WO2015199243A1 - 変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質、及びそれを用いた多能性を有する幹細胞の培養方法 - Google Patents
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Abstract
多能性を有する幹細胞の培養中のコロニーに発生する未分化状態を脱した細胞を除去可能な新たなヘマグルチニンの提供及びへマグルチンニンを用いた、多能性を有する幹細胞の新たな培養方法の提供。Ｂ型ボツリヌス菌由来の変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質であって、前記複合体タンパク質は、Ｂ型ボツリヌス菌由来のヘマグルチニンのサブコンポーネントＨＡ２及びＨＡ３を少なくとも含み、糖鎖結合部位を構成するアミノ酸の少なくとも一つが変異した、変異型ヘマグルチニン複合タンパク質に関する。多能性を有する幹細胞の培養方法であって、本開示の変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質の存在下で細胞培養することを含む方法に関する。
Description
本開示は、Ｂ型ボツリヌス菌由来の変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質、多能性を有する幹細胞の培養方法、多能性を有する幹細胞の培養中に発生した又は発生しうる未分化状態を脱した細胞を除去する方法、多能性を有する幹細胞の未分化状態を維持する方法、ｉＰＳ細胞の培養方法、ｉＰＳ細胞の細胞集塊の分割方法、及び、これらの方法に使用するキットに関する。
ヒトｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞を大量培養する際には、一連の増幅培養（継代培養）の繰り返しにより多くの未分化な細胞を調製する。この一連の培養において、未分化状態から逸脱した細胞“未分化逸脱細胞”が偶発的に発生することが知られている。
この未分化逸脱細胞は、未分化細胞とほぼ同等の分裂能力を有し、かつ、未分化細胞から未分化逸脱細胞への転換を誘発することが知られている。すなわち、未分化逸脱細胞が発生すると、その増殖速度は未分化細胞のそれを上回り、未分化細胞の増殖が抑制される。
未分化逸脱細胞の発生は、熟練してない培養操作者による培養で多く観察される。また、コロニーサイズの過大や、コロニー同士の合一が発生の一因であると知られている。よって、低コンフルエントでの継代、播種時の均一性維持により、未分化逸脱細胞の発生頻度をある程度下げることができる。また、近年の開発された培地によっても、未分化逸脱細胞の発生頻度がある程度抑制されている。しかしながら、それでも未分化逸脱細胞は偶発的に発生し、発生した場合には、未分化逸脱細胞を含むコロニーを除去することが未だ必須である。
未分化逸脱細胞を含むコロニーは、未分化状態を維持するため、継代時に顕微鏡下のピペッティング作業により丁寧に除去される。このようなコロニー除去の手技を模した装置、例えば、観察装置とロボットハンドリングによるピペッティングを組み合せた装置も開発されている。
また、特許文献１には、ｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞の未分化を維持しつつ増殖させるために、アクチビン存在下で多能性幹細胞を培養することを開示する。
上述したとおり、ヒトｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞の継代培養では、脱未分化現象を引き起こしやすく、未分化維持が困難で、数回の継代後には多くのｉＰＳ細胞コロニーが脱未分化現象を引き起こし、未分化状態を脱した細胞を含むコロニーとなりうる。よって、丁寧な培養、及び、丁寧なコロニーの選別という煩雑な操作が不可欠となる。幹細胞産業を促進する点からも、煩雑な操作が少なく、熟練者でなくても可能な、多能性幹細胞の未分化維持方法が望まれている。
また、ヒトｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞は、再生医療や創薬研究への実用化の点から、高品質の細胞を安定に大量供給することが望まれている。このため、近年、浮遊培養による培養が試みられているが、細胞塊の分割時に細胞にダメージを与えること等が問題となっている。このため、ヒトｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞を簡便に効率よく大量培養可能な方法が望まれている。
ボツリヌス菌由来のヘマグルチニン（ＨＡ）は、ボツリヌス神経毒素複合体の成分である。近年、このＨＡが、細胞接着分子であるＥ－カドヘリンに特異的に結合し、それによって腸管上皮細胞の細胞間バリアを破壊するという分子機構を有することが発見された。このＨＡが有する分子機構を用いて、多能性（“pluripotency”以下同様）を有する幹細胞の培養中のコロニーに発生する「未分化状態を脱した細胞」を除去することが本発明者らによって試みられている。
本開示は、一態様において、多能性を有する幹細胞の培養中のコロニーに発生する「未分化状態を脱した細胞」を除去可能な新たなヘマグルチニンを提供する。
本開示は、一態様において、へマグルチンニンを用いた、多能性を有する幹細胞の新たな培養方法を提供する。
本開示は、一態様において、Ｂ型ボツリヌス菌由来の変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質であって、前記複合体タンパク質は、Ｂ型ボツリヌス菌由来のヘマグルチニンのサブコンポーネントＨＡ２及びＨＡ３を少なくとも含み、糖鎖結合部位を構成するアミノ酸の少なくとも一つが変異した、変異型ヘマグルチニン複合タンパク質に関する。
本開示は、一態様において、Ｂ型ボツリヌス菌由来の変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質であって、前記複合体タンパク質は、サブコンポーネントＨＡ１、ＨＡ２及びＨＡ３によって形成され、前記サブコンポーネントＨＡ１の野生型のアミノ酸配列の２６４番目のアスパラギンに相当するアミノ酸、前記サブコンポーネントＨＡ１の野生型のアミノ酸配列の２８６番目のアスパラギンに相当するアミノ酸、及び前記サブコンポーネントＨＡ３の野生型のアミノ酸配列の５２８番目のアルギニンに相当するアミノ酸の一方のアミノ酸又は双方のアミノ酸が変異した変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質に関する。
本開示は、一態様において、多能性を有する幹細胞の培養方法であって、本開示の変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質の存在下で細胞培養することを含む方法に関する。
本開示は、一態様において、多能性を有する幹細胞の培養中に発生した又は発生しうる未分化状態を脱した細胞を除去する方法であって、本開示の変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質の存在下で細胞培養することを含む方法に関する。
本開示は、一態様において、ヒト由来のｉＰＳ細胞の培養方法であって、ボツリヌス菌由来のヘマグルチニン存在下で前記ｉＰＳ細胞を浮遊培養することを含む方法に関する。
本開示は、一態様において、ヒト由来のｉＰＳ細胞の細胞集塊の分割方法であって、ボツリヌス菌由来のヘマグルチニン存在下で前記ｉＰＳ細胞を浮遊培養することを含む方法に関する。
本開示によれば、一態様において、多能性を有する幹細胞の培養中のコロニーに発生する「未分化状態を脱した細胞」を除去できるという効果が奏されうる。
本開示によれば、一態様において、多能性を有する幹細胞を、簡便に効率よく大量培養できるという効果が奏されうる。
ボツリヌス菌由来の野生型ヘマグルチニンは、ＨＡ１（３３Ｋ、ＨＡ－３３）、ＨＡ２（１７Ｋ、ＨＡ－１７）及びＨＡ３（７０Ｋ、ＨＡ－７０）の３つのサブコンポーネントから構成される複合体であることが知られている。中でもＢ型ボツリヌス菌由来の野生型ヘマグルチニンは、サブコンポーネントＨＡ１、ＨＡ２及びＨＡ３が２：１：１の割合で１２量体の複合体を形成している。また、Ｂ型ボツリヌス菌由来の野生型ヘマグルチニンは、Ｅ－カドヘリンと結合してＥ－カドヘリンを介した細胞間接着を阻害すること、及びＨＡ２とＨＡ３の複合体であってもＥ－カドヘリン結合活性が得られることが知られている。
本開示は、一態様において、Ｂ型ボツリヌス菌由来のヘマグルチニンのサブコンポーネントＨＡ２及びＨＡ３を少なくとも含み、Ｅ－カドヘリン結合部位を構成するアミノ酸配列を有し、かつ、糖鎖認識部位を構成するアミノ酸の少なくとも一つを変異させたヘマグルチニン（変異型ヘマグルチニン）であれば、多能性を有する幹細胞の培養中のコロニー内に発生した及び／又は発生する未分化状態を脱した細胞（以下、「未分化逸脱細胞」ともいう）の細胞間接着を選択的に阻害することができ、さらには未分化逸脱細胞を選択的に除去できるという知見に基づく。
また、本開示は、一態様において、ボツリヌス菌由来のヘマグルチニン存在下で、多能性を有する幹細胞を浮遊培養すると、ヒトｉＰＳ細胞のようにデリケートな細胞であっても、細胞集塊を容易に効率よく小塊に分割でき、さらには小塊から新たな細胞集塊を形成させることができる、との知見に基づく。
また、本開示は、一態様において、Ａ型ボツリヌス菌由来のヘマグルチニンのサブコンポーネントＨＡ２及びＨＡ３を少なくとも含み、Ｅ－カドヘリン結合部位を構成するアミノ酸配列を有し、かつ、糖鎖認識部位を構成するアミノ酸の少なくとも一つを変異させたヘマグルチニン（Ａ型変異型ヘマグルチニン）は、Ｂ型野生型ヘマグルチニンと比較して、未分化逸脱細胞を効率よく除去できる、との知見に基づく。
［多能性を有する幹細胞］
本開示において、多能性を有する幹細胞は、限定されない一又は複数の実施形態において、ヒト多能性（pluripotent）幹細胞である。本開示において、ヒト多能性幹細胞は、限定されない一又は複数の実施形態において、ヒトｉＰＳ細胞又はヒトＥＳ細胞である。
本開示において、多能性を有する幹細胞は、限定されない一又は複数の実施形態において、ヒト多能性（pluripotent）幹細胞である。本開示において、ヒト多能性幹細胞は、限定されない一又は複数の実施形態において、ヒトｉＰＳ細胞又はヒトＥＳ細胞である。
［未分化状態を脱した細胞（未分化逸脱細胞）］
本開示において未分化状態を脱した細胞（未分化逸脱細胞）とは、限定されない一又は複数の実施形態において、細胞の形態が未分化状態の細胞のそれとは異なり、判別可能である。未分化逸脱細胞となったことは、限定されない一又は複数の実施形態において、未分化マーカーの消失で確認できる。未分化マーカーは、限定されない一又は複数の実施形態において、Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ－４、ＴＲＡ－１－６０である。
本開示において未分化状態を脱した細胞（未分化逸脱細胞）とは、限定されない一又は複数の実施形態において、細胞の形態が未分化状態の細胞のそれとは異なり、判別可能である。未分化逸脱細胞となったことは、限定されない一又は複数の実施形態において、未分化マーカーの消失で確認できる。未分化マーカーは、限定されない一又は複数の実施形態において、Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ－４、ＴＲＡ－１－６０である。
［変異型ヘマグルチニン（ＨＡ）複合体タンパク質］
本開示は、一又は複数の実施形態において、Ｂ型ボツリヌス菌由来の変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質（以下、「本開示の変異型ＨＡ複合体タンパク質」ともいう）に関する。本開示の変異型ＨＡ複合体タンパク質は、Ｂ型ボツリヌス菌由来のヘマグルチニンのサブコンポーネントＨＡ２及びＨＡ３を少なくとも含み、糖鎖結合部位を構成するアミノ酸の少なくとも一つが変異した変異型ヘマグルチニン複合タンパク質である。本開示の変異型ＨＡ複合体タンパク質は、一又は複数の実施形態において、Ｅ－カドヘリン結合部位を構成するアミノ酸配列を有し、かつ、糖鎖結合部位を構成するアミノ酸の少なくとも一つが変異した変異型ヘマグルチニン複合タンパク質である。また、本開示の変異型ＨＡ複合体タンパク質は、一又は複数の実施形態において、Ｅ－カドヘリン結合活性を有し、かつ、糖鎖結合部位を構成するアミノ酸の少なくとも一つが変異した変異型ヘマグルチニン複合タンパク質である。また、本開示の変異型ＨＡ複合体タンパク質は、一又は複数の実施形態において、Ｅ－カドヘリン機能阻害活性を有し、かつ、糖鎖結合部位を構成するアミノ酸の少なくとも一つが変異した変異型ヘマグルチニン複合タンパク質である。
本開示は、一又は複数の実施形態において、Ｂ型ボツリヌス菌由来の変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質（以下、「本開示の変異型ＨＡ複合体タンパク質」ともいう）に関する。本開示の変異型ＨＡ複合体タンパク質は、Ｂ型ボツリヌス菌由来のヘマグルチニンのサブコンポーネントＨＡ２及びＨＡ３を少なくとも含み、糖鎖結合部位を構成するアミノ酸の少なくとも一つが変異した変異型ヘマグルチニン複合タンパク質である。本開示の変異型ＨＡ複合体タンパク質は、一又は複数の実施形態において、Ｅ－カドヘリン結合部位を構成するアミノ酸配列を有し、かつ、糖鎖結合部位を構成するアミノ酸の少なくとも一つが変異した変異型ヘマグルチニン複合タンパク質である。また、本開示の変異型ＨＡ複合体タンパク質は、一又は複数の実施形態において、Ｅ－カドヘリン結合活性を有し、かつ、糖鎖結合部位を構成するアミノ酸の少なくとも一つが変異した変異型ヘマグルチニン複合タンパク質である。また、本開示の変異型ＨＡ複合体タンパク質は、一又は複数の実施形態において、Ｅ－カドヘリン機能阻害活性を有し、かつ、糖鎖結合部位を構成するアミノ酸の少なくとも一つが変異した変異型ヘマグルチニン複合タンパク質である。
本開示の変異型ＨＡ複合体タンパク質は、一又は複数の実施形態において、多能性を有する幹細胞の培養中に、コロニー内に発生した及び／又は発生する未分化逸脱細胞の細胞間接着を阻害することができるという効果を奏しうる。本開示の変異型ＨＡ複合体タンパク質は、好ましくはコロニーから未分化逸脱細胞を除去することができ、また、多能性を有する幹細胞の培養において構成されるコロニーを未分化状態に維持できる（未分化状態が維持された多能性を有する幹細胞で構成されたコロニーを形成し続けることができる）という効果を奏しうる。
本開示の変異型ＨＡ複合体タンパク質は、Ｂ型ボツリヌス菌由来のヘマグルチニンのサブコンポーネントＨＡ２及びＨＡ３を少なくとも含み、一又は複数の実施形態において、サブコンポーネントＨＡ１をさらに含んでいてもよい。本開示の変異型ＨＡ複合体タンパク質は、一又は複数の実施形態において、ＨＡ２及びＨＡ３の２成分で構成される複合体であり、より効率よく細胞間接着を阻害し、未分化逸脱細胞をより効率的に除去できる観点から、ＨＡ１、ＨＡ２及びＨＡ３の３成分で構成される複合体である。
本開示の変異型ＨＡ複合体タンパク質は、糖鎖結合部位を構成するアミノ酸の少なくとも一つが変異している。本開示の変異型ＨＡ複合体タンパク質は、一又は複数の実施形態において、Ｂ型ボツリヌス菌由来の野生型ヘマグルチニンにおける糖鎖結合活性の少なくとも一部又は全部を欠損させた変異型ヘマグルチニン複合タンパク質ともいうことができる。本発明者らは、Ｂ型ボツリヌス菌由来の野生型ヘマグルチニンにおける糖鎖結合部位を構成するアミノ酸として、ＨＡ１のアミノ酸配列（配列番号１）の２８６番目のアスパラギン及びＨＡ３のアミノ酸配列（配列番号３）の５２８番目のアルギニン等を見出している。また、その他のアミノ酸としては、ＨＡ１のアミノ酸配列（配列番号１）の２６４番目のアスパラギン等が知られている（例えば、KwangKook Lee et al, Biochem Biophys Res Commun 2014 Apr 4, Vol 446, Issue 2, pp.568-573等）。本開示の変異型ＨＡ複合体タンパク質は、一又は複数の実施形態において、これらのアミノ酸又はこれらのアミノ酸に相当するアミノ酸が変異されており、コロニーから効率よく未分化逸脱細胞を除去できる点からは、ＨＡ３のアミノ酸配列（配列番号３）の５２８番目のアルギニン又はそれに相当するアミノ酸が変異されていることが好ましく、より好ましくはＨＡ３のアミノ酸配列（配列番号３）の５２８番目のアルギニン又はそれに相当するアミノ酸と、ＨＡ１のアミノ酸配列（配列番号１）の２８６番目のアスパラギン又はそれに相当するアミノ酸とが変異されている。本開示において「これらのアミノ酸に相当するアミノ酸」とは、上記した糖鎖結合部位を構成する野生型のアミノ酸と立体構造上同等な位置のアミノ酸をいう。本開示におけるアミノ酸の変異は、一又は複数の実施形態において、糖鎖を認識しないアミノ酸への置換を含み、好ましくはアラニンへの置換を含む。
本開示の変異型ＨＡ複合体タンパク質は、Ｂ型ボツリヌス菌由来の野生型ヘマグルチニンにおけるＥ－カドヘリン結合部位を構成するアミノ酸配列を有している。すなわち、本開示の変異型ＨＡ複合体タンパク質は、一又は複数の実施形態において、Ｅ－カドヘリン結合活性を有している。したがって、本開示は、その他の態様において、Ｂ型ボツリヌス菌由来のヘマグルチニンのサブコンポーネントＨＡ２及びＨＡ３を少なくとも含み、Ｅ－カドヘリン結合活性を有し、かつ、糖鎖結合部位を構成するアミノ酸の少なくとも一つが変異した、Ｂ型ボツリヌス菌由来の変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質に関する。Ｅ－カドヘリン結合部位としては、Ｂ型ボツリヌス菌由来の野生型ヘマグルチニンと同様にＥ－カドヘリン結合活性を有するＡ型ボツリヌス菌由来の野生型ヘマグルチニンにおけるＥ－カドヘリン結合部位が解析されている（例えば、KwangKook Lee et al, Science 2014 Jun 20, Vol.344, no. 6190 pp.1405-1410等）。
本開示の変異型ＨＡ複合体タンパク質は、一又は複数の実施形態において、サブコンポーネントＨＡ３として、ＨＡ３の野生型（野生型ＨＡ３）のアミノ酸配列（配列番号３）において５２８番目のアルギニン又はそれに相当するアミノ酸が変異したアミノ酸配列の一部又は全部を含む。
本開示の変異型ＨＡ複合体タンパク質は、一又は複数の実施形態において、サブコンポーネントＨＡ２として、ＨＡ２の野生型（野生型ＨＡ２）のアミノ酸配列（配列番号２）の一部又は全部を含む。
本開示の変異型ＨＡ複合体タンパク質は、一又は複数の実施形態において、サブコンポーネントＨＡ１として、ＨＡ１の野生型（野生型ＨＡ１）のアミノ酸配列（配列番号１）において、２６４番目のアスパラギン若しくはそれに相当するアミノ酸、及び／又は２８６番目のアスパラギン若しくはそれに相当するアミノ酸が変異したアミノ酸配列の一部又は全部を含む。
本開示の変異型ＨＡ複合体タンパク質は、一又は複数の実施形態において、サブコンポーネントＨＡ１、ＨＡ２及びＨＡ３によって形成され、前記サブコンポーネントＨＡ１の野生型のアミノ酸配列の２８６番目のアスパラギンに相当するアミノ酸、及び前記サブコンポーネントＨＡ３の野生型のアミノ酸配列の５２８番目のアルギニンに相当するアミノ酸の一方のアミノ酸又は双方のアミノ酸が変異した変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質である。
本開示の変異型ＨＡ複合体タンパク質の第１の実施形態として、野生型ＨＡ１のアミノ酸配列（配列番号１）において２６４番目のアスパラギン及び／又は２８６番目のアスパラギンが変異したＨＡ１（変異型ＨＡ１）、野生型ＨＡ２及び野生型ＨＡ３を含む変異型ＨＡ複合体（変異型ＨＡ複合体１）が挙げられる。変異型ＨＡ複合体１の一又は複数の実施形態において、変異型ＨＡ複合体１に含まれるサブコンポーネントＨＡ１の少なくとも１つが変異型ＨＡ１であればよく、全てのＨＡ１が変異型ＨＡ１であることが好ましい。
本開示の変異型ＨＡ複合体タンパク質の第２の実施形態として、野生型ＨＡ１、野生型ＨＡ２、及び、野生型ＨＡ３のアミノ酸配列（配列番号３）において５２８番目のアルギニン又はそれに相当するアミノ酸が変異したＨＡ３（変異型ＨＡ３）を含む変異型ＨＡ複合体（変異型ＨＡ複合体２）が挙げられる。変異型ＨＡ複合体２の一又は複数の実施形態において、変異型ＨＡ複合体２に含まれるサブコンポーネントＨＡ３の少なくとも１つが変異型ＨＡ３であればよく、全てのＨＡ３が変異型ＨＡ３であることが好ましい。
本開示の変異型ＨＡ複合体タンパク質の第３の実施形態として、変異型ＨＡ１、野生型ＨＡ２及び変異型ＨＡ３を含む変異型ＨＡ複合体（変異型ＨＡ複合体３）が挙げられ、より効率よく細胞間接着を阻害し、未分化逸脱細胞をより効率的に除去する観点から、好ましくは野生型ＨＡ１のアミノ酸配列（配列番号１）において２８６番目のアスパラギンがアラニンに変異したＨＡ１（配列番号４）、野生型ＨＡ２（配列番号２）、及び野生型ＨＡ３のアミノ酸配列（配列番号３）において５２８番目のアルギニンがアラニンに変異したＨＡ３（配列番号５）が挙げられる。変異型ＨＡ複合体３の一又は複数の実施形態において、変異型ＨＡ複合体３に含まれるサブコンポーネントＨＡ１の少なくとも１つが変異型ＨＡ１であればよく、全てのＨＡ１が変異型ＨＡ１であることが好ましい。また、変異型ＨＡ複合体３に含まれるサブコンポーネントＨＡ３の少なくとも１つが変異型ＨＡ３であればよく、全てのＨＡ３が変異型ＨＡ３であることが好ましい。
本開示の変異型複合体タンパク質は、一又は複数の実施形態において、サブコンポーネントＨＡ１のＣ末端にタグが結合していてもよい。Ｃ末端に結合するタグとしては、一又は複数の実施形態において、ＦＬＡＧタグ、Ｄ４タグ（ＤＤＤＤ、配列番号１５）等が挙げられる。本開示の変異型複合体タンパク質は、一又は複数の実施形態において、サブコンポーネントＨＡ１のＮ末端にタグが結合していないことが好ましく、サブコンポーネントＨＡ１のＮ末端にＨｉｓタグ又はＦＬＡＧタグが結合していないことが好ましい。
［多能性を有する幹細胞の培養方法］
本開示は、一態様において、多能性を有する幹細胞の培養方法であって、本開示の変異型ＨＡ複合体タンパク質の存在下で細胞培養することを含む（以下、「本開示の培養方法」ともいう）。本開示の培養方法によれば、本開示の変異型ＨＡ複合体タンパク質の存在下で細胞培養することから、一又は複数の実施形態において、未分化逸脱細胞を除去することができ、また、多能性を有する幹細胞の培養において構成されるコロニーを未分化状態に維持できるという効果を奏しうる。また、本開示の培養方法によれば、本開示の変異型ＨＡ複合体タンパク質の存在下で細胞培養することから、一又は複数の実施形態において、ヒト由来のｉＰＳ細胞のようにデリケートな細胞であっても、スフェロイド状の細胞集塊を効率よく分割でき、好ましくは多能性を有する幹細胞を効率よく大量に培養することができる。本開示の培養方法において、細胞培養は、一又は複数の実施形態において、接着培養（平面培養）、及び浮遊培養等が挙げられる。
本開示は、一態様において、多能性を有する幹細胞の培養方法であって、本開示の変異型ＨＡ複合体タンパク質の存在下で細胞培養することを含む（以下、「本開示の培養方法」ともいう）。本開示の培養方法によれば、本開示の変異型ＨＡ複合体タンパク質の存在下で細胞培養することから、一又は複数の実施形態において、未分化逸脱細胞を除去することができ、また、多能性を有する幹細胞の培養において構成されるコロニーを未分化状態に維持できるという効果を奏しうる。また、本開示の培養方法によれば、本開示の変異型ＨＡ複合体タンパク質の存在下で細胞培養することから、一又は複数の実施形態において、ヒト由来のｉＰＳ細胞のようにデリケートな細胞であっても、スフェロイド状の細胞集塊を効率よく分割でき、好ましくは多能性を有する幹細胞を効率よく大量に培養することができる。本開示の培養方法において、細胞培養は、一又は複数の実施形態において、接着培養（平面培養）、及び浮遊培養等が挙げられる。
〔接着培養〕
本開示の培養方法の第一の実施形態として、接着培養により細胞培養を行うことが挙げられる。細胞培養が接着培養である場合、一又は複数の実施形態において、培養面上に形成されるコロニーから未分化逸脱細胞を除去できるという効果を奏しうる。したがって、本開示は、その他の態様において、多能性を有する幹細胞の培養中に発生した又は発生しうる未分化状態を脱した細胞を除去する方法であって、本開示の変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質の存在下で細胞培養することを含む方法に関する。また、本開示は、その他の態様において、未分化状態を脱した細胞が発生したコロニーから未分化状態の細胞からなるコロニーを形成する方法であって、本開示の変異型ＨＡ複合体タンパク質の存在下で前記未分化状態を脱した細胞が発生したコロニーを培養することを含む方法に関する。本開示は、その他の態様において、多能性を有する幹細胞の未分化状態を維持する方法であって、本開示の変異型ＨＡ複合体タンパク質の存在下で細胞培養することを含む方法に関する。
本開示の培養方法の第一の実施形態として、接着培養により細胞培養を行うことが挙げられる。細胞培養が接着培養である場合、一又は複数の実施形態において、培養面上に形成されるコロニーから未分化逸脱細胞を除去できるという効果を奏しうる。したがって、本開示は、その他の態様において、多能性を有する幹細胞の培養中に発生した又は発生しうる未分化状態を脱した細胞を除去する方法であって、本開示の変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質の存在下で細胞培養することを含む方法に関する。また、本開示は、その他の態様において、未分化状態を脱した細胞が発生したコロニーから未分化状態の細胞からなるコロニーを形成する方法であって、本開示の変異型ＨＡ複合体タンパク質の存在下で前記未分化状態を脱した細胞が発生したコロニーを培養することを含む方法に関する。本開示は、その他の態様において、多能性を有する幹細胞の未分化状態を維持する方法であって、本開示の変異型ＨＡ複合体タンパク質の存在下で細胞培養することを含む方法に関する。
本開示の培養方法、除去方法、コロニー形成方法及び／又は維持方法によれば、一又は複数の実施形態において、コロニーから未分化逸脱細胞を効率よく除去ができ、効率的に未分化細胞のみを培養できる。本開示の培養方法及び除去方法によれば、一又は複数の実施形態において、培養装置での培養中に閉鎖空間を維持しながら未分化逸脱細胞を除去することができ、コロニーを構成する細胞を実質的に未分化細胞のみとするコロニー選抜を行うことができる。
第一の実施形態における細胞培養は、従来用いられる及び／又は今後開発される、多能性を有する幹細胞の培養条件及び培養培地等を採用でき、該培養条件の培地に本開示の変異型ＨＡ複合体タンパク質を存在させることで行える。限定されない一又は複数の実施形態において、本開示の変異型ＨＡ複合体タンパク質を培養中の培養培地に添加してもよく、或いは、本開示の変異型ＨＡ複合体タンパク質を予め添加した培地を使用して培養してもよい。限定されない一又は複数の実施形態において、本開示の変異型ＨＡ複合体タンパク質は、コロニーに未分化逸脱細胞の発生が確認された場合に随時添加してもよい。培養培地、培養プレート等は市販のものを使用してもよい。
本開示の培養方法、除去方法、コロニー形成方法及び／又は維持方法に使用する本開示の変異型ＨＡ複合体タンパク質は、一又は複数の実施形態において、効率的に未分化逸脱細胞を除去する点から、変異型ＨＡ３を含むことが好ましく、より好ましくは変異型ＨＡ１及び変異型ＨＡ３を含む。培地に存在させる本開示の変異型ＨＡ複合体タンパク質の濃度は、限定されない一又は複数の実施形態において、効率的に未分化細胞を除去する観点から、５ｎＭ以上、１０ｎＭ以上、又は１５ｎＭ以上が挙げられる。同様の観点から、２００ｎＭ以下、１５０ｎＭ以下、又は１００ｎＭ以下である。
本開示の培養方法、除去方法、コロニー形成方法及び／又は維持方法において、培地中に添加された変異型ＨＡ複合体タンパク質は、一又は複数の実施形態において、細胞内吸収（エンドサイトーシスなど）により自発的に除去させることができる。また、変異型ＨＡ複合体タンパク質に付したタグを標的とした吸着カラムを備え付け、培地を循環させることにより、変異型ＨＡ複合体タンパク質を強制的に培地から回収してもよい。このように変異型ＨＡ複合体タンパク質を自発的及び／又は強制的に除去・回収することによって、未分化逸脱細胞の除去を適時に一時的又は連続的に行うことができる。本開示の培養方法は、一又は複数の実施形態において、多能性を有する幹細胞の細胞培養をバイオリアクターでの自動運転により行うことを含む。
第一の実施形態における細胞培養は、限定されない一又は複数の実施形態において、フィーダ細胞を用いた培養であってもよいし、フィーダレス培養であってもよい。フィーダ細胞は、限定されない一又は複数の実施形態において、ＭＥＦ（Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）細胞、ＳＬ１０、及びＳＮＬ ７６／７フィーダ細胞等が挙げられる。フィーダ細胞は、限定されない一又は複数の実施形態において、フィーダ細胞の中でも、多能性を有する幹細胞の遊走速度が比較的ゆっくりなフィーダ細胞が好ましい。フィーダ細胞は、限定されない一又は複数の実施形態において、多能性を有する幹細胞の遊走が比較的ゆっくりであり、多能性を有する幹細胞の培養中のコロニーに未分化逸脱細胞をコロニー中央部に発生させることができる点から、ＳＮＬ ７６／７フィーダ細胞が好ましい。
〔浮遊培養〕
本開示の培養方法の第二の実施形態として、浮遊培養により細胞培養を行うことが挙げられる。細胞培養が浮遊培養である場合、一又は複数の実施形態において、ヒト由来のｉＰＳ細胞のようにデリケートな細胞であって細胞集塊を効率よく分割でき、好ましくは多能性を有する幹細胞を効率よく大量に培養することができる。したがって、本開示は、その他の態様において、多能性を有する幹細胞の細胞集塊の分割方法であって、本開示の変異型ＨＡ複合体タンパク質の存在下で、多能性を有する幹細胞を浮遊培養することを含む、多能性を有する幹細胞の細胞集塊の分割方法に関する。
本開示の培養方法の第二の実施形態として、浮遊培養により細胞培養を行うことが挙げられる。細胞培養が浮遊培養である場合、一又は複数の実施形態において、ヒト由来のｉＰＳ細胞のようにデリケートな細胞であって細胞集塊を効率よく分割でき、好ましくは多能性を有する幹細胞を効率よく大量に培養することができる。したがって、本開示は、その他の態様において、多能性を有する幹細胞の細胞集塊の分割方法であって、本開示の変異型ＨＡ複合体タンパク質の存在下で、多能性を有する幹細胞を浮遊培養することを含む、多能性を有する幹細胞の細胞集塊の分割方法に関する。
第二の実施形態における培養方法は、一又は複数の実施形態において、前記幹細胞の細胞集塊をボツリヌス菌由来のヘマグルチニン存在下で浮遊培養することによって、前記幹細胞の細胞集塊を小塊に分割すること、及び前記小塊を浮遊培養して新たな細胞集塊を形成させることを含む。第二の実施形態における培養方法は、一又は複数の実施形態において、細胞集塊の形成を、細胞集塊の分割と同じ培地内で行う。培地中に添加された本開示の変異型ＨＡ複合体タンパク質は、一又は複数の実施形態において、細胞内吸収（エンドサイトーシスなど）による自発的に除去できることができる。したがって、第二の実施形態における培養方法は、一又は複数の実施形態において、変異型ＨＡ複合体タンパク質を洗浄することなく、連続培養によって細胞集塊の分割と新たな細胞集塊の形成とを行うことができる。第二の実施形態における培養方法は、一又は複数の実施形態において、変異型ＨＡ複合体タンパク質を洗浄する工程を含まない。また、一又は複数の実施形態において、本開示の変異型ＨＡ複合体タンパク質に付したタグを標的とした吸着カラムを備え付け、培地を循環させることにより、本物質を強制的に培地から回収してもよい。このように変異型ＨＡ複合体タンパク質を自発的及び／又は強制的に除去・回収可能することによって、細胞集塊の分割を制御して分割効果を適時に一時的又は連続的に発揮させることができる本開示の培養方法は、一又は複数の実施形態において、多能性を有する幹細胞の細胞培養をバイオリアクターでの自動運転により行うことを含む。
第二の実施形態における細胞培養は、従来用いられる及び／又は今後開発される、多能性を有する幹細胞の培養条件及び培養培地等を採用でき、該培養条件の培地に本開示の変異型ＨＡ複合体タンパク質を存在させることで行える。限定されない一又は複数の実施形態において、本開示の変異型ＨＡ複合体タンパク質を培養中の培養培地に添加してもよく、或いは、本開示の変異型ＨＡ複合体タンパク質を予め添加した培地を使用して培養してもよい。培養培地及び培養容器等は市販のものを使用してもよい。
培地に存在させる本開示の変異型ＨＡ複合体タンパク質の濃度は、限定されない一又は複数の実施形態において、効率的に未分化細胞を除去する観点から、５ｎＭ以上、１０ｎＭ以上、又は１５ｎＭ以上が挙げられる。同様の観点から、２００ｎＭ以下、１５０ｎＭ以下、又は１００ｎＭ以下である。
浮遊培養は、一又は複数の実施形態において、従来用いられる及び／又は今後開発される、多能性を有する幹細胞の培養条件及び培養培地等を採用でき、該培養条件の培地に本開示の変異型ＨＡ複合体タンパク質を存在させることで行える。
［ｉＰＳ細胞の培養方法］
本開示は、一又は複数の実施形態において、ｉＰＳ細胞の培養方法であって、ボツリヌス菌由来のヘマグルチニン存在下で前記ｉＰＳ細胞を浮遊培養することを含む方法（以下、「本開示のｉＰＳ細胞の培養方法」ともいう）に関する。本開示のｉＰＳ細胞の培養方法によれば、ヒト由来のｉＰＳ細胞のようにデリケートな細胞であってもスフェロイド状の細胞集塊を効率よく分割できることから、ｉＰＳ細胞を効率よく大量に培養することができる。したがって、本開示は、一又は複数の実施形態において、ｉＰＳ細胞の細胞集塊の分割方法であって、ボツリヌス菌由来のヘマグルチニン存在下でｉＰＳ幹細胞を浮遊培養することを含む方法（以下、「本開示の分割方法」ともいう）に関する。
本開示は、一又は複数の実施形態において、ｉＰＳ細胞の培養方法であって、ボツリヌス菌由来のヘマグルチニン存在下で前記ｉＰＳ細胞を浮遊培養することを含む方法（以下、「本開示のｉＰＳ細胞の培養方法」ともいう）に関する。本開示のｉＰＳ細胞の培養方法によれば、ヒト由来のｉＰＳ細胞のようにデリケートな細胞であってもスフェロイド状の細胞集塊を効率よく分割できることから、ｉＰＳ細胞を効率よく大量に培養することができる。したがって、本開示は、一又は複数の実施形態において、ｉＰＳ細胞の細胞集塊の分割方法であって、ボツリヌス菌由来のヘマグルチニン存在下でｉＰＳ幹細胞を浮遊培養することを含む方法（以下、「本開示の分割方法」ともいう）に関する。
本開示のｉＰＳ細胞の培養方法は、一又は複数の実施形態において、ｉＰＳ細胞の細胞集塊をボツリヌス菌由来のヘマグルチニン存在下で浮遊培養することによって、ｉＰＳ細胞の細胞集塊を小塊に分割すること、及び前記小塊を浮遊培養して新たな細胞集塊を形成させることを含む。本開示のｉＰＳ細胞の培養方法は、一又は複数の実施形態において、細胞集塊の形成を、細胞集塊の分割と同じ培地内で行う。培地中に添加された本開示の変異型ＨＡ複合体タンパク質は、一又は複数の実施形態において、細胞内吸収（エンドサイトーシスなど）による自発的に除去できることができる。したがって、本開示のｉＰＳ細胞の培養方法は、一又は複数の実施形態において、変異型ＨＡ複合体タンパク質を洗浄することなく、連続培養によって細胞集塊の分割と新たな細胞集塊の形成とを行うことができる。本開示のｉＰＳ細胞の培養方法は、一又は複数の実施形態において、変異型ＨＡ複合体タンパク質を洗浄する工程を含まない。また、一又は複数の実施形態において、本開示の変異型ＨＡ複合体タンパク質に付したタグを標的とした吸着カラムを備え付け、培地を循環させることにより、本物質を強制的に培地から回収してもよい。このように変異型ＨＡ複合体タンパク質を自発的及び／又は強制的に除去・回収可能することによって、細胞集塊の分割を制御して分割効果を適時に一時的又は連続的に発揮させることができる本開示の培養方法は、一又は複数の実施形態において、多能性を有する幹細胞の細胞培養をバイオリアクターでの自動運転により行うことを含む。
本開示のｉＰＳ細胞の培養方法及び分割方法において使用するボツリヌス菌由来のヘマグルチニンとしては、一又は複数の実施形態として、Ａ型ボツリヌス菌由来のヘマグルチニン及びＢ型ボツリヌス菌由来のヘマグルチニン等が挙げられる。Ｂ型ボツリヌス菌由来のヘマグルチニンとしては、一又は複数の実施形態において、Ｃ末端にタグが結合したサブコンポーネントＨＡ１を含むことが好ましい。Ｂ型ボツリヌス菌由来のヘマグルチニンは、一又は複数の実施形態において、本開示の変異型ＨＡ複合体タンパク質等が挙げられる。
本開示のｉＰＳ細胞の培養方法及び分割方法において、低濃度で効率よく細胞集塊を分割することができる点からは、Ａ型ボツリヌス菌由来のヘマグルチニンが好ましい。Ａ型ボツリヌス菌由来のヘマグルチニンとしては、一又は複数の実施形態において、Ａ型野生型ボツリヌス菌由来のヘマグルチニン及び後述するＡ型変異型ボツリヌス菌由来のヘマグルチニンが挙げられる。
本開示のｉＰＳ細胞の培養方法及び分割方法において、浮遊培養条件、ＨＡの添加条件等は第二の実施形態の培養方法と同様に行うことができる。
［組成物］
本開示は、その他の態様において、ボツリヌス菌由来のヘマグルチニンを含む組成物（以下、「本開示の組成物」ともいう。）に関する。本開示の組成物は、本開示の培養方法、本開示の除去方法、本開示のコロニー形成方法、本開示の維持方法、及び／又は本開示の分割方法のために使用できる。したがって、本開示は、その他の態様において、本開示の培養方法、本開示の除去方法、本開示のコロニー形成方法、本開示の維持方法、及び／又は本開示の分割方法に用いる組成物であって、ボツリヌス菌由来のヘマグルチニンを含む組成物に関する。また、本開示は、その他の態様において、本開示の培養方法、本開示の除去方法、本開示のコロニー形成方法、本開示の維持方法、及び／又は本開示の分割方法におけるツリヌス由来のヘマグルチニンの使用に関する。ボツリヌス菌由来のヘマグルチニンとしては、一又は複数の実施形態において、上述のＡ型ボツリヌス菌由来のヘマグルチニン及びＢ型ボツリヌス菌由来のヘマグルチニン並びにこれらの複合体が挙げられ、Ｂ型ボツリヌス菌由来のヘマグルチニンとしては、一又は複数の実施形態において、本開示の変異型ＨＡ複合体、及び野生型ＨＡ複合体が挙げられる。
本開示は、その他の態様において、ボツリヌス菌由来のヘマグルチニンを含む組成物（以下、「本開示の組成物」ともいう。）に関する。本開示の組成物は、本開示の培養方法、本開示の除去方法、本開示のコロニー形成方法、本開示の維持方法、及び／又は本開示の分割方法のために使用できる。したがって、本開示は、その他の態様において、本開示の培養方法、本開示の除去方法、本開示のコロニー形成方法、本開示の維持方法、及び／又は本開示の分割方法に用いる組成物であって、ボツリヌス菌由来のヘマグルチニンを含む組成物に関する。また、本開示は、その他の態様において、本開示の培養方法、本開示の除去方法、本開示のコロニー形成方法、本開示の維持方法、及び／又は本開示の分割方法におけるツリヌス由来のヘマグルチニンの使用に関する。ボツリヌス菌由来のヘマグルチニンとしては、一又は複数の実施形態において、上述のＡ型ボツリヌス菌由来のヘマグルチニン及びＢ型ボツリヌス菌由来のヘマグルチニン並びにこれらの複合体が挙げられ、Ｂ型ボツリヌス菌由来のヘマグルチニンとしては、一又は複数の実施形態において、本開示の変異型ＨＡ複合体、及び野生型ＨＡ複合体が挙げられる。
［キット］
本開示は、その他の態様において、多能性を有する幹細胞用の培地成分と本開示の変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質とを含むキット（以下、「本開示のキット」ともいう。）に関する。本開示のキットにおける「変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質」は、上述のとおりである。本開示のキットは、本開示の培養方法、除去方法、コロニー形成方法、及び／又は維持方法のために使用できる。多能性を有する幹細胞用の培地成分は、特に限定されず、従来使用される又は今後開発されるものを使用できる。
本開示は、その他の態様において、多能性を有する幹細胞用の培地成分と本開示の変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質とを含むキット（以下、「本開示のキット」ともいう。）に関する。本開示のキットにおける「変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質」は、上述のとおりである。本開示のキットは、本開示の培養方法、除去方法、コロニー形成方法、及び／又は維持方法のために使用できる。多能性を有する幹細胞用の培地成分は、特に限定されず、従来使用される又は今後開発されるものを使用できる。
［多能性を有する幹細胞の培養に用いる組成物］
本開示は、その他の態様において、ボツリヌス菌由来の変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質を含む、多能性を有する幹細胞の培養に用いる組成物（以下、「本開示の培養用組成物」）に関する。本開示の培養用組成物は、本開示の培養方法、本開示の除去方法、本開示のコロニー形成方法、本開示の維持方法、及び／又は本開示の分割方法のために使用できる。
本開示は、その他の態様において、ボツリヌス菌由来の変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質を含む、多能性を有する幹細胞の培養に用いる組成物（以下、「本開示の培養用組成物」）に関する。本開示の培養用組成物は、本開示の培養方法、本開示の除去方法、本開示のコロニー形成方法、本開示の維持方法、及び／又は本開示の分割方法のために使用できる。
本開示の培養用組成物に含まれるボツリヌス菌由来の変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質は、ボツリヌス菌由来のヘマグルチニンのサブコンポーネントＨＡ２及びＨＡ３を少なくとも含み、Ｅ－カドヘリン結合部位を構成するアミノ酸配列を有し、かつ、糖鎖結合部位を構成するアミノ酸の少なくとも一つが変異した、変異型ヘマグルチニン複合タンパク質である。変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質を構成するヘマグルチニンは、Ｅ－カドヘリンとの相互作用を有するヘマグルチニンであればそのボツリヌス菌の型は特に制限されない。ボツリヌス菌としては、特に限定されない一又は複数の実施形態において、Ａ型ボツリヌス菌又はＢ型ボツリヌス菌が挙げられる。
ボツリヌス菌由来の変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質は、一又は複数の実施形態において、Ｂ型ボツリヌス菌由来の変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質である本開示の変異型ＨＡ複合体タンパク質が挙げられる。
ボツリヌス菌由来の変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質は、一又は複数の実施形態において、Ａ型ボツリヌス菌由来の変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質（以下、「Ａ型変異型ＨＡ複合体」ともいう）が挙げられる。
Ａ型変異型ＨＡ複合体としては、一又は複数の実施形態において、糖鎖結合部位を構成するアミノ酸の少なくとも一つが変異した公知のＡ型変異型ＨＡ複合体が挙げられる。Ａ型ボツリヌス菌由来の野生型ヘマグルチニンにおける糖鎖結合部位を構成するアミノ酸として、例えば、ＨＡ１のアミノ酸配列（配列番号１６）の２８５番目のアスパラギン、及びＨＡ３のアミノ酸配列（配列番号１８）の５２８番目のアルギニン、ＨＡ１のアミノ酸配列（配列番号１６）の２６３番目のアスパラギン等がある。
Ａ型変異型ＨＡ複合体は、Ａ型ボツリヌス菌由来のヘマグルチニンのサブコンポーネントＨＡ２及びＨＡ３を少なくとも含み、一又は複数の実施形態において、サブコンポーネントＨＡ１をさらに含んでいてもよい。Ａ型変異型ＨＡ複合体は、一又は複数の実施形態において、ＨＡ２及びＨＡ３の２成分で構成される複合体であり、より効率よく細胞間接着を阻害し、未分化逸脱細胞をより効率的に除去できる観点から、ＨＡ１、ＨＡ２及びＨＡ３の３成分で構成される複合体である。
Ａ型変異型ＨＡ複合体は、糖鎖結合部位を構成するアミノ酸の少なくとも一つが変異している。Ａ型変異型ＨＡ複合体は、一又は複数の実施形態において、Ａ型ボツリヌス菌由来の野生型ヘマグルチニンにおける糖鎖結合活性の少なくとも一部又は全部を欠損させた変異型ヘマグルチニン複合タンパク質ともいうことができる。Ａ型変異型ＨＡ複合体は、一又は複数の実施形態において、糖鎖結合部位を構成するアミノ酸又はこれらのアミノ酸に相当するアミノ酸が変異されており、コロニーから効率よく未分化逸脱細胞を除去できる点からは、ＨＡ３のアミノ酸配列（配列番号１８）の５２８番目のアルギニン又はそれに相当するアミノ酸が変異されていることが好ましく、より好ましくはＨＡ３のアミノ酸配列（配列番号１８）の５２８番目のアルギニン又はそれに相当するアミノ酸と、ＨＡ１のアミノ酸配列（配列番号１６）の２８５番目のアスパラギン又はそれに相当するアミノ酸とが変異されている。
Ａ型変異型ＨＡ複合体は、Ａ型ボツリヌス菌由来の野生型ヘマグルチニンにおけるＥ－カドヘリン結合部位を構成するアミノ酸配列を有している。すなわち、Ａ型変異型ＨＡ複合体は、一又は複数の実施形態において、Ｅ－カドヘリン結合活性を有している。
Ａ型変異型ＨＡ複合体は、一又は複数の実施形態において、サブコンポーネントＨＡ３として、Ａ型－ＨＡ３の野生型（野生型ＨＡ３）のアミノ酸配列（配列番号１８）において５２８番目のアルギニン又はそれに相当するアミノ酸が変異したアミノ酸配列の一部又は全部を含む。
Ａ型変異型ＨＡ複合体は、一又は複数の実施形態において、サブコンポーネントＨＡ２として、Ａ型－ＨＡ２の野生型（野生型ＨＡ２）のアミノ酸配列（配列番号１７）の一部又は全部を含む。
Ａ型変異型ＨＡ複合体は、一又は複数の実施形態において、サブコンポーネントＨＡ１として、Ａ型－ＨＡ１の野生型（野生型ＨＡ１）のアミノ酸配列（配列番号１６）において、２６４番目のアスパラギン若しくはそれに相当するアミノ酸、及び／又は２８６番目のアスパラギン若しくはそれに相当するアミノ酸が変異したアミノ酸配列の一部又は全部を含む。
Ａ型変異型ＨＡ複合体は、一又は複数の実施形態において、サブコンポーネントＨＡ１のＣ末端にタグが結合していてもよい。Ｃ末端に結合するタグとしては、一又は複数の実施形態において、ＦＬＡＧタグ、Ｄ４タグ（ＤＤＤＤ、配列番号１５）等が挙げられる。本開示の変異型複合体タンパク質は、一又は複数の実施形態において、サブコンポーネントＨＡ１のＮ末端にタグが結合していないことが好ましく、サブコンポーネントＨＡ１のＮ末端にＨｉｓタグ又はＦＬＡＧタグが結合していないことが好ましい。
本開示は、一又は複数の実施形態において、本開示の培養用組成物を用いた多能性を有する幹細胞を培養する方法、多能性を有する幹細胞の培養中に発生した又は発生しうる未分化状態を脱した細胞を除去する方法、及び多能性を有する幹細胞の未分化状態を維持する方法に関する。これらの方法は、一又は複数の実施形態において、本開示の培養用組成物の存在下で多能性を有する幹細胞を細胞培養をすることを含む。
本開示はさらに以下の限定されない一又は複数の実施形態に関する。
〔Ａ１〕 Ｂ型ボツリヌス菌由来の変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質であって、
前記複合体タンパク質は、
Ｂ型ボツリヌス菌由来のヘマグルチニンのサブコンポーネントＨＡ２及びＨＡ３を少なくとも含み、
糖鎖結合部位を構成するアミノ酸の少なくとも一つが変異した、変異型ヘマグルチニン複合タンパク質。
〔Ａ２〕 Ｂ型ボツリヌス菌由来の変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質であって、
前記複合体タンパク質は、
Ｂ型ボツリヌス菌由来のヘマグルチニンのサブコンポーネントＨＡ２及びＨＡ３を少なくとも含み、
Ｅ－カドヘリン結合部位を構成するアミノ酸配列を有し、かつ、
糖鎖結合部位を構成するアミノ酸の少なくとも一つが変異した、変異型ヘマグルチニン複合タンパク質。
〔Ａ３〕 前記複合体タンパク質は、Ｂ型ボツリヌス菌由来のヘマグルチニンのサブコンポーネントＨＡ１をさらに含む、〔Ａ１〕記載の変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質。
〔Ａ４〕 前記糖鎖結合部位を構成するアミノ酸は、前記ＨＡ１の野生型のアミノ酸配列の２６４番目のアスパラギンに相当するアミノ酸、前記ＨＡ１の野生型のアミノ酸配列の２８６番目のアスパラギンに相当するアミノ酸、及び前記ＨＡ３の野生型のアミノ酸配列の５２８番目のアルギニンに相当するアミノ酸からなる群から選択される、〔Ａ３〕記載の変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質。
〔Ａ５〕 Ｂ型ボツリヌス菌由来の変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質であって、
前記複合体タンパク質は、サブコンポーネントＨＡ１、ＨＡ２及びＨＡ３によって形成され、
前記サブコンポーネントＨＡ１の野生型のアミノ酸配列の２８６番目のアスパラギンに相当するアミノ酸、及び前記サブコンポーネントＨＡ３の野生型のアミノ酸配列の５２８番目のアルギニンに相当するアミノ酸の一方のアミノ酸又は双方のアミノ酸が変異した、変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質。
〔Ａ６〕 前記サブコンポーネントＨＡ１のＣ末端にタグが結合している、〔Ａ１〕から〔Ａ５〕のいずれかに記載の変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質。
〔Ａ８〕 前記複合体タンパク質は、Ｅ－カドヘリン機能阻害活性を有する、〔Ａ１〕から〔Ａ７〕のいずれかに記載の変異型ヘマグルチニン複合タンパク質。
〔Ａ９〕 前記複合体タンパク質は、Ｅ－カドヘリン結合活性を有する、〔Ａ１〕から〔Ａ８〕のいずれかに記載の変異型ヘマグルチニン複合タンパク質。
〔Ａ１０〕 前記複合体タンパク質は、Ｅ－カドヘリン結合部位を構成するアミノ酸配列を有する、〔Ａ１〕から〔Ａ９〕のいずれかに記載の変異型ヘマグルチニン複合タンパク質。
〔Ｂ１〕 多能性（pluripotency）を有する幹細胞の培養方法であって、〔Ａ１〕から〔Ａ１０〕のいずれかに記載の変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質の存在下で細胞培養することを含む、方法。
〔Ｂ２〕 前記細胞培養は、接着培養又は浮遊培養である、〔Ｂ１〕記載の方法。
〔Ｃ１〕 多能性（pluripotency）を有する幹細胞の培養中に発生した又は発生しうる未分化状態を脱した細胞を除去する方法であって、〔Ａ１〕から〔Ａ１０〕のいずれかに記載の変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質の存在下で細胞培養することを含む、方法。
〔Ｃ２〕 多能性（pluripotency）を有する幹細胞の未分化状態を維持する方法であって〔Ａ１〕から〔Ａ１０〕のいずれかに記載の変異型ＨＡ複合体タンパク質の存在下で細胞培養することを含む、方法。
〔Ｄ１〕 ヒト由来のｉＰＳ細胞の培養方法であって、ボツリヌス菌由来のヘマグルチニン存在下で前記ｉＰＳ細胞を浮遊培養することを含む、方法。
〔Ｄ２〕 前記ｉＰＳ細胞の細胞集塊をボツリヌス菌由来のヘマグルチニン存在下で浮遊培養することによって、前記細胞集塊を小塊に分割すること、及び
前記小塊を浮遊培養して新たな細胞集塊を形成させることを含み、
前記細胞集塊の形成を、前記細胞集塊の分割と同じ培地内で行う、〔Ｄ１〕記載の方法。
〔Ｄ３〕 ヒト由来のｉＰＳ細胞の細胞集塊の分割方法であって、ボツリヌス菌由来のヘマグルチニン存在下で前記ｉＰＳ細胞を浮遊培養することを含む、方法。
〔Ｄ４〕 前記ボツリヌス菌由来のへマグルチンは、エンドサイトーシスによって取り込まれる、〔Ｄ１〕から〔Ｄ３〕のいずれかに記載の方法。
〔Ｄ５〕 前記ボツリヌス菌由来のヘマグルチニンは、Ａ型ボツリヌス菌由来のヘマグルチニン及びＢ型ボツリヌス菌由来のヘマグルチニンからなる群から選択される、〔Ｄ１〕から〔Ｄ４〕のいずれかに記載の方法。
〔Ｄ６〕 前記Ｂ型ボツリヌス菌由来のヘマグルチニンは、請求項１から５のいずれかに記載の変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質を含む、〔Ｄ５〕記載の方法。
〔Ｅ１〕 ボツリヌス菌由来のヘマグルチニンを含む組成物であって、〔Ｂ１〕、〔Ｂ２〕、〔Ｃ１〕、〔Ｃ２〕及び〔Ｄ１〕から〔Ｄ６〕のいずれかに記載の方法に使用するための組成物。
〔Ｆ１〕 多能性を有する幹細胞用の培地成分と、〔Ａ１〕から〔Ａ１０〕のいずれかに記載の変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質とを含む、キット。
〔Ｆ２〕 〔Ｂ１〕、〔Ｂ２〕、〔Ｃ１〕、〔Ｃ２〕及び〔Ｄ１〕から〔Ｄ６〕のいずれかに記載の方法に使用するための〔Ｆ１〕記載のキット。
〔Ｇ１〕 ボツリヌス菌由来の変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質を含む組成物であって、
前記複合体タンパク質は、
ボツリヌス菌由来のヘマグルチニンのサブコンポーネントＨＡ２及びＨＡ３を少なくとも含み、
Ｅ－カドヘリン結合部位を構成するアミノ酸配列を有し、かつ、
糖鎖結合部位を構成するアミノ酸の少なくとも一つが変異した、変異型ヘマグルチニン複合タンパク質であり、
前記組成物は、
多能性を有する幹細胞の培養中に発生した又は発生しうる未分化状態を脱した細胞を除去する方法、
多能性を有する幹細胞の未分化状態を維持する方法、
ヒト由来のｉＰＳ細胞を浮遊培養する方法、及び
ヒト由来のｉＰＳ細胞の細胞集塊の分割方法からなる群から選択されるいずれかの方法に使用するための組成物。
〔Ｇ２〕 前記ボツリヌス菌は、Ａ型ボツリヌス菌又はＢ型ボツリヌス菌である、〔Ｇ１〕記載の組成物。
〔Ｇ３〕 前記複合体タンパク質は、ボツリヌス菌由来のヘマグルチニンのサブコンポーネントＨＡ１をさらに含む、〔Ｇ１〕又は〔Ｇ２〕に記載の組成物。
〔Ｇ４〕 前記糖鎖結合部位を構成するアミノ酸は、
Ａ型ボツリヌス菌の場合、前記ＨＡ１の野生型のアミノ酸配列の２６３番目のアスパラギンに相当するアミノ酸、前記ＨＡ１の野生型のアミノ酸配列の２８５番目のアスパラギンに相当するアミノ酸、及び前記ＨＡ３の野生型のアミノ酸配列の５２８番目のアルギニンに相当するアミノ酸からなる群から選択され、
Ｂ型ボツリヌス菌の場合、前記ＨＡ１の野生型のアミノ酸配列の２６４番目のアスパラギンに相当するアミノ酸、前記ＨＡ１の野生型のアミノ酸配列の２８６番目のアスパラギンに相当するアミノ酸、及び前記ＨＡ３の野生型のアミノ酸配列の５２８番目のアルギニンに相当するアミノ酸からなる群から選択される、〔Ｇ３〕記載の組成物。
〔Ｈ１〕 多能性を有する幹細胞の培養方法であって、〔Ｇ１〕から〔Ｇ４〕のいずれかに記載の組成物の存在下で細胞培養することを含む、方法。
〔Ｈ２〕 前記細胞培養は、接着培養又は浮遊培養である、〔Ｈ１〕記載の方法。
〔Ｈ３〕 多能性を有する幹細胞の培養中に発生した又は発生しうる未分化状態を脱した細胞を除去する方法であって、〔Ｇ１〕から〔Ｇ４〕のいずれかに記載の組成物の存在下で細胞培養することを含む、方法。
〔Ｈ４〕 多能性を有する幹細胞の未分化状態を維持する方法であって、〔Ｇ１〕から〔Ｇ４〕のいずれかに記載の組成物の存在下で細胞培養することを含む、方法。
〔Ａ１〕 Ｂ型ボツリヌス菌由来の変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質であって、
前記複合体タンパク質は、
Ｂ型ボツリヌス菌由来のヘマグルチニンのサブコンポーネントＨＡ２及びＨＡ３を少なくとも含み、
糖鎖結合部位を構成するアミノ酸の少なくとも一つが変異した、変異型ヘマグルチニン複合タンパク質。
〔Ａ２〕 Ｂ型ボツリヌス菌由来の変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質であって、
前記複合体タンパク質は、
Ｂ型ボツリヌス菌由来のヘマグルチニンのサブコンポーネントＨＡ２及びＨＡ３を少なくとも含み、
Ｅ－カドヘリン結合部位を構成するアミノ酸配列を有し、かつ、
糖鎖結合部位を構成するアミノ酸の少なくとも一つが変異した、変異型ヘマグルチニン複合タンパク質。
〔Ａ３〕 前記複合体タンパク質は、Ｂ型ボツリヌス菌由来のヘマグルチニンのサブコンポーネントＨＡ１をさらに含む、〔Ａ１〕記載の変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質。
〔Ａ４〕 前記糖鎖結合部位を構成するアミノ酸は、前記ＨＡ１の野生型のアミノ酸配列の２６４番目のアスパラギンに相当するアミノ酸、前記ＨＡ１の野生型のアミノ酸配列の２８６番目のアスパラギンに相当するアミノ酸、及び前記ＨＡ３の野生型のアミノ酸配列の５２８番目のアルギニンに相当するアミノ酸からなる群から選択される、〔Ａ３〕記載の変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質。
〔Ａ５〕 Ｂ型ボツリヌス菌由来の変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質であって、
前記複合体タンパク質は、サブコンポーネントＨＡ１、ＨＡ２及びＨＡ３によって形成され、
前記サブコンポーネントＨＡ１の野生型のアミノ酸配列の２８６番目のアスパラギンに相当するアミノ酸、及び前記サブコンポーネントＨＡ３の野生型のアミノ酸配列の５２８番目のアルギニンに相当するアミノ酸の一方のアミノ酸又は双方のアミノ酸が変異した、変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質。
〔Ａ６〕 前記サブコンポーネントＨＡ１のＣ末端にタグが結合している、〔Ａ１〕から〔Ａ５〕のいずれかに記載の変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質。
〔Ａ８〕 前記複合体タンパク質は、Ｅ－カドヘリン機能阻害活性を有する、〔Ａ１〕から〔Ａ７〕のいずれかに記載の変異型ヘマグルチニン複合タンパク質。
〔Ａ９〕 前記複合体タンパク質は、Ｅ－カドヘリン結合活性を有する、〔Ａ１〕から〔Ａ８〕のいずれかに記載の変異型ヘマグルチニン複合タンパク質。
〔Ａ１０〕 前記複合体タンパク質は、Ｅ－カドヘリン結合部位を構成するアミノ酸配列を有する、〔Ａ１〕から〔Ａ９〕のいずれかに記載の変異型ヘマグルチニン複合タンパク質。
〔Ｂ１〕 多能性（pluripotency）を有する幹細胞の培養方法であって、〔Ａ１〕から〔Ａ１０〕のいずれかに記載の変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質の存在下で細胞培養することを含む、方法。
〔Ｂ２〕 前記細胞培養は、接着培養又は浮遊培養である、〔Ｂ１〕記載の方法。
〔Ｃ１〕 多能性（pluripotency）を有する幹細胞の培養中に発生した又は発生しうる未分化状態を脱した細胞を除去する方法であって、〔Ａ１〕から〔Ａ１０〕のいずれかに記載の変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質の存在下で細胞培養することを含む、方法。
〔Ｃ２〕 多能性（pluripotency）を有する幹細胞の未分化状態を維持する方法であって〔Ａ１〕から〔Ａ１０〕のいずれかに記載の変異型ＨＡ複合体タンパク質の存在下で細胞培養することを含む、方法。
〔Ｄ１〕 ヒト由来のｉＰＳ細胞の培養方法であって、ボツリヌス菌由来のヘマグルチニン存在下で前記ｉＰＳ細胞を浮遊培養することを含む、方法。
〔Ｄ２〕 前記ｉＰＳ細胞の細胞集塊をボツリヌス菌由来のヘマグルチニン存在下で浮遊培養することによって、前記細胞集塊を小塊に分割すること、及び
前記小塊を浮遊培養して新たな細胞集塊を形成させることを含み、
前記細胞集塊の形成を、前記細胞集塊の分割と同じ培地内で行う、〔Ｄ１〕記載の方法。
〔Ｄ３〕 ヒト由来のｉＰＳ細胞の細胞集塊の分割方法であって、ボツリヌス菌由来のヘマグルチニン存在下で前記ｉＰＳ細胞を浮遊培養することを含む、方法。
〔Ｄ４〕 前記ボツリヌス菌由来のへマグルチンは、エンドサイトーシスによって取り込まれる、〔Ｄ１〕から〔Ｄ３〕のいずれかに記載の方法。
〔Ｄ５〕 前記ボツリヌス菌由来のヘマグルチニンは、Ａ型ボツリヌス菌由来のヘマグルチニン及びＢ型ボツリヌス菌由来のヘマグルチニンからなる群から選択される、〔Ｄ１〕から〔Ｄ４〕のいずれかに記載の方法。
〔Ｄ６〕 前記Ｂ型ボツリヌス菌由来のヘマグルチニンは、請求項１から５のいずれかに記載の変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質を含む、〔Ｄ５〕記載の方法。
〔Ｅ１〕 ボツリヌス菌由来のヘマグルチニンを含む組成物であって、〔Ｂ１〕、〔Ｂ２〕、〔Ｃ１〕、〔Ｃ２〕及び〔Ｄ１〕から〔Ｄ６〕のいずれかに記載の方法に使用するための組成物。
〔Ｆ１〕 多能性を有する幹細胞用の培地成分と、〔Ａ１〕から〔Ａ１０〕のいずれかに記載の変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質とを含む、キット。
〔Ｆ２〕 〔Ｂ１〕、〔Ｂ２〕、〔Ｃ１〕、〔Ｃ２〕及び〔Ｄ１〕から〔Ｄ６〕のいずれかに記載の方法に使用するための〔Ｆ１〕記載のキット。
〔Ｇ１〕 ボツリヌス菌由来の変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質を含む組成物であって、
前記複合体タンパク質は、
ボツリヌス菌由来のヘマグルチニンのサブコンポーネントＨＡ２及びＨＡ３を少なくとも含み、
Ｅ－カドヘリン結合部位を構成するアミノ酸配列を有し、かつ、
糖鎖結合部位を構成するアミノ酸の少なくとも一つが変異した、変異型ヘマグルチニン複合タンパク質であり、
前記組成物は、
多能性を有する幹細胞の培養中に発生した又は発生しうる未分化状態を脱した細胞を除去する方法、
多能性を有する幹細胞の未分化状態を維持する方法、
ヒト由来のｉＰＳ細胞を浮遊培養する方法、及び
ヒト由来のｉＰＳ細胞の細胞集塊の分割方法からなる群から選択されるいずれかの方法に使用するための組成物。
〔Ｇ２〕 前記ボツリヌス菌は、Ａ型ボツリヌス菌又はＢ型ボツリヌス菌である、〔Ｇ１〕記載の組成物。
〔Ｇ３〕 前記複合体タンパク質は、ボツリヌス菌由来のヘマグルチニンのサブコンポーネントＨＡ１をさらに含む、〔Ｇ１〕又は〔Ｇ２〕に記載の組成物。
〔Ｇ４〕 前記糖鎖結合部位を構成するアミノ酸は、
Ａ型ボツリヌス菌の場合、前記ＨＡ１の野生型のアミノ酸配列の２６３番目のアスパラギンに相当するアミノ酸、前記ＨＡ１の野生型のアミノ酸配列の２８５番目のアスパラギンに相当するアミノ酸、及び前記ＨＡ３の野生型のアミノ酸配列の５２８番目のアルギニンに相当するアミノ酸からなる群から選択され、
Ｂ型ボツリヌス菌の場合、前記ＨＡ１の野生型のアミノ酸配列の２６４番目のアスパラギンに相当するアミノ酸、前記ＨＡ１の野生型のアミノ酸配列の２８６番目のアスパラギンに相当するアミノ酸、及び前記ＨＡ３の野生型のアミノ酸配列の５２８番目のアルギニンに相当するアミノ酸からなる群から選択される、〔Ｇ３〕記載の組成物。
〔Ｈ１〕 多能性を有する幹細胞の培養方法であって、〔Ｇ１〕から〔Ｇ４〕のいずれかに記載の組成物の存在下で細胞培養することを含む、方法。
〔Ｈ２〕 前記細胞培養は、接着培養又は浮遊培養である、〔Ｈ１〕記載の方法。
〔Ｈ３〕 多能性を有する幹細胞の培養中に発生した又は発生しうる未分化状態を脱した細胞を除去する方法であって、〔Ｇ１〕から〔Ｇ４〕のいずれかに記載の組成物の存在下で細胞培養することを含む、方法。
〔Ｈ４〕 多能性を有する幹細胞の未分化状態を維持する方法であって、〔Ｇ１〕から〔Ｇ４〕のいずれかに記載の組成物の存在下で細胞培養することを含む、方法。
以下、実施例により本開示をさらに詳細に説明するが、これらは例示的なものであって、本開示はこれら実施例に制限されるものではない。
（実施例１）
［Ｂ型ボツリヌスＨＡ複合体の作製］
下記表１に示すＢ型ボツリヌス菌由来の野生型ＨＡ複合体及び変異型ＨＡ複合体１～４を次の手順に従い作製した。これらのＨＡ複合体（野生型ＨＡ複合体及び変異型ＨＡ複合体）は、Ｂ型ボツリヌス菌由来の野生型ＨＡサブコンポーネント（ＨＡ１、ＨＡ２、ＨＡ３）、変異型ＨＡ１（ＨＡ１ Ｎ２８６Ａ、配列番号４）、変異型ＨＡ３（ＨＡ３ Ｒ５２８Ａ、配列番号５）及び変異型ＨＡ３Ｘ（ＨＡ３ Ｋ６０７Ａ、配列番号６）を使用して作製した。
（１）プラスミドの作製
野生型は、ＨＡ１、ＨＡ２及びＨＡ３のそれぞれのタンパク質として以下のタンパク質をコードする遺伝子を、それぞれ下記のプライマーを用いてＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ｂ－Ｏｋｒａ株のゲノムＤＮＡをテンプレートとして、ＰＣＲ法により増幅した。
（各サブコンポーネントのタンパク質）
ＨＡ１：配列番号１のアミノ酸配列の７－２９４位のアミノ酸配列からなるタンパク質のＣ末端にＦＬＡＧタグが結合した組換えタンパク質
ＨＡ２：配列番号２のアミノ酸配列の２－１４６位のアミノ酸配列からなるタンパク質のＮ末端にＦＬＡＧタグが結合した組換えタンパク質
ＨＡ３：配列番号３のアミノ酸配列の１９－６２６位のアミノ酸配列からなるタンパク質のＮ末端にＳｔｒｅｐタグが結合した組換えタンパク質
（タグ配列）
ＦＬＡＧタグ：ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号７）
Ｓｔｒｅｐタグ：ＷＳＨＰＱＦＥＫ（配列番号８）
（ＨＡ１増幅用プライマー）
ＨＡ１ フォワードプライマー：catgccatgggcatccaaaattcattaaatgac（配列番号９）
ＨＡ１ リバースプライマー：cgggatccttacttgtcgtcatcgtctttgtagtctgggttactcatagtccatatc（配列番号１０）
（ＢＨＡ２増幅用プライマー）
ＨＡ２ フォワードプライマー：tgaataagctttcagctgaaagaacttttc（配列番号１１）
ＨＡ２ リバースプライマー：cactttggtaccttatattttttcaagtttga（配列番号１２）
（ＨＡ３増幅用プライマー）
ＨＡ３ フォワードプライマー：gaaaaagggtaccaatatagtgatactattg（配列番号１３）
ＨＡ３ リバースプライマー：cgtgtcgacttaattagtaatatctatatgc（配列番号１４）
変異型ＨＡ複合体１～４（表１）は、変異体の作製は、野生型ＨＡが挿入されたベクターを鋳型として、ＰＣＲ によるｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法によって行った。
増幅したＤＮＡ断片について、ＨＡ１はｐＥＴ５２ｂ（＋）のＮｃｏＩ－ＢａｍＨＩ ｓｉｔｅに挿入し、ＨＡ２はｐＴ７－ＦＬＡＧ－１（Ｓｉｇｍａ）のＨｉｎｄＩＩＩ－ＳａｌＩ ｓｉｔｅに挿入し、ＨＡ３についてはｐＥＴ５２ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＫｐｎＩ－ＳａｌＩ ｓｉｔｅに挿入した（ｐＥＴ－ＢＨＡ３）。
（２）タンパク質発現
作製したプラスミドはそれぞれ単独で大腸菌株Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）にトランスフォームした。タンパク質発現誘導はＯｖｅｒｎｉｇｈｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ １（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて行った。ＨＡ１及びＨＡ３は３０℃で３６時間、ＨＡ２については１８℃で４０時間、タンパク質発現誘導を行った。大腸菌は遠心により回収し、－８０℃で保存した。
（３）タンパク質精製及び複合体作製
ＨＡ１及びＨＡ２は、Ａｎｔｉ－ＦＬＡＧ Ｍ２ ａｇａｒｏｓｅ（Ｓｉｇｍａ）を用いて精製を行った。ＨＡ３はＳｔｒｅｐＴｒａｐ ＨＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製した。
それぞれ精製した組換え体タンパク質を、ＨＡ１：ＨＡ２：ＨＡ３＝４：４：１のモル比で混合し、３７℃で３時間インキュベートした後、ＳｔｒｅｐＴｒａｐ ＨＰにより精製することにより、ＨＡ複合体を得た。
［Ｂ型ボツリヌスＨＡ複合体の作製］
下記表１に示すＢ型ボツリヌス菌由来の野生型ＨＡ複合体及び変異型ＨＡ複合体１～４を次の手順に従い作製した。これらのＨＡ複合体（野生型ＨＡ複合体及び変異型ＨＡ複合体）は、Ｂ型ボツリヌス菌由来の野生型ＨＡサブコンポーネント（ＨＡ１、ＨＡ２、ＨＡ３）、変異型ＨＡ１（ＨＡ１ Ｎ２８６Ａ、配列番号４）、変異型ＨＡ３（ＨＡ３ Ｒ５２８Ａ、配列番号５）及び変異型ＨＡ３Ｘ（ＨＡ３ Ｋ６０７Ａ、配列番号６）を使用して作製した。
（１）プラスミドの作製
野生型は、ＨＡ１、ＨＡ２及びＨＡ３のそれぞれのタンパク質として以下のタンパク質をコードする遺伝子を、それぞれ下記のプライマーを用いてＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ｂ－Ｏｋｒａ株のゲノムＤＮＡをテンプレートとして、ＰＣＲ法により増幅した。
（各サブコンポーネントのタンパク質）
ＨＡ１：配列番号１のアミノ酸配列の７－２９４位のアミノ酸配列からなるタンパク質のＣ末端にＦＬＡＧタグが結合した組換えタンパク質
ＨＡ２：配列番号２のアミノ酸配列の２－１４６位のアミノ酸配列からなるタンパク質のＮ末端にＦＬＡＧタグが結合した組換えタンパク質
ＨＡ３：配列番号３のアミノ酸配列の１９－６２６位のアミノ酸配列からなるタンパク質のＮ末端にＳｔｒｅｐタグが結合した組換えタンパク質
（タグ配列）
ＦＬＡＧタグ：ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号７）
Ｓｔｒｅｐタグ：ＷＳＨＰＱＦＥＫ（配列番号８）
（ＨＡ１増幅用プライマー）
ＨＡ１ フォワードプライマー：catgccatgggcatccaaaattcattaaatgac（配列番号９）
ＨＡ１ リバースプライマー：cgggatccttacttgtcgtcatcgtctttgtagtctgggttactcatagtccatatc（配列番号１０）
（ＢＨＡ２増幅用プライマー）
ＨＡ２ フォワードプライマー：tgaataagctttcagctgaaagaacttttc（配列番号１１）
ＨＡ２ リバースプライマー：cactttggtaccttatattttttcaagtttga（配列番号１２）
（ＨＡ３増幅用プライマー）
ＨＡ３ フォワードプライマー：gaaaaagggtaccaatatagtgatactattg（配列番号１３）
ＨＡ３ リバースプライマー：cgtgtcgacttaattagtaatatctatatgc（配列番号１４）
変異型ＨＡ複合体１～４（表１）は、変異体の作製は、野生型ＨＡが挿入されたベクターを鋳型として、ＰＣＲ によるｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法によって行った。
増幅したＤＮＡ断片について、ＨＡ１はｐＥＴ５２ｂ（＋）のＮｃｏＩ－ＢａｍＨＩ ｓｉｔｅに挿入し、ＨＡ２はｐＴ７－ＦＬＡＧ－１（Ｓｉｇｍａ）のＨｉｎｄＩＩＩ－ＳａｌＩ ｓｉｔｅに挿入し、ＨＡ３についてはｐＥＴ５２ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＫｐｎＩ－ＳａｌＩ ｓｉｔｅに挿入した（ｐＥＴ－ＢＨＡ３）。
（２）タンパク質発現
作製したプラスミドはそれぞれ単独で大腸菌株Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）にトランスフォームした。タンパク質発現誘導はＯｖｅｒｎｉｇｈｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ １（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて行った。ＨＡ１及びＨＡ３は３０℃で３６時間、ＨＡ２については１８℃で４０時間、タンパク質発現誘導を行った。大腸菌は遠心により回収し、－８０℃で保存した。
（３）タンパク質精製及び複合体作製
ＨＡ１及びＨＡ２は、Ａｎｔｉ－ＦＬＡＧ Ｍ２ ａｇａｒｏｓｅ（Ｓｉｇｍａ）を用いて精製を行った。ＨＡ３はＳｔｒｅｐＴｒａｐ ＨＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製した。
それぞれ精製した組換え体タンパク質を、ＨＡ１：ＨＡ２：ＨＡ３＝４：４：１のモル比で混合し、３７℃で３時間インキュベートした後、ＳｔｒｅｐＴｒａｐ ＨＰにより精製することにより、ＨＡ複合体を得た。
（実施例２）
［Ｂ型変異型ＨＡ複合体がｉＰＳ細胞に及ぼす影響］
フィーダ細胞上にｉＰＳ細胞を播種し（ｄａｙ０）、２４時間ごとに維持培地で培地交換した。３日後（ｄａｙ３）においてＨＡ複合体（野生型ＨＡ複合体又は変異型ＨＡ複合体）を添加し２４時間インキュベートし、ＰＢＳで２度洗浄して維持培地で培地交換した（ｄａｙ４）。その後、９日後（ｄａｙ９）まで２４時間ごとに維持培地で培地交換した。培養後、培養された細胞のＯｃｔ３／４の発現を免疫細胞染色法で確認した。使用した細胞、培地、及び培養条件は以下のとおりである。
〔細胞〕
ｉＰＳ細胞：Ｔｉｃ ＮＰ２９（ＭＥＦで維持していたＴｉｃを継代したもの）
フィーダ細胞：ＳＮＬ ７６／７
〔培地〕
ｉＰＳ細胞：Ｒｅｐｒｏ Ｓｔｅｍ（商品名、ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ社製）、５ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦ（ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ社製）
フィーダ細胞：ＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ社製）（７％ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ社製），１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＮＡＣＡＬＡＩ ＴＥＳＱＵＥ社製））
〔容器〕
１２ウェルプレート（培養面積：３．８ｃｍ2／ウェル、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）
〔ＨＡ調製・添加方法〕
ＰＢＳでＨＡ複合体を段階希釈し、さらに、培地（Ｒｅｐｒｏ Ｓｔｅｍ）を用いて希釈した（終濃度：１００ｎＭ）。さらにｂＦＧＦ（終濃度５ｎｇ／ｍｌ）を加え、それをウェルに添加した。
〔培養条件〕
３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下
ｉＰＳ細胞の継代後、３日後（ｄａｙ３）の培地交換において、ＨＡ複合体を各濃度で添加し、２４時間培養した。その後、４日後（ｄａｙ４）の培地交換において、ＨＡ複合体無添加の培地に切り替え、培養を継続した。
〔観察〕
ｄａｙ３、ｄａｙ４、ｄａｙ５及びｄａｙ９において、ＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ ２０００（商品名、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）で培養細胞を観察し画像を取得した。得られた顕微鏡観察写真を図１～４に示す。図１～４において、上図において実線で囲んだ部分を下図に示す。
［Ｂ型変異型ＨＡ複合体がｉＰＳ細胞に及ぼす影響］
フィーダ細胞上にｉＰＳ細胞を播種し（ｄａｙ０）、２４時間ごとに維持培地で培地交換した。３日後（ｄａｙ３）においてＨＡ複合体（野生型ＨＡ複合体又は変異型ＨＡ複合体）を添加し２４時間インキュベートし、ＰＢＳで２度洗浄して維持培地で培地交換した（ｄａｙ４）。その後、９日後（ｄａｙ９）まで２４時間ごとに維持培地で培地交換した。培養後、培養された細胞のＯｃｔ３／４の発現を免疫細胞染色法で確認した。使用した細胞、培地、及び培養条件は以下のとおりである。
〔細胞〕
ｉＰＳ細胞：Ｔｉｃ ＮＰ２９（ＭＥＦで維持していたＴｉｃを継代したもの）
フィーダ細胞：ＳＮＬ ７６／７
〔培地〕
ｉＰＳ細胞：Ｒｅｐｒｏ Ｓｔｅｍ（商品名、ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ社製）、５ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦ（ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ社製）
フィーダ細胞：ＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ社製）（７％ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ社製），１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＮＡＣＡＬＡＩ ＴＥＳＱＵＥ社製））
〔容器〕
１２ウェルプレート（培養面積：３．８ｃｍ2／ウェル、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）
〔ＨＡ調製・添加方法〕
ＰＢＳでＨＡ複合体を段階希釈し、さらに、培地（Ｒｅｐｒｏ Ｓｔｅｍ）を用いて希釈した（終濃度：１００ｎＭ）。さらにｂＦＧＦ（終濃度５ｎｇ／ｍｌ）を加え、それをウェルに添加した。
〔培養条件〕
３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下
ｉＰＳ細胞の継代後、３日後（ｄａｙ３）の培地交換において、ＨＡ複合体を各濃度で添加し、２４時間培養した。その後、４日後（ｄａｙ４）の培地交換において、ＨＡ複合体無添加の培地に切り替え、培養を継続した。
〔観察〕
ｄａｙ３、ｄａｙ４、ｄａｙ５及びｄａｙ９において、ＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ ２０００（商品名、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）で培養細胞を観察し画像を取得した。得られた顕微鏡観察写真を図１～４に示す。図１～４において、上図において実線で囲んだ部分を下図に示す。
（比較例１）
変異型ＨＡ複合体４（ＨＡ３ Ｋ６０７Ａ）を用い、実施例２と同様の実験を行った。その結果を図５に示す。図５において、上図において実線で囲んだ部分を下図に示す。
変異型ＨＡ複合体４（ＨＡ３ Ｋ６０７Ａ）を用い、実施例２と同様の実験を行った。その結果を図５に示す。図５において、上図において実線で囲んだ部分を下図に示す。
図１は野生型ＨＡ複合体の顕微鏡写真、図２は変異型ＨＡ複合体１の顕微鏡写真、図３は変異型ＨＡ複合体２の顕微鏡写真及び図４は変異型ＨＡ複合体３の顕微鏡写真を示す。
サブコンポーネントＨＡ１における２８６番目のアスバラギン及びＨＡ３における５２８番目のアルギニンは、糖鎖認識部位であることが知られている。図２～４に示すように、糖鎖結合活性を欠失させたいずれの変異型ＨＡ複合体１～３においても、変異型ＨＡ複合体添加から２４時間後（ｄａｙ３）で未分化逸脱細胞の細胞間接着がゆるくなり、未分化逸脱細胞の細胞間接着の阻害が確認できた。特に、変異型ＨＡ複合体２（ＨＡ３ Ｒ５２８Ａ）は、コロニー中心の未分化逸脱細胞の細胞間接着を阻害すると共に、細胞の剥離が確認された、また、変異型ＨＡ複合体３（ＨＡ１ Ｎ２８６Ａ／ＨＡ３ Ｒ５２８Ａ）では、図４に示すように変異型ＨＡ複合体添加から２４時間後（ｄａｙ３）で細胞間接着がゆるくなり、４８時間後（ｄａｙ４）には、他の変異型ＨＡ及び野生型ＨＡと比較して細胞剥離の効果が高いことが認められた（図４の矢印で示す部分）。さらに、培養９日目（ｄａｙ９）には未分化維持コロニーを形成していることが分かった。一方、カドヘリン結合活性消失変異体である比較例１の変異型ＨＡ複合体４（ＨＡ３ Ｋ６０７Ａ）は、細胞間接着の阻害及び細胞の剥離は確認されなかった（図５）。このため、糖鎖結合活性を欠失させた変異型ＨＡ複合体１～３によって、局所的な細胞－細胞間接着の阻害が可能であるとともに、特に変異型ＨＡ複合体２及び３によれば効率よい未分化逸脱細胞の剥離が可能であることが示唆された。
サブコンポーネントＨＡ１における２８６番目のアスバラギン及びＨＡ３における５２８番目のアルギニンは、糖鎖認識部位であることが知られている。図２～４に示すように、糖鎖結合活性を欠失させたいずれの変異型ＨＡ複合体１～３においても、変異型ＨＡ複合体添加から２４時間後（ｄａｙ３）で未分化逸脱細胞の細胞間接着がゆるくなり、未分化逸脱細胞の細胞間接着の阻害が確認できた。特に、変異型ＨＡ複合体２（ＨＡ３ Ｒ５２８Ａ）は、コロニー中心の未分化逸脱細胞の細胞間接着を阻害すると共に、細胞の剥離が確認された、また、変異型ＨＡ複合体３（ＨＡ１ Ｎ２８６Ａ／ＨＡ３ Ｒ５２８Ａ）では、図４に示すように変異型ＨＡ複合体添加から２４時間後（ｄａｙ３）で細胞間接着がゆるくなり、４８時間後（ｄａｙ４）には、他の変異型ＨＡ及び野生型ＨＡと比較して細胞剥離の効果が高いことが認められた（図４の矢印で示す部分）。さらに、培養９日目（ｄａｙ９）には未分化維持コロニーを形成していることが分かった。一方、カドヘリン結合活性消失変異体である比較例１の変異型ＨＡ複合体４（ＨＡ３ Ｋ６０７Ａ）は、細胞間接着の阻害及び細胞の剥離は確認されなかった（図５）。このため、糖鎖結合活性を欠失させた変異型ＨＡ複合体１～３によって、局所的な細胞－細胞間接着の阻害が可能であるとともに、特に変異型ＨＡ複合体２及び３によれば効率よい未分化逸脱細胞の剥離が可能であることが示唆された。
コロニーを、ＤＡＰＩと、未分化マーカー（Ｏｃｔ３／４、ＴＲＡ－１－６０及びＳＳＥＡ－４）又は内胚葉、中胚葉若しくは外胚葉の初期分化マーカー（α―ＳＡＭ、Ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ又はＮｅｓｔｉｎ）を用いて染色した。その結果、コロニー中心に発生した未分化逸脱細胞は未分化マーカー及び上記の初期分化マーカーのいずれも陰性であり、その周辺の細胞は未分化マーカーが陽性であることが確認された。
（実施例３）
［Ｂ型ＨＡ複合体がｉＰＳ細胞に及ぼす影響（その２）］
下記表２に示すように異なる位置にタグを結合させた以外は実施例１と同様の手順で野生型ＨＡ複合体１～５を作製した。
調製した野生型ＨＡ複合体１～５を用いて、実施例２と同様にしてｉＰＳ細胞に及ぼす影響を確認した。その結果を図６～１０に示す。図６は野生型ＨＡ複合体１の顕微鏡写真、図７は野生型ＨＡ複合体２の顕微鏡写真、図８は野生型ＨＡ複合体３の顕微鏡写真、図９は野生型ＨＡ複合体４の顕微鏡写真、及び図１０は野生型ＨＡ複合体５の顕微鏡写真を示す。
［Ｂ型ＨＡ複合体がｉＰＳ細胞に及ぼす影響（その２）］
下記表２に示すように異なる位置にタグを結合させた以外は実施例１と同様の手順で野生型ＨＡ複合体１～５を作製した。
調製した野生型ＨＡ複合体１～５を用いて、実施例２と同様にしてｉＰＳ細胞に及ぼす影響を確認した。その結果を図６～１０に示す。図６は野生型ＨＡ複合体１の顕微鏡写真、図７は野生型ＨＡ複合体２の顕微鏡写真、図８は野生型ＨＡ複合体３の顕微鏡写真、図９は野生型ＨＡ複合体４の顕微鏡写真、及び図１０は野生型ＨＡ複合体５の顕微鏡写真を示す。
図６～１０の矢印で示すように、いずれの野生型ＨＡ複合体においても、野生型ＨＡ複合体添加から２４時間後（ｄａｙ３）で、未分化逸脱細胞の細胞間接着のゆるみ（細胞間接着の阻害）が確認できた。特に、野生型ＨＡ複合体１、３及び４は、添加から２４時間後（ｄａｙ３）で細胞の剥離が確認され、中でも野生型ＨＡ複合体１は培養５日目（ｄａｙ５）には、未分化逸脱細胞が除去され、未分化維持コロニーを形成していることが確認された。したがって、野生型ＨＡ複合体１によれば、効率よい未分化逸脱細胞の剥離が可能であることが示唆された。
（実施例４）
［Ｂ型変異型ＨＡ複合体がｉＰＳ細胞集塊に及ぼす影響（その１）］
９６ｗｅｌｌ－Ｖ ｂｏｔｔｏｍ ｐｌａｔｅを用いてｉＰＳ細胞集塊を作成し、毎日半量培地交換を行った。培養３日目（ｄａｙ３）にｉＰＳ細胞集塊にＨＡ複合体を添加した。培養４日目（ｄａｙ４）に、ｉＰＳ細胞集塊を９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ ｆｌａｔ ｂｏｔｔｏｍ ｐｌａｔｅに移し、軽いピペッティングを行い、細胞集塊が割れるかどうかを確認した。使用した細胞、培地、ＨＡ複合体及び培養条件等は以下のとおりである。
〔細胞〕
ヒトｉＰＳ細胞（Ｔｉｃ ＮＰ４１（ｉＭａｔｒｉｘ－５１１（ｎｉｐｐｉ）で維持していたｉＰＳ細胞））
〔培地〕
ｍＴｅＳＲ１（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
〔容器〕
９６ｗｅｌｌ－Ｖ ｂｏｔｔｏｍ ｐｌａｔｅ（Ｓｕｍｉｔｏｍｏ Ｂａｋｅｌｉｔｅ）
〔ＨＡ〕
野生型ＨＡ複合体
変異型ＨＡ複合体１（ＨＡ１ Ｎ２８６Ａ）
変異型ＨＡ複合体２（ＨＡ３ Ｒ５２８Ａ）
変異型ＨＡ複合体３（ＨＡ１ Ｎ２８６Ａ／ＨＡ３ Ｒ５２８Ａ）
変異型ＨＡ複合体４（ＨＡ３ Ｋ６０７Ａ）
〔ＨＡ調製・添加方法〕
ＰＢＳでＨＡ複合体を段階希釈し、さらに、培地（ｍＴｅＳＲ１）を用いて希釈したもの（終濃度：１００ｎＭ）をウェルに添加した。
〔培養条件〕
３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下
〔観察〕
全視野をＩｎ Ｃｅｌｌ Ａａｎａｌｙｚｅｒ（商品名、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて細胞集塊を観察し画像を取得した。撮影は、変異型ＨＡ複合体添加前後（ｄａｙ３及びｄａｙ４）に倍率４倍で行った。得られた顕微鏡写真を図１１及び１２に示す。
［Ｂ型変異型ＨＡ複合体がｉＰＳ細胞集塊に及ぼす影響（その１）］
９６ｗｅｌｌ－Ｖ ｂｏｔｔｏｍ ｐｌａｔｅを用いてｉＰＳ細胞集塊を作成し、毎日半量培地交換を行った。培養３日目（ｄａｙ３）にｉＰＳ細胞集塊にＨＡ複合体を添加した。培養４日目（ｄａｙ４）に、ｉＰＳ細胞集塊を９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ ｆｌａｔ ｂｏｔｔｏｍ ｐｌａｔｅに移し、軽いピペッティングを行い、細胞集塊が割れるかどうかを確認した。使用した細胞、培地、ＨＡ複合体及び培養条件等は以下のとおりである。
〔細胞〕
ヒトｉＰＳ細胞（Ｔｉｃ ＮＰ４１（ｉＭａｔｒｉｘ－５１１（ｎｉｐｐｉ）で維持していたｉＰＳ細胞））
〔培地〕
ｍＴｅＳＲ１（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
〔容器〕
９６ｗｅｌｌ－Ｖ ｂｏｔｔｏｍ ｐｌａｔｅ（Ｓｕｍｉｔｏｍｏ Ｂａｋｅｌｉｔｅ）
〔ＨＡ〕
野生型ＨＡ複合体
変異型ＨＡ複合体１（ＨＡ１ Ｎ２８６Ａ）
変異型ＨＡ複合体２（ＨＡ３ Ｒ５２８Ａ）
変異型ＨＡ複合体３（ＨＡ１ Ｎ２８６Ａ／ＨＡ３ Ｒ５２８Ａ）
変異型ＨＡ複合体４（ＨＡ３ Ｋ６０７Ａ）
〔ＨＡ調製・添加方法〕
ＰＢＳでＨＡ複合体を段階希釈し、さらに、培地（ｍＴｅＳＲ１）を用いて希釈したもの（終濃度：１００ｎＭ）をウェルに添加した。
〔培養条件〕
３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下
〔観察〕
全視野をＩｎ Ｃｅｌｌ Ａａｎａｌｙｚｅｒ（商品名、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて細胞集塊を観察し画像を取得した。撮影は、変異型ＨＡ複合体添加前後（ｄａｙ３及びｄａｙ４）に倍率４倍で行った。得られた顕微鏡写真を図１１及び１２に示す。
割れた細胞集塊をｌａｍｉｎｉｎコート培養面上で培養し（フィーダ細胞：ＳＮＬ）、毎日、全量培地交換を行った。培養５日目に、細胞形態の観察を行うと共に、培養された細胞のＯｃｔ３／４の発現をｍｏｕｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｏｃｔ３／４ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ｓｃ－５２７９）を用いた免疫細胞染色法で確認し、また、ＤＡＰＩ染色を行った。
コントロールとして、ＨＡ複合体を添加しない以外は、上記と同様にして行った。以上の結果を下記表３に示す。
図１１及び１２に示すように、野生型ＨＡ複合体及び変異型ＨＡ複合体１～３を添加することによって、ヒトｉＰＳ細胞集塊をより小さい大きさの細胞集塊に分割させることができた。特に変異型ＨＡ複合体１～３の添加によって、ヒトｉＰＳ細胞集塊をより小さな塊に分割させることができた。一方、カドヘリン結合活性消失変異体である比較例１の変異型ＨＡ複合体４（ＨＡ３ Ｋ６０７Ａ）の添加では細胞集塊の分割は殆どみられず、ｃｏｎｔｒｏｌ（ＨＡ複合体未添加）では細胞集塊は分割しなかった。
（実施例５）
［Ｂ型ＨＡ複合体がｉＰＳ細胞集塊に及ぼす影響（その２）］
前培養として３０ｍｌリアクターで５日間ｉＰｓ細胞を培養した。培養５日目の細胞を２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに移しＨＡ複合体を添加した。ＨＡ複合体添加から６、１２、１８又は２４時間経過後、培地交換によってＨＡを取り除き、ピペッティングして細胞集塊を分割させた。その後培養を２４時間行い、細胞集塊の形態を観察した。使用した細胞、培地、ＨＡ及び培養条件等は以下のとおりである。得られた顕微鏡写真を図１３に示す。
〔細胞〕
ヒトｉＰＳ細胞（Ｔｉｃ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｇｌｏｂａｌ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎｐ．５２）
〔培地〕
ｍＴｅＳＲ１（Ｃａｔａ ＃０５８０／０５８９６，ＳＴＥＭＣＥＬＬ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ）
〔培養環境〕
３７℃，５％ＣＯ2雰囲気下
〔培養容器〕
２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃａｔ．Ｎｏ．３５２６）
〔播種密度〕
１．０×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌ
〔ＨＡ〕
野生型ＨＡ複合体５（Ｈｉｓ－ＢＨＡ１－ＦＬＡＧ：Ｈｉｓ－ＢＨＡ２：Ｓｔｒｅｐ－ＢＨＡ３）
添加濃度：４０ｎＭ
〔観察装置〕
ＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）
［Ｂ型ＨＡ複合体がｉＰＳ細胞集塊に及ぼす影響（その２）］
前培養として３０ｍｌリアクターで５日間ｉＰｓ細胞を培養した。培養５日目の細胞を２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに移しＨＡ複合体を添加した。ＨＡ複合体添加から６、１２、１８又は２４時間経過後、培地交換によってＨＡを取り除き、ピペッティングして細胞集塊を分割させた。その後培養を２４時間行い、細胞集塊の形態を観察した。使用した細胞、培地、ＨＡ及び培養条件等は以下のとおりである。得られた顕微鏡写真を図１３に示す。
〔細胞〕
ヒトｉＰＳ細胞（Ｔｉｃ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｇｌｏｂａｌ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎｐ．５２）
〔培地〕
ｍＴｅＳＲ１（Ｃａｔａ ＃０５８０／０５８９６，ＳＴＥＭＣＥＬＬ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ）
〔培養環境〕
３７℃，５％ＣＯ2雰囲気下
〔培養容器〕
２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃａｔ．Ｎｏ．３５２６）
〔播種密度〕
１．０×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌ
〔ＨＡ〕
野生型ＨＡ複合体５（Ｈｉｓ－ＢＨＡ１－ＦＬＡＧ：Ｈｉｓ－ＢＨＡ２：Ｓｔｒｅｐ－ＢＨＡ３）
添加濃度：４０ｎＭ
〔観察装置〕
ＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）
図１３に示すように、ＨＡ複合体の添加によって小さく分割させた細胞集塊を培養することによって、再び凝集塊が形成された。また、ＨＡ複合体の添加時間（ＨＡ添加から培地交換までの時間）に対して、添加時間が６時間の場合が最も分割の度合いが強く、１２時間以降では分割されにくくなるという傾向が確認された。これにより、培地内のＨＡ複合体が、細胞のエンドサイトーシス等によってＨＡ複合体が消化又は失活している可能性が示唆された。したがって、ＨＡ複合体により細胞集塊を分割させた後、ＨＡの除去操作を行わない場合であっても、ｉＰＳ細胞を再度凝集させて細胞集塊を形成できることが示唆された。一方、培地中に添加されたＨＡ複合体は、ＨＡ複合体に付したタグを標的とした吸着カラムを備え付け、培地を循環させることにより、ＨＡ複合体を強制的に培地から回収することが可能である。よって、ＨＡ複合体を自発的または強制的に除去・回収可能であるため、逸脱細胞の除去や細胞集塊の分割効果を適時に一時的または連続的に発揮でき、バイオリアクターでの自動運転を可能であることを示唆された。
（実施例６）
［Ｂ型変異型ＨＡ複合体がｉＰＳ細胞集塊に及ぼす影響（その３）］
図１４に示す手順でｉＰＳ細胞の培養を行った。まず、バイオリアクターでｉＰＳ細胞を１２０時間浮遊培養してｉＰＳ細胞の細胞集塊を形成した。ついでＢ型変異型ＨＡ複合体を添加し、６時間ＨＡ処理した後、ピペッティングにより細胞集塊を分割し、ついで１０μＭ ＲＯＣＫインヒビターを添加しさらに浮遊培養を行った。また、２４時間ごとに生細胞濃度の測定を行った。その結果の一例を図１５に示す。
〔細胞〕
ヒトｉＰＳ細胞（Ｔｉｃ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｇｌｏｂａｌ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎｐ．５２）
〔培地〕
ｍＴｅＳＲ１（Ｃａｔａ ＃０５８０／０５８９６，ＳＴＥＭＣＥＬＬ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ）
〔培養環境〕
３７℃，５％ＣＯ2雰囲気下
〔培養容器〕
２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃａｔ．Ｎｏ．３５２６）
〔播種密度〕
１．０×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌ
〔ＨＡ〕
Ｂ型変異型ＨＡ複合体（タグ（結合箇所、種類）ＨＡ１：Ｃ末端ＦＬＡＧ、ＨＡ２：Ｎ末端ＦＬＡＧ、ＨＡ３：Ｎ末端Ｓｔｒｅｐ）
添加濃度：１０ｎＭ
〔観察装置〕
ＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）
［Ｂ型変異型ＨＡ複合体がｉＰＳ細胞集塊に及ぼす影響（その３）］
図１４に示す手順でｉＰＳ細胞の培養を行った。まず、バイオリアクターでｉＰＳ細胞を１２０時間浮遊培養してｉＰＳ細胞の細胞集塊を形成した。ついでＢ型変異型ＨＡ複合体を添加し、６時間ＨＡ処理した後、ピペッティングにより細胞集塊を分割し、ついで１０μＭ ＲＯＣＫインヒビターを添加しさらに浮遊培養を行った。また、２４時間ごとに生細胞濃度の測定を行った。その結果の一例を図１５に示す。
〔細胞〕
ヒトｉＰＳ細胞（Ｔｉｃ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｇｌｏｂａｌ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎｐ．５２）
〔培地〕
ｍＴｅＳＲ１（Ｃａｔａ ＃０５８０／０５８９６，ＳＴＥＭＣＥＬＬ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ）
〔培養環境〕
３７℃，５％ＣＯ2雰囲気下
〔培養容器〕
２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃａｔ．Ｎｏ．３５２６）
〔播種密度〕
１．０×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌ
〔ＨＡ〕
Ｂ型変異型ＨＡ複合体（タグ（結合箇所、種類）ＨＡ１：Ｃ末端ＦＬＡＧ、ＨＡ２：Ｎ末端ＦＬＡＧ、ＨＡ３：Ｎ末端Ｓｔｒｅｐ）
添加濃度：１０ｎＭ
〔観察装置〕
ＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）
ＨＡ処理後のピペッティングによって小さな塊に分割された細胞集塊が、その後の培養により再凝集して細胞集塊を形成することが確認できた。よって、細胞のエンドサイトーシス等によってＨＡ複合体が消化又は失活していることが示唆された。また、図１５に示すように、培養日数とともに生細胞濃度が増加することが確認できた。したがって、ＨＡ処理による細胞分割操作を活用することによって、ｉＰＳ細胞の高密度培養プロセスを実現することができた。
（実施例７）
［Ｂ型変異型ＨＡ複合体がｉＰＳ細胞集塊に及ぼす影響（その４）］
図１６に示す手順でｉＰＳ細胞の培養を行った。まず、バイオリアクターにｉＰＳ細胞を入れ、ついで１０μＭ ＲＯＣＫインヒビターを添加し、２４時間ＲＯＣＫインヒビター処理を行った後、１２０時間浮遊培養してｉＰＳ細胞の細胞集塊を形成した。ついでＢ型変異型ＨＡ複合体を添加し、６時間ＨＡ処理した後、ピペッティングにより細胞集塊を分割した。ついで１０μＭ ＲＯＣＫインヒビターを添加し、１８時間ＲＯＣＫインヒビター処理を行った後、さらに１２時間浮遊培養を行った。なお、２４時間ごとに培地交換及び生細胞濃度の測定を行った。その結果の一例を図１７に示す。
〔細胞〕
ヒトｉＰＳ細胞（Ｔｉｃ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｇｌｏｂａｌ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎｐ．５２）
〔培地〕
ｍＴｅＳＲ１（Ｃａｔａ ＃０５８０／０５８９６，ＳＴＥＭＣＥＬＬ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ）
〔培養環境〕
３７℃，５％ＣＯ2雰囲気下
〔培養容器〕
２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃａｔ．Ｎｏ．３５２６）
〔播種密度〕
１．０×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌ
〔ＨＡ〕
Ｂ型変異型ＨＡ複合体（タグ（結合箇所、種類）ＨＡ１：Ｃ末端ＦＬＡＧ、ＨＡ２：Ｎ末端ＦＬＡＧ、ＨＡ３：Ｎ末端Ｓｔｒｅｐ）
添加濃度：１０ｎＭ
〔観察装置〕
ＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）
［Ｂ型変異型ＨＡ複合体がｉＰＳ細胞集塊に及ぼす影響（その４）］
図１６に示す手順でｉＰＳ細胞の培養を行った。まず、バイオリアクターにｉＰＳ細胞を入れ、ついで１０μＭ ＲＯＣＫインヒビターを添加し、２４時間ＲＯＣＫインヒビター処理を行った後、１２０時間浮遊培養してｉＰＳ細胞の細胞集塊を形成した。ついでＢ型変異型ＨＡ複合体を添加し、６時間ＨＡ処理した後、ピペッティングにより細胞集塊を分割した。ついで１０μＭ ＲＯＣＫインヒビターを添加し、１８時間ＲＯＣＫインヒビター処理を行った後、さらに１２時間浮遊培養を行った。なお、２４時間ごとに培地交換及び生細胞濃度の測定を行った。その結果の一例を図１７に示す。
〔細胞〕
ヒトｉＰＳ細胞（Ｔｉｃ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｇｌｏｂａｌ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎｐ．５２）
〔培地〕
ｍＴｅＳＲ１（Ｃａｔａ ＃０５８０／０５８９６，ＳＴＥＭＣＥＬＬ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ）
〔培養環境〕
３７℃，５％ＣＯ2雰囲気下
〔培養容器〕
２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃａｔ．Ｎｏ．３５２６）
〔播種密度〕
１．０×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌ
〔ＨＡ〕
Ｂ型変異型ＨＡ複合体（タグ（結合箇所、種類）ＨＡ１：Ｃ末端ＦＬＡＧ、ＨＡ２：Ｎ末端ＦＬＡＧ、ＨＡ３：Ｎ末端Ｓｔｒｅｐ）
添加濃度：１０ｎＭ
〔観察装置〕
ＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）
コントロールとして、図１６に示すように通常の継代培養法によるｉＰＳ細胞の培養を行った。すなわち、ＨＡ処理及び培養開始後１５０時間及び１９８時間のＲＯＣＫインヒビター処理を行わなかった以外は、実施例７と同様にｉＰＳ細胞の培養を行った。その結果の一例を図１７に示す。
実施例７では、ＨＡ処理後のピペッティングによる細胞集塊の分割と、その後の培養による細胞集塊の再凝集とが確認できた。図１７に示すように、実施例６及びコントロールのいずれも培養開始２４ｈ後から生細胞濃度が増加し迅速な増殖が確認されたが、培養開始１４４ｈ付近では増殖速度が穏やかに減少し、ＨＡ処理を行わないコントロールでは、１４４ｈ以降では増殖(生細胞濃度の増加)が遅くなり、１６８ｈ以降では生細胞濃度が１．５×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌ付近で増殖がほとんど確認できなくなった。一方、培養開始１４４ｈ後にＨＡ処理を行った実施例６では、１度低下していた増殖速度が再び回復し、１４４ｈ以降においても細胞の増殖が確認された。また、培養開始１９２ｈ後に２回目のＨＡ処理を行ったところ、緩やかだった増殖速度の回復が確認され、２１６ｈ培養後の最終的な生細胞濃度は、実施例６は３．３６×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌであった（コントロールは１．６８×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）。以上より、ＨＡ処理による細胞分割操作法を利用した培養法は通常の継代培養法と比べて細胞増殖能が維持されｉＰＳ細胞の高密度培養が可能であることが分かった．
（実施例８）
［Ａ型変異型ＨＡ複合体がｉＰＳ細胞に及ぼす影響］
下記表４に示すＡ型野生型ＨＡ複合体及びＡ型変異型ＨＡ複合体を作製した。これらのＨＡ複合体は、T. Matsumura et al., Nature Communications 2015 Feb 17;6:6255. doi: 10.1038/ncomms7255に基づき作製した。なお、プラスミド作製時における各サブコンポーネントのタンパク質としては、ＨＡ１はＣ末端にＦＬＡＧタグが結合した組み換えタンパク質、ＨＡ２はＮ末端にＦＬＡＧタグが結合した組み換えタンパク質、ＨＡ３はＮ末端にＳｔｒｅｐタグが結合した組み換えタンパク質を使用した。
［Ａ型変異型ＨＡ複合体がｉＰＳ細胞に及ぼす影響］
下記表４に示すＡ型野生型ＨＡ複合体及びＡ型変異型ＨＡ複合体を作製した。これらのＨＡ複合体は、T. Matsumura et al., Nature Communications 2015 Feb 17;6:6255. doi: 10.1038/ncomms7255に基づき作製した。なお、プラスミド作製時における各サブコンポーネントのタンパク質としては、ＨＡ１はＣ末端にＦＬＡＧタグが結合した組み換えタンパク質、ＨＡ２はＮ末端にＦＬＡＧタグが結合した組み換えタンパク質、ＨＡ３はＮ末端にＳｔｒｅｐタグが結合した組み換えタンパク質を使用した。
フィーダ細胞上にｉＰＳ細胞を播種し（ｄａｙ０）、２４時間ごとに維持培地で培地交換した。３日後（ｄａｙ３）においてＨＡ複合体（Ａ型野生型ＨＡ複合体又はＡ型変異型ＨＡ複合体）を添加し２４時間インキュベートし、ＰＢＳで２度洗浄して維持培地で培地交換した（ｄａｙ４）。その後、７日後（ｄａｙ７）まで２４時間ごとに維持培地で培地交換した。使用した細胞、培地、及び培養条件は以下のとおりである。
〔細胞〕
ｉＰＳ細胞：Ｔｉｃ（ＭＥＦで維持していたＴｉｃを継代し、ＳＮＬ細胞上に播種したもの、ＮＰ１３）
フィーダ細胞：ＳＮＬ
〔培地〕
ｉＰＳ細胞：Ｒｅｐｒｏ Ｓｔｅｍ（商品名、ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ社製）、５ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦ（ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ社製）
フィーダ細胞：ＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ社製）（７％ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ社製），１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＮＡＣＡＬＡＩ ＴＥＳＱＵＥ社製））
〔容器〕
１２ウェルプレート（培養面積：３．８ｃｍ2／ウェル、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）
〔ＨＡ調製・添加方法〕
培地（Ｒｅｐｒｏ Ｓｔｅｍ）にｂＦＧＦ（終濃度５ｎｇ／ｍｌ）を加え、希釈培地を準備した。上記表４に示すＡ型変異型ＨＡ複合体２～４を、希釈培地を用いて希釈し（終濃度：１００ｎＭ）し、それをウェルに添加した。
〔培養条件〕
３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下
ｉＰＳ細胞の継代後、３日後（ｄａｙ３）の培地交換において、ＨＡ複合体添加し、２４時間培養した。その後、４日後（ｄａｙ４）の培地交換において、ＨＡ複合体無添加の培地に切り替え、培養を継続した。
〔観察〕
ｄａｙ３、ｄａｙ４、ｄａｙ５及びｄａｙ７において、ＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ ２０００（商品名、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）で培養細胞を観察し画像を取得した。撮影は倍率４倍で行った。得られた顕微鏡観察写真を図１８及び１９に示す。図１８～２０において、上図において実線で囲んだ部分を下図に示す。
〔細胞〕
ｉＰＳ細胞：Ｔｉｃ（ＭＥＦで維持していたＴｉｃを継代し、ＳＮＬ細胞上に播種したもの、ＮＰ１３）
フィーダ細胞：ＳＮＬ
〔培地〕
ｉＰＳ細胞：Ｒｅｐｒｏ Ｓｔｅｍ（商品名、ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ社製）、５ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦ（ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ社製）
フィーダ細胞：ＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ社製）（７％ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ社製），１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＮＡＣＡＬＡＩ ＴＥＳＱＵＥ社製））
〔容器〕
１２ウェルプレート（培養面積：３．８ｃｍ2／ウェル、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）
〔ＨＡ調製・添加方法〕
培地（Ｒｅｐｒｏ Ｓｔｅｍ）にｂＦＧＦ（終濃度５ｎｇ／ｍｌ）を加え、希釈培地を準備した。上記表４に示すＡ型変異型ＨＡ複合体２～４を、希釈培地を用いて希釈し（終濃度：１００ｎＭ）し、それをウェルに添加した。
〔培養条件〕
３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下
ｉＰＳ細胞の継代後、３日後（ｄａｙ３）の培地交換において、ＨＡ複合体添加し、２４時間培養した。その後、４日後（ｄａｙ４）の培地交換において、ＨＡ複合体無添加の培地に切り替え、培養を継続した。
〔観察〕
ｄａｙ３、ｄａｙ４、ｄａｙ５及びｄａｙ７において、ＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ ２０００（商品名、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）で培養細胞を観察し画像を取得した。撮影は倍率４倍で行った。得られた顕微鏡観察写真を図１８及び１９に示す。図１８～２０において、上図において実線で囲んだ部分を下図に示す。
図１８はＡ型変異型ＨＡ複合体２（ＨＡ３ Ｒ５２８Ａ）の顕微鏡写真及び図１９はＡ型変異型ＨＡ複合体３（ＨＡ１ Ｎ２８５Ａ／ＨＡ３ Ｒ５２８Ａ）の顕微鏡写真を示す。
比較例３として、カドヘリン結合活性消失変異体であるＡ型変異型ＨＡ複合体４（ＨＡ３ Ｋ６０７Ａ）を用いた以外は、上記実施例と同様にしてｉＰＳ細胞の培養を行った。コントロールとして、ＨＡ複合体を添加しない以外は、実施例と同様にしてｉＰＳ細胞の培養を行った。得られた顕微鏡観察写真をそれぞれ図２０及び２１に示す。
図１８及び１９に示すように、糖鎖結合活性を欠失させたいずれのＡ型変異型ＨＡ複合体２及び３においても、Ａ型変異型ＨＡ複合体添加から２４時間後（ｄａｙ３）で、コロニー中心の未分化逸脱細胞の細胞間接着がゆるくなり、未分化逸脱細胞の細胞間接着の阻害が確認できたと共に、細胞の剥離が確認された。特に、Ａ型変異型ＨＡ複合体３（ＨＡ１ Ｎ２８５Ａ／ＨＡ３ Ｒ５２８Ａ）では、Ａ型野生型ＨＡ複合体及びＡ型変異型ＨＡ複合体２と比較して細胞剥離の効果が高いことが認められた。一方、ＨＡ複合体無添加のコントロール及びカドヘリン結合活性消失変異体である比較例３の変異型ＨＡ複合体４（ＨＡ３ Ｋ６０７Ａ）は、細胞間接着の阻害及び細胞の剥離は確認されなかった（図２０及び２１）。このため、糖鎖結合活性を欠失させたＡ型変異型ＨＡ複合体２及び３によって、局所的な細胞－細胞間接着の阻害が可能であるとともに、効率よい未分化逸脱細胞の剥離が可能であることが示唆された。
（実施例９）
［Ａ型変異型ＨＡ複合体がｉＰＳ細胞集塊に及ぼす影響］
非接着性培地容器６０ｍｍ ｄｉｓｈ（Ｔｈｅｒｍｏ： Ｎｕｎｃｌｏｎ Ｓｐｈｅｒｅ）にｉＰＳ細胞を播種し（４．２×１０6ｃｅｌｌｓ／６０ｍｍ ｄｉｓｈ）、培養してｉＰＳ細胞集塊を作成した。培養４日目（ｄａｙ４）まで毎日培地交換を行った。培養４日目（ｄａｙ４）にｉＰＳ細胞集塊を２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに移し、ＨＡ添加前の写真を撮影した後、ＨＡ複合体を添加した（終濃度：４０ｎＭ）。ＨＡ添加から６、１２、１８又は２４時間後にピペッティングを行い、ピペッティング前後に細胞集塊の観察をするとともに、細胞集塊が分割するかどうかの確認を行った。ピペッティング後、２４時間さらに培養を行い、細胞集塊の観察を行った。使用した細胞、培地、ＨＡ複合体及び培養条件等は以下のとおりである。また、Ａ型野生型ＨＡ複合体及びＡ型変異型ＨＡ複合体は実施例８で作製したものと同様のものを使用した。
〔細胞〕
ヒトｉＰＳ細胞（Ｔｉｃ（ｉＭａｔｒｉｘ－５１１（ｎｉｐｐｉ）で維持していたｉＰＳ細胞、ＮＰ１９））
〔培地〕
ｍＴｅＳＲ１（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
〔ＨＡ〕
Ａ型野生型ＨＡ複合体
Ａ型変異型ＨＡ複合体１（ＨＡ１ Ｎ２８５Ａ）
Ａ型変異型ＨＡ複合体２（ＨＡ３ Ｒ５２８Ａ）
Ａ型変異型ＨＡ複合体３（ＨＡ１ Ｎ２８５Ａ／ＨＡ３ Ｒ５２８Ａ）
Ａ型変異型ＨＡ複合体４（ＨＡ３ Ｋ６０７Ａ）
〔ＨＡ調製・添加方法〕
ＰＢＳでＨＡ複合体を段階希釈し、さらに、培地（ｍＴｅＳＲ１）を用いて希釈したもの（終濃度：１００ｎＭ）をウェルに添加した。
〔培養条件〕
３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下
〔観察〕
全視野をＩｎ Ｃｅｌｌ Ａａｎａｌｙｚｅｒ（商品名、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて細胞集塊を観察した。
［Ａ型変異型ＨＡ複合体がｉＰＳ細胞集塊に及ぼす影響］
非接着性培地容器６０ｍｍ ｄｉｓｈ（Ｔｈｅｒｍｏ： Ｎｕｎｃｌｏｎ Ｓｐｈｅｒｅ）にｉＰＳ細胞を播種し（４．２×１０6ｃｅｌｌｓ／６０ｍｍ ｄｉｓｈ）、培養してｉＰＳ細胞集塊を作成した。培養４日目（ｄａｙ４）まで毎日培地交換を行った。培養４日目（ｄａｙ４）にｉＰＳ細胞集塊を２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに移し、ＨＡ添加前の写真を撮影した後、ＨＡ複合体を添加した（終濃度：４０ｎＭ）。ＨＡ添加から６、１２、１８又は２４時間後にピペッティングを行い、ピペッティング前後に細胞集塊の観察をするとともに、細胞集塊が分割するかどうかの確認を行った。ピペッティング後、２４時間さらに培養を行い、細胞集塊の観察を行った。使用した細胞、培地、ＨＡ複合体及び培養条件等は以下のとおりである。また、Ａ型野生型ＨＡ複合体及びＡ型変異型ＨＡ複合体は実施例８で作製したものと同様のものを使用した。
〔細胞〕
ヒトｉＰＳ細胞（Ｔｉｃ（ｉＭａｔｒｉｘ－５１１（ｎｉｐｐｉ）で維持していたｉＰＳ細胞、ＮＰ１９））
〔培地〕
ｍＴｅＳＲ１（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
〔ＨＡ〕
Ａ型野生型ＨＡ複合体
Ａ型変異型ＨＡ複合体１（ＨＡ１ Ｎ２８５Ａ）
Ａ型変異型ＨＡ複合体２（ＨＡ３ Ｒ５２８Ａ）
Ａ型変異型ＨＡ複合体３（ＨＡ１ Ｎ２８５Ａ／ＨＡ３ Ｒ５２８Ａ）
Ａ型変異型ＨＡ複合体４（ＨＡ３ Ｋ６０７Ａ）
〔ＨＡ調製・添加方法〕
ＰＢＳでＨＡ複合体を段階希釈し、さらに、培地（ｍＴｅＳＲ１）を用いて希釈したもの（終濃度：１００ｎＭ）をウェルに添加した。
〔培養条件〕
３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下
〔観察〕
全視野をＩｎ Ｃｅｌｌ Ａａｎａｌｙｚｅｒ（商品名、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて細胞集塊を観察した。
コントロールとして、ＨＡ複合体を添加しない以外は、上記と同様にして行った。
以上の結果を下記表５に示す。
Ａ型野生型複合体は、Ｂ型野生型ＨＡ複合体及びＢ型変異型ＨＡ複合体１～３と同様のレベルで細胞集塊を分解することができた。Ａ型変異型ＨＡ複合体１～３は、同じ濃度条件で行った場合、Ａ型野生型複合体、Ｂ型野生型ＨＡ複合体及びＢ型変異型ＨＡ複合体１～３よりもさらに小さな塊に分割することができた。一方、カドヘリン結合活性消失変異体である比較例１の変異型ＨＡ複合体４（ＨＡ３ Ｋ６０７Ａ）の添加では細胞集塊の分割は殆どみられず、コントロール（ＨＡ複合体未添加）では細胞集塊は分割しなかった。
配列番号１：Ｂ型ボツリヌス菌由来の野生型ヘマグルチニンのサブコンポーネントＨＡ１
配列番号２：Ｂ型ボツリヌス菌由来の野生型ヘマグルチニンのサブコンポーネントＨＡ２
配列番号３：Ｂ型ボツリヌス菌由来の野生型ヘマグルチニンのサブコンポーネントＨＡ３
配列番号４：Ｂ型変異型ＨＡ１（ＨＡ１ Ｎ２８６Ａ）
配列番号５：Ｂ型変異型ＨＡ３（ＨＡ３ Ｒ５２８Ａ）
配列番号６：Ｂ型変異型ＨＡ３Ｘ（ＨＡ３ Ｋ６０７Ａ）
配列番号７：ＦＬＡＧタグ
配列番号８：Ｓｔｒｅｐタグ
配列番号９～１４：プライマー
配列番号１５：Ｄ４タグ
配列番号１６：Ａ型ボツリヌス菌由来の野生型ヘマグルチニンのサブコンポーネントＨＡ１
配列番号１７：Ａ型ボツリヌス菌由来の野生型ヘマグルチニンのサブコンポーネントＨＡ２
配列番号１８：Ａ型ボツリヌス菌由来の野生型ヘマグルチニンのサブコンポーネントＨＡ３
配列番号２：Ｂ型ボツリヌス菌由来の野生型ヘマグルチニンのサブコンポーネントＨＡ２
配列番号３：Ｂ型ボツリヌス菌由来の野生型ヘマグルチニンのサブコンポーネントＨＡ３
配列番号４：Ｂ型変異型ＨＡ１（ＨＡ１ Ｎ２８６Ａ）
配列番号５：Ｂ型変異型ＨＡ３（ＨＡ３ Ｒ５２８Ａ）
配列番号６：Ｂ型変異型ＨＡ３Ｘ（ＨＡ３ Ｋ６０７Ａ）
配列番号７：ＦＬＡＧタグ
配列番号８：Ｓｔｒｅｐタグ
配列番号９～１４：プライマー
配列番号１５：Ｄ４タグ
配列番号１６：Ａ型ボツリヌス菌由来の野生型ヘマグルチニンのサブコンポーネントＨＡ１
配列番号１７：Ａ型ボツリヌス菌由来の野生型ヘマグルチニンのサブコンポーネントＨＡ２
配列番号１８：Ａ型ボツリヌス菌由来の野生型ヘマグルチニンのサブコンポーネントＨＡ３
Claims (19)
- Ｂ型ボツリヌス菌由来の変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質であって、
前記複合体タンパク質は、
Ｂ型ボツリヌス菌由来のヘマグルチニンのサブコンポーネントＨＡ２及びＨＡ３を少なくとも含み、
Ｅ－カドヘリン結合部位を構成するアミノ酸配列を有し、かつ、
糖鎖結合部位を構成するアミノ酸の少なくとも一つが変異した、変異型ヘマグルチニン複合タンパク質。 - 前記複合体タンパク質は、Ｂ型ボツリヌス菌由来のヘマグルチニンのサブコンポーネントＨＡ１をさらに含む、請求項１記載の変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質。
- 前記糖鎖結合部位を構成するアミノ酸は、前記ＨＡ１の野生型のアミノ酸配列の２６４番目のアスパラギンに相当するアミノ酸、前記ＨＡ１の野生型のアミノ酸配列の２８６番目のアスパラギンに相当するアミノ酸、及び前記ＨＡ３の野生型のアミノ酸配列の５２８番目のアルギニンに相当するアミノ酸からなる群から選択される、請求項２記載の変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質。
- Ｂ型ボツリヌス菌由来の変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質であって、
前記複合体タンパク質は、サブコンポーネントＨＡ１、ＨＡ２及びＨＡ３によって形成され、
前記サブコンポーネントＨＡ１の野生型のアミノ酸配列の２８６番目のアスパラギンに相当するアミノ酸、及び前記サブコンポーネントＨＡ３の野生型のアミノ酸配列の５２８番目のアルギニンに相当するアミノ酸の一方のアミノ酸又は双方のアミノ酸が変異した、変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質。 - 前記サブコンポーネントＨＡ１のＣ末端にタグが結合している、請求項１から４のいずれかに記載の変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質。
- 多能性（pluripotency）を有する幹細胞の培養方法であって、請求項１から５のいずれかに記載の変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質の存在下で細胞培養することを含む、方法。
- 前記細胞培養は、接着培養又は浮遊培養である、請求項６記載の方法。
- 多能性（pluripotency）を有する幹細胞の培養中に発生した又は発生しうる未分化状態を脱した細胞を除去する方法であって、請求項１から５のいずれかに記載の変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質の存在下で細胞培養することを含む、方法。
- 多能性（pluripotency）を有する幹細胞の未分化状態を維持する方法であって、請求項１から５のいずれかに記載の変異型ＨＡ複合体タンパク質の存在下で細胞培養することを含む、方法。
- ヒト由来のｉＰＳ細胞の培養方法であって、ボツリヌス菌由来のヘマグルチニン存在下で前記ｉＰＳ細胞を浮遊培養することを含む、方法。
- 前記ｉＰＳ細胞の細胞集塊をボツリヌス菌由来のヘマグルチニン存在下で浮遊培養することによって、前記細胞集塊を小塊に分割すること、及び
前記小塊を浮遊培養して新たな細胞集塊を形成させることを含み、
前記細胞集塊の形成を、前記細胞集塊の分割と同じ培地内で行う、請求項１０記載の方法。 - ヒト由来のｉＰＳ細胞の細胞集塊の分割方法であって、ボツリヌス菌由来のヘマグルチニン存在下で前記ｉＰＳ細胞を浮遊培養することを含む、方法。
- 前記ボツリヌス菌由来のへマグルチンは、エンドサイトーシスによって取り込まれる、請求項１０から１２のいずれかに記載の方法。
- 前記ボツリヌス菌由来のヘマグルチニンは、Ａ型ボツリヌス菌由来のヘマグルチニン及びＢ型ボツリヌス菌由来のヘマグルチニンからなる群から選択される、請求項１０から１３のいずれかに記載の方法。
- 多能性を有する幹細胞用の培地成分と、請求項１から５のいずれかに記載の変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質とを含む、キット。
- ボツリヌス菌由来の変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質を含む組成物であって、
前記複合体タンパク質は、
ボツリヌス菌由来のヘマグルチニンのサブコンポーネントＨＡ２及びＨＡ３を少なくとも含み、
Ｅ－カドヘリン結合部位を構成するアミノ酸配列を有し、かつ、
糖鎖結合部位を構成するアミノ酸の少なくとも一つが変異した、変異型ヘマグルチニン複合タンパク質であり、
多能性（pluripotency）を有する幹細胞の培養中に発生した又は発生しうる未分化状態を脱した細胞を除去するために用いる、又はヒト由来のｉＰＳ細胞を浮遊培養するために用いる、組成物。 - 前記ボツリヌス菌は、Ａ型ボツリヌス菌又はＢ型ボツリヌス菌である、請求項１６記載の組成物。
- 前記複合体タンパク質は、ボツリヌス菌由来のヘマグルチニンのサブコンポーネントＨＡ１をさらに含む、請求項１６又は１７に記載の組成物。
- 前記糖鎖結合部位を構成するアミノ酸は、
Ａ型ボツリヌス菌の場合、前記ＨＡ１の野生型のアミノ酸配列の２６３番目のアスパラギンに相当するアミノ酸、前記ＨＡ１の野生型のアミノ酸配列の２８５番目のアスパラギンに相当するアミノ酸、及び前記ＨＡ３の野生型のアミノ酸配列の５２８番目のアルギニンに相当するアミノ酸からなる群から選択され、
Ｂ型ボツリヌス菌の場合、前記ＨＡ１の野生型のアミノ酸配列の２６４番目のアスパラギンに相当するアミノ酸、前記ＨＡ１の野生型のアミノ酸配列の２８６番目のアスパラギンに相当するアミノ酸、及び前記ＨＡ３の野生型のアミノ酸配列の５２８番目のアルギニンに相当するアミノ酸からなる群から選択される、請求項１８記載の組成物。
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