WO2016068663A1 - 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치, 이의 제조방법 및 이를 이용한 검출 방법 - Google Patents

표적 유전자 검출용 미세 유동 장치, 이의 제조방법 및 이를 이용한 검출 방법 Download PDF

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이혁진
이해신
이호연
정일영
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이화여자대학교 산학협력단
한국과학기술원
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Definitions

  • the present invention provides a microfluidic device for detecting a target gene, which can be visually identified by amplifying a target gene and selectively blocking a flow path of the microfluidic device, a manufacturing method thereof, and a method for detecting a target gene using the same. It is about.
  • the microfluidic device for detecting a target gene is a device including a substrate, an inlet, a discharge port connected to a first flow path and a second flow path.
  • the second flow path of the device is coated, a primer is immobilized on the coating, and a template (a template for target gene detection) is bound to the immobilized primer.
  • the linear structure of the template may be defined as' a first target gene binding site'- '(for forming a dumbbell shape) a complementary binding site'-'primer binding part'-' (for forming a dumbbell shape) Complementary binding site '-' second target gene binding site 'structure in the 2 template.
  • the second flow path may be coated to have a functional group capable of binding with the primer.
  • the primer may also be modified to have a functional group capable of binding to a functional group on the second flow path.
  • One end of the primer can be modified to have various functional groups, for example thiol, amine, hydroxyl, carboxyl, isothiocyanate, NHS Esters, aldehydes, epoxides, carbonates, HOBt esters, glutaraldehyde, carbamate, imidazole carbamate, maleimide, aziri From the group consisting of aziridine, sulfone, vinylsulfone, hydrazine, phenyl azide, benzophenone, anthraquinone, and diene groups
  • the terminal may be modified by more than one selected.
  • the template is formed by separating the complementary to the pathogen gene (complementary to pathogen) at both ends of the template, the complementary binding site in the template to form a dumbbell form (complementary region to make dumbbel shape) is formed adjacent to the binding site complementary to the pathogen gene of the both ends, and the binding site (primer binding region) complementary to the primer (primer binding region) forms the dumbbell shape It is formed between complementary binding sites in the template (see A in FIG. 2).
  • the detection composition may be a high salt solution to increase the agglomeration of the amplified gene product to help the human eye by causing a change in turbidity or precipitation.
  • the high salt solution is an inorganic salt solution, for example, magnesium chloride (MgCl 2 ) aqueous solution, ammonium chloride (NH 4 Cl) aqueous solution, ammonium acetate aqueous solution (NH 4 OA C ), sodium chloride (NaCl) aqueous solution, ammonium sulfate ((NH 4 ) 2 SO 4 ) It may be an aqueous solution containing an aqueous solution, or a neutral amino acid solution, but is not limited thereto.
  • the microfluidic device of the present invention may be able to visually identify the amplified gene product of the target gene.
  • the detection may be visually identified from the point that the amplified gene products are entangled with each other to form a hydrogel or change in turbidity.
  • the method may further comprise the step of injecting (S5) dyeing reagent, high salt solution, or fluorescent reagent.
  • the detection composition may be a gel red (staining reagent) or streptavidin beads (Streptavidin bead) strongly binding to biotin.
  • the detection composition may be a high salt solution such as MgCl 2 , NH 4 Cl.
  • FIG. 1 is a plan view (left) and a perspective view (right) of the microfluidic device for detecting a target gene of the present invention.
  • FIG. 3 is a view showing a method of manufacturing a microfluidic device for detecting a target gene of the present invention and a method of detecting a target gene using the same.
  • A, B, C, D, E, and F each mean each step of the method.
  • the microfluidic device for detecting a target gene of the present invention comprises a substrate 100; An inlet 101 through which the sample solution formed on the substrate is introduced from the outside; A first flow path 102 connected to the inlet to receive the sample solution introduced therein; A second flow path 103 connected to the first flow path; An outlet 104 connected to the second flow path.
  • the second flow passage 103 may be branched into two or more (for example, three) connected to the first flow passage.
  • the microfluidic device for detecting a target gene of the present invention comprises a primer fixed on the second flow path; And a template complementarily bound to the primer. Referring to FIG.
  • a microfluidic device for detecting a target gene (a microfluidic device ⁇ 1 III 3in1 uncoated Microscopy Chamber (ibidi) for preparing a pathogen gene detection device) ⁇ was prepared.
  • the second flow path 103 is connected to the first flow path may be divided into two or more (for example, three).
  • Step 3 immobilizing (combining) primers capable of binding to the template on the coated second flow path
  • Primer-5SS-polyA9 (BIONEER) (SEQ ID NO: 9) was used as a primer.
  • Example 2-2 Method for producing microfluidic device for detecting two or more target genes ⁇ Method for producing microfluidic device for detecting two or more pathogens (Bacillus anthracis and Ebola virus) genes ⁇
  • a template is applied to the second flow path 103 through each outlet 104 so that the primers and the respective templates fixed on the branched second flow path 103 can be fixed to each other. It was. Negative Control was used without the addition of a template. Specifically, a template (Template_E) for Ebola virus is added to the second flow path (the middle branch of the second flow path of FIG. 1) of the second flow path having three branches, and the third flow path (the left side of the second flow path of FIG. 1) is added. Branch) was added a template (Template_B_A) for Bacillus anthracis, the first flow path was used as a negative control.
  • Example 3-1 Method for detecting target gene using microfluidic device for single target gene detection ⁇ Method for detecting single target pathogen (Bacillus anthracis) gene using microfluidic device for single target gene detection ⁇
  • Gel red As the detection composition, 50 ⁇ l of Gel red (GelRed TM / Biotium) 1: 1000 dilution (diluted with DDW (Water Purification System / LABOGENE)) was added through the inlet. Gel red (GelRed TM / Biotium) 1: 200 dilution flowed through the first flow passage into the second flow passage.
  • the dilution factor of Gel red (GelRed TM / Biotium) is usually diluted to 1: 10000, but is controlled to see the color visually.
  • red lines in the second passage were a DNA membrane, and it was found that the amplified target gene product could be detected using a dyeing reagent such as gel red as a detection composition.
  • the imager (Gel Doc TM EZ (Bio-rad)) showed that the flow was blocked in the second flow path in the microfluidic device for detecting a single target gene.
  • This allows the use of a single flow gene detection device for detecting single target genes of the present invention without the use of a device such as a thermo cycler and without special temperature changes. For example, it was confirmed that the detection of a single pathogen (Bacillus anthracis) gene is possible with the naked eye.
  • samples ⁇ Pathogen_BA SEQ ID NO: 12
  • Pathogen_E SEQ ID NO: 13
  • Sample solutions were prepared with Pathogen_B_A 100 in 1 ⁇ PBS.
  • a sample solution was prepared with Pathogen_E 100 in 1X PBS.
  • the target gene (gene of the pathogen) present in the sample can be complementarily combined with a specific template to form an annular template (see FIG. 3C).
  • the hybridization step is performed in the same manner except that Template_E (SEQ ID NO: 11) is used instead of Template_BA (SEQ ID NO: 10) and Template_E_Not Phosp (SEQ ID NO: 15) is used instead of Pathogen_BA_Not Phosp (SEQ ID NO: 14). It was.
  • the second channel on the right side binds the template for the MERS virus to the primer fixed on the second channel, and adds the target MERS gene which binds to the template, so that rotational amplification always occurs. It was made.
  • the second flow path on the left side was used as a positive control (PC).
  • FIG. 13 a schematic diagram of a process occurring in the microfluidic device having three second flow paths of a negative control group, a sample group, and a positive control group is shown in FIG. 13.

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Abstract

본 발명은 표적 유전자를 증폭시켜 유로를 선택적으로 막음으로써 육안으로 식별이 가능한 표적 유전자, 특히 병원균 유전자를 검출하는 미세 유동 장치 및 이를 이용한 검출 방법을 제공한다. 따라서 본 발명은 복잡한 기계 장치 없이도 단일 표적 유전자, 예컨대 단일 병원균 또는 동시에 여러 표적 유전자, 예컨대 여러 병원균을 간편하게 검출 할 수 있다.

Description

표적 유전자 검출용 미세 유동 장치, 이의 제조방법 및 이를 이용한 검출 방법
본 발명은 표적 유전자 검출용 장치, 이의 제조방법 및 이를 이용한 검출 방법에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 유전자 검출을 통한 다양한 병원균을 검출하기 위한 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 검출 방법에 관한 것이다.
보다 상세하게 본 발명은 표적 유전자를 증폭시켜 미세 유동 장치의 유로를 선택적으로 막음으로써 표적 유전자 검출이 육안으로 식별이 가능한 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치, 이의 제조방법 및 이를 이용한 표적 유전자를 검출하는 방법에 관한 것이다.
본 연구는 대한민국 미래창조과학부의 재정지원을 받은 한국연구재단의 바이오의료기술개발사업 및 도약연구자지원사업, 보건복지부의 재정지원을 받은 한국보건산업진흥원의 보건의료기술연구개발사업의 지원을 받아 수행되었다.
지금까지 유전자를 검출하는 기술은 PCR 방법을 기초로 하는 방법들이 보고되어 왔다. 직접 PCR을 이용한 SDT/RT-PCR (simple-direct tube RT-PCR) 방법 및 PCR 반응을 저해시키는 요소를 제거하고 민감도를 높이기 위해서 면역학적 방법을 결합한 IC/RT-PCR (Immunocapture RT-PCR) 등이 개발되어 유전자 검출에 이용되어 왔다.
특히, 병원균 감염으로 인한 질병에 초기 대처 및 질병의 진행, 확산을 막기 위해서는 병원균의 감염 여부를 신속하고 정확하게 진단하는 것이 필요하다. 감염 후 증상이 나타나기 전인 잠복기 때 병원균을 진단할 수 있다면 전염병의 확산을 효과적으로 예방하여 큰 피해를 막을 수 있다.
현재까지 개발된 방법들은 병원균의 진단을 위한 배양과 검출에 많은 시간과 인력이 소모되고 감염여부 판단의 정확도가 떨어지는 문제점이 있을 뿐 아니라, 열순환기(Thermal cycler) 장치를 비롯하여 외부로부터 전원공급이 요구되는 기계 또는 장치를 필요로 하고, 동시에 여러 병원균에 대해 검출하기가 어렵다는 문제점이 있다.
PCR 키트를 이용한 진단 방법의 경우, Thermal cycler 장치를 필수적으로 필요로 할 뿐만 아니라, PCR을 하는 경우 각각의 사이클링 온도, 시간, 완충액의 조건 등을 일치시키기 어려우므로 다수의 병원균을 한 번에 검출하기 어렵다는 문제점이 있다.
이에, 검출 비용과 시간을 절감하면서도 간편하고 정확하게 병원균 등의 표적 유전자를 검출할 수 있는 방법의 개발이 요구되고 있다.
(선행기술문헌) 국내공개특허 제2010-0053831호
본 발명의 목적은 외부로부터 전원 공급이나 열순환기(thermal cycler) 장치를 비롯한 특별한 장치 없이 어떠한 환경에서도 간편하고 정확하게 표적 유전자를 검출할 수 있는 표적 유전자 검출 미세 유동 장치, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 검출 방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 표적 유전자 검출 미세 유동 장치, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 검출 방법을 제공한다. 이하에서는 각각의 발명에 대하여 상세히 살펴본다.
표적 유전자 검출을 위한 미세 유동 장치
본 발명의 일 구체예에 따르면,
기판;
상기 기판 상에 형성된 시료용액이 외부로부터 유입되는 유입구;
상기 시료 유입구와 연결되어 유입된 시료용액을 수용하는 제 1 유로;
상기 제 1 유로와 연결된 제 2 유로;
상기 제 2 유로와 연결된 배출구;
상기 제 2 유로 상의 코팅;
상기 제 2 유로의 코팅 상에 고정된 프라이머; 및
상기 프라이머에 상보적으로 결합된 템플레이트를 포함하고,
상기 템플레이트는 표적 유전자와 상보적으로 결합하는 결합 부위, 상기 프라이머에 상보적으로 결합하는 결합 부위, 덤벨 형태를 형성하기 위한 템플레이트 내 상보적인 결합 부위를 포함하고,
상기 표적 유전자와 상보적으로 결합하는 결합부위는 템플레이트의 양 말단에 분리되어 형성되고, 상기 프라이머에 상보적으로 결합하는 결합 부위는 분리되어 형성된 상기 덤벨 형태를 형성하기 위한 템플레이트 내 상보적인 결합 부위 사이에 형성된 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치를 제공한다.
즉, 다른 말로 설명하면, 본 발명의 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치는 기판, 유입구, 제 1 유로, 제 2 유로와 연결된 배출구를 포함하는 장치이다. 상기 장치의 제 2 유로는 코팅되어 있고, 코팅 상에는 프라이머가 고정되어 있고, 상기 고정된 프라이머에는 템플레이트(표적 유전자 검출용 템플레이트)가 결합되어 있다. 상기 템플레이트의 선형 구조는 ‘제 1 표적 유전자 결합부위’-‘(덤벨 형태를 형성하기 위한) 제 1 템플레이트 내 상보적인 결합 부위’-‘프라이머 결합부’-‘(덤벨 형태를 형성하기 위한) 제 2 템플레이트 내 상보적인 결합 부위’-‘제 2 표적 유전자 결합부위’구조이다. 즉, 상기 장치에 고정된 프라이머에, 템플레이트의 프라이머 결합부가 결합되어 있고, 상기 프라이머 결합부의 1 말단에는 ‘제 1 표적 유전자 결합부위’-‘(덤벨 형태를 형성하기 위한) 제 1 템플레이트 내 상보적인 결합 부위’가 존재하고, 다른 말단에는 ‘(덤벨 형태를 형성하기 위한) 제 2 템플레이트 내 상보적인 결합 부위’-‘제 2 표적 유전자 결합부위’가 존재하는 구조이다.
시료 내에 표적 유전자가 존재하는 경우, 표적 유전자는 템플레이트의 제 1 표적 유전자 결합부위와 제 2 표적 유전자 결합부위에 동시에 결합한다. 그러면 제 1 템플레이트 내 상보적인 결합 부위와 제 2 템플레이트 내 상보적인 결합 부위가 서로 가까워져 상보적 결합을 형성하게 된다. 따라서 템플레이트가 도 2B에서 관찰되는 바와 같은, 제 1 표적 유전자 결합 부위와 제 2 표적 유전자 결합 부위 사이에 닉(nick)이 존재하는 덤벨(dumbbell) 형태가 되는 것이다.
즉, 본 발명의 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치는
기판;
상기 기판 상에 형성된, 시료용액이 외부로부터 유입되는 유입구;
상기 시료 유입구와 연결되어 유입된 시료용액을 수용하는 제 1 유로;
상기 제 1 유로와 연결된 제 2 유로;
상기 제 2 유로와 연결된 배출구를 포함하는 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치로서,
상기 제 2 유로 표면은 코팅되어 있고;
상기 코팅 상에 프라이머가 고정되고;
상기 고정된 프라이머에는 표적 유전자 검출용 템플레이트가 결합되어 있으며,
상기 표적 유전자 검출용 템플레이트는 상기 프라이머에 상보적으로 결합하는 프라이머 결합부, 상기 프라이머 결합부의 일 말단에 결합된 제 1 템플레이트 내 상보적인 결합 부위-제 1 표적 유전자 결합 부위, 및 상기 프라이머 결합부의 다른 말단에 결합된 제 2 템플레이트 내 상보적인 결합 부위-제 2 표적 유전자 결합 부위를 포함하는, 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치이다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 제 2 유로는 제 1 유로와 연결되어 두 개 이상, 바람직하게는 2개 내지 20개로 분지되는 형상을 가질 수 있다. 상기 제 2 유로의 분지는 검출 대상인 표적 유전자에 대한 템플레이트의 수에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 표적 유전자 템플레이트가 2이면, 이에 대응하여 제2 유로의 분지의 수가 2 또는 표적 유전자 템플레이트 및 대조군을 포함하여 3일 수 있다. 예를 들어, 표적 유전자 템플레이트가 1이면, 이에 대응하여 제2 유로의 분지의 수가 1 또는 표적 유전자 템플레이트 및 대조군을 포함하여 2일 수 있다.
상기 시료 배출구는 제2 유로의 분지 수와 같을 수 있다. 예를 들어, 상기 시료 배출구는 제2 유로의 분지 수와 같이 두 개 이상, 바람직하게는 2개 내지 20개일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 제2 유로 상에 프라이머의 고정을 용이하게 하기 위하여 제2 유로는 프라이머와 서로 결합할 수 관능기를 가지도록 코팅될 수 있다. 상기 프라이머 역시 제2 유로 상의 관능기와 결합할 수 있는 관능기를 가지도록 변형될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 본 발명의 미세 유동 장치의 제2 유로는 파이로갈롤아민 (pyrogallol amine), 예컨대 5-하이드록시도파민 HCl(5-hydroxydopamine HCl)에 의해 코팅될 수 있다.
한 상기 프라이머의 말단은 다양한 관능기를 가지도록 변형될 수 있는데, 예를 들어, 티올(thiol), 아민(amine), 하이드록실(hydroxyl), 카복실(carboxyl), 이소티오시아네이트(isothiocyanate), NHS 에스테르, 알데히드(aldehyde), 에폭시드(epoxide), 카보네이트(Carbonate), HOBt 에스테르, 글루타르알데히드(Glutaraldehyde), 카바메이트(carbamate), 이미다졸 카바메이트(imidazole carbamate), 말레이미드(maleimide), 아지리딘(aziridine), 설폰(sulfone), 비닐설폰(vinylsulfone), 하이드라진(hydrazine), 페닐 아자이드(phenyl azide), 벤조페논(benzophenone), 안트라퀴논(anthraquinone), 및 디엔(Diene) 기로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상으로 말단이 변형될 수 있다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 제 2 유로의 코팅이 5-하이드록시도파민 염산이고, 상기 프라이머는 말단이 티올 또는 아민 기로 변형된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 템플레이트는 표적 유전자, 예컨대, 병원균 유전자의 길이, 프라이머의 길이 등을 고려하여 다양하게 길이와 서열을 디자인할 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 템플레이트의 길이는 40 내지 160 머(mer)일 수 있다. 본 발명에서 상기 템플레이트의 길이가 너무 짧으면 불안정하고 너무 길면 RCA 효율이 감소 할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 템플레이트는 병원균 유전자와 상보적으로 결합하는 결합부위(complementary to pathogen)가 템플레이트의 양 말단에 분리되어 형성되고, 덤벨 형태를 형성하기 위한 템플레이트 내 상보적인 결합 부위(complementary region to make dumbbel shape)가 상기 양 말단의 병원균 유전자와 상보적 결합하는 결합부위에 인접하여 분리되어 형성되고, 프라이머에 상보적으로 결합하는 결합 부위(primer binding region)는 상기 덤벨 형태를 형성하기 위한 템플레이트 내 상보적인 결합 부위 사이에 형성된다(도 2의 A 참조).
본 발명의 일 구체예에 따르면, 템플레이트는 10 내지 40 mer 길이의 표적 유전자와 상보적으로 결합하는 결합 부위, 10 내지 40 mer 길이의 프라이머에 상보적으로 결합하는 결합 부위, 20 내지 80 mer 길이의 덤벨 형태를 형성하기 위한 템플레이트 내 상보적인 결합 부위를 포함하는 총 40 내지 160 mer 길이의 템플레이트일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치에 주입되는 시료용액은 혈액, 타액, 소변 등의 생체 시료, 음식물, 또는 물공급원일 수 있으며, 수질 오염, 토양 오염 등을 분석하기 위한 물이나 토양 시료 등 다양한 시료용액이 될 수 있다.
또한, 다양한 시료용액에서 핵산 성분만을 추출한 용액을 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치에 주입할 수도 있다. 이 때 추출은 특정의 방법에 한정되지 않고, 페놀-클로로포름법 등의 액-액 추출법이나 담체를 이용하는 고액 추출법을 이용할 수 있다. 또한, 추출은 프로테이나제K/페놀 추출법, 프로테이나제K/페놀/클로로포름 추출법, 알칼리 용해법, 알칼리-SDS법 또는 용균효소법을 이용할 수 있다. 또한, 시판의 핵산추출 방법 QIAamp (QIAGEN사, 독일) 등을 이용하는 것도 가능하다. 예를 들어, 페놀, 페놀/클로로포름 혼합물을 이용할 수 있다.
본 발명에서 표적 유전자, 예컨대 핵산 서열 또는 분자는 단일 또는 이중 가닥일 수 있고 센스 또는 안티센스 가닥을 나타낼 수 있는 DNA 또는 RNA일 수 있다. 따라서 핵산 서열은 dsDNA, ssDNA, 혼합 ssDNA, 혼합 dsDNA, ssDNA(예컨대, 융해, 변성, 헬리케이즈 등에 의해)로 만들어진 dsDNA, A-, B-, 또는 Z-DNA, 삼중-가닥 DNA, RNA, ssRNA, dsRNA, 섞인 ssRNA 및 dsRNA, ssRNA(예컨대, 융해, 변성, 헬리케이즈 등을 통해)로 만들어진 dsRNA, 메신저 RNA(mRNA), 리보솜 RNA(rRNA), 전달 RNA(tRNA), 촉매 RNA, snRNA, 마이크로RNA, 또는 단백질 핵산(PNA)일 수 있다.
본 발명은 사용된 표적 유전자, 예컨대, 핵산(예컨대, 서열 또는 분자(예컨대, 표적 서열 및/또는 올리고뉴클레오티드))의 유형 또는 공급원에 의해 제한되지 않는다. 핵산 서열과 관련하여 사용될 때, 본 명세서에서 달리 나타내지 않는 한, 용어 "뉴클레오티드" 및 "염기"는 호환적으로 사용된다.
또한 본 발명은 상기 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치;
dNTP;
리가아제;
및 등온 핵산 중합효소를 포함하는, 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치 키트를 제공한다.
상기 키트에서, dNTP, 리가아제 및 등온 핵산 중합효소는 유전자 산물(핵산)을 증폭시키기 위한 증폭용 조성물에 포함될 수 있다. 상기 증폭용 조성물은 핵산을 증폭하기 위해 필요한 성분들을 모두 포함하는 혼합물을 의미하며, 핵산 중합효소(폴리머라제), 그의 활성 또는 반응에 필요한 완충액, 4종류의 dNTP, 보조인자, 및/또는 기질을 더 포함할 수 있다. 상기 핵산 중합효소는 DNA 중합효소, RNA 중합효소, 역전사 효소(reverse transcriptase) 및 이들의 조합일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 증폭용 조성물은 DNA 중합효소, 반응 완충용액, dNTPs를 포함하는 핵산 증폭용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 DNA 중합효소는 대장균 DNA 중합효소 I, 클레나우 단편, phi29 DNA 중합효소, vent DNA 중합효소, T4, T7 DNA 중합효소, 및 Taq 중합효소로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 완충용액(버퍼)은 NEB (New England Biolab) 완충용액 계열, 예를 들면 NEB 완충용액 4, Bst DNA 폴중합효소 완충용액, T4 DNA 리가아제 완충용액 T7 DNA 리가아제 완충용액등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치는 미세 유동 장치에 의해 검출되는 증폭된 유전자 산물의 하이드로겔의 형성 또는 탁도의 변화를 검출시킬 수 있는 검출용 조성물을 더 포함할 수 있다.
또한, 상기 검출용 조성물은 증폭된 유전자 산물의 육안 식별을 돕기 위한 염색시약으로서 색을 띄는 염색시약일 수 있으며, 예를 들어 겔 레드(Gel-red), 스트렙타아비딘 비드(Streptavidin bead), 트리판 블루 다이(trypane blue dye), 에반스 블루 다이(Evans Blue dye), 헤마톡실린-에오신 염색(hematoxylin-eosin stain), 크리스탈 바이올릿(crystal violet) 또는 메틸렌 블루(methylene blue)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 검출용 조성물은 증폭된 유전자 산물의 엉김을 증대시켜 탁도 변화 또는 침전을 일으켜서 육안 식별을 돕기 위한 것으로 고염용액(high salt solution)일 수 있다. 상기 고염 용액은 무기염 용액, 예를 들어, 염화마그네슘(MgCl2) 수용액, 염화암모늄(NH4Cl) 수용액, 아세트산암모늄 수용액(NH4OAC), 염화나트륨(NaCl) 수용액, 황산암모늄((NH4)2SO4) 수용액, 또는 중성아미노산 용액을 함유하는 수용액일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한 상기 검출용 조성물은 형광 시약일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 장치의 제2 유로의 직경은 증폭된 유전자 산물(덩어리)이 엉기어 막을 수 있는 크기일 수 있다. 일 구체예에서 상기 제2 유로의 직경은 1 μm 내지 5 mm의 크기일 수 있고, 다른 일 구체예에서 상기 제2 유로의 직경은 50 μm 내지 5 mm의 크기일 수 있다. 또한 일 구체예에서 제2 유로의 직경은 0.25 mm 내지 2 mm의 크기일 수 있고, 다른 일 구체예에서 0.5 mm 내지 1.5 mm의 크기일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 증폭된 유전자 산물(덩어리)은 약 직경 0.5 μm 내지 약 50 μm의 크기를 가질 수 있다. 또한, 본 발명의 일 구체예에서 상기 증폭된 유전자 산물(덩어리)은 서로 엉기어 하이드로겔을 형성하여 약 직경 50 μm 내지 5 mm의 크기를 가질 수 있다. 본 발명의 다른 일 구체예에서 상기 증폭된 유전자는 서로 엉기어 약 직경 0.25 mm 내지 2 mm의 크기일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 본 발명의 미세 유동 장치의 제2 유로의 표면은 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane), 금(Au), 금속 산화물(metal oxide)(SiO2, TiO2, Al2O3, 산화 인듐-주석(Indium-Tin Oxide)), 세라믹(ceramic), 합성 폴리머(synthetic polymer)(폴리카보네이트, 폴리우레탄, 환형 올레핀 공중합체(cyclic olefin copolymer), 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), 폴리스티렌, 폴리에틸렌) 중 어느 하나로 이루어질 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 코팅 물질은 하이드록시 벤젠류의 단분자 또는 고분자 코팅을 포함할 수 있다. 또한 상기 코팅 물질은 일례로 카테콜아민 고분자 코팅을 포함할 수 있다. 하이드록시 벤젠류의 단분자 또는 고분자는 뛰어난 표면 특성으로 인해 귀금속들, 금속 산화물들, 세라믹들, 및 합성 고분자들을 포함한 광범위한 소재에 용이하게 코팅될 수 있다. 상기 하이드록시 벤젠류의 단분자 및 고분자의 구체적인 예는 비제한적으로 도파민(dopamine), 5-하이드록시도파민 HCl(5-hydroxydopamine HCl), 노르에피네피린(norepinephrine), 에피네피린(epinephrine), 파이로갈롤아민(pyrogallol amine), DOPA(3,4-Dihydroxyphenylalanine), 카테킨 (catechin), 탄닌류(tannins), 파이로갈롤(pyrogallol), 파이로카테콜 (pyrocatechol), 헤파린-카테콜(heparin-catechol), 키토산-카테콜 (chitosan-catechol), 폴리에틸렌글리콜-카테콜(poly(ethylene glycol)-catechol), 폴리에틸렌이민-카테콜 (poly(ethyleneimine)-catechol), 폴리메틸메타크릴레이트-카테콜 (poly(methyl methacrylate)-catechol), 히알루론산-카테콜(hyaluronic acid-catechol) 등이 될 수 있다.
또한 상기 코팅 물질은 비닐 기(vinyl group)가 될 수 있다.
코팅 방법에는 제한이 없다. 예를 들어, 코팅용 조성물을 제조하고 이를 제 2 유로에 채움으로써 제 2 유로 표면이 코팅되도록 할 수 있다. 또 다른 예로서, 비닐 기 코팅을 증기증착 방식으로 제 2 유로에 코팅되도록 할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 본 발명의 미세 유동 장치는 육안으로 표적 유전자의 증폭된 유전자 산물의 식별이 가능할 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 검출은 증폭된 유전자 산물이 서로 엉기어 하이드로겔을 형성하거나 탁도가 변화는 점으로부터 육안으로 식별이 가능할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 검출하고자 하는 표적 유전자는 동물, 식물, 세균, 바이러스 또는 진균으로 얻어질 수 있다. 바람직하게는 세균, 바이러스 또는 진균 등 병원균으로부터 얻어질 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 검출하고자 하는 표적 유전자는 병원균 유전자일 수 있다. 상기 표적 유전자로는 핵산 서열을 아는 모든 병원균을 대상으로 할 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 병원균은 조류독감, 사스(SARS), 용혈성 요독 증후군(hemolytic uremic syndrome) 및 혈변(bloddy diarrhea)(Escherichia coli O157:H7), 결핵(Mycobacterium tuberculosis), 탄저병(Bacillus anthracis), 폐렴(Streptococcus pneumonia), 말라리아(Plasmodium), 살모넬라(Salmonella), 간염(Hepatitis A,B,C,D 및 E virus), 야토병균(Francisella tularensis), 페스트균(Yersinia pestis), 에르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica) 및 출혈열(Ebola virus), 메르스 코로나 바이러스(MERS-Cov virus)의 검출에 유용하다. 또한, 본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 병원균은 폐렴상구균, 장내구균, 포도상구균, 열대열원충 및 제 3세계에서의 결핵 또는 말라리아 박테리아와 같은 항생제 저항을 갖는 병원균의 검출에도 유용하다.
하기 표 1은 상기 본 발명의 일 구체예에 따른 검출 가능한 표적 유전자, 예컨대, 병원균의 종류, 서열 및 이와 상보적으로 결합할 수 있는 결합 부위를 포함하는 템플레이트의 서열을 예시적으로 나타낸다. (진한 글씨: 표적 병원균 유전자와 상보적으로 결합하는 부분, 이탤릭체: 템플레이트 내 상보적인 부분, 이탤릭체에 밑줄: 프라이머와 상보적으로 결합하는 부분)
표 1
병원균 종류 서열번호 템플레이트 서열 (5′ → 3′) 서열번호 병원균의 표적 유전자 서열
살모넬라 1 5’-포스페이트 - TG CTA TGC CGA CTC AAT CGA AGT ACT CAG CGT AAG TTT AGA GGC AT TA GCA TGC TAG TAT CGA CGT CCC ACG TAC CAA CAA CTT ACG CTG AGT ACT TCG ATT TG AGT G-3’ 5 5’-GAG TCG GCA TAG CAC ACT CA- 포스페이트-3’
에르시니아 엔테로콜리티카 2 5’-포스페이트 - GC TCA CCC CAG TAA AAT CGA AGT ACT CAG CGT AAG TTT AGA GGC AT TA GCA TGC TAG TAT CGA CGT CCC ACG TAC CAA CAA CTT ACG CTG AGT ACT TCG ATT AG CTT TAC-3’ 6 5’-TTA CTG GGG TGA GCG TAA AGC T- 포스페이트-3’
야토병균 3 5’-포스페이트 - TG TTT CCA GTA TTT AAT CGA AGT ACT CAG CGT AAG TTT AGA GGC AT T A GCA TGC TAG TAT CGA CGT CCC ACG TAC CAA CAA CTT ACG CTG AGT ACT TCG ATT TTT CCT CCG A- 3’ 7 5’-AAA TAC TGG AAA CAT CGG AGG AAA- 포스페이트-3’
페스트균 4 5’-포스페이트 - TC GAA TGC CAA CAA AAT CGA AGT ACT CAG CGT AAG TTT AGA GGC AT TA GCA TGC TAG TAT CGA CGT CCC ACG TAC CAA CAA CTT ACG CTG AGT ACT TCG ATT CTC TGA ACA- 3’ 8 5’-TTG TTG GCA TTC GAT GTT CAG AG-포스페이트-3’
이 경우 프라이머로는 템플레이트 서열에 상보적으로 결합할 수 있는 형태로 5’-Thiol-AAA AAA AAA GGG ACG TCG ATA CTA GCA TGC TA 3’(서열번호 9)을 사용할 수 있다.
하기 표 2는 본 발명의 상기 본 발명의 실시예 3에 따른 검출 가능한 표적 유전자, 예컨대, 병원균의 종류, 서열 및 이와 상보적으로 결합할 수 있는 결합 부위를 포함하는 템플레이트의 서열을 예시적으로 나타낸다.
표 2
병원균 종류 서열번호 템플레이트 서열 (5′ → 3′) 서열번호 병원균의 표적 유전자 서열
탄저균 10 5’-포스페이트 TTT GAA ATG GAG AAA ATC GAA GTA CTC AGC GTA AGT TTA GAG GTA GCA TGC TAG TAT CGA CGT ACG TAC CAA CTT ACG CTG AGT ACT TCG ATT TGA GCG-3’ 12 5’-TTC TCC ATT TCA AAC GCT CA 포스페이트-3’
에볼라 바이러스 11 5’-포스페이트 GA CGC ACG CG A ATC GAA GTA CTC AGC GTA AGT TTA GAG GTA GCA TGC TAG TAT CGA CGT ACG TAC CAA CTT ACG CTG A GT ACT TCG ATT AAC GAG AAA TCG CAC- 3’ 13 5’-CGC GTG CGT CGT GCG ATT TCT CGT T-포스페이트-3’
하기 표 3은 본 발명의 상기 본 발명의 실험예 5에 따른 검출 가능한 메르스 코로나 바이러스의 표적 유전자 서열 및 이와 상보적으로 결합할 수 있는 결합 부위를 포함하는 템플레이트의 서열을 나타낸다.
표 3
병원균 종류 서열번호 템플레이트 서열 (5′ → 3′) 서열번호 병원균의 표적 유전자 서열
메르스 코로나바이러스(MERS-CoV) 16 5’-5포스페이트/ AGG GCA CAT CTC CGA ATC GAA GTA CTC AGC GTA AGT TTA GAG GTA GCA TGC TAG TAT CGA CGT ACG TAC CAA CTT ACG CTG AGT ACT TCG ATT ATA CCC 3’ 17 5’-CG GAG AUG UGC CCU GGG UAU/3포스페이트-3’
본 발명의 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치를 이용하여 검출할 수 있는 병원균의 종류는 상기 기술한 것에 제한되지 않는다. 공지의 병원균의 유전자로부터 임의의 유전자 서열(pathogen sequence)을 선택하고, 상기 병원균의 유전자 서열에 닉(nick)을 사이에 두고 결합할 수 있는 서열을 2개 준비하여 각각 템플레이트의 표적 유전자 결합부위 서열(제 1 표적 유전자 결합부위, 및 제 2 표적 유전자 결합부위)로 할 수 있다. 이와 같은 방법으로 템플레이트의 표적 유전자 결합부위 서열만을 교체하여 매우 다양한 병원균의 유전자를 검출할 수 있는 표적 유전자 미세 유동 장치를 제조할 수 있다.
본 발명의 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치는 육안으로도 병원균의 존재를 충분히 식별할 수 있으나, 사용 목적에 따라 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명의 필수적 특징을 변경하지 않고 다양한 구체적인 형태로 실시할 수 있다. 이러한 예로, 당업자는 사용 목적에 따라 본 발명의 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치의 검출 민감도를 증가시키기 위해 추가로, 전극 사이의 전류, 전압, 전위차, 저항변화 등을 측정하는 전기화학센서, 자외선, 가시광, 형광, 적외선, 라만 등의 다양한 광원을 이용하는 광학센서, 금속, 세라믹, 고분자 등의 소재를 활용한 나노센서, 또는 효소, 항원, 항체 등의 생체 감지 물질을 이용한 바이오센서를 포함하여 실시할 수도 있다.
미세 유동 장치를 제조하는 방법
본 발명의 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치를 제조하는 방법은 다음 단계를 포함할 수 있다:
(S1) 기판, 상기 기판 상에 형성된 외부로부터 유입되는 유입구, 상기 유입구와 연결되어 유입된 시료용액을 수용하는 제 1 유로, 상기 제 1 유로와 연결된 제 2 유로, 상기 제 2 유로와 연결된 배출구를 포함하는 미세 유동 장치를 제공하는 단계;
(S2) 상기 미세 유동 장치의 제2 유로를 코팅하는 단계;
(S3) 상기 코팅된 제 2 유로 상에 템플레이트와 결합할 수 있는 프라이머를 고정화하는 단계; 및
(S4) 표적 유전자와 상보적으로 결합하는 결합 부위, 상기 프라이머에 상보적으로 결합하는 결합 부위, 덤벨 형태를 형성하기 위한 템플레이트 내 상보적인 결합 부위를 포함하는 템플레이트를 상기 프라이머에 결합시키는 단계,
여기서, 상기 표적 유전자와 상보적으로 결합하는 결합부위는 템플레이트의 양 말단에 분리되어 형성되고, 상기 프라이머에 상보적으로 결합하는 결합 부위는 분리되어 형성된 상기 덤벨 형태를 형성하기 위한 템플레이트 내 상보적인 결합 부위 사이에 형성된다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 본 발명의 미세 유동 장치의 제2 유로의 표면은 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane), 금(Au), 금속 산화물(metal oxide)(SiO2, TiO2, Al2O3, 산화 인듐-주석(Indium-Tin Oxide)), 세라믹(ceramic), 합성 폴리머(synthetic polymer)(폴리카보네이트, 폴리우레탄, 환형 올레핀 공중합체(cyclic olefin copolymer), 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), 폴리스티렌, 폴리에틸렌) 중 어느 하나로 이루어질 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 (S2) 상기 미세 유동 장치의 제2 유로를 코팅하는 단계에서 제2 유로를 코팅하는 물질은 물 액적의 이동을 돕기 위해 친수성 물질로 코팅될 수 있고, 제2 유로 상에 프라이머를 고정할 수 있는 관능기를 가지는 다양한 물질일 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, 제2 유로 상에 프라이머의 고정을 용이하게 하기 위하여 제2 유로는 프라이머와 서로 결합할 수 관능기를 가지도록 코팅될 수 있다. 상기 프라이머 역시 제2 유로 상의 관능기와 결합할 수 있는 관능기를 가지도록 변형될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 제2 유로를 코팅하는 물질은 하이드록시 벤젠류의 단분자 또는 고분자 코팅을 포함할 수 있다. 또한 상기 코팅 물질은 일례로 카테콜아민 고분자 코팅을 포함할 수 있다. 하이드록시 벤젠류의 단분자 또는 고분자는 뛰어난 표면 특성으로 인해 귀금속들, 금속 산화물들, 세라믹들, 및 합성 고분자들을 포함한 광범위한 소재에 용이하게 코팅될 수 있다. 상기 하이드록시 벤젠류의 단분자 및 고분자의 구체적인 예는 비제한적으로 도파민(dopamine), 5-하이드록시도파민 HCl(5-hydroxydopamine HCl), 노르에피네피린(norepinephrine), 에피네피린(epinephrine), 파이로갈롤아민(pyrogallol amine), DOPA(3,4-Dihydroxyphenylalanine), 카테킨 (catechin), 탄닌류(tannins), 파이로갈롤(pyrogallol), 파이로카테콜 (pyrocatechol), 헤파린-카테콜(heparin-catechol), 키토산-카테콜 (chitosan-catechol), 폴리에틸렌글리콜-카테콜(poly(ethylene glycol)-catechol), 폴리에틸렌이민-카테콜 (poly(ethyleneimine)-catechol), 폴리메틸메타크릴레이트-카테콜 (poly(methyl methacrylate)-catechol), 히알루론산-카테콜(hyaluronic acid-catechol) 등이 될 수 있다. 또는 비닐 기 역시 코팅을 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 본 발명의 미세 유동 장치의 제2 유로는 파이로갈롤아민 (pyrogallol amine), 예컨대 5-하이드록시도파민 HCl(5-hydroxydopamine HCl)에 의해 코팅될 수 있다.
미세 유동 장치를 이용한 병원균 유전자 검출을 위한 검출 방법
본 발명의 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치를 이용하여 표적 유전자를 검출하는 방법은 다음 단계를 포함할 수 있다:
(S1) 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치를 제공하는 단계;
(S2) 제 1 유로에 시료용액을 유입시키는 단계; 및
(S3) 상기 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치의 제 2 유로에 dNTP, 리가아제, 및 등온 핵산 중합효소를 첨가하는 단계.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 방법은 (S4) 증폭된 유전자 산물이 엉기어 직경 50 μm 내지 5 mm의 크기를 가지는 하이드로겔이 제 2 유로 및 배출구에 형성되는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 템플레이트는 병원균 유전자의 길이, 프라이머의 길이 등을 고려하여 다양하게 길이와 서열을 디자인할 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 템플레이트의 길이는 40 내지 160 머(mer)일 수 있다. 본 발명에서 상기 템플레이트의 길이가 너무 짧으면 불안정하고 너무 길면 RCA 효율이 감소 할 수 있다.
본 발명에서 프라이머는 제2 유로 상에 템플레이트를 고정하는 프라이머로서 의미와 유전자를 증폭시키기 위한 개시 물질로서 프라이머를 모두 의미한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치의 템플레이트가 덤벨형(dumbbell shape)을 형성할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 (S3) 단계에서 dNTP, 리가아제, 및 등온 핵산 중합효소를 첨가하면, 시료용액 내에 표적 유전자가 존재하는 경우 회전환 증폭이 일어난다. 즉, 템플레이트에 표적 유전자와 상보적으로 결합하는 결합 부위에 표적 유전자가 결합하면, 템플레이트가 덤벨 형태를 형성하고, 등온 핵산 중합효소(polymerase)에 의한 증폭이 일어날 수 있다. 상기 RCA 방법은 실온, 예컨대, 15℃ 내지 35℃, 바람직하게는 25℃ 내지 35℃의 온도에서 증폭될 수 있으며, 일 구체예에서 30℃에서 일어날 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 회전환 증폭에 의해 증폭된 산물은 세 개의 다리를 가진 둥근 형태의 엉킨 단일가닥의 RCA 산물을 만들 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 증폭된 유전자는 엉킨 단일가닥의 유전자 산물을 형성할 수 있다. 도 2를 참조하면, 증폭된 표적 유전자 산물은 후크(hook) 모양의 둥근 부분과 일정한 길이를 가지는 벨크로(velcro)가 연속된 형태의 엉킨 단일가닥을 형성할 수 있다. 상기 일정한 길이는 0.5 μm 내지 50 μm 크기일 수 있다. 상기 전체적으로 증폭된 표적 유전자 산물은 둥근 원형과 일정한 길이를 갖는 다리를 가진 삼발이 형태일 수 있다.
또한, 본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 엉킨 단일가닥의 산물은 하이드로겔을 형성할 수 있다.
또한, 상기 RCA 방법에 의한 증폭 및 하이드로겔 형성의 반응은 3 시간 이상에서 일어날 수 있으며, 일 구체예에서 반응시간은 3시간일 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에 따르면, 상기 방법은 (S5) 염색 시약, 고염 용액(high salt solution), 또는 형광 시약을 주입하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 염색 시약, 고염 용액, 또는 형광 시약은 검출을 보다 용이하게 하는 작용을 하며, 겔 레드(Gel-red), 스트렙타아비딘 비드(Streptavidin bead), 트리판 블루 다이(trypane blue dye), 에반스 블루 다이(Evans Blue dye), 헤마톡실린-에오신 염색(hematoxylin-eosin stain), 크리스탈 바이올릿(crystal violet), 메틸렌 블루(methylene blue), 염화마그네슘(MgCl2) 수용액, 염화암모늄(NH4Cl) 수용액, 아세트산암모늄(NH4OAC) 수용액, 염화나트륨(NaCl) 수용액, 황산암모늄((NH4)2SO4) 수용액, 또는 중성아미노산 용액 중 어느 하나일 수 있다. 예를 들어, 염색시약인 겔 레드(Gel Red) 또는 바이오틴과 강하게 결합하는 스트렙타아비딘 비드(Streptavidin bead)일 수 있다. 또한, 상기 검출용 조성물은 MgCl2, NH4Cl과 같은 고염 용액(high salt solution)일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 시료 유입구에 검출 대상인 시료용액이 로딩되어 이는 제 1 유로 및 제 2 유로를 통해 흐를 수 있다.
본 발명은 외부로부터 광원, 전기 에너지 등에 영향을 받지 않고 실온에서 특별한 장치 없이 단일 표적 유전자, 예컨대 단일 병원균 또는 동시에 여러 표적 유전자, 예컨대 여러 병원균을 간편하게 검출 할 수 있다.
따라서 본 발명은 병원균 검출을 위한 장치의 제조에 드는 시간, 비용이 경제적이고, 휴대가 가능하며, 고가의 검출 장비 없이도 신속한 진단이 가능하다.
따라서 본 발명은 제3세계에서 결핵 또는 말라리아 등의 병원균의 진단, 또는 세계를 위협하는 다양한 전염성 질병(예컨대 에볼라 바이러스, 메르스 바이러스)의 진단뿐 아니라, 생물학 무기 테러 및 환경오염과 관련된 병원균에 대하여도 신속하고 간편한 검출이 가능하여 현업에서 이용가능성이 높다.
도 1은 본 발명의 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치의 평면도(좌) 및 사시도(우)이다.
도 2는 본 발명의 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치를 이용하여 표적 유전자를 검출하는 방법을 나타내는 도이다. A, B, C, D, E는 각각 상기 방법의 각 단계를 의미한다.
도 3은 본 발명의 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치의 제조방법 및 이를 이용하여 표적 유전자를 검출하는 방법을 나타내는 도이다. A, B, C, D, E, F는 각각 상기 방법의 각 단계를 의미한다.
도 4는 탄저균(Bacillus anthracis)에 대한 템플레이트(Template_B_A)에 의한 튜브 내에서의 라이게이션을 확인한 전기영동 결과를 나타낸다.
도 5는 실험예 2의 (1)에서 탄저균(Bacillus anthracis)에 대한 템플레이트(Template_B_A)에 의한 튜브(tube) 내에서의 RCA 산물(product)을 확인한 SEM 사진이다.
도 6는 실험예 2의 (2)에서 에볼라 바이러스에 대한 템플레이트(Template_E)에 의한 튜브 내에서의 RCA 산물을 확인한 SEM 사진이다.
도 7a는 에볼라 바이러스에 대한 템플레이트(Template_E)에 의한 하이드로겔 형성을 확인한 tube 내에서의 결과이고, 도 7b는 회전점도계로 측정한 점도에 대한 그래프를 나타낸다.
도 8a는 미세 유동 장치의 제 2 유로를 코팅하지 않고 프라이머를 고정시킨 경우 회전환 증폭 결과의 AFM 이미지이고, 도 8b는 5-히드록시도파민 염산으로 제 2 유로를 코팅하고 프라이머를 고정시킨 후 확인한 회전환 증폭 결과의 AFM 이미지를 나타낸다.
도 9a는 본 발명의 미세 유동 장치를 이용한 Bacillus anthracis 검출 결과를 나타낸 사진이고, 도 9b는 이를 Imager(Gel Doc™ EZ(Bio-rad))로 확인한 결과를 나타낸 사진이다.
도 10a는 본 발명의 미세 유동 장치를 이용한 Bacillus anthracis 및 Ebola virus의 동시 검출 결과를 나타낸 사진이고, 도 10b는 이를 Imager(Gel Doc™ EZ(Bio-rad))로 확인한 결과를 나타낸 사진이다.
도 11은 본 발명의 미세 유동 장치를 이용한 Bacillus anthracis 및 Ebola virus의 streptavidin을 이용한 검출 결과를 나타낸다.
도 12는 본 발명의 미세 유동 장치의 프라이머에 결합된 템플레이트에서 닉(nick)의 라이게이션 및 RCA가 일어나는 과정을 구체적으로 나타낸 모식도이다. (A), (B), (C), (D)는 각각 상기 방법의 각 단계를 의미한다.
도 13은 실험예 5에서와 같이 제 2 유로가 3개(음성 대조군, 시료군, 및 양성 대조군)가 되도록 제작한 본 발명의 미세 유동 장치를 이용하여 표적 유전자를 검출하는 방법을 나타낸 모식도이다.
도 14는 표적 메르스 유전자 검출용 미세 유동 장치를 이용하여 메르스 바이러스를 검출한 결과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 도면을 참조하여 실시예에 대해 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니며 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 또한, 도면들에 있어서, 구성요소의 폭, 길이, 두께 등은 편의를 위하여 과장되어 표현될 수도 있다. 명세서 전체에 걸쳐서 동일한 참조번호들은 동일한 구성요소들을 나타낸다. 또한, 일 구성요소가 다른 구성요소 위에 있다고 할 때, 이는 다른 구성요소 바로 위에 있는 경우 뿐 아니라, 그 중간에 또 다른 구성요소가 있는 경우도 포함한다.
<제조예 1> 템플레이트 제조
(1) Template_BA의 제조
Bacillus anthracis의 병원균 유전자 서열을 바탕으로 Bacillus anthracis에 특이적인 템플레이트(Template_BA), 즉, Bacillus anthracis에 특이적으로 결합하는 템플레이트(Template_BA)(서열번호 10)를 제조하였다(Integrated DNA Technology, San Jose, CA, USA). Template_BA는 다음과 같이 표적 유전자(Bacillus anthracis의 병원균 유전자)와 상보적으로 결합하는 결합 부위, 즉 병원균의 상보적 부위(Pathogen complementary site) (20 mer, 흰 바탕에 진한 글씨), 덤벨 형태를 형성하기 위한 템플레이트 내 상보적인 결합 부위, 즉, 템플레이트 내 상보적인 영역(21 mer ×2, 총 42 mer, 이탤릭체), 상기 프라이머에 상보적으로 결합하는 결합 부위, 즉, 프라이머 고정화 영역(Primer immobilization region) (37 mer)으로 구성되며, 이 중 프라이머에 상보적으로 결합하는 결합 부위를 이탤릭체에 밑줄로 나타내었다.
5′/5Phos/TTT GAA ATG GAG AA A ATC GAA GTA CTC AGC GTA AGT TTA GAG G TA GCA TGC TAG TAT CGA CGT ACG TAC CAA CTT ACG CTG AGT ACT TCG ATT TGA GCG-3’
(2) Template_E의 제조
에볼라 바이러스의 병원균 유전자 서열을 바탕으로 에볼라 바이러스s에 특이적인 템플레이트(Template_E), 즉, Ebola virus에 특이적으로 결합하는 템플레이트(Template_E)(서열번호 11)를 제조하였다. Template_E는 표적 유전자(Ebola virus의 병원균 유전자)와 상보적으로 결합하는 결합 부위, 즉 병원균의 상보적 부위(Pathogen complementary site) (25 mer, 흰 바탕에 진한 글씨), 덤벨 형태를 형성하기 위한 템플레이트 내 상보적인 결합 부위, 즉, 템플레이트 내 상보적인 영역 (21 mer×2, 총 42 mer, 이탤릭체), 상기 프라이머에 상보적으로 결합하는 결합 부위, 즉, 프라이머 고정화 영역(Primer immobilization region) (37 mer)로 구성되며, 이 중 프라이머에 상보적으로 결합하는 결합 부위를 이탤릭체에 밑줄로 나타내었다.
5′/5Phos/GA CGC ACG CG A ATC GAA GTA CTC AGC GTA AGT TTA GAG G TA GCA TGC TAG TAT CGA CGT ACG TAC CAA CTT ACG CTG A GT ACT TCG ATT AAC GAG AAA TCG CAC- 3’
<실시예 1> 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치
본 발명의 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치의 구성의 일 구체예를 도 1 내지 3을 참조하여 설명한다.
도 1을 참조하면, 본 발명의 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치는 기판(100); 기판 위에 형성된 시료용액이 외부로부터 유입되는 유입구(101); 유입구와 연결되어 유입된 시료용액을 수용하는 제 1 유로(102); 제 1 유로와 연결된 제 2 유로(103); 제 2 유로와 연결된 배출구(104)를 포함한다. 상기 제 2 유로(103)는 제 1 유로와 연결되어 두 개 이상(예를 들어, 세 개로)으로 분지될 수 있다. 도 3을 참조하면, 본 발명의 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치는 상기 제 2 유로 상에 고정된 프라이머; 및 상기 프라이머에 상보적으로 결합된 템플레이트를 포함한다. 도 2를 참조하면, 상기 템플레이트는 표적 유전자와 상보적으로 결합하는 결합 부위(예를 들어, complementary to pathogen), 상기 프라이머에 상보적으로 결합하는 결합 부위(primer binding region), 덤벨 형태를 형성하기 위한 템플레이트 내 상보적인 결합 부위(dumbbel shape template)를 포함한다. 또한, 상기 표적 유전자와 상보적으로 결합하는 결합부위는 템플레이트의 양 말단에 분리되어 형성되고, 상기 프라이머에 상보적으로 결합하는 결합 부위는 분리되어 형성된 상기 덤벨 형태를 형성하기 위한 템플레이트 내 상보적인 결합 부위 사이에 형성된다. 즉, 도 2의 A에 도시된 바와 같이, 상기 템플레이트의 선형 구조는 ‘제 1 표적 유전자 결합부위’-‘제 1 템플레이트 내 상보적인 결합 부위’-‘프라이머 결합부’-‘제 2 템플레이트 내 상보적인 결합 부위’-‘제 2 표적 유전자 결합부위’구조이다. 도 12의 A에 도시된 바와 같이, 상기 제 2 유로 상에 고정된 프라이머에, 상기 템플레이트의 프라이머 결합부가 상보적으로 결합한 상태로 있게 된다.
제2 유로 상에 프라이머의 고정을 용이하게 하기 위하여 제2 유로는 프라이머와 서로 결합할 수 관능기를 가지도록 코팅될 수 있다. 상기 프라이머 역시 제2 유로 상의 관능기와 결합할 수 있는 관능기를 가지도록 변형될 수 있다.
<실시예 2> 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치(병원균 유전자 검출용 장치)의 제조
실시예 2-1. 단일 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치의 제조방법{단일 병원균(Bacillus anthracis) 유전자 검출용 미세 유동 장치의 제조방법}
1단계 : 미세 유동 장치를 제공하는 단계
본 발명의 일 실시예로 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치(병원균 유전자 검출용 장치를 제조하기 미세 유동 장치{1 Ⅲ 3in1uncoated Microscopy Chamber (ibidi)}를 준비하였다. 본 발명의 미세 유동 장치는 기판(100); 기판 위에 형성된 시료용액이 외부로부터 유입되는 유입구(101); 유입구와 연결되어 유입된 시료용액을 수용하는 제 1 유로(102); 제 1 유로와 연결된 제 2 유로(103); 제 2 유로와 연결된 배출구(104)를 포함한다(도 1 참조). 상기 제 2 유로(103)는 제 1 유로와 연결되어 두 개 이상(예를 들어, 세 개로)으로 분지될 수 있다.
2단계 : 미세 유동 장치의 제2 유로를 코팅하는 단계
5-히드록시도파민 염산(5-hydroxydopamine HCl)(Sigma Aldrich)을 1mg/ml로 10mM Tris buffer(1M UltraPure 1M Tris-HCl pH 8.0 / Invitrogen)에 녹였다. 그 후 pH를 8로 맞추어 코팅용 조성물을 제조하였다. 상기 코팅용 조성물로 장치(1 Ⅲ 3in1uncoated Microscopy Chamber (ibidi))의 제 2 유로를 채웠다. 2시간 후 DDW(Water Purification System / LABOGENE)로 세척(washing) 하였다.
3단계 : 상기 코팅된 제 2 유로 상에 템플레이트와 결합할 수 있는 프라이머를 고정화하는(결합시키는) 단계
프라이머로는 Primer-5SS-polyA9 (BIONEER)(서열번호 9)를 사용하였다.
상기 프라이머 100pmol과 5M DTT(DL-Dithiothreitol/Sigma Aldrich)를 준비한 후, 100pmol 프라이머에 5M DTT 5㎕ 더한 후, 총 50㎕가 되게 DDW(Water Purification System / LABOGENE)를 추가하였다. 프라이머의 이황화 결합(disulfide bond)을 끊기 위해(broken) DDT 처리를 4시간동안 진행 후 3K 아미콘 튜브(amicon tube)(Amicon Ultra Centrifugal Filters 3K / MILLIPORE)를 이용하여 반응 후 남아있는 DTT를 제거하였다(eppendorf Centrifuge 5415R) (132,000 rpm, 4℃, 25분에서 1회 원심분리 이후 40㎕ DDW를 넣고 다시 132,000 rpm, 4℃, 25분에서 원심분리하여 DTT를 깨끗하게 제거하기 위해 총 2번 원심분리 하였다). DTT를 제거하고 남은 용액을 3개의 분지를 갖는 각각의 제 2 유로(channel)(103)에 5㎕(1번 유로; 도 1의 제2 유로의 왼쪽 분지), 5㎕(2번 유로; 도 1의 제2 유로의 가운데 분지), 5㎕(3번 유로; 도 1의 제2 유로의 오른쪽 분지) 차례대로 넣고 2시간 기다린 후 DDW(Water Purification System / LABOGENE) 세척(washing) 하였다.
4단계 : 표적 유전자와 상보적으로 결합하는 결합 부위, 상기 프라이머에 상보적으로 결합하는 결합 부위, 덤벨 형태를 형성하기 위한 템플레이트 내 상보적인 결합 부위를 포함하는 템플레이트를 상기 프라이머에 결합시키는 단계(프라이머-템플레이트 결합 단계)
도 1을 참조하면, 각각의 배출구(104)를 통해 제 2 유로(103)에 템플레이트를 가해 분지되어 있는 제2 유로(103) 상에 고정된 프라이머와 각각의 템프레이트를 결합시켜 고정될 수 있도록 하였다. 대조군(Negative Control)은 템플레이트를 가하지 않은 것을 사용하였다. 구체적으로, 3개의 분지를 갖는 제 2 유로 중 2번 유로(도 1의 제2 유로의 가운데 분지)에는 Bacillus anthracis에 대한 템플레이트(Template_B_A)(서열번호 10)를 가했고, 1번 유로 및 3번 유로는 대조군(Negative Control)으로 하였다. 구체적으로, 100Template_B_A 0.2㎕(=20pmole)에 1X PBS(lifetechnoligies사에 의한 gibco)를 채워 5㎕가 되게 한 후 2번 유로에 넣었고, 1번 유로 및 3번 유로는 1X PBS(lifetechnoligies사에 의한 gibco) 6㎕로 채웠다. 2시간 방치한 후 DDW(Water Purification System / LABOGENE) 세척하였다.
실시예 2-2. 2이상의 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치의 제조방법{2이상의 병원균(Bacillus anthracis 및 Ebola virus) 유전자 검출용 미세 유동 장치의 제조방법}
1단계 : 미세 유동 장치를 제공하는 단계
본 발명의 일 실시예로 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치(병원균 유전자 검출용 장치를 제조하기 미세 유동 장치{1 Ⅲ 3in1uncoated Microscopy Chamber (ibidi)}를 준비하였다. 본 발명의 미세 유동 장치는 기판(100); 기판 위에 형성된 시료용액이 외부로부터 유입되는 유입구(101); 유입구와 연결되어 유입된 시료용액을 수용하는 제 1 유로(102); 제 1 유로와 연결된 제 2 유로(103); 제 2 유로와 연결된 배출구(104)를 포함한다(도 1 참조). 상기 제 2 유로(103)는 제 1 유로와 연결되어 두 개 이상(예를 들어, 세 개로)으로 분지될 수 있다.
2단계 : 미세 유동 장치의 제 2 유로를 코팅하는 단계
5-히드록시도파민 염산(5-hydroxydopamine HCl)(Sigma Aldrich)을 1mg/ml로 10mM Tris buffer(1M UltraPure 1M Tris-HCl pH 8.0 / Invitrogen)에 녹였다. 그 후 pH를 8로 맞추어 코팅용 조성물을 제조하였다. 상기 코팅용 조성물로 장치(1 Ⅲ 3in1uncoated Microscopy Chamber (ibidi))의 제 2 유로를 채웠다. 2시간 후 DDW(Water Purification System / LABOGENE)로 세척(washing) 하였다.
3단계 : 상기 코팅된 제 2 유로 상에 템플레이트와 결합할 수 있는 프라이머를 고정화하는(결합시키는) 단계
프라이머로는 Primer-5SS-polyA9 (BIONEER)(서열번호 9)를 사용하였다.
상기 프라이머 100pmol과 5M DTT(DL-Dithiothreitol/Sigma Aldrich)를 준비한 후, 100pmol 프라이머에 5M DTT 5㎕ 더한 후, 총 50㎕가 되게 DDW(Water Purification System / LABOGENE)를 추가하였다. 프라이머의 이황화 결합(disulfide bond)을 끊기 위해(broken) DDT 처리를 4시간동안 진행 후 3K 아미콘 튜브(amicon tube)(Amicon Ultra Centrifugal Filters 3K / MILLIPORE)를 이용하여 반응 후 남아있는 DTT를 제거하였다(eppendorf Centrifuge 5415R) (132,000 rpm, 4℃, 25분에서 1회 원심분리 이후 40㎕ DDW를 넣고 다시 132,000 rpm, 4℃, 25분에서 원심분리하여 DTT를 깨끗하게 제거하기 위해 총 2번 원심분리 하였다). DTT를 제거하고 남은 용액을 3개의 분지를 갖는 각각의 제 2 유로(channel)(103)에 5㎕(1번 유로; 도 1의 제2 유로의 왼쪽 분지), 5㎕(2번 유로; 도 1의 제2 유로의 가운데 분지), 5㎕(3번 유로; 도 1의 제2 유로의 오른쪽 분지) 차례대로 넣고 2시간 기다린 후 DDW(Water Purification System / LABOGENE) 세척(washing) 하였다.
이에 의해 미세 유동 장치의 제2 유로 상에는 프라이머가 고정화될 수 있다(도 3의 A 참조).
4단계 : 표적 유전자와 상보적으로 결합하는 결합 부위, 상기 프라이머에 상보적으로 결합하는 결합 부위, 덤벨 형태를 형성하기 위한 템플레이트 내 상보적인 결합 부위를 포함하는 템플레이트를 상기 프라이머에 결합시키는 단계(프라이머-템플레이트 결합 단계)
도 1을 참조하면, 각각의 배출구(104)를 통해 제 2 유로(103)에 템플레이트를 가해 분지되어 있는 제2 유로(103) 상에 고정된 프라이머와 각각의 템프레이트를 결합시켜 고정될 수 있도록 하였다. 대조군(Negative Control)은 템플레이트를 가하지 않은 것을 사용하였다. 구체적으로, 3개의 분지를 갖는 제 2 유로 중 2번 유로(도 1의 제2 유로의 가운데 분지)에는 Ebola virus에 대한 템플레이트(Template_E)를 가하고, 3번 유로(도 1의 제2 유로의 왼쪽 분지)에는 Bacillus anthracis에 대한 템플레이트(Template_B_A)를 가했고, 1번 유로는 대조군(Negative Control)으로 하였다. 구체적으로, 100Template_E(서열번호 11) 0.24㎕(=24pmole)에 1X PBS(lifetechnoligies사에 의한 gibco)를 채워 6㎕가 되게 한 후 3번 유로에 넣었다. 100Template_B_A(서열번호 10) 0.2㎕(=20pmole)에 1X PBS(lifetechnoligies사에 의한 gibco)를 채워 5㎕가 되게 한 후 2번 유로에 넣었고, 3번 유로는 1X PBS(lifetechnoligies사에 의한 gibco) 6㎕로 채웠다. 2시간 방치한 후 DDW(Water Purification System/LABOGENE) 세척하였다.
이에 의해 상기 제2 유로 상에 고정화된 프라이머와 템플레이트가 결합될 수 있다(도 3의 B 참조). 각각의 제 2 유로의 분지 상에 고정화된 프라이머에 특정한 병원균의 유전자를 인식할 수 있는 서로 다른 템플레이트들이 결합될 수 있고, 이를 통해 한 번에 여러 표적 유전자를 검출할 수 있게 한다.
<실시예 3> 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치를 이용하여 표적 유전자를 검출하는 방법
표적 유전자의 검출 원리
표적 유전자 검출용 미세 유동 장치를 이용하여 표적 유전자를 검출하는 방법의 원리는 표적 유전자(예컨대, 병원균 유전자)의 존재 시에만 닉(nick)이 사라진 닫힌 형(closed form)의 덤벨 형(dumbbel shape) 템플레이트가 라이게이션(ligation)되고 이어서 회전환 증폭(Rolling circle amplification)(RCA)에 의해 증폭되어 자가조립(self assembly)된 정교한 구조체의 파티클을 형성함을 기초로 한다(도 2 참조).
도 12는 도 3B 내지 도 3D의 과정을 보다 구체적인 모식도로 나타낸 것이다. 즉, 도 12A는 본 발명의 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치의 제 2 유로 상에 고정된 프라이머에 템플레이트가 결합되어 있는 모습을 보여준다. 상기 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치의 제 2 유로 내로 흘러들어온 시료에 표적 병원균 유전자가 존재하면, 상기 표적 병원균 유전자는 상기 템플레이트의 제 1 표적 유전자 결합부위와 제 2 표적 유전자 결합부위에 동시에 결합하게 된다(도 12B, 도 2B). 이 때 제 1 표적 유전자 결합부위와 제 2 표적 유전자 결합부위의 양 말단이 서로 가까워져, 그 사이에 작은 틈새, 즉 닉(nick)만이 존재하게 된다. 이와 동시에 제 1 템플레이트 내 상보적인 결합부위와 제 2 템플레이트 내 상보적인 결합부위 역시 서로 가까워져 상보적 결합을 형성하게 된다. 상기 닉(nick)은 인접한 5′ 말단과 3′ 말단을 연결하는 효소인 리가아제에 의하여 서로 연결되어, 상기 템플레이트는 완전히 닫힌 형태(closed form)이 되어 덤벨 모양이 된다(도 12C, 도 2C).
등온 핵산 중합효소는 상기 닫힌 형태의 표적 유전자 검출용 템플레이트를 주형으로 dNTP가 소진되기 전까지 핵산을 무한히 반복하여 복제하는 회전환 증폭((Rolling Circle Replication, RCA)을 한다(도 12D 및 도 2D 참조). 복제된 부분은 표적 유전자 검출용 템플레이트에서 떨어져 나가기 때문에, 표적 유전자 검출용 템플레이트의 서열이 반복하여 존재하는 선형(linear) 핵산이 생성된다. 이 선형 핵산에 존재하는 1 표적 유전자 결합부위와 제 2 표적 유전자 결합부위 각각이 표적 유전자와 결합하고 회전환 증폭 반응이 일어나 길고 엉킨 핵산 덩어리가 생성되며, 이는 제 2 유로의 코팅과 함께 엉겨 큰 하이드로겔 덩어리를 형성한다. 형성된 하이드로겔 덩어리가 제 2 유로 내에 존재하고 그 제 2 유로에 연결된 배출구를 막는 것을 관찰할 수 있다.
실시예 3-1. 단일 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치를 이용한 표적 유전자를 검출하는 방법{단일 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치를 이용한 단일 표적 병원균(Bacillus anthracis) 유전자를 검출하는 방법}
1단계 : 실시예 2-1에 의한 단일 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치{단일 병원균(Bacillus anthracis) 유전자 검출용 미세 유동 장치}를 제공하는 단계
단일 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치를 제공(준비) 하였다. 구체적으로 실시예 2-1에 의하여 단일 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치{단일 병원균(Bacillus anthracis) 유전자 검출용 미세 유동 장치}를 제공하였다.
2단계 : 제1 유로에 시료용액을 유입시키는 단계
(1) 시료용액 준비
Bacillus anthracis의 병원균 유전자 서열을 바탕으로 시료(Pathogen_BA)(서열번호 12)를 Bioneer(HPLC Purification)로부터 주문하여 준비하였다. 1X PBS 내 Pathogen_B_A 100으로 시료용액을 준비하였다.
하기 표 4는 실시예 3에서 사용한 Bacillus anthracis의 템플레이트 및 병원균 서열을 나타낸다.
표 4
Figure PCTKR2015011605-appb-T000001
(2) 제1 유로에 (1)에서 준비한 시료용액을 유입시키는 단계
(1)에서 준비한 시료용액 60㎕를 단일 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치의 유입구를 통해 제1 유로에 유입시켰다. 단일 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치의 제1 유로로 유입된 시료용액은 모세관 현상에 의하여 제1 유로를 거쳐 제2 유로로 이동하였다. 2시간 방치한 후, DDW(Water Purification System/LABOGENE) 세척하였다.
3단계 : 상기 시료용액에 포함된 단일 표적 유전자{단일 병원균(Bacillus anthracis) 유전자}와 템플레이트의 라이게이션 단계;
제 1 유로에 유입된 시료 용액은 모세관 현상에 의해 제 2 유로로 흘러 들어갔다.
그 다음, 단일 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치의 제 2 유로에 2X T7 리가아제(ligase) 30㎕, T7 ligase 5㎕, 100mM DTT 0.2㎕, DDW(Water Purification System/LABOGENE) 24.8㎕로 단일 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치의 제2 유로를 채웠다. 장치 안의 수분이 날아가는 것을 방지하기 위해 파라 필름으로 밀봉 한 플라스틱 용기 안에 넣어 시료 용액과 반응시켰다. 플라스틱 안은 물에 적신 휴지와 25℃ 물로 채웠다. 그 후 교반배양기(shaking incubator)(VS-8480 (VISION SCIENNTIFIC CO)) 무교반(non-shaking), 25℃에서 3시간 동안 반응시켰다.
4단계 : 상기 라이게이션된 유전자 산물의 증폭 단계(Rolling Circle Amplification)
그 후 25mM dNTP 2㎕, 10X T7 ligase reaction buffer(Biolabs) 6㎕, phi 29 polymerase (10unit/㎕) 50㎕, pyrophosphatase 1㎕, 100mM DTT 1㎕로 단일 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치의 제2 유로 내를 채웠다. 단일 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치의 제2 유로 내 안의 수분이 날아가는 것을 방지하기 위해 파라 필름으로 밀봉 한 플라스틱 용기 안에 넣어 반응시켰다. 플라스틱 안은 물에 적신 휴지와 30℃ 물로 채웠다. 그 후 교반배양기(shaking incubator)(VS-8480 (VISION SCIENNTIFIC CO)) 무교반(non-shaking), 30℃, 3시간 조건에서 진행하였다.
5단계 : 상기 증폭된 표적 유전자 산물의 검출 단계(표적 유전자 검출 확인
검출용 조성물로 Gel red(GelRed™ / Biotium) 1:1000 희석물 (DDW (Water Purification System/LABOGENE)로 희석) 50 ㎕를 유입구를 통하여 넣어 주었다. Gel red(GelRed™ / Biotium) 1:200 희석물은 제1 유로를 거쳐 제2 유로에 흘렀다. Gel red(GelRed™ / Biotium)의 희석 배수는 보통 1 : 10000 으로 희석하여 사용하나 육안으로 색을 보기 위하여 조절하는 것이며, 이에 제한되지 않는다.
도 9의 a를 참조하면 2번 유로에서 빨갛게 보이는 것은 DNA membrane이고, Gel red와 같은 염색시약을 검출용 조성물로 하여 상기 증폭된 표적 유전자 산물의 검출이 가능함을 알 수 있었다. 또한, 도 9의 b에서와 같이 Imager(Gel Doc™ EZ(Bio-rad))로 보면 단일 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치 내 2번 유로에서 흐름이 막힌 것을 쉽게 알 수 있었다. 이를 통해 본 발명의 단일 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치를 사용하여 Thermo cycler와 같은 장치를 사용하지 않고 특별한 온도 변화를 주지 않고도 온화한 온도 조건, 예를 들어 30℃의 온도 조건에서 단일 표적 유전자, 예를 들어, 단일 병원균(Bacillus anthracis) 유전자의 검출이 육안으로 가능함을 확인하였다.
실시예 3-2. 2이상의 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치를 이용한 표적 유전자를 검출하는 방법{2이상의 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치를 이용한 단일 표적 병원균(Bacillus anthracis 및 Ebola virus) 유전자를 검출하는 방법}
1단계 : 실시예 2-2에 의한 2이상의 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치{2이상의 병원균(Bacillus anthracis 및 Ebola virus) 유전자 검출용 미세 유동 장치}를 제공하는 단계
2이상의 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치를 제공(준비) 하였다. 구체적으로 실시예 2-2에 의하여 2이상의 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치{2이상의 병원균(Bacillus anthracis 및 Ebola virus) 유전자 검출용 미세 유동 장치}를 제공하였다.
2단계 : 제1 유로에 시료용액을 유입시키는 단계
(1) 시료용액 준비
Bacillus anthracis의 병원균 유전자 서열을 바탕으로 시료(Pathogen_BA)(서열번호 12)를 Bioneer(HPLC Purification)로부터 주문하여 준비하였다. 1X PBS 내 Pathogen_B_A 100으로 시료용액을 준비하였다.
(2) 시료 준비
Bacillus anthracis 및 Ebola virus의 병원균 유전자 서열을 바탕으로 시료{Pathogen_BA(서열번호 12) 및 Pathogen_E(서열번호13)}를 각각 Bioneer(HPLC Purification)로부터 주문하여 준비하였다. 1X PBS 내 Pathogen_B_A 100으로 시료용액을 준비하였다. 또한 1X PBS 내 Pathogen_E 100으로 시료용액을 준비하였다.
하기 표 5는 실시예 2에서 사용한 Bacillus anthracis 및 Ebola virus의 템플레이트 및 병원균 서열을 나타낸다.
표 5
Figure PCTKR2015011605-appb-T000002
(2) 제1 유로에 (1)에서 준비한 시료용액을 유입시키는 단계
(1)에서 준비한 시료용액 60㎕를 단일 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치의 유입구를 통해 제1 유로에 유입시켰다. 단일 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치의 제1 유로로 유입된 시료용액은 제1 유로를 거쳐 제2 유로로 이동하였다. 제2 유로의 2번 유로 및 3번 유로는 Template_E 총 20 ㎕ 중 5㎕를 Template_B_A 총 20 ㎕ 중 5㎕를 넣어주었다. 2시간 방치한 후, DDW(Water Purification System/LABOGENE) 세척하였다.
3단계 : 상기 시료용액에 포함된 2이상의 표적 유전자{2이상의 병원균(Bacillus anthracis 및 Ebola virus) 유전자}와 템플레이트의 라이게이션 단계;
단일 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치의 제 2 유로에 2X T7 리가아제(ligase) 30㎕, T7 ligase 5㎕, 100mM DTT 0.2㎕, DDW(Water Purification System/LABOGENE) 24.8㎕로 단일 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치의 제2 유로를 채웠다. 장치 안의 수분이 날아가는 것을 방지하기 위해 파라 필름으로 밀봉 한 플라스틱 용기 안에 넣어 반응시켰다. 플라스틱 안은 물에 적신 휴지와 25℃ 물로 채웠다. 그 후 교반배양기(shaking incubator)(VS-8480 (VISION SCIENNTIFIC CO)) 무교반(non-shaking), 25℃에서 3시간 동안 반응시켰다.
이에 의해 시료에 존재하는 표적 유전자(병원균의 유전자)가 특정 템플레이트와 상보적 결합하여 환형 템플레이트를 형성할 수 있다(도 3의 C 참조).
4단계 : 상기 라이게이션된 유전자 산물의 증폭 단계(Rolling Circle Amplification)
<방법 1>
그 후 25mM dNTP 2㎕, 10X T7 ligase reaction buffer(Biolabs) 6㎕, phi 29 polymerase (10unit/㎕) 50㎕, pyrophosphatase 1㎕, 100mM DTT 1㎕로 2이상의 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치의 제2 유로 내를 채웠다. 2이상의 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치의 제2 유로 내 안의 수분이 날아가는 것을 방지하기 위해 파라 필름으로 밀봉 한 플라스틱 용기 안에 넣어 반응시켰다. 플라스틱 안은 물에 적신 휴지와 30℃ 물로 채웠다. 그 후 교반배양기(shaking incubator)(VS-8480 (VISION SCIENNTIFIC CO)) 무교반(non-shaking), 30℃ 3시간 조건에서 진행하였다.
<방법 2>
그후 25mM dNTP 2㎕, 0.4mM Biotin-14-dCTP 1 ㎕, 10X T7 ligase reaction buffer(Biolabs) 2㎕, phi 29 polymerase (500unit/㎕) 5㎕, pyrophosphatase 1㎕, 100mM DTT 0.8㎕, DDW 6.2 ㎕로 2이상의 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치의 제2 유로 내를 채웠다. 2이상의 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치의 제2 유로 내 안의 수분이 날아가는 것을 방지하기 위해 파라 필름으로 밀봉 한 플라스틱 용기 안에 넣어 반응시켰다. 플라스틱 안은 물에 적신 휴지와 30℃ 물로 채웠다. 그 후 shaking incubator(VS-8480 (VISION SCIENNTIFIC CO)) non-shaking, 30℃, 3시간 반응 조건에서 반응시켰다.
상기 방법 1 또는 방법 2에 의해 회전환 증폭(rolling circle amplification)을 통해 표적 유전자(핵산)이 증폭될 수 있다(도 3의 D 참조).
5단계 : 상기 증폭된 표적 유전자 산물의 검출 단계(표적 유전자 검출 확인)
엉킨 단일 가닥 형태의 회전환 증폭된 유전자 산물(도 3의 E 참조)이 미세 유동 장치의 제2 유로의 각각의 분지를 선택적으로 막을 수 있고 이에 의해 유전자의 검출이 가능하다. 미세 유동 장치의 제2 유로에 검출용 조성물을 넣어 줄 경우, 검출을 보다 용이하게 할 수도 있다(도 3의 F 참조).
<4단계의 방법 1과 관련된 검출 방법>
검출용 조성물로 Gel red(GelRed™ / Biotium) 1:1000 희석물(DDW (Water Purification System/LABOGENE)로 희석) 50 ㎕를 유입구를 통하여 넣어 주었다. Gel red(GelRed™ / Biotium) 1:80 희석물은 제1 유로를 거쳐 제2 유로에 흘렀다.
도 10의 b에서와 같이 Imager(Gel Doc™ EZ(Bio-rad))로 보면 2이상의 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치 내 2번 유로 및 3번 유로에서 흐름이 막힌 것을 쉽게 알 수 있었다. 이를 통해 본 발명의 2이상의 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치를 사용하여 Thermo cycler와 같은 장치를 사용하지 않고 특별한 온도 변화를 주지 않고도 온화한 온도 조건, 예를 들어 30℃의 온도 조건에서 2이상의 표적 유전자, 예를 들어, 2이상의 병원균(Bacillus anthracis 및 Ebola virus) 유전자의 동시 검출이 육안으로 가능함을 확인하였다.
<4단계의 방법 2와 관련된 검출 방법>
검출용 조성물로 Streptavidin 비드를 사용하였다. 구체적으로, Streptavidin Fluoresbrite YG Microspheres 2.0 Micro 1:20 희석물(DDW (Water Purification System/LABOGENE)로 희석) 50 ㎕를 유입구를 통하여 넣어 주었다.
도 11에서와 같이 RCA product에 의한 공기층에 의해 막히거나 RCA 산물의 비오틴과 스트렙타비딘(streptavidin)이 반응하여 더 엉긴 RCA 산물에 의해 2이상의 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치 내 2번, 3번 유로에서 흐름이 막힌 것을 쉽게 알 수 있었다. 이를 통해 본 발명의 2이상의 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치를 사용하여 Thermo cycler와 같은 장치를 사용하지 않고 특별한 온도 변화를 주지 않고도 온화한 온도 조건, 예를 들어 30℃의 온도 조건에서 2이상의 표적 유전자, 예를 들어, 2이상의 병원균(Bacillus anthracis 및 Ebola virus) 유전자의 동시 검출이 육안으로 가능함을 확인하였다.
<실험예 1> 각 단계의 전기영동(electrophoresis) 결과 확인
상기 제조예 1에서 제조한 Template_BA와 병원균(Pathogen)과의 결합 및 라이게이션을 전기영동 결과로 확인하기 위한 실험을 진행하였다. 상기 실험예 1에서는 제조예 1의 템플레이트와 병원균에 대한 반응 여부를 확인하기 위하여 튜브(tube)에서 간이하게 실험하였다. 또한, 여러 반응 조건을 테스트하기 위하여 열순환기(Thermo cycler)를 사용하였다. 이와 함께, 상기 제조예 1에서 제조한 Template_E와 병원균(Pathogen)과의 결합 및 라이게이션을 전기영동 결과로 확인하기 위한 실험을 진행하였다. tube에서의 실험에서는 템플레이트를 프라이머에 고정시키지 않으므로 각각의 Pathogen 3’말단, 즉, 병원균 유전자 3’말단에 Phosphate를 붙이지 않았다.
(1) 어닐링(Annealing) 단계의 확인
100Bacillus anthracis에 대한 템플레이트(Template_BA)(서열번호 10)를 DEPC(Sigma-Aldrich)를 용매로 사용하여 1Template_BA로 희석하였다. 튜브(Tube)에 DDW(Water Purification System/LABOGENE) 3.2㎕, 10X PBS pH 7.4(lifetechnoligies사에 의한 gibco) 1㎕, 40mM MgCl2(Sigma-Aldrich) 5㎕를 차례대로 넣고 1Template_BA 0.8 ㎕ (즉 0.8pmole)를 넣었다. 그 후 Thermo cycler(Bio-rad T100™)로 95 ℃ → 4 ℃ 로 1 시간동안 온도를 내렸다.
그 후 로딩 염료(loading dye)(Gel Loading Dye Blue 6X / Biolabs) 2㎕를 넣고 15% PAGE in 1X Tris-borate-EDTA(TBE) buffer에 전기영동한 후(150V, 45분) 겔 레드(Gel red)(GelRed™ / Biotium)로 염색하고 Gel Doc™ EZ(Bio-rad)로 전기영동 결과를 확인하였다.
상기 Template_BA 대신 Template_E(서열번호 11)를 사용하는 것을 제외하고 동일한 방식으로 어닐링(Annealing) 단계의 확인 실험을 수행하였다.
(2) 혼성화(Hybridization)단계의 확인
시료의 Bacillus anthracis(Pathogen_BA Not Phosp)(서열번호 14)와 템플레이트의 혼성화를 확인하기 위해 다음 실험을 하였다. 먼저, 튜브(Tube)에 DDW(Water Purification System/LABOGENE) 2㎕, 10X PBS pH 7.4(lifetechnoligies사에 의한 gibco) 1㎕, 40mM MgCl2(Sigma-Aldrich) 5㎕를 차례대로 넣고 10Pathogen_BA_Not Phosp과 10Template_B_A를 각각 1㎕ 씩 넣었다. 그 후 Thermo cycler(Bio-rad T100™)로 95 ℃ → 4 ℃ 로 1 시간동안 온도를 내렸다.
그 후 총 10㎕ 중 1㎕(즉 0.8pmole)를 1X PBS 9㎕로 채운 후 로딩 염료(loading dye)(Gel Loading Dye Blue 6X / Biolabs) 2㎕를 넣고 15% PAGE in 1X Tris-borate-EDTA(TBE) buffer에 전기영동한 후(150V, 45분) Gel red(GelRed™ / Biotium)로 염색하고 Gel Doc™ EZ(Bio-rad)로 전기영동 결과를 확인하였다.
상기 Template_BA(서열번호 10) 대신 Template_E(서열번호 11)를 사용하고 Pathogen_BA_Not Phosp(서열번호 14) 대신 Template_E_Not Phosp(서열번호 15)를 사용하는 것을 제외하고 동일한 방식으로 혼성화(Hybridization)단계의 확인을 수행하였다.
(3) 라이게이션(Ligation) 단계의 확인
튜브(Tube)에 DDW(Water Purification System/LABOGENE) 2.4㎕, 2X T7 ligase reaction buffer(Biolabs) 10㎕, 100Pathogen_BA_Not Phosp (서열번호 14) 1.6㎕, 100Template_BA(서열번호 10) 0.8㎕를 차례대로 넣고 Thermo cycler(Bio-rad T100™)로 95 ℃ → 4 ℃ 로 5분간 온도를 내렸다. 그 후 100mM DTT{Epicenter RepliPHI Phi29 시약 세트(0.1㎍/㎕)} 0.2㎕ 와 T7 ligase (Biolabs) 5㎕를 넣어주었다. 그 후 Thermo cycler(Bio-rad T100™)로 25 ℃ 13시간 → 65 ℃ 20분 → 10 ℃ 로 유지 하였다. 결과적으로 4라이게이션 생성물(ligation product) 20㎕가 만들어졌다. 라이게이션 생성물 0.8pmole에 로딩 염료(loading dye)(Gel Loading Dye Blue 6X / Biolabs) 2㎕를 넣고 15% PAGE in 1X Tris-borate-EDTA(TBE) buffer에 전기영동한 후(150V, 45분) Gel red(GelRed™ / Biotium)로 염색하고 Gel Doc™ EZ(Bio-rad)로 전기영동 결과를 확인하였다.
상기 Template_BA(서열번호 10) 대신 Template_E(서열번호 11)를 사용하고 Pathogen_BA_Not Phosp(서열번호 14) 대신 Template_E_Not Phosp(서열번호 15)를 사용하는 것을 제외하고 동일한 방식으로 혼성화(Hybridization)단계의 확인을 수행하였다.
(4) 회전환 증폭(Rolling circle amplification)
튜브(Tube)에 DDW(Water Purification System / LABOGENE) 7.2㎕, 10X T7 ligase reaction buffer(Biolabs) 2㎕{Epicenter RepliPHI Phi29 시약 세트(0.1㎍/㎕)} 차례로 넣고 라이게이션 단계에서 만든 4라이게이션 생성물(ligation product) 2㎕(8pmole)을 넣었다. 그 후 25mM dNTP{Epicenter RepliPHI Phi29 시약 세트(0.1㎍/㎕)} 2㎕ 넣고 100mM DTT{Epicenter RepliPHI Phi29 시약 세트(0.1㎍/㎕)} 0.8㎕, Pyrophosphatase(100U/ml Biolabs) 1㎕, Phi 29 polymerase{Epicenter RepliPHI Phi29 시약 세트(0.1㎍/㎕)} 5㎕를 차례로 넣었다. 그 후 Thermo cycler(Bio-rad T100™)로 30 ℃ 15시간 → 65 ℃ 10분 → 4 ℃ 로 유지 하였다.
(5) 전기영동 결과 확인
DNA Ladder(Quick-LoadLMW Ladder/Biolabs)를 기준으로 하였고 상기 템플레이트(Template_BA)(서열번호 10), 병원균(Pathogen_BA_Not Phosp)(서열번호 14), 및 상기 (1) 내지 (3) 단계에서 얻은 생성물을 각각 0.8pmole 씩 로딩하여 전기영동한 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4를 참조하면, 템플레이트(Template)는 보통 선형(linear form), 즉, 선형 템플레이트(Linear template)로서 존재하는데(도 4의 a 참조), 상기 템플레이트는 자가 조립할 수 있는 조건 하에서 덤벨 형태를 형성하기 위한 템플레이트 내 상보적인 결합 부위 간의 상보적인 결합함으로써 어닐링(annealing)되어 자가 조립된 형태(Self-assembled form), 자가 조립된 템플레이트(Self-assembled template)가 만들어짐을 확인할 수 있었다(도 4의 b 참조). 자가 조립된 형태의 템플레이트 내 표적 유전자와 상보적으로 결합하는 결합 부위와 표적 유전자, 예를 들어 병원균(pathogen) 유전자가 결합하면 닉(nick)이 사라진 닫힌 형(closed form)의 덤벨 형태의 템플레이트(Dumbbell-sahped template)가 형성되어 라이게이션(ligation)됨을 확인할 수 있었다(도 4의 c 참조). 이어서 라이게이션 생성물의 회전환 증폭(Rolling circle amplification)(RCA)이 일어남을 확인할 수 있었다.
<실험예 2> RCA 생성물의 SEM 이미지 확인
(1) Bacillus anthracis 확인
상기 제조예 1에서 제조한 Template_B_A를 사용하여 실험예 1의 (4)의 방법으로 수득한 RCA 생성물 20㎕에 2M MgCl2 2㎕를 넣고 서냉(Slow cooling) (1시간에 걸쳐 95℃→4℃) 하였더니 약 1mm 정도의 하얀 DNA 공(DNA ball)이 생겼다. 글래스웨(glassware)(MARIENFELD)에 DNA 공(DNA ball)을 올려놓고 24시간 건조한 후, mica(Pelco Mica sheets, Ted Pella Corp.)에 결합시켜 SEM(Tm3030 tabletop microscope/Hitachi High-Tech) 사진을 찍었다. 도 5와 같이 정교한 단일 가닥의 DNA 덩어리들이 형성되는 것을 확인할 수 있다.
(2) Ebola virus 확인
상기 제조예 1에서 제조한 Template_E를 사용하여 실험예 1의 (3)의 방법으로 수득한 RCA 생성물 20㎕에 5M NH4OAc 40 (SIGMA-Aldrich)를 넣고 100% EtOH 500 로 채운 후 20분 동안 냉동하였다. 그 후 원심분리(10,000 rpm, 20분, 4℃) 하고 상층액을 따서 40남기고 30분 동안 초음파처리(BRANSON 5510) 하였다. Glass에 올려놓고 24시간 건조시킨 후mica(Pelco Mica sheets, Ted Pella Corp.)에 결합시켜 SEM(Tm3030 tabletop microscope/Hitachi High-Tech) 사진을 찍었다. 도 6과 같이 증폭된 유전자 산물의 엉킨 가닥의 덩어리가 형성되는 것을 확인할 수 있었다.
<실험예 3> 회전환 증폭된 유전자 산물의 하이드로겔 형성 확인
실험예 1의 회전환 증폭(Rolling circle amplification; RCA) 반응으로 얻은 증폭된 유전자 산물이 하이드로겔을 형성하는지 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 병원균으로는 Bacillus anthracis(Pathogen_BA Not Phosp, 서열번호 14) 및 Ebola virus(Pathogen_E Not Phosp, 서열번호 15)을 사용하였다.
상기 실험예 3에서는 제조예 1의 템플레이트와 병원균에 대한 반응 여부를 확인하기 위하여 튜브(tube)에서 간이하게 실험하였다. 또한, 여러 반응 조건을 테스트하기 위하여 열순환기(Thermo cycler)를 사용하였다.
하이드로겔 형성으로 인한 점도 측정을 위해 튜브(tube)와 피펫 팁(pipette tip)을 이용하여 점도 측정 및 회전점도계 측정을 수행하였다.
(1) 튜브(tube) 및 피펫 팁(pipette tip)을 이용한 점도 측정
튜브를 튜브의 장축을 중심으로 90도 각도로 기울인 후 반응액체(실험예 1의 (4) 회전환 증폭의 산물을 포함한 용액)의 흐름성을 측정하였다. 60초 동안 흐름성이 확인되지 않았을 경우 표적 유전자, 예를 들어, pathogen 유전자(Template_BA 또는 Template_E) 검출이 확인됨을 나타낸다.
또한 피펫 팁(pipette tip)을 이용하여 반응액체(실험예 1의 (4) 회전환 증폭의 산물을 포함한 용액)을 들어 올릴 때(빨아 들일 때) 점성변화로 인해 반응액체(실험예 1의 (4) 회전환 증폭의 산물을 포함한 용액)가 피펫 팁 표면을 따라 올라오게 됨으로써 물과 같은 점성인 경우에는 팁을 따라 오는 것이 없으나 점도가 증가할수록 팁속으로 물질이 따라 올라오고 되돌아가는 성질이 증가하는 것을 확인하였다(도 7의 a 참조).
상기 제조예 1에서 제조한 Template_BA 또는 Template_E을 이용한 회전환 증폭 반응에서 모두 60초 동안 거의 흐름성을 나타내지 않는 점성을 갖게 되어 표적 유전자, 예를 들어, pathogen 유전자(Template_BA 또는 Template_E)의 검출이 가능함을 알 수 있었다. 또한, Template_BA 보다 병원균에 상보적인 길이가 더 긴 Template_E을 이용하였을 때 더 점도가 있는 하이드로겔이 형성됨을 확인하였다.
(2) 회전점도계 측정
상기 제조예 1에서 제조한 Template_E를 이용하여 실험예 1에 개시된 회전환 증폭(Rolling circle amplification; RCA) 반응으로 얻은 증폭된 유전자 산물에 대한 점도 변화를 회전점도계를 이용하여 측정하였다. 반응액체(실험예 1의 (4) 회전환 증폭의 산물을 포함한 용액)의 점성변화 증가 및 storage modulus (G’) 값과 loss modulus (G”) 값의 비율을 측정하였고 이를 도 7의 b에 나타내었다(x축: Frequence (Hz), y 축: Pascal (Pa)). 하이드로겔 형성에 의한 점성변화 증가로부터 표적 유전자, 예를 들어, Ebola virus의 검출이 가능함을 알 수 있었다.
<실험예 4> 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치의 제2 유로를 코팅함에 따른 효과 확인
실시예 3-1의 방법에 의한 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치를 이용하여 표적 유전자를 검출하는 방법을 수행한 후 제2 유로의 모습을 원자탐침현미경(AFM)(NX-10, Park System)으로 살펴보았다. 2단계의 공정을 수행하지 않는 것(5-히드록시도파민 염산으로 제2 유로를 코팅하는 과정 없이)을 제외하고 실시예 2-1의 단일 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치의 제조방법으로 제조한 단일 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치를 사용하여 표적 유전자를 검출하는 방법(실시예 3-1의 방법)을 수행한 후 제2 유로의 모습을 원자탐침현미경(AFM)(NX-10, Park System)으로 살펴보았다.
그 결과 5-히드록시도파민 염산을 이용한 코팅하는 단계(5-히드록시도파민 염산으로 전 처리하는 단계) 없이 프라이머를 고정시킨 경우(도 8의 a)는 기판 표면에 부착된 프라이머가 거의 존재하지 않아 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치의 제2 유로 상에서 증폭이 일어나지 않았다. 반면에, 5-히드록시도파민 염산을 이용한 코팅하는 단계(5-히드록시도파민 염산으로 전 처리하는 단계)를 수행하고 프라이머를 고정시킨 후 표적 유전자(핵산)을 증폭 시킨 경우(도 8의 b)에는 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치의 제2 유로 상에서 핵산의 증폭이 우수하게 일어남을 알 수 있었다. 이를 통해 5-히드록시도파민 염산이 DNA 프라이머를 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치의 제2 유로에 효과적으로 고정화할 수 있음을 알 수 있었다.
이를 통해 5-히드록시도파민 염산으로 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치의 제2 유로를 코팅할 경우 티올(thiol)기를 함유하고 있는 프라이머와 반응하여 프라이머가 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치의 제2 유로 상에 효과적으로 고정되므로 이후 공정에 의해 핵산의 증폭이 증가할 수 있음을 알 수 있다.
<실험예 5> 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치를 이용한 메르스(MERS) 바이러스 검출
(1) 표적 메르스(MERS)유전자 검출용 미세 유동 장치의 제조
실시예 2의 1단계 및 2단계에서 기술한 바와 마찬가지로, 도 1과 같이 기판 상에 유입구, 제 1 유로, 3개의 제 2 유로 및 각각의 제 2 유로 끝에 배출구가 형성된 장치를 준비하였다. 실시예 2에서는 5-하이드록시도파민 염산을 제 2 유로 내에 주입하여 제 2 유로 내를 코팅하였으나, 본 실험예에서는 비닐 기를 증기증착 방식으로 플라스틱 재질의 제 2 유로에 코팅하였다. 실시예 2와 동일한 방법으로 코팅하는 것도 역시 가능하다. 그 후 DDW로 세척하였다.
그 다음 실시예 2의 3단계에서와 같이 Primer-5SS-polyA9 (BIONEER)(서열번호 9) 프라이머와 DTT의 혼합액을 유입구로 주입하였다. DTT에 의하여 프라이머에 존재하는 티올기가 노출되고, 노출된 티올기가 제 2 유로 상의 비닐 코팅(또는 5-하이드록시도파민 염산 코팅)에 결합되었다. 그 후 DDW로 세척하였다.
그 다음 상기 3개의 제 2 유로 상에 고정된 프라이머에 서로 다른 템플레이트 100를 0.2㎕(=20pmole)가 1X PBS(lifetechnoligies사의 gibco)에 희석한 용액을 주입하여, 프라이머에 각 템플레이트가 결합되도록 하였다.
구체적으로, 위에서 보았을 때 좌측의 제 2 유로에는 제조예 1 (1)의 Template_BA(Bacillus anthracis에 대한 템플레이트, 서열번호 10)를 결합시켰다. 상기 제 2 유로는 음성 대조군(Negative Control, NC)으로서, 미세 유동 장치에 주입된 시료 내에 메르스 바이러스가 포함되어 있어도 상기 템플레이트와 아무런 반응을 일으키지 않아 회전환 증폭 반응이 일어나지 않는다.
중앙의 제 2 유로에는 메르스 바이러스(MERS-CoV)에 대한 템플레이트를 결합시켰다. 중앙의 제 2 유로는 시료군(Sample)으로서, 미세 유동 장치에 주입된 시료 내에 메르스 유전자가 존재하는 경우에만 회전환 증폭이 일어나게 된다. 한편 상기 메르스 바이러스에 대한 템플레이트의 서열은 다음과 같다.
템플레이트 MERS
5′/5Phos/AGG GCA CAT CTC CG A ATC GAA GTA CTC AGC GTA AGT TTA GAG G TA GCA TGC TAG TAT CGA CGT ACG TAC CAA CTT ACG CTG AGT ACT TCG ATT ATA CCC - 3’
상기 템플레이트 MERS 서열에서, 표적 메르스 코로나바이러스 유전자에 상보적인 부분을 흰 바탕에 진한 글씨로, 템플레이트 내 서로 상보적인 부분을 이탤릭체로, 프라이머에 상보적으로 결합하는 부분을 이탤릭체에 밑줄로 표시하였다.
위에서 보았을 때 우측의 제 2 유로에는 제 2 유로 상에 고정된 프라이머에 상기와 같은 메르스 바이러스에 대한 템플레이트를 결합시키고, 상기 템플레이트에 결합하는 표적 메르스 유전자를 첨가하여, 항상 회전환증폭이 일어나도록 하였다. 좌측의 제 2 유로를 양성 대조군(Positive Control, PC)으로 하였다.
(2) 표적 메르스(MERS) 유전자의 검출
그 다음, 상기 메르스 바이러스에 대한 템플레이트에 결합하는 메르스 바이러스 유전자를 포함하는 시료를 상기 (1)에서 제조된 미세 유동 장치의 유입구로 주입하였다. 그 후 라이게이션이 25 ℃에서 밤새 일어나도록 하고, 회전환 증폭은 25 ℃에서 4시간 동안 일어나도록 하였다. 한편 라이게이션 시간 및 회전환 증폭 시간은 상황에 따라 조절될 수 있다. 예를 들어 결과를 형광으로 확인하는 경우 라이게이션 시간 및 회전환 증폭 시간이 훨씬 더 짧게 하는 것도 가능하며, 예를 들어 2시간 동안 라이게이션이 일어나도록 하고 2시간 동안 회전환 증폭이 일어나도록 한 후 관찰할 수 있다.
실험예 5에서와 같이, 음성대조군, 시료군, 양성대조군의 3개의 제 2 유로를 갖는 미세 유동 장치에서 일어나는 과정의 모식도를 도 13에 나타내었다.
결과는 도 14에 나타내었다. 도 14에서, 우측의 음성 대조군 제 2 유로에서는 배출구가 막히지 않아 시료가 흘러 나왔고, 중앙의 시료군 제 2 유로 및 좌측의 양성 대조군 제 2 유로에서는 회전환 증폭이 일어나 하이드로겔 덩어리가 형성되고 배출구를 막는 것이 관찰된다.
[부호의 설명]
100: 기판
101: 유입구
102: 제1유로
103: 제2유로
104: 배출구

Claims (17)

  1. 기판;
    상기 기판 상에 형성된 시료용액이 외부로부터 유입되는 유입구;
    상기 시료 유입구와 연결되어 유입된 시료용액을 수용하는 제 1 유로;
    상기 제 1 유로와 연결된 제 2 유로;
    상기 제 2 유로와 연결된 배출구;
    상기 제 2 유로 상의 코팅,
    상기 제 2 유로의 코팅 상에 고정된 프라이머; 및
    상기 프라이머에 상보적으로 결합된 템플레이트를 포함하고,
    상기 템플레이트는 표적 유전자와 상보적으로 결합하는 결합 부위, 상기 프라이머에 상보적으로 결합하는 결합 부위, 덤벨 형태를 형성하기 위한 템플레이트 내 상보적인 결합 부위를 포함하고,
    상기 표적 유전자와 상보적으로 결합하는 결합부위는 템플레이트의 양 말단에 분리되어 형성되고, 상기 프라이머에 상보적으로 결합하는 결합 부위는 분리되어 형성된 상기 덤벨 형태를 형성하기 위한 템플레이트 내 상보적인 결합 부위 사이에 형성된 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제 2 유로는 1 내지 20개인 표적 소분자 검출용 미세 유동 장치.
  3. 제1항에 있어서, 상기 제 2 유로는 2 내지 20개이며, 제 1 유로의 말단에서 각각의 제 2 유로가 분지되고,
    각각의 제 2 유로 상에 고정된 프라이머에 결합된 표적 유전자 검출용 템플레이트는 서로 같거나 다른 유전자에 결합하는, 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치.
  4. 제1항에 있어서, 상기 제2 유로는 5-히드록시도파민 염산, 노르에피네프린, 에피네프린, 파이로갈롤아민, DOPA(3,4-Dihydroxyphenylalanine), 카테킨, 탄닌류, 파이로갈롤, 파이로카테콜, 헤파린-카테콜, 키토산-카테콜, 폴리에틸렌글리콜-카테콜, 폴리에틸렌이민-카테콜, 폴리메틸메타크릴레이트-카테콜, 히알루론산-카테콜, 폴리라이신-카테콜 (polylysine-catechol), 및 폴리라이신 (polylysine)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상으로 코팅된 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치.
  5. 제1항에 있어서, 상기 프라이머는 티올(thiol), 아민(amine), 하이드록실(hydroxyl), 카복실(carboxyl), 이소티오시아네이트(isothiocyanate), NHS 에스테르, 알데히드(aldehyde), 에폭시드(epoxide), 카보네이트(Carbonate), HOBt 에스테르, 글루타르알데히드(Glutaraldehyde), 카바메이트(carbamate), 이미다졸 카바메이트(imidazole carbamate), 말레이미드(maleimide), 아지리딘(aziridine), 설폰(sulfone), 비닐설폰(vinylsulfone), 하이드라진(hydrazine), 페닐 아자이드(phenyl azide), 벤조페논(benzophenone), 안트라퀴논(anthraquinone), 및 디엔(Diene) 기로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상으로 말단이 변형된 것인, 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치.
  6. 제1항에 있어서, 상기 코팅은 5-하이드록시도파민 염산이고, 상기 프라이머는 말단이 티올 또는 아민 기로 변형된 것인, 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치.
  7. 제1항에 있어서, 상기 표적 유전자는 조류독감, 사스(SARS), 용혈성 요독 증후군(hemolytic uremic syndrome) 및 혈변(bloddy diarrhea)(Escherichia coli O157:H7), 결핵(Mycobacterium tuberculosis), 탄저병(Bacillus anthracis), 폐렴(Streptococcus pneumonia), 말라리아(Plasmodium), 살모넬라(Salmonella), 간염(Hepatitis A, B, C, D 또는 E virus), 야토병균(Francisella tularensis), 페스트균(Yersinia pestis), 에르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica) 및 출혈열(Ebola virus), 및 메르스 코로나 바이러스(MERS-Cov virus)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상으로부터 유래된 표적 유전자인, 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치.
  8. 제1항에 있어서, 상기 템플레이트는 서열번호 1 내지 4, 서열번호 10, 서열번호 11 및 서열번호 16으로 이루어진 군으로부터 선택된, 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치.
  9. 제1항의 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치;
    dNTP;
    리가아제;
    및 등온 핵산 중합효소를 포함하는, 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치 키트.
  10. 제9항에 있어서, 상기 리가아제는 DNA 리가아제이고, 상기 등온 핵산 중합효소는 phi 29 폴리머라제인, 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치 키트.
  11. 제9항에 있어서, 염색 시약, 고염 용액(high salt solution), 또는 형광 시약을 더 포함하는, 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치 키트.
  12. 제9항에 있어서, 제1항의 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치의 상기 템플레이트는 서열번호 1 내지 4, 서열번호 10, 서열번호 11 및 서열번호 16으로 이루어진 군으로부터 선택된, 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치 키트.
  13. 다음 단계를 포함하는 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치를 제조하는 방법:
    (S1) 기판, 상기 기판 상에 형성된 외부로부터 유입되는 유입구, 상기 유입구와 연결되어 유입된 시료용액을 수용하는 제 1 유로, 상기 제 1 유로와 연결된 제 2 유로, 상기 제 2 유로와 연결된 배출구를 포함하는 미세 유동 장치를 제공하는 단계;
    (S2) 상기 미세 유동 장치의 제2 유로를 코팅하는 단계;
    (S3) 상기 코팅된 제 2 유로 상에 템플레이트와 결합할 수 있는 프라이머를 고정화하는 단계; 및
    (S4) 표적 유전자와 상보적으로 결합하는 결합 부위, 상기 프라이머에 상보적으로 결합하는 결합 부위, 덤벨 형태를 형성하기 위한 템플레이트 내 상보적인 결합 부위를 포함하는 템플레이트를, 상기 프라이머에 결합시키는 단계,
    여기서, 상기 표적 유전자와 상보적으로 결합하는 결합부위는 템플레이트의 양 말단에 분리되어 형성되고, 상기 프라이머에 상보적으로 결합하는 결합 부위는 분리되어 형성된 상기 덤벨 형태를 형성하기 위한 템플레이트 내 상보적인 결합 부위 사이에 형성된다.
  14. 다음 단계를 포함하는 제1항의 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치를 이용하여 표적 유전자를 검출하는 방법:
    (S1) 제1항의 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치를 제공하는 단계;
    (S2) 제 1 유로에 시료용액을 유입시키는 단계; 및
    (S3) 상기 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치의 제 2 유로에 dNTP, 리가아제, 및 등온 핵산 중합효소를 첨가하는 단계.
  15. 제14항에 있어서,
    (S4) 증폭된 유전자 산물이 엉기어 직경 50 μm 내지 5 mm의 크기를 가지는 하이드로겔이 제 2 유로 및 배출구에 형성되는 단계를 포함하는, 표적 유전자를 검출하는 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    (S5) 염색 시약, 고염 용액(high salt solution), 또는 형광 시약을 주입하는 단계를 더 포함하는, 표적 유전자를 검출하는 방법.
  17. 제14항에 있어서, 제1항의 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치의 상기 템플레이트는 서열번호 1 내지 4, 서열번호 10, 서열번호 11 및 서열번호 16으로 이루어진 군으로부터 선택된, 표적 유전자를 검출하는 방법.
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