KR20080096661A - 마이크로채널 장치를 이용한 표적 분자의 검출, 분리 또는격리 - Google Patents

마이크로채널 장치를 이용한 표적 분자의 검출, 분리 또는격리 Download PDF

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KR20080096661A
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Abstract

본 발명은 샘플로부터 원하는 표적 세포 또는 분자를 검출하거나 격리하는데 유용한 마이크로유동 장치, 키트 및 방법을 제공한다. 샘플을 포함하는 액체를 랜덤식 유동 통로를 포함하고, 격리제가 부착되는 마이크로유동 장치를 통하여 전달함으로써 원하는 표적 세포 또는 분자는 검출 및/또는 격리된다.

Description

마이크로채널 장치를 이용한 표적 분자의 검출, 분리 또는 격리{DETECTION, SEPARATION OR ISOLATION OF TARGET MOLECULES USING A MICROCHANNEL APPARATUS}
본 발명은 표적 세포 또는 분자의 검출 또는 격리에 관한 것으로, 특히 원하는 표적 세포 또는 분자의 검출 또는 격리에 유용한 장치, 키트 및 방법에 관한 것이다.
이종 세포군으로부터의 희귀 세포의 효과적인 격리 및 수집은 기초 과학 연구뿐만 아니라, 질병 진단 및 치료, 예컨대, 유전자 치료(gene therapy)에서의 이용을 위한 격리된 세포군에 대한 수요가 증가함에 따라, 높은 관심의 대상이 되고 있다. 예를 들어, 암세포와 같은 병적으로 변화된 세포는 더 큰 정상 세포군으로부터 분리될 수 있고, 이후에 깨끗해진 세포군은 환자에게로 다시 이식될 수 있다.
임신 중에 잠재적인 염색체 이상을 조기에 가려내는 것과 같이, 조기의 태아 진단을 위해 이종 모체 세포군으로부터 특정의 태아 세포를 격리하는 데에 있어서 두드러진 요구가 있다. 태아 세포는 양수천자(羊水穿刺)(amniocentesis) 및 융모막 융모 표본검사(chorionic villus sampling)와 같은 방법에 의해 얻어져 왔으나, 이러한 방법은 특히 태아에게 위험을 줄 수 있다. 일부 태아 세포는 순환하는 모체 혈액에 또한 존재하는데, 이러한 세포는 비록 아주 작은 수일지라도, 태아로부 터 모체 혈류로 건너갈 수 있기 때문이다. 모체 세포에 대한 태아 세포의 비율은 단지 수 ppm 정도이다. 그러므로, 모체 혈액의 모체 세포의 주요 군으로부터 희귀한 태아세포를 격리 및 수집하는 것과 관련된 중요한 과제들이 있다. 이러한 과제들은 자궁경관 점액(cervical mucus)으로부터 태아 세포를 분리하는 데에도 있으며, 단지 소량으로 존재하는 다른 생체분자의 검출 및 격리뿐만 아니라, 체액 등으로부터 다른 희귀한 세포를 회수하는 데에도 흔할 수 있다.
세포 분리는 표적 세포군을 어떤 고체상(solid phase)에 선택적이고, 탈착가능하게 부착시키기 위하여 특이적 친화성 리간드(specific affinity ligand)로 세포 표면상의 분자를 표적화(targeting)함으로써 흔히 이뤄진다. 비특이적으로 흡착된 세포는 세척에 의해 이후에 제거되고, 분석을 위한 표적 세포의 방출이 뒤따른다. 이러한 특이적 친화성 리간드는 항체, 렉틴(lectin), 수용체(receptor)이거나, 단백질, 호르몬, 탄수화물을 결합하는 다른 리간드, 또는 생리 활성(biological activity)을 갖는 다른 이러한 분자일 수 있다.
컬럼(cloumn) 분리 외에, 체액 등에서 발견될 수 있는 것과 같은 다양한 세포군으로부터 표적 세포를 분리하기 위한 다른 방법이 현재에도 개발되어 왔다. 공개된 미국 특허 출원 제2004/038315호는 방출가능 링커(releasable linker)를 모세관의 내부 강측 표면(luminal surface)에 부착하고, 이후 원하는 결합된 세포가 절단제(cleavage reagent)를 통하여 방출되어 회수된다. 공개된 미국 특허 출원 제2002/132316호는 이동성 광학적 경사 필드(optical gradient field)를 통하여 세포군을 분리하는 데 마이크로채널을 이용한다. 미국 특허 제6,074,827호에는 "농 축 채널(enrichment channel)"을 갖도록 구성된 마이크로유체 장치의 이용이 개시되었는데, 여기서는 샘플로부터 특정 핵산을 분리하고 식별하는 데 전기영동(electrophoresis)을 이용한다. 또한, 항체 또는 다른 결합 절편을 선택적으로 이용하여 원하는 표적 생체재료(biomaterial)를 보유하는 것이 언급되었다. 미국 특허 제6,432,630호는 채널을 통하여 생체입자(bioparticle)를 포함하는 유체의 유동을 안내하기 위한 마이크로유동 시스템을 개시하는데, 여기서는 선택적 굴절(selective deflection)이 이용되고, 이러한 시스템이 모체 혈액 샘플로부터 태아 세포를 분리되는 데 이용될 수 있음을 보여준다. 이러한 특허 및 공개된 출원의 개시 내용은 여기서 참조로서 결합된다.
미국 특허 제6,454,924호는 마이크로유체 장치를 개시하는데, 여기서는 분석 대상 물질(analyte)을 포함하는 액체가 포획제(capture agent)가 부착되는 직립 기둥(pillar)의 위에 배치된 샘플 표면을 지나 일반적으로 아래로 흐르게 되며, 이러한 기둥의 측면은 소수성(hydrophobic)으로 되어서 이들이 형성하는 채널 내에서의 유동을 촉진한다.
케이.타카하시(K.Takahashi)외, 나노바이오기술 학회지, 2, 5(2004년 6월 13일)(6 페이지)(이 내용은 여기서 참조로서 결합된다)에는, 칩 상의 세포 분리 시스템을 개시하는데, 여기서는 복수의 마이크로유체 입구 통로가 유리 플레이트에 결합되는 [포토레지스트(photoresist) 에폭시 수지에 형성된 마스터 주형에서 제조된]PDMS 플레이트에 형성된 중앙 세포-분류 영역으로 안내한다. 아가겔(agar gel) 전극이 PDMS 플레이트에 마련되는데, 이는 정전기력을 가함으로써 원하지 않는 세 포의 분리를 촉진시키고, 짧은 합류부의 세포-분류 영역을 통하는 세포의 유동 중에, 이러한 세포를 평행하고, 연속적인 완충 흐름이 되도록 통제한다. 큰 먼지 입자를 물리적으로 잡기 위하여 기둥(post)을 이용하는 사전-필터(pre-filter)가 또한 도시되었다. 공개된 국제 출원 WO 2004/029221호는 모체의 RBC의 선택적 용해에 의해 모체 혈액으로부터 태아의 RBC를 분리하는 것과 같이, 세포 분리를 위해 사용될 수 있는 유사하게 형성된 마이크로 유체 장치를 개시한다. 세포를 포함하는 샘플은 또한 전체 세포를 분리하는 마이크로유체 채널 장치로 도입될 수 있는데, 이것은 복수의 실린더형 방해물을 포함하고, 이 방해물의 표면은 거기에 적절히 결합되는 결합부(binding moieties), 예컨대, 항체를 갖고, 이 부분은 샘플의 세포와 결합한다. 미국 특허 제5,637,469호는 100 마이크론이거나 그 미만의 깊이인 복수의 채널을 갖는 마이크로유체 장치를 개시하는데, 항체와 같은 결합 부분은 표면상에 고정되어 원위치에서 분석될 수 있는, 관심이 있는 생체분자를 포획한다. 미국 특허 제5,147,607호는 샌드위치 측정법과 같은, 면역 분석법(immunoassays)을 수행하기 위한 장치의 이용을 교시하는데, 여기서는 항체가 마이크로채널 내에 결집된다. 리세스된 부위가 돌출부 그룹을 포함하는 마이크로채널 내에 마련될 수 있는데, 이 돌출부는 채널의 하부 표면으로부터 위로 연장하고 돌출부에 항체가 고정된다.
동시 계류중인 미국 특허 출원 제11/038,920호 및 제60/678,004호는 모체 혈액으로부터 태아의 적혈구 세포를 또는 자궁경관 점액(cervical mucus)으로부터 영양막세포(trophoblast)를 분리하는 것과 같이, 세포 분리에 이용될 수 있는 마이크 로유체 장치를 개시하는데, 이 내용은 여기서 참조로서 결합된다. 마이크로유체 채널은 한 조의 불규칙한 패턴의 가로 기둥을 포함하는데, 이 가로 기둥은 전략적으로 위치되어 직선 및 유선형의 유동을 방해함으로써 기둥을 포함하는 영역의 표면에 적절히 결합되는 격리제(sequestering agents), 예컨대, 항체로 표적 세포를 효과적으로 포획한다. 이상의 간략히 설명된 2개의 적용은 체액 등으로부터 세포 또는 다른 생체재료를 격리시키기 위한 개선된 분리 방법을 제공할지라도, 이러한 기술은 초기단계인 것으로 생각되며, 표적 세포 또는 분자를 검출하거나 격리시키기 위한 개선된 장치 및 방법에 대한 연구는 계속된다.
본 발명은 랜덤식 유동 패턴, 특히 랜덤식 유체의 복수 채널 장치에 의해 제공되는 랜덤식 유동 패턴이 표적 분자 또는 개체(entity)를 격리시키거나 검출하는 데 이용될 수 있음을 개시한다. 따라서 본 발명은 표적 분자, 특히 표적 세포 또는 생물학적 분자를 격리시키거나 검출하는 데 유용한 장치 및 방법을 제공한다.
일 실시예에서, 본 발명은 마이크로유동 장치를 제공한다. 마이크로유동 장치는 입구 수단, 출구 수단, 및 이러한 입구 및 출구 수단 사이에서 연장하는 마이크로채널 배열을 포함하는 랜덤식 유동 통로를 갖는 본체; 유동 통로가 누출에 대해 실링(sealing)되기 위하여 본체에 접촉되는 폐쇄 플레이트를 포함하는데, 마이크로채널 배열은, 마이크로채널의 베이스 표면과 일체로 형성되고 베이스 표면으로부터 폐쇄 플레이트의 표면으로 돌출하는 복수의 횡단 분리기 기둥을 포함하며, 기둥은 랜덤식 유동 통로를 제공할 수 있는 패턴으로 배치된다.
다른 실시에에서, 본 본 발명은 본 발명의 장치 및 마이크로채널 및 폐쇄 플레이트의 표면을 격리제로 코팅하는 것에 대한 사용설명서를 포함하는 키트를 제공한다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 마이크로채널 및 폐쇄 플레이트의 표면이 격리제로 코팅되는, 본 발명의 장치를 포함하는 키트를 제공한다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 샘플 내의 표적 분자를 격리시키거나 포획하는 방법을 제공한다. 이 방법은 샘플을 포함하는 액체를 본 발명의 장치의 마이크로채널을 통하여 흐르도록 하는 단계를 포함하는데, 마이크로채널 및 폐쇄 플레이트의 표면은 표적 분자와 결합가능한 격리제로 코팅된다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 샘플 내의 표적 분자를 검출하는 방법을 제공한다. 이 방법은 샘플을 포함하는 액체를 본 발명의 장치의 마이크로채널을 통하여 흐르도록 하는 단계로서, 마이크로채널 및 폐쇄 플레이트의 표면이 표적 분자와 결합가능한 격리제로 코팅되는 것인 단계 및 표적 분자를 검출하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 샘플 내의 표적 분자를 검출하는 방법을 제공한다. 이 방법은 샘플을 포함하는 액체를 본 발명의 장치의 마이크로채널을 통하여 흐르도록 하는 단계로서, 마이크로채널 및 폐쇄 플레이트의 표면이 표적 분자와 결합가능한 격리제로 코팅되는 것인 단계; 폐쇄 플레이트의 표면상에 노출된 표적 분자를 갖는 폐쇄 플레이트를 본체로부터 분리시키는 단계, 및 표적 분자를 검출하는 단계를 포함한다.
도 1은 마이크로채널 통로 내에 제조된 수집 영역을 포함하여 분리기 기둥이 있는 것인, 본 발명의 일 실시예의 다양한 특징을 포함하는 마이크로유동 장치용 본체 저면의 사시도.
도 2는 횡단 분리기 기둥이 위치하는 도 1의 수집 영역의 부분을 도시하는 확대된 부분도.
도 3은 도 1의 본체의 저면도.
도 4는 상부 및 하부 플레이트 그리고 튜브형 슬리브와 결합한 것인, 도 1에 도시된 본체를 통합한 장치의 분해 사시도.
도 5는 슬리브가 없이 조립된 장치를 도시하는 것인, 도 4의 5-5 선을 따라 취해진 단면도.
도 6은 슬리브가 장치를 헐겁게 에워싸고 있는 것인, 도 5의 조립된 장치를 도시하는 단부도.
도 7은 슬리브가 조립된 장치상에 수축된 것인, 도 6과 유사한 도면.
도 8은 세포 회수 방법에 관하여 도 7의 장치를 이용을 보여주는 개략도.
도 9는 장치를 통한 샘플의 유동 후에, 장치의 입구 및 출구에 있는 연결부를 제거하고 마개를 삽입한 것인, 도 7의 장치의 사시도.
도 10은 마개가 제거되고 열수축 슬리브 내에 슬릿이 생성되고 있는 것을 보여주는 도 9와 유사한 사시도.
도 11은 슬릿이 완료된 후 본체의 상부 표면으로부터 상부 플레이트를 이동 시키면서 열수축 슬리브의 포장을 부분적으로 푼 장치를 보여주는 도 10과 유사한 도면.
도 12는 슬릿된 슬리브 및 상부 플레이트를 완벽히 제거한 이후에 본체를 단단한 하부 플레이트로부터 위로 벗기는 것을 보여주는 도 11과 유사한 도면.
본 발명은 랜덤식 유동 통로, 특히 랜덤식 유체의 복수 채널 장치에 의해 제공되는 랜덤식 유동 통로가 표적 분자 또는 개체(entity)를 격리시키거나 검출하는 데 이용될 수 있음을 개시한다. 따라서 본 발명은 표적 분자, 특히 표적 세포 또는 생물학적 분자를 격리시키거나 검출하는 데 유용한 장치, 키트 및 방법을 제공한다.
본 발명의 일 태양에 따르면, 본 발명은 입구 수단, 출구 수단, 및 입구와 출구 수단 사이에서 연장하는 마이크로채널 배열을 포함하는 랜덤식 유동 통로를 갖는 본체를 포함하는데, 유동 통로는 예컨대, 유동 통로를 통하여 흐르는 샘플의 실질적인 누출에 대하여 커버되거나 실링된다. 유동 통로 및/또는 마이크로채널 배열은 유동 통로를 포함하는 본체를 커버하거나 폐쇄하는 어떠한 종래의 또는 이후에 발견되는 수단, 예를 들어, 유동 통로를 통하여 흐르는 샘플의 누출을 실질적으로 차단할 수 있는 어떠한 재료를 이용하여 커버될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 커버 수단은 쉽게 신속하게 제거될 수 있다. 본체 내의 유동 통로 및/또는 마이크로채널 배열을 커버하기 위한 수단의 예는 단단하거나 가요성일 수 있는 플레이트 또는 리드(lid), 중합체 재료 또는 금속 호일로 제조된 시트와 같은 포장 재 료를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
커버 수단은 유동 통로를 커버 및/또는 실링하기 위하여 단순히 본체와 접촉하여 배치되거나, 커버 및 유동 통로를 갖는 본체를 서로 붙잡도록 압력이 가해질 수 있거나, 유동통로를 갖는 본체에 커버를 일시적으로 결합시키기 위해 실런트(sealant)가 사용될 수 있다. 더욱이, 커버 수단이 플레이트 또는 리드라면, 편평하거나/평면일 수 있으며 또는 상승면(raised side)일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 유동 통로를 갖는 본체는 플레이트, 예컨대, 폐쇄 플레이트로 커버된다. 플레이트는 당업자에게 알려진 어떠한 적합한 재료, 예컨대, 중합체 재료 또는 유리로 제조될 수 있다. 일 실시예에서, 플레이트는 유리로 제조된다. 플레이트는 단단한 것이 바람직하다. 더욱이, 플레이트는 코팅되지 않거나 중합체 재료로 코팅될 수 있다. 어떠한 적합한 중합체 재료 예컨대, 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane)이 플레이트를 코팅하는 데 이용될 수 있다.
유동 통로를 갖는 본체를 커버하는 데 이용되는 플레이트는 어떠한 형상 또는 크기일 수 있다. 바람직한 실시예에서, 플레이트는 편평하다. 다른 실시예에서, 플레이트는 적어도 유동 통로만큼 넓다. 또 다른 실시예에서, 플레이트는 유동 통로보다 넓다.
바람직한 실시예에서, 플레이트는 유동 통로를 포함하는 본체만큼 적어도 넓다. 플레이트는 본체보다 넓은 것이 바람직하다. 일 실시예에서, 본체의 폭은 플레이트의 폭의 약 40％ 내지 약 90％, 또는 약 40％ 내지 약 80％, 또는 약 40％ 내지 약 70％이다. 또 다른 실시예에서, 본체의 폭은 플레이트의 폭의 약 50％ 내 지 약 90％, 또는 약 50％ 내지 약 80％, 또는 약 50％ 내지 약 70％이다. 또 다른 실시예에서, 본체의 폭은 플레이트의 폭의 약 60％ 내지 약 90％, 또는 약 60％ 내지 약 80％, 또는 약 60％ 내지 약 70％이다.
바람직한 실시예에서, 유동 통로를 통하여 흐르는 샘플의 누출에 대해 내부에 포함된 유동 통로를 실링하기 위해서 플레이트는 유동 통로를 포함하는 본체와 누출-방지(leak-proof) 접촉을 한다. 이것은 당업자에게 알려진 어떠한 수단에 의해 달성될 수 있다. 이러한 수단의 예는 유동 통로 주위에서 편평한 표면 대 표면 접촉하는 것과 플레이트와 유동 통로를 갖는 본체를 서로 붙잡도록 선택적으로 압력 또는 힘을 가하는 것, 또는 플레이트를 유동 통로를 갖는 본체에 일시적으로 결합시키기 위해 실런트를 사용하는 것을 포함한다. 바람직한 실시예에서, 양호한 실링이 플레이트와 유동 통로를 갖는 본체 사이에서 이뤄지는데, 본체는 쉽게 신속하게 탈거된다.
따라서, 일 실시예에서, 플레이트는 유동 통로를 포함하는 본체와 표면 대 표면 접촉을 하여 플레이트의 상부 표면이 편평한, 본체의 하부 표면과 접하게 하고, 플레이트가 본체와 접촉을 유지하도록 압력이 가해져서 유동 통로가 누출에 대하여 실링되도록 한다. 바람직한 실시예에서, 플레이트는 본체에 결합되지 않는다. 다른 바람직한 실시예에서, 플레이트 및 본체를 에워싸는 데 시트가 이용되어 이들을 서로 표면 대 표면 접촉하도록 누르고 누출로부터 유동 통로를 실링하게 한다. 시트는 쉽게 제거가능한 것이 바람직하다. 시트는 중합체 재료를 포함하나 이에 제한적이지 않으며, 당업자에게 알려진 어떠한 적당한 재료로 제조될 수 있 다.
더욱이, 시트는 본체 및 플레이트 주위에 포장되어 이들을 서로 누르는 개방형 시트이거나 "수축 랩" 재료로서 상업적으로 가용할 수 있는 중합체 재료의 슬리브 또는 랩일 수 있다. 바람직한 실시예에서, 시트 또는 슬리브는 적어도 마이크로채널의 길이방향의 길이 전체에 걸쳐서 본체 및 플레이트를 에워싼다. 또 다른 바람직한 실시예에서, 본체 및 플레이트 주위에 초기에 헐겁게 맞춰지고 수축시 이들을 서로 누르는 슬리브 또는 랩이 누출로부터 유동 통로를 실링하는 데 이용된다. 슬리브 또는 랩의 수축은 당업자에게 알려진 어떠한 적합한 수단에 의해 이뤄질 수 있다. 열, 예컨대, 뜨거운 공기가 슬립브 또는 랩을 수축시키는 데 이용되는 것이 바람직하다. 사용되는 시트 또는 랩의 종류에 따라, 당업자는 본체 및 플레이트의 분리를 원하는 때에 랩을 제거하는 방법을 알고 있다. 예를 들어, 개방형 시트가 본체 및 플레이트 주위에 감싸져 이들을 서로 누른다면, 이후에 랩은 간단히 풀려질 수 있다. 본체 및 플레이트를 알맞게 맞추도록 수축된 슬리브의 경우, 랩은 슬릿된 후 장치로부터 절단되거나 벗겨질 수 있다.
마이크로유동 장치의 본체는 실리콘, 용융 실리카(fused silica), 유리 및 중합체 재료를 포함하나, 이에 제한되지 않으며, 어떠한 적합한 실험용으로 입수가능한 재료로부터 제조될 수 있다. 일 실시예에서, 중합체 재료, 바람직하게는 광학적으로 투명하고 적어도 어느 정도 가요성인 것이 사용된다. 사용될 수 있는 적합한 플라스틱은 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane)(PDMS), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmethacrylate)(PMMA), 폴리카보네이트(polycarbonate), 폴리스 티렌(polystyrene), 폴리에틸렌 테라프탈레이트(polyethylene teraphthalate) 뿐만 아니라 가용한 실험실 재료용으로 잘 알려진 다른 중합체 수지를 포함한다. 바람직한 실시예에서, 본체는 가요성 중합체 재료로부터 제조된다. 마이크로채널 배열을 수반하는 가요성 본체는 플레이트에 결합되지 않으면서 플레이트와 빈틈없는 접합에 의해 실링을 촉진시킨다. 사용되는 중합체 재료는 PDMS인 것이 바람직하다.
본체는 유동 통로 및 마이크로채널 배열을 수용하는 데 적합한 어떠한 형상으로 제조되거나 몰딩될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 본체는 실질적으로 평행 6면체 형상으로 몰딩된다.
다른 실시예에서, 본체는 본체 및 커버 플레이트의 분리를 용이하게 하는 수단을 포함한다. 이러한 수단의 예는 본체 및 커버를 분리하여 들어올리는 데 이용될 수 있는 본체 또는 플레이트의 어느 하나로부터 연장하는 탭, 또는 거기에 부착되는 핸들을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 바람직한 실시예에서, 본체는 일단부, 바람직하게는 길이방향의 단부로부터 연장하는 탭을 갖는다. 탭은 본체를 커버하는 데 이용되는 플레이트와 접촉하지 않는 일반적으로 본체의 상부 표면에 정렬되는 것이 바람직하다.
다른 실시예에서, 본체는 캡에 의해 선태적으로 상부 상에 커버된다. 캡은 본체의 위에 놓이는 것이 바람직하다. 이러한 실시예에서, 본체 및 플레이트를 서로 누르는 슬리브 또는 랩은 바람직하게는 캡 또한 에워싸므로, 에워싸는 랩은 본체를 캡 및 커버 플레이트 사이에 끼워 넣는다. 캡은 본체의 재료와 동일한 재료일 수도, 아닐 수도 있는 중합체 재료와 같은 어떠한 적합한 실험용 재료로 제조될 수 있다. 캡의 상부는 편평하거나, 곡면일 수 있으며 캡은 편평하거나 상승면을 가질 수 있다. 상승면은 경사진 것이 바람직하고, 이들이 길이방향의 측면을 따라 경사지는 것이 더 바람직하다.
바람직한 실시예에서, 캡은 본체 내의 유동 통로보다 적어도 약간 더 길고 적어도 약간 더 넓어서, 유동 통로 주변 전체에 대하여 본체 및 커버 플레이트 사이의 효과적인 실링을 보증한다. 캡은 본체의 길이보다 단지 약간 짧은 길이를 갖는 것이 유리하다.
캡의 폭은 본체의 폭보다 작거나 동일한 것이 바람직하다. 일 실시예에서, 캡은 자신의 최대 치수에서, 본체의 폭의 약 60％ 및 100％ 사이의 폭을 갖는다. 다른 실시예에서, 캡은 자신의 최대 치수에서, 본체의 폭의 약 70％ 및 100％ 사이의 폭을 갖고, 본체의 폭의 약 75％ 및 100％ 사이인 것이 바람직하고, 본체의 폭의 약 80％ 및 100％ 사이인 것이 더 바람직하고, 본체의 폭의 약 90％ 및 100％ 사이인 것이 훨씬 더 바람직하다.
위에서 언급된 바와 같이, 바람직한 실시예에서, 에워싸는 랩은 본체를 캡 및 커버 플레이트 사이에 끼워넣는다. 따라서, 캡 및 커버 플레이트 사이에 본체를 끼워넣는 데 있어서 랩에 의해 가해지는 힘이 전체 본체의 폭을 가로질러 퍼지게 하여, 유동 통로의 전체 주변을 따라 빈틈이 없는 실링을 보증하도록, 캡의 치수는 선택될 수 있다.
캡은 횡단 방향으로 통하여 연장하고, 본체의 입구 및 출구 수단에 각각 정렬되는 한 쌍의 개구부를 선택적으로 포함한다. 이러한 실시예에서, 둘러싸는 랩 은 한쌍의 이격된, 바람직하게는 캡의 개구부와 정렬되는 원형의 구멍을 선택적으로 포함한다.
본 발명의 일 실시예에서, 입구 수단 및 출구 수단은 각각, 입구 및 출구 통로이다. 입구 및 출구 통로는 어떠한 방향, 예컨대, 수직 또는 각을 이루거나/경사진 방향, 어떠한 형상의 단면, 예컨대, 실질적으로 원형, 실질적으로 사각형 등의 단면을 가질 수 있고, 동일 평면의 중심선 또는 축을 가질 수도 갖지 않을 수도 있다. 다른 실시예에서, 입구 및 출구 통로는 실질적으로 원형의 단면을 갖는다. 또 다른 실시예에서, 입구 통로는 일반적으로 원뿔 형상을 갖는다.
일 실시예에서, 입구 및 출구 통로의 축은 각을 이루거나/경사지고 본체의 하부 표면에 대하여 약 120˚ 및 약 150˚사이의 각으로, 바람직하게는 약 130˚ 및 140˚사이의 각으로, 더 바람직하게는 약 135˚로 각각 정렬된다. 다른 실시예에서, 입구 및 출구 통로의 축은 공통의 수직 평면에 있는 것이 바람직한데, 이 평면은 본체의 하부 평면에 수직이다. 바람직한 실시예에서, 입구 및 출구 통로의 축은 공통의 수직 평면 내에서, 서로 80˚ 및 100˚사이의 각으로, 더 바람직하게는 서로 약 90˚로 각을 이루며 배향된다.
입구 및 출구 통로는 하나 이상의 리저버 또는 우물 구조(well)에 선택적으로 연결될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 입구 통로는 일단부 상의 리저버 및 다른, 예컨대, 유동 통로 단부 상의 우물구조에 연결된다. 바람직하게는 이러한 리저버/우물 구조 조합은 샘플액의 약 50 ㎕ 내지 약 1000 ㎕, 바람직하게는 적어도 약 50 ㎕ 내지 약 500 ㎕를 보유하는 능력을 갖는다. 바람직한 실시예에서, 리저 버는 적어도 약 0.2 ㎖의 내부 체적을 갖는다.
본 발명의 마이크로채널 배열은 랜덤식(randomized) 유동 통로를 제공할 수 있는 어떠한 마이크로채널 패턴일 수 있다. 본 발명에 따라, 랜덤식 유동 통로는 최소치, 예컨대, 유선형 유동 또는 반복식 유동 패턴이 미량의 정도이거나 없는 것을 포함하는 어떠한 유동 통로일 수 있다. 일 실시예에서, 본 발명의 랜덤식 유동 통로는 유선형 유동 또는 반복식 유동 패턴을 갖지 않는 유동 통로이다. 다른 실시예에서, 본 발명의 랜덤식 유동 통로는 직선 유동을 방해하거나 저지하는 유동 통로이다. 또 다른 실시예에서, 본 발명의 랜덤식 유동 통로는 당업자에게 알려진 바와 같이 수학적으로 랜덤인 패턴에 상당하는 유동 통로이다.
본 발명의 랜덤식 유동 통로는 종래의 또는 이 분야에서 이후에 발견되는 어떠한 적합한 수단을 이용하여, 제공될 수 있다. 예컨대, 본 발명의 랜덤식 유동 통로는 복수의 횡단 분리기 기둥을 갖는 마이크로채널 배열을 이용하여 생성될 수 있는데, 이 분리기 기둥은 마이크로채널의 베이스 표면과 일체로 형성되고 거기서부터 돌출하며 본 발명의 랜덤식 유동 통로를 제공할 수 있는 패턴으로 배치된다. 바람직한 실시예에서, 기둥은 이 베이스 표면에 실질적으로 수직으로 정렬된다. 일반적으로, 마이크로채널 배열 내의 기둥, 예컨대, 단일 유닛 또는 영역은 크기별, 예컨대, 단면의 크기 및 형상에 따라 다양할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 마이크로채널 배열은 적어도 2개 또는 3개의 상이한 단면 크기, 예컨대, 크고, 작고, 중간인 크기를 갖는 기둥을 포함할 수 있다. 본 발명의 마이크로채널 배열은 또한 단일의 형상 또는 하나 초과의 형상을 갖는 기둥을 포함한다. 일반적으로 상이한 크기 및/또는 형상을 갖는 본 발명의 기둥은 본 발명의 랜덤 패턴을 따라 연속적으로 또는 균일하게 분포된다.
일 실시예에서, 기둥의 평균 단면 크기는 마이크로채널 배열을 통하여 유동되는 표적 분자의 크기와 관련된다. 보통, 기둥의 평균 단면 크기 및 표적 분자의 크기 사이의 상대적 비는 약 0.5:5, 0.5:8, 1:5, 1:8, 2:5, 2:9, 3:5, 또는 3:8이다. 다른 실시예에서, 기둥의 단면은 내부에 기둥을 포함하는 마이크로채널의 베이스 표면 단면의 약 20％ 내지 75％를 차지한다. 또 다른 실시예에서, 이러한 기둥의 총 체적(예컨대, 고체 부피 부분(solid volume fraction))은 마이크로채널의 총 체적(예컨대, 빈 체적 부분)의 약 15％ 내지 약 25％이다. 또 다른 실시예에서, 2개의 기둥 사이의 최소 거리는 기둥의 최소의 단면 크기와 관련되는데, 예를 들면, 기둥의 최소의 단면 크기와 동일하다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 기둥은 수학적 알고리즘, 예컨대, 컴퓨터 프로그램에 의해 생성되는 랜덤 패턴에 상응하는 패턴으로 배치될 수 있다. 예컨대, 어떤 사람은 어떠한 소정의 파라미터, 예컨대, 기둥의 총 개수와 2개의 기둥 사이의 최소 거리에 기초한 랜덤 패턴을 생성하는 수학적 알고리즘을 사용할 수 있다. 특히, 어떤 사람은 각각의 크기 그룹의 기둥의 총 개수와 2개 기둥 사이의 최소 거리를 확인하는 것(identifying)에 의한 수학적 알고리즘에 의해 생성되는 랜덤 패턴을 얻을 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 커버 플레이트의 표면, 예컨대, 마이크로채널 배열을 통하여 유동하는 샘플과 접촉하는 표면뿐만 아니라, 마이크로채널 배 열의 표면, 예컨대, 마이크로채널 배열 내부의 유동 통로의 표면은 적어도 하나의 격리제로 부분적으로 또는 전체적으로, 선택적으로 코팅될 수 있다. 보통, 격리제는 표적을 물리적으로 격리시키기 위하여, 표적 분자, 예컨대, 세포 또는 생물학적 분자와 특정의 방법으로 상호작용이 가능한 어떠한 개체(entity)일 수 있다.
본 발명의 격리제는 핵산, 예컨대, DNA, RNA, PNA, 또는 올리고뉴클리오티드(oligonucleotide), 리간드, 단백질, 예컨대, 수용체(receptor), 펩티드, 효소(enzyme), 효소 저해제(enzyme inhibitor), 효소-기질(enzyme-substrate), 면역글로불린(immunoglobulin)(특히 항체 또는 이들의 절편), 항원, 렉틴, 변형 단백질, 변형 펩티드, 생체 아민(biogenic amine) 및 복합 탄수화물을 포함할 수 있다. 합성 분자(synthetic molecule) 또한 이용될 수 있는데, 예를 들면, 어떠한 특정의 결합 활성(binding activity)을 갖게 하는 약물 및 합성 리간드이다. '변형' 단백질 또는 폴리펩티드는 새로운 화학 부위(moiety)의 추가에 의해, 존재하는 화학 부위의 제거에 의해, 또는 제거 및 추가 양자의 어떠한 조합에 의해 변경되는 분자 내부에 하나 이상의 아미노산을 갖는 이러한 단백질 또는 펩티드를 의미한다. 이러한 변경은 천연 및 합성 변형 모두를 포함할 수 있다. 천연 변형은 인산화반응(phosphorylation), 황산화(sulfation), 글리코실레이션(glycosylation), 뉴클레오티드 첨가, 및 리피데이션(lipidation)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 합성 변형은 히드로겔, 미세구조, 나노구조, 예컨대, 양자점(quantum dot), 또는 다른 합성 재료에 결합하는 것을 촉진시키는 화학적 링커를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 더욱이, 변형은 존재하는 작용 부위(functional moiety), 예컨대, 히드록실(hydroxyl), 설프히드릴(sulfhydryl) 또는 페닐(phenyl) 그룹의 제거, 또는 고유 측쇄(side chain) 또는 폴리펩티드 아미드 주사슬(backbone)의 제거 또는 변경을 포함할 수 있다.
복합 탄수화물의 예는 천연 및 합성의 선형 및 분지된(branched) 올리고당(oligosaccharide), 변형 다당류(polysaccharide), 예컨대, 당지질(glycolipid), 펩티도글리칸(peptidoglycan), 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan) 또는 아세틸레이티드 종(acetylated species) 뿐만 아니라, 이형(heterologous) 올리고당, 예컨대, N-아세틸글루코사민(N-acetylglucosamine) 또는 설페이티드(sulfated) 종을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 천연적으로 일어나는 복합 탄수화물의 예는 알부민(albumin) 및 IgG와 같은 변형 단백질 상에서 발견되는 키틴(chitin), 하이알루론산(hyaluronic acid), 케라틴 설페이트(keratin sulfate), 콘드로이탄 설페이트(chondroitan sulfate), 헤파린(heparin), 셀룰로오즈 및 탄수화물 부위가 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 마이크로채널의 표면, 예컨대, 마이크로채널 내부의 유동 통로의 표면 및 커버 플레이트의 표면, 예컨대, 유동 통로에 노출되거나 유동 통로를 통하여 흐르는 샘플과 접촉하는 커버 플레이트의 표면은 예컨대, 적어도 하나 또는 2개 이상의 격리제와 직접으로 또는 간접적으로 연결되거나 결합될 수 있다. 일 실시예에서, 이러한 시약의 2개 이상의 조합은 본 발명의 마이크로채널의 표면, 예컨대, 베이스 표면 및/또는 기둥의 표면, 및/또는 마이크로채널에 노출된 플레이트의 표면상에 고정되고, 이러한 조합은 2개의 개체의 혼 합물로서 부가되거나 연속적으로 부가될 수 있다.
본 발명의 다른 태양에 따르면, 본 발명은 본 발명의 장치, 및 선택적으로 사용설명서를 포함하는 키트를 제공한다. 일 실시예에서, 본 발명의 키트는 본 발명의 장치를 포함하는데, 마이크로채널 및 커버 플레이트의 표면은 격리제로 코팅되지 않고 키트는 마이크로채널 및 격리제를 갖는 플레이트의 표면을 코팅하는 것에 대한 사용설명서를 선택적으로 포함한다. 또 다른 실시예에서, 본 발명의 키트는 본 발명의 장치를 포함하는데, 마이크로채널 및 커버 플레이트의 표면은 격리제로 코팅되고, 키트는 이러한 장치를 사용하는 것에 대한 사용설명서를 선택적으로 포함한다.
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 본 발명은 표적 분자, 예컨대, 표적 생물학적 분자를 격리/포획하거나 검출하기 위해서 본 발명의 장치를 이용하는 방법을 제공한다. 이러한 표적 생물학적 분자는 핵산, 단백질, 펩티드, 바이러스, 탄수화물 등뿐만 아니라, 어떠한 다양한 종류의 세포일 수 있다. 일 실시예에서, 표적 생물학적 분자는 표적 세포이다. 용어 "세포"가 이러한 적용 전체에 걸쳐 사용될지라도, 격리제에 특이적인 표면 리간드를 마찬가지로 수반하는 세포 절편 및/또는 잔여물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 일 실시예에서, 본 발명의 표적 세포는 네오플라스틱(neoplastic), 예컨대, 암 또는 종양 세포이다. 다른 실시예에서, 본 발명의 표적 세포는 예컨대, 태아를 배고 있는 대상으로부터의 혈액 또는 자궁경관 점액 샘플 내의 태아 세포이다. 또 다른 실시예에서, 표적 세포는 샘플 내에 아주 적게 존재하는데, 예컨대, 샘플 내의 표적 세포 대 총 세포군의 비율은 약 1:107, 1:108, 또는 1:109 보다 작다.
본 발명의 장치에 의해 포획된 표적 분자는 제자리에서 또는 마이크로채널의 표면으로부터 방출된 이후에 검출되거나 분석될 수 있다. 예를 들어, 세포는 FISH 또는 어떠한 다른 적절한 방법을 통하여 제자리에서 직접적으로 검출될 수 있다. 뉴클레오티드 및 단백질은 또한 본 발명의 마이크로채널의 표면으로부터 방출되기 전 또는 후에 제자리에서 직접적으로 분석될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 본 발명은 샘플을 포함하는 액체가 본 발명의 마이크로채널을 통하여 흐르게 하도록 하는 것을 포함하는, 샘플 내의 표적 분자를 검출하거나 격리하는 방법을 제공하는데, 마이크로채널의 표면 및 커버 플레이트의 상부 표면은 표적 분자에 결합가능한 격리제로 코팅된다. 일단 샘플이 통하여 흐르면, 랩은 제거되고, 자신의 상부 표면상에 노출된 표적 분자를 갖는 커버 플레이트는 본체로부터 분리된다. 표적 분자는 예컨대, 커버 플레이트 자체의 상부 표면상에서 이제 검출될 수 있거나, 추가의 정제 또는 분석을 위해 수집될 수 있다.
다른 실시예에서, 포획된 표적 분자를 포함하는 마이크로채널 배열은 이러한 분리 이전에 세척된다. 또 다른 실시예에서, 포획된 표적 분자를 포함하는 마이크로채널 배열은 세척 단계 이후에, 그러나 플레이트로부터 본체를 분리하기 이전에 마이크로채널 및 플레이트의 표면으로부터 포획된 표적 분자를 방출하도록 화학 시약으로 처리된다. 또 다른 실시예에서, 본 발명의 마이크로유동 장치는 플레이트로부터 본체를 분리하기 이전에, 방출된 표적 분자가 폐쇄 플레이트의 상부 표면상 에 수집되도록 하기 위하여, 표적 분자가 방출된 후에 원심력을 받게 된다. 추가의 실시예에서, 본체는 가요성 중합체 재료로 제조되고 본체의 일단부에 마련된 탭을 이용하여 커버로부터 벗겨진다.
본 발명의 일 특정 실시예에 따르면, 마이크로유동 장치(11)가 제공되는데, 이 장치는 내부에 형성된 유동 통로를 갖는 본체(13)를 포함하고, 이 유동 통로는 수집 영역(17)으로 안내하는 입구(15) 및 수집 영역으로부터 나오는 출구(19)를 갖는 마이크로채널 배열을 포함한다. 이러한 기술에서 잘 알려진 바와 같이, 이러한 장치는 MEMS[마이크로 전자 기계 시스템(micro-electro-mechanical systems)]으로 현재 언급되는 분야의 칩, 디스크 등 상에 제조되는 집적 마이크로유체 장치의 일부일 수 있으나, 체액 샘플로부터 격리된 생체분자의 진단은 장치(11)의 해체 후에 수행되는 것이 바람직하다.
도 1 및 3은 본체(13)의 저면도인데, 여기에는 유동 통로가 형성되어, 이를 통하여 샘플 액이 흐르게 된다. 유동 통로는 각각, 본체(13)의 편평한 하부 표면(23)에 마련된 공동(cavity)(21)으로 안내하거나 거기로부터 나오는 비스듬히 배향된 입구 및 출구 통로(15, 19)를 포함한다. 통로(15, 19)는 동일한 수직 면에 놓인 중심선을 갖는 것이 바람직하다. 공동(21)은 액체 샘플용 우물구조의 역할을 할 수 있는 확대된 입구 단면(25)과 비스듬한 출구 통로(19)로 안내하는 짧은 방출 단면(27)을 포함할 수 있다. 입구 및 출구 통로 양자는 반대로, 본체(13)의 상부 편평한 표면(29)(도 4)에서 끝난다. 수집 영역(17)은, 액체 유동 통로에 횡단 방향으로 정렬되고 유동 채널의 수집 영역 부분의 전체 폭을 가로지르는 불규칙적이 고, 일반적으로 랜덤식인 패턴으로 정렬되는 복수의 직립 기둥(31)을 포함한다. 기둥(31)의 패턴으로 인해, 수집 영역(17)을 통하는 직선의 유동이 최소화되거나 없게 되고 유선형 유동 흐름이 붕괴되거나 방해받게 되어, 유동 통로를 따라 이동하게 되는 액체와 기둥의 표면 사이의 양호한 접촉을 보증한다. 기둥은 수집 영역(17)의 편평한 베이스(33)와 일체로 형성되는데, 이 베이스는 하부 표면(23)에 평행하고, 기둥은 거기로 수직으로 연장하며, 본체(13)의 편평한 하부 표면(23)에 수직한 표면을 제공한다. 편평한 폐쇄 플레이트(35)는 이하에 상세히 설명되는 바와 같이, 하부 표면(23)에 접하고 유동 채널을 밀폐시킨다. 유동 분배기(37)는 유동 통로의 수집 영역(17)으로의 입구 및 거기로부터의 출구에 인접하게 위치된다. 이러한 분배기는, 액체가 수집 영역(17)의 입구 단부로 전달되고 거기로부터 방출될 때, 액체의 유동을 더 균등하게 분배하도록 하는 역할을 한다.
이 장치를 통하는 유동은 예컨대, 주사기 펌프 등을 이용하는 펌프작동에 의해 이루질 수 있지만, 우물 구조(25)로 안내하는 입구 통로(15)에 설치된 원뿔형 리저버(39)(도 8)로부터 통하여 액체를 끌어당기는 진공에 의해 달성되는 것이 바람직하다. 이러한 리저버/우물 구조 조합은 약 50 ㎕ 내지 약 500 ㎕ 의 액체 샘플, 바람직하게는 적어도 약 200 ㎕ 를 수용할 수 있는 용량인 것이 바람직하다.
유동 채널의 디자인 때문에, 적당한 범위 내의 (예컨대 표준형 하바드 장치(Harvard Apparatus) 주입 주사기 펌프를 이용하는 모체 혈액의 주입은 약 0.05 내지 5 mm/s의 속도로 수집 영역(17)에서 유동을 형성) 본 장치를 통하는 유량에서, 난류를 형성하지 않으면서 이 영역을 통하는 유선형 유동은 실질적으로 붕괴하 게 되는데, 이것은 수집 영역(17)의 전체에 걸친 상이한 크기의 기둥의 랜덤식 배치와 기둥(31)의 상대적인 간격 덕분이다. 사각지대(dead spot)가 없는 상대적으로 평활하고, 비유선형의 유동은 약 0.05 내지 5 mm/s, 바람직하게는 약 0.1 내지 1 mm/s 의 평균 액체 유량에서 달성되고, 평균 유량이 약 0.2 내지 1 mm/s 사이에서 유지되는 것이 더욱 바람직하다. 바람직한 실시예에서, 원하는 유량은 정해진 크기의 입구 벽으로부터의 흡입에 의해 이뤄진다.
본체(13)가 어떠한 적절한 실험용으로 입수가능한 재료를 통하여 제조될지라도, 중합체 재료, 바람직하게는 시각적으로 투명하고 적어도 어느 정도 가요성인 중합체 재료를 이용하는 것이 바람직하다. 사용될 수 있는 적합한 플라스틱은 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리카보네이트, 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 테라프탈레이트 뿐만 아니라, 입수가능한 실험용 재료용으로 잘 알려진 중합체 수지(polymeric resin)를 포함한다. 가요성의 PDMS가 바람직하다. 패턴 형성된 공동을 갖는 이러한 본체는 종래의 몰딩(molding) 및 캐스팅(casting) 기술 중에서 선택된 것과 같이 어떠한 편리한 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 마이크로 채널 장치를 지닌 가요성 본체(13)는 플레이트(35)의 편평한 상부 표면에 결합 되지는 않으면서 그것과 빈틈이 없는 접합부를 형성함으로써 실링을 촉진한다. 이러한 플레이트(35)는 뻣뻣하거나 단단한 중합체 재료로부터 제조될 수 있거나 단순히 유리, 예컨대, 마이크로스코프 유리 슬라이드로 제조된 커버 플레이트일 수 있다. 플레이트의 조성에 따라, 얇은 PDMS 막을 거기에 결합시키는 것이 바람직할 수 있다.
본체(13)는 마스터 또는 네거티브 주형(negative mold) 구조로부터 제조될 수 있는데, 이러한 기술 분야에 잘 알려지고 나노바이오테크놀로지 저널의 기사( 이 개시된 내용은 여기서 참조로서 결합된다)에서 설명된 바와 같이, 이 구조는 광 리소그래피(optical lithography)를 이용하여, 두꺼운 네거티브 포토레지스트에서 제작될 수 있다. 예를 들어, 구조 층은 상업적으로 가용한, 표준 등급의 에폭시 수지(EPON SU-8) 포토레지스트 및 경화제(SU-8 2025)의 혼합물로부터 형성될 수 있는데, 이 혼합물은 2000 rpm으로 실리콘 웨이퍼 기판상에서 회전될 수 있어 예컨대, 40 또는 50 ㎛ 두께의 이러한 포토레지스트 막을 제공한다. 두께는 수집 영역(17)에서 유동 통로의 높이를 결정한다. 막은 정확하게 수평인 뜨거운 플레이트 상에서 60 ℃에서 3분 그 후 95 ℃에서 7분 동안 노출-전 베이킹(pre-exposure baking)을 받아 전체적으로 균일한 두께를 보증하고, 최종 샘플은 상온으로 냉각된다. 칼 서스 콘택트 마스크 얼라이너(Karl Suss Contact Mask Aligner)가 최종 장치(ultimate device)의 유동 통로를 위해 원하는 패턴을 갖는 막을 노출하는 데 이용된다. 막은 65 ℃에서 2분 동안 그 후에 95 ℃에서 5분 동안 노출-후 베이킹 된후, 5분 동안 상용 제품인 SU-8 현상액(developer)에서 현상되고, 현상(developing) 동안에는 광-교반(light stirring)이 가해진다. 이것은 이후에 PDMS 또는 다른 적합한 중합체 수지 내에서 패턴 형성된 기둥 본체의 복제를 위한 몰딩 마스터로서 이용되는, 에폭시 수지 포토레지스트 내의 네거티브 패턴 주형을 만든다.
일 예로서, PDMS 합성물은 10:1의 중량비로 PDMS 예비중합체(prepolymer) 및 경화제(curing agent)(Sylgard 184 kit, Dow Corning)의 혼합물로부터 마련된다. 혼합물은 진공하에 놓여져서 혼합과정 중에 형성될 수 있는 기포를 배출시킨 후, 원하는 깊이의 공동에 위치된 에폭시 수지 마스터 주형 위에서 부어져서, 원하는 두께의 본체를 제작하게 된다. 마스터 주형은 적합한 금속(예를 들어, 금)의 얇은 층(~50 nm)으로 선택적으로 사전-코팅될 수 있어 경화 후에 PDMS 복제품(replica)의 탈거를 증진시킨다. PDMS 본체의 경화는 80℃에서 90분 동안 수행될 수 있으나, 초기에는 PDMS의 경화부족에 의해, 이하에서 자세히 설명되는 바와 같이 기둥 표면을 포함하는 수집 영역의 후속하는 작용화를 촉진시키는 것이 가능할 수 있다.
수집 영역(17)에서의 마이크로채널 배열과 패턴 형성된 기둥(31)의 배치 및 치수는 마스터 주형의 제조 중 노출 단계에서 사용되는 마스크에 의해 정해진다. 공동(21)의 깊이는 마스터 주형의 SU-8 층의 두께에 의해 제어되는데, 이는 스핀-코팅 조건에 의해 정해진다. 도 2는 수집 영역(17) 내의 기둥(31)을 보여주는 공동(21)으로의 확대된 부분도를 제공하는 데, 기둥들은 바람직하게는 일반적으로 랜덤 방향으로 배치되어 있다.
아마도 도 4에서 가장 양호하게 도시된 바와 같이, 일 실시예의 마이크로유동 장치(11)는 4개의 주 부품을 포함한다. 바람직하게는 평행 6면체의 일반적인 형상을 갖도록 몰딩되는 본체(13), 및 편평한 하부 폐쇄 플레이트(35) 외에, 편평한 상부 캡 플레이트(41) 및 주위를 둘러싸는 중합체 랩(43)이 포함된다. 캡 플레이트(41)는 하부 폐쇄 플레이트와 대략 동일한 두께를 가질 수 있고, 동일한 뻣뻣하거나 강한 중합체 재료로부터 제조될 수 있다. 캡 플레이트는 유동 통로를 제공 하는 본체(13)의 하부 표면 내의 공동(21)보다 적어도 약간 더 길고 적어도 약간 더 넓은 치수를 가져서 공동의 전체 주변(perimeter)에 대하여 본체(13)의 하부 표면(23) 및 폐쇄 플레이트의 상부 표면(45) 사이에 효과적인 실링을 보증하는 유동 통로를 제공한다. 캡 플레이트(41)는 본체(13)의 주요 부분의 길이보다 단지 약간 작은 길이를 갖고, 이것의 가장 넓은 지점에서, 본체의 폭의 약 75％ 내지 100％의 폭을 갖는 것이 바람직하다. 캡 플레이트(41)의 길이방향의 측면 모서리(47)는 도 4 및 6에서 가장 양호하게 도시된 바와 같이 경사진 것이 바람직하다. 컷아웃 또는 개구부(49)는 캡 플레이트의 각각의 길이방향 단부에 마련되어 본체(13)의 상부 표면(29)의 입구 및 출구로의 통로를 제공한다.
앞서 설명한 바와 같이, 본체(13)는 PDMS와 같은 가요성, 중합체 재료로부터 몰딩되는 것이 바람직하고, 본체(13)는 하나의 길이방향의 단부로부터 연장하고 일반적으로 상부 표면(29)에 정렬되는 탭(51)을 갖는 것이 바람직하다. 탭(51)은, 이후 더 자세히 설명되는 바와 같이, 샘플의 표적 생체분자의 분리 이후에 본체(13) 및 편평한 플레이트(35)의 분리를 촉진한다. 공동(21)의 주변에 양호한 실링과 본체 및 편평한 폐쇄 플레이트(35)의 후속하는 준비된 분리를 이루기 위하여, 급속히 경감될 수 있는 방식으로 폐쇄 플레이트의 상부 표면(45)에 대하여 본체(13)를 누르게 하도록 어떤 장치가 제작되었다. 중합체 시트 재료의 랩(43)은 이러한 실링 압력을 형성하는 데 이용되는 것이 바람직한데, 이는 "수축-랩(shrink-wrap)" 재료와 같이 단순히 상업적으로 가용한 방향성 중합체 시트의 슬리브일 수 있다. 캡 플레이트(41)의 치수는, 본체를 플레이트(35 및 41) 사이에 끼워 넣을 때 이러한 랩에 의해 가해지는 힘이 전체 본체(13)의 폭을 가로질러 퍼져서, 공동(21)의 전체 주변에 빈틈이 없는 실링을 보증하도록 선택된다. 도 4에 도시된 바와 같이, 슬리브(43)에는 최종 조립된 장치(11) 내의 입구 및 출구 통로(15, 19)와 정렬되도록 위치된 한 쌍의 구멍(aperture)(53)이 마련된다.
서브 어셈블리가 폐쇄 플레이트(35)의 위에 놓인 본체(13)에 의해 제작되고 캡 플레이트(41)가 그 위에 바로 놓이게 되면, 이러한 서브 어셈블리는 도 6에 도시된 바와 같이, 슬리브(43) 내로 삽입된다. 구멍(49)은 입구 및 출구 통로(15, 19)와 정렬되고, 어셈블리는 이후에 슬리브의 열 수축을 일으키는 뜨거운 공기 등에 의해 가열되어, 슬리브의 둘레(girth)는 급격하게 줄어들고, 따라서 플레이트(35, 41)를 서로 향하도록 누르는 힘이 가해져 그 사이에 본체(14)를 단단히 끼우므로, 결과적으로 도 7에 도시된 구조가 된다. 캡 플레이트(41)의 상당한 폭은 이러한 힘을 균일하게 퍼뜨리고 본체(13)의 하부 표면(23) 내의 공동(21)의 전체 주변을 따라 빈틈없는 실링을 보증한다.
도 7에 도시된 조립된 장치는 모체 혈액으로부터 또는 자궁경관 점액으로부터의 태아 세포와 같은, 표적 생체분자를 회수하는 작업 중에 사용하기 위해 이제 준비되어 있다. 유동 통로의 내부, 및 특히 수집 영역(17)을 형성하는 모든 표면은 유도체화(derivatized) 되거나 관심 있는 표적 생체분자에 특이적인 격리제(sequestering agent)의 직접 또는 간접적인 부착을 촉진하는 코팅이 제공된다. 수집 영역(17)의 패턴 형성된 기둥의 코팅된 표면은 다양한 방식으로 유도체화 될 수 있어, 이러한 기술분야에서 알려진 바와 같이, 모든 표면상에, 원하는 표적 세 포 또는 다른 생체분자에 특이적인 격리제의 부착을 가능하게 한다. 일 실시예에서, 모든 표면은 친수성(hydrophilic) 층으로 코팅된다. 바람직한 실시예에서, 모든 표면은 PEG, PPG, 또는 이들의 공중합체(copolymer)의 이소시아네이트-기능성 중합체(isocyanate-functional polymer)를 포함하는 친수성의 투과성 히드로겔(hydrogel)로 코팅된다. 바람직하게는 적어도 약 1 마이크론의 두께인 친수성의 투과성 히드로겔이, PEG, PPG 또는 이들의 공중합체 및 폴리이소시아네이트의 반응 생성물인 이소시아네이트-기능성 예비중합체(prepolymer)를 포함하는 수용성(aqueous) 혼합물로부터 모든 표면상에 코팅된다.
격리제는 마이크로채널 및 플레이트의 모든 표면에 직접으로 또는 간접으로 결합될 수 있다. 일 실시예에서, 이들은 친수성 링커(linker) 또는 히드로겔 층을 통하여 결합된다. 또 다른 실시예에서, 격리제는 히드로겔의 이소시아네이트 그룹으로 직접적으로 또는 간접적으로 결합될 수 있다. 이러한 코팅 및 격리제의 부착에 대한 상세한 사항은 상기 언급된 2개의 계류중인 미국 특허 출원에 개시되어 있으며, 이 개시 내용은 여기서 참조로서 결합된다. 예를 들어, 간접적인 결합을 위해, 아비딘(avidin)과 같은 결합제가 코팅하는 데 이용되는 예비중합체의 수용액의 일부로서 포함될 수 있는데, 이 경우에 아비딘은 이러한 이소시아네이트 그룹에 공유적으로 연결된 후, 본 장치가 이후에 사용되는 분리 방법에서 관심 있는 특정한 생체 분자에 특이적인, 원하는 바이오틴화(biotinylated) 항체의 부착을 위한 기저(basis)를 제공한다.
수집 영역 전체에 걸쳐, 항체와 같은, 하나 이상의 격리제의 부착이 촉진되 므로, 격리제는 친수성 히드로겔 물질의 얇은 층으로 표면을 코팅함으로써, 더 효율적으로 수행하는데, 이 히드로겔 물질은 우레탄 결합에 의해 중합되고 반응성 이소시아네이트 그룹을 포함하는, 약 2000 내지 6000 달톤(dalton) 몰중량(MW)인 PEG, PPG 또는 이들의 공중합체를 포함하는 이소시아네이트-기능성 중합체이다. 일 실시예에서, 친수성 히드로겔의 층은 적어도 약 1 ㎛ 두께이다. 이러한 코팅 재료의 조성에 관한 상세사항은 2004년 12월 23일에 출원된, 동시 계류중인 미국 특허 출원 제11/021,304호에 개시되어 있으며, 이는 본 출원인의 양수인에게 양도되었다. 격리제가 히드로겔 코팅에 직접 또는 간접으로 부착될 수 있을지라도, 간접적인 고정화가 바람직하고 중간제(intermediate agent) 또는 첫 번째로 연결되는 물질의 이용을 고려해볼 수 있다. 중간제로서 결합쌍(coupling pair)을 이용하는 것이 바람직할 수 있는데, 예를 들어, 스트렙트아비딘(streptavidin), 또는 또 다른 종의 항체에 특이한 항체(Ab)는 히드로겔 코팅에 부착될 수 있으며, 이것은 그 후에 바이오틴화 항체에 또는 이러한 다른 종의 항체에 결합된다. 격리제로서 항체의 이용은 세포 분리에 바람직할 수 있고, 이러한 부착은 미국 특허 제5,646,404호에 개시되어 있으며, 이 내용은 여기서 참조로서 결합된다. 이러한 항체는 유리된 이소시아네이트 또는 등가의 그룹을 갖는 층으로 코팅되는 표면에 수용액 상태의 항체를 가함으로써 효과적으로 결합될 수 있다. 유리된 이소시아네이트 그룹을 갖는 친수성의 투과성 폴리우레탄계 히드로겔 층을 사용하는 것이 특히 바람직한데, 이러한 내용은 동시계류중인 2개의 특허 출원에 개시되었고 이후에 예제로 설명된다.
항체가 이용될 때, 항체는 이 기술 분야에 잘 알려진 어떠한 메카니즘을 이용하면서, 바람직하게는 이러한 중간제를 통하여, 적절히 부착된다. 예를 들어, 항체는 2-아미노타이올렌(aminothiolane)으로 처리될 수 있어 항체를 타이올레이트(thiolate)하고, 결과적인 타이올레트화 항체는 PEG-말레이미드(maleimide)로 처리된 기둥과 접합(conjugation)되는데, 대안으로, 항체는 반응성 이소시아네이트 그룹 또는 티오시아네이트(thiocyanate) 그룹을 갖는 적절한 친수성 코팅에 직접으로 공유적으로 결합될 수 있다.
항체 또는 다른 격리제가 수집 영역(17)의 패턴형성된 기둥 전체에 걸쳐 적절한 자리에 위치되면, 마이크로유동 장치(11)는 사용될 준비가 된다. 혈액 또는 소변(urine) 샘플과 같은 체액, 또는 표적 세포 또는 다른 생체분자 군을 포함하는 일부 다른 사전처리된 액체가 수집 영역(17)을 통하여 유동 통로를 따라 이동하게 되는데, 이것은 표준형 주사기 펌프로부터 입구 통로(15)로 조심스럽게 배출됨으로써, 또는 하부 단부가 통로(15)에 수용되고, 테스트를 위해 샘플의 원하는 체적을 보유할 수 있거나 주기적으로 다시 채워질 수 있는 샘플 리저버(39)로부터 입구 통로를 통하여 진공 펌프등에 의해 끌어 당겨짐으로써 이루어진다. 통로(15)는 원추형(frustoconical)인 것이 바람직하고 리저버와 같은 것이 사용될 때 이러한 원뿔형 리저버의 단부와 짝이 될 수 있도록 설계되는 것이 바람직하다. 펌프는 장치를 통하여 약 0.5 - 10 ㎛/min 사이의 유동을 이루도록 작동될 수 있는데, 약 0.01 cc의 체적을 갖는 장치에 대해, 약 3 내지 5 ㎛/min의 유량이 이용될 수 있다. 체액, 또는 처리 및/또는 분석되는 다른 세포를 포함하는 액체에 따라, 이러한 기술 분야에 알려진 바와 같이, 사전처리 단계는 그것의 체적을 줄이고/또는 원하지 않는 생체분자에서 그것을 제거하는 데 이용될 수 있다.
격리제(예컨대, 항체)는 본체의 베이스, 수집 영역(17)의 기둥 및 측벽에 그리고 이러한 영역의 폐쇄 플레이트(35)의 대면 상부 표면(45)에 부착된다. 적합하게 결합된 결과, 투과성 히드로겔의 내부 또는 상에 3차원 음각 형상을 가질 수 있는 격리제는 놀라울 정도로 효과적이다.
마이크로유동 장치(11)는, 도 8에 도시된 바와 같이, 중력 벡터 방향의 결과로, 균일한 유동을 형성하고, 액체가 처리될 때의 세포 또는 다른 생체 분자들과 수집 영역(17) 내의 장치의 표면 내부 사이의 접촉의 결합을 개선하기 위하여, 중력을 이용하여 작동된다. 이러한 실시예에서, 장치(11)는 수평에 대해 약 30˚ 내지 60˚의 각으로 베이스 또는 스탠드(55) 상에 지지된다. 장치는 약 45˚로 경사진 것이 바람직하다. 장치는 어떠한 적합한 방식, 예컨대, 장치의 상부 가장자리를 클램프 플레이트(57) 및 한 쌍의 스크류(59)를 이용하여 베이스(55)의 경사진 표면에 클램핑함으로써 제자리에 고정된다. 그러므로 수집 영역(17)의 복수의 기둥(31)은 마찬가지로 수평에 대해 약 45˚도로 향하게 된다. 입구 및 출구 통로로의 연결을 용이하게 하기 위하여, 이러한 2개의 통로는 본체(13)의 구성시에 유사하게 정렬된다. 일 실시예에서, 도 8에 도시된 바와 같이 장치가 수평에 대하여 약 45˚로 정렬될 때, 입구 통로(15)는 본체의 편평한 하부 표면(23)에 대하여 약 120˚ 내지 약 150˚의 각으로 더 바람직하게는 약 130˚ 내지 약 140˚의 각으로, 가장 바람직하게는 약 135˚의 각으로 정렬된다.
출구 통로(19)의 축 또는 중심선은 유사하게 정렬된다. 더욱이, 입구 및 출구 통로의 축은 동일한 수직 평면에 놓이는 것이 바람직한데, 이 평면은 본체(13)의 편평한 하부 표면(23)에 수직하고, 입구 및 출구는 서로에 대하여 80˚ 내지 100˚ 더 바람직하게는, 약 90˚의 각도로 배향되는 것이 바람직하다. 도 8에 도시된, 이러한 바람직한 작동 방향에서, 입구 통로(15)는 수직하고 출구 통로(19)는 수평하므로, 배출 유동의 일부로서 상방으로 이동할 필요없이 수평 방향으로 배출되는 것처럼, 액체 샘플을 공급하는 데 중력이 돕도록 해주며 유체 흐름이 부드럽게 배출되도록 도와준다.
적어도 2개, 바람직하게는 적어도 3개의 상이한 직경을 갖는 기둥(31)의 불규칙적 패턴이 도 2에 도시되었고 이는 상기 언급된 계류중인 미국 출원에 보다 상세히 설명되었다. 이러한 기둥 패턴은 수집 영역을 통하는 직선 유동을 방지하거나 최소화시키고, 이것은 유선형 유동을 불안정하게 하고, 와류(eddy)를 생성하여 이러한 액체 샘플에서의 세포는 이들 와류 내에서 혼합된 힘의 벡터를 받게 된다는 것이 발견되었다. 수평에 대한 이러한 각, 예컨대, 약 45˚에서의 작동은 수용성 완충제의 밀도보다 더 큰 밀도를 갖는 세포에 대해 추가적인 힘 벡터를 더하는 데 있어서 상승적인 작용을 보이게 된다는 것이 발견되었다. 이러한 벡터는 수집 영역을 통하는 유동 통로의 중심선에 대하여 약 45˚로 배향되고, 액체 유동의 통로를 벗어나 수집 영역 내의 표면과 접촉하도록 세포를 안내하는 경향이 있으며, 표적 세포 포획에 상당한, 결과적으로 유리한 영향을 끼친다.
놀랍게도, 예컨대, 적어도 약 2, 3 또는 4개의 상이한 크기, 약 50 내지 약 150 마이크론의 직경, 바람직하게는, 약 70 내지 약 130 마이크론의 직경, 수집 영역(17)에서 약 50 내지 약 200 마이크론의 높이, 바람직하게는 약 100 마이크론의 높이 그리고 약 2 내지 4 mm의 폭을 지닌 원형 단면 기둥과 같이 상이한 단면 크기인 기둥(31)의 한 조의 랜덤식 또는 불규칙한 패턴은 기둥들 사이의 최소 간격이 50 내지 70 ㎛이고 바람직하게는 약 60 ㎛일 때, 액체 샘플의 유동으로부터 세포의 포획을 두드러지게 효과적으로 증진시킨다는 것이 나타났다. 기둥의 단면은 이들이 수집 영역 체적의 약 15 내지 25％를 차지하도록 되는 것이 특히 바람직한데, 기둥 모두는 베이스(33)에 수직하는 평행선에 의해 형성된 측벽을 갖는다.
장치를 통하여 액체 샘플의 통과가 완료된 후에, 표적 세포의 대부분은, 만약 샘플 내에 존재한다면, 수집 영역 내에 포획되어 있을 것이다. 이후에 세척이 완충제로 수행되어, 샘플의 일부였고 수집 영역(17) 내의 항체 또는 다른 격리제에 의해 강하게 포획되지는 않았지만, 히드로겔-코팅된 표면에 비특이적으로 결합될 수 있는 이질적인 생체재료를 제거한다. 효과적인 완충제로 세척하는 것은 실질적으로 모든 비특이적으로 결합된 재료를 제거함으로써 이 영역을 청소하여 수집 영역 내에 부착된 표적 세포만을 남기게 될 것이다.
일단 세척제로 세척하는 것이 완료되면, 바람직하게는 장치(11)가 이제 수평으로 정렬되고, 수집 영역(17)은 포획된 세포가 적절하게 방출되도록 하는 화학 시약(chemical reagent)으로 채워질 수 있다. 방출은, 화학적으로(예컨대, pH의 변화), 또는 효소의 절단제(enzymatic cleavage agents)등의 이용을 통하는 것과 같이, 이 기술분야에 잘 알려진 바와 같은 적합한 방법에 의해 이뤄질 수 있다. 예 를 들어, 수집 영역 내의 고체 표면에 연결되거나 결합된 부착으로부터 표적 세포를 방출하기 위하여, 시약은 격리제를 절단하는 데, 또는 이러한 시약과 세포 사이의 결합을 절단하는 데 적용될 수 있다. 항체 등을 부착하는 것과 포획된 리간드를 이후에 효과적으로 제거하는 것 양자 모두를 위한 특정한 방법이 미국 특허 제5,378,624호에서 논의되었다. 예를 들어, 세포가 표적 세포의 표면 특성에 특이적인 항체의 이용을 통하여 격리된다면, 방출은 트립신 또는 프로나아제(pronase) 또는 프로테이나아제 K(proteinase K)와 같은 다른 적합한 프로테아제(protease)를 포함하는 용액으로 처리되어 이루어진다. 대안으로, 콜라게나제(collagenase)가 이용되어 다른 격리제로부터의 방출을 달성할 수 있고, 또는 특이적으로 절단 가능한 링커가 격리제를 부착하는 데 이용될 수 있다. 이러한 절단 중에, 마이크로 채널의 입구(15) 및 출구(19)는 간단한 마개(stopper)(61)(도 9 참조)로 틀어막는 것이 바람직하고, 장치(11)는 이러한 방출 다음에 원심처리를 받을 수 있다. 원심처리(centrifuging)는 마개(61)를 제자리에 위치시키고 장치(11)를 배향시킨 채로 약 5분 동안 약 500g에 상당하는 속도로 수행될 수 있어 원심력은 표적 생체분자들을 이들이 수집되는 폐쇄 플레이트(35)의 편평한 표면(45)에 대하여 압력을 가한다. 원심처리의 완료시, 장치는 도 9에 도시된 바와 같이 배향되고, 수집 영역(17) 내의 표적 생체분자는 상부 플레이트 표면(45) 상에 기대어 부착되려는 경향이 있다. 장치(11)의 분해는 이후에 수행된다.
도 7에 도시된 바와 같이, 본체(13)의 각각의 길이방향의 측면 가장자리 바로 밖에는 개방된 삼각형 단면의 영역(63)이 있다. 이러한 개방된 영역(63)은 나 이프 또는 스칼펠(scalpel)에 의한 열수축 중합체 랩(43)의 슬리팅을 용이하게 하여(도 10 참조) 랩이 장치를 더 이상 감싸지 않게 한다. 슬릿 슬리브(43)가 풀려진 후에(도 11 참조), 원한다면, 편평한 상부 캡 플레이트(41)는 쉽게 제거되는데, 이는 일단 열수축 슬리브(43)가 슬릿되고 풀려지면 이러한 2개의 요소 사이의 물리적인 결합이 없기 때문이다. 이후에, 엄지 및 집게 손가락 사이에 탭(51)을 움켜쥐면, 본체(13)는 하부 폐쇄 플레이트의 상부 표면(45)으로부터 쉽게 벗겨지는데(도 12 참조) 이것은 이들이 표면 대 표면의 어떠한 결합 없이 단순히 눌려져 서로 인접한 접촉(abutting contact)을 하게 되기 때문이다.
결과적으로, 표적 생체분자는 커버 플레이트(35)의 상부 표면상에 존재하는데, 플레이트 자체의 편평한 표면(45) 상에 있는 동안에, 이들은, FISH 분석 또는 어떤 다른 적절한 분석에 의하는 것과 같이, 쉽게 현미경 검사를 받게 될 수 있다. 대안으로, 이들은 이 기술 분야에 알려진 바와 같이 분자 진단학(molecular diagnostics)의 이용에 의한 분석에 쉽게 이용될 수 있다.
이하의 예는 자궁경관 점액의 추출로부터 영양막세포을 격리하기 위한 이러한 타입의 시제품 마이크로유동 장치의 효과적인 이용을 도시한다. 물론, 이들은 본 발명의 어떤 실시예만을 단지 도시하는 것이며 본 명세서에 첨부된 청구항에 의해 정해지는 본 발명의 범주를 제한하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
예1
생체분자를 분리하기 위한 마이크로유동 장치가 도면에서와 같이 시제품 장치를 마련하도록 구성되었다. 본체(13)는 PDMS으로부터 형성되었고, 캡 플레이 트(41)는 제자리에 위치하고 있으며, 본체는, 치수적으로 유동 채널을 밀폐시키기 위해 치수적으로 방향성 중합체인 열수축 슬리브(43)에 의해, 편평한 유리 플레이트(35)에 대하여 눌려진다. 수집 영역(17) 전체에 걸친 내부 표면은 Dow Corning Z-6020 또는 Z-6011의 10 체적％ 용액으로 상온에서 30분 동안 배양(incubating)함으로써 유도체화된다. 에탄올로 세척한 후에, 이들은 약 1시간 동안 상온에서 무지방 우유로 처리되어 얇은 카세인(casein) 코팅을 형성한다. 10％ 에탄올이 포함된 물로 세척한 후에, 약 6000의 평균 MW을 갖는 이소시아네이트로 캡핑된 PEG 트리올(isocyanate-capped PEG triols)에 기초한 투과성 히드로겔로 모든 내부 표면을 코팅하도록 처리된다. 예비중합체 용액은 6부의 유기 용매, 즉, 아세토니트릴(acetonitrile) 및 DMF에 1 중량부의 중합체를 사용하여 제조되고, 이것은 BSA를 포함하는 pH 8.0 100 mM 붕산나트륨(sodium borate)에 1mg/㎖ 항체 용액으로 혼합된다. 특정한 코팅 제재(formulation)는 Acn(아세토니트릴)/DMF 내에 100mg 예비중합체; 수용성 붕산 완충제 내에 350 ㎕의 0.25 mg/㎖의 항체 혼합물; 및 수용성 붕산 완충제 내에 350 ㎕의 1 mg/㎖의 BSA를 포함한다. 제재는 약 2 중량％의 중합체를 포함한다. 자궁경관 점액의 샘플로부터 영양막세포을 격리시키기 위해, 예를 들어, 항체 혼합물은 태중 근원(fetal origin)인 영양막세포의 외부 표면에 의해 수반되는 리간드에 특이적인 Trop-1 및 Trop-2에 대한 항체를 포함한다. 제재는 마이크로유동 장치(11) 내에 약 25℃에서 2시간 동안 배양되도록 남겨진다. 이러한 배양기간 이후에, 유동 채널은 1％ BSA/PBS로 플러쉬(flush)되어 태아의 영양막세포 세포를 격리시키려 디자인된 항체 코팅된 표면을 제공한다.
이렇게 각도를 이루며 배치된 장치의 효과를 테스트하기 위해, BeWo 및 Jurkat 세포의 혼합물을 포함하는 공급액이 사용된다. BeWo 세포는 이것이 Trop-1 및 Trop-2 항원을 나타내기 때문에 선택되고, 반면에 Jurkat 세포는 아무것도 나타내지 않으므로 네거티브(negative) 제어 세포로서 역할을 한다.
충분한 테스트 공급 용액이 3회 실행을 위해 마련되는데, 이것은 1％ BSA/PBS 완충제 내에 약 1,500 BeWo 세포 및 약 1,500 Jurkat 세포를 포함한다. 공급액은 3개의 분취액(aliquot)으로 나눠지는데, 각각의 분취액은 약 500 BeWo 세포 및 약 500 Jurkat 세포를 포함한다. 3개의 동일한 마이크로유동 장치는 수직으로부터 약 45˚로 배향되고, 혼합된 세포 공급액의 하나의 분취액이 진공 펌프에 의해 공급되는 흡입작용 덕분에 각각을 통하여 흐르도록 된다. 1 ㎕/min, 3 ㎕/min, 및 5 ㎕/min의 상이한 유량이 이용된다.
이러한 테스트 장치를 통하는 유동 다음에는, PBS 완충제로 세척이 수행되고, 이후에 각각의 장치는 현미경에 의해 검사된다. 2개 그룹의 포획된 세포의 각각은 현미경을 사용하여 수동으로 개별적으로 카운트된다. 표적 BeWo 세포에 대해서, 낮은 속도에서, BeWo세포의 약 75％가 수집 채널 영역에 포획된다는 것이 밝혀졌다. 이러한 수치는 3 ㎕/min의 중간 유량에서 약 82％로 증가하고, 5 ㎕/min로 테스트된 최고의 유량에서 약 60％로 머무른다. 반면에, 수집 영역의 Jurkat 세포의 비특이적 결합은 가장 낮은 유량에서 상대적으로 높은, 즉, 약 45％이지만, 3 ㎕/min에서는 단지 약 15％로 떨어지고, 최고의 유량에서 5％ 미만이다. 45˚ 배향시의 성과는 뛰어난 것으로 검토되었고, 계산에 따르면 약 0.27 mm/sec의 수집 챔버 영역을 통하는 속도와 동일한 유량으로 작동시킴으로써, 비특이적으로 결합된 세포에 의해 최소한으로 오염된, 표적 세포의 탁월한 수집이 이뤄졌다.
예 2
동일한 구조의 또 다른 마이크로유동 장치는 Trop-1 및 Trop-2 항체들을 수반하는 투과성 히드로겔로 유사하게 코팅된다. 출산을 앞둔 모체(8-12 주 잉태)로부터의 자궁경관 점액은 HAM 배양액(Ham's media)(InVitrogen)으로 10 ㎖로 희석되고 30분 동안 37℃에서 DNAse(120 유닛)로 처리된다. 100 ㎛ 세포 여과체(cell strainer)를 통하여 여과한 후에, 세포는 30분 동안 1500 RPM으로 회전된다. 세포 펠릿(pellet)은 HAM 배양액(100 ㎕)에서 재부유(resuspend)되고, 진공 펌프에 출구 튜브를 연결하고 수직으로 배향된 원뿔형 리저버에 약 50 마이크로리터의 이러한 자궁경관 점액 추출물의 세포 부유물을 공급함으로써 Trop-1 및 Trop-2가 코팅된 마이크로유동 장치를 통과하게 된다. 펌프는 상온에서 바람직하게는 약 3-5 ㎕/min 속도로 마이크로유동 장치를 통하여 샘플 액체의 느리고 연속적인 유동을 발생하도록 작동된다. 이러한 기간 동안, 수집 영역의 표면에 부착된 Trop-1 및 Trop-2 항체는 샘플에 존재하는 영양막세포을 포획한다. 전체 샘플이 전달된 후에, 1％ BSA/PBS 수용성 완충제로 저속의 플러싱이 수행된다. 약 100 ㎕의 이러한 수용성 완충제가 약 10분의 기간에 걸쳐 장치를 통하여 공급되는데, 이는 장치의 유동 채널로부터 비특이적으로 결합된 생체재료를 제거한다. 2개의 추가적인 세척이 수행되는데, 각각 약 100 ㎕의 PBS + 1% BSA로, 제거를 확실히 하기 위해 약 10분의 기간 동안 수행된다.
세척이 종류된 후에, 장치 내의 유동 통로는 0.25％의 프로나아제 용액으로 가득차게 되고 본 장치로의 입구 및 본 장치로부터의 출구는 마개로 차단된다. 장치는 27℃에서 약 20 동안 수평의 방향에서 배양된다. 이러한 시간 기간의 완료시, 장치는 원심기에 장착되고 약 5분 동안 500g에서 회전되어, 새롭게 분리된 세포가 히드로겔 코팅된 편평한 폐쇄 플레이트의 표면에 대하여 원심력에 의한 힘을 받도록 하게 한다. 원심처리의 종료시, 수용성 프로나아제 용액은 장치로부터 배출된다. 중합체 열수축 슬리브는 본체의 한 측면의 가장자리를 따르는 삼각형 영역에서 슬릿되고 풀려져, 이후에 상부 캡 플레이트가 본체로부터 들어 올려진다. 탭은 움켜줘지고, 본체는 아래 놓인 편평한 폐쇄 플레이트로부터 조심스럽게 벗겨진다. 편평한 플레이트의 표면에 부착된 세포는 시스토케라틴-7(cystokeratin-7) 및 시토케라틴-17(cytokeratin-17)로 착색(stained)되는데, 이는 영양막세포 기원(origin)의 세포에 특이적이다. 영양막세포로 확인되는 세포는 이후에 FISH 기술을 이용하여 쉽게 분석된다.
본 발명은 이러한 발명을 수행하는 데 있어서 발명자에게 현재 알려진 최적 실시예(the best mode)을 구성하는 어떠한 바람직한 실시예에 관하여 기재되었을 지라도, 다음의 청구항에서 정해진 본 발명의 범주를 일탈하지 않으면서 당업자에게 명백할 수 있는 다양한 변경 및 수정이 이뤄질 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 어떠한 바람직한 재료가 마이크로채널이 형성된 기판의 제조용으로 기재되었을 지라도, 이러한 기술분야에 잘 알려진 것뿐만 아니라, 이와 같이 실험용 장치에 적합한 넓은 범위의 구조적 재료가 이용될 수 있다. 일반적으로 모체 혈액 샘플로부터 태아 세포 및 자궁경관 점액 추출물로부터 영양막세포의 분리에 대하여 중점을 두었을지라도, 본 발명은 다양한 혈액 세포, 예를 들어, 유핵적혈구(nucleated erythrocytes), 림프구(lymphocytes) 등, 전이 암 세포(metastatic cancer cells), 줄기 세포(stem cells), 등을 격리하는 데 유용한 것으로 이해되어야하며, 더욱이, 다른 생물학적 재료, 예컨대, 단백질, 탄수화물, 바이러스, 등 또한 액체 샘플로부터 분리될 수 있다. 샘플이 특정의 하위 세포군(subpopulation)을 포함할 때, 네거티브 농축(negative enrichment)은 포획될 원하지 않는 세포의 그룹을 표적화 함으로써 이뤄질 수 있다.
본 명세서에서 특히 확인되는 모든 미국 특허 및 출원의 개시 내용은 여기서 명백히 참조로서 결합된다. 본 발명의 특별한 특징은 이하의 청구항에서 강조된다.

Claims (35)

  1. 마이크로유동 장치로서,
    입구 수단, 출구 수단, 및 상기 입구 및 출구 수단 사이에서 연장하는 마이크로채널 배열을 포함하는 랜덤식 유동 통로를 갖는 본체;
    상기 유동 통로가 누출에 대하여 실링되도록 하기 위하여 상기 본체에 접촉되는 폐쇄 플레이트를 포함하고,
    상기 마이크로채널 배열은, 상기 마이크로채널의 베이스 표면과 일체로 형성되고 상기 베이스 표면으로부터 상기 폐쇄 플레이트의 표면으로 돌출하는 복수의 횡단 분리기 기둥을 포함하며,
    상기 기둥은 상기 랜덤식 유동 통로를 제공할 수 있는 패턴으로 배치되는 것인 마이크로유동 장치.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 기둥은 상기 베이스 표면에 실질적으로 수직으로 정렬되는 것인 마이크로유동 장치.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 기둥은 수학적 알로리즘에 의해 생성되는 랜덤식 패턴으로 배치되는 것인 마이크로유동 장치.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 기둥은 상기 기둥의 총 갯수 및 상기 기둥중 2개 사이의 최소 거리를 이용하는 수학적 알고리즘에 의해 생성되는 랜덤식 패턴으로 배치되는 것인 마이크로유동 장치.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 기둥은 적어도 2개의 상이한 단면 크기를 갖는 것인 마이크로유동 장치.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 기둥의 평균 단면 크기는 상기 마이크로채널을 통하여 유동되는 표적 분자의 크기에 관련되는 것인 마이크로유동 장치.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 기둥의 단면은 상기 마이크로채널의 상기 베이스 표면의 단면의 약 20％ 내지 약 75％을 차지하는 것인 마이크로유동 장치.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 기둥의 전체 체적은 상기 마이크로채널의 전체 체적의 약 15％ 내지 약 75％인 것인 마이크로유동 장치.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 2개의 기둥 사이의 최소 거리는 상기 기둥의 최소의 단면 크기에 관련되는 것인 마이크로유동 장치.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 본체 및 상기 폐쇄 플레이트를 감싸고 이들을 눌러서 서로 표면 접촉하게 하여 누출에 대하여 상기 유동 통로를 실링하는 중합체 시 트 랩을 더 포함하는 것인 마이크로유동 장치.
  11. 청구항 1에 있어서, 상기 본체는 가요성 중합체 재료로부터 몰딩되고 시트 랩은 상기 마이크로채널의 적어도 길이방향의 길이 전체에 걸쳐 상기 본체 및 상기 플레이트를 에워싸는 것인 마이크로유동 장치.
  12. 청구항 1에 있어서, 상기 본체는 본체의 일단부로부터 연장하는 탭을 포함하는 것인 마이크로유동 장치.
  13. 청구항 1에 있어서, 상기 본체는 상기 본체 위에 겹쳐져 놓인 캡을 갖는 실질적으로 평행 6면체의 형상으로 몰딩되고, 시트 랩은 상기 본체가 상기 캡과 상기 폐쇄 플레이트 사이에 끼워지는 상태로 상기 캡 및 폐쇄 플레이트를 에워싸는 것인 마이크로유동 장치.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 캡에는, 상기 캡을 횡단 방향으로 관통하여 연장하고, 상기 본체의 상기 입구 수단 및 상기 출구 수단 각각과 정렬되는 한 쌍의 개구부가 형성되는 것인 마이크로유동 장치.
  15. 청구항 14에 있어서, 에워싸는 상기 랩은, 상기 캡의 상기 개구부와 정렬되는 한 쌍의 이격된 구멍을 갖는 중합체 재료의 열수축 슬리브인 것인 마이크로유동 장치.
  16. 청구항 13에 있어서, 상기 캡은 상기 본체의 폭보다 미만이거나 동일한 폭을 갖고, 경사진 길이방향의 측면을 갖는 것인 마이크로유동 장치.
  17. 청구항 13에 있어서, 상기 캡은, 최대 폭 치수에서, 상기 본체의 폭의 약 75％ 내지 100％인 것인 마이크로유동 장치.
  18. 청구항 1에 있어서, 상기 본체는 상기 폐쇄 플레이트의 폭의 약 50％ 내지 80％의 폭을 갖는 것인 마이크로유동 장치.
  19. 청구항 1에 있어서, 상기 입구 수단 및 상기 출구 수단은 실질적으로 원형 단면의 통로를 포함하고, 이 통로는 상기 폐쇄 플레이트와 접촉하는 상기 본체의 표면에 각각 120˚ 내지 150˚로 정렬되는 축을 갖는 것인 마이크로유동 장치.
  20. 청구항 19에 있어서, 상기 축은 서로 80˚ 내지 100˚의 각도로 정렬되는 것인 마이크로유동 장치.
  21. 청구항 19에 있어서, 리저버가 상기 입구 통로에 수용되고, 상기 리저버는 적어도 약 0.2 ㎖의 내부 체적을 갖는 것인 마이크로유동 장치.
  22. 청구항 1에 있어서, 상기 마이크로채널의 상기 표면과 상기 폐쇄 플레이트의 상기 표면은 친수성 층으로 코팅되는 것인 마이크로유동 장치.
  23. 청구항 1에 있어서, 상기 마이크로채널의 상기 표면 및 상기 폐쇄 플레이트의 상기 표면은 PEG, PPG, 또는 이들의 공중합체의 이소시아네이트-기능성 중합체를 포함하는 친수성의 투과성 히드로겔로 코팅되는 것인 마이크로유동 장치.
  24. 청구항 1에 있어서, 상기 마이크로채널의 상기 표면 및 상기 폐쇄 플레이트의 상기 표면은 격리제로 코팅되는 것인 마이크로유동 장치.
  25. 청구항 1에 있어서, 격리제가 친수성 링커 또는 히드로겔 층에 의해 상기 마이크로채널의 상기 표면에 결합되는 것인 마이크로유동 장치.
  26. 청구항 1의 마이크로유동 장치, 및 상기 마이크로채널의 상기 표면 및 격리제를 갖는 상기 폐쇄 플레이트의 상기 표면을 코팅하기 위한 사용설명서를 포함하는 것인 키트.
  27. 청구항 1의 마이크로유동 장치를 포함하는 키트로서, 상기 마이크로채널의 상기 표면 및 상기 폐쇄 플레이트의 상기 표면은 격리제로 코팅되는 것인 키트.
  28. 샘플 내의 표적 분자를 격리시키거나 포획하는 방법으로서, 상기 방법은:
    상기 샘플을 포함하는 액체를 청구항 1의 상기 마이크로유동 장치의 상기 마이크로채널을 통하여 흐르도록 하는 단계를 포함하고, 상기 마이크로채널의 상기 표면 및 상기 폐쇄 플레이트의 상기 표면은 상기 표적 분자와 결합가능한 격리제로 코팅되는 것인 샘플 내의 표적 분자를 격리시키거나 포획하는 방법.
  29. 샘플 내의 표적 분자를 검출하는 방법으로서, 상기 방법은:
    상기 샘플을 포함하는 액체를 청구항 1의 상기 마이크로유동 장치의 상기 마이크로채널을 통하여 흐르도록 하는 단계로서, 상기 마이크로채널의 상기 표면 및 상기 폐쇄 플레이트의 상기 표면은 상기 표적 분자와 결합가능한 격리제로 코팅되는 것인 단계 및
    표적 분자를 검출하는 단계를 포함하는 것인 샘플 내의 표적 분자를 검출하는 방법.
  30. 샘플 내의 표적 분자를 검출하는 방법으로서, 상기 방법은:
    상기 샘플을 포함하는 액체를 청구항 1의 상기 마이크로유동 장치의 상기 마이크로채널을 통하여 흐르도록 하는 단계로서, 상기 마이크로채널의 상기 표면 및 상기 폐쇄 플레이트의 상기 표면은 상기 표적 분자와 결합가능한 격리제로 코팅되는 것인 단계;
    상기 폐쇄 플레이트의 상기 표면상에 노출된 상기 표적 분자를 갖는 상기 폐쇄 플레이트를 상기 본체로부터 분리시키는 단계; 및
    상기 표적 분자를 검출하는 단계를 포함하는 것인 샘플 내의 표적 분자를 검출하는 방법.
  31. 청구항 30에 있어서, 상기 포획된 표적 분자를 포함하는 상기 마이크로채널 배열은 상기 분리 이전에 세척되는 것인 샘플 내의 표적 분자를 검출하는 방법.
  32. 청구항 31에 있어서, 상기 마이크로채널은 화학 시약으로 처리되어 상기 분리 이전에 상기 마이크로채널의 상기 표면으로부터 상기 포획된 표적 분자를 방출하는 것인 샘플 내의 표적 분자를 검출하는 방법.
  33. 청구항 32에 있어서, 상기 방출 다음에, 상기 마이크로유동 장치는 원심력을 받아서 상기 방출된 표적 분자가 상기 분리 이전에 상기 폐쇄 플레이트 표면상에 수집되게 하는 것인 샘플 내의 표적 분자를 검출하는 방법.
  34. 청구항 30에 있어서, 상기 본체는 가요성 중합체 재료로 제조되고 상기 본체의 하나의 길이방향의 단부에 마련된 탭을 이용하여 상기 폐쇄 플레이트로부터 벗겨지는 것인 샘플 내의 표적 분자를 검출하는 방법.
  35. 청구항 30에 있어서, 상기 샘플은 약 0.2 내지 약 1 mm/sec의 평균 액체 유량으로 상기 마이크로채널을 통하여 흐르게 되는 것인 샘플 내의 표적 분자를 검출하는 방법.
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