JP2009523429A - マイクロチャネル装置を用いた標的分子の検出、分離または単離 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は一般に、標的細胞または標的分子の検出または単離に関し、より詳細には所望の標的細胞または標的分子を検出または単離するのに有用な装置、キット、および方法に関する。
異種細胞集団からの希少細胞の効果的な単離および収集は、疾病の診断および治療、例えば遺伝子治療における使用、ならびに基礎科学研究のための使用における単離細胞集団への需要の増加により、高い関心を保っている。例えば、病理学的に変化した細胞、例えば癌細胞を、より大きな正常細胞集団から分離することができ、その後、浄化した細胞集団を、患者に移植して戻してもよい。
本発明の発見は、ランダムフローパターン、とりわけランダム流体マルチチャネル配置により提供されるランダムフローパターンを使用して、標的分子または標的実体を単離または検出することができることである。したがって、本発明は標的分子、とりわけ標的細胞または標的生物分子を単離または検出するのに有用な装置および方法を提供する。
本発明の発見は、ランダム流路、とりわけランダム流体マルチチャネル配置により提供されるランダム流路を使用して、標的分子を単離または検出することができることである。したがって、本発明は標的分子、とりわけ標的細胞または標的生物分子を単離または検出するのに有用な装置、キット、および方法を提供する。
生物分子を分離するためのマイクロフロー装置を、図面にあるようなプロトタイプ装置を提供するように構築させる。本体13をPDMSから形成させ、キャッププレート41を定位置に配すると、位置関係的に配向されたポリマーの熱収縮スリーブ43により平らなガラスプレート35に対して押し付けられ、フローチャネルが封鎖される。収集領域17全体の内側表面は、室温で30分間、Dow Corning Z-6020またはZ-6011の10体積%溶液とともにインキュベートすることにより、誘導体化される。エタノールで洗浄した後、室温の脱脂乳で約1時間処理し、薄いカゼインコーティングを生成させる。10%エタノール水で洗浄後、処理を実行し、内側表面全てを約6000の平均MWを有するイソシアネート-キャップPEGトリオールをベースとする透過性ヒドロゲルでコーティングする。1重量部のポリマー対6部の有機溶媒、すなわち、アセトニトリルおよびDMFを用いてプレポリマー溶液を生成させ、これを、BSAを含むpH8.0の100mMホウ酸ナトリウムに溶解した1mg/ml抗体溶液と混合する。特異的なコーティング調製物はAcn/DMFに溶解した100mgプレポリマー;0.25mg/mlの抗体混合物を含むホウ酸緩衝水溶液350μL;および1mg/mlのBSAを含むホウ酸緩衝水溶液350μLを含む。調製物は約2重量%のポリマーを含む。頸管粘液試料からトロホブラストを単離するために、例えば、抗体混合物は、胎児由来のトロホブラストの外側表面が有するリガンドに特異的なTrop-1およびTrop-2に対する抗体を含む。調製物を25℃で2時間、マイクロフロー装置11内でインキュベートさせる。このインキュベーション期間後、フローチャネルを1% BSA/PBSで洗い流すと、胎児トロホブラスト細胞を単離するように設計された抗体コート表面が得られる。
同じ構成の別のマイクロフロー装置を同様に、Trop-1およびTrop-2抗体を有する透過性ヒドロゲルでコーティングする。妊娠中の母親(妊娠8〜12週)由来の頸管粘液をHAM媒質(InVitrogen)で10mlまで希釈し、DNAse(120単位)を用いて37℃で30分間処理する。100μm細胞濾過器を通して濾過した後、細胞を1500RPMで30分間スピンさせる。細胞ペレットをHAM媒質(100μl)中に再懸濁させ、出口チューブを真空ポンプに接続させ、頸管粘液抽出物のこの細胞懸濁液約50μlを垂直に配向させた円錐形リザーバに供給することにより、Trop-1およびTrop-2でコーティングされたマイクロフロー装置に通過させる。ポンプを動作させ、室温で、好ましくは約3〜5μl/分の速度で、マイクロフロー装置を通過する試料液の遅い連続流を発生させる。この期間中、収集領域中の表面に付着されたTrop-1およびTrop-2抗体は、試料中に存在するトロホブラストを捕捉する。試料全体が送達された後、緩徐な洗浄を1%BSA/PBS緩衝水溶液で実施する。この緩衝水溶液約100μlを、装置を通して、約10分の期間にわたり、供給し、装置内のフローチャネルから非特異的に結合された生物材料を除去する。各々PBS+1% BSA 100μlを用いた2回の追加の洗浄を約10分の期間にわたり実施し、確実に除去する。
Claims (35)
- 入口手段、出口手段、および入口手段と出口手段との間に延びるマイクロチャネル配置を備えるランダム流路を有する本体と;
該流路が漏出に対抗して密閉されるように本体と接触するクロージャプレートとを備え、
前記マイクロチャネル配置が、該マイクロチャネルのベース面と一体となりかつそこから前記クロージャプレートの表面へ突出する複数の横セパレータ柱(transverse separator post)を含み、
該柱が、前記ランダム流路を提供することができるパターンで配置される、
マイクロフロー装置。 - 柱がベース面に対し実質的に垂直に整列される、請求項1記載の装置。
- 柱が数学アルゴリズムにより生成されるランダムパターンで配置される、請求項1記載の装置。
- 柱が、数学アルゴリズムにより、柱の総数および2つの柱の最小距離を用いて生成されたランダムパターンで配置される、請求項1記載の装置。
- 柱が少なくとも2つの異なる断面サイズを有する、請求項1記載の装置。
- 柱の平均断面サイズが、マイクロチャネルを通して流される標的分子のサイズに関連する、請求項1記載の装置。
- 柱の断面が、マイクロチャネルのベース面の断面の約20%〜約75%を占める、請求項1記載の装置。
- 柱の総体積が、マイクロチャネルの総体積の約15%〜約25%である、請求項1記載の装置。
- 2つの柱の間の最小距離が、柱の最小断面サイズに関連する、請求項1記載の装置。
- 本体およびクロージャプレートを取り囲み、それらを押し付けて互いに表面対表面接触させることで、流路を漏出に対抗して密閉するポリマーシート包装をさらに備える、請求項1記載の装置。
- 本体が可撓性ポリマー材料から成形され、シート包装が、マイクロチャネルの少なくとも長軸全長にわたって本体およびプレートを取り囲む、請求項1記載の装置。
- 本体がその一端から延びるタブを備える、請求項1記載の装置。
- 本体が、本体の上に重ねられたキャップを伴う実質的に平行六面体の形状で成形され、シート包装が、該キャップとクロージャプレートとの間に挟まれた本体と共に、該キャップおよびクロージャプレートを取り囲む、請求項1記載の装置。
- キャップに、それを通って横方向に延びる一対の開口が形成され、該キャップが本体の入口手段および出口手段とそれぞれ整合される、請求項13記載の装置。
- 取り囲み包装が、キャップ内の開口と整合される一対の間隔を空けた孔を有するポリマー材料の熱収縮スリーブである、請求項14記載の装置。
- キャップが本体の幅より小さいかまたはそれに等しい幅、および傾斜のついた長軸側面を有する、請求項13記載の装置。
- キャップが、最も広い寸法のところで、本体の幅の約75%〜100%に等しい幅を有する、請求項13記載の装置。
- 本体が、クロージャプレートの幅の約50%〜80%に等しい幅を有する、請求項1記載の装置。
- 入口手段および出口手段が実質的に円形断面の通路を備え、該通路が、クロージャプレートと接触している本体の表面に対し120°〜150°でそれぞれ整合される軸を有する、請求項1記載の装置。
- 軸が互いに80°〜100°で角度が整合される、請求項19記載の装置。
- リザーバが入口通路に受け入れられ、該リザーバが少なくとも約0.2mlの内部体積を有する、請求項19記載の装置。
- マイクロチャネルの表面およびクロージャプレートの表面が親水性層でコーティングされる、請求項1記載の装置。
- マイクロチャネルの表面およびクロージャプレートの表面が、PEG、PPGのイソシアネート官能性ポリマーまたはそのコポリマーを含む親水性透過性ヒドロゲルでコーティングされている、請求項1記載の装置。
- マイクロチャネルの表面およびクロージャプレートの表面が封鎖剤(sequestering agent)でコーティングされている、請求項1記載の装置。
- 封鎖剤が、親水性リンカーまたはヒドロゲル層によりマイクロチャネルの表面に結合される、請求項1記載の装置。
- 請求項1記載の装置とマイクロチャネルの表面およびクロージャプレートの表面を封鎖剤でコーティングするための使用説明書とを含む、キット。
- マイクロチャネルの表面およびクロージャプレートの表面が封鎖剤でコーティングされている、請求項1記載の装置を含むキット。
- 以下の段階を含む、試料中の標的分子を単離または捕捉する方法:
試料を含む液体物体を請求項1記載の装置のマイクロチャネルを通して流す段階であって、マイクロチャネルの表面およびクロージャプレートの表面が、標的分子に結合することができる封鎖剤でコーティングされている、段階。 - 以下の段階を含む、試料中の標的分子を検出する方法:
試料を含む液体物体を請求項1記載の装置のマイクロチャネルを通して流す段階であって、マイクロチャネルの表面およびクロージャプレートの表面が、標的分子に結合することができる封鎖剤でコーティングされている、段階;および
標的分子を検出する段階。 - 以下の段階を含む、試料中の標的分子を検出する方法:
試料を含む液体物体を請求項1記載の装置のマイクロチャネルを通して流す段階であって、マイクロチャネルの表面およびクロージャプレートの表面が、標的分子に結合することができる封鎖剤でコーティングされている、段階;
クロージャプレートを本体から分離し、標的分子を該クロージャプレートの表面で露出させる段階;および
標的分子を検出する段階。 - 捕捉された標的分子を含むマイクロチャネル配置が、前記分離の前に洗浄される、請求項30記載の方法。
- マイクロチャネルが化学試薬で処理され、捕捉された標的分子が前記分離の前に該マイクロチャネルの表面から解放される、請求項31記載の方法。
- 解放後、装置が遠心力に供せられ、解放された標的分子が前記分離の前にクロージャプレート表面上で収集される、請求項32記載の方法。
- 本体が、可撓性ポリマー材料で作製され、その1つの長軸端に設けられたタブを用いてクロージャプレートから剥がされる、請求項30記載の方法。
- 試料が、約0.2〜約1mm/秒の平均液体流速でマイクロチャネルを通して流される、請求項30記載の方法。
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