WO2017018408A1 - 酸化剤とその使用 - Google Patents

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WO2017018408A1
WO2017018408A1 PCT/JP2016/071832 JP2016071832W WO2017018408A1 WO 2017018408 A1 WO2017018408 A1 WO 2017018408A1 JP 2016071832 W JP2016071832 W JP 2016071832W WO 2017018408 A1 WO2017018408 A1 WO 2017018408A1
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compound
double
stranded polynucleotide
hydroxymethylcytosine
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PCT/JP2016/071832
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世傑 福沢
Original Assignee
国立大学法人東京大学
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D471/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00
    • C07D471/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D471/08—Bridged systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D209/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom

Definitions

  • the present invention relates to oxidizing agents and their use. This application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2015-150846 filed in Japan on July 30, 2015, the contents of which are incorporated herein by reference.
  • the method of oxidizing the hydroxy group is one of basic reactions of organic chemistry, and many oxidation reagents have been developed so far. Among them, as a method for quantitatively oxidizing a hydroxy group in an organic solvent, a hypervalent element reagent such as a transition metal oxidation reagent, dimethyl sulfoxide (DMSO), and a periodinane compound has been developed.
  • a hypervalent element reagent such as a transition metal oxidation reagent, dimethyl sulfoxide (DMSO), and a periodinane compound has been developed.
  • reaction control tends to be difficult due to the need for strong acid or alkaline conditions and side reactions due to hydroxy radical species generated from water molecules.
  • proteins and DNA which are water-soluble biopolymers, have electron-rich functional groups and belong to the most difficult class as a substrate, such as steric hindrance near the reaction point due to macromolecules.
  • Oxidizing a hydroxy group of a macromolecule containing many types of functional groups in an aqueous solvent under mild conditions opens up many possibilities for labeling and functionalization that have not been possible before.
  • hydroxymethylcytosine which has been attracting attention in the epigenomic field, can be converted to uracil by oxidation and reductive deamination reactions. Therefore, if a mild and quantitative oxidation reaction can be developed, the position information can be obtained at the single base level. A major contribution to stem cell and regenerative medicine research can be expected.
  • Patent Document 1 discloses a method for identifying a modified cytosine residue such as 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) in a sample nucleotide sequence using a perruthenate oxidant.
  • a perruthenate oxidant can oxidize a primary alcohol to an aldehyde and a secondary alcohol to a ketone under mildly basic conditions at room temperature.
  • TEMPO a nitroxy radical
  • AZADOL registered trademark (2-hydroxy-2-azaadamantane) developed by Iwasaki et al. At Tohoku University graduate School of Pharmaceutical Sciences is N-hydroxy having a higher activity than TEMPO (see, for example, Patent Document 2).
  • AZADOL® has the advantage of being more stable than AZADO (2-azaadamantane-N-oxyl), a nitroxy radical, and more soluble in water than AZADO.
  • NaOCl sodium hypochlorite
  • BAIB iodobenzene diacetate
  • AZADOL registered trademark
  • NaOCl sodium hypochlorite
  • BAIB iodobenzene diacetate
  • AZADOL registered trademark
  • NaOCl sodium hypochlorite
  • BAIB iodobenzene diacetate
  • BAIB iodobenzene diacetate
  • AZADOL registered trademark
  • NaOCl is hydrophilic
  • BAIB is hydrophobic
  • the physical properties are contradictory.
  • there is a report example in which NaOCl is used as a co-oxidant to oxidize the hydroxy group of cellulose in a homogeneous system for example, see Non-Patent Documents 1 and 2).
  • Tsuguyuki Saito et al “Homogeneous Suspensions of Individualized Microfibrils from TEMPO-Catalyzed Oxidation of NativeVuluumulumolumolumum, 7”. 1687-1690, June 2006.
  • Tsuguyuki Saito et al “Cellulose Nanofibres Prepared by TEMPO-Mediated Oxidation of Native Cellulose”, Biomacromolecules, Volume8, Number8p. 2485-2491, April 10, 2007.
  • the perruthenate oxidant described in Patent Document 1 acts as a trivalent oxidant and is reduced to ruthenium dioxide. Also, it has autocatalytic properties of the reaction, and this autocatalytic property is thought to be due to adsorption and activation of the perruthenate oxidant on the surface of the insoluble ruthenium dioxide particles produced by the reaction. .
  • water is preferentially adsorbed on the surface of the ruthenium dioxide particles over the perruthenate oxidant, there is a problem of hindering autocatalytic properties. Therefore, a desiccant is necessary to adsorb and remove water, and it is difficult to perform an oxidation reaction in an aqueous solvent reflecting the in vivo environment.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and provides a method for selectively oxidizing a hydroxy group in a water-soluble biopolymer under mild conditions in an aqueous solvent reflecting the in vivo environment. .
  • the present invention includes the following aspects.
  • [5] A method for producing a hypervalent iodine compound encapsulated in micelles with a surfactant, (A) mixing the hypervalent iodine compound, acetonitrile, a surfactant, and a solvent, and stirring and stirring until the liquid color becomes transparent to yellow at a temperature of 4 ° C. or higher and lower than 25 ° C .; (B) after the step (a), a step of shaking and stirring at a temperature of 25 ° C. or higher and 30 ° C. or lower; With The hypervalent iodine compound has iodobenzene as a basic structure and is hydrophobic. [6] The production method according to [5], wherein the concentration of the hypervalent iodine compound is 20 mg / mL or more and 30 mg / mL or less.
  • [7] A compound having an alicyclic heterocycle having an oxidant according to any one of [1] to [4] and one nitrogen as a heteroatom and a hydroxy group bonded to the nitrogen And an oxidation reaction reagent comprising a catalyst having a pH of 6.0 or more and less than 7.0.
  • an oxidation reaction reagent comprising a catalyst having a pH of 6.0 or more and less than 7.0.
  • a kit for selectively oxidizing a hydroxy group of a target water-soluble biopolymer which is a hydrophobic hypervalent iodine compound having a basic structure and having iodobenzene, and a surfactant And a catalyst which is an alicyclic heterocycle having acetonitrile, one nitrogen as a heteroatom, and a hydroxy group bonded to the nitrogen, a solvent having a pH of 6.0 or more and less than 7.0
  • a kit comprising: [10] A kit for detecting hydroxymethylcytosine in a double-stranded polynucleotide, comprising a hypervalent iodine compound having a basic structure of iodobenzene and hydrophobic, a surfactant, acetonitrile, A catalyst which is a compound having an alicyclic heterocycle having one nitrogen as a hetero atom and a hydroxy group bonded to the nitrogen, a solvent having a pH of 6.0 or more and less than
  • a method for detecting hydroxymethylcytosine in a double-stranded polynucleotide comprising: (A) a sample containing a double-stranded polynucleotide having hydroxymethylcytosine, the oxidizing agent according to any one of [1] to [4], and one nitrogen as a hetero atom, A catalyst, which is a compound having an alicyclic heterocycle having a hydroxy group bonded thereto, and a solvent having a pH of 6.0 or more and less than 7.0 are mixed to oxidize hydroxymethylcytosine and convert it to formylcytosine.
  • Process (B) treating the sample containing a double-stranded polynucleotide having the converted formylcytosine with bisulfite to convert formylcytosine to uracil; (C) adding and amplifying forward and reverse primers for amplifying a region containing hydroxymethylcytosine in the double-stranded polynucleotide to the double-stranded polynucleotide having the converted uracil; and (D) comparing a sample containing a double-stranded polynucleotide, which has been subjected to steps (A) to (C) without adding an oxidizing agent, as a control, and detecting hydroxymethylcytosine in the double-stranded polynucleotide And a detection method comprising:
  • An oxidizing agent comprising iodobenzene diacetate encapsulated in micelles with a surfactant.
  • a method for producing iodobenzene diacetate encapsulated in micelles with a surfactant (A) a step of mixing iodobenzene diacetate, acetonitrile, a surfactant, and a solvent, and shaking and stirring until the liquid color becomes transparent to yellow at a temperature of 4 ° C. or higher and lower than 25 ° C .; (B) After the step (a), a step of shaking and stirring at a temperature of 25 ° C. or higher and 30 ° C. or lower.
  • a catalyst that is a compound having an alicyclic heterocycle in which a hydroxy group is bonded to the nitrogen, and a solvent having a pH of 6.0 or more and less than 7.0 [17] A kit for detecting hydroxymethylcytosine in a double-stranded polynucleotide, comprising iodobenzene diacetate, a surfactant, acetonitrile, and one nitrogen as a heteroatom.
  • a catalyst which is a compound having an alicyclic heterocycle to which a hydroxy group is bonded, a solvent having a pH of 6.0 or more and less than 7.0, bisulfite, and hydroxymethylcytosine in the double-stranded polynucleotide
  • a kit comprising forward and reverse primer sets for amplifying the region.
  • a method for detecting hydroxymethylcytosine in a double-stranded polynucleotide comprising: (A) A sample containing a double-stranded polynucleotide having hydroxymethylcytosine, the oxidizing agent according to [12], and a fat having one nitrogen as a heteroatom and having a hydroxy group bonded to the nitrogen Mixing a catalyst which is a compound having a cyclic heterocycle with a solvent having a pH of 6.0 or more and less than 7.0, oxidizing hydroxymethylcytosine and converting it to formylcytosine; (B) treating the sample containing a double-stranded polynucleotide having the converted formylcytosine with bisulfite to convert formylcytosine to uracil; (C) adding and amplifying forward and reverse primers for amplifying a region containing hydroxymethylcytosine in the double-stranded polynucleotide to the double-stranded polynu
  • a hydroxy group in a water-soluble biopolymer can be selectively oxidized under a mild condition in an aqueous solvent reflecting the in vivo environment. Moreover, according to the present invention, hydroxymethylcytosine in a double-stranded polynucleotide can be easily detected.
  • FIG. 5 is a schematic diagram showing a change in the rate of conversion from hydroxymethylcytosine to uracil due to the difference in the oxidation time of the substrate DNA in Example 2.
  • 6 is a graph showing changes in the ratio of methylated (or hydroxymethylated) cytosine due to the difference in the oxidation time of the substrate DNA in Example 2.
  • the present invention provides an oxidizing agent containing a hypervalent iodine compound that has a basic structure of iodobenzene encapsulated in micelles with a surfactant and is hydrophobic.
  • a hypervalent iodine compound that has iodobenzene in the basic structure and is hydrophobic can be used as an oxidizing agent in an aqueous solvent.
  • hypervalent iodine compounds that have iodobenzene in the basic structure and are hydrophobic they can be isolated from the substrate, and side reactions such as substrate decomposition can be prevented.
  • the term “surfactant” means a substance that acts on an interface (surface of a substance boundary) to change its properties, and its structure is familiar to water in one molecule. It has two parts: “hydrophilic” which is easy to use and “lipophilic” which is easy to adjust to oil.
  • the surfactant to be used is preferably an ionic surfactant, and more preferably an anionic surfactant (anionic surfactant).
  • anionic surfactant means a compound that is ionized when dissolved in water and a hydrophilic group (part that is structurally compatible with water) is dissociated negatively.
  • carboxylic acid, sulfonic acid, or phosphoric acid structure as a hydrophilic group, a carboxylic acid type (R—COO ⁇ M + ), a branched or straight chain type sodium alkylbenzene sulfonate (RC 6 H 4) -SO 3 - Na + ), sulfonic acid type (R-SO 3 - Na + ), sulfate ester type (RO-SO 3 - Na + ) and phosphate ester type (RO-PO (OH) OM) + ) Etc.
  • a carboxylic acid type R—COO ⁇ M +
  • a branched or straight chain type sodium alkylbenzene sulfonate RC 6 H 4
  • -SO 3 - Na + branched or straight chain type sodium alkylbenzene sulfonate
  • R-SO 3 - Na + branched or straight chain type sodium alkylbenzene sulfonate
  • sodium cholate hydrate sodium deoxycholate, sodium glycocholate, sodium taurocholate, sodium taurodeoxycholate, N-lauroyl sarcosine sodium salt, lithium dodecyl sulfate, sodium dodecyl sulfate (sodium dodecyl) sulfate (SDS), dodecyl phosphocholine (DPC), and the like.
  • SDS or DPC is particularly preferable from the viewpoint that an inexpensive and compact micelle can be produced.
  • oxidation means a chemical reaction in which a target substance such as a water-soluble biopolymer loses electrons, specifically, a reaction in which oxygen combines with the target substance, or And the reaction in which the target substance is deprived of hydrogen.
  • the “oxidant” means a compound capable of transferring an oxygen atom, or a substance that obtains electrons by an oxidation-reduction reaction, and a hydroxyl group in a target substance such as a water-soluble biopolymer. Is oxidized to a formyl group or a ketone group.
  • a hypervalent iodine compound is a compound containing iodine having eight or more electrons in the valence shell.
  • the hypervalent iodine compound in the present embodiment has iodobenzene as a basic structure, is hydrophobic, and may be abbreviated as a compound represented by the following general formula (1) (hereinafter referred to as “compound (1)”). Or a compound represented by the following general formula (2) (hereinafter sometimes abbreviated as “compound (2)”).
  • R 11 , R 14 , R 15 , R 16 , R 21 , and R 24 are each independently a hydrogen atom, a halogen atom, a nitro group, a cyano group, hydroxy Group, mercapto group, amino group, formyl group, carboxyl group, sulfo group, C 1-12 alkyl group, C 3-12 cycloalkyl group, (C 1-12 alkyl) oxy group (C 1-12 alkoxy group), (C 3-12 cycloalkyl) oxy group, (C 1-12 alkyl) thio group, (C 3-12 cycloalkyl) thio group, (C 1-12 alkyl) amino group, (C 3-12 cycloalkyl) Amino group, di (C 1-6 alkyl) amino group, di (C 3-6 cyclo
  • Rubonyl amino group, C 1-6 haloalkyl group, C 3-6 halocycloalkyl group, C 2-6 alkenyl group, C 3-6 cycloalkenyl group, C 2-6 haloalkenyl group, C 3-6 halocyclo group
  • halogen atom examples include a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom and an iodine atom.
  • halo also represents these halogen atoms.
  • C a -C b alkyl represents a linear or branched hydrocarbon group having a to b carbon atoms.
  • Examples of C a -C b alkyl include methyl group, ethyl group, n-propyl group, i-propyl group, n-butyl group, i-butyl group, s-butyl group, t-butyl group, and n-pentyl.
  • C a -C b haloalkyl is a linear or branched hydrocarbon group comprising a to b carbon atoms, wherein a hydrogen atom bonded to a carbon atom is optionally substituted with a halogen atom Represents.
  • the halogen atoms may be the same as or different from each other.
  • C a -C b haloalkyl examples include, for example, fluoromethyl group, chloromethyl group, bromomethyl group, iodomethyl group, difluoromethyl group, chlorofluoromethyl group, dichloromethyl group, bromofluoromethyl group, trifluoromethyl group, chlorodifluoro Methyl group, dichlorofluoromethyl group, trichloromethyl group, bromodifluoromethyl group, bromochlorofluoromethyl group, dibromofluoromethyl group, 2-fluoroethyl group, 2-chloroethyl group, 2-bromoethyl group, 2,2-difluoroethyl Group, 2-chloro-2-fluoroethyl group, 2,2-dichloroethyl group, 2-bromo-2-fluoroethyl group, 2,2,2-trifluoroethyl group, 2-chloro-2,2-difluoro An
  • C a -C b cycloalkyl represents a cyclic hydrocarbon group having a carbon number of a to b and forms a monocyclic or complex ring structure having 3 to 6 members. I can do it. Each ring may be optionally substituted with an alkyl group within the range of the specified number of carbon atoms.
  • Examples of C a -C b cycloalkyl include cyclopropyl group, 1-methylcyclopropyl group, 2-methylcyclopropyl group, 2,2-dimethylcyclopropyl group, 2,2,3,3-tetramethylcyclohexane.
  • Specific examples include a heptan-2-yl group and the like, and each is selected within the range of the designated number of carbon atoms.
  • C a -C b halocycloalkyl represents a cyclic hydrocarbon group having a to b carbon atoms in which a hydrogen atom bonded to a carbon atom is optionally substituted with a halogen atom.
  • a monocyclic or complex ring structure from a 3-membered ring to a 6-membered ring can be formed.
  • Each ring may be optionally substituted with an alkyl group within the range of the specified number of carbon atoms, and the substitution with a halogen atom may be a ring structure part, a side chain part, They may be both, and when substituted by two or more halogen atoms, the halogen atoms may be the same as or different from each other.
  • C a -C b halocycloalkyl examples include 2,2-difluorocyclopropyl group, 2,2-dichlorocyclopropyl group, 2,2-dibromocyclopropyl group, 2,2-difluoro-1-methylcyclo Propyl group, 2,2-dichloro-1-methylcyclopropyl group, 2,2-dibromo-1-methylcyclopropyl group, 2,2,3,3-tetrafluorocyclobutyl group, 2- (trifluoromethyl) Specific examples include a cyclohexyl group, a 3- (trifluoromethyl) cyclohexyl group, a 4- (trifluoromethyl) cyclohexyl group, and the like, and each is selected within the range of the designated number of carbon atoms.
  • C a -C b alkenyl in the present specification is an unsaturated carbon having a straight chain or branched chain having a carbon number of a to b and having one or more double bonds in the molecule. Represents a hydrogen group.
  • Examples of C a -C b alkenyl include vinyl, 1-propenyl, 2-propenyl, 1-methylethenyl, 2-butenyl, 1-methyl-2-propenyl, and 2-methyl-2-propenyl.
  • 2-pentenyl group 2-methyl-2-butenyl group, 3-methyl-2-butenyl group, 2-ethyl-2-propenyl group, 1,1-dimethyl-2-propenyl group, 2-hexenyl group
  • Specific examples include 2-methyl-2-pentenyl group, 2,4-dimethyl-2,6-heptadienyl group, 3,7-dimethyl-2,6-octadienyl group, and the like. Selected by range.
  • C a -C b haloalkenyl is a straight chain or branched chain consisting of a to b carbon atoms in which a hydrogen atom bonded to a carbon atom is optionally substituted with a halogen atom, and Represents an unsaturated hydrocarbon group having one or more double bonds in the molecule.
  • the halogen atoms may be the same as or different from each other.
  • C a -C b haloalkenyl examples include 2,2-dichlorovinyl group, 2-fluoro-2-propenyl group, 2-chloro-2-propenyl group, 3-chloro-2-propenyl group, 2-bromo -2-propenyl group, 3-bromo-2-propenyl group, 3,3-difluoro-2-propenyl group, 2,3-dichloro-2-propenyl group, 3,3-dichloro-2-propenyl group, 2, 3-dibromo-2-propenyl group, 2,3,3-trifluoro-2-propenyl group, 2,3,3-trichloro-2-propenyl group, 1- (trifluoromethyl) ethenyl group, 3-chloro- 2-butenyl group, 3-bromo-2-butenyl group, 4,4-difluoro-3-butenyl group, 3,4,4-trifluoro-3-butenyl group,
  • C a -C b alkynyl represents a linear or branched chain having a carbon number of a to b and an unsaturated carbon having one or more triple bonds in the molecule.
  • Examples of C a -C b alkynyl include ethynyl, 1-propynyl, 2-propynyl, 2-butynyl, 1-methyl-2-propynyl, 2-pentynyl, 1-methyl-2-butynyl.
  • Specific examples include a group, 1,1-dimethyl-2-propynyl group, 2-hexynyl group and the like, and each is selected within the range of the designated number of carbon atoms.
  • C a -C b haloalkynyl is a straight or branched chain consisting of a to b carbon atoms, wherein a hydrogen atom bonded to a carbon atom is optionally substituted with a halogen atom, and Represents an unsaturated hydrocarbon group having one or more triple bonds in the molecule.
  • the halogen atoms may be the same as or different from each other.
  • C a -C b haloalkynyl includes, for example, 2-chloroethynyl group, 2-bromoethynyl group, 2-iodoethynyl group, 3-chloro-2-propynyl group, 3-bromo-2-propynyl group, 3- Specific examples include an iodo-2-propynyl group and the like, and each is selected within the range of the designated number of carbon atoms.
  • R a is a halogen atom, a C 1-6 alkyl group, a C 1-6 haloalkyl group, a C 3-6 cycloalkyl group, a C 1-6 alkoxy group, a C 1-6 alkoxy C 1-6 alkyl group, C 1 -6 alkylsulfenyl C 1-6 alkyl group, C 1-6 haloalkoxy group, C 1-6 alkylsulfenyl group, C 1-6 alkylsulfinyl group, C 1-6 alkylsulfonyl groups, C 1-6 haloalkyl Sulphenyl group, C 1-6 haloalkylsulfinyl group, C 1-6 haloalkylsulfonyl group, C 2-6 alkenyl group, C 2-6 haloalkenyl group, C 2-6 alkenyloxy group, C 2-6 haloalkenyloxy group, C 2-6 alkenyloxy group, C 2
  • Examples of the aryl group which may be substituted with Ra include a phenyl group, o-methylphenyl group, m-methylphenyl group, p-methylphenyl group, o-chlorophenyl group, m-chlorophenyl group, p -Chlorophenyl group, o-fluorophenyl group, p-fluorophenyl group, o-methoxyphenyl group, p-methoxyphenyl group, p-nitrophenyl group, p-cyanophenyl group, ⁇ -naphthyl group, ⁇ -naphthyl group O-biphenylyl group, m-biphenylyl group, p-biphenylyl group, 1-anthryl group, 2-anthryl group, 9-anthryl group, 1-phenanthryl group, 2-phenanthryl group, 3-phenanthryl group, 4-phenanthryl group 9-phenanthryl
  • Examples of the benzyl group optionally substituted with R a include benzyl group, o-methylbenzyl group, m-methylbenzyl group, p-methylbenzyl group, o-chlorobenzyl group, m-chlorobenzyl group, p Examples include, but are not limited to, -chlorobenzyl group, o-fluorobenzyl group, p-fluorobenzyl group, o-methoxybenzyl group, p-methoxybenzyl group, p-nitrobenzyl group, p-cyanobenzyl group.
  • Examples of the benzenesulfonyloxy group optionally substituted by Ra include a benzenesulfonyloxy group, an o-toluenesulfonyloxy group, an m-toluenesulfonyloxy group, a p-toluenesulfonyloxy group, and an o-chlorobenzenesulfonyloxy group.
  • M-chlorobenzenesulfonyloxy group, p-chlorobenzenesulfonyloxy group, o-fluorobenzenesulfonyloxy group, p-fluorobenzenesulfonyloxy group, o-methoxybenzenesulfonyloxy group, p-methoxybenzenesulfonyloxy group, p -Nitrobenzenesulfonyloxy group, p-cyanobenzenesulfonyloxy group and the like can be mentioned, but not limited thereto.
  • R 11 and R 21 are preferably hydrogen atoms.
  • R 14 , R 15 , R 16 and R 24 are each a fluorine atom, a hydroxy group, a trifluoromethyl group, a methylcarbonyloxy group, a trifluoromethylcarbonyloxy group, a p-toluenesulfonyloxy group, or phenyl. It is preferably a group.
  • R 14 , R 15 and R 16 are preferably the same because they are easily synthesized.
  • R 12 , R 13 , R 22 , and R 23 are each independently the same as the groups exemplified for R 11 , R 14 , R 15 , and R 16. The group of is mentioned.
  • R 12 and R 13 , or R 22 and R 23 are bonded to each other, and —O—, —S—, —NH—, —CO—, —COO—, —CONH—, C 1— 10 alkylene groups, or a combination thereof may be formed.
  • C a -C b alkylene is an unsaturated carbon having a straight or branched chain composed of a to b carbon atoms and having one or more double bonds in the molecule. Represents a hydrogen group.
  • Examples of C a -C b alkylene include methylene group, ethylene group, n-propylene group, n-butylene group, n-pentylene group, n-hexylene group, n-heptylene group, n-octylene group, n- Specific examples include linear alkylene groups such as nonylene group and n-decylene group, branched alkylene groups such as dimethylmethylene group, 2-methylpropylene group, 2-methylhexylene group and tetramethylethylene group. Each of which is selected for each specified number of carbon atoms.
  • R 12 and R 13 , or R 22 and R 23 are bonded to each other, it is preferable to form a —COO— or dimethylmethyleneoxy group.
  • R 12 and R 13 , or R 22 and R 23 are not bonded, among them, R 12 and R 22 are preferably hydrogen atoms, and R 13 and R 23 are fluorine atoms, hydroxy groups, trifluoro A methyl group, a methylcarbonyloxy group, a trifluoromethylcarbonyloxy group, a p-toluenesulfonyloxy group, or a phenyl group is preferable.
  • X 21 is an oxygen atom or a sulfur atom.
  • X 21 is preferably an oxygen atom.
  • n 11 represents the number of R 11 and is an integer of 1 to 5.
  • n 12 represents the number of R 12 and is an integer of 0 to 4.
  • n 21 represents the number of R 21 and is an integer of 1 to 5.
  • n 22 represents the number of R 22 and is an integer of 0 to 4.
  • n 22 may be the same as or different from each other.
  • the sum of n 11 and n 12 is 5, and the sum of n 21 and n 22 is 5.
  • n 13 and n 23 are 0 or 1.
  • Preferred examples of the compound (1) include, for example, a compound represented by the following general formula (1-1) (hereinafter sometimes abbreviated as “compound (1-1)”), or a compound represented by the following general formula ( 1-2) (hereinafter sometimes abbreviated as “compound (1-2))” and the like.
  • compound (1-1) a compound represented by the following general formula (1-1)
  • compound 1-2 a compound represented by the following general formula (1-2)
  • these compounds are only examples of a preferable compound (1), and a preferable compound (1) is not limited to these.
  • preferred examples of the compound (2) include, for example, a compound represented by the following general formula (2-1) (hereinafter sometimes abbreviated as “compound (2-1)”), or the following general formula (2-1). And a compound represented by the formula (2-2) (hereinafter sometimes abbreviated as “compound (2-2)”).
  • compound (2-1) a compound represented by the following general formula (2-1)
  • compound (2-2) a compound represented by the formula (2-2)
  • these compounds are only examples of a preferable compound (2), and a preferable compound (2) is not limited to these.
  • R 11 , R 13 , R 14 , R 15 , R 16 , R 23 , R 24 , n 11 , n 13 , and n 23 are all the same as described above.
  • Y 11 and Y 21 is —O—, —S—, —NH—, —CO—, —COO—, —CONH—, a C 1-10 alkylene group, or a combination thereof.
  • Y 11 and Y 21 are —O—, —S—, —NH—, —CO—, —COO—, —CONH—, C 1 ⁇ 10 alkylene groups, or a combination thereof.
  • Y 11 and Y 21 are preferably —COO— or a dimethylmethyleneoxy group.
  • Preferred examples of the compound (1-1) include, for example, R 11 is a hydrogen atom or a C 1-12 alkyl group, and R 13 is a halogen atom, a hydroxy group, a trifluoromethyl group, a methylcarbonyloxy group, A fluoromethylcarbonyloxy group, a p-toluenesulfonyloxy group, or a phenyl group, and R 14 is a halogen atom, a hydroxy group, a trifluoromethyl group, a methylcarbonyloxy group, a trifluoromethylcarbonyloxy group, a p-toluenesulfonyloxy group A group or a phenyl group.
  • More preferable examples of the compound (1-1) include, for example, R 11 is a hydrogen atom or a methyl group, and R 13 is a fluorine atom, a hydroxy group, a methylcarbonyloxy group, a trifluoromethylcarbonyloxy group, or a phenyl group. And a group in which R 14 is a fluorine atom, a methylcarbonyloxy group, a trifluoromethylcarbonyloxy group, or a p-toluenesulfonyloxy group.
  • Preferred examples of the compound (1-2) include those in which R 14 , R 15 , and R 16 are a halogen atom, hydroxy group, trifluoromethyl group, methylcarbonyloxy group, trifluoromethylcarbonyloxy group, p-toluene. Examples thereof include a sulfonyloxy group or a phenyl group, and Y 11 is —COO— or a dimethylmethyleneoxy group. More preferable compound (1-2) is, for example, that R 14 , R 15 , and R 16 are a methylcarbonyloxy group or a trifluoromethylcarbonyloxy group phenyl group, and Y 11 is —COO—. And the like.
  • Preferred examples of the compound (2-1) include those in which R 23 and R 23 are a halogen atom, a hydroxy group, a trifluoromethyl group, a methylcarbonyloxy group, a trifluoromethylcarbonyloxy group, a p-toluenesulfonyloxy group, Or what is a phenyl group etc. are mentioned. More preferable examples of the compound (2-1) include those in which R 23 and R 23 are a fluorine atom, a hydroxy group, a methylcarbonyloxy group, a trifluoromethylcarbonyloxy group, or a phenyl group.
  • Preferred examples of the compound (2-2) include those in which R 24 is a fluorine atom, a hydroxy group, a trifluoromethyl group, a methylcarbonyloxy group, a trifluoromethylcarbonyloxy group, a p-toluenesulfonyloxy group, or a phenyl group. And Y 11 is —COO— or a dimethylmethyleneoxy group. More preferable examples of the compound (2-2) include those in which R 24 is a hydroxy group or a methylcarbonyloxy group, and Y 11 is —COO—.
  • compound (1-1) compounds represented by the following general formula (1-1-1) (hereinafter referred to as “compound (1-1-1)”).
  • a compound represented by the following general formula (1-1-2) (hereinafter sometimes abbreviated as “compound (1-1-2)”), a compound represented by the following general formula (1-1 -3) (hereinafter sometimes abbreviated as “compound (1-1-3)”), a compound represented by the following general formula (1-1-4) (hereinafter “compound ( 1-1-4) ”and a compound represented by the following general formula (1-1-5) (hereinafter, abbreviated as“ compound (1-1-5) ”) ) And the like.
  • compound (1-2) preferred as the compound (1-2) are, for example, compounds represented by the following general formula (1-2-1) (hereinafter referred to as “compound (1-2-1)”). And a compound represented by the following general formula (1-2-2) (hereinafter sometimes abbreviated as “compound (1-2-2)”).
  • compound (1-2-1) compounds represented by the following general formula (1-2-1)
  • compound (1-2-2) hereinafter sometimes abbreviated as “compound (1-2-2)
  • these compounds are only examples of a preferable compound (1), and a preferable compound (1) is not limited to these.
  • compound (2-1) preferred as the compound (2-1) are, for example, compounds represented by the following general formula (2-1-1) (hereinafter referred to as “compound (2-1-1)”). May be abbreviated).
  • compound (2-2) preferred as the compound (2-2) are, for example, compounds represented by the following general formula (2-2-1) (hereinafter referred to as “compound (2-2-1)”). May be abbreviated).
  • compound (2-2-1) compounds represented by the following general formula (2-2-1)
  • these compounds are only examples of a preferable compound (2), and a preferable compound (2) is not limited to these.
  • Ac is an acetyl group (methylcarbonyl group)
  • Ts is a tosyl group (p-toluenesulfonyl group).
  • the compound (1-1-2) is a compound called iodobenzene diacetate (Bis (acetoxy) iodobenzene; BAIB)
  • the compound (1-2-2) is a compound called Dess-Martin reagent
  • the compound (2-1-1) is a compound called iodosylbenzene
  • compound (2-2-1) is a compound called 2-iodoxybenzoic acid.
  • compound (1) and compound (2) are known compounds, commercially available compounds or synthesized compounds may be used.
  • Compound (1) and compound (2) can be produced using, for example, a known reaction using a compound having iodobenzene as a basic structure as a raw material. More specifically, it is as follows.
  • the compound (1-1-2) (BAIB) includes, for example, a step of obtaining a compound (1-1-2) (BAIB) by reacting iodobenzene, peracetic acid and acetic acid. It can manufacture by the manufacturing method provided.
  • the compound (1-2-2) (Dess-Martin reagent) is obtained by reacting iodobenzoic acid with potassium peroxymonosulfate to obtain 2-iodoxybenzoic acid, Reacting 2-iodoxybenzoic acid and acetic anhydride with a catalytic amount of p-toluenesulfonic acid to obtain compound (1-2-2) (Dess-Martin reagent). Can be manufactured.
  • the compound (2-2-1) (2-iodoxybenzoic acid) comprises a step of reacting iodobenzoic acid and potassium peroxymonosulfate to obtain 2-iodoxybenzoic acid. It can be manufactured by a manufacturing method.
  • each compound may be taken out by performing a post-treatment if necessary by a known method. That is, as needed, post-treatment operations such as filtration, washing, extraction, pH adjustment, dehydration, concentration, etc. are performed alone or in combination of two or more, and concentration, crystallization, reprecipitation, column chromatography are performed. Each compound may be taken out by, for example. In addition, each of the extracted compounds is further subjected to crystallization, reprecipitation, column chromatography, extraction, stirring and washing of the crystals with a solvent, etc., alone or in combination of two or more if necessary. It may be purified by performing.
  • post-treatment operations such as filtration, washing, extraction, pH adjustment, dehydration, concentration, etc. are performed alone or in combination of two or more, and concentration, crystallization, reprecipitation, column chromatography are performed.
  • Each compound may be taken out by, for example.
  • each of the extracted compounds is further subjected to crystallization, reprecipitation, column chromatography,
  • each compound can be confirmed by a known method such as nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy, mass spectrometry (MS), infrared spectroscopy (IR).
  • NMR nuclear magnetic resonance
  • MS mass spectrometry
  • IR infrared spectroscopy
  • the production method of the compound (1) and the compound (2) is not limited to the above, and the compound (1) and the compound (2) having a desired structure may be produced using other known methods.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing an oxidation reaction of hydroxymethylcytosine using an oxidant containing BAIB encapsulated in micelles and AZADOL (registered trademark).
  • the hypervalent iodine compound (compound (1)) such as BAIB is water-soluble by being encapsulated in micelles by a surfactant, and further from a double-stranded polynucleotide as a substrate. Being sequestered, the degradation of the substrate can be suppressed.
  • the particle diameter of the micelle encapsulating the compound (1) or the compound (2) in the present embodiment is 50 nm or less, preferably 10 nm or more and 40 nm or less, and more preferably 10 nm or more and 30 nm.
  • the particle size of the micelle is not less than the lower limit, the compound (1) or the compound (2) can be encapsulated.
  • the particle size of the micelle is not more than the above upper limit value, the double-stranded polynucleotide as a substrate is about 100,000 in the case of about 300 to 400 bp, and the difference in molecular weight is large. The strand polynucleotide cannot enter into the micelle and can prevent oxidative attack by the compound (1) or the compound (2).
  • the molecular weight of the catalyst is about 200 (for example, AZADOL (registered trademark) has a molecular weight of 153), the catalyst is incorporated into the micelle, reoxidized, and hydroxymethylcytosine in the double-stranded polynucleotide as a substrate.
  • the hydroxy group of can be selectively oxidized.
  • the particle diameter of the micelle can be measured with a dynamic light scattering device or a transmission electron microscope.
  • the present invention provides a method for producing a hypervalent iodine compound encapsulated in micelles with a surfactant, (A) mixing the hypervalent iodine compound, acetonitrile, a surfactant, and a solvent, and stirring and stirring until the liquid color becomes transparent to yellow at a temperature of 4 ° C. or higher and lower than 25 ° C .; (B) after the step (a), a step of shaking and stirring at a temperature of 25 ° C. or higher and 30 ° C. or lower; With The hypervalent iodine compound has a basic structure of iodobenzene and is hydrophobic.
  • a hypervalent iodine compound (compound (1) or compound (2)) that has iodobenzene encapsulated in micelles with a surfactant in its basic structure and is hydrophobic is easily produced. be able to.
  • the mixture is shaken and stirred at a temperature of 4 ° C. or higher and lower than 25 ° C., more preferably 4 ° C. or higher and 10 ° C. or lower until the liquid color becomes clear to yellow (step (a)).
  • This reaction is an exothermic reaction, and if it is less than 25 ° C., acetonitrile having a low boiling point can be prevented from volatilizing. Therefore, ice water or the like is put around the reaction vessel to control the temperature to 4 ° C. or more and less than 25 ° C. It is preferable.
  • Acetonitrile as an organic ligand is considered to form a complex with compound (1) or compound (2) and contribute to micelle solubilization of compound (1) or compound (2).
  • concentration of acetonitrile in the oxidizing agent is preferably 5 to 10%, more preferably 8 to 10%, and particularly preferably 10%. In the case of 10% or less, the micelle formed by the surfactant is not broken.
  • the concentration of the surfactant in the oxidizing agent is preferably 2% or more and 5% or less.
  • the compound (1) or the compound (2) can be encapsulated in micelles, and in the case of 5% or less, the amount used can be adjusted to the cost.
  • the concentration of compound (1) or compound (2) in the oxidizing agent is preferably 20 mg / mL or more and 30 mg / mL or less. In the case of 20 mg / mL or more, the oxidizing power can be ensured, and in the case of 30 mg / mL or less, the oxidizing power commensurate with the concentration can be obtained.
  • the solvent used in the surfactant solution is not particularly limited as long as it does not inhibit the reaction and can be used as it is for the oxidation reaction of the water-soluble biopolymer, and examples thereof include water. If the amount of the surfactant solution is too small, acetonitrile having a low boiling point volatilizes during the reaction, so that the concentration of the compound (1) or the compound (2), acetonitrile, and the surfactant can be maintained at the above-described concentration. The amount within can be used.
  • the apparatus for shaking and stirring is not particularly limited, and examples thereof include an ultrasonic stirrer and an ultrasonic disperser.
  • the liquid color from transparent to yellow is an indicator of the oxidation activity of compound (1) or compound (2), and is a sign that compound (1) or compound (2) and acetonitrile have formed a complex. Therefore, after the liquid color is clear to yellow, the temperature is raised and the mixture is stirred at a temperature of 25 ° C. or higher and 30 ° C. or lower to completely dissolve the compound (1) or the compound (2). Promote micelle solubilization of 1) or compound (2) (step (b)).
  • the manufactured oxidizing agent can be stored frozen, but it is preferable that the manufactured oxidizing agent is manufactured immediately before use and used up on the manufacturing day. This is because the oxidation activity is lost over time.
  • the index of oxidation activity is that the liquid color is yellow, and if yellow is fading, it can be determined that the liquid is inactive.
  • the present invention provides a catalyst, which is a compound having an alicyclic heterocyclic ring having one nitrogen as a heteroatom and a hydroxy group bonded to the nitrogen, the oxidizing agent described above, and pH 6.
  • An oxidation reaction reagent comprising a solvent that is 0 or more and less than 7.0.
  • a reagent capable of selectively oxidizing a hydroxy group in a water-soluble biopolymer under mild conditions in an aqueous solvent reflecting the in vivo environment can be obtained.
  • the oxidation reaction reagent of this embodiment includes the above-described oxidizing agent.
  • Usable surfactants, oxidant production methods and the like are as described above.
  • the oxidation reaction reagent of this embodiment includes a catalyst that is a compound having an alicyclic heterocycle having one nitrogen as a hetero atom and a hydroxy group bonded to the nitrogen.
  • the catalyst “a compound having an alicyclic heterocycle having one nitrogen as a heteroatom and a hydroxy group bonded to the nitrogen” is represented by the following general formula (3). N-hydroxy compounds.
  • R 31 includes the same groups as those exemplified in the above-mentioned [groups represented by R 11 , R 14 , R 15 , and R 16 ]. Among these, R 31 is preferably a hydrogen atom, a halogen atom, a hydroxy group, a C 1-3 alkyl group, or a C 1-3 alkoxy group.
  • R 32 and R 33 are each independently the same groups as those exemplified in the above-mentioned [groups represented by R 11 , R 14 , R 15 , and R 16 ]. . R 32 and R 33 may be bonded to each other to form a methylene group.
  • n 31 represents the number of R 31 and is an integer of 1 to 8.
  • R 11 may be the same as or different from each other.
  • Preferred examples of the compound (3) include a compound represented by the following general formula (3-1) (hereinafter sometimes abbreviated as “compound (1-1)”).
  • compound (1-1) a compound represented by the following general formula (3-1)
  • these compounds are only examples of a preferable compound (3), and a preferable compound (3) is not limited to these.
  • R 31 is the same as above. R 31 may be the same as or different from each other.
  • Preferred examples of compound (3-1) include those wherein R 31 is a hydrogen atom, a halogen atom, a hydroxy group, a C 1-3 alkyl group, or a C 1-3 alkoxy group. More preferable examples of the compound (3-1) include those in which R 31 is a hydrogen atom, a fluorine atom, a hydroxy group, a methyl group, or a methoxy group.
  • the compounds (3) preferred as the compound (3-1) are, for example, N-hydroxy-1-fluoro-2-azaadamantane (1-F-AZADOH), N-hydroxy-5-fluoro-2 -Azaadamantane (5-F-AZADOH), N-hydroxy-5-fluoro-1-methyl-2-azaadamantane (5-F-1-Me-AZADOH), N-hydroxy-5,7-difluoro-1 -Methyl-2-azaadamantane (5,7-F 2 -1-Me-AZADOH), N-hydroxy-1-methyl-2-azaadamantane (1-Me-AZADOH), N-hydroxy-1-methyl- 5-hydroxy-2-azaadamantane (1-Me-5-OH-AZADOH), N-hydroxy-5-methoxy-1-methyl-2-azaadam Tan (5-MeO-1-Me-AZADOH), N-hydroxy-5-hydroxy-2-azaadamantane (5-OH-AZADOH), N-hydroxy-9-azabicy
  • the compound (3) used as a catalyst can be produced by the method described in “Y. Iwabuchi, Chem. Pharm. Bull. 2013, 61, 1197.” and International Publication No. 2006/001387. it can. Moreover, about AZADOL (trademark), a commercial item can also be used, without synthesize
  • the concentration of the catalyst is preferably 1 mg / mL or more and 2 mg / mL or less, and more preferably 2 mg / mL.
  • an oxidation reaction can be carried out under mild conditions using compounds having various hydroxy groups as substrates and in the presence of the compound (3) and the above-described oxidizing agent as catalysts. Further, oxidation reaction can also be performed on a compound having a sterically crowded hydroxy group, which has conventionally been difficult to perform an oxidation reaction with a catalyst such as TEMPO.
  • the alcohol compound to be oxidized is not particularly limited, and examples thereof include compounds having various hydroxy groups. Among these compounds having a hydroxy group, proteins or nucleic acids are preferred.
  • the oxidation reaction reagent of this embodiment includes a solvent having a pH of 6.0 or more and less than 7.0.
  • the pH is preferably from 6.0 to less than 7.0, more preferably from pH 6.6 to 6.8.
  • the solvent is not particularly limited as long as it is prepared within the above pH range.
  • a phosphate buffer is mentioned.
  • the concentration in the reaction reagent is preferably about 0.8M.
  • the volume ratio of the solvent in the reaction reagent having a pH of 6.0 to less than 7.0 and the compound (1) or compound (2) encapsulated in micelles and the catalyst is preferably 2: 2: 1. This is because the oxidation reactivity decreases when the amount of the solvent exceeds this ratio.
  • the present invention provides a method for selectively oxidizing a hydroxy group of a target water-soluble biopolymer using the above-described oxidation reaction reagent.
  • the hydroxy group in the water-soluble biopolymer can be selectively oxidized under mild conditions in an aqueous solvent reflecting the in vivo environment.
  • water-soluble biopolymer means a macromolecular organic compound that can be dissolved in an aqueous solvent and includes, for example, proteins and nucleic acids.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing an oxidation reaction of hydroxymethylcytosine using an oxidizing agent containing BAIB encapsulated in micelles and AZADOL (registered trademark).
  • AZADOL registered trademark
  • a solution containing a target water-soluble biopolymer and the above-described oxidation reaction reagent are mixed and allowed to stand.
  • the oxidation reaction in the present embodiment is characterized in that it can be carried out under mild conditions, and the reaction temperature can be carried out at 4 ° C. or higher and 40 ° C. or lower, preferably 4 ° C. or higher and 25 ° C. or lower.
  • the temperature is 4 ° C or higher, precipitation of salts of reagents and buffer solutions can be prevented, and when the temperature is 25 ° C or lower, side reactions such as substrate decomposition can be prevented while maintaining the reaction rate.
  • sizes and quantity of the water-soluble biopolymer which is a target 30 minutes or more and less than 4 hours are preferable.
  • the BAIB encapsulated in micelles selectively oxidizes the hydroxy group of AZADOL (registered trademark) in a mixed solution of a target water-soluble biopolymer and an oxidation reaction reagent.
  • Oxidized AZADOL (registered trademark) is converted to oxoammonium salt which is an active species through AZADO. This oxoammonium salt selectively oxidizes the hydroxy group of the target water-soluble biopolymer.
  • the solution containing the target water-soluble biopolymer and the above-mentioned oxidation reagent are mixed and reacted under mild conditions, so that the target is a water-soluble target that is oxidized to a formyl group or a ketone group.
  • a biopolymer can be obtained.
  • the present invention is a kit for selectively oxidizing a hydroxy group of a target water-soluble biopolymer, which is a hypervalent iodine that has iodobenzene as a basic structure and is hydrophobic.
  • a hydroxy group in a water-soluble biopolymer can be selectively oxidized under a mild condition in an aqueous solvent reflecting the in vivo environment.
  • the compound (1) or the compound (2) and the catalyst are in a powder form.
  • the oxidant containing the compound (1) or compound (2) encapsulated in micelles is preferably produced immediately before use.
  • acetonitrile and the catalyst may be mixed at a volume ratio of 1: 1 and dissolved in a solvent.
  • the catalyst may be prepared at a concentration of 5 mg / mL to 10 mg / mL and mixed in the reaction solution so that the final concentration is 1 mg / mL to 2 mg / mL.
  • the surfactant is preferably a liquid having a concentration of about 5%. What is necessary is just to use it so that a final concentration may be 2% or more and 5% or less at the time of manufacture of the compound (1) or compound (2) encapsulated with the micelle.
  • Acetonitrile is preferably a liquid having a concentration of about 100%. What is necessary is just to use so that final concentration may be set to about 10% at the time of manufacture of the micell-encapsulated BAIB.
  • the solvent having a pH of 6.0 or more and less than 7.0 is preferably a liquid having a concentration of about 2M. What is necessary is just to use so that it may become a density
  • the target water-soluble biopolymer includes, for example, proteins and nucleic acids.
  • the concentration should be 5 pM to 10 pM in the reaction solution. Is preferred.
  • kits for detecting hydroxymethylcytosine in double-stranded polynucleotide which is a hypervalent iodine compound (compound (I) that has iodobenzene as a basic structure and is hydrophobic.
  • kits comprising: a solvent having a pH of 6.0 or more and less than 7.0; bisulfite; and a forward and reverse primer set for amplifying a region containing hydroxymethylcytosine in the double-stranded polynucleotide.
  • hydroxymethylcytosine in the double-stranded polynucleotide can be easily detected.
  • compound (1) or compound (2), surfactant, acetonitrile, catalyst, and solvent are as described above.
  • bisulfite means bisulfite, which is used to replace a cytosine base in a double-stranded polynucleotide with a uracil base.
  • FIG. 2 is a diagram showing a reaction process in which a cytosine base is converted to a uracil base by bisulfite.
  • hydroxymethylcytosine is also known to be converted to uracil by bisulfite when the hydroxy group is oxidized to a formyl group.
  • the kit of this embodiment includes a forward and reverse primer set for amplifying a region containing hydroxymethylcytosine in a double-stranded polynucleotide.
  • a forward and reverse primer set for amplifying a region containing hydroxymethylcytosine in a double-stranded polynucleotide.
  • the base sequence of the said primer set it can design suitably by the area
  • the kit of this embodiment may contain at least one of one or more control cells and nucleic acids.
  • the control nucleic acid is either accessible in essentially all cells of an animal (eg, housekeeping gene sequence or its promoter), or inaccessible in most cells of an animal. Including a gene sequence that is
  • the kit of this embodiment may contain one or more sets of primers (whether gene sequences or cells are actually included in the kit) for amplifying such gene sequences.
  • the kit of this embodiment may include at least one of a DNA modifying agent, a cell permeabilizing agent, and a cytolytic agent, and one or a plurality of primer sets for amplifying a control DNA region.
  • the DNA modifying agent is a restriction enzyme
  • at least one potential cleavage site of the restriction enzyme eg, 1, 2, 3, 4, etc.
  • a first primer set for amplifying a portion of the DNA region eg useful for calculating the number of unmodified copies
  • a portion of the DNA region that does not include a potential cleavage site For example, at least two primer sets consisting of at least a second primer set (useful for calculating the total number of copies) can be included.
  • the kit of this embodiment may include one or more of the following.
  • a permeabilizing or disintegrating agent for cell membranes for cell membranes;
  • restriction enzymes, DNases or other DNA modifying agents for example, restriction enzymes, DNases or other DNA modifying agents;
  • stopping solution that can prevent further modification by the modifying agent;
  • Materials for performing at least one of nucleic acid extraction and purification for example, at least one of purification of genomic DNA and removal of non-DNA components such as “stop” solution components
  • Spin column for for
  • Reagents for PCR or qPCR amplification of DNA and optionally a mixture containing all components necessary for PCR or qPCR in addition to at least one of a template and a polymerase
  • the present invention is a method for detecting hydroxymethylcytosine in a double-stranded polynucleotide comprising: (A) an alicyclic heterocycle having a sample containing a double-stranded polynucleotide having hydroxymethylcytosine, the above-mentioned oxidizing agent, and one nitrogen as a hetero atom, and having a hydroxy group bonded to the nitrogen Mixing a catalyst that is a compound having a pH of 6.0 to less than 7.0 to oxidize hydroxymethylcytosine and convert it to formylcytosine; (B) treating the sample containing a double-stranded polynucleotide having the converted formylcytosine with bisulfite to convert formylcytosine to uracil; (C) adding and amplifying forward and reverse primers for amplifying a region containing hydroxymethylcyto
  • hydroxymethylcytosine in a double-stranded polynucleotide can be easily detected.
  • a sample containing a double-stranded polynucleotide having hydroxymethylcytosine, an oxidant containing micelle-encapsulated BAIB, a catalyst, and a solvent having a pH of 6.0 or more and less than 7.0 are mixed.
  • the volume ratio of the solvent having a pH of 6.0 or more and less than 7.0 to the compound (1) or compound (2) encapsulated in micelles and the catalyst is 2: 2: 1.
  • FIG. 3 is a diagram comparing the changes before and after the oxidation reaction and bisulfite treatment for hydroxymethylcytosine and methylcytosine in a double-stranded polynucleotide.
  • hydroxymethylcytosine (2) in the double-stranded polynucleotide is oxidized and converted to formylcytosine (3) (step A).
  • methylcytosine (1) does not change after the oxidation reaction and bisulfite treatment and remains methylcytosine.
  • After converting to formylcytosine (3) it is preferable to perform a step of removing the oxidizing agent. Specifically, a method of extracting a double-stranded polynucleotide with an organic solvent or the like and purifying it using a spin column or the like can be mentioned.
  • reaction solution is subjected to bisulfite treatment.
  • the reaction is preferably performed at a temperature of 80 ° C. or higher and lower than 100 ° C. for 30 minutes or longer and 1 hour or shorter.
  • formylcytosine (3) in the double-stranded polynucleotide is sulfonated and further converted into sulfonated uracil by a hydrodeamino reaction.
  • the sulfone group is removed by alkali treatment and converted to uracil (4) (step B).
  • forward and reverse primers for amplifying the region containing hydroxymethylcytosine in the double-stranded polynucleotide are added to the double-stranded polynucleotide subjected to bisulfite treatment, and amplified by PCR or qPCR.
  • the conditions for PCR or qPCR can be determined by those skilled in the art according to known methods according to the length and sequence characteristics of the double-stranded polynucleotide.
  • the base sequences are compared by the Sanger sequencing method using the sample containing the double-stranded polynucleotide subjected to steps (A) to (C) without adding an oxidizing agent as a control (step D).
  • step D By comparing with the control, hydroxymethylcytosine in the double-stranded polynucleotide can be detected.
  • epigenetics means a system that regulates and transmits gene expression that does not depend on a change in DNA sequence, and its academic field, and is a genetic gene that is inherited by daughter cells through cell division. It is a mechanism independent of DNA base sequence changes (mutations) while having characteristics.
  • Example 1 1-1.
  • Preparation of oxidizing agent Powdered BAIB (manufactured by Wako) (20 mg) was added to a mixed solution of 5% SDS aqueous solution (0.9 mL) and 100% acetonitrile (0.1 mL). The mixture was shaken and stirred for about 10 minutes. When the liquid color became yellow, the ice in the ultrasonic stirrer was removed, and the mixture was further shaken and stirred at room temperature to completely dissolve, thereby obtaining an oxidant containing BAIB encapsulated in micelles.
  • the oxidizing agent contained 4.5% SDS, 10% acetonitrile, 20 mg / mL BAIB. Further, when the micelle encapsulating BAIB was measured using a dynamic light scattering apparatus, the particle size was about 18 nm, and the particle size was about 26 nm as measured using a transmission electron microscope.
  • Table 1 shows the base sequence of 10 bp double-stranded DNA (manufactured by GeneDesign) used as a substrate. Each of the substrate DNAs was dissolved in a buffer solution (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 1 mM EDTA).
  • A, C, and E have undergone an oxidation reaction, and the 5 ′ end is oxidized and converted to a carboxyl group.
  • B, D, and F were those in which no oxidation reaction was performed as a control.
  • a and B in FIG. 4 were compared, in the case where the oxidation reaction was performed, hydroxymethylcytosine located at the sixth position from the 5 ′ end was converted to uracil, but in the control, it was cytosine methylsulfonate and uracil. It was not converted to.
  • a and C in FIG. 4 were compared, the peak values of the mass spectrum were the same. Furthermore, from E and F of FIG. 4, no influence by the oxidation reaction was observed for methylcytosine.
  • Example 2 2-1. Preparation of Oxidizing Agent 1-1 of Example 1. It was prepared by the same method. 2-2. Preparation of catalyst Example 1-2 of Example 1. It was prepared by the same method.
  • FIG. 5A is a schematic diagram showing the positions of hydroxymethylcytosine and methylcytosine in a substrate 100 bp double-stranded DNA and the conversion of cytosine and hydroxymethylcytosine into uracil in the substrate DNA by oxidation reaction and bisulfite treatment.
  • FIG. 5A is a schematic diagram showing the positions of hydroxymethylcytosine and methylcytosine in a substrate 100 bp double-stranded DNA and the conversion of cytosine and hydroxymethylcytosine into uracil in the substrate DNA by oxidation reaction and bisulfite treatment.
  • a sample solution (0.5 ⁇ L) in which substrate DNA (0.1 nmol) was dissolved, 2M phosphate buffer (pH 6.8) (20 ⁇ L), 20 mg / mL BAIB (20 ⁇ L), and 10 mg / mL AZADOL (10 ⁇ L) were PCRed.
  • 2M phosphate buffer pH 6.8
  • 20 mg / mL BAIB 20 mg / mL
  • 10 mg / mL AZADOL 10 mg / mL
  • the amplified PCR product was purified using a PCR purification kit.
  • FIG. 5B and FIG. 6 revealed that the ratio of hydroxymethylcytosine converted to uracil was proportional to the oxidation reaction time. Further, it was revealed that about 100% of the hydroxymethylcytosine in the substrate DNA was converted to uracil by performing an oxidation reaction for 4 hours or more with a 100 bp substrate DNA containing two hydroxymethylcytosines.
  • a hydroxy group in a water-soluble biopolymer can be selectively oxidized under a mild condition in an aqueous solvent reflecting the in vivo environment. Moreover, according to the present invention, hydroxymethylcytosine in a double-stranded polynucleotide can be easily detected.

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Abstract

本発明は、界面活性剤によりミセル封入化されたヨードベンゼンを基本構造に有し、疎水性である超原子価ヨウ素化合物を含有する酸化剤である。

Description

酸化剤とその使用
　本発明は、酸化剤とその使用に関する。
　本願は、２０１５年７月３０日に、日本に出願された特願２０１５－１５０８４６に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　ヒドロキシ基を酸化する方法は、有機化学の基本反応の一つであり、これまでに多くの酸化反応試薬が開発されてきた。中でも、有機溶媒中で定量的にヒドロキシ基を酸化する方法は、遷移金属酸化試薬、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ペルヨージナン化合物等の超原子価要素試薬などが開発されてきた。しかし、水系溶媒中では、強い酸又はアルカリ条件を必要とすることや、水分子から発生するヒドロキシラジカル種などによる副反応で、反応制御が難しい傾向がある。また、水溶性生体高分子であるタンパク質やＤＮＡは、電子豊富な官能基を有し、巨大分子ゆえの反応点近傍の立体障害など、基質としては最も難しい部類に属する。水系溶媒で多種類の官能基が混在する巨大分子のヒドロキシ基を温和な条件で酸化することは、今までできなかった標識や機能化など多くの可能性に道を開くことにつながる。例えば、エピゲノム分野で注目を浴びているヒドロキシメチルシトシンは、酸化及び還元的脱アミノ化反応でウラシルに変換できるので、温和且つ定量的酸化反応が開発できれば、一塩基レベルでその位置情報を取得し、幹細胞や再生医学研究への大きな寄与が期待できる。
　特許文献１には、過ルテニウム酸塩酸化剤を使用した、試料ヌクレオチド配列中の５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）などの修飾シトシン残基を同定する方法が開示されている。過ルテニウム酸塩酸化剤は、弱塩基性、室温の温和な条件で第１級アルコールをアルデヒドに、第２級アルコールをケトンに酸化できる。
　また、遷移金属酸化剤以外の温和な酸化方法として、ＴＥＭＰＯと呼ばれるニトロキシラジカルを用いた酸化方法がある。中でも、東北大学大学院薬学研究科の岩渕らによって開発されたＡＺＡＤＯＬ（登録商標）（２－ヒドロキシ－２－アザアダマンタン）は、ＴＥＭＰＯよりも高活性なＮ－ヒドロキシである（例えば、特許文献２参照）。ＡＺＡＤＯＬ（登録商標）は、ニトロキシラジカルであるＡＺＡＤＯ（２－アザアダマンタン－Ｎ－オキシル）よりも安定で且つＡＺＡＤＯよりも水への溶解性が高いという利点を有する。
一般的に、次亜塩素酸ナトリウム（ＮａＯＣｌ）又はヨードベンゼンジアセテート（（Ｄｉａｃｅｔｏｘｙｉｏｄｏ）ｂｅｎｚｅｎｅ；ＢＡＩＢ）を共酸化剤として用いる。水系溶媒中において、ＮａＯＣｌ又はＢＡＩＢによりＡＺＡＤＯＬ（登録商標）が酸化され、活性種であるオキソアンモニウム塩となることで、標的である水溶性生体高分子のヒドロキシ基を特異的に酸化することができる。ＮａＯＣｌは親水性であり、ＢＡＩＢは疎水性であり、物性は相反する。また、ＮａＯＣｌを共酸化剤として用いて、セルロースのヒドロキシ基を均一系で酸化した報告例がある（例えば、非特許文献１、２参照）。
特表２０１４－５２１３２９号公報 国際公開第２００９／１４５３２３号
Ｔｓｕｇｕｙｕｋｉ　Ｓａｉｔｏ　ｅｔ　ａｌ，"Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ　Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｉｚｅｄ　Ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌｓ ｆｒｏｍ　ＴＥＭＰＯ－Ｃａｔａｌｙｚｅｄ　Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｎａｔｉｖｅ　Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ"，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，Ｖｏｌｕｍｅ７，Ｎｕｍｂｅｒ６，ｐｐ．１６８７－１６９０，Ｊｕｎｅ　２００６． Ｔｓｕｇｕｙｕｋｉ　Ｓａｉｔｏ　ｅｔ　ａｌ，"Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　Ｎａｎｏｆｉｂｅｒｓ　Ｐｒｅｐａｒｅｄ　ｂｙ　ＴＥＭＰＯ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｎａｔｉｖｅ　Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ"，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，Ｖｏｌｕｍｅ８，Ｎｕｍｂｅｒ８，ｐｐ．２４８５－２４９１，Ａｐｒｉｌ　１０，　２００７．
　特許文献１に記載されている過ルテニウム酸塩酸化剤は、３価の酸化剤として働き、二酸化ルテニウムへと還元される。また、反応の自触媒性を有し、この自触媒性は反応で生成した不溶性の二酸化ルテニウム粒子の表面に過ルテニウム酸塩酸化剤が吸着して活性化されるためであると考えられている。しかしながら、水が存在すると二酸化ルテニウム粒子の表面に過ルテニウム酸塩酸化剤よりも優先的に吸着してしまうため、自触媒性を妨害するという課題がある。よって、水を吸着除去するために乾燥剤が必要であり、生体内環境を反映した水系溶媒中で酸化反応を行うことが難しい。
　また、ＡＺＡＤＯＬ（登録商標）とＮａＯＣｌ又はＢＡＩＢを使用した酸化反応では、共酸化剤としてＮａＯＣｌを用いる場合には、ＮａＯＣｌから発生するラジカルで、酸化反応に弱い基質は分解してしまうため、使用する基質が制限される。また、共酸化剤としてＢＡＩＢを用いる場合には、疎水性が高く、生体内環境を反映した水系溶媒中で酸化反応を行うことが難しい。
　本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、生体内環境を反映した水系溶媒中において、温和な条件で水溶性生体高分子中のヒドロキシ基を選択的に酸化する方法を提供する。
　本発明は、以下の態様を含む。
［１］界面活性剤によりミセル封入化されたヨードベンゼンを基本構造に有し、疎水性である超原子価ヨウ素化合物を含有する酸化剤。
［２］前記界面活性剤が、陰イオン界面活性剤である［１］に記載の酸化剤。
［３］前記超原子価ヨウ素化合物がデス・マーチン試薬、又は２－ヨードキシ安息香酸である［１］又は［２］に記載の酸化剤。
［４］前記ミセルの粒子径が５０ｎｍ以下である［１］～［３］のいずれか一つに記載の酸化剤。
［５］界面活性剤によりミセル封入化された超原子価ヨウ素化合物の製造方法であって、
　（ａ）前記超原子価ヨウ素化合物と、アセトニトリルと、界面活性剤と、溶媒とを混合し、４℃以上２５℃未満の温度で液色が透明から黄色を呈するまで振盪撹拌する工程と、
　（ｂ）前記工程（ａ）後、さらに２５℃以上３０℃以下の温度で振盪撹拌する工程と、
を備え、
前記超原子価ヨウ素化合物はヨードベンゼンを基本構造に有し、疎水性である製造方法。
［６］前記超原子価ヨウ素化合物の濃度が２０ｍｇ／ｍＬ以上３０ｍｇ／ｍＬ以下である［５］に記載の製造方法。
［７］［１］～［４］のいずれか一つに記載の酸化剤と、ヘテロ原子として窒素を１つ有し、該窒素にヒドロキシ基が結合している脂環式複素環を有する化合物である触媒と、ｐＨ６．０以上７．０未満である溶媒と、を備える酸化反応試薬。
［８］［７］に記載の酸化反応試薬を用いて、標的である水溶性生体高分子のヒドロキシ基を選択的に酸化する方法。
［９］標的である水溶性生体高分子のヒドロキシ基を選択的に酸化するためのキットであって、ヨードベンゼンを基本構造に有し、疎水性である超原子価ヨウ素化合物と、界面活性剤と、アセトニトリルと、ヘテロ原子として窒素を１つ有し、該窒素にヒドロキシ基が結合している脂環式複素環を有する化合物である触媒と、ｐＨ６．０以上７．０未満である溶媒と、を備えるキット。
［１０］二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンを検出するためのキットであって、ヨードベンゼンを基本構造に有し、疎水性である超原子価ヨウ素化合物と、界面活性剤と、アセトニトリルと、ヘテロ原子として窒素を１つ有し、該窒素にヒドロキシ基が結合している脂環式複素環を有する化合物である触媒と、ｐＨ６．０以上７．０未満である溶媒と、バイサルファイトと、前記二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンを含む領域を増幅するためのフォワード及びリバースプライマーセットと、を備えるキット。
［１１］二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンを検出する方法であって、
　（Ａ）ヒドロキシメチルシトシンを有する二本鎖ポリヌクレオチドを含有する試料と、［１］～［４］のいずれか一つに記載の酸化剤と、ヘテロ原子として窒素を１つ有し、該窒素にヒドロキシ基が結合している脂環式複素環を有する化合物である触媒と、ｐＨ６．０以上７．０未満である溶媒と、を混合し、ヒドロキシメチルシトシンを酸化し、ホルミルシトシンに変換する工程と、
　（Ｂ）前記変換されたホルミルシトシンを有する二本鎖ポリヌクレオチドを含有する試料をバイサルファイトにより処理し、ホルミルシトシンをウラシルに変換する工程と、
　（Ｃ）前記変換されたウラシルを有する二本鎖ポリヌクレオチドに、前記二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンを含む領域を増幅するためのフォワード及びリバースプライマーを添加し、増幅する工程と、
　（Ｄ）酸化剤を添加せずに工程（Ａ）～（Ｃ）を行った二本鎖ポリヌクレオチドを含有する試料をコントロールとして比較し、二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンを検出する工程と、を備える検出方法。
［１２］界面活性剤によりミセル封入化されたヨードベンゼンジアセテートを含有することを特徴とする酸化剤。
［１３］界面活性剤によりミセル封入化されたヨードベンゼンジアセテートの製造方法であって、
　（ａ）ヨードベンゼンジアセテートと、アセトニトリルと、界面活性剤と、溶媒とを混合し、４℃以上２５℃未満の温度で液色が透明から黄色を呈するまで振盪撹拌する工程と、
　（ｂ）前記工程（ａ）後、さらに２５℃以上３０℃以下の温度で振盪撹拌する工程と、を備える製造方法。
［１４］［１２］に記載の酸化剤と、ヘテロ原子として窒素を１つ有し、該窒素にヒドロキシ基が結合している脂環式複素環を有する化合物である触媒と、ｐＨ６．０以上７．０未満である溶媒と、を備える酸化反応試薬。
［１５］［１４］に記載の酸化反応試薬を用いて、標的である水溶性生体高分子のヒドロキシ基を選択的に酸化する方法。
［１６］標的である水溶性生体高分子のヒドロキシ基を選択的に酸化するためのキットであって、ヨードベンゼンジアセテートと、界面活性剤と、アセトニトリルと、ヘテロ原子として窒素を１つ有し、該窒素にヒドロキシ基が結合している脂環式複素環を有する化合物である触媒と、ｐＨ６．０以上７．０未満である溶媒と、を備えるキット。
［１７］二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンを検出するためのキットであって、ヨードベンゼンジアセテートと、界面活性剤と、アセトニトリルと、ヘテロ原子として窒素を１つ有し、該窒素にヒドロキシ基が結合している脂環式複素環を有する化合物である触媒と、ｐＨ６．０以上７．０未満である溶媒と、バイサルファイトと、前記二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンを含む領域を増幅するためのフォワード及びリバースプライマーセットと、を備えるキット。
［１８］二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンを検出する方法であって、
　（Ａ）ヒドロキシメチルシトシンを有する二本鎖ポリヌクレオチドを含有する試料と、［１２］に記載の酸化剤と、ヘテロ原子として窒素を１つ有し、該窒素にヒドロキシ基が結合している脂環式複素環を有する化合物である触媒と、ｐＨ６．０以上７．０未満である溶媒と、を混合し、ヒドロキシメチルシトシンを酸化し、ホルミルシトシンに変換する工程と、
　（Ｂ）前記変換されたホルミルシトシンを有する二本鎖ポリヌクレオチドを含有する試料をバイサルファイトにより処理し、ホルミルシトシンをウラシルに変換する工程と、
　（Ｃ）前記変換されたウラシルを有する二本鎖ポリヌクレオチドに、前記二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンを含む領域を増幅するためのフォワード及びリバースプライマーを添加し、増幅する工程と、
　（Ｄ）酸化剤を添加せずに工程（Ａ）～（Ｃ）を行った二本鎖ポリヌクレオチドを含有する試料をコントロールとして比較し、二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンを検出する工程と、を備える検出方法。
　本発明によれば、生体内環境を反映した水系溶媒中において、温和な条件で水溶性生体高分子中のヒドロキシ基を選択的に酸化することができる。また、本発明によれば、二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンを容易に検出することができる。
本実施形態におけるミセル封入化されたＢＡＩＢを含有する酸化剤及びＡＺＡＤＯＬ（登録商標）を用いたヒドロキシメチルシトシンの酸化反応を示した模式図である。 本実施形態における二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンとメチルシトシンについて、酸化反応及びバイサルファイト処理前後での変化を比較した図である。 本実施形態における二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンとメチルシトシンについて、酸化反応及びバイサルファイト処理前後での変化を比較した図である。 実施例１における基質ＤＮＡのＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳによる測定結果を示したグラフである。 実施例２における基質ＤＮＡ中のヒドロキシメチルシトシン及びメチルシトシンの位置と、酸化反応及びバイサルファイト処理による基質ＤＮＡ中のシトシン及びヒドロキシメチルシトシンからウラシルへの変換を示した模式図である。 実施例２における基質ＤＮＡの酸化反応の時間の違いによるヒドロキシメチルシトシンからウラシルへ変換する割合の変化を示した模式図である。 実施例２における基質ＤＮＡの酸化反応の時間の違いによるメチル化（又はヒドロキシメチル化）シトシンの割合の変化を示したグラフである。
　以下、必要に応じて図面を参照しながら、本発明の実施形態について詳細に説明する。
なお、図面中、同一又は相当部分には同一符号を付し、重複する説明は省略する。
＜＜酸化剤＞＞
　一実施形態において、本発明は、界面活性剤によりミセル封入化されたヨードベンゼンを基本構造に有し、疎水性である超原子価ヨウ素化合物を含有する酸化剤を提供する。
　本実施形態によれば、ヨードベンゼンを基本構造に有し、疎水性である超原子価ヨウ素化合物を水系溶媒中で酸化剤として使用することができる。また、ヨードベンゼンを基本構造に有し、疎水性である超原子価ヨウ素化合物をミセル封入化することにより、基質と隔離することができ、基質分解などの副反応を防ぐことができる。
　本明細書中において、「界面活性剤」とは、界面(物質の境の面）に作用して、性質を変化させる物質を意味し、構造としては、１つの分子の中に、水になじみやすい「親水性」と、油になじみやすい「親油性」の２つの部分を有する。本実施形態において、使用する界面活性剤としては、イオン性界面活性剤が好ましく、陰イオン界面活性剤（アニオン界面活性剤）がより好ましい。
　本明細書中において、「陰イオン界面活性剤」とは、水に溶かした際にイオン化して、親水基（構造的に水になじむ部分）がマイナスに解離するものを意味し、構造としては、親水基としてカルボン酸、スルホン酸、又はリン酸構造等を有し、カルボン酸型（Ｒ－ＣＯＯ－Ｍ＋）、分枝鎖型又は直鎖型アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム（Ｒ－Ｃ６Ｈ４－ＳＯ３ －Ｎａ＋）、スルホン酸型（Ｒ－ＳＯ３ －Ｎａ＋）、硫酸エステル型（Ｒ－Ｏ－ＳＯ３ －Ｎａ＋）及びリン酸エステル型（Ｒ－Ｏ－ＰＯ（ＯＨ）ＯＭ＋）等である。具体的には、コール酸ナトリウム水和物、デオキシコール酸ナトリウム、グリココール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム塩、タウロデオキシコール酸ナトリウム、Ｎ－ラウロイルサルコシンナトリウム塩、ドデシル硫酸リチウム、ドデシル硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ　ｄｏｄｅｃｙｌ　ｓｕｌｆａｔｅ；ＳＤＳ）、ドデシルホスホコリン（ｄｏｄｅｃｙｌ　ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ；ＤＰＣ）等が挙げられる。この中でも、安価で、且つ、コンパクトなミセルを作製可能であるという観点から、ＳＤＳ又はＤＰＣが特に好ましい。
　本明細書中において、「酸化」とは、水溶性生体高分子等の対象とする物質が電子を失う化学反応を意味し、具体的には、対象とする物質に酸素が化合する反応、又は、対象とする物質が水素を奪われる反応などが挙げられる。
　本明細書においては、「酸化剤」とは、酸素原子を転移される化合物、又は、酸化還元反応で電子を得る物質を意味し、水溶性生体高分子等の対象とする物質中のヒドロキシル基をホルミル基又はケトン基に酸化するものである。
＜超原子価ヨウ素化合物＞
　一般に、超原子価ヨウ素化合物とは原子価殻に８つ以上の電子を持つヨウ素を含有する化合物である。
本実施形態における超原子価ヨウ素化合物は、ヨードベンゼンを基本構造に有し、疎水性であり、下記一般式（１）で表される化合物（以下、「化合物（１）」と略記する場合がある。）、又は下記一般式（２）で表される化合物（以下、「化合物（２）」と略記する場合がある。）である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
［Ｒ１１、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ２１、及びＲ２４で表される基］
一般式（１）及び一般式（２）中、Ｒ１１、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ２１、及びＲ２４は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、ヒドロキシ基、メルカプト基、アミノ基、ホルミル基、カルボキシル基、スルホ基、Ｃ１-１２アルキル基、Ｃ３-１２シクロアルキル基、（Ｃ１-１２アルキル）オキシ基（Ｃ１-１２アルコキシ基）、（Ｃ３-１２シクロアルキル）オキシ基、（Ｃ１-１２アルキル）チオ基、（Ｃ３-１２シクロアルキル）チオ基、（Ｃ１-１２アルキル）アミノ基、（Ｃ３-１２シクロアルキル）アミノ基、ジ（Ｃ１－６アルキル）アミノ基、ジ（Ｃ３－６シクロアルキル）アミノ基、Ｃ１-１２アルキルカルボニル基、Ｃ３-１２シクロアルキルカルボニル基、（Ｃ１-１２アルキル）オキシカルボニル基、（Ｃ３-１２シクロアルキル）オキシカルボニル基、（Ｃ１-１２アルキル）チオカルボニル基、（Ｃ３-１２シクロアルキル）チオカルボニル基、（Ｃ１-１２アルキル）アミノカルボニル基、（Ｃ３-１２シクロアルキル）アミノカルボニル基、ジ（Ｃ１－６アルキル）アミノカルボニル基、ジ（Ｃ３－６シクロアルキル）アミノカルボニル基、（Ｃ１-１２アルキル）カルボニルオキシ基、（Ｃ３-１２シクロアルキル）カルボニルオキシ基、（Ｃ１-１２アルキル）カルボニルチオ基、（Ｃ３-１２シクロアルキル）カルボニルチオ基、（Ｃ１-１２アルキル）カルボニルアミノ基、（Ｃ３-１２シクロアルキル）カルボニルアミノ基、ジ（Ｃ１-１２アルキルカルボニル）アミノ基、ジ（Ｃ３-１２シクロアルキルカルボニル）アミノ基、Ｃ１－６ハロアルキル基、Ｃ３－６ハロシクロアルキル基、Ｃ２－６アルケニル基、Ｃ３－６シクロアルケニル基、Ｃ２－６ハロアルケニル基、Ｃ３－６ハロシクロアルケニル基、Ｃ２－６アルキニル基、Ｃ２－６ハロアルキニル基、Ｒａで置換されていてもよいベンジル基、Ｒａで置換されていてもよいベンジルオキシ基、Ｒａで置換されていてもよいベンジルチオ基、Ｒａで置換されていてもよいベンジルアミノ基、Ｒａで置換されていてもよいジベンジルアミノ基、Ｒａで置換されていてもよいベンジルカルボニル基、Ｒａで置換されていてもよいベンジルオキシカルボニル基、Ｒａで置換されていてもよいベンジルチオカルボニル基、Ｒａで置換されていてもよいベンジルアミノカルボニル基、Ｒａで置換されていてもよいジベンジルアミノカルボニル基、Ｒａで置換されていてもよいベンジルカルボニルオキシ基、Ｒａで置換されていてもよいベンジルカルボニルチオ基、Ｒａで置換されていてもよいベンジルカルボニルアミノ基、Ｒａで置換されていてもよいジ（ベンジルカルボニル）アミノ基、Ｒａで置換されていてもよいアリール基、Ｒａで置換されていてもよいアリールオキシ基、Ｒａで置換されていてもよいアリールチオ基、Ｒａで置換されていてもよいアリールアミノ基、Ｒａで置換されていてもよいジアリールアミノ基、Ｒａで置換されていてもよいアリールカルボニル基、Ｒａで置換されていてもよいアリールオキシカルボニル基、Ｒａで置換されていてもよいアリールチオカルボニル基、Ｒａで置換されていてもよいアリールアミノカルボニル基、Ｒａで置換されていてもよいジアリールアミノカルボニル基、Ｒａで置換されていてもよいアリールカルボニルオキシ基、Ｒａで置換されていてもよいアリールカルボニルチオ基、Ｒａで置換されていてもよいアリールカルボニルアミノ基、Ｒａで置換されていてもよいジ（アリールカルボニル）アミノ基、又はＲａで置換されていてもよいベンゼンスルホニルオキシ基である。Ｒ１１、Ｒ１４、Ｒ１５、及びＲ１６は互いに同一であってもよく、互いに異なっていてもよい。
　ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子及びヨウ素原子が挙げられる。なお、本明細書における「ハロ」（ｈａｌｏ）の表記もこれらのハロゲン原子を表す。
本明細書におけるＣａ～Ｃｂアルキルとは、炭素原子数がａ～ｂ個よりなる直鎖または分岐鎖の炭化水素基を表す。
　Ｃａ～Ｃｂアルキルとしては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｉ－プロピル基、ｎ－ブチル基、ｉ－ブチル基、ｓ－ブチル基、ｔ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、１－メチルブチル基、２－メチルブチル基、３－メチルブチル基、１－エチルプロピル基、１，１－ジメチルプロピル基、１，２－ジメチルプロピル基、２，２－ジメチルプロピル基、ｎ－ヘキシル基、１－メチルペンチル基、２－メチルペンチル基、１，１－ジメチルブチル基、１，３－ジメチルブチル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基等が具体例として挙げられ、各々の指定の炭素原子数の範囲で選択される。
本明細書におけるＣａ～Ｃｂハロアルキルとは、炭素原子に結合した水素原子が、ハロゲン原子によって任意に置換された、炭素原子数がａ～ｂ個よりなる直鎖または分岐鎖の炭化水素基を表す。このとき、２個以上のハロゲン原子によって置換されている場合、それらのハロゲン原子は互いに同一でも、または互いに異なっていてもよい。
Ｃａ～Ｃｂハロアルキルとしては、例えば、フルオロメチル基、クロロメチル基、ブロモメチル基、ヨードメチル基、ジフルオロメチル基、クロロフルオロメチル基、ジクロロメチル基、ブロモフルオロメチル基、トリフルオロメチル基、クロロジフルオロメチル基、ジクロロフルオロメチル基、トリクロロメチル基、ブロモジフルオロメチル基、ブロモクロロフルオロメチル基、ジブロモフルオロメチル基、２－フルオロエチル基、２－クロロエチル基、２－ブロモエチル基、２，２－ジフルオロエチル基、２－クロロ－２－フルオロエチル基、２，２－ジクロロエチル基、２－ブロモ－２－フルオロエチル基、２，２，２－トリフルオロエチル基、２－クロロ－２,２－ジフルオロエチル基、２，２－ジクロロ－２－フルオロエチル基、２，２，２－トリクロロエチル基、２－ブロモ－２,２－ジフルオロエチル基、２－ブロモ－２－クロロ－２－フルオロエチル基、２－ブロモ－２，２－ジクロロエチル基、１，１，２，２－テトラフルオロエチル基、ペンタフルオロエチル基、１－クロロ－１,２，２，２－テトラフルオロエチル基、２－クロロ－１，１，２，２－テトラフルオロエチル基、１，２－ジクロロ－１，２，２－トリフルオロエチル基、２－ブロモ－１，１，２，２－テトラフルオロエチル基、２－フルオロプロピル基、２－クロロプロピル基、２－ブロモプロピル基、２－クロロ－２－フルオロプロピル基、２，３－ジクロロプロピル基、２－ブロモ－３－フルオロプロピル基、３－ブロモ－２－クロロプロピル基、２，３－ジブロモプロピル基、３，３，３－トリフルオロプロピル基、３－ブロモ－３，３－ジフルオロプロピル基、２，２，３，３－テトラフルオロプロピル基、２－クロロ－３，３，３－トリフルオロプロピル基、２，２，３，３，３－ペンタフルオロプロピル基、１，１，２，３，３，３－ヘキサフルオロプロピル基、ヘプタフルオロプロピル基、２，３－ジクロロ－１，１，２，３，３－ペンタフルオロプロピル基、２－フルオロ－１－メチルエチル基、２－クロロ－１－メチルエチル基、２－ブロモ－１－メチルエチル基、２，２，２－トリフルオロ－１－（トリフルオロメチル）エチル基、１，２，２，２－テトラフルオロ－１－（トリフルオロメチル）エチル基、２，２，３，３，４，４－ヘキサフルオロブチル基、２，２，３，４，４，４－ヘキサフルオロブチル基、２，２，３，３，４，４，４－ヘプタフルオロブチル基、１，１，２，２，３，３，４，４－オクタフルオロブチル基、ノナフルオロブチル基、４－クロロ－１，１，２，２，３，３，４，４－オクタフルオロブチル基、２－フルオロ－２－メチルプロピル基、２－クロロ－１，１－ジメチルエチル基、２－ブロモ－１，１－ジメチルエチル基、５－クロロ－２，２，３，４，４，５，５－ヘプタフルオロペンチル基、トリデカフルオロヘキシル基等が具体例として挙げられ、各々の指定の炭素原子数の範囲で選択される。
　本明細書におけるＣａ～Ｃｂシクロアルキルとは、炭素原子数がａ～ｂ個よりなる環状の炭化水素基を表し、３員環から６員環までの単環または複合環構造を形成することが出来る。また、各々の環は指定の炭素原子数の範囲でアルキル基によって任意に置換されていてもよい。
　Ｃａ～Ｃｂシクロアルキルとしては、例えば、シクロプロピル基、１－メチルシクロプロピル基、２－メチルシクロプロピル基、２，２－ジメチルシクロプロピル基、２，２，３，３－テトラメチルシクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、２－メチルシクロペンチル基、３－メチルシクロペンチル基、シクロヘキシル基、２－メチルシクロヘキシル基、３－メチルシクロヘキシル基、４－メチルシクロヘキシル基、ビシクロ［２．２．１］ヘプタン－２－イル基等が具体例として挙げられ、各々の指定の炭素原子数の範囲で選択される。
本明細書におけるＣａ～Ｃｂハロシクロアルキルとは、炭素原子に結合した水素原子が、ハロゲン原子によって任意に置換された、炭素原子数がａ～ｂ個よりなる環状の炭化水素基を表し、３員環から６員環までの単環または複合環構造を形成することが出来る。また、各々の環は指定の炭素原子数の範囲でアルキル基によって任意に置換されていてもよく、ハロゲン原子による置換は環構造部分であっても、側鎖部分であっても、或いはそれらの両方であってもよく、さらに、２個以上のハロゲン原子によって置換されている場合、それらのハロゲン原子は互いに同一でも、または互いに異なっていてもよい。
Ｃａ～Ｃｂハロシクロアルキルとしては、例えば、２，２－ジフルオロシクロプロピル基、２，２－ジクロロシクロプロピル基、２，２－ジブロモシクロプロピル基、２，２－ジフルオロ-1-メチルシクロプロピル基、２，２－ジクロロ－１－メチルシクロプロピル基、２，２－ジブロモ-1-メチルシクロプロピル基、２，２，３，３－テトラフルオロシクロブチル基、２－（トリフルオロメチル）シクロヘキシル基、３－（トリフルオロメチル）シクロヘキシル基、４－（トリフルオロメチル）シクロヘキシル基等が具体例として挙げられ、各々の指定の炭素原子数の範囲で選択される。
　本明細書におけるＣａ～Ｃｂアルケニルとは、炭素原子数がａ～ｂ個よりなる直鎖または分岐鎖で、且つ、分子内に１個または２個以上の二重結合を有する不飽和炭化水素基を表す。
　Ｃａ～Ｃｂアルケニルとしては、例えば、ビニル基、１－プロペニル基、２－プロペニル基、１－メチルエテニル基、２－ブテニル基、１－メチル－２－プロペニル基、２－メチル－２－プロペニル基、２－ペンテニル基、２－メチル－２－ブテニル基、３－メチル－２－ブテニル基、２－エチル－２－プロペニル基、１，１－ジメチル－２－プロペニル基、２－ヘキセニル基、２－メチル－２－ペンテニル基、２，４－ジメチル－２，６－ヘプタジエニル基、３，７－ジメチル－２，６－オクタジエニル基等が具体例として挙げられ、各々の指定の炭素原子数の範囲で選択される。
本明細書におけるＣａ～Ｃｂハロアルケニルとは、炭素原子に結合した水素原子が、ハロゲン原子によって任意に置換された、炭素原子数がａ～ｂ個よりなる直鎖または分岐鎖で、且つ、分子内に１個または２個以上の二重結合を有する不飽和炭化水素基を表す。このとき、２個以上のハロゲン原子によって置換されている場合、それらのハロゲン原子は互いに同一でも、または互いに異なっていてもよい。
　Ｃａ～Ｃｂハロアルケニルとしては、例えば、２，２－ジクロロビニル基、２－フルオロ－２－プロペニル基、２－クロロ－２－プロペニル基、３－クロロ－２－プロペニル基、２－ブロモ－２－プロペニル基、３－ブロモ－２－プロペニル基、３，３－ジフルオロ－２－プロペニル基、２，３－ジクロロ－２－プロペニル基、３，３－ジクロロ-2-プロペニル基、２，３－ジブロモ－２－プロペニル基、２，３，３－トリフルオロ－２－プロペニル基、２，３，３－トリクロロ－２－プロペニル基、１－（トリフルオロメチル）エテニル基、３－クロロ－２－ブテニル基、３－ブロモ－２－ブテニル基、４，４－ジフルオロ－３－ブテニル基、３，４，４－トリフルオロ－３－ブテニル基、３－クロロ－４，４，４－トリフルオロ－２－ブテニル基、３－ブロモ－２－メチル－２－プロペニル基等が具体例として挙げられ、各々の指定の炭素原子数の範囲で選択される。
　本明細書におけるＣａ～Ｃｂアルキニルの表記は、炭素原子数がａ～ｂ個よりなる直鎖または分岐鎖で、且つ、分子内に１個または２個以上の三重結合を有する不飽和炭化水素基を表す。
　Ｃａ～Ｃｂアルキニルとしては、例えば、エチニル基、１－プロピニル基、２－プロピニル基、２－ブチニル基、１－メチル－２－プロピニル基、２－ペンチニル基、１－メチル－２－ブチニル基、１，１－ジメチル－２－プロピニル基、２－ヘキシニル基等が具体例として挙げられ、各々の指定の炭素原子数の範囲で選択される。
　本明細書におけるＣａ～Ｃｂハロアルキニルとは、炭素原子に結合した水素原子が、ハロゲン原子によって任意に置換された、炭素原子数がａ～ｂ個よりなる直鎖または分岐鎖で、且つ、分子内に１個または２個以上の三重結合を有する不飽和炭化水素基を表す。このとき、２個以上のハロゲン原子によって置換されている場合、それらのハロゲン原子は互いに同一でも、または互いに異なっていても良い。
　Ｃａ～Ｃｂハロアルキニルとしては、例えば、２－クロロエチニル基、２－ブロモエチニル基、２－ヨードエチニル基、３－クロロ－２－プロピニル基、３－ブロモ－２－プロピニル基、３－ヨード－２－プロピニル基等が具体例として挙げられ、各々の指定の炭素原子数の範囲で選択される。
（Ｒａで表される基）
　Ｒａは、ハロゲン原子、Ｃ１－６アルキル基、Ｃ１－６ハロアルキル基、Ｃ３－６シクロアルキル基、Ｃ１－６アルコキシ基、Ｃ１－６アルコキシＣ１－６アルキル基、Ｃ１－６アルキルスルフェニルＣ１－６アルキル基、Ｃ１－６ハロアルコキシ基、Ｃ１－６アルキルスルフェニル基、Ｃ１－６アルキルスルフィニル基、Ｃ１－６アルキルスルホニル基、Ｃ１－６ハロアルキルスルフェニル基、Ｃ１－６ハロアルキルスルフィニル基、Ｃ１－６ハロアルキルスルホニル基、Ｃ２－６アルケニル基、Ｃ２－６ハロアルケニル基、Ｃ２－６アルケニルオキシ基、Ｃ２－６ハロアルケニルオキシ基、Ｃ２－６アルケニルスルフェニル基、Ｃ２－６アルケニルスルフィニル基、Ｃ２－６アルケニルスルホニル基、Ｃ２－６ハロアルケニルスルフェニル基、Ｃ２－６ハロアルケニルスルフィニル基、Ｃ２－６ハロアルケニルスルホニル基、Ｃ２－６アルキニル基、Ｃ２－６ハロアルキニル基、Ｃ２－６アルキニルオキシ基、Ｃ２－６ハロアルキニルオキシ基、Ｃ２－６アルキニルスルフェニル基、Ｃ２－６アルキニルスルフィニル基、Ｃ２－６アルキニルスルホニル基、Ｃ２－６ハロアルキニルスルフェニル基、Ｃ２－６ハロアルキニルスルフィニル基、Ｃ２－６ハロアルキニルスルホニル基、－ＮＯ２、－ＣＮ、ホルミル基、－ＯＨ、－ＳＨ、－ＮＨ２、－ＳＣＮ、Ｃ１－６アルコキシカルボニル基、Ｃ１－６アルキルカルボニル基、Ｃ１－６ハロアルキルカルボニル基、Ｃ１－６アルキルカルボニルオキシ基、フェニル基、Ｃ１－６アルキルアミノ基、又はジＣ１－６アルキルアミノ基である。置換するＲａの数は１～５個であり、Ｒａが２個以上の場合は、それぞれの置換基は同一であってもよく、異なっていてもよい。
　Ｒａで置換されていてもよいアリール基としては、例えば、フェニル基、ｏ－メチルフェニル基、ｍ－メチルフェニル基、ｐ－メチルフェニル基、ｏ－クロルフェニル基、ｍ－クロルフェニル基、ｐ－クロルフェニル基、ｏ－フルオロフェニル基、ｐ－フルオロフェニル基、ｏ－メトキシフェニル基、ｐ－メトキシフェニル基、ｐ－ニトロフェニル基、ｐ－シアノフェニル基、α－ナフチル基、β－ナフチル基、ｏ－ビフェニリル基、ｍ－ビフェニリル基、ｐ－ビフェニリル基、１－アントリル基、２－アントリル基、９－アントリル基、１－フェナントリル基、２－フェナントリル基、３－フェナントリル基、４－フェナントリル基、９－フェナントリル基、２－チエニル基、３－チエニル基、２－フリル基、３－フリル基、２－ピラニル基、３－ピラニル基、４－ピラニル基、２－ベンゾフラニル基、３－ベンゾフラニル基、４－ベンゾフラニル基、５－ベンゾフラニル基、６－ベンゾフラニル基、７－ベンゾフラニル基、１－イソベンゾフラニル基、４－イソベンゾフラニル基、５－イソベンゾフラニル基、２－ベンゾチエニル基、３－ベンゾチエニル基、４－ベンゾチエニル基、５－ベンゾチエニル基、６－ベンゾチエニル基、７－ベンゾチエニル基、１－イソベンゾチエニル基、４－イソベンゾチエニル基、５－イソベンゾチエニル基、２－クロメニル基、３－クロメニル基、４－クロメニル基、５－クロメニル基、６－クロメニル基、７－クロメニル基、８－クロメニル基、１－ピロリル基、２－ピロリル基、３－ピロリル基、１－イミダゾリル基、２－イミダゾリル基、４－イミダゾリル基、１－ピラゾリル基、３－ピラゾリル基、４－ピラゾリル基、２－チアゾリル基、４－チアゾリル基、５－チアゾリル基、３－イソチアゾリル基、４－イソチアゾリル基、５－イソチアゾリル基、２－オキサゾリル基、４－オキサゾリル基、５－オキサゾリル基、３－イソオキサゾリル基、４－イソオキサゾリル基、５－イソオキサゾリル基、２－ピリジル基、３－ピリジル基、４－ピリジル基、２－ピラジニル基、２－ピリミジニル基、４－ピリミジニル基、５－ピリミジニル基、３－ピリダジニル基、４－ピリダジニル基、１－インドリジニル基、２－インドリジニル基、３－インドリジニル基、５－インドリジニル基、６－インドリジニル基、７－インドリジニル基、８－インドリジニル基、１－イソインドリル基、４－イソインドリル基、５－イソインドリル基、１－インドリル基、２－インドリル基、３－インドリル基、４－インドリル基、５－インドリル基、６－インドリル基、７－インドリル基、１－インダゾリル基、２－インダゾリル基、３－インダゾリル基、４－インダゾリル基、５－インダゾリル基、６－インダゾリル基、７－インダゾリル基、１－プリニル基、２－プリニル基、３－プリニル基、６－プリニル基、７－プリニル基、８－プリニル基、２－キノリル基、３－キノリル基、４－キノリル基、５－キノリル基、６－キノリル基、７－キノリル基、８－キノリル基、１－イソキノリル基、３－イソキノリル基、４－イソキノリル基、５－イソキノリル基、６－イソキノリル基、７－イソキノリル基、８－イソキノリル基、１－フタラジニル基、５－フタラジニル基、６－フタラジニル基、２－ナフチリジニル基、３－ナフチリジニル基、４－ナフチリジニル基、２－キノキサリニル基、５－キノキサリニル基、６－キノキサリニル基、２－キナゾリニル基、４－キナゾリニル基、５－キナゾリニル基、６－キナゾリニル基、７－キナゾリニル基、８－キナゾリニル基、３－シンノリニル基、４－シンノリニル基、５－シンノリニル基、６－シンノリニル基、７－シンノリニル基、８－シンノリニル基、２－プテニジニル基、４－プテニジニル基、６－プテニジニル基、７－プテニジニル基及び３－フラザニル基等が挙げられ、これらに限定されない。
　Ｒａで置換されていてもよいベンジル基としては、例えば、ベンジル基、ｏ－メチルベンジル基、ｍ－メチルベンジル基、ｐ－メチルベンジル基、ｏ－クロルベンジル基、ｍ－クロルベンジル基、ｐ－クロルベンジル基、ｏ－フルオロベンジル基、ｐ－フルオロベンジル基、ｏ－メトキシベンジル基、ｐ－メトキシベンジル基、ｐ－ニトロベンジル基、ｐ－シアノベンジル基等が挙げられ、これらに限定されない。
　Ｒａで置換されていてもよいベンゼンスルホニルオキシ基としては、例えば、ベンゼンスルホニルオキシ基、ｏ－トルエンスルホニルオキシ基、ｍ－トルエンスルホニルオキシ基、ｐ－トルエンスルホニル基、ｏ－クロルベンゼンスルホニルオキシ基、ｍ－クロルベンゼンスルホニルオキシ基、ｐ－クロルベンゼンスルホニルオキシ基、ｏ－フルオロベンゼンスルホニルオキシ基、ｐ－フルオロベンゼンスルホニルオキシ基、ｏ－メトキシベンゼンスルホニルオキシ基、ｐ－メトキシベンゼンスルホニルオキシ基、ｐ－ニトロベンゼンスルホニルオキシ基、ｐ－シアノベンゼンスルホニルオキシ基等が挙げられ、これらに限定されない。
中でも、Ｒ１１及びＲ２１は水素原子であることが好ましい。
また、中でも、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、及びＲ２４は、フッ素原子、ヒドロキシ基、トリフルオロメチル基、メチルカルボニルオキシ基、トリフルオロメチルカルボニルオキシ基、ｐ－トルエンスルホニルオキシ基、又はフェニル基であることが好ましい。
　Ｒ１４、Ｒ１５、及びＲ１６は、合成しやすいことから同一であることが好ましい。
［Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ２２、及びＲ２３で表される基］
　一般式（１）及び一般式（２）中、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ２２、及びＲ２３は、それぞれ独立に、Ｒ１１、Ｒ１４、Ｒ１５、及びＲ１６で例示された基と同様の基が挙げられる。本実施形態において、Ｒ１２及びＲ１３、又はＲ２２及びＲ２３は互いに結合して、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＨ－、－ＣＯ－、－ＣＯＯ－、－ＣＯＮＨ－、Ｃ１－１０アルキレン基、又はこれらの組み合わせを形成していてもよい。
　本明細書におけるＣａ～Ｃｂアルキレンとは、炭素原子数がａ～ｂ個よりなる直鎖または分岐鎖で、且つ、分子内に１個または２個以上の二重結合を有する不飽和炭化水素基を表す。
　Ｃａ～Ｃｂアルキレンとしては、例えば、メチレン基、エチレン基、ｎ－プロピレン基、ｎ－ブチレン基、ｎ－ペンチレン基、ｎ－へキシレン基、ｎ－ヘプチレン基、ｎ－オクチレン基、ｎ－ノニレン基、ｎ－デシレン基等の直鎖状のアルキレン基、ジメチルメチレン基、２－メチルプロピレン基、２－メチルへキシレン基、テトラメチルエチレン基等の分岐鎖状のアルキレン基等が具体例として挙げられ、各々の指定の炭素原子数の範囲で選択される。
　Ｒ１２及びＲ１３、又はＲ２２及びＲ２３が互いに結合している場合、中でも、－ＣＯＯ－、又はジメチルメチレンオキシ基を形成していることが好ましい。
　Ｒ１２及びＲ１３、又はＲ２２及びＲ２３が結合していない場合、中でも、Ｒ１２及びＲ２２は、水素原子であることが好ましく、Ｒ１３及びＲ２３はフッ素原子、ヒドロキシ基、トリフルオロメチル基、メチルカルボニルオキシ基、トリフルオロメチルカルボニルオキシ基、ｐ－トルエンスルホニルオキシ基、又はフェニル基であることが好ましい。
［Ｘ２１］
　一般式（２）中、Ｘ２１は酸素原子、又は硫黄原子である。中でも、Ｘ２１は酸素原子であることが好ましい。
［ｎ１１、ｎ１２、ｎ１３、ｎ２１、ｎ２２、及びｎ２３］
　一般式（１）中、ｎ１１はＲ１１の個数を示し、且つ１～５のいずれかの整数である。ｎ１１が２以上のときＲ１１は互いに同一であってもよく異なっていてもよい。
一般式（１）中、ｎ１２はＲ１２の個数を示し、且つ０～４のいずれかの整数である。ｎ１２が２以上のときＲ１２は互いに同一であってもよく異なっていてもよい。
一般式（２）中、ｎ２１はＲ２１の個数を示し、且つ１～５のいずれかの整数である。ｎ２１が２以上のときＲ２１は互いに同一であってもよく異なっていてもよい。
一般式（２）中、ｎ２２はＲ２２の個数を示し、且つ０～４のいずれかの整数である。ｎ２２が２以上のときＲ２２は互いに同一であってもよく異なっていてもよい。
ｎ１１とｎ１２との和は５であり、ｎ２１とｎ２２との和は５である。
ｎ１３及びｎ２３は０又は１である。
　化合物（１）で好ましいものとしては、例えば、下記一般式（１－１）で表される化合物（以下、「化合物（１－１）」と略記することがある。）、又は下記一般式（１－２）で表される化合物（以下、「化合物（１－２））と略記することがある。）等が挙げられる。
なお、これら化合物は、好ましい化合物（１）の一例に過ぎず、好ましい化合物（１）はこれらに限定されない。
　また、化合物（２）で好ましいものとしては、例えば、下記一般式（２－１）で表される化合物（以下、「化合物（２－１）」と略記することがある。）、又は下記一般式（２－２）で表される化合物（以下、「化合物（２－２））と略記することがある。）等が挙げられる。
　なお、これら化合物は、好ましい化合物（２）の一例に過ぎず、好ましい化合物（２）はこれらに限定されない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
（式中、Ｒ１１、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ２３、Ｒ２４、ｎ１１、ｎ１３、及びｎ２３は、いずれも上記と同じである。また、Ｙ１１及びＹ２１は－Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＨ－、－ＣＯ－、－ＣＯＯ－、－ＣＯＮＨ－、Ｃ１－１０アルキレン基、又はこれらの組み合わせである。）
［Ｙ１１及びＹ２１］
　一般式（１－２）及び一般式（２－２）中、Ｙ１１及びＹ２１は－Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＨ－、－ＣＯ－、－ＣＯＯ－、－ＣＯＮＨ－、Ｃ１－１０アルキレン基、又はこれらの組み合わせである。中でも、Ｙ１１及びＹ２１は－ＣＯＯ－、又はジメチルメチレンオキシ基であることが好ましい。
　化合物（１－１）で好ましいものとしては、例えば、Ｒ１１が水素原子、又はＣ１-１２アルキル基であり、Ｒ１３がハロゲン原子、ヒドロキシ基、トリフルオロメチル基、メチルカルボニルオキシ基、トリフルオロメチルカルボニルオキシ基、ｐ－トルエンスルホニルオキシ基、又はフェニル基であり、Ｒ１４がハロゲン原子、ヒドロキシ基、トリフルオロメチル基、メチルカルボニルオキシ基、トリフルオロメチルカルボニルオキシ基、ｐ－トルエンスルホニルオキシ基、又はフェニル基であるもの等が挙げられる。
　化合物（１－１）でより好ましいものとしては、例えば、Ｒ１１が水素原子、又はメチル基であり、Ｒ１３がフッ素原子、ヒドロキシ基、メチルカルボニルオキシ基、トリフルオロメチルカルボニルオキシ基、又はフェニル基であり、Ｒ１４がフッ素原子、メチルカルボニルオキシ基、トリフルオロメチルカルボニルオキシ基、又はｐ－トルエンスルホニルオキシ基であるもの等が挙げられる。
　化合物（１－２）で好ましいものとしては、例えば、Ｒ１４、Ｒ１５、及びＲ１６がハロゲン原子、ヒドロキシ基、トリフルオロメチル基、メチルカルボニルオキシ基、トリフルオロメチルカルボニルオキシ基、ｐ－トルエンスルホニルオキシ基、又はフェニル基であり、Ｙ１１が－ＣＯＯ－、又はジメチルメチレンオキシ基であるもの等が挙げられる。
　化合物（１－２）でより好ましいものとしては、例えば、Ｒ１４、Ｒ１５、及びＲ１６がメチルカルボニルオキシ基、又はトリフルオロメチルカルボニルオキシ基フェニル基であり、Ｙ１１が－ＣＯＯ－であるもの等が挙げられる。
　化合物（２－１）で好ましいものとしては、例えば、Ｒ２３及びＲ２３がハロゲン原子、ヒドロキシ基、トリフルオロメチル基、メチルカルボニルオキシ基、トリフルオロメチルカルボニルオキシ基、ｐ－トルエンスルホニルオキシ基、又はフェニル基であるもの等が挙げられる。
　化合物（２－１）でより好ましいものとしては、例えば、Ｒ２３及びＲ２３がフッ素原子、ヒドロキシ基、メチルカルボニルオキシ基、トリフルオロメチルカルボニルオキシ基、又はフェニル基であるもの等が挙げられる。
　化合物（２－２）で好ましいものとしては、例えば、Ｒ２４がフッ素原子、ヒドロキシ基、トリフルオロメチル基、メチルカルボニルオキシ基、トリフルオロメチルカルボニルオキシ基、ｐ－トルエンスルホニルオキシ基、又はフェニル基であり、Ｙ１１が－ＣＯＯ－、又はジメチルメチレンオキシ基であるもの等が挙げられる。
　化合物（２－２）でより好ましいものとしては、例えば、Ｒ２４がヒドロキシ基、又はメチルカルボニルオキシ基であり、Ｙ１１が－ＣＯＯ－であるもの等が挙げられる。
　化合物（１）のうち、化合物（１－１）で好ましいものとしては、例えば、下記一般式（１－１－１）で表される化合物（以下、「化合物（１－１－１）」と略記することがある）、下記一般式（１－１－２）で表される化合物（以下、「化合物（１－１－２）」と略記することがある）、下記一般式（１－１－３）で表される化合物（以下、「化合物（１－１－３）」と略記することがある）、下記一般式（１－１－４）で表される化合物（以下、「化合物（１－１－４）」と略記することがある）、及び下記一般式（１－１－５）で表される化合物（以下、「化合物（１－１－５）」と略記することがある）等が挙げられる。
　化合物（１）のうち、化合物（１－２）で好ましいものとしては、例えば、下記一般式（１－２－１）で表される化合物（以下、「化合物（１－２－１）」と略記することがある）、及び下記一般式（１－２－２）で表される化合物（以下、「化合物（１－２－２）」と略記することがある）等が挙げられる。
　なお、これら化合物は、好ましい化合物（１）の一例に過ぎず、好ましい化合物（１）はこれらに限定されない。
　化合物（２）のうち、化合物（２－１）で好ましいものとしては、例えば、下記一般式（２－１－１）で表される化合物（以下、「化合物（２－１－１）」と略記することがある）等が挙げられる。
　化合物（２）のうち、化合物（２－２）で好ましいものとしては、例えば、下記一般式（２－２－１）で表される化合物（以下、「化合物（２－２－１）」と略記することがある）等が挙げられる。
　なお、これら化合物は、好ましい化合物（２）の一例に過ぎず、好ましい化合物（２）はこれらに限定されない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
　式中、Ａｃとはアセチル基（メチルカルボニル基）であり、Ｔｓとはトシル基（ｐ－トルエンスルホニル基）である。
　化合物（１－１－２）は、ヨードベンゼンジアセテート（Ｂｉｓ（ａｃｅｔｏｘｙ）ｉｏｄｏ　ｂｅｎｚｅｎｅ；ＢＡＩＢ）と呼ばれる化合物であり、化合物（１－２－２）はデス・マーチン試薬と呼ばれる化合物であり、化合物（２－１－１）はヨードシルベンゼンと呼ばれる化合物であり、化合物（２－２－１）は２－ヨードキシ安息香酸と呼ばれる化合物である。
＜超原子価ヨウ素化合物の製造方法＞
　化合物（１）及び化合物（２）は公知化合物であるため、市販のものを用いてもよく、合成したものを用いてもよい。
　化合物（１）及び化合物（２）は、例えば、ヨードベンゼンを基本構造として有する化合物を原料として公知の反応を用いて、製造できる。より具体的には以下のとおりである。
　化合物（１）のうち、化合物（１－１－２）（ＢＡＩＢ）は、例えば、ヨードベンゼンと過酢酸と酢酸とを反応させて、化合物（１－１－２）（ＢＡＩＢ）を得る工程を備える製造方法により、製造できる。
　また、化合物（１）のうち、化合物（１－２－２）（デス・マーチン試薬）は、ヨード安息香酸とペルオキシ一硫酸カリウムとを反応させて、２－ヨードキシ安息香酸を得る工程と、前記２－ヨードキシ安息香酸と無水酢酸とを、触媒量のｐ－トルエンスルホン酸を用いて反応させて、化合物（１－２－２）（デス・マーチン試薬）を得る工程と、を備える製造方法により、製造できる。
　化合物（２）のうち、化合物（２－１－１）（ヨードシルベンゼン）は、例えば、化合物（１－１－２）（ＢＡＩＢ）を加水分解し、化合物（２－１－１）（ヨードシルベンゼン）を得る工程を備える製造方法により、製造できる。
　また、化合物（２）のうち、化合物（２－２－１）（２－ヨードキシ安息香酸）は、ヨード安息香酸とペルオキシ一硫酸カリウムとを反応させて、２－ヨードキシ安息香酸を得る工程を備える製造方法により、製造できる。
　反応終了後は、公知の手法によって、必要に応じて後処理を行い、各化合物を取り出せばよい。すなわち、適宜必要に応じて、ろ過、洗浄、抽出、ｐＨ調整、脱水、濃縮等の後処理操作をいずれか単独で、又は２種以上組み合わせて行い、濃縮、結晶化、再沈殿、カラムクロマトグラフィー等により、各化合物を取り出せばよい。また、取り出した各化合物は、さらに必要に応じて、結晶化、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、抽出、溶媒による結晶の撹拌洗浄等の操作をいずれか単独で、又は２種以上組み合わせて１回以上行うことで、精製してもよい。
　各化合物は、例えば、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法、質量分析法（ＭＳ）、赤外分光法（ＩＲ）等、公知の手法で構造を確認できる。
　化合物（１）及び化合物（２）の製造方法は上記に限定されず、その他公知の方法を用いて、所望の構造を有する化合物（１）及び化合物（２）を製造すればよい。
＜ミセル＞
　図１は、ミセル封入化されたＢＡＩＢを含有する酸化剤及びＡＺＡＤＯＬ（登録商標）を用いたヒドロキシメチルシトシンの酸化反応を示した模式図である。図１から、ＢＡＩＢ等の前記超原子価ヨウ素化合物（化合物（１））は、界面活性剤によりミセル封入化されることで、水溶性を有し、さらに、基質である二本鎖ポリヌクレオチドから隔離されて、基質の分解を抑制することができる。
　また、本実施形態における化合物（１）又は化合物（２）が封入されたミセルの粒子径は、５０ｎｍ以下であり、１０ｎｍ以上４０ｎｍ以下であることが好ましく、１０ｎｍ以上３０ｎｍであることがより好ましい。
前記ミセルの粒子径が上記下限値以上であることにより、化合物（１）又は化合物（２）を封入することができる。また、前記ミセルの粒子径が上記上限値以下であることにより、基質である二本鎖ポリヌクレオチドは約３００～４００ｂｐの場合、約１０万であって、分子量の差が大きいため、前記二本鎖ポリヌクレオチドは前記ミセル内に入り込めず、化合物（１）又は化合物（２）による酸化的攻撃を防ぐことができる。また、触媒の分子量が約２００（例えば、ＡＺＡＤＯＬ（登録商標）は分子量１５３）であるため、前記ミセル内に取り込まれて、再酸化されて、基質である二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンのヒドロキシ基をを選択的に酸化することができる。
　前記ミセルの粒子径は、動的光散乱装置、又は透過型電子顕微鏡により測定することができる。
＜＜酸化剤の製造方法＞＞
　一実施形態において、本発明は、界面活性剤によりミセル封入化された超原子価ヨウ素化合物の製造方法であって、
　（ａ）前記超原子価ヨウ素化合物と、アセトニトリルと、界面活性剤と、溶媒とを混合し、４℃以上２５℃未満の温度で液色が透明から黄色を呈するまで振盪撹拌する工程と、
　（ｂ）前記工程（ａ）後、さらに２５℃以上３０℃以下の温度で振盪撹拌する工程と、
を備え、
前記超原子価ヨウ素化合物はヨードベンゼンを基本構造に有し、疎水性である製造方法を提供する。
　本実施形態によれば、界面活性剤によりミセル封入化されたヨードベンゼンを基本構造に有し、疎水性である超原子価ヨウ素化合物（化合物（１）又は化合物（２））を容易に作製することができる。
　以下に、酸化剤の製造方法について、詳細に説明する。
　まず、反応容器において、アセトニトリルと界面活性剤溶液とを混合（好ましくは、体積比でアセトニトリル：界面活性剤溶液＝１：９）し、これに、化合物（１）又は化合物（２）を添加することが好ましい。好ましくは、４℃以上２５℃未満、より好ましくは、４℃以上１０℃以下の温度で液色が透明から黄色を呈するまで振盪撹拌する（工程（ａ））。この反応は、発熱反応であり、２５℃未満であれば、沸点の低いアセトニトリルが揮発することが防げるため、反応容器の周りに氷水等をはって、４℃以上２５℃未満に温度管理することが好ましい。
　有機配位子であるアセトニトリルは、化合物（１）又は化合物（２）と錯体を形成し、化合物（１）又は化合物（２）のミセル可溶化に寄与すると考えられている。また、酸化剤中のアセトニトリルの濃度は、５～１０％が好ましく、８～１０％がより好ましく、１０％が特に好ましい。１０％以下の場合、界面活性剤により形成されたミセルが壊れることはない。
　酸化剤中の界面活性剤の濃度は、２％以上５％以下であることが好ましい。２％以上の場合、化合物（１）又は化合物（２）をミセル封入することができ、５％以下の場合、コストに見合わった使用量とすることができる。
　酸化剤中の化合物（１）又は化合物（２）の濃度は、２０ｍｇ／ｍＬ以上３０ｍｇ／ｍＬ以下であることが好ましい。２０ｍｇ／ｍＬ以上の場合、酸化力を担保することができ、また、３０ｍｇ／ｍＬ以下の場合、濃度に見合った酸化力を得ることができる。
　界面活性剤溶液に用いる溶媒としては、反応を阻害せず、そのまま水溶性生体高分子の酸化反応に用いることができるものであれば特に限定はなく、例えば、水などが挙げられる。界面活性剤溶液の量が少なすぎると、反応中に沸点の低いアセトニトリルが揮発してしまうので、化合物（１）又は化合物（２）、アセトニトリル、及び界面活性剤の濃度を上述した濃度に保てる範囲内の量を使用すればよい。
　振盪撹拌するための装置としては、特に限定はなく、超音波攪拌機、超音波分散機等が挙げられる。
　液色が透明から黄色を呈することが、化合物（１）又は化合物（２）の酸化活性のインジケータであり、化合物（１）又は化合物（２）とアセトニトリルが錯体を形成したサインである。そのため、液色が透明から黄色を呈した後に、温度を上げて、２５℃以上３０℃以下の温度で振盪撹拌することで、化合物（１）又は化合物（２）を完全に溶解させ、化合物（１）又は化合物（２）のミセル可溶化を促進する（工程（ｂ））。
　本実施形態において、製造された酸化剤は、凍結保存することも可能であるが、使用する直前に製造し、製造当日に使い切ることが好ましい。これは、経時的に酸化活性が失われてしまうためである。酸化活性の指標は、液色が黄色を呈していることであり、黄色が退色していれば、失活していると判断することができる。
＜＜酸化反応試薬＞＞
　一実施形態において、本発明は、上述の酸化剤と、ヘテロ原子として窒素を１つ有し、該窒素にヒドロキシ基が結合している脂環式複素環を有する化合物である触媒と、ｐＨ６．０以上７．０未満である溶媒と、を備える酸化反応試薬を提供する。
本実施形態によれば、生体内環境を反映した水系溶媒中において、温和な条件で水溶性生体高分子中のヒドロキシ基を選択的に酸化可能な試薬を得ることができる。
本実施形態の酸化反応試薬は、上述の酸化剤を備える。使用可能な界面活性剤、酸化剤の製造方法等は上述のとおりである。
＜触媒＞
　さらに、本実施形態の酸化反応試薬は、ヘテロ原子として窒素を１つ有し、該窒素にヒドロキシ基が結合している脂環式複素環を有する化合物である触媒を備える。
　本実施形態において、触媒である「ヘテロ原子として窒素を１つ有し、該窒素にヒドロキシ基が結合している脂環式複素環を有する化合物」は、下記一般式（３）で表されるＮ－ヒドロキシ化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
［Ｒ３１で表される基］
　一般式（３）中、Ｒ３１は、上述の［Ｒ１１、Ｒ１４、Ｒ１５、及びＲ１６で表される基］で例示された基と同様の基が挙げられる。中でも、Ｒ３１は、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、Ｃ１-３アルキル基、又はＣ１-３アルコキシ基であることが好ましい。
［Ｒ３２及びＲ３３で表される基］
　一般式（３）中、Ｒ３２及びＲ３３は、それぞれ独立に上述の［Ｒ１１、Ｒ１４、Ｒ１５、及びＲ１６で表される基］で例示された基と同様の基が挙げられる。また、Ｒ３２及びＲ３３は、互いに結合してメチレン基を形成していてもよい。
［ｎ３１］
　一般式（３）中、ｎ３１はＲ３１の個数を示し、且つ１～８のいずれかの整数である。ｎ３１が２以上のときＲ１１は互いに同一であってもよく異なっていてもよい。
　化合物（３）で好ましいものとしては、例えば、下記一般式（３－１）で表される化合物（以下、「化合物（１－１）」と略記することがある。）等が挙げられる。
なお、これら化合物は、好ましい化合物（３）の一例に過ぎず、好ましい化合物（３）はこれらに限定されない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
（式中、Ｒ３１は、上記と同じである。Ｒ３１は、互いに同一でもあってもよく、異なっていてもよい。）
　化合物（３－１）で好ましいものとしては、例えば、Ｒ３１が水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、Ｃ１-３アルキル基、又はＣ１-３アルコキシ基であるもの等が挙げられる。
　化合物（３－１）でより好ましいものとしては、例えば、Ｒ３１が水素原子、フッ素原子、ヒドロキシ基、メチル基、又はメトキシ基であるもの等が挙げられる。
　化合物（３）のうち、化合物（３－１）で好ましいものとしては、例えば、Ｎ－ヒドロキシ－１－フルオロ－２－アザアダマンタン （１－Ｆ－ＡＺＡＤＯＨ）、Ｎ－ヒドロキシ－５－フルオロ－２－アザアダマンタン （５－Ｆ－ＡＺＡＤＯＨ）、Ｎ－ヒドロキシ－５－フルオロ－１－メチル－２－アザアダマンタン （５－Ｆ－１－Ｍｅ－ＡＺＡＤＯＨ）、Ｎ－ヒドロキシ－５，７－ジフルオロ－１－メチル－２－アザアダマンタン （５，７－Ｆ２－１－Ｍｅ－ＡＺＡＤＯＨ）、Ｎ－ヒドロキシ－１－メチル－２－アザアダマンタン（１－Ｍｅ－ＡＺＡＤＯＨ）、Ｎ－ヒドロキシ－１－メチル－５-ヒドロキシ－２－アザアダマンタン （１－Ｍｅ－５－ＯＨ－ＡＺＡＤＯＨ）、Ｎ－ヒドロキシ－５－メトキシ－１－メチル－２－アザアダマンタン （５－ＭｅＯ－１－Ｍｅ－ＡＺＡＤＯＨ）、Ｎ－ヒドロキシ－５－ヒドロキシ－２－アザアダマンタン（５－ＯＨ－ＡＺＡＤＯＨ）、Ｎ－ヒドロキシ－９－アザビシクロ［３．３．１］ノナン （ＡＢＮＯＨ）、２－ヒドロキシ－２－アザアダマンタン（ＡＺＡＤＯＬ（登録商標））等が挙げられる。
　なお、これら化合物は、好ましい化合物（３）の一例に過ぎず、好ましい化合物（３）はこれらに限定されない。
　中でも、化合物（３）は、ＡＺＡＤＯＬ（登録商標）であることが好ましい。
［触媒の製造方法］
　本明細書において、触媒として用いる化合物（３）は、「Ｙ．Ｉｗａｂｕｃｈｉ，　Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２０１３，６１，１１９７．」、及び国際公開第２００６／００１３８７号に記載の方法で製造することができる。また、ＡＺＡＤＯＬ（登録商標）については、合成せずに市販品を用いることもできる。
［触媒の濃度］
　反応試薬中において、触媒は、１ｍｇ／ｍＬ以上２ｍｇ／ｍＬ以下の濃度であることが好ましく、２ｍｇ／ｍＬであることがより好ましい。
［触媒の基質］
　本実施形態では、各種のヒドロキシ基を有する化合物を基質として、触媒として化合物（３）及び上述の酸化剤の存在下、温和な条件で酸化反応を行うことができる。
　また、従来、ＴＥＭＰＯなどの触媒では酸化反応を行うことが難しかった、立体的に込み合った構造のヒドロキシ基を有する化合物についても酸化反応を行うことができる。
　本実施形態において、酸化されるアルコール化合物としては、特に制限されるものではなく、各種のヒドロキシ基を有する化合物が挙げられる。これらヒドロキシ基を有する化合物としては、中でも、タンパク質又は核酸等が好ましい。
＜溶媒＞
　さらに、本実施形態の酸化反応試薬は、ｐＨ６．０以上７．０未満である溶媒を備える。ｐＨ６．０以上７．０未満である場合、酸化反応をスムーズに進めることができる。ｐＨ６．０以上７．０未満が好ましく、ｐＨ６．６以上６．８以下がさらに好ましい。溶媒としては、上記ｐＨの範囲内に調製されたものであれば、特に限定はない。例えば、リン酸緩衝液が挙げられる。反応試薬中での濃度が、０．８Ｍ程度であることが好ましい。
　反応試薬中のｐＨ６．０以上７．０未満である溶媒とミセル封入化された化合物（１）又は化合物（２）と触媒との体積比は、２：２：１であることが好ましい。溶媒がこの割合よりも増えると、酸化反応性が下がるためである。
＜＜標的である水溶性生体高分子のヒドロキシ基を選択的に酸化する方法＞＞
一実施形態において、本発明は、上述の酸化反応試薬を用いて、標的である水溶性生体高分子のヒドロキシ基を選択的に酸化する方法を提供する。
　本実施形態によれば、生体内環境を反映した水系溶媒中において、温和な条件で水溶性生体高分子中のヒドロキシ基を選択的に酸化することができる。
　本発明及び本明細書において、「水溶性生体高分子」とは、水系溶媒中に溶解可能な生体内に存在する高分子の有機化合物を意味し、例えば、タンパク質や核酸が挙げられる。
　図１は、ミセル封入化されたＢＡＩＢを含有する酸化剤及びＡＺＡＤＯＬ（登録商標）を用いたヒドロキシメチルシトシンの酸化反応を示した模式図である。上述の酸化反応試薬を用いて、標的である水溶性生体高分子のヒドロキシ基を選択的に酸化する方法について、図１を用いながら、以下に詳細を説明する。
　まず、標的である水溶性生体高分子を含む溶液と、上述の酸化反応試薬を混合し、静置する。本実施形態における酸化反応は、温和な条件で実施できることが特徴であり、反応温度としては、４℃以上４０℃以下で行うことができ、４℃以上２５℃以下で行うことが好ましい。４℃以上である場合、試薬や緩衝液の塩の沈殿を防ぐことができ、２５℃以下である場合、反応速度を保ちながら基質分解などの副反応を防ぐことができる。また、反応時間は、標的である水溶性生体高分子の大きさや量によって変化するが、３０分以上４時間以内が好ましい。
　標的である水溶性生体高分子と酸化反応試薬との混合液中において、ミセル封入化されたＢＡＩＢは、ＡＺＡＤＯＬ（登録商標）のヒドロキシ基を選択的に酸化する。酸化されたＡＺＡＤＯＬ（登録商標）は、ＡＺＡＤＯを経て活性種であるオキソアンモニウム塩となる。このオキソアンモニウム塩は、標的である水溶性生体高分子のヒドロキシ基を選択的に酸化する。
　よって、標的である水溶性生体高分子を含む溶液と、上述の酸化反応試薬を混合し、温和な条件で反応させることにより、ヒドロキシ基がホルミル基又はケトン基に酸化された標的である水溶性生体高分子を得ることができる。
＜＜標的である水溶性生体高分子のヒドロキシ基を選択的に酸化するためのキット＞＞
　一実施形態において、本発明は、標的である水溶性生体高分子のヒドロキシ基を選択的に酸化するためのキットであって、ヨードベンゼンを基本構造に有し、疎水性である超原子価ヨウ素化合物（化合物（１）又は化合物（２））と、界面活性剤と、アセトニトリルと、ヘテロ原子として窒素を１つ有し、該窒素にヒドロキシ基が結合している脂環式複素環を有する化合物である触媒と、ｐＨ６．０以上７．０未満である溶媒と、を備えるキットを提供する。
　本実施形態のキットによれば、生体内環境を反映した水系溶媒中において、温和な条件で水溶性生体高分子中のヒドロキシ基を選択的に酸化することができる。
　本実施形態において、化合物（１）又は化合物（２）、及び触媒は粉末状であることが好ましい。上述の通り、ミセル封入化された化合物（１）又は化合物（２）を含有する酸化剤は、使用直前に製造することが好ましい。
　また、触媒については、水に溶けにくい性質を有しているため、アセトニトリルと触媒とを体積比１：１で混合し、溶媒に溶解するとよい。触媒は、５ｍｇ／ｍＬ以上１０ｍｇ／ｍＬ以下の濃度で調製し、反応溶液中において、終濃度が１ｍｇ／ｍＬ以上２ｍｇ／ｍＬ以下となるように混合すればよい。
　界面活性剤は、５％程度の濃度の液体であることが好ましい。ミセル封入化された化合物（１）又は化合物（２）の製造時に、終濃度が２％以上５％以下となるように使用すればよい。
アセトニトリルは、１００％程度の濃度の液体であることが好ましい。ミセル封入化されたＢＡＩＢの製造時に、終濃度が１０％程度となるように使用すればよい。
　ｐＨ６．０以上７．０未満である溶媒は、２Ｍ程度の濃度の液体であることが好ましい。反応溶液中において、０．８Ｍ程度の濃度となるように使用すればよい。
　標的である水溶性生体高分子については、上述の通り、例えば、タンパク質や核酸が挙げられ、ＤＮＡを使用する場合には、反応溶液中において、５ｐＭ以上１０ｐＭ以下の濃度となるように調製することが好ましい。
＜＜二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンを検出するためのキット＞＞
　一実施形態において、本発明は、二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンを検出するためのキットであって、ヨードベンゼンを基本構造に有し、疎水性である超原子価ヨウ素化合物（化合物（１）又は化合物（２））と、界面活性剤と、アセトニトリルと、ヘテロ原子として窒素を１つ有し、該窒素にヒドロキシ基が結合している脂環式複素環を有する化合物である触媒と、ｐＨ６．０以上７．０未満である溶媒と、バイサルファイトと、前記二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンを含む領域を増幅するためのフォワード及びリバースプライマーセットと、を備えるキットを提供する。
　本実施形態のキットによれば、二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンを容易に検出することができる。
　本実施形態において、化合物（１）又は化合物（２）、界面活性剤、アセトニトリル、触媒、及び溶媒については、上述のとおりである。
　本明細書において、「バイサルファイト」とは、亜硫酸水素塩を意味し、二本鎖ポリヌクレオチド中のシトシン塩基をウラシル塩基に置換するためのものである。
　図２は、バイサルファイトによりシトシン塩基がウラシル塩基に変換する反応工程を示した図である。また、ヒドロキシメチルシトシンについても、ヒドロキシ基がホルミル基に酸化されることで、バイサルファイトによりウラシルに変換することが知られている。
　本実施形態のキットは、二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンを含む領域を増幅するためのフォワード及びリバースプライマーセットを備える。前記プライマーセットの塩基配列については、標的となる二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンを含む領域により、適宜設計することができる。
　本実施形態のキットは、１つまたは複数の対照細胞及び核酸のうち少なくともいずれかを含んでいてもよい。例えば、対照核酸には、ある動物の本質的にすべての細胞においてアクセス可能である（例えば、ハウスキーピング遺伝子配列またはそのプロモーター）か、またはある動物のほとんどの細胞においてアクセス不能であるかのいずれかである遺伝子配列を含むものが含まれる。
　本実施形態のキットは、そのような遺伝子配列を増幅するためのプライマーの１つまたは複数のセットを（遺伝子配列または細胞がキットに実際に含まれるか否かにかかわらず）含んでいてもよい。
　本実施形態のキットは、ＤＮＡ修飾剤、細胞透過処理剤及び細胞崩壊剤のうち少なくともいずれか、並びに対照ＤＮＡ領域を増幅するための１つまたは複数のプライマーセットを含んでいてもよい。
　例えば、前記ＤＮＡ修飾剤が制限酵素である場合において、１つのＤＮＡ領域当たりに、制限酵素の潜在的な切断部位を少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つ、４つなど）含むＤＮＡ領域の一部分を増幅するための（例えば、修飾されていないコピーの数を計算するために有用な）第１のプライマーセット、及び、潜在的な切断部位を含まないＤＮＡ領域の一部分を増幅するための（例えば、コピーの総数を計算するために有用な）少なくとも第２のプライマーセットからなる少なくとも２つのプライマーセットを含めることができる。
本実施形態のキットは、以下のもののうち１つまたは複数を含んでいてもよい。
（ｉ）細胞膜の透過処理剤または崩壊剤；
（ｉｉ）制限酵素、ＤＮアーゼ又は他のＤＮＡ修飾剤；
（ｉｉｉ）修飾剤による更なる修飾を防止することのできる「停止」用溶液；
（ｉｖ）核酸の抽出及び精製のうち少なくともいずれかを行うための材料（例えば、ゲノムＤＮＡの精製のため、及び「停止」用溶液の成分などの非ＤＮＡ成分の除去のうち少なくともいずれかを行うためのスピンカラム）；
（ｖｉ）ＤＮＡのＰＣＲ又はｑＰＣＲ増幅のための試薬、（さらに、任意で、テンプレート及びポリメラーゼのうち少なくともいずれかの他にＰＣＲ又はｑＰＣＲのために必要なすべての成分を含む１つの混合物）
＜＜二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンを検出する方法＞＞
　一実施形態において、本発明は、二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンを検出する方法であって、
　（Ａ）ヒドロキシメチルシトシンを有する二本鎖ポリヌクレオチドを含有する試料と、上述の酸化剤と、ヘテロ原子として窒素を１つ有し、該窒素にヒドロキシ基が結合している脂環式複素環を有する化合物である触媒と、ｐＨ６．０以上７．０未満である溶媒と、を混合し、ヒドロキシメチルシトシンを酸化し、ホルミルシトシンに変換する工程と、
　（Ｂ）前記変換されたホルミルシトシンを有する二本鎖ポリヌクレオチドを含有する試料をバイサルファイトにより処理し、ホルミルシトシンをウラシルに変換する工程と、
　（Ｃ）前記変換されたウラシルを有する二本鎖ポリヌクレオチドに、前記二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンを含む領域を増幅するためのフォワード及びリバースプライマーを添加し、増幅する工程と、
　（Ｄ）酸化剤を添加せずに工程（Ａ）～（Ｃ）を行った二本鎖ポリヌクレオチドを含有する試料をコントロールとして比較し、二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンを検出する工程と、を備える検出方法を提供する。
　本実施形態によれば、二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンを容易に検出することができる。
　本実施形態の検出方法について、以下に詳細を説明する。
　まず、ヒドロキシメチルシトシンを有する二本鎖ポリヌクレオチドを含有する試料と、ミセル封入化されたＢＡＩＢを含有する酸化剤と、触媒と、ｐＨ６．０以上７．０未満である溶媒と、を混合する（工程Ａ）。上述の＜酸化反応試薬＞と同様に、ｐＨ６．０以上７．０未満である溶媒とミセル封入化された化合物（１）又は化合物（２）と触媒との体積比は、２：２：１であることが好ましい。
　また、上述の＜標的である水溶性生体高分子のヒドロキシ基を選択的に酸化する方法＞と同様に、室温で行うことが好ましい。また、反応時間についても、標的である水溶性生体高分子の大きさや量によって変化するが、３０分以上４時間以内が好ましい。
　図３は、二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンとメチルシトシンについて、酸化反応及びバイサルファイト処理前後での変化を比較した図である。
　反応溶液中において、二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシン（２）は酸化されて、ホルミルシトシン（３）に変換する（工程Ａ）。一方、メチルシトシン（１）は、酸化反応及びバイサルファイト処理後においても変化せずメチルシトシンのままである。
　ホルミルシトシン（３）に変換後、酸化剤を除去する工程を行うことが好ましい。具体的には、有機溶剤などにより二本鎖ポリヌクレオチドを抽出し、スピンカラムなどを用いて精製する方法が挙げられる。
　次に、反応溶液にバイサルファイト処理を行う。反応条件は、８０℃以上１００℃未満の温度で３０分以上１時間以下行うことが好ましい。反応溶液中において、二本鎖ポリヌクレオチド中のホルミルシトシン（３）は、スルホン化され、さらに、加水的な脱アミノ反応により、スルホン化ウラシルに変換する。続いて、アルカリ処理でスルホン基を除去され、ウラシル（４）に変換する（工程Ｂ）。
　続いて、バイサルファイト処理を行った二本鎖ポリヌクレオチドに、前記二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンを含む領域を増幅するためのフォワード及びリバースプライマーを添加し、ＰＣＲ又はｑＰＣＲ等により増幅する（工程Ｃ）。
　ＰＣＲ又はｑＰＣＲの条件については、二本鎖ポリヌクレオチドの長さや配列特性に応じて、公知の方法に従って当業者が決定できる。
　続いて、酸化剤を添加せずに工程（Ａ）～（Ｃ）を行った二本鎖ポリヌクレオチドを含有する試料をコントロールとして、サンガーシークエンス法により、塩基配列を比較する（工程Ｄ）。コントロールと比較することにより、二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンを検出することができる。
　ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）は遺伝子発現のｏｎ又はｏｆｆに関与すると考えられており、その存在量は細胞の種類に拠り大きく異なる。また、最も多量に存在するのは中枢神経系であることが知られている。また、マウス海馬及び小脳では５ｈｍＣ含有量は加齢とともに増加することが知られている。よって、５ｈｍＣの検出は、エピジェネティクス分野において注目されている。
　本明細書中において、「エピジェネティクス」とは、ＤＮＡの配列変化によらない遺伝子発現を制御及び伝達するシステム、並びにその学術分野を意味し、細胞分裂を通して娘細胞に受け継がれるという遺伝的な特徴を持ちながらも、ＤＮＡ塩基配列の変化（突然変異）とは独立した機構である。このような制御は、化学的に安定した修飾である一方、食事、大気汚染、喫煙、酸化ストレスへの暴露などの環境要因によって動的に変化する。つまり、エピジェネティクスは、遺伝子と環境要因の架け橋となる機構であると考えられる。
　したがって、５ｈｍＣを検出することにより、病気の発症の有無や症状の程度に差、又は、幹細胞及び再生医学研究などへの大きな寄与が期待できる。
　以上、この発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、この発明の要旨を逸脱しない範囲の構成等も含まれる。
　以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳述するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
１－１．酸化剤の調製
　５％ＳＤＳ水溶液（０．９ｍＬ）と、１００％アセトニトリル（０．１ｍＬ）の混合溶液に粉末ＢＡＩＢ（Ｗａｋｏ社製）（２０ｍｇ）を添加し、氷を浮かべた超音波攪拌機にて、１０分前後振盪撹拌した。液色が黄色を呈したら、超音波攪拌機内の氷を除去し、室温でさらに振盪撹拌して完全溶解させ、ミセル封入化されたＢＡＩＢを含む酸化剤を得た。酸化剤中には、４．５％ＳＤＳ、１０％アセトニトリル、２０ｍｇ／ｍＬ　ＢＡＩＢが含有していた。
　また、ＢＡＩＢが封入されたミセルを、動的光散乱装置を用いて測定したところ、粒子径が約１８ｎｍであり、透過型電子顕微鏡を用いて測定したところ、粒子径が約２６ｎｍであった。
１－２．触媒の調製
　１００％アセトニトリル（０．２５ｍＬ）、水（０．２５ｍＬ）の混合溶液に、粉末ＡＺＡＤＯＬ（Ｗａｋｏ社製）（５ｍｇ）を添加し、超音波攪拌機にて、１０分前後振盪撹拌し、触媒溶液を得た。触媒溶液中には、５０％アセトニトリル、１０ｍｇ／ｍＬ　ＡＺＡＤＯＬが含有していた。
１－３．基質ＤＮＡ中のヒドロキシルメチルシトシンの酸化反応
　基質として使用した１０ｂｐの二本鎖ＤＮＡ（ＧｅｎｅＤｅｓｉｇｎ社製）の塩基配列を表１に示した。基質ＤＮＡはそれぞれ、緩衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ）に溶解した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　各基質ＤＮＡ（０．６ｎｍｏｌ）が溶解された試料溶液（１μＬ）、２Ｍ　リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）（２４μＬ）、２０ｍｇ／ｍＬ　ＢＡＩＢ（２４μＬ）及び１０ｍｇ／ｍＬ　ＡＺＡＤＯＬ（１２μＬ）をＰＣＲ用チューブに添加し、混合した後、氷により低温に保持した槽において、３０分静置して、酸化反応を行った。酸化反応を停止するために、アニリン（１２０μＬ）を添加し、ボルテックスにかけた。卓上遠心分離機にて遠心分離後、上層にある褐色の有機層を除去し、トルエン（１２０μＬ）を添加して、残留酸化剤を除去する工程を３回繰り返した。また、コントロールとして、酸化剤を加えないものも用意した。
１－４．バイサルファイト処理
　抽出された基質ＤＮＡを含有する溶液に１０Ｍ　バイサルファイト（１２０μＬ）を添加し、９０℃で１時間保持した。続いて、ＯＤＳ－ＨＰＬＣによりＤＮＡを精製した。０．２Ｍ　ＮａＯＨ（１０μＬ）を添加し、３７℃で３０分間静置して、脱スルホン酸処理を行った。得られた基質ＤＮＡを含有する溶液をＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ（ＪＥＯＬ社製　ＪＭＳ－Ｔ１００ＬＰ）を用いて分析した。結果を図４に示した。
　図４において、Ａ，Ｃ，Ｅは酸化反応を行ったものであり、５’末端が酸化され、カルボキシル基に変換している。また、Ｂ，Ｄ，Ｆはコントロールとして酸化反応を行わなかったものである。
　図４のＡとＢを比較すると、酸化反応を行ったものでは、５’末端から数えて６番目に位置するヒドロキシメチルシトシンがウラシルに変換したが、コントロールでは、メチルスルホン酸シトシンであり、ウラシルに変換していなかった。
また、図４のＡとＣを比較すると、マススペクトルのピーク値は同一であった。
さらに、図４のＥとＦから、メチルシトシンについては、酸化反応による影響は見られなかった。
　以上から、ミセル封入化されたＢＡＩＢ及びＡＺＡＤＯＬを用いることで、ヒドロキシメチルシトシンが酸化されることが確かめられた。また、酸化反応を行ったものと行わなかったものを比較することで、ヒドロキシメチルシトシンの位置を同定できることが明らかとなった。
［実施例２］
２－１．酸化剤の調製
　実施例１の１－１．と同様の方法により調製した。
２－２．触媒の調製
　実施例１の１－２．と同様の方法により調製した。
２－３．基質ＤＮＡ中のヒドロキシルメチルシトシンの酸化反応
　基質として１００ｂｐの二本鎖ＤＮＡ（ＧｅｎｅＤｅｓｉｇｎ社製）を使用した。塩基配列は、センス鎖を配列番号５に、アンチセンス鎖を配列番号６示した。図５Ａは、基質である１００ｂｐの二本鎖ＤＮＡ中のヒドロキシメチルシトシン及びメチルシトシンの位置と、酸化反応及びバイサルファイト処理による基質ＤＮＡ中のシトシン及びヒドロキシメチルシトシンからウラシルへの変換を示した模式図である。
　基質ＤＮＡ（０．１ｎｍｏｌ）が溶解された試料溶液（０．５μＬ）、２Ｍ　リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）（２０μＬ）、２０ｍｇ／ｍＬ　ＢＡＩＢ（２０μＬ）及び１０ｍｇ／ｍＬ　ＡＺＡＤＯＬ（１０μＬ）をＰＣＲ用チューブに添加し、混合した後、氷により低温に保持した槽において、３０分、１時間、４時間、１２時間と時間をふって、酸化反応を行った。酸化反応を停止するために、アニリン（１００μＬ）を添加し、ボルテックスにかけた。卓上遠心分離機にて遠心分離後、上層にある褐色の有機層を除去し、トルエン（１００μＬ）を添加して、基質ＤＮＡを抽出する工程を３回繰り返した。また、コントロールとして、酸化反応を行わないものも用意した。
２－４．バイサルファイト処理
　抽出された基質ＤＮＡを含有する溶液に１０Ｍ　バイサルファイト（１００μＬ）を添加し、９０℃で１時間保持した。続いて、ＥＺ　ＤＮＡ　Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ｋｉｔ（ＺＹＭＯ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いて、精製した。
２－５．基質ＤＮＡの増幅
　精製された基質ＤＮＡをＰＣＲにより増幅した。酵素としては、Ｔａｑポリメラーゼを使用し、プライマーの塩基配列は表２を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　増幅されたＰＣＲ産物をＰＣＲ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔを用いて、精製した。
２－６．サンガーシークエンス法によるヒドロキシルメチルシトシンの検出
　精製されたＰＣＲ産物をベクターに挿入し、サンガーシークエンス法により、塩基配列を同定した。結果を図５Ｂ及び図６に示した。
　図５Ｂ及び図６から、ヒドロキシメチルシトシンがウラシルへ変換した割合は、酸化反応時間に比例していることが明らかとなった。また、２つのヒドロキシメチルシトシンを含む１００ｂｐの基質ＤＮＡでは、４時間以上酸化反応を行うことで、基質ＤＮＡ中の約８６％のヒドロキシメチルシトシンがウラシルへ変換されることが明らかとなった。
以上の結果から、生体内環境を反映した水系溶媒中において、温和な条件で水溶性生体高分子中のヒドロキシ基を選択的に酸化できることが明らかとなった。また、二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンを容易に検出できることが明らかとなった。
　本発明によれば、生体内環境を反映した水系溶媒中において、温和な条件で水溶性生体高分子中のヒドロキシ基を選択的に酸化することができる。また、本発明によれば、二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンを容易に検出することができる。
　１…メチルシトシン（５ｍＣ）、２…ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）、３…ホルミルシトシン（５ｆＣ）、４…ウラシル

Claims (18)

  1. 界面活性剤によりミセル封入化されたヨードベンゼンを基本構造に有し、疎水性である超原子価ヨウ素化合物を含有する酸化剤。
  2. 　前記界面活性剤が、陰イオン界面活性剤である請求項１に記載の酸化剤。
  3. 　前記超原子価ヨウ素化合物がデス・マーチン試薬、又は２－ヨードキシ安息香酸である請求項１又は２に記載の酸化剤。
  4. 　前記ミセルの粒子径が５０ｎｍ以下である請求項１～３のいずれか一項に記載の酸化剤。
  5. 　界面活性剤によりミセル封入化された超原子価ヨウ素化合物の製造方法であって、
    　（ａ）前記超原子価ヨウ素化合物と、アセトニトリルと、界面活性剤と、溶媒とを混合し、４℃以上２５℃未満の温度で液色が透明から黄色を呈するまで振盪撹拌する工程と、
    　（ｂ）前記工程（ａ）後、さらに２５℃以上３０℃以下の温度で振盪撹拌する工程と、
    を備え、
    前記超原子価ヨウ素化合物はヨードベンゼンを基本構造に有し、疎水性である製造方法。
  6. 　前記超原子価ヨウ素化合物の濃度が２０ｍｇ／ｍＬ以上３０ｍｇ／ｍＬ以下である請求項５に記載の製造方法。
  7. 　請求項１～４のいずれか一項に記載の酸化剤と、
    　ヘテロ原子として窒素を１つ有し、該窒素にヒドロキシ基が結合している脂環式複素環を有する化合物である触媒と、
    　ｐＨ６．０以上７．０未満である溶媒と、
    を備える酸化反応試薬。
  8. 　請求項７に記載の酸化反応試薬を用いて、標的である水溶性生体高分子のヒドロキシ基を選択的に酸化する方法。
  9. 　標的である水溶性生体高分子のヒドロキシ基を選択的に酸化するためのキットであって、
    　ヨードベンゼンを基本構造に有し、疎水性である超原子価ヨウ素化合物と、
    　界面活性剤と、
    　アセトニトリルと、
    　ヘテロ原子として窒素を１つ有し、該窒素にヒドロキシ基が結合している脂環式複素環を有する化合物である触媒と、
    　ｐＨ６．０以上７．０未満である溶媒と、
    を備えるキット。
  10. 　二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンを検出するためのキットであって、
    　ヨードベンゼンを基本構造に有し、疎水性である超原子価ヨウ素化合物と、
    　界面活性剤と、
    　アセトニトリルと、
    　ヘテロ原子として窒素を１つ有し、該窒素にヒドロキシ基が結合している脂環式複素環を有する化合物である触媒と、
    　ｐＨ６．０以上７．０未満である溶媒と、
    　バイサルファイトと、
    　前記二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンを含む領域を増幅するためのフォワード及びリバースプライマーセットと、
    を備えるキット。
  11. 　二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンを検出する方法であって、
    　（Ａ）ヒドロキシメチルシトシンを有する二本鎖ポリヌクレオチドを含有する試料と、
    　請求項１～４のいずれか一項に記載の酸化剤と、
    　ヘテロ原子として窒素を１つ有し、該窒素にヒドロキシ基が結合している脂環式複素環を有する化合物である触媒と、
    　ｐＨ６．０以上７．０未満である溶媒と、
    を混合し、ヒドロキシメチルシトシンを酸化し、ホルミルシトシンに変換する工程と、
    　（Ｂ）前記変換されたホルミルシトシンを有する二本鎖ポリヌクレオチドを含有する試料をバイサルファイトにより処理し、ホルミルシトシンをウラシルに変換する工程と、
    　（Ｃ）前記変換されたウラシルを有する二本鎖ポリヌクレオチドに、前記二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンを含む領域を増幅するためのフォワード及びリバースプライマーを添加し、増幅する工程と、
    　（Ｄ）酸化剤を添加せずに工程（Ａ）～（Ｃ）を行った二本鎖ポリヌクレオチドを含有する試料をコントロールとして比較し、二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンを検出する工程と、
    を備える検出方法。
  12. 　界面活性剤によりミセル封入化されたヨードベンゼンジアセテートを含有することを特徴とする酸化剤。
  13. 　界面活性剤によりミセル封入化されたヨードベンゼンジアセテートの製造方法であって、
    　（ａ）ヨードベンゼンジアセテートと、アセトニトリルと、界面活性剤と、溶媒とを混合し、４℃以上２５℃未満の温度で液色が透明から黄色を呈するまで振盪撹拌する工程と、
    　（ｂ）前記工程（ａ）後、さらに２５℃以上３０℃以下の温度で振盪撹拌する工程と、
    を備える製造方法。
  14. 　請求項１２に記載の酸化剤と、
    　ヘテロ原子として窒素を１つ有し、該窒素にヒドロキシ基が結合している脂環式複素環を有する化合物である触媒と、
    　ｐＨ６．０以上７．０未満である溶媒と、
    を備える酸化反応試薬。
  15. 　請求項１４に記載の酸化反応試薬を用いて、標的である水溶性生体高分子のヒドロキシ基を選択的に酸化する方法。
  16. 　標的である水溶性生体高分子のヒドロキシ基を選択的に酸化するためのキットであって、
    　ヨードベンゼンジアセテートと、
    　界面活性剤と、
    　アセトニトリルと、
    　ヘテロ原子として窒素を１つ有し、該窒素にヒドロキシ基が結合している脂環式複素環を有する化合物である触媒と、
    　ｐＨ６．０以上７．０未満である溶媒と、
    を備えるキット。
  17. 　二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンを検出するためのキットであって、
    　ヨードベンゼンジアセテートと、
    　界面活性剤と、
    　アセトニトリルと、
    　ヘテロ原子として窒素を１つ有し、該窒素にヒドロキシ基が結合している脂環式複素環を有する化合物である触媒と、
    　ｐＨ６．０以上７．０未満である溶媒と、
    　バイサルファイトと、
    　前記二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンを含む領域を増幅するためのフォワード及びリバースプライマーセットと、
    を備えるキット。
  18. 　二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンを検出する方法であって、
    　（Ａ）ヒドロキシメチルシトシンを有する二本鎖ポリヌクレオチドを含有する試料と、
    　請求項１２に記載の酸化剤と、
    　ヘテロ原子として窒素を１つ有し、該窒素にヒドロキシ基が結合している脂環式複素環を有する化合物である触媒と、
    　ｐＨ６．０以上７．０未満である溶媒と、
    を混合し、ヒドロキシメチルシトシンを酸化し、ホルミルシトシンに変換する工程と、
    　（Ｂ）前記変換されたホルミルシトシンを有する二本鎖ポリヌクレオチドを含有する試料をバイサルファイトにより処理し、ホルミルシトシンをウラシルに変換する工程と、
    　（Ｃ）前記変換されたウラシルを有する二本鎖ポリヌクレオチドに、前記二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンを含む領域を増幅するためのフォワード及びリバースプライマーを添加し、増幅する工程と、
    　（Ｄ）酸化剤を添加せずに工程（Ａ）～（Ｃ）を行った二本鎖ポリヌクレオチドを含有する試料をコントロールとして比較し、二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンを検出する工程と、
    を備える検出方法。
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