CN118064389A - 一种双功能谷胱甘肽合成酶及利用其生产谷胱甘肽的方法 - Google Patents

一种双功能谷胱甘肽合成酶及利用其生产谷胱甘肽的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN118064389A
CN118064389A CN202410234350.8A CN202410234350A CN118064389A CN 118064389 A CN118064389 A CN 118064389A CN 202410234350 A CN202410234350 A CN 202410234350A CN 118064389 A CN118064389 A CN 118064389A
Authority
CN
China
Prior art keywords
glutathione
synthetase
host cell
bifunctional
synthesizing
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202410234350.8A
Other languages
English (en)
Inventor
马丽
王昕泽
姜艳军
贺莹
周丽亚
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hebei University of Technology
Original Assignee
Hebei University of Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hebei University of Technology filed Critical Hebei University of Technology
Priority to CN202410234350.8A priority Critical patent/CN118064389A/zh
Publication of CN118064389A publication Critical patent/CN118064389A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/02—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link
    • C07K5/0215—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link containing natural amino acids, forming a peptide bond via their side chain functional group, e.g. epsilon-Lys, gamma-Glu
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y603/00—Ligases forming carbon-nitrogen bonds (6.3)
    • C12Y603/02—Acid—amino-acid ligases (peptide synthases)(6.3.2)
    • C12Y603/02002—Glutamate-cysteine ligase (6.3.2.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y603/00—Ligases forming carbon-nitrogen bonds (6.3)
    • C12Y603/02—Acid—amino-acid ligases (peptide synthases)(6.3.2)
    • C12Y603/02003—Glutathione synthase (6.3.2.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供一种双功能谷胱甘肽合成酶，所述双功能为同时具有γ‑谷氨酰基半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶两种功能，所述双功能谷胱甘肽合成酶的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.1。本发明还提供其在合成谷胱甘肽中的应用。本发明的双功能谷胱甘肽合成酶可以明显提高谷胱甘肽的生产水平，且合成谷胱甘肽的过程中，体系pH向酸性变化。本发明的双功能谷胱甘肽合成酶具有良好的pH稳定性，在pH 6.0和pH 10.0下孵育12小时仍有95％以上的剩余活性。本发明首次将谷胱甘肽合成酶应用于谷胱甘肽的制备中，且取得很好的效果，极大降低了生产成本，具有广阔的应用前景。

Description

一种双功能谷胱甘肽合成酶及利用其生产谷胱甘肽的方法
技术领域
本发明涉及一种双功能谷胱甘肽合成酶及利用其生产谷胱甘肽的方法，具体是利用一种具有γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)和谷胱甘肽合成酶(GS)两种功能的酶作为催化剂来生产谷胱甘肽的方法。
背景技术
谷胱甘肽(Glutathione,简称GSH)的全称是γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酰甘氨酸，是一种由三个氨基酸(谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸)构成的活性三肽，其中含有γ-酰胺键和巯基。作为生物体中含量最多的非蛋白巯基化合物在细胞内发挥多种重要的生理作用，其还原性可以保护脂质、蛋白质、DNA等生物大分子免受氧化损伤：如避免ROS介导的细胞损伤、解除重金属中毒等。谷胱甘肽与哺乳动物白细胞结合能够产生免疫增强效果。其可作为多种疾病检测的生物标志物之一，如：神经退行性疾病、癌症、HIV等。作为一种抗氧化剂，谷胱甘肽也被用作食品添加剂，能防止褐变、保持色泽和风味的作用并延长食品保质期。
谷胱甘肽主要的生产方法有化学合成法和生物法。
最初，从动植物的组织中利用溶剂萃取谷胱甘肽。该方法利用各组分在不同溶剂中的溶解度差异，将谷胱甘肽含量较高的动植物组织和微生物(如酵母、植物种子胚芽等)作为原料，通过萃取、酶处理、分离纯化等操作获得谷胱甘肽。但由于谷胱甘肽含量低且产物纯度差，生产工艺复杂，萃取所用试剂造成污染，导致生产成本高，这种方法已经几乎不再使用。
在1929年解析出了谷胱甘肽的分子结构，化学合成法成为最早实现工业化的谷胱甘肽生产方式。直接利用三种前体氨基酸就可以实现谷胱甘肽的合成，但是合成的谷胱甘肽是L型和D型的消旋体混合物。只有L型的谷胱甘肽才具备生理活性。消旋体的理化性质相同难以将两者分离导致纯度较低，而化学合成过程中的耗时长和污染物较多也限制了化学合成法的工业化发展。
而生物体内及酶法生产的均为L型谷胱甘肽。生物法是目前工业生产谷胱甘肽的主要方法，尤其是微生物发酵法。通过含双功能谷胱甘肽合成酶或谷胱甘肽合成酶系的工程菌株，利用工业培养基经微生物代谢生产谷胱甘肽，后续还需从细胞中提取分离纯化，并除去细胞代谢产物。目前分离纯化步骤主要为：第一步利用乙醇法、热水法等方法从细胞中抽提后，第二步利用树脂进行进一步吸附洗脱进行纯化。而酶法则节省了第一步。多数生物体内合成谷胱甘肽的第一个酶γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)受到还原型谷胱甘肽的反馈抑制，在谷胱甘肽的生产过程中，解决产物的反馈抑制是提高谷胱甘肽产量的关键。
目前对于微生物发酵生产GSH主要有四个方向的研究：培养基的优化(如组分、浓度等)、发酵工艺控制的优化(如温度、pH、溶氧DO等)、高产工程菌的培育(如基因工程、代谢工程等)、前体利用效率提高(如前体氨基酸、其他诱导类氨基酸等)，通过四个方向的研究综合提高谷胱甘肽的产量。Wang等人通过不同载体系统在大肠杆菌中对嗜热链球菌来源的双功能谷胱甘肽合成酶(简称为“GshF”)进行表达，在分批补料发酵中，GSH产量可积累到15.21g/L。
Griffith等人发现，在无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)中有一种具有γ-GCS和GS两种功能的酶，命名为γ-GCS-GS，这个酶的N-端序列与大肠杆菌的γ-GCS有32％相同，43％的相似，其C-端序列与已报道的GS没有任何相似之处，但却与D-丙氨酸-D-丙氨酸连接酶有24％相同，38％的相似，这两个结构域之间存在一段连接区域，该区域对GshF的稳定性和活性有极大影响。来源于无乳链球菌的γ-GCS-GS对GSH的反馈抑制不敏感，且GSH对γ-GCS和GS的活性都没有抑制作用，这与先前报道的生物体内谷胱甘肽合成酶是不同的。Aharonowitz等人随后也报道了一种存在于单核细胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)内的同种酶，并命名为GshF，其N-端序列类似于γ-GCS，其C-端序列与报道的GS没有明显的同源性，而类似于三磷酸腺苷(ATP)结合蛋白。Nakashima等人认为GshF的基因是由γ-GCS和D-Ala，D-Ala连接酶基因横向融合，再慢慢进化而来的。
传统生物法合成谷胱甘肽的存在诸多缺陷，利用谷胱甘肽合成酶系需同时表达两种酶，需调控两种酶的比例，且产物对该反应有反馈抑制，使其产物累积浓度不能达到理想水平(2016年的文献中谷胱甘肽合成酶系固定化产量为11.26g/L)。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种同时具有γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶(γ-GCS)和谷胱甘肽合成酶(GS)两种功能的双功能谷胱甘肽合成酶及利用其生产谷胱甘肽的方法。本发明提供的双功能谷胱甘肽合成酶，包含757个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。编码该蛋白的基因有2271个碱基对，其基因序列如SEQ ID NO.2所示。其对谷胱甘肽的生产在降低副产物的生成、提高生产效率方面具有明显的推动作用。
本发明的第一个目的是提供一种双功能谷胱甘肽合成酶，所述双功能为同时具有γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶两种功能，所述双功能谷胱甘肽合成酶的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.1；
作为优选，所述双功能谷胱甘肽合成酶的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.2。
本发明的第二个目的是提供包含上述核苷酸序列的表达载体或宿主细胞；
作为优选，所述表达载体为原核表达载体；
作为进一步优选，所述原核表达载体为pET-28a；
作为优选，所述宿主细胞为细菌或酵母；
作为进一步优选，所述宿主细胞为大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母中的一种。
所述的双功能谷胱甘肽合成酶的基因可使用常规的基因工程手段获得，比如，以上述菌株染色体DNA为模板通过PCR取得，或根据其序列合成。采用合成方法时，可根据不同的表达系统对密码子的偏好，将编码双功能谷胱甘肽合成酶基因中部分或全部对宿主而言稀有的密码子替换为宿主偏好的密码子。如在大肠杆菌中表达时将其中编码亮氨酸的密码子CTA、编码精氨酸的密码子AGG、CGA替换成大肠杆菌偏好的密码子；也可以将序列中的大肠杆菌稀有密码子AGG,AGA,CGA,CTA,ATA,CCC,CGG,TGT,TGC,GGA,GGG等都替换成大肠杆菌偏好的密码子。
所述的双功能谷胱甘肽合成酶的基因可通过在宿主细胞内独立复制的表达载体引入宿主细胞，也可通过如同源重组等方法整合到受体菌染色体上。通常所用于进行基因表达的宿主菌都可以作为过量表达双功能谷胱甘肽合成酶的受体菌，包括如大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母等。双功能谷胱甘肽合成酶基因的表达可以采用通用的高效诱导型启动子、组成型启动子，如Pl、lac、trc、gap、A0X1、MOX、gpd、gla、amy、T7等启动子，也可采用双功能谷胱甘肽合成酶基因自身的启动子。
本发明的第三个目的是提供上述的双功能谷胱甘肽合成酶、表达载体或宿主细胞在生产谷胱甘肽中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种合成谷胱甘肽的方法，包括以下述(1)-(4)中的任意一种作为催化剂合成谷胱氨肽：
(1)上述的双功能谷胱甘肽合成酶；
(2)利用其他微生物及生物产生并提取的具有上述氨基酸序列的双功能谷胱甘肽合成酶；
(3)上述的表达载体或宿主细胞；
(4)将宿主细胞进行提取，得到的双功能谷胱甘肽合成酶。
作为优选方案，是将合成反应液进行发酵，得到谷胱甘肽，所述合成反应液包括权利要求4中所述的催化剂；
所述合成反应液还包括前体，所述前体包括氨基酸或氨基酸盐；作为优选，所述前体包括L-谷氨酸，L-半胱氨酸和甘氨酸三种氨基酸或对应的氨基酸盐；和/或
所述合成反应液包括三磷酸腺苷或包括能够产生三磷酸腺苷的原料。
作为优选方案，所述合成时的pH值为5-12；作为优选，所述pH值为9；和/或
所述合成时的温度为25-70℃，作为优选，所述温度为35-40℃；
所述合成时的时间为2-10h。
作为优选方案，在以双功能谷胱甘肽合成酶为催化剂时，酶蛋白在合成反应液中的浓度为5-25g/100ml。
作为优选方案，所述能够产生三磷酸腺苷的原料为，在合成反应液中加入多聚磷酸盐激酶和聚磷酸盐。
作为优选方案，在以宿主细胞为催化剂时，宿主细胞在合成反应液中的加入量为4g/100ml。
作为优选方案，在合成前，对宿主细胞进行通透化处理；作为优选，所述通透化处理为对宿主细胞进行冻融或用甲苯进行通透化处理。
过量表达GshF基因的重组菌可采用常规的方法进行培养，如采用补料分批培养方法进行高密度培养，获得大量具有高GshF活性的菌体细胞，作为合成谷胱甘肽的生物催化剂。为了提高底物进入细胞参加谷胱甘肽合成反应的效率，上述含GshF活性的细胞可进行通透化处理，如反复冻融1-3次；或用甲苯等试剂进行通透化处理。也可将表达GshF的重组菌进行细胞裂解后分离，可将分离后的GshF作为生物催化剂或固定化后作为催化剂，合成谷胱甘肽。也可直接使用细胞裂解液进行催化。
加入上述通透化的具有GshF活性的重组菌细胞或分离的GshF生物催化剂，在含有L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸三种前体氨基酸或对应的氨基酸盐的含Mg2+缓冲液中进行谷胱甘肽的合成。同时，在缓冲液中加入ATP或者利用细胞本身或其他微生物代谢葡萄糖产生ATP，也可利用其他方法再生ATP，如利用多聚磷酸盐激酶(PPK)以聚磷酸盐和ADP作为底物催化生成磷酸盐和ATP，由于聚磷酸盐廉价易得，通过这种方式可以实现ATP再生，降低生产成本。
具体地，在以全细胞或分离的GshF合成谷胱甘肽的反应中，反应液为0.01-0.8mol/L磷酸钾缓冲液(pH7.0-8.0)，加入Mg2+5-150mmol/L，三磷酸腺苷(ATP)10-110mmol/L，以及前体氨基酸包括L-谷氨酸5-80mmol/L，L-半胱氨酸5-60mmol/L，甘氨酸5-80mmol/L，在25-70℃反应2-10小时。以菌体细胞为催化剂时，湿菌体加入量为5-25g/100ml。也可不加ATP，通过细胞自身的代谢活性将蔗糖降解并产生ATP，或与PPK级联添加Poly6(10-160mmol/L)用于ATP的再生。亦可与其他细胞(如酿酒酵母)将反应液中加入的葡萄糖降解产生ATP的代谢反应耦合，提供合成GSH反应所需的ATP，葡萄糖加入的量为0.1-1.0mol/L。
本发明的有益效果如下：
1、本发明的双功能谷胱甘肽合成酶可以明显提高谷胱甘肽的生产水平，且合成谷胱甘肽的过程中，体系pH向酸性变化(ATP功能后生成ADP和磷酸，呈现酸性，从而导致体系pH不断下降)。本发明的双功能谷胱甘肽合成酶具有良好的pH稳定性，在pH 6.0和pH 10.0下孵育12小时仍有95％以上的剩余活性，为稳定谷胱甘肽产量和提高生产效率提供了保证。而2012年报道中A.succinogenes、A.pleuropneusmonia、S.thermohpilus这三种来源的GshF在pH 8.0和pH 10.0没有催化活性且产量最高为36.8mM即约11.3g/L；2018年的报道中无乳链球菌来源的GshF在pH 10.0条件下没有活性，pH为6.0时活性仅有37％且突变后活性为2.2U/mg。
2、本发明首次将氨基酸序列为SEQ ID NO.1的谷胱甘肽合成酶应用于谷胱甘肽的制备中，且取得很好的效果，其产率最高可达90.05％，产量最高可达到30.66g/L，极大降低了生产成本，具有广阔的应用前景。
3、生产时，副产物生成主要来源于产物氧化，高pH条件下容易发生氧化情况，表现为高pH反应速率快但产物产率较低。由于产物谷胱甘肽在酸性条件下容易保存，倾向于酸性和中性的反应条件有助于降低副产物的生成。本发明中的酶可以在中性条件下催化，因而可以降低副产物的生成。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为不同来源GshF进化关系分析。
图2为重组质粒pET28a-GshF的构建。
图3为GshF的PCR产物电泳图。
图4为GshF的三维结构图。
图5为GshF蛋白溶液的液相色谱图。
图6为GshF在不同温度下的活力。
图7为GshF在不同pH下的活力。
图8为GshF在pH 6.0和pH 10.0条件下孵育12h的稳定性。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均购自常规生化试剂公司。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
本发明涉及实验材料和操作方法简要说明:
1、酶以及主要试剂
pET28a载体：来自Novagen公司，产品目录编号：69864-3。
大肠杆菌BL21(DE3)：来自北京全式金生物技术有限公司，货号：CD601-02。
LB液体培养基：每升10g胰蛋白胨(Tryptone)，5g酵母提取物(Yeast extract)，5gNaCl，使用1ml浓度为1mol/L的NaOH调pH至7.4，用去离子水定容至1L。高压下蒸汽灭菌20min。
TB培养基：每升12g胰蛋白胨(Tryptone)，24g酵母提取物(Yeast extract)，87％甘油4mL，磷酸盐缓冲溶液(pH 6.5)100mL，用去离子水定容至1L。高压下蒸汽灭菌20min。
2、分子生物学操作
PCR反应条件，大肠杆菌和酿酒酵母感受态制作及转化方法参考《分子克隆实验指南》。基因组DNA的提取、质粒抽提、DNA的纯化、酶切以及连接均按产品说明书操作。
实施例1
基于数据库基因序列挖掘，在NCBI中以稳定性和活性良好的氨基酸序列：血链球菌来源的序列为模板在数据库中进行Blast，得到5000条序列。利用CD-HIT工具进行蛋白质聚类去除冗余序列保留代表性序列。将候选序列中氨基酸序列相似度大于80％的序列仅保留一条，除去文献和专利中已经报道过的序列，对候选序列构建进化树(共127条序列)，分析进化关系。根据进化亲缘关系，选取不同亲缘关系来源的菌株对其结构进行建模并进行分子对接，根据与底物的结合能大小和可溶性高低，预测候选序列活性高低并挑选候选序列，最终挑选得到的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，通过密码子翻译及优化得到核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
图1为不同来源GshF进化关系分析。
本发明的双功能谷胱甘肽合成酶(简称为“GshF”)的氨基酸序列(序列表中SEQ IDNO.1)为：
本发明中的酶存在两个功能域：γ-GCS(1-440位氨基酸)和γ-GS(522-752位氨基酸)，前者执行催化谷氨酸和半胱氨酸结合生产γ-GC，后者执行催化γ-GC和甘氨酸生成GSH。
在氨基酸序列的基础上，进行密码子翻译和优化，得到的本发明的双功能谷胱甘肽合成酶的核苷酸序列(序列表中SEQ ID NO.2)为：
密码子适应指数CAI，指异源mRNA序列中密码子和宿主细胞最佳密码子使用频率的相符程度，此数值越接近1，理论上，外源mRNA在宿主细胞中的蛋白表达越高。因此密码子优化最基本的原则就是用宿主细胞中使用频率高的同义密码子去替换外源mRNA序列中的密码子，保证外源mRNA序列中的密码子和宿主细胞的密码子使用偏向性更加契合，避免出现稀有密码子。进行密码子优化时还需要考虑GC含量、密码子平衡。提出该点的目的为无论密码子进行怎样的优化，只要能够表达本发明的氨基酸序列均为本发明保护范围。
实施例2重组大肠杆菌BL21(pET28a-GshF)的制备
1、重组表达载体的构建
将实施例1中SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列插入至pET28a载体的HindIII和BamHI酶切位点之间，得到重组表达载体pET28a-GshF，测序验证正确。GshF基因序列由上海生工合成并接入载体pET28a中。
图2为重组质粒pET28a-GshF的构建。
图3为GshF的PCR产物电泳图。
图4为GshF的三维结构图。
2、重组菌的制备。将步骤1中得到的重组表达载体pET28a-GshF转化大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组大肠杆菌BL21(pET28a-GshF)(简称“重组菌”)。
实施例3利用重组大肠杆菌BL21(pET28a-GshF)表达GshF酶活力及酶学性质测定
培养实施例2得到的重组菌。
1、将重组菌接种于10mL LB液体培养基中，所述培养基中含有终浓度50μg/mL卡那霉素，37℃、180rpm振荡培养16h，获得种子液。再将种子液接种到50mL的TB培养基中(接种量1％)，所述培养基中含有终浓度50μg/mL卡那霉素，37℃、180rpm振荡培养至菌液OD6000.6-0.8，加入终浓度0.5μM的IPTG，继续20℃、180rpm振荡培养20-24h，5000rpm离心15min收集菌体。将所述重组菌菌体采用50mM 50mL的PBS缓冲液洗涤重悬2次，重悬后利用匀浆机破碎，12000rpm离心15min，收集上清即为粗酶液。
2、将步骤1得到的蛋白溶液命名为GshF蛋白溶液。Bradford法测蛋白质浓度，蛋白浓度为5mg/mL。
3、配制酶活检测反应体系：反应缓冲溶液浓度100mM Tris-HCl(pH 8.0)，半胱氨酸、谷氨酸和甘氨酸底物终浓度均为50mM，辅酶ATP终浓度为100mM，Mg2+终浓度为100mM，上述底物溶液950μL，待测蛋白溶液50μL(蛋白含量约为0.1mg)。37℃反应20min。95℃终止反应2min，离心1min，将反应液用纯水稀释10倍，取60μL进样分析。214nm处测定反应峰面积的变化。
4、检测方法:
色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C184.6×250mm 5μm；
流动相A:50mM磷酸氢二钠、50mM磷酸二氢钾、8mM硫酸四丁铵(用磷酸调节pH至4.5)；
流动相B:甲醇；
流动相比例为A:B＝80:20；
波长：214nm；
流速：1.0ml/min。
检测结果见图5。
图5为GshF蛋白溶液的液相色谱图。
4、根据峰面积值变化计算酶活：
酶活计算公式：
其中，C：214nm处峰面积对应的GSH浓度，单位为μmol/L；V1：反应体系的总体积，单位为L；t：反应时间，单位为min；V2：反应中加入的酶体积，单位为μL。
比酶活计算公式：
其中，U：酶活；mg：蛋白含量。
5、GshF的活力及酶学性质
按照步骤3所述配制的酶活检测反应体系进行反应，测定的GshF的活力见表1。
然后固定测试酶活时的pH值为8.0，检测在不同温度下(温度分别为30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃)反应所得到的产物的酶活，结果见图6和表1。
图6为GshF在不同温度下的活力。
随后固定测试酶活时的温度为50℃，检测在不同pH值下(pH值分别为6、7、8、9、10、11)反应所得到的产物的酶活，结果见图7和表1。
图7为GshF在不同pH下的活力。
如图7所示，在pH 6.0条件下反应时该酶活力下降为22.23(为最适条件下的60％)，在pH为11.0时该酶活力下降为22.23U/mg(为最适条件下的70％)的活性，该酶具有较广的pH适用范围。
表1GshF的活力及酶学性质
活力U/mg 最适温度℃ 最适pH
GshF 37.05 50 9.0
6、GshF的稳定性
(1)为了评价GshF的热稳定性，将所得到的GshF以相同酶量(约3mg即100U)分别置于一定温度中(35℃和50℃)，在pH为9.0下，孵育1个小时，后取出GshF测定其剩余活力，具体数据如表2所示。其结果表明，GshF在35℃下稳定性良好在孵育1小时后活力为36.69U/mg(为初始活力的99.02％)。在50℃孵育1小时后活力为18.58U/mg(为初始活力的50.14％)。即，虽然GshF的最适温度为50℃，但是在50℃时的热稳定性不如35℃。生产时以35℃为宜。
表2GshF的1h的热稳定性
35℃剩余活力(％) 50℃剩余活力(％)
GshF 99.02％ 50.14％
(2)为了评价GshF的pH稳定性，将所得到的GshF以相同酶量(约3mg即100U)分别置于一定pH(6.0、10.0)中，在温度为4℃下，孵育12个小时，后取出GshF测定其剩余活力，具体数据如表3所示。其结果表明，GshF在pH6.0和pH10.0都具有良好的稳定性，孵育12小时后，剩余活力分别为35.35U/mg(为初始活力的95.41％)和35.61U/mg(为初始活力的96.11％)。
图8为GshF在pH 6.0和pH 10.0条件下孵育12h的稳定性。
表3GshF的孵育12h的pH稳定性
pH6.0剩余活力(％) pH10.0剩余活力(％)
GshF 95.41％ 96.11％
实施例4利用重组大肠杆菌BL21(pET28a-GshF)全细胞合成谷胱甘肽
1、按实施例3的方法培养大肠杆菌BL21(pET28a-GshF)，分离和洗涤细胞。
2、对步骤1的细胞冻融1次进行通透处理。加入2g湿细胞后构成50mL体系组成如下的反应液，反应液配方为：L-谷氨酸钠60mmol/L、L-半胱氨酸盐酸盐50mmol/L、甘氨酸60mmol/L、MgSO4·7H2O 120mmol/L、ATP 110mmol/L、Tris-HCl缓冲液0.1mol/L(pH8.0)，于37℃反应2小时，从细胞中抽提产物(利用50％乙醇、pH1.0、40℃条件下提取40min两次)，得到谷胱甘肽。因生物体内及酶法生产的均为L型谷胱甘肽，故本发明获得的也为L型谷胱甘肽。按照实施例3中所述的方法利用液相色谱对产物进行分析，得到的谷胱甘肽产率为78.10％，产量为12g/L。
谷胱甘肽产率的计算方法为：产率＝反应液中谷胱甘肽浓度(g/L)÷底物投料摩尔浓度×谷胱甘肽分子量。
3、对步骤1的细胞冻融1次进行通透处理。加入2g湿细胞后构成50mL体系组成如下的反应液，反应液配方为：L-谷氨酸钠60mmol/L、L-半胱氨酸盐酸盐50mmol/L、甘氨酸60mmol/L、MgSO4·7H2O 120mmol/L、ATP 10mmol/L、Tris-HCl缓冲液0.1mol/L(pH8.0)、蔗糖0.5mol/L，于40℃反应2小时，从细胞中抽提产物(利用50％乙醇、pH1.0、40℃条件下提取40min两次)，得到谷胱甘肽。按照实施例3中所述的方法利用液相色谱对产物进行分析，得到的谷胱甘肽产率为60.65％，产量为9.3g/L。
本步骤中，利用细胞本身ATP再生系统进行ATP供给，通过添加蔗糖进行糖酵解和三羧酸循环供给ATP。与直接添加ATP成本可能较低，但产率也会差一些。
实施例5利用重组大肠杆菌BL21(pET28a-GshF)表达的GshF合成谷胱甘肽
按实施例3的方法培养大肠杆菌BL21(pET28a-GshF)，分离和洗涤细胞，将所述重组菌菌体采用50mM 50mL的PBS缓冲液洗涤重悬2次，重悬后利用匀浆机破碎，12000rpm离心15min，收集上清即为粗酶液。
实验1、加入粗酶液(6mg蛋白)后构成50mL体系组成如下的反应液：L-谷氨酸钠60mmol/L、L-半胱氨酸盐酸盐50mmol/L、甘氨酸60mmol/L、MgSO4·7H2O 120mmol/L、ATP110mmol/L、Tris-HCl缓冲液0.1mol/L(pH 8.0)，于40℃反应2小时，从细胞中抽提产物(利用50％乙醇、pH1.0、40℃条件下提取40min两次)，得到谷胱甘肽。按照实施例3中所述的方法利用液相色谱对产物进行分析，得到的谷胱甘肽产率为88.35％，产量为13.56g/L。
实验2、加入粗酶液(300mg蛋白)后构成3L体系组成如下的反应液：L-谷氨酸60mmol/L、L-半胱氨酸50mmol/L、甘氨酸60mmol/L、MgSO4·7H2O 120mmol/L、ATP 110mmol/L、Tris-HCl缓冲液0.1mol/L(pH 8.0)，于40℃反应2小时，从细胞中抽提产物(利用50％乙醇、pH1.0、40℃条件下提取40min两次)，得到谷胱甘肽。按照实施例3中所述的方法利用液相色谱对产物进行分析，得到的谷胱甘肽产率为90.05％，产量为13.82g/L。
实验3、加入粗酶液(100mg蛋白)后构成1L体系组成如下的反应液：L-谷氨酸110mmol/L、L-半胱氨酸100mmol/L、甘氨酸110mmol/L、MgSO4·7H2O 230mmol/L、ATP10mmol/L、多聚磷酸盐激酶(PPK)15000U、聚磷酸盐(Poly6)100mmol/L、Tris-HCl缓冲液0.1mol/L(pH 8.0)，于40℃反应2小时，从细胞中抽提产物(利用50％乙醇、pH1.0、40℃条件下提取40min两次)，得到谷胱甘肽。按照实施例3中所述的方法利用液相色谱对产物进行分析，得到的谷胱甘肽产率为88.23％，产量为27.09g/L。其中PPK利用聚磷酸盐为底物可以催化再生ATP供给谷胱甘肽合成。
实验4、加入粗酶液(150mg蛋白)后构成1L体系组成如下的反应液：L-谷氨酸150mmol/L、L-半胱氨酸150mmol/L、甘氨酸150mmol/L、MgSO4·7H2O 280mmol/L、ATP10mmol/L、多聚磷酸盐激酶(PPK)15000U、聚磷酸盐(Poly6)150mmol/L、Tris-HCl缓冲液0.1mol/L(pH 8.0)，于40℃反应2小时，从细胞中抽提产物(利用50％乙醇、pH1.0、40℃条件下提取40min两次)，得到谷胱甘肽。按照实施例3中所述的方法利用液相色谱对产物进行分析，得到的谷胱甘肽产率为83.23％，产量为30.66g/L。
在实际的合成谷胱甘肽的过程中发现，35-40℃的产率差距不大，在2％左右。温度为40℃时产率最高。
实验5、将反应结束后的50mL反应液3000r/min离心或静止后，取一定量005×7阳离子交换树脂，用自来水反复洗涤去除杂质5次，用2mol/L的NaOH溶液浸泡洗涤(流速:1.5倍床层体积/h)，用去离子水洗至中性，再用2mol/L的HCl溶液转型(流速:1.5倍床层体积/h)，再用去离子水洗至中性，最后浸泡于去离子水中备用。pH 3.0上样，0.5mol/L的NH4Cl溶液为洗脱液，流速为2.4mL/min，收集洗脱液，浓缩，乙醇沉淀，真空冷冻干燥(-56℃，16Pa，24h)得到谷胱甘肽固体。通过液相色谱检测，纯化前溶液内含有0.68g谷胱甘肽，最终得到0.54g谷胱甘肽固体，收率为80.01％。
由实施例5中各实验可以看出：
本发明的方法可以应用于各种浓度底物进行生产，体现生产效果。底物中的3种氨基酸为摩尔比1:1:1消耗，但由于半胱氨酸成本高于其他两种氨基酸，所以选择其他两种氨基酸略微过量来保证半胱氨酸的充分转化。ATP与底物为摩尔比2:1消耗，投料略大于2倍底物(半胱氨酸)。镁离子螯合在ATP的磷酸基团间起到中和ATP电负性的作用，但磷酸会与镁离子结合生成沉淀，导致镁离子浓度下降，所以镁离子的投料量比较大。
2、上述实例中，产率基本保持在80-90％，在已报道的文献和资料中处于较高的水平。既可直接使用ATP进行高浓度生产，也可使用不同的ATP再生手段进行生产。从而满足工业生产的需求。
3、纯化过程可以直接省略从细胞中抽提产物，同时反应液较为纯净可以直接与阳离子树脂进行吸附洗脱并纯化。
以上详细描述了本发明的优选实施方式。但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims (10)

1.一种双功能谷胱甘肽合成酶，所述双功能为同时具有γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶两种功能，其特征在于：所述双功能谷胱甘肽合成酶的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.1；
作为优选，所述双功能谷胱甘肽合成酶的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.2。
2.包含权利要求1中所述核苷酸序列的表达载体或宿主细胞；
作为优选，所述表达载体为原核表达载体；
作为进一步优选，所述原核表达载体为pET-28a；
作为优选，所述宿主细胞为细菌或酵母；
作为进一步优选，所述宿主细胞为大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母中的一种。
3.权利要求1所述的双功能谷胱甘肽合成酶、权利要求2所述的表达载体或宿主细胞在生产谷胱甘肽中的应用。
4.一种合成谷胱甘肽的方法，其特征在于：包括以下述(1)-(4)中的任意一种作为催化剂合成谷胱氨肽：
(1)权利要求1所述的双功能谷胱甘肽合成酶；
(2)利用其他微生物及生物产生并提取的具有权利要求1中所述氨基酸序列的双功能谷胱甘肽合成酶；
(3)权利要求2所述的表达载体或宿主细胞；
(4)将宿主细胞进行提取，得到的双功能谷胱甘肽合成酶。
5.根据权利要求4所述的一种合成谷胱甘肽的方法，其特征在于：是将合成反应液进行发酵，得到谷胱甘肽，所述合成反应液包括权利要求4中所述的催化剂；
所述合成反应液还包括前体，所述前体包括氨基酸或氨基酸盐；作为优选，所述前体包括L-谷氨酸，L-半胱氨酸和甘氨酸三种氨基酸或对应的氨基酸盐；和/或
所述合成反应液包括三磷酸腺苷或包括能够产生三磷酸腺苷的原料。
6.根据权利要求4所述的一种合成谷胱甘肽的方法，其特征在于：所述合成时的pH值为5-12；作为优选，所述pH值为9；和/或
所述合成时的温度为25-70℃，作为优选，所述温度为35-40℃；
所述合成时的时间为2-10h。
7.根据权利要求4-6任一项所述的一种合成谷胱甘肽的方法，其特征在于：在以双功能谷胱甘肽合成酶为催化剂时，酶蛋白在合成反应液中的浓度为5-25g/100ml。
8.根据权利要求7所述的一种合成谷胱甘肽的方法，其特征在于：所述能够产生三磷酸腺苷的原料为，在合成反应液中加入多聚磷酸盐激酶和聚磷酸盐。
9.根据权利要求4-6任一项所述的一种合成谷胱甘肽的方法，其特征在于：在以宿主细胞为催化剂时，宿主细胞在合成反应液中的加入量为4g/100ml。
10.根据权利要求9所述的一种合成谷胱甘肽的方法，其特征在于：在合成前，对宿主细胞进行通透化处理；作为优选，所述通透化处理为对宿主细胞进行冻融或用甲苯进行通透化处理。
CN202410234350.8A 2024-03-01 2024-03-01 一种双功能谷胱甘肽合成酶及利用其生产谷胱甘肽的方法 Pending CN118064389A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202410234350.8A CN118064389A (zh) 2024-03-01 2024-03-01 一种双功能谷胱甘肽合成酶及利用其生产谷胱甘肽的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202410234350.8A CN118064389A (zh) 2024-03-01 2024-03-01 一种双功能谷胱甘肽合成酶及利用其生产谷胱甘肽的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN118064389A true CN118064389A (zh) 2024-05-24

Family

ID=91108765

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202410234350.8A Pending CN118064389A (zh) 2024-03-01 2024-03-01 一种双功能谷胱甘肽合成酶及利用其生产谷胱甘肽的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN118064389A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220307061A1 (en) Phosphinothricin dehydrogenase mutant, genetically engineered bacterium and one-pot multi-enzyme synchronous directed evolution method
Luo et al. Cloning and expression of a novel leucine dehydrogenase: Characterization and L-tert-leucine production
CN106566823B (zh) 一种谷氨酸脱羧酶基因的克隆及其应用
CN112359036B (zh) 一种催化活力和反应专一性提高的腈水解酶突变体及应用
US10612054B2 (en) Single-cell factory for efficiently synthesizing α-aminobutyric acid and construction and application thereof
Jia et al. Expression of novel L-leucine dehydrogenase and high-level production of L-tert-leucine catalyzed by engineered Escherichia coli
CN112522228B (zh) 一种来源于氨氧化假诺卡氏单胞菌的r-转氨酶及其合成方法
CN118064389A (zh) 一种双功能谷胱甘肽合成酶及利用其生产谷胱甘肽的方法
CN113174378B (zh) 一种谷氨酸脱氢酶突变体及其编码基因、基因工程菌以及在制备l-2-氨基丁酸中的应用
CN112481320B (zh) 一种催化效率高的制备(-)γ-内酰胺的方法
CN115896081A (zh) 天冬氨酸酶突变体及其应用
CN113088500B (zh) 一种谷氨酸脱氢酶突变体、编码基因及制备l-草铵膦的方法
CN118207172B (zh) 双功能谷胱甘肽合酶突变体及其应用
Ouyang et al. A thermostable leucine dehydrogenase from Bacillus coagulansNL01: Expression, purification and characterization
CN111826405B (zh) 一种生物催化还原丙酮酸产d-乳酸的方法
CN113774078B (zh) 一种重组巴斯德毕赤酵母菌株、其构建方法和应用
CN114196642B (zh) 谷氨酸脱氢酶变体及其在制备l-氨基酸中的应用
CN116004593B (zh) 半理性设计酶定向进化方法及其在腈水解酶分子改造中的应用
CN116478974B (zh) 一种谷氨酸脱羧酶及其基因和应用
CN118272330A (zh) 一种富马酸还原酶突变体及其制备方法和应用
CN115948482A (zh) 一种2，4-二羟基丁酸生物合成途径的构建方法及应用
CN116949086A (zh) 利用马克斯克鲁维酵母重组表达血红蛋白的方法
CN115927217A (zh) γ-谷氨酰甲胺合成酶突变体及其应用
CN115948355A (zh) 一种nadph氧化酶突变体及其应用
CN118374561A (zh) 酶催化制备化合物的方法以及使用该方法制备n-乙酰神经氨酸、组合物、用途和筛选方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination