JP7001674B2 - 細胞培養の組成または純度を定量し軟骨細胞または滑膜細胞の同一性を生体外で定量するためのマーカーと方法 - Google Patents

細胞培養の組成または純度を定量し軟骨細胞または滑膜細胞の同一性を生体外で定量するためのマーカーと方法 Download PDF

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Description

本発明は、細胞培養の組成または純度を定量し軟骨細胞または滑膜細胞の同一性を生体外で定量するためのマーカー、細胞培養の組成または純度を定量するための方法、軟骨細胞または滑膜細胞の同一性を定量するための生体外の方法、新規療法のための医薬を製造するための細胞培養の使用法ならびに上記の方法を実行するためのキットの使用法に関する。
細胞に基づいた医薬品の品質、より具体的には細胞に基づいた組織工学製品の品質に関する必要条件がますます厳格さを増加してきている。このことは、特に細胞に基づいた医薬品を製造するために使用される細胞の純度と同一性に関係して適用される。これは特に軟骨細胞に対して大きな問題である。そのような培養は、自家移植軟骨細胞を使って頻繁に調製されまたマトリックスに会合した自家移植軟骨細胞の移植における特定の培養期間の後で使用される。
特別な問題は、例えば、骨芽細胞、滑膜細胞および間葉系幹細胞のような間葉系由来の様々な細胞型には大きな差がなく、したがって従来のマーカーを用いて識別することは事実上不可能である。
一般に、内皮細胞、骨芽細胞および滑膜細胞は、夾雑細胞型として軟骨細胞培養において有意であると考えることができる。しかし、滑膜細胞は、内皮細胞および骨芽細胞とは対照的に、それらは通常の培養条件下において軟骨細胞と同様の挙動をすることが多いという点で特に重要である。
細胞および細胞培養を定量するための方法は、欧州特許第２１３２５６２Ｂ９号から公知である。
しかしながら、細胞培養における純度制御を実行して細胞を同定するための代替または改善された可能性が依然として必要とされているという課題がある。
上記の課題を解決するために、本発明は、細胞培養、より具体的には軟骨細胞および／または滑膜細胞培養の純度制御を可能にするマーカーを提供することを目的とする。
さらに、本発明の目的は、軟骨細胞および／または滑膜細胞の同定を可能にするマーカーを提供することである。
さらに、本発明の目的は、軟骨細胞および滑膜細胞の識別を可能にするマーカーを提供することである。
本発明の別の目的は、対応する生体外方法の提供、上記生体外方法を実行するためのキットの使用法および新医療法用の医薬品を製造するための細胞培養の使用法を提供することである。
これらの目的は、本発明に従って独立請求項１に記載のマーカーの使用法により、請求項１３に記載の方法により、請求項１４に記載の細胞培養の使用法により、請求項１５に記載のキットの使用法によりそして本明細書において開示された本出願および方法により達成される。好ましい実施形態は従属請求項において画定される。全ての請求項の文言は、本明細書の上記内容に明示的な参照を利用して組み込まれる。
第１の態様に従い、本発明は細胞培養の組成または純度の評価、具体的には細胞培養の組成または純度を定量するためのマーカーの使用法に関する。
そのマーカーは、ＡＣＥ、ＭＭＰ１、ＰＯＳＴＮ、ＳＹＮＰＯ、ＳＵＬＦ１、ＡＲＨＧＥＦ２８、ＩＧＦ２ＢＰ１、ＢＡＩＡＰ２Ｌ１、ＬＩＭＣＨ１、ＳＣＩＮ、ＤＣＬＫ１、ＰＰＬ、ＣＲＡＢＰ２、ＮＥＳ、ＸＰＮＰＥＰ２およびＳＬＩＴ３からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーであることを、特に、特徴とし、当該少なくとも１つのマーカーの発現レベルが定量される。
本発明の意味において用語の「少なくとも１つのマーカー」とは、上記のマーカーの１つあるいは２つ以上のマーカーの組み合わせを示し、即ち上記のマーカー２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６の組み合わせまたは上記の全マーカーの組み合わせを示す。特に、本発明の意味において用語の「少なくとも１つのマーカー」とは、上記の２つのマーカーの比を示す。
さらに、本発明の意味において用語の「マーカー」とは、一般に遺伝産物、即ち、発現の結果、例えばより具体的にはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）または上記のマーカーの１つまたは複数のタンパク質などを示すことができる。
本発明の意味において理解される用語の「発現レベル」とは、ＲＮＡ塩基における発現レベル、より具体的にはメッセンジャーＲＮＡ塩基（ｍＲＮＡ塩基）、および／またはタンパク質塩基における発現レベルを示す。
本発明において用語の「発現レベル」と関連して使用される用語の「定量する」とは、本発明の意味において任意の生化学的および／または生物工学的方法であって、それを用いて上記少なくとも１つのマーカーの発現レベル、より具体的にはＲＮＡまたはタンパク質塩基を定量し、より具体的には定量的に測定することを示す。
その後の生命情報科学的評価を用いた質量分析試験に基づいたプロテオーム解析において、本発明者らは、細胞培養の純度制御を可能にするために適合する軟骨細胞マーカーおよび滑膜細胞マーカー、より具体的には軟骨細胞および／または滑膜細胞培養の同定、および／または軟骨細胞、即ち軟骨細胞および／または滑膜細胞、即ち滑膜細胞または滑膜繊維芽細胞の同一性の同定に成功している。本発明に関連して同定されたマーカーは、より具体的には軟骨細胞培養における滑膜細胞の混入の同定および／または滑膜細胞培養における軟骨細胞の存在の同定および／または軟骨細胞と滑膜細胞との識別を可能にする。
したがって本発明により提案されたマーカーは、軟骨細胞または軟骨細胞マーカー、即ち軟骨細胞に対する純度または特性マーカーとして、および／または滑膜細胞または滑膜細胞マーカーとして、即ち滑膜細胞に対する純度または特性マーカーおよび／または同一性マーカーとしても示される。
好ましい実施携帯では、少なくとも１つのマーカーの発現レベルが、細胞培養から取得した細胞試料について定量される。
本発明の意味における用語の「細胞試料」とは、細胞を含有する試料または細胞培養から採取された細胞を含む試料を示すものと理解される。
別の実施形態において、上記少なくとも１つのマーカーは、ＭＭＰ１、ＰＯＳＴＮ、ＳＹＮＰＯ、ＳＵＬＦ１、ＡＲＨＧＥＦ２８、ＩＧＦ２ＢＰ１、ＢＡＩＡＰ２Ｌ１、ＬＩＭＣＨ１、ＳＣＩＮおよび少なくとも２つの上記のマーカーの組み合わせからなる群から選択される。
別の実施形態において、少なくとも１つのマーカーは、ＡＣＥ、ＤＣＬＫ１、ＰＰＬ、ＣＲＡＢＰ２、ＮＥＳ、ＸＰＮＰＥＰ２、ＳＬＩＴ３および少なくとも２つの上記のマーカーの組み合わせからなる群から選択される。
さらに別の実施形態において、上記少なくとも１つのマーカーは、ＭＭＰ１、ＡＣＥ、ＰＯＳＴＮ、ＳＹＮＰＯ、ＳＵＬＦ１、ＡＲＨＧＥＦ２８、ＩＧＦ２ＢＰ１、ＢＡＩＡＰ２Ｌ１、ＬＩＭＣＨ１、ＳＣＩＮ、ＤＣＬＫ１、ＰＰＬ、ＣＲＡＢＰ２、ＮＥＳ、ＸＰＮＰＥＰ２、ＳＬＩＴ３のタンパク質、または少なくとも２つの上記のマーカーのタンパク質の組み合わせである。
特に、上記少なくとも１つのマーカーは、ＭＭＰ１、ＰＯＳＴＮ、ＳＹＮＰＯ、ＳＵＬＦ１、ＡＲＨＧＥＦ２８、ＩＧＦ２ＢＰ１、ＢＡＩＡＰ２Ｌ１、ＬＩＭＣＨ１、ＳＣＩＮのタンパク質、または少なくとも２つの上記のマーカーのタンパク質の組み合わせでもよい。あるいは、上記少なくとも１つのマーカーは、ＡＣＥ、ＤＣＬＫ１、ＰＰＬ、ＣＲＡＢＰ２、ＮＥＳ、ＸＰＮＰＥＰ２、ＳＬＩＴ３のタンパク質、または少なくとも２つの上記のマーカーのタンパク質の組み合わせでもよい。
別の実施形態において、上記少なくとも１つのマーカーはＲＮＡ、より具体的には、ＭＭＰ１、ＡＣＥ、ＰＯＳＴＮ、ＳＹＮＰＯ、ＳＵＬＦ１、ＡＲＨＧＥＦ２８、ＩＧＦ２ＢＰ１、ＢＡＩＡＰ２Ｌ１、ＬＩＭＣＨ１、ＳＣＩＮ、ＤＣＬＫ１、ＰＰＬ、ＣＲＡＢＰ２、ＮＥＳ、ＸＰＮＰＥＰ２、ＳＬＩＴ３のｍＲＮＡまたはＲＮＡの組み合わせ、より具体的には少なくとも２つの上記のマーカーのｍＲＮＡの組み合わせである。
特に、少なくとも１つのマーカーは、ＲＮＡ、より具体的には、ＭＭＰ１、ＰＯＳＴＮ、ＳＹＮＰＯ、ＳＵＬＦ１、ＡＲＨＧＥＦ２８、ＩＧＦ２ＢＰ１、ＢＡＩＡＰ２Ｌ１、ＬＩＭＣＨ１、ＳＣＩＮのｍＲＮＡまたはＲＮＡの組み合わせ、より具体的には少なくとも２つの上記マーカーのｍＲＮＡの組み合わせでもよい。あるいは、上記少なくとも１つのマーカーは、ＲＮＡ、より具体的には、ＡＣＥ、ＤＣＬＫ１、ＰＰＬ、ＣＲＡＢＰ２、ＮＥＳ、ＸＰＮＰＥＰ２、ＳＬＩＴ３のｍＲＮＡまたはＲＮＡの組み合わせ、具体的には少なくとも２つの上記のマーカーのｍＲＮＡの組み合わせでもよい。
別の実施形態において、上記少なくとも１つのマーカーはＰＯＳＴＮである。タンパク質として、ＰＯＳＴＮは、「ペリオスチン」または「骨芽細胞の特異的な因子ＯＳＦ－２」としても示される。ペリオスチンは、上皮細胞の接着および遊走を支持するためにアルファ－Ｖ／ベータ－３およびアルファ－Ｖ／ベータ－５インテグリン用のリガンドである。
特に、上記少なくとも１つのマーカーは、ＰＯＳＴＮと、ＳＹＮＰＯ、ＭＭＰ１、ＳＵＬＦ１、ＡＲＨＧＥＦ２８、ＩＧＦ２ＢＰ１、ＢＡＩＡＰ２Ｌ１、ＬＩＭＣＨ１、ＳＣＩＮ、ＤＣＬＫ１、ＰＰＬ、ＣＲＡＢＰ２、ＮＥＳ、ＸＰＮＰＥＰ２、ＳＬＩＴ３およびＡＣＥとからなる群から選択される少なくとも１つの別のマーカーとの組み合わせでもよい。
好ましくは、上記少なくとも１つのマーカーは、ＰＯＳＴＮと、ＳＹＮＰＯ、ＭＭＰ１、ＳＵＬＦ１、ＡＲＨＧＥＦ２８、ＩＧＦ２ＢＰ１、ＢＡＩＡＰ２Ｌ１、ＬＩＭＣＨ１およびＳＣＩＮからなる群から選択される少なくとも１つの他のマーカーとの組み合わせである。
別の実施形態において、上記少なくとも１つのマーカーはＳＹＮＰＯである。タンパク質として、ＳＹＮＰＯは、「上皮細胞」としても示される。上皮細胞は、約７３ｋＤａの分子量を有する細胞質のアクチン関連タンパク質である。上皮細胞は、腎臓の有足細胞内および大脳内の両方で産出する。
特に、上記少なくとも１つのマーカーは、ＳＹＮＰＯと、ＰＯＳＴＮ、ＭＭＰ１、ＳＵＬＦ１、ＡＲＨＧＥＦ２８、ＩＧＦ２ＢＰ１、ＢＡＩＡＰ２Ｌ１、ＬＩＭＣＨ１、ＳＣＩＮ、ＤＣＬＫ１、ＰＰＬ、ＣＲＡＢＰ２、ＮＥＳ、ＸＰＮＰＥＲ２、ＳＬＩＴ３およびＡＣＥからなる群から選択される少なくとも１つの別のマーカーとの組み合わせでもよい。
好ましくは、少なくとも１つのマーカーは、ＳＹＮＰＯと、ＰＯＳＴＮ、ＭＭＰ１、ＳＵＬＦ１、ＡＲＨＧＥＦ２８、ＩＧＦ２ＢＰ１、ＢＡＩＡＰ２Ｌ１、ＬＩＭＣＨ１、およびＳＣＩＮからなる群から選択される少なくとも１つの別のマーカーとの組み合わせである。
さらに別の実施形態において、上記少なくとも１つのマーカーはＭＭＰ１である。タンパク質として、ＭＭＰ１は、「マトリックスメタロプロテアーゼ－１」、「間質コラゲナーゼ」または「繊維芽細胞コラゲナーゼ」としても示される。
特に、上記少なくとも１つのマーカーは、ＭＭＰ１と、ＡＣＥ、ＰＯＳＴＮ、ＳＹＮＰＯ、ＳＵＬＦ１、ＡＲＨＧＥＦ２８、ＩＧＦ２ＢＰ１、ＢＡＩＡＰ２Ｌ１、ＬＩＭＣＨ１、ＳＣＩＮ、ＤＣＬＫ１、ＰＰＬ、ＣＲＡＢＰ２、ＮＥＳ、ＸＰＮＰＥＰ２およびＳＬＩＴ３からなる群から選択される少なくとも１つの別のマーカーとの組み合わせでもよい。特に好ましくは、上記少なくとも１つのマーカーは、ＭＭＰ１とＡＣＥの組み合わせである。
さらに、上記少なくとも１つのマーカーは、より具体的にはＭＭＰ１と、ＰＯＳＴＮ、ＳＹＮＰＯ、ＳＵＬＦ１、ＡＲＨＧＥＦ２８、ＩＧＦ２ＢＰ１、ＢＡＩＡＰ２Ｌ１、ＬＩＭＣＨ１およびＳＣＩＮからなる群から選択される少なくとも１つの別のマーカーとの組み合わせでもよい。
さらに別の実施形態において、上記少なくとも１つのマーカーはＳＵＬＦ１である。タンパク質として、ＳＵＬＦ１は「硫酸塩１」としても示される。硫酸塩１はヘパリン硫酸から６－Ｏ硫酸塩基を選択的に除去する酵素である。
特に、上記少なくとも１つのマーカーは、ＳＵＬＦ１と、ＰＯＳＴＮ、ＳＹＮＰＯ、ＭＭＰ１、ＡＲＨＧＥＦ２８、ＩＧＦ２ＢＰ１、ＢＡＩＡＰ２Ｌ１、ＬＩＭＣＨ１、ＳＣＩＮ、ＤＣＬＫ１、ＰＰＬ、ＣＲＡＢＰ２、ＮＥＳ、ＸＰＮＰＥＰ２、ＳＬＩＴ３およびＡＣＥからなる群から選択される少なくとも１つの別のマーカーとの組み合わせでもよい。
好ましくは、上記少なくとも１つのマーカーは、ＳＵＬＦ１と、ＰＯＳＴＮ、ＳＹＮＰＯ、ＭＭＰ１、ＡＲＨＧＥＦ２８、ＩＧＦ２ＢＰ１、ＢＡＩＡＰ２Ｌ１、ＬＩＭＣＨ１およびＳＣＩＮとからなる群から選択される少なくとも１つの他のマーカーとの組み合わせである。
別の実施形態において、上記少なくとも１つのマーカーはＡＲＨＧＥＦ２８である。タンパク質として、ＡＲＨＧＥＦ２８は「ｒｈｏグアニンヌクレオチド交換因子２８」として示される。
特に、上記少なくとも１つのマーカーは、ＡＲＨＧＥＦ２８と、ＰＯＳＴＮ、ＳＹＮＰＯ、ＭＭＰ１、ＳＵＬＦ１、ＩＧＦ２ＢＰ１、ＢＡＩＡＰ２Ｌ１、ＬＩＭＣＨ１、ＳＣＩＮ、ＤＣＬＫ１、ＰＰＬ、ＣＲＡＢＰ２、ＮＥＳ、ＸＰＮＰＥＰ２、ＳＬＩＴ３およびＡＣＥからなる群から選択される少なくとも１つの別のマーカーとの組み合わせでもよい。
好ましくは、上記少なくとも１つのマーカーは、ＡＲＨＧＥＦ２８と、ＰＯＳＴＮ、ＳＹＮＰＯ、ＭＭＰ１、ＳＵＬＦ１、ＩＧＦ２ＢＰ１、ＢＡＩＡＰ２Ｌ１、ＬＩＭＣＨ１およびＳＣＩＮからなる群から選択される少なくとも１つの別のマーカーとの組み合わせである。
他の実施形態において、上記少なくとも１つのマーカーはＩＧＦ２ＢＰ１である。タンパク質として、ＩＧＦ２ＢＰ１はまたインシュリン様成長因子２のｍＲＮＡ結合タンパク質１」とも示される。
特に、上記少なくとも１つのマーカーは、ＩＧＦ２ＢＰ１と、ＰＯＳＴＮ、ＳＹＮＰＯ、ＭＭＰ１、ＳＵＬＦ１、ＡＲＨＧＥＦ２８、ＢＡＩＡＰ２Ｌ１、ＬＩＭＣＨ１、ＳＣＩＮ、ＤＣＬＫ１、ＰＰＬ、ＣＲＡＢＰ２、ＮＥＳ、ＸＰＮＰＥＰ２、ＳＬＩＴ３およびＡＣＥからなる群から選択される少なくとも１つの別のマーカーとの組み合わせでもよい。
好ましくは、上記少なくとも１つのマーカーは、ＩＧＦ２ＢＰ１と、ＰＯＳＴＮ、ＳＹＮＰＯ、ＭＭＰ１、ＳＵＬＦ１、ＡＲＨＧＥＦ２８、ＢＡＩＡＰ２Ｌ１、ＬＩＭＣＨ１およびＳＣＩＮからなる群から選択される少なくとも１つの別のマーカーとの組み合わせである。
他の実施形態において、上記少なくとも１つのマーカーはＢＡＩＡＰＬ１である。タンパク質として、ＢＡＩＡＰＬ１は「脳特異的血管新生阻害剤１関連タンパク質２様タンパク質１（ＢＡＩ１関連タンパク質２様タンパク質１）」としても示される。
具体的には、上記少なくとも１つのマーカーは、ＢＡＩＡＰ２Ｌ１と、ＰＯＳＴＮ、ＳＹＮＰＯ、ＭＭＰ１、ＳＵＬＦ１、ＡＲＨＧＥＦ２８、ＩＧＦ２ＢＰ１、ＬＩＭＣＨ１、ＳＣＩＮ、ＤＣＬＫ１、ＰＰＬ、ＣＲＡＢＰ２、ＮＥＳ、ＸＰＮＰＥＰ２、ＳＬＩＴ３およびＡＣＥからなる群から選択される少なくとも１つの別のマーカーとの組み合わせでもよい。
好ましくは、上記少なくとも１つのマーカーは、ＢＡＩＡＰ２Ｌ１と、ＰＯＳＴＮ、ＳＹＮＰＯ、ＭＭＰ１、ＳＵＬＦ１、ＡＲＨＧＥＦ２８、ＩＧＦ２ＢＰ１、ＬＩＭＣＨ１およびＳＣＩＮからなる群から選択される少なくとも１つの別のマーカーとの組み合わせである。
他の実施形態において、上記少なくとも１つのマーカーはＬＩＭＣＨ１である。タンパク質として、ＬＩＭＣＨ１は「ＬＩＭおよびカルポニン相同ドメイン１」としても示される。
特に、上記少なくとも１つのマーカーは、ＬＩＭＣＨ１と、ＰＯＳＴＮ、ＳＹＮＰＯ、ＭＭＰ１、ＳＵＬＦ１、ＡＲＨＧＥＦ２８、ＩＧＦ２ＢＰ１、ＢＡＩＡＰ２Ｌ１、ＳＣＩＮ、ＤＣＬＫ１、ＰＰＬ、ＣＲＡＢＰ２、ＮＥＳ、ＸＰＮＰＥＰ２、ＳＬＩＴ３およびＡＣＥからなる群から選択される少なくとも１つの別のマーカーとの組み合わせででもよい。
好ましくは、上記少なくとも１つのマーカーは、ＬＩＭＣＨ１と、ＰＯＳＴＮ、ＳＹＮＰＯ、ＭＭＰ１、ＳＵＬＦ１、ＡＲＨＧＥＦ２８、ＩＧＦ２ＢＰ１、ＢＡＩＡＰ２Ｌ１およびＳＣＩＮからなる群から選択される少なくとも１つの別のマーカーとの組み合わせである。
別の実施形態において、上記少なくとも１つのマーカーはＳＣＩＮである。タンパク質として、ＳＣＩＮは「シンデリン」または「アドセベリン」としても示される。
特に、上記少なくとも１つのマーカーは、ＳＣＩＮと、ＰＯＳＴＮ、ＳＹＮＰＯ、ＭＭＰ１、ＳＵＬＦ１、ＡＲＨＧＥＦ２８、ＩＧＦ２ＢＰ１、ＢＡＩＡＰ２Ｌ１、ＬＩＭＣＨ１、ＤＣＬＫ１、ＰＰＬ、ＣＲＡＢＰ２、ＮＥＳ、ＸＰＮＰＥＰ２、ＳＬＩＴ３およびＡＣＥからなる群から選択される少なくとも１つの別のマーカーとの組み合わせでもよい。
好ましくは、上記少なくとも１つのマーカーは、ＳＣＩＮと、ＰＯＳＴＮ、ＳＹＮＰＯ、ＭＭＰ１、ＳＵＬＦ１、ＡＲＨＧＥＦ２８、ＩＧＦ２ＢＰ１、ＢＡＩＡＰ２Ｌ１およびＬＩＭＣＨ１からなる群から選択される少なくとも１つの別のマーカーとの組み合わせである。
別の実施形態において、上記少なくとも１つのマーカーはＤＣＬＫ１である。タンパク質として、ＤＣＬＫ１は「ダブルコルチン様キナーゼ１」としても示される。
特に、上記少なくとも１つのマーカーは、ＤＣＬＫ１と、ＰＯＳＴＮ、ＳＹＮＰＯ、ＭＭＰ１、ＳＵＬＦ１、ＡＲＨＧＥＦ２８、ＩＧＦ２ＢＰ１、ＢＡＩＡＰ２Ｌ１、ＬＩＭＣＨ１、ＳＣＩＮ、ＰＰＬ、ＣＲＡＢＰ２、ＮＥＳ、ＸＰＮＰＥＰ２、ＳＬＩＴ３およびＡＣＥからなる群から選択される少なくとも１つの別のマーカーとの組み合わせでもよい。
好ましくは、上記少なくとも１つのマーカーは、ＤＣＬＫ１と、ＰＰＬ、ＣＲＡＢＰ２、ＮＥＳ、ＸＰＮＰＥＰ２、ＳＬＩＴ３およびＡＣＥからなる群から選択される少なくとも１つの別のマーカーとの組み合わせである。
別の実施形態において、少なくとも１つのマーカーはＰＰＬである。タンパク質として、ＰＰＬは「ペリプラキン」としても示される。
特に、上記少なくとも１つのマーカーは、ＰＰＬと、ＰＯＳＴＮ、ＳＹＮＰＯ、ＭＭＰ１、ＳＵＬＦ１、ＡＲＨＧＥＦ２８、ＩＧＦ２ＢＰ１、ＢＡＩＡＰ２Ｌ１、ＬＩＭＣＨ１、ＳＣＩＮ、ＤＣＬＫ１、ＣＲＡＢＰ２、ＮＥＳ、ＸＰＮＰＥＰ２、ＳＬＩＴ３およびＡＣＥからなる群から選択される少なくとも１つの別のマーカーとの組み合わせでもよい。
好ましくは、上記少なくとも１つのマーカーは、ＰＰＬと、ＤＣＬＫ１、ＣＲＡＢＰ２、ＮＥＳ、ＸＰＮＰＥＰ２、ＳＬＩＴ３およびＡＣＥからなる群から選択される少なくとも１つの別のマーカーとの組み合わせである。
別の実施形態において、上記少なくとも１つのマーカーはＣＲＡＢＰ２である。タンパク質として、ＣＲＡＢＰ２は「細胞レチノイン酸結合タンパク質２」としても示される。
特に、上記少なくとも１つのマーカーは、ＣＲＡＢＰ２と、ＰＯＳＴＮ、ＳＹＮＰＯ、ＭＭＰ１、ＳＵＬＦ１、ＡＲＨＧＥＦ２８、ＩＧＦ２ＢＰ１、ＢＡＩＡＰ２Ｌ１、ＬＩＭＣＨ１、ＳＣＩＮ、ＤＣＬＫ１、ＰＰＬ、ＮＥＳ、ＸＰＮＰＥＰ２、ＳＬＩＴ３およびＡＣＥからなる群から選択される少なくとも１つの別のマーカーとの組み合わせでもよい。
好ましくは、上記少なくとも１つのマーカーは、ＣＲＡＢＰ２と、ＤＣＬＫ１、ＰＰＬ、ＮＥＳ、ＸＰＮＰＥＰ２、ＳＬＩＴ３、およびＡＣＥからなる群から選択される少なくとも１つの別のマーカーとの組み合わせである。
別の実施形態において、上記少なくとも１つのマーカーはＮＥＳである。タンパク質として、ＮＥＳは「ネスチン」としても示される。
特に、上記少なくとも１つのマーカーは、ＮＥＳと、ＰＯＳＴＮ、ＳＹＮＰＯ、ＭＭＰ１、ＳＵＬＦ１、ＡＲＨＧＥＦ２８、ＩＧＦ２ＢＰ１、ＢＡＩＡＰ２Ｌ１、ＬＩＭＣＨ１、ＳＣＩＮ、ＤＣＬＫ１、ＰＰＬ、ＣＲＡＢＰ２、ＸＰＮＰＥＰ２、ＳＬＩＴ３、およびＡＣＥからなる群から選択される少なくとも１つの別のマーカーとの組み合わせでもよい。
好ましくは、上記少なくとも１つのマーカーは、ＮＥＳと、ＤＣＬＫ１、ＰＰＬ、ＣＲＡＢＰ２、ＸＰＮＰＥＰ２、ＳＬＩＴ３およびＡＣＥからなる群から選択される少なくとも１つの別のマーカーとの組み合わせである。
別の実施形態において、上記少なくとも１つのマーカーはＸＰＮＰＥＰ２である。タンパク質として、ＸＰＮＰＥＰ２は「Ｘプロリルアミノペプチダーゼ」としても示される。
特に、上記少なくとも１つのマーカーは、ＸＰＮＰＥＰ２と、ＰＯＳＴＮ、ＳＹＮＰＯ、ＭＭＰ１、ＳＵＬＦ１、ＡＲＨＧＥＦ２８、ＩＧＦ２ＢＰ１、ＢＡＩＡＰ２Ｌ１、ＬＩＭＣＨ１、ＳＣＩＮ、ＤＣＬＫ１、ＰＰＬ、ＣＲＡＢＰ２、ＮＥＳ、ＳＬＩＴ３およびＡＣＥからなる群から選択される少なくとも１つの別のマーカーとの組み合わせでもよい。
好ましくは、上記少なくとも１つのマーカーは、ＸＰＮＰＥＰ２と、ＤＣＬＫ１、ＰＰＬ、ＣＲＡＢＰ２、ＮＥＳ、ＳＬＩＴ３、およびＡＣＥからなる群から選択される少なくとも１つの別のマーカーとの組み合わせである。
別の実施形態において、上記少なくとも１つのマーカーはＳＬＩＴ３である。タンパク質として、ＳＬＩＴ３は「軸索ガイダンスリガンド３」としても示される。
特に、上記少なくとも１つのマーカーは、ＳＬＩＴ３と、ＰＯＳＴＮ、ＳＹＮＰＯ、ＭＭＰ１、ＳＵＬＦ１、ＡＲＨＧＥＦ２８、ＩＧＦ２ＢＰ１、ＢＡＩＡＰ２Ｌ１、ＬＩＭＣＨ１、ＳＣＩＮ、ＤＣＬＫ１、ＰＰＬ、ＣＲＡＢＰ２、ＮＥＳ、ＸＰＮＰＥＰ２およびＡＣＥからなる群から選択される少なくとも１つの別のマーカーとの組み合わせでもよい。
好ましくは、上記少なくとも１つのマーカーは、ＳＬＩＴ３と、ＤＣＬＫ１、ＰＰＬ、ＣＲＡＢＰ２、ＮＥＳ、ＸＰＮＰＥＰ２およびＡＣＥからなる群から選択される少なくとも１つの別のマーカーとの組み合わせである。
別の実施形態において、上記少なくとも１つのマーカーはＡＣＥである。タンパク質として、ＡＣＥは「アンジオテンシン変換酵素」としても示される。
特に、上記少なくとも１つのマーカーは、ＡＣＥと、ＭＭＰ１、ＰＯＳＴＮ、ＳＹＮＰＯ、ＳＵＬＦ１、ＡＲＨＧＥＦ２８、ＩＧＦ２ＢＰ１、ＢＡＩＡＰ２Ｌ１、ＬＩＭＣＨ１、ＳＣＩＮ、ＤＣＬＫ１、ＰＰＬ、ＣＲＡＢＰ２、ＮＥＳ、ＸＰＮＰＥＰ２、およびＳＬＩＴ３からなる群から選択される少なくとも１つの別のマーカーとの組み合わせでもよい。特に好ましくは。上記少なくとも１つのマーカーは、ＡＣＥとＭＭＰ１の組み合わせである。
さらに、上記少なくとも１つのマーカーは、より具体的にはＡＣＥと、ＤＣＬＫ１、ＰＰＬ、ＣＲＡＢＰ２、ＮＥＳ、ＸＰＮＰＥＰ２およびＳＬＩＴ３からなる群から選択される少なくとも１つの別のマーカーとの組み合わせでもよい。
別の実施形態において、細胞培養は、軟骨細胞培養（ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｒ ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ ｃｕｌｔｕｒｅ）である。
用語の「軟骨細胞培養」は、本発明の意味において、軟骨組織から、好ましくは軟骨生検試料、より具体的には酵素消化および消化後に得られた上記細胞のその後の培養による、軟骨／骨穿孔生検から生産または生産可能の培養物を示すように理解されるものとする。
用語の「軟骨組織」は、本発明の意味において、好ましくは医学的治療の結果としての健康な軟骨組織、罹患もしくは病理学的に修飾された軟骨組織即ち新規に作成された軟骨細胞、または軟骨組織の再生、具体的には自己由来の軟骨細胞移植（ＡＣＴ）またはマトリックス関連自家移植軟骨細胞移植（ＭＡＣＴ）を示すことができる。
用語の「軟骨生検試料」は、本発明の意味において、健常な軟骨組織、罹患もしくは病理学的に修飾された軟骨組織、または再生した軟骨組織または上記の組織の１つからなる軟骨組織を含む生検試料を示すことができる。
用語の「軟骨／骨穿孔生検試料」は、本発明の意味において、健常な骨および軟骨組織、罹患骨および軟骨組織または病理学的に修飾された骨および軟骨組織または骨および再生された軟骨組織または上記の１つの組織からなる軟骨組織を含む生検試料を示すものと理解するものとする。
別の実施形態において、上記細胞培養は滑膜細胞培養である。用語「滑膜細胞培養物（ｓｙｎｏｖｉａｌ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ）」または「滑膜細胞培養物（ｓｙｎｏｖｉｏｃｙｔｅ ｃｕｌｔｕｒｅ）」は、本発明の意味において酵素消化および消化後に得られたその後の細胞の培養によって滑膜組織から産生されたあるいは産生され得る培養物を示すように理解されるものとする。
別の実施形態において、細胞培養は、軟骨生検試料に由来する細胞を含む。特に、細胞培養は、軟骨／骨穿孔生検試料、より具体的には、それらの軟骨組織断片に由来する細胞を含む。
上記生検試料、より具体的には上記軟骨生検試料または軟骨／骨穿孔生検試料は、関節、より具体的には膝関節由来の生検試料が好ましい。
別の実施形態において、上記細胞培養は滑膜組織生検試料に由来する細胞を含む。
別の実施形態において、少なくとも１つのマーカーは、ＭＭＰ１、ＰＯＳＴＮ、ＳＹＮＰＯ、ＳＵＬＦ１、ＡＲＨＧＥＦ２８、ＩＧＦ２ＢＰ１、ＢＡＩＡＰ２Ｌ１、ＬＩＭＣＨ１、ＳＣＩＮ、および上記のマーカーの中の少なくとも２つの組み合わせからなる群から選択され、画定された閾値を超える上記少なくとも１つのマーカーの発現レベルは上記細胞培養が軟骨細胞を含むことを示唆することを特徴とする。上記閾値は、純粋な滑膜細胞培養中における上記少なくとも１つのマーカーの発現レベル以上であることが好ましい。用語の「純粋な滑膜細胞培養」は、本発明の意味において、滑膜細胞の形の細胞のみを含む滑膜細胞培養を示すものと理解するものとする。したがって、本節において述べた上記マーカーは、本発明の意味において、軟骨細胞マーカーを示してもよい。
別の実施形態において、上記少なくとも１つのマーカーは、ＡＣＥ、ＤＣＬＫ１、ＰＰＬ、ＣＲＡＢＰ２、ＮＥＳ、ＸＰＮＰＥＰ２、ＳＬＩＴ３および上記のマーカーの少なくとも２つの組み合わせからなる群から選択され、画定された閾値を超える発現レベルの上記少なくとも１つのマーカーは細胞培養に滑膜細胞を含むことを示唆することを特徴とする。上記閾値は、純粋な軟骨細胞培養中における上記少なくとも１つのマーカーの発現レベル以上であることが好ましい。用語の「純粋な軟骨細胞培養」は、本発明の意味において軟骨細胞の形態の細胞のみを含む軟骨細胞培養を示すことと理解するものとする。したがって、本節において述べた上記マーカーは、本発明の意味において、滑膜細胞マーカーを示してもよい。
さらに別の実施形態において、上記少なくとも１つのマーカーは、ＭＭＰ１に対するＡＣＥの比（ＡＣＥ／ＭＭＰ１比）またはＡＣＥに対するＭＭＰ１の比（ＭＭＰ１／ＡＣＥ比）である。換言すると、別の実施形態に従う細胞培養の組成または純度を定量するためのマーカーは、ＭＭＰ１に対するＡＣＥの比またはＡＣＥに対するＭＭＰ１の比である。好ましくは、上記細胞培養の組成または純度を定量するためには、上記ＭＭＰ１に対するＡＣＥの比が形成され、即ちＡＣＥ／ＭＭＰ１比が細胞培養の上記組成または純度を定量するためのマーカーとして使用される。好ましくは、画定された閾値を超えるＡＣＥ／ＭＭＰ１比率は、上記細胞培養が滑膜細胞を含有することを示唆する。上記閾値は、純粋な滑膜細胞培養におけるＭＭＰ１に対するＡＣＥの比の値以下であることが好ましい。上記少なくとも１つのマーカーの上記発現レベルは、別の実施形態においてＲＮＡ塩基、好ましくはメッセンジャーＲＮＡ塩基（ｍＲＮＡ塩基）について定量される。
別の実施形態において、上記少なくとも１つのマーカーの発現レベルは、タンパク質塩基について定量される。
別の実施形態において、上記少なくとも１つのマーカーの上記発現レベルは、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応または定量実時間ポリメラーゼ連鎖反応などのポリメラーゼ連鎖反応、電気泳動分析、サザンブロットなどのゲル電気泳動分析、ノーザンブロットまたはウエスタンブロット、タンパク質チップ、抗体、ＥＬＩＳＡなどの免疫測定法、ＬＵＭＩＮＥＸ免疫測定法またはＥＬＩＳＰｏｔ分析、免疫蛍光分析、免疫組織化学分析、放射免疫学的分析、プロテオーム分析、ＨＰＬＣなどのクロマトグラフィーに基づく分析またはゲルクロマトグラフィーなどの質量分析法分析またはフローサイトメトリー分析の手段を用いて定量される。
第２の態様に従い、本発明は軟骨細胞および／または滑膜細胞の同一性を生体外で定量するためのマーカーの用途、より具体的には軟骨細胞と滑膜細胞を判別する（区別する）ためのマーカーの使用法に関する。
上記マーカーは、ＭＭＰ１、ＡＣＥ、ＰＯＳＴＮ、ＳＹＮＰＯ、ＳＵＬＦ１、ＡＲＨＧＥＦ２８、ＩＧＦ２ＢＰ１、ＢＡＩＡＰ２Ｌ１、ＬＩＭＣＨ１、ＳＣＩＮ、ＤＣＬＫ１、ＰＰＬ、ＣＲＡＢＰ２、ＮＥＳ、ＸＰＮＰＥＰ２およびＳＬＩＴ３からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーであって、上記少なくとも１つのマーカーの発現レベルは細胞培養から得られた細胞試料において定量されることを特徴とする。
好ましい実施形態において、上記少なくとも１つのマーカーは、ＭＭＰ１、ＰＯＳＴＮ、ＳＹＮＰＯ、ＳＵＬＦ１、ＡＲＨＧＥＦ２８、ＩＧＦ２ＢＰ１、ＢＡＩＡＰ２Ｌ１、ＬＩＭＣＨ１、ＳＣＩＮおよび上記のマーカーの少なくとも２つの組み合わせからなる群から選択され、画定された閾値レベルを超える上記少なくとも１つのマーカーの発現レベルは、上記細胞が軟骨細胞であることを示唆することを特徴とする。上記閾値は、滑膜細胞における上記少なくとも１つのマーカーの発現レベル以上であることが好ましい。
別の実施形態において、上記少なくとも１つのマーカーは、ＡＣＥ、ＤＣＬＫ１、ＰＰＬ、ＣＲＡＢＰ２、ＮＥＳ、ＸＰＮＰＥＰ２、ＳＬＩＴ３および上記のマーカーの少なくとも２つの組み合わせからなる群から選択され、画定された閾値レベルを超える上記少なくとも１つのマーカーの発現レベルは、上記細胞が滑膜細胞であることを示唆することを特徴とする。上記閾値は、軟骨細胞における上記少なくとも１つのマーカーの発現レベル以上であることが好ましい。
別の実施形態において、上記細胞培養は軟骨生検試料に由来する細胞を含有する。特に、上記細胞培養は軟骨／骨穿孔生検試料、より具体的にはその軟骨組織断片に由来する細胞を含有してもよい。
上記生検試料、より具体的には上記軟骨生検試料または軟骨／骨穿孔生検試料は、関節、より具体的には膝関節由来の生検試料が好ましい。
別の実施形態において、上記細胞培養は滑膜組織生検試料に由来する細胞を含有する。
さらに別の実施形態において、上記少なくとも１つのマーカーは、ＭＭＰ１に対するＡＣＥの比（ＡＣＥ／ＭＭＰ１比）またはＡＣＥに対するＭＭＰ１の比（ＭＭＰ１／ＡＣＥ比）である。換言すると、別の実施形態に従う軟骨および／または滑膜細胞の同一性の生体外定量のための上記マーカーは、ＭＭＰ１に対するＡＣＥの比またはＡＣＥに対するＭＭＰ１の比である。好ましくは、上記少なくとも１つのマーカーはＭＭＰ１に対するＡＣＥの比である。換言すると、軟骨細胞および／または滑膜細胞の同一性を生体外で定量するためのマーカーが、ＭＭＰ１に対するＡＣＥの比かどうかは、本発明において好ましい。画定された閾値を超える上記ＡＣＥ／ＭＭＰ１比の値は、上記細胞が滑膜細胞であることを示唆する。上記閾値は、滑膜細胞におけるＭＭＰ１に対するＡＣＥの比の値以下であることが好ましい。
さらなる特徴とその使用法の利点、より具体的には上記少なくとも１つのマーカーについて、繰り返しを避けるために、上記の記述に照らして行った上記説明は、その全体を参照することにより本明細書に組み込まれる。ここに記述した実施形態はまた、本発明の第２の態様に従って上記マーカーの使用法に対して準用する。
第３の態様に従って、本発明は細胞培養の組成または純度を評価し、より具体的には定量するための方法に関する。
上記方法は、
ａ）細胞培養から細胞試料を取得すること、
ｂ）上記細胞試料における少なくとも１つのマーカーの発現レベルを定量すること、そして
ｃ）上記細胞培養の組成または純度を上記少なくとも１つのマーカーの上記発現レベルに基づいて定量することの、各段階を含む。
上記方法は、特に、上記少なくとも１つのマーカーが、ＭＭＰ１、ＡＣＥ、ＰＯＳＴＮ、ＳＹＮＰＯ、ＳＵＬＦ１、ＡＲＨＧＥＦ２８、ＩＧＦ２ＢＰ１、ＢＡＩＡＰ２Ｌ１、ＬＩＭＣＨ１、ＳＣＩＮ、ＤＣＬＫ１、ＰＰＬ、ＣＲＡＢＰ２、ＮＥＳ、ＸＰＮＰＥＰ２、ＳＬＩＴ３および上記のマーカーの少なくとも２つの組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする。
別の実施形態において、上記細胞培養は軟骨生検試料に由来する細胞を含有する。特に、上記細胞培養は軟骨／骨穿孔生検試料、より具体的にはその軟骨組織断片に由来する細胞を含有してもよい。
上記生検試料、より具体的には上記軟骨生検試料または軟骨／骨穿孔生検試料は、関節、より具体的には膝関節由来の生検試料が好ましい。
別の実施形態において、上記細胞培養は滑膜組織生検試料に由来する細胞を含有する。
さらに別の実施形態において、上記少なくとも１つのマーカーは、ＭＭＰ１に対するＡＣＥの比（ＡＣＥ／ＭＭＰ１比）またはＡＣＥに対するＭＭＰ１の比（ＭＭＰ１／ＡＣＥ比）である。好ましくは、上記少なくとも１つのマーカーはＭＭＰ１に対するＡＣＥの比である。好ましくは、画定された閾値を超えるＡＣＥのＭＭＰ１の比の値は、上記細胞培養が滑膜細胞を含有することを示唆する。上記閾値は、純粋な滑膜細胞培養におけるＭＭＰ１に対するＡＣＥの比の値以下であることが好ましい。
さらなる特徴とその方法の利点、より具体的には上記少なくとも１つのマーカーについて、繰り返しを避けるために、上記の記述に照らして行った上記説明、より具体的には本発明の第１の態様に関しては、その全体を参照することにより本明細書に組み込まれる。ここに記述した実施形態はまた、本発明の第３の態様に従った方法に対しても準用する。
第４の態様に従い、本発明は軟骨細胞および／または滑膜細胞の同一性を定量するための生体外での方法、より具体的には軟骨細胞を判別する（区別する）ためのマーカーの使用法に関する。
上記方法は、
ａ）細胞培養から取得した細胞試料における少なくとも１つのマーカーの発現レベルを定量すること、そして
ｂ）上記少なくとも１つのマーカーの上記発現レベルに基づいて上記細胞の同一性を定量すること、の各段階を含む。
上記方法は、特に、上記少なくとも１つのマーカーが、ＭＭＰ１、ＡＣＥ、ＰＯＳＴＮ、ＳＹＮＰＯ、ＳＵＬＦ１、ＡＲＨＧＥＦ２８、ＩＧＦ２ＢＰ１、ＢＡＩＡＰ２Ｌ１、ＬＩＭＣＨ１、ＳＣＩＮ、ＤＣＬＫ１、ＰＰＬ、ＣＲＡＢＰ２、ＮＥＳ、ＸＰＮＰＥＰ２、ＳＬＩＴ３および上記のマーカーの少なくとも２つの組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする。
別の実施形態において、上記細胞培養は軟骨生検試料に由来する細胞を含有する。特に、上記細胞培養は軟骨／骨穿孔生検試料、より具体的にはその軟骨組織断片に由来する細胞を含有してもよい。
上記生検試料、より具体的には上記軟骨生検試料または軟骨／骨穿孔生検試料は、関節、より具体的には膝関節由来の生検試料が好ましい。
別の実施形態において、上記細胞培養は滑膜組織生検試料に由来する細胞を含有する。
さらに別の実施形態において、上記少なくとも１つのマーカーは、ＭＭＰ１に対するＡＣＥの比（ＡＣＥ／ＭＭＰ１比）またはＡＣＥに対するＭＭＰ１の比（ＭＭＰ１／ＡＣＥ比）である。好ましくは、上記少なくとも１つのマーカーはＭＭＰ１に対するＡＣＥの比である。好ましくは、画定された閾値を超えるＭＭＰ１に対するＡＣＥの比の値は、上記細胞が滑膜細胞であることを示唆する。上記閾値は、滑膜細胞におけるＭＭＰ１に対するＡＣＥの比の値以下であることが好ましい。
さらなる特徴とその方法の利点、より具体的には上記少なくとも１つのマーカーについて、上記の記述に照らして行った上記説明、より具体的には本発明の第２の態様に関しては、その全体を参照することにより本明細書に組み込まれる。ここに記述した実施形態はまた、本発明の第４の態様に従った方法に対しても準用する。
第５の態様に従い、本発明は上記評価において使用するためのマーカー、より具体的には細胞培養の組成または純度の定量に関する。
上記マーカーは、ＭＭＰ１、ＡＣＥ、ＰＯＳＴＮ、ＳＹＮＰＯ、ＳＵＬＦ１、ＡＲＨＧＥＦ２８、ＩＧＦ２ＢＰ１、ＢＡＩＡＰ２Ｌ１、ＬＩＭＣＨ１、ＳＣＩＮ、ＤＣＬＫ１、ＰＰＬ、ＣＲＡＢＰ２、ＮＥＳ、ＸＰＮＰＥＰ２およびＳＬＩＴ３からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーであり、上記少なくとも１つのマーカーの発現レベルが定量されることを特徴とする。
別の実施形態において、上記細胞培養は軟骨生検試料に由来する細胞を含有する。特に、上記細胞培養は軟骨／骨穿孔生検試料、より具体的にはその軟骨組織断片に由来する細胞を含有してもよい。
上記生検試料、より具体的には上記軟骨生検試料または軟骨／骨穿孔生検試料は、関節、より具体的には膝関節由来の生検試料が好ましい。
別の実施形態において、上記細胞培養は滑膜組織生検試料に由来する細胞を含有する。
さらに別の実施形態において、上記少なくとも１つのマーカーは、ＭＭＰ１に対するＡＣＥの比（ＡＣＥ／ＭＭＰ１比）またはＡＣＥに対するＭＭＰ１の比（ＭＭＰ１／ＡＣＥ比）である。換言すると、別の実施形態に従う細胞培養の組成または純度を評価するためのマーカーは、ＭＭＰ１に対するＡＣＥの比（ＡＣＥ／ＭＭＰ１比）またはＡＣＥに対するＭＭＰ１の比（ＭＭＰ１／ＡＣＥ比）である。
好ましくは、上記少なくとも１つのマーカーはＭＭＰ１に対するＡＣＥの比である。換言すると、細胞培養の上記組成または純度を評価する際に使用するための上記マーカーがＭＭＰ１に対するＡＣＥの比かどうかは、本発明において好ましい。好ましくは、画定された閾値を超えるＭＭＰ１に対するＡＣＥの比の値は、上記細胞培養が滑膜細胞を含有することを示唆する。上記閾値は、純粋な滑膜細胞培養におけるＭＭＰ１に対するＡＣＥの比の値以下であることが好ましい。
上記マーカーのさらなる特徴と利点について、繰り返しを避けるために、上記の記述に照らして行った上記説明、より具体的には本発明の第１の態様に関する上記説明は、その全体を参照することにより本明細書に組み込まれる。ここに記述した実施形態はまた、本発明の第５の態様に従って上記マーカーに対しても準用する。
第６の態様に従い、本発明は軟骨細胞および／または滑膜細胞の同一性を生体外で定量する際に使用するためのマーカー、より具体的には軟骨細胞と滑膜細胞の間の生体外での判別（区別）において使用するためのマーカーに関する。
上記マーカーは、ＭＭＰ１、ＡＣＥ、ＰＯＳＴＮ、ＳＹＮＰＯ、ＳＵＬＦ１、ＡＲＨＧＥＦ２８、ＩＧＦ２ＢＰ１、ＢＡＩＡＰ２Ｌ１、ＬＩＭＣＨ１、ＳＣＩＮ、ＤＣＬＫ１、ＰＰＬ、ＣＲＡＢＰ２、ＮＥＳ、ＸＰＮＰＥＰ２およびＳＬＩＴ３からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーであって、上記少なくとも１つのマーカーの発現レベルは細胞培養から得られた細胞試料において定量されることを特徴とする。
別の実施形態において、上記細胞培養は軟骨生検試料に由来する細胞を含有する。特に、上記細胞培養は軟骨／骨穿孔生検試料、より具体的にはその軟骨組織断片に由来する細胞を含有してもよい。
上記生検試料、より具体的には上記軟骨生検試料または軟骨／骨穿孔生検試料は、関節、より具体的には膝関節由来の生検試料が好ましい。
別の実施形態において、上記細胞培養は滑膜組織生検試料に由来する細胞を含有する。
さらに別の実施形態において、上記少なくとも１つのマーカーは、ＭＭＰ１に対するＡＣＥの比（ＡＣＥ／ＭＭＰ１比）またはＡＣＥに対するＭＭＰ１の比（ＭＭＰ１／ＡＣＥ比）である。換言すると、別の実施形態に従って生体外において軟骨細胞および／または滑膜細胞の同一性を定量する際に使用するための上記マーカーは、ＭＭＰ１に対するＡＣＥの比（ＡＣＥ／ＭＭＰ１比）またはＡＣＥに対するＭＭＰ１の比（ＭＭＰ１／ＡＣＥ比）である。
好ましくは、上記少なくとも１つのマーカーはＭＭＰ１に対するＡＣＥの比である。換言すると、軟骨細胞および／または滑膜細胞の同一性を生体外で定量する際に使うためのマーカーが、ＭＭＰ１に対するＡＣＥの比かどうかは、本発明において好ましい。好ましくは、画定された閾値を超えるＭＭＰ１に対するＡＣＥの比の値は、上記細胞が滑膜細胞であることを示唆する。上記閾値は、滑膜細胞におけるＭＭＰ１に対するＡＣＥの比の値以下であることが好ましい。
上記マーカーのさらなる特徴と利点について、繰り返しを避けるために、上記の記述に照らして行った上記説明、より具体的には本発明の第１および第２の態様に関する上記説明は、その全体を参照することにより本明細書にもまた組み込まれる。ここに記述した実施形態はまた、本発明の第６の態様に従って上記マーカーに対しても準用する。
第７の態様に従い、本発明は、細胞を用いた新規療法または細胞を付与した（生体外）移植組織用の医薬品を製造するための細胞培養の使用法、および好ましくは軟骨細胞培養または軟骨細胞の使用法、および好ましくは組織工学製品に関する。
上記細胞培養の組成と純度は、本発明の第１または第５の態様に従うマーカーを用いて若しくは本発明の第３の態様に従う方法を用いて定量される。
新規療法の上記医薬品または上記移植組織は、軟骨細胞を含むことが好ましい。
例えば、新規療法用の医薬品は、細胞含有の二成分系、より具体的にはキット型のものでもよく、第１成分はマレイミド基類などのチオール反応性基類を有する官能化アルブミン、より具体的にはヒト血清アルブミンおよび自家移植軟骨細胞を含みまた第２成分は例えばジチオポリエチレングリコール（二つの末端チオール基を有する非分枝型ポリエチレングリコール）などのチオール基で官能化された架橋剤を含むことを特徴とする。新規療法用の上記医薬品は、Ｎｏｖｏｃａｒｔ（登録商標）Ｉｎｊｅｃｔの名義の出願者により販売されている。
あるいは、新規療法用の上記医薬品は自家移植軟骨細胞を植え付けたコラーゲンに基づいた移植組織でもよい。特に、新規治療用の医薬品は、２層構造を有する自家移植軟骨細胞を植え付けた移植組織でもよく、その第１の層は膜型、より具体的には心嚢膜の形態であり、また第２の層はスポンジ状と開孔構造、より具体的には柱状細孔を有し、上記軟骨細胞は上記第２の層またはスポンジ状の層の中に包含されることを特徴とする。当該移植組織は、Ｎｏｖｏｃａｒｔ（登録商標）３Ｄの名義の出願者によって市場販売されている。
上記使用法のさらなる特徴と利点について、繰り返しを避けるために、上記の記述に照らして行った上記説明、より具体的には本発明の第１、第３および第５の態様に関する上記説明は、その全体を参照することにより本明細書にもまた組み込まれる。ここに記述した実施形態はまた、本発明の第７の態様に従って上記使用法に対しても準用する。
第８の態様に従って、本発明は、本発明の第３または第４の態様に従う方法を実行するためのキットの使用法に関する。
上記キットは、ＰＯＳＴＮ、ＳＹＮＰＯ、ＭＭＰ１、ＳＵＬＦ１、ＡＲＨＧＥＦ２８、ＢＡＩＡＰ２Ｌ１、ＬＩＭＣＨ１、ＳＣＩＮ、ＤＣＬＫ１、ＰＰＬ、ＣＲＡＢＰ２、ＮＥＳ、ＸＰＮＰＥＰ２、ＳＬＩＴ３およびＡＣＥからなる群から選択される少なくとも１つのマーカーを定量するための少なくとも１つの成分を含む。
成分は、より具体的には、例えば、捕捉および／または検出抗体などの抗体、蛍光染料のような染料、ビーズ、緩衝液、栄養溶液、洗浄液、開始剤（ＤＮＡポリメラーゼのようなＤＮＡ複製酵素に対する出発点として作用するオリゴヌクレオチド）または上記の成分の少なくとも２つの混合物／配合物でもよい。
上記キットの別の特徴と利点、より具体的には上記少なくとも１つの上記マーカーについて、繰り返しを避けるために、上記の記述に照らして行った上記説明は、その全体を参照することにより本明細書にもまたここに記述した実施形態はまた、本発明の第８の態様に従って上記キットに対しても準用する。
本発明の別の特徴と利点は、実施例の形態で後続の記述における好ましい実施形態において見出される。上記個々の特徴は、独立にまたは相互に組み合わせた形で実装できる。下記に記述した実施例は、本発明をさらに説明するために提供するものであって、それにより決して制限されない。
以下に、本明細書で開示する技術の特徴を列挙する。
（項目１）
細胞培養の組成および純度を定量するためのマーカーの使用法であって、前記マーカーが、ＡＣＥ、ＭＭＰ１、ＰＯＳＴＮ、ＳＹＮＰＯ、ＳＵＬＦ１、ＡＲＨＧＥＦ２８、ＩＧＦ２ＢＰ１、ＢＡＩＡＰ２Ｌ１、ＬＩＭＣＨ１、ＳＣＩＮ、ＤＣＬＫ１、ＰＰＬ、ＣＲＡＢＰ２、ＮＥＳ、ＸＰＮＰＥＰ２およびＳＬＩＴ３からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーであり、前記少なくとも１つのマーカーの発現レベルが定量されることを特徴とする、細胞培養の組成および純度を定量するためのマーカーの使用法。
（項目２）
前記少なくとも１つのマーカーの発現レベルが、前記細胞培養から取得した細胞試料について定量されることを特徴とする、項目１に記載の使用法。
（項目３）
前記細胞培養が軟骨細胞培養であることを特徴とする、項目１または項目２に記載の使用法。
（項目４）
前記細胞培養が、軟骨生検試料、好ましくは、軟骨／骨穿孔生検試料、より具体的には、それらの軟骨組織断片に由来する細胞を含むことを特徴とする、項目１から３のいずれか一項に記載の使用法。
（項目５）
前記生検試料が、関節、より具体的には膝関節からの生検試料であることを特徴とする、項目４に記載の使用法。
（項目６）
前記少なくとも１つのマーカーが、ＭＭＰ１、ＰＯＳＴＮ、ＳＹＮＰＯ、ＳＵＬＦ１、ＡＲＨＧＥＦ２８、ＩＧＦ２ＢＰ１、ＢＡＩＡＰ２Ｌ１、ＬＩＭＣＨ１、ＳＣＩＮおよび前記記述されたマーカーの中の少なくとも２つの組み合わせからなる群から選択され、前記少なくとも１つのマーカーの発現レベルが画定された閾値レベルを超えることは、前記細胞培養が軟骨細胞を含むことを示すことを特徴とする、項目１から５のいずれか一項に記載の使用法。
（項目７）
前記閾値が、純粋な滑膜細胞培養中の前記少なくとも１つのマーカーの発現レベル以上であることを特徴とする、項目６に記載の使用法。
（項目８）
前記少なくとも１つのマーカーが、ＡＣＥ、ＤＣＬＫ１、ＰＰＬ、ＣＲＡＢＰ２、ＮＥＳ、ＸＰＮＰＥＰ２、ＳＬＩＴ３、および前記記述されたマーカーの中の少なくとも２つの組み合わせからなる群から選択され、前記少なくとも１つのマーカーの発現レベルが画定された閾値レベルを超えることは、前記細胞培養が滑膜細胞を含むことを示すことを特徴とする、項目１から７のいずれか一項に記載の使用法。
（項目９）
前記閾値が、純粋な軟骨細胞培養中の前記少なくとも１つのマーカーの発現レベル以上であることを特徴とする、項目１１に記載の使用法。
（項目１０）
前記少なくとも１つのマーカーが、ＡＣＥに対するＭＭＰ１の比または前記２つの逆比であることを特徴とする、項目１から９のいずれか一項に記載の使用法。
（項目１１）
ＡＣＥに対するＭＭＰ１の比の値が画定された閾値を超えることは、前記細胞培養が滑膜細胞を含むことを示し、
前記閾値は、好ましくは、純粋な滑膜細胞培養におけるＡＣＥに対するＭＭＰ１の比の値以下であることを特徴とする、項目１０に記載の使用法。
（項目１２）
前記発現レベルはＲＮＡの塩基、好ましくはｍＲＮＡの塩基またはタンパク質の塩基について定量されることを特徴とする、項目１から１１のいずれか一項に記載の使用法。
（項目１３）
細胞培養の前記組成または純度を定量する方法であって、
前記方法は、
ａ）細胞培養から細胞試料を取得すること、
ｂ）前記細胞試料における少なくとも１つのマーカーの発現レベルを定量すること、
ｃ）前記細胞培養の前記組成または純度を前記少なくとも１つのマーカーの前記発現レベルに基づいて定量すること
を含み、
前記少なくとも１つのマーカーが、ＭＭＰ１、ＡＣＥ、ＰＯＳＴＮ、ＳＹＮＰＯ、ＳＵＬＦ１、ＡＲＨＧＥＦ２８、ＩＧＦ２ＢＰ１、ＢＡＩＡＰ２Ｌ１、ＬＩＭＣＨ１、ＳＣＩＮ、ＤＣＬＫ１、ＰＰＬ、ＣＲＡＢＰ２、ＮＥＳ、ＸＰＮＰＥＰ２、ＳＬＩＴ３および前記記述のマーカーの少なくとも２つの組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする、方法。
（項目１４）
前記細胞培養の前記組成または純度が、項目１から項目１２のいずれか一項に記載のマーカーの手段、又は、項目１３に記載の方法の手段によって定量されることを特徴とする、新規療法用の医薬品、より具体的には組織工学製品を製造するための細胞培養の使用法。
（項目１５）
項目２２または項目２３に記載の方法を実行するためのキットの使用法であって、前記キットが、ＭＭＰ１、ＡＣＥ、ＰＯＳＴＮ、ＳＹＮＰＯ、ＳＵＬＦ１、ＡＲＨＧＥＦ２８、ＩＧＦ２ＢＰ１、ＢＡＩＡＰ２Ｌ１、ＬＩＭＣＨ１、ＳＣＩＮ、ＤＣＬＫ１、ＰＰＬ、ＣＲＡＢＰ２、ＮＥＳ、ＸＰＮＰＥＰ２およびＳＬＩＴ３からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーを検出するための少なくとも１つの成分を含むことを特徴とする、使用法。
図は以下を示す。
ｌｏｇ１０変換滑膜細胞／軟骨細胞ＬＱＦ強度の散布図比較図である。 ｌｏｇ１０変換滑膜細胞／軟骨細胞ＬＱＦ強度（平均ＬＦＱ比）の平均値の可視化用のヴォルカーノプロット図である。 滑膜細胞と軟骨細胞間のペプチド数の差および平均順位検定で使用されない全タンパク質用のｑ値の付随的な差の可視化用の火山プロット図である。 軟骨細胞と滑膜細胞における滑膜細胞マーカーＡＣＥのｍＲＮＡ発現である。 軟骨細胞と滑膜細胞における軟骨細胞マーカーＭＭＰ１のｍＲＮＡ発現である。 軟骨細胞と滑膜細胞における滑膜細胞マーカーＡＣＥおよび軟骨細胞マーカーＭＭＰ１のｍＲＮＡ発現の比である。 細胞混合物におけるＡＣＥ／ＭＭＰ１のｍＲＮＡ発現の比である。 細胞混合物におけるＡＣＥのｍＲＮＡ発現である。 細胞混合物におけるＭＭＰ１のｍＲＮＡ発現である。
図面の詳細な説明
図１は、異なる４人の提供者における提供者１（ｘ軸）に関するｌｏｇ１０変換滑膜細胞／軟骨細胞ＬＥＱ強度の散布図の比較を示す。原点を通った傾き１の直線は、繰り返し実験における１００％相関に対応する。平均順位テスト（ｍｅａｎ ｒａｎｋ ｔｅｓｔ）で１つの細胞型において高い発現を示すとして分類されたタンパク質は、暗く示されている。
図２は、５回の繰り返し実験の少なくとも３回が定量された全タンパク質の比の標準偏差に対する、ｌｏｇ１０形質転換滑膜細胞／軟骨細胞のＬＦＱ強度の平均値（平均ＬＦＱ比）の可視化用のヴォルカーノプロットを示す。黒い垂直は、陽性（滑膜細胞におけるより高い発現）と陰性（軟骨細胞におけるより高い発現）のＬＦＱ比の間の境界を示す。各々の破線は、タンパク質の発現における２倍または１０倍の差（対数の尺度で０．３と１に対応）を示す。
図３は、滑膜細胞と軟骨細胞の間のペプチド数の差および平均順位テストにおいて用いられない全タンパク質に対するｑ値の付随的な差を視覚化するためのヴォルカーノプロットを示す。１より大きいペプチド数の差は、滑膜細胞における高い発現を意味し、また１より小さいペプチド数の差は、軟骨細胞における高い発現を意味する。研究１においてバイオマーカー候補として分類されたタンパク質は、遺伝子名で同定される。
図４は、上記滑膜細胞マーカーＡＣＥのｍＲＮＡ発現のグラフを示す。同一提供者由来の軟骨細胞および滑膜細胞が、－以下に記述される、１．材料および方法－において培養される。培養法の終わりで、ＡＣＥの上記ｍＲＮＡの発現が分析された。結果は、上記参照遺伝子ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ）（ｎ＝１０）の発現に対して示される。上記図中で用いた箱ひげは、２５／７５パーセンタイル（箱）、１０／９０パーセンタイル（括弧）、５／９５パーセンタイル（点）、中央値（実線）および平均値（点線）を示す。図４は、滑膜細胞におけるＡＣＥのｍＲＮＡ発現が軟骨細胞においてより有意に高いことを示す。ＡＣＥは、したがって、滑膜細胞のマーカーとしての使用に対して特別に適合する。
図５は、上記軟骨マーカーＭＭＰ１のｍＲＮＡ発現のグラフを示す。同一提供者由来の軟骨細胞および滑膜細胞が－以下に記述される、１．材料および方法－において培養される。培養法の終わりで、ＭＭＰ１の上記ｍＲＮＡの発現が分析された。結果は、上記参照遺伝子ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ）（ｎ＝１０）の発現に対して示される。上記図中で用いた箱ひげは、２５／７５パーセンタイル（箱）、１０／９０パーセンタイル（括弧）、５／９５パーセンタイル（点）、中央値（実線）および平均値（点線）を示す。図５は、軟骨細胞におけるＭＭＰ１のｍＲＮＡ発現が滑膜細胞においてより有意に高いことを示す。ＭＭＰ１は、したがって、軟骨細胞のマーカーとしての使用に対して特別に適合する。
図６は、軟骨細胞および滑膜細胞における滑膜細胞マーカーＡＣＥと軟骨細胞マーカーＭＭＰ１の発現の比のグラフを示す（ｎ＝１０）。上記図中で用いた箱ひげは、２５／７５パーセンタイル（箱）、１０／９０パーセンタイル（括弧）、５／９５パーセンタイル（点）、中央値（実線）および平均値（点線）を示す。図６は、ＭＭＰ１に対するＡＣＥの比（ＡＣＥ／ＭＭＰ１比）もまた、本発明の意味において、より具体的には細胞培養物の組成または純度を定量するためおよび／または生体外で軟骨細胞および／または滑膜細胞の同一性を定量するためのマーカーとして適合することを示す。
図７は、軟骨細胞および滑膜細胞の異なる内容物を有する細胞におけるＡＣＥに対するＭＭＰ１のｍＲＮＡ発現の比のグラフを示す。（ｎ＝７）。上記図中で用いた箱ひげは、２５／７５パーセンタイル（箱）、１０／９０パーセンタイル（括弧）、５／９５パーセンタイル（点）、中央値（実線）および平均値（点線）を示す。図７は、ＭＭＰ１に対するＡＣＥの比の値が、軟骨細胞含有の細胞混合物の純度の程度と相関し、具体的にはＡＣＥに対するＭＭＰ１の低い比が軟骨細胞含有の細胞混合物の純度の程度より強く相関し、またＡＣＥに対するＭＭＰ１の高い比は軟骨細胞含有の細胞混合物の純度が低く相関することを示す。図７は、特に、軟骨細胞含有の細胞混合物の純度がＭＭＰ１に対するＡＣＥの比の縮小に伴って増加することを示す。
上記細胞混合物は、以下のように生成された。
軟骨細胞および滑膜細胞は、－以下に記述される１．材料および方法－において、互いに独立して培養されて、培養の終了時点でトリプシン処理と遠心処理された。得られた上記細胞ペレットは再懸濁された。細胞懸濁液の細胞数を定量し、次いで各細胞懸濁液の対応する容量を用いて１００％、９０％、７５％、５０％、２５％、１０％および０％の軟骨細胞を含む混合物を生成した。このような手段で調製された上記細胞混合物は、再度遠心分離されてその結果得られた細胞ペレットを溶解して遺伝子用に使用した。
図８は、軟骨細胞および滑膜細胞の異なる内容物を有する細胞混合物におけるＡＣＥのｍＲＮＡ発現のグラフを示す（ｎ＝７）。上記図中で用いた箱ひげは、２５／７５パーセンタイル（箱）、１０／９０パーセンタイル（括弧）、５／９５パーセンタイル（点）、中央値（実線）および平均値（点線）を示す。
上記細胞混合物の生成に関して、図７に関する上記説明を参照する。
図９は、軟骨細胞および滑膜細胞の異なる内容物を有する細胞混合物におけるＭＭＰ１のｍＲＮＡ発現のグラフを示す（ｎ＝７）。上記図中で用いた箱ひげは、２５／７５パーセンタイル（箱）、１０／９０パーセンタイル（括弧）、５／９５パーセンタイル（点）、中央値（実線）および平均値（点線）を示す。
上記細胞混合物の生成に関して、図７に関する上記説明をまた参照する。
例示的な実施形態の詳細な説明
１．材料および方法
１．１ 細胞培養、阻害剤処理および細胞溶解
使用された上記軟骨細胞および滑膜細胞は、合衆国からの死亡した提供者の膝関節に由来する。上記組織は２つの解剖用メスを使って細かく切断してのコラゲナーゼを用いて２４時間に亘って、５％のＣＯ２で３７℃で消化した。培養の間、上記滑膜組織は上記軟骨組織に同様に処理された。消化後、上記試料は、軟骨細胞培地内で４８時間に亘って、５％ＣＯ２で３７℃で縦型インキュベーションを受けた。この処理の後、上記細胞は、細胞ふるいを通過させ、遠心分離にかけて新鮮な軟骨細胞培地内で広げた。増殖に応じて、上記細胞を１９～最大２３日間に亘って、上記培地を２～３回交換して培養した。
培養後、上記細胞をトリプシンを用いて培養表面から剥がし、ＰＢＳで洗浄し、凍結し、ドライアイスを用いてミュンヘンのエボティック社に送った。
タンパク質の細胞溶解と酵素解裂は、最近発表された実施要綱（Ｋｕｌａｋ，Ｎ．Ａ．、Ｐｉｃｈｌｅｒ，Ｇ．、Ｐａｒｏｎ，Ｉ．、Ｎａｇａｒａｊ，Ｎ．およびＭａｎｎ，Ｍ．（２０１４）Ｍｉｎｉｍａｌ， ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ－ｓａｍｐｌｅ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｃｏｐｙ－ｎｕｍｂｅｒ ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｃｅｌｌｓ． Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １１，３１９～３２４）に従って実施した。上記細胞は最初－８０℃で保存し、その後溶解の前に氷の上に置いた。溶解は冷涼な緩衝材（１％ｗ／ｖのＳＤＣ、１０ｍＭのＴＣＥＰ、４０ｍＭのＣＡＡ、ｐＨ８．５の１００ｍＭのＴｒｉｓ）を用いて実行した。細胞抽出物は、直ちに９９℃で１０分間に亘って培養し、次いで、氷を用いて３０秒間超音波処理した。その後、上記細胞破片を遠心分離して除去した。その上澄みは、新規の反応容器に移して、タンパク質濃度を定量した（ＢＣＡ分析、ピアス）。１５０μｇの各細胞溶解質は、その後の酵素タンパク質解裂に対して使われる。合計１０の軟骨細胞と１０の滑膜細胞の培養が、分析に使用された。
１．２ 質量分析法（ＭＳ）用の試料調製
細胞溶解質中のタンパク質は、１０ｍＭのＴＣＥＰ（トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン）で還元して４０ｍＭのＣＡＡ（２－クロロアセトアミド）の存在下でアルキル化した。遠心分離後、各場合において、上記透明溶解質の１５０μｇアリコートはＨ２Ｏにより１：２に希釈され、エンドペプチダーゼＬｙｓ－Ｃ（Ｗａｋｏ）およびトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）の１：１混合物が、酵素対タンパク質比１：５０の中に添加され、培養が一晩中実行された。得られたペプチド混合物は、９９％の酢酸エチルおよび１％のＴＦＡを加えて酸性化し、次いでＳｔｒａｔａ－Ｘ－Ｃカラム（フェノメネックス社製の１００ｍｇの吸着剤）を使用して脱塩した。上記ペプチドは、８０％のアセトニトリルおよび５％ｖ／ｖの水酸化アンモニウムで溶離し、液体窒素中で衝撃凍結し、そして凍結乾燥した。この後、ペプチドを逆相クロマトグラフィー（Ｗａｎｇ，Ｙ．、Ｙａｎｇ，Ｆ．、Ｇｒｉｔｓｅｎｋｏ，ＭＡ、Ｃｌａｕｓｓ，Ｔ．、Ｌｉｕ，Ｔ．、Ｓｈｅｎ，Ｙ．、Ｍｏｎｒｏｅ，ＭＥ、Ｌｏｐｅｚ－Ｆｅｒｒｅｒ，Ｄ．、Ｒｅｎｏ，Ｔ．、Ｍｏｏｒｅ，Ｒ．Ｊ．ら。（２０１１）、Ｒｅｖｅｒｓｅｄ－ｐｈａｓｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｗｉｔｈ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｆｒａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｃａｔｅｎａｔｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｏｍｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＭＣＦ１０Ａ ｃｅｌｌｓ． Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ １１，２０１９－２０２６）によって高いｐＨで分画した。この目的のために、上記ペプチドは、２０ｍＭギ酸アンモニウム（ｐＨ１０、緩衝液Ａ）中で再構成され、エクタエクスプローラシステム（Ａｋｔａ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））のＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８ ２００×４．６ｍｍ分析カラム（ウォーターズ社）に充填され、その後、セグメント化されたグラジエントの手段により、増加するアセトニトリル濃度が７％～３０％の緩衝液Ｂ（８０％のアセトニトリルを含む緩衝液Ａ）を用いて１５分間、次に最大５５％の勾配で５分間に亘って、分離された。上記溶離されたペプチドについて収集された画分は、次に非線形手段を用いて結合されて合計１２個の試料が得られた。上記試料は次いで、自己生成Ｃ１８ ＳＴＡＧＥｔｉｐカラム（Ｒａｐｐｓｉｌｂｅｒ，Ｊ．、Ｍａｎｎ，Ｍ．およびＩｓｈｉｈａｍａ，Ｙ．（２００７）、Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ ｍｉｃｒｏ－ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ， ｐｒｅ－ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔｏｒａｇｅ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｕｓｉｎｇ ＳｔａｇｅＴｉｐｓ． Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ２，１８９６～１９０６）で脱塩した。質量分析法のために、上記ペプチドは０．５％のギ酸中で再構築された。
１．３ 質量分析法
全てのＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析は、Ｅａｓｙ ｎ－ＬＣ １０００ ＵＰＬＣシステム（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を備えたＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｐｌｕｓ質量分析計（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）で行った。上記試料は、逆相物質（Ｒｅｐｒｕｓｉｌ－Ｐｕｒ Ｃ１８－ＡＱ、３μｍ、Ｄｒ．Ｍａｉｓｃｈ ＧｍｂＨ）を最大圧力８００ｂａｒまで充満した４０ｃｍの石英ガラス製エミッター（ニューオブジェクティブス）の上のオートサンプラーに充填された。結合ペプチドは全分画された試料の分析用に１２５分の実行時間内に溶離された。ペプチドは、ナノエレクトロスプレーイオン源（プロジーオンバイオシステムズ社）を用いて質量分析計内に直接噴射した。質量分析計は、目標値が３，０００，０００計数（最大注入時間＝４５ｍｓ）で分解能がＲ＝７０，０００（ｍ／ｚ＝２００）の全ＭＳ走査とＲ＝１７，５００で目標値が１００，０００イオンにおけるＭＳ／ＭＳフラグメンテーション走査との間の自動切換えを可能にするためにデータ依存モードで動作された。上記１０個の最も示強性のペプチドイオンは、ＨＣＤ（高エネルギー衝突解離）を用いて選別された。
１．４ データ処理方法
上記試験で取得された全ての生データは、ペプチドとタンパク質の同定と定量のためにヒトスイスプロットデータベース（バージョン０３ ０２０１４）（Ｃｏｘ，Ｊ．およびＭａｎｎ，Ｍ．（２００８）、マックスカントは、高いペプチド同定率、個別化ｐ．ｐ．ｂ領域の質量精度およびプロテオーム全体のタンパク質定量が可能である。Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２６，１３６７－１３７２、Ｏｌｓｅｎ，Ｊ．Ｖ．、Ｖｅｒｍｅｕｌｅｎ，Ｍ．、Ｓａｎｔａｍａｒｉａ，Ａ．、Ｋｕｍａｒ，Ｃ．、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｍ．Ｌ．、Ｊｅｎｓｅｎ，Ｌ．Ｊ．、Ｇｎａｄ，Ｆ．，、Ｃｏｘ，Ｊ．，、Ｊｅｎｓｅｎ，Ｔ．Ｓ．、Ｎｉｇｇ，Ｅ．Ａ．、ら、（２０１０）。Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｒｅｖｅａｌｓ ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ ｆｕｌｌ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ ｏｃｃｕｐａｎｃｙ ｄｕｒｉｎｇ ｍｉｔｏｓｉｓ． Ｓｃｉ Ｓｉｇｎａｌ ３，ｒａ３）を使用してマックスカント（ＭａｘＱｕａｎｔ）ソフトウェアスイート（バージョン１．５．３．２）により処理された。ラベルフリーの定量が作動され、一方で「実行間の一致」機能が切られた。最大許容質量偏差は、ＭＳでは４．５ｐｐｍ、ＭＳ２ピークでは２０ｐｐｍであった。システインのカルバミドメチル化は固定修飾として入力され、またメチオニンの酸化とＮ末端アセチル化は可変修飾として入力された。全てのペプチドは、最小長さ７のアミノ酸を含む必要があり、また最大２つの未解裂トリプシン部位（解裂見逃し）が許容されていた。タンパク質とペプチドの同定用のＦＤＲ（誤発見率）は１％に設定された。
１．５ 生命情報科学データの分析
無標識定量化（ＬＦＱ）のタンパク質強度は、同一提供者の滑膜細胞／軟骨細胞の比を計算するために使用された。この対合は、合計５回の複製をもたらした。取得された比は、その後ｌｏｇ１０変換して別のデータ分析に使用された。デコイデータベース内で汚染物質またはリバースヒットとして標識されたタンパク質は、修飾されたマックスカントのタンパク質群の表から除外された。３回以上の複製においてＬＦＱ比を有するタンパク質に関する有意な発現差は、非母数の１標本平均順位検定（Ｋｌａｍｍｅｒ Ｍ．、Ｄｙｂｏｗｓｋｉ Ｊ．Ｎ．、Ｈｏｆｆｍａｎｎ Ｄ．、およびＳｃｈａａｂ Ｃ．（２０１４）、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｂｙ ｔｈｅ Ｇｌｏｂａｌ Ｍｅａｎ Ｒａｎｋ ｔｅｓｔ． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ． ２０１４年８月１３日、９（８）：ｅ１０４５０４． ｄｏｉ番号：１０．１３７１）を用いて定量された。平均順位テストは、ＦＤＲ（誤発見率）を確実に制御する包括的な順位に基づいたテストである。
３回複製未満の比を有するタンパク質は、与えられたタンパク質に対する個々のペプチド計数を使用した非母数のペプチド計数テストを受けた。各タンパク質に対して、軟骨細胞と滑膜細胞の間のペプチド計数における平均差が定量された。集団標識は次ぎに並べ替えられて、大きな差が発生したタンパク質を全体に亘って計数した。これは、与えられたタンパク質の誤り発見（ＦＤ）を予測するために、その誤り発見の平均数を使って考えられるあらゆる再配列に対して繰り返された。
上記２つの研究の組み合わせ分析を目的として、関連する軟骨細胞と滑膜細胞を有する合計１０の提供者が使われた。少なくとも７回の複製におけるＬＦＱ比を有するタンパク質中の有意な発現差は、上記平均順位テストを用いて定量され、また他の全てのタンパク質が非母数のペプチド計数テストを受けた。
１．６ 上記２つのデータ集合の比較
夫々５人の提供者を有する上記２つの独立した研究結果を比較できるようにするために、上記データはユニプロットＫＢ識別子および／または遺伝子名の何れかを用いて比較された。上記比較の性質に基づいて、上記データは以下の４つの範疇、即ち、（＋＋）同一のユニプロットＫＢ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ）識別子と、（＋）部分的に同一のユニプロットＫＢ識別子および同一の遺伝子名と、（＋／－）部分的に同一のユニプロットＫＢ識別子および部分的に一致する遺伝子名と、（－）適用不能のもの、に分類された。
１．７ 遺伝子発現分析
培養が完了した後で、５０万の一定分量が、遺伝子発現の分析用に採取され遠心分離され、そして上記細胞ペレットが溶解緩衝液を用いて溶解された。その後のＲＮＡの分離は、ＲＮ簡易小型キット（キアゲン社）を使って実行した。相補的ＤＮＡの合成は、ＰＣＲキット（クロンテック社）用のＡｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）ＲＴを用いて実行された。
遺伝子特異的プライマー配列は、プライマーブラストを用いてＮＣＢＩ社により設計されて、Ｂｉｏｔｅｚ社によって合成された。上記プライマーは、１００ｎＭまたは２００ｎＭ／ウェルの濃度で使用され、ｍＲＮＡの発現はロッシュ（Ｒｏｃｈｅ）社のＬＣ４８０を用いて実時間ＰＣＲ法で分析された。蛍光染料ＳＹＢＲグリーンが、上記増幅した配列の検出のために使用された。
２．結果
合計で、定量されたＦＤＲが＜１％、１０，７０２の異なるタンパク質が同定された。軟骨細胞と滑膜細胞に対してタンパク質の同様の数が同定された（１０，５５０または１０，４６２）。同定は、２，３００，０００を超えるペプチドの検出および１６２，２９９の同定済みペプチドに基づいて実行された。全ての上記実験を通して同程度の数のタンパク質が同定されたが、これはプロテオミクス分析に使用される作業の流れの基本的な頑健性を示している。
関連する軟骨細胞と滑膜細胞調製物を有する５人の提供者の生物学的複製に関するタンパク質定量の再現性を示すために、無標識の定量比（ＬＦＱ比）の散布図分析が実行された。この目的のために、上記ＬＦＱの強度は、滑膜細胞のＬＦＱ強度の軟骨細胞のＬＦＱ強度に対する比を表すｌｏｇ１０変換比に換算された。
一例として、提供者１に対する上記結果を図１に示す。上記タンパク質が両方の細胞型において同一に発現されることを意味する、ｌｏｇ１０変換タンパク質比約ゼロ（＝線形比が約１）の大きな斑点に加えて、上記２つの細胞型において異なる頻度を示す少数のタンパク質がいくつか見られる。上記散布図の相互比較は、大多数のタンパク質が勾配１の原点を通って勾配が１の線上にあることから、上記提供者について高い相関関係を示している。取得された結果は、上記２つの研究に関して同等であった。
次の段階において、上記２つの細胞型の間で発現レベルが有意に異なるタンパク質を同定するために、別のデータ分析が実行された。この目的のために、５つの生物学的複製のうち少なくとも３つが定量される上記タンパク質の全てが、統計分析された。これらの必要条件は、研究２における合計７，３６１のタンパク質および研究１における５，３７８のタンパク質によって満たされた。有意で再現性のある変化は、ＦＤＲが１０％（ｑ値≦０．１）の平均順位テストを使って同定された（Ｋｌａｍｍｅｒ Ｍ．、Ｄｙｂｏｗｓｋｉ Ｊ．Ｎ．、Ｈｏｆｆｍａｎｎ Ｄ．、およびＳｃｈａｂ Ｃ．（２０１４）、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｂｙ ｔｈｅ Ｇｌｏｂａｌ Ｍｅａｎ Ｒａｎｋ ｔｅｓｔ． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ． ２０１４年８月１３日、９（８）：ｅ１０４５０４． ｄｏｉ番号：１０．１３７１）。使用された１０％のＦＤＲは、遺伝子オントロジー濃縮および相互作用ネットワーク分析などの研究の別の生命情報科学分析に適合すると見られるような任意に選択された値である。上記２つの細胞型の間で有意に異なるタンパク質の発現を有する上記タンパク質の分布は、所謂ヴォルカーノプロットを使用して視覚化することができる。この目的のために、ｌｏｇ１０変換された滑膜細胞／軟骨細胞のＬＦＱ強度の平均値（平均ＬＦＱ比）が、全タンパク質の比の標準偏差に対してプロットされた。上記２つの細胞型の間で発現が異なる上記タンパク質の全てが、赤で示されている。バイオマーカー候補として分類されたタンパク質は、名称で標識された。
平均順位テストを適用した後、上記テストで分析された全タンパク質の１５％が、軟骨細胞と滑膜細胞（合計１，１３５）中で有意に異なることが分かった。次の段階において、上記２つの細胞型の中の１つのみにおいて可能な限り独占的に発現したマーカータンパク質を同定するためにペプチド計数が実行された。このテストは、２つの細胞型のうちのどの１つのタンパク質が同定されたかに関してペプチドの平均数を比較する。このテストに対して、全部で３，３４０のタンパク質が使われて、その中１６が異なって発現された（１０％のＦＤＲ、ｑ値≦０．１）。これらの１６のタンパク質の中、８は１つの型のみで発現され、あるいは１つの細胞型のみにおいて有意に高く発現された。
両方の研究においてペプチド計数テストによって見出された軟骨細胞または滑膜細胞における特異的なタンパク質発現を有する選択されたタンパク質が、表１に示される。
Figure 0007001674000001
有意に異なる手段を使って発現される生命情報科学分析によって定量されたタンパク質を表２に示す。
Figure 0007001674000002
さらに、バイオマーカー候補として分類された上記タンパク質に対して、上記２つの細胞型間のタンパク質発現の差（―倍の差）および平均ペプチド計数を表３に要約する。
Figure 0007001674000003

Claims (7)

  1. 細胞培養の組成および純度を定量するためのマーカーの使用法であって、前記マーカーが、ＭＭＰ１／ＡＣＥまたはＡＣＥ／ＭＭＰ１であり、前記マーカーの発現レベルが定量され、前記細胞培養が、軟骨細胞の培養であることを特徴とする、細胞培養の組成および純度を定量するためのマーカーの使用法。
  2. 前記細胞培養が、軟骨生検試料、軟骨／骨穿孔生検試料、及び、それらの軟骨組織断片のうちの少なくとも一つに由来する細胞を含むことを特徴とする、請求項１に記載の使用法。
  3. 前記生検試料が、関節、及び、膝関節のうちの少なくとも一つからの生検試料であることを特徴とする、請求項２に記載の使用法。
  4. 前記マーカーは、ＭＭＰ１／ＡＣＥであり、
    前記マーカーの発現レベルが第１の閾値レベルを超えることは、前記細胞培養が軟骨細胞を含むことを示し、
    前記第１の閾値レベルは、純粋な滑膜細胞の培養中の前記マーカーの発現レベル以上であることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の使用法。
  5. 前記マーカーは、ＡＣＥ／ＭＭＰ１であり、
    前記マーカーの発現レベルが第２の閾値レベルを超えることは、前記細胞培養が滑膜細胞を含むことを示し、
    前記第２の閾値レベルが、純粋な軟骨細胞の培養中の前記マーカーの発現レベル以上であることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の使用法。
  6. 前記発現レベルは、ＲＮＡの塩基、ｍＲＮＡの塩基、または、タンパク質の塩基について定量されることを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載の使用法。
  7. 細胞培養の組成または純度を定量する方法であって、
    前記方法は、
    ａ）軟骨細胞の培養である細胞培養から細胞試料を取得すること、
    ｂ）前記細胞試料におけるマーカーの発現レベルを定量すること、
    ｃ）前記細胞培養の前記組成または純度を前記マーカーの前記発現レベルに基づいて定量すること
    を含み、
    前記マーカーが、ＭＭＰ１／ＡＣＥまたはＡＣＥ／ＭＭＰ１である、方法。
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