WO2015016392A1 - 筋萎縮性側索硬化症の新規病因遺伝子 - Google Patents

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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting amyotrophic lateral sclerosis (ALS) using a mutation of the ERBB4 gene as an index.
  • ALS amyotrophic lateral sclerosis
  • ALS Amyotrophic lateral sclerosis
  • FALS familial ALS
  • SALS sporadic ALS
  • a mutation in the causative gene of familial ALS identified in sporadic ALS patients is considered a reduced penetrance mutation or a novel mutation. Further discovery of the familial ALS causative gene is essential to elucidate the molecular background of both familial and sporadic ALS.
  • identification of a causal gene of familial disease is achieved through identification of a disease locus on a chromosome by linkage analysis of a large family, and subsequent positional cloning of the causative gene.
  • many familial ALS families are often difficult to analyze in large families due to poor prognosis and late onset age. This fact means that it is difficult to narrow down candidate regions on chromosomes using linkage analysis, and requires great efforts to identify the causative gene for familial ALS.
  • Recent developments in massively parallel sequencing technologies have opened up the possibility of identifying disease genes by whole genome sequencing (WGS) or exome analysis.
  • An object of the present invention is to provide a method for detecting amyotrophic lateral sclerosis using a mutation in the ERBB4 gene as an index.
  • the present inventor has found that the 2780th base (927th amino acid) or 3823 of the nucleotide sequences of the ERBB4 gene obtained from ALS families and ALS patients.
  • the present inventors have found that the mutation of the 1st base (the 1275th amino acid) is associated with ALS, and completed the present invention.
  • the present invention is as follows. [1] Among the nucleotide sequences of the ERBB4 gene collected from the subject, the gene mutation of the 2780th base from G to A or the gene mutation of the 3823th base from C to T is analyzed, Alternatively, when there are both gene mutations, the ALS detection method determines that the subject has amyotrophic lateral sclerosis (ALS) or is at risk of having ALS. [2] The method according to [1], wherein the ALS is familial ALS or sporadic ALS.
  • ALS amyotrophic lateral sclerosis
  • the ERBB4 gene which contains either or both of a gene mutation from G to A at the 2780th base and a gene mutation from C to T at the 3823th base in the base sequence of the ERBB4 gene.
  • An oligonucleotide consisting of a base sequence containing the 2780th or 3823th base in the base sequence of the ERBB4 gene or a sequence complementary thereto.
  • a kit for detecting amyotrophic lateral sclerosis comprising the oligonucleotide according to [4] or [5].
  • a screening method for a compound that promotes autophosphorylation of ErbB4 protein or a salt thereof which comprises contacting ErbB4 protein with neuregulin-1 in the presence or absence of a candidate substance.
  • a therapeutic agent for amyotrophic lateral sclerosis comprising the compound obtained in [7] or a salt thereof.
  • the present invention provides an ALS detection method and a detection kit.
  • the presence of a novel gene mutation characteristic of ALS becomes clear, and an ALS patient or a patient at risk for ALS can be detected or diagnosed easily and reliably. Therefore, the method of the present invention is useful for detection of ALS, understanding of pathological conditions, diagnosis, and development of molecular target therapy.
  • FIG. 5 shows additional families with ERBB4 mutations in additional ALS patient mutation analysis. An electropherogram of the mutation data is shown next to each member. It is a figure which shows the amino acid preservation
  • R927Q is present within the tyrosine kinase domain, which mediates an important function of ErbB4.
  • Mutation p. R1275W is present in the C-terminal domain in the vicinity of multiple phosphorylation sites, which mediates downstream signaling pathways.
  • FIG. 6 shows functional analysis of wild type and mutant ErbB4 upon neuregulin-1 stimulation.
  • COS transfected with plasmid encoding empty vector control, or wild type (wt) or mutant HA-tagged ErbB4 (p.R114Q, p.A158E, p.H374Q, p.R927Q, or p.R1275W) -7 cells were stimulated with or without NRG-1, and ErbB4 autophosphorylation activity was determined by phospho-ErbB4 (Tyr1284) (Cell Signaling, Danvers, MA, USA) and HA-tag (Abcam), respectively. , Cambridge, UK) and analyzed by Western blot analysis. Loading was controlled by Western blotting using anti-actin antibodies (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). ErbB4 mutant p. R114Q, p. A158E, and p. H374Q was analyzed as an additional control and these were considered benign polymorphisms.
  • the present invention analyzes the gene mutation of the 2780th or 3823th base in the nucleotide sequence of a gene (hereinafter also referred to as ERBB4 gene or ERBB4) encoding an ErbB4 protein collected from a subject, and the analysis result
  • the present invention relates to a method for detecting amyotrophic lateral sclerosis (ALS), characterized by associating a subject with onset of ALS.
  • ALS amyotrophic lateral sclerosis
  • Detection means that the subject's ERBB4 mutation is associated with ALS, and if the subject has an ERBB4 mutation, the subject is an ALS patient, suffers from ALS, or is at risk of developing ALS. Means estimation, determination, determination or diagnosis. Detection also includes pre-determining the onset or likelihood of onset of ALS by a non-healthcare worker, assisting in the determination, or assisting diagnosis.
  • ALS Amyotrophic lateral sclerosis
  • the present inventors have identified a Japanese family with late-onset autosomal dominant ALS, excluding known causative gene mutations. Mutation in ERBB4 by whole genome sequencing and parametric linkage analysis assuming an autosomal dominant form of inheritance with incomplete penetrance performed on the same family c. 2780G> A (p.R927Q) was found.
  • C. 2780G> A means that the 2780th base is mutated from G to A in the coding DNA sequence of ERBB4. This mutation causes the amino acid at 927 to be mutated from R (arginine) to Q (glutamine) in the amino acid sequence of the corresponding ErbB4 protein. This c.
  • the 2780G> A (p.R927Q) mutation was a novel mutation and was found to have the same mutation in a Caucasian familial ALS patient.
  • the present inventors have conducted mutations in Japanese sporadic ALS patients by extensive mutation analysis c. 3823C> T (p.R1275W) was found. This c. The 3823C> T (p.R1275W) mutation is a novel mutation.
  • C. 3823C> T means that the 3823rd base is mutated from C to T in the ERBB4 coding DNA sequence. This mutation causes the amino acid at position 1275 to be mutated from R (arginine) to W (tryptophan) in the amino acid sequence of the corresponding ErbB4 protein.
  • the present invention uses the 2780th base substitution (c.2780G> A (R927Q in the amino acid sequence)) or the 3823rd base substitution (c.3823C> T (R1275W in the amino acid sequence)) of ERBB4 as an index.
  • the present invention relates to a method for evaluating the onset of ALS in a subject.
  • the mutation of the present invention is a mutation that occurs in a highly conserved amino acid among species and is expected to be harmful. Specifically, these mutations are located within the tyrosine kinase domain (p.R927Q) or C-terminal domain (p.R1275W) of the ErbB4 protein, both of which are essential functions of the ErbB4 protein as receptor tyrosine kinases. Mediate.
  • the present inventors have revealed by functional analysis that the mutation of the present invention leads to a reduction in ErbB4 autophosphorylation upon neuregulin-1 (NRG-1) stimulation.
  • the clinical symptoms of patients with mutations are characterized by the involvement of both upper and lower motor neurons without overt cognitive impairment, and relatively slow progression.
  • the present invention shows that disruption of the neuregulin-ErbB4 pathway is involved in the pathogenesis of ALS, and a breakthrough ALS treatment strategy, such as using NRG or these agonists to upregulate ErbB4 function May open the way to.
  • the present invention relates to a compound that promotes autophosphorylation of ErbB4 protein, comprising stimulating ErbB4 protein, for example, a cell expressing ErbB4 protein, with neuregulin-1 in the presence or absence of a candidate substance Or it is related with the screening method of the salt. It is expected that the compound obtained by the screening method of the present invention or a salt thereof can be used as a therapeutic agent for ALS.
  • ERBB4 In the present invention, the genes and proteins used for detection are ERBB4 and ErbB4 proteins.
  • ERBB4 is a gene encoding ErbB4 protein which is a transmembrane tyrosine kinase receptor.
  • human ERBB4 is shown in SEQ ID NO: 1
  • human ErbB4 protein consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • the sequence information of human ERBB4 and ErbB4 proteins can be obtained by, for example, accession numbers NM_005235.2 and NP_005226.
  • the ERBB4 mutation to be analyzed in the present invention is a mutation from G to A at the 2780th base of the ERBB4 base sequence (the 2780th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1).
  • c. 2780G> A ".
  • c. 2780G> A is a substitution of R (arginine) to Q (glutamine) at position 927 (amino acid residue at position 927 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2) in the amino acid sequence of ErbB4 protein (p.R927Q) Occur.
  • the ERBB4 mutation to be analyzed is a mutation from C to T at the 3823th base of the base sequence of ERBB4 (the 3823th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1).
  • c. 3823C> T is a substitution of R (arginine) to W (tryptophan) at position 1275 (the amino acid residue at position 1275 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2) in the ErbB4 protein amino acid sequence (p.R1275W). Occur.
  • Having an ERBB4 (gene) mutation” or “having an ERBB4 (gene) mutation” means that “c. 2780G> A” and “c. 3823C> T” in an ERBB4 gene collected from a subject by genetic analysis. It is included that either or both are confirmed.
  • ERBB4 gene having “c. 2780G> A” and ERBB4 gene having “c. 3823C> T” are included in the present invention.
  • An ErbB4 protein having “p.R927Q” and an ErbB4 protein having “p.R1275W” are also included in the present invention.
  • An example of the base sequence of the ERBB4 gene having “c.2780G> A” is SEQ ID NO: 59
  • an example of the base sequence of the ERBB4 gene having “c.3823C> T” is SEQ ID NO: 61
  • ErbB4 having “p.R927Q” An example of the amino acid sequence of the protein is shown in SEQ ID NO: 60
  • an example of the amino acid sequence of the ErbB4 protein having “p.R1275W” is shown in SEQ ID NO: 62.
  • Table 1 shows c.
  • the base sequence of the coding region containing the 3823C> T mutation is displayed.
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 c.
  • the 2780G> A mutated base sequence and the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, c.
  • Base sequences mutated by 3823C> T are also included in the scope of the present invention.
  • the 2780th and 3823rd bases are underlined, “g / a” indicates a mutation from “G” to “A”, and “c / t” is “C” to “T”. Indicates a mutation.
  • ERBB4 represented by a base sequence other than SEQ ID NO: 1 is also c. 2780 and c.
  • ERBB4 containing a mutation at the site corresponding to 3823 is within the scope of the present invention.
  • ERBB4 represented by a base sequence other than SEQ ID NO: 1 is a base sequence that is not identical to SEQ ID NO: 1 due to, for example, deletion, substitution, addition, insertion, or species difference of a gene other than the mutation of the present invention.
  • the ALS to be detected is familial ALS (FALS) or sporadic ALS (SALS).
  • the above mutation of ERBB4 can be used as a marker for evaluating ALS of a subject. That is, by analyzing this mutation, it is possible to evaluate whether or not it is ALS.
  • the 3823C> T mutation is a causative factor of ALS.
  • the mutation can be associated with ALS. That is, when the analyzed 2780th base of ERBB4 is mutated from G to A, it can be determined that the subject has developed ALS or is at risk of developing ALS. c. When it has a 2780G> A mutation, for example, ALS develops with a probability of about 75% or more. Similarly, when the analyzed 3823rd base of ERBB4 is mutated from C to T, it can be determined that the subject has developed ALS or is at risk of developing ALS.
  • Genomic samples from subjects for detecting the above mutations can be obtained from biological samples such as blood, saliva, skin, lymph nodes, bone marrow, etc. It is not limited to. Methods for extracting and purifying genomic DNA are well known. For example, QIAmp DNA mini kit, QIAmg DNA FFPE Tissue kit (QIAGEN), Wizard (registered trademark) Genomic DNA Purification Kit (Promega), NucleoSpin (registered trademark) series from samples such as blood and saliva collected from humans. It can be extracted using a kit such as Takara Bio. In the case of the present invention, since the mutation is present in the coding region (open reading frame) of the ErbB4 protein, mRNA and total RNA can be obtained instead of genomic DNA and used in the ALS detection method of the present invention.
  • a person skilled in the art can appropriately detect the gene mutation of the present invention in a subject-derived gene based on known methods and common technical knowledge.
  • a method for detecting a gene mutation in the test sample will be described.
  • a known allele-specific amplification method ASA, PASA, ASP, ARMS, etc.
  • ASA allele-specific amplification method
  • ASP ASP
  • ARMS ARMS
  • a DNA polymerase with high fidelity for example, KOD-Plus-neo polymerase (TOYOBO), but is not limited thereto.
  • the primer to be used is designed and synthesized so that the gene mutation is included at an arbitrary position of the primer so that the target mutation portion in the test sample is amplified. After completion of the amplification reaction, the amplification product is detected and the presence or absence of mutation is determined.
  • the TaqMan PCR method is a method that uses a fluorescently labeled allele-specific oligo and a PCR reaction using Taq DNA polymerase.
  • An allele-specific oligo (referred to as TaqMan probe) used in the TaqMan PCR method can be designed based on the gene mutation information.
  • the mutant gene when amplifying using an allele-specific primer, can be quantified by incorporating a fluorescently labeled base into the amplification product using the SyberGreen PCR method.
  • mutations can also be detected by direct sequencing.
  • a commercially available HiSeq system, MiSeq system (Illumina), ABI series (Life Technologies), PGM system (Life Technologies) or the like is used as a sequencer used for base sequence determination.
  • the DNA microarray has a nucleotide probe fixed on a support, and includes a DNA chip, a microchip, a bead array, and the like.
  • a polynucleotide of a test sample is isolated, amplified by PCR, and labeled with a fluorescent reporter group.
  • labeled DNA / mRNA and total RNA are incubated with the array.
  • the array is then inserted into a scanner and the hybridization pattern is detected. Hybridization data is collected as luminescence from fluorescent reporter groups attached to the probe array (ie, incorporated into the target sequence).
  • a probe that perfectly matches the target sequence produces a stronger signal than one that has a portion that does not match the target sequence. Since the sequence and position of each probe on the array is known, the sequence of the target polynucleotide reacted with the probe array can be determined by complementation. In the microarray, the principle of the ASO (allele specific oligo) hybridization method using a synthetic probe corresponding to a mutated gene can also be used.
  • ASO allele specific oligo
  • the invader method is a method of detecting a gene polymorphism by hybridizing an allele-specific oligo and a template. This method can be used to detect mutations in the present invention. Kits for performing the invader method are commercially available, and gene mutations can be easily detected by this method.
  • PCR-RFLP method This is a method of detecting a mutation by treating an amplified PCR product with a restriction enzyme and confirming the presence or absence of cleavage. The PCR-RFLP method can be used for mutation detection in the present invention.
  • the mutation of the present invention can be detected at the DNA level as described above. Since the gene mutation of the present invention mutates the encoded amino acid, the mutation of the present invention can also be detected at the protein level.
  • a protein is collected from a biological sample such as blood, saliva, skin, etc. obtained from a subject based on a conventional method and purified as appropriate.
  • the mutation of the present invention may be detected by using an amino acid mutation site of the present invention or an antibody specific for the mutated amino acid. Alternatively, mutations can be detected using known protein analysis techniques.
  • the present invention provides an oligonucleotide comprising an ERBB4 sequence or a sequence complementary thereto.
  • the oligonucleotide of the present invention has a c. 2780G> A mutation and / or c.
  • the oligonucleotide of the present invention is preferably an oligonucleotide consisting of a base sequence containing the 2780th or 3823th base in the base sequence of the ERBB4 gene or a sequence complementary thereto. Therefore, the oligonucleotide of the present invention can be used for detecting the gene mutation.
  • a mutation can be determined or detected using whether or not the probe is hybridized to the test DNA and the presence or absence thereof.
  • the probe can be used, for example, as a TaqMan® probe.
  • the present invention provides an oligonucleotide that specifically hybridizes to a DNA fragment containing the gene mutation site. That is, the present invention provides an oligonucleotide comprising a sequence containing the above-mentioned gene mutation site or a sequence complementary thereto.
  • the oligonucleotide of the present invention has a gene mutation site, i.e., c. 2780 or c. It contains the normal (wild type) sequence of ERBB4 including 3823.
  • the presence or absence of the gene mutation in the test sample can be detected by comparing the intensity of the signal or spot with the control.
  • the probe is preferably designed so as to include, for example, the 3823th base in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and include a base upstream and a downstream base from the 3823th base. .
  • the probe designed and synthesized in this manner hybridizes to the sequence (normal sequence) where the 3823th base is C, but the 3823th base is mutated to the T sequence (the 3823th base). Hybridization is performed under conditions that do not hybridize (or weakly hybridize). Since such a probe hybridizes with DNA having a sequence that has not undergone mutation, when the band or signal is present (or the signal is strong), the 3823rd base has a mutation from C to T. It can be judged (detected) that there is no.
  • a probe containing a mutated gene sequence can be designed. That is, the present invention provides an oligonucleotide containing the gene mutation that specifically hybridizes to a DNA fragment containing the gene mutation.
  • the oligonucleotide of the present invention comprises an ERBB4 nucleotide sequence containing the above gene mutation (the 2780th base is A or the 3823th base is T) or a complementary sequence thereto. including.
  • the probe containing the normal sequence differs from the probe of this embodiment in that the 3823rd base is C or T.
  • This probe hybridizes to the sequence where the 3823th base is T (sequence in which the 3823th base is mutated), but the 3823rd base hybridizes to the C sequence (wild type sequence). Hybridize under conditions that do not soy. Since such a probe hybridizes with DNA having a mutated sequence, it can be judged (detected) that the 3823rd base has a C to T mutation when there is a band or a signal. it can.
  • a probe can be designed in the same manner as the 3823th mutation, and the mutation can be detected using the probe.
  • Hybridize means to form a DNA pair in the normal PCR or hybridization process. Therefore, hybridization conditions can be set by using a commercially available PCR reagent or hybridization reagent.
  • the present invention provides an oligonucleotide prepared such that the mutated site is contained in an amplified fragment when an ERBB4 gene or a sequence complementary thereto is amplified.
  • an oligonucleotide as a primer for detecting a mutation, for example, among the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, it contains the 2780th or 3823th base, and the 2780th or 3823th base. It can be designed to include a base upstream and a base downstream of the base.
  • the oligonucleotide of the present invention comprises the nucleotide sequence of ERBB4 containing the above gene mutation (the 2780th base is A, or the 3823th base is T) or a sequence complementary thereto. Includes oligonucleotides.
  • the PCR method it is preferable to prepare a primer so that the 3 'end portion of the amplified fragment has a sequence complementary to the base sequence of the mutation site.
  • a primer designed in this way a mismatch between the sample and the primer occurs depending on whether or not the sample as a template has a mutation, and the success or failure of the polymerase extension reaction is determined. Therefore, by performing PCR amplification using such a primer and analyzing the amplified product by agarose gel electrophoresis or the like, the mutation of the template as a sample can be confirmed.
  • the length of the amplified fragment is not particularly limited, and is, for example, several tens to several hundred bases.
  • the length of the base sequence of the oligonucleotide of the present invention is preferably designed to be at least 10 mer, more preferably 10 to 200 mer, still more preferably 15 to 150 mer, and most preferably 20 to 30 mer.
  • the oligonucleotides of the present invention are shown, for example, in Table 4, c. ERBB4_Ex23F1 and ERBB4_Ex23R1 for detecting 2780G> A, and c. Mention may be made of ERBB4_Ex28F1 and ERBB4_Ex28R1 for detecting 3823C> T.
  • the oligonucleotide of the present invention can be used as an ALS detection probe or an ALS detection PCR primer.
  • the detection of ALS is performed in the above c. 2780G> A mutation or c. 3823C> T mutation is used as an index.
  • the method for obtaining a genomic DNA sample from the subject is as described above.
  • the oligonucleotide of the present invention includes a complementary strand (complementary sequence) of the above sequence.
  • the mutation site can be designed to exist at the 5 ′ end or 3 ′ end of the base sequence, but is not limited thereto, and may be designed to exist inside the 5 ′ or 3 ′ end. .
  • oligonucleotides of the present invention designed as described above can be chemically synthesized by known means / methods based on the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 1. Is synthesized using a commercially available chemical synthesizer.
  • the oligonucleotide of the present invention can be automated by adding an appropriate fluorescent label (for example, FAM, VIC, etc.) in advance. Oligonucleotides to which fluorescent labels have been added are also included within the scope of the present invention.
  • Kit provides a kit for detecting ALS.
  • the kit of the present invention contains one or more components necessary for carrying out the present invention.
  • the kit of the present invention includes a nucleotide of the present invention, an enzyme buffer, dNTP, a control reagent (eg, tissue sample, target oligonucleotide for positive and negative control, etc.), a labeling and / or detection reagent, a solid reagent. Examples include phase supports and instructions.
  • the kit of the present invention may be a partial kit containing only a part of necessary components, and in that case, the user can prepare other components.
  • the kit of the present invention can also be provided as a microarray in which the oligonucleotide is immobilized on a support.
  • the microarray is obtained by fixing the oligonucleotide of the present invention on a support, and includes a DNA chip, a microchip, a bead array, and the like.
  • the kit of the present invention preferably contains an oligonucleotide that specifically hybridizes to a DNA fragment containing a mutation of ERBB4.
  • kits of the present invention When determining a genetic mutation using the kit of the present invention, for example, from the blood, saliva, body cavity fluid (such as pleural effusion, ascites fluid, and cerebrospinal fluid), bone marrow fluid, tumor specimen, and a fixed specimen prepared from them at the time of diagnosis of the disease
  • the DNA containing the ERBB4 is isolated, and the isolated DNA is reacted with the oligonucleotide in the kit to determine the genotype.
  • ErbB4 protein is a member of the epidermal growth factor (EGF) subfamily of receptor tyrosine kinases (RTK) that form homodimers or heterodimers with ErbB2 or ErbB3, and neuregulin ( NRG) is activated when bound to the extracellular ligand binding domain of ErbB4.
  • EGF epidermal growth factor
  • RTK receptor tyrosine kinases
  • NRG neuregulin
  • the present invention provides a method for screening a compound or a salt thereof that promotes autophosphorylation of ErbB4 protein, which comprises contacting ErbB4 protein with neuregulin-1 in the presence or absence of a candidate substance. To do.
  • the compound obtained by the screening method of the present invention or a salt thereof can activate the neuregulin-ErbB4 pathway and increase the ErbB function. Therefore, it is expected that the compound obtained by the screening method of the present invention or a salt thereof can be used as a therapeutic agent for ALS.
  • the screening method of the present invention comprises the following steps. (I) contacting ErbB4 protein and neuregulin-1 in the presence of a candidate substance or in the absence of a candidate substance, (Ii) a step of detecting the degree of autophosphorylation of ErbB4 protein, and (iii) a step of selecting a substance that promotes autophosphorylation of ErbB4 protein using the obtained detection result as an index.
  • Candidate substances used in the contacting step (i) include, for example, low-molecular or high-molecular compounds, natural or artificially synthesized various peptides, proteins (including enzymes and antibodies), nucleic acids (polynucleotide ( DNA, RNA), oligonucleotides (siRNA, etc.), peptide nucleic acids (PNA), etc.) can be used, but are not limited thereto.
  • the “salt” is not limited, but includes, for example, hydrohalides (eg, hydrochloride, hydrobromide, hydroiodide, etc.), inorganic acid salts, organic acid salts, amino acids Salt (eg, aspartate, glutamate, etc.), quaternary amine salt, alkali metal salt (eg, sodium salt, potassium salt, etc.), alkaline earth metal salt (eg, magnesium salt, calcium salt, etc.) Etc.
  • hydrohalides eg, hydrochloride, hydrobromide, hydroiodide, etc.
  • inorganic acid salts eg, organic acid salts, amino acids Salt (eg, aspartate, glutamate, etc.), quaternary amine salt, alkali metal salt (eg, sodium salt, potassium salt, etc.), alkaline earth metal salt (eg, magnesium salt, calcium salt, etc.) Etc.
  • hydrohalides eg, hydrochloride, hydrobromide, hydroiodide,
  • Neuregulin-1 used in the contacting step can be produced based on known sequence information and known methods. Alternatively, commercially available neuregulin-1 may be used.
  • the ErbB4 protein used in the contacting step can be produced based on known sequence information (for example, SEQ ID NOs: 1 and 2) and a known method.
  • the ErbB4 protein may be used in a state expressed or solubilized in a cell, or a purified protein may be used.
  • the ErbB4 protein used in the screening method may be a mutant ErbB4 protein containing the mutation of the present invention, or a normal (wild-type) ErbB4 protein containing no mutation.
  • Contact means that ErbB4 protein and neuregulin-1 are allowed to react, exist in the same reaction system, or exist in the same culture system.
  • the ErbB4 protein and neuregulin-1 are preferably contacted in an appropriate buffer containing a candidate substance (eg, HEPES buffer, Tris buffer, PBS, etc.).
  • the candidate substance and ErbB4 protein may be mixed in an appropriate buffer, and then neuregulin-1 may be added.
  • the temperature at the time of contact is not limited as long as the activity of the ErbB4 protein is not lowered or inactivated, and is preferably 0 to 40 ° C., more preferably 20 to 38 ° C., for example.
  • the contact time is not limited, but is preferably 1 to 30 minutes, and more preferably 5 to 20 minutes.
  • the concentration of the candidate substance, ErbB4 protein and neuregulin-1 in the contacting step can be appropriately set by those skilled in the art.
  • the step of detecting the degree of autophosphorylation of ErbB protein in (ii) is not limited, but Western blotting or radio using an anti-phosphorylated ErbB4 antibody (for example, Tyr1284 (Cell Signaling, Danvers, MA, USA)). A method using an isotope can be used.
  • a substance that promotes autophosphorylation of ErbB protein is selected, but the degree of phosphorylation detected in the detection process is stronger than in the absence of a candidate substance Can be evaluated and selected as a candidate substance that promotes autophosphorylation of ErbB4 protein. It can be evaluated that the greater the degree of phosphorylation, the higher the activity of promoting the autophosphorylation of ErbB protein.
  • the screening method of the present invention can be used to easily and extensively screen substances having the activity to promote autophosphorylation of ErbB4 protein, it is possible to strongly promote the development of therapeutic agents for ALS. It is extremely useful.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for treating ALS comprising a compound obtained by the screening method of the present invention or a salt thereof.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is preferably provided in the form of a pharmaceutical composition comprising the compound obtained by the screening method of the present invention or a salt thereof as an active ingredient and further comprising a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is expected to be used as an ALS therapeutic agent.
  • “Pharmaceutically acceptable carrier” is a carrier that is commonly used in formulations, such as excipients, diluents, extenders, disintegrants, stabilizers, preservatives, buffers, emulsifiers, fragrances, colorings. Agents, sweeteners, thickeners, corrigents, solubilizers or other additives.
  • pharmaceutical compositions in the form of injections, solutions, capsules, suspensions, emulsions or syrups can be prepared. These pharmaceutical compositions can be administered orally or parenterally. Other forms for parenteral administration include injections that contain one or more active substances and are prescribed by conventional methods. In the case of an injection, it can be produced by dissolving or suspending it in a pharmaceutically acceptable carrier such as physiological saline or commercially available distilled water for injection.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention depends on the patient's age, sex, weight and symptoms, therapeutic effect, administration method, treatment time, or the type of compound or salt thereof which is an active ingredient contained in the pharmaceutical composition.
  • the compound which is an active ingredient or a salt thereof can be usually administered in the range of 10 ⁇ g to 1000 mg per one adult (body weight 60 kg), but is not limited to this range.
  • WGS was performed on three individuals (I-2, II-3, and II-4, FIG. 1a) in the indicator family.
  • a paired-end DNA library was generated and subjected to massive parallel sequencing using GAII Illumina Genome Analyzer according to the manufacturer's instructions.
  • the resulting short read sequence was aligned against a reference genome (NCBI37 / hg19 assembly) using a Burrows-Wheeler Aligner. Downstream analysis from which potential PCR replicas were removed was processed using SAMtools.
  • the aligned leads were examined using an Integrative Genomics Viewer.
  • the numbers of new non-synonymous variants with amino acid substitutions identified in I-2, II-3, and II-4 were 411, 404, and 382, respectively (Table 2). This did not include any novel non-synonymous variants in known causal genes for FALS. Of these, 57 mutants were identified in both probands and affected siblings but were not identified in the mother and were subjected to further analysis.
  • the genotypes of individuals indicated by dots were identified using a human SNP array 6.0 (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) across the entire genome. Assuming an autosomal dominant form of inheritance with a disease allele frequency of 0.000001, linkage analysis and halotype reconstruction were performed using pipeline software SNP-HiTLLink and Allegro version 2.
  • OR2D3 is an olfactory receptor gene and the mutated amino acid in OR2D3 is not conserved, and this mutation was predicted as benign by PolyPhen-2 analysis.
  • FTCD and TJP2 are the causative genes for autosomal recessive glutamate formiminotransferase deficiency (OMIM229100) and familial hyperbiliary anemia (OMIM607748), respectively, and heterozygous carriers are described as exhibiting ALS It has not been.
  • mutants in ERBB4 c. 2780G> A (p.R927Q) was found to be the most likely pathogenic mutation.
  • PCR 3.1 (Applied Biosystems, USA). confirmed.
  • the conditions for PCR are as follows: 95 ° C. for 2 minutes, followed by 35 cycles of 95 ° C. for 30 seconds, 60 ° C. for 30 seconds, 68 ° C. for 1 minute, and finally an extension step of 68 ° C. for 7 minutes.
  • ERBB4_Ex23F1 and ERBB4_Ex23R1 are c.
  • 2780G> A is a primer for detecting ERBB4_Ex28F1 and ERBB4_Ex28R1 c. It is a primer for detecting 3823C> T.
  • the two mutations of the present invention are highly conserved among the species (FIG. 2b).
  • the mutation of the present invention is expected to be a harmful mutation by PolyPhen-2 analysis.
  • Amino acid residue R927 is present in the tyrosine kinase domain of the ErbB4 protein that is essential for receptor tyrosine kinase activity.
  • R1275 is also located in the C-terminal domain near multiple phosphorylation sites that mediate downstream signaling pathways (FIG. 2c).
  • Example 3 This example was performed to determine how the two mutations of the present invention identified in ALS patients affect ErbB4 function.
  • ErbB4 autophosphorylation in cells expressing ErbB4 of wild type or mutant was measured in the presence of NRG-1.
  • Plasmids were transiently transfected into COS-7 cells using FuGENE6 transfection reagent (Roche, Basel, Switzerland) according to the manufacturer's instructions. Transfected cells were serum deprived overnight and stimulated with 0 or 50 ng / ml NRG-1 (R & D, Minneapolis, MN, USA) for 10 minutes at 37 ° C. After stimulation, the cells were lysed and a sample equivalent to 50 ⁇ g total protein was separated through an 8% SDS-PAGE gel.
  • ErbB4 phosphorylation and total ErbB4 expression were detected by Western blotting using antibodies against phospho-ErbB4 (Tyr1284) (Cell Signaling, Danvers, MA, USA) and HA-tag (Abcam, Cambridge, UK), respectively.
  • the two mutations of the present invention are causative mutations of ALS.
  • a method for detecting an ERBB4 gene mutation for ALS diagnosis could be established. This method is expected to provide early detection, diagnosis and treatment of ALS.
  • the present invention revealed that the reduction of ErbB4 autophosphorylation upon NRG-1 stimulation is involved in the pathogenesis of ALS.
  • ErbB4 is specifically expressed in the cell bodies of large motor neurons in the rat spinal cord.
  • the lack of ErbB4 is embryonic lethal in mice, indicating disruption of motor neuron axon guidance and pathway search during embryogenesis.
  • Heterozygous null mice show weight loss and motor development delay, and brain-specific conditional knockout mice demonstrate reduced hindlimb locomotor activity and grip strength.
  • NRG-1 cysteine-rich domain (CRD) isoform deficient mice (CRD-NRG-1 ⁇ / ⁇ ) die perinatally due to respiratory failure, lack detectable limb movement, and spinal motor neurons A loss of about 60%.
  • the present invention provides a novel aspect of ALS pathogenesis and is expected to open the way to develop breakthrough therapeutic strategies such as using NRG or agonists thereof to upregulate ErbB4 function.
  • Sequence number 1 The base sequence of human ERBB4 gene (Accession number NM_005235.2).
  • SEQ ID NO: 2 Amino acid sequence of human ErbB4 protein (accession number NP_005226).
  • SEQ ID NOs: 3 to 58 Primers.
  • SEQ ID NO: 59 base sequence of human ERBB4 gene having “c. 2780G> A”.
  • SEQ ID NO: 60 amino acid sequence of human ErbB4 protein having “p.R927Q”.
  • SEQ ID NO: 62 amino acid sequence of human ErbB4 protein having “p.R1275W”.

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Abstract

本発明は、ＡＬＳの検出方法の提供を目的とする。本発明は、被験者から採取されたＥＲＢＢ４遺伝子の塩基配列のうち、第２７８０番目または第３８２３番目の塩基の遺伝子変異を解析し、当該解析結果と筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）とを関連づけることを特徴とする、ＡＬＳの検出方法に関する。

Description

筋萎縮性側索硬化症の新規病因遺伝子
　本発明は、ＥＲＢＢ４遺伝子の変異を指標とした筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の検出方法に関する。
　筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、運動ニューロンの変性を特徴とする壊滅的な神経学的障害であり、四肢筋、延髄性筋および呼吸筋の進行性の筋力低下や衰えを伴う。ＡＬＳ症例のうち、５~１０％の症例が家族性ＡＬＳ（ＦＡＬＳ）であり、残りの症例は孤発性ＡＬＳ（ＳＡＬＳ）である。これまでに、２０を超える遺伝子がＡＬＳと関連していることが示されており（非特許文献１）、これらは白人集団における家族性ＡＬＳの７５％および孤発性ＡＬＳの１４％の主要因であることが明らかにされている（非特許文献２）。孤発性ＡＬＳ患者において同定された家族性ＡＬＳの原因遺伝子の突然変異は、浸透度が低減した突然変異または新規突然変異と考えられている。家族性ＡＬＳの原因遺伝子をさらに発見することが、家族性ＡＬＳおよび孤発性ＡＬＳの両方の分子的背景を解明するのに欠かせない。
　一般に、家族性疾患の原因遺伝子の同定は、大家系の連鎖解析による染色体上の疾患遺伝子座の同定、およびその後の原因遺伝子のポジショナルクローニングを通じて達成されている。しかし、多くの家族性ＡＬＳ家系は、予後不良および発症年齢が遅いなどの理由で、大家系で解析をする事が困難な場合が多い。この事実は、連鎖解析を用いて染色体上の候補領域を十分に絞ることを困難にし、家族性ＡＬＳの原因遺伝子を同定するのに甚大な努力を必要とすることを意味する。近年の大量並列シーケンシング技術の開発によって、全ゲノム配列決定（ＷＧＳ）またはエクソーム解析による疾患遺伝子の同定への可能性が広がった。
　しかしながら、これまでにＡＬＳの全ての原因遺伝子が明らかとなったわけではなく、原因遺伝子の明らかでないＡＬＳ患者は依然として存在するため、そのような患者の早期診断、早期治療の開始には困難が伴う。したがって、ＡＬＳの診断および治療の観点から、さらなる原因遺伝子の解明の必要性が存在する。
Ａｌ−Ｃｈａｌａｂｉ，Ａ．，Ｊｏｎｅｓ，Ａ．，Ｔｒｏａｋｅｓ，Ｃ．，Ｋｉｎｇ，Ａ．，Ａｌ−Ｓａｒｒａｊ，Ｓ．，ａｎｄ　ｖａｎ　ｄｅｎ　Ｂｅｒｇ，Ｌ．Ｈ．（２０１２）．Ｔｈｅ　ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ａｎｄ　ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ　ｌａｔｅｒａｌ　ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ａｃｔａ　Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ　１２４，３３９−３５２． Ａｎｄｅｒｓｅｎ，Ｐ．Ｍ．ａｎｄ　Ａｌ−Ｃｈａｌａｂｉ，Ａ．（２０１１）．Ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ｏｆ　ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ　ｌａｔｅｒａｌ　ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：　ｗｈａｔ　ｄｏ　ｗｅ　ｒｅａｌｌｙ　ｋｎｏｗ？　Ｎａｔ　Ｒｅｖ　Ｎｅｕｒｏｌ　７，６０３−６１５．
　本発明は、ＥＲＢＢ４遺伝子の変異を指標とした筋萎縮性側索硬化症の検出方法を提供することを目的とする。
　本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、ＡＬＳ家系およびＡＬＳ患者から得られたＥＲＢＢ４遺伝子の塩基配列のうち、第２７８０番目の塩基（第９２７番目のアミノ酸）または第３８２３番目の塩基（第１２７５番目のアミノ酸）の変異がＡＬＳと関連することを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］　被験者から採取されたＥＲＢＢ４遺伝子の塩基配列のうち、第２７８０番目の塩基のＧからＡへの遺伝子変異または第３８２３番目の塩基のＣからＴへの遺伝子変異を解析し、前記いずれかまたは両方の遺伝子変異があるとき、当該被験者が筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）に罹患している、またはＡＬＳに罹患するリスクがあると判定する、ＡＬＳの検出方法。
［２］　ＡＬＳが、家族性ＡＬＳまたは孤発性ＡＬＳである、［１］に記載の方法。
［３］　ＥＲＢＢ４遺伝子の塩基配列において、第２７８０番目の塩基のＧからＡへの遺伝子変異および第３８２３番目の塩基のＣからＴへの遺伝子変異のいずれかまたは両方を含む、ＥＲＢＢ４遺伝子。
［４］　ＥＲＢＢ４遺伝子の塩基配列のうち、第２７８０番目または第３８２３番目の塩基を含む塩基配列またはこれに相補的な配列からなるオリゴヌクレオチド。
［５］　第２７８０番目の塩基がＡであるか、または第３８２３番目の塩基がＴである、［４］に記載のオリゴヌクレオチド。
［６］　［４］または［５］に記載のオリゴヌクレオチドを含む、筋萎縮性側索硬化症の検出用キット。
［７］　候補物質の存在下または非存在下において、ＥｒｂＢ４タンパク質とニューレグリン−１とを接触させることを含む、ＥｒｂＢ４タンパク質の自己リン酸化を促進させる化合物またはその塩のスクリーニング方法。
［８］　［７］で得られる化合物またはその塩を含む、筋萎縮性側索硬化症の治療剤。
　本発明により、ＡＬＳの検出方法および検出キットが提供される。本発明の方法を用いることにより、ＡＬＳに特徴的な新規遺伝子変異の存在が明らかとなり、ＡＬＳ患者またはＡＬＳのリスクのある患者を簡便かつ確実に検出又は診断することができる。したがって、本発明の方法は、ＡＬＳの検出、病態理解、診断及び分子標的療法の開発に有用である。
、指標となる家族（ｉｎｄｅｘ　ｆａｍｉｌｙ）（ｐｅｄ３１６６）の家系チャートおよび連鎖解析を示す図である。黒塗り記号は、発症した個人を示す。矢印は、発端者（ｐｒｏｂａｎｄ）を示す。機密保持の目的のために、すべての発症していない兄弟姉妹は、菱形で示されている。ドットまたはアステリスクは、それぞれ、連鎖研究またはＷＧＳに含められた個人を示す。存在時または死亡時の年齢は、各個人の下に示されており、発病時の年齢は、括弧内に示されている。 指標となる家族（ｐｅｄ３１６６）のゲノム全域にわたるパラメトリック連鎖解析を示す図である。パラメトリック連鎖解析によって求めたマルチポイントＬＯＤスコアが、異なる色を用いてすべての常染色体について合成グラフ中に示されている。上のグラフは、浸透度＝１．０でのＬＯＤスコアを示し、下のグラフは、浸透度＝０．８でのＬＯＤスコアを示す。染色体２における矢じりは、ＥＲＢＢ４の遺伝子座を示す。 追加のＡＬＳ患者の突然変異解析における、ＥＲＢＢ４突然変異を有する追加の家系を示す図である。突然変異データの電気泳動図が各メンバーの横に示されている。 ＥｒｂＢ４タンパク質のアミノ酸保存を示す図である。アミノ酸Ｒ９２７およびＲ１２７５は、種の中で高度に保存されている。 本発明のＥｒｂＢ４タンパク質における突然変異の位置を示す図である。コーディングエクソンおよびタンパク質構造が示されており、ここで突然変異は、矢印によって示されている。突然変異ｐ．Ｒ９２７Ｑは、チロシンキナーゼドメイン内に存在し、これは、ＥｒｂＢ４の重要な機能を媒介する。突然変異ｐ．Ｒ１２７５Ｗは、複数のリン酸化部位の近傍におけるＣ末端ドメイン内に存在し、これは、下流のシグナル伝達経路を媒介する。 ニューレグリン−１刺激における野生型および突然変異体ＥｒｂＢ４の機能分析を示す図である。空ベクター対照、あるいは野生型（ｗｔ）または突然変異体ＨＡ−タグ付きＥｒｂＢ４（ｐ．Ｒ１１４Ｑ、ｐ．Ａ１５８Ｅ、ｐ．Ｈ３７４Ｑ、ｐ．Ｒ９２７Ｑ、もしくはｐ．Ｒ１２７５Ｗ）をコードするプラスミドをトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞を、ＮＲＧ−１を用いて、あるいは用いずに刺激し、ＥｒｂＢ４自己リン酸化活性を、それぞれ、ホスホ−ＥｒｂＢ４（Ｔｙｒ１２８４）（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ、ＵＳＡ）およびＨＡ−タグ（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）に対する抗体を用いて、ウエスタンブロット解析によって分析した。ローディングは、抗アクチン抗体（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いたウエスタンブロッティングによってコントロールした。ＥｒｂＢ４突然変異体ｐ．Ｒ１１４Ｑ、ｐ．Ａ１５８Ｅ、およびｐ．Ｈ３７４Ｑを追加の対照として分析し、これらは良性の多型とみなされた。
　以下に本発明の実施の形態について説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態にのみ限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、さまざまな形態で実施をすることができる。
　なお、本明細書において引用した文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。
１．概要
　以下、本発明を詳細に説明する。本発明は、被験者から採取された、ＥｒｂＢ４タンパク質をコードする遺伝子（以下、ＥＲＢＢ４遺伝子またはＥＲＢＢ４ともいう）の塩基配列において、第２７８０番目または第３８２３番目の塩基の遺伝子変異を解析し、当該解析結果と被験者のＡＬＳ発症とを関連づけることを特徴とする、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の検出方法に関する。
　「検出」とは、被験者のＥＲＢＢ４の変異とＡＬＳとを関連づけて、ＥＲＢＢ４変異を有する場合は、当該被験者はＡＬＳの患者である、ＡＬＳに罹患している、又はＡＬＳ発症のリスクがあるものと、推定、決定、判定又は診断することを意味する。また、検出には、ＡＬＳの発症または発症の可能性を、医療従事者以外が予備的に決定する、決定を補助する、あるいは診断を支援することも含まれる。
　「筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）」は、運動ニューロンの変性を特徴とする壊滅的な神経学的障害であり、一般的に発病から３~５年以内に死に至るといわれている。家族性ＡＬＳ（ＦＡＬＳ）は、ＡＬＳ症例の５~１０％を占め、これらの原因遺伝子の同定は、ＡＬＳの分子病態を解明するのに欠かせない。
　本発明者らは、公知の原因遺伝子の突然変異を除外した、遅発性常染色体優性ＡＬＳを有する日本人家系を同定した。同家系に対して行った、不完全浸透度を伴った遺伝の常染色体優性形式を仮定した全ゲノム配列決定およびパラメトリック連鎖解析により、ＥＲＢＢ４における突然変異ｃ．２７８０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｒ９２７Ｑ）を見出した。
　「ｃ．２７８０Ｇ＞Ａ」は、ＥＲＢＢ４のコードＤＮＡ配列において、第２７８０番目の塩基がＧからＡに変異していることを意味する。この変異は、対応するＥｒｂＢ４タンパク質のアミノ酸配列において、第９２７番目のアミノ酸がＲ（アルギニン）からＱ（グルタミン）に変異させる。このｃ．２７８０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｒ９２７Ｑ）突然変異は、新規の突然変異であり、ある白人家族性ＡＬＳ患者においても同突然変異を有することを見出した。
　さらに、本発明者らは、大規模な突然変異解析により、日本人の孤発性ＡＬＳ患者における突然変異ｃ．３８２３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｒ１２７５Ｗ）を見出した。このｃ．３８２３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｒ１２７５Ｗ）突然変異は、新規の突然変異である。
　「ｃ．３８２３Ｃ＞Ｔ」は、ＥＲＢＢ４のコードＤＮＡ配列において、第３８２３番目の塩基がＣからＴに変異していることを意味する。この変異は、対応するＥｒｂＢ４タンパク質のアミノ酸配列において、第１２７５番目のアミノ酸がＲ（アルギニン）からＷ（トリプトファン）に変異させる。
　したがって、本発明は、ＥＲＢＢ４の第２７８０番目の塩基置換（ｃ．２７８０Ｇ＞Ａ（アミノ酸配列ではＲ９２７Ｑ））、または第３８２３番目の塩基置換（ｃ．３８２３Ｃ＞Ｔ（アミノ酸配列ではＲ１２７５Ｗ））を指標として、対象のＡＬＳ発症を評価する方法に関する。
　本発明の突然変異は、種の中で高度に保存されたアミノ酸に生じた変異であって、有害であることが予想される。具体的にはこれらの突然変異は、ＥｒｂＢ４タンパク質のチロシンキナーゼドメイン（ｐ．Ｒ９２７Ｑ）またはＣ末端ドメイン（ｐ．Ｒ１２７５Ｗ）内に位置し、いずれのドメインも受容体チロシンキナーゼとしてのＥｒｂＢ４タンパク質の必須機能を媒介する。
　本発明者らは、機能分析により、本発明の突然変異は、ニューレグリン−１（ＮＲＧ−１）刺激における、ＥｒｂＢ４自己リン酸化の低減をもたらすことを明らかにした。
　突然変異を有する患者の臨床症状は、明白な認知機能障害を伴わない上位運動ニューロンおよび下位運動ニューロンの両方の関与、ならびに比較的遅い進行により特徴付けられる。本発明によって、ニューレグリン−ＥｒｂＢ４経路の破壊がＡＬＳの病因に関与していることが示され、ＮＲＧまたはこれらのアゴニストを使用してＥｒｂＢ４機能を上方制御することなどの画期的なＡＬＳ治療戦略への道を開く可能性がある。
　したがって、本発明は、ＥｒｂＢ４タンパク質、例えばＥｒｂＢ４タンパク質を発現させた細胞を、候補物質の存在下または非存在下においてニューレグリン−１で刺激することを含む、ＥｒｂＢ４タンパク質の自己リン酸化を促進させる化合物またはその塩のスクリーニング方法に関する。本発明のスクリーニング方法で得られる化合物またはその塩は、ＡＬＳの治療薬として使用し得ることが期待される。
２．ＥＲＢＢ４
　本発明において、検出のために使用される遺伝子およびタンパク質は、ＥＲＢＢ４およびＥｒｂＢ４タンパク質である。ＥＲＢＢ４は、細胞膜貫通型のチロシンキナーゼ受容体であるＥｒｂＢ４タンパク質をコードする遺伝子である。例えば、ヒトＥＲＢＢ４は配列番号１に示されるものであり、ヒトＥｒｂＢ４タンパク質は配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる。ヒトＥＲＢＢ４およびＥｒｂＢ４タンパク質の配列情報は、例えばアクセッション番号ＮＭ＿００５２３５．２、ＮＰ＿００５２２６により得ることができる。
３．遺伝子変異マーカー
　本発明において解析の対象となるＥＲＢＢ４変異は、ＥＲＢＢ４塩基配列の第２７８０番目の塩基（配列番号１に示す塩基配列の第２７８０番目の塩基）のＧからＡへの変異であり、「ｃ．２７８０Ｇ＞Ａ」という。ｃ．２７８０Ｇ＞Ａは、ＥｒｂＢ４タンパク質のアミノ酸配列の第９２７位（配列番号２に示すアミノ酸配列の第９２７番目のアミノ酸残基）でＲ（アルギニン）からＱ（グルタミン）への置換（ｐ．Ｒ９２７Ｑ）が起こる。また、本発明の別の態様において解析の対象となるＥＲＢＢ４変異は、ＥＲＢＢ４の塩基配列の第３８２３番目の塩基（配列番号１に示す塩基配列の第３８２３番目の塩基）のＣからＴへの変異であり、「ｃ．３８２３Ｃ＞Ｔ」という。ｃ．３８２３Ｃ＞Ｔは、ＥｒｂＢ４タンパク質のアミノ酸配列の第１２７５位（配列番号２に示すアミノ酸配列の第１２７５番目のアミノ酸残基）でＲ（アルギニン）からＷ（トリプトファン）への置換（ｐ．Ｒ１２７５Ｗ）が起こる。
　「ＥＲＢＢ４（遺伝子）変異を有する」または「ＥＲＢＢ４（遺伝子）変異がある」には、遺伝子解析により、被験者から採取されたＥＲＢＢ４遺伝子において「ｃ．２７８０Ｇ＞Ａ」および「ｃ．３８２３Ｃ＞Ｔ」のいずれかまたは両方が確認されることが含まれる。
　「ｃ．２７８０Ｇ＞Ａ」を有するＥＲＢＢ４遺伝子および「ｃ．３８２３Ｃ＞Ｔ」を有するＥＲＢＢ４遺伝子は、本発明に含まれる。また、「ｐ．Ｒ９２７Ｑ」を有するＥｒｂＢ４タンパク質および「ｐ．Ｒ１２７５Ｗ」を有するＥｒｂＢ４タンパク質も、本発明に含まれる。「ｃ．２７８０Ｇ＞Ａ」を有するＥＲＢＢ４遺伝子の塩基配列の例を配列番号５９、「ｃ．３８２３Ｃ＞Ｔ」を有するＥＲＢＢ４遺伝子の塩基配列の例を配列番号６１、「ｐ．Ｒ９２７Ｑ」を有するＥｒｂＢ４タンパク質のアミノ酸配列の例を配列番号６０、「ｐ．Ｒ１２７５Ｗ」を有するＥｒｂＢ４タンパク質のアミノ酸配列の例を配列番号６２に示す。
　表１には、配列番号１で示されるＥＲＢＢ４の塩基配列におけるｃ．２７８０Ｇ＞Ａおよびｃ．３８２３Ｃ＞Ｔ変異を含むコーディング領域の塩基配列を表示する。配列番号１で示される塩基配列においてｃ．２７８０Ｇ＞Ａ変異した塩基配列、および配列番号１で示される塩基配列においてｃ．３８２３Ｃ＞Ｔ変異した塩基配列も、本発明の範囲に含まれる。表１において、第２７８０番目および第３８２３番目の塩基は下線で表示し、「ｇ／ａ」は「Ｇ」から「Ａ」への変異を示し、「ｃ／ｔ」は「Ｃ」から「Ｔ」への変異を示す。本明細書では、本発明を配列番号１を例に挙げて説明するが、配列番号１以外の塩基配列で示されるＥＲＢＢ４についても、ｃ．２７８０およびｃ．３８２３に対応する箇所の突然変異を含むＥＲＢＢ４は本発明の範囲である。配列番号１以外の塩基配列で示されるＥＲＢＢ４は、例えば、本発明の突然変異以外の箇所の遺伝子の欠失、置換、付加、挿入、あるいは種差などによって配列番号１とは同一ではない塩基配列を有するＥＲＢＢ４遺伝子などが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
　本発明において、検出の対象となるＡＬＳは、家族性ＡＬＳ（ＦＡＬＳ）または孤発性ＡＬＳ（ＳＡＬＳ）である。
　ＥＲＢＢ４の上記変異は、被験者のＡＬＳを評価するためのマーカーとして利用することができる。すなわち、この変異を解析することによって、ＡＬＳであるか否かを評価することができる。
　本発明において見出されたｃ．２７８０Ｇ＞Ａ変異およびｃ．３８２３Ｃ＞Ｔ変異は、ＡＬＳの原因因子である。本発明においては、当該変異とＡＬＳとを関連づけることができる。すなわち、解析したＥＲＢＢ４の第２７８０番目の塩基がＧからＡに変異しているときは、被験者はＡＬＳを発症している、あるいはＡＬＳ発症のリスクがあると判定することができる。ｃ．２７８０Ｇ＞Ａ変異を有する場合は、例えば約７５％以上の確率でＡＬＳを発症する。同様に、解析したＥＲＢＢ４の第３８２３番目の塩基がＣからＴに変異しているときは、被験者はＡＬＳを発症している、あるいはＡＬＳ発症のリスクがあると判定することができる。
４．変異検出法
　上記変異を検出するための被験者からのゲノムサンプルは、血液、唾液、皮膚、リンパ節、骨髄等の生体試料から取得することができるが、ゲノムサンプルを採取できるものであれば、これに限定されるものではない。ゲノムＤＮＡの抽出及び精製法は周知である。例えば、ヒトから採取した血液、唾液等の検体から、ＱＩＡｍｐ　ＤＮＡ　ｍｉｎｉ　ｋｉｔ、ＱＩＡｍｇ　ＤＮＡ　ＦＦＰＥ　Ｔｉｓｓｕｅ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）、Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）シリーズのキット（タカラバイオ）、などのキットを用いて抽出することができる。本発明の場合、変異がＥｒｂＢ４タンパク質のコード領域（オープンリーディングフレーム）に存在するため、ゲノムＤＮＡの代わりにｍＲＮＡやｔｏｔａｌ　ＲＮＡを取得し、本発明のＡＬＳ検出方法に使用することもできる。
　当業者であれば、被験者由来の遺伝子における本発明の遺伝子変異を、公知の方法および技術常識に基づいて適宜検出することができる。以下、上記の被験サンプルの遺伝子変異を検出する方法の一例を示す。
（１）ＰＣＲ法を用いた検出
　突然変異を検出する方法としては、公知の対立遺伝子特異的増幅方法（ＡＳＡ、ＰＡＳＡ、ＡＳＰ、ＡＲＭＳなど）を適用することができる。これらの方法は、基本的には、プライマーの３’末端にミスマッチが存在すると、ポリメラーゼによる伸長反応が阻害される。
　ＰＣＲにより被験サンプルを増幅するには、Ｆｉｄｅｌｉｔｙの高いＤＮＡポリメラーゼ、例えば、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ｎｅｏポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いることが好ましいが、これに限定されるものではない。用いるプライマーは、被験サンプル中の対象変異部分が増幅されるように、プライマーの任意の位置に遺伝子変異が含まれるように設計し合成する。増幅反応終了後は、増幅産物の検出を行い、変異の有無を判定する。
　例えばＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法は、蛍光標識したアレル特異的オリゴとＴａｑＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲ反応とを利用した方法である。ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法で用いるアレル特異的オリゴ（ＴａｑＭａｎプローブという）は、前記遺伝子変異情報に基づいて設計することができる。あるいは、アレル特異的プライマーを用いて増幅する際に、ＳｙｂｅｒＧｒｅｅｎ　ＰＣＲ法を用いて増幅産物に蛍光標識した塩基を取り込むことで、変異遺伝子の定量を行うことができる。
（２）塩基配列決定法による検出
　本発明においては、ダイレクトシークエンシングにより変異を検出することもできる。塩基配列決定に用いるシークエンサーには、市販のＨｉＳｅｑシステム、ＭｉＳｅｑシステム（イルミナ）、ＡＢＩシリーズ（ライフテクノロジーズ）、ＰＧＭシステム（ライフテクノロジーズ）等を用いる。
（３）ＤＮＡマイクロアレイによる検出
　ＤＮＡマイクロアレイは、支持体上にヌクレオチドプローブが固定されたものであり、ＤＮＡチップ、マイクロチップ、ビーズアレイなどを含む。まず、被験サンプルのポリヌクレオチドを単離し、ＰＣＲにより増幅し、蛍光レポーター基により標識する。続いて、標識化ＤＮＡ／ｍＲＮＡ、ｔｏｔａｌ　ＲＮＡをアレイと共にインキュベートする。次にこのアレイをスキャナーに差し込み、ハイブリダイゼーションパターンを検出する。ハイブリダイゼーションのデータは、プローブアレイに結合した（すなわち標的配列に取り込まれた）蛍光レポーター基からの発光として採集する。標的配列と完全に一致したプローブは、標的配列と一致していない部分を有するものよりも強いシグナルを生じる。アレイ上の各プローブの配列及び位置は分かっているため、相補性によって、プローブアレイと反応させた標的ポリヌクレオチドの配列を決定することができる。マイクロアレイにおいては、変異遺伝子に対応した合成プローブを用いるＡＳＯ（アレル特異的オリゴ）ハイブリダイゼーション法の原理を使用することもできる。
（４）インベーダー法による遺伝子変異の検出
　インベーダー法は、アレル特異的オリゴと鋳型とをハイブリダイゼーションすることにより遺伝子多型を検出する方法である。この方法を本発明における変異の検出に使用することができる。インベーダー法を行うためのキットは市販されており、この方法により容易に遺伝子変異を検出することが可能である。
（５）ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法
　増幅したＰＣＲ産物を制限酵素で処理し、切断の有無を確認することにより、変異を検出する方法である。ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法を本発明における変異の検出に使用することができる。
（６）本発明の変異は、上記のとおりＤＮＡレベルで検出することが可能である。本発明の遺伝子変異は、コードされるアミノ酸を変異させるため、本発明の変異はタンパク質レベルで検出することもできる。被験者から取得した血液、唾液、皮膚などの生体試料から常法に基づきタンパク質を採取し、適宜精製する。本発明のアミノ酸変異箇所または変異アミノ酸に特異的な抗体を用いて、本発明の変異を検出してもよい。あるいは、公知のタンパク質分析技術を用いて、変異を検出することができる。
５．オリゴヌクレオチド
　本発明は、ＥＲＢＢ４配列またはこれに相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドを提供する。本発明のオリゴヌクレオチドは、上記に例示される変異検出方法において、ＥＲＢＢ４配列におけるｃ．２７８０Ｇ＞Ａ変異および／またはｃ．３８２３Ｃ＞Ｔ変異を検出できるように設計および製造されたオリゴヌクレオチドである。本発明のオリゴヌクレオチドは、好ましくは、ＥＲＢＢ４遺伝子の塩基配列のうち、第２７８０番目または第３８２３番目の塩基を含む塩基配列またはこれに相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドである。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、上記遺伝子変異を検出するために使用することができる。
　例えば、作製されたオリゴヌクレオチドをプローブとして用いると、当該プローブが被験ＤＮＡにハイブリダイズしたかどうか、その有無を利用して変異を決定又は検出することができる。プローブは、例えばＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブとして使用することができる。
　本発明の一態様において、本発明は上記遺伝子変異部位を含むＤＮＡ断片に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを提供する。すなわち、本発明は上記遺伝子変異の部位を含む配列またはこれに相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドを提供する。本発明のオリゴヌクレオチドは、遺伝子変異の部位、すなわち、ｃ．２７８０またはｃ．３８２３を含むＥＲＢＢ４の正常（野生型）配列を含む。本発明のオリゴヌクレオチドを用いてＥＲＢＢ４配列の遺伝子変異を検出する際に、シグナルやスポットの強さを対照と比較することにより、被験サンプルにおける遺伝子変異の有無を検出することができる。
　プローブは、配列番号１に示す塩基配列のうち、例えば、第３８２３番目の塩基を含み、かつ、第３８２３番目の塩基よりも上流側の塩基及び下流側の塩基を含むように設計することが好ましい。このようにして設計及び合成したプローブを、第３８２３番目の塩基がＣの配列（正常配列）にはハイブリダイズするが、第３８２３番目の塩基がＴの配列（第３８２３番目の塩基に変異を生じている配列）にはハイブリダイズしない（もしくはハイブリダイズ形成の弱い）条件でハイブリダイゼーションを行う。このようなプローブは変異を生じていない配列を有するＤＮＡとハイブリダイズするため、バンドまたはシグナルの有る（もしくはシグナルの強い）場合に、第３８２３番目の塩基がＣからＴへの変異を有していないことを判断（検出）することができる。
　また、本発明の別のプローブの態様として、変異遺伝子配列を含むプローブを設計することもできる。すなわち、本発明は上記遺伝子変異を含むＤＮＡ断片に特異的にハイブリダイズする、当該遺伝子変異を含むオリゴヌクレオチドを提供する。本発明のオリゴヌクレオチドは、上記遺伝子変異を含む（第２７８０番目の塩基がＡであるか、または第３８２３番目の塩基がＴである）ＥＲＢＢ４の塩基配列またはこれに相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドを含む。
　正常配列を含む上記プローブと本態様のプローブとは、第３８２３番目の塩基がＣであるかＴであるかの点で異なる。本プローブを第３８２３番目の塩基がＴの配列（第３８２３番目の塩基に変異を生じている配列）にはハイブリダイズするが、第３８２３番目の塩基がＣの配列（野生型配列）にはハイブリダイズしない条件でハイブリダイゼーションを行う。このようなプローブは変異を生じている配列を有するＤＮＡとハイブリダイズするため、バンドまたはシグナルの有る場合に第３８２３番目の塩基がＣからＴへの変異を有することを判断（検出）することができる。
　第２７８０番目の変異についても、第３８２３番目の変異と同様にプローブを設計し、またプローブを用いて変異を検出することができる。
　「ハイブリダイズする」とは、通常のＰＣＲやハイブリダイゼーションの過程においてＤＮＡ対を形成することを意味する。従って、ハイブリダイズする条件は、市販のＰＣＲ試薬やハイブリダイゼーション用試薬を用いることで設定することが可能である。
　また、本発明の別の態様において、本発明は、ＥＲＢＢ４遺伝子またはこれに相補的な配列を増幅したときに増幅断片中に前記変異部位が含まれるように作製されたオリゴヌクレオチドを提供する。変異を検出するためのプライマーとしてオリゴヌクレオチドを設計するときも、例えば、配列番号１に示す塩基配列のうち、第２７８０番目または第３８２３番目の塩基を含み、かつ、第２７８０番目または第３８２３番目の塩基よりも上流側の塩基及び下流側の塩基を含むように設計することができる。例えば、本発明のオリゴヌクレオチドは、上記遺伝子変異を含む（第２７８０番目の塩基がＡであるか、または第３８２３番目の塩基がＴである）ＥＲＢＢ４の塩基配列またはこれに相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドを含む。
　ＰＣＲ法の場合、増幅断片の３’末端部分が変異部位の塩基配列に相補的な配列を有するようにプライマーを作製することが好ましい。このように設計されたプライマーを用いると、鋳型となるサンプルが変異を有するか否かに応じて、サンプルとプライマーとのミスマッチが生じ、ポリメラーゼ伸長反応の成否が決まる。したがって、このようなプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、増幅産物をアガロースゲル電気泳動などによって分析することで、サンプルである鋳型の変異を確認することができる。増幅断片の長さは特に限定されるわけではないが、例えば、数１０塩基~数１００塩基である。
　本発明のオリゴヌクレオチドの塩基配列の長さは、少なくとも１０ｍｅｒとなるように設計することが好ましく、より好ましくは１０~２００ｍｅｒ、さらに好ましくは１５~１５０ｍｅｒ、最も好ましくは２０~３０ｍｅｒである。本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば表４に示されており、ｃ．２７８０Ｇ＞Ａを検出するためのＥＲＢＢ４＿Ｅｘ２３Ｆ１およびＥＲＢＢ４＿Ｅｘ２３Ｒ１、並びにｃ．３８２３Ｃ＞Ｔを検出するためのＥＲＢＢ４＿Ｅｘ２８Ｆ１およびＥＲＢＢ４＿Ｅｘ２８Ｒ１を挙げることができる。
　本発明のオリゴヌクレオチドは、ＡＬＳ検出用プローブ又はＡＬＳ検出用ＰＣＲプライマーとして使用することができる。ＡＬＳの検出は、前記ｃ．２７８０Ｇ＞Ａ変異またはｃ．３８２３Ｃ＞Ｔ変異を指標として行われる。被験対象者からのゲノムＤＮＡサンプルの取得法は前記のとおりである。
　本発明のオリゴヌクレオチドは、上記配列の相補鎖（相補配列）も含まれる。変異部位が塩基配列の５’端又は３’端に存在するように設計することもできるが、これに限定されず、５’又は３’端よりも内側に存在するように設計してもよい。
　以上のように設計された本発明のオリゴヌクレオチド（例えばオリゴヌクレオチドプライマー及びオリゴヌクレオチドプローブ）は、配列番号１記載の塩基配列に基づいて、公知の手段・方法により化学合成することができるが、一般には、市販の化学合成装置を使用して合成される。なお、本発明のオリゴヌクレオチドには、予め適当な蛍光標識（例えばＦＡＭ、ＶＩＣ等）を付加して作業の自動化を図ることも可能である。蛍光標識が付加されたオリゴヌクレオチドも、本発明の範囲に含まれる。
６．キット
　本発明は、ＡＬＳを検出するためのキットを提供する。本発明のキットは、本発明を実施するために必要な１種以上の成分を含む。例えば、本発明のキットには、本発明のヌクレオチド、酵素緩衝液、ｄＮＴＰ、コントロール用試薬（例えば、組織サンプル、ポジティブ及びネガティブコントロール用標的オリゴヌクレオチドなど）、標識用及び／又は検出用試薬、固相支持体、説明書などが挙げられる。また本発明のキットは、必要な成分のうちの一部のみを含む部分的キットであってもよく、その場合には、ユーザーが他の成分を用意することができる。
　本発明のキットは、上記オリゴヌクレオチドを支持体に固定したマイクロアレイとして提供することもできる。マイクロアレイは、支持体上に本発明のオリゴヌクレオチドが固定されたものであり、ＤＮＡチップ、マイクロチップ、ビーズアレイなどを含む。
　本発明のキットは、ＥＲＢＢ４の変異を含むＤＮＡ断片に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含むことが好ましい。
　本発明のキットにより遺伝子変異を判定する場合、例えば、疾患の診断時に血液、唾液、体腔液（胸水、腹水、髄液など）、骨髄液、腫瘍検体、およびそれらから作製された固定標本などから上記ＥＲＢＢ４を含むＤＮＡを単離し、この単離したＤＮＡをキット中のオリゴヌクレオチドと反応させて遺伝子型を判定する。
　判定した遺伝子型及び遺伝子変異からＡＬＳであるか否か、又はＡＬＳのリスクを判定する。
７．スクリーニング方法およびＡＬＳ治療剤
　ＥｒｂＢ４タンパク質は、ＥｒｂＢ２またはＥｒｂＢ３とホモ二量体またはヘテロ二量体を形成する受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の上皮成長因子（ＥＧＦ）サブファミリーのメンバーであり、ニューレグリン（ＮＲＧ）がＥｒｂＢ４の細胞外リガンド結合ドメインに結合すると活性化される。ＥｒｂＢ４の活性化は、ＮＲＧが結合した後のチロシンキナーゼ活性の増大によって媒介され、Ｃ末端の自己リン酸化をもたらす。
　本発明者らの機能分析により、ｐ．Ｒ９２７Ｑまたはｐ．Ｒ１２７５Ｗ変異を有する変異ＥｒｂＢ４タンパク質を発現する細胞は、野生型ＥｒｂＢ４タンパク質を発現する細胞よりも、ニューレグリン−１を介するＥｒｂＢタンパク質の活性化機能が低いことが明らかとなった。具体的には、本発明の突然変異は、ニューレグリン−１（ＮＲＧ−１）刺激における、ＥｒｂＢ４タンパク質自己リン酸化の低減に至ることが見出された。すなわち、ニューレグリン−ＥｒｂＢ４経路の破壊がＡＬＳの病因に関与していることが示された。
　したがって、本発明は、候補物質の存在下または非存在下において、ＥｒｂＢ４タンパク質とニューレグリン−１とを接触させることを含む、ＥｒｂＢ４タンパク質の自己リン酸化を促進させる化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法で得られる化合物またはその塩は、ニューレグリン−ＥｒｂＢ４経路を賦活化し、ＥｒｂＢ機能を上昇制御し得る。よって、本発明のスクリーニング方法で得られる化合物またはその塩は、ＡＬＳの治療剤として使用し得ることが期待される。
　本発明のスクリーニング方法は、具体的には以下の工程を含むことを特徴とするものである。
（ｉ）候補物質の存在下または候補物質の非存在下で、ＥｒｂＢ４タンパク質とニューレグリン−１とを接触させる工程、
（ｉｉ）ＥｒｂＢ４タンパク質の自己リン酸化の程度を検出する工程、および
（ｉｉｉ）得られた検出結果を指標としてＥｒｂＢ４タンパク質の自己リン酸化を促進させる物質を選択する工程。
　上記（ｉ）の接触工程において使用される候補物質としては、例えば、低分子もしくは高分子化合物、天然もしくは人為的に合成された各種ペプチド、タンパク質（酵素や抗体を含む）、核酸（ポリヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、オリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ等）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）など）等を用いることができるが、これらに限定されるわけではない。
　本発明において「塩」は、限定はされないが、例えば、ハロゲン化水素酸塩（例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、及びヨウ化水素酸塩など）、無機酸塩、有機酸塩、アミノ酸塩（例えば、アスパラギン酸塩、及びグルタミン酸塩など）、四級アミン塩、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウム塩、及びカリウム塩など）、アルカリ土類金属塩（例えば、マグネシウム塩、及びカルシウム塩など）などが挙げられる。
　接触工程において使用されるニューレグリン−１は、公知の配列情報および公知の方法に基づき製造することができる。あるいは市販のニューレグリン−１を使用してもよい。
　接触工程において使用されるＥｒｂＢ４タンパク質は、公知の配列情報（例えば配列番号１および２）および公知の方法に基づき製造することができる。ＥｒｂＢ４タンパク質は、細胞に発現させた状態または可溶化した状態で使用してもよく、精製したタンパク質を使用してもよい。スクリーニング方法において使用されるＥｒｂＢ４タンパク質は、本発明の変異を含む変異型ＥｒｂＢ４タンパク質でもよいし、変異を含まない正常型（野生型）ＥｒｂＢ４タンパク質でもよい。
　「接触」とは、ＥｒｂＢ４タンパク質およびニューレグリン−１を反応可能な状態におくこと、同一の反応系に存在させること、または同一の培養系に存在させることなどを意味する。接触工程においてＥｒｂＢ４タンパク質とニューレグリン−１とを接触させる際は、候補物質を含む適当なバッファー（例えばＨＥＰＥＳバッファー、Ｔｒｉｓバッファー、ＰＢＳ等）中で行うことが好ましい。あるいは、適当なバッファー中で候補物質とＥｒｂＢ４タンパク質とを混合させておき、その後ニューレグリン−１を添加するようにしてもよい。接触時の温度は、ＥｒｂＢ４タンパク質の活性が低下又は失活しない温度であればよく、限定はされないが、例えば、０~４０℃であることが好ましく、より好ましくは２０~３８℃である。また、接触の時間は、限定はされないが、例えば、１~３０分であることが好ましく、より好ましくは５~２０分である。接触工程における候補物質、ＥｒｂＢ４タンパク質およびニューレグリン−１の濃度は、当業者であれば適宜設定することができる。
　（ｉｉ）のＥｒｂＢタンパク質の自己リン酸化の程度を検出する工程については、限定されないが、抗リン酸化ＥｒｂＢ４抗体（例えばＴｙｒ１２８４（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ、ＵＳＡ））を用いたウエスタンブロッティング法やラジオアイソトープを用いた方法を利用することができる。
　（ｉｉｉ）の選択工程においては、ＥｒｂＢタンパク質の自己リン酸化を促進する物質を選択するが、検出工程において検出されるリン酸化の程度が、候補物質の非存在下の場合と比較して強い場合は、使用された候補物質がＥｒｂＢ４タンパク質の自己リン酸化を促進する物質であるとして評価及び選択することができる。当該リン酸化の程度がより大きいほど、ＥｒｂＢタンパク質の自己リン酸化を促進する活性がより高い物質であると評価することができる。
　本発明のスクリーニング方法は、ＥｒｂＢ４タンパク質の自己リン酸化を促進する活性を有する物質を簡易に且つ大規模にスクリーニングするために用いることができるため、ＡＬＳの治療薬開発を強力に推し進めることができる点で、極めて有用性の高いものである。
　本発明は、上記本発明のスクリーニング方法により得られた化合物またはその塩を含む、ＡＬＳ治療用の医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、本発明のスクリーニング方法により得られた化合物またはその塩を活性成分として含み、さらに薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物の形態で提供することが好ましい。本発明の医薬組成物は、ＡＬＳ治療剤として使用することが期待される。
　「薬学的に許容され得る担体」は、製剤において通常使用される担体であり、例えば賦形剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等挙げられる。そのような担体の一つ以上を用いることにより、注射剤、液剤、カプセル剤、懸濁剤、乳剤あるいはシロップ剤等の形態の医薬組成物を調製することができる。これらの医薬組成物は、経口あるいは非経口的に投与することができる。非経口投与のためのその他の形態としては、１つ以上の活性物質を含み、常法により処方される注射剤などが含まれる。注射剤の場合には、生理食塩水又は市販の注射用蒸留水等の薬学的に許容される担体中に溶解または懸濁することにより製造することができる。
　本発明の医薬組成物の投与量は、患者の年齢、性別、体重及び症状、治療効果、投与方法、処理時間、あるいは医薬組成物に含有される活性成分である化合物またはその塩の種類などにより異なるが、例えば、活性成分である化合物またはその塩を、通常成人一人（体重６０ｋｇ）当たり、一回につき１０μｇから１０００ｍｇの範囲で投与することができるが、この範囲に限定されるものではない。
　以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
［実施例１］ｃ．２７８０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｒ９２７Ｑ）の同定
　本実施例において、遅発性ＡＬＳを起こしている３人の発症した兄弟姉妹を有する日本人家族を同定した（図１ａ、表６）。
　家族歴は、おそらく常染色体優性の遺伝であることを示した。ダイレクトヌクレオチド配列解析を使用する発端者（ＩＩ−４）の突然変異解析、マイクロアレイベース再配列決定、またはリピートプライムドＰＣＲ（ｒｅｐｅａｔ−ｐｒｉｍｅｄ　ＰＣＲ）解析により、原因遺伝子としてＳＯＤ１、ＡＬＳ２、ＤＣＴＮ１、ＣＨＭＰ２Ｂ、ＡＮＧ、ＴＡＲＤＢＰ、ＦＵＳ、およびＣ９０ＲＦ７２が除外された。ＦＡＬＳの新規原因遺伝子を同定するために、この家系に対して連鎖解析と組み合わせてＷＧＳを実施した。
　指標の家系における３人の個人（Ｉ−２、ＩＩ−３、およびＩＩ−４、図１ａ）にＷＧＳを実施した。ペアエンドＤＮＡライブラリーを生成し、製造者の指示書に従ってＧＡＩＩ　Ｉｌｌｕｍｉｎａ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して大量並列シーケンシングにかけた。得られたショートリード配列を、Ｂｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ　Ａｌｉｇｎｅｒを使用して参照ゲノム（ＮＣＢＩ３７／ｈｇ１９アセンブリー）に対して整列させた。潜在的なＰＣＲ複製物が除去された下流分析を、ＳＡＭｔｏｏｌｓを使用して処理した。整列されたリードを、Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　Ｖｉｅｗｅｒを使用して調べた。ＳＡＭｔｏｏｌｓのパイルアップコマンド（ｐｉｌｅｕｐ　ｃｏｍｍａｎｄ）を使用してゲノム配列変異を同定し、Ｒｅｆｓｅｑ、ｄｂＳＮＰ１３５、１０００ゲノム、個人ゲノムデータベース、ＮＨＬＢＩ　ＧＯ　Ｅｘｏｍｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＮＨＬＢＩ−ＥＳＰ）データベース、および日本人集団における４１の全ゲノムおよび１４０８のエクソームを含有する社内変異体データベースを使用してアノテートした。
　Ｉ−２、ＩＩ−３、およびＩＩ−４において同定された新規でアミノ酸置換を伴う非同義変異体の数は、それぞれ４１１、４０４、および３８２であった（表２）。この中には、ＦＡＬＳについての公知の原因遺伝子における新規非同義変異体は、まったく含まれなかった。これらの中で、５７の変異体が発端者および発症した兄弟姉妹の両方において同定されたが、母において同定されず、これらをさらなる解析にかけた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　ドットで示した個人（図１ａ）の遺伝子型を、ゲノム全域にわたるヒトＳＮＰアレイ６．０（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ　Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して同定した。０．０００００１の疾患対立遺伝子頻度を伴った遺伝の常染色体優性形式を仮定して、パイプラインソフトウェアＳＮＰ−ＨｉＴＬｉｎｋおよびＡｌｌｅｇｒｏバージョン２を用いて連鎖解析およびハロタイプ再構築を行った。
　その結果、完全浸透度を仮定したパラメトリック多点連鎖解析により、１．８の最大ＬＯＤスコアを伴って染色体１、６、および１３上に２３．６Ｍｂに及ぶ３つの遺伝子座が明らかになった（図１ｂ、浸透度＝１．０）。しかし、上記の新規非同義変異体は、候補領域においていずれも同定されなかった。
　そのため、浸透度の低減の可能性を考慮したところ、浸透度が０．８に低減される場合、７つの追加の遺伝子座が、０．７超のＬＯＤスコアを伴って連鎖を支持することが示された（図１ｂ、浸透度＝０．８）。そして、３つのヘテロ接合性新規非同義変異体がこれらの領域内で同定され、これらの中で、ｖ−ｅｒｂ−ａ赤芽球性白血病ウイルス発癌遺伝子同族体４（ａｖｉａｎ）（ＥＲＢＢ４［ＮＭ＿００１０４２５９９．１］）における変異体ｃ．２７８０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｒ９２７Ｑ）のみが、４７７個の対照において存在しなかった（表３）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　また、浸透度をさらに低減させた場合、０を超えるＬＯＤを伴って、１９の追加の遺伝子座が同定された。これらの領域内で、７つのヘテロ接合性新規非同義変異体が同定されこれらの中で、ＯＲ２Ｄ３（ＮＭ＿００１００４６８４．１）、ＦＴＣＤ（ＮＭ＿２０６９６５．１）、およびＴＪＰ２（ＮＭ＿００１１７０４１４．２）における３つの変異体は、４７７個の対照において存在しなかった（表３）。ＯＲ２Ｄ３は、嗅覚受容体遺伝子であり、ＯＲ２Ｄ３中の突然変異アミノ酸は、保存されておらず、この突然変異は、ＰｏｌｙＰｈｅｎ−２解析によって良性として予測された。ＦＴＣＤおよびＴＪＰ２はそれぞれ、常染色体劣性グルタミン酸ホルムイミノトランスフェラーゼ欠損症（ＯＭＩＭ２２９１００）および家族性高胆汁性貧血（ｈｙｐｅｒｃｈｏｌａｎｅｍｉａ）（ＯＭＩＭ６０７７４８）の原因遺伝子であり、ヘテロ接合保因者は、ＡＬＳを呈するように記述されていない。
　以上の結果を総合すると、ＥＲＢＢ４中の変異体ｃ．２７８０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｒ９２７Ｑ）が、最も可能性の高い病原性の突然変異であることが明らかとなった。
［実施例２］ｃ．２７８０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｒ９２７Ｑ）の解析およびｃ．３８２３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｒ１２７５Ｗ）の同定
（１）ｃ．２７８０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｒ９２７Ｑ）の解析
　３６４人のＦＡＬＳ患者および８１８人の孤発性ＡＬＳ（ＳＡＬＳ）患者におけるＥＲＢＢ４の突然変異解析を、ＡＢＩ３１００シーケンシング装置およびＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒバージョン３．１（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、ダイレクトヌクレオチド配列解析法により行った。オリゴヌクレオチドプライマーは、ＥｘｏｎＰｒｉｍｅｒウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｉｈｇ．ｇｓｆ．ｄｅ／ｉｈｇ／ＥｘｏｎＰｒｉｍｅｒ．ｈｔｍｌ）を使用して設計した（表４）。変異体の配列は、Ｔａｋａｒａ　ＬＡＴａｑ（Ｔａｋａｒａ　Ｂｉｏ，Ｏｔｓｕ，Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）を用いるゲノムＰＣＲ解析およびＡＢＩ　３１００　ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ　ａｎｄ　ＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｖｅｒ３．１（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いるサンガーシーケンシングにより確認した。ＰＣＲの条件は、以下のとおりである：９５℃２分、続いて９５℃３０秒、６０℃３０秒、６８℃１分からなるサイクルを３５サイクル、最後に６８℃７分の伸長ステップ。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000006
　表４中、ＥＲＢＢ４＿Ｅｘ２３Ｆ１およびＥＲＢＢ４＿Ｅｘ２３Ｒ１がｃ．２７８０Ｇ＞Ａを検出するためのプライマーであり、ＥＲＢＢ４＿Ｅｘ２８Ｆ１およびＥＲＢＢ４＿Ｅｘ２８Ｒ１がｃ．３８２３Ｃ＞Ｔを検出するためのプライマーである。
　解析の結果、同じ突然変異ｃ．２７８０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｒ９２７Ｑ）が、１人のカナダ人ＦＡＬＳ患者において同定された（図２ａ）。残念ながら、他の家族メンバーからのＤＮＡは、分離を確認するためには入手することができなかった。
（２）ｃ．３８２３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｒ１２７５Ｗ）の同定
　興味深いことに、ｃ．３８２３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｒ１２７５Ｗ）の新規突然変異を、日本人ＳＡＬＳ患者において確認した。当該患者は、生物学的親−子孫関係がＰｌｉｎｋアルゴリズムを使用して確認された（表５）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
（３）本発明のこれらの突然変異は、４７７人の日本人対照において存在せず、４１の全ゲノムおよび１４０８のエクソームを含有する社内データベース、１０００ゲノムデータベース、または６５０３のエクソームを含有するＮＨＬＢＩ−ＥＳＰデータベース中に登録されていなかった。さらに、ｃ．２７８０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｒ９２７Ｑ）は、１９０人の白人対照において存在しなかった。
　異なる民族的背景の２つの独立した家族におけるｐ．Ｒ９２７Ｑの同定により、ＡＬＳの原因突然変異としてｐ．Ｒ９２７Ｑが強く支持された。また、新規突然変異率が、１世代当たり１ヌクレオチド当たり１．２０×１０−８であり、および非同義単一ヌクレオチド変異体（ＳＮＶ）が１未満／世代であると推定されたことを考慮すると、新規突然変異の結果は、ｐ．Ｒ１２７５Ｗがおそらくこの患者におけるＡＬＳの原因突然変異であるという考えをさらに支持する。
　本発明の２つの突然変異、すなわちＲ９２７およびＲ１２７５において置換されたアルギニン残基は、種の中で高度に保存されている（図２ｂ）。この点、本発明の突然変異は、ＰｏｌｙＰｈｅｎ−２解析によって、有害な変異であることが予想される。アミノ酸残基Ｒ９２７は、受容体チロシンキナーゼ活性に必須なＥｒｂＢ４タンパク質のチロシンキナーゼドメイン内に存在する。また、Ｒ１２７５は、下流のシグナル伝達経路を媒介する複数のリン酸化部位の近傍のＣ末端ドメイン内に位置している（図２ｃ）。
（４）ＥＲＢＢ４突然変異を有するこれらのＡＬＳ患者の臨床症状を表６に要約する。患者の共通の臨床的特徴には、Ｅｌ　Ｅｓｃｏｒｉａｌ　ａｎｄ　Ａｉｒｌｉｅ　Ｈｏｕｓｅ改定診断基準によって確実な、または推定されるＡＬＳとして診断された上位運動ニューロンおよび下位運動ニューロンの両方の関与、相対的に遅い進行、ならびに明らかな認知障害がまったくないことが含まれた。ｐ．Ｒ９２７Ｑ突然変異を有する患者は、浸透度がわずかに低減された、相対的に遅い発症（発病時の年齢は、６０~７０の範囲である）を特徴とした。対照的に、ｐ．Ｒ１２７５Ｗ突然変異を有する患者は、早期の発病（年齢４５歳）を特徴とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
［実施例３］
　ＡＬＳ患者において同定された本発明の２つの突然変異が、ＥｒｂＢ４機能にどのように影響するかを判定するために、本実施例を行った。本実施例では、ＮＲＧ−１の存在下で、野生型または突然変異体（ｐ．Ｒ９２７Ｑまたはｐ．Ｒ１２７５Ｗ）のＥｒｂＢ４を発現する細胞内のＥｒｂＢ４の自己リン酸化を測定した。
　Ｐｈｕｓｉｏｎ　Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）に記載されたプロトコールに従って、部位特異的突然変異によって、ＨＡタグ付きＥｒｂＢ４　ＪＭ−ａ　ＣＹＴ−２をコードするｐＢＡＢＥ−ｐｕｒｏＥＲＢＢ４ＪＭ−ａＣＹＴ−２ＨＡプラスミド中にＥｒｂＢ４突然変異を導入した。突然変異誘発後、すべてのコンストラクトを配列決定によって確証した。製造者の指示書に従って、ＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｚｅｒｌａｎｄ）を使用して、ＣＯＳ−７細胞内にプラスミドを一過性にトランスフェクトした。トランスフェクション細胞を、一晩血清を欠乏させ、０または５０ｎｇ／ｍｌのＮＲＧ−１（Ｒ＆Ｄ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）を用いて、３７℃で１０分間刺激した。刺激した後、細胞を溶解させ、５０μｇの全タンパク質に等価な試料を、８％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを通じて分離した。ＥｒｂＢ４リン酸化および全ＥｒｂＢ４発現を、それぞれ、ホスホ−ＥｒｂＢ４（Ｔｙｒ１２８４）（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ、ＵＳＡ）およびＨＡ−タグ（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）に対する抗体を用いて、ウエスタンブロッティングによって検出した。
　その結果、２つの突然変異体ｐ．Ｒ９２７Ｑおよびｐ．Ｒ１２７５Ｗは、ＥｒｂＢ４の自己リン酸化の明確な低減を示した（図３）。
　本実施例による遺伝学的データおよび機能的データに基づいて、本発明の２つの突然変異がＡＬＳの原因突然変異であると結論することができる。そして、本発明により、ＡＬＳ診断のためにＥＲＢＢ４遺伝子変異を検出する方法を確立することができた。この方法によりＡＬＳの早期発見、診断および治療をもたらすものであると期待される。
　本発明により、ＮＲＧ−１刺激におけるＥｒｂＢ４自己リン酸化の低減が、ＡＬＳの病因に関与していることが明らかになった。ＥｒｂＢ４は、ラット脊髄の大型運動ニューロンの細胞体内で特異的に発現される。ＥｒｂＢ４の欠如は、マウスにおいて胚致死性であり、これは、胚形成の間の運動ニューロン軸索誘導および経路探索の撹乱を示す。ヘテロ接合性ヌルマウスは、体重減少および運動発達遅延を示し、脳特異的条件付きノックアウトマウスは、後肢の自発運動活性および握力の低減を実証する。ＮＲＧ−１のシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）アイソフォーム欠損マウス（ＣＲＤ−ＮＲＧ−１−／−）は、呼吸不全のために周産期に死亡し、検出可能な肢の運動を欠き、脊髄運動ニューロンの約６０％の喪失を示す。同様に、運動ニューロンおよび知覚ニューロン特異的条件付きＮＲＧ−１ノックアウトマウスは、出生時に死亡し、運動ニューロン軸索の顕著な退縮を示した。さらに、ＣＲＤ−ＮＲＧ−１発現レベルの減少が、疾患発症時のＦＡＬＳ患者およびＳＡＬＳ患者ならびにＳＯＤ１突然変異体マウスにおける脊髄運動ニューロン中に検出され、ＮＲＧ−ＥｒｂＢ経路の破壊が、一般に、ＡＬＳの根底をなす運動ニューロン変性に関与している可能性を高めている。
　本発明は、ＡＬＳ病因の新規側面をもたらすものであり、ＮＲＧまたはこれらのアゴニストを使用して、ＥｒｂＢ４機能を上方制御することなどの画期的な治療戦略を開発する道を開くことが期待される。
　配列番号１：ヒトＥＲＢＢ４遺伝子の塩基配列（アクセッション番号ＮＭ＿００５２３５．２）。
　配列番号２：ヒトＥｒｂＢ４タンパク質のアミノ酸配列（アクセッション番号ＮＰ＿００５２２６）。
　配列番号３~５８：プライマー。
　配列番号５９：「ｃ．２７８０Ｇ＞Ａ」を有するヒトＥＲＢＢ４遺伝子の塩基配列。
　配列番号６０：「ｐ．Ｒ９２７Ｑ」を有するヒトＥｒｂＢ４タンパク質のアミノ酸配列。
　配列番号６１：「ｃ．３８２３Ｃ＞Ｔ」を有するヒトＥＲＢＢ４遺伝子の塩基配列。
　配列番号６２：「ｐ．Ｒ１２７５Ｗ」を有するヒトＥｒｂＢ４タンパク質のアミノ酸配列。

Claims (8)

  1. 被験者から採取されたＥＲＢＢ４遺伝子の塩基配列のうち、第２７８０番目の塩基のＧからＡへの遺伝子変異または第３８２３番目の塩基のＣからＴへの遺伝子変異を解析し、前記いずれかまたは両方の遺伝子変異があるとき、当該被験者が筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）に罹患している、またはＡＬＳに罹患するリスクがあると判定する、ＡＬＳの検出方法。
  2. ＡＬＳが、家族性ＡＬＳまたは孤発性ＡＬＳである、請求項１に記載の方法。
  3. ＥＲＢＢ４遺伝子の塩基配列において、第２７８０番目の塩基のＧからＡへの遺伝子変異および第３８２３番目の塩基のＣからＴへの遺伝子変異のいずれかまたは両方を含む、ＥＲＢＢ４遺伝子。
  4. ＥＲＢＢ４遺伝子の塩基配列のうち、第２７８０番目または第３８２３番目の塩基を含む塩基配列またはこれに相補的な配列からなるオリゴヌクレオチド。
  5. 第２７８０番目の塩基がＡであるか、または第３８２３番目の塩基がＴである、請求項４に記載のオリゴヌクレオチド。
  6. 請求項４または５に記載のオリゴヌクレオチドを含む、筋萎縮性側索硬化症の検出用キット。
  7. 候補物質の存在下または非存在下において、ＥｒｂＢ４タンパク質とニューレグリン−１とを接触させることを含む、ＥｒｂＢ４タンパク質の自己リン酸化を促進させる化合物またはその塩のスクリーニング方法。
  8. 請求項７で得られる化合物またはその塩を含む、筋萎縮性側索硬化症の治療剤。
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