WO2015053523A1 - 항체 발현용 바이시스트로닉 발현벡터 및 이를 이용한 항체의 생산 방법 - Google Patents

항체 발현용 바이시스트로닉 발현벡터 및 이를 이용한 항체의 생산 방법 Download PDF

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김영민
손용규
안용호
이동헌
이양순
전희정
최유빈
김은아
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    • C12N2840/203—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES

Definitions

  • the present invention provides a composition comprising (i) a first expression cassette comprising a 'promoter-untranslation region (UTR) -intron-antibody light chain gene-polyA'; And (ii) a second expression cassette comprising a 'promoter-UTR-intron-antibody heavy chain gene-IRES (internal ribosome entry site) -amplification gene-polyA', a bisstronic expression vector for antibody expression, said expression
  • the present invention relates to a method for producing an antibody comprising the transformed animal cell and the animal cell.
  • Immunoglobulin G (IgG) gene which is widely used as a therapeutic antibody, is composed of a heavy chain gene and a light chain gene. The heavy and light chain proteins produced from each gene bind to one another during the folding process and secrete out of the cell.
  • CHO cells Choinese hamster ovary cells, Chinese hamster ovary cells
  • CHO cells Choinese hamster ovary cells, Chinese hamster ovary cells
  • a representative method is to select a strong promoter to increase gene expression rate.
  • the promoter has a binding position of various transcription factors and a TATA box, and the amount of gene expression depends largely on the performance of the promoter as an element on DNA where RNA polymerase binds to start mRNA synthesis. For high antibody expression, it is appropriate to always have high expression.
  • Representative strong promoters include SV40 (simian virus 40) promoter, CMV (Cytomegalovirus) promoter and EF1- ⁇ (Elongation factor1- ⁇ ) promoter.
  • the method is to transform a foreign gene into a cell, and then use a chemical agent to select and culture the cell so that only the cell whose foreign gene is recombined with the chromosome can be separated, and then express more protein.
  • increased amounts of chemicals are added to the medium to induce amplification of the foreign genes recombined on the chromosome.
  • DHFR dehydrofolate reductase
  • GS glucose synthetase
  • Drugs used to amplify these amplification genes are methotrexate (hereinafter referred to as MTX) for DHFR and methionine sulfoximine (hereinafter referred to as MSX) for GS.
  • MTX methotrexate
  • MSX methionine sulfoximine
  • the plasmid vector DNA including the heavy and light chain genes to be expressed and the vector DNA having the amplification gene are simultaneously transformed into the cells, and the two DNAs are simultaneously present on the chromosome.
  • a method is used to isolate inserted cell lines (Kaufman, Methods in Enz. (1990) 185, 487), or to express amplified genes in one vector by the SV40 promoter, thereby separating the cell lines in which the vector is inserted into the chromosome. .
  • Another method for amplifying gene expression is to prepare bicistronic vectors.
  • eukaryotes unlike prokaryotes, in principle, one mRNA is produced by one promoter, and only the genes are decoded to synthesize proteins.
  • some viruses have a sequence that can bind to ribosomes in the middle of the mRNA, allowing the synthesis of several proteins in a single mRNA.
  • the antibody gene and the amplification gene are expressed by different promoters, only the amplification gene portion may be amplified when the gene is amplified, and the amplification of the antibody gene may not be performed. Since the internal ribosome entry site (IRS) is expressed from the same promoter, This problem can be avoided.
  • such bicistronic vector strategy still has the disadvantage that it can not produce the desired protein in excess, a stronger strategy is required.
  • Bevacizumab (also known as Avastin ® ) is a humanized antibody against VEGF developed by Genentech in the United States and acts as an angiogenesis inhibitor, and is responsible for colorectal cancer, lung cancer, kidney cancer and brain cancer. It is attracting attention as an antibody therapeutic agent whose main indication is a treatment.
  • Tocilizumab (also known as Actemra ® ) is a human monoclonal antibody directed against the IL-6 receptor developed by the Swiss pharmaceutical company Roche, and is the product name Actemra. Has been approved for rheumatoid arthritis.
  • Denosumab also called Prolia ®
  • Prolia ® is a human monoclonal antibody against the Receptor activator of NF-kB ligand (RANKL), developed by Amgen, USA. It was approved for osteoporosis indications in Canada and Europe, and under the name Xgeva, it was approved as a drug to prevent fractures in patients with solid cancers that had metastasized to bone in Europe.
  • Valley mumap (Belimumab, also called Benlysta ®) is a human monoclonal antibodies to a soluble B lymphocyte stimulating factor (B Lymphocyte Stimulator, BLyS) developed by the international pharmaceutical company GlaxoSmithKline (GlaxoSmithKline, GSK) Inc., USA Has been approved for lupus (systemic lupus erythematosus, SLE) in Canada, and Europe.
  • Golimumab also known as Simponi ®
  • Simponi is a human single to TNF ⁇ developed by Janssen Biotech, Inc. (formerly Centocor), a subsidiary of Johnson & Johnson, a global pharmaceutical company.
  • Simponi As a cloned antibody, it has been approved for rheumatoid arthritis, psoriatic arthritis and ankylosing spondylitis indications in the United States, Canada and Korea under the product name Simponi.
  • Ustekinumab (also known as Stelara ® ) is also known as Interleukin-12 (IL-12) and Interleukin-23, developed by multinational pharmaceutical company Janssen Pharmaceuticals, Inc. 23, IL-23) is a human monoclonal antibody against psoriatic arthritis from the US Food and Drug Administration (FDA), severe psoriasis, moderate Clinical trials are ongoing for moderate-to-severe plaque psoriasis, multiple sclerosis and sarcoidosis.
  • Ipilimumab (also known as Yervoy ® ) is a cytotoxic T-Lymphocyte Antigen, CTLA, developed by Bristol-Myers Squibb Co., BMS, an American pharmaceutical company.
  • the present inventors have made diligent efforts to find a method that can induce gene expression in a variety of mammalian cells robustly and stably, and thus produced a bistronic expression vector including an untranslation region (UTR) and an intron in an existing expression vector.
  • the present invention was completed by confirming that the light and heavy chain genes of various antibody therapeutic agents can be simultaneously expressed together with the amplification gene.
  • One object of the present invention is a first expression cassette comprising a 'promoter-untranslation region (UTR) -intron-antibody light chain gene-polyA' and a 'promoter-UTR-intron-antibody heavy chain gene-IRES (internal ribosome entry site) It is to provide a biscistronic expression vector for antibody expression comprising a second expression cassette comprising an amplification gene-polyA '.
  • UTR 'promoter-untranslation region
  • IRES internal ribosome entry site
  • Another object of the present invention is to provide an animal cell transformed with the expression vector.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for producing an antibody comprising culturing the animal cells.
  • an expression vector capable of expressing a desired antibody with high efficiency can be prepared, and the animal cell transformed with the expression vector is cultured. Antibodies can be produced stably and with high efficiency.
  • FIG. 1 is a diagram showing the configuration of the gene fragments Gln-LC and Gln-HC according to the present invention.
  • Figure 2 is a diagram showing the manufacturing process of the GS-Gln-LC of the present invention.
  • FIG. 3 is a diagram illustrating a manufacturing process of a pCYBIG vector including a GS gene according to the present invention by inserting Gln-HC into GS-Gln-LC of the present invention.
  • Figure 4 is a diagram showing the manufacturing process of the pCYBID vector containing the DHFR gene according to the present invention from the pCYBIG vector of the present invention.
  • Figure 5 is a diagram showing the manufacturing process of the light chain / heavy chain expression vector pCYB204IG of bevacizumab including the GS gene according to the present invention.
  • Figure 6 is a diagram showing the manufacturing process of the light chain / heavy chain expression vector pCYB204ID of bevacizumab including the DHFR gene according to the present invention.
  • Figure 7a is the result of confirming the antibody expression amount of the cell line transformed with pCYB204IG at MSX concentration 500uM.
  • Figure 7b is the result of confirming the antibody expression amount of the cell line transformed with pCYB204ID in MTX 800nM.
  • FIG. 8 schematically shows a restriction map of the expression vector pCYBBSS001 used in the present invention.
  • FIG. 9 schematically shows a restriction map of the expression vector pCYBBSS002 used in the present invention.
  • Figure 10 schematically shows a restriction map of the expression vector pCYBBSS003 used in the present invention.
  • Fig. 11 schematically shows a restriction map of the expression vector pCYBBSS004 used in the present invention.
  • Fig. 12 schematically shows a restriction map of the expression vector pCYBBSS005 used in the present invention.
  • Fig. 13 schematically shows a restriction map of the expression vector pCYBBSS006 used in the present invention.
  • the present invention is (i) a first expression cassette comprising a 'promoter-untranslation region (UTR) -intron-antibody light chain gene-polyA'; And (ii) a second expression cassette comprising a 'promoter-UTR-intron-antibody heavy chain gene-IRES (internal ribosome entry site) -amplification gene-polyA'.
  • a first expression cassette comprising a 'promoter-untranslation region (UTR) -intron-antibody light chain gene-polyA'
  • a second expression cassette comprising a 'promoter-UTR-intron-antibody heavy chain gene-IRES (internal ribosome entry site) -amplification gene-polyA'.
  • the present invention provides a biscistronic expression vector designed to express the heavy and light chain genes and the amplification genes of an antibody as one gene, including UTR and introns, so as to induce gene expression in a variety of mammalian cells. There is that characteristic in what can be.
  • the present invention provides new expression cassettes comprising UTRs and introns.
  • the present invention provides a composition comprising: (i) a first expression cassette comprising a 'promoter-UTR (untranslation region) -intron-bevacizumab light chain gene-polyA'; And (ii) a second expression cassette comprising a 'promoter-UTR-intron-bevacizumab heavy chain gene-IRES (internal ribosome entry site) -amplification gene-polyA' to provide.
  • a composition comprising: (i) a first expression cassette comprising a 'promoter-UTR (untranslation region) -intron-bevacizumab light chain gene-polyA'; And (ii) a second expression cassette comprising a 'promoter-UTR-intron-bevacizumab heavy chain gene-IRES (internal ribosome entry site) -amplification gene-polyA' to provide.
  • a first expression cassette comprising a 'promoter-UTR (
  • the present invention provides a kit comprising: (i) a first expression cassette comprising a 'promoter-untranslation region (UTR) -intron-tocilizumab light chain gene-polyA'; And (ii) a second expression cassette comprising a 'promoter-UTR-intron-tosilizumab heavy chain gene-IRES (internal ribosome entry site) -amplification gene-polyA' to provide.
  • a first expression cassette comprising a 'promoter-untranslation region (UTR) -intron-tocilizumab light chain gene-polyA'
  • a second expression cassette comprising a 'promoter-UTR-intron-tosilizumab heavy chain gene-IRES (internal ribosome entry site) -amplification gene-polyA' to provide.
  • the present invention provides a kit comprising: (i) a first expression cassette comprising a 'promoter-untranslation region (UTR) -intron-Denosumab light chain gene-polyA'; And (ii) a second expression cassette comprising a promoter-UTR-intron-denosumab heavy chain gene-IRES (internal ribosome entry site) -amplification gene-polyA ' to provide.
  • a first expression cassette comprising a 'promoter-untranslation region (UTR) -intron-Denosumab light chain gene-polyA'
  • a second expression cassette comprising a promoter-UTR-intron-denosumab heavy chain gene-IRES (internal ribosome entry site) -amplification gene-polyA ' to provide.
  • the present invention provides a kit comprising: (i) a first expression cassette comprising a 'promoter-untranslation region (UTR) -intron-belimab light chain gene-polyA'; And (ii) a second expression cassette comprising a 'promoter-UTR-intron-belimumab heavy chain gene-internal ribosome entry site (IRES) -amplification gene-polyA'.
  • a kit comprising: (i) a first expression cassette comprising a 'promoter-untranslation region (UTR) -intron-belimab light chain gene-polyA'; And (ii) a second expression cassette comprising a 'promoter-UTR-intron-belimumab heavy chain gene-internal ribosome entry site (IRES) -amplification gene-polyA'.
  • the present invention provides a kit comprising: (i) a first expression cassette comprising a 'promoter-untranslation region (UTR) -intron-Golimumab light chain gene-polyA'; And (ii) a second expression cassette comprising a 'promoter-UTR-intron-golimumab heavy chain gene-IRES (internal ribosome entry site) -amplification gene-polyA'. do.
  • a first expression cassette comprising a 'promoter-untranslation region (UTR) -intron-Golimumab light chain gene-polyA'
  • a second expression cassette comprising a 'promoter-UTR-intron-golimumab heavy chain gene-IRES (internal ribosome entry site) -amplification gene-polyA'.
  • the present invention provides an antibody comprising: (i) a first expression cassette comprising a 'promoter-untranslation region (UTR) -intron-Ustekinumab light chain gene-polyA'; And (ii) a second expression cassette comprising a 'promoter-UTR-intron-usstekinumab heavy chain gene-internal ribosome entry site (IRES) -amplification gene-polyA' To provide.
  • a first expression cassette comprising a 'promoter-untranslation region (UTR) -intron-Ustekinumab light chain gene-polyA'
  • a second expression cassette comprising a 'promoter-UTR-intron-usstekinumab heavy chain gene-internal ribosome entry site (IRES) -amplification gene-polyA'
  • the present invention provides a kit comprising: (i) a first expression cassette comprising a 'promoter-untranslation region (UTR) -intron-Ipilimumab light chain gene-polyA'; And (ii) a second expression cassette comprising a 'promoter-UTR-intron-ipilimumab heavy chain gene-internal ribosome entry site (IRES) -amplification gene-polyA' to provide.
  • a first expression cassette comprising a 'promoter-untranslation region (UTR) -intron-Ipilimumab light chain gene-polyA'
  • a second expression cassette comprising a 'promoter-UTR-intron-ipilimumab heavy chain gene-internal ribosome entry site (IRES) -amplification gene-polyA' to provide.
  • bicistronic refers to a system in which a ribosome can synthesize a polypeptide even inside an mRNA in a eukaryotic cell, whereby several proteins can be synthesized from one mRNA.
  • Vector we designed a vector so that antibody and amplification genes can be expressed at the same time.
  • prokaryotic cells such as E. coli have a polycistronic system that allows ribosomes to bind to multiple sites in one mRNA to synthesize multiple proteins at once, whereas in eukaryotic cells, translation of proteins from mRNA
  • a scanning method is used to find the start codon AUG, and as a result of the synthesis of the protein from this AUG codon, one polypeptide must be formed from one mRNA. It is known to have a monocistronic system, and the Kozac sequence plays an important role in the recognition of ATG and the start of protein synthesis.
  • EMC virus Esphalomyocarditis virus, hereinafter referred to as ⁇ EMCV ''
  • ⁇ EMCV '' has an RNA sequence with a special structure called the internal ribosome entry site (IRES).
  • IRES internal ribosome entry site
  • Several proteins can be synthesized from a single mRNA in eukaryotic cells (Jang et al., J. Virol. (1989) 63, 1651).
  • the vector was designed so that the IRES comes after the heavy chain gene of the antibody and then the amplification gene.
  • vector refers to a gene construct including an essential regulatory element such as a promoter so that a target gene can be expressed in a suitable host cell, and for the purposes of the present invention, it is preferable to express an antibody.
  • a vector of the present invention may comprise (i) a first expression cassette comprising a 'promoter-untranslation region (UTR) -intron-bevacizumab light chain gene-polyA'; And (ii) a second expression cassette comprising a promoter-untranslation region (UTR) -intron-bevacizumab heavy chain gene-IRES (internal ribosome entry site) -amplification gene-polyA ' Cystronic expression vector.
  • a first expression cassette comprising a 'promoter-untranslation region (UTR) -intron-bevacizumab light chain gene-polyA'
  • a second expression cassette comprising a promoter-untranslation region (UTR) -intron-bevacizumab heavy chain gene-IRES (internal ribosome entry site) -amplification gene-polyA ' Cystronic expression vector.
  • a vector of the present invention may comprise (i) a first expression cassette comprising a 'promoter-untranslation region (UTR) -intron-tocilizumab light chain gene-polyA'; And (ii) a bicistronic expression for tocilizumab expression comprising a second expression cassette comprising a 'promoter-UTR-intron-tosilizumab heavy chain gene-internal ribosome entry site (IRES) -amplification gene-polyA' It may be a vector.
  • a first expression cassette comprising a 'promoter-untranslation region (UTR) -intron-tocilizumab light chain gene-polyA'
  • a bicistronic expression for tocilizumab expression comprising a second expression cassette comprising a 'promoter-UTR-intron-tosilizumab heavy chain gene-internal ribosome entry site (IRES) -amplification gene-polyA'
  • a vector of the present invention may comprise (i) a first expression cassette comprising a 'promoter-untranslation region (UTR) -intron-Denosumab light chain gene-polyA'; And (ii) a bistronic expression for denosumab expression comprising a second expression cassette comprising a 'promoter-UTR-intron-denosumab heavy chain gene-internal ribosome entry site (IRES) -amplification gene-polyA' It may be a vector.
  • a first expression cassette comprising a 'promoter-untranslation region (UTR) -intron-Denosumab light chain gene-polyA'
  • a bistronic expression for denosumab expression comprising a second expression cassette comprising a 'promoter-UTR-intron-denosumab heavy chain gene-internal ribosome entry site (IRES) -amplification gene-polyA'
  • IRS ribo
  • the vector of the present invention may comprise (i) a first expression cassette comprising a 'promoter-untranslation region (UTR) -intron-golimumab light chain gene-polyA'; And (ii) a second expression cassette comprising a promoter-UTR-intron-golimumab heavy chain gene-IRES (internal ribosome entry site) -amplification gene-polyA ' Can be.
  • a first expression cassette comprising a 'promoter-untranslation region (UTR) -intron-golimumab light chain gene-polyA'
  • a second expression cassette comprising a promoter-UTR-intron-golimumab heavy chain gene-IRES (internal ribosome entry site) -amplification gene-polyA ' Can be.
  • a vector of the present invention may comprise (i) a first expression cassette comprising a 'promoter-untranslation region (UTR) -intron-belimumab light chain gene-polyA'; And (ii) a bicistronic for belimumab expression comprising a second expression cassette comprising a 'promoter-untranslation region (UTR) -intron-belimumab heavy chain gene-internal ribosome entry site (IRES) -amplification gene-polyA' It may be an expression vector.
  • a first expression cassette comprising a 'promoter-untranslation region (UTR) -intron-belimumab light chain gene-polyA'
  • a bicistronic for belimumab expression comprising a second expression cassette comprising a 'promoter-untranslation region (UTR) -intron-belimumab heavy chain gene-internal ribosome entry site (IRES)
  • a vector of the present invention may comprise (i) a first expression cassette comprising a 'promoter-untranslation region (UTR) -intron-usstekinumab light chain gene-polyA'; And (ii) a Ustekinumab expression comprising a second expression cassette comprising a 'promoter-untranslation region (UTR) -intron-Ustekinumab heavy chain gene-internal ribosome entry site (IRES) -amplification gene-polyA'
  • UTR 'promoter-untranslation region
  • IVS ribosome entry site
  • a vector of the present invention may comprise (i) a first expression cassette comprising a 'promoter-untranslation region (UTR) -intron-ipilimumab light chain gene-polyA'; And (ii) a second expression cassette comprising a promoter-untranslation region (UTR) -intron-ipilimumab heavy chain gene-IRES (internal ribosome entry site) -amplification gene-polyA ' Cystronic expression vector.
  • a first expression cassette comprising a 'promoter-untranslation region (UTR) -intron-ipilimumab light chain gene-polyA'
  • a second expression cassette comprising a promoter-untranslation region (UTR) -intron-ipilimumab heavy chain gene-IRES (internal ribosome entry site) -amplification gene-polyA ' Cystronic expression vector.
  • promoter means a DNA sequence region to which transcriptional regulators bind, and for the purpose of the present invention, a promoter capable of inducing strong and stable gene expression may be used.
  • the promoter is not limited thereto, but may be preferably selected from the group consisting of an SV40 (simian virus 40) early promoter, a CMV (Cytomegalovirus) promoter, and an EF1- ⁇ (elongation factor1- ⁇ ) promoter, and the EF1- ⁇ May be hEF1- ⁇ (human elongation factor1- ⁇ ). More preferably, it may be a cytomegalovirus promoter, and most preferably, a promoter of strain Cytomegalovirus strainAD169.
  • an expression vector is prepared by inserting a promoter on one of the most powerful animal cell promoters known to date, Cytomegalovirus strainAD169 genome (genBank: X17403.1), to induce high antibody expression. It was.
  • the term “UTR (untranslation region)” refers to a non-translated portion of mRNA and generally refers to both ends of a coding region.
  • the 5 'terminal portion is referred to as 5' UTR and the 3 'terminal portion is referred to as 3'UTR.
  • the UTR in the present invention is not limited as long as it has the effect of increasing the expression level of the gene contained in the biscistronic vector of the present invention.
  • it may be a UTR derived from CMV.
  • the present invention is characterized by providing a new antibody expression vector for the first time that the expression level of a gene into which a bicistronic expression vector including an expression cassette including such UTR and intron is simultaneously increased is increased.
  • the UTR of the present invention is not limited thereto, but may preferably be a UTR of Cytomegalovirus strainAD169 of SEQ ID NO.
  • the expression vector was prepared by inserting between the promoter and the antibody light and heavy chain genes, respectively, using UTR on the Cytomegalovirus strainAD169 genome (genBank: X17403.1) sequence for more robust gene expression.
  • the term "intron” is a characteristic sequence found in eukaryotic cells, and means a DNA region that does not have a genetic information and does not make a protein, and is transcribed when mRNA is synthesized by an RNA polymerase in a nucleus. However, it is removed by splicing as it exits the nucleus. As the results of studies accumulate that the expression level of the plasmid containing the untranslated exon is higher than that without the intron, the heterologous intron is introduced into the recombinant expression vector, resulting in more stable and continuous gene expression. Improved vectors have been developed and used to make this possible.
  • the conventional intron insertion vector has a disadvantage of expressing only one gene used in the monocystronic vector. Accordingly, the present inventors have devised a high-efficiency gene expression when the external intron gene is inserted after the promoter in the bicistronic vector system.
  • the introns of the invention can be introns derived from CMV.
  • the intron of the present invention is not limited thereto, but may preferably be an intron of Cytomegalovirus strainAD169 of SEQ ID NO.
  • an intron on the Cytomegalovirus strainAD169 genome (genBank: X17403.1) sequence was used to construct a stronger promoter, and the expression vector was prepared by inserting the promoter and the antibody light and heavy chain genes, respectively. .
  • Expression vectors of the present invention may be the same or different from the origin of the promoter, UTR, intron.
  • the promoter may be an SV40 initial promoter, and the UTR and the intron may be derived from SV40;
  • the promoter is a CMV promoter, and the UTR and the intron may be from CMV;
  • the promoter may be a hEF1- ⁇ promoter, the UTR and the intron may be derived from hEF1- ⁇ .
  • the term "amplification gene” refers to a gene that is amplified to induce to express it stably with the antibody gene to be stably expressed in the present invention, a cell in which the amplification gene and the antibody gene are recombined into an intracellular chromosome.
  • Cells without amplification genes can be amplified using chemicals, using the principle that cells without amplification genes are not grown in the presence of treated chemicals.
  • the biscistronic expression vector of the present invention the amplification gene and the antibody gene are induced to be expressed together as a single gene, thereby ultimately expressing a desired antibody gene.
  • the amplification gene may be, but is not limited to, glutamine synthetase (GS) or dehydrofolate reductase (DHFR).
  • GS glutamine synthetase
  • DHFR dehydrofolate reductase
  • pCYB204IG expression vector using GS as amplification gene and pCYB204ID expression vector using DHFR as amplification gene were prepared (FIGS. 5 and 6), pCYBBSS001 (FIG. 8), pCYBBSS002 (FIG. 9), and pCYBBSS003 ( 10), pCYBBSS004 (FIG. 11), pCYBBSS005 (FIG. 12), pCYBBSS006 (FIG. 13) expression vectors were constructed and confirmed that the expression vectors were useful for high expression of the antibody gene.
  • the term "antibody” refers to a substance that is produced by stimulation of an antigen in the immune system, and specifically binds to a specific antigen, which floats lymph and blood to generate an antigen-antibody reaction.
  • the antibody is intended to continuously express high, can be induced to express the antibody genes strongly and stably using the expression vector of the present invention, transforming the expression vector Animal cells can be used to efficiently produce antibodies.
  • the antibody is a protein coupled with an amino acid and oligosaccharide, and two light chains and two heavy chains are formed as Y-shaped proteins through disulfide bonds.
  • an expression vector capable of producing an antibody having both light and heavy chains was prepared by preparing a vector including a light chain expression cassette and a heavy chain expression cassette of an antibody including UTR and intron in one vector.
  • Antibodies of the present invention may include, but are not limited to, all therapeutic antibodies that are commonly used in the art. Examples include bevacizumab, an antibody that targets vascular endothelial growth factor-A, and tocilizumab, an antibody that targets the IL-6 receptor, Receptor activator of NF-kB ligand Denosumab, an antibody targeting (RANKL), Belimumab, an antibody against soluble B Lymphocyte Stimulator (BLyS), and Golimumab, an antibody targeting TNF ⁇ , Ustekinumab and Cytotoxic T Lymphocyte Antigen-4, which are antibodies against Interleukin-12 (IL-12) and Interleukin-23 (IL-23) It may be selected from the group consisting of Ipilimumab (antipimumumab), an antibody targeting.
  • Ipilimumab an antibody targeting.
  • Bevacizumab also known as Avastin
  • Avastin is a humanized antibody developed by Genentech in the US, which is known as an antibody treatment for colorectal cancer, lung cancer, kidney cancer, and brain cancer.
  • the bevacizumab a representative therapeutic antibody
  • the bicystronic expression vector for antibody expression of the present invention it was confirmed that the antibody is effectively produced.
  • the tocilizumab is a human monoclonal antibody developed by the Swiss subsidiary of Chugai, a Japanese subsidiary of Roche Co., Ltd., and is used as a therapeutic agent for rheumatoid arthritis in the United States, Europe, and Japan under the product name Actemra. Approved.
  • the bisstronic expression vector of the present invention is confirmed to be effective by producing the antibody. It was confirmed that the system is a high expression of Jumab antibody.
  • the denosumab is a human monoclonal antibody developed by Amgen, USA, and is approved for osteoporosis indications in the United States, Canada, and Europe under the product name Prolia, and the product name Xgeva. In Europe, it was approved as a drug to prevent fractures in patients with solid cancers that have metastasized to bone.
  • the denosumab when the denosumab is introduced into the biscistronic expression vector for antibody expression of the present invention, it is confirmed that the antibody is produced effectively, and the bisstronic expression vector of the present invention is denosumab. It was confirmed that the system is a high expression of the antibody.
  • the belimumab is a human monoclonal for soluble B lymphocyte stimulator (B Lymphocyte Stimulator, BLyS; or B cell activating factor, BAFF) developed by the multinational pharmaceutical company GlaxoSmithKline (GSK). As antibodies, it has been approved for lupus (systemic lupus erythematosus, SLE) in the United States, Canada, and Europe.
  • B Lymphocyte Stimulator BLyS
  • BAFF B cell activating factor
  • GSK GlaxoSmithKline
  • the bicistronic expression vector of the present invention highly expresses the belimumab antibody by introducing belimumab into the bicistronic expression vector for antibody expression of the present invention and confirming that the antibody is effectively produced. It was confirmed that the system.
  • the golimumab is a human monoclonal antibody developed by Janssen Biotech, Inc., formerly Centocor, a subsidiary of global pharmaceutical company Johnson & Johnson. Has been approved for the treatment of rheumatoid arthritis, psoriatic arthritis and ankylosing spondylitis in the United States, Canada and Korea.
  • the bicistronic expression vector of the present invention is effective in confirming that the antibody is produced. It was confirmed that the system is highly expressed.
  • the Ustekinumab is a human single to Interleukin-12 (IL-12) and Interleukin-23 (IL-23) developed by the multinational pharmaceutical company Janssen Pharmaceuticals, Inc.
  • IL-12 Interleukin-12
  • IL-223 Interleukin-23
  • FDA US Food and Drug Administration
  • the bisistonic expression vector of the present invention is introduced into the bisistonic expression vector by confirming that Ustekinumab is introduced into the bistronic expression vector for antibody expression according to the present invention, thereby effectively producing the antibody. It was confirmed that the system is a high expression of the antibody.
  • Ipilimumab is a human monoclonal against cytotoxic T-Lymphocyte Antigen (CTLA-4) developed by Bristol-Myers Squibb Co. (BMS), an American pharmaceutical company. As an antibody, it is approved for melanoma and skin cancer by the US Food and Drug Administration (FDA) under the product name of Yervoy, and is a non-small cell lung carcinoma (NSCLC) and small cell cancer (small cell). lung cancer (SCLC), bladder cancer and metastatic hormone-refractory prostate cancer.
  • FDA US Food and Drug Administration
  • NSCLC non-small cell lung carcinoma
  • SCLC small cell cancer
  • the FDA's approved forecast for melanoma treatment is administered in the form of an intravenous injection and works by helping the human immune system to target and attack tumor cells that form melanoma.
  • the bicistronic expression vector of the present invention is characterized by introducing ipilimumab into the bicistronic expression vector for antibody expression of the present invention and confirming that the antibody is effectively produced. It was confirmed that the system is highly expressed.
  • the "antibody light chain gene” refers to a gene encoding a light chain portion in an antibody in which two light chains and two heavy chains are Y-shaped proteins joined with amino acids and oligosaccharides.
  • the antibody light chain gene includes, without limitation, the light chain gene for any antibody whose expression level is increased by using the bicistronic vector of the present invention.
  • the therapeutic antibodies bevacizumab, tocilizumab, It may be a nucleotide sequence encoding the light chain portion of denosumab, belimumab, golimumab, Ustekinumab or Ipilimumab.
  • SEQ ID NO: 13 for the light chain portion of bevacizumab SEQ ID NO: 17 for the light chain portion of tocilizumab, SEQ ID NO: 21 for the light chain portion of denosumab, SEQ ID 25 for the light chain portion of belimumab, Consisting of a base sequence encoding an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 29 for the light chain portion of golimumab, SEQ ID NO: 33 for the light chain portion of Ustekinumab, and SEQ ID NO: 37 for the light chain portion of Ipilimumab More specifically, SEQ ID NO: 11 encoding the light chain portion of bevacizumab, SEQ ID NO: 15 encoding the light chain portion of tocilizumab, SEQ ID NO: 19 encoding the light chain portion of denosumab, light chain of belimumab SEQ ID NO: 23 encoding the portion, SEQ ID NO: 27 encoding the light chain portion of golimuma
  • the "antibody heavy chain gene” refers to a gene encoding a heavy chain portion in an antibody in which two light chains and two heavy chains are Y-shaped proteins joined with amino acids and oligosaccharides.
  • the antibody heavy chain gene may include without limitation the heavy chain gene for any antibody whose expression level is increased by using the bicistronic vector of the present invention.
  • the therapeutic antibodies bevacizumab, tocilizumab, It may be a sequence encoding the heavy chain portion of denosumab, belimumab, golimumab, Ustekinumab or Ipilimumab.
  • SEQ ID NO: 14 for the heavy chain portion of bevacizumab SEQ ID NO: 18 for the heavy chain portion of tocilizumab, SEQ ID NO: 22 for the heavy chain portion of denosumab, SEQ ID NO: 26 for the heavy chain portion of belimumab, Consisting of a base sequence encoding an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 30 for the heavy chain portion of golimumab, SEQ ID 34 for the heavy chain portion of Ustekinumab, and SEQ ID NO: 38 for the heavy chain portion of Ipilimumab More specifically, SEQ ID NO: 12 encoding the heavy chain portion of bevacizumab, SEQ ID NO: 16 encoding the heavy chain portion of tocilizumab, SEQ ID NO: 20 encoding the heavy chain portion of denosumab, heavy chain of belimumab SEQ ID NO: 24 encoding the portion, SEQ ID NO: 28 encoding the heavy chain portion of golimuma
  • IRES internal ribosome entry site, internal ribosome entry point, SEQ ID NO: 4
  • SEQ ID NO: 4 refers to a specific region present inside the mRNA to which ribosomes directly bind to enable the synthesis of several proteins from one mRNA in eukaryotic cells. Means, and serves to enable the expression vector of the present invention to be a bicistronic expression vector.
  • the translation of mRNA in eukaryotic cells is generally cap structure dependent at the 5 'end of the mRNA, but in this cap structure independent translation, ribosomes bind directly to specific regions within the mRNA and begin translation. This may be referred to as an internal start mechanism.
  • the site on the mRNA directly bound to the ribosomes in the internal initiation mechanism is called IRES.
  • IRES The site on the mRNA directly bound to the ribosomes in the internal initiation mechanism.
  • viral mRNAs such as poliovirus and EMC virus, immunoglobulin heavy chain binding protein (BiP) mRNA, Drosophila antenna gene (Antp) mRNA, etc. Is also found.
  • polyA refers to a polyadenylic acid or polyadenylic acid fragment, and refers to a contiguous arrangement of adenylic acid commonly present at the mRNA 3 'end of a eukaryotes.
  • the length is about 10 to 200 nucleotides, and can be variously adjusted according to the allowable size of the expression vector backbone.
  • polyA is known to be involved in stabilizing, detoxifying mRNA and transporting from the nucleus to the cytoplasm.
  • the biscistronic expression vector for antibody production of the present invention is not limited thereto, but preferably, pCYB204IG shown in FIG. 5, pCYB204ID shown in FIG. 6, pCYBBSS001 shown in FIG. 8, pCYBBSS002 shown in FIG. 9, and FIG. PCYBBSS003 shown in FIG. 10, pCYBBSS004 shown in FIG. 11, pCYBBSS005 shown in FIG. 12, or pCYBBSS006 shown in FIG. 13.
  • the pCYB204IG expression vector comprises a first expression cassette comprising a 'CMV promoter-UTR-intron-bevacizumab light chain gene-polyA' and a 'CMV promoter-UTR-intron-bevacizumab heavy chain gene-IRES-GS-polyA'.
  • the pCYBBSS001 expression vector comprises a first expression cassette comprising a 'CMV promoter-UTR-intron-tosilizumab light chain gene-polyA' and a 'CMV promoter-UTR-intron-tosilizumab heavy chain gene-IRES-DHFR-polyA'. Expression vector comprising a second expression cassette comprising.
  • the pCYBBSS002 expression vector comprises a first expression cassette comprising a 'CMV promoter-UTR-intron-denosumab light chain gene-polyA' and a 'CMV promoter-UTR-intron-denosumab heavy chain gene-IRES-DHFR-polyA'. Expression vector comprising a second expression cassette comprising.
  • the pCYBBSS003 expression vector comprises a first expression cassette comprising a 'CMV promoter-UTR-intron-belimumab light chain gene-polyA' and a 'CMV promoter-UTR-intron-belimumab heavy chain gene-IRES-DHFR-polyA'. Expression vector comprising a second expression cassette.
  • the pCYBBSS004 expression vector comprises a first expression cassette comprising a 'CMV promoter-UTR-intron-golimumab light chain gene-polyA' and a 'CMV promoter-UTR-intron-golimumab heavy chain gene-IRES-DHFR-polyA' Expression vector comprising a second expression cassette.
  • the pCYBBSS005 expression vector is a first expression cassette comprising a 'CMV promoter-UTR-intron-Ustekinumab light chain gene-polyA' and a 'CMV promoter-UTR-Intron-Ustekinumab heavy chain gene-IRES-DHFR-polyA Is an expression vector comprising a second expression cassette comprising ''.
  • the pCYBBSS006 expression vector is a first expression cassette comprising a 'CMV promoter-UTR-intron-ipilimumab light chain gene-polyA' and a 'CMV promoter-UTR-intron-ipilimumab heavy chain gene-IRES-DHFR-polyA Is an expression vector comprising a second expression cassette comprising ''.
  • GS was used as an amplification gene
  • pCYBIG was prepared using a light chain expression cassette and a heavy chain expression cassette
  • a pCYBID expression vector including DHFR was prepared instead of GS as an amplification gene in the pCYBIG expression vector.
  • the bicistronic expression vector of the present invention is designed such that the heavy and light chain genes and the amplification genes of the antibody are expressed as a single gene, and thus may have a use capable of stably and efficiently expressing the antibody.
  • the present invention provides an animal cell transformed with the expression vector.
  • the expression vector transformed into the animal cell is a bicystronic expression vector for antibody expression, as described above.
  • the term "transfection” refers to a method of directly introducing DNA into a culture animal cell to change the genotype of the cell, and generally using a method of introducing a target gene into a medium such as a plasmid. do.
  • the transformation may be carried out according to a conventional method in the art, and preferably, for example, calcium phosphate coprecipitation, DEAE-dextran treatment, electroporation, lipofectamine treatment, redistribution (an artificial membrane called ribosomes and Fusion with cells that make DNA complexes).
  • lipofectamine was used to transform the light / heavy chain expression vector into cells.
  • animal cells used in the art can be used without limitation, and preferably Chinese hamster ovary cells (CHO) can be used.
  • CHO Chinese hamster ovary cells
  • the light and heavy chain genes of bevacizumab were inserted into a vector having different amplification genes by GS and DHFR, thereby preparing pCYB204IG and pCYB204GS bistronic vectors for expressing bevacizumab antibodies.
  • the cell line transformed with the pCYB204ID vector showed that bevacizumab was twice as high as the cell line transformed with the pCYB204IG vector. Confirmed.
  • pCYBBSS001 bicystronic vector for tocilizumab antibody expression was prepared by inserting the light chain and heavy chain genes of tocilizumab into a vector including DHFR as an amplification gene.
  • a vector including DHFR as an amplification gene.
  • pCYBBSS002 bistronic vectors for denosumab antibody expression were prepared by inserting the light chain and heavy chain genes of denosumab into a vector including DHFR as an amplification gene.
  • a vector including DHFR as an amplification gene.
  • the light and heavy chain genes of belimumab were inserted into a vector including DHFR as an amplification gene to prepare pCYBBSS003 bistronic vectors for expressing belimumab antibody.
  • pCYBBSS003 bistronic vectors for expressing belimumab antibody.
  • the light and heavy chain genes of golimumab were inserted into a vector including DHFR as an amplification gene, thereby preparing a pCYBBSS004 bistronic vector for expressing golimumab antibody.
  • a vector including DHFR as an amplification gene
  • pCYBBSS005 bistronic vectors for expressing Ustekinumab antibodies were prepared by inserting the Ustekinumab light and heavy chain genes into a vector containing DHFR as an amplification gene. As a result of confirming the expression level of Ustekinumab antibody in the cell line transformed with the vector, it was confirmed that it is highly expressed at 2.5 ⁇ g / ml.
  • the light and heavy chain genes of ipilimumab were inserted into a vector including DHFR as an amplification gene, thereby preparing pCYBBSS006 bistronic vectors for expressing ipilimumab antibodies.
  • a vector including DHFR as an amplification gene
  • pCYBBSS006 bistronic vectors for expressing ipilimumab antibodies As a result of confirming the expression level of Ipilimumab antibody in the cell line transformed with the vector, it was confirmed that it is highly expressed at 8 ⁇ g / ml under gene amplification conditions of 500 nM methotrexate (MTX) concentration.
  • MTX methotrexate
  • the expression level was measured by applying the bicystronic expression vector for antibody expression according to the present invention to various therapeutic antibodies. It confirmed that it became excellent.
  • the present invention provides a method for producing an antibody comprising the step of culturing the animal cells.
  • the animal cell is an animal cell transformed with a bicistronic expression vector including an intron according to the present invention, as described above.
  • the antibody production method of the present invention by culturing the animal cells, the antibody can be produced stably and with high efficiency.
  • the method may preferably further comprise the step of purifying the antibody in the culture cultured the animal cells.
  • the antibodies that can be produced according to the present invention are as described above, but are not limited to bevacizumab, tocilizumab, denosumab, belimumab, golimumab, urstekinumab or ipilimu It may be pleased.
  • the DNA sequence of the CMV promoter including the UTR portion and the intron portion was obtained through the nucleotide sequence of the complete genome (GenBank: X17403.1) of the human cytomegalovirus strain AD169. Since at least a promoter, a cloning site, and a poly A element are required for the expression of the target protein, the CMV promoter, UTR, intron, cloning site, and SV40 poly A DNA can be identified using the nucleotide sequences identified in the cytomegalovirus genome. Was synthesized by Genotech (Korea).
  • restriction enzymes Xba I and Not I recognition sites were added to clone the light chain portion of the antibody protein between intron and poly A, and the recognition sites of restriction enzyme Asc I at the 5 'end of the CMV promoter and poly A 3'. Recognition sites of restriction enzymes BamH I and Xho I were added to the ends for subsequent cloning.
  • the gene set Gln-HC for heavy chain expression was added with a restriction enzyme BamH I recognition site at the 3 'end of the CMV promoter, and restriction enzymes Nhe I and Xho I for cloning the heavy chain portion of the UTR, intron and antibody proteins after the CMV promoter.
  • a recognition site was added to be used for subsequent cloning.
  • the PCR reaction was initially denatured at 94 ° C. for 5 minutes, followed by 30 cycles consisting of 94 ° C. 50 seconds, 50 ° C. 30 seconds, and 72 ° C., 2 minutes 30 seconds, and finally amplified at 72 ° C. for 7 minutes.
  • the PCR reaction solution contained 25 ⁇ l of Premix Taq (Ex Taq version) (TAKARA), 2 ⁇ l of primers (10 pmole / ⁇ l) of SEQ ID NOs. 7 and 8, and distilled water was added so that the total volume was 50 ⁇ l.
  • the Gln-HC gene amplified by PCR was inserted into the pGEM T-easy vector (Promega) according to the manufacturer's instructions.
  • IRES-GS vector developed by the company was used. IRES-GS vector containing IRES and GS gene, poly A, was treated with restriction enzymes Mlu I and Xho I for 37 hours at 37 ° C. IRES-GS gene-f1 origin-Kanamycin / neomycin resistance gene-Poly A-pUC DNA vector fragments containing orogin were recovered.
  • the light chain expression gene set Gln-LC synthesized in Example 1 was cut by treating Asc I and Xho I.
  • the cut IRES-GS vector fragment and the Gln-LC gene set fragment were recovered by gel extraction after 1% agarose gel electrophoresis, respectively. Each recovered DNA was linked to prepare a GS-Gln-LC plasmid (FIG. 2).
  • Gln-HC DNA which is a light chain expression gene set inserted into the T-easy vector prepared in Example 2
  • the prepared enzymes were treated with restriction enzymes BamH I and Xho I at 37 ° C. for 4 hours. Cut. Restriction enzyme-treated DNA recovered DNA corresponding to the size of Gln-HC through 1% agaroge gel electrophoresis.
  • the GS-Gln-LC plasmid prepared in Example 3 was digested by treating the restriction enzymes BamHI and XhoI at 37 °C for 4 hours. Restriction enzyme-treated DNA was recovered from DNA corresponding to the size of GS-Gln-LC plasmid by 1% agaroge gel electrophoresis.
  • the pCYBIG vector was prepared by connecting the Gln-HC gene set fragment and the GS-Gln-LC plasmid fragment recovered through the above procedure (FIG. 3).
  • the pCYBID vector was prepared by replacing the GS amplification gene of the pCYBIG vector prepared in Example 4 with a dehydrofolate reductase (DHFR) gene.
  • DHFR dehydrofolate reductase
  • a PCR reaction was performed using sal I DHFR-F primer (SEQ ID NO: 9) and Nhe I DHFR-R primer (SEQ ID NO: 10) summarized in Table 2 below.
  • the PCR reaction was initially denatured at 94 ° C. for 5 minutes, followed by 30 cycles consisting of 94 ° C. 50 seconds, 50 ° C. 30 seconds, and 72 ° C., 2 minutes 30 seconds, and finally amplified at 72 ° C. for 7 minutes.
  • the PCR reaction solution contained 25 [mu] l of Premix Taq (Ex Taq version) (TAKARA), 2 [mu] l of primers (10 pmole / [mu] l) of SEQ ID NOs. 9 and 10, and distilled water was added so that the total volume was 50 [mu] l.
  • the DHFR gene amplified by PCR was inserted into pGEM T-easy vector (Promega) according to the manufacturer's instructions.
  • the pCYBIG vector prepared in Example 4 was digested by treatment with the restriction enzymes sal I and Xba I, DHFR gene cloned in the T-easy vector was cleaved DNA by treatment of sal I and Nhe I.
  • Each cleaved DNA was recovered from DNA by 1% agarose gel electrophoresis, and then the two DNAs were joined to prepare a pCYBID vector substituted with DHFR gene instead of GS (FIG. 4).
  • a bevacizumab light chain expression plasmid was prepared by inserting the bevacizumab light chain gene into the pCYBIG vector and pCYBID vector prepared in Examples 4 and 5.
  • the pCYBIG vector and the pCYBID vector were digested with Xba I and Not I.
  • the light chain gene of bevacizumab replaced the amino acid sequence of bevacizumab (SEQ ID NO: 13) with a DNA base sequence (SEQ ID NO: 11).
  • the DNA sequence was replaced, the DNA nucleotide sequences optimized for CHO cells, which are antibody expressing cell lines, were substituted, and restriction enzyme Nhe I and Not I recognition sites were inserted at both 5'- and 3'-terminus.
  • a Kozak sequence (GCCACC) was put in front of ATG, which is a start codon, to induce a higher expression level, and MGWSCIILFLVATATGVHS was added as a signal sequence to synthesize a gene.
  • the synthesized gene was cleaved by treatment with Nhe I and Not I.
  • Each digested DNA was recovered by 1% agarose gel electrophoresis, and then the two DNAs were linked to each other to prepare a vector in which the bevacizumab light chain gene was inserted into the pCYBIG and pCYBID vectors.
  • the light chain expression vector pCYBIG-bevacizumab light chain gene vector and pCYBID-bevacizumab light chain gene vector prepared in Example 6-1 were digested with Nhe I and Xho I.
  • the DNA sequence was substituted from the heavy chain amino acid sequence of bevacizumab (SEQ ID NO: 14) (SEQ ID NO: 12).
  • Kozak sequence GCCACC was designed in front of ATG, which is a start codon, as in Example 6, and the genes were synthesized by inserting restriction enzymes NheI and XhoI recognition sites at both ends thereof, and then treated by NheI and XhoI.
  • Each cleaved DNA was recovered from DNA by 1% agarose gel electrophoresis, and then the two DNAs were linked to each other to prepare a vector in which bevacizumab light and heavy chain genes were inserted into each pCYB vector (FIG. 5, FIG. 5). 6).
  • 5 and 6 are schematic diagrams illustrating a method of cloning bevacizumab light and heavy chains of the pCYB204IG vector and pCYB204ID vector of the present invention.
  • Example 7 Determination of antibody expression rate of pCYB204IG vector
  • GS-deficient CHO-K1 cells were first cultured in 6-well plates at a concentration of 4 ⁇ 10 5 cells per well on the day before the transformation experiment, and then cultured in a 37 ° C. carbon dioxide incubator. . After confirming that the viability of the cell was 98% or more, the pCYB204IG vector was transformed into the cell using Lipofectamine (Invitrogen). In this case, transformation was performed using a medium in which 20 ⁇ g of the expression vector DNA and 10 ⁇ l of lipofectamine were added to Opti-MEM-1 (Invitrgen). From this, CHO-K1 cells transformed with pCYB204IG were selected.
  • Example 7-1 pCYB204IG-transformed CHO-K1 cell line was treated with 25 ⁇ M at the initial concentration of Methionine sulfoximine (MSX), and growth was observed until cell growth was restored normally. After treatment with 25 ⁇ M of MSX, the concentration of MSX was increased to 250 ⁇ M in the passages after 7 days.In the same way, the concentration of MSX was increased to the final point of 500 ⁇ M at the time of passage of recovery to the external pressure by MSX. Increased. The expression level of the cell line pools pool1 and pool2 prepared at a concentration of 500 ⁇ M MSX was measured. The expression level was measured using an ELISA method using Anti-Fc (FIG. 7A).
  • MSX Methionine sulfoximine
  • CHO-DG44 cells (Gibco, 12609-) in the same manner as in Example 7-1. PCYB204ID was transformed into cells in 012), and then transformed CHO-DG44 cells were selected.
  • Example 8-1 gene amplification was performed by treating the CHO-DG44 cell line transformed with pCYB204ID with MTX (methotrexate).
  • MTX metalhotrexate
  • the expression level was measured by increasing the concentration of MTX when cell growth was normally restored.
  • MTX treatment concentration was progressed to a concentration of 50nM / 200nM / 800nM.
  • the expression level was measured using an ELISA method using Anti-Fc (FIG. 7B).
  • the cell line transformed with the pCYB204ID vector was twice as high as bevacizumab than the cell line transformed with the pCYB204IG vector. Confirmed.
  • a tocilizumab light chain expression plasmid was prepared by inserting the tocilizumab light chain gene into the pCYBID vector prepared in Example 5.
  • the pCYBID vector was digested with Xba I and Not I.
  • the light chain gene of tocilizumab was replaced with a DNA base sequence encoding the light chain amino acid sequence of tocilizumab (SEQ ID NO: 17) (SEQ ID NO: 15).
  • SEQ ID NO: 17 DNA base sequence encoding the light chain amino acid sequence of tocilizumab
  • SEQ ID NO: 15 DNA base sequence encoding the light chain amino acid sequence of tocilizumab
  • the DNA sequence was replaced, the DNA nucleotide sequences optimized for CHO cells, which are antibody expressing cell lines, were substituted, and restriction enzyme Nhe I and Not I recognition sites were inserted at both 5'- and 3'-terminus.
  • a Kozak sequence (GCCACC) was put in front of ATG, which is a start codon, to induce a higher expression level, and MGWSCIILFLVATATGVHS was added as a signal sequence to synthesize a gene.
  • the synthesized gene was cleaved by treatment with Nhe I and Not I.
  • Each cleaved DNA was recovered by 1% agarose gel electrophoresis, and then the two DNAs were linked to prepare a vector in which the tocilizumab light chain gene was inserted into the pCYBID vector.
  • the light chain expression vector pCYBID-tosilizumab light chain gene vector prepared in Example 9-1 was digested with Nhe I and Xho I.
  • the heavy chain amino acid sequence of tocilizumab (SEQ ID NO: 18) was substituted with a DNA base sequence (SEQ ID NO: 16).
  • Kozak sequence GCCACC was designed in front of ATG, which is a start codon, as in Example 9-1, and the genes were synthesized by inserting restriction enzymes Nhe I and Xho I recognition sites at both ends, and then Nhe I and Xho I were synthesized. Treated and cut.
  • Each cleaved DNA was recovered from DNA by 1% agarose gel electrophoresis, and then the two DNAs were joined to prepare a vector in which the tocilizumab light and heavy chain genes were inserted into the pCYB vector (FIG. 8).
  • Figure 8 schematically shows a restriction map of the expression vector pCYBBSS001 of the present invention.
  • DHFR deficient CHO-DG44 cells (Dr. Chasin, Univ. Columbia. USA) were first placed in a 6-well plate at the concentration of 8 ⁇ 10 5 cells per well on the day before the transformation experiment. After the incubation was incubated in a carbon dioxide incubator at 37 °C. After confirming that the cells were grown on the plate by about 70 to 80%, the light / heavy chain expression vector pCYBBSS001 was transformed into cells using lipofectamine LTX and PLUS (Lipofectamine LTX and PLUS reagent, Invitrogen).
  • a medium in which 2.5 ⁇ g of each of the expression vector DNA and 10 ⁇ l of lipofectamine LTX was added to Opti-MEM-1 (Invitrogen) was used. From this, CHO-DG44 cells transformed with the light / heavy chain expression vector pCYBBSS001 were selected.
  • Genetic amplification was performed by treating MTX (methotrexate) to the CHO-DG44 cell line transformed with pCYBBSS001 in Example 10-1.
  • MTX metalhotrexate
  • the expression level was measured by increasing the concentration of MTX.
  • MTX treatment concentration proceeded to a concentration of 50 nM / 200 nM / 800 nM.
  • the cell line transformed with the pCYBBSS001 vector showed the highest expression at the MTX concentration of 800 nM.
  • the expression level was measured using Octet titer assay, and Protein A Dip and Read biosensors (forteBIO, cat. No. 18-5010, lot no.
  • a denosumab light chain gene was inserted into the pCYBID vector prepared in Example 5 to prepare a denosumab light chain expression plasmid.
  • the pCYBID vector was digested with Xba I and Not I.
  • the light chain gene of denosumab replaced the amino acid sequence of denosumab (SEQ ID NO: 21) with a DNA base sequence (SEQ ID NO: 19).
  • the DNA sequence was replaced, the DNA nucleotide sequences optimized for CHO cells, which are antibody expressing cell lines, were substituted, and restriction enzyme Nhe I and Not I recognition sites were inserted at both 5'- and 3'-terminus.
  • a Kozak sequence (GCCACC) was put in front of ATG, which is a start codon, to induce a higher expression level, and MGWSCIILFLVATATGVHS was added as a signal sequence to synthesize a gene.
  • the synthesized gene was cleaved by treatment with Nhe I and Not I.
  • Each cleaved DNA was recovered by 1% agarose gel electrophoresis, and then the two DNAs were linked to each other to prepare a vector in which the denosumab light chain gene was inserted into the pCYBID vector.
  • the light chain expression vector pCYBID-denosumab light chain gene vector prepared in Example 11-1 was digested with Nhe I and Xho I.
  • the DNA chain was substituted from the heavy chain amino acid sequence of denosumab (SEQ ID NO: 22) (SEQ ID NO: 20).
  • Kozak sequence GCCACC was designed in front of ATG, which is a start codon, as in Example 11-1, and the genes were synthesized by inserting restriction enzymes Nhe I and Xho I recognition sites at both ends, and then Nhe I and Xho I were synthesized. Treated and cut.
  • Each cleaved DNA was recovered from DNA by 1% agarose gel electrophoresis, and then the two DNAs were linked to prepare a vector in which denosumab light and heavy chain genes were inserted into the pCYB vector (FIG. 9).
  • Fig. 9 schematically shows a restriction map of the expression vector pCYBBSS002 of the present invention.
  • DHFR deficient CHO-DG44 cells (Dr. Chasin, Univ. Columbia. USA) were first placed in a 6-well plate at the concentration of 8 ⁇ 10 5 cells per well on the day before the transformation experiment. After the incubation was incubated in a carbon dioxide incubator at 37 °C. After confirming that the cells were grown on the plate by about 70 to 80%, the light / heavy chain expression vector pCYBBSS002 was transformed into cells using lipofectamine LTX and PLUS (Lipofectamine LTX and PLUS reagent, Invitrogen).
  • a medium in which 2.5 ⁇ g of each of the expression vector DNA and 10 ⁇ l of lipofectamine LTX was added to Opti-MEM-1 (Invitrogen) was used. From this, CHO-DG44 cells transformed with the light / heavy chain expression vector pCYBBSS002 were selected.
  • Example 12-1 gene amplification was performed by treating the CHO-DG44 cell line transformed with pCYBBSS002 with MTX (methotrexate). When cell growth was restored normally, the expression level was measured by increasing the concentration of MTX. MTX treatment concentration proceeded to a concentration of 50 nM / 200 nM / 800 nM. As a result, the cell line transformed with the pCYBBSS002 vector showed the highest expression at an MTX concentration of 800 nM. The expression level was measured using Octet titer assay, and Protein A Dip and Read biosensors (forteBIO, cat. No. 18-5010, lot no.
  • MTX metalhotrexate
  • a belimumab light chain gene was inserted into the pCYBID vector prepared in Example 5 to prepare a belimumab light chain expression plasmid.
  • the pCYBID vector was digested with Xba I and Not I.
  • Belimumab's light chain gene was substituted with a DNA base sequence encoding belimumab's light chain amino acid sequence (SEQ ID NO: 25) (SEQ ID NO: 23).
  • SEQ ID NO: 25 DNA base sequence encoding belimumab's light chain amino acid sequence
  • SEQ ID NO: 23 DNA base sequence encoding belimumab's light chain amino acid sequence
  • Nhe I and Not I recognition sites were inserted at both 5'- and 3'-terminus.
  • a Kozak sequence (GCCACC) was put in front of ATG, which is a start codon, to induce a higher expression level, and MGWSCIILFLVATATGVHS was added as a signal sequence to synthesize a gene.
  • the synthesized gene was cleaved by treatment with Nhe I and Not I.
  • Each cleaved DNA was recovered by 1% agarose gel electrophoresis, and then the two DNAs were linked to prepare a vector in which belimumab light chain gene was inserted into the pCYBID vector.
  • the light chain expression vector pCYBID-belimumab light chain gene vector prepared in Example 13-1 was digested with Nhe I and Xho I.
  • the heavy chain amino acid sequence of belimumab (SEQ ID NO: 26) was substituted with a DNA base sequence (SEQ ID NO: 24).
  • Kozak sequence GCCACC was put in front of ATG, which is a start codon, as in Example 13-1, and the genes were synthesized by adding restriction enzyme Nhe I and Xho I recognition sites at both ends, and then Nhe I and Xho I were synthesized. Treated and cut.
  • Each cleaved DNA was recovered from DNA by 1% agarose gel electrophoresis, and then the two DNAs were linked to prepare a vector in which belimumab light and heavy chain genes were inserted into each pCYB vector (FIG. 10).
  • Figure 10 schematically shows a restriction map of the expression vector pCYBBSS003 of the present invention.
  • DHFR deficient CHO-DG44 cells (Dr. Chasin, Univ. Columbia. USA) were first placed in a 6-well plate at the concentration of 8 ⁇ 10 5 cells per well on the day before the transformation experiment. After the incubation was incubated in a carbon dioxide incubator at 37 °C. After confirming that the cells were grown on the plate by about 70 to 80%, the light / heavy chain expression vector pCYBBSS003 was transformed into cells using lipofectamine LTX and PLUS (Lipofectamine LTX and PLUS reagent, Invitrogen).
  • a medium in which 2.5 ⁇ g of each of the expression vector DNA and 10 ⁇ l of lipofectamine LTX was added to Opti-MEM-1 (Invitrogen) was used. From this, CHO-DG44 cells transformed with the light / heavy chain expression vector pCYBBSS003 were selected.
  • Example 14-1 the expression level of belimumab was measured in the CHO-DG44 cell line transformed with the pCYBBSS003 vector.
  • the expression level was measured by ELISA method using Anti-Fc, and the expression level per cell was calculated by PCD (Picograms / cell / day).
  • PCD PCD (Picograms / cell / day).
  • a golimumab light chain expression plasmid was prepared by inserting a golimumab light chain gene into the pCYBID vector prepared in Example 5.
  • the pCYBID vector was digested with Xba I and Not I.
  • the light chain gene of golimumab was substituted with a DNA base sequence encoding the light chain amino acid sequence of golimumab (SEQ ID NO: 29) (SEQ ID NO: 27).
  • SEQ ID NO: 29 DNA base sequence encoding the light chain amino acid sequence of golimumab
  • SEQ ID NO: 27 DNA base sequence encoding the light chain amino acid sequence of golimumab
  • the DNA sequence was replaced, the DNA nucleotide sequences optimized for CHO cells, which are antibody expressing cell lines, were substituted, and restriction enzyme Nhe I and Not I recognition sites were inserted at both 5'- and 3'-terminus.
  • a Kozak sequence (GCCACC) was put in front of ATG, which is a start codon, to induce a higher expression level, and MGWSCIILFLVATATGVHS was added as a signal sequence to synthesize a gene.
  • the synthesized gene was cleaved by treatment with Nhe I and Not I.
  • Each cut DNA was recovered by 1% agarose gel electrophoresis, and then the two DNAs were linked to prepare a vector in which the golimumab light chain gene was inserted into the pCYBID vector.
  • the light chain expression vector pCYBID-golimumab light chain gene vector prepared in Example 15-1 was digested with Nhe I and Xho I.
  • the heavy chain amino acid sequence of golimumab (SEQ ID NO: 30) was substituted with a DNA base sequence (SEQ ID NO: 28).
  • Kozak sequence GCCACC was designed in front of ATG, which is a start codon, as in Example 15-1, and the genes were synthesized by inserting restriction enzyme Nhe I and Xho I recognition sites at both ends, and then Nhe I and Xho I were synthesized. Treated and cut.
  • Each cleaved DNA was recovered from DNA by 1% agarose gel electrophoresis, and then the two DNAs were linked to prepare a vector in which the golimumab light and heavy chain genes were inserted into the pCYB vector (FIG. 11).
  • Fig. 11 schematically shows a restriction map of the expression vector pCYBBSS004 of the present invention.
  • Example 16 Determination of antibody expression rate of pCYBBSS004 vector
  • DHFR deficient CHO-DG44 cells (Dr. Chasin, Univ. Columbia. USA) were first placed in a 6-well plate at the concentration of 8 ⁇ 10 5 cells per well on the day before the transformation experiment. After the incubation was incubated in a carbon dioxide incubator at 37 °C. After confirming that the cells were grown on the plate by about 70 to 80%, the light / heavy chain expression vector pCYBBSS004 was transformed into cells using lipofectamine LTX and PLUS (Lipofectamine LTX and PLUS reagent, Invitrogen).
  • a medium in which 2.5 ⁇ g of each of the expression vector DNA and 10 ⁇ l of lipofectamine LTX was added to Opti-MEM-1 (Invitrogen) was used. From this, CHO-DG44 cells transformed with the light / heavy chain expression vector pCYBBSS004 were selected.
  • Gene amplification was performed by treating MTX (methotrexate) to the CHO-DG44 cell line transformed with pCYBBSS004 in Example 16-1.
  • MTX metalhotrexate
  • the expression level was measured by increasing the concentration of MTX.
  • MTX treatment concentration proceeded to a concentration of 50 nM / 200 nM / 500 nM / 800 nM.
  • the cell line transformed with the pCYBBSS004 vector showed the highest expression at an MTX concentration of 800 nM.
  • the expression level was measured using Octet titer assay, and Protein A Dip and Read biosensors (forteBIO, cat. No. 18-5010, lot no.
  • the Ustekinumab light chain gene was inserted into the pCYBID vector prepared in Example 5 to prepare a Ustekinumab light chain expression plasmid.
  • the pCYBID vector was digested with Xba I and Not I.
  • the light chain gene of Ustekinumab was substituted with a DNA base sequence encoding the light chain amino acid sequence of Ustekinumab (SEQ ID NO: 33) (SEQ ID NO: 31).
  • SEQ ID NO: 33 DNA base sequence encoding the light chain amino acid sequence of Ustekinumab
  • Nhe I and Not I recognition sites were inserted at both 5'- and 3'-terminus.
  • a Kozak sequence (GCCACC) was put in front of ATG, which is a start codon, to induce a higher expression level, and MGWSCIILFLVATATGVHS was added as a signal sequence to synthesize a gene.
  • the synthesized gene was cleaved by treatment with Nhe I and Not I.
  • Each cleaved DNA was recovered by 1% agarose gel electrophoresis, and then the two DNAs were linked to each other to prepare a vector in which the Ustekinumab light chain gene was inserted into the pCYBID vector.
  • the light chain expression vector pCYBID-Ustekinumab light chain gene vector prepared in Example 17-1 was digested with Nhe I and Xho I.
  • the DNA sequence was substituted from the heavy chain amino acid sequence of Ustekinumab (SEQ ID NO: 34) (SEQ ID NO: 32).
  • Kozak sequence (GCCACC) was put in front of ATG, which is a start codon, as in Example 17-1, and the genes were synthesized by inserting restriction enzymes Nhe I and Xho I at both ends, and then Nhe I and Xho I were synthesized. Treated and cut.
  • Each cleaved DNA was recovered from DNA by 1% agarose gel electrophoresis, and then the two DNAs were linked to each other to prepare a vector having Ustekinumab light and heavy chain genes inserted into each pCYB vector (FIG. 12). .
  • DHFR deficient CHO-DG44 cells (Dr. Chasin, Univ. Columbia. USA) were first placed in a 6-well plate at the concentration of 8 ⁇ 10 5 cells per well on the day before the transformation experiment. After the incubation was incubated in a carbon dioxide incubator at 37 °C. After confirming that the cells were grown on the plate by about 70 to 80%, the light / heavy chain expression vector pCYBBSS005 was transformed into cells using lipofectamine LTX and PLUS (Lipofectamine LTX and PLUS reagent, Invitrogen).
  • a medium in which 2.5 ⁇ g of each of the expression vector DNA and 10 ⁇ l of lipofectamine LTX was added to Opti-MEM-1 (Invitrogen) was used. From this, CHO-DG44 cells transformed with the light / heavy chain expression vector pCYBBSS005 were selected.
  • Example 18-1 the expression level of Ustekinumab in the CHO-DG44 cell line transformed with the pCYBBSS005 vector was measured.
  • the expression level was measured by ELISA method using Anti-Fc, and the expression level per cell was calculated by PCD (Picograms / cell / day).
  • PCD PCD (Picograms / cell / day).
  • An ipilimumab light chain expression plasmid was prepared by inserting an ipilimumab light chain gene into the pCYBID vector prepared in Example 5.
  • the pCYBID vector was digested with Xba I and Not I.
  • the light chain gene of Ipilimumab was replaced with a DNA base sequence encoding the light chain amino acid sequence of Ipilimumab (SEQ ID NO: 37) (SEQ ID NO: 35).
  • SEQ ID NO: 37 DNA base sequence encoding the light chain amino acid sequence of Ipilimumab
  • SEQ ID NO: 35 DNA base sequence encoding the light chain amino acid sequence of Ipilimumab.
  • the DNA nucleotide sequences optimized for CHO cells, which are antibody expressing cell lines were substituted, and restriction enzyme Nhe I and Not I recognition sites were inserted at both 5'- and 3'-terminus.
  • a Kozak sequence (GCCACC) was put in front of ATG, which is a start codon, to induce a higher expression level, and MGWSCIILFLVATATGVHS was added as a signal sequence to synthesize a gene.
  • the synthesized gene was cleaved by treatment with Nhe I and Not I.
  • Each cleaved DNA was recovered by 1% agarose gel electrophoresis, and then the two DNAs were linked to each other to prepare a vector in which Ipilimumab light chain gene was inserted into the pCYBID vector.
  • the light chain expression vector pCYBID-ipilimumab light chain gene vector prepared in Example 19-1 was digested with Nhe I and Xho I.
  • the heavy chain amino acid sequence of Ipilimumab (SEQ ID NO: 38) was substituted with a DNA base sequence (SEQ ID NO: 36).
  • Kozak sequence GCCACC was designed in front of ATG, which is a start codon, as in Example 19-1, and the genes were synthesized by inserting restriction enzymes Nhe I and Xho I at both ends, and then Nhe I and Xho I were synthesized. Treated and cut.
  • Each cleaved DNA was recovered from DNA by 1% agarose gel electrophoresis, and then the two DNAs were linked to each other to prepare a vector in which ipilimumab light and heavy chain genes were inserted into each pCYB vector (FIG. 13).
  • Figure 13 schematically shows a restriction map of the expression vector pCYBBSS006 of the present invention.
  • DHFR deficient CHO-DG44 cells (Dr. Chasin, Univ. Columbia. USA) were first placed in a 6-well plate at the concentration of 8 ⁇ 10 5 cells per well on the day before the transformation experiment. After the incubation was incubated in a carbon dioxide incubator at 37 °C. After confirming that the cells were grown on the plate by about 70 to 80%, the light / heavy chain expression vector pCYBBSS006 was transformed into cells using lipofectamine LTX and PLUS (Lipofectamine LTX and PLUS reagent, Invitrogen).
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  • the expression level was measured using Octet titer assay, and Protein A Dip and Read biosensors (forteBIO, cat. No. 18-5010, lot no.

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Abstract

본 발명은 '프로모터-UTR-인트론-항체 경쇄 유전자-polyA'를 포함하는 제1발현 카세트 및 '프로모터-UTR-인트론-항체 중쇄 유전자-IRES(internal ribosome entry site)-증폭 유전자-polyA'를 포함하는 제2발현 카세트를 포함하는 항체 발현용 바이시스트로닉 발현벡터, 상기 발현벡터가 형질전환된 동물세포 및 상기 동물세포를 배양하는 단계를 포함하는 항체의 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 인트론을 포함하는 항체 발현용 바이시스트로닉 발현벡터를 이용하면, 원하는 항체를 고효율로 발현시킬 수 있는 발현벡터를 제작할 수 있으며, 상기 발현벡터가 형질전환된 동물세포를 배양하여 항체를 안정적이고 고효율로 생산할 수 있다.

Description

항체 발현용 바이시스트로닉 발현벡터 및 이를 이용한 항체의 생산 방법
본 발명은 (i) '프로모터-UTR(untranslation region)-인트론-항체 경쇄 유전자-polyA'를 포함하는 제1발현 카세트 ; 및 (ii) '프로모터-UTR-인트론-항체 중쇄 유전자-IRES(internal ribosome entry site)-증폭 유전자-polyA'를 포함하는 제2발현 카세트를 포함하는, 항체 발현용 바이시스트로닉 발현벡터, 상기 발현벡터가 형질전환된 동물세포 및 상기 동물세포를 배양하는 단계를 포함하는 항체의 생산 방법에 관한 것이다.
유전자 재조합 기술을 이용하여 다양한 인간유래 단백질들이 발현되고 있으나, 진핵세포 특유의 당화, 인산화 등과 같은 일련의 과정으로 인하여 포유동물세포를 이용할 경우에만 정상적으로 생물학적 활성을 갖는 단백질이 합성되는 경우가 많다. 치료용 항체로 많이 사용되는 면역글로불린G (IgG) 유전자는 중쇄(heavy chain) 유전자와 경쇄(light chain) 유전자로 구성되어 있다. 각각의 유전자로부터 만들어지는 중쇄와 경쇄 단백질은 세포내에서 접힘(folding) 과정에서 서로 결합하여 세포 밖으로 분비된다. 유전자 재조합 항체 단백질을 생산하기 위하여 주로 포유동물세포의 하나인 CHO 세포(Chinese hamster ovary 세포, 중국 햄스터 난소 세포)를 많이 이용한다(Kaufman 등, Mol. Cell. Biol. (1985) 5, 1750).
포유동물 세포에서 보다 강력하고 안정된 유전자 발현을 유도할 수 있는 재조합 발현벡터를 제조하기 위해 사용되고 있는 여러 가지 전략들 중에서 대표적인 방법은 강력한 프로모터를 선별하여 유전자 발현률을 증대시키는 방법이다. 프로모터는 여러가지 전사 인자(transcription factor)의 결합 위치와 TATA box가 존재하여, RNA 중합효소가 결합하여 mRNA 합성이 시작되는 DNA 상의 요소로서 프로모터의 성능에 따라 유전자 발현량이 크게 좌우된다. 높은 항체 발현을 위해서는 항상 높은 발현을 갖는 것이 적합한데, 대표적인 강력한 프로모터로 SV40(simian virus 40) 프로모터, CMV(Cytomegalovirus) 프로모터와 EF1-α(Elongation factor1-α) 프로모터 등이 있다.
강력한 프로모터의 사용을 통한 벡터 자체의 mRNA 합성능력을 높이는 방법 외에 치료용 단백질의 생산성을 높이기 위해 널리 사용되는 방법으로 유전자 증폭방법이 있다. 그 방법을 간단히 요약하면, 세포에 외부 유전자를 형질전환 시킨 후 화학 약품을 이용하여 외부 유전자가 염색체에 재조합된 세포만 성장이 가능하도록 선택 배양하여 세포를 분리한 후, 더욱 많은 단백질을 발현하도록 하기 위해서 증가된 양의 화학 약품을 배지에 첨가하여 염색체에 재조합된 외부 유전자의 증폭을 유도하는 것이다. 유전자 증폭에 사용되는 대표적인 유전자로는 DHFR (dehydrofolate reductase, 이하 'DHFR'이라 칭한다)과 GS(glutamine synthetase, 이하 'GS'라 칭한다)가 있다. 이들 증폭 유전자들의 증폭에 사용되는 약품으로는 DHFR에 대하여는 메토트렉세이트(methotrexate, 이하 'MTX'라 한다)가 사용되고 GS에 대하여는 메티오닌 설폭시민(Methionine sulfoximine, 이하 'MSX'라 한다)이 사용된다. 이러한 유전자 증폭과정을 거쳐 1000개 이상의 증폭된 외부유전자를 갖는 세포주의 제조가 가능하게 된다.
통상적으로 항체 유전자를 계속적으로 발현하는 세포주를 제조하기 위해서는 발현하고자 하는 중쇄와 경쇄 유전자를 포함하는 플라스미드 벡터 DNA와 증폭 유전자를 갖는 벡터 DNA를 함께 세포에 동시 형질전환시킨 후 두 개의 DNA가 동시에 염색체에 삽입된 세포주를 분리하거나(Kaufman, Methods in Enz.(1990) 185, 487), 하나의 벡터 내에 SV40 프로모터에 의해 증폭 유전자가 발현되도록 하여 그 벡터가 염색체에 삽입된 세포주를 분리하는 방법이 사용된다.
또 다른 증폭 유전자 발현 방법으로 바이시스트로닉 벡터를 제조하는 방법이 있다. 진핵생물은 원핵생물과 달리 원칙적으로 하나의 프로모터에서 하나의 mRNA가 만들어지고 그 유전자만 해독되어 단백질이 합성된다. 그런데 일부 바이러스의 경우 mRNA 중간에 리보좀이 결합할 수 있는 서열이 있어 하나의 mRNA에서 여러 단백질을 합성할 수 있게 해 준다. 항체 유전자와 증폭 유전자가 서로 다른 프로모터에 의하여 발현될 경우, 유전자 증폭시 증폭 유전자 부분만 증폭되고 항체 유전자의 증폭은 이루어 지지 않을 수 있는데, IRES(internal ribosome entry site)를 사용하면 동일한 프로모터로부터 발현되므로 이러한 문제를 피할 수 있다. 그러나, 이와 같은 바이시스트로닉 벡터 전략 역시 여전히 원하는 단백질을 과량으로 제조할 수 없다는 단점이 있어, 보다 강력한 전략이 요구되고 있다.
한편, 베바시주맙(bevacizumab, Avastin®이라고도 함)은 미국 Genentech사에서 개발한 VEGF에 대한 인간화 항체로서, 신생혈관생성 (Angiogenesis) 억제제의 역할을 하며, 결장직장암, 폐암, 신장암, 뇌암등의 치료를 주 적응증으로 하는 항체 치료제로 각광받고 있다. 토실리주맙(tocilizumab, Actemra®이라고도 함)은 스위스계 제약회사인 로슈(Roche) 사에서 개발한 IL-6 수용체에 대한 인간 단일클론 항체로서, 악템라(Actemra)라는 제품명으로 미국, 유럽, 일본에서 류마티스 관절염에 대하여 승인을 받았다. 데노수맙(denosumab, Prolia®이라고도 함)은 미국 암젠(Amgen) 사에서 개발한 Receptor activator of NF-kB ligand (RANKL)에 대한 인간 단일클론 항체로서, 프롤리아(Prolia)라는 제품명으로 미국, 캐나다, 유럽에서 골다공증 적응증에 대하여 승인을 받았으며, 엑스제바(Xgeva)라는 제품명으로 유럽에서 고형암이 뼈로 전이된 환자의 골절 등을 예방하는 약물로 승인받았다.
한편, 벨리무맙(Belimumab, Benlysta®이라고도 함)은 다국적 제약회사인 글락소스미스클라인 (GlaxoSmithKline, GSK)사에서 개발한 가용성 B 림프구 자극인자(B Lymphocyte Stimulator, BLyS)에 대한 인간 단일클론 항체로서, 미국, 캐나다 및 유럽에서 루푸스(전신 홍반 루푸스, systemic lupus erythematosus, SLE)에 대하여 승인을 받았다. 골리무맙(Golimumab, Simponi®이라고도 함)은 글로벌 제약회사인 존슨앤존슨(Johnson & Johnson) 사의 자회사인 얀센바이오테크(Janssen Biotech, Inc., 구 센토고, Centocor)에서 개발한 TNFα에 대한 인간 단일클론 항체로서, 심포니(Simponi)라는 제품명으로 미국, 캐나다 및 한국에서 류마티스 관절염, 건선성 관절염 및 강직성 척추염 적응증에 대하여 승인을 받았다.
또 한편, 우스테키누맙(Ustekinumab, Stelara®이라고도 함)은 다국적 제약회사인 얀센 제약회사(Janssen Pharmaceuticals, Inc.)에서 개발한 인터루킨 12(Interleukin-12, IL-12)과 인터루킨 23(Interleukin-23, IL-23)에 대한 인간 단일클론 항체로서, 미국 식품의약국(U.S. Food and Drug Administration, FDA)에서 건선성 관절염(psoriatic arthritis)에 대하여 승인을 받았으며, 중증 건선(severe psoriasis), 중등증-중증 판상건선(moderate-to-severe plaque psoriasis), 다발성 경화증(multiple sclerosis) 및 유육종증(sarcoidosis) 등에 대한 임상 진행 중에 있다. 이필리무맙(Ipilimumab, Yervoy®이라고도 함)은 미국의 제약회사인 브리스톨-마이어스 스큅(Bristol-Myers Squibb Co., BMS) 사에서 개발한 세포독성 T 림프구 항원-4(Cytotoxic T-Lymphocyte Antigen, CTLA-4)에 대한 인간 단일클론 항체로서, 예보이(Yervoy)라는 제품명으로 미국 식품의약국(U.S. Food and Drug Administration, FDA)에서 흑생종 및 피부암에 대하여 승인을 받았으며, 비소세포암(non-small cell lung carcinoma, NSCLC), 소세포암(small cell lung cancer, SCLC), 방광암(bladder cancer) 및 전이 호르몬 무반응성 전립선암(metastatic hormone-refractory prostate cancer)에 대해서 임상 진행 중에 있다.
이와 같은 블록버스터급 항체 치료제들의 대량 생산 방법의 개발이 요구되고 있다.
본 발명자들은 다양한 포유동물세포에서 강력하고 안정하게 유전자 발현을 유도할 수 있는 방법을 찾기 위해 예의 노력한 결과, 기존의 발현벡터에 UTR(untranslation region) 및 인트론을 포함하는 바이시스트로닉 발현벡터를 제작하여 증폭 유전자와 함께 다양한 항체 치료제들의 경쇄 및 중쇄 유전자를 동시에 고발현 시킬 수 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 하나의 목적은 '프로모터-UTR(untranslation region)-인트론-항체 경쇄 유전자-polyA'를 포함하는 제1발현 카세트 및 '프로모터-UTR-인트론-항체 중쇄 유전자-IRES(internal ribosome entry site)-증폭 유전자-polyA'를 포함하는 제2발현 카세트를 포함하는 항체 발현용 바이시스트로닉 발현벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 발현벡터가 형질전환된 동물세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 동물세포를 배양하는 단계를 포함하는 항체의 생산 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 따른 UTR 및 인트론을 포함하는 항체 발현용 바이시스트로닉 발현벡터를 이용하면, 원하는 항체를 고효율로 발현시킬 수 있는 발현벡터를 제작할 수 있으며, 상기 발현벡터가 형질전환된 동물세포를 배양하여 항체를 안정적이고 고효율로 생산할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 유전자 단편 Gln-LC 및 Gln-HC의 제작된 구성을 나타낸 그림이다.
도 2는 본 발명의 GS-Gln-LC의 제작과정을 나타낸 그림이다.
도 3은 본 발명의 GS-Gln-LC에 Gln-HC를 삽입하여 본 발명에 따른 GS 유전자를 포함한 pCYBIG 벡터의 제작과정을 나타낸 그림이다.
도 4는 본 발명의 pCYBIG 벡터로부터 본 발명에 따른 DHFR 유전자를 포함한 pCYBID 벡터의 제작과정을 나타낸 그림이다.
도 5는 본 발명에 따른 GS 유전자를 포함한 베바시주맙의 경쇄/중쇄 발현벡터 pCYB204IG의 제작과정을 나타낸 그림이다.
도 6은 본 발명에 따른 DHFR 유전자를 포함한 베바시주맙의 경쇄/중쇄 발현벡터 pCYB204ID의 제작과정을 나타낸 그림이다.
도 7a는 MSX 농도 500uM에서 pCYB204IG를 형질전환시킨 세포주의 항체 발현량을 확인한 결과이다.
도 7b는 MTX 800nM에서 pCYB204ID를 형질전환시킨 세포주의 항체 발현량을 확인한 결과이다.
도 8은 본 발명에서 사용한 발현 벡터 pCYBBSS001의 제한효소 지도를 모식적으로 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명에서 사용한 발현 벡터 pCYBBSS002의 제한효소 지도를 모식적으로 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명에서 사용한 발현 벡터 pCYBBSS003의 제한효소 지도를 모식적으로 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명에서 사용한 발현 벡터 pCYBBSS004의 제한효소 지도를 모식적으로 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명에서 사용한 발현 벡터 pCYBBSS005의 제한효소 지도를 모식적으로 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명에서 사용한 발현 벡터 pCYBBSS006의 제한효소 지도를 모식적으로 나타낸 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 (i) '프로모터-UTR(untranslation region)-인트론-항체 경쇄 유전자-polyA'를 포함하는 제1발현 카세트 ; 및 (ii) '프로모터-UTR-인트론-항체 중쇄 유전자-IRES(internal ribosome entry site)-증폭 유전자-polyA'를 포함하는 제2발현 카세트를 포함하는, 항체 발현용 바이시스트로닉 발현벡터를 제공한다.
본 발명은 다양한 포유동물세포에서 강력하고 안정적으로 유전자 발현을 유도할 수 있도록 UTR 및 인트론을 포함하여 항체의 중쇄 및 경쇄 유전자와 증폭 유전자가 하나의 유전자처럼 발현되도록 설계된 바이시스트로닉 발현벡터를 제공할 수 있는 것에 그 특징이 있다. 특히, 본 발명은 UTR 및 인트론이 포함된 새로운 발현 카세트를 제공한다.
구체적으로 본 발명은 (i) '프로모터-UTR(untranslation region)-인트론-베바시주맙(bevacizumab) 경쇄 유전자-polyA'를 포함하는 제1발현 카세트 ; 및 (ii) '프로모터-UTR-인트론-베바시주맙 중쇄 유전자-IRES(internal ribosome entry site)-증폭 유전자-polyA'를 포함하는 제2발현 카세트를 포함하는, 항체 발현용 바이시스트로닉 발현벡터를 제공한다. 본 발명은 (i) '프로모터-UTR(untranslation region)-인트론-토실리주맙(Tocilizumab) 경쇄 유전자-polyA'를 포함하는 제1발현 카세트 ; 및 (ii) '프로모터-UTR-인트론-토실리주맙 중쇄 유전자-IRES(internal ribosome entry site)-증폭 유전자-polyA'를 포함하는 제2발현 카세트를 포함하는, 항체 발현용 바이시스트로닉 발현벡터를 제공한다. 본 발명은 (i) '프로모터-UTR(untranslation region)-인트론-데노수맙(Denosumab) 경쇄 유전자-polyA'를 포함하는 제1발현 카세트 ; 및 (ii) '프로모터-UTR-인트론-데노수맙 중쇄 유전자-IRES(internal ribosome entry site)-증폭 유전자-polyA'를 포함하는 제2발현 카세트를 포함하는, 항체 발현용 바이시스트로닉 발현벡터를 제공한다. 본 발명은 (i) '프로모터-UTR(untranslation region)-인트론-벨리무맙(Belimumab) 경쇄 유전자-polyA'를 포함하는 제1발현 카세트; 및 (ii) '프로모터-UTR-인트론-벨리무맙 중쇄 유전자-IRES(internal ribosome entry site)-증폭 유전자-polyA'를 포함하는 제2발현 카세트를 포함하는, 항체 발현용 바이시스트로닉 발현벡터를 제공한다. 본 발명은 (i) '프로모터-UTR(untranslation region)-인트론-골리무맙(Golimumab) 경쇄 유전자-polyA'를 포함하는 제1발현 카세트 ; 및 (ii) '프로모터-UTR-인트론-골리무맙 중쇄 유전자-IRES(internal ribosome entry site)-증폭 유전자-polyA'를 포함하는 제2발현 카세트를 포함하는, 항체 발현용 바이시스트로닉 발현벡터를 제공한다. 본 발명은 (i) '프로모터-UTR(untranslation region)-인트론-우스테키누맙(Ustekinumab) 경쇄 유전자-polyA'를 포함하는 제1발현 카세트; 및 (ii) '프로모터-UTR-인트론-우스테키누맙 중쇄 유전자-IRES(internal ribosome entry site)-증폭 유전자-polyA'를 포함하는 제2발현 카세트를 포함하는, 항체 발현용 바이시스트로닉 발현벡터를 제공한다. 본 발명은 (i) '프로모터-UTR(untranslation region)-인트론-이필리무맙(Ipilimumab) 경쇄 유전자-polyA'를 포함하는 제1발현 카세트 ; 및 (ii) '프로모터-UTR-인트론-이필리무맙 중쇄 유전자-IRES(internal ribosome entry site)-증폭 유전자-polyA'를 포함하는 제2발현 카세트를 포함하는, 항체 발현용 바이시스트로닉 발현벡터를 제공한다.
본 발명에서 용어, "바이시스트로닉(bicistronic)"이란, 진핵세포 내에서 mRNA의 내부에서도 리보좀이 폴리펩티드를 합성할 수 있게 되어 하나의 mRNA로부터 여러 단백질이 합성 가능하게 된 시스템을 의미하며, 본 발명에서는 항체 유전자와 증폭 유전자가 동시에 발현될 수 있도록 벡터를 디자인하였다.
일반적으로, 대장균과 같은 원핵세포가 하나의 mRNA의 여러 위치에 리보좀이 결합하여 한번에 여러 단백질을 합성할 수 있는 폴리시스트로닉(polycistronic) 시스템을 가진 것과는 달리, 진핵세포에서는 mRNA로부터 단백질을 해독(translation)할 때, 리보좀이 mRNA의 5' 끝에 부착된 후 스캐닝(scanning) 방법을 통해서 개시 코돈인 AUG를 찾게 되고, 이 AUG 코돈으로부터 단백질의 합성이 시작됨에 따라 하나의 mRNA로부터 반드시 하나의 폴리펩티드가 형성되는 모노시스트로닉(monocistronic) 시스템을 갖게 되며, ATG의 인식 및 단백질 합성의 시작에 코작 서열(Kozac sequence)이 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 그러나 EMC 바이러스(Encephalomyocarditis virus, 이하 'EMCV'라 한다)의 경우는, 내부 리보좀 도입점(Internal Ribosome Entry Site, IRES, 이하 'IRES'라 칭한다)이라 불리는 특별한 구조로 되어있는 RNA 서열을 갖고 있어, 진핵세포 내에서 하나의 mRNA로부터 여러 단백질 합성이 가능하다(Jang 등, J. Virol.(1989) 63, 1651). 본 발명에서는 항체 유전자와 증폭 유전자가 동시에 발현될 수 있도록 하기 위하여, 항체의 중쇄 유전자 뒤에 IRES가 오도록 한 후 그 뒤에 증폭 유전자가 오도록 벡터를 디자인하였다.
본 발명에서 용어, "벡터(vector)"는 적당한 숙주세포 내에서 목적 유전자가 발현할 수 있도록 프로모터 등의 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물로서, 본 발명의 목적상 바람직하게는 항체를 발현하기 위한 벡터를 의미하며, 바이시스트로닉 발현벡터일 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터는 (i) '프로모터-UTR(untranslation region)-인트론-베바시주맙 경쇄 유전자-polyA'를 포함하는 제1발현 카세트; 및 (ii) '프로모터-UTR(untranslation region)-인트론-베바시주맙 중쇄 유전자-IRES(internal ribosome entry site)-증폭 유전자-polyA'를 포함하는 제2발현 카세트를 포함하는 베바시주맙 발현용 바이시스트로닉 발현벡터일 수 있다.
또 하나의 다른 예로, 본 발명의 벡터는 (i) '프로모터-UTR(untranslation region)-인트론-토실리주맙(Tocilizumab) 경쇄 유전자-polyA'를 포함하는 제1발현 카세트 ; 및 (ii) '프로모터-UTR-인트론-토실리주맙 중쇄 유전자-IRES(internal ribosome entry site)-증폭 유전자-polyA'를 포함하는 제2발현 카세트를 포함하는, 토실리주맙 발현용 바이시스트로닉 발현벡터일 수 있다. 또 하나의 다른 예로, 본 발명의 벡터는 (i) '프로모터-UTR(untranslation region)-인트론-데노수맙(Denosumab) 경쇄 유전자-polyA'를 포함하는 제1발현 카세트 ; 및 (ii) '프로모터-UTR-인트론-데노수맙 중쇄 유전자-IRES(internal ribosome entry site)-증폭 유전자-polyA'를 포함하는 제2발현 카세트를 포함하는, 데노수맙 발현용 바이시스트로닉 발현벡터일 수 있다. 또 하나의 다른 예로, 본 발명의 벡터는 (i) '프로모터-UTR(untranslation region)-인트론-골리무맙(Golimumab) 경쇄 유전자-polyA'를 포함하는 제1발현 카세트 ; 및 (ii) '프로모터-UTR-인트론-골리무맙 중쇄 유전자-IRES(internal ribosome entry site)-증폭 유전자-polyA'를 포함하는 제2발현 카세트를 포함하는, 골리무맙 발현용 바이시스트로닉 발현벡터일 수 있다. 또 하나의 다른 예로, 본 발명의 벡터는 (i) '프로모터-UTR(untranslation region)-인트론-벨리무맙 경쇄 유전자-polyA'를 포함하는 제1발현 카세트; 및 (ii) '프로모터-UTR(untranslation region)-인트론-벨리무맙 중쇄 유전자-IRES(internal ribosome entry site)-증폭 유전자-polyA'를 포함하는 제2발현 카세트를 포함하는 벨리무맙 발현용 바이시스트로닉 발현벡터일 수 있다. 또 하나의 다른 예로, 본 발명의 벡터는 (i) '프로모터-UTR(untranslation region)-인트론-우스테키누맙 경쇄 유전자-polyA'를 포함하는 제1발현 카세트; 및 (ii) '프로모터-UTR(untranslation region)-인트론-우스테키누맙 중쇄 유전자-IRES(internal ribosome entry site)-증폭 유전자-polyA'를 포함하는 제2발현 카세트를 포함하는 우스테키누맙 발현용 바이시스트로닉 발현벡터일 수 있다. 또 하나의 다른 예로, 본 발명의 벡터는 (i) '프로모터-UTR(untranslation region)-인트론-이필리무맙 경쇄 유전자-polyA'를 포함하는 제1발현 카세트; 및 (ii) '프로모터-UTR(untranslation region)-인트론-이필리무맙 중쇄 유전자-IRES(internal ribosome entry site)-증폭 유전자-polyA'를 포함하는 제2발현 카세트를 포함하는 이필리무맙 발현용 바이시스트로닉 발현벡터일 수 있다.
본 발명에서 용어, "프로모터"는 전사조절인자들이 결합하는 DNA 염기서열 부위를 의미하며, 본 발명의 목적상 유전자 발현율을 높이기 위하여 강력하고 안정적인 유전자 발현을 유도할 수 있는 프로모터를 사용할 수 있다.
상기 프로모터는 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 SV40(simian virus 40) 초기 프로모터, CMV(Cytomegalovirus) 프로모터 및 EF1-α(elongation factor1-α) 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있으며, 상기 EF1-α는 hEF1-α(human elongation factor1-α)일 수 있다. 보다 바람직하게는 사이토메갈로 바이러스 프로모터일 수 있고, 가장 바람직하게는 strain의 Cytomegalovirus strainAD169의 프로모터일 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 높은 항체 발현을 유도하기 위하여 지금까지 알려진 가장 강력한 동물세포용 프로모터 중의 하나인 Cytomegalovirus strainAD169 genome (genBank : X17403.1) 서열 상의 프로모터를 사용하여, 이를 삽입하여 발현벡터를 제작하였다.
본 발명에서 용어, "UTR(untranslation region, 비해독 부분)"은 mRNA의 비해독 부분을 이르는 단어로 일반적으로 코딩 영역의 양 말단을 의미한다. 특히, 5' 말단 부분을 5' UTR로 3' 말단 부분을 3'UTR로 지칭한다. 특히, 본 발명에서 UTR은 본 발명의 바이시스트로닉 벡터에 포함되어 유전자의 발현량을 증대시키는 효과를 갖는 한 제한되지 않는다. 특히, CMV로부터 유래한 UTR일 수 있다. 본 발명은 이와 같은 UTR 및 인트론을 동시에 포함하는 발현 카세트를 포함하는 바이시스트로닉 발현 벡터가 도입된 유전자의 발현량이 증가되는 것을 최초로 규명하여 새로운 항체 발현 벡터를 제공하는데 특징이 있다.
본 발명의 UTR는 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 서열번호 2의 Cytomegalovirus strainAD169의 UTR일 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 보다 강력한 유전자 발현을 위해, Cytomegalovirus strainAD169 genome (genBank : X17403.1) 서열 상의 UTR을 사용하여, 이를 프로모터와 항체 경쇄 및 중쇄 유전자 사이에 각각 삽입하여 발현벡터를 제작하였다.
본 발명에서 용어, "인트론(intron)"은 진핵세포에서 발견되는 특징적인 서열로 유전정보를 가지고 있지 않아서 단백질을 만들지 못하는 DNA 영역을 의미하며, 핵에서 RNA 중합효소에 의하여 mRNA가 합성될 때 전사되지만 핵 밖으로 빠져나가는 과정에서 스플라이싱(splicing) 과정을 통해 제거되는 부분이다. 이러한 인트론과 비해독 엑손(untranslated exon)을 포함하는 플라스미드의 유전자 발현량이 인트론을 포함하지 않는 경우에 비하여 더 높다는 연구 결과들이 축적됨에 따라, 재조합 발현벡터에 이종 인트론을 도입함으로써 보다 안정하고 지속적인 유전자 발현이 가능하도록 개선된 벡터들이 개발되어 사용되고 있다. 그러나 기존의 인트론 삽입 벡터의 경우에는 모노시스트로닉 벡터에 사용되어 단지 하나의 유전자만을 발현시키는 단점이 있었다. 이에 본 발명자들은 이러한 단점을 극복하기 위하여 바이시스트로닉 벡터 시스템에서 외부 인트론 유전자를 프로모터 뒤에 삽입할 경우 고효율의 유전자 발현을 시킬 수 있음을 고안하였다. 특히, 본 발명의 인트론은 CMV로부터 유래한 인트론일 수 있다.
본 발명의 인트론은 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 서열번호 3의 Cytomegalovirus strainAD169의 인트론일 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 보다 강력한 프로모터의 구성을 위해, Cytomegalovirus strainAD169 genome (genBank : X17403.1) 서열 상의 인트론을 사용하여, 이를 프로모터와 항체 경쇄 및 중쇄 유전자 사이에 각각 삽입하여 발현벡터를 제작하였다.
본 발명의 발현벡터는, 프로모터, UTR, 인트론의 유래가 동일하거나 상이할 수 있다. 예를 들어, 상기 프로모터가 SV40 초기 프로모터이며, 상기 UTR 및 상기 인트론은 SV40 유래인 것일 수 있고; 상기 프로모터가 CMV 프로모터이며, 상기 UTR 및 상기 인트론은 CMV 유래인 것일 수 있으며; 상기 프로모터가 hEF1-α 프로모터이며, 상기 UTR 및 상기 인트론이 hEF1-α 유래인 것일 수 있다.
본 발명에서 용어, "증폭 유전자"는 본 발명에서 안정적으로 고발현하고자 하는 항체 유전자와 함께 발현시키도록 유도하기 위하여 증폭되는 유전자를 의미하며, 세포 내 염색체로 상기 증폭 유전자 및 항체 유전자가 재조합된 세포만이 성장이 가능하도록, 증폭 유전자가 삽입되지 않은 세포는 처리된 화학약품의 존재 하에서는 성장하지 않는 원리를 이용하여, 화학 약품을 사용하여 유전자를 증폭시킬 수 있다. 본 발명의 바이시스트로닉 발현벡터를 이용하면 상기 증폭 유전자와 항체 유전자가 하나의 유전자처럼 함께 발현되도록 유도되어 궁극적으로 목적하는 항체 유전자를 고발현시킬 수 있다.
상기 증폭 유전자는 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 GS(glutamine synthetase) 또는 DHFR(dehydrofolate reductase)일 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 증폭 유전자로 GS를 사용한 pCYB204IG 발현벡터 및 증폭 유전자로 DHFR을 사용한 pCYB204ID 발현벡터를 제작하였고(도 5 및 6), pCYBBSS001(도 8), pCYBBSS002(도 9), pCYBBSS003(도 10), pCYBBSS004(도 11), pCYBBSS005(도 12), pCYBBSS006(도 13) 발현벡터를 제작하였고 상기 발현벡터가 항체 유전자를 고발현시키는데 유용함을 확인하였다.
본 발명에서 용어, "항체"는 면역계 내에서 항원의 자극에 의하여 만들어지는 물질로서, 특정한 항원과 특이적으로 결합하여 림프와 혈액을 떠돌며 항원항체반응을 일으키는 물질을 의미한다. 본 발명의 목적상, 상기 항체는 계속적으로 고발현되기 위한 목적이 되는 것으로서, 본 발명의 발현벡터를 이용하여 상기 항체 유전자를 강력하고 안정적으로 발현하도록 유도할 수 있으며, 상기 발현벡터를 형질전환시킨 동물세포를 이용하여 항체를 효율적으로 생산할 수 있다.
상기 항체는 아미노산과 당사슬로 결합된 단백질로 경쇄 2개와 중쇄 2개가 이황화결합을 통하여 Y자형의 단백질로 형성된다. 본 발명의 일실시예에서는 한 벡터에서 UTR 및 인트론을 포함하는 항체의 경쇄 발현 카세트 및 중쇄 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제작함으로써, 경쇄 및 중쇄를 모두 갖는 항체를 생산할 수 있는 발현벡터를 제작하였다.
본 발명의 항체는 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 치료용 항체를 모두 포함할 수 있다. 그 예로 VEGF-A(vascular endothelial Growth Factor-A)를 표적으로 하는 항체인 베바시주맙(Bevacizumab), IL-6 수용체를 표적으로 하는 항체인 토실리주맙(Tocilizumab), Receptor activator of NF-kB ligand (RANKL)를 표적으로 하는 항체인 데노수맙(Denosumab), 가용성 B 림프구 자극인자(B Lymphocyte Stimulator, BLyS)에 대한 항체인 벨리무맙(Belimumab), TNFα를 표적으로 하는 항체인 골리무맙(Golimumab), 인터루킨 12(Interleukin-12, IL-12)과 인터루킨 23(Interleukin-23, IL-23)에 대한 항체인 우스테키누맙(Ustekinumab) 및 세포독성 T 림프구 항원-4(Cytotoxic T Lymphocyte Antigen-4)를 표적으로 하는 항체인 이필리무맙(Ipilimumab)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
상기 베바시주맙은 아바스틴(Avastin)이라고도 하며, 결장직장암, 폐암, 신장암, 뇌암에 대한 항체치료제로 알려져 있는 미국 Genentech사에서 개발한 인간화 항체이다. 본 발명의 실시예에 따르면, 대표적인 치료용 항체인 베바시주맙을 본 발명의 항체 발현용 바이시스트로닉 발현 벡터에 도입할 경우, 효과적으로 상기 항체를 생산하는 것을 확인하였다.
상기 토실리주맙은 스위스계 제약회사인 로슈(Roche)사의 일본 자회사인 쥬가이(Chugai)에서 개발한 인간 단일클론 항체로서, 악템라(Actemra)라는 제품명으로 미국, 유럽, 일본에서 류마티스 관절염 치료제로 승인을 받았다. 본 발명의 실시예에서는, 토실리주맙을 본 발명의 항체 발현용 바이시스트로닉 발현 벡터에 도입할 경우, 효과적으로 상기 항체를 생산하는 것을 확인하는 것을 통해, 본 발명의 바이시스트로닉 발현 벡터가 토실리주맙 항체를 고발현시키는 시스템임을 확인하였다.
상기 데노수맙은 미국 암젠(Amgen)사에서 개발한 인간 단일클론 항체로서, 프롤리아(Prolia)라는 제품명으로 미국, 캐나다, 유럽에서 골다공증 적응증에 대하여 승인을 받았으며, 엑스제바(Xgeva)라는 제품명으로 유럽에서 고형암이 뼈로 전이된 환자의 골절 등을 예방하는 약물로 승인받았다. 본 발명의 실시예에 따르면, 데노수맙을 본 발명의 항체 발현용 바이시스트로닉 발현 벡터에 도입할 경우, 효과적으로 상기 항체를 생산하는 것을 확인하여, 본 발명의 바이시스트로닉 발현 벡터가 데노수맙 항체를 고발현시키는 시스템임을 확인하였다.
상기 벨리무맙은 다국적 제약회사인 글락소스미스클라인 (GlaxoSmithKline, GSK)사에서 개발한 가용성 B 림프구 자극인자(B Lymphocyte Stimulator, BLyS; 또는 B 세포 활성화 인자, B cell Activating Factor, BAFF)에 대한 인간 단일클론 항체로서, 미국, 캐나다 및 유럽에서 루푸스(전신 홍반 루푸스, systemic lupus erythematosus, SLE)에 대하여 승인을 받았다. 본 발명의 실시예에서는 벨리무맙을 본 발명의 항체 발현용 바이시스트로닉 발현 벡터에 도입하여, 효과적으로 상기 항체를 생산하는 것을 확인하는 것을 통해 본 발명의 바이시스트로닉 발현 벡터가 벨리무맙 항체를 고발현시키는 시스템임을 확인하였다.
상기 골리무맙은 글로벌 제약회사인 존슨앤존슨(Johnson & Johnson)사의 자회사인 얀센바이오테크(Janssen Biotech, Inc., 구 센토고, Centocor)에서 개발한 인간 단일클론 항체로서, 심포니(Simponi)라는 제품명으로 미국, 캐나다, 한국에서 류마티스 관절염, 건선성 관절염 및 강직성 척추염 치료제로 승인을 받았다. 본 발명의 실시예에서는, 골리무맙을 본 발명의 항체 발현용 바이시스트로닉 발현 벡터에 도입할 경우, 효과적으로 상기 항체를 생산하는 것을 확인하는 것을 통해 본 발명의 바이시스트로닉 발현 벡터가 골리무맙 항체를 고발현시키는 시스템임을 확인하였다.
상기 우스테키누맙은 다국적 제약회사인 얀센 제약회사(Janssen Pharmaceuticals, Inc.)에서 개발한 인터루킨 12(Interleukin-12, IL-12)과 인터루킨 23(Interleukin-23, IL-23)에 대한 인간 단일클론 항체로서, 미국 식품의약국(U.S. Food and Drug Administration, FDA)에서 건선성 관절염(psoriatic arthritis)에 대하여 승인을 받았으며, 중증 건선(severe psoriasis), 중등증-중증 판상건선(moderate-to-severe plaque psoriasis), 다발성 경화증(multiple sclerosis) 및 유육종증(sarcoidosis) 등에 대한 임상 진행 중에 있다. 본 발명의 실시예에서는 우스테키누맙을 본 발명의 항체 발현용 바이시스트로닉 발현 벡터에 도입하여, 효과적으로 상기 항체를 생산하는 것을 확인하는 것을 통해 본 발명의 바이시스트로닉 발현 벡터가 우스테키누맙 항체를 고발현시키는 시스템임을 확인하였다.
상기 이필리무맙은 미국계 제약회사인 브리스톨-마이어스 스큅(Bristol-Myers Squibb Co., BMS) 사에서 개발한 세포독성 T 림프구 항원-4(Cytotoxic T-Lymphocyte Antigen, CTLA-4)에 대한 인간 단일클론 항체로서, 예보이(Yervoy)라는 제품명으로 미국 식품의약국(U.S. Food and Drug Administration, FDA)에서 흑생종 및 피부암에 대하여 승인을 받았으며, 비소세포암(non-small cell lung carcinoma, NSCLC), 소세포암(small cell lung cancer, SCLC), 방광암(bladder cancer) 및 전이 호르몬 무반응성 전립선암(metastatic hormone-refractory prostate cancer)에 대해서 임상 진행 중에 있다. 특히, 흑색종 치료제로 FDA의 승인된 예보이는 정맥주사제 형식으로 투여되며 인체 면역시스템이 흑색종을 형성하는 종양세포를 표적으로 인식해 공격할 수 있도록 도와줌으로써 약효를 발휘한다. 본 발명의 실시예에서는 이필리무맙을 본 발명의 항체 발현용 바이시스트로닉 발현 벡터에 도입하여, 효과적으로 상기 항체를 생산하는 것을 확인하는 것을 통해 본 발명의 바이시스트로닉 발현 벡터가 이필리무맙 항체를 고발현시키는 시스템임을 확인하였다.
본 발명에서 "항체 경쇄 유전자"는 경쇄 2개와 중쇄 2개가 아미노산과 당사슬로 결합된 Y자형의 단백질인 항체에서 경쇄 부분을 암호화하는 유전자를 의미한다. 본 발명에서 항체 경쇄 유전자는 본 발명의 바이시스트로닉 벡터를 이용하여 발현량이 증가되는 임의의 항체에 대한 경쇄 유전자는 제한없이 포함되며, 예를 들어, 치료용 항체인 베바시주맙, 토실리주맙, 데노수맙, 벨리무맙, 골리무맙, 우스테키누맙 또는 이필리무맙의 경쇄 부분을 암호화하는 염기서열일 수 있다. 구체적으로, 베바시주맙의 경쇄 부분에 대한 서열번호 13, 토실리주맙의 경쇄 부분에 대한 서열번호 17, 데노수맙의 경쇄 부분에 대한 서열번호 21, 벨리무맙의 경쇄 부분에 대한 서열번호 25, 골리무맙의 경쇄 부분에 대한 서열번호 29, 우스테키누맙의 경쇄 부분에 대한 서열번호 33 및 이필리무맙의 경쇄 부분에 대한 서열번호 37로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열로 구성된 것일 수 있으며, 더욱 구체적으로는 베바시주맙의 경쇄 부분을 암호화하는 서열번호 11, 토실리주맙의 경쇄 부분을 암호화하는 서열번호 15, 데노수맙의 경쇄 부분을 암호화하는 서열번호 19, 벨리무맙의 경쇄 부분을 암호화하는 서열번호 23, 골리무맙의 경쇄 부분을 암호화하는 서열번호 27, 우스테키무맵의 경쇄 부분을 암호화하는 서열번호 31 및 이필리무맙의 경쇄 부분을 암호화하는 서열번호 35로 이루어진 군으로부터 선택된 염기서열로 구성된 것일 수 있다.
본 발명에서 "항체 중쇄 유전자"는 경쇄 2개와 중쇄 2개가 아미노산과 당사슬로 결합된 Y자형의 단백질인 항체에서 중쇄 부분을 암호화하는 유전자를 의미한다. 본 발명에서 항체 중쇄 유전자는 본 발명의 바이시스트로닉 벡터를 이용하여 발현량이 증가되는 임의의 항체에 대한 중쇄 유전자는 제한없이 포함되며, 예를 들어, 치료용 항체인 베바시주맙, 토실리주맙, 데노수맙, 벨리무맙, 골리무맙, 우스테키누맙 또는 이필리무맙의 중쇄 부분을 암호화하는 염기서열일 수 있다. 구체적으로, 베바시주맙의 중쇄 부분에 대한 서열번호 14, 토실리주맙의 중쇄 부분에 대한 서열번호 18, 데노수맙의 중쇄 부분에 대한 서열번호 22, 벨리무맙의 중쇄 부분에 대한 서열번호 26, 골리무맙의 중쇄 부분에 대한 서열번호 30, 우스테키누맙의 중쇄 부분에 대한 서열번호 34 및 이필리무맙의 중쇄 부분에 대한 서열번호 38로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열로 구성된 것일 수 있으며, 더욱 구체적으로는 베바시주맙의 중쇄 부분을 암호화하는 서열번호 12, 토실리주맙의 중쇄 부분을 암호화하는 서열번호 16, 데노수맙의 중쇄 부분을 암호화하는 서열번호 20, 벨리무맙의 중쇄 부분을 암호화하는 서열번호 24, 골리무맙의 중쇄 부분을 암호화하는 서열번호 28, 우스테키누맙의 중쇄 부분을 암호화하는 서열번호 32 및 이필리무맙의 중쇄 부분을 암호화하는 서열번호 36으로 이루어진 군으로부터 선택된 염기서열로 구성된 것일 수 있다.
본 발명에서 용어, "IRES(internal ribosome entry site, 내부 리보좀 유입점, 서열번호 4)"는 진핵세포에서 하나의 mRNA로부터 여러 단백질 합성이 가능하도록 리보좀이 직접 결합하는 mRNA 내부에 존재하고 있는 특정 영역을 의미하며, 본 발명의 발현벡터가 바이시스트로닉 발현벡터가 될 수 있도록 하는 역할을 한다.
진핵세포에서 mRNA의 해독은 일반적으로 mRNA의 5'끝에 부착된 캡(cap) 구조 의존적이지만, 이러한 캡 구조 비의존성 번역을 하는 경우 리보좀이 mRNA 내부에 존재하고 있는 특정 영역에 직접 결합하여 번역을 시작하는 경우가 있어 이것을 내부 개시 기구라 한다. 상기 내부 개시 기구에서 리보좀이 직접 결합하는 mRNA 상의 부위를 IRES라 하는데, 폴리오바이러스, EMC 바이러스 등의 바이러스 mRNA 외에 면역글로불린 중쇄 결합단백질(BiP) mRNA, 초파리의 안테나유전자(Antp) mRNA 등의 세포 mRNA에서도 발견된다.
본 발명에서 용어, "polyA"는 폴리아데닐산 또는 폴리아데닐산 절편이라고 불리며, 진핵생물의 mRNA 3' 말단에 보편적으로 존재하는 아데닐산의 연속한 배열을 의미한다. 그 길이는 10 내지 200 뉴클레오티드 정도이며, 발현벡터 백본(backbone)의 허용 크기에 따라 다양하게 조절될 수 있다. polyA는 mRNA의 안정화, 해독, 핵에서 세포질로의 수송 등에 관여하는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 항체 생산용 바이시스트로닉 발현벡터는 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 도 5에 도시된 pCYB204IG, 도 6에 도시된 pCYB204ID,도 8에 도시된 pCYBBSS001, 도 9에 도시된 pCYBBSS002, 도 10에 도시된 pCYBBSS003, 도 11에 도시된 pCYBBSS004, 도 12에 도시된 pCYBBSS005 또는 도 13에 도시된 pCYBBSS006일 수 있다.
상기 pCYB204IG 발현벡터는 'CMV 프로모터-UTR-인트론-베바시주맙 경쇄 유전자-polyA'를 포함하는 제1발현 카세트 및 'CMV 프로모터-UTR-인트론-베바시주맙 중쇄 유전자-IRES-GS-polyA'를 포함하는 제2발현 카세트를 포함하는 발현벡터이며, pCYB204ID 발현벡터는 'CMV 프로모터-UTR-인트론-베바시주맙 경쇄 유전자-polyA'를 포함하는 제1발현 카세트 및 'CMV 프로모터-UTR-인트론-베바시주맙 중쇄 유전자-IRES-DHFR-polyA'를 포함하는 제2발현 카세트를 포함하는 발현벡터이다. 상기 pCYBBSS001 발현벡터는 'CMV 프로모터-UTR-인트론-토실리주맙 경쇄 유전자-polyA'를 포함하는 제1발현 카세트 및 'CMV 프로모터-UTR-인트론-토실리주맙 중쇄 유전자-IRES-DHFR-polyA'를 포함하는 제2발현 카세트를 포함하는 발현벡터이다. 상기 pCYBBSS002 발현벡터는 'CMV 프로모터-UTR-인트론-데노수맙 경쇄 유전자-polyA'를 포함하는 제1발현 카세트 및 'CMV 프로모터-UTR-인트론-데노수맙 중쇄 유전자-IRES-DHFR-polyA'를 포함하는 제2발현 카세트를 포함하는 발현벡터이다. 상기 pCYBBSS003 발현벡터는 'CMV 프로모터-UTR-인트론-벨리무맙 경쇄 유전자-polyA'를 포함하는 제1발현 카세트 및 'CMV 프로모터-UTR-인트론-벨리무맙 중쇄 유전자-IRES-DHFR-polyA'를 포함하는 제2발현 카세트를 포함하는 발현벡터이다. 상기 pCYBBSS004 발현벡터는 'CMV 프로모터-UTR-인트론-골리무맙 경쇄 유전자-polyA'를 포함하는 제1발현 카세트 및 'CMV 프로모터-UTR-인트론-골리무맙 중쇄 유전자-IRES-DHFR-polyA'를 포함하는 제2발현 카세트를 포함하는 발현벡터이다. 상기 pCYBBSS005 발현벡터는 'CMV 프로모터-UTR-인트론-우스테키누맙 경쇄 유전자-polyA'를 포함하는 제1발현 카세트 및 'CMV 프로모터-UTR-인트론-우스테키누맙 중쇄 유전자-IRES-DHFR-polyA''를 포함하는 제2발현 카세트를 포함하는 발현벡터이다. 아울러, 상기 pCYBBSS006 발현벡터는 'CMV 프로모터-UTR-인트론-이필리무맙 경쇄 유전자-polyA'를 포함하는 제1발현 카세트 및 'CMV 프로모터-UTR-인트론-이필리무맙 중쇄 유전자-IRES-DHFR-polyA''를 포함하는 제2발현 카세트를 포함하는 발현벡터이다.
본 발명의 일 실시예에서는 증폭 유전자로써 GS를 사용하고, 경쇄 발현 카세트 및 중쇄 발현 카세트를 이용하여 pCYBIG를 제작하였으며, 상기 pCYBIG 발현벡터에서 증폭 유전자로서 GS 대신 DHFR을 포함하는 pCYBID 발현벡터를 제작하였다.
본 발명의 바이시스트로닉 발현벡터는 상기에서 설명한 바와 같이 항체의 중쇄 및 경쇄 유전자와 증폭 유전자가 하나의 유전자처럼 발현되도록 설계되어, 상기 항체를 안정적이고 고효율로 발현시킬 수 있는 용도를 가질 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 발현벡터가 형질전환된 동물세포를 제공한다.
본 발명에서 동물세포에 형질전환된 발현벡터는 항체 발현용 바이시스트로닉 발현벡터이며, 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명에서 용어, "형질전환(transfection)"은 배양동물세포에 DNA를 직접 도입하여 세포의 유전형질을 변이시키는 방법으로서, 일반적으로 목적으로 하는 유전자를 플라스미드 등의 매개체에 넣어 도입하는 방법을 사용한다. 상기 형질전환은 당 분야의 통상적인 방법에 따라 실시될 수 있으며, 바람직하게는 그 예로 인산칼슘공침법, DEAE-덱스트란 처리법, 전기천공법, 리포펙타민 처리법, 재분포법 (리보좀이라는 인공막과 DNA복합체를 만들게 하는 세포와 융합시키게 하는 방법) 등이 있다. 본 발명의 일실시예에서는 리포펙타민을 이용하여 경쇄/중쇄 발현벡터를 세포 내로 형질전환시켰다.
상기 동물세포는 항체를 생산할 수 있는 한 당 분야에서 사용하는 동물세포를 제한 없이 사용할 수 있으며, 바람직하게는 중국 햄스터 난소 세포(CHO)를 사용할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일실시예에서는 증폭 유전자를 GS와 DHFR로 달리한 벡터에 베바시주맙의 경쇄 및 중쇄 유전자를 삽입하여, 베바시주맙 항체 발현용 pCYB204IG 및 pCYB204GS 바이시스트로닉 벡터를 제조하였다. 상기 두 벡터로 각각 형질전환된 세포주에서 베바시주맙 항체의 발현량을 비교한 결과, pCYB204ID 벡터를 형질전환시킨 세포주의 경우 pCYB204IG 벡터를 형질전환시킨 세포주보다 베바시주맙이 2배 이상 고발현되는 것을 확인하였다.
또한, 본 발명의 구체적인 일실시예에서는 증폭 유전자로 DHFR를 포함하는 벡터에 토실리주맙의 경쇄 및 중쇄 유전자를 삽입하여, 토실리주맙 항체 발현용 pCYBBSS001 바이시스트로닉 벡터를 제조하였다. 상기 벡터로 형질전환된 세포주에서 토실리주맙 항체의 발현량을 확인한 결과, 800 nM의 MTX 농도의 유전자 증폭 조건에서 50.8 ㎍/㎖과 51.7 ㎍/㎖로 고발현되는 것을 확인하였다.
본 발명의 구체적인 일실시예에서는 증폭 유전자로 DHFR를 포함하는 벡터에 데노수맙의 경쇄 및 중쇄 유전자를 삽입하여, 데노수맙 항체 발현용 pCYBBSS002 바이시스트로닉 벡터를 제조하였다. 상기 벡터로 형질전환된 세포주에서 데노수맙 항체의 발현량을 확인한 결과, 800 nM의 MTX 농도의 유전자 증폭 조건에서 81.4 ㎍/㎖로 고발현되는 것을 확인하였다.
본 발명의 구체적인 일실시예에서는 증폭 유전자로 DHFR를 포함하는 벡터에 벨리무맙의 경쇄 및 중쇄 유전자를 삽입하여, 벨리무맙 항체 발현용 pCYBBSS003 바이시스트로닉 벡터를 제조하였다. 상기 벡터로 형질전환시킨 세포주에서 벨리무맙 항체의 발현량을 확인한 결과, 4 ㎍/㎖로 고발현되는 것을 확인하였다.
본 발명의 구체적인 일실시예에서는 증폭 유전자로 DHFR를 포함하는 벡터에 골리무맙의 경쇄 및 중쇄 유전자를 삽입하여, 골리무맙 항체 발현용 pCYBBSS004 바이시스트로닉 벡터를 제조하였다. 상기 벡터로 형질전환된 세포주에서 골리무맙 항체의 발현량을 확인한 결과, 500 nM의 MTX 농도의 유전자 증폭 조건에서 120.3 ㎍/㎖로 고발현되는 것을 확인하였다.
본 발명의 구체적인 일실시예에서는 증폭 유전자로 DHFR를 포함하는 벡터에 우스테키누맙의 경쇄 및 중쇄 유전자를 삽입하여, 우스테키누맙 항체 발현용 pCYBBSS005 바이시스트로닉 벡터를 제조하였다. 상기 벡터로 형질전환시킨 세포주에서 우스테키누맙 항체의 발현량을 확인한 결과, 2.5 ㎍/㎖로 고발현되는 것을 확인하였다.
아울러, 본 발명의 구체적인 일실시예에서는 증폭 유전자로 DHFR를 포함하는 벡터에 이필리무맙의 경쇄 및 중쇄 유전자를 삽입하여, 이필리무맙 항체 발현용 pCYBBSS006 바이시스트로닉 벡터를 제조하였다. 상기 벡터로 형질전환된 세포주에서 이필리무맙 항체의 발현량을 확인한 결과, 500 nM의 메토트렉세이트(methotrexate, MTX) 농도의 유전자 증폭 조건에서 8 ㎍/㎖로 고발현되는 것을 확인하였다.
정리하면, 상기 설명한 바와 같이 본 발명에서는 실제 본 발명의 항체 발현용 바이시스트로닉 발현벡터를 다양한 치료용 항체에 적용하여 발현량을 측정하였으며 그 결과 본 발명의 발현벡터를 이용한 결과 다양한 항체의 발현능이 우수해지는 것을 확인하였다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 동물세포를 배양하는 단계를 포함하는 항체의 생산 방법을 제공한다.
본 발명에서 상기 동물세포는 본 발명에 따른 인트론을 포함하는 바이시스트로닉 발현벡터가 형질전환된 동물세포로서, 이는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 항체 생산 방법은 상기 동물세포를 배양함으로써, 항체를 안정적이고 고효율로 생산할 수 있다. 상기 방법은 바람직하게는 상기 동물세포를 배양한 배양물에서 항체를 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따라 생산될 수 있는 상기 항체에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같으며, 이에 제한되지는 않으나,베바시주맙, 토실리주맙, 데노수맙, 벨리무맙, 골리무맙, 우스테키누맙 또는 이필리무맙일 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 경쇄 발현용 유전자 세트 Gln-LC의 제작
인간 사이토메갈로바이러스 (human cytomegalovirus) strain AD169의 complete genome (GenBank:X17403.1)의 염기 서열을 통해 UTR 부분과 인트론(intron) 부분을 포함한 CMV 프로모터(promoter)의 DNA 서열을 확보하였다. 목적 단백질의 발현을 위해서는 최소한 프로모터, cloning site, poly A element가 필요하므로, 상기 사이토메갈로 바이러스의 genome에서 확인된 염기서열을 이용해, CMV 프로모터 부분과 UTR 부분, 인트론, cloning site, SV40 poly A의 DNA를 Genotech(한국)에 의뢰하여 합성하였다.
아울러, 인트론과 poly A 사이에는 항체 단백질의 경쇄 부분을 클로닝하기 위해 제한효소 XbaI과 NotI 인식부위를 각각 첨가하였으며, CMV 프로모터 5' 말단에는 제한효소 AscI의 인식부위를, poly A 3' 말단에는 제한효소 BamHI과 XhoI의 인식부위를 첨가하여 이후의 클로닝 과정에 사용되도록 하였다.
상기와 같은 과정을 통하여, [AscI]-CMV 프로모터-UTR-인트론-[XbaI/NotI]-polyA-[BamHI/XhoI]의 구성을 가지는 경쇄 발현용 유전자 세트(Gln-LC)를 제작하였다(도 1).
실시예 2 : 중쇄 발현용 유전자 세트 Gln-HC 제작
상기 실시예 1에서 제작한 Gln-LC 유전자 세트를 주형으로 하여, 하기 표 1에 정리한 BamHI Gln-F 프라이머(서열번호 7)와 NheI Gln-R 프라이머(서열번호 8)를 사용하여 PCR 반응을 진행하였다.
표 1
프라이머 염기서열 서열번호
BamHI Gln-F GGC CGG ATC CGG CGC GCC TGC AGT GAA T 7
NheI Gln-R GGC CCT CGA GAA AGA TCT GGG CTA GCC GTG TCA AGG ACG GTG ACT GCA G 8
중쇄 발현용 유전자 세트 Gln-HC에는 CMV 프로모터의 3' 말단에 제한효소 BamHI 인식부위를 첨가하였으며, CMV 프로모터 이후에 UTR, intron 그리고 항체 단백질의 중쇄 부분을 클로닝하기 위해 제한효소 NheI과 XhoI 인식부위를 첨가하여 이후의 클로닝 과정에 사용하도록 하였다.
상기 PCR 반응은 94℃에서 5분간 초기 변성시킨 후, 94℃ 50초, 50℃ 30초 및 72℃에서 2분 30초로 이루어진 순환을 30회 반복하고, 마지막으로 72℃에서 7분간 증폭시켰다. PCR 반응용액은 Premix Taq (Ex Taq version) (TAKARA사) 25 ㎕, 서열번호 7 과 8의 프라이머(10 pmole/㎕) 각 2 ㎕를 포함하고, 총 부피가 50 ㎕가 되도록 증류수를 첨가하였다.
상기와 같은 과정을 통하여, [BamHI]-CMV 프로모터-UTR-인트론-[NheI/XhoI]-[NheI]의 구성을 가지는 중쇄 발현용 유전자 세트(Gln-HC)를 제작하였다(도 1).
PCR로 증폭된 Gln-HC 유전자는 제조사의 지침에 따라 pGEM T-easy 벡터(Promega사)에 삽입하였다.
실시예 3 : 경쇄 발현용 유전자 세트의 GS 벡터 클로닝을 통한 GS-Gln-LC 플라스미드 제작
증폭용 유전자로서 GS(Glutamin synthetase) 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제작하기 위해, 당사에서 개발한 IRES-GS 벡터를 사용하였다. IRES와 GS 유전자, poly A를 포함하는 IRES-GS 벡터를, 제한효소 MluI과 XhoI으로 37℃, 4시간 동안 처리하여 IRES - GS 유전자 - f1 origin - Kanamycin/neomycin 저항 유전자 - Poly A - pUC orogin이 포함된 DNA 벡터 절편을 회수하였다.
한편, 실시예 1에서 합성한 경쇄 발현용 유전자 세트 Gln-LC는 AscI과 XhoI을 처리하여 절단하였다.
상기 절단한 IRES-GS 벡터 절편 및 Gln-LC 유전자 세트 절편을 각각 1% agarose gel 전기영동을 한 후 gel extraction 하여 회수하였다. 각각의 회수한 DNA를 연결하여 GS-Gln-LC 플라스미드를 제작하였다(도 2).
실시예 4 : 경쇄 및 중쇄 발현용 플라스미드 pCYBIG의 제작
상기 실시예 2에서 제작한 T-easy 벡터에 삽입되어 있는 경쇄 발현용 유전자 세트인 Gln-HC DNA를 수득하기 위하여, 제조된 벡터에 제한효소 BamHI과 XhoI을 37℃에서 4시간 동안 처리하여 절단하였다. 제한효소를 처리한 DNA는 1% agaroge gel 전기영동을 통해 Gln-HC 의 크기에 해당하는 DNA를 회수하였다.
한편, 실시예 3에서 제작한 GS-Gln-LC 플라스미드는 제한효소 BamHI과 XhoI을 37℃에서 4시간 동안 처리하여 절단하였다. 제한효소를 처리한 DNA는 1% agaroge gel 전기영동을 통해 GS-Gln-LC 플라스미드의 크기에 해당하는 DNA를 회수하였다.
상기 과정을 통해 회수한 Gln-HC 유전자 세트 절편과 GS-Gln-LC 플라스미드 절편을 연결하여 pCYBIG 벡터를 제작하였다(도 3).
실시예 5 : 경쇄 및 중쇄 발현용 플라스미드 pCYBID의 제작
상기 실시예 4에서 제작한 pCYBIG 벡터의 GS 증폭 유전자를 DHFR(dehydrofolate reductase) 유전자로 대체한 pCYBID 벡터를 제작하고자 하였다.
구체적으로, DHFR 유전자를 주형으로 하여, 하기 표 2에 정리한 salI DHFR-F 프라이머(서열번호 9)와 NheI DHFR-R 프라이머(서열번호 10)를 사용하여 PCR 반응을 진행하였다.
표 2
프라이머 염기서열 서열번호
SalI DHFR-F GGC CGT CGA CAT GGT TCG ACC GCT G 9
NheI DHFR-R GGC CGC TAG CTT AGC CTT TCT TCT CAT AGA C 10
상기 PCR 반응은 94℃에서 5분간 초기 변성시킨 후, 94℃ 50초, 50℃ 30초 및 72℃에서 2분 30초로 이루어진 순환을 30회 반복하고, 마지막으로 72℃에서 7분간 증폭시켰다. PCR 반응용액은 Premix Taq (Ex Taq version) (TAKARA사) 25 ㎕, 서열번호 9과 10의 프라이머(10 pmole/㎕) 각 2 ㎕를 포함하고, 총 부피가 50 ㎕가 되도록 증류수를 첨가하였다. 상기와 같이 PCR로 증폭된 DHFR 유전자는 제조사의 지침에 따라 pGEM T-easy 벡터(Promega사)에 삽입하였다.
한편, 실시예 4에서 제작한 pCYBIG 벡터는 제한 효소 salI과 XbaI을 처리하여 절단하였고, T-easy 벡터에 클로닝된 DHFR 유전자는 salI과 NheI을 처리하여 DNA를 절단하였다.
각각의 절단한 DNA는 1% agarose gel 전기영동을 통해 DNA를 회수한 후 두 개의 DNA를 연결하여 GS 대신 DHFR 유전자로 치환된 pCYBID 벡터를 제작하였다(도 4).
실시예 6 : 베바시주맙 발현 플라스미드를 제작
6-1. 베바시주맙 경쇄 유전자의 삽입
상기 실시예 4 및 5에서 제작한 pCYBIG 벡터 및 pCYBID 벡터에 베바시주맙 경쇄 유전자를 삽입하여, 베바시주맙 경쇄 발현 플라스미드를 제작하였다.
구체적으로는, pCYBIG 벡터 및 pCYBID 벡터에 대해서는 XbaI과 NotI으로 절단하였다.
베바시주맙의 경쇄유전자는 베바시주맙의 아미노산 서열(서열번호 13)을, DNA 염기 서열로 치환하였다(서열번호 11). DNA 서열 치환시에는 항체 발현 세포주인 CHO 세포에 최적화된 DNA 염기 서열로 치환하였으며, 5'-, 3'-양 말단에 제한효소 NheI과 NotI 인식 부위를 삽입하였다. Start codon 인 ATG 앞에 Kozak sequence (GCCACC)를 넣어 발현량이 높아지도록 유도하였으며, signal sequence로 MGWSCIILFLVATATGVHS를 첨가하여 유전자를 합성하였다. 합성된 유전자는 NheI과 NotI을 처리하여 절단하였다.
각각의 절단한 DNA는 1% agarose gel 전기영동을 통해 DNA를 회수한 후 두 개의 DNA를 연결하여, 각각의 pCYBIG 및 pCYBID 벡터에 베바시주맙 경쇄 유전자가 삽입된 벡터를 제조하였다.
6-2. 베바시주맙 중쇄 유전자의 삽입
상기 실시예 6-1에서 제작된 경쇄 발현용 벡터 pCYBIG-베바시주맙 경쇄 유전자 벡터와, pCYBID-베바시주맙 경쇄 유전자 벡터를 NheI과 XhoI으로 절단하였다. 베바시주맙의 중쇄 아미노산 서열(서열번호 14)로부터 DNA 염기 서열로 치환하였다(서열번호 12). 이후, 실시예 6과 같이 start codon 인 ATG 앞에 Kozak sequence (GCCACC)를 넣어 design 하였으며, 양 말단에 제한효소 NheI과 XhoI 인식부위를 넣어 유전자를 합성한 후, NheI과 XhoI을 처리하여 절단하였다. 각각의 절단한 DNA는 1% agarose gel 전기영동을 통해 DNA를 회수한 후 두 개의 DNA를 연결하여, 각각의 pCYB 벡터에 베바시주맙 경쇄 및 중쇄 유전자가 삽입된 벡터를 제조하였다(도 5, 도 6).
도 5 및 도 6은 본 발명의 pCYB204IG 벡터 및 pCYB204ID 벡터를 베바시주맙 경쇄 및 중쇄를 클로닝하는 방법을 도식화하여 나타낸 개략도이다.
실시예 7 : pCYB204IG 벡터의 항체 발현율 측정
7-1. 형질전환
항체 단백질을 안정적으로 발현하는 세포주를 개발하기 위해, 우선 GS 결핍 CHO-K1 세포를 형질전환 실험 전날 6-웰 플레이트에 웰당 4×105 세포의 농도로 분양한 후 37℃, 이산화탄소 배양기에서 배양하였다. 세포의 viability가 98% 이상인 것을 확인한 후 일반적이나 리포펙타민(Lipofectamine, Invitrogen사)을 이용해 pCYB204IG벡터를 세포 내로 형질전환시켰다. 이때 형질전환은 Opti-MEM-1(Invitrgen 사)에 상기 발현벡터 DNA 20 ㎍과 리포펙타민 10 ㎕를 첨가한 배지를 사용하여 수행되었다. 이로부터 pCYB204IG가 형질전환된 CHO-K1 세포를 선발하였다.
7-2. 항체 유전자 증폭
상기 실시예 7-1에서 pCYB204IG가 형질전환된 CHO-K1 세포주에 MSX(Methionine sulfoximine)의 초기 농도로 25μM을 처리한 후 세포 생장이 정상적으로 회복될 때까지 생장의 추이를 관찰하였다. MSX 25μM을 처리한 후, 7일 이후의 계대에서는 MSX의 농도를 250μM로 증가시켰으며, 마찬가지 방법으로 MSX에 의한 외부압력에 대해 생장이 회복되는 계대 시점에서 MSX의 농도를 증가시켜 최종적으로 500μM까지 증가시켰다. 500μM의 MSX의 농도에서 제조된 세포주 풀(pool1 및 pool2)의 발현량을 측정하였다. 발현량의 측정은 Anti-Fc를 사용한 ELISA 방법을 사용하여 확인하였다(도 7a).
실시예 8 : pCYB204ID 벡터의 항체 발현율 측정
8-1: 형질전환
상기 pCUB204IG 벡터의 증폭 유전자 GS 대신에 증폭 유전자 DHFR를 포함하는 pCYB204ID 발현벡터가 형질전환된 세포주의 발현량을 비교하기 위하여, 상기 실시예 7-1과 동일한 방법으로 CHO-DG44 세포(Gibco, 12609-012)에 pCYB204ID를 세포 내로 형질전환시킨 뒤, 형질전환된 CHO-DG44 세포를 선발하였다.
8-2: 항체 유전자 증폭
실시예 8-1에서 pCYB204ID가 형질전환된 CHO-DG44 세포주에 MTX (methotrexate)를 처리하여 유전자 증폭을 수행하였다. 실시예 7-2와 동일하게 세포 생장이 정상적으로 회복될 때 MTX의 농도를 증가시키는 방법에 의하여 발현량을 측정하였다. MTX 처리 농도는 50nM/200nM/800nM의 농도로 진행하였다. 발현량의 측정은 Anti-Fc를 사용한 ELISA 방법을 사용하여 확인하였다(도 7b).
상기 7-2와 8-2에서 측정한 벡터별 항체의 발현량을 비교한 결과, pCYB204ID 벡터를 형질전환시킨 세포주의 경우 pCYB204IG 벡터를 형질전환시킨 세포주보다 베바시주맙이 2배 이상 고발현되는 것을 확인하였다.
실시예 9 : 토실리주맙 발현 플라스미드 제작
9-1. 토실리주맙 경쇄 유전자의 삽입
상기 실시예 5에서 제작한 pCYBID 벡터에 토실리주맙 경쇄 유전자를 삽입하여, 토실리주맙 경쇄 발현 플라스미드를 제작하였다.
구체적으로는, pCYBID 벡터에 대해서 XbaI과 NotI으로 절단하였다.
토실리주맙의 경쇄 유전자는 토실리주맙의 경쇄 아미노산 서열(서열번호 17)을 암호화하는 DNA 염기 서열로 치환하였다(서열번호 15). DNA 서열 치환시에는 항체 발현 세포주인 CHO 세포에 최적화된 DNA 염기 서열로 치환하였으며, 5'-, 3'-양 말단에 제한효소 NheI과 NotI 인식 부위를 삽입하였다. Start codon 인 ATG 앞에 Kozak sequence (GCCACC)를 넣어 발현량이 높아지도록 유도하였으며, signal sequence로 MGWSCIILFLVATATGVHS를 첨가하여 유전자를 합성하였다. 합성된 유전자는 NheI과 NotI을 처리하여 절단하였다.
각각 절단한 DNA는 1% agarose gel 전기영동을 통해 DNA를 회수한 후 두 개의 DNA를 연결하여, pCYBID 벡터에 토실리주맙 경쇄 유전자가 삽입된 벡터를 제조하였다.
9-2. 토실리주맙 중쇄 유전자의 삽입
상기 실시예 9-1에서 제작된 경쇄 발현용 벡터 pCYBID-토실리주맙 경쇄 유전자 벡터를 NheI과 XhoI으로 절단하였다. 토실리주맙의 중쇄 아미노산 서열(서열번호 18)로부터 DNA 염기 서열로 치환하였다(서열번호 16). 이후, 실시예 9-1과 같이 start codon 인 ATG 앞에 Kozak sequence (GCCACC)를 넣어 design 하였으며, 양 말단에 제한효소 NheI과 XhoI 인식부위를 넣어 유전자를 합성한 후, NheI과 XhoI을 처리하여 절단하였다. 각각의 절단한 DNA는 1% agarose gel 전기영동을 통해 DNA를 회수한 후 두 개의 DNA를 연결하여, pCYB 벡터에 토실리주맙 경쇄 및 중쇄 유전자가 삽입된 벡터를 제조하였다(도 8).
도 8은 본 발명의 발현벡터 pCYBBSS001의 제한효소 지도를 모식적으로 나타낸 것이다.
실시예 10 : pCYBBSS001 벡터의 항체 발현율 측정
10-1. 형질전환
항체 단백질을 안정적으로 발현하는 세포주를 개발하기 위해, 우선 DHFR 결핍 CHO-DG44 세포(Dr.Chasin, Univ. Columbia. USA)를 형질전환 실험 전날 6-웰 플레이트에 웰당 8×105 세포의 농도로 분양한 후 37℃, 이산화탄소 배양기에서 배양하였다. 세포가 플레이트에 70 내지 80% 정도 성장한 것을 확인한 후 리포펙타민 LTX and PLUS(Lipofectamine LTX and PLUS reagent, Invitrogen사)를 이용해 경쇄/중쇄 발현벡터 pCYBBSS001을 세포 내로 형질전환하였다. 이때 형질전환에는 Opti-MEM-1 (Invitrogen 사)에 상기 발현벡터 DNA 각 2.5 ㎍과 리포펙타민 LTX 10 ㎕를 첨가한 배지를 사용하였다. 이로부터 경쇄/중쇄 발현벡터 pCYBBSS001이 형질전환된 CHO-DG44 세포를 선별하였다.
10-2. 항체 유전자 증폭
상기 실시예 10-1에서 pCYBBSS001이 형질전환된 CHO-DG44 세포주에 MTX(methotrexate)를 처리하여 유전자 증폭을 수행하였다. 세포 생장이 정상적으로 회복될 때 MTX의 농도를 증가시키는 방법에 의하여 발현량을 측정하였다. MTX 처리 농도는 50 nM/ 200 nM/ 800 nM의 농도로 진행하였다. 그 결과, pCYBBSS001 벡터를 형질전환시킨 세포주의 경우 800 nM의 MTX 농도에서 최고 발현량을 보였다. 발현량 측정은 Octet titer assay를 이용하였으며, Protein A Dip and Read biosensors (forteBIO, cat. no. 18-5010, lot no. 120716)를 1 X PBS로 10분 이상 평형화한 뒤 배양액에 반응시켰다. Biosensor의 regeneration/neutralization은 각 시료를 분석한 후 3 cycles로 수행하였고, 배양액은 standard 범위 내에서 분석되도록 1 X PBS를 사용하여 희석하여 분석하였다. 800 nM의 MTX 농도에서 발현량은 2가지 pool에서 각각 50.8 ㎍/㎖과 51.7 ㎍/㎖으로 확인되었으며, 이러한 결과는 본 발명의 인트론이 삽입된 발현벡터를 형질전환한 경우 유전자를 계속적으로 고발현할 수 있음을 의미한다.
실시예 11 : 데노수맙 발현 플라스미드 제작
11-1. 데노수맙 경쇄 유전자의 삽입
상기 실시예 5에서 제작한 pCYBID 벡터에 데노수맙 경쇄 유전자를 삽입하여, 데노수맙 경쇄 발현 플라스미드를 제작하였다.
구체적으로는, pCYBID 벡터에 대해서 XbaI과 NotI으로 절단하였다.
데노수맙의 경쇄유전자는 데노수맙의 아미노산 서열(서열번호 21)을, DNA 염기 서열로 치환하였다(서열번호 19). DNA 서열 치환시에는 항체 발현 세포주인 CHO 세포에 최적화된 DNA 염기 서열로 치환하였으며, 5'-, 3'-양 말단에 제한효소 NheI과 NotI 인식 부위를 삽입하였다. Start codon 인 ATG 앞에 Kozak sequence (GCCACC)를 넣어 발현량이 높아지도록 유도하였으며, signal sequence로 MGWSCIILFLVATATGVHS를 첨가하여 유전자를 합성하였다. 합성된 유전자는 NheI과 NotI을 처리하여 절단하였다.
각각 절단한 DNA는 1% agarose gel 전기영동을 통해 DNA를 회수한 후 두 개의 DNA를 연결하여, pCYBID 벡터에 데노수맙 경쇄 유전자가 삽입된 벡터를 제조하였다.
11-2. 데노수맙 중쇄 유전자의 삽입
상기 실시예 11-1에서 제작된 경쇄 발현용 벡터 pCYBID-데노수맙 경쇄 유전자 벡터를 NheI과 XhoI으로 절단하였다. 데노수맙의 중쇄 아미노산 서열(서열번호 22)로부터 DNA 염기 서열로 치환하였다(서열번호 20). 이후, 실시예 11-1과 같이 start codon 인 ATG 앞에 Kozak sequence (GCCACC)를 넣어 design 하였으며, 양 말단에 제한효소 NheI과 XhoI 인식부위를 넣어 유전자를 합성한 후, NheI과 XhoI을 처리하여 절단하였다. 각각의 절단한 DNA는 1% agarose gel 전기영동을 통해 DNA를 회수한 후 두 개의 DNA를 연결하여, pCYB 벡터에 데노수맙 경쇄 및 중쇄 유전자가 삽입된 벡터를 제조하였다(도 9).
도 9는 본 발명의 발현벡터 pCYBBSS002의 제한효소 지도를 모식적으로 나타낸 것이다.
실시예 12 : pCYBBSS002 벡터의 항체 발현율 측정
12-1. 형질전환
항체 단백질을 안정적으로 발현하는 세포주를 개발하기 위해, 우선 DHFR 결핍 CHO-DG44 세포(Dr.Chasin, Univ. Columbia. USA)를 형질전환 실험 전날 6-웰 플레이트에 웰당 8×105 세포의 농도로 분양한 후 37℃, 이산화탄소 배양기에서 배양하였다. 세포가 플레이트에 70 내지 80% 정도 성장한 것을 확인한 후 리포펙타민 LTX and PLUS(Lipofectamine LTX and PLUS reagent, Invitrogen사)를 이용해 경쇄/중쇄 발현벡터 pCYBBSS002를 세포 내로 형질전환하였다. 이때 형질전환에는 Opti-MEM-1 (Invitrogen 사)에 상기 발현벡터 DNA 각 2.5 ㎍과 리포펙타민 LTX 10 ㎕를 첨가한 배지를 사용하였다. 이로부터 경쇄/중쇄 발현벡터 pCYBBSS002가 형질전환된 CHO-DG44 세포를 선별하였다.
12-2. 항체 유전자 증폭
상기 실시예 12-1에서 pCYBBSS002가 형질전환된 CHO-DG44 세포주에 MTX(methotrexate)를 처리하여 유전자 증폭을 수행하였다. 세포 생장이 정상적으로 회복될 때 MTX의 농도를 증가시키는 방법에 의하여 발현량을 측정하였다. MTX 처리 농도는 50 nM/ 200 nM/ 800 nM의 농도로 진행하였다. 그 결과, pCYBBSS002 벡터를 형질전환시킨 세포주의 경우 800 nM의 MTX 농도에서 최고 발현량을 보였다. 발현량 측정은 Octet titer assay를 이용하였으며, Protein A Dip and Read biosensors (forteBIO, cat. no. 18-5010, lot no. 120716)를 1 X PBS로 10분 이상 평형화한 뒤 배양액에 반응시켰다. Biosensor의 regeneration/neutralization은 각 시료를 분석한 후 3 cycles로 수행하였고, 배양액은 standard 범위 내에서 분석되도록 1 X PBS를 사용하여 희석하여 분석하였다. 800 nM의 MTX 농도에서 발현량은 81.4 ㎍/㎖으로 확인되었으며, 이러한 결과는 본 발명의 인트론이 삽입된 발현벡터를 형질전환한 경우 유전자를 계속적으로 고발현할 수 있음을 의미한다.
실시예 13 : 벨리무맙 발현 플라스미드 제작
13-1. 벨리무맙 경쇄 유전자의 삽입
상기 실시예 5에서 제작한 pCYBID 벡터에 벨리무맙 경쇄 유전자를 삽입하여, 벨리무맙 경쇄 발현 플라스미드를 제작하였다.
구체적으로는, pCYBID 벡터에 대해서 XbaI과 NotI으로 절단하였다.
벨리무맙의 경쇄 유전자는 벨리무맙의 경쇄 아미노산 서열(서열번호 25)을 암호화하는 DNA 염기 서열로 치환하였다(서열번호 23). DNA 서열 치환시에는 항체 발현 세포주인 CHO 세포에 최적화된 DNA 염기 서열로 치환하였으며, 5'-, 3'-양 말단에 제한효소 NheI과 NotI 인식 부위를 삽입하였다. Start codon 인 ATG 앞에 Kozak sequence (GCCACC)를 넣어 발현량이 높아지도록 유도하였으며, signal sequence로 MGWSCIILFLVATATGVHS를 첨가하여 유전자를 합성하였다. 합성된 유전자는 NheI과 NotI을 처리하여 절단하였다.
각각 절단한 DNA는 1% agarose gel 전기영동을 통해 DNA를 회수한 후 두 개의 DNA를 연결하여, pCYBID 벡터에 벨리무맙 경쇄 유전자가 삽입된 벡터를 제조하였다.
13-2. 벨리무맙 중쇄 유전자의 삽입
상기 실시예 13-1에서 제작된 경쇄 발현용 벡터 pCYBID-벨리무맙 경쇄 유전자 벡터를 NheI과 XhoI으로 절단하였다. 벨리무맙의 중쇄 아미노산 서열(서열번호 26)로부터 DNA 염기 서열로 치환하였다(서열번호 24). 이후, 실시예 13-1과 같이 start codon 인 ATG 앞에 Kozak sequence (GCCACC)를 넣어 design 하였으며, 양 말단에 제한효소 NheI과 XhoI 인식부위를 넣어 유전자를 합성한 후, NheI과 XhoI을 처리하여 절단하였다. 각각의 절단한 DNA는 1% agarose gel 전기영동을 통해 DNA를 회수한 후 두 개의 DNA를 연결하여, 각각의 pCYB 벡터에 벨리무맙 경쇄 및 중쇄 유전자가 삽입된 벡터를 제조하였다(도 10).
도 10는 본 발명의 발현벡터 pCYBBSS003의 제한효소 지도를 모식적으로 나타낸 것이다.
실시예 14 : pCYBBSS003 벡터의 항체 발현율 측정
14-1. 형질전환
항체 단백질을 안정적으로 발현하는 세포주를 개발하기 위해, 우선 DHFR 결핍 CHO-DG44 세포(Dr.Chasin, Univ. Columbia. USA)를 형질전환 실험 전날 6-웰 플레이트에 웰당 8×105 세포의 농도로 분양한 후 37℃, 이산화탄소 배양기에서 배양하였다. 세포가 플레이트에 70 내지 80% 정도 성장한 것을 확인한 후 리포펙타민 LTX and PLUS(Lipofectamine LTX and PLUS reagent, Invitrogen사)를 이용해 경쇄/중쇄 발현벡터 pCYBBSS003을 세포 내로 형질전환하였다. 이때 형질전환에는 Opti-MEM-1 (Invitrogen 사)에 상기 발현벡터 DNA 각 2.5 ㎍과 리포펙타민 LTX 10 ㎕를 첨가한 배지를 사용하였다. 이로부터 경쇄/중쇄 발현벡터 pCYBBSS003이 형질전환된 CHO-DG44 세포를 선별하였다.
14-2. 항체 유전자 발현량 측정
상기 실시예 14-1에서 pCYBBSS003 벡터가 형질전환된 CHO-DG44 세포주의 벨리무맙의 발현량을 측정하였다. 발현량의 측정은 Anti-Fc를 사용한 ELISA 방법을 사용하였으며, PCD(Picograms/cell/day)로 계산하여 세포당 발현량을 구하였다. 그 결과, pCYBBSS003 벡터를 형질전환시킨 세포주의 경우 4 ㎍/㎖의 발현량을 보임을 확인하였으며, 이러한 결과는 본 발명의 인트론이 삽입된 발현벡터를 형질전환한 경우 유전자를 계속적으로 고발현할 수 있음을 의미한다.
실시예 15 : 골리무맙 발현 플라스미드 제작
15-1. 골리무맙 경쇄 유전자의 삽입
상기 실시예 5에서 제작한 pCYBID 벡터에 골리무맙 경쇄 유전자를 삽입하여, 골리무맙 경쇄 발현 플라스미드를 제작하였다.
구체적으로는, pCYBID 벡터에 대해서 XbaI과 NotI으로 절단하였다.
골리무맙의 경쇄 유전자는 골리무맙의 경쇄 아미노산 서열(서열번호 29)을 암호화하는 DNA 염기 서열로 치환하였다(서열번호 27). DNA 서열 치환시에는 항체 발현 세포주인 CHO 세포에 최적화된 DNA 염기 서열로 치환하였으며, 5'-, 3'-양 말단에 제한효소 NheI과 NotI 인식 부위를 삽입하였다. Start codon 인 ATG 앞에 Kozak sequence (GCCACC)를 넣어 발현량이 높아지도록 유도하였으며, signal sequence로 MGWSCIILFLVATATGVHS를 첨가하여 유전자를 합성하였다. 합성된 유전자는 NheI과 NotI을 처리하여 절단하였다.
각각 절단한 DNA는 1% agarose gel 전기영동을 통해 DNA를 회수한 후 두 개의 DNA를 연결하여, pCYBID 벡터에 골리무맙 경쇄 유전자가 삽입된 벡터를 제조하였다.
15-2. 골리무맙 중쇄 유전자의 삽입
상기 실시예 15-1에서 제작된 경쇄 발현용 벡터 pCYBID-골리무맙 경쇄 유전자 벡터를 NheI과 XhoI으로 절단하였다. 골리무맙의 중쇄 아미노산 서열(서열번호 30)로부터 DNA 염기 서열로 치환하였다(서열번호 28). 이후, 실시예 15-1과 같이 start codon 인 ATG 앞에 Kozak sequence (GCCACC)를 넣어 design 하였으며, 양 말단에 제한효소 NheI과 XhoI 인식부위를 넣어 유전자를 합성한 후, NheI과 XhoI을 처리하여 절단하였다. 각각의 절단한 DNA는 1% agarose gel 전기영동을 통해 DNA를 회수한 후 두 개의 DNA를 연결하여, pCYB 벡터에 골리무맙 경쇄 및 중쇄 유전자가 삽입된 벡터를 제조하였다(도 11).
도 11는 본 발명의 발현벡터 pCYBBSS004의 제한효소 지도를 모식적으로 나타낸 것이다.
실시예 16 : pCYBBSS004 벡터의 항체 발현율 측정
16-1. 형질전환
항체 단백질을 안정적으로 발현하는 세포주를 개발하기 위해, 우선 DHFR 결핍 CHO-DG44 세포(Dr.Chasin, Univ. Columbia. USA)를 형질전환 실험 전날 6-웰 플레이트에 웰당 8×105 세포의 농도로 분양한 후 37℃, 이산화탄소 배양기에서 배양하였다. 세포가 플레이트에 70 내지 80% 정도 성장한 것을 확인한 후 리포펙타민 LTX and PLUS(Lipofectamine LTX and PLUS reagent, Invitrogen사)를 이용해 경쇄/중쇄 발현벡터 pCYBBSS004을 세포 내로 형질전환하였다. 이때 형질전환에는 Opti-MEM-1 (Invitrogen 사)에 상기 발현벡터 DNA 각 2.5 ㎍과 리포펙타민 LTX 10 ㎕를 첨가한 배지를 사용하였다. 이로부터 경쇄/중쇄 발현벡터 pCYBBSS004이 형질전환된 CHO-DG44 세포를 선별하였다.
16-2. 항체 유전자 증폭
상기 실시예 16-1에서 pCYBBSS004이 형질전환된 CHO-DG44 세포주에 MTX(methotrexate)를 처리하여 유전자 증폭을 수행하였다. 세포 생장이 정상적으로 회복될 때 MTX의 농도를 증가시키는 방법에 의하여 발현량을 측정하였다. MTX 처리 농도는 50 nM/ 200 nM/ 500 nM/ 800 nM의 농도로 진행하였다. 그 결과, pCYBBSS004 벡터를 형질전환시킨 세포주의 경우 800 nM의 MTX 농도에서 최고 발현량을 보였다. 발현량 측정은 Octet titer assay를 이용하였으며, Protein A Dip and Read biosensors (forteBIO, cat. no. 18-5010, lot no. 120716)를 1 X PBS로 10분 이상 평형화한 뒤 배양액에 반응시켰다. Biosensor의 regeneration/neutralization은 각 시료를 분석한 후 3 cycles로 수행하였고, 배양액은 standard 범위 내에서 분석되도록 1 X PBS를 사용하여 희석하여 분석하였다. 500 nM의 MTX 농도에서 발현량은 120.3 ㎍/㎖으로 확인되었으며, 이러한 결과는 본 발명의 골리무맙 발현벡터를 형질전환한 경우 유전자를 계속적으로 고발현할 수 있음을 의미한다.
실시예 17 : 우스테키누맙 발현 플라스미드 제작
17-1. 우스테키누맙 경쇄 유전자의 삽입
상기 실시예 5에서 제작한 pCYBID 벡터에 우스테키누맙 경쇄 유전자를 삽입하여, 우스테키누맙 경쇄 발현 플라스미드를 제작하였다.
구체적으로는, pCYBID 벡터에 대해서 XbaI과 NotI으로 절단하였다.
우스테키누맙의 경쇄 유전자는 우스테키누맙의 경쇄 아미노산 서열(서열번호 33)을 암호화하는 DNA 염기 서열로 치환하였다(서열번호 31). DNA 서열 치환시에는 항체 발현 세포주인 CHO 세포에 최적화된 DNA 염기 서열로 치환하였으며, 5'-, 3'-양 말단에 제한효소 NheI과 NotI 인식 부위를 삽입하였다. Start codon 인 ATG 앞에 Kozak sequence (GCCACC)를 넣어 발현량이 높아지도록 유도하였으며, signal sequence로 MGWSCIILFLVATATGVHS를 첨가하여 유전자를 합성하였다. 합성된 유전자는 NheI과 NotI을 처리하여 절단하였다.
각각 절단한 DNA는 1% agarose gel 전기영동을 통해 DNA를 회수한 후 두 개의 DNA를 연결하여, pCYBID 벡터에 우스테키누맙 경쇄 유전자가 삽입된 벡터를 제조하였다.
17-2. 우스테키누맙 중쇄 유전자의 삽입
상기 실시예 17-1에서 제작된 경쇄 발현용 벡터 pCYBID-우스테키누맙 경쇄 유전자 벡터를 NheI과 XhoI으로 절단하였다. 우스테키누맙의 중쇄 아미노산 서열(서열번호 34)로부터 DNA 염기 서열로 치환하였다(서열번호 32). 이후, 실시예 17-1과 같이 start codon 인 ATG 앞에 Kozak sequence (GCCACC)를 넣어 design 하였으며, 양 말단에 제한효소 NheI과 XhoI 인식부위를 넣어 유전자를 합성한 후, NheI과 XhoI을 처리하여 절단하였다. 각각의 절단한 DNA는 1% agarose gel 전기영동을 통해 DNA를 회수한 후 두 개의 DNA를 연결하여, 각각의 pCYB 벡터에 우스테키누맙 경쇄 및 중쇄 유전자가 삽입된 벡터를 제조하였다(도 12).
도 12는 본 발명의 발현벡터 pCYBBSS005의 제한효소 지도를 모식적으로 나타낸 것이다.
실시예 18 : pCYBBSS005 벡터의 항체 발현율 측정
18-1. 형질전환
항체 단백질을 안정적으로 발현하는 세포주를 개발하기 위해, 우선 DHFR 결핍 CHO-DG44 세포(Dr.Chasin, Univ. Columbia. USA)를 형질전환 실험 전날 6-웰 플레이트에 웰당 8×105 세포의 농도로 분양한 후 37℃, 이산화탄소 배양기에서 배양하였다. 세포가 플레이트에 70 내지 80% 정도 성장한 것을 확인한 후 리포펙타민 LTX and PLUS(Lipofectamine LTX and PLUS reagent, Invitrogen사)를 이용해 경쇄/중쇄 발현벡터 pCYBBSS005을 세포 내로 형질전환하였다. 이때 형질전환에는 Opti-MEM-1 (Invitrogen 사)에 상기 발현벡터 DNA 각 2.5 ㎍과 리포펙타민 LTX 10 ㎕를 첨가한 배지를 사용하였다. 이로부터 경쇄/중쇄 발현벡터 pCYBBSS005이 형질전환된 CHO-DG44 세포를 선별하였다.
18-2. 항체 유전자 발현량 측정
상기 실시예 18-1에서 pCYBBSS005 벡터가 형질전환된 CHO-DG44 세포주의 우스테키누맙의 발현량을 측정하였다. 발현량의 측정은 Anti-Fc를 사용한 ELISA 방법을 사용하였으며, PCD(Picograms/cell/day)로 계산하여 세포당 발현량을 구하였다. 그 결과, pCYBBSS005 벡터를 형질전환시킨 세포주의 경우 2.5μg/ml의 발현량을 보임을 확인하였으며, 이러한 결과는 본 발명의 인트론이 삽입된 발현벡터를 형질전환한 경우 유전자를 계속적으로 고발현할 수 있음을 의미한다.
실시예 19 : 이필리무맙 발현 플라스미드 제작
19-1. 이필리무맙 경쇄 유전자의 삽입
상기 실시예 5에서 제작한 pCYBID 벡터에 이필리무맙 경쇄 유전자를 삽입하여, 이필리무맙 경쇄 발현 플라스미드를 제작하였다.
구체적으로는, pCYBID 벡터에 대해서 XbaI과 NotI으로 절단하였다.
이필리무맙의 경쇄 유전자는 이필리무맙의 경쇄 아미노산 서열(서열번호 37)을 암호화하는 DNA 염기 서열로 치환하였다(서열번호 35). DNA 서열 치환시에는 항체 발현 세포주인 CHO 세포에 최적화된 DNA 염기 서열로 치환하였으며, 5'-, 3'-양 말단에 제한효소 NheI과 NotI 인식 부위를 삽입하였다. Start codon 인 ATG 앞에 Kozak sequence (GCCACC)를 넣어 발현량이 높아지도록 유도하였으며, signal sequence로 MGWSCIILFLVATATGVHS를 첨가하여 유전자를 합성하였다. 합성된 유전자는 NheI과 NotI을 처리하여 절단하였다.
각각 절단한 DNA는 1% agarose gel 전기영동을 통해 DNA를 회수한 후 두 개의 DNA를 연결하여, pCYBID 벡터에 이필리무맙 경쇄 유전자가 삽입된 벡터를 제조하였다.
19-2. 이필리무맙 중쇄 유전자의 삽입
상기 실시예 19-1에서 제작된 경쇄 발현용 벡터 pCYBID-이필리무맙 경쇄 유전자 벡터를 NheI과 XhoI으로 절단하였다. 이필리무맙의 중쇄 아미노산 서열(서열번호 38)로부터 DNA 염기 서열로 치환하였다(서열번호 36). 이후, 실시예 19-1과 같이 start codon 인 ATG 앞에 Kozak sequence (GCCACC)를 넣어 design 하였으며, 양 말단에 제한효소 NheI과 XhoI 인식부위를 넣어 유전자를 합성한 후, NheI과 XhoI을 처리하여 절단하였다. 각각의 절단한 DNA는 1% agarose gel 전기영동을 통해 DNA를 회수한 후 두 개의 DNA를 연결하여, 각각의 pCYB 벡터에 이필리무맙 경쇄 및 중쇄 유전자가 삽입된 벡터를 제조하였다(도 13).
도 13는 본 발명의 발현벡터 pCYBBSS006의 제한효소 지도를 모식적으로 나타낸 것이다.
실시예 20 : pCYBBSS006 벡터의 항체 발현율 측정
20-1. 형질전환
항체 단백질을 안정적으로 발현하는 세포주를 개발하기 위해, 우선 DHFR 결핍 CHO-DG44 세포(Dr.Chasin, Univ. Columbia. USA)를 형질전환 실험 전날 6-웰 플레이트에 웰당 8×105 세포의 농도로 분양한 후 37℃, 이산화탄소 배양기에서 배양하였다. 세포가 플레이트에 70 내지 80% 정도 성장한 것을 확인한 후 리포펙타민 LTX and PLUS(Lipofectamine LTX and PLUS reagent, Invitrogen사)를 이용해 경쇄/중쇄 발현벡터 pCYBBSS006을 세포 내로 형질전환하였다. 이때 형질전환에는 Opti-MEM-1 (Invitrogen 사)에 상기 발현벡터 DNA 각 2.5 ㎍과 리포펙타민 LTX 10 ㎕를 첨가한 배지를 사용하였다. 이로부터 경쇄/중쇄 발현벡터 pCYBBSS006이 형질전환된 CHO-DG44 세포를 선별하였다.
20-2. 항체 유전자 증폭
상기 실시예 20-1에서 pCYBBSS006이 형질전환된 CHO-DG44 세포주에 MTX(Methotrexate)를 처리하여 유전자 증폭을 수행하였다. 세포 생장이 정상적으로 회복될 때 MTX의 농도를 증가시키는 방법에 의하여 발현량을 측정하였다. MTX 처리 농도는 50 nM/ 200 nM/ 500 nM/ 800 nM의 농도로 진행하였다. 그 결과, pCYBBSS006 벡터를 형질전환시킨 세포주의 경우 500 nM의 MTX 농도에서 최고 발현량을 보였다. 발현량 측정은 Octet titer assay를 이용하였으며, Protein A Dip and Read biosensors (forteBIO, cat. no. 18-5010, lot no. 120716)를 1 X PBS로 10분 이상 평형화한 뒤 배양액에 반응시켰다. Biosensor의 regeneration/neutralization은 각 시료를 분석한 후 3 cycles로 수행하였고, 배양액은 standard 범위 내에서 분석되도록 1 X PBS를 사용하여 희석하여 분석하였다. 500 nM의 MTX 농도에서 발현량은 8 ㎍/㎖으로 확인되었으며, 이러한 결과는 본 발명의 인트론이 삽입된 발현벡터를 형질전환한 경우 유전자를 계속적으로 고발현할 수 있음을 의미한다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (20)

  1. (i) '프로모터-UTR(untranslation region)-인트론-항체 경쇄 유전자-polyA'를 포함하는 제1발현 카세트 ; 및
    (ii) '프로모터-UTR-인트론-항체 중쇄 유전자-IRES(internal ribosome entry site)-증폭 유전자-polyA'를 포함하는 제2발현 카세트를 포함하는,
    항체 발현용 바이시스트로닉 발현벡터.
  2. 제1항에 있어서, 상기 프로모터는 SV40(simian virus 40) 초기 프로모터, CMV(Cytomegalovirus) 프로모터 및 hEF1-α(human elongation factor1-α) 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 발현벡터.
  3. 제1항에 있어서, 상기 UTR은 CMV 유래인 것인 발현벡터.
  4. 제1항에 있어서, 상기 인트론은 CMV 유래인 것인 발현벡터.
  5. 제1항에 있어서, 상기 프로모터가 SV40 초기 프로모터이며, 상기 UTR 및 상기 인트론은 SV40 유래인 것인, 발현벡터.
  6. 제1항에 있어서, 상기 프로모터가 CMV 프로모터이며, 상기 UTR 및 상기 인트론은 CMV 유래인 것인, 발현벡터.
  7. 제1항에 있어서, 상기 프로모터가 hEF1-α 프로모터이며, 상기 UTR 및 상기 인트론이 hEF1-α 유래인 것인, 발현벡터.
  8. 제2항에 있어서, 상기 프로모터는 서열번호 1의 염기서열로 구성된 CMV 프로모터인 것인 발현벡터.
  9. 제3항에 있어서, 상기 UTR은 서열번호 2의 염기서열로 구성된 CMV 유래 UTR인 것인 발현벡터.
  10. 제5항에 있어서, 상기 인트론은 서열번호 3의 염기서열로 구성된 발현벡터.
  11. 제1항에 있어서, 상기 증폭 유전자는 GS(glutamine synthetase) 또는 DHFR(dehydrofolate reductase)인 것인 발현벡터.
  12. 제1항에 있어서, 상기 항체는 베바시주맙(bevacizumab), 토실리주맙(Tocilizumab), 데노수맙(denosumab), 벨리무맙(belimumab), 골리무맙(golimumab), 우스테키누맙(ustekinumab) 또는 이필리무맙(Ipilimumab)인 것인 발현벡터.
  13. 제1항에 있어서, 상기 발현벡터는 도 5에 기재된 pCYB204IG의 개열지도, 도 6에 기재된 pCYB204ID의 개열지도, 도 8에 기재된 pCYBBSS001의 개열지도, 도 9에 기재된 pCYBBSS002의 개열지도, 도 10에 기재된 pCYBBSS003의 개열지도, 도 11에 기재된 pCYBBSS004의 개열지도, 도 12에 기재된 pCYBBSS005의 개열지도 및 도 13에 기재된 pCYBBSS006의 개열지도로 이루어진 군으로부터 선택된 개열지도를 갖는 발현벡터.
  14. 제1항에 있어서, 상기 항체 경쇄 유전자는 서열번호 11, 서열번호 15, 서열번호 19, 서열번호 23, 서열번호 27, 서열번호 31 및 서열번호 35로 이루어진 군으로부터 선택된 염기서열로 구성되는 것인 발현벡터.
  15. 제1항에 있어서, 상기 항체 중쇄 유전자는 서열번호 12, 서열번호 16, 서열번호 20, 서열번호 24, 서열번호 28, 서열번호 32 및 서열번호 36으로 이루어진 군으로부터 선택된 염기서열로 구성되는 것인 발현벡터.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 발현벡터가 형질전환된 동물세포.
  17. 제16항에 있어서, 상기 동물세포는 중국 햄스터 난소 세포(CHO)인 것인 동물세포.
  18. 제16항에 따른 동물세포를 배양하는 단계를 포함하는 항체의 생산 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 동물세포를 배양한 배양물에서 항체를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 항체의 생산 방법.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 항체는 베바시주맙, 토실리주맙, 데노수맙, 벨리무맙, 골리무맙, 우스테키누맙 또는 이필리무맙인 것인 방법.
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