的图；
图10是比较使用功能性水合透明质酸四层包覆的嗜酸乳杆菌IDCC 3302和未包覆及使用常规透明质酸四层包覆的嗜酸乳杆菌IDCC 3302的肠道内固定性的图；
图11是评价使用功能性水合透明质酸四层包覆的嗜酸乳杆菌IDCC 3302和未包覆及使用常规透明质酸四层包覆的嗜酸乳杆菌IDCC 3302对肠道沙门氏菌生长的影响的图；
图12是显示本发明中使用的未包覆的嗜酸乳杆菌IDCC 3302形状的SEM照片；
图13是显示将羧甲基纤维素与嗜酸乳杆菌IDCC 3302混合而1次包覆的乳酸菌的形状的SEM照片；
图14是显示使用羧甲基纤维素1次包覆的嗜酸乳杆菌IDCC 3302，与功能性水合透明质酸混合而二次包覆的乳酸菌的形状的SEM照片；
图15是显示使用羧甲基纤维素及功能性水合透明质酸2次包覆的嗜酸乳杆菌IDCC3302，与麦芽糊精混合而三次包覆的乳酸菌的形状的SEM照片；
图16是显示使用羧甲基纤维素及功能性水合透明质酸及麦芽糊精三次包覆的嗜酸乳杆菌IDCC 3302，与乳清蛋白混合而四次包覆的乳酸菌的形状的SEM照片。
具体实施方式
下面将对本发明进行详细说明。
下面说明的实施例，是为了帮助理解本发明的示例性说明，本发明的内容不限于以下实施例。
<实施例1>功能性水合透明质酸的制备
将代表性乳酸菌即嗜酸乳杆菌IDCC 3302(Lactobacillus acidophilus IDCC3302)发酵菌体进行间歇灭菌(tyndallization)，用于嗜酸乳杆菌IDCC 3302细胞结构中所含有的代表性成分脂磷壁酸(lipoteichoic acid)和肽聚糖(peptidoglycan)等的有害细菌粘附抑制物质及抑制有害菌细菌增殖和促进有益细菌的生长的乳酸菌发酵产物捕集到透明质酸中。为此，将充分培养的嗜酸乳杆菌IDCC 3302菌液在121℃下进行加压和热处理5分钟(压力计为1.2atm)，并将菌液冷却至30℃。将菌液进一步在110℃下加压和热处理10分钟(压力计为0.8atm)，冷却至30℃，之后再次在80℃热处理30分钟，最后冷却至30℃以制备抑制粘附的乳酸菌液。
所述培养基在60℃下减压浓缩至初始体积的1/10，向其中加入0.01～1％(w/v)的透明质酸，彻底搅拌并溶解后，通过在50℃进一步加压浓缩并干燥，如图1所示，制备了功能性水合透明质酸的原料。
<实施例2>功能性水合透明质酸的粘附抑制能力
为了评价功能性水合透明质酸对有害菌的粘附抑制能力，使用作为人上皮细胞系的Caco-2细胞系的体外模型。Caco-2细胞系的体外模型显示出极化(polarization)、功能性刷状缘(brush border)和水解酶分泌等成熟的肠细胞特征。由于乳酸菌的配体必须与特定的受体相互作用以使乳酸菌结合肠粘膜细胞，因此已知肠中的Caco-2细胞是用于研究乳酸菌的肠内固定性的最有用的体外模型之一(Microbiol.59(12)：4121-4128，Gut.35：483-489，FEMS microbiology Lett.91：213-218等)。
具体而言，先用功能性水合透明质酸处理Caco-2细胞，随后粘附鼠伤寒沙门氏菌KCTC 2054时，测量粘附于Caco-2细胞的鼠伤寒沙门氏菌KCTC 2054细胞的数量，将此转化为抑制率。
作为对照组，使用常规透明质酸代替功能性水合透明质酸。更具体地说，Caco-2细胞单层，用添加有10％(v/v)胎牛血清(fetal calf serum)和20μl/ml庆大霉素(gentamicin)的DMEM中以1.2×105个细胞/ml的浓度接种Caco-2细胞后，在6孔组织培养板(6-well tissue culture plate，BD，USA)上等分为每孔1ml，培养7天，然后用磷酸盐缓冲盐水(phosphate buffered saline，PBS，pH 7.2)洗涤两次来制备。向形成了Caco-2单层的各孔中加入0.5ml功能性水合透明质酸溶液，使其反应90分钟。对照组使用透明质酸溶液。向其中加入0.5ml(1×108cfu/ml)鼠伤寒沙门氏菌KCTC 2054样品并反应90分钟。反应后，除去上清液，并用PBS洗涤Caco-2细胞两次以除去未附着的鼠伤寒沙门氏菌KCTC 2054。通过加入1ml的0.04％(w/v)吐温80(Tween80)，回收附着于Caco-2细胞的鼠伤寒沙门氏菌KCTC 2054，并测量活细胞。结果显示在下表1中。
表1功能性水合透明质酸对鼠伤寒沙门氏菌KCTC 2054的粘附抑制作用
如表1所示，作为对照组的透明质酸几乎不显示对鼠伤寒沙门氏菌的粘附抑制率，而功能性水合透明质酸显示46％的粘附抑制率。即，经判断，当功能性水合透明质酸用作乳酸菌的包衣剂时，乳酸菌不仅可以粘附在肠粘膜上，还有助于肠内有害细菌的竞争性消除。
<实施例3>功能性水合透明质酸的有害菌拮抗作用
为了评估功能性水合透明质酸对肠道中有害细菌的抗菌性，测定了鼠伤寒沙门氏菌KCTC 2054的最小抑制浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)，并比较了对肠道菌群中有害菌的影响。实验方法修改并使用了韩国药典医药品收录的细菌生长抑制试验，详情如下。
1)制备鼠伤寒沙门氏菌KCTC 2054试验菌溶液
为了制备鼠伤寒沙门氏菌KCTC 2054试验菌溶液，将在脑心浸液琼脂(BHI琼脂，BD，USA)中生长的1环鼠伤寒沙门氏菌KCTC 2054菌体悬浮于5ml无菌BHI流体培养基中，在O.D.620nm处调整为值0.15。使用该溶液作为试验菌溶液。
2)操作
将功能性水合透明质酸粉末加入到20ml BHI流体培养基中至1～10％(w/v)的浓度，并将该悬浮液搅拌5～10分钟。将悬浮液离心(5,000RPM/15分钟)，用膜过滤器(0.45um)过滤上清液并灭菌。将2ml各浓度的过滤灭菌溶液放入无菌4ml试管中，接种2％(v/v)鼠伤寒沙门氏菌KCTC 2054试验菌溶液。作为对照，使用常规透明质酸代替功能性水合透明质酸。接种后，在37℃下培养24小时，并观察细菌生长。
3)判断
培养24小时后测定观察到微生物生长的浓度，将此时的浓度值定义为MIC值。
结果显示在下表2和图2中。
表2功能性水合透明质酸对鼠伤寒沙门氏菌KCTC 2054的拮抗作用
如表2和图2所示，评价功能性水合透明质酸对鼠伤寒沙门氏菌KCTC 2054菌株的MIC值的结果为，功能性水合透明质酸在浓度为4％(w/v)时显示最小抑制浓度(MIC)，显示出抑制有害细菌生长的效果。
<实施例4>功能性水合透明质酸对有益菌的增殖促进作用
为了评价功能性水合透明质酸对有益菌的影响，使用了代表乳杆菌的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、代表双歧杆菌的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、代表肠球菌的屎肠球菌(Enterococcus faecium)。更具体地，为了制备这三种肠道有益菌，取在MRS琼脂(Man-Rogosa-Sharpe agar,MRS，BD，USA)中生长的三种有益菌菌体，将其悬浮在灭菌的MRS流体培养基中，将其作为试验菌溶液。
将嗜酸乳杆菌IDCC 3302的功能性水合透明质酸粉末加入到20ml M RS流体介质中至浓度为4％(w/v)，并将悬浮液搅拌5～10分钟。作为对照组，使用常规透明质酸代替功能性水合透明质酸粉末。
将悬浮液离心(5,000RPM/15分钟)，用膜过滤器(0.45um)过滤上清液并灭菌。将2ml过滤灭菌溶液放入无菌4ml试管中，接种3种有益菌各2％(v/v)。接种后，在37℃下培养24小时，并用显微镜观察细菌生长，与对照组比较增殖度，如图3～图5所示。
如图3至图5所示，在根据本发明的用功能性水合透明质酸处理的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)(图3)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)(图4)和屎肠球菌(Enterococcus faecium)(图5)中证实，每种细菌的生长与用常规透明质酸处理的对照组相比得到了促进。
<实施例5>用于乳酸菌表面薄膜包衣的交联剂的选择
通过评价形成乳酸菌表面薄膜包衣的水溶性聚合物和功能性水合透明质酸的交联能力来选择最合适的涂布交联剂。更具体地说，以4g/l浓度将功能性水合透明质酸溶解在三次蒸馏水中的溶液和以1％(w/v)浓度将水溶性聚合物溶解在三次蒸馏水中的溶液，以1：1(v/v)体积比混合，剧烈搅拌，然后在室温下放置30分钟。与仅通过将三次蒸馏水与功能性水合透明质酸混合而获得的结果进行比较来判断交联亲和力。当形成交联时，功能性水合透明质酸的平均分子量增加因此溶液的粘度增加。将溶液添加到粘度计(Ubbelogdevisceter，SI analytics)中，使用ViscoClock(SI Analytics)测量通过特定区间的下降所需的时间来测量和比较，所述粘度计的测量时间在24℃恒温水浴中随着粘度增加而增加(表3)。
从下表3中可以看出，功能性水合透明质酸与实验中使用的所有水溶性聚合物形成良好的交联，并且发现尤其与羧甲基纤维素(CMC)形成最佳的交联。
表3用于与功能性水合透明质酸形成交联的最佳涂布交联剂的选择
区分 对照组 壳聚糖 聚乙烯吡咯烷酮 CMC 阿拉伯树胶
下降时间(秒) 548 584 595 625 560
为了确定与功能性水合透明质酸形成最佳交联的涂布交联剂CMC的最佳浓度，将功能性水合透明质酸以4g/L的浓度溶解于三次蒸馏水中，加入CMC使其浓度达到从0.1％(w/v)到0.4％(w/v)。使用可比较相对交联性能的ViscoClock(SI Analytics)测量通过特定区间的下降所需的时间来比较相对的粘度。
结果显示在下表4中。
表4与功能性水合透明质酸形成交联的最佳CMC浓度
浓度(w/v) 无 0.1％ 0.2％ 0.3％ 0.4％
下降时间(秒) 548 625 632 583 567
如表4所示，决定与功能性水合透明质酸形成交联的最佳CMC浓度的测试中，当使用0.2％(w/v)时，显示632秒的下降时间，该浓度表现出相对优秀的交联性能。
<实施例6>功能性水合的双层包衣乳酸菌
<6-1>功能性水合双层包衣乳酸菌的制备
在本发明中，基于韩国专利(第10-1280232号)的实施例中描述的包衣乳酸菌的制备方法，通过使用乳酸菌的表面薄膜包衣剂CMC-Na作为第一包衣剂，所述<实施例1>中制备的功能性水合透明质酸作为第二包衣剂来制备功能性水合双层包衣乳酸菌。作为对照组，使用常规透明质酸代替功能性水合透明质酸制备双层包衣乳酸菌。
<6-2>功能性水合双层包衣乳酸菌耐酸性(acid Tolerance)
口服乳酸菌后，当它们通过人体消化器官胃(stomach)时暴露于胃液中(gastricjuice)。在试管条件下形成类似环境，并比较功能性水合双层包衣乳酸菌和常规透明质酸双层包衣乳酸菌的存活率，以此评价耐酸性。
更具体地说，将10％HCl加入到MRS培养基中滴定至pH值2.3和2.5，灭菌后使用。将1g样品加入到调节至各pH值的MRS培养基中，并反应0小时、1小时和2小时。之后，活细胞计数。实验中使用的乳酸菌有12种乳酸杆菌属(Lactobacillus sp.)、4种双歧杆菌属(Bifidobacterium sp.)、1种链球菌属(Streptococcus sp.)、1种肠球菌属(Enterococcussp.)、1种乳球菌属(Lactococcus sp.)，用它们分别制备功能性水合双层包衣乳酸菌和常规透明质酸双层包衣乳酸菌进行比较。
结果显示在下表5中。
表5功能性水合透明质酸双层包衣乳酸菌的耐酸性结果
如表5所示，比较了功能性水合透明质酸双层包衣乳酸菌和常规透明质酸双层包衣乳酸菌的耐酸性。结果，每个实验组都表现出相似的耐酸性。
这些结果表明，在制备功能性水合透明质酸过程中，保护乳酸菌的透明质酸的固有特性未被破坏。
<6-3>功能性水合双层包衣乳酸菌的耐胆汁酸性(bile tolerance)
胆汁酸(bile acid)在肝脏(liver)中形成，从胆管流入小肠(small intestine)，再被小肠末端的回肠(ileum)吸收95％，重新回到肝脏进行肠管循环。在这个过程中影响沉淀在小肠中的乳酸菌。
因此，比较了当暴露于胆汁酸时，功能性水合透明质酸双层包衣乳酸菌和常规透明质酸双层包衣乳酸菌的试验管环境下的存活率。更具体地说，将加入0.3％胆汁酸的培养基或未加入胆汁酸的培养基灭菌使用。各培养基中接种1g功能性水合透明质酸双层包衣乳酸菌和常规透明质酸双层包衣乳酸菌样品，反应5小时后，计数活细胞以比较耐胆汁酸性。
结果显示在下表6中。
表6功能性水合透明质酸双层包衣乳酸菌的耐胆汁酸性结果
如上表6所示，比较了功能性水合透明质酸双层包衣乳酸菌和透明质酸双层包衣乳酸菌的耐胆汁酸性。结果，每个实验组都表现出相似的耐胆汁酸性。
因此可以推断，在制备功能性水合透明质酸过程中，透明质酸的固有特性未被破坏，包覆乳酸菌后仍显示出类似的效果。
<6-4>功能性水合双层包衣乳酸菌的非竞争性粘附(Non-competitive adhesion)
Caco-2细胞单层，用添加有10％(v/v)胎牛血清(fetal calf serum)和20μl/ml庆大霉素(gentamicin)的Dulbecco`s改良Eagle`s培养基(Dulbecco`s Modified Eagle`sMedium，DMEM)中以1.2×105个细胞/ml的浓度接种Caco-2细胞(韩国细胞株银行)后，在6孔组织培养板(6-well tissue culture plate，BD，USA)上每孔注入1ml，培养7天，然后用磷酸盐缓冲盐水洗涤两次来制备。
向形成了Caco-2单层的各孔中加入1ml未包衣乳酸菌、透明质酸双层包衣乳酸菌和功能性水合透明质酸双层包衣乳酸菌样品，使其反应90分钟。所述双层包衣乳酸菌参照韩国注册专利(第10-1280232号)的双层包衣乳酸菌制备方法完成制备。
反应后，除去上清液，通过加入1ml的0.04％(w/v)吐温80(Tween80)，回收附着于Caco-2细胞的乳酸菌样品，并用血球计数板测定观察细菌数量。粘附效率是由粘附细菌的数量与初始细菌数量之比计算出来的。
结果显示在下表7中。
如下表7所示，在评价对与肠膜相似的Caco-2细胞的粘附性时，透明质酸双层包衣乳酸菌的粘附效率比未包衣乳酸菌相对更优秀，而功能性水合透明质酸双层包衣乳酸菌与透明质酸双层包衣乳酸菌相比，整体显示出更改善的粘附效率。
表7功能性水合双层包衣乳酸菌的非竞争性粘附
当在肠粘膜细胞中没有微生物与乳酸菌竞争时，功能性水合透明质酸双层包衣乳酸菌与常规透明质酸双层包衣乳酸菌相比，在基本肠粘膜粘附性上显示出整体改善的粘附效率。从这些结果发现，功能性水合透明质酸的肠粘膜粘附效果与常规透明质酸等同或更加改善，从而可以确认在制备功能性水合透明质酸中，透明质酸固有的肠粘膜粘附性未被破坏。
<6-5>功能性水合双层包衣乳酸菌的竞争性粘附抑制性(Competitive exclusion)
一般来说，乳酸菌为了在肠内发挥肠道调节作用，与肠粘膜的结合能力应该优于大肠杆菌和沙门氏菌等有害菌与肠粘膜的结合能力。但是，分类为革兰氏阳性菌的乳酸菌与大肠杆菌、沙门氏菌等革兰氏阴性菌相比，不易与肠粘膜结合。因此，本发明者们为了更清楚地确定功能性水合透明质酸双层包衣乳酸菌是否可以在肠中显示有益的生理活性，评估了在常驻菌群存在的条件下乳酸菌的粘附能力。
为了进行常驻菌群存在下粘附能力的比较试验，使用鼠伤寒沙门氏菌KCTC 2054作为指示细菌，先附着于Caco-2细胞后，用未包衣乳酸菌、透明质酸双层包衣乳酸菌和功能性水合透明质酸双层包衣乳酸菌进行处理，测量附着在Caco-2细胞的鼠伤寒沙门氏菌KCTC2054细菌数，该测量值被转换为抑制率。
更具体而言，Caco-2细胞单层，用添加有10％(v/v)胎牛血清(fetal calf serum)和20μl/ml庆大霉素(gentamicin)的Dulbecco`s改良Eagle`s培养基(Dulbecco`sModified Eagle`s Medium，DMEM)中以1.2×105个细胞/ml的浓度接种Caco-2细胞后，在6孔组织培养板(6-well tissue culture plate，BD，USA)上每孔注入1ml，培养7天，然后用磷酸盐缓冲盐水洗涤两次来制备。
鼠伤寒沙门氏菌KCTC 2054样品通过分别离心10ml脑心浸液(brain heartinfusion，BHI，BD，USA)收集菌体，用磷酸盐缓冲盐水洗涤两次，用1ml磷酸盐缓冲盐水重悬，并用浓度为1×108CFU/ml的无血清DMEM稀释来制备。将常驻菌鼠伤寒沙门氏菌KCTC2054样品0.5ml置于形成Caco-2单层的每个孔中，并使其反应60分钟。反应后，以相同量乳酸菌(1×108CFU/ml)处理并反应90分钟。
为了测量附着于Caco-2细胞的鼠伤寒沙门氏菌KCTC 2054的存活计数，加入1ml吐温80(Tween80)0.04％(w/v)从Caco-2细胞中回收附着的常驻菌鼠伤寒沙门氏菌KCTC2054，在BG琼脂培养基中测量活细胞的数量。
鼠伤寒沙门氏菌KCTC 2054的粘附抑制率按以下方法计算。
[鼠伤寒沙门氏菌粘附抑制率(％)]
＝[1-(试验组处理时的鼠伤寒沙门氏菌的附着细菌数/DMEM处理时的鼠伤寒沙门氏菌的附着细菌数×100(％)]
结果显示在下表8中。
如下表8所示，首先将有害菌即鼠伤寒沙门氏菌KCTC 2054附着于类似肠膜的Caco-2细胞，之后比较未包衣乳酸菌、透明质酸双层包衣乳酸菌和功能性水合透明质酸双层包衣乳酸菌的竞争有害菌的去除率,结果为不含有功能性物质的未包衣乳酸菌的去除效率比较低，因为它们仅通过竞争去除方法去除鼠伤寒沙门氏菌KCTC 2054，功能性水合透明质酸双层包衣乳酸菌显示出比未包衣相对更高的有害细菌去除效率。
同时，功能性水合透明质酸双层包衣乳酸菌除竞争性去除外，还显示出对已附着的鼠伤寒沙门氏菌KCTC 2054的直接抗菌活性，因此可从Caco-2细胞中顺利地除去鼠伤寒沙门氏菌，并通过透明质酸在去除有害细菌的部位处良好沉降。
另外，所述功能性水合透明质酸双层包衣乳酸菌的效果，即使仅看嗜酸乳杆菌IDCC3302的结果，也优于未包衣乳酸菌47％，甚至与常规的透明质酸双层包衣乳酸菌相比也显示高出33％以上的优异效果。因此，可以确认，使用功能性水合透明质酸作为乳酸菌包衣剂时，与以往的常规乳酸菌包衣剂相比，对肠内有害菌的抑制效果显著提高。
表8功能性水合透明质酸双层包衣乳酸菌的竞争性粘附抑制性
<6-6>功能性水合透明质酸双层包衣乳酸菌的体内肠固定性
为了进行功能性水合透明质酸双层包衣乳酸菌的体内肠固定性实验，每个试验组使用五只4周龄的ICR小鼠。特别地，通过施用抗生素来干扰肠道菌群之后，进行该实验以选择在肠道菌群中有效恢复乳酸杆菌的实验组。
实验组由未包衣乳酸菌、透明质酸双层包衣乳酸菌和功能性水合透明质酸双层包衣乳酸菌施用组和未施用乳酸菌的对照组组成。试验期为6周，前0.5周为实验动物的适应期。在适应期后，饮用水中每天给予0.4g/l氨苄青霉素摄入一周。
接下来的2周，口服乳酸菌，使用菌数为1×1010CFU/g。作为对照组，口服PBS代替乳酸菌。在接下来的2.5周内，停止施用乳酸菌并观察肠道菌群变化。在整个试验期间每周收集两次粪便样品。在LBS(乳杆菌选择培养基，Lactobacillus selective media，BD，USA)琼脂培养基上计数实验组中的乳酸杆菌的数量，分析个实验组的增殖度差异。
结果显示在图6中。
如图6所示，确认与未包衣乳酸菌施用组不同，透明质酸双层包衣乳酸菌和功能性水合透明质酸双层包衣乳酸菌施用组，在投入停止起至2.5周为止的粪便中检测到乳酸杆菌。然而，包衣乳酸菌的形式基于单独的透明质酸的结构，是对胃酸和胆汁酸都较敏感的结构，因此两组均显示类似的肠固定模式。
<6-7>功能性水合透明质酸双层包衣乳酸菌对体内有害细菌的抑制作用
在感染鼠伤寒沙门氏菌KCTC 2054的小鼠模型中研究了抗菌活性，以确认功能性水合透明质酸双层包衣乳酸菌在体内抑制有害细菌的能力。将六周龄的雌性ICR小鼠(5只小鼠/笼)为1组，分为未包衣乳酸菌、透明质酸双层包衣乳酸菌和功能性水合透明质酸双层包衣乳酸菌和PBS(载体,vehicle)施用组共4组。以滞留期满的小鼠为对象，以200μl/小鼠/天的剂量给予0.2％(w/v)的四环素一周以抑制和扰乱肠道菌群。1周后，在施用样品的头3天以200μl/小鼠/天的剂量口服施用鼠伤寒沙门氏菌KCTC 2054(1×108CFU/ml)，并且还将4个样品以200μl/小鼠/天口服施用2周，此时细菌数使用1×1010CFU/g。在接下来的2.5周中，停止施用样品并观察有害菌的生长抑制变化。每个实验组在整个测试期间每周收集两次粪便样品，并在BG琼脂培养基上分析沙门氏菌细菌数量。
结果显示在图7中。
如图7所示，对施用抗生素抑制肠内常驻菌群并感染鼠伤寒沙门氏菌KCTC 2054的小鼠模型，施用未包衣乳酸菌、透明质酸双层包衣乳酸菌和功能性水合透明质酸双层包衣乳酸菌样品的结果确认为，起到单纯竞争排斥作用的未包衣、透明质酸双层包衣乳酸菌与鼠伤寒沙门氏菌KCTC 2054竞争并抑制其生长，而功能性水合透明质酸双层包衣乳酸菌对鼠伤寒沙门氏菌KCTC 2054同时具有拮抗作用和竞争性排斥作用，抑制鼠伤寒沙门氏菌KCTC 2054的效率高达10倍以上。
<实施例7>功能性水合三层包衣乳酸菌
<7-1>功能性水合三层包衣乳酸菌的制备
在本发明中，基于韩国专利(第10-1280232号)的实施例中描述的包衣乳酸菌的制备方法，通过使用乳酸菌的表面薄膜包衣剂CMC-Na作为第一包衣剂，所述<实施例1>中制备的功能性水合透明质酸作为第二包衣剂，麦芽糊精(maltodextrin)作为第三包衣剂来制备功能性水合三层包衣乳酸菌。作为对照组，使用常规透明质酸代替功能性水合透明质酸制备三层包衣乳酸菌。
<7-2>功能性水合三层包衣乳酸菌耐酸性(acid Tolerance)
当乳酸菌通过人体消化器官胃(stomach)时暴露于胃液中(gastric juice)。在试管条件下形成类似环境，并比较功能性水合三层包衣乳酸菌和透明质酸三层包衣乳酸菌的耐酸性(表9)。以与本发明实施例<6-2>相同的方法进行实验。
其结果如下表9所示。
表9功能性水合透明质酸三层包衣乳酸菌的耐酸性结果
如表9所示，制备功能性水合透明质酸三层包衣乳酸菌与常规透明质酸三层包衣乳酸菌比较耐酸性，结果，表现出相似的耐酸性。这些结果表明，在制备功能性水合透明质酸过程中，保护乳酸菌的透明质酸的固有特性未被破坏。
同时，在上表的结果中仅比较嗜酸乳杆菌IDCC 3302的结果时，常规透明质酸三层包衣乳酸菌显示60％(pH 2.3)和64％(pH 2.5)的耐酸性。这比所述实施例<6-2>中的透明质酸双层包衣乳酸菌的50％的耐酸性更高，由此可以发现包衣效果与耐酸性相关。即，确认了三层包衣比双层包衣显示更优秀的耐酸性，并且包衣的保护作用反映在耐酸性存活率中。
<7-3>功能性水合透明质酸三层包衣乳酸菌的耐胆汁酸性(bile tolerance)
当暴露于胆汁酸(bile acid)时，试验管环境下比较功能性水合透明质酸三层包衣乳酸菌和常规透明质酸三层包衣乳酸菌。以与本发明的实施例<6-3>相同的方式进行实验。
结果显示在下表10中。
表10功能性水合透明质酸三层包衣乳酸菌的耐胆汁酸性结果
如表10所示，在胆汁酸中暴露5小时时，比较功能性水合三层包衣乳酸菌的耐胆汁酸性和透明质酸三层包衣乳酸菌的耐胆汁酸性，两者均显示出约70％的相似存活率。这些结果表明，在功能性水合透明质酸的制备过程中，保护乳酸菌的透明质酸的固有特性没有被破坏。
<7-4>功能性水合三层包衣乳酸菌的非竞争性粘附(Non-competitive adhesion)
为了在不存在竞争关系的微生物的状态下比较粘附性，参照韩国注册专利(第10-1280232号)的三层包衣乳酸菌制备方法制备所述三层包衣乳酸菌。另外，为了评价非竞争性粘附能力，以与本发明的实施例<6-4>相同的方法进行实验。
结果显示在下表11中。
如下表11所示，在评价对与肠膜相似的Caco-2细胞的粘附性时，功能性水合透明质酸及透明质酸三层包衣乳酸菌的粘附效率比未包衣乳酸菌相对更优秀，而功能性水合透明质酸三层包衣乳酸菌与透明质酸三层包衣乳酸菌相比，整体显示出更改善的粘附效率。
表11功能性水合三层包衣乳酸菌的非竞争性粘附
<7-5>功能性水合三层包衣乳酸菌的竞争性粘附抑制性(Competitive exclusion)
为了更清楚地确定功能性水合透明质酸三层包衣乳酸菌是否可以在肠中显示有益的生理活性，使用与本发明的实施例<6-5>相同的方法以评估在常驻菌群存在的条件下乳酸菌的粘附能力。
结果显示在下表12中。
如下表12所示，首先将有害菌即鼠伤寒沙门氏菌KCTC 2054附着于类似肠膜的Caco-2细胞，之后比较未包衣乳酸菌、透明质酸三层包衣乳酸菌和功能性水合透明质酸三层包衣乳酸菌的竞争有害菌的去除率,结果为不含有功能性物质的未包衣乳酸菌的去除效率比较低，因为它们仅通过竞争去除方法去除鼠伤寒沙门氏菌KCTC 2054，而功能性水合透明质酸三层包衣乳酸菌显示出比未包衣及透明质酸三层包衣乳酸菌显著更高的有害细菌去除效率。
另外，所述功能性水合透明质酸三层包衣乳酸菌的效果，即使仅看嗜酸乳杆菌IDCC3302的结果，也显示出比未包衣乳酸菌高出51％的优秀的效果，甚至与常规的透明质酸三层包衣乳酸菌相比也显示高出27％以上的优异效果。因此，可以确认，使用功能性水合透明质酸作为乳酸菌包衣剂时，与以往的常规乳酸菌包衣剂相比，对肠内有害菌的抑制效果显著提高。
表12功能性水合透明质酸三层包衣乳酸菌的竞争性粘附抑制性
<7-6>功能性水合透明质酸三层包衣乳酸菌的体内肠固定性
为了进行功能性水合透明质酸三层包衣乳酸菌的体内肠固定性实验，以与实施例<6-6>相同的方法进行实验。
结果显示在图8中。
如图8所示，确认与未包衣乳酸菌施用组不同，透明质酸三层包衣乳酸菌和功能性水合透明质酸三层包衣乳酸菌施用组，在投入停止起至2.5周为止的粪便中检测到乳酸杆菌。确认其效果在功能性水合透明质酸三层包衣乳酸菌施用组中最优秀。
然而，包衣乳酸菌施用组，仅在投入停止后1周内的粪便中检测到乳酸杆菌，且功能性水合透明质酸三层包衣乳酸菌施用组延长1.5周仍检测出乳酸杆菌，由此确认后者肠内固定性最优秀。
尤其是，功能性水合透明质酸三层包衣乳酸菌不仅通过竞争排斥(competitiveexclusion)而粘附于肠粘膜，而且增殖活跃，以1×103CFU的水平检测到乳酸杆菌属(Lactobacillus sp.)。因此，可以判断功能性水合透明质酸三层包衣乳酸菌在抗生素和鼠伤寒沙门氏菌干扰的肠内微生物菌群中具有增殖有益菌的作用。
<7-7>功能性水合透明质酸三层包衣乳酸菌对体内有害细菌的抑制作用
使用与本发明的实施例<6-7>相同的方法，在感染鼠伤寒沙门氏菌KCTC 2054的小鼠模型中测量抗菌活性，以确认功能性水合透明质酸三层包衣乳酸菌在体内抑制有害细菌的能力。
结果显示在图9中。
如图9所示，对施用抗生素抑制肠内常驻菌群并感染鼠伤寒沙门氏菌KCTC 2054的小鼠模型，施用未包衣乳酸菌、透明质酸三层包衣乳酸菌和功能性水合透明质酸三层包衣乳酸菌样品的结果确认为，起到单纯竞争排斥作用的未包衣、透明质酸三层包衣乳酸菌与鼠伤寒沙门氏菌KCTC 2054竞争并抑制其生长，而功能性水合透明质酸三层包衣乳酸菌可以更长时间更有效地抑制鼠伤寒沙门氏菌KCTC 2054。
该结果表明，对于通过抗菌素和作为竞争性细菌的鼠伤寒沙门氏菌KCTC 2054干扰的小鼠的肠道菌群，功能性水合透明质酸三层包衣乳酸菌起到抗菌作用和竞争排斥作用，即通过抗菌活性和竞争排斥原理降低有害菌增殖，并增加有益菌的增殖，从而快速使肠内环境正常化。
<实施例8>功能性水合透明质酸四层包衣乳酸菌
<8-1>功能性水合透明质酸四层包衣乳酸菌的制备
在本发明中，基于韩国专利(第10-1280232号)的实施例中描述的四层包衣乳酸菌的制备方法，通过使用乳酸菌的表面薄膜包衣剂CMC-Na作为第一包衣剂，所述<实施例1>中制备的功能性水合透明质酸作为第二包衣剂，麦芽糊精(maltodextrin)作为第三包衣剂，最后使用乳清蛋白作为第四包衣剂来制备功能性水合四层包衣乳酸菌。作为对照组，使用常规透明质酸代替功能性水合透明质酸制备四层包衣乳酸菌。
<8-2>功能性水合透明质酸四层包衣乳酸菌耐酸性(acid Tolerance)
当乳酸菌通过人体消化器官胃(stomach)时暴露于胃液中(gastric juice)。在试管条件下形成类似环境，并通过功能性水合四层包衣乳酸菌和透明质酸四层包衣乳酸菌的存活率来比较耐酸性。以与本发明实施例<6-2>相同的实验方法进行实验。
其结果如下表13所示。
表13功能性水合透明质酸四层包衣乳酸菌的耐酸性结果
如表13所示，功能性水合透明质酸四层包衣乳酸菌显示出比双层、三层包衣乳酸菌更高的耐酸性，尤其在pH 2.5条件下显示出更高的耐酸性。可以判断这个结果是由于4层包衣乳酸菌原本具有较高的耐酸性导致的，功能性水合透明质酸四层包衣乳酸菌的耐酸性显示出与以往4层包衣乳酸菌相似的模式，可知在结构上具有稳定性。
<8-3>功能性水合透明质酸四层包衣乳酸菌的耐胆汁酸性(bile tolerance)
当暴露于胆汁酸(bile acid)时，试验管环境下比较功能性水合透明质酸四层包衣乳酸菌和透明质酸四层包衣乳酸菌的存活率。以与本发明的实施例<6-3>相同的方式进行实验。
结果显示在下表14中。
表14功能性水合透明质酸四层包衣乳酸菌的耐胆汁酸性结果
如表14所示，功能性水合四层包衣乳酸菌的耐胆汁酸性的效果与透明质酸四层包衣乳酸菌的差异不大，可判断保持了结构性稳定的形态。
<8-4>功能性水合透明质酸四层包衣乳酸菌的非竞争性粘附(Non-competitive adhesion)
为了在不存在竞争关系的微生物的状态下比较粘附性，参照韩国注册专利(第10-1280232号)的四层包衣乳酸菌制备方法制备所述四层包衣乳酸菌。另外，为了评价非竞争性粘附性，以与本发明的实施例<6-4>相同的方法进行实验。
结果显示在下表15中。
如下表15所示，在评价对与肠膜相似的Caco-2细胞的粘附性时，透明质酸四层包衣乳酸菌的粘附效率比未包衣乳酸菌相对更优秀，而功能性水合透明质酸四层包衣乳酸菌显示出与透明质酸四层包衣乳酸菌相同的粘附效率。
表15功能性水合透明质酸四层包衣乳酸菌的非竞争性粘附
可以确认，功能性水合透明质酸四层包衣乳酸菌的单纯粘附效率随着包衣的数量进一步改善。即，当仅评价嗜酸乳杆菌IDCC 3302的结果时，证实功能性水合透明质酸双层包衣乳酸菌(48％的粘附率)、功能性水合透明质酸三层包衣乳酸菌(56％的粘附率)、功能性水合透明质酸四层包衣乳酸菌(66％粘附率)随着包衣的数量而增加，粘附率增加了20％以上。通过这些结果可以推测，作为第三包衣剂的麦芽糊精和作为第四包衣剂的乳清蛋白将乳酸菌暴露于酸性环境的程度降至最低，第二包衣剂也在一定程度上减少了暴露时间，从而使其与粘膜的相互作用最大化。
<8-5>功能性水合透明质酸四层包衣乳酸菌的竞争性粘附抑制性(Competitive exclusion)
为了更清楚地确定功能性水合透明质酸三层包衣乳酸菌是否可以在肠中显示有益的生理活性，使用与本发明的实施例<6-5>相同的方法评估在常驻菌群存在的条件下乳酸菌的粘附能力。
结果显示在下表16中。
如下表16所示，首先将有害菌即鼠伤寒沙门氏菌KCTC 2054附着于类似肠膜的Caco-2细胞，之后比较未包衣乳酸菌、透明质酸四层包衣乳酸菌和功能性水合透明质酸四层包衣乳酸菌的竞争有害菌的去除率,结果为不含有功能性物质的未包衣乳酸菌的去除效率比较低，因为它们仅通过竞争去除方法去除鼠伤寒沙门氏菌KCTC 2054，而功能性水合透明质酸四层包衣乳酸菌显示出比未包衣及常规透明质酸四层包衣乳酸菌显著更高的有害细菌去除效率。
另外，所述功能性水合透明质酸四层包衣乳酸菌的效果，即使仅看嗜酸乳杆菌IDCC3302的结果，也显示出比未包衣乳酸菌高出57％的优秀的效果，甚至与常规的透明质酸四层包衣乳酸菌相比也显示高出31％以上的优异效果。即，可以确认，使用功能性水合透明质酸作为乳酸菌包衣剂时，与以往的常规乳酸菌包衣剂相比，对肠内有害菌的抑制效果显著提高。
表16功能性水合透明质酸四层包衣乳酸菌的竞争性粘附抑制性
与所述实施例<8-4>中评估的单纯粘附能力相比，功能性水合透明质酸四层包衣乳酸菌的竞争性粘附抑制性改善约30％。通过结果可以推断，如果说常规的四层包衣乳酸菌通过竞争排斥增加附着效率而增殖，功能性水合透明质酸四层包衣乳酸菌则通过结合竞争性排斥与抗菌活性来降低竞争性菌株鼠伤寒沙门氏菌的活性从而增加粘附的机会。
<8-6>功能性水合透明质酸四层包衣乳酸菌的体内肠固定性
为了进行功能性水合透明质酸四层包衣乳酸菌的体内肠固定性实验，以与实施例<6-6>相同的方法进行实验。
结果显示在图10中。
如图10所示，确认与未包衣乳酸菌施用组不同，透明质酸四层包衣乳酸菌和功能性水合透明质酸四层包衣乳酸菌施用组，在投入停止起至2.5周为止的粪便中检测到乳酸杆菌。确认其效果在功能性水合透明质酸四层包衣乳酸菌施用组中最优秀。
然而，包衣乳酸菌施用组，仅在投入停止后1周内的粪便中检测到乳酸杆菌，且功能性水合透明质酸四层包衣乳酸菌施用组延长1.5周仍检测出乳酸杆菌，由此确认后者肠内固定性相对优秀。
<8-7>功能性水合透明质酸四层包衣乳酸菌对体内有害细菌的抑制作用
使用与本发明的实施例<6-7>相同的方法，在感染鼠伤寒沙门氏菌KCTC 2054的小鼠模型中测量抗菌活性，以确认功能性水合透明质酸四层包衣乳酸菌在体内抑制有害细菌的能力。
结果显示在图11中。
如图11所示，对施用抗生素抑制肠内常驻菌群并感染鼠伤寒沙门氏菌KCTC 2054的小鼠模型，施用未包衣乳酸菌、透明质酸四层包衣乳酸菌和功能性水合透明质酸四层包衣乳酸菌样品的结果确认为，起到单纯竞争排斥作用的未包衣、透明质酸四层包衣乳酸菌与鼠伤寒沙门氏菌KCTC 2054竞争并抑制其生长，而功能性水合透明质酸四层包衣乳酸菌可以更长时间更有效地抑制鼠伤寒沙门氏菌KCTC 2054。
另外，同时具有抗菌活性和活菌竞争排斥功能的功能性水合透明质酸四层包衣乳酸菌从感染鼠伤寒沙门氏菌KCTC 2054一开始就抑制其生长，使有害菌即鼠伤寒沙门氏菌KCTC 2054对乳酸菌的影响较小，从而使乳酸菌的个体数量增加，又由于乳酸菌的数量增加，即使停止投入2.5周后，仍有助于维持正常的菌群。
<实施例9>电子显微镜(FE-SEM)结构分析
对所述实施例1中制备的功能性水合透明质酸四层包覆的嗜酸乳杆菌IDCC 3302的性状，根据制备工序通过电子显微镜照相进行结构分析。对功能性水合透明质酸四层包衣乳酸菌的制备工艺按步骤用电子显微镜进行结构分析，如图12至图16所示。
如图12至16所示，当CMC-Na与乳酸菌混合时，观察到CMC-Na在乳酸菌表面形成膜状薄膜并包覆乳酸菌(图13)。此外，观察到通过CMC-Na和功能性水合透明质酸的混合，从结构上功能性水合透明质酸的结构变得更致密(图14)。通过加入多孔颗粒麦芽糊精防止外部水分和温度传递到至菌体(图15)，最后，用乳清蛋白包覆，使菌体不暴露到外部(图16)。
即，可以证实，随着按顺序添加第一至第四包衣剂，各包衣剂包覆乳酸菌，更加致密和牢固地保护了乳酸菌。
产业利用可能性
本发明的功能性水合透明质酸显示出对有害菌的抑制增殖作用及对有益菌的促进增殖作用从而具有选择性拮抗作用，通过本发明的方法四层包覆的乳酸菌，通过将乳酸菌与水溶性聚合物、功能性水合透明质酸、具有多孔颗粒的包衣剂和蛋白质混合而进行4层包覆，不仅显示出以往未包衣、单层、双层、三层、四层包衣乳酸菌未曾具有的优秀的肠粘膜的粘附性和对有害细菌的选择性拮抗作用，而且具有优异的耐酸性和耐胆汁性，没有失去乳酸菌固有的生理活性功能，因此具有优秀的产业利用可能性。

Claims (13)

1.一种通过相对于100重量份的乳酸菌培养基以0.001重量份～1重量份的比例添加透明质酸并搅拌溶解后浓缩的方法制备的、乳酸菌发酵产物被捕集的功能性水合透明质酸。
2.根据权利请求第1项的所述功能性水合透明质酸，其特征为，所述乳酸菌培养基通过以下步骤制备：
(a)在110～135℃下加压热处理乳酸菌培养基3～7分钟的步骤；
(b)将所述步骤(a)的加压热处理的培养基冷却至25～35℃的步骤；
(c)将所述步骤(b)的冷却的培养基在105～115℃下加压热处理8～12分钟的步骤；
(d)将所述步骤(c)的加压热处理的培养基冷却至25～35℃的步骤；
(e)将所述步骤(d)的冷却的培养基在75～85℃下热处理20～40分钟，然后最终冷却至25～35℃的步骤。
3.根据权利请求第1项或第2项的所述功能性水合透明质酸，其特征为，所述乳酸菌是选自由乳酸杆菌属、双歧杆菌属、链球菌属、乳球菌属、肠球菌属、片球菌属、明串珠菌属、魏斯氏菌属组合的群中的至少一种乳酸菌。
4.一种使用权利请求第1项或第2项的所述功能性水合透明质酸包覆的乳酸菌。
5.一种四层包衣乳酸菌的制备方法，包括：
(a)通过将水溶性聚合物与乳酸菌混合来进行第1次包覆的步骤；
(b)通过将权利请求第1项的功能性水合透明质酸与所述步骤(a)的第1次包覆的乳酸菌混合来进行第2次包覆的步骤；
(c)通过将具有多孔颗粒的包衣剂与所述步骤(b)的第2次包覆的乳酸菌混合来进行第3次包覆的步骤；和
(d)通过将蛋白质与所述步骤(c)的第3次包覆的乳酸菌混合来进行第4次包覆的步骤。
6.根据权利请求第5项的所述四层包衣乳酸菌的制备方法，其特征为，所述步骤(a)中的水溶性聚合物选自羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、黄原胶、瓜耳胶、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆、海藻酸钠和海藻酸丙二醇酯组合的群中的至少一种。
7.根据权利请求第5项的所述四层包衣乳酸菌的制备方法，其特征为，所述步骤(b)中的功能性水合透明质酸为通过相对于100重量份的乳酸菌培养基以0.001重量份～1重量份的比例添加透明质酸，通过搅拌溶解后，在30至60℃下减压浓缩的方法来制备，并且其透明质酸中捕集了乳酸菌发酵产物。
8.根据权利请求第5项的所述四层包衣乳酸菌的制备方法，其特征为，所述步骤(c)中的具有多孔颗粒的包衣剂选自由海藻酸盐、麦芽糊精、壳聚糖，淀粉、聚乙二醇、三醋精、丙二醇、乙酰柠檬酸三乙酯、柠檬酸三乙酯、甘油组合的群中的至少一种。
9.根据权利请求第5项的所述四层包衣乳酸菌的制备方法，其特征为，所述步骤(d)中的蛋白质选自由脱脂奶粉、乳清蛋白、分离的大豆蛋白组合的群中的至少一种。
10.根据权利请求第5项的所述四层包衣乳酸菌的制备方法，其特征为，所述乳酸菌是选自由乳酸杆菌属、双歧杆菌属、链球菌属、乳球菌属、肠球菌属、片球菌属、明串珠菌属、魏斯氏菌属组合的群中的至少一种乳酸菌。
11.根据权利请求第5项的所述四层包衣乳酸菌的制备方法，其特征为，包括：
所述步骤(a)中的所述水溶性聚合物，与相对于100重量份的乳酸菌培养基以0.1重量份至10重量份的比例混合来进行第一次包覆的步骤；
所述步骤(b)中的所述透明质酸，与相对于100重量份的乳酸菌培养基以0.001重量份至0.5重量份的比例混合来进行第二次包覆的步骤；
所述步骤(c)中的所述具有多孔颗粒的包衣剂，与相对于100重量份的乳酸菌培养基以0.1重量份10重量份的比例混合来进行第三次包覆的步骤；
所述步骤(d)中的所述蛋白质，与相对于100重量份的乳酸菌培养基以1重量分至30重量份的比例混合来进行第四次包覆的步骤。
12.一种根据权利请求第5项的所述制备方法制备的四层包衣乳酸菌。
13.根据权利请求第12项的所述四层包衣乳酸菌，其特征为，所述乳酸菌是选自由乳酸杆菌属、双歧杆菌属、链球菌属、乳球菌属、肠球菌属、片球菌属、明串珠菌属、魏斯氏菌属组合的群中的至少一种乳酸菌。
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