WO2016017631A1 - γ－グルタミルシステイン及びグルタチオンの製造方法 - Google Patents

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glutamylcysteine
gsh
glutathione
amino acid
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増俊 野尻
八十原　良彦
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Kaneka Corp
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    • C12Y603/02—Acid—amino-acid ligases (peptide synthases)(6.3.2)
    • C12Y603/02003—Glutathione synthase (6.3.2.3)
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Definitions

  • the present invention relates to a method for producing ⁇ -glutamylcysteine.
  • the present invention also relates to a method for producing glutathione.
  • Glutathione is a peptide consisting of three amino acids, L-cysteine, L-glutamic acid, and glycine. It exists not only in the human body but also in many other living organisms such as other animals, plants, and microorganisms. It is an important compound for living organisms such as amino acid metabolism.
  • Glutathione is a reduced form of glutathione (N- (N- ⁇ -L-glutamyl-L-cysteinyl) glycine, hereinafter referred to as “GSH”), which is a form of SH in which the thiol group of the L-cysteine residue is reduced in vivo.
  • GSH glutathione
  • GSSG oxidized glutathione
  • Non-patent Document 1 As a method for producing glutathione, fermentation using Saccharomyces cerevisiae or Candida utilis (Non-patent Document 1), and ⁇ - in the presence of L-glutamic acid, L-cysteine, glycine, a surfactant or an organic solvent are used. Enzymatic methods using Escherichia coli or Saccharomyces cerevisiae cells produced by recombinant production of glutamylcysteine synthetase or glutathione synthetase as an enzyme source (patent documents 1 and 2) (non-patent documents 1 and 2) are common. It is.
  • the present inventors when performing the step of synthesizing glutathione from ⁇ -glutamylcysteine and glycine using an enzyme in an air atmosphere, not only reduced glutathione but also oxidized glutathione as a by-product. It has been found that there is a problem that a considerable amount of is produced and the yield of glutathione is lowered.
  • glutathione or “GSH” exclusively means “reduced glutathione”, and oxidized glutathione is expressed as “oxidized glutathione” or “GSSG”.
  • ⁇ -glutamylcysteine exclusively means “reduced ⁇ -glutamylcysteine”, and a compound in which two molecules of ⁇ -glutamylcysteine are oxidized and bonded by an —SS— bond is referred to as “oxidized ⁇ - ⁇ ”. -"Glutamylcysteine".
  • ATP adenosine triphosphate
  • the step A is performed by coupling with an ATP regeneration reaction for regenerating adenosine diphosphate (ADP, also referred to as adenosine 5′-diphosphate) to adenosine triphosphate (ATP).
  • ADP adenosine diphosphate
  • ATP adenosine triphosphate
  • ATP consumed in step A can be regenerated and the amount of ATP added can be reduced.
  • the ⁇ -glutamylcysteine synthetase used in the method (3) is preferable because it has a particularly high activity of producing ⁇ -glutamylcysteine from L-cysteine and L-glutamic acid.
  • the bifunctional glutathione synthetase used in the method (4) is preferable because of its particularly high activity of generating ⁇ -glutamylcysteine from L-cysteine and L-glutamic acid.
  • the production of oxidized glutathione as a by-product is suppressed, and glutathione can be produced with high efficiency.
  • step B is performed by coupling with an ATP regeneration reaction for regenerating adenosine diphosphate (ADP) to adenosine triphosphate (ATP).
  • ADP adenosine diphosphate
  • ATP adenosine triphosphate
  • ATP consumed in step B can be regenerated and the amount of ATP added can be reduced.
  • the glutathione synthetase used in the method (7) is preferable because it has particularly high activity to produce glutathione from ⁇ -glutamylcysteine and glycine.
  • the bifunctional glutathione synthetase used in the method (8) is preferable because of its particularly high activity for producing glutathione from ⁇ -glutamylcysteine and glycine.
  • L-cysteine and L-glutamic acid are produced by using at least one enzyme selected from the group consisting of ⁇ -glutamylcysteine synthetase and bifunctional glutathione synthetase in an atmosphere having an oxygen concentration lower than that of air. Further comprising a step A of reacting by action in the presence of adenosine triphosphate (ATP) to produce ⁇ -glutamylcysteine; ⁇ -glutamylcysteine used in Step B is produced by Step A. (5) The method according to any one of (8).
  • ATP adenosine triphosphate
  • glutathione can be efficiently produced from L-cysteine and L-glutamic acid with a small amount of by-product oxidized ⁇ -glutamylcysteine and oxidized glutathione.
  • step A is performed by coupling with an ATP regeneration reaction for regenerating adenosine diphosphate (ADP) into adenosine triphosphate (ATP).
  • ADP adenosine diphosphate
  • ATP adenosine triphosphate
  • ATP consumed in step A can be regenerated and the amount of ATP added can be reduced.
  • the ⁇ -glutamylcysteine synthetase used in the method (11) is preferable because it has a particularly high activity of producing ⁇ -glutamylcysteine from L-cysteine and L-glutamic acid.
  • the bifunctional glutathione synthetase used in the method (12) is preferable because of its particularly high activity of producing ⁇ -glutamylcysteine from L-cysteine and L-glutamic acid.
  • the step A ′ is more preferably the step A described in (1).
  • a method for producing glutathione comprising the step B ′ of producing glutathione by reacting ⁇ -glutamylcysteine and glycine in an atmosphere having an oxygen concentration lower than that of air.
  • the step B ′ is more preferably the step B described in (5).
  • the method further comprises a step A ′ of producing ⁇ -glutamylcysteine by reacting L-cysteine and L-glutamic acid in an atmosphere having an oxygen concentration lower than that of the atmosphere.
  • the step A ′ is more preferably the step A described in (1).
  • L-cysteine “L-glutamic acid”, “glycine” “ ⁇ -glutamylcysteine”, “glutathione”, “L-cystine”, “oxidized ⁇ -glutamylcysteine”, “oxidized form”
  • the air refers to the air on the ground, that is, air.
  • the present invention provides a method for producing ⁇ -glutamylcysteine in which by-production of oxidized ⁇ -glutamylcysteine is suppressed.
  • the present invention also provides a method for producing glutathione in which by-production of oxidized glutathione is suppressed.
  • ⁇ -glutamylcysteine synthetase is “GSH I”
  • glutathione synthetase is “GSH II”
  • bifunctional glutathione synthetase is “GSH F”
  • adenylate kinase is “ADK”
  • polyphosphate-dependent AMP transferase may be abbreviated as “PAP”.
  • ⁇ GSH I> The ⁇ -glutamylcysteine synthetase (GSH I) used in the present invention recognizes L-cysteine (L-Cys) as a substrate in the presence of ATP and binds to L-glutamic acid (L-Glu) to form ⁇ -An enzyme having an activity to catalyze a reaction for producing Glu-Cys, and its origin, structure, etc. are not particularly limited as long as it has the activity. In the present invention, this activity is referred to as ⁇ -glutamylcysteine synthetase activity. 1 U of the activity means the activity of producing 1 ⁇ mol of ⁇ -glutamylcysteine per minute at 30 ° C., and was measured under the following measurement conditions.
  • the reaction was performed by adding the enzyme solution to 50 mM Tris hydrochloride buffer (pH 8.0) containing 10 mM ATP, 15 mM L-glutamic acid, 15 mM L-cysteine, 10 mM magnesium sulfate, and keeping the temperature at 30 ° C. The reaction is stopped by adding. Quantitative determination of ⁇ -glutamylcysteine in the reaction solution using high performance liquid chromatography.
  • the conditions for the high performance liquid chromatography are as follows. Under these conditions, glutathione (GSH), ⁇ -glutamylcysteine ( ⁇ -GC), oxidized ⁇ -GC, and oxidized glutathione (GSSG) are eluted in this order.
  • GSH glutathione
  • ⁇ -GC ⁇ -glutamylcysteine
  • GSSG oxidized glutathione
  • GSH I it is preferable to use ⁇ -glutamylcysteine synthetase activity (specific activity) of 0.5 U or more per 1 mg of protein.
  • GSH I is not particularly limited, and those derived from microorganisms, animals, plants and the like can be used. GSH I derived from microorganisms is preferable, and GSH I derived from intestinal bacteria such as Escherichia coli, bacteria such as coryneform bacteria, eukaryotic microorganisms such as yeast, and the like is particularly preferable.
  • GSH I is not limited to GSH I consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9, and other polypeptides having GSH I activity, such as active mutants and other types of orthologs, can also be used.
  • the other polypeptide having GSH I activity is preferably 10% or more, preferably 40% or more, more preferably when GSH I consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 is used under the above activity measurement conditions.
  • polypeptides having GSH I activity such as the above-mentioned active mutants and other orthologs, for example, one to a plurality of amino acids are added, deleted or substituted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9.
  • a polypeptide comprising an amino acid sequence (particularly preferably, at least one or both of the N-terminal and C-terminal of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 are substituted, deleted and / or added, preferably Polypeptide having a deleted and / or added amino acid sequence) or 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, 95% or more, 97% or more with respect to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9.
  • a polypeptide comprising an amino acid sequence having 98% or more or 99% or more amino acid identity Furthermore, a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9, the aforementioned polypeptide consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are added, deleted or substituted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9, and SEQ ID NO: A fragment having GSH I activity of at least one polypeptide selected from the group consisting of the above-mentioned polypeptides consisting of the amino acid sequence having the above-mentioned amino acid sequence with respect to the amino acid sequence shown in FIG.
  • a polypeptide having an amino acid number of preferably 250 or more, more preferably 300 or more, more preferably 400 or more, more preferably 500 or more can be used.
  • plural means, for example, 2 to 20, 2 to 15, 2 to 10, 2 to 7, 2 to 5, 2 to 4, or 2 to 3.
  • Amino acid identity refers to the protein shown in SEQ ID NO: 9 when two amino acid sequences are aligned (aligned) and a gap is introduced as necessary so that the degree of amino acid coincidence between the two is maximized. The ratio (%) of the same amino acid residue to the total number of amino acid residues. Amino acid identity can be calculated using a BLAST or FASTA protein search system (Karlin, S.
  • amino acid substitution is preferably conservative amino acid substitution.
  • Constant amino acid substitution refers to substitution between amino acids having similar properties such as charge, side chain, polarity, aromaticity and the like.
  • Amino acids with similar properties include, for example, basic amino acids (arginine, lysine, histidine), acidic amino acids (aspartic acid, glutamic acid), uncharged polar amino acids (glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, cysteine, tyrosine), nonpolar
  • functional amino acids leucine, isoleucine, alanine, valine, proline, phenylalanine, tryptophan, methionine
  • branched chain amino acids leucine, valine, isoleucine
  • aromatic amino acids phenylalanine, tyrosine, tryptophan, histidine
  • Each polypeptide may be appropriately chemically modified.
  • the base sequence of the gene (DNA or RNA) encoding GSH I that can be used for the preparation of GSH I is not limited to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, but encodes the target GSH I amino acid sequence.
  • the base sequence can be an appropriate one depending on the type of host organism.
  • Glutathione synthase (GSH II) used in the present invention recognizes ⁇ -Glu-Cys as a substrate in the presence of ATP and generates ⁇ -Glu-Cys-Gly by binding to glycine (Gly). As long as it has the activity, its origin, structure, etc. are not particularly limited. In the present invention, this activity is referred to as glutathione synthetase activity. 1 U of the activity means an activity of producing 1 ⁇ mol of glutathione per minute at 30 ° C., and is measured under the following measurement conditions.
  • the reaction was performed by adding the enzyme solution to 50 mM Tris hydrochloride buffer (pH 8.0) containing 10 mM ATP, 15 mM ⁇ -glutamylcysteine, 15 mM glycine, and 10 mM magnesium sulfate, and maintaining the temperature at 30 ° C. The reaction is stopped by adding. Glutathione in the reaction solution is quantified using high performance liquid chromatography.
  • GSH II having a glutathione synthetase activity (specific activity) of 0.5 U or more per 1 mg of protein.
  • GSH II is not particularly limited, and those derived from microorganisms, animals, plants and the like can be used. GSH II derived from microorganisms is preferable, and GSH II derived from intestinal bacteria such as Escherichia coli, bacteria such as coryneform bacteria, eukaryotic microorganisms such as yeast, and the like are particularly preferable.
  • GSH II is not limited to GSH II consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10, but other polypeptides having GSH II activity, such as active mutants and other types of orthologs, can also be used.
  • the other polypeptide having GSH II activity is preferably 10% or more, preferably 40% or more, more preferably when GSH II consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 is used under the above activity measurement conditions.
  • polypeptides having GSH II activity such as the above-mentioned active mutants and other orthologs.
  • a polypeptide comprising an amino acid sequence (particularly preferably, a total of 1 to a plurality of amino acids are substituted, deleted and / or added at one or both of the N-terminal and C-terminal of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10, preferably A polypeptide having a deleted and / or added amino acid sequence) or 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, 95% or more, 97% or more with respect to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10.
  • a polypeptide comprising an amino acid sequence having 98% or more or 99% or more amino acid identity Furthermore, a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10, the polypeptide consisting of an amino acid sequence in which one to a plurality of amino acids are added, deleted, or substituted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10, and SEQ ID NO: A fragment having GSH II activity of at least one polypeptide selected from the group consisting of the above-mentioned polypeptides consisting of the amino acid sequence having the above-mentioned amino acid sequence with respect to the amino acid sequence shown in FIG.
  • amino acid identity refers to the protein shown in SEQ ID NO: 10 when two amino acid sequences are aligned (aligned), and gaps are introduced as necessary to maximize the degree of amino acid identity between the two. The ratio (%) of the same amino acid residue to the total number of amino acid residues.
  • the amino acid substitution is preferably conservative amino acid substitution.
  • a preferred range of “plurality”, a method for calculating amino acid identity, and conservative amino acid substitution are as described for GSH I.
  • Each polypeptide may be appropriately chemically modified.
  • the base sequence of the gene (DNA or RNA) encoding GSH II that can be used for the preparation of GSH II is not limited to the base sequence shown in SEQ ID NO: 4, but encodes the target GSH II amino acid sequence.
  • the base sequence can be an appropriate one depending on the type of host organism.
  • the bifunctional glutathione synthetase (GSH F) used in the present invention recognizes L-Cys as a substrate in the presence of ATP, and catalyzes a reaction for producing ⁇ -Glu-Cys by binding to L-Glu. It is an enzyme that has both an activity and an activity of recognizing ⁇ -Glu-Cys as a substrate in the presence of ATP and catalyzing a reaction to produce ⁇ -Glu-Cys-Gly by binding to Gly.
  • the origin, structure, etc. are not particularly limited. In the present invention, this activity is referred to as bifunctional glutathione synthetase activity.
  • 1 U of the activity means an activity of producing 1 ⁇ mol of ⁇ -Glu-Cys-Gly (glutathione) per minute at 30 ° C., and was measured under the following measurement conditions.
  • the reaction is carried out by adding the enzyme solution to 50 mM Tris hydrochloride buffer (pH 8.0) containing 10 mM ATP, 15 mM L-glutamic acid, 15 mM L-cysteine, 15 mM glycine, and 10 mM magnesium sulfate, and maintaining the temperature at 30 ° C.
  • the reaction is stopped by adding 6N hydrochloric acid. Glutathione in the reaction solution is quantified using high performance liquid chromatography.
  • GSH F having a bifunctional glutathione synthetase activity (specific activity) of 0.5 U or more per 1 mg of protein.
  • GSH F The origin of GSH F is not particularly limited, and those derived from microorganisms, animals, plants and the like can be used.
  • GSH F derived from microorganisms is preferred. Particularly preferred are bacteria-derived GSH F, specifically, Streptococcus agalactiae, Streptococcus mutans, Streptococcus suis, Streptococcus suis, Streptococcus suis, Streptococcus suisto Streptococcus genus; Lactobacillus plantarum and other Lactobacillus genus bacteria; Desulfotalea cyclophila and other desulphotales (Desulfotalia) bacterium; Clostridium perfringens and other Clostridium bacteria; Listeria innocua, Listeria monocteris (Listeria monolithes, etc.) Enterococcus faecium, Enterococcus faecium, and other Enterococcus
  • the base sequence of GSH F derived from Streptococcus agalactie and the amino acid sequence encoded by the base sequence are shown in SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12, respectively.
  • the base sequence consisting of the 4th base to the 2253th base of SEQ ID NO: 7 is a base sequence encoding GSH F derived from Streptococcus agalactiae consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12, and is frequently used in codon usage in E. coli. It is an example of the adapted base sequence.
  • GSH F is not limited to GSH F consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12, and other polypeptides having GSH F activity such as active mutants and other species orthologs can also be used.
  • the other polypeptide having GSH F activity is preferably 10% or more, preferably 40% or more, more preferably, when GSH F comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 is used under the above activity measurement conditions.
  • polypeptides having GSH F activity such as the above-mentioned active mutants and other orthologs, for example, one to a plurality of amino acids are added, deleted or substituted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12.
  • a polypeptide comprising an amino acid sequence (particularly preferably, at least one or both of the N-terminal and C-terminal of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 is substituted, deleted and / or added, preferably Polypeptide having a deleted and / or added amino acid sequence) or 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, 95% or more, 97% or more with respect to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12.
  • a polypeptide comprising an amino acid sequence having 98% or more or 99% or more amino acid identity Furthermore, a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12, the polypeptide consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are added, deleted or substituted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12, and SEQ ID NO: A fragment having GSH F activity of at least one polypeptide selected from the group consisting of the above-mentioned polypeptides consisting of the amino acid sequence having the above-mentioned amino acid identity to the amino acid sequence shown in FIG.
  • a polypeptide having a number of amino acids of preferably 400 or more, more preferably 500 or more, more preferably 600 or more, more preferably 700 or more, more preferably 730 or more is used. it can.
  • “Amino acid identity” refers to the protein shown in SEQ ID NO: 12 when two amino acid sequences are aligned (aligned) and a gap is introduced as necessary so that the amino acid identity between the two is the highest. The ratio (%) of the same amino acid residue to the total number of amino acid residues.
  • the amino acid substitution is preferably conservative amino acid substitution.
  • a preferred range of “plurality”, a method for calculating amino acid identity, and conservative amino acid substitution are as described for GSH I.
  • Each polypeptide may be appropriately chemically modified.
  • the base sequence of the gene (DNA or RNA) encoding GSH F that can be used for the preparation of GSH F is not limited to the base sequence shown in SEQ ID NO: 11, but encodes the target amino acid sequence of GSH F.
  • the base sequence can be an appropriate one depending on the type of host organism.
  • Adenylate kinase (ADK) used in the present invention is an enzyme that has an activity of catalyzing a reaction for generating ATP and AMP one molecule at a time from two molecules of ADP, and as long as it has the activity, its origin, structure, etc. It is not limited. In the present invention, this activity is referred to as ADK activity.
  • 1 U of the activity means an activity of producing 1 ⁇ mol of AMP per minute at 30 ° C., and is measured under the following measurement conditions.
  • the reaction is carried out by adding the enzyme solution to 50 mM Tris hydrochloride buffer (pH 8.0) containing 10 mM ADP and 70 mM magnesium sulfate and keeping the solution at 30 ° C., and the reaction is stopped by adding 6N hydrochloric acid.
  • AMP in the reaction solution was quantified using high performance liquid chromatography.
  • adenosine triphosphate ATP
  • ADP adenosine diphosphate
  • AMP adenosine monophosphate
  • ADK having an ADK activity (specific activity) of 20 U or more per 1 mg of protein.
  • ADK origin of ADK is not particularly limited, and those derived from microorganisms, animals, plants and the like can be used.
  • a microorganism-derived ADK is preferred.
  • Bacteria-derived ADK is particularly preferable, and specifically, Escherichia coli-derived ADK is preferable.
  • base sequence of ADK derived from Escherichia coli and the amino acid sequence encoded by the base sequence are shown in SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14, respectively.
  • the ADK is not limited to the ADK consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14, and other polypeptides having ADK activity such as active mutants and other types of orthologs can also be used.
  • the other polypeptide having ADK activity is preferably 10% or more, preferably 40% or more, more preferably 60%, when ADK comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 is used under the above activity measurement conditions. As described above, it is a polypeptide exhibiting an activity of 80% or more, more preferably 90% or more.
  • polypeptides having ADK activity such as the above-mentioned active mutants and other species orthologs
  • one to a plurality of amino acids are added, deleted or substituted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14.
  • a polypeptide comprising an amino acid sequence (particularly preferably, a total of one or more amino acids are substituted, deleted and / or added, preferably missing at one or both of the N-terminal and C-terminal of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14.
  • a polypeptide consisting of an amino acid sequence having 98% or more or 99% or more amino acid identity is applicable. Furthermore, a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14, the above polypeptide consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are added, deleted or substituted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14, and SEQ ID NO: A fragment having ADK activity of at least one polypeptide selected from the group consisting of the above-mentioned polypeptides comprising the amino acid sequence having the above-mentioned amino acid identity to the amino acid sequence shown in FIG. As the fragment, a polypeptide having an amino acid number of preferably 100 or more, more preferably 150 or more, more preferably 200 or more can be used.
  • amino acid identity refers to the protein shown in SEQ ID NO: 14 when two amino acid sequences are aligned (aligned), and a gap is introduced as necessary so that the amino acid identity between the two is the highest. The ratio (%) of the same amino acid residue to the total number of amino acid residues.
  • the amino acid substitution is preferably conservative amino acid substitution.
  • a preferred range of “plurality”, a method for calculating amino acid identity, and conservative amino acid substitution are as described for GSH I.
  • Each polypeptide may be appropriately chemically modified.
  • the base sequence of a gene (DNA or RNA) encoding ADK that can be used for the preparation of ADK is not limited to the base sequence shown in SEQ ID NO: 13, but a host organism encoding the target amino acid sequence of ADK It can be an appropriate base sequence depending on the kind of the DNA.
  • the polyphosphate-dependent AMP transferase (PAP) used in the present invention is an enzyme that has the activity of catalyzing the reaction of phosphorylating AMP to produce ADP using polyphosphate as a phosphate donor.
  • the origin, structure, etc. are not particularly limited. In the present invention, this activity is referred to as PAP activity.
  • 1 U of the activity means an activity of producing 1 ⁇ mol of ADP per minute at 30 ° C., and is measured under the following measurement conditions.
  • PAP having a PAP activity (specific activity) of 20 U or more per 1 mg of protein.
  • the origin of PAP is not particularly limited, and those derived from microorganisms, animals, plants and the like can be used. Microbial PAP is preferred. In particular, PAP derived from bacteria is preferable, and specifically, PAP derived from Acinetobacter johnsonii is preferable.
  • base sequence of PAP derived from Acinetobacter johnsonii and the amino acid sequence encoded by the base sequence are shown in SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16, respectively.
  • the base sequence consisting of the 4th to 1428th bases of SEQ ID NO: 8 is a base sequence encoding Acinetobacter johnsonii-derived PAP consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16, and is suitable for codon usage in E. coli. It is an example of the made base sequence.
  • the PAP is not limited to the PAP consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16, and other polypeptides having PAP activity such as active mutants and other species orthologs can also be used.
  • the other polypeptide having PAP activity is preferably 10% or more, preferably 40% or more, more preferably 60% when the PAP consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16 is used under the above activity measurement conditions. As described above, it is a polypeptide exhibiting an activity of 80% or more, more preferably 90% or more.
  • polypeptides having PAP activity such as the above-mentioned active mutants and other species orthologs
  • one to a plurality of amino acids are added, deleted or substituted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16.
  • a polypeptide comprising an amino acid sequence (particularly preferably, a total of 1 to a plurality of amino acids are substituted, deleted and / or added, preferably deleted at one or both of the N-terminal and C-terminal of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16.
  • a polypeptide consisting of an amino acid sequence having 98% or more or 99% or more amino acid identity is applicable. Furthermore, a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16, the polypeptide consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are added, deleted or substituted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16, and SEQ ID NO: A fragment having PAP activity of at least one polypeptide selected from the group consisting of the above-mentioned polypeptides consisting of the amino acid sequence having the above-mentioned amino acid sequence with respect to the amino acid sequence shown in FIG.
  • amino acid identity refers to the protein shown in SEQ ID NO: 16 when two amino acid sequences are aligned (aligned) and a gap is introduced as necessary so that the degree of amino acid coincidence between the two is maximized. The ratio (%) of the same amino acid residue to the total number of amino acid residues.
  • the amino acid substitution is preferably conservative amino acid substitution.
  • a preferred range of “plurality”, a method for calculating amino acid identity, and conservative amino acid substitution are as described for GSH I.
  • Each polypeptide may be appropriately chemically modified.
  • the base sequence of a gene (DNA or RNA) encoding PAP that can be used for the preparation of PAP is not limited to the base sequence shown in SEQ ID NO: 15, but a host organism that encodes the amino acid sequence of the target PAP. It can be an appropriate base sequence depending on the kind of the DNA.
  • each of the enzymes used in the present invention is not particularly limited.
  • Each of the above enzymes can be prepared from an organism having the activity of the enzyme, for example, a wild strain or a mutant strain of a microorganism.
  • the organism having the target enzyme activity may be either an organism originally having the enzyme activity or an organism having an enhanced enzyme activity.
  • Examples of organisms with enhanced enzyme activity include recombinant biological cells in which the expression of genes encoding each of the enzymes is enhanced by genetic engineering techniques.
  • organism with enhanced enzyme activity refers to an organism with inherently increased activity of the enzyme in an organism with inherently higher activity of the enzyme and an organism with essentially no activity of the enzyme. It includes both organisms to which the activity of the enzyme is imparted.
  • a recombinant biological cell obtained by using a genetic engineering technique typically has a recombinant vector obtained by inserting a gene (DNA or RNA) encoding an enzyme of interest into an appropriate vector.
  • host biological cells include bacteria, yeasts, filamentous fungi, plant cells, animal cells, and the like. From the viewpoint of introduction and expression efficiency, bacteria are preferable, and Escherichia coli is particularly preferable.
  • the method for producing ⁇ -glutamylcysteine according to the present invention comprises the steps of combining L-cysteine and L-glutamic acid with ⁇ -glutamylcysteine synthetase (GSH I) and bifunctional glutathione synthetase in an atmosphere having a lower oxygen concentration than the atmosphere. Characterized in that it comprises a step A in which at least one enzyme selected from the group consisting of (GSH F) is reacted in the presence of adenosine triphosphate (ATP) to produce ⁇ -glutamylcysteine. To do.
  • GSH F ⁇ -glutamylcysteine synthetase
  • ATP adenosine triphosphate
  • Step A is a step of producing ⁇ -glutamylcysteine by reacting L-cysteine and L-glutamic acid in the presence of the enzyme and ATP.
  • the enzyme acts to catalyze the reaction, adenosine is produced.
  • Triphosphate (ATP) is consumed.
  • the method for producing ⁇ -glutamylcysteine according to the present invention also includes a step A ′ for producing ⁇ -glutamylcysteine by reacting L-cysteine and L-glutamic acid in an atmosphere having an oxygen concentration lower than that of the atmosphere. It is characterized by.
  • Step A ′ may be performed by an enzymatic reaction or may be performed by a chemical reaction without using an enzyme, but is preferably a step performed by an enzymatic reaction, and particularly preferably the step A.
  • the enzymatic reaction is more advantageous than the chemical synthesis reaction because protection by a functional group of the substrate compound is unnecessary and the specificity of the reaction is high.
  • Step A ′ by a chemical reaction without using an enzyme is not particularly limited.
  • L-cysteine having a carboxyl group protected with an appropriate protecting group, and an ⁇ -carboxyl group and an amino group with an appropriate protecting group.
  • one or more protecting groups are deprotected as necessary after the dehydration condensation reaction.
  • protecting group for the carboxyl group a known protecting group for carboxyl group such as benzyl group can be used, and as the protecting group for amino group, t-butoxycarbonyl (Boc) group, 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) group, etc. Any known protecting group for amino group can be used.
  • GSH I and / or GSH F may be a living cell having GSH I and / or GSH F activity, or may be dead but not damaged. It may be used, or may be used in a form in which GSH I and / or GSH F are present outside the cell, specifically in the form of a crushed cell of the organism, or separated from the cell and used as necessary. Accordingly, it may be used in the form of a protein that is appropriately purified.
  • the degree of purification of the protein having GSH I and / or GSH F activity is not particularly limited, and may be crude purification.
  • the enzyme used in step A is preferably a live cell having GSH I and / or GSH F activity, more preferably a live cell having GSH I and / or GSH F activity and a dead cell that is not damaged. Is not used.
  • the enzyme used in the step A is GSH I and / or GSH F existing outside the cell, specifically, GSH I and / or GSH F in the form of the crushed material of the cell, or separated from the cell. It is preferable to use GSH I and / or GSH F in the form of different proteins.
  • adenosine monophosphate (AMP) is easily decomposed in the reaction system (see Example 4).
  • AMP is one of the intermediates of the ATP regeneration reaction described later, it is difficult to efficiently advance the ATP regeneration reaction when AMP is decomposed.
  • GSH I and / or GSH F is used in Step A in a form that exists extracellularly, it is preferable that AMP is hardly decomposed and the ATP regeneration reaction can be advanced efficiently.
  • the reaction of step A is performed without using living cells, there is no reduction action by living cells, and therefore, oxidation is likely to proceed in an oxygen-rich atmosphere, and oxidized ⁇ -glutamylcysteine is likely to be generated.
  • the oxidation of ⁇ -glutamylcysteine is suppressed and the reduced ⁇ -glutamylcysteine can be obtained in a high yield by performing the reaction in Step A in an atmosphere having a lower oxygen concentration than the atmosphere.
  • the present invention uses GSH I and / or GSH F in a form that exists outside the cell, specifically, in the form of a disrupted cell having the activity or in the form of a protein separated from the cell.
  • disruption of a cell refers to a treatment that damages the surface structure of a cell to such an extent that an enzyme formed in the cell can be accessed from the outside of the cell, and the cell does not necessarily have to be fragmented.
  • the “disrupted product” of cells refers to a processed product of disrupted cells.
  • Cell disruption can be performed by performing one or more disruptions in an appropriate order. Examples of the cell disruption treatment include physical treatment, chemical treatment, and enzymatic treatment. Examples of the physical treatment include use of a high-pressure homogenizer, an ultrasonic homogenizer, a French press, a ball mill, or a combination thereof.
  • Examples of the chemical treatment include treatment using an acid such as hydrochloric acid and sulfuric acid (preferably a strong acid), treatment using a base such as sodium hydroxide and potassium hydroxide (preferably a strong base), and combinations thereof.
  • Examples of the enzymatic treatment include a method using lysozyme, zymolyase, glucanase, protease, cellulase and the like, and combinations thereof.
  • step A L-cysteine, L-glutamic acid, adenosine triphosphate (ATP), and in step A ′, L-cysteine and L-glutamic acid are salt forms, free forms, solvates such as hydrates, etc. These can be added to the reaction system in various forms.
  • L-cysteine used as a raw material in step A and / or step A ′ is preferably substantially free of L-cystine, and specifically, relative to the total molar amount of L-cystine and L-cysteine.
  • L-cysteine is 70 mol% or more, more preferably 80 mol% or more, more preferably 90 mol% or more, still more preferably 95 mol% or more, still more preferably 98 mol% or more, and most preferably 100 mol% L-cysteine. Cysteine is used.
  • the requirement that the ratio of L-cysteine to the total molar amount of L-cysteine and L-cystine is within the above range is preferably satisfied at least at the start of the reaction in step A and / or step A ′. It is more preferable that the period from the start of the reaction in step A and / or step A ′ to after the reaction is satisfied.
  • step A and / or step A ′ the reaction is carried out in an “atmosphere having a lower oxygen concentration than the atmosphere”.
  • the atmosphere an atmosphere having an oxygen concentration of 10% by volume or less is preferable, and an atmosphere of 5% by volume or less is more preferable.
  • the lower limit is not particularly limited, and the oxygen concentration may be 0% by volume.
  • an atmosphere of an inert gas can be exemplified.
  • the inert gas is not particularly limited as long as it does not contain oxygen, but an inert gas atmosphere such as nitrogen, a rare gas (such as argon), or carbon dioxide gas is preferable.
  • the fact that oxygen is not contained in the inert gas includes that oxygen is not substantially contained.
  • the reaction in the atmosphere having the oxygen concentration can be realized.
  • “Reacting in a reaction vessel in which the gas phase is replaced with the inert gas” also includes performing the reaction under a flow of the inert gas as necessary.
  • the atmospheric pressure is not particularly limited, but can usually be around normal pressure, typically 0.08 to 0.12 MPa.
  • the yield of ⁇ -glutamylcysteine relative to the substrate L-cysteine in step A and / or step A ′ is typically 80 mol% or more, preferably 85 mol% or more, more preferably 90 mol% or more, particularly preferably. It is 95 mol% or more.
  • the reaction system after the reaction in step A and / or step A ′ (for example, reaction mixture) is substantially free of oxidized ⁇ -glutamylcysteine.
  • ⁇ -glutamylcysteine is 80 mol% or more, more preferably 90 mol% or more, and still more preferably 95% with respect to the total molar amount of ⁇ -glutamylcysteine and oxidized ⁇ -glutamylcysteine. More than mol%, more preferably 97 mol% or more, most preferably 100 mol% is contained.
  • the reaction of step A and / or step A ′ can be performed in a reaction mixture containing a solvent such as water adjusted to an appropriate pH.
  • the conditions at this time are not particularly limited, but the substrate concentration (total concentration of L-cysteine and L-glutamic acid) is preferably about 0.1 to 99% by weight, more preferably 1 to 20% by weight. it can.
  • the amount ratio of L-cysteine and L-glutamic acid in the substrate at the start of the reaction can be about 1 mole of L-glutamic acid per mole of L-cysteine, for example, 1 mole of L-cysteine.
  • L-glutamic acid can be used in an amount of 0.5 to 2 mol, preferably 0.7 to 1.3 mol.
  • the reaction temperature can be preferably 10 to 60 ° C, more preferably 20 to 50 ° C.
  • the pH of the reaction can be preferably 4 to 11, more preferably 6 to 9.
  • the reaction time is preferably 1 to 120 hours, more preferably
  • the concentration of each enzyme in the reaction mixture can be appropriately adjusted.
  • the lower limit of the protein concentration of each enzyme is 1 ⁇ g / ml or more, and no upper limit is provided.
  • the concentration is adjusted within the range of 100 mg / ml or less. be able to.
  • the GSH I activity in the Step A reaction mixture is not particularly limited, but the lower limit is preferably 0.05 U / ml or more, and the upper limit is not particularly provided, but usually 5000 U / ml or less. be able to.
  • the GSH F activity in the Step A reaction mixture is not particularly limited, but the lower limit is preferably 0.05 U / ml or more, and the upper limit is not particularly provided, but usually 5000 U / ml or less. be able to.
  • the concentration of ATP in the reaction mixture can be appropriately adjusted according to the concentration of L-cysteine as a substrate and the presence or absence of an ATP regeneration system.
  • ATP is consumed in equimolar amounts relative to L-cysteine.
  • the upper limit of the ATP concentration in the reaction mixture in Step A is not particularly limited, but it is preferably 2 times or less, more preferably 1.2 times or less in terms of molar concentration ratio to the L-cysteine concentration.
  • the lower limit of the ATP concentration in the reaction mixture in Step A is not particularly limited, but is preferably 0.0001 times or more, more preferably 0.001 times or more in terms of molar concentration ratio with respect to the L-cysteine concentration. 01 times or more is more preferable.
  • the method for producing glutathione (GSH) comprises ⁇ -glutamylcysteine and glycine in an atmosphere having a lower oxygen concentration than the atmosphere, glutathione synthetase (GSH II) and bifunctional glutathione synthetase (GSH F). It comprises a step B of producing glutathione by reacting with an action of at least one enzyme selected from the group consisting of adenosine triphosphate (ATP) in the presence of adenosine triphosphate (ATP).
  • ATP adenosine triphosphate
  • Step B is a step of reacting ⁇ -glutamylcysteine and glycine in the presence of the enzyme and adenosine triphosphate (ATP) to produce glutathione.
  • ATP adenosine triphosphate
  • the method for producing glutathione according to the present invention is also characterized in that it comprises a step B ′ of producing glutathione by reacting ⁇ -glutamylcysteine and glycine in an atmosphere having an oxygen concentration lower than that of the atmosphere.
  • Step B ′ may be performed by an enzymatic reaction or may be performed by a chemical reaction without using an enzyme, but is preferably a step performed by an enzymatic reaction, and particularly preferably the step B.
  • the enzymatic reaction is more advantageous than the chemical synthesis reaction because protection by a functional group of the substrate compound is unnecessary and the specificity of the reaction is high.
  • Step B ′ by a chemical reaction without using an enzyme is not particularly limited.
  • ⁇ -glutamylcysteine in which an ⁇ -carboxyl group and an amino group in an L-glutamic acid residue are protected with an appropriate protecting group
  • a step of reacting with a glycine in which a carboxyl group is protected with an appropriate protecting group and dehydrating and condensing an amino group of one molecule of glycine to a carboxyl group in one molecule of ⁇ -glutamylcysteine to form a peptide bond is mentioned. It is done.
  • one or more protecting groups are deprotected as necessary after the dehydration condensation reaction.
  • protecting group for the carboxyl group a known protecting group for carboxyl group such as benzyl group can be used, and as the protecting group for amino group, t-butoxycarbonyl (Boc) group, 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) group, etc. Any known protecting group for amino group can be used.
  • GSH II and / or GSH F may be a living cell having GSH II and / or GSH F activity, or may be dead but not damaged. May be used, or may be used in a form in which GSH II and / or GSH F is present outside the cell, specifically in the form of a crushed cell of the organism, or separated from the cell and required Accordingly, it may be used in the form of a protein that is appropriately purified.
  • the degree of purification of the protein having GSH II and / or GSH F activity is not particularly limited, and may be crude purification.
  • the “broken product” of the cell is as described above.
  • a living cell having GSH II and / or GSH F activity is not used, and more preferably, a living cell having GSH II and / or GSH F activity and a dead cell that is not damaged. Is not used.
  • the enzyme used in the step B is GSH II and / or GSH F existing outside the cell, specifically, GSH II and / or GSH F in the form of crushed cells, or separated from the cell. It is preferable to use GSH II and / or GSH F in the form of different proteins.
  • the present invention by performing the reaction in Step B in an atmosphere having an oxygen concentration lower than that in the air, it is possible to suppress the oxidation of glutathione and obtain reduced glutathione in a high yield. That is, the present invention uses GSH II and / or GSH F in a form that exists outside the cell, specifically, in the form of a crushed product of the cell having the activity, or in the form of a protein separated from the cell. By performing the step B, it is possible to achieve both AMP decomposition inhibition and glutathione oxidation inhibition.
  • Step B ⁇ -glutamylcysteine, glycine, adenosine triphosphate (ATP), and in Step B ′, ⁇ -glutamylcysteine and glycine are in the form of a salt, a free form, a solvate such as a hydrate, etc. These can be added to the reaction system in various forms.
  • the ⁇ -glutamylcysteine used as a raw material in Step B and / or Step B ′ is preferably substantially free of oxidized ⁇ -glutamylcysteine, specifically, ⁇ -glutamylcysteine and oxidized ⁇ -glutamylcysteine.
  • ⁇ -glutamylcysteine is 70 mol% or more, more preferably 80 mol% or more, more preferably 90 mol% or more, still more preferably 95 mol% or more, still more preferably 98 mol% or more. Most preferably 100 mol% ⁇ -glutamylcysteine is used.
  • step B and / or step B ′ the reaction is performed in an “atmosphere having an oxygen concentration lower than that of the atmosphere”.
  • the atmosphere an atmosphere having an oxygen concentration of 10% by volume or less is preferable, and an atmosphere of 5% by volume or less is more preferable.
  • the lower limit is not particularly limited, and the oxygen concentration may be 0% by volume.
  • an atmosphere of an inert gas can be exemplified.
  • the inert gas is not particularly limited as long as it does not contain oxygen, but an inert gas atmosphere such as nitrogen, a rare gas (such as argon), or carbon dioxide gas is preferable.
  • the fact that oxygen is not contained in the inert gas includes that oxygen is not substantially contained.
  • the reaction in the atmosphere having the oxygen concentration can be realized.
  • “Reacting in a reaction vessel in which the gas phase is replaced with the inert gas” also includes performing the reaction under a flow of the inert gas as necessary.
  • the atmospheric pressure is not particularly limited, but can usually be around normal pressure, typically 0.08 to 0.12 MPa.
  • the yield of glutathione relative to the substrate ⁇ -glutamylcysteine in step B and / or step B ′ is typically 80 mol% or more, preferably 85 mol% or more, more preferably 90 mol% or more, particularly preferably 95 mol. % Or more.
  • the reaction system after the reaction in Step B and / or Step B ′ (for example, reaction mixture) is substantially free of oxidized glutathione, and specifically, after the reaction in Step B and / or Step B ′.
  • glutathione is 80 mol% or more, more preferably 90 mol% or more, still more preferably 95 mol% or more, still more preferably 97 mol% or more, based on the total molar amount of glutathione and oxidized glutathione. Most preferably, it is contained at 100 mol%.
  • the reaction in step B and / or step B ′ can be performed in a reaction mixture containing a solvent such as water adjusted to an appropriate pH.
  • the conditions at this time are not particularly limited, but the substrate concentration (total concentration of ⁇ -glutamylcysteine and glycine) is preferably about 0.1 to 99% by weight, more preferably 1 to 20% by weight. .
  • the amount ratio of ⁇ -glutamylcysteine and glycine in the substrate at the start of the reaction can be about 1 mole of glycine with respect to 1 mole of ⁇ -glutamylcysteine, for example, glycine with respect to 1 mole of ⁇ -glutamylcysteine.
  • the reaction temperature can be preferably 10 to 60 ° C, more preferably 20 to 50 ° C.
  • the pH of the reaction can be preferably 4 to 11, more preferably 6 to 9.
  • the reaction time is preferably 1 to 120 hours, more preferably 1 to 72 hours.
  • the ⁇ -glutamylcysteine used as a raw material in Step B and / or Step B ′ can be obtained by Step A and / or Step A ′.
  • glutathione can be produced from L-cysteine, which is the starting material of step A and / or step A ′, while suppressing by-production of oxidized ⁇ -glutamylcysteine and oxidized glutathione, -The yield of glutathione relative to cysteine can typically be 75 mol% or more, preferably 80 mol% or more, more preferably 85 mol% or more, particularly preferably 90 mol% or more.
  • step B when ⁇ -glutamylcysteine obtained in step A is used as a raw material, the reaction in step A and the reaction in step B can be performed sequentially.
  • ⁇ -glutamylcysteine may be separated from the reaction mixture after completion of step A and used in step B, or step A may be deficient in at least one of the elements of GSH II and / or GSH F and glycine.
  • the step B may be carried out under the condition that the step B does not proceed, and then the step B may be carried out by adding the missing element to the reaction mixture without separating ⁇ -glutamylcysteine from the reaction mixture after completion of the step A. .
  • the reaction in step A and the reaction in step B do not have to be performed sequentially, and may be performed simultaneously. That is, a raw material mixture containing L-cysteine, L-glutamic acid, and glycine may be reacted in the presence of the enzyme used in step A, the enzyme used in step B, and ATP.
  • This embodiment is also one of the embodiments of the present invention in which oxidized ⁇ -glutamylcysteine used as a raw material in Step B is produced by Step A.
  • GSH I is subject to feedback inhibition by glutathione, and when GSH I is used as an enzyme in step A, the reaction in step A and the reaction in step B are preferably performed sequentially.
  • steps A and B can be performed simultaneously by the action of GSH F alone.
  • ⁇ -glutamylcysteine used as a raw material in step B ′ can be obtained by the above step A ′.
  • ⁇ -glutamylcysteine may be separated from the reaction mixture after completion of step A ′ and used in step B ′, or glycine may be added to the reaction mixture after completion of step A ′ without separation of ⁇ -glutamylcysteine.
  • the reaction in the step A ′ and the reaction in the step B ′ do not need to be performed sequentially and may be performed simultaneously. That is, a raw material mixture containing L-cysteine, L-glutamic acid, and glycine may be reacted.
  • This embodiment is also one of the embodiments of the present invention in which ⁇ -glutamylcysteine used as a raw material in Step B ′ is produced by Step A ′.
  • the concentration of each enzyme in the reaction mixture can be appropriately adjusted.
  • the lower limit of the protein concentration of each enzyme is 1 ⁇ g / ml or more, and no upper limit is provided.
  • the concentration is adjusted within the range of 100 mg / ml or less. be able to.
  • the GSH II activity in the reaction mixture of Step B is not particularly limited, but the lower limit is preferably 0.05 U / ml or more, and no upper limit is provided, but usually 5000 U / ml or less. can do.
  • the GSH F activity in the Step B reaction mixture is not particularly limited, but the lower limit is preferably 0.05 U / ml or more, and the upper limit is not particularly provided, but usually 5000 U / ml or less. be able to.
  • the concentration of ATP in the reaction mixture can be appropriately adjusted according to the concentration of ⁇ -glutamylcysteine as a substrate and the presence or absence of an ATP regeneration system.
  • Step B ATP is consumed in an equimolar amount with respect to ⁇ -glutamylcysteine.
  • the upper limit of the ATP concentration in the reaction mixture in Step B is not particularly limited, but it is preferably 2 times or less, more preferably 1.2 times or less in terms of molar concentration ratio with respect to the ⁇ -glutamylcysteine concentration.
  • the lower limit of the ATP concentration in the reaction mixture in Step B is not particularly limited, but is preferably 0.0001 times or more, more preferably 0.001 times or more in terms of molar concentration ratio with respect to the ⁇ -glutamylcysteine concentration. More preferably, 0.01 times or more.
  • Processes A and B are processes that consume ATP and generate ADP. Since ATP is a relatively expensive raw material, it is preferable to perform step A and / or B in combination with an ATP regeneration reaction for regenerating ATP from ADP generated in the step.
  • Examples of the ATP regeneration reaction include a reaction in which ADP is regenerated to ATP using a phosphate group supply source and a phosphotransferase.
  • condensed phosphate (polyphosphate) is used as a phosphate group supply source, and ATP regeneration using a combination of polyphosphate-dependent AMP transferase (PAP) and adenylate kinase (ADK) as a phosphotransferase.
  • PAP polyphosphate-dependent AMP transferase
  • ADK adenylate kinase
  • AMP adenosine monophosphate
  • PAP polyphosphate-dependent AMP transferase
  • ADK adenylate kinase
  • PolyP n a condensed phosphate having n phosphorus atoms (herein, “polyphosphorus”).
  • PolyP n-1 represents a condensed phosphoric acid (polyphosphoric acid) having n-1 phosphorus atoms
  • reaction raw material represents the reaction raw material in step A or B
  • product Indicates the product in step A or B.
  • step A and / or B by performing step A and / or B in the presence of condensed phosphoric acid (polyphosphoric acid), PAP, and ADK, ADP generated by consumption of ATP is converted into ATP and AMP by the action of ADK, AMP generated by the action of ADK is converted to ADP by the action of PAP.
  • This ATP regeneration reaction can be coupled to the reaction of step A and / or B.
  • ADK and PAP living cells having the activity of each enzyme may be used as they are, or may be used in the form of cells that have been killed but not damaged, and ADK and / or It may be used in a form in which PAP is present outside the cell, specifically, in the form of a disrupted cell of the organism, or in the form of a protein that has been separated from the cell and appropriately purified as necessary. Also good.
  • the degree of purification of the protein having ADK and / or PAP activity is not particularly limited, and may be crude purification.
  • the “broken product” of the cell is as described above.
  • a living cell having ADK and / or PAP activity is not used, and more preferably, a living cell having ADK and / or PAP activity and an uninjured dead cell are not used.
  • the enzyme used in the step B is ADK and / or PAP present outside the cell, specifically, ADK and / or PAP in the form of a crushed cell, or a protein separated from the cell. It is preferable to use ADK and / or PAP.
  • ADK and / or PAP is used for the ATP regeneration reaction in the form of a living cell having the activity, AMP is easily decomposed and it is difficult to efficiently proceed with the ATP regeneration reaction (see Example 4).
  • Step A and / or Step B without using living cells, there is no reducing action by living cells, and therefore oxidation tends to proceed in an oxygen-rich atmosphere and oxidized ⁇ -glutamylcysteine and / or Although there is a problem that oxidized glutathione is easily generated, in the present invention, oxidation of ⁇ -glutamylcysteine and / or glutathione is performed by performing the reaction of step A and / or step B in an atmosphere having an oxygen concentration lower than that of the atmosphere.
  • step A and / or step B it is possible to achieve both suppression of AMP degradation and suppression of ⁇ -glutamylcysteine and / or glutathione oxidation.
  • the concentration of each enzyme used in the ATP regeneration reaction in the reaction mixture can be adjusted as appropriate.
  • the lower limit of protein concentration of each enzyme is 1 ⁇ g / ml or more, and no upper limit is provided, but preferably 100 mg / ml or less. It can adjust suitably within the range.
  • the ADK activity in the reaction mixture is not particularly limited, but the lower limit is preferably 2 U / ml or more, and the upper limit is not particularly provided, but usually 200,000 U / ml or less.
  • the PAP activity in the reaction mixture is not particularly limited, but the lower limit is preferably 0.5 U / ml or more, and the upper limit is not particularly provided, but it can usually be 50000 U / ml or less.
  • the amount of condensed phosphoric acid (polyphosphoric acid) added may be appropriately adjusted according to the amount of the reaction substrate.
  • the condensed phosphoric acid (polyphosphoric acid) can be added in various forms such as a salt form such as sodium salt and potassium salt, a free form, and a solvate such as hydrate.
  • the degree of polymerization of condensed phosphoric acid (polyphosphoric acid) (the number of phosphorus atoms per molecule) is not particularly limited.
  • the sodium metaphosphate used in the Examples and Comparative Examples was a mixture of condensed sodium phosphate salts having various polymerization degrees.
  • ⁇ -glutamylcysteine synthetase (GSH I) derived from E. coli K12 strain
  • the restriction enzyme SacI cleavage site and SD sequence were linked to the base sequence of the N-terminal part of the GSH I gene (SEQ ID NO: 1) derived from E. coli K12 strain.
  • a primer (Primer-2: SEQ ID NO: 3) having a sequence obtained by binding a restriction enzyme KpnI cleavage site to the base sequence of the C-terminal part.
  • a DNA fragment containing the full length of the GSH I gene was obtained by amplifying the DNA between these sequences by PCR using this DNA primer.
  • the template used for PCR amplification at this time is the genomic DNA of Escherichia coli K12 strain.
  • the base sequence of the obtained DNA fragment was analyzed, and it was confirmed that the full length (SEQ ID NO: 1) of the GSH I gene was included.
  • the obtained DNA fragment was inserted between the SacI recognition site and the KpnI recognition site downstream of the lac promoter of plasmid pUC18 (manufactured by Takara Bio Inc., GenBank Accession No. L09136) to construct a recombinant vector pUCGSHI.
  • E. coli was used.
  • E. coli HB101 competent cells (Takara Bio Inc.) were transformed.
  • coli HB101 (pUCGSHI) was obtained.
  • the obtained transformant was inoculated into 50 ml of 2 ⁇ YT medium (tripton 1.6%, yeast extract 1.0%, NaCl 0.5%, pH 7.0) containing 200 ⁇ g / ml ampicillin at 37 ° C. Cultured with shaking for 24 hours.
  • the enzyme activity was measured, the GSH I activity was 5 U / ml, and the ADK activity derived from Escherichia coli used as the host cell was 90 U / ml.
  • the cells were collected by centrifugation, suspended in 2.5 ml of 100 mM phosphate buffer (pH 7.0), and sonicated to obtain an enzyme solution.
  • GSH II glutathione synthetase
  • DNA primer having a sequence in which a restriction enzyme NdeI cleavage site is bound to the base sequence of the N-terminal part of the GSH II gene (SEQ ID NO: 4) derived from Escherichia coli K12 strain (Primer-3: SEQ ID NO: 5) and a DNA primer (Primer-4: SEQ ID NO: 6) having a sequence obtained by binding a restriction enzyme EcoRI cleavage site to the base sequence of the C-terminal part were prepared.
  • DNA between this sequence was amplified by PCR to obtain a DNA fragment containing the full length of the GSH II gene.
  • the template used for PCR amplification at this time is the genomic DNA of Escherichia coli K12 strain.
  • the base sequence of the obtained DNA fragment was analyzed, and it was confirmed that the full length of GSH II gene (SEQ ID NO: 4) was included.
  • the obtained DNA fragment was transformed into plasmid pUCN18 (by PCR, pUC18 (manufactured by Takara Bio Inc., GenBank Accession No. L09136) at 185th T was changed to A, and the NdeI site was destroyed.
  • the recombinant vector pNGSHII was constructed by inserting it between the NdeI recognition site and the EcoRI recognition site downstream of the lac promoter of the plasmid in which the NdeI site was newly introduced by modification to TG.
  • E. coli HB101 competent cells Takara Bio Inc.
  • E. coli HB101 pNGSHII
  • the obtained transformant was inoculated into 50 ml of 2 ⁇ YT medium (tripton 1.6%, yeast extract 1.0%, NaCl 0.5%, pH 7.0) containing 200 ⁇ g / ml ampicillin at 37 ° C. Cultured with shaking for 24 hours.
  • the GSH II activity was 5 U / ml
  • the ADK activity derived from Escherichia coli used as the host cell was 90 U / ml.
  • the cells were collected by centrifugation, suspended in 2.5 ml of 100 mM phosphate buffer (pH 7.0), and sonicated to obtain an enzyme solution.
  • L09136 at 185th T was changed to A, and the NdeI site was destroyed.
  • the plasmid was newly introduced with an NdeI site by modification to TG) and inserted between the NdeI recognition site downstream of the lac promoter and the EcoRI recognition site to construct a recombinant vector pNGSHHF.
  • E. coli HB101 competent cells (Takara Bio Inc.) were transformed.
  • coli HB101 (pNGSHHF) was obtained.
  • the obtained transformant was inoculated into 50 ml of 2 ⁇ YT medium (tripton 1.6%, yeast extract 1.0%, NaCl 0.5%, pH 7.0) containing 200 ⁇ g / ml ampicillin at 37 ° C. Cultured with shaking for 24 hours.
  • the enzyme activity was measured, the GSH F activity was 3 U / ml, and the ADK activity derived from Escherichia coli used as the host cell was 90 U / ml.
  • the cells were collected by centrifugation, suspended in 2.5 ml of 100 mM phosphate buffer (pH 7.0), and sonicated to obtain an enzyme solution.
  • the recombinant vector pNPAP was constructed by inserting it between the NdeI recognition site downstream of the lac promoter and the EcoRI recognition site of the plasmid (which has been newly introduced with the NdeI site by modification to TG). Using this recombinant vector pNPAP, E. coli HB101 competent cells (Takara Bio Inc.) were transformed. E. coli HB101 (pNPAP) was obtained.
  • the obtained transformant was inoculated into 50 ml of 2 ⁇ YT medium (tripton 1.6%, yeast extract 1.0%, NaCl 0.5%, pH 7.0) containing 200 ⁇ g / ml ampicillin at 37 ° C. Cultured with shaking for 24 hours.
  • the enzyme activity was measured, the PAP activity was 40 U / ml, and the ADK activity derived from Escherichia coli used as the host cell was 90 U / ml.
  • the cells were collected by centrifugation, suspended in 2.5 ml of 100 mM phosphate buffer (pH 7.0), and sonicated to obtain an enzyme solution.
  • the reaction product was quantitatively analyzed by high performance liquid chromatography, and the yield was determined by the following formula. Yield: amount of each compound produced (mol) / initial L-cysteine (mol) ⁇ 100
  • the conditions of the high performance liquid chromatography are as follows. Under these elution conditions, glutathione (GSH), ⁇ -glutamylcysteine ( ⁇ -GC), oxidized ⁇ -GC, and oxidized glutathione (GSSG) are eluted in this order.
  • Example 1 ATP equivalent addition system, reaction under nitrogen atmosphere> The reaction of Example 1 shown below was performed under a nitrogen atmosphere. (Production of ⁇ -glutamylcysteine)
  • Nitrogen is flowed from the nitrogen line port at 10 ml / min to expel air in the gas phase in the reaction vessel, so that the oxygen concentration in the gas phase reaches 0% by volume.
  • the reaction was carried out in a maintained state. The temperature during the reaction was 30 ° C.
  • the reaction proceeded continuously, and ⁇ -glutamylcysteine and oxidized glutamylcysteine were produced. After 6 hours of reaction, L-cysteine disappeared.
  • the yields of ⁇ -glutamylcysteine and oxidized glutamylcysteine after 6 hours of reaction were 97 mol% and 1 mol%, respectively, with respect to the initial L-cysteine.
  • the reaction proceeded continuously, and after 4 hours of reaction, ⁇ -glutamylcysteine and oxidized glutamylcysteine disappeared, and glutathione and oxidized glutathione were produced.
  • the yield after 4 hours of reaction was 94 mol% glutathione and 2 mol% oxidized glutathione with respect to the initial L-cysteine.
  • Example 2 ATP regeneration system, reaction under nitrogen atmosphere> The reaction of Example 2 shown below was performed under a nitrogen atmosphere. (Production of ⁇ -glutamylcysteine)
  • the reaction vessel is provided with a nitrogen line port and an exhaust port, and nitrogen is flowed from the nitrogen line port at a rate of 10 ml / min.
  • the reaction was carried out in a maintained state.
  • the temperature during the reaction was 30 ° C.
  • the reaction proceeded continuously, and ⁇ -glutamylcysteine and oxidized glutamylcysteine were produced.
  • L-cysteine disappeared.
  • the yields of ⁇ -glutamylcysteine and oxidized glutamylcysteine after 6 hours of reaction were 95 mol% and 1 mol%, respectively, with respect to the initial L-cysteine.
  • the reaction solution after 6 hours of the above reaction was mixed with 0.19 g (2.53 mmol) of glycine, and the pH was adjusted to 7.5 with 0.2 g of a 15 wt% aqueous sodium hydroxide solution.
  • 1 g of glutathione synthetase (GSH II) enzyme solution prepared in Experiment 2 and 1 g of PAP enzyme solution prepared in Experiment 4 were added thereto, and the reaction was started.
  • the reaction was performed in a nitrogen atmosphere in the same manner as in the ⁇ -glutamylcysteine production step.
  • the temperature during the reaction was 30 ° C.
  • the reaction proceeded continuously, and glutathione and oxidized glutathione were produced.
  • the GSH I enzyme solution prepared in Experiment 1, the GSH II enzyme solution prepared in Experiment 2, and the PAP enzyme solution prepared in Experiment 4 are derived from Escherichia coli used as host cells, respectively. Since ADK activity is included, it was not necessary to prepare an ADK enzyme solution separately in the above two steps.
  • the temperature during the reaction was 30 ° C.
  • the reaction proceeded continuously, and ⁇ -glutamylcysteine and oxidized glutamylcysteine were produced. After 6 hours of reaction, L-cysteine disappeared.
  • the yields of ⁇ -glutamylcysteine and oxidized glutamylcysteine after 6 hours of reaction were 78 mol% and 10 mol%, respectively, relative to the initial L-cysteine.
  • the reaction proceeded continuously, and after 4 hours of reaction, ⁇ -glutamylcysteine and oxidized glutamylcysteine disappeared, and glutathione and oxidized glutathione were produced.
  • the yield after 4 hours of reaction was 58 mol% glutathione and 20 mol% oxidized glutathione with respect to the initial L-cysteine.
  • the reaction solution after 6 hours of the above reaction was mixed with 0.19 g (2.53 mmol) of glycine, and the pH was adjusted to 7.5 with 0.2 g of a 15 wt% aqueous sodium hydroxide solution.
  • 1 g of glutathione synthetase (GSH II) enzyme solution prepared in Experiment 2 and 1 g of PAP enzyme solution prepared in Experiment 4 were added thereto, and the reaction was started. Nitrogen replacement was not performed, and the reaction was performed in a state where the reaction solution was in contact with the air in the reaction vessel. The temperature during the reaction was 30 ° C. The reaction proceeded continuously, and glutathione and oxidized glutathione were produced.
  • the GSH I enzyme solution prepared in Experiment 1, the GSH II enzyme solution prepared in Experiment 2, and the PAP enzyme solution prepared in Experiment 4 are derived from Escherichia coli used as host cells, respectively. Since ADK activity is included, it was not necessary to prepare an ADK enzyme solution separately in the above two steps.
  • the reaction vessel is provided with a nitrogen line port and an exhaust port, and nitrogen is flowed from the nitrogen line port at a rate of 10 ml / min.
  • the reaction was carried out in a maintained state. The temperature during the reaction was 30 ° C.
  • the conversion rates were 7.3 mol% and 0.6 mol% for the initial L-cysteine, respectively. Thereafter, the reaction proceeded, but almost stopped after 7 hours. The conversion rates were 10.8 mol% and 1.2 mol% for the initial L-cysteine, respectively. All of ATP, ADP, and AMP disappeared, and adenine, adenosine, and hypoxanthine, which are degradation products of AMP, were confirmed.
  • liquid containing unbroken cells of recombinant Escherichia coli expressing GSH F is the last “collecting cells by centrifugation and collecting 2.5 ml of 100 mM phosphate buffer ( Instead of the operation of “suspending in pH 7.0) and sonication to obtain an enzyme solution”, “then, the cells are collected by centrifugation and added to 2.5 ml of 100 mM phosphate buffer (pH 7.0). It was prepared by the same materials and procedures as those in Experiment 3 except that the suspension was used to make a solution containing undisrupted cells of recombinant Escherichia coli expressing GSH F.
  • the above-mentioned “solution containing unbroken cells of recombinant E. coli expressing PAP” is the last “in the experiment 4“ collecting the cells by centrifugation and collecting 2.5 ml of 100 mM phosphate buffer (pH 7). 0.0), instead of the operation of “suspending and sonicating into an enzyme solution”, the cells were collected by centrifugation and suspended in 2.5 ml of 100 mM phosphate buffer (pH 7.0). It was prepared according to the same materials and procedures as those in Experiment 4 except that the operation was carried out to make the solution turbid and a solution containing unbroken cells of recombinant Escherichia coli expressing PAP.
  • the solution prepared by the above method containing unbroken cells of recombinant Escherichia coli expressing GSH F and the solution containing unbroken cells of recombinant Escherichia coli expressing PAP are used as host cells, respectively. Since the ADK activity derived from Escherichia coli was included, it was not necessary to prepare an ADK enzyme solution separately in the above step.
  • Sequence number 2 Primer Sequence number 3: Primer sequence number 5: Primer sequence number 6: Primer

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Abstract

　本発明は、グルタチオン及びその前駆体であるγ－グルタミルシステインを高収率で製造する方法を提供することを解決課題とする。　本発明のグルタチオンの製造方法は、上記課題を解決する手段として、低酸素雰囲気下でＬ－システインとＬ－グルタミン酸とを反応させてγ－グルタミルシステインを生成する工程Ａ'と、低酸素雰囲気下でγ－グルタミルシステインとグリシンとを反応させてグルタチオンを生成する工程Ｂ'とを含む。

Description

γ－グルタミルシステイン及びグルタチオンの製造方法
　本発明はγ－グルタミルシステインを製造する方法に関する。
　本発明はまたグルタチオンを製造する方法に関する。
　グルタチオンは、Ｌ－システイン、Ｌ－グルタミン酸、グリシンの３つのアミノ酸から成るペプチドで、人体だけでなく、他の動物や植物、微生物など多くの生体内に存在し、活性酸素の消去作用、解毒作用、アミノ酸代謝など、生体にとって重要な化合物である。
　グルタチオンは生体内で、Ｌ－システイン残基のチオール基が還元されたＳＨの形態である還元型のグルタチオン（Ｎ－（Ｎ－γ－Ｌ－グルタミル－Ｌ－システイニル）グリシン、以下「ＧＳＨ」と称することがある）と、Ｌ－システイン残基のチオール基が酸化されグルタチオン２分子間でジスルフィド結合を形成した形態である酸化型グルタチオン（以下「ＧＳＳＧ」と称することがある）とのいずれかの形態で存在する。
　グルタチオンの製造方法としてはサッカロマイセス・セレビジエやキャンディダ・ユーティリスを用いた発酵法（非特許文献１）、及びＬ－グルタミン酸、Ｌ－システイン、グリシン及び界面活性剤や有機溶媒の存在下、γ－グルタミルシステイン合成酵素やグルタチオン合成酵素を組換え生産させたエシェリヒア・コリやサッカロマイセス・セレビジエの菌体を酵素源として用いる酵素法（特許文献１、２）（非特許文献１、２）等が一般的である。
特開昭６０－２７３９６号公報 特開昭６０－２７３９７号公報
Appl. Microbial. Biotechnol., 66, 233 (2004) Appl. Environ. Microbial., 44, 1444 (1982)
　本発明者らは、大気雰囲気下において、酵素を用いてＬ－システインとＬ－グルタミン酸とからγ－グルタミルシステインを製造する工程を行う場合に、γ－グルタミルシステインだけでなく、副生成物として、Ｌ－システイン残基のチオール基が酸化されて２分子のγ－グルタミルシステインがジスルフィド結合を介して結合してなる化合物である酸化型γ－グルタミルシステインが相当量生じ、γ－グルタミルシステインの収率が低下するという課題があることを見出した。
　更に本発明者らは、大気雰囲気下において、酵素を用いてγ－グルタミルシステインとグリシンとからグルタチオンを合成する工程を行う場合に、還元型であるグルタチオンだけでなく、副生成物として酸化型グルタチオンが相当量生じ、グルタチオンの収率が低下するという課題があることを見出した。
　反応を酵素を用いて行わない場合にも同様の課題があると考えられる。
　本発明は、酸化型γ－グルタミルシステインの副生成が抑制された、γ－グルタミルシステインの製造方法を提供することを解決すべき課題とする。また本発明は、酸化型グルタチオンの副生成が抑制された、グルタチオンの製造方法を提供することを解決すべき課題とする。
　なお、本発明において「グルタチオン」又は「ＧＳＨ」は専ら「還元型グルタチオン」を意味し、酸化型のグルタチオンは「酸化型グルタチオン」又は「ＧＳＳＧ」と表現する。また本発明において「γ－グルタミルシステイン」は専ら「還元型γ－グルタミルシステイン」を意味し、２分子のγ－グルタミルシステインが酸化して－Ｓ－Ｓ－結合により結合した化合物は「酸化型γ－グルタミルシステイン」と表現する。
　本明細書では上記課題を解決するための手段として、以下の発明を開示する。
（１）Ｌ－システインとＬ－グルタミン酸とを、大気よりも酸素濃度が低い雰囲気下で、γ－グルタミルシステイン合成酵素及び２機能性グルタチオン合成酵素からなる群から選択される少なくとも１種の酵素のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ，アデノシン５’－三リン酸ともいう）の存在下での作用により反応させて、γ－グルタミルシステインを生成する工程Ａを含むことを特徴とする、γ－グルタミルシステインの製造方法。
　当該（１）の方法では、副生物である酸化型γ－グルタミルシステインの生成が抑制され、γ－グルタミルシステインを高効率で製造することができる。
（２）前記工程Ａが、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ，アデノシン５’－二リン酸ともいう）をアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）へと再生するＡＴＰ再生反応と共役させて行われる、（１）に記載の方法。
　当該（２）の方法では、工程Ａで消費されるＡＴＰを再生できＡＴＰの添加量を低減することができる。
（３）前記γ－グルタミルシステイン合成酵素がエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）由来である、（１）又は（２）に記載の方法。
　当該（３）の方法で用いられるγ－グルタミルシステイン合成酵素は、Ｌ－システインとＬ－グルタミン酸からγ－グルタミルシステインを生成する活性が特に高いため好ましい。
（４）前記２機能性グルタチオン合成酵素がストレプトコッカス・アガラクチエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｇａｌａｃｔｉａｅ）由来である、（１）又は（２）に記載の方法。
　当該（４）の方法で用いられる２機能性グルタチオン合成酵素は、Ｌ－システインとＬ－グルタミン酸からγ－グルタミルシステインを生成する活性が特に高いため好ましい。
（５）γ－グルタミルシステインとグリシンとを、大気よりも酸素濃度が低い雰囲気下で、グルタチオン合成酵素及び２機能性グルタチオン合成酵素からなる群から選択される少なくとも１種の酵素のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の存在下での作用により反応させて、グルタチオンを生成する工程Ｂを含むことを特徴とする、グルタチオンの製造方法。
　当該（５）の方法では、副生物である酸化型グルタチオンの生成が抑制され、グルタチオンを高効率で製造することができる。
（６）前記工程Ｂが、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）をアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）へと再生するＡＴＰ再生反応と共役させて行われる、（５）に記載の方法。
　当該（６）の方法では、工程Bで消費されるＡＴＰを再生できＡＴＰの添加量を低減することができる。
（７）前記グルタチオン合成酵素がエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）由来である、（５）又は（６）に記載の方法。
　当該（７）の方法で用いられるグルタチオン合成酵素は、γ－グルタミルシステインとグリシンとからグルタチオンを生成する活性が特に高いため好ましい。
（８）前記２機能性グルタチオン合成酵素がストレプトコッカス・アガラクチエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｇａｌａｃｔｉａｅ）由来である、（５）又は（６）に記載の方法。
　当該（８）の方法で用いられる２機能性グルタチオン合成酵素は、γ－グルタミルシステインとグリシンとからグルタチオンを生成する活性が特に高いため好ましい。
（９）Ｌ－システインとＬ－グルタミン酸とを、大気よりも酸素濃度が低い雰囲気下で、γ－グルタミルシステイン合成酵素及び２機能性グルタチオン合成酵素からなる群から選択される少なくとも１種の酵素のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の存在下での作用により反応させて、γ－グルタミルシステインを生成する工程Ａを更に含み、
　前記工程Ｂに用いられるγ－グルタミルシステインが、前記工程Ａにより生成されたものである、
（５）～（８）のいずれかに記載の方法。
　当該（９）の方法によれば、Ｌ－システインとＬ－グルタミン酸とから、副生成物である酸化型γ－グルタミルシステイン及び酸化型グルタチオンの生成量が少なく効率よくグルタチオンを製造することができる。
（１０）前記工程Ａが、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）をアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）へと再生するＡＴＰ再生反応と共役させて行われる、（９）に記載の方法。
　当該（１０）の方法によれば、工程Ａで消費されるＡＴＰを再生できＡＴＰの添加量を低減することができる。
（１１）前記γ－グルタミルシステイン合成酵素がエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）由来である、（９）又は（１０）に記載の方法。
　当該（１１）の方法に用いられるγ－グルタミルシステイン合成酵素は、Ｌ－システインとＬ－グルタミン酸からγ－グルタミルシステインを生成する活性が特に高いため好ましい。
（１２）前記２機能性グルタチオン合成酵素がストレプトコッカス・アガラクチエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｇａｌａｃｔｉａｅ）由来である、（９）又は（１０）に記載の方法。
　当該（１２）の方法に用いられる２機能性グルタチオン合成酵素は、Ｌ－システインとＬ－グルタミン酸からγ－グルタミルシステインを生成する活性が特に高いため好ましい。
（１３）Ｌ－システインとＬ－グルタミン酸とを、大気よりも酸素濃度が低い雰囲気下で反応させて、γ－グルタミルシステインを生成する工程Ａ’を含むことを特徴とする、γ－グルタミルシステインの製造方法。
　当該（１３）の方法では、副生物である酸化型γ－グルタミルシステインの生成が抑制され、γ－グルタミルシステインを高効率で製造することができる。本方法では、より好ましくは前記工程Ａ’が（１）に記載の前記工程Ａである。
（１４）γ－グルタミルシステインとグリシンとを、大気よりも酸素濃度が低い雰囲気下で反応させて、グルタチオンを生成する工程Ｂ’を含むことを特徴とする、グルタチオンの製造方法。
　当該（１４）の方法では、副生物である酸化型グルタチオンの生成が抑制され、グルタチオンを高効率で製造することができる。本方法では、より好ましくは前記工程Ｂ’が（５）に記載の前記工程Ｂである。
（１５）Ｌ－システインとＬ－グルタミン酸とを、大気よりも酸素濃度が低い雰囲気下で反応させて、γ－グルタミルシステインを生成する工程Ａ’を更に含み、
　前記工程Ｂ’に用いられるγ－グルタミルシステインが、前記工程Ａ’により生成されたものである、（１４）に記載の方法。
　当該（１５）の方法では、副生物である酸化型γ－グルタミルシステイン及び酸化型グルタチオンの生成が抑制され、グルタチオンを高効率で製造することができる。本方法では、より好ましくは前記工程Ａ’が（１）に記載の前記工程Ａである。
　なお、本明細書において「Ｌ－システイン」、「Ｌ－グルタミン酸」、「グリシン」「γ－グルタミルシステイン」、「グルタチオン」、「Ｌ－シスチン」、「酸化型γ－グルタミルシステイン」、「酸化型グルタチオン」、「アデノシン三リン酸」、「アデノシン二リン酸」、「アデノシン一リン酸」、「縮合リン酸」、「ポリリン酸」等の各用語は、それぞれ、各化合物の形態を限定するものではなく、フリー体の形態であってもよいし、ナトリウム塩、カリウム塩等の塩の形態や、水和物等の溶媒和物の形態や、電離したイオンの形態である場合も包含する。
　本発明において大気とは地上の大気、すなわち空気を指す。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号２０１４－１５４０２６号の開示内容を包含する。
　本発明は、酸化型γ－グルタミルシステインの副生成が抑制された、γ－グルタミルシステインの製造方法を提供する。本発明はまた、酸化型グルタチオンの副生成が抑制された、グルタチオンの製造方法を提供する。
＜本発明で用いる酵素＞
　本明細書では、γ－グルタミルシステイン合成酵素を「ＧＳＨ　Ｉ」、グルタチオン合成酵素を「ＧＳＨ　ＩＩ」、２機能性グルタチオン合成酵素を「ＧＳＨ　Ｆ」、アデニル酸キナーゼを「ＡＤＫ」、ポリリン酸依存的ＡＭＰトランスフェラーゼを「ＰＡＰ」とそれぞれ略記する場合がある。
＜ＧＳＨ　Ｉ＞
　本発明に用いられるγ－グルタミルシステイン合成酵素（ＧＳＨ　Ｉ）は、ＡＴＰの存在下でＬ－システイン（Ｌ－Ｃｙｓ）を基質として認識し、Ｌ－グルタミン酸（Ｌ－Ｇｌｕ）と結合させることでγ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓを生成する反応を触媒する活性を有する酵素であり、当該活性を有する限りその起源、構造等は特に限定されない。本発明において、当該活性を、γ－グルタミルシステイン合成酵素活性という。当該活性の１Ｕは、３０℃で１分間に１μｍｏｌのγ－グルタミルシステインを生成する活性を意味し、以下の測定条件で測定したものである。
（測定条件）
１０ｍＭ　ＡＴＰ、１５ｍＭ　Ｌ－グルタミン酸、１５ｍＭ　Ｌ－システイン、１０ｍＭ　硫酸マグネシウムを含有する５０ｍＭ　トリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）に酵素液を添加して３０℃で保温することで反応を行い、６Ｎ　塩酸を添加することで反応を停止させる。高速液体クロマトグラフィーを用いて反応液中のγ－グルタミルシステインを定量する。
　上記高速液体クロマトグラフィーの条件は以下の通りである。この条件では、グルタチオン（ＧＳＨ）、γ－グルタミルシステイン（γ－ＧＣ）、酸化型γ－ＧＣ、酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）の順で溶出する。
［ＨＰＬＣ条件］
カラム：ＯＤＳ－ＨＧ－３（４．６ｍｍφ×１５０ｍｍ、野村化学社製）；
溶離液：リン酸２水素カリウム１２．２ｇ及びヘプタンスルホン酸ナトリウム３．６ｇを蒸留水１．８Ｌで溶解した後、該溶液をリン酸でｐＨ２．８に調整し、メタノール１８６ｍｌを追加して溶解した液；
流速：１．０ｍｌ／分；
カラム温度：４０℃；
測定波長：２１０ｎｍ
　ＧＳＨ　Ｉとしてはタンパク質１ｍｇあたりのγ－グルタミルシステイン合成酵素活性（比活性）が０．５Ｕ以上のものを使用することが好ましい。
　ＧＳＨ　Ｉの起源は特に限定されず微生物、動物、植物等に由来するものを用いることができる。微生物由来のＧＳＨ　Ｉが好ましく、特にエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）等の腸内細菌や、コリネ型細菌等の細菌、酵母等の真核微生物等に由来するＧＳＨ　Ｉが好ましい。
　エシェリヒア・コリ由来のＧＳＨ　Ｉの塩基配列、及び該塩基配列によりコードされるアミノ酸配列の具体例を、それぞれ配列番号１及び配列番号９に示す。
　ＧＳＨ　Ｉとしてはまた、配列番号９に示すアミノ酸配列からなるＧＳＨ　Ｉに限らず、その活性変異体や他種オルソログ等の、ＧＳＨ　Ｉ活性を有する他のポリペプチドも使用できる。ＧＳＨ　Ｉ活性を有する他のポリペプチドは、好ましくは、上記の活性測定条件において、配列番号９に示すアミノ酸配列からなるＧＳＨ　Ｉを用いた場合の１０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上の活性を示すポリペプチドである。上記の活性変異体、他種オルソログ等の、ＧＳＨ　Ｉ活性を有する他のポリペプチドには、例えば、配列番号９に示すアミノ酸配列において、１～複数個のアミノ酸が付加、欠失、又は置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド（特に好ましくは、配列番号９に示すアミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端の一方又は両方において合計で１～複数個のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加、好ましくは欠失及び／又は付加したアミノ酸配列からなるポリペプチド）や、配列番号９に示すアミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドが該当する。更に、配列番号９に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号９に示すアミノ酸配列において１～複数個のアミノ酸が付加、欠失、又は置換されたアミノ酸配列からなる前記ポリペプチド、並びに、配列番号９に示すアミノ酸配列に対して前記のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列からなる前記ポリペプチドからなる群から選択される少なくとも１種のポリペプチドの、ＧＳＨ　Ｉ活性を有する断片も、前記他のポリペプチドとして使用することができ、該断片としては、アミノ酸数が好ましくは２５０以上、より好ましくは３００以上、より好ましくは４００以上、より好ましくは５００以上のポリペプチドを用いることができる。本明細書において「複数個」とは、例えば、２～２０個、２～１５個、２～１０個、２～７個、２～５個、２～４個又は２～３個をいう。「アミノ酸同一性」とは、二つのアミノ酸配列を整列（アラインメント）し、必要に応じてギャップを導入して、両者のアミノ酸一致度が最も高くなるようにしたときの、配列番号９に示すタンパク質の全アミノ酸残基数に対する同一アミノ酸残基の割合（％）をいう。アミノ酸同一性は、ＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡによるタンパク質の検索システムを用いて算出することができる（Karlin，S．et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877；Altschul，S．F．et al., 1990, J. Mol. Biol., 215: 403-410；Pearson，W．R．et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444-2448）。また、アミノ酸の置換は、保存的アミノ酸置換が望ましい。「保存的アミノ酸置換」とは、電荷、側鎖、極性、芳香族性等の性質の類似するアミノ酸間の置換をいう。性質の類似するアミノ酸は、例えば、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性アミノ酸（グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン）、無極性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン、アラニン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン）、分枝鎖アミノ酸（ロイシン、バリン、イソロイシン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン）等に分類することができる。前記各ポリペプチドは適宜化学修飾されていてもよい。
　ＧＳＨ　Ｉの調製に用いることができる、ＧＳＨ　Ｉをコードする遺伝子（ＤＮＡ又はＲＮＡ）の塩基配列は、配列番号１に示す塩基配列には限定されず、目的とするＧＳＨ　Ｉのアミノ酸配列をコードする、宿主生物の種類に応じた適当な塩基配列であることができる。
＜ＧＳＨ　ＩＩ＞
　本発明に用いられるグルタチオン合成酵素（ＧＳＨ　ＩＩ）は、ＡＴＰの存在下でγ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓを基質として認識し、グリシン（Ｇｌｙ）と結合させることでγ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙを生成する反応を触媒する活性を有する酵素であり、当該活性を有する限りその起源、構造等は特に限定されない。本発明において、当該活性をグルタチオン合成酵素活性という。当該活性の１Ｕは、３０℃で１分間に１μｍｏｌのグルタチオンを生成する活性を意味し、以下の測定条件で測定したものである。
（測定条件）
　１０ｍＭ　ＡＴＰ、１５ｍＭ　γ－グルタミルシステイン、１５ｍＭ　グリシン、１０ｍＭ　硫酸マグネシウムを含有する５０ｍＭ　トリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）に酵素液を添加して３０℃で保温することで反応を行い、６Ｎ　塩酸を添加することで反応を停止させる。高速液体クロマトグラフィーを用いて反応液中のグルタチオンを定量する。
　高速液体クロマトグラフィーの条件は、ＧＳＨ　Ｉの活性測定法に関して上述したのと同じ条件を用いる。
　ＧＳＨ　ＩＩとしてはタンパク質１ｍｇあたりのグルタチオン合成酵素活性（比活性）が０．５Ｕ以上のものを使用することが好ましい。
　ＧＳＨ　ＩＩの起源は特に限定されず微生物、動物、植物等に由来するものを用いることができる。微生物由来のＧＳＨ　ＩＩが好ましく、特にエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）等の腸内細菌や、コリネ型細菌等の細菌、酵母等の真核微生物等に由来するＧＳＨ　ＩＩが好ましい。
　エシェリヒア・コリ由来のＧＳＨ　ＩＩの塩基配列、及び該塩基配列によりコードされるアミノ酸配列の具体例を、それぞれ配列番号４及び配列番号１０に示す。
　ＧＳＨ　ＩＩとしてはまた、配列番号１０に示すアミノ酸配列からなるＧＳＨ　ＩＩに限らず、その活性変異体や他種オルソログ等の、ＧＳＨ　ＩＩ活性を有する他のポリペプチドも使用できる。ＧＳＨ　ＩＩ活性を有する他のポリペプチドは、好ましくは、上記の活性測定条件において、配列番号１０に示すアミノ酸配列からなるＧＳＨ　ＩＩを用いた場合の１０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上の活性を示すポリペプチドである。上記の活性変異体、他種オルソログ等の、ＧＳＨ　ＩＩ活性を有する他のポリペプチドには、例えば、配列番号１０に示すアミノ酸配列において、１～複数個のアミノ酸が付加、欠失、又は置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド（特に好ましくは、配列番号１０に示すアミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端の一方又は両方において合計で１～複数個のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加、好ましくは欠失及び／又は付加したアミノ酸配列からなるポリペプチド）や、配列番号１０に示すアミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドが該当する。更に、配列番号１０に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号１０に示すアミノ酸配列において１～複数個のアミノ酸が付加、欠失、又は置換されたアミノ酸配列からなる前記ポリペプチド、並びに、配列番号１０に示すアミノ酸配列に対して前記のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列からなる前記ポリペプチドからなる群から選択される少なくとも１種のポリペプチドの、ＧＳＨ　ＩＩ活性を有する断片も、前記他のポリペプチドとして使用することができ、該断片としては、アミノ酸数が好ましくは１５０以上、より好ましくは２００以上、より好ましくは３００以上のポリペプチドを用いることができる。「アミノ酸同一性」とは、二つのアミノ酸配列を整列（アラインメント）し、必要に応じてギャップを導入して、両者のアミノ酸一致度が最も高くなるようにしたときの、配列番号１０に示すタンパク質の全アミノ酸残基数に対する同一アミノ酸残基の割合（％）をいう。また、アミノ酸の置換は、保存的アミノ酸置換が望ましい。ここで「複数個」の好適な範囲、アミノ酸同一性の算出方法、保存的アミノ酸置換についてはＧＳＨ　Ｉに関して説明した通りである。前記各ポリペプチドは適宜化学修飾されていてもよい。
　ＧＳＨ　ＩＩの調製に用いることができる、ＧＳＨ　ＩＩをコードする遺伝子（ＤＮＡ又はＲＮＡ）の塩基配列は、配列番号４に示す塩基配列には限定されず、目的とするＧＳＨ　ＩＩのアミノ酸配列をコードする、宿主生物の種類に応じた適当な塩基配列であることができる。
＜ＧＳＨ　Ｆ＞
　本発明に用いられる２機能性グルタチオン合成酵素（ＧＳＨ　Ｆ）は、ＡＴＰ存在下でＬ－Ｃｙｓを基質として認識し、Ｌ－Ｇｌｕと結合させることでγ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓを生成する反応を触媒する活性及びＡＴＰ存在下でγ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓを基質として認識し、Ｇｌｙと結合させることでγ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙを生成する反応を触媒する活性を併せ持つ酵素であり、当該活性を有する限りその起源、構造等は特に限定されない。本発明において、当該活性を、２機能性グルタチオン合成酵素活性という。当該活性の１Ｕは、３０℃で１分間に１μｍｏｌのγ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ（グルタチオン）を生成する活性を意味し、以下の測定条件で測定したものである。
（測定条件）
　１０ｍＭ　ＡＴＰ、１５ｍＭ　Ｌ－グルタミン酸、１５ｍＭ　Ｌ－システイン、１５ｍＭ　グリシン、１０ｍＭ　硫酸マグネシウムを含有する５０ｍＭ　トリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）に酵素液を添加して３０℃で保温することで反応を行い、６Ｎ　塩酸を添加することで反応を停止させる。高速液体クロマトグラフィーを用いて反応液中のグルタチオンを定量する。
　高速液体クロマトグラフィーの条件は、ＧＳＨ　Ｉの活性測定法に関して上述したのと同じ条件を用いる。
　ＧＳＨ　Ｆとしてはタンパク質１ｍｇあたりの２機能性グルタチオン合成酵素活性（比活性）が０．５Ｕ以上のものを使用することが好ましい。
　ＧＳＨ　Ｆの起源は特に限定されず微生物、動物、植物等に由来するものを用いることができる。微生物由来のＧＳＨ　Ｆが好ましい。特に細菌由来ＧＳＨ　Ｆが好ましく、具体的には、ストレプトコッカス・アガラクチエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓ）、ストレプトコッカス・スイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｕｉｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）等のストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌；ラクトバシルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｌａｎｔａｒｕｍ）等のラクトバシルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌；デスルフォタレア・サイクロフィラ（Ｄｅｓｕｌｆｏｔａｌｅａ　ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌａ）等のデスルフォタレア（Ｄｅｓｕｌｆｏｔａｌｅａ）属細菌；クロストリジウム・パーフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）等のクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌；リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ　ｉｎｎｏｃｕａ）、リステリア・モノサイトジェネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ　ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）等のリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属細菌；エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃｉｕｍ）等のエンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌；パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ　ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）等のパスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）属細菌；マンハイミア・スクシニシプロデュセンス（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ　ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｅｃｅｎｓ）等のマンハイミア（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ）属細菌；及び、ヘモフィルス・ソムナス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｓｏｍｎｕｓ）等のヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）属細菌からなる群から選択される少なくとも１種に由来するＧＳＨ　Ｆが好ましい。
　ストレプトコッカス・アガラクチエ由来のＧＳＨ　Ｆの塩基配列、及び該塩基配列によりコードされるアミノ酸配列の具体例を、それぞれ配列番号１１及び配列番号１２に示す。また、配列番号７の第４塩基～第２２５３塩基からなる塩基配列は、配列番号１２に示すアミノ酸配列からなるストレプトコッカス・アガラクチエ由来ＧＳＨ　Ｆをコードする塩基配列であって、大腸菌でのコドン使用頻度に適合させた塩基配列の例である。
　ＧＳＨ　Ｆとしてはまた、配列番号１２に示すアミノ酸配列からなるＧＳＨ　Ｆに限らず、その活性変異体や他種オルソログ等の、ＧＳＨ　Ｆ活性を有する他のポリペプチドも使用できる。ＧＳＨ　Ｆ活性を有する他のポリペプチドは、好ましくは、上記の活性測定条件において、配列番号１２に示すアミノ酸配列からなるＧＳＨ　Ｆを用いた場合の１０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上の活性を示すポリペプチドである。上記の活性変異体、他種オルソログ等の、ＧＳＨ　Ｆ活性を有する他のポリペプチドには、例えば、配列番号１２に示すアミノ酸配列において、１～複数個のアミノ酸が付加、欠失、又は置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド（特に好ましくは、配列番号１２に示すアミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端の一方又は両方において合計で１～複数個のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加、好ましくは欠失及び／又は付加したアミノ酸配列からなるポリペプチド）や、配列番号１２に示すアミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドが該当する。更に、配列番号１２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号１２に示すアミノ酸配列において１～複数個のアミノ酸が付加、欠失、又は置換されたアミノ酸配列からなる前記ポリペプチド、並びに、配列番号１２に示すアミノ酸配列に対して前記のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列からなる前記ポリペプチドからなる群から選択される少なくとも１種のポリペプチドの、ＧＳＨ　Ｆ活性を有する断片も、前記他のポリペプチドとして使用することができ、該断片としては、アミノ酸数が好ましくは４００以上、より好ましくは５００以上、より好ましくは６００以上、より好ましくは７００以上、より好ましくは７３０以上のポリペプチドを用いることができる。「アミノ酸同一性」とは、二つのアミノ酸配列を整列（アラインメント）し、必要に応じてギャップを導入して、両者のアミノ酸一致度が最も高くなるようにしたときの、配列番号１２に示すタンパク質の全アミノ酸残基数に対する同一アミノ酸残基の割合（％）をいう。また、アミノ酸の置換は、保存的アミノ酸置換が望ましい。ここで「複数個」の好適な範囲、アミノ酸同一性の算出方法、保存的アミノ酸置換についてはＧＳＨ　Ｉに関して説明した通りである。前記各ポリペプチドは適宜化学修飾されていてもよい。
　ＧＳＨ　Ｆの調製に用いることができる、ＧＳＨ　Ｆをコードする遺伝子（ＤＮＡ又はＲＮＡ）の塩基配列は、配列番号１１に示す塩基配列には限定されず、目的とするＧＳＨ　Ｆのアミノ酸配列をコードする、宿主生物の種類に応じた適当な塩基配列であることができる。
＜ＡＤＫ＞
　本発明に用いられるアデニル酸キナーゼ（ＡＤＫ）は、２分子のＡＤＰからＡＴＰ、ＡＭＰを１分子ずつ生成する反応を触媒する活性を有する酵素であり、当該活性を有する限りその起源、構造等は特に限定されない。本発明において、当該活性をＡＤＫ活性という。当該活性の１Ｕは、３０℃で１分間に１μｍｏｌのＡＭＰを生成する活性を意味し、以下の測定条件で測定したものである。
（測定条件）
　１０ｍＭ　ＡＤＰ、７０ｍＭ　硫酸マグネシウムを含有する５０ｍＭ　トリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）に酵素液を添加して３０℃で保温することで反応を行い、６Ｎ　塩酸を添加することで反応を停止させる。高速液体クロマトグラフィーを用いて反応液中のＡＭＰを定量した。
　上記高速液体クロマトグラフィーの条件は以下の通りである。この条件ではアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン一リン酸（５’－アデニル酸）（ＡＭＰ）の順で溶出する。
［ＨＰＬＣ条件］
カラム：ＯＤＳ－ＨＧ－３　（４．６ｍｍφ×１５０ｍｍ、野村化学社製）；
溶離液：リン酸２水素カリウム　１２．２ｇ及びヘプタンスルホン酸ナトリウム３．６ｇを蒸留水１．８Ｌで溶解した後、該溶液をリン酸でｐＨ２．８に調整し、メタノール１８６ｍｌを追加して溶解した液；
流速：１．０ｍｌ／分；
カラム温度：４０℃；
測定波長：２１０ｎｍ
　ＡＤＫとしてはタンパク質１ｍｇあたりのＡＤＫ活性（比活性）が２０Ｕ以上のものを使用することが好ましい。
　ＡＤＫの起源は特に限定されず微生物、動物、植物等に由来するものを用いることができる。微生物由来ＡＤＫが好ましい。特に細菌由来ＡＤＫが好ましく、具体的には、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）由来ＡＤＫが好ましい。
　エシェリヒア・コリ由来のＡＤＫの塩基配列、及び該塩基配列によりコードされるアミノ酸配列の具体例を、それぞれ配列番号１３及び配列番号１４に示す。
　ＡＤＫとしてはまた、配列番号１４に示すアミノ酸配列からなるＡＤＫに限らず、その活性変異体や他種オルソログ等の、ＡＤＫ活性を有する他のポリペプチドも使用できる。ＡＤＫ活性を有する他のポリペプチドは、好ましくは、上記の活性測定条件において、配列番号１４に示すアミノ酸配列からなるＡＤＫを用いた場合の１０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上の活性を示すポリペプチドである。上記の活性変異体、他種オルソログ等の、ＡＤＫ活性を有する他のポリペプチドには、例えば、配列番号１４に示すアミノ酸配列において、１～複数個のアミノ酸が付加、欠失、又は置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド（特に好ましくは、配列番号１４に示すアミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端の一方又は両方において合計で１～複数個のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加、好ましくは欠失及び／又は付加したアミノ酸配列からなるポリペプチド）や、配列番号１４に示すアミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドが該当する。更に、配列番号１４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号１４に示すアミノ酸配列において１～複数個のアミノ酸が付加、欠失、又は置換されたアミノ酸配列からなる前記ポリペプチド、並びに、配列番号１４に示すアミノ酸配列に対して前記のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列からなる前記ポリペプチドからなる群から選択される少なくとも１種のポリペプチドの、ＡＤＫ活性を有する断片も、前記他のポリペプチドとして使用することができ、該断片としては、アミノ酸数が好ましくは１００以上、より好ましくは１５０以上、より好ましくは２００以上のポリペプチドを用いることができる。「アミノ酸同一性」とは、二つのアミノ酸配列を整列（アラインメント）し、必要に応じてギャップを導入して、両者のアミノ酸一致度が最も高くなるようにしたときの、配列番号１４に示すタンパク質の全アミノ酸残基数に対する同一アミノ酸残基の割合（％）をいう。また、アミノ酸の置換は、保存的アミノ酸置換が望ましい。ここで「複数個」の好適な範囲、アミノ酸同一性の算出方法、保存的アミノ酸置換についてはＧＳＨ　Ｉに関して説明した通りである。前記各ポリペプチドは適宜化学修飾されていてもよい。
　ＡＤＫの調製に用いることができる、ＡＤＫをコードする遺伝子（ＤＮＡ又はＲＮＡ）の塩基配列は、配列番号１３に示す塩基配列には限定されず、目的とするＡＤＫのアミノ酸配列をコードする、宿主生物の種類に応じた適当な塩基配列であることができる。
＜ＰＡＰ＞
　本発明に用いられるポリリン酸依存的ＡＭＰトランスフェラーゼ（ＰＡＰ）は、ポリリン酸をリン酸ドナーとしてＡＭＰをリン酸化してＡＤＰを生成する反応を触媒する活性を有する酵素であり、当該活性を有する限りその起源、構造等は特に限定されない。本発明において、当該活性をＰＡＰ活性という。当該活性の１Ｕは、３０℃で１分間に１μｍｏｌのＡＤＰを生成する活性を意味し、以下の測定条件で測定したものである。
（測定条件）
　５ｍＭ　メタリン酸ナトリウム、１０ｍＭ　ＡＭＰ、７０ｍＭ　硫酸マグネシウムを含有する５０ｍＭ　トリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）に酵素液を添加して３０℃で保温することで反応を行い、６Ｎ　塩酸を添加することで反応を停止させる。高速液体クロマトグラフィーを用いて反応液中のＡＤＰを定量した。
　高速液体クロマトグラフィーの条件は、ＡＤＫの活性測定法に関して上述したのと同じ条件を用いる。
　ＰＡＰとしてはタンパク質１ｍｇあたりのＰＡＰ活性（比活性）が２０Ｕ以上のものを使用することが好ましい。
　ＰＡＰの起源は特に限定されず微生物、動物、植物等に由来するものを用いることができる。微生物由来ＰＡＰが好ましい。特に細菌由来ＰＡＰが好ましく、具体的にはアシネトバクター・ジョンソニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）由来ＰＡＰが好ましい。
　アシネトバクター・ジョンソニ由来のＰＡＰの塩基配列、及び該塩基配列によりコードされるアミノ酸配列の具体例を、それぞれ配列番号１５及び配列番号１６に示す。また、配列番号８の第４塩基～第１４２８塩基からなる塩基配列は、配列番号１６に示すアミノ酸配列からなるアシネトバクター・ジョンソニ由来ＰＡＰをコードする塩基配列であって、大腸菌でのコドン使用頻度に適合させた塩基配列の例である。
　ＰＡＰとしてはまた、配列番号１６に示すアミノ酸配列からなるＰＡＰに限らず、その活性変異体や他種オルソログ等の、ＰＡＰ活性を有する他のポリペプチドも使用できる。ＰＡＰ活性を有する他のポリペプチドは、好ましくは、上記の活性測定条件において、配列番号１６に示すアミノ酸配列からなるＰＡＰを用いた場合の１０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上の活性を示すポリペプチドである。上記の活性変異体、他種オルソログ等の、ＰＡＰ活性を有する他のポリペプチドには、例えば、配列番号１６に示すアミノ酸配列において、１～複数個のアミノ酸が付加、欠失、又は置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド（特に好ましくは、配列番号１６に示すアミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端の一方又は両方において合計で１～複数個のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加、好ましくは欠失及び／又は付加したアミノ酸配列からなるポリペプチド）や、配列番号１６に示すアミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドが該当する。更に、配列番号１６に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号１６に示すアミノ酸配列において１～複数個のアミノ酸が付加、欠失、又は置換されたアミノ酸配列からなる前記ポリペプチド、並びに、配列番号１６に示すアミノ酸配列に対して前記のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列からなる前記ポリペプチドからなる群から選択される少なくとも１種のポリペプチドの、ＰＡＰ活性を有する断片も、前記他のポリペプチドとして使用することができ、該断片としては、アミノ酸数が好ましくは２５０以上、より好ましくは３００以上、より好ましくは４００以上、より好ましくは４５０以上のポリペプチドを用いることができる。「アミノ酸同一性」とは、二つのアミノ酸配列を整列（アラインメント）し、必要に応じてギャップを導入して、両者のアミノ酸一致度が最も高くなるようにしたときの、配列番号１６に示すタンパク質の全アミノ酸残基数に対する同一アミノ酸残基の割合（％）をいう。また、アミノ酸の置換は、保存的アミノ酸置換が望ましい。ここで「複数個」の好適な範囲、アミノ酸同一性の算出方法、保存的アミノ酸置換についてはＧＳＨ　Ｉに関して説明した通りである。前記各ポリペプチドは適宜化学修飾されていてもよい。
　ＰＡＰの調製に用いることができる、ＰＡＰをコードする遺伝子（ＤＮＡ又はＲＮＡ）の塩基配列は、配列番号１５に示す塩基配列には限定されず、目的とするＰＡＰのアミノ酸配列をコードする、宿主生物の種類に応じた適当な塩基配列であることができる。
＜酵素の調製＞
　本発明で用いる上記の各酵素を取得する方法は特に限定されない。上記各酵素は該酵素の活性を有する生物、例えば微生物の野生株又は変異株から調製することができる。目的とする酵素の活性を有する生物としては、本来的に該酵素の活性を有する生物と、該酵素の活性が増強された生物とのどちらでもよい。酵素の活性が増強された生物としては、遺伝子工学の手法により上記各酵素をコードする遺伝子の発現が増強された組換え生物細胞が挙げられる。なお「酵素の活性が増強された生物」とは、本来的に該酵素の活性を有する生物において該酵素の活性が増大された生物と、本来的には該酵素の活性を有さない生物において該酵素の活性が付与された生物との両方を包含する。
　遺伝子工学の手法を用いて得られる組換え生物細胞とは、典型的には、目的の酵素をコードする遺伝子（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を適当なベクターに挿入して組換えベクターとし、該組換えベクターにより適当な宿主生物細胞を形質転換して得られる、該酵素を生産する能力を有する組換え生物細胞である。該組換え生物細胞を培養することにより目的とする上記各酵素を製造することができる。宿主生物細胞としては細菌、酵母、糸状菌、植物細胞、動物細胞などが挙げられるが、導入及び発現効率の観点から細菌が好ましく、特にエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）が好ましい。
＜工程Ａ及び工程Ａ’＞
　本発明によるγ－グルタミルシステインの製造方法は、Ｌ－システインとＬ－グルタミン酸とを、大気よりも酸素濃度が低い雰囲気下で、γ－グルタミルシステイン合成酵素（ＧＳＨ　Ｉ）及び２機能性グルタチオン合成酵素（ＧＳＨ　Ｆ）からなる群から選択される少なくとも１種の酵素のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の存在下での作用により反応させて、γ－グルタミルシステインを生成する工程Ａを含むことを特徴とする。工程Ａは、前記酵素とＡＴＰとの存在下でＬ－システインとＬ－グルタミン酸とを反応させてγ－グルタミルシステインを生成する工程であり、前記酵素が作用し上記反応を触媒する際にはアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）が消費される。
　本発明によるγ－グルタミルシステインの製造方法はまた、Ｌ－システインとＬ－グルタミン酸とを、大気よりも酸素濃度が低い雰囲気下で反応させて、γ－グルタミルシステインを生成する工程Ａ’を含むことを特徴とする。工程Ａ’は酵素反応により行ってもよいし、酵素を用いず化学的な反応により行ってもよいが、好ましくは酵素反応により行う工程であり、特に好ましくは前記工程Ａである。酵素反応によれば基質化合物の官能基による保護等が不要であることや、反応の特異性が高いことなどの理由で化学的合成反応よりも有利である。
　酵素を用いない化学的な反応による工程Ａ’としては、特に限定されないが、例えば、カルボキシル基を適当な保護基で保護したＬ－システインと、α－カルボキシル基及びアミノ基を適当な保護基で保護したＬ－グルタミン酸とを反応させて、Ｌ－システイン１分子中のアミノ基に対し１分子のＬ－グルタミン酸のγ－カルボキシル基を脱水縮合させてペプチド結合を形成する工程が挙げられる。該工程では脱水縮合反応後に必要に応じて保護基の１つ以上を脱保護する。カルボキシル基に対する保護基としてはベンジル基等の公知のカルボキシル基用保護基が使用でき、アミノ基に対する保護基としてはｔ－ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、９－フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基等の公知のアミノ基用保護基が使用できる。
　工程ＡにおいてＧＳＨ　Ｉ及び／又はＧＳＨ　Ｆは、ＧＳＨ　Ｉ及び／又はＧＳＨ　Ｆ活性を有する生物の細胞を生細胞のまま用いてもよいし、死滅しているが損傷していない前記細胞の形態で用いてもよいし、ＧＳＨ　Ｉ及び／又はＧＳＨ　Ｆが細胞外に存在する形態、具体的には、前記生物の細胞の破砕物の形態で用いてもよいし、前記細胞から分離され、必要に応じて適宜精製されたタンパク質の形態で用いてもよい。ここでＧＳＨ　Ｉ及び／又はＧＳＨ　Ｆ活性を有するタンパク質の精製の程度は特に限定されず、粗精製であってもよい。
　工程Ａで用いる酵素としては、好ましくは、ＧＳＨ　Ｉ及び／又はＧＳＨ　Ｆ活性を有する生細胞を用いず、より好ましくは、ＧＳＨ　Ｉ及び／又はＧＳＨ　Ｆ活性を有する生細胞及び損傷していない死滅細胞を用いない。工程Ａで用いる酵素としては特に、細胞外に存在するＧＳＨ　Ｉ及び／又はＧＳＨ　Ｆ、具体的には、前記細胞の破砕物の形態のＧＳＨ　Ｉ及び／又はＧＳＨ　Ｆ、又は、前記細胞から分離されたタンパク質の形態のＧＳＨ　Ｉ及び／又はＧＳＨ　Ｆを用いることが好ましい。ＧＳＨ　Ｉ及び／又はＧＳＨ　Ｆを、当該活性を有する生細胞の形態で工程Ａに用いる場合は反応系中でアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）が分解され易い（実施例４参照）。ＡＭＰは後述するＡＴＰ再生反応の中間体の１つであるため、ＡＭＰが分解されると、ＡＴＰ再生反応を効率的に進めることが難しい。一方、ＧＳＨ　Ｉ及び／又はＧＳＨ　Ｆを、細胞外に存在する形態で工程Ａに用いる場合はＡＭＰの分解が生じ難く、ＡＴＰ再生反応を効率的に進めることができるため好ましい。なお、生細胞を用いずに工程Ａの反応を行う場合、生細胞による還元作用が存在しないために、酸素を多く含む雰囲気下においては酸化が進み易く酸化型γ－グルタミルシステインが生じやすいという問題があるが、本発明では工程Ａの反応を大気よりも酸素濃度が低い雰囲気下で行うことによって、γ－グルタミルシステインの酸化を抑制し、還元型のγ－グルタミルシステインを高収率で得ることが可能となる。すなわち、ＧＳＨ　Ｉ及び／又はＧＳＨ　Ｆを、細胞外に存在する形態、具体的には、当該活性を有する細胞の破砕物の形態、又は、当該細胞から分離されたタンパク質の形態で用いて本発明の工程Ａを行うことにより、ＡＭＰの分解抑制とγ－グルタミルシステインの酸化抑制を両立させることが可能となる。
　本明細書において細胞の「破砕」とは、細胞内で形成された酵素が細胞外からアクセス可能な程度に細胞の表面構造に損傷を与える処理を指し、必ずしも細胞が断片化される必要はない。本明細書において細胞の「破砕物」は、破砕処理された細胞の処理物を指す。細胞の破砕処理は、１つ又は複数の破砕処理を適当な順序で行うことにより実施できる。細胞の破砕処理としては、物理的処理、化学的処理、酵素的処理等を挙げることができる。物理的処理としては、例えば、高圧ホモジナイザー、超音波ホモジナイザー、フレンチプレス、ボールミル等の使用、或いは、これらの組み合わせを挙げることができる。上記化学的処理としては、例えば、塩酸、硫酸等の酸（好ましくは強酸）を用いる処理、水酸化ナトリウムや水酸化カリウム等の塩基（好ましくは強塩基）を用いる処理等や、これらの組み合わせを挙げることができる。上記酵素的処理としては、例えば、リゾチーム、ザイモリアーゼ、グルカナーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ等を用いる方法や、これらの組み合わせを挙げることができる。
　工程ＡにおいてＬ－システイン、Ｌ－グルタミン酸、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、工程Ａ’においてＬ－システイン、Ｌ－グルタミン酸はそれぞれ塩の形態、フリー体の形態、水和物等の溶媒和物等の各種の形態で反応系中に添加することができる。
　工程Ａ及び／又は工程Ａ’において原料として用いるＬ－システインは、Ｌ－シスチンを実質的に含まないものが好ましく、具体的には、Ｌ－シスチンとＬ－システインとの総モル量に対してＬ－システインが７０モル％以上、より好ましくは８０モル％以上、より好ましくは９０モル％以上、更に好ましくは９５モル％以上、更に好ましくは９８モル％以上、最も好ましくは１００モル％のＬ－システインを用いる。Ｌ－システインとＬ－シスチンとの総モル量に対するＬ－システインの割合が前記範囲内であるという要件は、少なくとも工程Ａ及び／又は工程Ａ’の反応開始時において満足されることが好ましく、工程Ａ及び／又は工程Ａ’の反応開始時から反応後までの期間に満足されることがより好ましい。
　工程Ａ及び／又は工程Ａ’では反応を「大気よりも酸素濃度が低い雰囲気」下において行うことを特徴とする。当該雰囲気としては、酸素濃度１０体積％以下の雰囲気が好ましく、更に好ましくは５体積％以下の雰囲気である。下限は特に限定されるものではなく、酸素濃度が０体積％でもよい。「大気よりも酸素濃度が低い雰囲気」としては不活性ガスの雰囲気が例示できる。不活性ガスとしては、酸素が含まれていなければ特にガスは限定しないが、窒素、希ガス（アルゴン等）、二酸化炭素ガス等の不活性ガスの雰囲気が好ましい。ここで不活性ガスに酸素が含まれていないとは、実質的に酸素が含まれていないことも包含する。気相が前記不活性ガスにより置換された反応容器中で反応を行うことで、上記酸素濃度の雰囲気下での反応を実現することができる。「気相が前記不活性ガスにより置換された反応容器中で反応を行う」は、必要に応じて前記不活性ガスの流通下で反応を行うことも包含する。なお、雰囲気圧は特に限定されないが、通常は常圧付近、典型的には０．０８～０．１２ＭＰａとすることができる。この雰囲気下でγ－グルタミルシステインの生成を行うと、酸化型γ－グルタミルシステインの副生が抑制され、効率的にγ－グルタミルシステインを製造することができる。工程Ａ及び／又は工程Ａ’での基質Ｌ－システインに対するγ－グルタミルシステインの収率は典型的には８０モル％以上、好ましくは８５モル％以上、より好ましくは９０モル％以上、特に好ましくは９５モル％以上である。工程Ａ及び／又は工程Ａ’の反応後の反応系（例えば反応混合液）中には酸化型γ－グルタミルシステインは実質的に含まれず、具体的には、工程Ａ及び／又は工程Ａ’の反応後の反応系中には、γ－グルタミルシステインと酸化型γ－グルタミルシステインとの総モル量に対してγ－グルタミルシステインが８０モル％以上、より好ましくは９０モル％以上、更に好ましくは９５モル％以上、更に好ましくは９７モル％以上、最も好ましくは１００モル％含まれる。
　工程Ａ及び／又は工程Ａ’の反応は適当なｐＨに調整された水等の溶媒を含む反応混合液中で行うことができる。このときの条件としては特に限定されないが、基質濃度（Ｌ－システインとＬ－グルタミン酸との合計濃度）は好ましくは約０．１～９９重量％、より好ましくは１～２０重量％とすることができる。反応開始時の基質中のＬ－システインとＬ－グルタミン酸との量比は、Ｌ－システイン１モルに対してＬ－グルタミン酸を１モル前後とすることができ、例えばＬ－システイン１モルに対してＬ－グルタミン酸を０．５～２モル、好ましくは０．７～１．３モルとすることができる。反応温度は好ましくは１０～６０℃、より好ましくは２０～５０℃とすることができる。反応のｐＨは好ましくは４～１１、より好ましくは６～９とすることができる。反応時間は好ましくは１～１２０時間、より好ましくは１～７２時間とすることができる。
　反応混合液中の各酵素の濃度は適宜調整することができ、例えば各酵素のタンパク質濃度として下限が１μｇ／ｍｌ以上、上限は特に設けないが好ましくは１００ｍｇ／ｍｌ以下の範囲内で適宜調整することができる。工程ＡにＧＳＨ　Ｉが用いられる場合、工程Ａ反応混合液中のＧＳＨ　Ｉ活性は特に限定されないが下限は０．０５Ｕ／ｍｌ以上が好ましく、上限は特に設けないが通常は５０００Ｕ／ｍｌ以下とすることができる。工程ＡにＧＳＨ　Ｆが用いられる場合、工程Ａ反応混合液中のＧＳＨ　Ｆ活性は特に限定されないが下限は０．０５Ｕ／ｍｌ以上が好ましく、上限は特に設けないが通常は５０００Ｕ／ｍｌ以下とすることができる。
　反応混合液中のＡＴＰの濃度は、基質であるＬ－システインの濃度やＡＴＰ再生系の有無に応じて適宜調整することができる。工程Ａにおいて、ＡＴＰはＬ－システインに対し等モル量消費される。工程ＡをＡＴＰ再生反応と共役させて実施する場合は、Ｌ－システインに対するＡＴＰの添加量を大幅に低減することができる。そこで、工程Ａにおける反応混合液中のＡＴＰ濃度の上限は特に限定されないが、Ｌ－システイン濃度に対してモル濃度比で２倍以下が好ましく、１．２倍以下がより好ましい。また、工程Ａにおける反応混合液中のＡＴＰ濃度の下限は特に限定されないが、Ｌ－システイン濃度に対してモル濃度比で０．０００１倍以上が好ましく、０．００１倍以上がより好ましく、０．０１倍以上が更に好ましい。
＜工程Ｂ及び工程Ｂ’＞
　本発明によるグルタチオン（ＧＳＨ）の製造方法は、γ－グルタミルシステインとグリシンとを、大気よりも酸素濃度が低い雰囲気下で、グルタチオン合成酵素（ＧＳＨ　ＩＩ）及び２機能性グルタチオン合成酵素（ＧＳＨ　Ｆ）からなる群から選択される少なくとも１種の酵素のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の存在下での作用により反応させて、グルタチオンを生成する工程Ｂを含むことを特徴とする。工程Ｂは、前記酵素とアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）との存在下でγ－グルタミルシステインとグリシンとを反応させてグルタチオンを生成する工程であり、前記酵素が作用し上記反応を触媒する際にはＡＴＰが消費される。
　本発明によるグルタチオンの製造方法はまた、γ－グルタミルシステインとグリシンとを、大気よりも酸素濃度が低い雰囲気下で反応させて、グルタチオンを生成する工程Ｂ’を含むことを特徴とする。工程Ｂ’は酵素反応により行ってもよいし、酵素を用いず化学的な反応により行ってもよいが、好ましくは酵素反応により行う工程であり、特に好ましくは前記工程Ｂである。酵素反応によれば基質化合物の官能基による保護等が不要であることや、反応の特異性が高いことなどの理由で化学的合成反応よりも有利である。
　酵素を用いない化学的な反応による工程Ｂ’としては、特に限定されないが、例えば、Ｌ－グルタミン酸残基中のα－カルボキシル基及びアミノ基を適当な保護基で保護したγ－グルタミルシステインと、カルボキシル基を適当な保護基で保護したグリシンとを反応させて、γ－グルタミルシステイン１分子中のカルボキシル基に対して１分子のグリシンのアミノ基を脱水縮合させてペプチド結合を形成する工程が挙げられる。該工程では脱水縮合反応後に必要に応じて保護基の１つ以上を脱保護する。カルボキシル基に対する保護基としてはベンジル基等の公知のカルボキシル基用保護基が使用でき、アミノ基に対する保護基としてはｔ－ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、９－フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基等の公知のアミノ基用保護基が使用できる。
　工程ＢにおいてＧＳＨ　ＩＩ及び／又はＧＳＨ　Ｆは、ＧＳＨ　ＩＩ及び／又はＧＳＨ　Ｆ活性を有する生物の細胞を生細胞のまま用いてもよいし、死滅しているが損傷していない前記細胞の形態で用いてもよいし、ＧＳＨ　ＩＩ及び／又はＧＳＨ　Ｆが細胞外に存在する形態、具体的には、前記生物の細胞の破砕物の形態で用いてもよいし、前記細胞から分離され、必要に応じて適宜精製されたタンパク質の形態で用いてもよい。ここでＧＳＨ　ＩＩ及び／又はＧＳＨ　Ｆ活性を有するタンパク質の精製の程度は特に限定されず、粗精製であってもよい。細胞の「破砕物」については既述の通りである。
　工程Ｂで用いる酵素としては、好ましくは、ＧＳＨ　ＩＩ及び／又はＧＳＨ　Ｆ活性を有する生細胞を用いず、より好ましくは、ＧＳＨ　ＩＩ及び／又はＧＳＨ　Ｆ活性を有する生細胞及び損傷していない死滅細胞を用いない。工程Ｂで用いる酵素としては特に、細胞外に存在するＧＳＨ　ＩＩ及び／又はＧＳＨ　Ｆ、具体的には、前記細胞の破砕物の形態のＧＳＨ　ＩＩ及び／又はＧＳＨ　Ｆ、又は、前記細胞から分離されたタンパク質の形態のＧＳＨ　ＩＩ及び／又はＧＳＨ　Ｆを用いることが好ましい。ＧＳＨ　ＩＩ及び／又はＧＳＨ　Ｆを、当該活性を有する生細胞の形態で工程Ｂに用いる場合は反応系中でＡＭＰが分解され易く、ＡＴＰ再生反応を効率的に進めることが難しい（実施例４参照）。一方、ＧＳＨ　ＩＩ及び／又はＧＳＨ　Ｆを、細胞外に存在する形態で工程Ｂに用いる場合はＡＭＰの分解は生じ難く、ＡＴＰ再生反応を効率的に進めることができるため好ましい。なお、生細胞を用いず工程Ｂの反応を行う場合、生細胞による還元作用が存在しないために、酸素を多く含む雰囲気下においては酸化が進み易く酸化型グルタチオンが生じやすいという問題があるが、本発明では工程Ｂの反応を大気よりも酸素濃度が低い雰囲気下で行うことによって、グルタチオンの酸化を抑制し、還元型のグルタチオンを高収率で得ることが可能となる。すなわち、ＧＳＨ　ＩＩ及び／又はＧＳＨ　Ｆを、細胞外に存在する形態、具体的には、当該活性を有する細胞の破砕物の形態、又は、当該細胞から分離されたタンパク質の形態で用いて本発明の工程Ｂを行うことにより、ＡＭＰの分解抑制とグルタチオンの酸化抑制を両立させることが可能となる。
　工程Ｂにおいてγ－グルタミルシステイン、グリシン、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、工程Ｂ’においてγ－グルタミルシステイン、グリシンはそれぞれ塩の形態、フリー体の形態、水和物等の溶媒和物の形態等の各種の形態で反応系中に添加することができる。
　工程Ｂ及び／又は工程Ｂ’において原料として用いるγ－グルタミルシステインは、酸化型γ－グルタミルシステインを実質的に含まないものが好ましく、具体的には、γ－グルタミルシステインと酸化型γ－グルタミルシステインとの総モル量に対してγ－グルタミルシステインが７０モル％以上、より好ましくは８０モル％以上、より好ましくは９０モル％以上、更に好ましくは９５モル％以上、更に好ましくは９８モル％以上、最も好ましくは１００モル％のγ－グルタミルシステインを用いる。
　工程Ｂ及び／又は工程Ｂ’では反応を「大気よりも酸素濃度が低い雰囲気」下において行うことを特徴とする。当該雰囲気としては、酸素濃度１０体積％以下の雰囲気が好ましく、更に好ましくは５体積％以下の雰囲気である。下限は特に限定されるものではなく、酸素濃度が０体積％でもよい。「大気よりも酸素濃度が低い雰囲気」としては不活性ガスの雰囲気が例示できる。不活性ガスとしては、酸素が含まれていなければ特にガスは限定しないが、窒素、希ガス（アルゴン等）、二酸化炭素ガス等の不活性ガスの雰囲気が好ましい。ここで不活性ガスに酸素が含まれていないとは、実質的に酸素が含まれていないことも包含する。気相が前記不活性ガスにより置換された反応容器中で反応を行うことで、上記酸素濃度の雰囲気下での反応を実現することができる。「気相が前記不活性ガスにより置換された反応容器中で反応を行う」は、必要に応じて前記不活性ガスの流通下で反応を行うことも包含する。なお、雰囲気圧は特に限定されないが、通常は常圧付近、典型的には０．０８～０．１２ＭＰａとすることができる。この雰囲気下でグルタチオンの生成を行うと、酸化型グルタチオンの副生が抑制され、効率的にグルタチオンを製造することができる。工程Ｂ及び／又は工程Ｂ’での基質γ－グルタミルシステインに対するグルタチオンの収率は典型的には８０モル％以上、好ましくは８５モル％以上、より好ましくは９０モル％以上、特に好ましくは９５モル％以上である。工程Ｂ及び／又は工程Ｂ’の反応後の反応系（例えば反応混合液）中には酸化型グルタチオンは実質的に含まれず、具体的には、工程Ｂ及び／又は工程Ｂ’の反応後の反応系中には、グルタチオンと酸化型グルタチオンとの総モル量に対してグルタチオンが８０モル％以上、より好ましくは９０モル％以上、更に好ましくは９５モル％以上、更に好ましくは９７モル％以上、最も好ましくは１００モル％含まれる。
　工程Ｂ及び／又は工程Ｂ’での反応は適当なｐＨに調整された水等の溶媒を含む反応混合液中で行うことができる。このときの条件としては特に限定されないが、基質濃度（γ－グルタミルシステインとグリシンとの合計濃度）は好ましくは約０．１～９９重量％、より好ましくは１～２０重量％とすることができる。反応開始時の基質中のγ－グルタミルシステインとグリシンとの量比は、γ－グルタミルシステイン１モルに対してグリシンを１モル前後とすることができ、例えばγ－グルタミルシステイン１モルに対してグリシンを０．５～２モル、好ましくは０．７～１．３モルとすることができる。反応温度は好ましくは１０～６０℃、より好ましくは２０～５０℃とすることができる。反応のｐＨは好ましくは４～１１、より好ましくは６～９とすることができる。反応時間は好ましくは１～１２０時間、より好ましくは１～７２時間とすることができる。
　工程Ｂ及び／又は工程Ｂ’で原料となるγ－グルタミルシステインは上記工程Ａ及び／又は工程Ａ’により得ることができる。この場合、工程Ａ及び／又は工程Ａ’の出発原料であるＬ－システインから、酸化型γ－グルタミルシステイン及び酸化型グルタチオンの副生を抑制しながらグルタチオンを製造することが可能であり、基質Ｌ－システインに対するグルタチオンの収率は典型的には７５モル％以上、好ましくは８０モル％以上、より好ましくは８５モル％以上、特に好ましくは９０モル％以上とすることができる。
　工程Ｂにおいて工程Ａで得られたγ－グルタミルシステインを原料とする場合、工程Ａの反応と工程Ｂの反応を順次行うことができる。この場合、工程Ａ終了後の反応混合液からγ－グルタミルシステインを分離し工程Ｂに用いてもよいし、工程Ａを、ＧＳＨ　ＩＩ及び／又はＧＳＨ　Ｆとグリシンの各要素のうち少なくとも１つが不足し工程Ｂが進行しない条件で行い、次いで工程Ａ終了後の反応混合液からγ－グルタミルシステインを分離することなく前記不足していた要素を反応混合液に追加して工程Ｂを行ってもよい。
　また工程Ａの反応と工程Ｂの反応とは順次行う必要はなく同時に行ってもよい。すなわち、Ｌ－システインと、Ｌ－グルタミン酸と、グリシンとを含む原料混合物を、工程Ａに用いる上記酵素と工程Ｂに用いる上記酵素とＡＴＰとの存在下で反応させてもよい。この実施形態もまた、工程Ｂに原料として用いられる酸化型γ－グルタミルシステインが工程Ａにより生成されたものである本発明の実施形態の１つである。ただし、ＧＳＨ　Ｉはグルタチオンによりフィードバック阻害を受けることが知られており、工程Ａにおいて酵素としてＧＳＨ　Ｉを用いる場合には、工程Ａの反応と工程Ｂの反応とは順次行うことが好ましい。工程Ａ及びＢにおいて酵素としてＧＳＨ　Ｆを用いる場合には、ＧＳＨ　Ｆのみの作用により工程ＡとＢを同時に行うことができる。
　同様に、工程Ｂ’で原料となるγ－グルタミルシステインは上記工程Ａ’により得ることができる。工程Ａ’終了後の反応混合物からγ－グルタミルシステインを分離し、工程Ｂ’に用いてもよいし、γ－グルタミルシステインを分離することなく、工程Ａ’終了後の反応混合物にグリシンを追加し適宜反応条件を調整して工程Ｂ’を行ってもよい。また、工程Ａ’の反応と工程Ｂ’の反応とは順次行う必要はなく同時に行ってもよい。すなわち、Ｌ－システインと、Ｌ－グルタミン酸と、グリシンとを含む原料混合物を反応させてもよい。この実施形態もまた、工程Ｂ’に原料として用いられるγ－グルタミルシステインが工程Ａ’により生成されたものである本発明の実施形態の１つである。
　反応混合液中の各酵素の濃度は適宜調整することができ、例えば各酵素のタンパク質濃度として下限が１μｇ／ｍｌ以上、上限は特に設けないが好ましくは１００ｍｇ／ｍｌ以下の範囲内で適宜調整することができる。工程ＢにＧＳＨ　ＩＩが用いられる場合、工程Ｂの反応混合液中のＧＳＨ　ＩＩ活性は特に限定されないが下限は０．０５Ｕ／ｍｌ以上が好ましく、上限は特に設けないが通常は５０００Ｕ／ｍｌ以下とすることができる。工程ＢにＧＳＨ　Ｆが用いられる場合、工程Ｂ反応混合液中のＧＳＨ　Ｆ活性は特に限定されないが下限は０．０５Ｕ／ｍｌ以上が好ましく、上限は特に設けないが通常は５０００Ｕ／ｍｌ以下とすることができる。
　反応混合液中のＡＴＰの濃度は、基質である、γ－グルタミルシステインの濃度やＡＴＰ再生系の有無に応じて適宜調整することができる。工程Ｂにおいて、ＡＴＰは、γ－グルタミルシステインに対し等モル量消費される。工程ＢをＡＴＰ再生反応と共役させて実施する場合は、γ－グルタミルシステインに対するＡＴＰの添加量を大幅に低減することができる。そこで、工程Ｂにおける反応混合液中のＡＴＰ濃度の上限は特に限定されないが、γ－グルタミルシステイン濃度に対してモル濃度比で２倍以下が好ましく、１．２倍以下がより好ましい。また、工程Ｂにおける反応混合液中のＡＴＰ濃度の下限は特に限定されないが、γ－グルタミルシステイン濃度に対してモル濃度比で０．０００１倍以上が好ましく、０．００１倍以上がより好ましく、０．０１倍以上が更に好ましい。
＜ＡＴＰ再生反応＞
　工程Ａ及びＢはいずれもＡＴＰを消費しＡＤＰを生成する工程である。ＡＴＰは比較的高価な原料であるため、工程Ａ及び／又はＢを、該工程で生じたＡＤＰからＡＴＰを再生するＡＴＰ再生反応と共役させて行うことが好ましい。
　ＡＴＰ再生反応としては、リン酸基供給源とホスホトランスフェラーゼとを用いてＡＤＰをＡＴＰへと再生する反応が挙げられる。
　ＡＴＰ再生反応の一例として、リン酸基供給源として縮合リン酸（ポリリン酸）を用い、ホスホトランスフェラーゼとして、ポリリン酸依存的ＡＭＰトランスフェラーゼ（ＰＡＰ）とアデニル酸キナーゼ（ＡＤＫ）との組み合わせを用いるＡＴＰ再生反応のスキームを以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　スキームにおいて、ＡＭＰはアデノシン一リン酸を示し、ＰＡＰはポリリン酸依存的ＡＭＰトランスフェラーゼを示し、ＡＤＫはアデニル酸キナーゼを示し、ＰｏｌｙＰｎはリン原子がｎ個の縮合リン酸（本明細書では「ポリリン酸」という）を示し、ＰｏｌｙＰｎ-1はリン原子がｎ－１個の縮合リン酸（ポリリン酸）を示し、「反応原料」は工程Ａ又はＢでの反応原料を示し、「生成物」は工程Ａ又はＢでの生成物を示す。
　すなわち、工程Ａ及び／又はＢを縮合リン酸（ポリリン酸）とＰＡＰとＡＤＫとの存在下で行うことにより、ＡＴＰが消費されて生じたＡＤＰはＡＤＫの作用によりＡＴＰとＡＭＰとに変換され、ＡＤＫの作用により生じたＡＭＰはＰＡＰの作用によりＡＤＰに変換される。このＡＴＰ再生反応は工程Ａ及び／又はＢの反応と共役することができる。
　ＡＤＫ及びＰＡＰとしては、各酵素の活性を有する生物の細胞を生細胞のまま用いてもよいし、死滅しているが損傷していない前記細胞の形態で用いてもよいし、ＡＤＫ及び／又はＰＡＰが細胞外に存在する形態、具体的には、前記生物の細胞の破砕物の形態で用いてもよいし、前記細胞から分離され、必要に応じて適宜精製されたタンパク質の形態で用いてもよい。ここでＡＤＫ及び／又はＰＡＰ活性を有するタンパク質の精製の程度は特に限定されず、粗精製であってもよい。細胞の「破砕物」については既述の通りである。
　ＡＴＰ再生反応で用いる酵素としては、好ましくは、ＡＤＫ及び／又はＰＡＰ活性を有する生細胞を用いず、より好ましくは、ＡＤＫ及び／又はＰＡＰ活性を有する生細胞及び損傷していない死滅細胞を用いない。工程Ｂで用いる酵素としては特に、細胞外に存在するＡＤＫ及び／又はＰＡＰ、具体的には、前記細胞の破砕物の形態のＡＤＫ及び／又はＰＡＰ、又は、前記細胞から分離されたタンパク質の形態のＡＤＫ及び／又はＰＡＰを用いることが好ましい。ＡＤＫ及び／又はＰＡＰを、当該活性を有する生細胞の形態でＡＴＰ再生反応に用いる場合はＡＭＰが分解され易く、ＡＴＰ再生反応を効率的に進めることが難しい（実施例４参照）。一方、細胞外に存在する形態でＡＴＰ再生反応に用いる場合はＡＭＰの分解は生じ難く、ＡＴＰ再生反応を効率的に進めることができるため好ましい。なお、生細胞を用いず工程Ａ及び／又は工程Ｂを行う場合、生細胞による還元作用が存在しないために、酸素を多く含む雰囲気下においては酸化が進み易く酸化型γ－グルタミルシステイン及び／又は酸化型グルタチオンが生じやすいという問題があるが、本発明では工程Ａ及び／又は工程Ｂの反応を大気よりも酸素濃度が低い雰囲気下で行うことによって、γ－グルタミルシステイン及び／又はグルタチオンの酸化を抑制し、還元型のγ－グルタミルシステイン及び／又はグルタチオンを高収率で得ることが可能となる。すなわち、ＡＤＫ及び／又はＰＡＰを、細胞外に存在する形態、具体的には、当該活性を有する細胞の破砕物の形態、又は、当該細胞から分離されたタンパク質の形態で用いて本発明の工程Ａ及び／又は工程Ｂを行うことにより、ＡＭＰの分解抑制とγ－グルタミルシステイン及び／又はグルタチオンの酸化抑制を両立させることが可能となる。
　ＡＴＰ再生反応に用いる各酵素の反応混合液中での濃度は適宜調整することができ、例えば各酵素のタンパク質濃度として下限が１μｇ／ｍｌ以上、上限は特に設けないが好ましくは１００ｍｇ／ｍｌ以下の範囲内で適宜調整することができる。工程Ａ又はＢにＡＴＰ再生反応を共役させる場合、反応混合液中のＡＤＫ活性は特に限定されないが下限は２Ｕ／ｍｌ以上が好ましく、上限は特に設けないが通常は２０００００Ｕ／ｍｌ以下とすることができ、反応混合液中のＰＡＰ活性は特に限定されないが下限は０．５Ｕ／ｍｌ以上が好ましく、上限は特に設けないが通常は５００００Ｕ／ｍｌ以下とすることができる。
　縮合リン酸（ポリリン酸）の添加量は反応基質の量に応じて適宜調節すればよい。縮合リン酸（ポリリン酸）はナトリウム塩、カリウム塩等の塩の形態、フリー体の形態、水和物等の溶媒和物の形態等の各種の形態で添加することができる。縮合リン酸（ポリリン酸）の重合度（１分子あたりのリン原子数）は特に限定されない。なお、実施例及び比較例で使用したメタリン酸Ｎａは種々の重合度の縮合リン酸ナトリウム塩の混合物であった。
＜実験１＞
大腸菌Ｋ１２株由来γ－グルタミルシステイン合成酵素（ＧＳＨ　Ｉ）の調製
　大腸菌Ｋ１２株に由来するＧＳＨ　Ｉ遺伝子（配列番号１）のＮ末端部分の塩基配列に制限酵素ＳａｃＩの切断部位及びＳＤ配列を結合させた配列をもつＤＮＡプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ－１：配列番号２）と、Ｃ末端部分の塩基配列に制限酵素ＫｐｎＩ切断部位を結合させた配列をもつＤＮＡプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ－２：配列番号３）を調製した。このＤＮＡプライマーを用いて、この配列の間のＤＮＡをＰＣＲにより増幅することでＧＳＨ　Ｉ遺伝子の全長を含むＤＮＡ断片を取得した。このときＰＣＲ増幅に用いた鋳型は大腸菌Ｋ１２株のゲノムＤＮＡである。得られたＤＮＡ断片の塩基配列を解析し、ＧＳＨ　Ｉ遺伝子の全長（配列番号１）が含まれていることを確認した。得られたＤＮＡ断片をプラスミドｐＵＣ１８（タカラバイオ社製、ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｌ０９１３６）のｌａｃプロモーターの下流のＳａｃＩ認識部位とＫｐｎＩ認識部位の間に挿入し、組換えベクターｐＵＣＧＳＨＩを構築した。この組換えベクターｐＵＣＧＳＨＩを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＵＣＧＳＨＩ）を得た。得られた形質転換体を、２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、ＮａＣｌ０．５％、ｐＨ７．０）５０ｍｌに接種し、３７℃で２４時間振とう培養した。酵素活性を測定すると、ＧＳＨ　Ｉ活性は５Ｕ／ｍｌ、宿主細胞として用いたエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）に由来するＡＤＫ活性は９０Ｕ／ｍｌであった。続いて、遠心分離により菌体を集め、２．５ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁、超音波破砕し酵素液とした。
＜実験２＞
大腸菌Ｋ１２株由来グルタチオン合成酵素（ＧＳＨ　ＩＩ）の調製
　大腸菌Ｋ１２株に由来するＧＳＨ　ＩＩ遺伝子（配列番号４）のＮ末端部分の塩基配列に制限酵素ＮｄｅＩの切断部位を結合させた配列をもつＤＮＡプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ－３：配列番号５）と、Ｃ末端部分の塩基配列に制限酵素ＥｃｏＲＩ切断部位を結合させた配列をもつＤＮＡプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ－４：配列番号６）を調製した。このＤＮＡプライマーを用いて、この配列の間のＤＮＡをＰＣＲにより増幅することでＧＳＨ　ＩＩ遺伝子の全長を含むＤＮＡ断片を取得した。このときＰＣＲ増幅に用いた鋳型は大腸菌Ｋ１２株のゲノムＤＮＡである。得られたＤＮＡ断片の塩基配列を解析し、ＧＳＨ　ＩＩ遺伝子の全長（配列番号４）が含まれていることを確認した。得られたＤＮＡ断片をプラスミドｐＵＣＮ１８（ＰＣＲ法によりｐＵＣ１８（タカラバイオ社製、ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｌ０９１３６）の１８５番目のＴをＡに改変してＮｄｅＩサイトを破壊し、更に４７１－４７２番目のＧＣをＴＧに改変することにより新たにＮｄｅＩサイトを導入したプラスミド）のｌａｃプロモーターの下流のＮｄｅＩ認識部位とＥｃｏＲＩ認識部位の間に挿入し、組換えベクターｐＮＧＳＨＩＩを構築した。この組換えベクターｐＮＧＳＨＩＩを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＧＳＨＩＩ）を得た。得られた形質転換体を、２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、ＮａＣｌ０．５％、ｐＨ７．０）５０ｍｌに接種し、３７℃で２４時間振とう培養した。酵素活性を測定すると、ＧＳＨ　ＩＩ活性は５Ｕ／ｍｌ、宿主細胞として用いたエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）に由来するＡＤＫ活性は９０Ｕ／ｍｌであった。続いて、遠心分離により菌体を集め、２．５ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁、超音波破砕し酵素液とした。
＜実験３＞
ストレプトコッカス・アガラクチエ由来２機能性グルタチオン合成酵素（ＧＳＨ　Ｆ）の調製
　大腸菌での発現用にコドンを最適化し、Ｎ末端部分の塩基配列に制限酵素ＮｄｅＩの切断部位、Ｃ末端部分の塩基配列に制限酵素ＥｃｏＲＩ切断部位を結合させたストレプトコッカス・アガラクチエ由来のＧＳＨ　Ｆ遺伝子断片（配列番号７）を遺伝子合成法にて取得（ユーロジェンテック社製）した。得られた遺伝子断片をプラスミドｐＵＣＮ１８（ＰＣＲ法によりｐＵＣ１８（タカラバイオ社製、ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｌ０９１３６）の１８５番目のＴをＡに改変してＮｄｅＩサイトを破壊し、更に４７１－４７２番目のＧＣをＴＧに改変することにより新たにＮｄｅＩサイトを導入したプラスミド）のｌａｃプロモーターの下流のＮｄｅＩ認識部位とＥｃｏＲＩ認識部位の間に挿入し、組換えベクターｐＮＧＳＨＦを構築した。この組換えベクターｐＮＧＳＨＦを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＧＳＨＦ）を得た。得られた形質転換体を、２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、ＮａＣｌ０．５％、ｐＨ７．０）５０ｍｌに接種し、３７℃で２４時間振とう培養した。酵素活性を測定すると、ＧＳＨ　Ｆ活性は３Ｕ／ｍｌ、宿主細胞として用いたエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）に由来するＡＤＫ活性は９０Ｕ／ｍｌであった。続いて、遠心分離により菌体を集め、２．５ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁、超音波破砕し酵素液とした。
＜実験４＞
アシネトバクター・ジョンソニ由来ＡＭＰホスホトランスフェラーゼ（ＰＡＰ）の調製
　大腸菌での発現用にコドンを最適化し、Ｎ末端部分の塩基配列に制限酵素ＮｄｅＩの切断部位、Ｃ末端部分の塩基配列に制限酵素ＥｃｏＲＩ切断部位を結合させたアシネトバクター・ジョンソニ由来のＰＡＰ遺伝子断片（配列番号８）を遺伝子合成法にて取得（ユーロジェンテック社製）した。得られた遺伝子断片をプラスミドｐＵＣＮ１８（ＰＣＲ法によりｐＵＣ１８（タカラバイオ社製、ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｌ０９１３６）の１８５番目のＴをＡに改変してＮｄｅＩサイトを破壊し、更に４７１－４７２番目のＧＣをＴＧに改変することにより新たにＮｄｅＩサイトを導入したプラスミド）のｌａｃプロモーターの下流のＮｄｅＩ認識部位とＥｃｏＲＩ認識部位の間に挿入し、組換えベクターｐＮＰＡＰを構築した。この組換えベクターｐＮＰＡＰを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＰＡＰ）を得た。得られた形質転換体を、２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、ＮａＣｌ０．５％、ｐＨ７．０）５０ｍｌに接種し、３７℃で２４時間振とう培養した。酵素活性を測定すると、ＰＡＰ活性は４０Ｕ／ｍｌ、宿主細胞として用いたエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）に由来するＡＤＫ活性は９０Ｕ／ｍｌであった。続いて、遠心分離により菌体を集め、２．５ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁、超音波破砕し酵素液とした。
＜収率の算出＞
　本明細書の実験における各化合物の収率の算出方法は以下の通り。
　反応生成物を高速液体クロマトグラフィーにて分析することにより定量し、下記式により収率を求めた。
収率：各化合物の生成量（ｍｏｌ）／初発のＬ－システイン（ｍｏｌ）×１００
　上記高速液体クロマトグラフィーの条件は以下の通りである。この溶出条件では、グルタチオン（ＧＳＨ）、γ－グルタミルシステイン（γ－ＧＣ）、酸化型γ－ＧＣ、酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）の順で溶出する。
［収率の分析］
カラム：ＯＤＳ－ＨＧ－３（４．６ｍｍφ×１５０ｍｍ、野村化学社製）；
溶離液：リン酸２水素カリウム１２．２ｇ及びヘプタンスルホン酸ナトリウム３．６ｇを蒸留水１．８Ｌで溶解し、該溶液をリン酸でｐＨ２．８に調整し、メタノール１８６ｍｌを追加して溶解した液；
流速：１．０ｍｌ／分；
カラム温度：４０℃；
測定波長：２１０ｎｍ。
＜実施例１　ＡＴＰ当量添加系，窒素雰囲気下での反応＞
　以下に示す実施例１の反応は窒素雰囲気下で実施した。
（γ－グルタミルシステインの生成）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　Ｌ－グルタミン酸Ｎａ１水和物０．３６６８ｇ（２．１７ｍｍｏｌ）、Ｌ－システイン塩酸塩１水和物０．３６３６ｇ（２．０７ｍｍｏｌ）、硫酸マグネシウム７水和物１．０２ｇ、ＡＴＰ１．１９ｇ（２．１６ｍｍｏｌ）、蒸留水１５ｇを混合し、１５重量％水酸化ナトリウム水溶液１．４ｇでｐＨを７．５に調整した。そこへ実験１で調製したγ－グルタミルシステイン合成酵素（ＧＳＨ　Ｉ）酵素液を１ｇ添加し、反応開始した。反応容器に窒素ライン口、排気口を設け、窒素ライン口から窒素を１０ｍｌ／ｍｉｎで流し、反応容器内の気相部の空気を追い出すことで気相部の酸素濃度を限りなく０体積％に維持した状態で反応を行った。反応中の温度は３０℃とした。反応は持続的に進行し、γ－グルタミルシステイン、酸化型グルタミルシステインが生成した。反応６時間後にＬ－システインが消失した。反応６時間後におけるγ－グルタミルシステイン、酸化型グルタミルシステインの収率は、対初発Ｌ－システインでそれぞれ、９７ｍｏｌ％、１ｍｏｌ％であった。
（グルタチオンの生成）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　上記の反応６時間後の反応液に、グリシン０．１９２ｇ（２．５６ｍｍｏｌ）、硫酸マグネシウム７水和物１．０２ｇ、ＡＴＰ１．１９ｇ（２．１６ｍｍｏｌ）を混合し、１５重量％水酸化ナトリウム水溶液１．４ｇでｐＨを７．５に調整した。そこへ実験２で調製した、グルタチオン合成酵素（ＧＳＨ　ＩＩ）酵素液１ｇを添加し、反応を開始した。γ－グルタミルシステイン生成工程と同様に窒素雰囲気下で反応を行った。反応中の温度は３０℃とした。反応は持続的に進行し、反応４時間後にγ－グルタミルシステイン、酸化型グルタミルシステインが消失し、グルタチオン及び酸化型グルタチオンが生成した。反応４時間後における収率は対初発Ｌ－システインでグルタチオン９４ｍｏｌ％、酸化型グルタチオン２ｍｏｌ％であった。
＜実施例２　ＡＴＰ再生系，窒素雰囲気下での反応＞
　以下に示す実施例２の反応は窒素雰囲気下で実施した。
（γ－グルタミルシステインの生成）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
　Ｌ－グルタミン酸Ｎａ１水和物０．３８９ｇ（２．３０ｍｍｏｌ）、Ｌ－システイン塩酸塩１水和物０．３７１４ｇ（２．１１ｍｍｏｌ）、硫酸マグネシウム７水和物０．７０６８ｇ、ＡＴＰ０．０５８８ｇ（０．１１ｍｍｏｌ）、メタリン酸Ｎａ０．８ｇ、蒸留水１４ｇを混合し、１５重量％水酸化ナトリウム水溶液０．８ｇでｐＨを７．５に調整した。そこへ実験１で調製したγ－グルタミルシステイン合成酵素（ＧＳＨ　Ｉ）酵素液を１ｇ、実験４で調製したＰＡＰ酵素液１ｇを添加し、反応開始した。反応容器に窒素ライン口、排気口を設け、窒素ライン口から窒素を１０ｍｌ／ｍｉｎで流し、反応容器内の気相部の空気を追い出すことで気相部の酸素濃度を限りなく０体積％に維持した状態で反応を行った。反応中の温度は３０℃とした。反応は持続的に進行し、γ－グルタミルシステイン、酸化型グルタミルシステインが生成した。反応６時間後にＬ－システインが消失した。反応６時間後におけるγ－グルタミルシステイン、酸化型グルタミルシステインの収率は、対初発Ｌ－システインでそれぞれ、９５ｍｏｌ％、１ｍｏｌ％であった。
（グルタチオンの生成）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　上記の反応６時間後の反応液に、グリシン０．１９ｇ（２．５３ｍｍｏｌ）を混合し、１５重量％水酸化ナトリウム水溶液０．２ｇでｐＨを７．５に調整した。そこへ実験２で調製した、グルタチオン合成酵素（ＧＳＨ　ＩＩ）酵素液１ｇ、実験４で調製したＰＡＰ酵素液１ｇを添加し、反応を開始した。γ－グルタミルシステイン生成工程と同様に窒素雰囲気下で反応を行った。反応中の温度は３０℃とした。反応は持続的に進行し、グルタチオン、酸化型グルタチオンが生成した。反応６時間後にγ－グルタミルシステイン、酸化型グルタミルシステインが消失し。反応６時間後におけるグルタチオン、酸化型グルタチオンの収率は、対初発Ｌ－システインでそれぞれ８２ｍｏｌ％、２ｍｏｌ％であった。
　なお、実験１で調製したＧＳＨ　Ｉ酵素液、実験２で調製したＧＳＨ　ＩＩ酵素液、及び、実験４で調製したＰＡＰ酵素液にはそれぞれ宿主細胞として用いたエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）に由来するＡＤＫ活性が含まれるため、上記の２工程ではＡＤＫ酵素液を別途調製する必要はなかった。
＜実施例３　ＡＴＰ再生系，窒素雰囲気下での反応＞
　以下に示す実施例の反応は窒素雰囲気下で実施した。
（グルタチオンの生成）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　Ｌ－グルタミン酸Ｎａ１水和物０．１８５ｇ（１．０９ｍｍｏｌ）、Ｌ－システイン塩酸塩１水和物０．１７５ｇ（１．００ｍｍｏｌ）、グリシン（１．０９ｍｍｏｌ）、硫酸マグネシウム７水和物０．３５ｇ、ＡＴＰ０．０５５ｇ（０．１０ｍｍｏｌ）、メタリン酸Ｎａ０．４ｇ、蒸留水１６ｇを混合し、１５重量％水酸化ナトリウム水溶液０．４４ｇでｐＨを７．５に調整した。そこへ実験３で調製した２機能性グルタチオン合成酵素（ＧＳＨ　Ｆ）酵素液１ｇ、実験４で調製したＰＡＰ酵素液１ｇを添加し、反応開始した。反応容器に窒素ライン口、排気口を設け、窒素ライン口から窒素を１０ｍｌ／ｍｉｎで流し、反応容器内の気相部の空気を追い出すことで気相部の酸素濃度を限りなく０体積％に維持した状態で反応を行った。反応中の温度は３０℃とした。反応は持続的に進行し、グルタチオン、酸化型グルタチオンが生成した。反応６時間後にＬ－システインが消失した。反応６時間後におけるグルタチオン、酸化型グルタチオンの収率は、対初発Ｌ－システインでそれぞれ、９０ｍｏｌ％、１ｍｏｌ％であった。
　なお、実験３で調製したＧＳＨ　Ｆ酵素液、及び、実験４で調製したＰＡＰ酵素液にはそれぞれ宿主細胞として用いたエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）に由来するＡＤＫ活性が含まれるため、上記工程ではＡＤＫ酵素液を別途調製する必要はなかった。
＜比較例１　ＡＴＰ当量添加系，空気雰囲気下での反応＞
　以下に示す比較例１の反応は空気雰囲気下で実施した。
（γ－グルタミルシステインの生成）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　Ｌ－グルタミン酸Ｎａ１水和物０．３６６８ｇ（２．１７ｍｍｏｌ）、Ｌ－システイン塩酸塩１水和物０．３６３６ｇ（２．０７ｍｍｏｌ）、硫酸マグネシウム７水和物１．０２ｇ、ＡＴＰ１．１９ｇ（２．１６ｍｍｏｌ）、蒸留水１５ｇを混合し、１５重量％水酸化ナトリウム水溶液１．４ｇでｐＨを７．５に調整した。そこへ実験１で調製したγ－グルタミルシステイン合成酵素（ＧＳＨ　Ｉ）酵素液を１ｇ添加し、反応開始した。窒素置換は行わず、反応液が反応容器内の空気と接触した状態で反応を行った。反応中の温度は３０℃とした。反応は持続的に進行し、γ－グルタミルシステイン、酸化型グルタミルシステインが生成した。反応６時間後にＬ－システインが消失した。反応６時間後におけるγ－グルタミルシステイン、酸化型グルタミルシステインの収率は、対初発Ｌ－システインでそれぞれ、７８ｍｏｌ％、１０ｍｏｌ％であった。
（グルタチオンの生成）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　上記の反応６時間後の反応液に、グリシン０．１９２ｇ（２．５６ｍｍｏｌ）、硫酸マグネシウム７水和物１．０２ｇ、ＡＴＰ１．１９ｇ（２．１６ｍｍｏｌ）を混合し、１５重量％水酸化ナトリウム水溶液１．４ｇでｐＨを７．５に調整した。そこへ実験２で調製した、グルタチオン合成酵素（ＧＳＨ　ＩＩ）酵素液１ｇを添加し、反応を開始した。窒素置換は行わず、反応液が反応容器内の空気と接触した状態で反応を行った。反応中の温度は３０℃とした。反応は持続的に進行し、反応４時間後にγ－グルタミルシステイン、酸化型グルタミルシステインが消失し、グルタチオン及び酸化型グルタチオンが生成した。反応４時間後における収率は対初発Ｌ－システインでグルタチオン５８ｍｏｌ％、酸化型グルタチオン２０ｍｏｌ％であった。
＜比較例２　ＡＴＰ再生系，空気雰囲気下での反応＞
　以下に示す比較例２の反応は空気雰囲気下で実施した。
（γ－グルタミルシステインの生成）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　Ｌ－グルタミン酸Ｎａ１水和物０．３８９ｇ（２．３０ｍｍｏｌ）、Ｌ－システイン塩酸塩１水和物０．３７１４ｇ（２．１１ｍｍｏｌ）、硫酸マグネシウム７水和物０．７０６８ｇ、ＡＴＰ０．０５８８ｇ（０．１１ｍｍｏｌ）、メタリン酸Ｎａ０．８ｇ、蒸留水１４ｇを混合し、１５重量％水酸化ナトリウム水溶液０．８ｇでｐＨを７．５に調整した。そこへ実験１で調製したγ－グルタミルシステイン合成酵素（ＧＳＨ　Ｉ）酵素液を１ｇ、実験４で調製したＰＡＰ酵素液１ｇを添加し、反応開始した。窒素置換は行わず、反応液が反応容器内の空気と接触した状態で反応を行った。反応中の温度は３０℃とした。反応は持続的に進行し、γ－グルタミルシステイン、酸化型グルタミルシステインが生成した。反応６時間後にＬ－システインが消失した。反応６時間後におけるγ－グルタミルシステイン、酸化型グルタミルシステインの収率は、対初発Ｌ－システインでそれぞれ、７２ｍｏｌ％、１３ｍｏｌ％であった。
（グルタチオンの生成）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　上記の反応６時間後の反応液に、グリシン０．１９ｇ（２．５３ｍｍｏｌ）を混合し、１５重量％水酸化ナトリウム水溶液０．２ｇでｐＨを７．５に調整した。そこへ実験２で調製した、グルタチオン合成酵素（ＧＳＨ　ＩＩ）酵素液１ｇ、実験４で調製したＰＡＰ酵素液１ｇを添加し、反応を開始した。窒素置換は行わず、反応液が反応容器内の空気と接触した状態で反応を行った。反応中の温度は３０℃とした。反応は持続的に進行し、グルタチオン、酸化型グルタチオンが生成した。反応６時間後にγ－グルタミルシステイン、酸化型グルタミルシステインが消失した。反応６時間後におけるグルタチオン、酸化型グルタチオンの収率は、対初発Ｌ－システインでそれぞれ、５１ｍｏｌ％、２２ｍｏｌ％であった。
　なお、実験１で調製したＧＳＨ　Ｉ酵素液、実験２で調製したＧＳＨ　ＩＩ酵素液、及び、実験４で調製したＰＡＰ酵素液にはそれぞれ宿主細胞として用いたエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）に由来するＡＤＫ活性が含まれるため、上記の２工程ではＡＤＫ酵素液を別途調製する必要はなかった。
＜比較例３　ＡＴＰ再生系，空気雰囲気下での反応＞
　以下に示す比較例の反応は空気雰囲気下で実施した。
（グルタチオンの生成）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　Ｌ－グルタミン酸Ｎａ１水和物０．１８５ｇ（１．０９ｍｍｏｌ）、Ｌ－システイン塩酸塩１水和物０．１７５ｇ（１．００ｍｍｏｌ）、グリシン（１．０９ｍｍｏｌ）、硫酸マグネシウム７水和物０．３５ｇ、ＡＴＰ０．０５５ｇ（０．１０ｍｍｏｌ）、メタリン酸Ｎａ０．４ｇ、蒸留水１６ｇを混合し、１５重量％水酸化ナトリウム水溶液０．４４ｇでｐＨを７．５に調整した。そこへ実験３で調製した２機能性グルタチオン合成酵素（ＧＳＨ　Ｆ）酵素液１ｇ、実験４で調製したＰＡＰ酵素液１ｇを添加し、反応開始した。窒素置換は行わず、反応液が反応容器内の空気と接触した状態で反応を行った。反応中の温度は３０℃とした。反応は持続的に進行し、グルタチオン、酸化型グルタチオンが生成した。反応６時間後にＬ－システインが消失した。反応６時間後におけるグルタチオン、酸化型グルタチオンの収率は、対初発Ｌ－システインでそれぞれ、３６ｍｏｌ％、１４ｍｏｌ％であった。尚、酸化型γ－グルタミルシステインが収率６ｍｏｌ％で生成していた。
　なお、実験３で調製したＧＳＨ　Ｆ酵素液、及び、実験４で調製したＰＡＰ酵素液にはそれぞれ宿主細胞として用いたエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）に由来するＡＤＫ活性が含まれるため、上記工程ではＡＤＫ酵素液を別途調製する必要はなかった。
＜実施例４　未破砕菌体を使用したＡＴＰ再生系，窒素雰囲気下での反応＞
　以下に示す反応は窒素雰囲気下で実施した。
（グルタチオンの生成）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
　Ｌ－グルタミン酸Ｎａ１水和物０．１８５ｇ（１．０９ｍｍｏｌ）、Ｌ－システイン塩酸塩１水和物０．１７５ｇ（１．００ｍｍｏｌ）、グリシン（１．０９ｍｍｏｌ）、硫酸マグネシウム７水和物０．３５ｇ、ＡＴＰ０．０５５ｇ（０．１０ｍｍｏｌ）、メタリン酸Ｎａ０．４ｇ、蒸留水１６ｇを混合し、１５重量％水酸化ナトリウム水溶液０．４４ｇでｐＨを７．５に調整した。そこへＧＳＨ　Ｆを発現する組換大腸菌の未破砕菌体を含有する液１ｇ、ＰＡＰを発現する組換大腸菌の未破砕菌体を含有する液１ｇを添加し、反応開始した。反応容器に窒素ライン口、排気口を設け、窒素ライン口から窒素を１０ｍｌ／ｍｉｎで流し、反応容器内の気相部の空気を追い出すことで気相部の酸素濃度を限りなく０体積％に維持した状態で反応を行った。反応中の温度は３０℃とした。反応１時間後に反応液を分析したところ、グルタチオン及び酸化型グルタチオンの生成が確認できた。変換率は、対初発Ｌ－システインでそれぞれ７．３ｍｏｌ％、０．６ｍｏｌ％であった。その後反応は進行したものの、反応７時間後でほぼ停止した。変換率は、対初発Ｌ－システインでそれぞれ１０．８ｍｏｌ％、１．２ｍｏｌ％であった。ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰいずれもほぼ消失しており、ＡＭＰの分解物であるアデニン、アデノシン、ヒポキサンチンが確認された。
　上記の「ＧＳＨ　Ｆを発現する組換大腸菌の未破砕菌体を含有する液」は、実験３における末尾の「続いて、遠心分離により菌体を集め、２．５ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁、超音波破砕し酵素液とした」という操作の代わりに、「続いて、遠心分離により菌体を集め、２．５ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁して、ＧＳＨ　Ｆを発現する組換大腸菌の未破砕菌体を含有する液とした」という操作を行った以外は実験３と同じ材料及び手順により調製した。
　上記の「ＰＡＰを発現する組換大腸菌の未破砕菌体を含有する液」は、実験４における末尾の「続いて、遠心分離により菌体を集め、２．５ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁、超音波破砕し酵素液とした」という操作の代わりに、「続いて、遠心分離により菌体を集め、２．５ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁して、ＰＡＰを発現する組換大腸菌の未破砕菌体を含有する液とした」という操作を行った以外は実験４と同じ材料及び手順により調製した。
　上記の方法で調製した、ＧＳＨ　Ｆを発現する組換大腸菌の未破砕菌体を含有する液、及び、ＰＡＰを発現する組換大腸菌の未破砕菌体を含有する液にはそれぞれ宿主細胞として用いたエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）に由来するＡＤＫ活性が含まれるため、上記工程ではＡＤＫ酵素液を別途調製する必要はなかった。
配列番号２：プライマー
配列番号３：プライマー
配列番号５：プライマー
配列番号６：プライマー
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (15)

  1. 　Ｌ－システインとＬ－グルタミン酸とを、大気よりも酸素濃度が低い雰囲気下で反応させて、γ－グルタミルシステインを生成する工程Ａ’を含むことを特徴とする、γ－グルタミルシステインの製造方法。
  2. 　前記工程Ａ’が、Ｌ－システインとＬ－グルタミン酸とを、大気よりも酸素濃度が低い雰囲気下で、γ－グルタミルシステイン合成酵素及び２機能性グルタチオン合成酵素からなる群から選択される少なくとも１種の酵素のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の存在下での作用により反応させて、γ－グルタミルシステインを生成する工程Ａである、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記工程Ａが、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）をアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）へと再生するＡＴＰ再生反応と共役させて行われる、請求項２に記載の方法。
  4. 　前記γ－グルタミルシステイン合成酵素がエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）由来である、請求項２又は３に記載の方法。
  5. 　前記２機能性グルタチオン合成酵素がストレプトコッカス・アガラクチエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｇａｌａｃｔｉａｅ）由来である、請求項２又は３に記載の方法。
  6. 　γ－グルタミルシステインとグリシンとを、大気よりも酸素濃度が低い雰囲気下で反応させて、グルタチオンを生成する工程Ｂ’を含むことを特徴とする、グルタチオンの製造方法。
  7. 　前記工程Ｂ’が、γ－グルタミルシステインとグリシンとを、大気よりも酸素濃度が低い雰囲気下で、グルタチオン合成酵素及び２機能性グルタチオン合成酵素からなる群から選択される少なくとも１種の酵素のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の存在下での作用により反応させて、グルタチオンを生成する工程Ｂである、請求項６に記載の方法。
  8. 　前記工程Ｂが、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）をアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）へと再生するＡＴＰ再生反応と共役させて行われる、請求項７に記載の方法。
  9. 　前記グルタチオン合成酵素がエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）由来である、請求項７又は８に記載の方法。
  10. 　前記２機能性グルタチオン合成酵素がストレプトコッカス・アガラクチエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｇａｌａｃｔｉａｅ）由来である、請求項７又は８に記載の方法。
  11. 　Ｌ－システインとＬ－グルタミン酸とを、大気よりも酸素濃度が低い雰囲気下で反応させて、γ－グルタミルシステインを生成する工程Ａ’を更に含み、
    　前記工程Ｂ’に用いられるγ－グルタミルシステインが、前記工程Ａ’により生成されたものである、
    請求項６～１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 　前記工程Ａ’が、Ｌ－システインとＬ－グルタミン酸とを、大気よりも酸素濃度が低い雰囲気下で、γ－グルタミルシステイン合成酵素及び２機能性グルタチオン合成酵素からなる群から選択される少なくとも１種の酵素のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の存在下での作用により反応させて、γ－グルタミルシステインを生成する工程Ａである、
    請求項１１に記載の方法。
  13. 　前記工程Ａが、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）をアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）へと再生するＡＴＰ再生反応と共役させて行われる、請求項１２に記載の方法。
  14. 　前記γ－グルタミルシステイン合成酵素がエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）由来である、請求項１２又は１３に記載の方法。
  15. 　前記２機能性グルタチオン合成酵素がストレプトコッカス・アガラクチエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｇａｌａｃｔｉａｅ）由来である、請求項１２又は１３に記載の方法。
     
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