JPWO2015199243A1 - 変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質、及びそれを用いた多能性を有する幹細胞の培養方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本開示において、多能性を有する幹細胞は、限定されない一又は複数の実施形態において、ヒト多能性(pluripotent)幹細胞である。本開示において、ヒト多能性幹細胞は、限定されない一又は複数の実施形態において、ヒトiPS細胞又はヒトES細胞である。
本開示において未分化状態を脱した細胞(未分化逸脱細胞)とは、限定されない一又は複数の実施形態において、細胞の形態が未分化状態の細胞のそれとは異なり、判別可能である。未分化逸脱細胞となったことは、限定されない一又は複数の実施形態において、未分化マーカーの消失で確認できる。未分化マーカーは、限定されない一又は複数の実施形態において、Oct3/4、Nanog、SSEA−4、TRA−1−60である。
本開示は、一又は複数の実施形態において、B型ボツリヌス菌由来の変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質(以下、「本開示の変異型HA複合体タンパク質」ともいう)に関する。本開示の変異型HA複合体タンパク質は、B型ボツリヌス菌由来のヘマグルチニンのサブコンポーネントHA2及びHA3を少なくとも含み、糖鎖結合部位を構成するアミノ酸の少なくとも一つが変異した変異型ヘマグルチニン複合タンパク質である。本開示の変異型HA複合体タンパク質は、一又は複数の実施形態において、E−カドヘリン結合部位を構成するアミノ酸配列を有し、かつ、糖鎖結合部位を構成するアミノ酸の少なくとも一つが変異した変異型ヘマグルチニン複合タンパク質である。また、本開示の変異型HA複合体タンパク質は、一又は複数の実施形態において、E−カドヘリン結合活性を有し、かつ、糖鎖結合部位を構成するアミノ酸の少なくとも一つが変異した変異型ヘマグルチニン複合タンパク質である。また、本開示の変異型HA複合体タンパク質は、一又は複数の実施形態において、E−カドヘリン機能阻害活性を有し、かつ、糖鎖結合部位を構成するアミノ酸の少なくとも一つが変異した変異型ヘマグルチニン複合タンパク質である。
本開示は、一態様において、多能性を有する幹細胞の培養方法であって、本開示の変異型HA複合体タンパク質の存在下で細胞培養することを含む(以下、「本開示の培養方法」ともいう)。本開示の培養方法によれば、本開示の変異型HA複合体タンパク質の存在下で細胞培養することから、一又は複数の実施形態において、未分化逸脱細胞を除去することができ、また、多能性を有する幹細胞の培養において構成されるコロニーを未分化状態に維持できるという効果を奏しうる。また、本開示の培養方法によれば、本開示の変異型HA複合体タンパク質の存在下で細胞培養することから、一又は複数の実施形態において、ヒト由来のiPS細胞のようにデリケートな細胞であっても、スフェロイド状の細胞集塊を効率よく分割でき、好ましくは多能性を有する幹細胞を効率よく大量に培養することができる。本開示の培養方法において、細胞培養は、一又は複数の実施形態において、接着培養(平面培養)、及び浮遊培養等が挙げられる。
本開示の培養方法の第一の実施形態として、接着培養により細胞培養を行うことが挙げられる。細胞培養が接着培養である場合、一又は複数の実施形態において、培養面上に形成されるコロニーから未分化逸脱細胞を除去できるという効果を奏しうる。したがって、本開示は、その他の態様において、多能性を有する幹細胞の培養中に発生した又は発生しうる未分化状態を脱した細胞を除去する方法であって、本開示の変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質の存在下で細胞培養することを含む方法に関する。また、本開示は、その他の態様において、未分化状態を脱した細胞が発生したコロニーから未分化状態の細胞からなるコロニーを形成する方法であって、本開示の変異型HA複合体タンパク質の存在下で前記未分化状態を脱した細胞が発生したコロニーを培養することを含む方法に関する。本開示は、その他の態様において、多能性を有する幹細胞の未分化状態を維持する方法であって、本開示の変異型HA複合体タンパク質の存在下で細胞培養することを含む方法に関する。
本開示の培養方法の第二の実施形態として、浮遊培養により細胞培養を行うことが挙げられる。細胞培養が浮遊培養である場合、一又は複数の実施形態において、ヒト由来のiPS細胞のようにデリケートな細胞であって細胞集塊を効率よく分割でき、好ましくは多能性を有する幹細胞を効率よく大量に培養することができる。したがって、本開示は、その他の態様において、多能性を有する幹細胞の細胞集塊の分割方法であって、本開示の変異型HA複合体タンパク質の存在下で、多能性を有する幹細胞を浮遊培養することを含む、多能性を有する幹細胞の細胞集塊の分割方法に関する。
本開示は、一又は複数の実施形態において、iPS細胞の培養方法であって、ボツリヌス菌由来のヘマグルチニン存在下で前記iPS細胞を浮遊培養することを含む方法(以下、「本開示のiPS細胞の培養方法」ともいう)に関する。本開示のiPS細胞の培養方法によれば、ヒト由来のiPS細胞のようにデリケートな細胞であってもスフェロイド状の細胞集塊を効率よく分割できることから、iPS細胞を効率よく大量に培養することができる。したがって、本開示は、一又は複数の実施形態において、iPS細胞の細胞集塊の分割方法であって、ボツリヌス菌由来のヘマグルチニン存在下でiPS幹細胞を浮遊培養することを含む方法(以下、「本開示の分割方法」ともいう)に関する。
本開示は、その他の態様において、ボツリヌス菌由来のヘマグルチニンを含む組成物(以下、「本開示の組成物」ともいう。)に関する。本開示の組成物は、本開示の培養方法、本開示の除去方法、本開示のコロニー形成方法、本開示の維持方法、及び/又は本開示の分割方法のために使用できる。したがって、本開示は、その他の態様において、本開示の培養方法、本開示の除去方法、本開示のコロニー形成方法、本開示の維持方法、及び/又は本開示の分割方法に用いる組成物であって、ボツリヌス菌由来のヘマグルチニンを含む組成物に関する。また、本開示は、その他の態様において、本開示の培養方法、本開示の除去方法、本開示のコロニー形成方法、本開示の維持方法、及び/又は本開示の分割方法におけるツリヌス由来のヘマグルチニンの使用に関する。ボツリヌス菌由来のヘマグルチニンとしては、一又は複数の実施形態において、上述のA型ボツリヌス菌由来のヘマグルチニン及びB型ボツリヌス菌由来のヘマグルチニン並びにこれらの複合体が挙げられ、B型ボツリヌス菌由来のヘマグルチニンとしては、一又は複数の実施形態において、本開示の変異型HA複合体、及び野生型HA複合体が挙げられる。
本開示は、その他の態様において、多能性を有する幹細胞用の培地成分と本開示の変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質とを含むキット(以下、「本開示のキット」ともいう。)に関する。本開示のキットにおける「変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質」は、上述のとおりである。本開示のキットは、本開示の培養方法、除去方法、コロニー形成方法、及び/又は維持方法のために使用できる。多能性を有する幹細胞用の培地成分は、特に限定されず、従来使用される又は今後開発されるものを使用できる。
本開示は、その他の態様において、ボツリヌス菌由来の変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質を含む、多能性を有する幹細胞の培養に用いる組成物(以下、「本開示の培養用組成物」)に関する。本開示の培養用組成物は、本開示の培養方法、本開示の除去方法、本開示のコロニー形成方法、本開示の維持方法、及び/又は本開示の分割方法のために使用できる。
〔A1〕 B型ボツリヌス菌由来の変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質であって、
前記複合体タンパク質は、
B型ボツリヌス菌由来のヘマグルチニンのサブコンポーネントHA2及びHA3を少なくとも含み、
糖鎖結合部位を構成するアミノ酸の少なくとも一つが変異した、変異型ヘマグルチニン複合タンパク質。
〔A2〕 B型ボツリヌス菌由来の変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質であって、
前記複合体タンパク質は、
B型ボツリヌス菌由来のヘマグルチニンのサブコンポーネントHA2及びHA3を少なくとも含み、
E−カドヘリン結合部位を構成するアミノ酸配列を有し、かつ、
糖鎖結合部位を構成するアミノ酸の少なくとも一つが変異した、変異型ヘマグルチニン複合タンパク質。
〔A3〕 前記複合体タンパク質は、B型ボツリヌス菌由来のヘマグルチニンのサブコンポーネントHA1をさらに含む、〔A1〕記載の変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質。
〔A4〕 前記糖鎖結合部位を構成するアミノ酸は、前記HA1の野生型のアミノ酸配列の264番目のアスパラギンに相当するアミノ酸、前記HA1の野生型のアミノ酸配列の286番目のアスパラギンに相当するアミノ酸、及び前記HA3の野生型のアミノ酸配列の528番目のアルギニンに相当するアミノ酸からなる群から選択される、〔A3〕記載の変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質。
〔A5〕 B型ボツリヌス菌由来の変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質であって、
前記複合体タンパク質は、サブコンポーネントHA1、HA2及びHA3によって形成され、
前記サブコンポーネントHA1の野生型のアミノ酸配列の286番目のアスパラギンに相当するアミノ酸、及び前記サブコンポーネントHA3の野生型のアミノ酸配列の528番目のアルギニンに相当するアミノ酸の一方のアミノ酸又は双方のアミノ酸が変異した、変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質。
〔A6〕 前記サブコンポーネントHA1のC末端にタグが結合している、〔A1〕から〔A5〕のいずれかに記載の変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質。
〔A8〕 前記複合体タンパク質は、E−カドヘリン機能阻害活性を有する、〔A1〕から〔A7〕のいずれかに記載の変異型ヘマグルチニン複合タンパク質。
〔A9〕 前記複合体タンパク質は、E−カドヘリン結合活性を有する、〔A1〕から〔A8〕のいずれかに記載の変異型ヘマグルチニン複合タンパク質。
〔A10〕 前記複合体タンパク質は、E−カドヘリン結合部位を構成するアミノ酸配列を有する、〔A1〕から〔A9〕のいずれかに記載の変異型ヘマグルチニン複合タンパク質。
〔B1〕 多能性(pluripotency)を有する幹細胞の培養方法であって、〔A1〕から〔A10〕のいずれかに記載の変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質の存在下で細胞培養することを含む、方法。
〔B2〕 前記細胞培養は、接着培養又は浮遊培養である、〔B1〕記載の方法。
〔C1〕 多能性(pluripotency)を有する幹細胞の培養中に発生した又は発生しうる未分化状態を脱した細胞を除去する方法であって、〔A1〕から〔A10〕のいずれかに記載の変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質の存在下で細胞培養することを含む、方法。
〔C2〕 多能性(pluripotency)を有する幹細胞の未分化状態を維持する方法であって〔A1〕から〔A10〕のいずれかに記載の変異型HA複合体タンパク質の存在下で細胞培養することを含む、方法。
〔D1〕 ヒト由来のiPS細胞の培養方法であって、ボツリヌス菌由来のヘマグルチニン存在下で前記iPS細胞を浮遊培養することを含む、方法。
〔D2〕 前記iPS細胞の細胞集塊をボツリヌス菌由来のヘマグルチニン存在下で浮遊培養することによって、前記細胞集塊を小塊に分割すること、及び
前記小塊を浮遊培養して新たな細胞集塊を形成させることを含み、
前記細胞集塊の形成を、前記細胞集塊の分割と同じ培地内で行う、〔D1〕記載の方法。
〔D3〕 ヒト由来のiPS細胞の細胞集塊の分割方法であって、ボツリヌス菌由来のヘマグルチニン存在下で前記iPS細胞を浮遊培養することを含む、方法。
〔D4〕 前記ボツリヌス菌由来のへマグルチンは、エンドサイトーシスによって取り込まれる、〔D1〕から〔D3〕のいずれかに記載の方法。
〔D5〕 前記ボツリヌス菌由来のヘマグルチニンは、A型ボツリヌス菌由来のヘマグルチニン及びB型ボツリヌス菌由来のヘマグルチニンからなる群から選択される、〔D1〕から〔D4〕のいずれかに記載の方法。
〔D6〕 前記B型ボツリヌス菌由来のヘマグルチニンは、請求項1から5のいずれかに記載の変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質を含む、〔D5〕記載の方法。
〔E1〕 ボツリヌス菌由来のヘマグルチニンを含む組成物であって、〔B1〕、〔B2〕、〔C1〕、〔C2〕及び〔D1〕から〔D6〕のいずれかに記載の方法に使用するための組成物。
〔F1〕 多能性を有する幹細胞用の培地成分と、〔A1〕から〔A10〕のいずれかに記載の変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質とを含む、キット。
〔F2〕 〔B1〕、〔B2〕、〔C1〕、〔C2〕及び〔D1〕から〔D6〕のいずれかに記載の方法に使用するための〔F1〕記載のキット。
〔G1〕 ボツリヌス菌由来の変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質を含む組成物であって、
前記複合体タンパク質は、
ボツリヌス菌由来のヘマグルチニンのサブコンポーネントHA2及びHA3を少なくとも含み、
E−カドヘリン結合部位を構成するアミノ酸配列を有し、かつ、
糖鎖結合部位を構成するアミノ酸の少なくとも一つが変異した、変異型ヘマグルチニン複合タンパク質であり、
前記組成物は、
多能性を有する幹細胞の培養中に発生した又は発生しうる未分化状態を脱した細胞を除去する方法、
多能性を有する幹細胞の未分化状態を維持する方法、
ヒト由来のiPS細胞を浮遊培養する方法、及び
ヒト由来のiPS細胞の細胞集塊の分割方法からなる群から選択されるいずれかの方法に使用するための組成物。
〔G2〕 前記ボツリヌス菌は、A型ボツリヌス菌又はB型ボツリヌス菌である、〔G1〕記載の組成物。
〔G3〕 前記複合体タンパク質は、ボツリヌス菌由来のヘマグルチニンのサブコンポーネントHA1をさらに含む、〔G1〕又は〔G2〕に記載の組成物。
〔G4〕 前記糖鎖結合部位を構成するアミノ酸は、
A型ボツリヌス菌の場合、前記HA1の野生型のアミノ酸配列の263番目のアスパラギンに相当するアミノ酸、前記HA1の野生型のアミノ酸配列の285番目のアスパラギンに相当するアミノ酸、及び前記HA3の野生型のアミノ酸配列の528番目のアルギニンに相当するアミノ酸からなる群から選択され、
B型ボツリヌス菌の場合、前記HA1の野生型のアミノ酸配列の264番目のアスパラギンに相当するアミノ酸、前記HA1の野生型のアミノ酸配列の286番目のアスパラギンに相当するアミノ酸、及び前記HA3の野生型のアミノ酸配列の528番目のアルギニンに相当するアミノ酸からなる群から選択される、〔G3〕記載の組成物。
〔H1〕 多能性を有する幹細胞の培養方法であって、〔G1〕から〔G4〕のいずれかに記載の組成物の存在下で細胞培養することを含む、方法。
〔H2〕 前記細胞培養は、接着培養又は浮遊培養である、〔H1〕記載の方法。
〔H3〕 多能性を有する幹細胞の培養中に発生した又は発生しうる未分化状態を脱した細胞を除去する方法であって、〔G1〕から〔G4〕のいずれかに記載の組成物の存在下で細胞培養することを含む、方法。
〔H4〕 多能性を有する幹細胞の未分化状態を維持する方法であって、〔G1〕から〔G4〕のいずれかに記載の組成物の存在下で細胞培養することを含む、方法。
[B型ボツリヌスHA複合体の作製]
下記表1に示すB型ボツリヌス菌由来の野生型HA複合体及び変異型HA複合体1〜4を次の手順に従い作製した。これらのHA複合体(野生型HA複合体及び変異型HA複合体)は、B型ボツリヌス菌由来の野生型HAサブコンポーネント(HA1、HA2、HA3)、変異型HA1(HA1 N286A、配列番号4)、変異型HA3(HA3 R528A、配列番号5)及び変異型HA3X(HA3 K607A、配列番号6)を使用して作製した。
(1)プラスミドの作製
野生型は、HA1、HA2及びHA3のそれぞれのタンパク質として以下のタンパク質をコードする遺伝子を、それぞれ下記のプライマーを用いてClostridium botulinum B−Okra株のゲノムDNAをテンプレートとして、PCR法により増幅した。
(各サブコンポーネントのタンパク質)
HA1:配列番号1のアミノ酸配列の7−294位のアミノ酸配列からなるタンパク質のC末端にFLAGタグが結合した組換えタンパク質
HA2:配列番号2のアミノ酸配列の2−146位のアミノ酸配列からなるタンパク質のN末端にFLAGタグが結合した組換えタンパク質
HA3:配列番号3のアミノ酸配列の19−626位のアミノ酸配列からなるタンパク質のN末端にStrepタグが結合した組換えタンパク質
(タグ配列)
FLAGタグ:DYKDDDDK(配列番号7)
Strepタグ:WSHPQFEK(配列番号8)
(HA1増幅用プライマー)
HA1 フォワードプライマー:catgccatgggcatccaaaattcattaaatgac(配列番号9)
HA1 リバースプライマー:cgggatccttacttgtcgtcatcgtctttgtagtctgggttactcatagtccatatc(配列番号10)
(BHA2増幅用プライマー)
HA2 フォワードプライマー:tgaataagctttcagctgaaagaacttttc(配列番号11)
HA2 リバースプライマー:cactttggtaccttatattttttcaagtttga(配列番号12)
(HA3増幅用プライマー)
HA3 フォワードプライマー:gaaaaagggtaccaatatagtgatactattg(配列番号13)
HA3 リバースプライマー:cgtgtcgacttaattagtaatatctatatgc(配列番号14)
変異型HA複合体1〜4(表1)は、変異体の作製は、野生型HAが挿入されたベクターを鋳型として、PCR によるsite−directed mutagenesis法によって行った。
増幅したDNA断片について、HA1はpET52b(+)のNcoI−BamHI siteに挿入し、HA2はpT7−FLAG−1(Sigma)のHindIII−SalI siteに挿入し、HA3についてはpET52b(+)(Novagen)のKpnI−SalI siteに挿入した(pET−BHA3)。
(2)タンパク質発現
作製したプラスミドはそれぞれ単独で大腸菌株Rosetta2(DE3)(Novagen)にトランスフォームした。タンパク質発現誘導はOvernight Express Autoinduction system 1(Novagen)を用いて行った。HA1及びHA3は30℃で36時間、HA2については18℃で40時間、タンパク質発現誘導を行った。大腸菌は遠心により回収し、−80℃で保存した。
(3)タンパク質精製及び複合体作製
HA1及びHA2は、Anti−FLAG M2 agarose(Sigma)を用いて精製を行った。HA3はStrepTrap HP(GE Healthcare)を用いて精製した。
それぞれ精製した組換え体タンパク質を、HA1:HA2:HA3=4:4:1のモル比で混合し、37℃で3時間インキュベートした後、StrepTrap HPにより精製することにより、HA複合体を得た。
[B型変異型HA複合体がiPS細胞に及ぼす影響]
フィーダ細胞上にiPS細胞を播種し(day0)、24時間ごとに維持培地で培地交換した。3日後(day3)においてHA複合体(野生型HA複合体又は変異型HA複合体)を添加し24時間インキュベートし、PBSで2度洗浄して維持培地で培地交換した(day4)。その後、9日後(day9)まで24時間ごとに維持培地で培地交換した。培養後、培養された細胞のOct3/4の発現を免疫細胞染色法で確認した。使用した細胞、培地、及び培養条件は以下のとおりである。
〔細胞〕
iPS細胞:Tic NP29(MEFで維持していたTicを継代したもの)
フィーダ細胞:SNL 76/7
〔培地〕
iPS細胞:Repro Stem(商品名、ReproCELL社製)、5ng/mL bFGF(ReproCELL社製)
フィーダ細胞:DMEM(Sigma社製)(7%FBS(GIBCO社製),1%Penicillin−streptomycin solution(NACALAI TESQUE社製))
〔容器〕
12ウェルプレート(培養面積:3.8cm2/ウェル、Corning社製)
〔HA調製・添加方法〕
PBSでHA複合体を段階希釈し、さらに、培地(Repro Stem)を用いて希釈した(終濃度:100nM)。さらにbFGF(終濃度5ng/ml)を加え、それをウェルに添加した。
〔培養条件〕
37℃、5%CO2雰囲気下
iPS細胞の継代後、3日後(day3)の培地交換において、HA複合体を各濃度で添加し、24時間培養した。その後、4日後(day4)の培地交換において、HA複合体無添加の培地に切り替え、培養を継続した。
〔観察〕
day3、day4、day5及びday9において、IN Cell Analyzer 2000(商品名、GEヘルスケアバイオサイエンス社製)で培養細胞を観察し画像を取得した。得られた顕微鏡観察写真を図1〜4に示す。図1〜4において、上図において実線で囲んだ部分を下図に示す。
変異型HA複合体4(HA3 K607A)を用い、実施例2と同様の実験を行った。その結果を図5に示す。図5において、上図において実線で囲んだ部分を下図に示す。
サブコンポーネントHA1における286番目のアスバラギン及びHA3における528番目のアルギニンは、糖鎖認識部位であることが知られている。図2〜4に示すように、糖鎖結合活性を欠失させたいずれの変異型HA複合体1〜3においても、変異型HA複合体添加から24時間後(day3)で未分化逸脱細胞の細胞間接着がゆるくなり、未分化逸脱細胞の細胞間接着の阻害が確認できた。特に、変異型HA複合体2(HA3 R528A)は、コロニー中心の未分化逸脱細胞の細胞間接着を阻害すると共に、細胞の剥離が確認された、また、変異型HA複合体3(HA1 N286A/HA3 R528A)では、図4に示すように変異型HA複合体添加から24時間後(day3)で細胞間接着がゆるくなり、48時間後(day4)には、他の変異型HA及び野生型HAと比較して細胞剥離の効果が高いことが認められた(図4の矢印で示す部分)。さらに、培養9日目(day9)には未分化維持コロニーを形成していることが分かった。一方、カドヘリン結合活性消失変異体である比較例1の変異型HA複合体4(HA3 K607A)は、細胞間接着の阻害及び細胞の剥離は確認されなかった(図5)。このため、糖鎖結合活性を欠失させた変異型HA複合体1〜3によって、局所的な細胞−細胞間接着の阻害が可能であるとともに、特に変異型HA複合体2及び3によれば効率よい未分化逸脱細胞の剥離が可能であることが示唆された。
[B型HA複合体がiPS細胞に及ぼす影響(その2)]
下記表2に示すように異なる位置にタグを結合させた以外は実施例1と同様の手順で野生型HA複合体1〜5を作製した。
調製した野生型HA複合体1〜5を用いて、実施例2と同様にしてiPS細胞に及ぼす影響を確認した。その結果を図6〜10に示す。図6は野生型HA複合体1の顕微鏡写真、図7は野生型HA複合体2の顕微鏡写真、図8は野生型HA複合体3の顕微鏡写真、図9は野生型HA複合体4の顕微鏡写真、及び図10は野生型HA複合体5の顕微鏡写真を示す。
[B型変異型HA複合体がiPS細胞集塊に及ぼす影響(その1)]
96well−V bottom plateを用いてiPS細胞集塊を作成し、毎日半量培地交換を行った。培養3日目(day3)にiPS細胞集塊にHA複合体を添加した。培養4日目(day4)に、iPS細胞集塊を96well plate flat bottom plateに移し、軽いピペッティングを行い、細胞集塊が割れるかどうかを確認した。使用した細胞、培地、HA複合体及び培養条件等は以下のとおりである。
〔細胞〕
ヒトiPS細胞(Tic NP41(iMatrix−511(nippi)で維持していたiPS細胞))
〔培地〕
mTeSR1(STEMCELL Technologies)
〔容器〕
96well−V bottom plate(Sumitomo Bakelite)
〔HA〕
野生型HA複合体
変異型HA複合体1(HA1 N286A)
変異型HA複合体2(HA3 R528A)
変異型HA複合体3(HA1 N286A/HA3 R528A)
変異型HA複合体4(HA3 K607A)
〔HA調製・添加方法〕
PBSでHA複合体を段階希釈し、さらに、培地(mTeSR1)を用いて希釈したもの(終濃度:100nM)をウェルに添加した。
〔培養条件〕
37℃、5%CO2雰囲気下
〔観察〕
全視野をIn Cell Aanalyzer(商品名、GEヘルスケアバイオサイエンス社製)を用いて細胞集塊を観察し画像を取得した。撮影は、変異型HA複合体添加前後(day3及びday4)に倍率4倍で行った。得られた顕微鏡写真を図11及び12に示す。
[B型HA複合体がiPS細胞集塊に及ぼす影響(その2)]
前培養として30mlリアクターで5日間iPs細胞を培養した。培養5日目の細胞を24well plateに移しHA複合体を添加した。HA複合体添加から6、12、18又は24時間経過後、培地交換によってHAを取り除き、ピペッティングして細胞集塊を分割させた。その後培養を24時間行い、細胞集塊の形態を観察した。使用した細胞、培地、HA及び培養条件等は以下のとおりである。得られた顕微鏡写真を図13に示す。
〔細胞〕
ヒトiPS細胞(Tic, National Center for Global Health and Medicine,Np.52)
〔培地〕
mTeSR1(Cata #0580/05896,STEMCELL TECHNOLOGIES)
〔培養環境〕
37℃,5%CO2雰囲気下
〔培養容器〕
24well plate(Corning,Cat.No.3526)
〔播種密度〕
1.0×105cells/ml
〔HA〕
野生型HA複合体5(His−BHA1−FLAG:His−BHA2:Strep−BHA3)
添加濃度:40nM
〔観察装置〕
IN Cell Analyzer(GE Healthcare)
[B型変異型HA複合体がiPS細胞集塊に及ぼす影響(その3)]
図14に示す手順でiPS細胞の培養を行った。まず、バイオリアクターでiPS細胞を120時間浮遊培養してiPS細胞の細胞集塊を形成した。ついでB型変異型HA複合体を添加し、6時間HA処理した後、ピペッティングにより細胞集塊を分割し、ついで10μM ROCKインヒビターを添加しさらに浮遊培養を行った。また、24時間ごとに生細胞濃度の測定を行った。その結果の一例を図15に示す。
〔細胞〕
ヒトiPS細胞(Tic, National Center for Global Health and Medicine,Np.52)
〔培地〕
mTeSR1(Cata #0580/05896,STEMCELL TECHNOLOGIES)
〔培養環境〕
37℃,5%CO2雰囲気下
〔培養容器〕
24well plate(Corning,Cat.No.3526)
〔播種密度〕
1.0×105cells/ml
〔HA〕
B型変異型HA複合体(タグ(結合箇所、種類)HA1:C末端FLAG、HA2:N末端FLAG、HA3:N末端Strep)
添加濃度:10nM
〔観察装置〕
IN Cell Analyzer(GE Healthcare)
[B型変異型HA複合体がiPS細胞集塊に及ぼす影響(その4)]
図16に示す手順でiPS細胞の培養を行った。まず、バイオリアクターにiPS細胞を入れ、ついで10μM ROCKインヒビターを添加し、24時間ROCKインヒビター処理を行った後、120時間浮遊培養してiPS細胞の細胞集塊を形成した。ついでB型変異型HA複合体を添加し、6時間HA処理した後、ピペッティングにより細胞集塊を分割した。ついで10μM ROCKインヒビターを添加し、18時間ROCKインヒビター処理を行った後、さらに12時間浮遊培養を行った。なお、24時間ごとに培地交換及び生細胞濃度の測定を行った。その結果の一例を図17に示す。
〔細胞〕
ヒトiPS細胞(Tic, National Center for Global Health and Medicine,Np.52)
〔培地〕
mTeSR1(Cata #0580/05896,STEMCELL TECHNOLOGIES)
〔培養環境〕
37℃,5%CO2雰囲気下
〔培養容器〕
24well plate(Corning,Cat.No.3526)
〔播種密度〕
1.0×105cells/ml
〔HA〕
B型変異型HA複合体(タグ(結合箇所、種類)HA1:C末端FLAG、HA2:N末端FLAG、HA3:N末端Strep)
添加濃度:10nM
〔観察装置〕
IN Cell Analyzer(GE Healthcare)
[A型変異型HA複合体がiPS細胞に及ぼす影響]
下記表4に示すA型野生型HA複合体及びA型変異型HA複合体を作製した。これらのHA複合体は、T. Matsumura et al., Nature Communications 2015 Feb 17;6:6255. doi: 10.1038/ncomms7255に基づき作製した。なお、プラスミド作製時における各サブコンポーネントのタンパク質としては、HA1はC末端にFLAGタグが結合した組み換えタンパク質、HA2はN末端にFLAGタグが結合した組み換えタンパク質、HA3はN末端にStrepタグが結合した組み換えタンパク質を使用した。
〔細胞〕
iPS細胞:Tic(MEFで維持していたTicを継代し、SNL細胞上に播種したもの、NP13)
フィーダ細胞:SNL
〔培地〕
iPS細胞:Repro Stem(商品名、ReproCELL社製)、5ng/mL bFGF(ReproCELL社製)
フィーダ細胞:DMEM(Sigma社製)(7%FBS(GIBCO社製),1%Penicillin−streptomycin solution(NACALAI TESQUE社製))
〔容器〕
12ウェルプレート(培養面積:3.8cm2/ウェル、Corning社製)
〔HA調製・添加方法〕
培地(Repro Stem)にbFGF(終濃度5ng/ml)を加え、希釈培地を準備した。上記表4に示すA型変異型HA複合体2〜4を、希釈培地を用いて希釈し(終濃度:100nM)し、それをウェルに添加した。
〔培養条件〕
37℃、5%CO2雰囲気下
iPS細胞の継代後、3日後(day3)の培地交換において、HA複合体添加し、24時間培養した。その後、4日後(day4)の培地交換において、HA複合体無添加の培地に切り替え、培養を継続した。
〔観察〕
day3、day4、day5及びday7において、IN Cell Analyzer 2000(商品名、GEヘルスケアバイオサイエンス社製)で培養細胞を観察し画像を取得した。撮影は倍率4倍で行った。得られた顕微鏡観察写真を図18及び19に示す。図18〜20において、上図において実線で囲んだ部分を下図に示す。
[A型変異型HA複合体がiPS細胞集塊に及ぼす影響]
非接着性培地容器60mm dish(Thermo: Nunclon Sphere)にiPS細胞を播種し(4.2×106cells/60mm dish)、培養してiPS細胞集塊を作成した。培養4日目(day4)まで毎日培地交換を行った。培養4日目(day4)にiPS細胞集塊を24well plateに移し、HA添加前の写真を撮影した後、HA複合体を添加した(終濃度:40nM)。HA添加から6、12、18又は24時間後にピペッティングを行い、ピペッティング前後に細胞集塊の観察をするとともに、細胞集塊が分割するかどうかの確認を行った。ピペッティング後、24時間さらに培養を行い、細胞集塊の観察を行った。使用した細胞、培地、HA複合体及び培養条件等は以下のとおりである。また、A型野生型HA複合体及びA型変異型HA複合体は実施例8で作製したものと同様のものを使用した。
〔細胞〕
ヒトiPS細胞(Tic(iMatrix−511(nippi)で維持していたiPS細胞、NP19))
〔培地〕
mTeSR1(STEMCELL Technologies)
〔HA〕
A型野生型HA複合体
A型変異型HA複合体1(HA1 N285A)
A型変異型HA複合体2(HA3 R528A)
A型変異型HA複合体3(HA1 N285A/HA3 R528A)
A型変異型HA複合体4(HA3 K607A)
〔HA調製・添加方法〕
PBSでHA複合体を段階希釈し、さらに、培地(mTeSR1)を用いて希釈したもの(終濃度:100nM)をウェルに添加した。
〔培養条件〕
37℃、5%CO2雰囲気下
〔観察〕
全視野をIn Cell Aanalyzer(商品名、GEヘルスケアバイオサイエンス社製)を用いて細胞集塊を観察した。
配列番号2:B型ボツリヌス菌由来の野生型ヘマグルチニンのサブコンポーネントHA2
配列番号3:B型ボツリヌス菌由来の野生型ヘマグルチニンのサブコンポーネントHA3
配列番号4:B型変異型HA1(HA1 N286A)
配列番号5:B型変異型HA3(HA3 R528A)
配列番号6:B型変異型HA3X(HA3 K607A)
配列番号7:FLAGタグ
配列番号8:Strepタグ
配列番号9〜14:プライマー
配列番号15:D4タグ
配列番号16:A型ボツリヌス菌由来の野生型ヘマグルチニンのサブコンポーネントHA1
配列番号17:A型ボツリヌス菌由来の野生型ヘマグルチニンのサブコンポーネントHA2
配列番号18:A型ボツリヌス菌由来の野生型ヘマグルチニンのサブコンポーネントHA3
Claims (19)
- B型ボツリヌス菌由来の変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質であって、
前記複合体タンパク質は、
B型ボツリヌス菌由来のヘマグルチニンのサブコンポーネントHA2及びHA3を少なくとも含み、
E−カドヘリン結合部位を構成するアミノ酸配列を有し、かつ、
糖鎖結合部位を構成するアミノ酸の少なくとも一つが変異した、変異型ヘマグルチニン複合タンパク質。 - 前記複合体タンパク質は、B型ボツリヌス菌由来のヘマグルチニンのサブコンポーネントHA1をさらに含む、請求項1記載の変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質。
- 前記糖鎖結合部位を構成するアミノ酸は、前記HA1の野生型のアミノ酸配列の264番目のアスパラギンに相当するアミノ酸、前記HA1の野生型のアミノ酸配列の286番目のアスパラギンに相当するアミノ酸、及び前記HA3の野生型のアミノ酸配列の528番目のアルギニンに相当するアミノ酸からなる群から選択される、請求項2記載の変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質。
- B型ボツリヌス菌由来の変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質であって、
前記複合体タンパク質は、サブコンポーネントHA1、HA2及びHA3によって形成され、
前記サブコンポーネントHA1の野生型のアミノ酸配列の286番目のアスパラギンに相当するアミノ酸、及び前記サブコンポーネントHA3の野生型のアミノ酸配列の528番目のアルギニンに相当するアミノ酸の一方のアミノ酸又は双方のアミノ酸が変異した、変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質。 - 前記サブコンポーネントHA1のC末端にタグが結合している、請求項1から4のいずれかに記載の変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質。
- 多能性(pluripotency)を有する幹細胞の培養方法であって、請求項1から5のいずれかに記載の変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質の存在下で細胞培養することを含む、方法。
- 前記細胞培養は、接着培養又は浮遊培養である、請求項6記載の方法。
- 多能性(pluripotency)を有する幹細胞の培養中に発生した又は発生しうる未分化状態を脱した細胞を除去する方法であって、請求項1から5のいずれかに記載の変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質の存在下で細胞培養することを含む、方法。
- 多能性(pluripotency)を有する幹細胞の未分化状態を維持する方法であって、請求項1から5のいずれかに記載の変異型HA複合体タンパク質の存在下で細胞培養することを含む、方法。
- ヒト由来のiPS細胞の培養方法であって、ボツリヌス菌由来のヘマグルチニン存在下で前記iPS細胞を浮遊培養することを含む、方法。
- 前記iPS細胞の細胞集塊をボツリヌス菌由来のヘマグルチニン存在下で浮遊培養することによって、前記細胞集塊を小塊に分割すること、及び
前記小塊を浮遊培養して新たな細胞集塊を形成させることを含み、
前記細胞集塊の形成を、前記細胞集塊の分割と同じ培地内で行う、請求項10記載の方法。 - ヒト由来のiPS細胞の細胞集塊の分割方法であって、ボツリヌス菌由来のヘマグルチニン存在下で前記iPS細胞を浮遊培養することを含む、方法。
- 前記ボツリヌス菌由来のへマグルチンは、エンドサイトーシスによって取り込まれる、請求項10から12のいずれかに記載の方法。
- 前記ボツリヌス菌由来のヘマグルチニンは、A型ボツリヌス菌由来のヘマグルチニン及びB型ボツリヌス菌由来のヘマグルチニンからなる群から選択される、請求項10から13のいずれかに記載の方法。
- 多能性を有する幹細胞用の培地成分と、請求項1から5のいずれかに記載の変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質とを含む、キット。
- ボツリヌス菌由来の変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質を含む組成物であって、
前記複合体タンパク質は、
ボツリヌス菌由来のヘマグルチニンのサブコンポーネントHA2及びHA3を少なくとも含み、
E−カドヘリン結合部位を構成するアミノ酸配列を有し、かつ、
糖鎖結合部位を構成するアミノ酸の少なくとも一つが変異した、変異型ヘマグルチニン複合タンパク質であり、
多能性(pluripotency)を有する幹細胞の培養中に発生した又は発生しうる未分化状態を脱した細胞を除去するために用いる、又はヒト由来のiPS細胞を浮遊培養するために用いる、組成物。 - 前記ボツリヌス菌は、A型ボツリヌス菌又はB型ボツリヌス菌である、請求項16記載の組成物。
- 前記複合体タンパク質は、ボツリヌス菌由来のヘマグルチニンのサブコンポーネントHA1をさらに含む、請求項16又は17に記載の組成物。
- 前記糖鎖結合部位を構成するアミノ酸は、
A型ボツリヌス菌の場合、前記HA1の野生型のアミノ酸配列の263番目のアスパラギンに相当するアミノ酸、前記HA1の野生型のアミノ酸配列の285番目のアスパラギンに相当するアミノ酸、及び前記HA3の野生型のアミノ酸配列の528番目のアルギニンに相当するアミノ酸からなる群から選択され、
B型ボツリヌス菌の場合、前記HA1の野生型のアミノ酸配列の264番目のアスパラギンに相当するアミノ酸、前記HA1の野生型のアミノ酸配列の286番目のアスパラギンに相当するアミノ酸、及び前記HA3の野生型のアミノ酸配列の528番目のアルギニンに相当するアミノ酸からなる群から選択される、請求項18記載の組成物。
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