JP7269605B2 - ヘマグルチニン複合体タンパク質及びその用途 - Google Patents
ヘマグルチニン複合体タンパク質及びその用途 Download PDFInfo
- Publication number
- JP7269605B2 JP7269605B2 JP2019555374A JP2019555374A JP7269605B2 JP 7269605 B2 JP7269605 B2 JP 7269605B2 JP 2019555374 A JP2019555374 A JP 2019555374A JP 2019555374 A JP2019555374 A JP 2019555374A JP 7269605 B2 JP7269605 B2 JP 7269605B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- subcomponent
- complex
- seq
- amino acid
- represented
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/33—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Clostridium (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
第1に、Jinらが作製したのと同様のmini-HA複合体(但し、HA3のフラグメントとして380位のGluから626位のAsnまでを含む)について、培養細胞における経上皮電気抵抗(TER)を指標としてカドヘリン機能阻害活性を追試したところ、驚くべきことに、このmini-HA複合体は、FL-HAと同様にTERを低下させ、カドヘリン機能阻害活性を有することがわかった(図1、図2参照)。
第2に、pull-downアッセイや結晶構造解析の結果から、E-カドヘリンとの結合に寄与するHAの領域は、HA2とHA3との結合領域であることが明らかとなっていたので(例えば、非特許文献3及び4を参照)、全長のHA2及びHA3をそれぞれ発現させ、これらを混合して、HA2:HA3=3:3のHA複合体(FL(2+3))に再構成させて、培養細胞におけるTERを調べたところ、TERの低下が認められ、3価複合体とすることで、HA1サブコンポーネントがなくともカドヘリン機能阻害活性が保持されることがわかった(図1、図3参照)。さらにHA2とHA3とをリンカーを介して融合タンパク質(linked-FL(2+3))として発現させてもカドヘリン機能阻害活性は保持され、各サブコンポーネントをいったん精製した後に混合・インキュベートすることなく、簡便に機能的なHA2:HA3=3:3のHA複合体を作製できることが明らかとなった。
これまで使用したHAサブコンポーネントは、いずれもB型ボツリヌス菌由来であったが、本発明者らは、mini(2+3)複合体において、HA2サブコンポーネントを、E-カドヘリンと相互作用せず、ヒト腸管上皮細胞株の細胞間バリアを破壊しないことが知られているC型ボツリヌス菌HA由来のものに置換してみた(mini(2+3)/CB)。その結果、驚くべきことに、一時的ではあるがTERの低下が認められ、一過的なカドヘリン機能阻害活性を示した(図1、図4参照)。
本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
〔1〕E-カドヘリンの機能阻害活性を有する小型化されたヘマグルチニン複合体タンパク質であって、
(a)少なくともHA1サブコンポーネントの全部もしくは一部、及び/又はHA3サブコンポーネントの一部を欠失し、
(b)HA2及びHA3サブコンポーネント中のE-カドヘリンとの結合に寄与する領域を含み、かつ
(c)HA3サブコンポーネントはA型もしくはB型ボツリヌス菌由来である、
タンパク質。
(但し、A型ボツリヌス菌由来の、全長HA1サブコンポーネントの二量体、全長HA2サブコンポーネント及びHA3サブコンポーネントの378位のProから626位のAsnまでの断片が会合してなる単価型の複合体タンパク質を除く。)
〔2〕単価型である、上記〔1〕記載のヘマグルチニン複合体タンパク質。
〔3〕HA3サブコンポーネント部分が、
(a)配列番号1もしくは2で表されるアミノ酸配列、又は
(b)該アミノ酸配列において、1ないし数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列である、上記〔2〕記載のヘマグルチニン複合体タンパク質。
〔4〕HA2サブコンポーネント部分が、
(a)配列番号3~6のいずれかで表されるアミノ酸配列、又は
(b)該アミノ酸配列において、1ないし数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列である、上記〔2〕又は〔3〕記載のヘマグルチニン複合体タンパク質。
〔5〕HA1サブコンポーネントの全部を欠失する、上記〔2〕~〔4〕のいずれかに記載のヘマグルチニン複合体タンパク質。
〔6〕HA3サブコンポーネントとHA2サブコンポーネントとが、リンカーを介して連結されている、上記〔2〕~〔5〕のいずれかに記載のヘマグルチニン複合体タンパク質。
〔7〕HA3サブコンポーネントのC末端とHA2サブコンポーネントのN末端とが、リンカーを介して連結されている、上記〔6〕記載のヘマグルチニン複合体タンパク質。
〔8〕HA2サブコンポーネントがC型あるいはD型ボツリヌス菌由来である、上記〔2〕~〔7〕のいずれか記載のヘマグルチニン複合体タンパク質。
〔9〕HA2サブコンポーネント及び/又はHA3サブコンポーネント中のアミノ酸残基であって、ヘマグルチニン複合体タンパク質の分子表面上に露出する1ないし数個の疎水性アミノ酸残基が、それぞれより親水性のアミノ酸で置換された、上記〔2〕~〔8〕のいずれかに記載のヘマグルチニン複合体タンパク質。
〔10〕3価型である、上記〔1〕記載のヘマグルチニン複合体タンパク質。
〔11〕HA1サブコンポーネントの全部を欠失する、上記〔10〕記載のヘマグルチニン複合体タンパク質。
〔12〕HA2サブコンポーネントが、
(a)配列番号3~6のいずれかで表されるアミノ酸配列、又は
(b)該アミノ酸配列において、1ないし数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列である、上記〔10〕又は〔11〕記載のヘマグルチニン複合体タンパク質。
〔13〕HA3サブコンポーネントが、
(a)配列番号7もしくは8で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号19乃至626の部分配列を少なくとも含む配列、又は
(b)該アミノ酸配列において、1ないし数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなる、上記〔10〕~〔12〕のいずれかに記載のヘマグルチニン複合体タンパク質。
〔14〕HA3サブコンポーネントとHA2サブコンポーネントとが、リンカーを介して連結されている、上記〔10〕~〔13〕のいずれかに記載のヘマグルチニン複合体タンパク質。
〔15〕HA3サブコンポーネントのC末端とHA2サブコンポーネントのN末端とが、リンカーを介して連結されている、上記〔14〕記載のヘマグルチニン複合体タンパク質。
〔16〕上記〔1〕~〔15〕のいずれかに記載のヘマグルチニン複合体タンパク質をコードする核酸。
〔17〕上記〔16〕記載の核酸を含有する発現ベクター。
〔18〕上記〔17〕記載の発現ベクターが導入された宿主細胞。
〔19〕上記〔18〕記載の宿主細胞を培養し、得られた培養物からヘマグルチニン複合体タンパク質又はそのサブコンポーネントを回収し、サブコンポーネントの場合は、さらに、得られたサブコンポーネント同士を接触させ、生成するヘマグルチニン複合体タンパク質を回収することを特徴とする、該ヘマグルチニン複合体タンパク質の製造方法。
〔20〕上記〔1〕~〔15〕のいずれかに記載のヘマグルチニン複合体タンパク質、又はA型ボツリヌス菌由来の、全長HA1サブコンポーネントの二量体、全長HA2サブコンポーネント及びHA3サブコンポーネントの378位のProから626位のAsnまでの断片が会合してなる単価型の複合体タンパク質を含有してなる、E-カドヘリンの機能阻害剤。
〔21〕E-カドヘリンの機能が細胞間接着機能である、上記〔20〕記載の阻害剤。
〔22〕上記〔1〕~〔15〕のいずれかに記載のヘマグルチニン複合体タンパク質、又はA型ボツリヌス菌由来の、全長HA1サブコンポーネントの二量体、全長HA2サブコンポーネント及びHA3サブコンポーネントの378位のProから626位のAsnまでの断片が会合してなる単価型の複合体タンパク質を、細胞集団と接触させることを特徴とする、該細胞集団中の細胞間接着の阻害方法。
〔23〕細胞集団が多能性幹細胞の集団である、上記〔22〕記載の方法。
〔24〕上記〔1〕~〔15〕のいずれかに記載のヘマグルチニン複合体タンパク質、又はA型ボツリヌス菌由来の、全長HA1サブコンポーネントの二量体、全長HA2サブコンポーネント及びHA3サブコンポーネントの378位のProから626位のAsnまでの断片が会合してなる単価型の複合体タンパク質を含有してなる、細胞の増殖促進剤。
〔25〕上記〔1〕~〔15〕のいずれかに記載のヘマグルチニン複合体タンパク質、又はA型ボツリヌス菌由来の、全長HA1サブコンポーネントの二量体、全長HA2サブコンポーネント及びHA3サブコンポーネントの378位のProから626位のAsnまでの断片が会合してなる単価型の複合体タンパク質の存在下で、細胞と培養することを特徴とする、該細胞の増殖促進方法。
(a)少なくともHA1サブコンポーネントの全部もしくは一部、及び/又はHA3サブコンポーネントの一部を欠失し、
(b)HA2及びHA3サブコンポーネント中のE-カドヘリンとの結合に寄与する領域を含み、かつ
(c)HA3サブコンポーネントはA型もしくはB型ボツリヌス菌由来である
ことを特徴とする。
本発明のHA複合体は、単価型と3価型とに大別される。
本明細書において「単価型」とは、HA1サブコンポーネント二量体、HA2サブコンポーネント及びHA3サブコンポーネントからなる複合体を基本(完全型)とし、そこからさらに1以上のサブコンポーネントの一部もしくは全部が欠失したものを含む。単価型HA複合体がtriskelion様の立体構造をとり三量体化したものが3価型HA複合体であり、完全型の単価型HA複合体が三量体化したものが、FL-HA(12量体)である。尚、HA3サブコンポーネントのN末端側領域を欠失するために、理論上triskelion様の3価型HA複合体を形成することはできないが、何らかの分子間相互作用により単価型HA複合体が2分子以上会合した状態で存在する場合も、本発明の単価型HA複合体に包含されるものとする。
HA2サブコンポーネント中のE-カドヘリンとの結合に寄与する領域としては、E-カドヘリンと水素結合又は塩橋を形成する83位、86位、104位、109位、131位及び135位のアミノ酸残基を含む領域が挙げられ(例えば、非特許文献6参照)、例えば、HA2サブコンポーネントの80位~135位、好ましくは50位~140位、より好ましくは2位~146位のアミノ酸配列を含む領域であり得る。
HA3サブコンポーネント中のE-カドヘリンとの結合に寄与する領域としては、E-カドヘリンと水素結合又は塩橋を形成する501位、503位、505位、506位、534位、535位、582位、586位、607位及び609位のアミノ酸残基、さらにE-カドヘリンとの疎水性相互作用に関与する417位、473位及び508位のアミノ酸残基を含む領域が挙げられ(例えば、非特許文献6参照)、例えば、HA3サブコンポーネントの400位~610位、好ましくは390位~620位、より好ましくは380位~626位のアミノ酸配列を含む領域であり得る。
本発明の単価型HA複合体を構成するHA3サブコンポーネントは、380位よりさらにN末端側のアミノ酸配列を含んでもよいが、380位よりC末端側のアミノ酸配列を含めば、該複合体にE-カドヘリン機能阻害活性を付与することができるので、好ましい一実施態様においては、小型化の観点から、HA3サブコンポーネントは、380位よりN末端側のアミノ酸配列を含まない。また、各サブコンポーネントを別個に作製した後、それらを接触させ再構成させる実施態様においては、HA3サブコンポーネントのよりN末端側までを含むことで、3価型に再構成され、単価型の収率が低下するおそれもあるので、この点でも380位よりさらにN末端側のアミノ酸配列を含まないことが望ましい。
従って、本発明の単価型HA複合体を構成するHA3サブコンポーネントは、例えば、配列番号7又は8で表されるアミノ酸配列中、400位~610位、好ましくは390位~620位、より好ましくは380位~626位の部分アミノ酸配列、あるいは、該部分アミノ酸配列において、1ないし数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含むものであり得る。
HA1サブコンポーネントとして、その全長を含んでもよいし、一部のみを含んでもよい。一部のみを含む場合、E-カドヘリンとの相互作用に寄与する領域を少なくとも含むことが望ましい。また、該単価型HA複合体は、HA1サブコンポーネントを二量体として含んでもよく、あるいは単量体で含んでもよい。
(a)配列番号1もしくは2で表されるアミノ酸配列、又は
(b)該アミノ酸配列において、1ないし数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列である複合体タンパク質である。
配列番号1及び2のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号7及び8のアミノ酸配列中380位~626位のアミノ酸配列に相当する。アミノ酸の置換、欠失、挿入もしくは付加については前記と同様である。
(a)配列番号3~6のいずれかで表されるアミノ酸配列、又は
(b)該アミノ酸配列において、1ないし数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列である複合体タンパク質である。
配列番号3~6のアミノ酸配列は、それぞれA型~D型のボツリヌス菌由来のHA2サブコンポーネントの全長(1位~146位)のアミノ酸配列(それぞれGenBank:AAM75950.1、 GenBank: BAE48260.1、NCBI: YP_398513.1及びGenBank:EES90370.1)に相当する。アミノ酸の置換、欠失、挿入もしくは付加については、基本的に前記HA3サブコンポーネントの場合と同様であるが、HA2サブコンポーネントは、C型もしくはD型ボツリヌス菌由来であり得るので、変異の位置の自由度はHA3サブコンポーネントよりも高くなり得る。すなわち、A型HA2サブコンポーネントとB型HA2サブコンポーネントとは、約98%のアミノ酸同一性を有するが、B型HA2サブコンポーネントとC型もしくはD型HA2サブコンポーネントとは、64%のアミノ酸同一性、類似アミノ酸を含めたアミノ酸類似性でも79%にとどまるので(図12参照)、アミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加される位置としての、例えば、A型又はB型のHA2とC型又はD型のHA2とでアミノ酸残基が異なる位置はより多くある。
従って、好ましい一実施態様においては、本発明の単価型HA複合体は、C型ボツリヌス菌由来のHA2サブコンポーネントを含む。
リンカーはペプチドリンカーであれば特に制限はないが、HA2サブコンポーネントとHA3サブコンポーネントの立体構造を考慮すると(図13参照)、HA3サブコンポーネントのC末端とHA2サブコンポーネントのN末端とをリンカーで繋ぐ場合、6~12アミノ酸、好ましくは8~10アミノ酸からなる任意のアミノ酸配列からなるリンカーを使用することができる。例えば、GSGGDDPPG(配列番号13)が挙げられるが、それに限定されない。
一方、HA2サブコンポーネントのC末端とHA3サブコンポーネントのN末端とをリンカーで繋ぐ場合、HA複合体の立体構造上、両末端の距離が離れているので、より長いリンカーを用いることが望ましい。しかし、リンカーがプロテアーゼやペプチダーゼにより切断されやすくなる等の不利な点が考えられるので、HA3サブコンポーネントのC末端とHA2サブコンポーネントのN末端とをリンカーで繋ぐ方がより好ましい。
本発明はまた、3価型のHA複合体タンパク質を提供する。該3価型HA複合体は、HA3サブコンポーネントの一部を欠失することを妨げないが、E-カドヘリンとの結合に寄与する領域と、triskelion様の立体構造をとるのに必要な領域とを含む必要がある。E-カドヘリンとの結合に寄与する領域は、前記単価型の場合と同様であり、また、3価型として再構成されるためにはHA3サブコンポーネントのN末端側のアミノ酸配列を含む必要がある。従って、好ましい実施態様においては、該3価型HA複合体は、HA3サブコンポーネントの全長を含み得る。
(a)配列番号3~6のいずれかで表されるアミノ酸配列、又は
(b)該アミノ酸配列において、1ないし数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列である複合体タンパク質である。
前述のように、配列番号3~6のアミノ酸配列は、それぞれA型ないしD型のHA2サブコンポーネントの全長(1位~146位の)アミノ酸配列に相当する。アミノ酸の置換、欠失、挿入もしくは付加については前記と同様である。
(a)配列番号7もしくは8で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号19乃至626(実施例で使用)の部分配列を少なくとも含む配列、又は
(b)該アミノ酸配列において、1ないし数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなる複合体タンパク質である。
配列番号7及び8のアミノ酸配列は、それぞれA型及びB型のHA3サブコンポーネントの全長アミノ酸配列に相当する。アミノ酸の置換、欠失、挿入もしくは付加については前記単価型HA複合体におけるHA3サブコンポーネントの場合と同様である。
本発明のHA複合体タンパク質は、各サブコンポーネント又はその融合タンパク質をコードするDNAを含む発現ベクターを宿主細胞に導入して培養し、得られた培養物から該サブコンポーネント又は融合タンパク質を回収し、サブコンポーネントの場合は、さらに、得られたサブコンポーネント同士を接触させ、生成するHA複合体タンパク質を回収することにより、製造することができる。
クローン化されたDNAは、そのまま、または所望により制限酵素で消化するか、適当なリンカーを付加した後に、他のサブコンポーネントをコードするDNAとライゲーションして、融合タンパク質をコードするDNAを調製することができる。
発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド(例、pBR322,pBR325,pUC12,pUC13);枯草菌由来のプラスミド(例、pUB110,pTP5,pC194);酵母由来プラスミド(例、pSH19,pSH15);昆虫細胞発現プラスミド(例:pFast-Bac);動物細胞発現プラスミド(例:pA1-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo);λファージなどのバクテリオファージ;バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクター(例:BmNPV、AcNPV);レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルスなどの動物ウイルスベクターなどが用いられる。
プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、宿主が動物細胞である場合、SRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMV(サイトメガロウイルス)プロモーター、RSV(ラウス肉腫ウイルス)プロモーター、MoMuLV(モロニーマウス白血病ウイルス)LTR、HSV-TK(単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ)プロモーターなどが用いられる。なかでも、CMVプロモーター、SRαプロモーターなどが好ましい。宿主が大腸菌である場合、trpプロモーター、lacプロモーター、recAプロモーター、λPLプロモーター、lppプロモーター、T7プロモーターなどが好ましい。宿主がバチルス属菌である場合、SPO1プロモーター、SPO2プロモーター、penPプロモーターなどが好ましい。宿主が酵母である場合、Gal1/10プロモーター、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーターなどが好ましい。
宿主としては、例えば、大腸菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。大腸菌としては、例えば、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)K12・DH1〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA,60,160 (1968)〕,エシェリヒア・コリJM103〔Nucleic Acids Research,9,309 (1981)〕,エシェリヒア・コリJA221〔Journal of Molecular Biology,120,517 (1978)〕,エシェリヒア・コリHB101〔Journal of Molecular Biology,41,459 (1969)〕,エシェリヒア・コリC600〔Genetics,39,440 (1954)〕などが用いられる。バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サブチルス(Bacillus subtilis)MI114〔Gene,24,255 (1983)〕,バチルス・サブチルス207-21〔Journal of Biochemistry,95,87 (1984)〕などが用いられる。酵母としては、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)AH22,AH22R-,NA87-11A,DKD-5D,20B-12、シゾサッカロマイセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)NCYC1913,NCYC2036,ピキア・パストリス(Pichia pastoris=Komagataella phaffii)KM71などが用いられる。
大腸菌を培養する場合の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むM9培地〔Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972〕が好ましい。必要により、プロモーターを効率よく働かせるために、例えば、3β-インドリルアクリル酸のような薬剤を培地に添加してもよい。大腸菌の培養は、通常約15~約43℃で行なわれる。必要により、通気や撹拌を行ってもよい。
各サブコンポーネントを別個のタンパク質として発現させた場合には、上記の手法により各サブコンポーネントを精製した後、常法に従って、それらを混合し、適切な条件下でインキュベートすることにより、本発明のHA複合体タンパク質に再構成することができる。
本発明のHA複合体タンパク質は、E-カドヘリンの機能、好ましくは細胞間バリア機能の阻害活性(即ち、バリア破壊活性)を保持しつつ、分子サイズが小型化されているため、製造が簡易で、取扱いに優れており、従来の公知のHA複合体タンパク質の用途に対して、従来品よりも有利に使用することができる。
従って、本発明はまた、本発明のHA複合体タンパク質を含有してなる、E-カドヘリンの機能阻害剤(以下、「本発明の阻害剤」ともいう。)を提供する。特に、本発明の阻害剤は、E-カドヘリンの細胞間接着機能の阻害に有用であり、例えば、接着した細胞集団の解離剤として使用され得る。
特に好ましい態様においては、本発明の阻害剤は、多能性細胞の維持増幅培養の過程で偶発的に発生する脱未分化細胞を効率よく除去し、及び/又はその発生を抑制することで、多能性幹細胞の未分化状態の維持に使用され得る。また、培地に添加されたHA複合体タンパク質は、エンドサイトーシス等により細胞内に吸収され、分解除去され得るが、本発明のHA複合体タンパク質は分子サイズが小型化されているので、従来品よりも効率よく細胞により吸収・除去されるものと考えられる。また、本発明のHA複合体タンパク質の存在下でiPS細胞を浮遊培養することにより、iPS細胞集塊を効率よく分割することができ、iPS細胞を効率よく大量増幅させることができる。これらの方法の詳細は、上記特許文献1及び2に記載されている。
(1) プラスミドの作製
(I) pET52b+の改変(pET52b-C)
下記プライマーをpET52b+[Novagen]のNcoI-SalIサイトへ挿入した。
C-strep-f(配列番号14):
taccatggctagcgcaagctacggatccggtagtgcatggagccacccgcagttcgaaaagtaagtcgacgc
C-strep-r(配列番号15):
gcgtcgacttacttttcgaactgcgggtggctccatgcactaccggatccgtagcttgcgctagccatggta
・His-BHA1-Flag (7-294 a.a)
・His-BHA2 (2-146 a.a.)
・Strep-BHA3 (19-626 a.a.)
Clostridiumbotulinum B-okra株のゲノムDNAをテンプレートとして下記プライマーを用いてPCR法により増幅した。
HA1/B-f(配列番号16):
ctagctagcatccaaaattcattaaatgac
HA1/B-r(配列番号17):
cgggatccttacttgtcgtcatcgtctttgtagtctgggttactcatagtccatatc
HA2/B-f(配列番号18):
ctagctagctcagctgaaagaacttttctac
HA2/B-r(配列番号19):
ccgctcgagttatattttttcaagtttgaacatttg
HA3/B-f(配列番号20):
gaaaaagggtaccaatatagtgatactattg
HA3/B-r(配列番号21):
cgtgtcgacttaattagtaatatctatatgc
HA1はpET28b+(Novagen)のNheI-BamHIサイト、HA2はpET28b+(Novagen)のNheI-XhoIサイト、HA3はpET52b+(Novagen)のKpnI-SalIサイトへ挿入した。
・His-BHA2 (2-146 a.a.)
・Strep-BHA3 (19-626 a.a.)
Clostridiumbotulinum B-okra株のゲノムDNAをテンプレートとして下記プライマーを用いてPCR法により増幅した。
HA2/B-f(配列番号18):
ctagctagctcagctgaaagaacttttctac
HA2/B-r(配列番号19):
ccgctcgagttatattttttcaagtttgaacatttg
HA3/B-f(配列番号20):
gaaaaagggtaccaatatagtgatactattg
HA3/B-r(配列番号21):
cgtgtcgacttaattagtaatatctatatgc
HA2はpET28b+(Novagen)のNheI-XhoIサイト、HA3はpET52b+(Novagen)のKpnI-SalIサイトへ挿入した。
・His-BHA2 (2-146 a.a.)
・BHA3-Strep (19-626 a.a.)
Clostridiumbotulinum B-okra株のゲノムDNAをテンプレートとして下記プライマーを用いてPCR法により増幅した。
HA2/B-f(配列番号18):
ctagctagctcagctgaaagaacttttctac
HA2/B-r(配列番号19):
ccgctcgagttatattttttcaagtttgaacatttg
HA3/B-f(配列番号22):
gcgctagcaatatagtgatactattgatttagctgatgg
HA3/B-r(配列番号23):
ccggatccattagtaatatctatatgcaattttatattatag
HA2はpET28b+(Novagen)のNheI-XhoIサイト、HA3はpET52b-CのNheI-BamHIサイトへ挿入した。
・BHA3-linker-BHA2-Strep (19-626 a.a + 1-9 a.a. + 2-146 a.a.)
pET28b-BHA2とpET52b-BHA3をテンプレートとして下記プライマーを用いてPCR法により増幅した。
HA2/B-f(配列番号24):
ggggtgatgaccctccaggatcagctgaaagaacttttctacctaatg
HA2/B-r(配列番号25):
actaccggatcctattttttcaagtttgaacatttg
HA3/B-f(配列番号26):
taagaaggagatataccatggctagc
HA3/B-r(配列番号27):
gggtcatcacccccacttccattagtaatatctatatgcaattttatattata
HA2とHA3をpET52b-CのNcoI-BamHIサイトへGeneArt(登録商標) Seamless Cloning and Assembly Kit(Invitrogen)を用いて挿入した。
・His-BHA1-FLAG (7-294 a.a)
・His-BHA2 (2-146 a.a.)
・BHA3mini-Strep (380-626 a.a.)
Clostridiumbotulinum B-okra株のゲノムDNAをテンプレートとして下記プライマーを用いてPCR法により増幅した。
HA1/B-f(配列番号16):
ctagctagcatccaaaattcattaaatgac
HA1/B-r(配列番号17):
cgggatccttacttgtcgtcatcgtctttgtagtctgggttactcatagtccatatc
HA2/B-f(配列番号18):
ctagctagctcagctgaaagaacttttctac
HA2/B-r(配列番号19):
ccgctcgagttatattttttcaagtttgaacatttg
HA3mini/B-f(配列番号28):
gcgctagcgaaaatatacaagaaataaatactgctatttcag
HA3mini/B-r(配列番号23):
ccggatccattagtaatatctatatgcaattttatattatag
HA1はpET28b+(Novagen)のNheI-BamHIサイト、HA2はpET28b+(Novagen)のNheI-XhoIサイト、HA3miniはpET52b-CのNheI-BamHIサイトへ挿入した。
・His-BHA2 (2-146 a.a.)
・BHA3mini-Strep (380-626 a.a.)
Clostridiumbotulinum B-okra株のゲノムDNAをテンプレートとして下記プライマーを用いてPCR法により増幅した。
HA2/B-f(配列番号18):
ctagctagctcagctgaaagaacttttctac
HA2/B-r(配列番号19):
ccgctcgagttatattttttcaagtttgaacatttg
HA3mini/B-f(配列番号28):
gcgctagcgaaaatatacaagaaataaatactgctatttcag
HA3mini/B-r(配列番号23):
ccggatccattagtaatatctatatgcaattttatattatag
HA2はpET28b+(Novagen)のNheI-XhoIサイト、HA3miniはpET52b-CのNheI-BamHIサイトへ挿入した。
・His-CHA2 (2-146 a.a.)
・BHA3mini-Strep (380-626 a.a.)
Clostridiumbotulinum C-st 株、B-okra株のゲノムDNAをテンプレートとして下記プライマーを用いてPCR法により増幅した。
HA2/C-f(配列番号29):
ctagctagctcaagtgaaagaacctttttac
HA2/C-r(配列番号30):
acgcgtcgacttaaagtttttctaattttaaaatttg
HA3mini/B-f(配列番号28):
gcgctagcgaaaatatacaagaaataaatactgctatttcag
HA3mini/B-r(配列番号23):
ccggatccattagtaatatctatatgcaattttatattatag
HA2はpET28b+(Novagen)のNheI-SalIサイト、HA3miniはpET52b-CのNheI-BamHIサイトへ挿入した。
・BHA3mini-linker-BHA2-Strep (380-626 a.a + 1-9 a.a. + 2-146 a.a.)
pET28b-BHA2とpET52b-BHA3をテンプレートとして下記プライマーを用いてPCR法により増幅した。
HA2/B-f(配列番号24):
ggggtgatgaccctccaggatcagctgaaagaacttttctacctaatg
HA2/B-r(配列番号25):
actaccggatcctattttttcaagttgaacatttg
HA3mini/B-f(配列番号26):
taagaaggagatataccatggctagc
HA3mini/B-r(配列番号27):
gggtcatcacccccacttccattagtaatatctatatgcaattttatattata
HA2とHA3miniをpET52b-CのNcoI-BamHIサイトへGeneArt(登録商標)Seamless Cloning and Assembly Kit(Invitrogen)を用いて挿入した。
・BHA3mini-linker-CHA2-Strep (380-626 a.a + 1-9 a.a. + 2-146 a.a.)
pET28b-CHA2とpET52b-BHA3をテンプレートとして下記プライマーを用いてPCR法により増幅した。
HA2/C-f(配列番号31):
ggggtgatgaccctccaggatcaagtgaaagaacctttttacctaatg
HA2/C-r(配列番号32):
actaccggatccaagtttttctaattttaaaatttgattag
HA3mini/B-f(配列番号26):
taagaaggagatataccatggctagc
HA3mini/B-r(配列番号27):
gggtcatcacccccacttcc attagtaatatctatatgcaattttatattata
HA2とHA3miniをpET52b-CのNcoI-BamHIサイトへGeneArt(登録商標)Seamless Cloning and Assembly Kit(Invitrogen)を用いて挿入した。
・HA2-Y73D-F75Y
pET52b-C-linked-mini-HA(2+3)/CBをテンプレートとして下記のプライマーを用いたsite-directed mutagenesis法により変異を導入した。
Y73D/F75Y-f(配列番号33):
atgatgatggttatatctatttaagttcatcatctaataatag
Y73D/F75Y-r(配列番号34):
agatataaccatcatcattataagctaaatatttattagg
・HA2-Y73D-F75Y-I90C
pET52b-C-linked-mini-HA(2+3)/CB-YFDYをテンプレートとして下記のプライマーを用いたsite-directed mutagenesis法により変異を導入した。
I90C-f(配列番号35):
aatccttgtaaaattgctataaattcttatattatatg
I90C-r(配列番号36):
aattttacaaggattccataaactattattag
・HA2-Y73D-F75Y-I90C, HA3-T572C
pET52b-C-linked-mini-HA(2+3)/CB-YFDY-ICをテンプレートとして下記のプライマーを用いたsite-directed mutagenesis法により変異を導入した。
T572C-f(配列番号37):
agagtctgtgaaactattgacggctataattt
T572C-r(配列番号38):
agtttcacagactctaaataaagtacctattc
・HA2-L40D-Y73D-F75Y
pET52b-C-linked-mini-HA(2+3)/CB-YFDYをテンプレートとして下記のプライマーを用いたsite-directed mutagenesis法により変異を導入した。
L40D-f(配列番号39):
tcttctgatgataatcaaaaatggaagttag
L40D-r(配列番号40):
attatcatcagaagatgtatttgaaaatgataatg
上記で作製したプラスミドはRosetta2 (DE3) [Novagen] にトランスフォームした。タンパク質発現誘導はOvernight Express Autoinduction System 1 [Novagen]を用いて行った。それぞれのプラスミドにおいて下記のように発現誘導を行った後、大腸菌は遠心により回収し使用まで-80℃で保存した。
pET28b-BHA1・・・18℃, 48時間
pET28b-BHA2・・・18℃, 48時間
pET28b-CHA2・・・18℃, 48時間
pET52b-BHA3・・・30℃, 36時間
pET52b-C-BHA3・・・30℃, 36時間
pET52b-C-BHA3mini・・・30℃, 36時間
pET52b-C-linked-mini-HA(2+3)/B・・・30℃, 20時間
pET52b-C-linked-mini-HA(2+3)/CB・・・30℃, 20時間
各変異体は野生型と同条件でおこなった。
それぞれのタンパク質において下記を用いて精製した。
pET28b-BHA1・・・His-Trap HP [GE Healthcare]
pET28b-BHA2・・・His-Trap HP [GE Healthcare]
pET28b-CHA2・・・His-Trap HP [GE Healthcare]
pET52b-BHA3・・・Strep-Trap HP [GE Healthcare]
pET52b-C-BHA3・・・Strep-Trap HP [GE Healthcare]
pET52b-C-BHA3mini・・・Strep-Trap HP [GE Healthcare]
pET52b-C-linked-mini-HA(2+3)/B・・・Strep-Trap HP [GE Healthcare]
pET52b-C-linked-mini-HA(2+3)/CB・・・Strep-Trap HP [GE Healthcare]
複合体(II, III, IV, VI, VII, VIII)においては(HA1:)HA2:HA3=(4:)4:1のモル比で混合し、37℃で3時間インキュベートした後、Strep-Trap HP [GE Healthcare]を用いて精製した。
>His-BHA1-Flag(配列番号41):
MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASIQNSLNDKIVTISCKANTDLFFYQVPGNGNVSLFQQTRNYLERWRIIYDSNKAAYKIKSMNIYNTNLVLTWNAPTHNISAQQDSNADNQYWLLLKDIGNNSFIIASYKNPNLVLYADTVARNLKLSTLNNSSYIKFIIEDYVISDFKNFTCRISPILAGGKVVQQVSMTNLAVNLYIWNNDLNQKWTIIYNEEKAAYQFFNKILSNGVLTWIFSDGNTVRVSSSAQNNDAQYWLINPVSDNYDRYTITNLRDKTKVLDLYGGQTADGTTIQVFNSNGGDNQIWTMSNPDYKDDDDK
>His-BHA2(配列番号42):
MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASSAERTFLPNGNYNIKSIFSGSLYLSPVSGSLTFSNESSANNQKWNVEYMAENRCFKISNVAEPNKYLSYDNFGFISLDSLSNRCYWFPIKIAVNTYIMLSLNKVNELDYAWDIYDTNENILSQPLLLLPNFDIYNSNQMFKLEKI
>Strep-BHA3(配列番号43):
MASWSHPQFEKGALEVLFQGPGYQYSDTIDLADGNYVVSRGDGWILSRQNQILGGSVISNGSTGIVGDLRVNDNAIPYYYPTPSFNEEYIKNNIQTVFANFTEANQIPIGFEFSKTAPSNKNLYMYLQYTYIRYEIIKVLQHEIIERAVLYVPSLGYVKSIEFNPGEKINKDFYFLTNDKCILNEQFLYKKILETTKNIPTNNIFNSKVSSTQRVLPYSNGLYVINKGDGYIRTNDKDLIGTLLIEAGSSGSIIQPRLRNTTRPLFTTSNDAKFSQQYTEERLKDAFNVQLFNTSTSLFKFVEEAPSNKNICIKAYNTYEKYELIDYQNGSIVNKAEYYLPSLGYCEVTNAPSPESEVVKTQVAEDGFIQNGPEEEIVVGVIDPSENIQEINTAISDNYTYNIPGIVNNNPFYILFTVNTTGIYKINAQNNLPSLKIYEAIGSGNRNFQSGNLCDDDIKAINYITGFDSPNAKSYLVVLLNKDKNYYIRVPQTSSNIENQIKFKREEGDLRNLMNSSVNIIDNLNSTGAHYYTRQSPDVHDYISYEFTIPGNFNNKDTSNIRLYTSYNQGIGTLFRVTETIDGYNLINIQQNLNLLNSTKSIRLLNGAIYILKVEVTELNNYNIKLHIDITN
>BHA3-Strep(配列番号44):
MASYSDTIDLADGNYVVSRGDGWILSRQNQILGGSVISNGSTGIVGDLRVNDNAIPYYYPTPSFNEEYIKNNIQTVFANFTEANQIPIGFEFSKTAPSNKNLYMYLQYTYIRYEIIKVLQHEIIERAVLYVPSLGYVKSIEFNPGEKINKDFYFLTNDKCILNEQFLYKKILETTKNIPTNNIFNSKVSSTQRVLPYSNGLYVINKGDGYIRTNDKDLIGTLLIEAGSSGSIIQPRLRNTTRPLFTTSNDAKFSQQYTEERLKDAFNVQLFNTSTSLFKFVEEAPSNKNICIKAYNTYEKYELIDYQNGSIVNKAEYYLPSLGYCEVTNAPSPESEVVKTQVAEDGFIQNGPEEEIVVGVIDPSENIQEINTAISDNYTYNIPGIVNNNPFYILFTVNTTGIYKINAQNNLPSLKIYEAIGSGNRNFQSGNLCDDDIKAINYITGFDSPNAKSYLVVLLNKDKNYYIRVPQTSSNIENQIKFKREEGDLRNLMNSSVNIIDNLNSTGAHYYTRQSPDVHDYISYEFTIPGNFNNKDTSNIRLYTSYNQGIGTLFRVTETIDGYNLINIQQNLNLLNSTKSIRLLNGAIYILKVEVTELNNYNIKLHIDITNGSGSAWSHPQFEK
>linked-FL(2+3)/BB(配列番号45):
MASYSDTIDLADGNYVVSRGDGWILSRQNQILGGSVISNGSTGIVGDLRVNDNAIPYYYPTPSFNEEYIKNNIQTVFANFTEANQIPIGFEFSKTAPSNKNLYMYLQYTYIRYEIIKVLQHEIIERAVLYVPSLGYVKSIEFNPGEKINKDFYFLTNDKCILNEQFLYKKILETTKNIPTNNIFNSKVSSTQRVLPYSNGLYVINKGDGYIRTNDKDLIGTLLIEAGSSGSIIQPRLRNTTRPLFTTSNDAKFSQQYTEERLKDAFNVQLFNTSTSLFKFVEEAPSNKNICIKAYNTYEKYELIDYQNGSIVNKAEYYLPSLGYCEVTNAPSPESEVVKTQVAEDGFIQNGPEEEIVVGVIDPSENIQEINTAISDNYTYNIPGIVNNNPFYILFTVNTTGIYKINAQNNLPSLKIYEAIGSGNRNFQSGNLCDDDIKAINYITGFDSPNAKSYLVVLLNKDKNYYIRVPQTSSNIENQIKFKREEGDLRNLMNSSVNIIDNLNSTGAHYYTRQSPDVHDYISYEFTIPGNFNNKDTSNIRLYTSYNQGIGTLFRVTETIDGYNLINIQQNLNLLNSTKSIRLLNGAIYILKVEVTELNNYNIKLHIDITNGSGGDDPPGSAERTFLPNGNYNIKSIFSGSLYLSPVSGSLTFSNESSANNQKWNVEYMAENRCFKISNVAEPNKYLSYDNFGFISLDSLSNRCYWFPIKIAVNTYIMLSLNKVNELDYAWDIYDTNENILSQPLLLLPNFDIYNSNQMFKLEKIGSGSAWSHPQFEK
>BHA3mini-Strep(配列番号46):
MASENIQEINTAISDNYTYNIPGIVNNNPFYILFTVNTTGIYKINAQNNLPSLKIYEAIGSGNRNFQSGNLCDDDIKAINYITGFDSPNAKSYLVVLLNKDKNYYIRVPQTSSNIENQIKFKREEGDLRNLMNSSVNIIDNLNSTGAHYYTRQSPDVHDYISYEFTIPGNFNNKDTSNIRLYTSYNQGIGTLFRVTETIDGYNLINIQQNLNLLNSTKSIRLLNGAIYILKVEVTELNNYNIKLHIDITNGSGSAWSHPQFEK
>linked-mini(2+3)/BB(配列番号47):
MASENIQEINTAISDNYTYNIPGIVNNNPFYILFTVNTTGIYKINAQNNLPSLKIYEAIGSGNRNFQSGNLCDDDIKAINYITGFDSPNAKSYLVVLLNKDKNYYIRVPQTSSNIENQIKFKREEGDLRNLMNSSVNIIDNLNSTGAHYYTRQSPDVHDYISYEFTIPGNFNNKDTSNIRLYTSYNQGIGTLFRVTETIDGYNLINIQQNLNLLNSTKSIRLLNGAIYILKVEVTELNNYNIKLHIDITNGSGGDDPPGSAERTFLPNGNYNIKSIFSGSLYLSPVSGSLTFSNESSANNQKWNVEYMAENRCFKISNVAEPNKYLSYDNFGFISLDSLSNRCYWFPIKIAVNTYIMLSLNKVNELDYAWDIYDTNENILSQPLLLLPNFDIYNSNQMFKLEKIGSGSAWSHPQFEK
>linked-mini(2+3)/CB(配列番号48):
MASENIQEINTAISDNYTYNIPGIVNNNPFYILFTVNTTGIYKINAQNNLPSLKIYEAIGSGNRNFQSGNLCDDDIKAINYITGFDSPNAKSYLVVLLNKDKNYYIRVPQTSSNIENQIKFKREEGDLRNLMNSSVNIIDNLNSTGAHYYTRQSPDVHDYISYEFTIPGNFNNKDTSNIRLYTSYNQGIGTLFRVTETIDGYNLINIQQNLNLLNSTKSIRLLNGAIYILKVEVTELNNYNIKLHIDITNGSGGDDPPGSSERTFLPNGNYKIKSLFSDSLYLTYSSGALSFSNTSSLDNQKWKLEYISSSNGFRFSNVAEPNKYLAYNDYGFIYLSSSSNNSLWNPIKIAINSYIICTLSIVNVTDYAWTIYDNNNNITDQPILNLPNFDINNSNQILKLEKLGSGSAWSHPQFEK
>linked-mini(2+3)/CB-YFDY(配列番号49):
MASENIQEINTAISDNYTYNIPGIVNNNPFYILFTVNTTGIYKINAQNNLPSLKIYEAIGSGNRNFQSGNLCDDDIKAINYITGFDSPNAKSYLVVLLNKDKNYYIRVPQTSSNIENQIKFKREEGDLRNLMNSSVNIIDNLNSTGAHYYTRQSPDVHDYISYEFTIPGNFNNKDTSNIRLYTSYNQGIGTLFRVTETIDGYNLINIQQNLNLLNSTKSIRLLNGAIYILKVEVTELNNYNIKLHIDITNGSGGDDPPGSSERTFLPNGNYKIKSLFSDSLYLTYSSGALSFSNTSSLDNQKWKLEYISSSNGFRFSNVAEPNKYLAYNDDGYIYLSSSSNNSLWNPIKIAINSYIICTLSIVNVTDYAWTIYDNNNNITDQPILNLPNFDINNSNQILKLEKLGSGSAWSHPQFEK
>linked-mini(2+3)/CB-LD/YFDY(配列番号50):
MASENIQEINTAISDNYTYNIPGIVNNNPFYILFTVNTTGIYKINAQNNLPSLKIYEAIGSGNRNFQSGNLCDDDIKAINYITGFDSPNAKSYLVVLLNKDKNYYIRVPQTSSNIENQIKFKREEGDLRNLMNSSVNIIDNLNSTGAHYYTRQSPDVHDYISYEFTIPGNFNNKDTSNIRLYTSYNQGIGTLFRVTETIDGYNLINIQQNLNLLNSTKSIRLLNGAIYILKVEVTELNNYNIKLHIDITNGSGGDDPPGSSERTFLPNGNYKIKSLFSDSLYLTYSSGALSFSNTSSDDNQKWKLEYISSSNGFRFSNVAEPNKYLAYNDDGYIYLSSSSNNSLWNPIKIAINSYIICTLSIVNVTDYAWTIYDNNNNITDQPILNLPNFDINNSNQILKLEKLGSGSAWSHPQFEK
>linked-mini(2+3)/CB-YFDY/IC(配列番号51):
MASENIQEINTAISDNYTYNIPGIVNNNPFYILFTVNTTGIYKINAQNNLPSLKIYEAIGSGNRNFQSGNLCDDDIKAINYITGFDSPNAKSYLVVLLNKDKNYYIRVPQTSSNIENQIKFKREEGDLRNLMNSSVNIIDNLNSTGAHYYTRQSPDVHDYISYEFTIPGNFNNKDTSNIRLYTSYNQGIGTLFRVTETIDGYNLINIQQNLNLLNSTKSIRLLNGAIYILKVEVTELNNYNIKLHIDITNGSGGDDPPGSSERTFLPNGNYKIKSLFSDSLYLTYSSGALSFSNTSSLDNQKWKLEYISSSNGFRFSNVAEPNKYLAYNDDGYIYLSSSSNNSLWNPCKIAINSYIICTLSIVNVTDYAWTIYDNNNNITDQPILNLPNFDINNSNQILKLEKLGSGSAWSHPQFEK
>linked-mini(2+3)/CB-YFDY/ITCC(配列番号52):
MASENIQEINTAISDNYTYNIPGIVNNNPFYILFTVNTTGIYKINAQNNLPSLKIYEAIGSGNRNFQSGNLCDDDIKAINYITGFDSPNAKSYLVVLLNKDKNYYIRVPQTSSNIENQIKFKREEGDLRNLMNSSVNIIDNLNSTGAHYYTRQSPDVHDYISYEFTIPGNFNNKDTSNIRLYTSYNQGIGTLFRVCETIDGYNLINIQQNLNLLNSTKSIRLLNGAIYILKVEVTELNNYNIKLHIDITNGSGGDDPPGSSERTFLPNGNYKIKSLFSDSLYLTYSSGALSFSNTSSLDNQKWKLEYISSSNGFRFSNVAEPNKYLAYNDDGYIYLSSSSNNSLWNPCKIAINSYIICTLSIVNVTDYAWTIYDNNNNITDQPILNLPNFDINNSNQILKLEKLGSGSAWSHPQFEK
1. Caco-2細胞をコラーゲンコートした0.4 μm-pore size・6.5 mm diameterのtranswell chamber [Costar] に播種し、Caco-2細胞培養用培地(20% FBS [Equitech-Bio], MEM [Gibco], 1 mM L-glutamine [Gibco], 17.86 mM NaHCO3 [Wako], 15 mM Hepes [Dojindo], pH7.4, 70 U/ml penicillin G-70 ug/ml Streptomycin [Gibco])を用いて、CO2インキュベータ内(37℃, 5% CO2)で培養した。
2. TER値が600 Ω・cm2以上になるまで3日ずつ培地交換をおこなった。
3. 試験前日に各transwellをPBSで洗浄し、培地中で一晩培養をCO2インキュベータ内でおこなった。
4. 各ウェルの基底側チャンバーへプロトマー計算で終濃度30-300 nMとなるように各種HAを2または3ウェルずつ添加し、CO2インキュベータ内で培養した。
5. HA添加後24時間まで各ウェルのTER値をMillicell-ERS2 [Millipore]を用いて経時的に計測した。
6. 測定値は下記の式により計算をおこない、2または3ウェルの平均値を求め、標準偏差を誤差とした。
[TERcalc(X hr)] = ([TERX hr] / [TER0 hr]) x 100
1. 96穴プレートにCaco-2細胞を1x10^4 cell/wellを100 μl/wellのCaco-2細胞培養用培地中に播種し、CO2インキュベータ内(37℃, 5% CO2)で24時間培養した。
2. 細胞を播種していない培地のみのウェルをブランクとした。
3. 96穴プレートに1% Triton X-100または各種タンパク質をプロトマー計算で終濃度300 nMとなるように3ウェルずつ添加し、CO2インキュベータ内で48時間培養した。
4. 各ウェルにSF reagent [nacalai tesque]を10 μlずつ添加し、1.5時間培養した。
5. 各ウェルに1% SDSを10 μlずつ添加し、450 nmと620nm波長の吸光度を測定した。
6. 測定値を下記の式により計算した。
A450calc(sample)= ([A450sample] - [A620sample]) - ([A450blank] - [A620blank])
7. 測定値は各条件において、3ウェルの平均を求め、標準偏差を誤差とした。
1. 100mmディッシュ上で4日間前培養したヒトiPS細胞D2株(入手先:京都大学iPS細胞研究所(CiRA))を、各ウェルにStemFit(登録商標)AK02N培地200μlを添加した48穴プレート(costar 3548)中に、無フィーダー条件下、2.5×103細胞/cm2の密度で播種した(Day0)。
2. 該48穴プレートをCO2インキュベータ内、5% CO2雰囲気下、37℃で3日間培養した。1日毎に培地交換を行い、培養開始1日(Day1)から2日(Day2)にかけて24時間、種々の濃度(0.1~450nM)のlinked-mini(2+3)/CB-LD/YFDY又はB型FL-HA(HFHS)をウェルに添加した(各濃度2ウェル)。培養開始1、2及び3日目に顕微鏡写真(4X)撮影を行った。
(a)SFアッセイ
1. 96穴プレートにMDCK細胞1 x 104 cells/wellを100 μl/wellのMDCK細胞培養用培地中に播種し、CO2インキュベータ内(37℃, 5% CO2)で24時間培養した。
2. 96穴プレートに終濃度1 - 300 nMでFL-HAもしくはlinked-mini (2+3)/CB-LD/YFDYを3ウェルずつ添加し、CO2インキュベータ内で24時間培養した。
3. 各ウェルにSF regent [nacalai tesque]を10 μlずつ添加し、CO2インキュベータ内で1.5時間培養した。
4. 各ウェルに1% SDSを10 μlずつ添加し、450 nmと620 nm波長の吸光度を測定した。
5. 測定値を次の式により計算した。
A450calc(sample) = ([A450sample] - [A620sample]) - ([A450blank] - [A620blank])
6. 測定値は各条件において、3ウェルの平均を求め、標準偏差を誤差とした。
1. 35 mm dishにMDCK細胞1 x 104 cells/dishを1.5 ml/dishのMDCK細胞培養用培地中に播種し、CO2インキュベータ内(37℃, 5% CO2)で48時間培養した。
2. 各dishをPBSで洗浄後、FL-HA終濃度30 nM(プロトマー 90 nM)もしくはlinked-mini (2+3)/CB-LD/YFDY終濃度100 nMを3 dishずつ添加し、CO2インキュベータ内で48時間培養した。
3. 各dishをPBSで洗浄後、0.25% trypsin-EDTA [GIBCO] をdishへ添加し、CO2インキュベータ内で30分インキュベートした。その後FBS含有培地を各dishに添加し細胞を回収した。
4. 細胞計数盤ワンセルカウンター[OneCell]を用いて細胞数を計測した。
5. 細胞数は各群3 dishの平均を求め、標準偏差を誤差とした。
(1)完全なHA12量体(FL-HA)とHA3の一部を欠く単価型HA複合体(mini-HA)について、種々の濃度でCaco-2細胞におけるTER値に及ぼす効果を調べた。その結果、mini-HAは、FL-HAと同様にカドヘリン機能阻害活性を有することが示された(図2)。
また、mini(2+3)/CBにおいてHA2サブコンポーネントとHA3サブコンポーネントとをリンカーを介して連結すると、カドヘリン機能阻害活性は一時的なものから持続的なものへと変化した(図6、図7)。
また、B型HA1、HA2及びHA3サブコンポーネントを別個に発現させ、タグを用いて精製した後、これらを混合、インキュベートして再構成させたところ、再構成による収率を50-80%として計算した結果、合計3L培養に換算して、3xプロトマーを1分子として0.13-0.2μmol、プロトマーとして0.4-0.6umolが得られたのに対し、リンカーでHA2とHA3とを繋いだ場合、3L培養に換算すると、linked-mini(2+3)/BBで5.1μmol、linked-mini(2+3)/CBで3.3μmol、さらに変異を導入したlinked-mini(2+3)/CB-YFDYでは8.4μmolのHA複合体を回収することができ、単価分子あたり約10倍高い収率が得られた。
Claims (12)
- E-カドヘリンの機能阻害活性を有する小型化された、単価型又は3価型のヘマグルチニン複合体タンパク質であって、
(A)配列番号10で表されるB型ボツリヌス菌由来HA1サブコンポーネントの二量体、配列番号4で表されるB型ボツリヌス菌由来HA2サブコンポーネント、及び配列番号8で表されるB型ボツリヌス菌由来HA3サブコンポーネントの380番目のGluから626番目のAsnまでを含むフラグメントから構成される単価型複合体;
(B)配列番号8で表されるB型ボツリヌス菌由来HA3サブコンポーネントの380番目のGluから626番目のAsnまでを含むフラグメントのC末端アミノ酸と、配列番号4で表されるB型ボツリヌス菌由来HA2サブコンポーネントの2番目のSerから146番目のIleまでを含むフラグメントのN末端アミノ酸とが、GSGGDDPPGで示されるアミノ酸配列からなるリンカーによって連結された単価型複合体;
(C)配列番号8で表されるB型ボツリヌス菌由来HA3サブコンポーネントの380番目のGluから626番目のAsnまでを含むフラグメントのC末端アミノ酸と、配列番号5で表されるC型ボツリヌス菌由来HA2サブコンポーネントの2番目のSerから146番目のLeuまでを含むフラグメントのN末端アミノ酸とが、GSGGDDPPGで示されるアミノ酸配列からなるリンカーによって連結された単価型複合体;
(D)前記(C)の複合体のHA2サブコンポーネント中、配列番号5で表されるアミノ酸配列の73番目のTyrがAspに、75番目のPheがTyrにそれぞれ置換され、任意で40番目のLeuがAspにさらに置換されていてもよい、単価型複合体;
(E)配列番号8で表されるB型ボツリヌス菌由来HA3サブコンポーネントの380番目のGluから626番目のAsnまでを含むフラグメントと、配列番号5で表されるC型ボツリヌス菌由来HA2サブコンポーネントとから構成される単価型複合体;
(F)配列番号4で表されるB型ボツリヌス菌由来HA2サブコンポーネント、及び配列番号8で表されるB型ボツリヌス菌由来HA3サブコンポーネントから構成される3価型複合体;並びに
(G)配列番号8で表されるB型ボツリヌス菌由来HA3サブコンポーネントの380番目のGluから626番目のAsnまでを含むフラグメントのC末端アミノ酸と、配列番号4で表されるB型ボツリヌス菌由来HA2サブコンポーネントの2番目のSerから146番目のIleまでを含むフラグメントのN末端アミノ酸とが、GSGGDDPPGで示されるアミノ酸配列からなるリンカーによって連結されたタンパク質から構成される3価型複合体
からなる群より選択される、タンパク質。 - 前記(A)~(E)のいずれかの単価型複合体である、請求項1記載のヘマグルチニン複合体タンパク質。
- 前記(A)~(D)のいずれかの単価型複合体である、請求項1記載のヘマグルチニン複合体タンパク質。
- 前記(F)又は(G)の3価型複合体である、請求項1記載のヘマグルチニン複合体タンパク質。
- 請求項1~4のいずれか一項に記載のヘマグルチニン複合体タンパク質をコードする核酸。
- 請求項5記載の核酸を含有する発現ベクターが導入された宿主細胞を培養し、得られた培養物からヘマグルチニン複合体タンパク質又はそのサブコンポーネントを回収し、サブコンポーネントの場合は、さらに、得られたサブコンポーネント同士を接触させ、生成するヘマグルチニン複合体タンパク質を回収することを特徴とする、該ヘマグルチニン複合体タンパク質の製造方法。
- 請求項1~4のいずれか一項に記載のヘマグルチニン複合体タンパク質を含有してなる、E-カドヘリンの機能阻害剤。
- E-カドヘリンの機能が細胞間接着機能である、請求項7記載の阻害剤。
- 請求項1~4のいずれか一項に記載のヘマグルチニン複合体タンパク質を、細胞集団と接触させることを特徴とする、該細胞集団中の細胞間接着の阻害方法。
- 細胞集団が多能性幹細胞の集団である、請求項9記載の方法。
- 請求項1~4のいずれか一項に記載のヘマグルチニン複合体タンパク質を含有してなる、細胞の増殖促進剤。
- 請求項1~4のいずれか一項に記載のヘマグルチニン複合体タンパク質の存在下で、細胞を培養することを特徴とする、該細胞の増殖促進方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2017226370 | 2017-11-24 | ||
JP2017226370 | 2017-11-24 | ||
PCT/JP2018/043249 WO2019103111A1 (ja) | 2017-11-24 | 2018-11-22 | ヘマグルチニン複合体タンパク質及びその用途 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2019103111A1 JPWO2019103111A1 (ja) | 2020-12-03 |
JP7269605B2 true JP7269605B2 (ja) | 2023-05-09 |
Family
ID=66631636
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2019555374A Active JP7269605B2 (ja) | 2017-11-24 | 2018-11-22 | ヘマグルチニン複合体タンパク質及びその用途 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20210122790A1 (ja) |
EP (1) | EP3715378A4 (ja) |
JP (1) | JP7269605B2 (ja) |
WO (1) | WO2019103111A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2023149565A1 (ja) * | 2022-02-07 | 2023-08-10 | 国立大学法人大阪大学 | 多能性幹細胞から網膜色素上皮細胞への分化誘導方法 |
WO2023149566A1 (ja) * | 2022-02-07 | 2023-08-10 | 国立大学法人大阪大学 | 多能性幹細胞の分化誘導制御剤および分化誘導安定化剤 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2015199243A1 (ja) | 2014-06-27 | 2015-12-30 | 国立大学法人大阪大学 | 変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質、及びそれを用いた多能性を有する幹細胞の培養方法 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7514088B2 (en) * | 2005-03-15 | 2009-04-07 | Allergan, Inc. | Multivalent Clostridial toxin derivatives and methods of their use |
EP2773674A4 (en) * | 2011-11-04 | 2015-04-29 | Vaxinnate Corp | IMMUNOLOGICAL CONSTRUCTIONS AND ASSOCIATED METHODS |
CN105051185A (zh) | 2012-12-28 | 2015-11-11 | 国立大学法人大阪大学 | 具有多能性(pluripotency)的干细胞的培养方法 |
US10226529B2 (en) * | 2014-06-04 | 2019-03-12 | Osaka University | Adjuvant for mucosal vaccine |
JP2017226370A (ja) | 2016-06-24 | 2017-12-28 | アイシン・エィ・ダブリュ株式会社 | 車載机 |
-
2018
- 2018-11-22 WO PCT/JP2018/043249 patent/WO2019103111A1/ja unknown
- 2018-11-22 JP JP2019555374A patent/JP7269605B2/ja active Active
- 2018-11-22 US US16/766,596 patent/US20210122790A1/en active Pending
- 2018-11-22 EP EP18880123.7A patent/EP3715378A4/en active Pending
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2015199243A1 (ja) | 2014-06-27 | 2015-12-30 | 国立大学法人大阪大学 | 変異型ヘマグルチニン複合体タンパク質、及びそれを用いた多能性を有する幹細胞の培養方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
PLoS Pathog.,2013年,vol.9, no.10, article. e1003690(p.1-13) |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20210122790A1 (en) | 2021-04-29 |
EP3715378A4 (en) | 2021-09-01 |
WO2019103111A1 (ja) | 2019-05-31 |
JPWO2019103111A1 (ja) | 2020-12-03 |
EP3715378A1 (en) | 2020-09-30 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR101861872B1 (ko) | 항암 융합 단백질 | |
Sriram et al. | The N-end rule pathway: emerging functions and molecular principles of substrate recognition | |
AU2013280693B2 (en) | Split inteins, conjugates and uses thereof | |
JP7269605B2 (ja) | ヘマグルチニン複合体タンパク質及びその用途 | |
EP2871235A1 (en) | New methods to produce active hTERT | |
WO2021185360A1 (en) | Novel truncated sortase variants | |
US10323235B2 (en) | Reversible regulation of intein activity through engineered new zinc binding domain | |
KR20140019828A (ko) | 항암 융합 단백질 | |
KR20220034182A (ko) | 분자의 세포내 전달용 복합체 | |
KR101667023B1 (ko) | 무세포 단백질 합성 방법을 이용하여 생산된 항체의 세포질 내로의 유입을 간편하게 분석하는 방법 | |
JP4960454B2 (ja) | 細胞膜透過伝達ペプチド及びこれを含む生物製剤 | |
US10253064B2 (en) | Purification method, purification kit, and silicon oxide-binding tag for use therein | |
AU2004276687B2 (en) | Method of cleaving polypeptide by using OmpT protease mutant | |
KR101106262B1 (ko) | 인간 호메오 도메인 유전자 유래의 단백질 도입 도메인 및 이를 이용한 단백질 도입 벡터 | |
KR101505697B1 (ko) | 시스토바이러스 파이12의 외피막 단백질 피9을 융합파트너로 포함하는 막 단백질 발현벡터 및 이를 이용한 막 단백질 제조 방법 | |
RU2802488C1 (ru) | Белковая конструкция на основе рецептор-специфичного мутантного варианта противоопухолевого цитокина TRAIL в виде гибридного белка с пептидом, специфичным к интегрину αvβ3, для терапии солидных опухолей | |
EP1362120A1 (en) | Method for purification of soluble ssao | |
Hai et al. | The role of the C-terminal region of cyanophycin synthetase from Nostoc ellipsosporum NE1 in its enzymatic activity and thermostability: A key function of Glu856 | |
WO2024019642A1 (ru) | ГИБРИДНАЯ БЕЛКОВАЯ КОНСТРУКЦИЯ НА ОСНОВЕ РЕЦЕПТОР-СПЕЦИФИЧНОГО ВАРИАНТА TRAIL С ПЕПТИДОМ, СПЕЦИФИЧНЫМ К αVβ3-ИНТЕГРИНУ | |
CA2296508A1 (en) | Structure of the ankyrin binding domain of a alpha-na,k-atpase | |
Rodríguez Gallardo et al. | Production of Cell-Penetrating Peptides in Escherichia coli Using an Intein-Mediated System | |
CN106536731A (zh) | 基质金属蛋白酶7(mmp‑7)聚集体的单体化方法 | |
AU2002232349A1 (en) | Method for purification of soluble SSAO |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A529 | Written submission of copy of amendment under article 34 pct |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A5211 Effective date: 20200519 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20210910 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20220823 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20221021 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20221222 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20230314 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230317 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20230404 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20230412 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7269605 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |