WO2016190263A1 - 新規抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメント - Google Patents

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fab fragment
ngf antibody
antibody fab
antibody
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祐嗣 田中
大雅 藤田
俊明 青木
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アステラス製薬株式会社
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    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Definitions

  • the present invention relates to a novel anti-human NGF antibody Fab fragment.
  • the present invention also provides a polynucleotide comprising a base sequence encoding the anti-human NGF antibody Fab fragment, an expression vector comprising the polynucleotide, a host cell transformed with the expression vector, and the anti-human NGF antibody. It relates to a method for producing Fab fragments.
  • the present invention further relates to a pharmaceutical composition comprising the anti-human NGF antibody Fab fragment, and a method for treating postoperative pain using the anti-human NGF antibody Fab fragment.
  • Nerve growth factor is one of the humoral factors collectively called neurotrophic factor, and plays an important role in the generation, differentiation and maintenance of neurons in vivo.
  • NGF nerve growth factor
  • As an NGF receptor high affinity trkA (tropomyosin receptor kinase A) and low affinity p75NTR (p75 neurotrophin receptor) are known. Of these, p75NTR has been reported to bind to all neurotrophic factors and participate in apoptosis during neuronal development, but its role has not yet been fully elucidated.
  • p75NTR has been reported to bind to all neurotrophic factors and participate in apoptosis during neuronal development, but its role has not yet been fully elucidated.
  • trkA knockout mice Non-patent Document 1
  • Non-patent Document 2 It has been reported that pain is induced when NGF is administered to rats (Non-patent Document 2). Further, when NGF is intravenously administered to humans, systemic myalgia occurs, and systemic pain is caused by local administration of NGF. In addition, it has been reported that hyperalgesia and allodynia are induced at the site of administration (Non-patent Document 3). It is known that the expression level of NGF in animals increases due to tissue damage such as incision of muscle (Non-Patent Document 4) and skin (Non-Patent Document 5) tissues such as a rat postoperative pain model.
  • Non-patent Document 6 the level of NGF in the exudate at the time of cesarean section. It has been demonstrated that NGF levels are elevated in patients with rheumatoid arthritis (Non-patent document 8) and interstitial cystitis (Non-patent document 9). .
  • Examples of antibodies against human NGF that have been reported so far include REGN475 (Patent Document 2), 1-15 (N52D-A) -Fab′-PEG (Patent Document 3), and Fullanumab, which are fully human anti-human NGF antibodies.
  • Patent Literature 4 MEDI-578 (Patent Literature 5), Tanezumab (Patent Literature 6) and PG110 (Patent Literature 7) which are humanized anti-human NGF antibodies have been reported.
  • Tanezumab in addition to intravenous administration of Tanezumab in the clinical setting, it can show a wide range of analgesic effects on pain such as joint pain associated with osteoarthritis, chronic low back pain, and bladder pain associated with interstitial cystitis. It has been reported (Non-Patent Documents 11 to 13).
  • Non-Patent Document 11 As adverse events expressed by the administration of anti-NGF antibodies to humans, headache, upper respiratory tract infection, sensory abnormalities, etc. have been reported in a clinical trial of Tanezumab (Non-patent Document 11), and sensory disturbances in a clinical trial of Fullanumab, Headache, nasopharyngitis, etc. have been reported (Non-Patent Document 14). Furthermore, in clinical trials of REGN475, joint pain, hypersensitivity, muscle pain, peripheral edema, joint swelling, etc. have been reported (Non-Patent Document 15). .
  • Non-patent Document 16 Many antibody pharmaceuticals are administered to sites such as subcutaneous or intramuscular in addition to administration into blood vessels such as veins. These are administered subcutaneously or intramuscularly and then quickly migrated into the blood via lymphatic vessels. Many antibody drugs are transported to the target tissue via blood circulation after exertion into the blood and exert pharmacological action. In addition, the distribution of many antibody drugs is high in blood, and the transferability from the blood to the target tissue (tissue / blood concentration ratio) is low. Therefore, in order for many antibody pharmaceuticals to maintain the working concentration of the target tissue, it is necessary to maintain a high blood concentration (Non-patent Document 16).
  • antibody pharmaceuticals have a blood half-life of several days to one month, and maintain a long-term blood concentration, thereby maintaining a long-term pharmacological action. Therefore, even if a normal antibody drug is administered to a local site such as subcutaneously or intramuscularly, most of the antibody drug remains in the blood and circulates throughout the body, thereby exhibiting systemic efficacy and side effects.
  • An object of the present invention is to provide an excellent anti-human NGF antibody Fab fragment that retains a high neutralizing activity and exhibits local medicinal effects while reducing systemic side effects due to systemic exposure.
  • the present invention includes the following inventions as medically or industrially useful substances / methods.
  • the present invention may be as follows.
  • An anti-human NGF antibody Fab fragment selected from the group consisting of the following (a) and (b): (A) an anti-human NGF antibody Fab fragment comprising a heavy chain fragment comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 and a light chain comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8; and (b) the anti-human NGF antibody of (a) Anti-human NGF antibody Fab fragment generated by post-translational modification of the Fab fragment.
  • the anti-human NGF antibody Fab fragment according to (1) above comprising a heavy chain fragment consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 and a light chain consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8.
  • the host cell according to (7) above which is selected from the group consisting of the following (a) and (b): (A) a polynucleotide comprising a base sequence encoding the heavy chain fragment of the anti-human NGF antibody Fab fragment described in (1) above, and a polynucleotide comprising a base sequence encoding the light chain of the anti-human NGF antibody Fab fragment; A host cell transformed with an expression vector comprising: and (b) an expression vector comprising a polynucleotide comprising a nucleotide sequence encoding a heavy chain fragment of the anti-human NGF antibody Fab fragment described in (1) above and the anti-human A host cell transformed with an expression vector comprising a polynucleotide comprising a base sequence encoding the light chain of an NGF antibody Fab fragment.
  • a method for producing an anti-human NGF antibody Fab fragment comprising culturing the host cell according to (8) above and expressing the anti-human NGF antibody Fab fragment.
  • An anti-human NGF antibody Fab fragment that can be produced by the method described in (9) above.
  • a pharmaceutical composition comprising the anti-human NGF antibody Fab fragment according to any one of (1) to (4) and (10) above, and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutical composition according to (11) above which is a topical pharmaceutical composition for treating postoperative pain.
  • a pharmaceutical composition comprising the anti-human NGF antibody Fab fragment described in (2) above, the anti-human NGF antibody Fab fragment described in (4) above, and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a method for treating postoperative pain comprising administering an effective amount of the anti-human NGF antibody Fab fragment according to any one of (1) to (4) and (10) above to a subject.
  • the anti-human NGF antibody Fab fragment of the present invention is useful for the treatment of postoperative pain in which human NGF is involved in pathogenesis.
  • Such an anti-human NGF antibody Fab fragment of the present invention exhibits reduced dosage and prolonged sustained efficacy due to its excellent neutralization activity, high local retention and excellent pharmacokinetics such as rapid disappearance from the blood. Moreover, systemic side effects due to systemic exposure are reduced, and it is expected to show a very excellent improvement in both drug efficacy and safety in clinical application.
  • the anti-human NGF antibody Fab fragment of the present invention greatly contributes to the treatment of postoperative pain involving human NGF.
  • the basic structure of antibody molecules is common to each class, and consists of heavy chains with a molecular weight of 50,000 to 70,000 and light chains with a molecular weight of 20,000 to 30,000.
  • the heavy chain is usually composed of a polypeptide chain containing about 440 amino acids, has a characteristic structure for each class, and corresponds to IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, ⁇ , ⁇ , ⁇ , ⁇ . It is called a chain.
  • IgG includes IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4, which are called ⁇ 1, ⁇ 2, ⁇ 3, and ⁇ 4, respectively.
  • the light chain is usually composed of a polypeptide chain containing about 220 amino acids, and two types of L-type and K-type are known and are called ⁇ and ⁇ chains, respectively.
  • the peptide structure of the basic structure of an antibody molecule has a molecular weight of 150,000 to 190,000, in which two heavy chains and two light chains that are homologous are linked by a disulfide bond (SS bond) and a non-covalent bond, respectively. .
  • the two light chains can be paired with any heavy chain.
  • Each antibody molecule always consists of two identical light chains and two identical heavy chains.
  • variable region The domain located at the N-terminus of both heavy and light chains is called a variable region because its amino acid sequence is not constant even if it is a specimen from the same class (subclass) of the same species.
  • VH heavy chain variable region
  • VL light chain variable region
  • the amino acid sequence on the C-terminal side of the variable region is almost constant for each class or subclass and is called a constant region, and each domain is represented as CH1, CH2, CH3, or CL, respectively.
  • the antigen-determining site of an antibody is composed of VH and VL, and the binding specificity depends on the amino acid sequence of this site.
  • biological activities such as binding to complement and various cells reflect differences in the structure of the constant region of each class Ig.
  • CDRs complementarity determining regions
  • FR framework region
  • the region between the CH1 and CH2 domains of the heavy chain constant region of an antibody is called the hinge region, and this region contains a number of proline residues and a plurality of interchain SSs connecting two heavy chains. Includes bonds.
  • each of the human IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4 hinge regions has two, four, eleven, and two cysteine residues that constitute SS bonds between heavy chains, respectively.
  • the hinge region is a region that is highly sensitive to proteolytic enzymes such as papain and pepsin.
  • the heavy chain When the antibody is digested with papain, the heavy chain is cleaved at a position N-terminal to the S—S bond between the heavy chains in the hinge region and decomposed into two Fab fragments and one Fc fragment.
  • the Fab fragment is composed of a heavy chain fragment comprising a light chain, a heavy chain variable region (VH), a CH1 domain and a portion of the hinge region.
  • VH heavy chain variable region
  • the heavy chain When the antibody is digested with pepsin, the heavy chain is cleaved at a position on the C-terminal side of the S—S bond between heavy chains in the hinge region, and an F (ab ′) 2 fragment is generated.
  • the F (ab ′) 2 fragment is a fragment of a dimeric structure in which two Fab ′ fragments are linked by an inter-heavy chain SS bond in the hinge region.
  • the Fab ′ fragment is composed of a heavy chain fragment comprising a light chain, a heavy chain variable region (VH), a CH1 domain and a part of the hinge region, and this hinge region has an inter-heavy chain SS bond. Constructed cysteine residues are included.
  • the Fab fragment, F (ab ′) 2 fragment, and Fab ′ fragment all contain a variable region and have antigen binding activity.
  • the anti-human NGF antibody Fab fragment of the present invention that the present inventors have successfully produced is a Fab fragment having the following characteristics: An anti-human NGF antibody Fab fragment comprising a heavy chain fragment consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 and a light chain consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8.
  • NGF antibody 1-15 N52D-A -Fab ′ fragment
  • Patent Document 3 1-15 (N52D-A) -Fab ′ in the same document.
  • the anti-human NGF antibody Fab fragment that retains stable and high neutralizing activity and local retention by screening antibodies using various biological activity tests and physical property tests.
  • a human NGF antibody Fab fragment was successfully identified.
  • the anti-human NGF antibody Fab fragment of the present invention can be easily prepared by those skilled in the art using methods known in the art based on the sequence information disclosed in the present specification.
  • the anti-human NGF antibody Fab fragment of the present invention is prepared by synthesizing a polynucleotide containing a base sequence encoding a heavy chain fragment and a polynucleotide containing a base sequence encoding a light chain and ligating them to an appropriate expression vector. Next, the expression vector is introduced into cultured cells. Finally, the cultured cells can be cultured to obtain monoclonal Fab fragments from the culture supernatant.
  • the polynucleotide containing the base sequence encoding the heavy chain fragment of the Fab fragment of the present invention and the polynucleotide containing the base sequence encoding the light chain of the Fab fragment of the present invention are, for example, the amino acid sequences of the heavy chain fragment and the light chain Based on the base sequence designed based on the above, it is possible to synthesize using a gene synthesis method known in the art. As such a gene synthesis method, various methods known to those skilled in the art such as an antibody gene synthesis method described in WO 90/07861 can be used.
  • the polynucleotide containing the base sequence encoding the heavy chain fragment of the anti-human NGF antibody Fab fragment consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 includes, for example, the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • a polynucleotide is mentioned.
  • the polynucleotide containing the base sequence which codes the light chain of the anti-human NGF antibody Fab fragment which consists of an amino acid sequence shown by sequence number 8 the polynucleotide containing the base sequence shown by sequence number 4 is mentioned, for example.
  • polynucleotide comprising the base sequence encoding the heavy chain fragment of the Fab fragment of the present invention and the polynucleotide comprising the base sequence encoding the light chain of the Fab fragment of the present invention
  • introduction of the polynucleotide into an expression vector Introduction of expression vectors into cultured cells, culture of cultured cells, purification of Fab fragments, and the like can be performed using various methods known in the art.
  • Examples of the expression vector to be used include GS vector pEE6.4 and pEE12.4 (Lonza), and a polynucleotide containing a base sequence encoding the heavy chain fragment of the Fab fragment of the present invention and / or the present vector.
  • the polynucleotide is not particularly limited as long as it can express a polynucleotide containing a base sequence encoding the light chain of the Fab fragment of the invention and produce a polypeptide encoded by these.
  • the above expression vector is introduced into cultured cells by, for example, the calcium phosphate method, the electroporation method, or the like.
  • cultured cells into which the expression vector is introduced for example, cultured cells such as CHO-K1SV cells, CHO-DG44 cells, and 293 cells can be used, and these can be cultured by a conventional method.
  • Fab fragments accumulated in the culture supernatant can be purified by various column chromatography.
  • column chromatography by KappaSelect or the like can be used.
  • anti-human NGF antibody Fab fragment of the present invention examples include h1f. 6 antibodies.
  • the anti-human NGF antibody Fab fragment of the present invention may also include an anti-human NGF antibody Fab fragment generated by post-translational modification.
  • An example of an anti-human NGF antibody Fab fragment of the present invention that can be generated by post-translational modification includes the N-terminal pyroglutamylated anti-human NGF antibody Fab fragment of the heavy chain variable region. It is known in the art that such post-translational modification by N-terminal pyroglutamylation does not affect the activity of the antibody (Anal. Biochem., 2006, Vol. 348, p. 24- 39).
  • the anti-human NGF antibody Fab fragments of the present invention also include the following anti-human NGF antibody Fab fragments: An anti-human NGF antibody Fab fragment comprising a heavy chain fragment consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 and a light chain consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 wherein glutamine of amino acid number 1 of SEQ ID NO: 5 is modified with pyroglutamic acid .
  • the anti-human NGF antibody Fab fragment of the present invention binds to human NGF.
  • Methods for measuring the binding activity of the obtained anti-human NGF antibody Fab fragment to human NGF include methods such as ELISA and FACS.
  • human NGF is immobilized on an ELISA plate, a Fab fragment is added thereto for reaction, a secondary antibody such as an anti-Kappa antibody labeled with biotin or the like, and alkaline phosphatase-labeled streptavidin.
  • the binding of the secondary antibody is identified by measuring the activity using a reagent that detects the activity (for example, in the case of alkaline phosphatase labeling, a chemiluminescent alkaline phosphatase substrate).
  • the anti-human NGF antibody Fab fragment of the present invention can bind to NGF derived from other animals (for example, mouse NGF) in addition to human NGF, and the binding activity to these proteins may be measured.
  • the anti-human NGF antibody Fab fragment of the present invention has neutralizing activity against human NGF.
  • neutralizing activity of an anti-human NGF antibody Fab fragment means an activity that inhibits any biological activity mediated by human NGF upon binding to human NGF; One or more biological activities of human NGF can be assessed as an indicator.
  • neutralizing activity includes, for example, binding inhibitory activity between human NGF and its receptor human trkA, and can be evaluated by using a method as described in Examples below.
  • In vivo tests can also be used to evaluate the effects of the anti-human NGF antibody Fab fragment of the present invention in more detail.
  • the in vivo drug efficacy of an anti-human NGF antibody Fab fragment can be evaluated using an analgesic effect test using a rat foot incision post-pain model.
  • a test for evaluating the binding activity with NGF using the tissue homogenate and a test for evaluating the binding inhibitory activity between NGF and its receptor trkA are performed.
  • the pharmacological activity of the anti-human NGF antibody Fab fragment in the tissue can also be confirmed.
  • it is possible to evaluate the maintenance of the local exposure of the Fab fragment and the reduction of the exposure to the whole body blood by conducting a drug concentration evaluation test in plasma and tissue.
  • the anti-human NGF antibody Fab fragment of the present invention is purified as necessary and then formulated in accordance with a conventional method, and can be used for the treatment of postoperative pain.
  • Post-surgical pain refers to pain resulting from or resulting from external trauma such as a wound, puncture, incision, laceration, or wound in an individual's tissue (whether invasive or non-invasive, all Resulting from surgical procedures).
  • post-operative pain does not include pain that occurs without external physical trauma (not due to or not derived from trauma).
  • Postoperative pain is internal or external (including peripheral) pain, and wounds, incisions, trauma, lacerations or incisions are incidental (for traumatic wounds) or intentionally (for surgical incisions) Can happen. Pain can be objectively and subjectively assessed using pain scores and other methods well known in the art.
  • postoperative pain includes allodynia (ie, increased response to a normally non-noxious stimulus) and hyperalgesia (ie, increased response to a normally noxious or unpleasant stimulus). These may be of thermal or mechanical nature. Pain is characterized by heat sensitivity, sensitivity to mechanical stimuli and / or resting pain. Postoperative pain includes pain induced by mechanical stimulation and resting pain.
  • the anti-human NGF antibody Fab fragment of the present invention can be used as a therapeutic agent for postoperative pain.
  • the dosage form of this therapeutic agent include parenteral agents such as injections, infusions, and depots, and it is preferable to administer by intramuscular injection, subcutaneous injection or the like to the target tissue.
  • parenteral agents such as injections, infusions, and depots
  • carriers and additives corresponding to these dosage forms can be used within a pharmaceutically acceptable range.
  • the addition amount of the anti-human NGF antibody Fab fragment of the present invention in the above formulation varies depending on the degree and age of the patient's symptoms, the dosage form of the formulation used, the antibody binding titer, etc., for example, 0.001 mg / Kg to 100 mg / kg may be used.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition comprising the anti-human NGF antibody Fab fragment of the present invention.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain a pharmaceutically acceptable carrier or additive.
  • the types of pharmaceutically acceptable carriers and additives are not particularly limited, and carriers and additives well known to those skilled in the art can be used.
  • the present invention relates to the anti-human NGF antibody Fab fragment of the present invention for use in the treatment of postoperative pain and the anti-human NGF antibody Fab fragment of the present invention for the manufacture of a pharmaceutical composition for the treatment of postoperative pain. Also related to use.
  • the present invention also relates to a method for treating postoperative pain comprising administering to a subject locally an effective amount of an anti-human NGF antibody Fab fragment of the present invention.
  • the “subject” is a human or other mammal that needs the treatment, and as a certain aspect, a human that needs the treatment.
  • the effective amount of the anti-human NGF antibody Fab fragment in the treatment method of the present invention may be the same amount as the added amount of the Fab fragment in the preparation.
  • the topical pharmaceutical composition of the present invention is a pharmaceutical composition that is administered and used at a site where treatment is desired, or a site adjacent to the region, particularly a target tissue such as an incised tissue at the time of surgery, or the vicinity thereof. means. For example, as described above, it can be administered by intramuscular injection, subcutaneous injection, or the like to the target tissue.
  • the anti-human NGF antibody Fab fragment of the present invention stays in the target tissue for a certain period of time, preferably 72 hours, and more preferably 24 hours.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain a plurality of types of anti-human NGF antibody Fab fragments of the present invention.
  • a pharmaceutical composition containing an anti-human NGF antibody Fab fragment that has not undergone post-translational modification and an anti-human NGF antibody Fab fragment produced by post-translational modification is also included in the present invention.
  • the pharmaceutical composition of the present invention also includes a pharmaceutical composition containing the anti-human NGF antibody Fab fragment of (a) and (b) below.
  • a pharmaceutical composition containing the anti-human NGF antibody Fab fragment of (a) and (b) below (A) an anti-human NGF antibody Fab fragment comprising a heavy chain fragment comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 and a light chain comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8; and (b) the anti-human NGF antibody of (a) Anti-human NGF antibody Fab fragment generated by post-translational modification of the Fab fragment.
  • the pharmaceutical composition of the present invention also includes a pharmaceutical composition containing the anti-human NGF antibody Fab fragment of (a) and (b) below.
  • A an anti-human NGF antibody Fab fragment comprising a heavy chain fragment consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 and a light chain consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8; and (b) of amino acid number 1 of SEQ ID NO: 5
  • An anti-human NGF antibody Fab fragment comprising a heavy chain fragment consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 and a light chain consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 in which glutamine is modified with pyroglutamic acid.
  • the present invention also includes a polynucleotide comprising a base sequence encoding the heavy chain fragment of the anti-human NGF antibody Fab fragment of the present invention, and a polynucleotide comprising a base sequence encoding the light chain of the anti-human NGF antibody Fab fragment of the present invention.
  • polynucleotide of the present invention and an expression vector containing either or both of them (hereinafter also referred to as “expression vector of the present invention”).
  • the expression vector of the present invention is a polynucleotide comprising a nucleotide sequence encoding the heavy chain fragment of the anti-human NGF antibody Fab fragment of the present invention in various prokaryotic and / or eukaryotic host cells and / or
  • the polynucleotide is not particularly limited as long as it can express a polynucleotide containing a base sequence encoding the light chain of the anti-human NGF antibody Fab fragment and produce a polypeptide encoded by these.
  • Examples of expression vectors to be used include plasmid vectors, virus vectors (eg, adenovirus, retrovirus) and the like.
  • the expression vector of the present invention is an expression vector comprising a polynucleotide comprising a base sequence encoding the heavy chain fragment of the anti-human NGF antibody Fab fragment of the present invention.
  • the expression vector of the present invention comprises a polynucleotide comprising a base sequence encoding the heavy chain fragment of the anti-human NGF antibody Fab fragment of the present invention and a base encoding the light chain of the anti-human NGF antibody Fab fragment.
  • the expression vector of the present invention may contain a promoter operably linked to the polynucleotide of the present invention.
  • a promoter for expressing a gene encoding the Fab fragment of the present invention or its heavy chain variable region and / or light chain variable region in bacteria when the host is Escherichia, for example, Trp promoter, lac promoter, Examples include recA promoter, ⁇ PL promoter, lpp promoter, tac promoter and the like.
  • promoters for expression in yeast include PH05 promoter, PGK promoter, GAP promoter, and ADH promoter.
  • promoters for expression in Bacillus include SL01 promoter, SP02 promoter, and penP promoter.
  • the host is a eukaryotic cell such as a mammalian cell, examples include SV40-derived promoters, retroviral promoters, heat shock promoters, and the like.
  • the expression vector of the present invention may further contain a start codon, a stop codon, a terminator region, and a replicable unit.
  • yeast, animal cells or insect cells are used as the host, the expression vector of the present invention may contain a start codon and a stop codon.
  • the enhancer sequence, the 5 ′ and 3 ′ untranslated regions of the gene encoding the anti-human NGF antibody Fab fragment of the present invention, a secretory signal sequence, a splicing junction, a polyadenylation site, or replicable Units may be included. Further, it may contain a selection marker (for example, tetracycline resistance gene, ampicillin resistance gene, kanamycin resistance gene, neomycin resistance gene, dihydrofolate reductase gene) that is usually used depending on the purpose.
  • a selection marker for example, tetracycline resistance gene, ampicillin resistance gene, kanamycin resistance gene, neomycin resistance gene, dihydrofolate reducta
  • the present invention also relates to a host cell transformed with the expression vector of the present invention.
  • the host cell used for the preparation of the transformant is not particularly limited as long as it is compatible with the above expression vector and can be transformed.
  • Examples of the host cell of the present invention include the following (a) and (b): (A) Expression comprising a polynucleotide comprising a base sequence encoding the heavy chain fragment of the anti-human NGF antibody Fab fragment of the present invention and a polynucleotide comprising a base sequence encoding the light chain of the anti-human NGF antibody Fab fragment A host cell transformed with the vector; and (b) an expression vector comprising a polynucleotide comprising a base sequence encoding the heavy chain fragment of the anti-human NGF antibody Fab fragment of the present invention, and a light chain of the anti-human NGF antibody Fab fragment.
  • the present invention also relates to a method for producing an anti-human NGF antibody Fab fragment, comprising culturing the host cell of the present invention and expressing the anti-human NGF antibody Fab fragment.
  • the host cells used in the method include the host cells (a) and (b) of the present invention.
  • transformed host cells can be cultured in a nutrient medium.
  • the nutrient medium preferably contains a carbon source, an inorganic nitrogen source or an organic nitrogen source necessary for the growth of the host cell.
  • the carbon source include glucose, dextran, soluble starch, and sucrose.
  • the inorganic or organic nitrogen source include ammonium salts, nitrates, amino acids, corn steep liquor, peptone, casein, and meat extract. , Soybean meal, potato extract and the like.
  • nutrients eg, inorganic salts (eg, calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, magnesium chloride), vitamins, etc.
  • antibiotics eg, tetracycline, neomycin, ampicillin, kanamycin, etc.
  • nutrients eg, inorganic salts (eg, calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, magnesium chloride), vitamins, etc.
  • antibiotics eg, tetracycline, neomycin, ampicillin, kanamycin, etc.
  • the host cell culture itself is performed by a known method.
  • the culture conditions such as temperature, pH of the medium and culture time are appropriately selected.
  • examples of the medium include MEM medium (Science, 1955, Vol. 122, p. 501-504) containing about 5 to 20% fetal bovine serum, DMEM medium (Virology, 1959, Vol. 8, 396-397), RPMI 1640 medium (J. Am. Med. Assoc., 1967, Vol. 199, p. 519-524), 199 medium (Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 1950) Vol.73, p.1-8) and the like can be used.
  • the pH of the medium is preferably about 6 to 8, and the culture is usually carried out at about 30 to 40 ° C. for about 15 to 72 hours, and if necessary, aeration and agitation can be performed.
  • the host is an insect cell, for example, Grace's medium containing fetal bovine serum (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, Vol. 82, p. 8404-8408) and the like can be mentioned. It is preferably 5-8.
  • the culture is usually carried out at about 20 to 40 ° C. for 15 to 100 hours, and if necessary, aeration or agitation can be performed.
  • a liquid medium containing the above nutrient source is appropriate.
  • a medium having a pH of 5 to 8 is preferable.
  • the host is E. coli.
  • preferable examples include LB medium and M9 medium (Mol. Col., Cold Spring Harbor Laboratory, Vol. 3, A2.2).
  • the culture can be performed usually at 14 to 43 ° C. for about 3 to 24 hours with aeration and agitation, if necessary.
  • the treatment can be performed usually at 30 to 40 ° C. for about 16 to 96 hours with aeration and stirring as necessary.
  • examples of the medium include Burkholder's minimal medium (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980, Vol. 77, p. 4504-4508), and the pH is 5-8. Is desirable.
  • the culture is usually carried out at about 20 to 35 ° C. for about 14 to 144 hours, and if necessary, aeration or agitation can be performed.
  • the method of producing the anti-human NGF antibody Fab fragment of the present invention includes the step of culturing the transformed host cell of the present invention to express the anti-human NGF antibody Fab fragment, and further, anti-human NGF antibody Fab fragment from the host cell.
  • Human NGF antibody Fab fragments can be recovered, preferably isolated and purified. Examples of isolation or purification methods include differences in molecular weight such as salt precipitation, solvent precipitation, and other methods that utilize solubility, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, sodium dodecyl sulfate (SDS) -polyacrylamide gel electrophoresis, and the like.
  • the anti-human NGF antibody Fab fragment of the present invention includes an anti-human NGF antibody Fab fragment that can be produced by the method for producing the anti-human NGF antibody Fab fragment of the present invention.
  • Example 1 Preparation of anti-human NGF antibody Fab fragment
  • Three types of gene fragments from VH to hinge region (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, and SEQ ID NO: 2) using an expression vector containing a polynucleotide encoding the heavy chain of 1-15 (N52D) -Fab ′ fragment (Patent Document 3) as a template
  • the three gene fragments were amplified using Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finzymes, F-530L).
  • the amplified region contains HindIII on the 5 ′ side and EcoRI on the 3 ′ side.
  • the heavy chain gene fragment thus obtained was digested with HindIII and EcoRI (both from NEB) and inserted into the expression vector pEE6.4.
  • the light chain gene has the same base sequence (SEQ ID NO: 4) as the light chain gene of the 1-15 (N52D-A) -Fab 'fragment, and the amino acid sequence encoded thereby is SEQ ID NO: 8. PEE12.4 containing this light chain gene fragment was used.
  • GS vector (pEE6.4) into which the heavy chain gene fragment of the anti-human NGF antibody Fab fragment was inserted, and GS vector (pEE12.4) into which the light chain gene fragment of the anti-human NGF antibody Fab fragment was inserted were used as restriction enzymes.
  • NotI and PvuI both from NEB.
  • ligation was performed using DNA Ligation Mix (Takara Bio Inc., 6023) to construct a GS vector in which both heavy chain and light chain gene fragments of the anti-human NGF antibody Fab fragment were inserted.
  • a sequence reaction was performed using the obtained plasmid DNA as a template, and the nucleotide sequence of the cloned heavy chain from the VH to the hinge region and the light chain from the VL to the CL region were confirmed.
  • the nucleotide sequences of the three heavy chains from the VH to the hinge region are shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3.
  • the amino acid sequences encoded thereby are shown in SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7, respectively.
  • the three types of anti-human NGF antibody Fab fragments are the heavy chain of SEQ ID NO: 1 and the light chain of SEQ ID NO: 4, the heavy chain of SEQ ID NO: 2, the light chain of SEQ ID NO: 4, and the heavy chain of SEQ ID NO: 3 and the light chain of SEQ ID NO: 4. Chains were made and each was h1f. 6 antibody, h1f. 7 antibody, h1f. There were 8 antibodies.
  • an anti-human NGF antibody Fab fragment was expressed by two methods, transient expression and constitutive expression.
  • transient expression CHO-K1SV cells (Lonza) cultured on CD-CHO medium (Invitrogen) were transfected with the GS vector using a MaxCyte electroporation apparatus (MaxCyte) for 7 days. Cultured. The anti-human NGF antibody Fab fragment was purified from the culture supernatant using KappaSelect (GE Healthcare, 17-5458-02).
  • the anti-human NGF antibody Fab fragment was expressed by transfecting CHO-K1SV cells with the GS vector cleaved with the restriction enzyme PvuI using electroporation.
  • the anti-human NGF antibody Fab fragment was purified from the culture supernatant using KappaSelect and confirmed by size exclusion chromatography and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. The purified h1f. As a result of mass spectrometry to confirm post-translational modification of antibody 6, most of the peaks were considered to be N-terminal pyroglutamylation.
  • Example 2 Evaluation of human NGF function inhibitory activity of each anti-human NGF antibody Fab fragment
  • a human NGF-trkA antagonistic ELISA was performed using binding inhibition of human NGF and its receptor trkA as an index.
  • Human trkA R & D Systems, 175-TK-050
  • PBS phosphate buffered saline
  • Nunkumaxisorp white 96 plates Nunkumaxisorp white 96 plates
  • the human trkA solid phase solution was removed by reverse centrifugation, and 200 ⁇ L of Blocker Casein in TBS (Thermo, 37532) was added per well. After incubating the plate at room temperature for 30 minutes, Blocker Casein in TBS was removed by reverse centrifugation.
  • Purified antibody samples diluted in 7 to 11 steps between about 200,000 ng / mL and about 2 ng / mL using PBS containing 0.1% bovine serum-derived albumin (BSA) were added with 700 ng / mL biotinylated human NGF, respectively. Equal amounts were mixed and 100 ⁇ L per well of sample incubated for 30 minutes at room temperature was added.
  • the biotinylated human NGF used here was biotinylated human EGF (R & D Systems, 256-GF-100 / CF) using EZ-Link NHS-PEG4-Biotin (Thermo, 21329).
  • EZ-Link NHS-PEG4-Biotin Thermo, 21329.
  • For biotinylation of human NGF add 1.25 ⁇ L of 5 mM NHS-PEG4-Biotin solution to 250 ⁇ L of 0.4 mg / mL human NGF solution, react on ice for 2 hours under light-shielded conditions, and then follow the manual.
  • the reaction solution was collected as a PBS solution using Amicon Ultra-0.5 mL 3K (Millipore, UFC500324) twice.
  • As a control PBS containing 0.1% BSA was prepared.
  • TBS Tris buffered saline
  • PBS Nacalai Tesque, 03953-95
  • Alkaline phosphatase-labeled streptavidin (Thermo, 21324) diluted 1000-fold with the solution was added at 100 ⁇ L per well.
  • the human NGF-trkA binding inhibition IC 50 values of the 8 antibodies are 0.30 ⁇ g / mL, 0.32 ⁇ g / mL, 0.30 ⁇ g / mL, and 0.28 ⁇ g / mL, respectively. It was almost the same.
  • Example 3 Evaluation of dimer formation by storage of each anti-human NGF antibody Fab fragment at 50 ° C for 14 days
  • Replace each antibody solution with pH 5, 6 and 7 buffer pH 5 and 6 are 20 mM citric acid and 120 mM NaCl, pH 7 is PBS
  • adjust to 10 mg / mL and store at 50 ° C for 14 days for stability Sex was evaluated.
  • Dimer formation in the sample before and after storage at 50 ° C. for 14 days was evaluated using LC1100 (Agilent Technology) and TSK gel Super Sw3000 (TOSOH, 2 mmID ⁇ 300 mm) size exclusion chromatography as a column. .
  • LC1100 Alent Technology
  • TSK gel Super Sw3000 TOSOH, 2 mmID ⁇ 300 mm
  • Use as a mobile phase a solution adjusted to pH 6.8 by adding hydrochloric acid to 0.1M disodium hydrogen phosphate, 0.2M L (+) arginate, using a flow rate of 0.075mL / min, and a temperature of 25 ° C. The measurement was performed at a detection wavelength of 280 nm and a reference wavelength of 360 nm.
  • the dimer increase rate of the 1-15 (N52D-A) -Fab ′ fragment was 5.4%, 17.0% and 18.2% under the conditions of pH 5, 6 and 7, respectively.
  • Significant dimer formation was also observed at pH.
  • the dimer increase rate of antibody 6 was 0.1%, 0.3%, 0.5%, h1f.
  • the dimer increase rate of antibody 7 is 0.1%, 0.3%, 0.4%, h1f.
  • the dimer increase rate of the 8 antibody was 0.1%, 0.5%, and 0.7% under the conditions of pH 5, 6, and 7, respectively.
  • Example 4 Evaluation of stability of human NGF function inhibitory activity by storage of each anti-human NGF antibody Fab fragment at 50 ° C for 14 days
  • Changes in human NGF-trkA binding inhibitory activity after storage of the 8 antibody were evaluated using the human NGF-trkA antagonistic ELISA described in Example 2.
  • the human NGF-trkA binding inhibition IC 50 values of the 8 antibodies after storage at 50 ° C. for 14 days were 0.47 ⁇ g / mL, 0.38 ⁇ g / mL, 0.56 ⁇ g / mL, and 0.47 ⁇ g / mL, respectively.
  • the IC 50 increase rates of each antibody after storage at 50 ° C. for 14 days before storage were 59%, 21%, 87%, and 68%, respectively.
  • h1f. 6 antibody h1f. 7 antibody
  • h1f. 8 antibody significantly reduced the dimer increase that occurs with the 1-15 (N52D-A) -Fab 'fragment upon storage at 50 ° C. for 14 days.
  • h1f. The antibody 6 was found to be an anti-NGF antibody Fab fragment with little stability during storage and high stability.
  • Example 5 Evaluation of human NGF binding of anti-human NGF antibody by ELISA
  • An ELISA was used to measure the antigen binding activity of 6 antibodies.
  • a test was performed using a plate on which human NGF was immobilized.
  • the preceding antibody Tanezumab was used as a comparative control.
  • Human NGF (R & D Systems, 256-GF-100 / CF) was diluted with PBS to 1000 ng / mL, and 100 ⁇ L per well was added to Nunkumaxisorp white 96 plates (Nunc, 436110) at 4 ° C. Incubate the plate overnight at The human NGF solid phase solution was removed by reverse centrifugation, 200 ⁇ L of Blocker Casein in TBS (Thermo, 37532) was added per well, and the plate was incubated at room temperature for 30 minutes.
  • Blocker Casein in TBS is removed by reverse centrifugation, and the purified antibody sample is diluted in 11 steps from 1000 ng / mL to 0.01 ng / mL using PBS containing 0.1% BSA, and 100 ⁇ L is added per well.
  • the plate was incubated for 30 minutes at room temperature.
  • PBS containing 0.1% BSA was prepared.
  • the plate was washed three times with a washing solution (0.05% Tween-20-containing TBS) and diluted 1000 times with a solution of Blocking One (Nacalai Tesque, 03953-95) diluted 20-fold with PBS, biotinylated anti-human Kappa.
  • Light chain antibody (IBL, 17249) was added at 100 ⁇ L per well and incubated at room temperature for 30 minutes. The plate was washed 3 times with a washing solution, and 100 ⁇ L of alkaline phosphatase-labeled streptavidin (Thermo, 21324) diluted 1000-fold with Blocking One solution diluted 20-fold with PBS was added per well. Incubated for 5 hours. The plate was washed 3 times with a washing solution and diluted 5 times with a 2 mM Tris (pH 9.8) buffer solution containing 0.1 mM magnesium chloride (Chemiluminescent AP Microwell / Membrane Substrate, Super Sensitive, 450 nm; SurA Modics, Inc. 0100-01) was added per well. The mixture was incubated at room temperature for 30 minutes, and the signal value was measured with an EnVision counter (Perkin Elmer).
  • each antibody was tested in duplicate and the arithmetic mean was calculated.
  • the measured value of PBS containing 0.1% BSA was set to 0%, and the measured value of the maximum concentration of each antibody was set to 100%.
  • the calculated human NGF binding rate was analyzed, and the EC 50 value of the antibody was calculated by 3-parameter logistic curve regression. h1f.
  • the EC 50 value of 6 antibody was 73.0 ng / mL, whereas the EC 50 value of Tanezumab was 146 ng / mL.
  • Example 6 Evaluation of human NGF function inhibitory activity of anti-human NGF antibody
  • Example 6 Evaluation of human NGF function inhibitory activity of anti-human NGF antibody
  • the antagonistic ELISA used to evaluate NGF-trkA binding inhibition used in Example 2 was used.
  • the preceding antibody Tanezumab was used as a comparative control.
  • h1f Six trials were performed for 6 antibodies and 3 trials for Tanezumab, and the geometric mean of the calculated IC 50 values was calculated. As a result, h1f.
  • the human NGF-trkA binding inhibition IC 50 value of antibody 6 was 0.31 ⁇ g / mL, whereas the human NGF-trkA binding inhibition IC 50 value of Tanezumab was 0.86 ⁇ g / mL.
  • Example 7 Evaluation of local retention of antibody in tissue, human NGF binding activity and human NGF function inhibitory activity
  • h1f After local administration of 6 antibodies, the antibody concentration in the administered tissue was evaluated to evaluate local retention of the antibody.
  • each n 4 and h1f. 6 antibodies were locally administered into the thigh muscle at 0.3 and 3 mg / kg, and the antibody concentration in the thigh muscle 6 hours after the administration was measured by an electrochemistry (ECL) assay.
  • ECL electrochemistry
  • tissue homogenate (10 mM Tris, 137 mM NaCl, cOplete, Mini (Roche), pH 8.0) was prepared.
  • tissue homogenate 10 mM Tris, 137 mM NaCl, cOplete, Mini (Roche), pH 8.0
  • ANA- obtained by immunizing mice with 1-15 antibody
  • Patent Document 3 obtained by immunizing Verosimune mice with human NGF IBL-13A and biotinylated ANA-IBL-52A were used.
  • the biotinylated ANA-IBL-52A used here was biotinylated from ANA-IBL-52A using Biotin Labeling Kit-NH2 (Dojindo, LK03) according to the technical manual.
  • ANA-IBL-13A which is an anti-1-15 antibody
  • TBS Tris-HCl
  • 25 ⁇ L per well was added to Multi-array 96-well Plate (Meso Scale Discovery, L15XA-6).
  • ANA-IBL-13A was immobilized by incubating the plate for 1 hour at room temperature.
  • ANA-IBL-13A solid phase solution was removed by reverse centrifugation, the plate was washed 3 times with a washing solution (0.05% Tween-20-containing TBS), and Blocker Casein in TBS (Thermo, 37532) was 150 ⁇ L per well. Added.
  • Blocker Casein in TBS was removed by reverse centrifugation, the plate was washed 3 times with a washing solution, and the thigh muscle homogenate was 100% with a diluent (Blocker Casein in TBS containing 0.05% Tween-20).
  • the sample was diluted with a diluent containing 1% of a thigh muscle homogenate to which no antibody had been administered so that it was within the calibration curve, and 25 ⁇ L was added per well.
  • h1f For preparation of a calibration curve for thigh muscle homogenate, h1f.
  • a sample was prepared by diluting 6 antibodies 100-fold with a diluent containing 1% of a thigh muscle homogenate to which no antibody was administered.
  • a diluted solution containing 1% of a thigh muscle homogenate without antibody administration was prepared. After incubating at room temperature for 1 hour, the solution was removed by reverse centrifugation, the plate was washed 3 times with a washing solution, and 1 well of biotinylated ANA-IBL-52A diluted to 300 ng / mL with the diluent was used. 25 ⁇ L was added per unit.
  • a calibration curve was prepared for calculating the antibody concentration.
  • the regression equation was analyzed by 4-parameter logistic curve regression. From the calibration curve, the antibody concentration in the thigh muscle at each point was calculated. Each individual was duplicated and the arithmetic mean of concentration was determined.
  • 6 antibody was locally administered into 0.3 and 3 mg / kg thigh muscle, and the concentration in the thigh muscle 6 hours after administration was measured. In the 6 antibody 0.3 and 3 mg / kg administration groups, they were 2.66 ⁇ g / mL and 67.9 ⁇ g / mL, respectively.
  • h1f Having human NGF binding activity in the thigh muscle.
  • a human NGF binding ELISA was used.
  • Human NGF (R & D Systems, 256-GF / CF) was diluted with PBS to 1000 ng / mL, and 20 ⁇ L per well was added to a Numkumaxisorp white 384 plate (Nunc, 460372), and one at 4 ° C. The evening plate was incubated to immobilize.
  • the human NGF solid phase solution was removed by reverse centrifugation, 80 ⁇ L of blocking one (Nacalai Tesque, 03953-95) solution was added per well, and the plate was incubated at room temperature for 1 hour.
  • the plate was washed 3 times with a washing solution (0.05% Tween-20-containing TBS) and diluted 10-fold with 0.05% Tween-20-containing TBS, and the 0.3 mg / kg administration group was 10 times.
  • the thigh muscle homogenate was diluted 100 times, and 20 ⁇ L was added per well.
  • thigh muscle not administered with antibody to blocking one diluted 10-fold with 0.05% Tween-20-containing TBS Dilutions with 10% and 1% homogenates, respectively h1f. 6 antibodies were diluted in 11 steps from 3000 ng / mL to 0.03 ng / mL, and 20 ⁇ L was added per well.
  • the plate was washed 3 times with a washing solution, and biotinylated anti-human Kappa light chain antibody (IBL) was used with blocking one diluted 10-fold with TBS containing 0.05% Tween-20. 17249) was diluted 2500 times and 20 ⁇ L was added per well. After incubating at room temperature for 1 hour, the plate was washed 3 times with a washing solution and highly sensitive streptavidin-HRP (Thermo, 21130) using Blocking One diluted 10-fold with TBS containing 0.05% Tween-20. Was diluted 8000 times, 20 ⁇ L was added per well, and the plate was incubated at room temperature for 1 hour.
  • IBL biotinylated anti-human Kappa light chain antibody
  • BM Chemiluminescence ELISA Substrate (POD); Roche, 11582950001) was added at 20 ⁇ L per well, and the signal value was measured with an EnVision counter (Perkin Elmer).
  • the test was performed in duplicate, and a calibration curve was prepared in order to calculate the amount of antibody having human NGF binding activity.
  • the amount of antibody having human NGF binding activity at each point was calculated from a calibration curve by 4-parameter logistic curve regression. H1f. Having human NGF binding activity in the thigh muscles by 35-fold and 350-fold for the 0.3 and 3 mg / kg administration groups, respectively. The amount of 6 antibodies was determined, and the arithmetic average was calculated.
  • h1f Having human NGF binding activity in the 0.3 mg / kg administration group.
  • the 6 antibody was 2.7.9 ⁇ g / mL in the 2.12 ⁇ g / mL and 3 mg / kg administration groups.
  • human NGF-trkA antagonistic ELISA was performed using binding inhibition of human NGF and its receptor trkA as an index. Dilute human trkA (R & D Systems, 175-TK-050) to 2000 ng / mL with PBS, add 20 ⁇ L per well to Nunkumaxisorp white 384 plate, and incubate overnight at 4 ° C. Phased. The human trkA solid phase solution was removed by reverse centrifugation, and 80 ⁇ L of Blocker Casein in TBS was added per well, and the plate was incubated at room temperature for 30 minutes.
  • the plate was washed 3 times with a washing solution (TBS containing 0.05% Tween-20) to remove Blocker Casein in TBS.
  • TBS washing solution
  • the rat thigh muscle homogenate diluted 5 times in the 0.3 mg / kg administration group and 50 times in the 3 mg / kg administration group using PBS containing 0.1% BSA, and biotinylated human NGF at 0.4 ⁇ g / mL, respectively.
  • An equal volume was mixed and 20 ⁇ L of a sample incubated for 30 minutes at room temperature was added per well.
  • the rat thigh muscle homogenate was prepared with 2.5 times the tissue homogenate solution of the collected thigh muscle tissue, so that the 0.3 and 3 mg / kg administration groups each had 35 times the original thigh muscle tissue concentration.
  • the biotinylated human NGF used here is biotinylated human EGF (R & D Systems, 256-GF-100 / CF) using EZ-Link NHS-PEG4-Biotin (Thermo, 21329). It was.
  • NHS-PEG4-Biotin solution was added to 1 mL of 0.4 mg / mL human NGF solution. The reaction was carried out on ice for 2 hours under light-shielding conditions, and then the reaction solution was collected as a PBS solution using Amicon Ultra-0.5 mL 3K (Millipore, UFC500324) twice according to the manual.
  • PBS containing 0.1% BSA and 10 ⁇ g / mL of h1f.6 antibody diluted with PBS containing 0.1% BSA were prepared.
  • Control samples for the 0.3 mg / kg administration group and the 3 mg / kg administration group were prepared using dilutions of 10% and 1% of the thigh muscle homogenate to which no antibody was administered in PBS containing 0.1% BSA, respectively.
  • the plate was washed 3 times with a washing solution, and alkaline phosphatase-labeled streptavidin (Thermo) diluted 1000-fold with Blocking One solution diluted 20-fold with 0.05% Tween-20-containing TBS. 21324) was added per well.
  • an alkaline phosphatase substrate (Chemiluminescent AP) mixed 1: 1 with a 10-fold diluted 200 mM Tris (pH 9.8) buffer containing 10 mM magnesium chloride.
  • Microwell / Membrane Substrate, Super Sensitive, 450 nm; SurModics, APU4-0100-01) was added at 20 ⁇ L per well. The mixture was incubated at room temperature for 30 minutes, and the signal value was measured with an EnVision counter (Perkin Elmer).
  • the measured value of the sample to which PBS containing 0.1% BSA was added was set to 0%, and the measured value of 10 ⁇ g / mL was set to 100%.
  • the test was performed in duplicate (control was 4 or 8 wells), and the arithmetic average was calculated.
  • the 0.3 mg / kg administration group showed an inhibitory activity of 21.2% even under conditions where the antibody concentration in the thigh muscle was 35 times thinner.
  • the 3 mg / kg administration group showed 59.9% inhibitory activity under conditions where the antibody concentration in the thigh muscle was 350 times thinner. That is, h1f. It was confirmed that the thigh muscle tissue of the group administered with 6 antibodies at 0.3 and 3 mg / kg has human NGF function inhibitory activity by inhibiting the binding of human NGF and its receptor trkA.
  • h1f. which is the anti-human NGF antibody Fab fragment of the present invention. It was clarified that the 6 antibody inhibits the binding of human NGF and its receptor by locally administering the antibody and maintaining the antibody concentration and human NGF binding activity in the target tissue. H1f. Which is an anti-human NGF antibody Fab fragment of the present invention. It is expected that the 6 antibody is likely to be an excellent pharmaceutical product that exhibits the local medicinal effect of the target tissue with a smaller local dose.
  • Example 8 Evaluation of analgesic effect in pain model after rat foot incision
  • a rat foot incision post-pain pain model (Pain, 2005, Vol. 117, p. 68-76) that reflects clinical postoperative pain
  • Patent Document 3 shows that fully human anti-human NGF antibody 1-15 (N52D-A) -Fab′-10 kPEG has an analgesic effect in this model by systemic administration by intravenous administration.
  • h1f In evaluating the analgesic effect on postoperative pain by local administration of 6 antibodies, local and systemic administration of 1-15 (N52D-A) -Fab′-10 kPEG was used as a comparative control.
  • 10 surgical groups each, 5 non-surgical groups, non-operative group, solvent (20 mM Citrate, 120 mM NaCl, pH 6) group, h1f. 6 antibody 900 ⁇ g sole locally administered group, 1-15 (N52D-A) -Fab′-10 kPEG group locally administered 900 ⁇ g sole, and 1-15 (N52D-A) -Fab′-10 kPEG 1 mg / A total of 5 groups of intravenously administered kg were set.
  • Sole topical administration was performed by embedding a Spongel (registered trademark) sheet (Astellas Pharma Inc.) of about 2 mg in which 30 ⁇ L of a 30 mg / mL antibody solution was osmotically swollen into the muscle of the incised sole.
  • a Spongel sheet in which the solvent was osmotically swollen was embedded.
  • the pain threshold of each drug group is calculated by calculating the arithmetic average of three times of the pressure threshold that caused the avoidance behavior of the individual of each group as the pain threshold, the pain threshold of the non-operative group being 100%, and the pain threshold of the solvent group being 0%.
  • the improvement rate was calculated. As a result, h1f.
  • Example 9 Evaluation of drug concentration in plasma and tissue by local administration
  • a group administered intravenously was set, and antibody concentrations in plantar muscle and plasma after 24 hours were measured by ECL assay.
  • topical administration of the sole of the foot is performed by embedding a sutured Spongel (registered trademark) sheet (Astellas Pharma) into which 30 ⁇ L of a 30 mg / mL antibody solution is osmotically swollen and embedded in the muscle of the incised sole. I went there.
  • a sutured Spongel registered trademark
  • the antibody concentration in the plantar muscle was determined by measuring the plantar muscle collected 9 times the sole tissue homogenate solution (10 mM Tris, 137 mM NaCl, 1% Triton X-100, 10% Glycerol, cComplete, Mini (Roche), The concentration in the sample homogenized at pH 8.0) was measured, and a value obtained by multiplying the concentration by 10 was used.
  • Two types of anti-1-15 antibodies, ANA-IBL-13A and biotinylated ANA-IBL-52A were used for measurement in the ECL assay.
  • the biotinylated ANA-IBL-52A used here was biotinylated from ANA-IBL-52A using Biotin Labeling Kit-NH2 (Dojindo, LK03) according to the technical manual.
  • ANA-IBL-13A was diluted with TBS to 5000 ng / mL, and 25 ⁇ L was added per well to Multi-array 96-well Plate (Meso Scale Discovery, L15XA-3).
  • ANA-IBL-13A was immobilized by incubating the plate for 1 hour at room temperature.
  • ANA-IBL-13A solid phase solution was removed by reverse centrifugation, the plate was washed 3 times with a washing solution (0.05% Tween-20-containing TBS), and Blocker Casein in TBS (Thermo, 37532) was 150 ⁇ L per well. Added.
  • Blocker Casein in TBS was removed by reverse centrifugation.
  • the plate was washed 3 times with a washing solution, and the plasma sample and plantar muscle homogenate were diluted 10-fold with a diluent (Blocker Casein in TBS containing 0.05% Tween-20), and 25 ⁇ L was added per well.
  • h1f Diluted in 10 stages from 333 ng / mL to 0.017 ng / mL using a diluent containing 10% of plasma without antibody administration.
  • the plate was washed 3 times with a washing solution, 25 ⁇ L of biotinylated ANA-IBL-52A diluted to 1000 ng / mL with the diluent was added per well, and the plate was incubated at room temperature for 1 hour. The solution was removed by reverse centrifugation, washed 3 times with a washing solution, and 25 ⁇ L of MSD SULFO-TAG labeled Streptavidin (Meso Scale Discovery, R32AD-1) diluted 500 times with a diluent was added. After incubating the plate at room temperature for 1 hour, the solution was removed by reverse centrifugation and the plate was washed 3 times with a washing solution.
  • MSD Read Buffer T (4x) (Meso Scale Discovery, R92TC-1) diluted 2-fold with ultrapure water (MilliQ (registered trademark), Merck) was added, and the electrochemiluminescence was SECTOR Imager 6000 ( (Meso Scale Discovery).
  • a calibration curve was prepared for calculating the antibody concentration.
  • the regression equation was analyzed by 4-parameter logistic or 5-parameter logistic curve regression. From the calibration curve, the antibody concentration in plasma and plantar muscle at each point was calculated. Each test was performed in triplicate, and the arithmetic average of the calculated concentrations was determined. H1f.
  • the quantification limit of antibody 6 is 0.2 ng / mL in plasma and 2 ng / mL in plantar muscle, and the quantification limit of fully human anti-NGF antibody 1-15 (N52D-A) -Fab′-10 kPEG Had a plasma concentration of 0.5 ng / mL and a plantar muscle concentration of 2 ng / mL.
  • H1f 6 groups of 900 ⁇ g sole locally administered antibody, 1-15 (N52D-A) -Fab′-10 kPEG group locally administered 900 ⁇ g sole, 1-15 (N52D-A) -Fab′-10 kPEG 1 mg / kg As a result of measuring the concentration in the plantar muscle 24 hours after administration in each of the groups administered intravenously, they were 132 ng / mL, 46.2 ng / mL, and 24.1 ng / mL, respectively. h1f. The concentration in plantar muscle of the group to which 6 antibody was administered into the sole was highest.
  • the plasma concentrations 24 hours after administration were less than 0.230 ng / mL (1 in 3 cases was 0.230 ng / mL, 2 were less than 0.2 ng / mL), 65.1 ng / mL, 396 ng / mL, respectively. mL, h1f.
  • the plasma concentration of the group in which 6 antibody was administered into the sole was lowest.
  • h1f 6 groups of 900 ⁇ g sole locally administered antibody, 1-15 (N52D-A) -Fab′-10 kPEG group locally administered 900 ⁇ g sole, 1-15 (N52D-A) -Fab′-10 kPEG 1 mg / kg
  • concentration ratio in the plantar muscle / plasma 24 hours after the administration was calculated.
  • h1f. The plasma concentration 24 hours after administration of 900 ⁇ g of the 6 antibody locally administered to the sole of the foot was 0.2 ng / mL, which is the limit of quantification.
  • the concentration ratios in plantar muscle / plasma 24 hours after administration in each of the intravenous administration groups were 628, 0.71, and 0.061, respectively.
  • 1-15 (N52D-A) -Fab'-10kPEG was administered intraplantarly, and the concentration ratio in the plantar muscle / plasma was 10 times or more higher than that administered intravenously.
  • the antibody 6 had a concentration ratio in plantar muscle / plasma of 800 times or more.
  • h1f which is the anti-human NGF antibody Fab fragment of the present invention. It has been shown that local administration of antibody 6 can reduce the antibody concentration in the systemic blood stream while maintaining the desired local drug concentration. Furthermore, fully human anti-human NGF antibody 1-15 (N52D-A) -Fab′- It was shown that the drug concentration in the whole body blood stream was reduced while maintaining the local drug concentration very effectively compared to 10 kPEG. Therefore, it is expected that the anti-human NGF antibody Fab fragment of the present invention is highly likely to be an excellent pharmaceutical agent that exhibits systemic side effects while reducing systemic side effects.
  • the anti-human NGF antibody Fab fragment of the present invention is expected to be useful for the treatment of postoperative pain.
  • the anti-human NGF antibody Fab fragment of the present invention is expected to be particularly useful in that it is an excellent drug with reduced side effects due to systemic blood exposure while expressing local drug efficacy.
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing is h1f. 6 is the nucleotide sequence of the heavy chain fragment of the antibody, and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 in the sequence listing is the amino acid sequence of the heavy chain fragment encoded by SEQ ID NO: 1.
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 in the sequence listing is h1f. 7 is the base sequence of the heavy chain fragment of antibody 7.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 in the sequence listing is the amino acid sequence of the heavy chain fragment encoded by SEQ ID NO: 2.
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 in the sequence listing is h1f.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 in the sequence listing is the amino acid sequence of the heavy chain fragment encoded by SEQ ID NO: 3.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing is the base sequence of the light chain of the 1-15 (N52D-A) -Fab ′ fragment, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing is SEQ ID NO: 4 Is the amino acid sequence of the light chain encoded by.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 9 in the sequence listing is the base sequence of the heavy chain variable region of the anti-human NGF antibody Fab fragment of the present invention.
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 in the sequence listing is based on SEQ ID NO: 9.
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 11 in the sequence listing is the base sequence of the light chain variable region of the anti-human NGF antibody Fab fragment of the present invention.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 in the sequence listing is represented by SEQ ID NO: 11. Amino acid sequence of the encoded light chain variable region.

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Abstract

高い中和活性を保持し、局所での薬効を発現しつつ全身暴露による全身性の副作用を低減した、優れた抗ヒトＮＧＦ抗体フラグメント、及び、該抗体フラグメントを用いた、術後疼痛の治療手段の提供。　配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメント。

Description

新規抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメント
　本発明は、新規な抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントに関する。本発明はまた、当該抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び、当該発現ベクターで形質転換された宿主細胞、並びに、当該抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントを生産する方法に関する。本発明はさらに当該抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントを含む医薬組成物、及び、当該抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントを用いて術後疼痛を治療する方法に関する。
　神経成長因子（ｎｅｒｖｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ；ＮＧＦ）は、神経栄養因子（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ　ｆａｃｔｏｒ）と総称される液性因子の一つであり、生体内においてニューロンの発生、分化、機能維持において重要な役割を担っている。ＮＧＦの受容体としては、高親和性のｔｒｋＡ（ｔｒｏｐｏｍｙｏｓｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｋｉｎａｓｅ Ａ）と低親和性のｐ７５ＮＴＲ（ｐ７５　ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ）が知られている。このうちｐ７５ＮＴＲは全ての神経栄養因子と結合し、ニューロンの発生過程においてアポトーシスに関与していることが報告されているが、その役割は未だ十分に解明されていない。一方、ＮＧＦとｔｒｋＡのノックアウトマウスの間では同様のフェノタイプが認められることが知られており（非特許文献１）、ＮＧＦの生理作用は主にｔｒｋＡを介して発現すると考えられている。
　ＮＧＦをラットに投与すると痛みが誘発されることが報告され（非特許文献２）、さらにヒトへＮＧＦを静脈内投与すると全身性の筋肉痛を生じること、またＮＧＦの局所投与により全身性の痛みだけでなく、投与した部位に痛覚過敏及び異痛症が誘発されると報告されている（非特許文献３）。動物においてＮＧＦの発現量はラットの術後疼痛モデルなど筋肉（非特許文献４）及び皮膚（非特許文献５）組織の切開時等の組織障害により上昇することが知られている。ヒト疼痛病態においては、変形性関節症（ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ；ＯＡ）の関節軟骨でＮＧＦ及びｔｒｋＡの発現が亢進していることや（非特許文献６）、帝王切開時の切開部滲出液中でＮＧＦレベルが上昇していること（非特許文献７）、リウマチ性関節炎（非特許文献８）や間質性膀胱炎（非特許文献９）の患者でＮＧＦレベルが上昇していることが実証されている。
　これまでに種々の疼痛動物モデルにおいてＮＧＦシグナルを阻害すると疼痛が抑制されることが報告されている（非特許文献１０、特許文献１～３）。
　現在までに報告されているヒトＮＧＦに対する抗体としては、完全ヒト型抗ヒトＮＧＦ抗体であるＲＥＧＮ４７５（特許文献２）、１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’－ＰＥＧ（特許文献３）、Ｆｕｌｒａｎｕｍａｂ（特許文献４）、及びＭＥＤＩ－５７８（特許文献５）、ヒト化抗ヒトＮＧＦ抗体であるＴａｎｅｚｕｍａｂ（特許文献６）及びＰＧ１１０（特許文献７）が報告されている。その中でも臨床においてＴａｎｅｚｕｍａｂの静脈内投与に加えて、皮下投与で変形性関節症に伴う関節痛、慢性腰痛、間質性膀胱炎に伴う膀胱痛などの疼痛に対して幅広い鎮痛効果を示すことが報告されている（非特許文献１１～１３）。
　医薬品において副作用は多くの医薬品で報告されており、それは抗ＮＧＦ抗体においても例外ではない。抗ＮＧＦ抗体のヒトへの投与により発現した有害事象として、Ｔａｎｅｚｕｍａｂの臨床試験においては頭痛、上気道感染症、感覚異常等が報告され（非特許文献１１）、Ｆｕｌｒａｎｕｍａｂの臨床試験においては知覚障害、頭痛、鼻咽頭炎等が報告され（非特許文献１４）、さらにはＲＥＧＮ４７５の臨床試験では関節痛、知覚過敏、筋肉痛、末梢浮腫、及び関節腫脹等が報告されている（非特許文献１５）。
　一般に、医薬品が作用する標的組織以外の組織に暴露された場合、それらの組織においては人体にとって好ましくない副作用が生じる。
　一般に、医薬品を標的組織に直接投与して、その部位での組織濃度を高め、全身循環血を介した標的以外の組織の暴露を低減することにより、副作用を回避する局所投与剤が開発されている。
　多くの抗体医薬品は静脈などの血管内への投与に加えて、皮下あるいは筋肉内といった部位へ投与するものも多く存在する。これらは皮下あるいは筋肉内へ投与されたのち、リンパ管を介して速やかに血中に移行する。多くの抗体医薬品は血中に移行した後に血流循環を介して標的組織に運ばれて薬理作用を発揮する。また、多くの抗体医薬品の分布は血液が高く、血中から標的組織への移行性（組織／血液濃度比）は低い。そのため多くの抗体医薬品が標的組織の作用濃度を維持するためには、高い血中濃度の維持が必要である（非特許文献１６）。さらに、多くの抗体医薬品は数日から１カ月程度の血中半減期を有し、長期間の血中濃度持続を示すことにより、長時間薬理作用が維持される。従って、通常の抗体医薬品を皮下あるいは筋肉内という局所部位に投与したとしても、抗体医薬品の多くは血液中に残存して全身循環することにより全身性の薬効及び副作用が発現する。
　抗体医薬品等のバイオ医薬品において二量体化等の多量体化は安定で均質な品質の担保をする上で大きな課題となる。
　Ｆａｂ’の二量体化体のＦ（ａｂ’）２はＦａｂ’とは体内動態が異なることが知られている（非特許文献１７，１８）。
　Ｆａｂ’の二量体化体のＦ（ａｂ’）２に対する自然抗体は抗体の消失を引き起こすことが報告されている（非特許文献１９）。このような抗原－抗体反応は薬剤の体内動態に影響して消失を早める他、アナフィラキシー反応等のリスクも生じる。このように、Ｆ（ａｂ’）２にはいくつかのリスクがある。
国際公開第２０１３／１８３０３２号 国際公開第２００９／０２３５４０号 国際公開第２０１３／０２２０８３号 国際公開第２００５／０１９２６６号 国際公開第２００６／０７７４４１号 国際公開第２００４／０５８１８４号 米国特許第８４３５５２３号明細書
「レビューズ　イン　ザ　ニューロサイエンシズ（Ｒｅｖｉｅｗｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、１９９７、Ｖｏｌ．８、ｐ．１３－２７ 「ザ　ジャーナル　オブ　ニューロサイエンス（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９９３、Ｖｏｌ．１３、ｐ．２１３６－２１４８ 「アナルズ　オブ　ニューロロジー（Ａｎｎａｌｓ　ｏｆ　Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ）」、１９９４、Ｖｏｌ．３６、ｐ．２４４－２４６ 「アネスシージオロジー（Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ）」、２００９、Ｖｏｌ．１１０、ｐ．１４０－１４９ 「ペイン（Ｐａｉｎ）」、２００５、Ｖｏｌ．１１７、ｐ．６８－７６ 「リューマトロジー（Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ）」、２００２、Ｖｏｌ．４１、ｐ．１４１３－１４１８ 「ザ　ジャーナル　オブ　ペイン（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐａｉｎ）」、２００８、Ｖｏｌ．９、ｐ．６５０－６５７ 「クリニカル　アンド　エクスペリメンタル　リューマトロジー（Ｃｌｉｎｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ）」、１９９７、Ｖｏｌ．１５、ｐ．４３３－４３８ 「ブリティッシュ　ジャーナル　オブ　ウロロジー（Ｂｒｉｔｉｓｈ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｕｒｏｌｏｇｙ）」、１９９７、Ｖｏｌ．７９、ｐ．５７２－５７７ 「トレンズ　イン　ファーマコロジカル　サイエンシズ（Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、２００６、Ｖｏｌ．２７、ｐ．８５－９１ 「ザ　ニュー　イングランド　ジャーナル　オブ　メディシン（Ｔｈｅ　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」、２０１０、Ｖｏｌ．３６３、ｐ．１５２１－１５３１ 「ザ　ジャーナル　オブ　ウロロジー（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｕｒｏｌｏｇｙ）」、２０１１、Ｖｏｌ．１８５、ｐ．１７１６－１７２１ 「ペイン（Ｐａｉｎ）」、２０１１、Ｖｏｌ．１５２、ｐ．２２４８－２２５８ 「ペイン（Ｐａｉｎ）」、２０１３、Ｖｏｌ．１５４、ｐ．１９１０－１９１９ 「ペイン（Ｐａｉｎ）」、２０１４、Ｖｏｌ．１５５、ｐ．１２４５－１２５２ 「バイオアナリシス（Ｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ）」、２０１３、Ｖｏｌ．５、ｐ．２００３－２０１４ 「ザ　ジャーナル　オブ　ファーマコロジー　アンド　エクスペリメンタル　セラピューティクス（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）」、１９９７、Ｖｏｌ．２８１、ｐ．１－８ 「キャンサー　リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、１９８６、Ｖｏｌ．４６、ｐ．３９６９－３９７８ 「ヨーロピアン　ジャーナル　オブ　イミュノロジー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、１９９５、Ｖｏｌ．２５、ｐ．３１２８－３１３３
　本発明の課題は、高い中和活性を保持し、局所での薬効を発現しつつ全身暴露による全身性の副作用を低減した、優れた抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントを提供することにある。
　本発明は、医学上又は産業上有用な物質・方法として以下の発明を含むものである。
　すなわち、一態様において、本発明は以下のとおりであってよい。
（１）以下の（ａ）及び（ｂ）からなる群より選択される、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメント：
（ａ）配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメント；及び
（ｂ）（ａ）の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの翻訳後修飾により生じた抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメント。
（２）配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、上記（１）に記載の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメント。
（３）翻訳後修飾が重鎖可変領域Ｎ末端のピログルタミル化である、上記（１）に記載の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメント。
（４）配列番号５のアミノ酸番号１のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、上記（１）に記載の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメント。
（５）上記（１）に記載の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含む、ポリヌクレオチド。
（６）以下の（ａ）及び（ｂ）からなる群より選択される、発現ベクター：
（ａ）上記（１）に記載の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクター；及び
（ｂ）上記（１）に記載の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
（７）上記（６）に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
（８）以下の（ａ）及び（ｂ）からなる群より選択される、上記（７）に記載の宿主細胞：
（ａ）上記（１）に記載の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；及び
（ｂ）上記（１）に記載の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターとで形質転換された宿主細胞。
（９）上記（８）に記載の宿主細胞を培養し、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントを発現させる工程を包含する、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントを生産する方法。
（１０）上記（９）に記載の方法で生産できる抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメント。
（１１）上記（１）～（４）及び（１０）のいずれかに記載の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメント、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
（１２）術後疼痛の治療用局所医薬組成物である、上記（１１）に記載の医薬組成物。
（１３）上記（２）に記載の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメント、上記（４）に記載の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメント、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
（１４）術後疼痛の治療用局所医薬組成物である、上記（１３）に記載の医薬組成物。
（１５）術後疼痛の治療用局所医薬組成物の製造のための、上記（１）～（４）及び（１０）のいずれかに記載の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの使用。
（１６）術後疼痛の治療のための、上記（１）～（４）及び（１０）のいずれかに記載の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの局所投与による使用。
（１７）術後疼痛の治療に局所投与での使用をするための、上記（１）～（４）及び（１０）のいずれかに記載の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメント。
（１８）上記（１）～（４）及び（１０）のいずれかに記載の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの有効量を対象の局所に投与することを含む、術後疼痛の治療方法。
　本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントは、ヒトＮＧＦが病態形成に関与する術後疼痛の治療に有用である。このような本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントは、その中和活性及び局所滞留性が高くかつ血中からの消失が早いという優れた体内動態により、投与量の低減ならびに薬効持続の延長を示し、かつ全身暴露による全身性の副作用が低減された、臨床適用において薬効、安全性共に非常に優れた改善を示すことが期待されるものである。本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントは、ヒトＮＧＦが関与する術後疼痛の治療において大きく貢献するものである。
　以下に、本発明について詳述するが、本発明はこれらに限定されるものではない。本明細書で特段に定義されない限り、本発明に関連して用いられる科学用語及び技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。
　本発明者らは、抗ヒトＮＧＦ抗体又はその抗原結合フラグメントの作製において相当の創意検討を重ねた結果、高い中和活性を保持しつつ、局所での薬効を発現しつつ全身暴露による全身性の副作用を低減した、優れた抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントを作製することに成功した。
　抗体分子の基本構造は、各クラス共通で、分子量５万～７万の重鎖と２万～３万の軽鎖から構成される。重鎖は、通常約４４０個のアミノ酸を含むポリペプチド鎖からなり、クラスごとに特徴的な構造をもち、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥに対応してγ、μ、α、δ、ε鎖とよばれる。さらにＩｇＧには、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４が存在し、それぞれγ１、γ２、γ３、γ４とよばれている。軽鎖は、通常約２２０個のアミノ酸を含むポリペプチド鎖からなり、Ｌ型とＫ型の２種が知られており、それぞれλ、κ鎖とよばれる。抗体分子の基本構造のペプチド構成は、それぞれ相同な２本の重鎖及び２本の軽鎖が、ジスルフィド結合（Ｓ－Ｓ結合）及び非共有結合によって結合され、分子量１５万～１９万である。２種の軽鎖は、どの重鎖とも対をなすことができる。個々の抗体分子は、常に同一の軽鎖２本と同一の重鎖２本からできている。
　鎖内Ｓ－Ｓ結合は、重鎖に四つ（μ、ε鎖には五つ）、軽鎖には二つあって、アミノ酸１００～１１０残基ごとに一つのループを成し、この立体構造は各ループ間で類似していて、構造単位あるいはドメインとよばれる。重鎖、軽鎖ともにＮ末端に位置するドメインは、同種動物の同一クラス（サブクラス）からの標品であっても、そのアミノ酸配列が一定せず、可変領域とよばれており、各ドメインは、それぞれ、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）とよばれている。可変領域よりＣ末端側のアミノ酸配列は、各クラスあるいはサブクラスごとにほぼ一定で定常領域とよばれており、各ドメインは、それぞれ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３あるいはＣＬと表される。
　抗体の抗原決定部位はＶＨ及びＶＬによって構成され、結合の特異性はこの部位のアミノ酸配列によっている。一方、補体や各種細胞との結合といった生物学的活性は各クラスＩｇの定常領域の構造の差を反映している。重鎖と軽鎖の可変領域の可変性は、どちらの鎖にも存在する３つの小さな超可変領域にほぼ限られることがわかっており、これらの領域を相補性決定領域（ＣＤＲ；それぞれＮ末端側からＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）と呼んでいる。可変領域の残りの部分はフレームワーク領域（ＦＲ）とよばれ、比較的一定である。
　抗体の重鎖定常領域のＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間にある領域はヒンジ領域とよばれ、この領域は、プロリン残基を多く含み、２本の重鎖をつなぐ複数の鎖間Ｓ－Ｓ結合を含む。例えば、ヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４の各ヒンジ領域には、重鎖間のＳ－Ｓ結合を構成している、それぞれ、２個、４個、１１個、２個のシステイン残基を含む。ヒンジ領域は、パパインやペプシン等のタンパク質分解酵素に対する感受性が高い領域である。抗体をパパインで消化した場合、ヒンジ領域の重鎖間Ｓ－Ｓ結合よりもＮ末端側の位置で重鎖が切断され、２個のＦａｂフラグメントと１個のＦｃフラグメントに分解される。Ｆａｂフラグメントは、軽鎖と、重鎖可変領域（ＶＨ）、ＣＨ１ドメインとヒンジ領域の一部とを含む重鎖フラグメントから構成される。抗体をペプシンで消化した場合、ヒンジ領域の重鎖間Ｓ－Ｓ結合よりもＣ末端側の位置で重鎖が切断され、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントが生成される。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、２つのＦａｂ’フラグメントがヒンジ領域中の重鎖間Ｓ－Ｓ結合で結合した二量体構造のフラグメントである。Ｆａｂ’フラグメントは、軽鎖と、重鎖可変領域（ＶＨ）、ＣＨ１ドメインとヒンジ領域の一部とを含む重鎖フラグメントから構成され、このヒンジ領域の部分には重鎖間Ｓ－Ｓ結合を構成していたシステイン残基が含まれる。Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメントは、いずれも可変領域を含み、抗原結合活性を有する。
　本発明者らが作製に成功した本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントは、以下の特徴を有するＦａｂフラグメントである：
　配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメント。
　具体的には、本発明者らは、完全ヒト型抗ヒトＮＧＦ抗体１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’フラグメント（特許文献３；同文献中で１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’とも称する）を改変し、各種生物学的活性試験及び物性試験を用いた抗体のスクリーニングによって、安定でかつ高い中和活性及び局所滞留性を保持する抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントとして、本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントを同定することに成功した。
　本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントは、本願明細書に開示される配列情報に基づいて、当該分野で公知の方法を使用して、当業者によって容易に作製され得る。例えば、本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントは、その重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを合成し、適当な発現ベクターに連結する。次いで、当該発現ベクターを培養細胞中に導入する。最後にこの培養細胞を培養して培養上清からモノクローナルＦａｂフラグメントを得ることができる。
　本発明のＦａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び本発明のＦａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、例えば、当該重鎖フラグメント及び軽鎖のアミノ酸配列に基づいてデザインされた塩基配列に基づき、当該分野で公知の遺伝子合成方法を利用して合成することが可能である。このような遺伝子合成方法としては、国際公開第９０／０７８６１号に記載の抗体遺伝子の合成方法等の当業者に公知の種々の方法が使用され得る。
　１つの実施形態において、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号１に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号４に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。
　本発明のＦａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び本発明のＦａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドの作製につづく、当該ポリヌクレオチドの発現ベクターへの導入、発現ベクターの培養細胞への導入、培養細胞の培養、Ｆａｂフラグメントの精製等については、当該分野で公知の種々の方法を使用して行うことができる。
　使用される発現ベクターとしては、例えば、ＧＳベクターｐＥＥ６．４やｐＥＥ１２．４（Ｌｏｎｚａ社）が挙げられるが、本発明のＦａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び／又は本発明のＦａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを発現し、これらによりコードされるポリペプチドを産生できるものであれば特に制限されない。
　上記の発現ベクターは、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等により、培養細胞中に導入される。
　発現ベクターを導入する培養細胞としては、例えば、ＣＨＯ－Ｋ１ＳＶ細胞、ＣＨＯ－ＤＧ４４細胞、２９３細胞等の培養細胞が使用でき、これを常法により培養すればよい。
　上記培養後、培養上清中に蓄積されたＦａｂフラグメントは、各種カラムクロマトグラフィーにより精製することができ、例えば、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ等によるカラムクロマトグラフィーを使用することができる。
　本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの例としては、後記実施例に記載されるｈ１ｆ．６抗体が挙げられる。
　抗体を細胞で発現させる場合、抗体が翻訳後に修飾を受けることが知られている。翻訳後修飾の例としては、重鎖Ｃ末端のリジンのカルボキシペプチダーゼによる切断、重鎖及び軽鎖Ｎ末端のグルタミン又はグルタミン酸のピログルタミル化によるピログルタミン酸への修飾、グリコシル化、酸化、脱アミド化、糖化等が挙げられ、種々の抗体において、このような翻訳後修飾が生じることが知られている（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、２００８、Ｖｏｌ．９７、ｐ．２４２６－２４４７）。
　本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントには、翻訳後修飾により生じた抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントも含まれ得る。翻訳後修飾により生じ得る本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの例としては、重鎖可変領域Ｎ末端のピログルタミル化した抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントが挙げられる。このようなＮ末端のピログルタミル化による翻訳後修飾は、抗体の活性に影響を及ぼすものではないことは当該分野で知られている（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２００６、Ｖｏｌ．３４８、ｐ．２４－３９）。
　例えば、本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントには、以下の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントも含まれる：
　配列番号５のアミノ酸番号１のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメント。
　本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントは、ヒトＮＧＦに結合する。得られた抗ヒトＮＧＦ抗体ＦａｂフラグメントのヒトＮＧＦに対する結合活性を測定する方法としては、ＥＬＩＳＡやＦＡＣＳ等の方法がある。例えば、ＥＬＩＳＡを用いる場合、ヒトＮＧＦをＥＬＩＳＡプレートに固定化し、これに対してＦａｂフラグメントを添加して反応させた後、ビオチン等で標識した抗Ｋａｐｐａ抗体等の二次抗体及びアルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジンを反応させた後、その活性を検出する試薬（例えば、アルカリフォスファターゼ標識の場合、化学発光アルカリフォスファターゼ基質）等を用いた活性測定により、二次抗体の結合を同定する。また、本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントは、ヒトＮＧＦに加え、他の動物由来のＮＧＦ（例えば、マウスＮＧＦ）にも結合でき、これらのタンパク質に対する結合活性を測定してもよい。
　本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントは、ヒトＮＧＦに対する中和活性を有している。本明細書中で使用される場合、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの「中和活性」とは、ヒトＮＧＦへの結合によりヒトＮＧＦを介してもたらされる任意の生物活性を阻害する活性を意味し、ヒトＮＧＦの１つ又は複数の生物活性を指標に評価することができる。このような中和活性としては、例えば、ヒトＮＧＦとその受容体であるヒトｔｒｋＡとの結合阻害活性が挙げられ、後記実施例に記載されるような方法を用いることによって評価することができる。
　本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの効果をより詳細に評価するために、ｉｎ　ｖｉｖｏでの試験を用いることもできる。例えば、後記実施例に記載のように、ラット足裏切開術後痛モデルを用いる鎮痛効果試験等を用いて、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントのｉｎ　ｖｉｖｏでの薬効を評価することができる。また、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントをラットの大腿筋へ局所投与した後にその組織ホモジネートを用いたＮＧＦとの結合活性評価試験や、ＮＧＦとその受容体であるｔｒｋＡとの結合阻害活性評価試験を行うことにより組織中の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの薬理活性を確認することもできる。さらに、血漿中及び組織中の薬物濃度評価試験を行うことによりＦａｂフラグメントの局所曝露量の維持及び全身血中曝露量の低減を評価することもできる。
　その他、本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの各種安定性（例えば、熱安定性、長期保存安定性、高濃度安定性）を評価する方法としては、例えばサイズ排除クロマトグラフィーによる保存中の凝集体形成の測定を利用する方法が挙げられる。
　本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントは、必要に応じて精製された後、常法に従って製剤化され、術後疼痛の治療に用いることができる。
　「術後疼痛」とは、切創、穿刺、切開、裂傷、又は個体の組織内の創傷などの外部の外傷に起因する又はそれから生じる疼痛をいう（侵襲性又は非侵襲性にかかわらず、すべての外科的処置に起因するものが含まれる）。本明細書中で使用する術後疼痛には、外部からの物理的な外傷を伴わずに起こる（外傷に起因しない、又は外傷により派生したものではない）疼痛は含まれない。術後疼痛は内部又は外部（末梢が含まれる）の疼痛であり、創傷、切創、外傷、裂傷又は切開は、偶発的（外傷創傷の場合）または意図的（手術時の切開の場合）に起こり得る。疼痛は疼痛スコア及び当分野で周知の他の方法を用いて客観的及び主観的に評価することができる。本明細書中で使用する術後疼痛にはアロディニア（すなわち、通常は非侵害である刺激に対する応答の増加）及び痛覚異常過敏（すなわち、通常は侵害性又は不快な刺激に対する応答の増加）が含まれ、これらは熱的又は機械的な性質である場合がある。疼痛は、熱感受性、機械的刺激に対する感受性及び／又は安静時疼痛によって特徴づけられる。術後疼痛には、機械的刺激に対して誘導された疼痛及び安静時疼痛が含まれる。
　本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントは、術後疼痛の治療剤として用いることができる。この治療剤の剤型の例としては、注射剤、点滴用剤、デポ剤等の非経口剤を挙げることができ、標的組織局所への筋肉内注射、皮下注射等により投与することが好ましい。また、製剤化にあたっては、薬学的に許容される範囲で、これら剤型に応じた担体や添加剤を使用することができる。
　上記製剤化に当たっての本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの添加量は、患者の症状の程度や年齢、使用する製剤の剤型、あるいは抗体の結合力価等により異なるが、例えば、０．００１ｍｇ／ｋｇないし１００ｍｇ／ｋｇ程度を用いればよい。
　また、本発明は、本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントを含む医薬組成物にも関する。本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される担体や添加剤を含んでいてもよい。薬学的に許容される担体や添加剤の種類は特に限定されず、当業者に周知の担体や添加剤を用いることができる。本発明は、術後疼痛の治療に使用するための本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメント、及び、術後疼痛の治療用医薬組成物の製造のための本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの使用にも関する。本発明は、本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの有効量を対象の局所に投与することを含む、術後疼痛の治療方法にも関する。なお、「対象」とは、その治療を必要とするヒト又はその他のほ乳動物であり、ある態様としては、その治療を必要とするヒトである。本発明の治療方法における抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの有効量は、上記製剤化にあたってのＦａｂフラグメントの添加量と同様の量であってよい。また、本発明の局所医薬組成物は、治療が望まれる部位、又はその領域に隣接した部位、特に外科手術時の切開組織等の標的組織、あるいはその近傍に投与、使用される医薬組成物を意味する。例えば、上記に記載した通り、標的組織局所への筋肉内注射、皮下注射等により投与することができる。また、標的組織局所に本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントが一定時間、好ましくは、７２時間であり、さらに好ましくは２４時間滞留することを含む。
　本発明の医薬組成物には、複数種の本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントを含み得る。例えば、翻訳後修飾を受けていない抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメント及び翻訳後修飾により生じた抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントを含有する医薬組成物も本発明に含まれる。
　１つの実施形態において、本発明の医薬組成物には、以下の（ａ）及び（ｂ）の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントを含有する医薬組成物も含まれる。
（ａ）配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメント；及び
（ｂ）（ａ）の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの翻訳後修飾により生じた抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメント。
　１つの実施形態において、本発明の医薬組成物には、以下の（ａ）及び（ｂ）の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントを含有する医薬組成物も含まれる。
（ａ）配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメント；及び
（ｂ）配列番号５のアミノ酸番号１のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメント。
　本発明はまた、本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド（以下、纏めて「本発明のポリヌクレオチド」とも称する）、並びにそれらのいずれか又は両方を含む発現ベクター（以下、「本発明の発現ベクター」とも称する）に関する。
　本発明の発現ベクターは、原核細胞及び／又は真核細胞の各種の宿主細胞中で本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び／又は本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを発現し、これらによりコードされるポリペプチドを産生できるものであれば特に制限されない。使用される発現ベクターとしては、プラスミドベクター、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス）等が挙げられ、例えば、ＧＳベクターｐＥＥ６．４やｐＥＥ１２．４（Ｌｏｎｚａ社）を使用することができる。１つの実施形態において、本発明の発現ベクターは、本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターである。別の実施形態において、本発明の発現ベクターは、本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターである。
　本発明の発現ベクターは、本発明のポリヌクレオチドに機能可能に連結されたプロモーターを含み得る。細菌中で本発明のＦａｂフラグメントあるいはその重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域をコードする遺伝子を発現させるためのプロモーターとしては、宿主がエシェリキア属菌の場合、例えば、Ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔａｃプロモーターなどが挙げられる。酵母中での発現用プロモーターとしては、例えば、ＰＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターが挙げられ、バチルス属菌での発現用プロモーターとしては、ＳＬ０１プロモーター、ＳＰ０２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなどが挙げられる。また、宿主が哺乳動物細胞等の真核細胞である場合、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、ヒートショックプロモーターなどが挙げられる。
　宿主細胞として細菌、特に大腸菌を用いる場合、本発明の発現ベクターは、開始コドン、終止コドン、ターミネーター領域及び複製可能単位をさらに含み得る。一方、宿主として酵母、動物細胞又は昆虫細胞を用いる場合、本発明の発現ベクターは、開始コドン、終止コドンを含み得る。また、この場合、エンハンサー配列、本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントをコードする遺伝子の５’側及び３’側の非翻訳領域、分泌シグナル配列、スプライシング接合部、ポリアデニレーション部位、又は複製可能単位などを含んでいてもよい。また、目的に応じて通常用いられる選択マーカー（例えば、テトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子）を含んでいてもよい。
　本発明はまた、本発明の発現ベクターで形質転換された宿主細胞に関する。形質転換体の作製に用いられる宿主細胞としては、前記の発現ベクターに適合し、形質転換され得るものであれば特に限定されず、本発明の技術分野において通常使用される天然細胞あるいは人工的に樹立された細胞など種々の細胞（例えば、細菌（エシェリキア属菌、バチルス属菌）、酵母（サッカロマイセス属、ピキア属など）、動物細胞（ＣＨＯ－Ｋ１ＳＶ細胞、ＣＨＯ－ＤＧ４４細胞、２９３細胞等）又は昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９）など）が例示される。形質転換自体は、公知の方法により行われ得る。
　本発明の宿主細胞としては、以下の（ａ）及び（ｂ）が挙げられる：
（ａ）本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと、該抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；及び
（ｂ）本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと、該抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
　本発明はまた、本発明の宿主細胞を培養し、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントを発現させる工程を含む、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントを生産する方法に関する。好ましくは、該方法で使用される宿主細胞としては、前記本発明の宿主細胞（ａ）及び（ｂ）が挙げられる。
　本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの生産において、形質転換された宿主細胞は、栄養培地中で培養され得る。栄養培地は、宿主細胞の生育に必要な炭素源、無機窒素源もしくは有機窒素源を含んでいることが好ましい。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖などが、無機窒素源もしくは有機窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などが例示される。また所望により他の栄養素（例えば、無機塩（例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム）、ビタミン類等）、抗生物質（例えば、テトラサイクリン、ネオマイシン、アンピシリン、カナマイシン等）を含んでいてもよい。
　宿主細胞の培養自体は、公知の方法により行われる。培養条件、例えば、温度、培地のｐＨ及び培養時間は、適宜選択される。例えば、宿主が動物細胞の場合、培地としては、約５～２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地（Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９５５、Ｖｏｌ．１２２、ｐ．５０１－５０４）、ＤＭＥＭ培地（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９５９、Ｖｏｌ．８、ｐ．３９６－３９７）、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．、１９６７、Ｖｏｌ．１９９、ｐ．５１９－５２４）、１９９培地（Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．、１９５０、Ｖｏｌ．７３、ｐ．１－８）等を用いることができる。培地のｐＨは約６～８であるのが好ましく、培養は通常約３０～４０℃で約１５～７２時間行なわれ、必要により通気や撹拌を行うこともできる。宿主が昆虫細胞の場合、例えば、胎児牛血清を含むＧｒａｃｅ’ｓ培地（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８５、Ｖｏｌ．８２、ｐ．８４０４－８４０８）等が挙げられ、そのｐＨは約５～８であるのが好ましい。培養は通常約２０～４０℃で１５～１００時間行なわれ、必要により通気や撹拌を行うこともできる。宿主が細菌、放線菌、酵母、糸状菌である場合、例えば、上記栄養源を含有する液体培地が適当である。好ましくは、ｐＨが５～８である培地である。宿主がＥ．ｃｏｌｉの場合、好ましい培地としてＬＢ培地、Ｍ９培地（Ｍｏｌ．Ｃｏｌ．、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｖｏｌ．３、Ａ２．２）等が例示される。かかる場合、培養は、必要により通気、撹拌しながら、通常１４～４３℃、約３～２４時間行うことができる。宿主がＢａｃｉｌｌｕｓ属菌の場合、必要により通気、撹拌をしながら、通常３０～４０℃、約１６～９６時間行うことができる。宿主が酵母である場合、培地として、例えば、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ最小培地（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８０、Ｖｏｌ．７７、ｐ．４５０４－４５０８）が挙げられ、ｐＨは５～８であることが望ましい。培養は通常約２０～３５℃で約１４～１４４時間行なわれ、必要により通気や撹拌を行うこともできる。
　本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントを生産する方法は、本発明の形質転換された宿主細胞を培養し、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントを発現させる工程に加えて、さらには、該宿主細胞から抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントを回収、好ましくは単離、精製することができる。単離又は精製方法としては、例えば、塩析、溶媒沈澱法等の溶解度を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）－ポリアクリルアミドゲル電気泳動など分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーやヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーなどの荷電を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動などの等電点の差を利用する方法などが挙げられる。
　本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントには、本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントを生産する方法で生産できる抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントも含まれる。
　本発明について全般的に記載したが、さらに理解を得るために参照する特定の実施例をここに提供する。しかし、これらは例示目的とするものであって、本発明を限定するものではない。
　市販のキット又は試薬等を用いた部分については、特に断りのない限り添付のプロトコールに従って実験を行った。
　（実施例１：抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの作製）
　１－１５（Ｎ５２Ｄ）－Ｆａｂ’フラグメント（特許文献３）の重鎖をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを鋳型として、ＶＨからヒンジ領域の遺伝子断片３種（配列番号１、配列番号２及び配列番号３）を各々増幅できるように設計したプライマーを用い、Ｐｈｕｓｉｏｎ　Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ社、Ｆ－５３０Ｌ）を用いて当該３種の遺伝子断片を増幅した。増幅した領域の５’側にはＨｉｎｄＩＩＩが、３’側にはＥｃｏＲＩが含まれている。このようにして得た重鎖遺伝子断片をＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩ（ともにＮＥＢ社）で消化し、発現ベクターであるｐＥＥ６．４に挿入した。
　これらの発現プラスミドを常法により大腸菌に導入して形質転換クローンを得、それからＷｉｚａｒｄ　Ｐｌｕｓ　ＳＶ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ　ＤＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、Ａ１４６０）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。一方、軽鎖遺伝子は、１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’フラグメントの軽鎖遺伝子と同じ塩基配列（配列番号４）であり、それによりコードされるアミノ酸配列は配列番号８である。この軽鎖遺伝子断片を含むｐＥＥ１２．４を使用した。
　抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖遺伝子断片が挿入されたＧＳベクター（ｐＥＥ６．４）、及び抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖遺伝子断片が挿入されたＧＳベクター（ｐＥＥ１２．４）を、制限酵素であるＮｏｔＩとＰｖｕＩ（ともにＮＥＢ社）を用いそれぞれ切断した。その後、ＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｍｉｘ（タカラバイオ社、６０２３）を用いてライゲーションを行い、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖及び軽鎖の両遺伝子断片が挿入されたＧＳベクターを構築した。得られたプラスミドＤＮＡを鋳型としてシークエンス反応を行い、クローニングされている重鎖をＶＨからヒンジ領域まで、軽鎖をＶＬからＣＬ領域までの塩基配列を確認した。３種類の重鎖の当該ＶＨからヒンジ領域の塩基配列を配列番号１、配列番号２及び配列番号３に示した。また、それによりコードされるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号５、配列番号６及び配列番号７に示した。３種類の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントは配列番号１の重鎖と配列番号４の軽鎖、配列番号２の重鎖と配列番号４の軽鎖及び配列番号３の重鎖と配列番号４の軽鎖を組み合わせて作製し、それぞれをｈ１ｆ．６抗体、ｈ１ｆ．７抗体、ｈ１ｆ．８抗体とした。
　当該ＧＳベクターを用いて、一過性発現及び恒常的発現の２種類の方法で抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントを発現させた。一過性発現については、ＣＤ－ＣＨＯ　ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で培養されたＣＨＯ－Ｋ１ＳＶ細胞（Ｌｏｎｚａ社）に対し、当該ＧＳベクターをＭａｘＣｙｔｅエレクトロポレーション装置（ＭａｘＣｙｔｅ社）によりトランスフェクトし、７日間培養した。その培養上清からＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ（ＧＥヘルスケア社、１７－５４５８－０２）を用いて、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントを精製した。恒常的発現については、エレクトロポレーション法を用いて制限酵素であるＰｖｕＩで切断した当該ＧＳベクターをＣＨＯ－Ｋ１ＳＶ細胞にトランスフェクトすることにより抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントを発現させた。その培養上清からＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔを用いて、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントを精製し、サイズ排除クロマトグラフィー及びＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて確認した。なお、精製したｈ１ｆ．６抗体の翻訳後修飾を確認するため質量分析を行った結果、その大部分においてＮ末端のピログルタミル化と考えられるピークが生じていた。
　（実施例２：各抗ヒトＮＧＦ抗体ＦａｂフラグメントのヒトＮＧＦ機能阻害活性評価）
　作製した各抗ヒトＮＧＦ抗体ＦａｂフラグメントのヒトＮＧＦ機能阻害活性評価を行うため、ヒトＮＧＦとその受容体ｔｒｋＡの結合阻害を指標としたヒトＮＧＦ－ｔｒｋＡ拮抗ＥＬＩＳＡを行った。ヒトｔｒｋＡ（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社、１７５－ＴＫ－０５０）をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２０００ｎｇ／ｍＬとなるように希釈し、ヌンクマキシソープ白色９６プレート（Ｎｕｎｃ社、４３６１１０）に１ウェルあたり５０μＬ添加し、４℃で一晩プレートをインキュベートすることで固相化した。逆遠心によりヒトｔｒｋＡ固相液を除去し、Ｂｌｏｃｋｅｒ　Ｃａｓｅｉｎ　ｉｎ　ＴＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ社、３７５３２）を１ウェルあたり２００μＬ添加した。プレートを室温にて３０分間インキュベートした後、逆遠心によりＢｌｏｃｋｅｒ　Ｃａｓｅｉｎ　ｉｎ　ＴＢＳを除去した。０．１％ウシ血清由来アルブミン（ＢＳＡ）含有ＰＢＳを用いて約２０００００ｎｇ／ｍＬから約２ｎｇ／ｍＬの間で７から１１段階に希釈した精製抗体サンプルを、それぞれ７００ｎｇ／ｍＬのビオチン化ヒトＮＧＦと等量ずつ混合し、室温にて３０分間インキュベートしたサンプルを１ウェルあたり１００μＬ添加した。尚、ここで用いたビオチン化ヒトＮＧＦは、ヒトＮＧＦ（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社、２５６－ＧＦ－１００／ＣＦ）をＥＺ－Ｌｉｎｋ ＮＨＳ－ＰＥＧ４－Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ社、２１３２９）を使用してビオチン化したものを用いた。ヒトＮＧＦのビオチン化は、２５０μＬの０．４ｍｇ／ｍＬ　ヒトＮＧＦ溶液に対して、１．２５μＬの５ｍＭ　ＮＨＳ－ＰＥＧ４－Ｂｉｏｔｉｎ溶液を添加し、氷上、遮光条件で２時間反応させた後、マニュアルに従ってＡｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ　３Ｋ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ＵＦＣ５００３２４）を２回用いて、反応液をＰＢＳ溶液として回収することにより行った。コントロールとして０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを準備した。室温にて３０分間インキュベートした後、プレートを洗浄液（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ－２０含有トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ））で３回洗浄し、ＰＢＳで２０倍に希釈したブロッキングワン（ナカライテスク社、０３９５３－９５）溶液で１０００倍に希釈したアルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジン（Ｔｈｅｒｍｏ社、２１３２４）を１ウェルあたり１００μＬ添加した。室温にて３０分間インキュベートした後、プレートを洗浄液で３回洗浄し、０．１ｍＭ塩化マグネシウム含有２ｍＭトリス（ｐＨ９．８）緩衝液で５倍希釈したアルカリフォスファターゼ基質（Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　ＡＰ　Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ／Ｍｅｍｂｒａｎｅ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，　Ｓｕｐｅｒ　Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，　４５０ｎｍ；ＳｕｒＭｏｄｉｃｓ社、ＡＰＵ４－０１００－０１）を１ウェルあたり１００μＬ加えた。室温にて３０分間インキュベートし、そのシグナル値をＥｎＶｉｓｉｏｎカウンター（パーキンエルマー社）で測定した。
　１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’フラグメント、ｈ１ｆ．６抗体、ｈ１ｆ．７抗体、ｈ１ｆ．８抗体の試験を２試行実施した。各抗体のヒトＮＧＦ－ｔｒｋＡ結合阻害率を算出するにあたり、０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳの測定値を０％とし、各抗体における最大濃度の測定値を１００％と設定した。算出されたヒトＮＧＦ－ｔｒｋＡ結合阻害率を解析し、３パラメータロジスティック又は４パラメータロジスティック曲線回帰により抗体のＩＣ５０値を算出した。２試行のＩＣ５０値を幾何平均した結果、１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’フラグメント、ｈ１ｆ．６抗体、ｈ１ｆ．７抗体、ｈ１ｆ．８抗体のヒトＮＧＦ－ｔｒｋＡ結合阻害ＩＣ５０値はそれぞれ０．３０μｇ／ｍＬ、０．３２μｇ／ｍＬ、０．３０μｇ／ｍＬ、０．２８μｇ／ｍＬであり、これらのヒトＮＧＦ－ｔｒｋＡ結合阻害能はほぼ同等であった。
　（実施例３：各抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの５０℃、１４日間保存による二量体形成評価）
　１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’フラグメント、ｈ１ｆ．６抗体、ｈ１ｆ．７抗体、ｈ１ｆ．８抗体の各溶液をｐＨ５，６，７の緩衝液（ｐＨ５，６は２０ｍＭ　クエン酸・１２０ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ７はＰＢＳ）に置換し、１０ｍｇ／ｍＬに調整して５０℃、１４日間保存し、安定性を評価した。
　５０℃、１４日間保存する前後のサンプル中の二量体の形成はＬＣ１１００（アジレントテクノロジー社）を用い、カラムとしてＴＳＫ　ｇｅｌ　Ｓｕｐｅｒ　Ｓｗ３０００（ＴＯＳＯＨ社、２ｍｍＩＤ×３００ｍｍ）サイズ排除クロマトグラフィーを用いて評価した。移動相として０．１Ｍリン酸水素二ナトリウム、０．２Ｍ　Ｌ（＋）アルギニン酸塩に塩酸を加えてｐＨ６．８に調整した溶液を用い、流速を０．０７５ｍＬ／分、温度２５℃で使用し、検出波長２８０ｎｍ、リファレンス波長３６０ｎｍで測定した。測定は各２回実施して二量体形成率を算術平均し、保存後の二量体形成率から保存前の二量体形成率を引くことで二量体増加率を算出した。結果、１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’フラグメントの二量体増加率はｐＨ５，６，７の条件下でそれぞれ５．４％、１７．０％、１８．２％であり、いずれのｐＨにおいても顕著な二量体の形成を認めた。一方でｈ１ｆ．６抗体の二量体増加率はｐＨ５，６，７の条件下でそれぞれ０．１％、０．３％、０．５％、ｈ１ｆ．７抗体の二量体増加率はｐＨ５，６，７の条件下でそれぞれ０．１％、０．３％、０．４％、ｈ１ｆ．８抗体の二量体増加率はｐＨ５，６，７の条件下でそれぞれ０．１％、０．５％、０．７％、であった。ｈ１ｆ．６抗体、ｈ１ｆ．７抗体、ｈ１ｆ．８抗体は１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’フラグメントに比べて二量体の増加率が顕著に低く、安定であることが示された。
　（実施例４：各抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの５０℃、１４日間保存によるヒトＮＧＦ機能阻害活性安定性評価）
　ｐＨ６において５０℃、１４日間保存した１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’フラグメント、ｈ１ｆ．６抗体、ｈ１ｆ．７抗体、及びｈ１ｆ．８抗体の保存後のヒトＮＧＦ－ｔｒｋＡ結合阻害活性の変化を実施例２に記載のヒトＮＧＦ－ｔｒｋＡ拮抗ＥＬＩＳＡを用いて評価した。２試行のＩＣ５０値を幾何平均した結果、１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’フラグメント、ｈ１ｆ．６抗体、ｈ１ｆ．７抗体、ｈ１ｆ．８抗体の５０℃、１４日間保存後のヒトＮＧＦ－ｔｒｋＡ結合阻害ＩＣ５０値はそれぞれ０．４７μｇ／ｍＬ、０．３８μｇ／ｍＬ、０．５６μｇ／ｍＬ、０．４７μｇ／ｍＬであった。各抗体の５０℃、１４日間保存後の保存前に対するＩＣ５０増加率はそれぞれ５９％、２１％、８７％、６８％であった。
　以上より、ｈ１ｆ．６抗体、ｈ１ｆ．７抗体、ｈ１ｆ．８抗体が５０℃、１４日間の保存において１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’フラグメントで起こる二量体増加を顕著に減少させた。ｈ１ｆ．６抗体は保存中の活性減弱も少なく、高い安定性を持つ抗ＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントであることを見出した。
（実施例５：ＥＬＩＳＡによる抗ヒトＮＧＦ抗体のヒトＮＧＦ結合評価）
　ｈ１ｆ．６抗体の抗原結合活性を測定するために、ＥＬＩＳＡを使用した。ここではヒトＮＧＦに対する結合能を評価するために、ヒトＮＧＦを固相化したプレートを用いて試験した。この際、比較対照として先行抗体Ｔａｎｅｚｕｍａｂを用いた。
　ヒトＮＧＦ（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社、２５６－ＧＦ－１００／ＣＦ）をＰＢＳで１０００ｎｇ／ｍＬとなるように希釈し、ヌンクマキシソープ白色９６プレート（Ｎｕｎｃ社、４３６１１０）に１ウェルあたり１００μＬ添加し、４℃で一晩プレートをインキュベートすることで固相化した。逆遠心によりヒトＮＧＦ固相液を除去し、Ｂｌｏｃｋｅｒ　Ｃａｓｅｉｎ　ｉｎ　ＴＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ社、３７５３２）を１ウェルあたり２００μＬ添加し、室温にて３０分間プレートをインキュベートした。その後逆遠心によりＢｌｏｃｋｅｒ　Ｃａｓｅｉｎ　ｉｎ　ＴＢＳを除去し、０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを用いて、精製抗体サンプルを１０００ｎｇ／ｍＬから０．０１ｎｇ／ｍＬまで１１段階に希釈し、１ウェルあたり１００μＬ添加して、室温にて３０分間プレートをインキュベートした。コントロールとして０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを準備した。プレートを洗浄液（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ－２０含有ＴＢＳ）で３回洗浄し、ＰＢＳで２０倍に希釈したブロッキングワン（ナカライテスク社、０３９５３－９５）溶液で１０００倍に希釈したビオチン化抗ヒトＫａｐｐａ軽鎖抗体（ＩＢＬ社、１７２４９）を１ウェルあたり１００μＬ添加し、室温で３０分インキュベートした。プレートを洗浄液で３回洗浄し、ＰＢＳで２０倍に希釈したブロッキングワン溶液で１０００倍に希釈したアルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジン（Ｔｈｅｒｍｏ社、２１３２４）を１ウェルあたり１００μＬ添加し、プレートを室温にて０．５時間インキュベートした。プレートを洗浄液で３回洗浄し、０．１ｍＭ塩化マグネシウム含有２ｍＭトリス（ｐＨ９．８）緩衝液で５倍希釈したアルカリフォスファターゼ基質（Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　ＡＰ　Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ／Ｍｅｍｂｒａｎｅ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，　Ｓｕｐｅｒ　Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，　４５０ｎｍ；ＳｕｒＭｏｄｉｃｓ社、ＡＰＵ４－０１００－０１）を１ウェルあたり１００μＬ加えた。室温にて３０分間インキュベートし、そのシグナル値をＥｎＶｉｓｉｏｎカウンター（パーキンエルマー社）で測定した。
　各抗体の試験をデュプリケートで行い、算術平均を算出した。各抗体のヒトＮＧＦ結合率を算出するにあたり、０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳの測定値を０％とし、各抗体における最大濃度の測定値を１００％と設定した。算出されたヒトＮＧＦ結合率を解析し、３パラメータロジスティック曲線回帰により抗体のＥＣ５０値を算出した。ｈ１ｆ．６抗体については２試行のＥＣ５０値を幾何平均した結果、ｈ１ｆ．６抗体のＥＣ５０値は７３．０ｎｇ／ｍＬであったのに対し、ＴａｎｅｚｕｍａｂのＥＣ５０値は１４６ｎｇ／ｍＬであった。
（実施例６：抗ヒトＮＧＦ抗体のヒトＮＧＦ機能阻害活性評価）
　ｈ１ｆ．６抗体のヒトＮＧＦ機能阻害活性を測定するために、実施例２で用いたＮＧＦ－ｔｒｋＡ結合阻害を評価する拮抗ＥＬＩＳＡを使用した。この際、比較対照として先行抗体Ｔａｎｅｚｕｍａｂを用いた。
　ｈ１ｆ．６抗体は４試行、Ｔａｎｅｚｕｍａｂは３試行実施し、算出したＩＣ５０値の幾何平均を算出した。結果、ｈ１ｆ．６抗体のヒトＮＧＦ－ｔｒｋＡ結合阻害ＩＣ５０値は０．３１μｇ／ｍＬであったのに対し、ＴａｎｅｚｕｍａｂのヒトＮＧＦ－ｔｒｋＡ結合阻害ＩＣ５０値は０．８６μｇ／ｍＬであった。
（実施例７：組織中の抗体の局所滞留性、ヒトＮＧＦ結合活性及びヒトＮＧＦ機能阻害活性の評価）
　ｈ１ｆ．６抗体を局所投与した後、抗体の局所滞留を評価するため、投与組織における抗体濃度を評価した。正常ラットに各ｎ＝４でｈ１ｆ．６抗体を０．３及び３ｍｇ／ｋｇで大腿筋内に局所投与し、投与６時間後の大腿筋中の抗体濃度をＥｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ（ＥＣＬ）アッセイにより測定した。局所投与は抗体をＰＢＳを溶媒として０．２ｍＬ／ｋｇの投与容量で大腿筋内に注射することで行った。
　採取した大腿筋組織は２．５倍量の組織ホモジネート液（１０ｍＭ　トリス、１３７ｍＭ　ＮａＣｌ、ｃＯｍｐｌｅｔｅ，Ｍｉｎｉ（Ｒｏｃｈｅ社）、ｐＨ８．０）を添加し、大腿筋ホモジネートを作製した。ＥＣＬアッセイでの測定にはベロシミューンマウスにヒトＮＧＦを免疫して得られた１－１５抗体（特許文献３）をマウスに免疫して取得した２種類の抗１－１５抗体であるＡＮＡ－ＩＢＬ－１３Ａとビオチン化ＡＮＡ－ＩＢＬ－５２Ａを用いた。尚、ここで用いたビオチン化ＡＮＡ－ＩＢＬ－５２Ａは、ＡＮＡ－ＩＢＬ－５２ＡをＢｉｏｔｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ－ＮＨ２（同仁化学、ＬＫ０３）を用いて、テクニカルマニュアルに従いビオチン化したものを用いた。
　ＥＣＬアッセイの方法を以下に示す。抗１－１５抗体であるＡＮＡ－ＩＢＬ－１３ＡをＴＢＳで１０００ｎｇ／ｍＬとなるように希釈し、Ｍｕｌｔｉ－ａｒｒａｙ　９６－ｗｅｌｌ　Ｐｌａｔｅ（Ｍｅｓｏ　Ｓｃａｌｅ　Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ社、Ｌ１５ＸＡ－６）に１ウェルあたり２５μＬ添加した。室温で１時間プレートをインキュベートすることで、ＡＮＡ－ＩＢＬ－１３Ａを固相化した。逆遠心によりＡＮＡ－ＩＢＬ－１３Ａ固相液を除去し、プレートを洗浄液（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ－２０含有ＴＢＳ）で３回洗浄し、Ｂｌｏｃｋｅｒ　Ｃａｓｅｉｎ　ｉｎ　ＴＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ社、３７５３２）を１ウェルあたり１５０μＬ添加した。室温で1時間インキュベートした後、逆遠心によりＢｌｏｃｋｅｒ　Ｃａｓｅｉｎ　ｉｎ　ＴＢＳを除去し、プレートを洗浄液で３回洗浄し、大腿筋ホモジネートは希釈液（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ－２０含有Ｂｌｏｃｋｅｒ　Ｃａｓｅｉｎ　ｉｎ　ＴＢＳ）で１００倍に希釈し、さらに希釈が必要なサンプルについては、抗体未投与の大腿筋ホモジネートを１％含む希釈液を用いて検量線の範囲内になるように希釈して、１ウェルあたり２５μＬ添加した。大腿筋ホモジネートの検量線作成用に、希釈液を用いて１００００ｎｇ／ｍＬから０．５１ｎｇ／ｍＬまで１０段階に希釈したｈ１ｆ．６抗体を、抗体未投与の大腿筋ホモジネート１％を含む希釈液を用いて１００倍希釈したサンプルを準備した。コントロールとして、抗体未投与の大腿筋ホモジネート１％を含む希釈液を準備した。室温にて１時間インキュベートした後、逆遠心により溶液を除去し、プレートを洗浄液で３回洗浄し、希釈液を用いて３００ｎｇ／ｍＬとなるように希釈したビオチン化ＡＮＡ－ＩＢＬ－５２Ａを１ウェルあたり２５μＬ添加した。室温にて1時間インキュベートした後、逆遠心により溶液を除去し、プレートを洗浄液で３回洗浄し、希釈液を用いて１０００ｎｇ／ｍＬに希釈したＭＳＤ　ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ　ｌａｂｅｌｅｄ　Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（Ｍｅｓｏ　Ｓｃａｌｅ　Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ社、Ｒ３２ＡＤ－１）を２５μＬ添加した。室温にて1時間インキュベートした後、逆遠心により溶液を除去し、プレートを洗浄液で３回洗浄した。超純水（ＭｉｌｌｉＱ（登録商標）、メルク社）で２倍に希釈したＭＳＤ　Ｒｅａｄ　Ｂｕｆｆｅｒ　Ｔ（４ｘ）ｗｉｔｈ　Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ（Ｍｅｓｏ　Ｓｃａｌｅ　Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ社、Ｒ９２ＴＣ－２）を１５０μＬ添加し、その電気化学発光をＳＥＣＴＯＲ　Ｉｍａｇｅｒ　６０００（Ｍｅｓｏ　Ｓｃａｌｅ　Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ社）で測定した。
　抗体濃度を算出するにあたり、検量線を作成した。回帰式は４パラメータロジスティック曲線回帰にて解析を行った。検量線から、各ポイントにおける大腿筋中の抗体濃度を算出した。各個体をデュプリケートで行い、濃度の算術平均を求めた。
　ｈ１ｆ．６抗体を０．３及び３ｍｇ/ｋｇ大腿筋内へ局所投与して、投与６時間後の大腿筋中濃度を測定した結果、ｈ１ｆ．６抗体の０．３及び３ｍｇ/ｋｇ投与群ではそれぞれ２．６６μｇ／ｍＬ及び６７．９μｇ／ｍＬであった。
　次に、大腿筋中でのヒトＮＧＦ結合活性を有するｈ１ｆ．６抗体量を測定するため、ヒトＮＧＦ結合ＥＬＩＳＡを使用した。
　ヒトＮＧＦ（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社、２５６－ＧＦ／ＣＦ）をＰＢＳで１０００ｎｇ／ｍＬとなるように希釈し、ヌンクマキシソープ白色３８４プレート（Ｎｕｎｃ社、４６０３７２）に１ウェルあたり２０μＬ添加し、４℃で一晩プレートをインキュベートして固相化した。逆遠心によりヒトＮＧＦ固相液を除去し、ブロッキングワン（ナカライテスク社、０３９５３－９５）溶液を１ウェルあたり８０μＬ添加し、室温にて１時間プレートをインキュベートした。プレートを洗浄液（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ－２０含有ＴＢＳ）で３回洗浄し、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ－２０含有ＴＢＳで１０倍に希釈したブロッキングワンを用いて０．３ｍｇ／ｋｇ投与群は１０倍、３ｍｇ／ｋｇ投与群は１００倍に大腿筋ホモジネートを希釈し、１ウェルあたり２０μＬ添加した。
　また、０．３ｍｇ／ｋｇ投与群及び３ｍｇ／ｋｇ投与群の大腿筋ホモジネートの検量線作成用に、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ－２０含有ＴＢＳで１０倍に希釈したブロッキングワンに抗体未投与の大腿筋ホモジネート１０％及び１％を加えた希釈液で、それぞれｈ１ｆ．６抗体を３０００ｎｇ／ｍＬから０．０３ｎｇ／ｍＬまで１１段階に希釈し、１ウェルあたり２０μＬ添加した。
　室温にて１時間インキュベートした後、プレートを洗浄液で３回洗浄し、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ－２０含有ＴＢＳで１０倍に希釈したブロッキングワンを用いて、ビオチン化抗ヒトＫａｐｐａ軽鎖抗体（ＩＢＬ社、１７２４９）を２５００倍希釈し、１ウェルあたり２０μＬ添加した。室温にて１時間インキュベートした後、プレートを洗浄液で３回洗浄し、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ－２０含有ＴＢＳで１０倍希釈したブロッキングワンを用いて、高感度ストレプトアビジン－ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ社、２１１３０）を８０００倍希釈し、１ウェルあたり２０μＬ添加して室温にて１時間プレートをインキュベートした。プレートを洗浄液で３回洗浄し、化学発光基質（ＢＭ　Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ　ＥＬＩＳＡ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＰＯＤ）；Ｒｏｃｈｅ社、１１５８２９５０００１）を１ウェルあたり２０μＬ加え、そのシグナル値をＥｎＶｉｓｉｏｎカウンター（パーキンエルマー社）で測定した。試験はデュプリケートで行い、ヒトＮＧＦ結合活性を有する抗体量を算出するために検量線を作成した。回帰式は４パラメータロジスティック曲線回帰により、検量線から各ポイントにおけるヒトＮＧＦ結合活性を有する抗体量を算出した。０．３及び３ｍｇ／ｋｇ投与群に関してそれぞれ３５倍及び３５０倍することで大腿筋中でのヒトＮＧＦ結合活性を有するｈ１ｆ．６抗体量を求め、算術平均を算出した。
　その結果、０．３ｍｇ／ｋｇ投与群でヒトＮＧＦ結合活性を有するｈ１ｆ．６抗体は２．１２μｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｋｇ投与群では７７．９μｇ／ｍＬであった。
　よって、上記の大腿筋中のｈ１ｆ．６抗体濃度及びヒトＮＧＦ結合活性を有するｈ１ｆ．６抗体量の結果から、大腿筋中に存在する抗体のほぼ全てが、ヒトＮＧＦ結合活性を有することが示された。
　そこで次に、大腿筋中のヒトＮＧＦ機能阻害活性評価を行うため、ヒトＮＧＦとその受容体ｔｒｋＡの結合阻害を指標としたヒトＮＧＦ－ｔｒｋＡ拮抗ＥＬＩＳＡを行った。
　ヒトｔｒｋＡ（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社、１７５－ＴＫ－０５０）をＰＢＳで２０００ｎｇ／ｍＬとなるように希釈し、ヌンクマキシソープ白色３８４プレートに１ウェルあたり２０μＬ添加し、４℃で一晩インキュベートすることで固相化した。逆遠心によりヒトｔｒｋＡ固相液を除去し、Ｂｌｏｃｋｅｒ　Ｃａｓｅｉｎ　ｉｎ　ＴＢＳを１ウェルあたり８０μＬ添加し、室温にて３０分間プレートをインキュベートした。プレートを洗浄液（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ－２０含有ＴＢＳ）で３回洗浄し、Ｂｌｏｃｋｅｒ　Ｃａｓｅｉｎ　ｉｎ　ＴＢＳを除去した。０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを用いて０．３ｍｇ／ｋｇ投与群は５倍、３ｍｇ／ｋｇ投与群は５０倍に希釈したラット大腿筋ホモジネートを、それぞれ０．４μｇ／ｍＬのビオチン化ヒトＮＧＦと等量ずつ混合し、室温にて３０分間インキュベートしたサンプルを１ウェルあたり２０μＬ添加した。尚、ラット大腿筋ホモジネートは採取した大腿筋組織を２．５倍量の組織ホモジネート液で作製しているため、０．３及び３ｍｇ／ｋｇ投与群はもとの大腿筋組織濃度のそれぞれ３５倍及び３５０倍希釈した溶液を用いて評価している。
　ここで用いたビオチン化ヒトＮＧＦは、ヒトＮＧＦ（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社、２５６－ＧＦ－１００／ＣＦ）をＥＺ－Ｌｉｎｋ ＮＨＳ－ＰＥＧ４－Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ社、２１３２９）を使用してビオチン化したものを用いた。ヒトＮＧＦのビオチン化は、１ｍＬの０．４ ｍｇ／ｍＬ　ヒトＮＧＦ溶液に対して、５μＬの５ｍＭ　ＮＨＳ－ＰＥＧ４－Ｂｉｏｔｉｎ溶液を添加した。氷上、遮光条件で２時間反応させた後、マニュアルに従ってＡｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ　３Ｋ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ＵＦＣ５００３２４）を２回用いて、反応液をＰＢＳ溶液として回収することにより行った。
　コントロールとして０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳと、０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを用いて希釈したｈ１ｆ.６抗体　１０μｇ／ｍＬを準備した。０．３ｍｇ／ｋｇ投与群及び３ｍｇ／ｋｇ投与群のコントロールサンプルは０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳに抗体未投与の大腿筋ホモジネートを１０％及び１％加えた希釈液を用いてそれぞれ調製した。室温にて３０分間インキュベートした後、プレートを洗浄液で３回洗浄し、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ－２０含有ＴＢＳで２０倍に希釈したブロッキングワン溶液で１０００倍に希釈したアルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジン（Ｔｈｅｒｍｏ社、２１３２４）を１ウェルあたり２０μＬ添加した。室温にて３０分間インキュベートした後、プレートを洗浄液で３回洗浄し、１０ｍＭ塩化マグネシウム含有２００ｍＭトリス（ｐＨ９．８）緩衝液を１０倍希釈した溶液と１：１で混和したアルカリフォスファターゼ基質（Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　ＡＰ　Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ／Ｍｅｍｂｒａｎｅ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，　Ｓｕｐｅｒ　Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，　４５０ｎｍ；ＳｕｒＭｏｄｉｃｓ社、ＡＰＵ４－０１００－０１）を１ウェルあたり２０μＬ加えた。室温にて３０分間インキュベートし、そのシグナル値をＥｎＶｉｓｉｏｎカウンター（パーキンエルマー社）で測定した。
　各濃度におけるヒトＮＧＦ機能阻害活性を算出するにあたり、０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを添加したサンプルの測定値を０％とし、１０μｇ／ｍＬの測定値を１００％と設定した。試験はデュプリケート（コントロールは４或いは８ウェル）で行い、算術平均を算出した。
　その結果、０．３ｍｇ／ｋｇ投与群では、大腿筋内抗体濃度の３５倍薄い条件においても２１．２％の阻害活性を示した。また、３ｍｇ／ｋｇ投与群では、大腿筋内抗体濃度の３５０倍薄い条件において５９．９％の阻害活性を示した。すなわち、ｈ１ｆ．６抗体を０．３及び３ｍｇ／ｋｇ投与した群の大腿筋組織中では、ヒトＮＧＦとその受容体ｔｒｋＡの結合を阻害することによるヒトＮＧＦ機能阻害活性を有することを確認できた。
　以上から、本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントであるｈ１ｆ．６抗体は局所に投与することで標的組織での抗体濃度及びヒトＮＧＦ結合活性を保つことにより、ヒトＮＧＦとその受容体の結合を阻害することが明らかとなった。本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントであるｈ１ｆ．６抗体は、より少ない局所投与量で標的組織の局所薬効を発現する優れた医薬品になり得る可能性が高いことが期待される。
（実施例８：ラット足裏切開術後痛モデルにおける鎮痛効果評価）
　臨床における術後疼痛を反映するとされるラット足裏切開術後痛モデル(Ｐａｉｎ、２００５、Ｖｏｌ．１１７、ｐ．６８－７６)を用いて、ｈ１ｆ．６抗体を術部に局所投与した際の術後痛に対する鎮痛効果を評価した。特許文献３には、完全ヒト型抗ヒトＮＧＦ抗体１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’－１０ｋＰＥＧが静脈内投与の全身投与によって本モデルでの鎮痛効果を有することが示されている。本試験では、ｈ１ｆ．６抗体の局所投与による術後痛に対する鎮痛効果を評価するにあたり、比較対照として１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’－１０ｋＰＥＧの局所投与及び全身投与を用いた。
　具体的には、手術群は各群１０匹、非手術群は５匹とし、非手術群、溶媒（２０ｍＭ　Ｃｉｔｒａｔｅ，１２０ｍＭ　ＮａＣｌ，ｐＨ６）群、ｈ１ｆ．６抗体を９００μｇ足裏局所投与した群、１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’－１０ｋＰＥＧを９００μｇ足裏局所投与した群、及び１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’－１０ｋＰＥＧを１ｍｇ／ｋｇ静脈内投与した群の計５群を設定した。足裏局所投与は約２ｍｇ小片のＳｐｏｎｇｅｌ（登録商標）シート（アステラス製薬）に３０ｍｇ／ｍＬ抗体溶液３０μＬを浸透膨潤させたものを切開した足底の筋部に埋め込むことで行った。また、溶媒群及び１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’－１０ｋＰＥＧを１ｍｇ／ｋｇ静脈内投与した群においては溶媒を浸透膨潤させたＳｐｏｎｇｅｌシートを埋め込んだ。本評価ではイソフルラン麻酔下において左後肢足裏を踵先端から約５ｍｍ部分を起点として約１０ｍｍつま先方向へ直線的に切開し、露出した足底筋を縦方向に切開後、筋の位置を戻し、Ｓｐｏｎｇｅｌシートを埋め込んでナイロン糸で２か所マットレス縫合した。手術終了２４時間、４８時間、７２時間後の疼痛閾値を測定した。疼痛閾値は、Ｄｙｎａｍｉｃ　ｐｌａｎｔａｒ　ａｅｓｔｈｅｓｉｏｍｅｔｅｒ（Ｕｇｏ　Ｂａｓｉｌｅ社）を用いて、ラットの足裏への加圧に対する逃避行動を示す圧力を測定した。
　疼痛閾値として各群の個体の回避行動を起こした圧力閾値の３回の算術平均を算出し、非手術群の疼痛閾値を１００％、溶媒群の疼痛閾値を０％として各薬剤群の疼痛閾値の改善率を算出した。結果、術後２４時間後のｈ１ｆ．６抗体を９００μｇ足裏局所投与した群、１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’－１０ｋＰＥＧを９００μｇ足裏局所投与した群、１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’－１０ｋＰＥＧを１ｍｇ／ｋｇ静脈内投与した群の疼痛閾値改善率は、それぞれ３４％、４９％、４６％であり、各薬剤投与群の疼痛閾値はＳｔｕｄｅｎｔ－ｔ検定においていずれも溶媒群に対してｐ＜０．０５の有意な改善作用を認めた。また、術後４８時間後のｈ１ｆ．６抗体を９００μｇ足裏局所投与した群、１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’－１０ｋＰＥＧを９００μｇ足裏局所投与した群、１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’－１０ｋＰＥＧを１ｍｇ／ｋｇ静脈内投与した群の疼痛閾値改善率は、それぞれ３８％、３１％、３４％であり、各薬剤投与群の疼痛閾値はＳｔｕｄｅｎｔ－ｔ検定においていずれも溶媒群に対してｐ＜０．０５の有意な改善作用を認め、術後７２時間後のｈ１ｆ．６抗体を９００μｇ足裏局所投与した群、１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’－１０ｋＰＥＧを９００μｇ足裏局所投与した群、１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’－１０ｋＰＥＧを１ｍｇ／ｋｇ静脈内投与した群の疼痛閾値改善率は、それぞれ２６％、３３％、２８％であり、各薬剤投与群の疼痛閾値はＳｔｕｄｅｎｔ－ｔ検定においていずれも溶媒群に対してｐ＜０．０５の有意な改善作用を認めた。この際、術後２４時間後、４８時間後、７２時間後のいずれにおいてもＴｕｋｅｙ多重比較検定においてｈ１ｆ．６抗体を９００μｇ足裏局所投与した群、１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’－１０ｋＰＥＧを９００μｇ足裏局所投与した群、１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’－１０ｋＰＥＧを１ｍｇ／ｋｇ静脈内投与した群の３群の間で疼痛閾値にｐ＜０．０５の有意な差は見られず、これら３群間で観察された鎮痛薬効は術後２４時間後、４８時間後、７２時間後のいずれにおいても薬理学的に同等であることが判明した。
（実施例９：局所投与による血漿中及び組織中の薬物濃度評価）
　実施例８での評価の際の各抗体の足底筋中及び血漿中の濃度を評価するために、実施例８と同様の方法でラットに各ｎ＝３でｈ１ｆ．６抗体を９００μｇ足裏局所投与した群、１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’－１０ｋＰＥＧを９００μｇ足裏局所投与した群、１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’－１０ｋＰＥＧを１ｍｇ／ｋｇ静脈内投与した群を設定し、２４時間後の足底筋中及び血漿中の抗体濃度をＥＣＬアッセイにより測定した。足裏局所投与は実施例８と同じく約２ｍｇ小片のＳｐｏｎｇｅｌ（登録商標）シート（アステラス製薬）に３０ｍｇ／ｍＬ抗体溶液３０μＬを浸透膨潤させたものを切開した足底の筋部に埋め込み縫合することで行った。
　足底筋中の抗体濃度は、採取した足底筋を９倍量の足裏組織ホモジネート液（１０ｍＭ　トリス、１３７ｍＭ　ＮａＣｌ、１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００、１０％　Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、ｃＯｍｐｌｅｔｅ，　Ｍｉｎｉ（Ｒｏｃｈｅ社）、ｐＨ８．０）でホモジネートしたサンプル中濃度を測定し、その濃度を１０倍した値を用いた。ＥＣＬアッセイでの測定には２種類の抗１－１５抗体であるＡＮＡ－ＩＢＬ－１３Ａとビオチン化ＡＮＡ－ＩＢＬ－５２Ａを用いた。尚、ここで用いたビオチン化ＡＮＡ－ＩＢＬ－５２Ａは、ＡＮＡ－ＩＢＬ－５２ＡをＢｉｏｔｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ－ＮＨ２（同仁化学、ＬＫ０３）を用いて、テクニカルマニュアルに従いビオチン化したものを用いた。
　ＥＣＬアッセイの方法を以下に示す。ＡＮＡ－ＩＢＬ－１３ＡをＴＢＳで５０００ｎｇ／ｍＬとなるように希釈し、Ｍｕｌｔｉ－ａｒｒａｙ　９６－ｗｅｌｌ　Ｐｌａｔｅ（Ｍｅｓｏ　Ｓｃａｌｅ　Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ社、Ｌ１５ＸＡ－３）に１ウェルあたり２５μＬ添加した。室温で１時間プレートをインキュベートすることで、ＡＮＡ－ＩＢＬ－１３Ａを固相化した。逆遠心によりＡＮＡ－ＩＢＬ－１３Ａ固相液を除去し、洗浄液（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ－２０含有ＴＢＳ）でプレートを３回洗浄し、Ｂｌｏｃｋｅｒ　Ｃａｓｅｉｎ　ｉｎ　ＴＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ社、３７５３２）を１ウェルあたり１５０μＬ添加した。プレートを室温で１時間インキュベートした後、逆遠心によりＢｌｏｃｋｅｒ　Ｃａｓｅｉｎ　ｉｎ　ＴＢＳを除去した。プレートを洗浄液で３回洗浄し、血漿サンプル及び足底筋ホモジネートを希釈液（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ－２０含有Ｂｌｏｃｋｅｒ　Ｃａｓｅｉｎ　ｉｎ　ＴＢＳ）で１０倍に希釈し、１ウェルあたり２５μＬ添加した。血漿サンプルの検量線作成用に、抗体未投与の血漿１０％を含む希釈液を用いて、３３３ｎｇ／ｍＬから０．０１７ｎｇ／ｍＬまで１０段階に希釈したｈ１ｆ．６抗体及び１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’－１０ｋＰＥＧを準備し、コントロールとして、抗体未投与の血漿１０％を含む希釈液を準備した。足底筋ホモジネートの検量線作成用に、抗体未投与の足底筋ホモジネート１０％を含む希釈液を用いて、３３３ｎｇ／ｍＬから０．０１７ｎｇ／ｍＬまで１０段階に希釈したｈ１ｆ．６抗体及び１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’－１０ｋＰＥＧを準備した。コントロールとして、抗体未投与の足底筋ホモジネート１０％を含む希釈液を準備した。室温にて１時間プレートをインキュベートした後、逆遠心により溶液を除去した。プレートを洗浄液で３回洗浄し、希釈液を用いて１０００ｎｇ／ｍＬとなるように希釈したビオチン化ＡＮＡ－ＩＢＬ－５２Ａを１ウェルあたり２５μＬ添加して、プレートを室温にて１時間インキュベートした。逆遠心により溶液を除去し、洗浄液で３回洗浄し、希釈液を用いて５００倍に希釈したＭＳＤ　ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ　ｌａｂｅｌｅｄ　Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（Ｍｅｓｏ　Ｓｃａｌｅ　Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ社、Ｒ３２ＡＤ－１）を２５μＬ添加した。プレートを室温にて１時間インキュベートした後、逆遠心により溶液を除去し、プレートを洗浄液で３回洗浄した。超純水（ＭｉｌｌｉＱ（登録商標）、メルク社）で２倍に希釈したＭＳＤ　Ｒｅａｄ　Ｂｕｆｆｅｒ　Ｔ（４ｘ）（Ｍｅｓｏ　Ｓｃａｌｅ　Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ社、Ｒ９２ＴＣ－１）を１５０μＬ添加し、その電気化学発光をＳＥＣＴＯＲ　Ｉｍａｇｅｒ　６０００（Ｍｅｓｏ　Ｓｃａｌｅ　Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ社）で測定した。
　抗体濃度を算出するにあたり、検量線を作成した。回帰式は４パラメータロジスティックもしくは５パラメータロジスティック曲線回帰により解析を行った。検量線から、各ポイントにおける血漿中及び足底筋中の抗体濃度を算出した。各試験をトリプリケートで行い、算出した濃度の算術平均を求めた。本試験でのｈ１ｆ．６抗体の定量限界は血漿中濃度が０．２ｎｇ／ｍＬ、足底筋中濃度が２ｎｇ／ｍＬであり、完全ヒト型抗ＮＧＦ抗体１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’－１０ｋＰＥＧの定量限界は血漿中濃度が０．５ｎｇ／ｍＬ、足底筋中濃度が２ｎｇ／ｍＬであった。
　ｈ１ｆ．６抗体を９００μｇ足裏局所投与した群、１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’－１０ｋＰＥＧを９００μｇ足裏局所投与した群、１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’－１０ｋＰＥＧを１ｍｇ／ｋｇ静脈内投与した群のそれぞれにおける投与２４時間後の足底筋中濃度を測定した結果、それぞれ１３２ｎｇ／ｍＬ、４６．２ｎｇ／ｍＬ、２４．１ｎｇ／ｍＬであった。ｈ１ｆ．６抗体を足裏内投与した群の足底筋中濃度が最も高かった。一方、投与２４時間後の血漿中濃度はそれぞれ０．２３０ｎｇ／ｍＬ未満（３例中１例は０．２３０ｎｇ／ｍＬ、２例は０．２ｎｇ／ｍＬ未満）、６５．１ｎｇ／ｍＬ、３９６ｎｇ／ｍＬであり、ｈ１ｆ．６抗体を足裏内投与した群の血漿中濃度が最も低かった。
　各抗体の足底筋中濃度及び血漿中濃度を基に、ｈ１ｆ．６抗体を９００μｇ足裏局所投与した群、１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’－１０ｋＰＥＧを９００μｇ足裏局所投与した群、１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’－１０ｋＰＥＧを１ｍｇ／ｋｇ静脈内投与した群のそれぞれについて投与２４時間後の足底筋中／血漿中の濃度比を算出した。その際、定量限界未満であったｈ１ｆ．６抗体を９００μｇ足裏局所投与した個体の投与２４時間後の血漿中濃度は定量限界の０．２ｎｇ／ｍＬとした。
　ｈ１ｆ．６抗体を９００μｇ足裏局所投与した群、１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’－１０ｋＰＥＧを９００μｇ足裏局所投与した群、１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’－１０ｋＰＥＧを１ｍｇ／ｋｇ静脈内投与した群のそれぞれにおける投与２４時間後の足底筋中／血漿中の濃度比はそれぞれ６２８、０．７１、０．０６１であった。１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’－１０ｋＰＥＧは足裏内投与を行うことで静脈内投与に比して足底筋中／血漿中の濃度比が１０倍以上高かった。足裏への局所投与群の比較では、ｈ１ｆ．６抗体は１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’－１０ｋＰＥＧと比較して、足底筋中／血漿中の濃度比が８００倍以上であった。
　以上から、本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントであるｈ１ｆ．６抗体の局所投与は目的の局所での薬剤濃度を保ちつつ全身血流中の抗体濃度を低減できることが示され、さらに完全ヒト型抗ヒトＮＧＦ抗体１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’－１０ｋＰＥＧに比して極めて有効に局所での薬剤濃度を保ちつつ全身血流中の薬剤濃度を低減することが示された。よって、本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントは局所での薬効を発現しつつ全身性の副作用を低減する優れた医薬品になり得る可能性が高いことが期待される。
　本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントは、術後疼痛の治療に有用であることが期待される。本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントは、局所での薬効を発現しつつ全身性の血中暴露に基づく副作用を低減した優れた薬剤であるという点で特に有用であることが期待される。
　以下の配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」の説明を記載する。具体的には、配列表の配列番号１で示される塩基配列は、ｈ１ｆ．６抗体の重鎖フラグメントの塩基配列であり、配列表の配列番号５で示されるアミノ酸配列は、配列番号１によりコードされる重鎖フラグメントのアミノ酸配列である。配列表の配列番号２で示される塩基配列は、ｈ１ｆ．７抗体の重鎖フラグメントの塩基配列であり、配列表の配列番号６で示されるアミノ酸配列は、配列番号２によりコードされる重鎖フラグメントのアミノ酸配列である。配列表の配列番号３で示される塩基配列は、ｈ１ｆ．８抗体の重鎖フラグメントの塩基配列であり、配列表の配列番号７で示されるアミノ酸配列は、配列番号３によりコードされる重鎖フラグメントのアミノ酸配列である。配列表の配列番号４で示される塩基配列は、１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’フラグメントの軽鎖の塩基配列であり、配列表の配列番号８で示されるアミノ酸配列は、配列番号４によりコードされる軽鎖のアミノ酸配列である。配列表の配列番号９で示される塩基配列は、本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖可変領域の塩基配列であり、配列表の配列番号１０で示されるアミノ酸配列は、配列番号９によりコードされる重鎖可変領域のアミノ酸配列である。配列表の配列番号１１で示される塩基配列は、本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖可変領域の塩基配列であり、配列表の配列番号１２で示されるアミノ酸配列は、配列番号１１によりコードされる軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。

Claims (18)

  1. 　以下の（ａ）及び（ｂ）からなる群より選択される抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメント：
    （ａ）配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメント；及び
    （ｂ）（ａ）の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの翻訳後修飾により生じた抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメント。
  2. 　配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、請求項１に記載の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメント。
  3. 　翻訳後修飾が重鎖可変領域Ｎ末端のピログルタミル化である、請求項１に記載の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメント。
  4. 　配列番号５のアミノ酸番号１のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、請求項１に記載の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメント。
  5. 　請求項１に記載の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含む、ポリヌクレオチド。
  6. 　以下の（ａ）及び（ｂ）からなる群より選択される、発現ベクター：
    （ａ）請求項１に記載の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクター；及び
    （ｂ）請求項１に記載の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
  7. 　請求項６に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
  8. 　以下の（ａ）及び（ｂ）からなる群より選択される、請求項７に記載の宿主細胞：
    （ａ）請求項１に記載の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；及び
    （ｂ）請求項１に記載の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターとで形質転換された宿主細胞。
  9. 　請求項８に記載の宿主細胞を培養し、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントを発現させる工程を包含する、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントを生産する方法。
  10. 　請求項９に記載の方法で生産できる抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメント。
  11. 　請求項１～４及び１０のいずれか１項に記載の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメント、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
  12. 　術後疼痛の治療用局所医薬組成物である、請求項１１に記載の医薬組成物。
  13. 　請求項２に記載の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメント、請求項４に記載の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメント、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
  14. 　術後疼痛の治療用局所医薬組成物である、請求項１３に記載の医薬組成物。
  15. 　術後疼痛の治療用局所医薬組成物の製造のための、請求項１～４及び１０のいずれか１項に記載の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの使用。
  16. 　術後疼痛の治療のための、請求項１～４及び１０のいずれか１項に記載の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの局所投与による使用。
  17. 　術後疼痛の治療に局所投与での使用をするための、請求項１～４及び１０のいずれか１項に記載の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメント。
  18. 　請求項１～４及び１０のいずれか１項に記載の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの有効量を対象の局所に投与することを含む、術後疼痛の治療方法。
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