JP2012505407A - 細胞試料調製用のマイクロ液体装置および方法 - Google Patents

Abstract

液体サンプルから試料を処理する装置は、前記液体サンプルを、フィルタからスライドへと試料を転置するよう構成された膨張可能な気嚢上に配置されたフィルタに供給するよう構成された１またはそれ以上のマイクロ流体チャネルの第１のセットを具える。この装置は、ほぼ単分子の粒子を凝集させるよう構成され、前記膨張可能な気嚢上に配置されたフィルタを通って流れる液体を取り除く１またはそれ以上のマイクロ流体チャネルの第２のセットを具える。装置はまた、圧力源と、当該圧力源および１またはそれ以上のマイクロ流体チャネルの第１のセットに連結されたサンプル容器と、フィルタを通る流量を測定するよう構成された流量ゲージと、１またはそれ以上のマイクロ流体チャネルの第１のセットに連結された染料源とを具えてもよい。
【選択図】図２

Description

開示する発明は、検鏡用の細胞表試料を調製するマイクロ液体装置および方法に関し、より具体的には、サンプル液体に懸濁している粒子を凝集させ、凝集させた粒子を検鏡用スライドに転置する装置および方法に関する。

パパニコロー染色塗抹試料（Ｐａｐ）を含む多くの医療試験は、施術者が器具で目標範囲の皮膚または粘膜をブラッシングおよび／またはひっかいて細胞を採取することが必要である。これらの細胞はその後スライド上に塗布され、固定されてスライドが染色される試験所へ送られる。このスライドはその後、細胞異常を特定すべく細胞検査技師および／または病理学者により顕微鏡で検査される。評価中は、病理学者は細胞核部分を染色する多染色法を用いて、形成異常や腫瘍形成が存在しないかを判定する。病理学者はまた、対比染色を適用して細胞質を検査することもある。サンプルは壊死組織片、血液、粘液、その他の曖昧な人工産物を含むため、この試験は評価が困難で、採取したサンプルの正確な診断評価ができないことがあった。

剥離細胞を液体保存薬中に回収して行う細胞学は、細胞を直接スライド上で染色する従来の方法に対して多くの利点がある。例えばＣｙｔｏｐｓｐｉｎ（商標）技術やＴｈｉｎ−ｐｒｅｐ（商標）技術といった濾過技術を用いて細胞懸濁液から調製されるスライドが、米国特許第６，６３４，２４４号、第６，５７２，８２４号、第６，５６２，２９９号、第６，３１８，１９０号、第６，２２５，１２５号、第６，０１０，９０９号、第５，９４２，７００号、第５，７７２，８１８号、第５，５０３，８０２号、第５，３６４，５９７号、第５，１４３，６２７号に開示されている。

濾過法は一般に、液体中に懸濁している細胞の凝集から始まる。これらの細胞は採取されてから保存液中に分散され、あるいはこれらは採取した体液中に自然に存在する。保存液中への分散は、例えばＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ（商標）溶液などのメタノールを含み、対象の細胞に影響を及ぼすことなく粘液や溶解赤血球などを破壊する。この液体はその後、開口部が膜で覆われたフィルタに通され、細胞が凝集され回収される。膜の細孔を通って流れる溶解赤血球や分散粘液などの残骸は膜に回収されず、分散と濾過を組み合わせたこの方法により大幅に低減される。その後、膜上に凝集された細胞がスライド上に移される。既存のフィルタ移動方法は、通常、膜からスライドへの細胞の移動が「セミドライ」環境、すなわち大部分の液体がフィルタアセンブリから取り去られた環境で行われる。

本書に開示の装置および方法は、ガラススライドなどの薄層上の細胞試料を調製するものであり、より具体的には、マイクロ液体技術を用いた「ウェット」環境で細胞試料を調製する装置および方法である。

一実施例において、液体サンプルから試料を処理する装置は、前記液体サンプルを、フィルタからスライドへと試料を転置するよう構成された膨張可能な気嚢上に配置されたフィルタに供給するよう構成された１またはそれ以上のマイクロ液体チャネルの第１のセットを具える。この装置は、ほぼ単分子の粒子を凝集させるよう構成され、前記膨張可能な気嚢上に配置されたフィルタを通って流れる液体を取り除く１またはそれ以上のマイクロ液体チャネルの第２のセットを具える。装置はまた、サンプル容器と１またはそれ以上のマイクロ液体チャネルの第１のセットとが連結された（あるいは連結可能な）圧力源と、フィルタを通る流量を測定するよう構成された流量ゲージと、１またはそれ以上のマイクロ液体チャネルの第１のセットに連結された染料源とを具えるか、これらに連結されてもよい。

別の実施例では、液体サンプルから試料を処理する装置は第１の層と第２の層とを具える。第１の層は、サンプル液体をフィルタに供給するよう構成された１またはそれ以上のマイクロ液体チャネルの第１のセットを具える。第２の層は、フィルタを通って流れる液体を取り除くよう構成された１またはそれ以上のマイクロ液体チャネルの第２のセットと、フィルタからスライドへ試料を移動させるべく、フィルタに対して構成され配置された膨張可能な気嚢を具える。この装置は、好適に試料のほぼ単分子層を凝集させるよう構成され、膨張可能な気嚢上に配置されたフィルタを通る液体の流れを除去するよう構成された１またはそれ以上のマイクロ液体チャネルの第２のセットを具える。装置はまた圧力源を具えるかこれに接続されており、圧力源に接続された（あるいは接続可能な）サンプル容器と、１またはそれ以上のマイクロ液体チャネルの第１のセットと、１またはそれ以上のマイクロ液体チャネルの第１のセットに接続された染料源とを有する。このフィルタは膜であってもよい。

さらに別の実施例では、液体サンプルから試料を処理する方法が、前記液体サンプルを、１またはそれ以上のマイクロ液体チャネルのセットおよびフィルタに圧送するステップと、フィルタ上に前記試料を凝集させるステップと、気嚢を膨張させて前記フィルタをスライドに接触させるステップとを具え、これにより凝集された試料がフィルタから薄層上へと移動する。フィルタ上に試料を凝集させるステップは、試料の単分子層を懸濁液から凝集させるステップと、凝集させた試料をスライド上に転置するステップを含む。この方法はまた、前記１またはそれ以上のマイクロ液体チャネルのセットを通して前記薄層の上の凝集された試料に染料を圧送するステップを具えるとともに、前記凝集させた試料により妨害されたフィルタの割合を算出するステップを具えてもよい。このフィルタは膜であってもよい。

図に示す装置は必ずしも縮尺通りではなく、図示する実施例の多様な態様および特徴を説明すべく強調されていることを理解されたい。
図１は、開示された発明の例示的な実施例に従って構成されたマイクロ液体細胞試料調製装置の斜視図である。 図２は、開示された発明の例示的な実施例に従って構成されたマイクロ液体回路の分解斜視図である。 図３Ａは、開示された発明の例示的な実施例に従って構成されたマイクロ液体ウェハの概略上面図である。 図３Ｂは、開示された発明の例示的な実施例に従って構成された別のマイクロ液体ウェハの概略底面図である。 図４Ａは、図２のマイクロ液体回路の概略分解斜視図である。 図４Ｂは、図４Ａのマイクロ液体回路の面Ｘにおける概略断面図である。 図５は、開示された発明の例示的な実施例にかかる細胞調製プロセスのフローチャートである。

開示する発明の実施例を、（可能な場合に）図面を参照しながら以下に説明する。しかしながら、明白に、開示の発明はこれらの説明および／または図示した実施例に限定されるものではなく、当業者であれば開示の発明およびその均等物の範囲のを逸脱することなく様々な変更や変形を考えることができる。また、図示や説明の簡単のために、開示の発明の異なる図や実施例において、同一または類似の構成または動作には同じ参照番号を用いることを理解されたい。

図１を参照すると、マイクロ液体細胞試料調整装置１００の一実施例は、サンプル液体（図示せず）を含むサンプルバイアル１０２を具える。このサンプルバイアル１０２に圧力源１０４が連結されている。この圧力源はポンプ１０６と、そこに接続された圧力容器１０８と、当該圧力容器１０８に接続された圧力ゲージと、前記圧力容器１０８およびサンプルバイアル１０２に接続された圧力制御バルブ１１２とを具える。ポンプ１０６は、圧力容器１０８を加圧するよう構成されている。圧力容器１０８内の圧力は、圧力ゲージ１１０を用いて監視される。圧力制御バルブ１１２は、圧力容器１０８とサンプルバイアル１０２間に介在し、サンプルバイアル１０２の圧力を調整するのに用いられる。

サンプルバイアル１０２はまた、マイクロ液体回路１１４に接続されており、これはサンプル液体（図示せず）に懸濁された粒子（図示せず）を凝集させ、凝集させた粒子（図示せず）を検鏡用にスライド１３０に移動させるよう構成されている。このマイクロ液体回路１１４はまた、当該マイクロ流体回路１１４を通る液体流量を測定するよう構成された流量ゲージ１１８に接続されている。

マイクロ流体細胞調製装置１００はまたコンピュータ１２０を具えており、これは流量ゲージ１１８で測定されたマイクロ流体回路１１４を通る液体流量を用いて、マイクロ流体回路１１４に適切な単細胞の密集した試料（図示せず）が回収されたかを判定するよう構成されている。上述の判定の詳細は、２００７年１２月２０日提出の暫定出願第６１／０１５，３４０号、名称「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ Ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ ｏｆ ａ Ｆｉｌｔｅｒ ｂｙ Ｆｌｕｉｄ Ｆｌｏｗ」に開示されている。このコンピュータ１２０はポンプ１０６と圧力制御バルブ１１２に接続してこれらを制御する。コンピュータ１２０は、圧力ゲージ１１０と流量ゲージ１１８に接続されこれらから情報を受信する。圧力ゲージ１１８はまた、廃物容器１２２に接続されている。

図２に示すように、マイクロ流体回路１１４は７層からなる。底部から始めると、ベースレイヤ１２４はマイクロ流体装置１１４を支持し、金属で形成されてもよい。このベースレイヤ１２４は、スライドレイヤ１２８が嵌る凹部１２６を具える。スライドレイヤ１２８は、試料（図示せず）が回収されるガラススライド１３０でできている。

次の層は、チャネルパターン１３４を有する入力レイヤ１３２であり、標準的な光リソグラフィ技術により製造されるシリコンウェハ上のＳＵ−８の反転モールドを用いたポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）の薄いシートで作られている。パターン１３４は、図３Ａに示すバイナリツリー構造とすることができる。本実施例では、パターン１３４は厚さ２００μｍｓであり、パターン１３４内の最も大きなチャネル１３６は幅約２ｍｍで、最も小さいチャネル１３８は幅約２００μｍｓである。パターン１３４は、最初に例えばＤＷＧＥｄｉｔｏｒ（商標）などのコンピュータ支援設計ソフトを用いて設計され、次にこのデザインを使ってフォトマスクを製造し、これをＳＵ−８などのフォトレジストのモールド形成に用いる。入力レイヤ１３２は、入力チャネル１４０と、染料出力チャネル１４２とを具える。

図１、２に示すように、入力チャネル１４０は、入力導管１４４と、入力管１４６とを介してサンプルバイアル１０２に接続されている。同様に、染料出力チャネル１４２は、染料出力導管１４８、染料出力管１５０および流量制御バルブ（図示せず）を介して廃物容器１２２に接続される。入力導管１４４と出力導管１４８は、ともに入力層１３２の上の層の開口部から形成されている。入力管１４６と出力管１５０は、通常の試験用の管（laboratory tubing）である。

図２、図３Ａを参照すると、円形開口キャビティ１５２が入力レイヤ１３２の中心に穿孔されており、チャネル１３４のパターンから次の層であるフィルタレイヤ１５６への入力経路１５４を形成している。このフィルタレイヤ１５６は、例えばＭｙｌａｒ Ｄで作成可能な標準的な経路エッチング膜１５８を有し、その周囲は隣接層と圧着または接着されている。別の実施例では、フィルタレイヤ１５４は、溶液中の粒子を凝集させるよう構成された別の器具を具えてよい。

次の層は出力レイヤ１６０である。図３Ｂに示すように、出力レイヤ１６０は、底側対向面１６２と、上側対向面１６４とを具える。底側対向面１６２はその上に、入力レイヤ１３２のパターンと似た出力チャネル１６６が設けられている。出力レイヤ１６０と出力チャネル１６６もまた、上述の一般的な光リソグラフィ技術を用いて作成することができる。図１、２に示すように、出力チャネル１６６は出力導管１６８および出力管１７０を通り、流量ゲージ１１８を介して廃物容器１２２へと接続されている。上側対向面１６４は次の層である移動レイヤ１７２に接着され、気嚢（bladder）１７４を形成している。

図４Ｂに示すように、移動レイヤ１７２はその底面１７８に凹部１７６を有している。出力レイヤの上面１６４は移動レイヤの底面１７８に接着されており、この凹部１７６を覆って気嚢１７４を形成している。図１、２に示すように、気嚢１７４は気道１８０および気管１８２を通って空気源１８４に接続されている。気管１８２は０．０４インチのＩＤ ｄｉａｍｅｔｅｒ Ｔｙｇｏｎ（商標）の管とすることができる。代替実施例では、移動層１７２は、フィルタレイヤ１５６から凝集させた試料をスライドレイヤ１２８へ機械的に移動させるよう構成された他の装置を具える。

図２を参照すると、その次であって最後の層はプレキシグラスレイヤ１８６であり、これはプレキシグラスと、入力導管１４４、染料出力導管１４８、出力導管１６８、およびこれらを通る気道１８０の一部でなる。このプレキシグラスレイヤ１８６はベースレイヤ１２４にボルト締めされ、７つの層（１２４、１２８、１３２、１５６、１６０、１７２、および１８６）をともに合体保持する。

図５は、液体サンプルからの試料の処理方法を示す。最初に、サンプル粒子を含んだ液体サンプルが、サンプルバイアル１０２に供給される（ステップＡ）。染料出力経路が閉じられ、その後圧力源１０４が作動され、圧力バルブ１１２が調整されて、流量ゲージ１１８により毎分約２５０マイクロリットルが測定される所望の開始流量を得るのに十分な圧力がかけられる（ステップＢ）。液体サンプルは、フィルタレイヤ１５６の膜１５８に適切な単細胞凝集試料が凝集されたことを示す流量の変化があるまで（サンプルの細胞濃度に応じて約数分）、等しい圧力でマイクロ流体回路１１４を通って流される（ステップＣ）。その後、圧力源が停止される（ステップＤ）。

次に、空気源１８４が作動されて、約１５立方センチメートルの空気が気管１８２内に圧送されて、気嚢１７４が拡張される（ステップＥ）。気嚢１７４が膨張すると、入力路１５４に沿って拡大し、気嚢１７４が膜１５８とともにガラススライド１３０上に凝集された試料を押す（ステップＦ）。その後空気源１８４が停止され、気嚢１７４から空気が放出される（ステップＧ）。気嚢１７４を構成する移動レイヤ１７２および出力層１６０のＰＤＭＳの伸縮性が、気嚢１７４をガラススライド１３０から離して収縮させる。この収縮の間、凝集された試料とガラススライド１３０の表面張力により、試料が膜１５８からスライド１３０へと移動する。入力レイヤ１３２に設計された開口部の形状により、ガラススライド１３０上に移動した細胞スポットの形状が決定される。

試料がガラススライド１３０に移動されたら、９５％アルコール溶液がマイクロ流体回路に数分間通される（ステップＨ）。次に、例えばＳａｋｕｒａ ＤＲＳ−６０１に用いられるような順序で染料と溶剤が連続的に入力レイヤ１３２に導入される（ステップＩ）。染料と溶剤はそれぞれ、バルブ制御されたマニホルド連結部（図示せず）を介して導入され、シーケンス内の次の染料または溶剤を導入することにより染料出力チャネルから押し出される（ステップＪ）。その後、染色された試料が付着したガラススライド１３０が、マイクロ流体回路から取り外される（ステップＫ）。

Claims (20)

1. 液体サンプルから試料を処理する装置であって、
   前記液体サンプルをフィルタに供給するよう構成された１またはそれ以上のマイクロ流体チャネルの第１のセットと、
   前記試料を前記フィルタから薄層に移動させるよう構成された移動機構とを具えることを特徴とする装置。
2. 請求項１の装置において、前記移動機構は膨張可能な気嚢を具えることを特徴とする装置。
3. 請求項１または２の装置において、前記サンプルは懸濁液中の粒子を含むとともに、前記装置は、前記懸濁液から前記粒子の空間的な分配を凝集させ、凝集させた粒子を前記薄層上に配置するよう構成されていることを特徴とする装置。
4. 請求項３の装置において、前記空間的な分配はほぼ単分子層を含み、前記薄層はスライドを含むことを特徴とする装置。
5. 請求項２の装置において、さらに、前記フィルタを通る液体を除去するよう構成された１またはそれ以上のマイクロ流体チャネルの第２のセットを具えることを特徴とする装置。
6. 請求項５の装置において、前記１またはそれ以上のマイクロ流体チャネルの第２のセットは、前記膨張可能な気嚢に設けられていることを特徴とする装置。
7. 請求項１乃至６のいずれかの装置において、さらに、
   圧力源と前記１またはそれ以上のマイクロ流体チャネルの第１のセットとに連結されるか連結可能なサンプル容器と、
   前記フィルタを通る流量を測定するよう構成された流量ゲージとを具えることを特徴とする装置。
8. 請求項１乃至７のいずれかの装置において、さらに、前記１またはそれ以上のマイクロ流体チャネルの第１のセットに接続された染料源を具えることを特徴とする装置。
9. 液体サンプルから試料を処理する装置であって、
   前記液体サンプルをフィルタに供給するよう構成された１またはそれ以上のマイクロ流体チャネルの第１のセットを含む第１の層と、
   前記フィルタを通る液体を除去するよう構成された１またはそれ以上のマイクロ流体チャネルの第２のセットと、前記フィルタから薄層へと前記試料を移動させるよう構成された移動機構とを含む第２の層と、
   を具えることを特徴とする装置。
10. 請求項９の装置において、前記移動機構は、膨張可能な気嚢を具えることを特徴とする装置。
11. 請求項９または１０の装置において、前記サンプルは懸濁液中の粒子を含むとともに、前記装置は、前記懸濁液から前記粒子の空間的な分配を凝集させ、凝集させた粒子を前記薄層上に配置するよう構成されており、前記空間的な分配はほぼ単分子層を含み、前記薄層はスライドを含むことを特徴とする装置。
12. 請求項１０の装置において、前記１またはそれ以上のマイクロ流体チャネルの第２のセットは、前記膨張可能な気嚢に設けられていることを特徴とする装置。
13. 請求項９乃至１２のいずれかの装置において、さらに、
    圧力源と前記１またはそれ以上のマイクロ流体チャネルの第１のセットとに連結されるか連結可能なサンプル容器と、
    前記１またはそれ以上のマイクロ流体チャネルの第１のセットに接続された染料源を具えることを特徴とする装置。
14. 液体サンプルから試料を処理する方法であって、
    前記液体サンプルを、１またはそれ以上のマイクロ流体チャネルのセットに圧送するステップと、
    フィルタ上に前記試料を凝集させるステップと、
    凝集させた試料を薄層状に移動させるステップと、を具えることを特徴とする方法。
15. 請求項１４の方法において、前記凝集させた試料を前記フィルタから前記薄層に移動させるステップは、気嚢を膨張させて前記フィルタを前記薄層に接触させるステップを含むことを特徴とする方法。
16. 請求項１４または１５の方法において、前記サンプルは懸濁液中の粒子を含むとともに、前記フィルタ上に試料を凝集させるステップは、前記懸濁液から前記粒子の空間的な分配を凝集させ、凝集させた分子を前記薄層状に載置するステップと、を含むことを特徴とする方法。
17. 請求項１６の方法において、前記空間的な分配はほぼ単分子層を含み、前記薄層はスライドを含むことを特徴とする方法。
18. 請求項１４乃至１７のいずれかの方法において、さらに、前記１またはそれ以上のマイクロ流体チャネルのセットを通して前記薄層の上の凝集された試料に染料を圧送するステップを具えることを特徴とする方法。
19. 請求項１４乃至１８のいずれかの方法において、さらに、前記フィルタを通る流量を測定するステップを具えることを特徴とする方法。
20. 請求項１９の方法において、さらに、測定された流量を用いて、前記凝集させた試料により妨害されたフィルタの割合を算出するステップを具えることを特徴とする方法。
    

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