WO2016104574A1 - 異所性骨化の予防・治療剤及びそのスクリーニング方法 - Google Patents

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WO2016104574A1
WO2016104574A1 PCT/JP2015/085962 JP2015085962W WO2016104574A1 WO 2016104574 A1 WO2016104574 A1 WO 2016104574A1 JP 2015085962 W JP2015085962 W JP 2015085962W WO 2016104574 A1 WO2016104574 A1 WO 2016104574A1
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淳也 戸口田
真 池谷
佳久 松本
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国立大学法人京都大学
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    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/10—Musculoskeletal or connective tissue disorders

Definitions

  • the present invention relates to a method for screening a substance having prophylactic and / or therapeutic activity for ectopic ossification, particularly progressive ossifying fibrodysplasia (hereinafter also referred to as “FOP”).
  • FOP progressive ossifying fibrodysplasia
  • the present invention also relates to an agent for preventing and / or treating ectopic ossification.
  • Ectopic ossification is a pathological condition in which bone formation is observed in tissues where bone formation does not naturally occur, posterior longitudinal ligament ossification, yellow ligament ossification (yellow ligament hypertrophy), progressive ossification fibrosis Symptoms are seen in erythematosis (FOP), traumatic ossifying myositis, and the like.
  • FOP is a rare genetic disease that occurs in connective tissues characterized by congenital malformations of the thumb and progressive ectopic ossification (Non-patent Document 1). Ectopic ossification in FOP begins in early childhood via the cartilage pathway and may be traumatic or sudden. FOP results in extra-articular stiffness or thorax fusion of the main joint in the mid-axis skeleton and appendage skeleton, resulting in serious disability and fatal respiratory failure.
  • ACVR1 also known as ALK2
  • a mutation (617G> A (R206H)) has been confirmed in the GS) activation domain (Non-patent Document 2).
  • R206H glycine-serine rich in ACVR1
  • Non-patent Document 2 Many researchers have experimented with overexpressing mutant ACVR1 in various cell lines, and the R206H mutation converted ACVR1 to an active form, resulting in activation of BMP signaling that does not require a ligand, It has been found to result in hypersensitivity to the ligand.
  • Non-patent Document 6 Since BMP is recognized as a protein related to bone formation and cartilage formation, it supports that the mutant ACVR1 causes ectopic bone formation of FOP.
  • induction of the mutant ACVR1 confirmed the induction of SMAD1 / 5/8.
  • some contradictions remain, such as not being seen in the C2C12 cell line (Non-Patent Documents 3, 4 and 5). Therefore, research using cells of FOP patients is necessary, but the available cells are limited and it is difficult to obtain reproducibility of symptoms due to cell aging (Non-patent Document 6).
  • Non-patent Document 7 induced pluripotent stem cells (iPS cells) from FOP patients, and further, in the FOP patient-derived iPS cells (FOP-iPSC), increased calcification and cartilage hyperplasia. It has been found that some of the pathological conditions of FOP, such as formation characteristics, are reproduced (Non-patent Document 7). However, since significant differences were observed between iPS cell clones and experiments, it was necessary to compare multiple FOP-iPSC strains and control iPSCs for detailed analysis. In addition, such variability between clones and experiments makes it difficult to elucidate the mechanism of ectopic ossification (especially FOP), and therefore, development of effective therapeutic agents has not progressed. It was.
  • FOP-iPSC iPS cells derived from patients with progressive ossifying fibrodysplasia.
  • resFOP-iPSC iPS cells
  • iPS cells derived from somatic cells of FOP patients found that cartilage tissue tends to be excessively formed as compared with resFOP-iPSC when cartilage is induced.
  • the cause of the excessive formation of the cartilage tissue was not caused by the increased proliferation of the cartilage progenitor cells but by the excessive production of the extracellular matrix from the chondrocytes. I found out.
  • gene expression profiles of various cells derived from FOP-iPSC and resFOP-iPSC are classified into several signal transduction pathways. Differences between the two were observed for the gene group.
  • a prophylactic and / or therapeutic agent for ectopic ossification comprising a plasminogen activator inhibitor 1 (PAI1) inhibitor and / or a matrix metalloproteinase 1 (MMP1) inhibitor.
  • PAI1 plasminogen activator inhibitor 1
  • MMP1 matrix metalloproteinase 1
  • PAI1 plasminogen activator inhibitor 1
  • MMP1 matrix metalloproteinase 1
  • [5] A method for preventing and / or treating ectopic ossification in a subject, comprising administering an effective amount of a PAI1 inhibitor and / or MMP1 inhibitor to the subject.
  • [6] The method according to [5], wherein the PAI1 inhibitor is tiplaxtinin.
  • [7] The method according to [5] or [6], wherein the MMP1 inhibitor is GM6001.
  • [8] The method according to any one of [5] to [7], wherein the ectopic ossification is ectopic ossification in FOP.
  • a PAI1 inhibitor and / or MMP1 inhibitor for use in the prevention and / or treatment of ectopic ossification.
  • a method for screening a substance having prophylactic and / or therapeutic activity for ectopic ossification comprising: (a) differentiating neural crest cells having a mutation in ACVR1 into mesenchymal stromal cells in the presence and absence of the test substance, (b) differentiating the mesenchymal stromal cells obtained in step (a) into chondrocytes, (c) measuring the amount of cartilage tissue in the culture obtained in step (b), and (d) Compared to the case where step (a) is carried out in the absence of the test substance, when the amount of cartilage tissue decreases when the test substance is carried out, the test substance is placed in the ectopic bone.
  • [25] The method according to any one of [17] to [20], wherein the measurement of the amount of cartilage tissue is performed by Alcian Blue staining.
  • [26] The method according to any one of [17] to [25], wherein the genetic mutation of ACVR1 is R206H.
  • the neural crest cell is a cell obtained by expanding and culturing a neural crest cell having a mutation in ACVR1.
  • Expansion of the neural crest cells is performed by culturing the neural crest cells in a culture solution containing a transforming growth factor ⁇ (TGF ⁇ ) inhibitor, epidermal growth factor (EGF), and FGF2. [27].
  • TGF ⁇ transforming growth factor ⁇
  • EGF epidermal growth factor
  • the TGF ⁇ inhibitor is SB431542.
  • the differentiation induction of the neural crest cells is performed by culturing the pluripotent stem cells in a culture solution containing a TGF ⁇ inhibitor and a glycogen synthase kinase 3 ⁇ (GSK3 ⁇ ) inhibitor. The method described.
  • the pathological condition of ectopic ossification can be expressed with good reproducibility, and thus it becomes possible to search for a prophylactic / therapeutic agent for ectopic ossification.
  • the PAI1 inhibitor and MMP1 inhibitor obtained by the screening method can suppress hyperplasia of cartilage tissue, they can be effective prophylactic / therapeutic agents for ectopic ossification.
  • FIG. 1 shows the result of producing a gene repair FOP-iPSC (resFOP-iPSC) clone.
  • FOP-iPSC FOP-iPSC
  • FIG. 1 shows the result of producing a gene repair FOP-iPSC (resFOP-iPSC) clone.
  • (b) The result of examining the repair of the mutation of ACVR1 (617 G> A) is shown. It was confirmed that the gene was repaired by determining the cDNA base sequence.
  • FOP is FOP-iPSC
  • resFOP (cl1) and resFOP (cl2) are FOP-iPSC clones that have been gene-repaired (rescue).
  • (c) shows the results of examining whether homologous recombination occurs in the 5 ′ region of ACVR1. In the 5 'region of ACVR1, a 6.8 Kb PCR product was inserted by homologous recombination.
  • (d) shows the results of examining copy number variation for the pgk-neo resistance cassette.
  • p.c. is an OSR1-GFP knock-in hiPSC clone before Cre-mediated excision of the pgk-neo cassette.
  • FIG. 2 shows the results of analysis of FOP-iPSC-derived iNCC (induced Neural Crest Cell) and iMSC (induced Mesenchymal Stromal Cell).
  • FIG. 2 shows the results of analysis of FOP-iPSC-derived iNCC (induced Neural Crest Cell) and iMSC (induced Mesenchymal Stromal Cell).
  • FIG. 2 shows the results of analysis of FOP-iPSC-derived iNCC (induced Neural Crest Cell) and iMSC (induced Mesenchymal Stromal Cell).
  • FIG. 2 shows the results of analysis of FOP-iPSC-derived iNCC (induced Neural Crest Cell) and iMSC (induced Mesenchymal Stromal Cell).
  • FIG. 2 shows the results of analysis of FOP-iPSC-derived iNCC (induced Neural Crest Cell) and iMSC (induced Mesenchymal Stromal Cell).
  • FIG. 2 shows the results of analysis of FOP-iPSC-derived iNCC (induced Neural Crest Cell) and
  • the GAG value was higher in FOP-iMSC than in resFOP-iMSC, but no significant difference was observed in the amount of DNA.
  • SD standard deviation
  • FIG. 4 shows the results of gene expression profiles of FOP-iPSC and resFOP-iPSC.
  • (a, b) shows the results of analyzing the gene expression status of FOP-iPSC and resFOP-iPSC at each stage of iPSC, iNCC and iMSC.
  • FIG. 5 shows the results of analysis of the basic activity status of SMAD1 / 5/8, SMAD2 / 3, and ERK1 / 2 pathways in FOP-iMSC and resFOP-iMSC.
  • FIG. 5 shows the results of analysis of the western blotting analysis about the phosphorylation state of SMAD1 / 5/8, SMAD2 / 3, and ERK1 / 2 in FOP-iMSC and resFOP-iMSC.
  • ID1 expression was higher in FOP-iMSC than resFOP-iMSC.
  • (e) shows the results of evaluating the activity of the TGF ⁇ -specific luciferase construct in FOP-iMSC and resFOP-iMSC. Luciferase activity was higher in FOP-iMSC than resFOP-iMSC.
  • (f) The result of having analyzed the expression state of PAI1 (target gene of TGF ⁇ ) in FOP-iMSC and resFOP-iMSC is shown. PAI1 expression was higher in FOP-iMSC than in resFOP-iMSC.
  • FIG. 6 shows the result of analyzing the regulatory pathway of PAI1 expression in iMSC.
  • FIG. 8 shows the results of analyzing the function of SMAD1 / 5/8 during MSC induction.
  • FIG. 9 shows the results of analyzing the function of SMAD2 / 3 during MSC induction.
  • a schematic diagram of the inhibitor treatment time course is shown.
  • Representative images of micromass stained with Alcian Blue after treatment with SB431542 (SMAD2 / 3-inhibitor, 10 ⁇ M) are shown.
  • ectopic ossification means a pathological condition in which bone formation is observed in a tissue where bone formation does not occur.
  • diseases associated with ectopic ossification include posterior longitudinal ligament ossification, yellow ligament ossification (yellow ligament hypertrophy), progressive ossifying fibrodysplasia (FOP), and traumatic ossification myositis Includes, but is not limited to, ectopic ossification.
  • the FOP may be accompanied by a mutation of the gene, and may be, for example, a mutation of ACVR1. Examples of mutations that occur in ACVR1 include, but are not limited to, R206H, G356D, and the like. Mutations may occur alone or multiple mutations may occur simultaneously.
  • the FOP ACVR1 mutation in the present invention may be R206H.
  • Prophylactic and / or therapeutic agent for ectopic ossification relates to a prophylactic and / or therapeutic agent for ectopic ossification, which comprises a PAI1 inhibitor and / or an MMP1 inhibitor (hereinafter referred to as “prevention / treatment of the present invention An agent).
  • a prophylactic and / or therapeutic agent for ectopic ossification which comprises a PAI1 inhibitor and / or an MMP1 inhibitor (hereinafter referred to as “prevention / treatment of the present invention An agent).
  • the term “prophylactic / therapeutic agent” means the active ingredient itself
  • the term “prophylactic / therapeutic agent” means a pharmaceutical preparation for use in prevention and / or treatment.
  • the pharmaceutical preparation may be the active ingredient alone or may be in the form of a composition containing additives other than the active ingredient.
  • PAI1 is an abbreviation for “plasminogen activator inhibitor 1”, which is tissue plasminogen activator (also referred to as “t-PA”) or urokinase-type plasminogen activator ( A serine protease inhibitor protein that specifically inhibits "u-PA”).
  • tissue plasminogen activator also referred to as “t-PA”
  • urokinase-type plasminogen activator A serine protease inhibitor protein that specifically inhibits "u-PA”
  • the ⁇ PAI1 inhibitor '' that can be used in the present invention may be any substance that inhibits the activity of PAI1 and interferes with its function, even if it specifically inhibits PAI1, It may be one that broadly inhibits PAI family members.
  • PAI1 inhibitors examples include diketopiperazine (XR330, XR334, XR1853, XR5082, etc.), 11-keto-9 (E), 12 (E) -octadecadienoic acid, tiplaxtinin, fosinopril, imidapril, captopril Enalapril, L158809, eprosartan, troglitazone, vitamin C, vitamin E, perindolpril, mifepristone (RU486), spironolactone and reactive central loop peptide, anti-PAI1 neutralizing antibody, siRNA against PAI1, etc. It is not limited to these.
  • the PAI1 inhibitor in the present invention is preferably tiplaxtinin. These substances can be produced using a synthesis method described in public literature or a normal synthesis method, or can be obtained from companies that produce and sell these substances.
  • MMP1 is an abbreviation of “matrix metalloprotease 1” and is one of the metalloproteases that are proteolytic enzymes in which a metal ion is coordinated to the active center. It is an enzyme involved in degradation.
  • the ⁇ MMP1 inhibitor '' that can be used in the present invention may be any substance that inhibits the activity of MMP1 and interferes with its function, and even a substance that specifically inhibits MMP1, It may be one that extensively inhibits MMP family members.
  • MMP1 inhibitors for example, batimastat (BB-94), marimastat (BB-2516), purinomastert (Prinomastat; AG-3340), CGS-27023A (MMI-270B), neobasstat (Neovastat AE-941), BMS 275-291, tetracyclines, matristatin, catechin, GM6001 (galaldine, iromasterat), trocade (Ro-32-3555), anti-MMP1 neutralizing antibody, siRNA against MMP1, etc.
  • the MMP1 inhibitor in the present invention is preferably GM6001.
  • These substances can be produced by referring to synthesis methods described in known literature or by using ordinary synthesis methods, and can also be obtained from the manufacture, sales, development companies, etc. of these substances. it can.
  • the PAI1 inhibitor and MMP1 inhibitor of the present invention include not only free forms but also pharmacologically acceptable salts thereof.
  • the pharmacologically acceptable salt varies depending on the type of inhibitor. For example, in the case of tiplaxtinin, an alkali metal salt (sodium salt, potassium salt, etc.), an alkaline earth metal salt (calcium salt, magnesium salt, etc.), an aluminum salt
  • Inorganic base salts such as ammonium salts, and base addition salts such as organic base salts such as trimethylamine, triethylamine, pyridine, picoline, ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, dicyclohexylamine, N, N′-dibenzylethylenediamine, or
  • Inorganic acid salts such as hydrochloride, hydrobromide, sulfate, hydroiodide, nitrate, phosphate, citrate, oxalate, acetate, formate, propionate, benzoate ,
  • the prophylactic / therapeutic agent of the present invention comprises a PAI1 inhibitor and / or MMP1 inhibitor as it is or mixed with a pharmacologically acceptable carrier, excipient, diluent, etc.
  • the pharmaceutical composition can be administered orally or parenterally.
  • compositions for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including sugar-coated tablets and film-coated tablets), pills, granules, powders, capsules (including soft capsules), and syrups. Agents, emulsions, suspensions and the like.
  • a composition for parenteral administration for example, injections, suppositories and the like are used, and injections include intravenous injections, subcutaneous injections, intradermal injections, intramuscular injections, infusions, and the like. Dosage forms may be included.
  • excipients eg sugar derivatives such as lactose, sucrose, sucrose, mannitol, sorbitol; starch derivatives such as corn starch, potato starch, alpha starch, dextrin; cellulose derivatives such as crystalline cellulose; Gum arabic; dextran; organic excipients such as pullulan; and silicate derivatives such as light anhydrous silicic acid, synthetic aluminum silicate, calcium silicate and magnesium metasilicate aluminate; phosphates such as calcium hydrogen phosphate; Carbonates such as calcium; inorganic excipients such as sulfates such as calcium sulfate), lubricants (eg, stearic acid metal salts such as stearic acid, calcium stearate, magnesium stearate; talc; Colloidal silica; wax like beeswax and gay wax Borax; adipic acid; sulfate such as sodium sulfate; glycol; fumedi
  • the content of the PAI1 inhibitor and the MMP1 inhibitor may be about 0.01 to 100% by weight of the whole preparation.
  • each inhibitor when a PAI1 inhibitor and an MMP1 inhibitor are used in combination, each inhibitor may be formulated alone or in combination. In the former case, each preparation can be administered to the same subject simultaneously or with a time difference.
  • the dosage of the prophylactic / therapeutic agent of the present invention can be appropriately changed in consideration of various conditions such as the type of drug, the type of administration target, body weight, age, administration route, severity of symptoms, drug acceptability and the like.
  • the amount of the active ingredient is usually about 0.1 to about 2000 mg / kg / day, preferably about 1 to 200 mg / kg / day, and this amount is once or twice to three times a day. Can be administered separately.
  • the present invention is a method for screening a test substance (hereinafter referred to as “screening of the present invention”) for searching for a prophylactic / therapeutic agent for ectopic ossification. Law).
  • a prophylactic / therapeutic agent for ectopic ossification can be screened by including the following steps; (a) differentiating neural crest cells having a mutation in ACVR1 into mesenchymal stromal cells in the presence and absence of the test substance, (b) a step of differentiating the mesenchymal stromal cells obtained in step (a) into chondrocytes, (c) measuring the amount of cartilage tissue in the culture obtained in step (b), and (d) When the amount of cartilage tissue is reduced when the step (a) is performed in the presence of the test substance compared to the case where the test substance is not present, the test substance is removed from the ectopic bone.
  • the “neural crest cell” means a cell equivalent to a cell de-epithelialized from the neural crest having the ability to migrate to various sites in the embryo. That is, the neural crest cells of the present invention include undifferentiated neural crest-derived cells in tissues derived from the neural crest (for example, bone marrow, dorsal root ganglia, heart, cornea, iris, dental pulp, and olfactory mucosa).
  • the neural crest cell may preferably be a cell positive for at least one gene of TFAP2A, SOX10, PAX3 and p75 (NGFR).
  • TFAP2A includes, as a NCBI accession number, in the case of human, NM_001032280, NM_001042425 or NM_003220, in the case of mouse, a gene having a nucleotide sequence described in NM_001122948 or NM_011547, and a protein encoded by the gene, As well as naturally occurring variants having these functions.
  • SOX10 has the NCBI accession number, NM_006941 for humans, NM_011437 for mice, NM_011437, a gene encoded by the gene, and a protein encoded by the gene, and these functions. Naturally occurring variants are included.
  • PAX3 has the nucleotide sequence described in NCBI as an accession number in humans: NM_000438, NM_001127366, NM_013942, NM_181457, NM_181458, NM_181459, NM_181460 or NM_181461, and NM_001159520 or NM_008781 in mice.
  • the gene and protein encoded by the gene, as well as naturally occurring variants having these functions are included.
  • p75 includes the gene having the nucleotide sequence described in NCNM accession number NM_002507 for humans and NM_033217 for humans, as well as proteins encoded by these genes, and these Naturally occurring variants with functions are included.
  • ACVR1 has a mutation means that ACVR1 has a mutation such as R206H (206th arginine is replaced with histidine) and / or G356D (356th glycine is replaced with aspartic acid).
  • R206H 206th arginine is replaced with histidine
  • G356D 356th glycine is replaced with aspartic acid
  • the mutation is not limited thereto. Mutations may occur alone or multiple mutations may occur simultaneously.
  • the mutation in ACVR1 may preferably be R206H.
  • ACVR1 is a receptor for BMPs also called ALK-2 (activin receptor-like kinase-2), NCBI accession number is NM_001105 or NM_001111067 for humans, and for mice, A gene having the nucleotide sequence described in NM_001110204, NM_001110205 or NM_007394 and a protein encoded by the gene.
  • ALK-2 activin receptor-like kinase-2
  • the neural crest cells used in the present invention can be proliferated by expanding and culturing neural crest cells prepared in advance by cryopreservation or the like.
  • Examples of the method for culturing neural crest cells include a method of culturing in a culture medium containing a TGF ⁇ inhibitor, EGF and FGF2.
  • the culture solution used for the expansion culture of neural crest cells can be prepared using a medium used for animal cell culture as a basal medium.
  • the basal medium include IMDM medium, Medium 199 medium, Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) medium, ⁇ MEM medium, Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) medium, Ham's F12 medium, RPMI 1640 medium, Fischer's medium, Stem Pro34 RPMI-base medium and mixed media thereof are included.
  • ⁇ MEM medium is preferably used.
  • the medium may contain serum or may be serum-free.
  • the medium can be, for example, albumin, transferrin, Knockout Serum Replacement (KSR) (serum substitute for FBS during ES cell culture), N2 supplement (Invitrogen), B27 supplement (Invitrogen), fatty acid, insulin, collagen It may contain one or more serum replacements such as precursors, trace elements, 2-mercaptoethanol (2ME), thiol glycerol, lipids, amino acids, L-glutamine, Glutamax (Invitrogen), non-essential amino acids, vitamins, It may also contain one or more substances such as growth factors, small molecule compounds, antibiotics, antioxidants, pyruvate, buffers, inorganic salts.
  • KSR Knockout Serum Replacement
  • a TGF ⁇ inhibitor is a substance that inhibits signal transduction from binding of TGF ⁇ to a receptor to SMAD, a substance that inhibits binding to the ALK family of receptors, or SMAD by an ALK family.
  • the substance is not particularly limited as long as it is a substance that inhibits phosphorylation.
  • TGF ⁇ inhibitors include, for example, Lefty-1 (NCBI Accession No., mouse: NM_010094, human: NM_020997 is exemplified), SB431542, SB202190 (above, RKLindemann et al., Mol.
  • the TGF ⁇ inhibitor used for expansion of neural crest cells may preferably be SB431542.
  • the concentration of a TGF ⁇ inhibitor such as SB431542 in the culture solution is not particularly limited as long as it inhibits ALK5, but is preferably 1 to 50 ⁇ M, for example, 1 to nM, 10 to nM, 50 to nM, 100 to nM, 500 nM, 750 ⁇ M, 1 ⁇ M, 2 ⁇ M, 3 ⁇ M, 4 ⁇ M, 5 ⁇ M, 6 ⁇ M, 7 ⁇ M, 8 ⁇ M, 9 ⁇ M, 10 ⁇ M, 15 ⁇ M, 20 ⁇ M, 25 ⁇ M, 30 ⁇ M, 40 ⁇ M, Although it is 50 micro
  • the concentration of EGF in the culture medium is preferably 1 ng / ml to 100 ng / ml, for example, 1 ng / ml, 5 ng / ml, 10 ng / ml, 20 ng / ml, 30 ng / ml, 40 ng / ml, 50 ng / ml, 60 ng / ml, 70 ng / ml, 80 ng / ml, 90 ng / ml, 100 ng / ml, but not limited thereto. More preferably, it is 20 ng / ml.
  • the concentration of FGF2 in the culture medium used for expansion culture of neural crest cells is preferably 1 ng / ml to 100 ng / ml, for example, 1 ng / ml, 5 ng / ml, 10 ng / ml, 20 ng / ml 30 ng / ml, 40 ng / ml, 50 ng / ml, 60 ng / ml, 70 ng / ml, 80 ng / ml, 90 ng / ml, 100 ng / ml, but not limited thereto. More preferably, it is 20 ng / ml.
  • examples of the isolation method include mechanical separation and a separation solution having protease activity and collagenase activity (for example, trypsin). And collagenase-containing solutions Accutase (TM) and Accumax (TM) (Innovative Cell Technologies, Inc.) or separation using a separation solution having only collagenase activity.
  • a ROCK inhibitor may be added to the culture solution for the purpose of suppressing cell death.
  • the ROCK inhibitor is not particularly limited as long as it can suppress the function of Rho-kinase (ROCK).
  • ROCK Rho-kinase
  • Y-27632 eg, Ishizaki et al., Mol. Pharmacol. 57, 976-983 (2000) ; Narumiya et al., Methods Enzymol. 325,273-284 (2000)
  • Fasudil / HA1077 eg, Uenata et al., Nature 389: 990-994 (1997)
  • H-1152 eg, Sasaki et al
  • Pharmacol. Ther. 93 See 225-232 (2002)
  • Wf-536 eg, Nakajima et al., Cancer Chemother Pharmacol.
  • ROCK inhibitors for example, US Patent Application Publication Nos. 2005/0209261, 2005/0192304, 2004/0014755, 2004/0002508,. 2004/0002507, 2003/0125344, 2003/0087919, and International Publications 2003/062227, 2003/059913, 2003/062225, 2002/076976 No., 2004/039796).
  • one or more ROCK inhibitors may be used.
  • a preferred ROCK inhibitor used in this step includes Y-27632.
  • the concentration of the ROCK inhibitor used in this step can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the ROCK inhibitor to be used.For example, when Y-27632 is used as the ROCK inhibitor, 0.1 to 100 ⁇ M, preferably 1 ⁇ M to 50 ⁇ M, and more preferably 5 ⁇ M to 20 ⁇ M.
  • the expansion culture of neural crest cells of the present invention can be preferably performed by adhesion culture.
  • the culture container in order to enhance the adhesion ability of neural crest cells to the culture container, the culture container can be coated and used.
  • the coating agent include Matrigel (BD Biosciences), Synthemax (Corning), collagen, gelatin, laminin, heparan sulfate proteoglycan, entactin, or fibronectin, and fragments or combinations thereof, and preferably fibronectin.
  • the culture temperature is not limited to the following, but is about 30 to about 40 ° C., preferably about 37 ° C., and the culture is performed in an atmosphere of CO 2 -containing air.
  • the CO 2 concentration is about 2 to about 5%, preferably about 5%.
  • the neural crest cells used in the present invention may be derived from pluripotent stem cells.
  • Examples of a method for inducing neural crest cells from pluripotent stem cells include a method of culturing in a culture solution containing a TGF ⁇ inhibitor and a GSK-3 ⁇ inhibitor.
  • the neural crest cells induced by this method may be isolated and used using p75 as an indicator, or may be used as a cell population containing other cell types.
  • a method for isolating neural crest cells using p75 as an index a method well known to those skilled in the art can be used, and examples thereof include a method of labeling with an antibody of p75 and isolating using a flow cytometer.
  • the TGF ⁇ inhibitor, the culture solution, and the like used for inducing neural crest cells from pluripotent stem cells can be used under the same conditions as the above-described method for culturing neural crest cells.
  • the GSK-3 ⁇ inhibitor used for inducing neural crest cells from pluripotent stem cells is defined as a substance that inhibits the kinase activity of GSK-3 ⁇ protein (for example, the ability to phosphorylate ⁇ -catenin), Many are already known.
  • BIO also known as GSK-3 ⁇ inhibitor IX; 6-bromoindirubin 3′-oxime
  • GSK-3 ⁇ inhibitor VII which is a phenyl ⁇ bromomethyl ketone compound Acetophenone
  • L803-mts also known as GSK-3 ⁇ peptide inhibitor; Myr-N-GKEAPPAPPQSpP-NH2
  • CHIR99021 6- [2- [4- ( 2,4-Dichlorophenyl) -5- (4-methyl-1H-imidazol-2-yl) pyrimidin-2-ylamino] ethylamino] pyridine- 3-carbonitrile.
  • the concentration of a GSK-3 ⁇ inhibitor such as CHIR99021 in the culture solution is not particularly limited as long as it inhibits the kinase activity of GSK-3 ⁇ protein, but is preferably 1 nM-5 ⁇ M, for example, 1 nM, 10 nM , 50 nM, 100 nM, 500 nM, 750 nM, 1 ⁇ M, 2 ⁇ M, 3 ⁇ M, 4 ⁇ M, and 5 ⁇ M, but are not limited thereto. More preferably, it is 1 ⁇ M.
  • the method of inducing neural crest cells from pluripotent stem cells can be preferably performed by adhesion culture.
  • the adhesion culture in order to enhance the adhesion ability of neural crest cells to the culture container, the culture container can be coated and used.
  • the coating agent include Matrigel (BD Biosciences), Synthemax (Corning), collagen, gelatin, laminin, heparan sulfate proteoglycan, entactin, or fibronectin, and fragments or combinations thereof, preferably Matrigel.
  • the number of culture days for inducing neural crest cells from pluripotent stem cells is, for example, 10 days or less, for example, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7,
  • the culture is performed for 8 days, 9 days, and 10 days, preferably 3-9 days, particularly preferably 7 days.
  • a pluripotent stem cell is a stem cell having pluripotency that can be differentiated into many cells existing in a living body and also having proliferative ability, and is used in the present invention. Any cell that is induced by an intermediate mesoderm cell is included. Although it does not specifically limit in a pluripotent stem cell, For example, an embryonic stem (ES) cell, the embryonic stem (ntES) cell derived from the clone embryo obtained by nuclear transfer, a sperm stem cell (GS cell), an embryonic germ cell (EG cells), induced pluripotent stem (iPS) cells, cultured fibroblasts, bone marrow stem cell-derived pluripotent cells (Muse cells), and the like.
  • ES embryonic stem
  • ntES embryonic stem
  • GS cell sperm stem cell
  • EG cells embryonic germ cell
  • iPS induced pluripotent stem
  • cultured fibroblasts bone marrow stem cell-derived pluripotent cells
  • Muse cells bone
  • IPS cell production methods are known in the art and can be produced by introducing reprogramming factors into any somatic cells.
  • the reprogramming factor is, for example, Oct3 / 4, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Klf4, Klf2, c-Myc, N-Myc, L-Myc, Nanog, Lin28, Fbx15, ERas, ECAT15 -2, Tcl1, beta-catenin, Lin28b, Sall1, Sall4, Esrrb, Nr5a2, Tbx3 or Glis1 and other genes or gene products are exemplified, and these reprogramming factors may be used alone or in combination. Also good.
  • Somatic cells include, but are not limited to, fetal (pup) somatic cells, neonatal (pup) somatic cells, and mature healthy or diseased somatic cells, as well as primary cultured cells. , Passage cells, and established cell lines are all included.
  • somatic cells are, for example, (1) tissue stem cells (somatic stem cells) such as neural stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, dental pulp stem cells, (2) tissue progenitor cells, (3) blood cells (peripheral) Blood cells, umbilical cord blood cells, etc.), lymphocytes, epithelial cells, endothelial cells, muscle cells, fibroblasts (skin cells, etc.), hair cells, hepatocytes, gastric mucosal cells, intestinal cells, spleen cells, pancreatic cells (pancreatic exocrine cells) Etc.), differentiated cells such as brain cells, lung cells, kidney cells and fat cells.
  • tissue stem cells such as neural stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, dental pulp stem cells
  • tissue progenitor cells such as blood cells, umbilical cord blood cells, etc.
  • lymphocytes epithelial cells, endothelial cells, muscle cells, fibroblasts (skin
  • the mammal individual from which somatic cells are collected is not particularly limited, but is preferably a human.
  • pluripotent stem cells are preferably produced from somatic cells derived from patients with progressive ossifying fibrodysplasia (FOP) because ACVR1 desirably has a mutation such as R206H or G356D.
  • FOP progressive ossifying fibrodysplasia
  • iPS cells are preferred.
  • it can also be obtained by introducing a mutation into the ACVR1 gene using a gene modification technique for a pluripotent stem cell having no mutation in the ACVR1 gene.
  • the gene modification technique various techniques known in the art can be adopted, and examples thereof include a method described in WO2013 / 042731, a method using ZFN, TALEN, CRISPR / Cas and the like. However, it is not limited to these.
  • mesenchymal stromal cells are chondrocytes, osteoblasts, bone cells, muscle cells, fat cells, It means a cell capable of differentiating into connective tissue cells such as fibroblasts, immune cells, endothelial cells and pericytes, and has the same meaning as mesenchymal stem cells unless otherwise specified.
  • the mesenchymal stromal cell in the present invention is not particularly limited, but is a cell that is positive for CD73, CD44 and CD105 and negative for CD45.
  • CD73 contains NCBI accession numbers, NM_001204813 or NM_002526 in the case of humans, NM_011851 in the case of mice, and the genes encoded by these genes, and their functions. Naturally occurring variants having are included.
  • CD44 has an NCBI accession number of NM_000610, NM_001001389, NM_001001390, NM_001001391, NM_001001392, NM_001202555, NM_001202556 or NM_001202557 for humans, NM_001039150, NM_001039151, NM_001177785, NM_001177786, As well as the proteins encoded by the genes and naturally occurring variants having these functions.
  • CD105 is encoded by NCBI as an accession number of a gene having a nucleotide sequence described in NM_000118, NM_001114753 or NM_001278138 in the case of human, NM_001146348, NM_001146350 or NM_007932 in the case of a mouse, and the gene. Proteins as well as naturally occurring variants having these functions are included.
  • CD45 is encoded by NCBI as an accession number of a gene having a nucleotide sequence described in NM_001267798, NM_002838 or NM_080921 in the case of humans, NM_001111316, NM_001268286 or NM_011210 in the case of humans, and the gene. Proteins as well as naturally occurring variants having these functions are included.
  • the step of inducing mesenchymal stromal cells from neural crest cells may be performed by suspension culture, or may be performed by adhesion culture using a coated culture dish. Preferably, it is cultured by adhesion culture.
  • adhesion culture a coated culture vessel may be used, or culture may be performed on feeder cells.
  • a medium for inducing mesenchymal stromal cells can be prepared using a medium used for culturing animal cells as a basal medium.
  • the basal medium include IMDM medium, MediumMedi199 medium, Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) medium, ⁇ MEM medium, Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) medium, Ham's F12 medium, RPMI 1640 medium, Fischer's medium, StemPro34 medium , RPMI-base medium and mixed media thereof.
  • ⁇ MEM medium is preferably used.
  • the medium may contain serum or may be serum-free.
  • the medium can be, for example, albumin, transferrin, Knockout Serum Replacement (KSR) (serum substitute for FBS during ES cell culture), N2 supplement (Invitrogen), B27 supplement (Invitrogen), fatty acid, insulin, collagen It may contain one or more serum replacements such as precursors, trace elements, 2-mercaptoethanol (2ME), thiol glycerol, lipids, amino acids, L-glutamine, Glutamax (Invitrogen), non-essential amino acids, vitamins, It may also contain one or more substances such as growth factors, small molecule compounds, antibiotics, antioxidants, pyruvate, buffers, inorganic salts.
  • a preferred basal medium is ⁇ MEM medium containing serum.
  • the concentration of FGF2 in the culture medium used for induction of mesenchymal stromal cells from neural crest cells is preferably 1 ng / ml to 20 ng / ml, for example, 1 ng / ml, 2 ng / ml, 3 ng / ml ml, 4 ng / ml, 5 ng / ml, 6 ng / ml, 7 ng / ml, 8 ng / ml, 9 ng / ml, 10 ng / ml, 15 ng / ml, 20 ng / ml It is not limited to. More preferably, it is 5 ng / ml.
  • the number of days of culture for induction of mesenchymal stromal cells from neural crest cells does not affect the induction of mesenchymal stromal cells by culturing for a long time, so an upper limit is not particularly required. 2 days or more, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, 7 days, 8 days, 9 days, 10 days, 11 days, 12 days, 13 days and 14 days, preferably 7 days or longer, particularly preferably 13 days.
  • Induction of mesenchymal stromal cells from neural crest cells can be preferably performed by adhesion culture.
  • the adhesion culture in order to enhance the adhesion ability of neural crest cells to the culture container, the culture container can be coated and used.
  • the coating agent include Matrigel (BD Biosciences), Synthemax (Corning), collagen, gelatin, laminin, heparan sulfate proteoglycan, entactin, or fibronectin, and fragments or combinations thereof, and preferably fibronectin.
  • the cells may be separated with a known separation solution such as trypsin-EDTA and re-seeded under the same conditions, and the passage may be performed.
  • the agent may be changed.
  • the first culture can be performed in a culture vessel coated with fibronectin, and the subsequent culture can be performed by adhesion culture without using the coating agent.
  • the number of days of culture on fibronectin is, for example, 5 days or less, for example, 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days of culture, preferably 1-3 days, particularly preferably 2 days.
  • the culture temperature is not limited to the following, but is about 30 to about 40 ° C., preferably about 37 ° C., and the culture is performed in an atmosphere of CO 2 -containing air.
  • the CO 2 concentration is about 2 to about 5%, preferably about 5%.
  • chondrocytes are cells that produce extracellular matrix constituting cartilage or cartilage tissue such as collagen and glycosaminoglycan (GAG), or It means a progenitor cell that becomes such a cell.
  • the chondrocytes may form a population only by the chondrocytes, or may be in the state of a culture (particle) composed of chondrocytes and an extracellular matrix produced from the chondrocytes (cartilage-like tissue). May be.
  • Such chondrocytes may be cells that express a chondrocyte marker, and examples of chondrocyte markers include type II collagen (COL2A1), SOX9 or AGGRECAN (ACAN).
  • COL2A1 includes NCBI accession numbers, NM_001844 or NM_033150 for humans, NM_001113515 or NM_031163 for mice, and proteins encoded by these genes, and these Naturally occurring variants having the following functions are included.
  • SOX9 has a gene having a nucleotide sequence described as NCBI accession number NM_000346 for humans and NM_011448 for mice, a protein encoded by the gene, and these functions. Naturally occurring variants are included.
  • AGGRECAN includes NCBI accession numbers as follows: in the case of humans, NM_001135 or NM_013227, in the case of mice, the gene having the nucleotide sequence described in NM_007424, the protein encoded by the gene, and their functions Naturally occurring variants having are included.
  • the chondrocytes in the present invention can be stained with Alcian Blue.
  • a two-dimensional (2D) micromass culture method or a three-dimensional (3D) pellet culture method can be used as a method for inducing chondrocytes from mesenchymal stromal cells.
  • mesenchymal stromal cells can be separated by any method and cultured by adhesion culture.
  • a separation method a mechanical method or an enzymatic method can be used.
  • the separation can be preferably performed by TrypLE Select (Invitrogen).
  • the adhesion culture in the 2D micromass culture method can be performed by culturing using a culture vessel coated with an extracellular matrix.
  • the coating treatment can be performed by placing a solution containing an extracellular matrix in a culture container and then removing the solution as appropriate.
  • coating with fibronectin is preferable.
  • the culture solution used in the 2D micromass culture method can be prepared by adding PDGF-BB or a functional equivalent thereof to a basal medium used for animal cell culture. TGF ⁇ 3, BMP4, or a functional equivalent thereof can be further added to the culture solution.
  • the factors added to these basal media may be added simultaneously, or may be added separately at any stage of the culture process.
  • Examples of functional equivalents of PDGF-BB include, but are not limited to, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-CC, and PDGF-DD.
  • Examples of functional equivalents of TGF ⁇ 3 include, but are not limited to, TGF ⁇ 1, TGF ⁇ 2, and the like.
  • Examples of functional equivalents of BMP4 include, but are not limited to, BMP2, BMP6, BMP7 and the like.
  • Examples of the basic medium used in the 2D micromass culture method include IMDM medium, Medium ⁇ 199 medium, Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) medium, ⁇ MEM medium, Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) medium, Ham's F12 medium, RPMI 1640 Examples thereof include a medium, Fischer's medium, and a mixed medium thereof.
  • the medium may contain serum (eg, FCS) or may be serum-free.
  • albumin transferrin, KnockOut Serum Replacement (KSR) (serum substitute for FBS during ES cell culture) (Invitrogen), N2 supplement (Invitrogen), B27 supplement (Invitrogen), fatty acids, insulin, It may contain one or more serum substitutes such as sodium selenate, collagen precursor, trace elements, 2-mercaptoethanol, 3'-thiolglycerol, lipids, amino acids, L-glutamine, GlutaMAX (Invitrogen), non It may also contain one or more substances such as essential amino acids (NEAA), vitamins, growth factors, low molecular compounds, antibiotics, antioxidants, pyruvate, buffers, inorganic salts and the like.
  • the basal medium is a serum-free chondrogenic medium in which DMEM medium and Ham's F12 medium are mixed at a ratio of 1: 1.
  • the concentration of PDGF-BB added to the basal medium is, for example, in the range of 1-100 ng / ml, preferably in the range of 20-60 ng / ml, for example, 1 ng / ml, 10 ng / ml, 20 ng / ml, 25 ng / ml, 30 ng / ml, 35 ng / ml, 40 ng / ml, 50 ng / ml, 60 ng / ml, 70 ng / ml, 80 ng / ml, 90 ng / ml, 100 Although it is ng / ml, it is not limited to these. Preferably, it is 40 ng / ml.
  • the concentration of TGF ⁇ 3 added to the basal medium is, for example, in the range of 1-100 ng / ml, preferably in the range of 5-20 ng / ml, for example, 1 ng / ml, 2 ng.
  • ng / ml 3 ng / ml, 4 ng / ml, 5 ng / ml, 6 ng / ml, 7 ng / ml, 8 ng / ml, 9 ng / ml, 10 ng / ml, 11 ng / ml, 12 ng / ml, 13 ng / ml, 14 ng / ml, 15 ng / ml, 16 ng / ml, 17 ng / ml, 18 ng / ml, 19 ng / ml, 20 ng / ml, 25 ng / ml, 50 ng / ml, 75 ng / ml, and 100 ng / ml, but not limited thereto.
  • it is 10 ng / ml.
  • the concentration of BMP4 added to the basal medium is, for example, in the range of 1-100 ng / ml, preferably in the range of 5-20 ng / ml, for example, 1 ng / ml, 2 ng.
  • ng / ml 3 ng / ml, 4 ng / ml, 5 ng / ml, 6 ng / ml, 7 ng / ml, 8 ng / ml, 9 ng / ml, 10 ng / ml, 11 ng / ml, 12 ng / ml, 13 ng / ml, 14 ng / ml, 15 ng / ml, 16 ng / ml, 17 ng / ml, 18 ng / ml, 19 ng / ml, 20 ng / ml, 25 ng / ml, 50 ng / ml, 75 ng / ml, and 100 ng / ml, but not limited thereto.
  • it is 10 ng / ml.
  • the culture temperature is not particularly limited, but is about 30 to about 40 ° C., preferably about 37 ° C., and the culture is performed in an atmosphere of CO 2 -containing air.
  • the CO 2 concentration is about 2 to about 5%, preferably about 5%.
  • the condition in which the O 2 content in the air is lower than the normal 20% may be used, and examples thereof include 15%, 10%, or 5%.
  • the culture time in this step is, for example, 20 days or less, preferably 10 days.
  • the addition of PDGF-BB, TGF ⁇ 3 and BMP4 to the basal medium may be performed simultaneously or separately at any stage of the culture process. Preferably, they are added in any combination in any order depending on the stage of the culturing process.
  • the addition of PDGF-BB, TGF ⁇ 3, and BMP4 to the basal medium can be added directly to the medium being cultured, or can be added when the medium is changed.
  • the addition of PDGF-BB, TGF ⁇ 3 and BMP4 to the basal medium in this step can be performed, for example, in the following order and combination.
  • the culture period in step (1) is, for example, 10 days or less, preferably 3 days.
  • the culture period in step (2) is, for example, 8 days or less, preferably 7 days.
  • the culture in the step (3) may be omitted, and the period for performing the step is, for example, 8 days or less, preferably 4 days.
  • PDGF-BB, TGF ⁇ 3 and BMP4 can be further performed in combination with other differentiation inducing factors.
  • other differentiation-inducing factors include, but are not limited to, Wnt3A, Activin, FGF2, Follistatin, GDF5, and NT4.
  • (Ii) Three-dimensional (3D) pellet culture method prior to 3D pellet culture, a step of subculturing mesenchymal stromal cells in a medium supplemented with FGF2 and TGF ⁇ 3 can be included.
  • the passage period is not particularly limited, but is a period of 5 days or less, preferably 3 days.
  • the concentration of FGF2 in the medium is, for example, in the range of 0.1-50 ng / ml, preferably in the range of 0.5-20 ng / ml, such as 0.5 ng / ml, 0.6 ng / ml, 0.7 ng / ml, 0.8 ng / ml, 0.9 ng / ml, 1 ng / ml, 2 ng / ml, 3 ng / ml, 4 ng / ml, 5 ng / ml, 6 ng / ml, 7 ng / ml, 8 ng / ml, Examples include, but are not limited to, 9 ng / ml, 10 ng / ml, 12 ng / ml, 14 ng / ml, 16 ng / ml, 18 ng / ml, and 20 ng / ml.
  • the concentration of TGF ⁇ 3 in the medium is, for example, in the range of 1-100 ng / ml, preferably in the range of 5-20 ng / ml, such as 1 ng / ml, 2 ng / ml, 3 ng / ml, 4 ng / ml, 5 ng / ml, 6 ng / ml, 7 ng / ml, 8 ng / ml, 9 ng / ml, 10 ng / ml, 11 ng / ml, 12 ng / ml, 13 ng / ml, 14 ng / ml, 15 ng / ml, 16 ng / ml, 17 ng / ml, 18 ng / ml, 19 ng / ml, 20 ng / ml, 25 ng / ml.
  • the subcultured cells may be further centrifuged to form a pellet.
  • the number of cells used in the centrifuge is not particularly limited. For example, 2.5 ⁇ 10 5 cells can be used.
  • the culture medium used in the 3D pellet culture method can be performed using the same medium as in the 2D micromass culture method.
  • the culture temperature is not particularly limited, but is about 30 to about 40 ° C., preferably about 37 ° C., and the culture is performed in an atmosphere of CO 2 -containing air.
  • the CO 2 concentration is about 2 to about 5%, preferably about 5%.
  • the culture time in this step is, for example, 40 days or less, preferably 28 days.
  • the test substance with a reduced amount of cartilage tissue is prevented from ectopic ossification compared to the case where the test substance is brought into contact with the cells described above. ⁇ Select as a therapeutic agent.
  • the measurement of the amount of cartilage tissue in the screening method of the present invention is to measure the size of the chondrocyte tissue induced per unit cell of mesenchymal stromal cells, and to measure the expression level of the chondrocyte marker gene Or by measuring the amount of chondrocyte extracellular matrix.
  • the contact between the test substance and the cells may be performed at least during induction from neural crest cells to mesenchymal stromal cells, and induced from mesenchymal stromal cells to chondrocytes. It does not prevent the test substance from coming into contact with the cells during the process.
  • the measurement of the tissue size of chondrocytes in the present invention can be performed by measuring the area or diameter stained with a substance that specifically stains chondrocytes.
  • a substance that specifically stains chondrocytes include, but are not limited to, Alcian Blue, Safranin O, and analogs thereof.
  • chondrocyte marker gene in the present invention examples include, but are not limited to, SOX9, ACAN, COL2A1, and the like.
  • the chondrocyte marker gene is measured as mRNA expression level or protein level, and can be performed by methods well known to those skilled in the art. For example, Northern blotting, RT-PCR, Western blotting, flow site Examples include a method such as measurement.
  • Measurement of the amount of extracellular matrix in the present invention can be performed using methods well known to those skilled in the art.
  • the amount of extracellular matrix can be measured using Blyscan ⁇ Glycosaminoglycan Assay (Biocolor), which targets glycosaminoglycan (GAG), but is not limited thereto.
  • any test substance can be used, and any known compound and novel compound may be used, for example, cell extracts, cell culture supernatants, microbial fermentation products, marine organism-derived extracts.
  • Product plant extract, purified protein or crude protein, peptide, non-peptide compound, synthetic low molecular weight compound, natural compound and the like.
  • the test substance is also (1) biological library method, (2) synthetic library method using deconvolution, (3) “one-beadoneone-compound” live Can be obtained using any of a number of approaches in combinatorial library methods known in the art, including rally methods, and (4) synthetic library methods using affinity chromatography sorting.
  • Biological library methods using affinity chromatography sorting are limited to peptide libraries, but the other four approaches are applicable to peptide, non-peptide oligomer, or small molecule compound libraries of compounds (Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12: 145-67).
  • Examples of methods for the synthesis of molecular libraries can be found in the art (DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6909-13; Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11422-6; Zuckermann et al. (1994) J. Med. Chem. 37: 2678-85; Cho et al.
  • Example 1 Establishment of resFOP-iPSC clone by homologous recombination using BAC
  • homologous recombination technology using BAC was used.
  • BAC recombination method Ikeya M., Int. J. Dev. Biol. 49: 807-823, 2005
  • BAC recombination method Ikeya M., Int. J. Dev. Biol. 49: 807-823, 2005
  • human BAC clone CTD-20251l1 was purchased from life technologies (Carlsbad, CA, USA).
  • a targeting vector was then constructed by inserting the floxed pgk-neo cassette into the 6th intron and shortening the 5 ′ region to 5 KB.
  • the resulting targeting vector is a construct comprising 5 KB of 5′-short arm and 120 Kb of 3′-long arm as shown in FIG. 1a.
  • targeting vectors were introduced by electroporation using a method modified from the method of Mae et al. (Mae S, et al., Nat Commun. 4: 1367, ⁇ 2013), and two types of resFOP-iPSC clones were established.
  • ACVR1 targeting vector was linearized with FspA1 restriction enzyme and sterilized by ethanol precipitation.
  • FOP-iPSC vFOP4-1 strain; Matsumoto Y., et al. Orphanet J Rare Dis. 8 (1): 190, 2013
  • FOP-iPSC A total of 30 mg of linearized DNA was added to the resuspended FOP-iPSC, and cells were subjected to electrical stimulation of single-250 V, 500-mF pulse (Gene-pulser-CE, Bio-Rad) at room temperature.
  • FOP-iPSC was seeded on a SNL feeder layer treated with mitomycin-C in a medium supplemented with ROCK inhibitor (Y-27632, 10 ⁇ M).
  • ROCK inhibitor Y-27632, 10 ⁇ M
  • G418 75 ⁇ g / ml
  • Genomic DNA was extracted from the obtained colonies, and the base sequence of the genomic DNA was determined, whereby the gene repair clone was subjected to primary screening.
  • resFOP-iPSC cl1
  • resFOP-iPSC cl2
  • FOP-iPSC measure pluripotency marker gene expression, teratoma formation ability, karyotype and morphology (Fig. 1e), and there is no difference in pluripotency It was confirmed. Moreover, it was confirmed that there is no difference in resFOP-iPSC and FOP-iPSC in the cartilage region in teratomas.
  • Example 2 Cell culture iPSCs were maintained in primate ES cell medium (ReproCELL, Tokyo, Japan) supplemented with 4 ng / ml recombinant human basic fibroblast growth factor (FGF2) (WAKO).
  • primate ES cell medium ReproCELL, Tokyo, Japan
  • FGF2 human basic fibroblast growth factor
  • NCC neural crest cells
  • CDM is 1x chemically defined lipid concentrate (GIBCO), 15 ⁇ g / ml apo-transferrin (Sigma), 450 ⁇ M monothioglycerol (Sigma), 5 mg / ml purified BSA (99% purified by crystallization; Sigma), 7 ⁇ g / ml Insulin (WAKO) and penicillin / streptomycin (Invitrogen) were added to Iscove's modified Dulbecco's medium / Ham's F-12 1: 1.
  • differentiation induction from iNCC to mesenchymal stromal cells was performed by the following method. Extract p75-positive cells by FACS using the anti-p75 antibody (BD, Cat No. 560326) from the induced cells described above, inoculate on a 12-well plate coated with Fibronectin at 2 ⁇ 10 5 / well, and 10 ⁇ M After culturing in CDM supplemented with Y-27632 and 10 ⁇ M SB431542 for 1 day, the medium was replaced with CDM supplemented with 10 ⁇ M SB431542, 20 ng / ml FGF2 and 20 ng / ml epidermal growth factor (EGF) (R & D) Maintenance culture was performed for 9 days.
  • CDM supplemented with Y-27632 and 10 ⁇ M SB431542 for 1 day
  • the medium was replaced with CDM supplemented with 10 ⁇ M SB431542, 20 ng / ml FGF2 and 20 ng / ml epidermal growth factor
  • MSC medium minimum essential medium alpha modification ( ⁇ MEM; Invitrogen Co.) supplemented with 5 ng / ml FGF2, 10% fetal bovine serum (FBS) (Nichirei Inc.) and 0.5% penicillin and streptomycin (Invitrogen)
  • FBS fetal bovine serum
  • Invitrogen penicillin and streptomycin
  • Example 3 Analysis of iNCC / iMSC differentiation ability of FOP-iPSC It was previously reported that overexpression of ACVR1 (R206H) promotes cartilage induction in FOP-iPSC (Matsumoto Y., et al. Orphanet J Rare Dis. 8 (1): 190 (2013)). Therefore, iNCC (induced Neural Crest Cell) and iMSC (induced Mesenchmal Stromal Cell) were induced from FOP-iPSC and resFOP-iPSC, respectively, and their chondrocyte differentiation characteristics were compared. On the 7th day from the start of iNCC induction, cells were sorted with anti-p75 antibody using FACS, and the morphology of iNCC was observed.
  • ACVR1 induced Neural Crest Cell
  • iMSC induced Mesenchmal Stromal Cell
  • PCR was performed with ExTaq (Takara, Shiga, Japan). Quantitative PCR was performed using Thunderbird SYBR qPCR Mix (TOYOBO, Osaka, Japan), and analysis was performed using StepOne real-time PCR system (Applied Biosystems, Forester City, CA).
  • NCC markers TFAP2A, SOX10 and PAX3
  • iNCC derived from FOP-iPSC and resFOP-iPSC (cl1) and (cl2)) for all genes of p75 (NGFR) at similar levels. It was expressed specifically (Fig. 2b).
  • Example 4 Analysis of chondrocyte differentiation ability of FOP-iMSC
  • FOP-iMSC and resFOP-iMSC were differentiated into chondrocytes using a 2D micromass culture system and analyzed.
  • the 2D micromass culture system was performed as described by Umeda et al. (Umeda, K. et al. Scientific Reports 2 (2012)).
  • Induced MSC (1.5 x10 5 cells) in 5 ⁇ l of cartilage medium (40 ng / ml PDGF-BB (R & D) and 1% FBS (Nichirei) in serum-free chondrogenic medium (DMEM: F12 (1: 1) (Invitrogen), 1% (v / v) ITS + mix (BD), 0.17 mM AA2P, 0.35 mM Proline (Sigma), 0.1 ⁇ M dexamethasone (Sigma), 0.15% (v / v) glucose (Sigma), 1 mM Na -pyruvate (Invitrogen), 2 mM GlutaMax, 0.05 mM MTG) and spotted on a fibronectin-coated 24-well plate (BD).
  • cartilage medium 40 ng / ml PDGF-BB (R & D) and 1% FBS (Nichirei) in serum-free chondrogenic medium (DMEM: F12 (1: 1) (Invitrogen
  • cartilage medium was added to make 1 ml. From day 3 to day 10, 10 ng / ml TGF ⁇ 3 (R & D system) was added to the medium and cultured. Micromass culture was performed at 5% CO 2 and 37 ° C. for 10 days. Cartilage induction was evaluated by Alcian Blue staining, glycosaminoglycan (GAG) amount, and DNA amount.
  • GAG glycosaminoglycan
  • Alcian Blue staining was performed by fixing induced cells with 10% formalin (Sigma) for 30 minutes, washing with PBS, and then using Alcian Blue solution (3% glacial acetic acid and 1% HCl, pH 1 1% Alcian Blue (MUTO PURE CHEMICAL CO., LTD)) overnight and destained with acetic acid solution.
  • the amount of GAG was measured by quantifying the amount of GAG in the pellet using BLYSCAN Dye and Dissociation reagents (BIOCOLOR, Harbor, UK). On the other hand, the amount of DNA was measured using PicoGreen dsDNA Quantitation kit (Invitrogen).
  • each chondrocyte differentiation marker of FOP-iMSC and resFOP-iMSC induced to differentiate into chondrocytes for 10 days was analyzed by RT-PCR.
  • all chondrocyte differentiation markers SOX9, COL2A1 and ACAN
  • ACVR1 mutations contribute not to cell proliferation but to promotion of differentiation into chondrocytes and maturation of chondrocytes.
  • Example 5 Analysis on gene expression profile of FOP-iPSC
  • differentiation differentiation into chondrocytes was shown between FOP-iMSC and resFOP-iMSC.
  • Microarray analysis was performed to compare gene expression profiles at each stage. Microarray analysis was performed as follows. Total RNA was prepared using RNeasy Mini Kit (Qiagen) and then cDNA was synthesized using GeneChip WT (Whole Transcript) Sense Target Labeling and Control Reagents kit as described by the manufacturer (Affymetrix). . After that, hybridization, washing and scanning into GeneChip Human Gene 1.0 ST expression arrays were performed according to the manufacturer's (Affymetrix) protocol.
  • FIG. 4e MMP1 and PAI1 are shown in the figure as genes that rise in FOP-iMSC.
  • 191 genes whose expression was increased 2-fold or more in FOP-iMSC and 110 genes whose expression was decreased 2-fold or more were confirmed, and the top 20 of these genes are shown in FIG. 4f. From the above, it was confirmed that FOP cells and resFOP cells were almost identical at the stage of iPS cells, NCC and MSC, but several gene expressions were found to be different at the stage of MSC.
  • Example 6 Analysis of basic activation state of SMAD1 / 5/8, SMAD2 / 3 and ERK1 / 2 pathway in iMSC BMP signal is SMAD binding element (SBE) of SMAD1 / 5/8 gene activated by BMP It is transmitted by the canonical pathway by binding to the transcription factor and the non-canonical pathway by binding of the transcription factor to the AP-1 binding site. Therefore, in order to confirm whether the expression of the gene in FOP-iMSC is caused by BMP signaling, we examined whether there are SBE and AP-1 binding site in the regulatory region of the gene whose expression is increased. It was confirmed that there was one or more SBE and AP-1 binding sites.
  • SBE SMAD binding element
  • reporter assay using BMP-specific luciferase reporter construct (BRE-luciferase), and expression of ID1, which is a downstream gene of BMP State analysis was performed.
  • BMP-specific luciferase reporter construct (BRE-luciferase)
  • ID1 which is a downstream gene of BMP State analysis was performed.
  • FOP-iMSC and resFOP-iMSC were dissolved, and analyzed according to dual ⁇ luciferase reporter assay system (Promega) according to the manufacturer's instructions.
  • dual ⁇ luciferase reporter assay system Promega
  • TGF ⁇ signal a reporter assay using a TGF ⁇ -specific luciferase reporter construct (CAGA-lusiferase) and an analysis of the expression state of PAI1, which is a downstream gene of TGF ⁇ , were performed. As a result, it was observed that both luciferase activity and PAI1 expression were higher in FOP-iMSC than in resFOP-iMSC (FIGS. 5e and f). On the other hand, luciferase assay was similarly performed for AP-1, but no difference was found between the two.
  • CAGA-lusiferase TGF ⁇ -specific luciferase reporter construct
  • Example 7 Analysis of PAI1 expression control pathway in iMSC
  • activation of SMAD1 / 5/8, SMAD2 / 3, and ERK1 / 2 pathway was observed in FOP-iMSC. It was investigated whether the expression was controlled.
  • Cells differentiated into iMSC by the same method as in Example 3 FOP-iMSC and resFOP-iMSC were treated with DMH1 (SMAD1 / 5/8 inhibitor, 2 ⁇ M), SB431542 (SMAD2 / 3 inhibitor, 10 ⁇ M) and U0126 ( MEK1 / 2 inhibitor, 1 ⁇ M), and 24 hours later, the expression of PAI1 was analyzed by RT-PCR.
  • PAI1 expression decreased when treated with DMH1 or SB431542 (FIG. 6a).
  • BMP4 10 ng / ml
  • BMP7 100 ng / ml
  • TGF ⁇ 3 10 ng / ml
  • BMP4, BMP7, or TGF ⁇ 3 increased both FOP-iMSC and resFOP-iMSC (FIG. 6b).
  • Example 8 Analysis of functions of PAI1, MMP1, SMAD1 / 5/8 and SMAD2 / 3 in chondrocyte differentiation Since expression of PAI1 and MMP1 was higher in FOP-iMSC than resFOP-iMSC (FIG. 4e), PAI1 And to examine whether MMP1 plays an important role in chondrocyte differentiation, during induction of NCC to MSC (phase I), during induction of MSC to chondrocytes (phase II), and from NCC to chondrocytes At each stage during induction of (phase I + II) (FIGS.
  • PAI1, MMP1, SMAD1 / 5/8 and SMAD2 / 3 10 ⁇ M Tiplaxtinin (PAI1 inhibitor) ( Axon Medchem), 10 nM GM6001 (MMP1 inhibitor) (Calbiochem), 2 ⁇ M DMH1 (SMAD1 / 5/8 inhibitor) and 10 ⁇ M SB431542 (SMAD2 / 3 inhibitor)) are added to the chondrocyte size and GAG The value was examined. Differentiation induction into NCC was performed in Example 3, and differentiation induction into MSC and chondrocytes was performed in the same manner as in Examples 3 and 4.
  • Ectopic ossification in FOP patients is caused by endochondral ossification, where cartilage is first formed and then replaced by bone, so drugs that have the effect of inhibiting cartilage formation can be used to treat ectopic ossification. It is considered useful. Furthermore, since it is thought that chondrogenic ability is determined in the process of induction of MSC in the ectopic ossification of FOP, PAI1 inhibitor and MMP1 inhibitor act at the induction of MSC and suppress MSC cartilage differentiation. It is considered effective for the treatment of ectopic ossification of FOP.
  • the present invention provides a new screening method for a prophylactic / therapeutic agent for ectopic ossification.
  • a prophylactic / therapeutic agent for ectopic ossification By using an appropriate differentiation induction system, more effective screening can be performed.
  • PAI1 inhibitors and MMP1 inhibitors newly found by the screening system are extremely useful for ectopic ossification, especially for the prevention and treatment of FOP.

Abstract

　本発明は、異所性骨化の予防・治療剤であって、有効成分として、(i)PAI1阻害剤及び(ii)MMP1阻害剤のうちの少なくとも一つを含む、医薬製剤を提供する。また本発明は、異所性骨化の予防・治療薬をスクリーニングする方法であって、(a)被験物質の存在下及び非存在下でACVR1に変異を有する神経堤細胞を間葉系間質細胞へ分化させる工程、(b)工程(a)で得られた間葉系間質細胞を軟骨細胞へ分化させる工程、(c)工程(b)で得られた培養物中における軟骨組織量を測定する工程、及び(d)工程(a)を被験物質の非存在下で行った場合と比較して、被験物質の存在下で行った場合において軟骨組織量が減少した場合に、当該被験物質を異所性骨化の予防・治療薬として選定する工程を含む、方法を提供する。

Description

異所性骨化の予防・治療剤及びそのスクリーニング方法
　本発明は、異所性骨化、とりわけ、進行性骨化性線維異形成症（以下、「FOP」とも言う）の予防及び／又は治療活性を有する物質のスクリーニング方法に関する。本発明はまた、異所性骨化の予防及び／又は治療剤に関する。
　異所性骨化は、本来骨形成が起きない組織において骨形成が認められる病態であり、後縦靭帯骨化症、黄色靭帯骨化症（黄色靭帯肥厚症）、進行性骨化性線維異形成症（FOP）、外傷性骨化性筋炎などにおいて、その症状が見られる。
　FOPは、親指の先天性奇形や進行性異所性骨化により特徴づけられる結合組織に発生する希少遺伝子疾患である（非特許文献１）。FOPにおける異所性骨化は、軟骨経路を介して幼児期に始まり、外傷が起因となる場合や突発的に起こる場合がある。FOPは、中軸骨格及び付属肢骨格における主関節の関節外硬直又は胸郭の融合を生じ、重篤な障害や致命的な呼吸器不全を生じる。
　FOPの責任遺伝子は、骨形成タンパク質（BMP）についてのI型受容体の一つをコードするACVR1（また、ALK2として知られている）であると考えられており、ACVR1のグリシン－セリンリッチ（GS）活性化ドメインにおいて突然変異（617G>A（R206H））が確認されている（非特許文献２）。変異ACVR1を様々な細胞株で過剰発現させる実験が多くの研究者によって行われており、R206H変異がACVR1を活性型に変換させ、その結果としてリガンドを必要としないBMPシグナル伝達の活性化や、リガンドへの過敏性をもたらしていることが見出されている。BMPは、骨形成や軟骨形成に関連するタンパク質として認識されていることから、変異ACVR1がFOPの異所性骨形成の原因となっていることを支持している。しかし変異ACVR1の過剰発現系を用いたこれらの重要な知見にもかかわらず、例えば、COS-7及びMC3T3-E1細胞株では変異ACVR1(R206H)の導入によりSMAD1/5/8の誘導が確認されているが、C2C12細胞株ではこのようなことは見られていないなど、いくつかの矛盾が残っている（非特許文献３、４及び５）。そこで、FOP患者の細胞を用いた研究が必要となるが、入手できる細胞は限られているうえに、細胞老化などにより症状の再現性を得ることが難しい（非特許文献６）。
　最近、本発明者らは、FOP患者から人工多能性幹細胞（iPS細胞）を作製することに成功し、さらに、該FOP患者由来iPS細胞（FOP-iPSC）において、石灰化の増大や軟骨過形成特性等、FOPの病態の一部が再現されることを見出した（非特許文献７）。しかし、iPS細胞クローン間や実験間でかなりの差異が見られるため、詳細な解析のためには、複数のFOP-iPSC株やコントロールiPSCを比較する必要があった。また、このようなクローン間や実験間でのばらつきが、異所性骨化（とりわけ、FOP）のメカニズムの解明を困難なものとし、それ故、有効な治療薬の開発が進まない状況であった。
Kaplan FS, et al., Dis Model Mech. 5, 756-762 (2012) Shore EM, et al., Nat Genet. 38, 525-527 (2006) Fukuda T, et al., J Biol Chem. 284, 7149-56 (2009) Shen Q, et al., J Clin Invest. 119, 3462-3472 (2009) van Dinther M et al., J Bone Miner Res. 25, 1208-1215 (2010) Billings PC et al., J Bone Miner Res. 23, 305-313 (2008) Matsumoto Y., et al. Orphanet J Rare Dis. 8(1):190 (2013)
　本発明の課題は、異所性骨化、とりわけ、FOPの予防及び／又は治療活性を有する物質（以下、「予防・治療薬」ともいう）の高確度なスクリーニング方法を提供することである。また、本発明の別の課題は、該スクリーニング法により得られる物質を含有する、異所性骨化の予防及び／又は治療剤を提供することである。
　本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、進行性骨化性線維異形成症患者由来のiPS細胞（FOP-iPSC）において、遺伝子修復技術を適用することにより、遺伝的バックグラウンドは同一で突然変異のみ修復されたiPS細胞（resFOP-iPSC）を作製することに成功した。続いて、FOP-iPSCを、神経堤細胞及び間葉系間質細胞を介して軟骨細胞に分化誘導させたところ、FOP-iPSCに特有の軟骨細胞の分化促進という病態を再現することに成功した。すなわち、FOP患者の体細胞由来のiPS細胞は、軟骨誘導した際に、resFOP-iPSCと比較して、軟骨組織が過剰に形成される傾向を見出した。また、軟骨組織の過剰形成の生じる原因について検討したところ、軟骨前駆細胞の増殖が亢進することが原因ではなく、軟骨細胞から細胞外マトリックスが過剰に産生されることが軟骨組織の過剰形成の原因であることを見出した。さらに、FOPに代表される異所性骨化の機序を見出すべく、FOP-iPSC及びresFOP-iPSC由来の種々の細胞につき遺伝子発現プロファイルを比較したところ、いくつかのシグナル伝達経路に分類される遺伝子群について両者間で違いが観察された。これらのシグナル阻害剤のうちPAI1阻害剤及びMMP1阻害剤をFOP-iPSC由来の神経堤細胞へ適用すると軟骨組織の過剰形成が抑制されることから、当該阻害剤が、異所性骨化、とりわけFOPの異所性骨化の予防・治療薬として有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は次に記載の事項を提供するものである。
［１］　プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター１（PAI1）阻害剤及び／又はマトリックスメタロプロテアーゼ１（MMP1）阻害剤を含む、異所性骨化の予防及び／又は治療剤。
［２］　前記PAI1阻害剤が、チプラクスチニン（tiplaxtinin）である、［１］に記載の剤。
［３］　前記MMP1阻害剤が、ガラルジン（GM6001）である、［１］又は［２］に記載の剤。
［４］　前記異所性骨化が、進行性骨化性線維異形成症（FOP）における異所性骨化である、［１］から［３］のいずれか１項に記載の剤。
［５］　有効量のPAI1阻害剤及び／又はMMP1阻害剤を対象に投与することを含む、該対象における異所性骨化の予防及び／又は治療方法。
［６］　前記PAI1阻害剤が、tiplaxtininである、［５］に記載の方法。
［７］　前記MMP1阻害剤が、GM6001である、［５］又は［６］に記載の方法。
［８］　前記異所性骨化が、FOPにおける異所性骨化である、［５］から［７］のいずれか１項に記載の方法。
［９］　異所性骨化の予防及び／又は治療において使用するためのPAI1阻害剤及び／又はMMP1阻害剤。
［１０］　前記PAI1阻害剤が、tiplaxtininである、［９］に記載の阻害剤。
［１１］　前記MMP1阻害剤が、GM6001である、［９］又は［１０］に記載の阻害剤。
［１２］　前記異所性骨化が、FOPにおける異所性骨化である、［９］から［１１］のいずれか１項に記載の阻害剤。
［１３］　異所性骨化の予防及び／又は治療剤の製造のためのPAI1阻害剤及び／又はMMP1阻害剤の使用。
［１４］　前記PAI1阻害剤が、tiplaxtininである、［１３］に記載の使用。
［１５］　前記MMP1阻害剤が、GM6001である、［１３］又は［１４］に記載の使用。
［１６］　前記異所性骨化が、FOPにおける異所性骨化である、［１３］から［１５］のいずれか１項に記載の使用。
［１７］　異所性骨化の予防及び／又は治療活性を有する物質をスクリーニングする方法であって、下記：
(a)被験物質の存在下及び非存在下でACVR1に変異を有する神経堤細胞を間葉系間質細胞へ分化させる工程、
(b) 工程(a)で得られた間葉系間質細胞を軟骨細胞へ分化させる工程、
(c) 工程(b)で得られた培養物中における軟骨組織量を測定する工程、及び
(d) 工程(a)を被験物質の非存在下で行った場合と比較して、被験物質の存在下で行った場合において軟骨組織量が減少した場合に、当該被験物質を異所性骨化の予防及び／又は治療活性を有する物質として選定する工程、
を含む、方法。
［１８］　前記工程(b)が、被験物質の存在下及び非存在下で行われる、［１７］に記載の方法。
［１９］　前記工程(a)が、塩基性線維芽細胞増殖因子（FGF2）を含む培養液中で神経堤細胞を培養することにより行われる、［１７］又は［１８］に記載の方法。
［２０］　前記工程(b)が、血小板由来増殖因子Ｂ鎖ホモダイマー（PDGF-BB）を含有する培養液中で間葉系間質細胞を培養することにより行われる、［１７］から［１９］のいずれか１項に記載の方法。
［２１］　前記軟骨組織量の測定が、細胞外マトリックスの量を測定することにより行われる、［１７］から［２０］のいずれか１項に記載の方法。
［２２］　前記細胞外マトリックスが、グリコサミノグリカン（GAG）である、［２１］に記載の方法。
［２３］　前記軟骨組織量の測定が、軟骨細胞マーカー遺伝子の発現量を測定することにより行われる、［１７］から［２０］のいずれか１項に記載の方法。
［２４］　前記軟骨細胞マーカー遺伝子が、SOX9、ACAN及びCOL2A1からなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子である、［２３］に記載の方法。
［２５］　前記軟骨組織量の測定が、アルシアンブルー（Alcian Blue）染色により行われる、［１７］から［２０］のいずれか１項に記載の方法。
［２６］　前記ACVR1の遺伝的変異が、R206Hである、［１７］から［２５］のいずれか１項に記載の方法。
［２７］　前記神経堤細胞が、ACVR1に変異を有する神経堤細胞を拡大培養して得られた細胞である、［１７］から［２６］のいずれか１項に記載の方法。
［２８］　前記神経堤細胞の拡大培養が、トランスフォーミング増殖因子β（TGFβ）阻害剤、上皮細胞増殖因子（EGF）及びFGF2を含有する培養液中で該神経堤細胞を培養することにより行われる、［２７］に記載の方法。
［２９］　前記TGFβ阻害剤が、SB431542である［２８］に記載の方法。
［３０］　前記神経堤細胞が、ACVR1に変異を有する多能性幹細胞から分化誘導された細胞である、［１７］から［２９］のいずれか１項に記載の方法。
［３１］　前記神経堤細胞の分化誘導が、TGFβ阻害剤及びグリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（GSK3β）阻害剤を含有する培養液中で前記多能性幹細胞を培養することにより行われる、［３０］に記載の方法。
［３２］　前記TGFβ阻害剤が、SB431542であり、前記GSK3β阻害剤が、CHIR99021である、［３１］に記載の方法。
　本発明のスクリーニング法によれば、再現性よく異所性骨化の病態を発現させ得るので、異所性骨化の予防・治療薬の探索が可能となる。また、該スクリーニング法により得られたPAI1阻害剤及びMMP1阻害剤は、軟骨組織の過形成を抑制し得るので、異所性骨化の有効な予防・治療薬となり得る。
図１は、遺伝子修復FOP-iPSC(resFOP-iPSC)クローンを作製した結果を示す。(a)遺伝子修復(rescue)のためのBACに基づくターゲティングベクターの構築について示す。矢印は、プライマーの位置を示す(Acvr1(Ex7)F1、Acvr1(Ex7)R1、Acvr1(Ex7)R2、HR_Fow1及びneo_Rev)。(b)ACVR1の変異(617 G>A)の修復について調べた結果を示す。cDNA塩基配列を決定することにより、遺伝子が修復されていることを確認した。FOPは、FOP-iPSCであり、resFOP(cl1)及びresFOP(cl2)は、遺伝子修復された(rescue)FOP-iPSCクローンである。(c)ACVR1の5'領域において相同組換えが生じているかを調べた結果を示す。ACVR1の5'領域は、相同組換えにより、6.8 KbのPCR産物の挿入が生じていた。(d)pgk-neo耐性カセットについてのコピー数多型を調べた結果を示す。p.c.は、pgk-neoカセットのCre介在切除が行われる前のOSR1-GFPノックインhiPSCクローンである。(e)FOP-iPSC及びresFOP-iPSC（(cl1)及び(cl2)）の代表的な画像を示す。スケールバーは、200 μmである。 図２は、FOP-iPSC由来のiNCC（induced Neural Crest Cell）及びiMSC（induced Mesenchymal Stromal Cell）について解析した結果を示す。(a) FOP-iPSC及びresFOP-iPSC（(cl1)及び(cl2)）からiNCCへの分化を誘導した代表的な画像を示す。(b)FOP-iPSC及びresFOP-iPSC（(cl1)及び(cl2)）由来のiNCCにおける、NCC（Neural Crest Cell）マーカー(TFAP2A、SOX10及びPAX3)、ならびにp75(NGFR)の発現状態を解析した結果を示す。いずれの遺伝子マーカーも、FOP-iPSC及びresFOP-iPSC（(cl1)及び(cl2)）に由来するiNCCにおいて、同様のレベルで特異的に発現していた。(c)FOP-iPSC及びresFOP-iPSC（(cl1)及び(cl2)）からiMSCへの分化を誘導した代表的な画像を示す。(d)FOP-iPSC及びresFOP-iPSC（(cl1)及び(cl2)）由来のiMSCにおける、MSC（Mesenchymal Stromal Cell）の細胞表面マーカー(CD73、CD44及びCD105)、ならびにCD45の発現状態を解析した結果を示す。FOP-iPSC及びresFOP-iPSC（(cl1)及び(cl2)）に由来するiMSCにおいて、MSCの細胞表面マーカーであるCD73、CD44及びCD105の発現は見られたが、CD45については陰性であった。 図３は、FOP-iMSCの軟骨細胞分化能について解析した結果を示す。(a)FOP-iMSC及びresFOP-iMSCから軟骨細胞への分化を誘導した10日目に、マイクロマス(MM)をAlcian Blue染色した代表的な画像を示す。(b)FOP-iMSC及びresFOP-iMSCにおけるマイクロマスのサイズを定量化した結果を示す。マイクロマスのサイズは、resFOP-iMSCよりもFOP-iMSCにおいて増加していた。(c,d)FOP-iMSC及びresFOP-iMSCにおけるGAG値(c)及びDNA量(d)を定量化した結果を示す。GAG値は、resFOP-iMSCよりもFOP-iMSCにおいて高値であったが、DNA量は、有意な差が見られなかった。結果は、平均±標準偏差(SD)で示しており、N = 8 (FOP)及びN = 4 (resFOP(cl1)及び(cl2))である。(e)FOP-iMSC及びresFOP-iMSCのマイクロマスにおける軟骨細胞分化マーカー(SOX9、COL2A1及びACAN)の発現状態を解析した結果を示す。いずれの軟骨細胞分化マーカーも、resFOP-iMSCよりもFOP-iMSCにおいて高発現していた。結果は、平均±標準偏差(SD)で示しており、N = 3である（resFOPの値は、cl1(N = 2)及びcl2(N = 1)の平均である）。スチューデントt検定においては、**, P < 0.01; ***, P < 0.001である。 図４は、FOP-iPSC及びresFOP-iPSCの遺伝子発現プロファイルの結果を示す。(a, b)iPSC、iNCC及びiMSCの各段階におけるFOP-iPSC及びresFOP-iPSCの遺伝子発現状態を解析した結果を示す。(a)は、iPSC、iNCC及びiMSCにおける階層的クラスタリング解析の結果であり、(b)は、異なる遺伝子発現セットを用いたPCAプロットの結果である。FOP-iPSC及びresFOP-iPSCは、同様の遺伝子発現プロファイルを示した。resFOPのすべてのデータは、resFOP(cl1)及び(cl2)の平均である。N = 2(resFOP-iPSC及びresFOP-iNCC)、N = 3(resFOP-iMSC(N = 2, cl1; N = 1, cl2))、N = 2(FOP-iPSC及びFOP-iNCC)、N = 3(FOP-iMSC)、N = 3(PSC、iNCC及びiMSC; 414C2、TIG120-4f1及びKhES1に由来する各細胞の平均)、ならびにN = 2(BMMSC; BM90及びBM91の平均)。(c-e)FOP-iPSC及びresFOP-iPSCにおけるグローバルな遺伝子発現プロファイルについての散布図を示す。iPSC及びiNCCは、N = 2であり、iMSCは、N = 3である。対角線の上下2本の線は、2つのサンプル間の2倍率変化の境界を示す。(f)FOP-iPSC及びresFOP-iPSCにおいて、統計的に有意な異なる発現状態を示す上位20個の遺伝子を示す(N = 3, p < 0.05)。 図５は、FOP-iMSC及びresFOP-iMSCにおけるSMAD1/5/8、SMAD2/3及びERK1/2経路の基礎的な活性の状態について解析した結果を示す。(a)FOP-iMSC及びresFOP-iMSCにおけるSMAD1/5/8、SMAD2/3及びERK1/2のリン酸化状態についてのウエスタンブロッティング解析の結果を示す。SMAD1/5/8、SMAD2/3及びERK1/2のリン酸化は、resFOP-iMSCよりもFOP-iMSCにおいてより高い状態であった。(b)(a)におけるリン酸化状態を定量化したグラフを示す。(c)FOP-iMSC及びresFOP-iMSCにおけるBMP特異的ルシフェラーゼ構築体の活性を評価した結果を示す。ルシフェラーゼ活性は、resFOP-iMSCよりもFOP-iMSCにおいてより高かった。(d)FOP-iMSC及びresFOP-iMSCにおけるID1（BMPの標的遺伝子）の発現状態を解析した結果を示す。ID1の発現は、resFOP-iMSCよりもFOP-iMSCにおいてより高かった。(e)FOP-iMSC及びresFOP-iMSCにおけるTGFβ特異的ルシフェラーゼ構築体の活性を評価した結果を示す。ルシフェラーゼ活性は、resFOP-iMSCよりもFOP-iMSCにおいてより高かった。(f)FOP-iMSC及びresFOP-iMSCにおけるPAI1（TGFβの標的遺伝子）の発現状態を解析した結果を示す。PAI1の発現は、resFOP-iMSCよりもFOP-iMSCにおいてより高かった。結果は、平均±標準偏差(SD)で示しており、N = 3である（resFOPの値は、cl1(N = 2)及びcl2(N = 1)の平均である）。スチューデントt検定においては、*, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P < 0.001である。 図６は、iMSCにおけるPAI1発現の制御経路について解析した結果を示す。(a)FOP-iMSC及びresFOP-iMSCにおいて、DMH1(SMAD1/5/8 inhibitor, 2 μM)、SB431542(SMAD2/3 inhibitor, 10 μM)及びU0126(MEK1/2 inhibitor, 1 μM)で処理した24時間後のPAI1の発現状態を解析した結果を示す。PAI1の発現は、DMH1又はSB431542で処理した場合に減少していた。(b)FOP-iMSC及びresFOP-iMSCにおいて、BMP4(10 ng/ml)、BMP7(100 ng/ml)及びTGFβ3(10 ng/ml)で処理した24時間後のPAI1の発現状態を解析した結果を示す。PAI1の発現は、BMP4、BMP7又はTGFβ3で処理した場合に増加していた。結果は、平均±標準偏差(SD)で示しており、N = 6である（resFOPの値は、cl1(N = 3)及びcl2(N = 3)の平均である）。 図７は、MSC誘導の間におけるPAI1及びMMP1の機能について解析した結果を示す。(a)阻害剤処理のタイムコースについての略図を示す。(b)Tiplaxtinin(PAI1 inhibitor, 10 μM)で処理後にマイクロマスをAlcian Blue染色した代表的な画像を示す。(c,d)陽性領域のサイズ(c)及びGAG値(d)を定量化した結果を示す。結果は、平均±標準偏差(SD)で示しており、N = 3である。(e)GM6001(MMP1 inhibitor)で処理後にマイクロマスをAlcian Blue染色した代表的な画像を示す。(f,g)陽性領域のサイズ(f)及びGAG値(g)を定量化した結果を示す。結果は、平均±標準偏差(SD)で示しており、N = 3である。 図８は、MSC誘導の間におけるSMAD1/5/8の機能について解析した結果を示す。(a)阻害剤処理のタイムコースについての略図を示す。(b)DMH1(SMAD1/5/8 inhibitor, 2 μM)で処理後にマイクロマスをAlcian Blue染色した代表的な画像を示す。(c,d)陽性領域のサイズ(c)及びGAG値(d)を定量化した結果を示す。結果は、平均±標準偏差(SD)で示しており、N = 3である。 図９は、MSC誘導の間におけるSMAD2/3の機能について解析した結果を示す。(a)阻害剤処理のタイムコースについての略図を示す。(b)SB431542 (SMAD2/3 inhibitor, 10 μM)で処理後にマイクロマスをAlcian Blue染色した代表的な画像を示す。(c,d)陽性領域のサイズ(c)及びGAG値(d)を定量化した結果を示す。結果は、平均±標準偏差(SD)で示しており、N = 3である。
　本明細書において、「異所性骨化」は、本来骨形成が起きない組織において骨形成が認められる病態を意味する。異所性骨化を伴う疾患として、例えば、後縦靭帯骨化症、黄色靭帯骨化症（黄色靭帯肥厚症）、進行性骨化性線維異形成症（FOP）、外傷性骨化性筋炎による異所性骨化が挙げられるが、これらに限定されない。FOPは、遺伝子の突然変異を伴うものでもよく、例えば、ACVR1の変異であり得る。ACVR1中に生じる突然変異としては、例えば、R206H、G356D等が挙げられるがこれらに限定されない。突然変異は、単独で生じていてもよいし、複数の変異が同時に生じていてもよい。本発明におけるFOPのACVR1の突然変異は、R206Hであり得る。
異所性骨化の予防及び／又は治療剤
　本発明は、PAI1阻害剤及び／又はMMP1阻害剤を含む、異所性骨化の予防及び／又は治療剤（以下、「本発明の予防・治療剤」ともいう）を提供する。本明細書において「予防・治療薬」という場合は活性成分そのものを意味し、「予防・治療剤」という場合は、予防及び／又は治療に用いるための医薬製剤を意味する。該医薬製剤は、活性成分単独であってもよいし、活性成分以外の添加物を含む組成物の形態であってもよい。
PAI1阻害剤
　本発明において、「PAI1」は、「プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター１」の略称であり、組織プラスミノーゲンアクチベーター（「t-PA」とも言う）やウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター（「u-PA」とも言う）を特異的に阻害するセリンプロテアーゼ阻害タンパク質を意味する。本発明において使用され得る「PAI1阻害剤」は、PAI1の活性を阻害し、その機能を妨害するような物質であれば、いかなるものでもよく、PAI1を特異的に阻害するものであっても、PAIファミリーメンバーを広範に阻害するものであってもよい。PAI1阻害剤として、例えば、ジケトピペラジン（XR330、XR334、XR1853、XR5082等）、11-ケト-9(E),12(E)-オクタデカジエン酸、チプラクスチニン（tiplaxtinin）、フォシノプリル、イミダプリル、カプトプリル、エナラプリル、L158809、エプロサルタン、トログリタゾン、ビタミンC、ビタミンE、ペリンドルプリル、ミフェプリストン(RU486)、スピロノラクトン及び反応性中心ループペプチド、抗PAI1中和抗体、PAI1に対するsiRNAなどが挙げられるが、これらに限定されない。本発明におけるPAI1阻害剤は、好ましくは、tiplaxtininである。これらの物質は、公知文献に記載された合成方法もしくは通常の合成方法を用いて製造することができるし、あるいはこれらの物質を製造・販売している企業等から入手することもできる。
MMP1阻害剤
　本発明において、「MMP1」は、「マトリックスメタロプロテアーゼ１」の略称であり、活性中心に金属イオンが配座しているタンパク質分解酵素であるメタロプロテアーゼの一つで、細胞外マトリックスの分解に関与する酵素である。本発明において使用され得る「MMP1阻害剤」は、MMP1の活性を阻害し、その機能を妨害するような物質であれば、いかなるものでもよく、MMP1を特異的に阻害するものであっても、MMPファミリーメンバーを広範に阻害するものであってもよい。MMP1阻害剤として、例えば、バチマスタット（Batimastat; BB-94）、マリマスタット（Marimastat; BB-2516）、プリノマスタット（Prinomastat; AG-3340）、CGS-27023A（MMI-270B）、ネオバスタット（Neovastat; AE-941）、BMS 275-291、テトラサイクリン類、マトリスタチン（Matristatin）、カテキン、GM6001（ガラルジン、アイロマスタット）、トロケード（Ro-32-3555）、抗MMP1中和抗体、MMP1に対するsiRNAなどが挙げられるが、これらに限定されない。本発明におけるMMP1阻害剤は、好ましくは、GM6001である。これらの物質は、公知文献に記載された合成方法を参照し、あるいは通常の合成法を用いることにより製造することができ、また、これらの物質の製造、販売、開発会社等から入手することもできる。
　本発明のPAI1阻害剤及びMMP1阻害剤は、フリー体だけでなく、その薬理学的に許容される塩を包含するものとする。薬理学的に許容される塩は阻害剤の種類によって異なるが、例えばtiplaxtininの場合、アルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩等）、アルカリ土類金属塩（カルシウム塩、マグネシウム塩等）、アルミニウム塩、アンモニウム塩等の無機塩基塩、並びにトリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン等の有機塩基塩などの塩基付加塩、あるいは塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、酢酸塩、ギ酸塩、プロピオン酸塩、安息香酸塩、トリフルオロ酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩等の有機酸塩などの酸付加塩が挙げられる。また、GM6001の場合、前記酸付加塩などが挙げられる。
医薬製剤
　本発明の予防・治療剤は、PAI1阻害剤及び／又はMMP1阻害剤を、そのまま、あるいは薬理学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤等と混合し、適当な剤型の医薬組成物として、経口的又は非経口的に投与することができる。
　経口投与のための組成物としては、固体又は液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等が挙げられる。一方、非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を包含しても良い。これらの製剤は、賦形剤（例えば、乳糖、白糖、葡萄糖、マンニトール、ソルビトールのような糖誘導体；トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、α澱粉、デキストリンのような澱粉誘導体；結晶セルロースのようなセルロース誘導体；アラビアゴム；デキストラン；プルランのような有機系賦形剤；及び、軽質無水珪酸、合成珪酸アルミニウム、珪酸カルシウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウムのような珪酸塩誘導体；燐酸水素カルシウムのような燐酸塩；炭酸カルシウムのような炭酸塩；硫酸カルシウムのような硫酸塩等の無機系賦形剤である）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウムのようなステアリン酸金属塩；タルク；コロイドシリカ；ビーズワックス、ゲイ蝋のようなワックス類；硼酸；アジピン酸；硫酸ナトリウムのような硫酸塩；グリコール；フマル酸；安息香酸ナトリウム；ＤＬロイシン；ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウムのようなラウリル硫酸塩；無水珪酸、珪酸水和物のような珪酸類；及び、上記澱粉誘導体である）、結合剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴール、及び、前記賦形剤と同様の化合物である）、崩壊剤（例えば、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、内部架橋カルボキシメチルセルロースナトリウムのようなセルロース誘導体；カルボキシメチルスターチ、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドンのような化学修飾されたデンプン・セルロース類である）、乳化剤（例えば、ベントナイト、ビーガムのようなコロイド性粘土；水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウムのような金属水酸化物；ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸カルシウムのような陰イオン界面活性剤；塩化ベンザルコニウムのような陽イオン界面活性剤；及び、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステルのような非イオン界面活性剤である）、安定剤（メチルパラベン、プロピルパラベンのようなパラオキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコールのようなアルコール類；塩化ベンザルコニウム；フェノール、クレゾールのようなフェノール類；チメロサール；デヒドロ酢酸；及び、ソルビン酸である）、矯味矯臭剤（例えば、通常使用される、甘味料、酸味料、香料等である）、希釈剤等の添加剤を用いて周知の方法で製造される。
　本発明の予防・治療剤中の、PAI1阻害剤、MMP1阻害剤の含有量は、それぞれ製剤全体の約0.0１～100重量%であり得る。本発明の予防・治療剤において、PAI1阻害剤とMMP1阻害剤とを併用する場合には、各阻害剤をそれぞれ単独で製剤化してもよいし、合剤としてもよい。前者の場合、各製剤を同一対象に対して同時にまたは時間差をおいて投与することができる。本発明の予防・治療剤の投与量は、薬物の種類、投与対象の種、体重、齢、投与経路、症状の重篤度、薬物受容性等の種々の条件を考慮し、適宜変更し得るが、例えば、tiplaxtininの場合、通常、有効成分量として、約0.1～約2000mg/kg/日、好ましくは約1～200mg/kg/日であり、この量を1日1回又は2～3回に分けて投与することができる。
異所性骨化の予防剤及び／又は治療剤のスクリーニング方法
　本発明は、異所性骨化の予防・治療薬の探索のために、被験物質をスクリーニングする方法（以下、「本発明のスクリーニング法」という場合がある）を提供する。
　本発明のスクリーニング法の一態様においては、以下の工程を含むことにより、異所性骨化の予防・治療薬をスクリーニングすることができる；
(a)被験物質の存在下及び非存在下でACVR1に変異を有する神経堤細胞を間葉系間質細胞へ分化させる工程、
(b)工程(a)で得られた間葉系間質細胞を軟骨細胞へ分化させる工程、
(c)工程(b)で得られた培養物中における軟骨組織量を測定する工程、及び
(d)工程(a)を被験物質の非存在下で行った場合と比較して、被験物質の存在下で行った場合において軟骨組織量が減少した場合に、当該被験物質を異所性骨化の予防・治療薬として選定する工程。
神経堤細胞
　本発明において、「神経堤細胞」（NCCともいう）とは、胚内の様々な部位への遊走能を有する、神経堤から脱上皮化した細胞と同等の細胞を意味する。すなわち、本発明の神経堤細胞は、神経堤由来の組織中（例えば、骨髄、脊髄後根神経節、心臓、角膜、虹彩、歯髄、及び嗅粘膜）の未分化な神経堤由来細胞も含む。神経堤細胞は、好ましくは、TFAP2A、SOX10、PAX3及びp75 (NGFR)のうち少なくとも一つの遺伝子が陽性である細胞であり得る。本発明において、TFAP2Aには、NCBIのアクセッション番号として、ヒトの場合、NM_001032280、NM_001042425又はNM_003220、マウスの場合、NM_001122948又はNM_011547に記載されたヌクレオチド配列を有する遺伝子ならびに当該遺伝子にコードされるタンパク質、ならびにこれらの機能を有する天然に存在する変異体が包含される。本発明において、SOX10には、NCBIのアクセッション番号として、ヒトの場合、NM_006941、マウスの場合、NM_011437に記載されたヌクレオチド配列を有する遺伝子ならびに当該遺伝子にコードされるタンパク質、ならびにこれらの機能を有する天然に存在する変異体が包含される。本発明において、PAX3には、NCBIのアクセッション番号として、ヒトの場合、NM_000438、NM_001127366、NM_013942、NM_181457、NM_181458、NM_181459、NM_181460又はNM_181461、マウスの場合、NM_001159520又はNM_008781に記載されたヌクレオチド配列を有する遺伝子ならびに当該遺伝子にコードされるタンパク質、ならびにこれらの機能を有する天然に存在する変異体が包含される。本発明において、p75 (NGFR)には、NCBIのアクセッション番号として、ヒトの場合、NM_002507、マウスの場合、NM_033217に記載されたヌクレオチド配列を有する遺伝子ならびに当該遺伝子にコードされるタンパク質、ならびにこれらの機能を有する天然に存在する変異体が包含される。
　本発明において、「ACVR1に変異を有する」とは、ACVR1において、R206H（206番目のアルギニンがヒスチジンに置換）及び／又はG356D（356番目のグリシンがアスパラギン酸に置換）等の変異を有することが例示されるが、変異はこれに限定されない。変異は、単独で生じていてもよいし、複数の変異が同時に生じていてもよい。ACVR1における変異は、好ましくは、R206Hであり得る。本発明において、ACVR1は、ALK-2 (activin receptor-like kinase-2)とも呼ばれるBMP類に対する受容体であり、NCBIのアクセッション番号として、ヒトの場合、NM_001105又はNM_001111067であり、マウスの場合、NM_001110204、NM_001110205又はNM_007394に記載されたヌクレオチド配列を有する遺伝子ならびに当該遺伝子にコードされるタンパク質である。
　本発明で用いる神経堤細胞は、凍結保存等によって予め用意された神経堤細胞を拡大培養することによって増殖させて用いることができる。神経堤細胞を拡大培養する方法として、TGFβ阻害剤、EGF及びFGF2を含有する培養液中で培養する方法が例示される。
　本発明において、神経堤細胞の拡大培養に用いる培養液は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、IMDM培地、Medium199培地、Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM)培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、StemPro34（invitrogen）、RPMI-base medium及びこれらの混合培地などが包含される。本工程において、好ましくは、αMEM培地が用いられる。培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清でもよい。必要に応じて、培地は、例えば、アルブミン、トランスフェリン、Knockout Serum Replacement(KSR)(ES細胞培養時のFBSの血清代替物)、N2サプリメント（Invitrogen）、B27サプリメント（Invitrogen）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール（2ME）、チオールグリセロールなどの1つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、Glutamax（Invitrogen）、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの1つ以上の物質も含有し得る。
　本発明において、TGFβ阻害剤は、TGFβの受容体への結合からSMADへと続くシグナル伝達を阻害する物質であり、受容体であるALKファミリーへの結合を阻害する物質、又はALKファミリーによるSMADのリン酸化を阻害する物質である限り特に限定されない。本発明において、TGFβ阻害剤は、例えば、Lefty-1（NCBI Accession No.として、マウス：NM_010094、ヒト：NM_020997が例示される）、SB431542、SB202190(以上、R.K.Lindemann et al., Mol. Cancer, 2003, 2:20)、SB505124 (GlaxoSmithKline)、 NPC30345 、SD093、SD908、SD208 (Scios)、LY2109761、LY364947、 LY580276 (Lilly Research Laboratories)、A-83-01(WO 2009/146408) 及びこれらの誘導体などが例示される。神経堤細胞を拡大培養に使用されるTGFβ阻害剤は、好ましくは、SB431542であり得る。
　培養液中におけるSB431542などのTGFβ阻害剤の濃度は、ALK5を阻害する濃度であれば特に限定されないが、1 nM～50 μMが好ましく、例えば、1 nM、10 nM、50 nM、100 nM、500 nM、750 nM、1 μM、2 μM、3 μM、4 μM、5 μM、6 μM、7 μM、8 μM、9 μM、10 μM、15 μM、20 μM、25 μM、30 μM、40 μM、50 μMであるがこれらに限定されない。より好ましくは、10 μMである。
　培養液中におけるEGFの濃度は、1 ng/ml～100 ng/mlが好ましく、例えば、1 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、30 ng/ml、40 ng/ml、50 ng/ml、60 ng/ml、70 ng/ml、80 ng/ml、90 ng/ml、100 ng/mlであるがこれらに限定されない。より好ましくは、20 ng/mlである。
　神経堤細胞を拡大培養に用いる培養液中におけるFGF2の濃度は、1 ng/ml～100 ng/mlが好ましく、例えば、1 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、30 ng/ml、40 ng/ml、50 ng/ml、60 ng/ml、70 ng/ml、80 ng/ml、90 ng/ml、100 ng/mlであるがこれらに限定されない。より好ましくは、20 ng/mlである。
　本発明の神経堤細胞の拡大培養において、細胞を単一に分離して培養する場合、単離の方法としては、例えば、力学的分離や、プロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性を有する分離溶液（例えば、トリプシンとコラゲナーゼの含有溶液Accutase(TM)及びAccumax(TM)（Innovative Cell Technologies, Inc）が挙げられる）又はコラゲナーゼ活性のみを有する分離溶液を用いた分離が挙げられる。細胞を単一に分離する場合、細胞死を抑制する目的で培養液へROCK阻害剤を添加してもよい。
　ROCK阻害剤は、Rho-キナーゼ（ROCK）の機能を抑制できるものである限り特に限定されず、例えば、Y-27632（例、Ishizaki et al., Mol. Pharmacol. 57, 976-983 (2000)；Narumiya et al., Methods Enzymol. 325,273-284 (2000)参照）、Fasudil/HA1077（例、Uenata et al., Nature 389: 990-994 (1997)参照）、H-1152（例、Sasaki et al., Pharmacol. Ther. 93: 225-232 (2002)参照）、Wf-536（例、Nakajima et al., Cancer Chemother Pharmacol. 52(4): 319-324 (2003)参照）及びそれらの誘導体、ならびにROCKに対するアンチセンス核酸、RNA干渉誘導性核酸（例、siRNA）、ドミナントネガティブ変異体、及びそれらの発現ベクターが挙げられる。また、ROCK阻害剤としては他の公知の低分子化合物も使用できる（例えば、米国特許出願公開第2005/0209261号、同第2005/0192304号、同第2004/0014755号、同第2004/0002508号、同第2004/0002507号、同第2003/0125344号、同第2003/0087919号、及び国際公開第2003/062227号、同第2003/059913号、同第2003/062225号、同第2002/076976号、同第2004/039796号参照）。本発明では、１種又は２種以上のROCK阻害剤が使用され得る。本工程で用いる好ましいROCK阻害剤としては、Y-27632が挙げられる。本工程で用いるROCK阻害剤の濃度は、使用するROCK阻害剤に応じて当業者に適宜選択可能であるが、例えば、ROCK阻害剤としてY-27632を用いる場合、0.1 μMから100 μM、好ましくは、1 μMから50 μM、さらに好ましくは、5 μＭから20 μMである。
　本発明の神経堤細胞の拡大培養は、好ましくは、接着培養によって行い得る。接着培養においては、神経堤細胞の培養容器への接着能を高めるため、培養容器をコーティングして用いることができる。コーティング剤としては、例えば、マトリゲル（BD Biosciences）、Synthemax（Corning）、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチン、又はフィブロネクチン及びこれらの断片、又は組み合わせが挙げられ、好ましくは、フィブロネクチンである。
　培養温度は、以下に限定されないが、約30～約40℃、好ましくは約37℃であり、CO2含有空気の雰囲気下で培養が行われる。CO2濃度は、約2～約5％、好ましくは約5％である。
　本発明で用いる神経堤細胞は、多能性幹細胞から誘導して用いても良い。多能性幹細胞から神経堤細胞を誘導する方法として、TGFβ阻害剤及びGSK-3β阻害剤を含有する培養液中で培養する方法が例示される。当該方法で誘導された神経堤細胞は、ｐ75を指標として単離して用いてもよく、他の細胞種が含有される細胞集団として用いても良い。ｐ75を指標として神経堤細胞を単離する方法は、当業者に周知の方法を用いることができ、例えば、ｐ75の抗体により標識し、フローサイトメーターを用いて単離する方法が挙げられる。
　本発明において、多能性幹細胞から神経堤細胞を誘導するために用いるTGFβ阻害剤、培養液等は、上述した神経堤細胞を拡大培養する方法と同条件で用いることができる。
　本発明において、多能性幹細胞から神経堤細胞を誘導するために用いるGSK-3β阻害剤は、GSK-3βタンパク質のキナーゼ活性（例えば、βカテニンに対するリン酸化能）を阻害する物質として定義され、既に多数のものが知られているが、例えば、インジルビン誘導体であるBIO（別名、GSK-3β阻害剤IX；6-ブロモインジルビン3'-オキシム）、マレイミド誘導体であるSB216763（3-(2,4-ジクロロフェニル)-4-(1-メチル-1H-インドール-3-イル)-1H-ピロール-2,5-ジオン）、フェニルαブロモメチルケトン化合物であるGSK-3β阻害剤VII（4-ジブロモアセトフェノン）、細胞膜透過型のリン酸化ペプチドであるL803-mts（別名、GSK-3βペプチド阻害剤；Myr-N-GKEAPPAPPQSpP-NH2）及び高い選択性を有するCHIR99021(6-[2-[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(4-methyl-1H-imidazol-2-yl)pyrimidin-2-ylamino]ethylamino]pyridine-3-carbonitrile)が挙げられる。これらの化合物は、例えばCalbiochem社やBiomol社等から市販されており容易に利用することが可能であるが、他の入手先から入手してもよく、あるいはまた自ら作製してもよい。好ましくは、CHIR99021であり得る。
　培養液中におけるCHIR99021などのGSK-3β阻害剤の濃度は、GSK-3βタンパク質のキナーゼ活性を阻害する濃度であれば特に限定されないが、1 nM～5 μMが好ましく、例えば、1 nM、10 nM、50 nM、100 nM、500 nM、750 nM、1 μM、2 μM、3 μM、4 μM、5 μMであるがこれらに限定されない。より好ましくは、1 μMである。
　本発明において、多能性幹細胞から神経堤細胞を誘導する方法は、好ましくは、接着培養によって行い得る。接着培養においては、神経堤細胞の培養容器への接着能を高めるため、培養容器をコーティングして用いることができる。コーティング剤としては、例えば、マトリゲル（BD Biosciences）、Synthemax（Corning）、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチン、又はフィブロネクチン及びこれらの断片、又は組み合わせが挙げられ、好ましくは、マトリゲルである。
　本工程において、多能性幹細胞から神経堤細胞を誘導するための培養日数は、例えば、10日以下、例えば、1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、及び10日の培養であり、好ましくは、3-9日、特に好ましくは、7日である。
多能性幹細胞
　本発明において多能性幹細胞とは、生体に存在する多くの細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、増殖能をも併せもつ幹細胞であり、本発明で使用される中間中胚葉細胞に誘導される任意の細胞が包含される。多能性幹細胞には、特に限定されないが、例えば、胚性幹（ES）細胞、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹（ntES）細胞、精子幹細胞（GS細胞）、胚性生殖細胞（EG細胞）、人工多能性幹（iPS）細胞、培養線維芽細胞や骨髄幹細胞由来の多能性細胞（Muse細胞）などが含まれる。好ましい多能性幹細胞は、製造工程において胚、卵子等の破壊をしないで入手可能であるという観点から、iPS細胞であり、より好ましくはヒトiPS細胞である。
　iPS細胞の製造方法は当該分野で公知であり、任意の体細胞へ初期化因子を導入することによって製造され得る。ここで、初期化因子とは、例えば、Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、beta-catenin、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3又はGlis1等の遺伝子又は遺伝子産物が例示され、これらの初期化因子は、単独で用いても良く、組み合わせて用いても良い。初期化因子の組み合わせとしては、WO2007/069666、WO2008/118820、WO2009/007852、WO2009/032194、WO2009/058413、WO2009/057831、WO2009/075119、WO2009/079007、WO2009/091659、WO2009/101084、WO2009/101407、WO2009/102983、WO2009/114949、WO2009/117439、WO2009/126250、WO2009/126251、WO2009/126655、WO2009/157593、WO2010/009015、WO2010/033906、WO2010/033920、WO2010/042800、WO2010/050626、WO2010/056831、WO2010/068955、WO2010/098419、WO2010/102267、WO2010/111409、WO2010/111422、WO2010/115050、WO2010/124290、WO2010/147395、WO2010/147612、Huangfu D, et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26: 795-797、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 2: 525-528、Eminli S, et al. (2008), Stem Cells. 26:2467-2474、Huangfu D, et al. (2008), Nat. Biotechnol. 26:1269-1275、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3, 568-574、Zhao Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3:475-479、Marson A, (2008), Cell Stem Cell, 3, 132-135、Feng B, et al. (2009), Nat. Cell Biol. 11:197-203、R.L. Judson et al., (2009), Nat. Biotechnol., 27:459-461、Lyssiotis CA, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:8912-8917、Kim JB, et al. (2009), Nature. 461:649-643、Ichida JK, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:491-503、Heng JC, et al. (2010), Cell Stem Cell. 6:167-74、Han J, et al. (2010), Nature. 463:1096-100、Mali P, et al. (2010), Stem Cells. 28:713-720、Maekawa M, et al. (2011), Nature. 474:225-9.に記載の組み合わせが例示される。
　体細胞には、非限定的に、胎児(仔)の体細胞、新生児(仔)の体細胞、及び成熟した健全なもしくは疾患性の体細胞のいずれも包含されるし、また、初代培養細胞、継代細胞、及び株化細胞のいずれも包含される。具体的には、体細胞は、例えば（1）神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）、（2）組織前駆細胞、（3）血液細胞（末梢血細胞、臍帯血細胞等）、リンパ球、上皮細胞、内皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞（皮膚細胞等）、毛細胞、肝細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞(膵外分泌細胞等)、脳細胞、肺細胞、腎細胞及び脂肪細胞等の分化した細胞などが例示される。
　本発明において、体細胞を採取する由来となる哺乳動物個体は特に制限されないが、好ましくはヒトである。
　本発明において、多能性幹細胞は、ACVR1に、R206H、又はG356D等の変異を有することが望ましいことから、進行性骨化性線維異形成症（FOP）の患者由来の体細胞から製造されたiPS細胞が好ましい。あるいは、ACVR1遺伝子に変異を有さない多能性幹細胞に対して、遺伝子改変技術を用いて、ACVR1遺伝子中に突然変異を導入することによっても得られる。この場合において、遺伝子改変技術は、当分野で既知である種々の技術を採用することができ、例えば、WO2013/042731に記載の方法、ZFN、TALEN、CRISPR/Cas等を用いる方法が挙げられるが、これらに限定されない。
神経堤細胞を間葉系間質細胞へ分化させる工程
　本発明において、「間葉系間質細胞」（MSCともいう）とは、軟骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、筋肉細胞、脂肪細胞、繊維芽細胞、免疫細胞、内皮細胞、周皮細胞などの結合組織の細胞への分化能を有する細胞を意味し、特に断りのない限り、間葉系幹細胞と同等の意味を有する。本発明における間葉系間質細胞は、特に限定されないが、CD73、CD44及びCD105が陽性であり、CD45が陰性である細胞である。本発明において、CD73には、NCBIのアクセッション番号として、ヒトの場合、NM_001204813又はNM_002526、マウスの場合、NM_011851に記載されたヌクレオチド配列を有する遺伝子ならびに当該遺伝子にコードされるタンパク質、ならびにこれらの機能を有する天然に存在する変異体が包含される。本発明において、CD44には、NCBIのアクセッション番号として、ヒトの場合、NM_000610、NM_001001389、NM_001001390、NM_001001391、NM_001001392、NM_001202555、NM_001202556又はNM_001202557、マウスの場合、NM_001039150、NM_001039151、NM_001177785、NM_001177786、NM_001177787又はNM_009851に記載されたヌクレオチド配列を有する遺伝子ならびに当該遺伝子にコードされるタンパク質、ならびにこれらの機能を有する天然に存在する変異体が包含される。本発明において、CD105には、NCBIのアクセッション番号として、ヒトの場合、NM_000118、NM_001114753又はNM_001278138、マウスの場合、NM_001146348、NM_001146350又はNM_007932に記載されたヌクレオチド配列を有する遺伝子ならびに当該遺伝子にコードされるタンパク質、ならびにこれらの機能を有する天然に存在する変異体が包含される。本発明において、CD45には、NCBIのアクセッション番号として、ヒトの場合、NM_001267798、NM_002838又はNM_080921、マウスの場合、NM_001111316、NM_001268286又はNM_011210に記載されたヌクレオチド配列を有する遺伝子ならびに当該遺伝子にコードされるタンパク質、ならびにこれらの機能を有する天然に存在する変異体が包含される。
　本発明において、神経堤細胞から間葉系間質細胞を誘導する工程は、浮遊培養により行われてもよく、あるいはコーティング処理された培養皿を用いて接着培養により行われてもよい。好ましくは、接着培養により培養される。接着培養が行われる際には、コーティング処理された培養容器を用いてもよく、フィーダー細胞上で培養してもよい。
　神経堤細胞から間葉系間質細胞を誘導する工程において、間葉系間質細胞を誘導する培地は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM)培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、StemPro34（invitrogen）、RPMI-base medium及びこれらの混合培地などが包含される。本工程において、好ましくは、αMEM培地が用いられる。培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清でもよい。必要に応じて、培地は、例えば、アルブミン、トランスフェリン、Knockout Serum Replacement(KSR)(ES細胞培養時のFBSの血清代替物)、N2サプリメント（Invitrogen）、B27サプリメント（Invitrogen）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール（2ME）、チオールグリセロールなどの1つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、Glutamax（Invitrogen）、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの1つ以上の物質も含有し得る。好ましい基礎培地は、血清を含有するαMEM培地である。
　神経堤細胞からの間葉系間質細胞の誘導に用いる培養液におけるFGF2の濃度は、1 ng/ml～20 ng/mlが好ましく、例えば、1 ng/ml、2 ng/ml、3 ng/ml、4 ng/ml、5 ng/ml、6 ng/ml、7 ng/ml、8 ng/ml、9 ng/ml、10 ng/ml、15 ng/ml、20 ng/mlであるがこれらに限定されない。より好ましくは、5 ng/mlである。
　神経堤細胞からの間葉系間質細胞の誘導にかかる培養日数は、長期に培養することによって間葉系間質細胞の誘導に影響を及ぼすことがないので、特に上限は必要ないが、例えば、2日以上、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日及び14日の培養であり、好ましくは、7日以上、特に好ましくは、13日である。
　神経堤細胞からの間葉系間質細胞の誘導は、好ましくは、接着培養によって行い得る。接着培養においては、神経堤細胞の培養容器への接着能を高めるため、培養容器をコーティングして用いることができる。コーティング剤としては、例えば、マトリゲル（BD Biosciences）、Synthemax（Corning）、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチン、又はフィブロネクチン及びこれらの断片、又は組み合わせが挙げられ、好ましくは、フィブロネクチンである。
　本発明では、接着培養による間葉系間質細胞の誘導期間において、トリプシン-EDTA等の自体公知の分離溶液で細胞を分離し、同条件にて再播種する継代を行っても良く、コーティング剤を変更しても良い。コーティング剤を変更する場合、例えば、最初の培養をフィブロネクチンでコーティング処理された培養容器で行い、それに続く培養は、コーティング剤を用いずに接着培養することができる。この場合、フィブロネクチン上での培養日数は、例えば、5日以下、例えば、1日、2日、3日、4日、5日の培養であり、好ましくは、1-3日、特に好ましくは、2日である。
　培養温度は、以下に限定されないが、約30～約40℃、好ましくは約37℃であり、CO2含有空気の雰囲気下で培養が行われる。CO2濃度は、約2～約5％、好ましくは約5％である。
間葉系間質細胞を軟骨細胞へ分化させる工程
　本発明において「軟骨細胞」は、コラーゲン、グリコサミノグリカン（GAG）などの軟骨又は軟骨組織を構成する細胞外マトリックスを産生する細胞、又は、このような細胞となる前駆細胞を意味する。本発明において軟骨細胞は、軟骨細胞のみによって集団を形成していてもよく、あるいは軟骨細胞と当該軟骨細胞から産生された細胞外マトリックスからなる培養物（パーティクル）の状態（軟骨様組織）であってもよい。また、このような軟骨細胞は、軟骨細胞マーカーを発現する細胞であってもよく、軟骨細胞マーカーとしてII型コラーゲン（COL2A1）、SOX9又はAGGRECAN（ACAN）が例示される。本発明において、COL2A1には、NCBIのアクセッション番号として、ヒトの場合、NM_001844又はNM_033150、マウスの場合、NM_001113515又はNM_031163に記載されたヌクレオチド配列を有する遺伝子ならびに当該遺伝子にコードされるタンパク質、ならびにこれらの機能を有する天然に存在する変異体が包含される。本発明において、SOX9には、NCBIのアクセッション番号として、ヒトの場合、NM_000346、マウスの場合、NM_011448に記載されたヌクレオチド配列を有する遺伝子ならびに当該遺伝子にコードされるタンパク質、ならびにこれらの機能を有する天然に存在する変異体が包含される。本発明において、AGGRECANには、NCBIのアクセッション番号として、ヒトの場合、NM_001135もしくはNM_013227、マウスの場合、NM_007424に記載されたヌクレオチド配列を有する遺伝子ならびに当該遺伝子にコードされるタンパク質、ならびにこれらの機能を有する天然に存在する変異体が包含される。また、本発明における軟骨細胞は、Alcian Blueにより染色され得る。
　本発明では、間葉系間質細胞から軟骨細胞を誘導する方法として、二次元(2D)マイクロマス培養法又は三次元(3D)ペレット培養法を用いることができる。
（i）二次元(2D)マイクロマス培養法
　2Dマイクロマス培養法では、間葉系間質細胞を任意の方法で分離し、接着培養により培養し得る。ここで、分離の方法としては、力学的な方法や酵素学的な方法を用いることができるが、本工程において、好ましくは、TrypLE Select (Invitrogen)により分離することができる。
　本発明において、2Dマイクロマス培養法での接着培養は、細胞外基質によりコーティング処理された培養容器を用いて培養することによって行い得る。コーティング処理は、細胞外基質を含有する溶液を培養容器に入れた後、当該溶液を適宜除くことによって行い得る。本発明において、フィブロネクチンでコーティング処理されていることが好ましい。
　2Dマイクロマス培養法において使用される培養液は、動物細胞の培養に用いられる基礎培地へPDGF-BB又はその機能的同等物を添加して調製することができる。該培養液には、さらにTGFβ3やBMP4、あるいはこれらの機能的同等物を添加することもできる。これらの基礎培地へ添加される因子は、同時に添加されてもよく、また培養工程の任意の段階において別々に添加されてもよい。
　PDGF-BBの機能的同等物としては、例えば、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-CC、PDGF-DDなどが挙げられるがこれらに限定されない。TGFβ3の機能的同等物としては、例えば、TGFβ1、TGFβ2などが挙げられるがこれらに限定されない。BMP4の機能的同等物としては、例えば、BMP2、BMP6、BMP7などが挙げられるがこれらに限定されない。
　2Dマイクロマス培養法において使用される基礎培地としては、例えば、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle’s Minimum Essential Medium（EMEM）培地、αMEM培地、Dulbecco’s modified Eagle’s Medium（DMEM）培地、Ham’s F12培地、RPMI 1640培地、Fischer’s培地、これらの混合培地などが挙げられる。培地には、血清（例えば、FCS）が含有されていてもよいし、又は無血清でもよい。必要に応じて、例えば、アルブミン、トランスフェリン、KnockOut Serum Replacement（KSR）（ES細胞培養時のFBSの血清代替物）（Invitrogen）、N2サプリメント（Invitrogen）、B27サプリメント（Invitrogen）、脂肪酸、インスリン、亜セレン酸ナトリウム、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール、3’-チオールグリセロールなどの１つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、GlutaMAX（Invitrogen）、非必須アミノ酸（NEAA）、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの１つ以上の物質も含有し得る。本工程の１つの実施形態において、基礎培地は、DMEM培地とHam’s F12培地を1:1で混合した無血清軟骨形成培地である。
　基礎培地に添加するPDGF-BBの濃度は、例えば1-100 ng/mlの範囲内、好ましくは20-60 ng/mlの範囲内にあり、例えば、1 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、25 ng/ml、30 ng/ml、35 ng/ml、40 ng/ml、50 ng/ml、60 ng/ml、70 ng/ml、80 ng/ml、90 ng/ml、100 ng/mlであるがこれらに限定されない。好ましくは、40 ng/mlである。
　TGFβ3を添加する場合、基礎培地に添加するTGFβ3の濃度は、例えば1-100 ng/mlの範囲内、好ましくは5-20 ng/mlの範囲内にあり、例えば、1 ng/ml、2 ng/ml、3 ng/ml、4 ng/ml、5 ng/ml、6 ng/ml、7 ng/ml、8 ng/ml、9 ng/ml、10 ng/ml、11 ng/ml、12 ng/ml、13 ng/ml、14 ng/ml、15 ng/ml、16 ng/ml、17 ng/ml、18 ng/ml、19 ng/ml、20 ng/ml、25 ng/ml、50 ng/ml、75 ng/ml、100 ng/mlであるがこれらに限定されない。好ましくは、10 ng/mlである。
　BMP4を添加する場合、基礎培地に添加するBMP4の濃度は、例えば1-100 ng/mlの範囲内、好ましくは5-20 ng/mlの範囲内にあり、例えば、1 ng/ml、2 ng/ml、3 ng/ml、4 ng/ml、5 ng/ml、6 ng/ml、7 ng/ml、8 ng/ml、9 ng/ml、10 ng/ml、11 ng/ml、12 ng/ml、13 ng/ml、14 ng/ml、15 ng/ml、16 ng/ml、17 ng/ml、18 ng/ml、19 ng/ml、20 ng/ml、25 ng/ml、50 ng/ml、75 ng/ml、100 ng/mlであるがこれらに限定されない。好ましくは、10 ng/mlである。
　2Dマイクロマス培養法において、培養温度は特に限定されないが、約30～約40℃、好ましくは約37℃であり、CO2含有空気の雰囲気下で培養が行われる。CO2濃度は、約2～約5％、好ましくは約5%である。空気におけるO2含有量は、通常の20％よりも低下した条件でもよく、例えば、15％、10％、又は5％が例示される。本工程の培養時間は、例えば20日以下の培養であり、好ましくは10日である。
　上記のとおり、基礎培地へのPDGF-BB、TGFβ3及びBMP4の添加は、同時に行われてもよく、また培養工程の任意の段階において別々に添加されてもよい。好ましくは、培養工程の段階に応じて、任意の順序で任意の組み合わせで添加される。また、基礎培地へのPDGF-BB、TGFβ3及びBMP4の添加は、培養中の培地に直接添加することもでき、また培地を交換する際に添加することもできる。
　本工程における基礎培地へのPDGF-BB、TGFβ3及びBMP4の添加は、例えば、下記の順序及び組み合わせで行われ得る。
（１）PDGF-BB、
（２）PDGF-BB及びTGFβ3、ならびに
（３）BMP4。
　工程（１）の培養期間は、例えば10日以下であり、好ましくは3日である。工程（２）の培養期間は、例えば8日以下であり、好ましくは7日である。工程（３）の培養は、省略してもよく、行う場合の期間は、例えば8日以下であり、好ましくは4日である。
　基礎培地へのPDGF-BB、TGFβ3及びBMP4の添加はさらに、他の分化誘導因子と組み合わせて行うこともできる。他の分化誘導因子は、例えば、Wnt3A、Activin、FGF2、Follistatin、GDF5、NT4などが挙げられるが、これらに限定されない。
（ii）三次元(3D)ペレット培養法
　本発明において、3Dペレット培養に先んじて、間葉系間質細胞をFGF2及びTGFβ3を添加した培地中で継代する工程を含むことができる。継代期間は、特に限定されないが、5日以下の期間であり、3日間が好ましい。培地中のFGF2の濃度は、例えば0.1-50 ng/mlの範囲内、好ましくは0.5-20 ng/mlの範囲内にあり、例えば、0.5 ng/ml、0.6 ng/ml、0.7 ng/ml、0.8 ng/ml、0.9 ng/ml、1 ng/ml、2 ng/ml、3 ng/ml、4 ng/ml、5 ng/ml、6 ng/ml、7 ng/ml、8 ng/ml、9 ng/ml、10 ng/ml、12 ng/ml、14 ng/ml、16 ng/ml、18 ng/ml、20 ng/mlであるがこれらに限定されない。好ましくは、1～5 ng/mlの範囲内である。培地中のTGFβ3の濃度は、例えば1-100 ng/mlの範囲内、好ましくは5-20 ng/mlの範囲内にあり、例えば、1 ng/ml、2 ng/ml、3 ng/ml、4 ng/ml、5 ng/ml、6 ng/ml、7 ng/ml、8 ng/ml、9 ng/ml、10 ng/ml、11 ng/ml、12 ng/ml、13 ng/ml、14 ng/ml、15 ng/ml、16 ng/ml、17 ng/ml、18 ng/ml、19 ng/ml、20 ng/ml、25 ng/ml、50 ng/ml、75 ng/ml、100 ng/mlであるがこれらに限定されない。好ましくは、10 ng/mlである。
　本発明において、3Dペレット培養に先んじて、上記継代培養された細胞を遠心分離機にかけて、ペレットを形成させる工程をさらに含み得る。遠心分離機に用いられる細胞の数は特に限定されないが、例えば、2.5×105個の細胞が用いられ得る。
　3Dペレット培養法において使用される培養液は、2Dマイクロマス培養法と同様の培地を用いて行うことができる。
　3Dペレット培養法において、培養温度は特に限定されないが、約30～約40℃、好ましくは約37℃であり、CO2含有空気の雰囲気下で培養が行われる。CO2濃度は、約2～約5％、好ましくは約5%である。本工程の培養時間は、例えば40日以下であり、好ましくは28日である。
スクリーニング工程
　本発明のスクリーニング法においては、上述した細胞と被験物質を接触させ、被験物質を接触させなかった場合と比較して、軟骨組織量を減少させた被験物質を異所性骨化の予防・治療薬として選定する。
　本発明のスクリーニング法における軟骨組織量の測定は、間葉系間質細胞の単位細胞あたりで誘導される軟骨細胞の組織の大きさを測定すること、軟骨細胞マーカー遺伝子の発現量を測定すること、又は、軟骨細胞の細胞外マトリックスの量を測定することによって成し得る。
　本発明のスクリーニング法において、被験物質と細胞との接触は、少なくとも神経堤細胞から間葉系間質細胞へと誘導する間に行われればよく、間葉系間質細胞から軟骨細胞へと誘導する間も被験物質を細胞と接触させることを妨げない。
　本発明における軟骨細胞の組織の大きさの測定は、軟骨細胞を特異的に染色する物質を用いて染色された面積又は直径を測定することで行い得る。軟骨細胞を特異的に染色する物質は、例えば、Alcian Blue、サフラニンOやその類縁体を挙げることができるが、これらに限定されない。
　本発明における軟骨細胞マーカー遺伝子として、例えば、SOX9, ACAN, COL2A1などが挙げられるが、これらに限定されない。軟骨細胞マーカー遺伝子は、mRNAの発現量又はタンパク質量として測定され、当該測定方法としては、当業者に周知の方法によって行い得るが、例えば、ノーザンブロット法、RT-PCR、ウェスタンブロット法、フローサイトメトリー等の方法が挙げられる。
　本発明における細胞外マトリックスの量の測定は、当業者に周知の方法を用いて行うことができる。例えば、細胞外マトリックスの量の測定は、グリコサミノグリカン（GAG）を標的とするBlyscan Glycosaminoglycan Assay (Biocolor)を用いて行うことができるが、これに限定されない。
　本発明のスクリーニング法においては、任意の被験物質を用いることができ、いかなる公知化合物及び新規化合物であってもよく、例えば、細胞抽出物、細胞培養上清、微生物発酵産物、海洋生物由来の抽出物、植物抽出物、精製タンパク質又は粗タンパク質、ペプチド、非ペプチド化合物、合成低分子化合物、天然化合物等が挙げられる。本発明において、被験物質はまた、（1）生物学的ライブラリー法、（2）デコンヴォルーションを用いる合成ライブラリー法、（3）「1ビーズ1化合物（one-bead one-compound）」ライブラリー法、及び（4）アフィニティクロマトグラフィ選別を使用する合成ライブラリー法を含む当技術分野で公知のコンビナトリアルライブラリー法における多くのアプローチのいずれかを使用して得ることができる。アフィニティクロマトグラフィ選別を使用する生物学的ライブラリー法はペプチドライブラリーに限定されるが、その他の4つのアプローチはペプチド、非ペプチドオリゴマー、又は化合物の低分子化合物ライブラリーに適用できる（Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12: 145-67）。分子ライブラリーの合成方法の例は、当技術分野において見出され得る（DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6909-13; Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11422-6; Zuckermann et al. (1994) J. Med. Chem. 37: 2678-85; Cho et al. (1993) Science 261: 1303-5; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061; Gallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37: 1233-51）。化合物ライブラリーは、溶液（Houghten (1992) Bio/Techniques 13: 412-21を参照のこと）又はビーズ（Lam (1991) Nature 354: 82-4）、チップ（Fodor (1993) Nature 364: 555-6）、細菌（米国特許第5,223,409号）、胞子（米国特許第5,571,698号、同第5,403,484号、及び同第5,223,409号）、プラスミド（Cull et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1865-9）若しくはファージ（Scott and Smith (1990) Science 249: 386-90; Devlin (1990) Science 249: 404-6; Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6378-82; Felici (1991) J. Mol. Biol. 222: 301-10; 米国特許出願第2002103360号）として作製され得る。
　本発明を以下の実施例でさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はそれら実施例に限定されないものとする。
実施例１　BACを用いた相同組換えによるresFOP-iPSCクローンの樹立
　FOP-iPSC（第7エクソンに617G>A(R206H)変異を有する）と同様の遺伝子バックグラウンドを有する信頼性の高いコントロールiPSCを作製するために、BACを用いた相同組換え技術を用いた。以前に記載されたとおり、BAC組換え法を行うため（Ikeya M., Int. J. Dev. Biol. 49: 807 - 823, 2005）、BACを用いてターゲティングベクターの構築を行った。簡潔には、ヒトBAC clone CTD-20251l1をlife technologies (Carlsbad, CA, USA)から購入した。次いで、floxed pgk-neoカセットを第6イントロンに挿入し、5' 領域を5 KBまで短くすることにより、ターゲティングベクターを構築した。得られたターゲティングベクターは、図１aで示されたとおり、5 KBの5'-短腕及び120 Kbの3'-長腕を含む構築体である。
　続いて、Maeらの方法（Mae S, et al., Nat Commun. 4:1367, 2013）を改変した方法でエレクトロポレーションによりターゲティングベクターを導入し、2種類のresFOP-iPSCクローンを樹立した。簡潔には、ACVR1ターゲティングベクターをFspA1制限酵素により直線化し、エタノール沈殿により滅菌した。FOP-iPSC (vFOP4-1株； Matsumoto Y., et al. Orphanet J Rare Dis. 8(1):190, 2013) をトリプシン処理し、遠心分離を行った後、PBSで再懸濁した。再懸濁したFOP-iPSCに全30 mgの直線化DNAを加えて、室温で、single 250 V, 500 mF pulse (Gene pulser CE, Bio-Rad) の電気刺激を細胞に与えた。次いで、FOP-iPSCを、ROCK inhibitor (Y-27632, 10 μM) を加えた培地中で、mitomycin-Cで処理したSNLフィーダー層上に播種した。エレクトロポレーションの2日後に、G418 (75 μg/ml)を添加して組換え体を選択した。得られたコロニーからゲノムDNAを抽出し、そのゲノムDNAの塩基配列を決定することにより、遺伝子修復クローンを一次スクリーニングにかけた。次いで、5’long PCR産物（図１a下）により、相同組換えが生じていることを確認し（図１c）、cDNAの塩基配列を直接決定することにより、遺伝子修復が成功していることを確認した（図１b）。pgk-neoカセットに対するゲノムqPCRにより、単一コピーの挿入を確認した（図１d）。
　以上より、2株の遺伝子修復された(rescue) FOP-iPSCクローンの樹立に成功した（resFOP-iPSC (cl1)及びresFOP-iPSC (cl2)）。また、このとき、2株の非ターゲティングG418耐性クローンを得た。これらの非ターゲティングクローンは、軟骨細胞への分化能において、親のFOP-iPSCと同じ表現型を示すことが確認された。以後、非ターゲティングG418耐性クローンのうちの1つをFOP-iPSCクローンとして用いた。
　resFOP-iPSC (cl1)、resFOP-iPSC (cl2)及びFOP-iPSCは、多能性マーカー遺伝子の発現、テラトーマ形成能、核型及び形態（図１e）を測定し、多能性に差異がないことを確認した。また、テラトーマにおける軟骨領域にresFOP-iPSC及びFOP-iPSCで違いがないことを確認した。
実施例２　細胞培養
　iPSCは、4 ng/ml recombinant human basic fibroblast growth factor (FGF2)（WAKO）を補充した霊長類ES細胞培地(ReproCELL, Tokyo, Japan) にて維持した。
　神経堤細胞（NCC）の誘導は、次の通り行った。iPS細胞を1×104/wellでマトリゲルコーティングした24-wellプレートに播種し、mTeSR1（STEMCELL Technologies）中で2日間培養した後、10 μM SB431542及び1 μM CHIR99021を添加したchemically defined medium (CDM) で7日間培養して、NCCを誘導した（以下、iNCCと言う）。なお、CDMは、1x chemically defined lipid concentrate (GIBCO)、15 μg/ml apo-transferrin (Sigma)、450 μM monothioglycerol (Sigma)、5 mg/ml purified BSA (99% purified by crystallization; Sigma)、7 μg/ml Insulin (WAKO) 及びpenicillin/streptomycin (Invitrogen) をIscove’s modified Dulbecco’s medium/Ham’s F-12 1:1に添加することによって調製した。
　続いて、iNCCから間葉系間質細胞（MSC）への分化誘導は、次の方法で行った。上述の誘導後の細胞から抗p75抗体（BD, Cat No.560326）を用いてFACSによりp75陽性細胞を抽出し、2×105/wellでFibronectinコーティングした12-wellプレートに播種し、10 μM Y-27632及び10 μM SB431542を添加したCDM中で1日間培養した後、培地を10 μM SB431542、20 ng/ml FGF2及び20 ng/ml epidermal growth factor (EGF)（R&D）を添加したCDMへ交換し維持培養を9日間行った。維持培養後、MSC培地（5 ng/ml FGF2、10% fetal bovine serum (FBS)（Nichirei Inc.）及び0.5% penicillin and streptomycin (Invitrogen) を添加したminimum essential medium alpha modification (αMEM; Invitrogen Co.)）へ交換し2日間培養した。さらに、トリプシンで細胞を分離した後、3×105/wellで6-wellプレート（Costar社、#3516）に播種し、MSC培地中で、11日間継代培養した（以下、iMSCと言う）。
実施例３　FOP-iPSCのiNCC／iMSC分化能についての解析
　FOP-iPSCにおいて、ACVR1(R206H)の過剰発現が軟骨誘導を促進することが以前に報告されている（Matsumoto Y., et al. Orphanet J Rare Dis. 8(1):190 (2013)）。そこで、FOP-iPSC及びresFOP-iPSCからそれぞれiNCC（induced Neural Crest Cell）及びiMSC（induced Mesenchmal Stromal Cell）を誘導し、両者の軟骨細胞分化特性を比較した。iNCCの誘導開始の7日目に、FACSを用いて、抗p75抗体により細胞を選別した後、iNCCの形態を観察した。その結果、FOP-iNCC及びresFOP-iNCCにおいて形態的な差異は見られなかった（図２a）。さらに、得られたiNCCにおけるNCCマーカー(TFAP2A、SOX10及びPAX3)、ならびにp75 (NGFR)の発現状態を、RT-PCRにより解析した。RT-PCRは、RNeasy kit (Qiagen, Valencia, CA)を用いて、各iNCCから全RNAをそれぞれ精製し、DNase-one kit (Qiagen)で処理してゲノムDNAを除去した。製造者の指示に従って、ランダムオリゴ及びSuperscript III reverse transcriptase (Invitrogen) を用いて、1 μgの全RNAを一本鎖cDNAに逆転写した。ExTaq (Takara, Shiga, Japan)によりPCRを行った。Thunderbird SYBR qPCR Mix (TOYOBO, Osaka, Japan)を用いて定量的PCRを行い、StepOne real-time PCR system (Applied Biosystems, Forester City, CA)を用いて解析を行った。その結果、NCCマーカー(TFAP2A、SOX10及びPAX3)、ならびにp75 (NGFR)のすべての遺伝子について、FOP-iPSC及びresFOP-iPSC（(cl1)及び(cl2)）に由来するiNCCで、同様のレベルで特異的に発現していた（図２b）。
　iMSC誘導開始の3継代目には、ヒト初代培養MSCと同様の形態の細胞が出現し、FOP-iPSC及びresFOP-iPSCにおいて形態に違いは見られなかった（図２c）。iMSC誘導開始の7日目に、FOP-iPSC及びresFOP-iPSC（(cl1)及び(cl2)）に由来するiMSCで、MSCの細胞表面マーカー(CD73、CD44及びCD105)、ならびにCD45を指標としてFACS解析を行った。FACS解析は、製造者のプロトコールに従って、AriaII (BD)を用いて行った。FACSで使用された抗体は、表１に記載した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　その結果、FOP-iPSC及びresFOP-iPSC（(cl1)及び(cl2)）に由来するiMSCにおいて、MSCの細胞表面マーカーであるCD73、CD44及びCD105の発現は見られたが、CD45は陰性であった（図２d）。この結果、FOP-iPSC及びresFOP-iPSC（(cl1)及び(cl2)）のいずれのiPS細胞からでも、MSCへ分化誘導できたことが確認された。
実施例４　FOP-iMSCの軟骨細胞分化能についての解析
　FOP-iMSC及びresFOP-iMSCを2Dマイクロマス培養系により軟骨細胞へ分化させて、解析を行った。2Dマイクロマス培養系は、Umedaらの記載に従って次のとおり行われた（Umeda, K. et al. Scientific Reports 2 (2012)）。誘導したMSC (1.5 x105 cells) を5 μlの軟骨培地（40 ng/ml PDGF-BB (R&D)及び1% FBS (Nichirei)を添加した無血清軟骨形成培地（DMEM: F12 (1:1) (Invitrogen), 1% (v/v) ITS+ mix (BD), 0.17 mM AA2P, 0.35 mM Proline (Sigma), 0.1 μM dexamethasone (Sigma), 0.15% (v/v) glucose (Sigma), 1 mM Na-pyruvate (Invitrogen), 2 mM GlutaMax, 0.05 mM MTG））に懸濁させ、fibronectin-coated 24-well plate (BD)上にスポットした。1時間後に軟骨培地を加えて1 mlとした。3日目から10日目に、10 ng/ml TGFβ3 (R&D system)を培地に加えて培養を行った。マイクロマス培養は、5% CO2、37℃で10日間行った。軟骨誘導は、Alcian Blue染色、グリコサミノグリカン（GAG）量、DNA量によって評価した。Alcian Blue染色は、簡潔には、誘導した細胞を10% formalin (Sigma)で30分間固定し、PBSで洗浄した後、Alcian Blue溶液 (3% 氷酢酸及び1% HCl, pH 1の1% Alcian Blue (MUTO PURE CHEMICAL CO., LTD) )で一晩染色し、酢酸溶液で脱染した。GAG量の測定は、BLYSCAN Dye及びDissociation reagents (BIOCOLOR, Belfast, UK)を用いて、ペレット中のGAG量を定量化することにより行った。一方で、DNA量の測定は、PicoGreen dsDNA Quantitation kit (Invitrogen)を用いて行った。
　その結果、10日間分化誘導されたマイクロマスのサイズは、resFOP-iMSCよりもFOP-iMSCにおいて増加していた（図３a及びb）。また、GAG値は、resFOP-iMSCよりもFOP-iMSCにおいて高かったが（図３c）、DNA量は、両者において有意な差が見られなかった（図３d）。以上より、FOP-iMSCを軟骨細胞へ誘導すると、細胞外マトリックスを過剰に産生することが示された。
　続いて、10日間軟骨細胞へ分化誘導させたFOP-iMSC及びresFOP-iMSCの各軟骨細胞分化マーカーの発現をRT-PCRにより解析した。その結果、いずれの軟骨細胞分化マーカー（SOX9、COL2A1及びACAN）も、resFOP-iMSC由来の軟骨細胞と比較して、FOP-iMSC由来の軟骨細胞においてより高発現していることが観察された（図３e）。
　上記の結果をまとめると、ACVR1の変異は、細胞増殖ではなく、軟骨細胞への分化促進や軟骨細胞成熟化の促進に寄与することが示唆された。
実施例５　FOP-iPSCの遺伝子発現プロファイルについての解析
　実施例４において、FOP-iMSCとresFOP-iMSCとの間で軟骨細胞への異なる分化能が示されたことから、軟骨細胞への分化誘導工程の各段階における遺伝子発現プロファイルを比較するためにマイクロアレイ解析を行った。マイクロアレイ解析は、次のとおり行った。RNeasy Mini Kit (Qiagen)を用いて、全RNAを調製し、次いで、GeneChip WT (Whole Transcript) Sense Target Labeling and Control Reagents kitを用いて、製造者 (Affymetrix)により記載されたとおり、cDNAを合成した。その後、製造者(Affymetrix)のプロトコールに従って、GeneChip Human Gene 1.0 ST expression arraysへのハイブリダイゼーション、洗浄及びスキャニングを行った。データの解析は、GeneSpring GX 11.5.1 (Agilent Technologies)を用いて、散布図、階層的クラスタリングにより行った。階層的クラスタリングのために、similarity measureやaverage linkage clusteringについてChebyshev correlationを用いた。その結果、FOP-iPSCとresFOP-iPSCとの間における遺伝子発現プロファイルは、類似が階層クラスタリング（図４a）及びPrimary Component Analysis（PCA）（図４b）及び散布図（図４c）より確認された。また、FOP-iNCCとresFOP-iNCCとの間においても遺伝子発現プロファイルは類似していたが（図４a、b及びd）、FOP-iMSCとresFOP-iMSCとの間における遺伝子発現プロファイルは、階層的クラスタリングとPCAでは違いが見られなかったが（図４a及びb）、散布図において、明らかに異なる遺伝子発現状態を示す遺伝子群が存在していた（図４e）。MMP1及びPAI1についてはFOP-iMSCにおいて上昇する遺伝子として図中に示した。また、FOP-iMSCにおいて2倍以上発現が上昇する191個の遺伝子と2倍以上発現が減少する110個の遺伝子を確認し、これらの遺伝子のうち上位20個を図４fに示した。以上より、iPS細胞、NCC及びMSCの段階において、FOP細胞とresFOP細胞ではほぼ同一であることが確認されたが、MSCの段階ではいくつかの遺伝子発現が異なることが見出された。
実施例６　iMSCにおけるSMAD1/5/8、SMAD2/3及びERK1/2経路の基礎的な活性状態の解析
　BMPシグナルは、BMPで活性化されるSMAD1/5/8遺伝子のSMAD binding element (SBE)へ転写因子が結合することによるカノニカル経路とAP-1 binding siteへ転写因子が結合することによるノンカノニカル経路によって伝達される。そこで、FOP-iMSCにおいて遺伝子の発現が、BMPシグナル伝達によって引き起こされるかを確認するため、発現上昇する遺伝子の調節領域にSBE及びAP-1 binding siteがあるか調べたところ、ほとんどの遺伝子において、１つ又はそれ以上のSBE及びAP-1 binding siteがあることが確認された。一方、一部の遺伝子にはTGFβで活性化されるSMAD2/3のSBEが含まれることも確認された。さらに、SMAD1/5/8、ERK1/2、p38、JNK及びSMAD2/3のリン酸化状態をウエスタンブロッティングにより調べた。ウエスタンブロッティングは、標準的な手順により、FOP-iMSC及びresFOP-iMSCのそれぞれの全セルライセートを用いて、SDS-PAGE後ブロッティングを行った。AmerchamTMECLTMPrime Western Blotting Detection Reagent (GE Healthcare, Tokyo, Japan) を用いてタンパク質バンドを検出し、Image LabTM softwareと共にBIO-RAD Molecular Imager（登録商標） Chemi-DocTM XRS+を用いて可視化した。その結果、SMAD1/5/8、SMAD2/3及びERK1/2のリン酸化状態が、resFOP-iMSCよりもFOP-iMSCにおいてより高いことが観察された（図５a及びb）。一方、p38及びJNKでは違いが見られなかった。
　続いて、FOP-iMSCにおいてBMPシグナル及びTGFβシグナルが活性化していることを調べるために、BMP特異的ルシフェラーゼレポーターコンストラクト（BRE-luciferase）を用いたレポーターアッセイ、及びBMPの下流遺伝子であるID1の発現状態の解析を行った。レポーターアッセイは、FOP-iMSC及びresFOP-iMSCをそれぞれ溶解した後、製造者の指示に従って、dual luciferase reporter assay system (Promega)により解析を行った。その結果、ルシフェラーゼ活性及びID1発現のいずれも、resFOP-iMSCよりもFOP-iMSCにおいてより高いことが観察された（図５c及びd）。TGFβシグナルについては、TGFβ特異的ルシフェラーゼレポーターコンストラクト（CAGA-lusiferase）を用いたレポーターアッセイ、及びTGFβの下流遺伝子であるPAI1の発現状態の解析を行った。その結果、ルシフェラーゼ活性及びPAI1発現のいずれも、resFOP-iMSCよりもFOP-iMSCにおいてより高いことが観察された（図５e及びf）。一方、AP-1についても同様にルシフェラーゼアッセイを行ったが、両者で特に違いは見られなかった。また、培養上清におけるBMP4、BMP6、BMP7及びTGFβのELISAを行ったが、iPS細胞、NCC及びMSCのいずれの段階においても、FOPとresFOPとの間で違いは見られず、わずかに検知されたのみであった。以上の結果より、変異ACVR1（R206H）により、FOP-iMSCでは、BMP-SMAD1/5/8及びTGFβ-SMAD2/3経路を恒常的に活性化していることが示唆された。
実施例７　iMSCにおけるPAI1発現の制御経路についての解析
　実施例６において、SMAD1/5/8、SMAD2/3及びERK1/2経路の活性化がFOP-iMSCで観察されたため、これらの経路がPAI1の発現を制御しているかを調べた。実施例３と同様の方法によりiMSCへ分化させた細胞（FOP-iMSC及びresFOP-iMSC）をDMH1 (SMAD1/5/8 inhibitor, 2 μM)、SB431542 (SMAD2/3 inhibitor, 10 μM)及びU0126 (MEK1/2 inhibitor, 1 μM)で処理し、24時間後にPAI1の発現をRT-PCRにより解析した。その結果、PAI1の発現は、DMH1又はSB431542で処理した場合に減少していた（図６a）。続いて、BMP4 (10 ng/ml)、BMP7 (100 ng/ml)及びTGFβ3 (10 ng/ml)で処理し、24時間後にPAI1の発現状態をRT-PCRにより解析したところ、PAI1の発現は、BMP4、BMP7又はTGFβ3で処理するとFOP-iMSC及びresFOP-iMSCのいずれでも増加していた（図６b）。これらの結果より、iMSCにおいて、PAI1の発現がBMP-SMAD1/5/8及びTGFβ-SMAD2/3の経路により正に制御されていることが示唆され、さらに、SMAD1/5/8及びSMAD2/3の経路がresFOP-iMSCよりもFOP-iMSCにおいて亢進している結果を支持している。
実施例８　軟骨細胞分化におけるPAI1、MMP1、SMAD1/5/8及びSMAD2/3の機能についての解析
　PAI1及びMMP1の発現がFOP-iMSCにおいてresFOP-iMSCよりも高かったことから（図４e）、 PAI1及びMMP1が、軟骨細胞分化において重要な役割を果たしているかを調べるため、NCCからMSCへの誘導の間（phase I）、MSCから軟骨細胞への誘導の間（phase II）及びNCCから軟骨細胞への誘導の間（phase I + II）の各段階において（図７a、８a及び９a）、PAI1、MMP1、SMAD1/5/8及びSMAD2/3のそれぞれの阻害剤（10 μM Tiplaxtinin（PAI1 inhibitor）（Axon Medchem）、10 nM GM6001（MMP1 inhibitor）（Calbiochem）、2 μM DMH1（SMAD1/5/8 inhibitor）及び10 μM SB431542（SMAD2/3 inhibitor））を添加した場合における、軟骨細胞の大きさ及びGAG値について調べた。NCCへの分化誘導は、実施例３、MSC及び軟骨細胞への分化誘導は、実施例３及び４と同様の方法により行った。その結果、DMH1及びSB431542をphase I、phase II又はphase I + IIの段階で添加した場合全てにおいて、Alcian Blue陽性領域の大きさ及びGAG値が陰性対照と比較して減少した（図８b、図８c、図９b及び図９c）。このことは、MSC誘導工程及び軟骨誘導工程において、SMAD1/5/8及びSMAD2/3シグナルの両方が軟骨誘導に関与していることを示唆している。一方、GM6001及びTiplaxtininでは、phase I及びphase I + IIの段階で添加した場合において、FOP-MSCにおける軟骨誘導を減少させた（図７bからg）。これらの結果より、MMP1及びPAI1は、FOP細胞がNCCからMSCに誘導される間において軟骨誘導能を亢進させることが示唆された。
　FOP患者における異所性骨化は、まず軟骨が形成され、その後骨に置き換わる、軟骨内骨化により引き起こされることから、軟骨形成を抑制する効果のある薬剤は、異所性骨化の治療に有用であると考えられる。さらに、FOPの異所性骨化においてMSCの誘導過程において軟骨形成能が決定されると考えられることから、PAI1阻害剤やMMP1阻害剤はMSCの誘導時に働きMSCの軟骨易分化性を抑制し、FOPの異所性骨化の治療に有効であると考えられる。
　本発明を好ましい態様を強調して説明してきたが、好ましい態様が変更され得ることは当業者にとって自明であろう。本発明は、本発明が本明細書に詳細に記載された以外の方法で実施され得ることを意図する。したがって、本発明は添付の「請求の範囲」の精神および範囲に包含されるすべての変更を含むものである。
　ここで述べられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
　本出願は、2014年12月24日付で日本国に出願された特願2014-261086を基礎としており、ここで言及することによりその内容は全て本明細書に包含される。
　本発明は、異所性骨化の予防・治療薬の新たなスクリーニング方法を提供するものである。適当な分化誘導系を用いることで、より有効なスクリーニングを実施することが可能となる。また、当該スクリーニング系により新たに見出されたPAI1阻害剤やMMP1阻害剤等は、異所性骨化、とりわけ、FOPの予防・治療に極めて有用である。

Claims (20)

  1. 　プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター１（PAI1）阻害剤及び／又はマトリックスメタロプロテアーゼ１（MMP1）阻害剤を含む、異所性骨化の予防及び／又は治療剤。
  2. 　前記PAI1阻害剤が、チプラクスチニン（tiplaxtinin）である、請求項１に記載の剤。
  3. 　前記MMP1阻害剤が、ガラルジン（GM6001）である、請求項１又は２に記載の剤。
  4. 　前記異所性骨化が、進行性骨化性線維異形成症（FOP）における異所性骨化である、請求項１から３のいずれか１項に記載の剤。
  5. 　異所性骨化の予防及び／又は治療活性を有する物質をスクリーニングする方法であって、下記：
    (a)被験物質の存在下及び非存在下でACVR1に変異を有する神経堤細胞を間葉系間質細胞へ分化させる工程、
    (b) 工程(a)で得られた間葉系間質細胞を軟骨細胞へ分化させる工程、
    (c) 工程(b)で得られた培養物中における軟骨組織量を測定する工程、及び
    (d) 工程(a)を被験物質の非存在下で行った場合と比較して、被験物質の存在下で行った場合において軟骨組織量が減少した場合に、当該被験物質を異所性骨化の予防及び／又は治療活性を有する物質として選定する工程、
    を含む、方法。
  6. 　前記工程(b)が、被験物質の存在下及び非存在下で行われる、請求項５に記載の方法。
  7. 　前記工程(a)が、塩基性線維芽細胞増殖因子（FGF2）を含む培養液中で神経堤細胞を培養することにより行われる、請求項５又は６に記載の方法。
  8. 　前記工程(b)が、血小板由来増殖因子Ｂ鎖ホモダイマー（PDGF-BB）を含有する培養液中で間葉系間質細胞を培養することにより行われる、請求項５から７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 　前記軟骨組織量の測定が、細胞外マトリックスの量を測定することにより行われる、請求項５から８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 　前記細胞外マトリックスが、グリコサミノグリカン（GAG）である、請求項９に記載の方法。
  11. 　前記軟骨組織量の測定が、軟骨細胞マーカー遺伝子の発現量を測定することにより行われる、請求項５から８のいずれか１項に記載の方法。
  12. 　前記軟骨細胞マーカー遺伝子が、SOX9、ACAN及びCOL2A1からなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子である、請求項１１に記載の方法。
  13. 　前記軟骨組織量の測定が、アルシアンブルー（Alcian Blue）染色により行われる、請求項５から８のいずれか１項に記載の方法。
  14. 　前記ACVR1の遺伝的変異が、R206Hである、請求項５から１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 　前記神経堤細胞が、ACVR1に変異を有する神経堤細胞を拡大培養して得られた細胞である、請求項５から１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 　前記神経堤細胞の拡大培養が、トランスフォーミング増殖因子β（TGFβ）阻害剤、上皮細胞増殖因子（EGF）及びFGF2を含有する培養液中で該神経堤細胞を培養することにより行われる、請求項１５に記載の方法。
  17. 　前記TGFβ阻害剤が、SB431542である請求項１６に記載の方法。
  18. 　前記神経堤細胞が、ACVR1に変異を有する多能性幹細胞から分化誘導された細胞である、請求項５から１７のいずれか１項に記載の方法。
  19. 　前記神経堤細胞の分化誘導が、TGFβ阻害剤及びグリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（GSK3β）阻害剤を含有する培養液中で前記多能性幹細胞を培養することにより行われる、請求項１８に記載の方法。
  20. 　前記TGFβ阻害剤が、SB431542であり、前記GSK3β阻害剤が、CHIR99021である、請求項１９に記載の方法。
     
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