WO2016147942A1 - 急速進行型孤発性ａｌｓの検査方法、検査キット、及び医薬のスクリーニング方法 - Google Patents

急速進行型孤発性ａｌｓの検査方法、検査キット、及び医薬のスクリーニング方法 Download PDF

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Abstract

　ＡＬＳ、特に孤発性ＡＬＳ患者の病態、病因を解明することにより、病気の進行を抑止する治療薬、治療方法を開発することを課題とする。孤発性ＡＬＳ患者を発症後の病態進行により類型化し、４つの類型に分類した。ゲノムワイド関連解析を行い、４つの類型のうち急速に増悪化する急速進行型と関連する７つのＳＮＰｓを見出した。これらＳＮＰｓはチチン発現に関連していることも明らかとなった。これらＳＮＰｓやチチン発現を急速進行型ＡＬＳのマーカーとし、さらに、これらマーカーを用いて病態抑止治療予防法の開発を行うことができる。

Description

急速進行型孤発性ＡＬＳの検査方法、検査キット、及び医薬のスクリーニング方法
　本発明は、筋萎縮性側索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis；以下、ＡＬＳと記載することがある。）の進行を類型化し、急速に進行する急速進行型の患者群に見られる遺伝子多型を用いた検査方法、検査キット、及び医薬のスクリーニング方法に関する。また、遺伝子多型の解析より、急速進行型の患者群では横紋筋の構造タンパク質チチンの発現低下が明らかとなったことから、チチン発現を指標とする検査方法、検査キット、医薬のスクリーニング方法に関する。
　ＡＬＳは、重篤な筋肉の萎縮と筋力低下をきたす進行性の神経変性疾患で、運動ニューロン病の一種である。ＡＬＳは、極めて進行が速く、呼吸麻痺、嚥下障害、四肢麻痺をきたし、発症後半数ほどが３年から５年で死亡もしくは呼吸器装着に至る。我が国からの最近の報告では１年間に人口１０万人あたり２．２人程度が発症し、有病率は９．９人／１０万人と推計されている。稀な疾患ではないものの治癒のための有効な治療法は現在確立されていない。
　ＡＬＳの５～１０％が家族性であり、多くが孤発性であるといわれている。単一の遺伝子の変異により発症する家族性ＡＬＳは、近年、新規遺伝子の発見が相次いでいるものの、孤発性ＡＬＳに関しては、病態、原因の解明は遅れている（非特許文献１）。孤発性ＡＬＳの中にも、家族性ＡＬＳで発見された遺伝子の突然変異が見出せるものもあるが、多くの孤発性ＡＬＳは多因子が関与していると考えられており、その原因は明らかにされていない。
　一塩基多型（single nucleotide polymorphisms, 以下、ＳＮＰｓと記載することもある。）をマーカーとしたゲノムワイド関連解析（Genome Wide Association Study, GWAS）が孤発性ＡＬＳに関与する遺伝子研究のために行われてきた（非特許文献２）。しかしながら、報告されている関連遺伝子多型は、オッズ比が１．５程度と低く、孤発性ＡＬＳの疾患モデルを構築するのには不十分であったり、また、再現性に欠けるとされている（非特許文献３）。
　また、ＡＬＳの治療については、多くの臨床試験が試みられているが、いまだに効果のあるものがなく、進行を抑制させる疾患修飾療法も満足のいくものがないのが現状である。ＡＬＳ患者の機能低下の経過は個々で大きく異なることが報告されており（非特許文献４、５）、病気の進行の多様性がＡＬＳの臨床試験の解析結果を困難にし、効果的な治療法を見出せない原因となっている。
特表２０１４－５２６０４２号公報
Finsters, J. & Burgunder, J.M., 2014, Eur. J. Med. Genet.,Vol.57(2-3), pp.103-112 Renton, A. E., et al., 2014, Nature Neuroscience, Vol.17(1),pp.17-23 Iida, A., et al., 2011, Neurobiology of aging, Vol.32(4), 757e13-14 Qureshi, M. M. et al., 2006, Amyotroph. Lateral Scler., Vol.7(3),pp.173-82 Gomeni, R., & Fava, M., 2014, Amyotrophic lateral sclerosis& frontotemporal degeneration, Vol.15(1-2), pp.119-129 Granzier, H.L. & Labeit, S., 2004, Circulation research,Vol.94(3), pp.284-295 Gregorio, C.C. et al., 1999, Current opinion in cell biology,Vol.11(1), pp.18-25 Trinick, J., 1994, Trends in biochemical sciences, Vol.19(10),pp.405-409 Udd, B., et al., 2005, Neurology, Vol.64(4), pp.636-642 Hackman, O., et al., 2002, American Journal of human genetics,Vol.71(3), pp.492-500 Ohlson, M., et al., 2012, Brain: a journal of neurology, Vol.135(pt6), pp.1682-1694 Udaka, J., et al., 2008, Journal of general physiology, Vol.131(1),pp.33-41 Atsuta, N., et al., 2011, Brain and Nerve=Shinkei kenkyuno shinpo, Vol.63(5), pp.491-496 Ma, et al., 2006, Nucleic Acids Research, Vol.34(4), pp.1261-1269
　本発明は、ＡＬＳ、特に孤発性ＡＬＳ患者の病態、病因を解明することにより、病気の進行を抑止する治療薬、治療方法を開発することを課題とする。孤発性ＡＬＳ患者の病態を類型化し、急激に症状が悪化する急速進行型ＡＬＳを判定する検査方法、及び急速進行型ＡＬＳの治療薬のスクリーニング方法を提供することを課題とする。
　本発明は以下に示すＡＬＳ患者の発症後の進行の類型を検査する方法、及び急速進行型ＡＬＳの進行を抑制する医薬をスクリーニングする方法に関する。
（１）ＡＬＳ患者の発症後の進行の類型を検査する方法であって、
ＡＬＳ患者のリファレンスＳＮＰ　ＩＤ番号：ｒｓ１２０５２９８３、ｒｓ２３１１４５８２、ｒｓ２３０３５３７、ｒｓ４８９４０２０、ｒｓ６４５３７０９、ｒｓ６００１７６、ｒｓ９５７８７５の少なくともいずれか１つの一塩基多型を検査し、
前記一塩基多型がマイナーアレルである場合に急速進行型のリスクが高いと判定することを特徴とする検査方法。
（２）ＡＬＳ患者の発症後の進行の類型を検査する方法であって、
ＡＬＳ患者のチチンの発現量を測定し、
チチン発現量が閾値より低い場合、急速進行型に進行するリスクが高いと判定することを特徴とする検査方法。
（３）（２）に記載のＡＬＳ患者の発症後の進行の類型を検査する方法であって、
前記チチンの発現量は、ｍＲＮＡ及び／又はタンパク質発現量を測定することを特徴とする検査方法。
（４）（３）に記載のＡＬＳ患者の発症後の進行の類型を検査する方法であって、
前記チチン発現量はｍＲＮＡ発現を定量的ＰＣＲで測定することを特徴とする検査方法。
（５）（３）に記載のＡＬＳ患者の発症後の進行の類型を検査する方法であって、
　前記チチンの発現量はタンパク質発現を抗チチン抗体によって測定することを特徴とする検査方法。
（６）（１）～（５）いずれかに記載のＡＬＳ患者の発症後の進行の類型を検査する方法であって、
患者から得られたリンパ球を用いて検査することを特徴とする検査方法。
（７）ＡＬＳ患者が急速進行型ＡＬＳに分類されるかを検査するキットであって、
リファレンスＳＮＰ　ＩＤ番号：ｒｓ１２０５２９８３、ｒｓ２３１１４５８２、ｒｓ２３０３５３７、ｒｓ４８９４０２０、ｒｓ６４５３７０９、ｒｓ６００１７６、ｒｓ９５７８７５の少なくともいずれか１つの一塩基多型を検出するためのＰＣＲプライマー、チチン発現量を解析するための定量的ＰＣＲプライマー、チチン発現量を定量するための抗体の少なくともいずれか１つを含むことを特徴とする検査キット。
（８）急速進行型ＡＬＳの進行を抑制する医薬をスクリーニングする方法であって、
被験物質を培養細胞に接触させ、
チチン発現量の増加を指標として選択することを特徴とするスクリーニング方法。
（９）（８）記載の急速進行型ＡＬＳの進行を抑制する医薬をスクリーニングする方法であって、
前記培養細胞がリファレンスＳＮＰ　ＩＤ番号：ｒｓ１２０５２９８３、ｒｓ２３１１４５８２、ｒｓ２３０３５３７、ｒｓ４８９４０２０、ｒｓ６４５３７０９、ｒｓ６００１７６、ｒｓ９５７８７５がマイナーホモアレルであることを特徴とするスクリーニング方法。
（１０）（８）又は（９）記載のスクリーニング方法であって、
　上記培養細胞が急速進行型ＡＬＳ患者の末梢血から樹立したリンパ球細胞株であることを特徴とするスクリーニング方法。
（１１）（８）～（１０）いずれかに記載のスクリーニング方法であって、
　前記チチン発現は、ｍＲＮＡ及び／又はタンパク質を測定することによることを特徴とするスクリーニング方法。
ＡＬＳＦＲＳ-Ｒの経時変化による孤発性ＡＬＳの類型化を示す図。 急速進行型ＡＬＳと相関の見出されたＳＮＰｓの連鎖不平衡を示す図。 急速進行型ＡＬＳと相関の見出されたＳＮＰｓのハプロタイプ解析を示す図。 各遺伝子型におけるチチン遺伝子発現量を示す図。
　本発明者らは、コホート研究を行い、孤発性ＡＬＳの病態の進行を急速進行型、単調進行型、シグモイド型、緩徐進行型の４つの類型に分類した。さらに、ゲノムワイド関連解析を行い、急速進行型の病態と関連の高い７つのＳＮＰｓを見出した。さらに、上記７つのＳＮＰｓは、強い連鎖不平衡状態にあることが解析によって明らかとなった。したがって、上記７つのＳＮＰｓのいずれか１つ以上を解析することによって、急速進行型の経過をたどるリスクを判定することができる。
　強い連鎖不平衡を示すことから７つのＳＮＰｓのうちいずれか１つ以上を解析し、マイナーアレルであるか、メジャーアレルであるかを調べることによって、孤発性ＡＬＳ患者が急速進行型であるリスクを検査することができる。ＳＮＰの検出方法としては、Ｉｎｖａｄｅｒ法、ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法、一塩基伸長法、Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法、Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｃｙｃｌｉｎｇ　Ａｓｓａｙ法等、公知の方法を用いることができる。上記７つのＳＮＰｓを検出するのに必要なプライマーは公知の方法で作成することができる。具体的には７つのＳＮＰｓを含む遺伝子領域の配列情報をデータベースから得て、ソフトウェアＰｒｉｍｅｒ３を用いて、一塩基配列の変異が解析できることに留意しながらＰＣＲプライマーセットの設計を行えばよい。
　また、上記４つの類型のうち、病態が急速に進行する急速進行型と関連するＳＮＰｓはチチン発現の低下をもたらすことがＳＮＰ情報のデータベースより明らかになった。チチンは、分子量３００万という巨大なタンパク質であり、骨格筋を形成する横紋筋の構造タンパク質である。チチンは、横紋筋のＺ線からＭ線付近まで伸長しており、筋肉の伸展性と弾性に関与していることが知られている（非特許文献６～８）。また、チチンの突然変異は、肢帯筋ジストロフィー、脛骨筋ジストロフィー、早期の呼吸器障害を伴う先天的ミオパチー等の先天的な筋疾患に関与していることが報告されている（非特許文献９～１１）。また、動物モデルにおいても、長期の廃用により、骨格筋のチチン量が選択的に減少し、サルコメアの構造が変化することが報告されている（非特許文献１２）。これら疾患との関連性を鑑みると、チチン発現がＡＬＳの病態の進行に影響を与えていることは十分に可能性がある。
　実際に上記７つのＳＮＰｓが急速進行型と関連のあるマイナーアレルホモ接合体の患者から得られたリンパ球細胞株では、チチン発現量がメジャーアレルホモ接合体の患者から得られた細胞株より有意に低かった。したがって、ＡＬＳ患者において、7つのＳＮＰｓのタイピングを行うこと、及び／又はチチン発現量を測定することによって急速進行型の経過をたどるリスクを判定することができる。チチン発現量の測定は、ｍＲＮＡを測定してもタンパク質を測定してもよい。
　チチンｍＲＮＡを測定する場合には、定量的ＰＣＲを用いればよい。定量的ＰＣＲ法は、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ法、ＴａｑＭａｎプローブ法、ＲＴ-ＰＣＲ法等、公知の方法を用いることができる。また、タンパク質は公知の抗チチン抗体（特許文献１）を用いて、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ法等公知の方法によって定量することができる。ｍＲＮＡ、タンパク質を測定することにより、感度よくチチン発現を定量することができる。
　チチン量がコントロールと比較して有意に低値であれば、急速進行型のリスクが高いと判断することが可能である。コントロールとしては、健常者、あるいは、以下に示す７つのＳＮＰｓがメジャーホモアレルである群から得たサンプルを用いることができる。測定方法によって、適宜閾値は定めることができるが、例えば、７つのＳＮＰｓがメジャーホモアレルである群の平均値を閾値と定め、リスクを判断してもよい。
　患者試料としては血液、組織等、細胞が含まれていればどのような試料を用いてもよいが、末梢血を用いれば、患者の身体的負担が少ないことから好ましい。
　本発明者らは孤発性ＡＬＳの病態の類型のうち、急速進行型とチチン発現が相関することを示した。したがって、チチン発現を指標として、急速進行型ＡＬＳの病態を抑制する治療薬をスクリーニングすることができる。また、チチンは骨格筋を構成するタンパク質であることから、スクリーニングにより得られた医薬は、急速進行型ＡＬＳだけではなく、他の類型のＡＬＳや家族性ＡＬＳ、筋萎縮をもたらす他の神経変性疾患にも適用できる可能性がある。
　チチン発現の指標として、ｍＲＮＡやタンパク質を上述の公知の方法で測定し、その発現が増加するような物質を選択することにより、急速進行型ＡＬＳの病態を抑制する医薬をスクリーニングすることができる。
　具体的には、チチン発現量の低い細胞にライブラリー化合物を添加して、化合物添加前後で、チチン発現量の変化を解析すればよい。チチン発現量を増加させることができる化合物であれば、急速進行型ＡＬＳの病態を抑制する医薬の候補となり得る。チチン発現量の低い細胞としては、どのようなものを用いても良いが、前記７つのＳＮＰｓがマイナーアレルホモ接合体である遺伝子型の細胞株はチチン発現量が低いことから、これらの細胞株を用い、培養液中にライブラリー化合物を添加してチチンの発現量を解析すればよい。
　具体的な細胞株としては、孤発性ＡＬＳ患者から樹立した７つのＳＮＰｓがマイナーアレルホモ接合体であるリンパ球細胞株を用いるのが好ましい。樹立した細胞株のうち、特にチチン発現が低い細胞株を使うことによって、感度よくチチン発現の増加を捉えることができる。また、孤発性ＡＬＳ患者の細胞から樹立したｉＰＳ細胞を用いることができる。本発明者らは、すでに６５症例の患者由来のｉＰＳ細胞を樹立し、運動ニューロンへの分化誘導を行っている。これら特定の遺伝子型を持った患者細胞由来のリンパ球細胞株、ｉＰＳ細胞を用いてチチン発現量を増加させる薬剤のスクリーニングおよび、効果の検証を行うことができる。
　スクリーニングする物質としては、低分子化合物、天然物、抗体等、医薬の候補となる物質であればどのようなものであってもよい。チチンの発現量は、ｍＲＮＡ，あるいはタンパク質を定量することによって測定することができる。
　本発明では、孤発性ＡＬＳの病気の進行に関与する遺伝子変異を探索するために、孤発性ＡＬＳ患者のゲノムワイド関連解析を行うとともに、孤発性ＡＬＳ患者の機能低下の進行パターンを分類し、病気の進行と関連する遺伝子の解析を行った。その結果、孤発性ＡＬＳの進行を左右する新しい関連遺伝子を見出すことができた。以下、本発明についてデータを示しながら詳述する。
≪多施設共同ＡＬＳ患者コホート研究、ＪａＣＡＬＳ≫
　ＡＬＳは現在のところ病態は明らかではなく、有効な治療法がない。そのためＡＬＳの病態解明、治療法開発が望まれている。そこで、多施設共同ＡＬＳ患者コホートが構築され、全国で３０施設が参加し、２０１５年１月現在、ＡＬＳ患者１００７例、コントロール３００例を登録し、病態解明、病態抑止治療予防法の開発、診療・患者支援の向上を目的として調査・研究を行っている。多施設共同ＡＬＳ患者コホート研究(Japanese Consortium for ALS research, 以下、ＪａＣＡＬＳと記載することもある。）では登録されたＡＬＳ患者の前向き臨床像を把握していくとともに、患者の遺伝子、不死化細胞等のリソースを蓄積していき、病態の解明や治療薬の開発研究を進めている。
　ＪａＣＡＬＳに参加している上記３０施設において、改訂エルエスコリアル（El Escorial）診断基準により診断されたＡＬＳ患者は、同意のうえ匿名化されたデータベースに登録される。登録された患者は、固有の患者番号を割り当てられ、臨床データは各参加施設において匿名情報とされる。データは名古屋大学医学部のクリニカルデータセンターに送られ、ＪａＣＡＬＳデータベースに蓄積される。ＡＬＳ患者は、登録時に各診療施設において神経内科医によって診察を受けるとともに採血が行われ、ゲノムＤＮＡ、及びＥＢウイルスによって不死化したリンパ球が保管される。
　発病時期は各患者が、筋力の低下、嚥下障害、言語障害、呼吸困難等の症状に初めて気づいたときとする。登録された患者は、臨床研究コーディネーターによる電話調査、医師の診断によって３ヶ月毎に病気の進行を判定する。判定には、ＡＬＳ患者の総合的な重症度、病態進行の評価として用いられているＡＬＳ機能評価スケール改訂版（ALS Functional Rating Scale-Revised, 以下、ＡＬＳＦＲＳ－Ｒと記載することもある。）を使用して、患者の病態の把握及び進行の程度の把握を行う。
　ＡＬＳＦＲＳ-Ｒとは、ＡＬＳ患者の日常生活を把握するための評価尺度であって、言語、嚥下、身の回りの動作、呼吸等の１２項目を、４～０までの５段階で評価して、ＡＬＳ患者の機能を評価する。スコアが低いほど、病態が進み、機能が低下していることを示している。
　電話調査によるＡＬＳＦＲＳ－Ｒデータの蓄積が信頼のおける方法であることは、医師の診察によるＡＬＳＦＲＳ－Ｒとの間に高い相関（級内相関係数０．９７、９５％ＣＩで０．９４－０．９８）があることによってすでに確認している（非特許文献１３）。また、研究に参加する各施設での調査方法等を標準化するために、３名の医師が各施設を訪問し、評価方法の確認を行った。
　呼吸器装着、又は患者の死亡をエンドポイントとし、呼吸器未装着の患者を「生存、survival」と定義する。観察期間はエンドポイント、又は発病から５年までとして解析を行った。
≪孤発性ＡＬＳ患者の選択≫
　２００６年１月から２０１２年１２月までにＪａＣＡＬＳに合計６５２人の孤発性ＡＬＳ患者が登録された。このうち９名の患者は、家族性ＡＬＳの研究によりＡＬＳを引き起こす責任遺伝子として報告されているＳＯＤ１（superoxide dismutase-1）（７名）、ＴＤＰ－４３（trans-active　response DNA-binding protein 43kDa）（１名）、ＴＦＧ（TRK-fused　gene）（１名）の突然変異を有していることがわかったため、解析からは除外した。したがって、合計６４３名の患者について以下に記載するゲノムワイドのジェノタイプ解析を行った。
　ジェノタイプ解析を行った６４３名の孤発性ＡＬＳ患者のうち、７３名はエルエスコリアル診断に基づくＡＬＳ疑い（suspected ALS）、３０名の患者は登録時すでに呼吸器を装着していたので解析から除外した。また、３４名の患者は登録時に罹病期間が５年以上経過しており、また、４１名の患者は発症から５年までのＡＬＳＦＲＳ-Ｒ推移データが３点以上得られておらず除外した。したがって、最終的に４６５名の患者を孤発性ＡＬＳとして解析した。２０１２年７月以前に、エンドポイントを迎えることなく、継続調査ができなくなった場合に調査の喪失（loss）として扱った。表１に４６５名の患者の臨床所見を示す。
　登録時の罹病期間は１．１～６０ヶ月であり、経過観察平均期間は２．５年（ＳＤ，２．０年）であった。また、３７名の患者（８．０％）が経過観察から離脱した。呼吸器装着までの平均期間は４５ヶ月（５．０～６０．０ヶ月の範囲）であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
≪ゲノムワイド遺伝子型決定による解析≫
　ＪａＣＡＬＳに登録している上記６４３名の患者のゲノムワイド遺伝子型解析をHumanOmniExpressExome BeadChip（Illumina社製）を用いて７０万ＳＮＰｓと２５万のエクソームについて行った。サンプルの精度管理（quality control, QC）上、コールレートが９８％未満の７サンプルと、報告された性別と遺伝子型により決定した性別の間に矛盾を有する１サンプルを解析から除外した。また、全ゲノムの家系同一性（identity-by-descent, 以下、ＩＢＤと記載することもある。）＞０．１８７５である検体のペアを特定し、サンプルの重複や、血縁関係にあるサンプルを検出した。主成分分析（principal component analysis, 以下、ＰＣＡと記載することもある。）を集団の外れ値を同定するために用いた。ＩＢＤ推定値はＰＬＩＮＫオプション‘--genome’を、ＰＣＡはＳＭＡＲＴＰＣＡを用いて、連鎖不平衡（ＬＤ）を除いた１０３，３６３のＳＮＰｓ、すなわち、連鎖不平衡の高い領域（large scale high LD region）、コールレート＜０．９８、ＭＡＦ(minor　allele frequency)＜０．０１， ＨＷＥ(Hardy-Weinberg equilibrium)Ｐ＜1×１０－６を除いたＳＮＰｓを用いて算出した。１０の主成分に基づいて、４つの外れ値の集団が同定され、続く解析からは除外された。精度管理の結果１３例が除外された。
　孤発性ＡＬＳとして臨床解析が行われた４６５名の患者のうち、１１名の患者はＳＮＰタイピングの精度管理によって除外されたため、最終的に４５４名の患者について臨床所見と遺伝子型の関連（clinico-genotype association）について解析が行われた。
　９５１，１１７ＳＮＰsのうち、コールレートが＜０．９８、ＭＡＦ＜０．０１、又はＨＷＥ　Ｐ＜1×１０－６のＳＮＰｓを除外した。残りの５７２，９８３の常染色体のＳＮＰsについてゲノムワイド関連解析（Genome Wide Association Study,　GWAS）を行った。
≪患者のＡＬＳＦＲＳ-Ｒの推移・進行の類型化≫
　孤発性ＡＬＳと診断された４６５名の患者のＡＬＳＦＲＳ－Ｒの推移を図１Ａに示す。図１Ａは４６５名の患者の２，４７６の時点のＡＬＳ機能評価スケールを各患者ごとに時間経過に沿ってプロットしたものである。発症後のＡＬＳ患者の進行は極めて多様であることがわかる。病態の多様性が治療標的となる遺伝子、分子の解析を困難にしていると考えられるため、患者の病態の進行を類型化することを試みた。
　患者を病態別に類型しクラスタ化する方法について述べる。ＡＬＳＦＲＳ－Ｒに対して非線形混合効果モデルを仮定し、モデルパラメータをベイズ法によって推定し、患者の類型化を行った。クラスタｋ（ｋ＝１,…,Ｋ）に属する患者iの時点j（ｊ＝１,…,Ｔ）で測定されたＡＬＳＦＲＳ-Ｒ(yij)は以下の数式（１）で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
 　ここで、μｋは、平均化非線形曲線であり、biは平均０、分散σ２ ｂの正規分布に従う変量効果、εijは平均０、分散σ２に従う誤差である。パラメータμｋは、以下の数式２の４パラメータロジスティックモデルに合うようにモデル化されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
 　β１、ｋは平均曲線の形を決定するパラメータであり、β２、ｋは、クラスタｋのＡＬＳＦＲＳ－Ｒの半数、すなわち２４になる時点である。μｋ（ｔij）は、ｔij＝０（すなわち、発病前）のときに４８であり、仮定された各クラスタ特有の関数にしたがって時間とともに徐々に減少する。
　クラスタの数がいくつあるかは一般的には不明であるから、ＡＬＳＦＲＳ－Ｒの推移はＫクラスタの混合であると仮定した。つまり、全集団のＡＬＳＦＲＳ－Ｒに、Ｋ個の正規分布を混合させた混合正規分布を仮定する。すなわち、以下の数式３を仮定する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000004
 　ここでＫは仮定されたクラスタ総数であり、ｐ１,…,ｐｋはクラスタの比率である。したがって、ｐ１+…ｐｋ＝1である。ここで、Ｎｏｒｍａｌ(μｋ，Σ)は、平均μｋ、複合対称型共分散行列Σの正規分布である。各患者のＡＬＳＦＲＳ－Ｒのデータと、無情報事前分布を用いてベイズ法によってパラメータを算出した。クラスタ数はベイズ情報処理基準（Bayesian information Criteria, BIC）と臨床的観点から決定した。パラメータの事後推定値を用いて、各患者の各クラスタに対する帰属度（ｍｉ，ｋ）を求め、Ｋクラスタの中で最も高い帰属度をとるクラスタに患者を分類した。帰属度は０と１の間の値をとり、以下の数式４で与えられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000005
 表２に非線形混合効果モデルのパラメータ推定値を記載する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　上記パラメータはベイズ法に基づいて推定されているが、パラメータ推定においては、一様事前分布を適用している。具体的には、ｐｋに０．０１から1の値をとる一様分布（以下、Ｕｎｉｆｏｒｍ（０．０１、１）と表す）、β１、ｋにＵｎｉｆｏｒｍ（０、５）、β２、ｋにＵｎｉｆｏｒｍ（1、１００）、またσ２ ｂとσ２に逆ガンマ分布（inverse gamma distribution）を用いた無情報事前分布（vague　priors）をそれぞれ仮定した。
　パラメータθの事後平均は、ランダム　ウォーク　メトロポリスアルゴリズム基づいて推定した。ソフトウェアは、ＳＡＳ、ｖｅｒｓｉｏｎ９．３（SAS Institute Inc.,）のＰＲＯＣ　ＭＣＭＣを用いた。なお、事後分布は、バーンイン回数を１０００回とし、１０，０００のサンプルから５サンプル間隔で抽出した２０００サンプルで推定した。
　上記解析から、クラスタ数は４つが尤もらしいと判断した。ＡＬＳＦＲＳ－Ｒを縦軸とする４つのクラスタの平均曲線を図１Ｂに示す。急速進行型、単調進行型、シグモイド型、緩徐進行型の４つのクラスタが同定された。４６５名の患者のＡＬＳＦＲＳ－Ｒデータの推移から、変量効果を有する４パラメータロジスティックモデルを仮定した混合正規モデルによってクラスタを同定した。また、各患者の測定時におけるＡＬＳＦＲＳ-Ｒは正規分布していると推定した。
　クラスタ１の急速進行型（図１Ｃ）は、ＡＬＳＦＲＳ－Ｒのスコアが発病期から２４ヶ月までに急速に減少する患者群である。クラスタ２の単調進行型（図１Ｄ）は、スコアが、徐々に減少していく患者群、クラスタ３のシグモイド型（図１Ｅ）はスコアの減少がシグモイド型に減少していく患者群、クラスタ４の緩徐進行型（図１Ｆ）は、スコアの減少が非常に緩やかであるか、発病時期からほとんど変わらない患者群を含んでいる。
　各クラスタの患者の比率は急速進行型４％、単調進行型１５％、シグモイド型１６％、緩徐進行型６５％であると推定された。個々の患者の発症からの経過とＡＬＳＦＲＳ－Ｒとの関係を図１Ｃ～図１Ｆに示す。
　各クラスタのメンバーシップ値を計算し、４６５名の患者を分類すると５９名（１３％）がクラスタ１に、１１３名（２４％）がクラスタ２に、７２名（１５％）がクラスタ３に、２２１名（４８％）がクラスタ４に分類された。
　患者の発症年齢、性別、発症部位等の臨床的因子と上記ＡＬＳＦＲＳ-Ｒスコア変化の類型との間には有意な関連を認めなかった。
≪急速進行型ＡＬＳと関連するＳＮＰｓの同定≫
　孤発性ＡＬＳの進行に関連のある遺伝子の解析を行った。特に、ＡＬＳＦＲＳ－Ｒで分類した結果、急速に進行する急速進行型（クラスタ１）及び緩徐進行型（クラスタ４）は臨床的意義が大きいことから、関連する遺伝子の解明を行った。
　急速進行型と他の３類型、緩徐進行型と他の３類型でアレル頻度を比較し、病態の進行と関連するＳＮＰｓを同定した。解析を行った４５４名の患者において、優性モデル（dominant model）、劣性モデル（recessive model）、相加モデル（additive model）を用いて、２つのグループ間でアレル頻度を比較した。結果を表３に示す。
　ボンフェローニ（Bonferroni）法に基づく有意水準は８．７３×１０－８であり、この値を閾値として用いた。劣性モデルにおいては、急速進行型に関与する表３の８つのＳＮＰｓを同定した（Ｐ＝３．４７×１０－８～８．３４×１０－８）。８つのＳＮＰｓのうち２つのＳＮＰｓ（表３中のｒｓ２１１４５８２とｅｘｍ２２６９１８３）は重複していたことから、７つのＳＮＰｓが急速進行型ＡＬＳＦＲＳ-Ｒのクラスタに関連していることが明らかとなった。いずれのＳＮＰｓもオッズ比が高く（オッズ比５．５～５．８４）、急速進行型とこれら７つのＳＮＰｓが高い関連を有することを示している。一方、緩徐進行型に関連するＳＮＰｓは見出せなかった。
　表３において、Ｃｈｒ：chromosome;　Ａ：メジャーアレル；　ａ：マイナーアレル；*：クラスタ２の患者の一人の遺伝型が欠失していることを示す。
　関連解析の結果を図２に示す。図２Ａは各ＳＮＰの優勢・劣性・相加モデルにより算出したＰ値の中で最も小さい値を縦軸に、染色体上の位置を横軸にとったマンハッタンプロットである。図中○で囲んだ急速進行型と関連の高い７つのＳＮＰｓは、２番染色体に位置している。図２Ｂは、２番染色体上の８つのＳＮＰｓの近傍をさらに拡大して、Ｐ値を示した図である。最も低いＰ値を示したｒｓ４８９４０２０と連鎖不平衡状態にあるため、７つのＳＮＰｓ近傍も高いＰ値を示している。
≪連鎖不平衡解析≫
　表３で同定した7つのＳＮＰｓ間の連鎖不平衡関係を調査するため、連鎖不平衡解析を実施した。連鎖不平衡の指標として、連鎖不平衡係数を標準化した値Ｄ´とピアソンの相関係数の２乗値であるr2の２種類の指標を採用し、ＳＮＰのペア毎にこれらの指標を計算した。計算用ソフトウェアとしてＨａｐｌｏｖｉｅｗ４．２を使用した。連鎖不平衡解析の結果、７つのＳＮＰｓ間ほぼ全てで強い連鎖不平衡(ｒ２≧０．８)を示したことから、これらのＳＮＰ及び近傍領域は連鎖不平衡（ＬＤ）ブロックを形成していることが明らかとなった（図３）。　
　７つのＳＮＰｓ遺伝型すべてにおけるマイナーアレルとメジャーアレルのホモ接合性は各々３０％と６０％であり、全ハプロタイプの９０％を占める。これらのＳＮＰｓの少なくともいずれか１つを解析することによって、発病初期のＡＬＳ患者についても急速進行型ＡＬＳであるリスクが高いかを診断することが可能である。
≪ｅＱＴＬ（expression quantitative trait loci）解析≫
　ｅＱＴＬ情報をＨｕｍａｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｖａｒｉａｔｉｏｎ　Ｄａｔａｂａｓｅ（ＨＧＶＤ）から入手した（ＨＧＶＤ　リリースバージョン１．４１）。ＨＧＶＤは日本の５拠点から出されたデータベースであり、日本人１２０８人のエクソームと３２４８人のＳＮＰｓの解析結果が含まれている。
　ＨＧＶＤのｅＱＴＬマッピングによれば、上記７つのＳＮＰｓは、リンパ球においてＴＴＮ（チチン、Ｔｉｔｉｎ）遺伝子の発現に影響を与えることが示されている（表４）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　そこで、ＡＬＳ患者において、７つのＳＮＰｓを含むＬＤブロックが発現に影響を与えていることを確認するために、各遺伝子型（マイナーホモ接合体、メジャーホモ接合体、ヘテロ接合体）について年齢、及び性別が適合した患者のリンパ球でのチチン発現を測定した。
　登録時にＡＬＳ患者全員から得た末梢血のＢリンパ球にＥＢウイルスを感染させることにより不死化した細胞株を樹立し、液体窒素タンクを用いて保存した。得られた不死化細胞株から、ＡＬＳの病態の進行に関与していると考えられる７つのＳＮＰｓのＬＤブロックを用いて、マイナーホモ接合体、メジャーホモ接合体、ヘテロ接合体の各遺伝子型を有する１９例ずつの細胞株について、チチン遺伝子発現の解析を行った。これらの３群では表５に示すように年齢、性別の有意な違いはなかった。
　チチンｍＲＮＡの発現レベルは、以下の定量ＲＴ-ＰＣＲにより測定した。ＲＮＡをリンパ球からＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて精製し、１μｇのトータルＲＮＡからＯｌｉｇｏ-ｄＴプライマーを用いて逆転写した。サーマルサイクラーＣＦＸ９６システム（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いて９５℃３分に続き、９５℃１０秒、５５℃３０秒の４０サイクルでＤＮＡ増幅を行った。
　各転写産物の量比は、ｃＤＮＡサンプルの段階希釈液を用いてＣｔ値の標準曲線を引き、ＧＡＰＤＨレベルにより正規化して求めた。リアルタイム定量的ＰＣＲはｉＱ　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（ＢｉｏＲａｄ社製）を用い三重実験を行った。プライマーセットとしては以下のプライマーを用いた。
ヒトＧＡＰＤＨ；ＡＣＡＧＴＣＡＧＣＣＧＣＡＴＣＴＴＣＴＴ（配列番号１）
　　　　　　　ＡＣＧＡＣＣＡＡＡＴＣＣＧＴＴＧＡＣＴＣ（配列番号２）
ＴＴＮ;　　　　ＴＧＡＣＡＣＡＡＣＴＧＧＡＡＡＧＣＴＣＡ（配列番号３）
　　　　　　ＡＣＴＴＴＧＣＣＴＴＣＡＴＣＡＡＴＧＣＴＧ（配列番号４）
　遺伝子発現試験を行った患者の臨床特性を表５に、チチンの遺伝子発現を図４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　図４に示されるように、チチン遺伝子の発現量は、マイナーアレル遺伝子型の患者のリンパ球では、メジャーアレル遺伝子型の患者に比べて、有意に低いことが示された（Ｐ＝０．００２、一元配置分散分析、及びテューキー検定）。上記結果から、ＡＬＳ患者の末梢血を用いて、チチン発現量を解析することにより、急速進行型であるリスクを評価することができる。
　孤発性ＡＬＳ病態解明の基礎となるだけではなく、ＴＴＮ発現を指標として急速に進行するＡＬＳの病態を抑止する治療薬の開発することが可能となる。また、治験を行う際に、今回見出されたＳＮＰｓを割り付け因子として活用することができるため、治験薬の評価をより正確に行うことが可能となる。また、経過やその背景となる病態を予測することができるため、介護、ケアサポートプランを作成する際に、より適切なケアを行うことが可能となる。

Claims (11)

  1. 　ＡＬＳ患者の発症後の進行の類型を検査する方法であって、
    　ＡＬＳ患者のリファレンスＳＮＰ　ＩＤ番号：ｒｓ１２０５２９８３、ｒｓ２３１１４５８２、ｒｓ２３０３５３７、ｒｓ４８９４０２０、ｒｓ６４５３７０９、ｒｓ６００１７６、ｒｓ９５７８７５の少なくともいずれか１つの一塩基多型を検査し、
    　前記一塩基多型がマイナーアレルである場合に急速進行型のリスクが高いと判定することを特徴とする検査方法。
  2. 　ＡＬＳ患者の発症後の進行の類型を検査する方法であって、
    　ＡＬＳ患者のチチンの発現量を測定し、
    　チチン発現量が閾値より低い場合、急速進行型に進行するリスクが高いと判定することを特徴とする検査方法。
  3. 　請求項２に記載のＡＬＳ患者の発症後の進行の類型を検査する方法であって、
    　前記チチンの発現量は、ｍＲＮＡ及び／又はタンパク質発現量を測定することを特徴とする検査方法。
  4. 　請求項３に記載のＡＬＳ患者の発症後の進行の類型を検査する方法であって、
    　前記チチン発現量はｍＲＮＡ発現を定量的ＰＣＲで測定することを特徴とする検査方法。
  5. 　請求項３に記載のＡＬＳ患者の発症後の進行の類型を検査する方法であって、
    　前記チチンの発現量はタンパク質発現を抗チチン抗体によって測定することを特徴とする検査方法。
  6. 　請求項１～５いずれか１項記載のＡＬＳ患者の発症後の進行の類型を検査する方法であって、
    　患者から得られたリンパ球を用いて検査することを特徴とする検査方法。
  7. 　ＡＬＳ患者が急速進行型ＡＬＳに分類されるかを検査するキットであって、
    　リファレンスＳＮＰ　ＩＤ番号：ｒｓ１２０５２９８３、ｒｓ２３１１４５８２、ｒｓ２３０３５３７、ｒｓ４８９４０２０、ｒｓ６４５３７０９、ｒｓ６００１７６、ｒｓ９５７８７５の少なくともいずれか１つの一塩基多型を検出するためのＰＣＲプライマー、チチン発現量を解析するための定量的ＰＣＲプライマー、チチン発現量を定量するための抗体の少なくともいずれか１つを含むことを特徴とする検査キット。
  8. 　急速進行型ＡＬＳの進行を抑制する医薬をスクリーニングする方法であって、
    　被験物質を培養細胞に接触させ、
    　チチン発現量の増加を指標として選択することを特徴とするスクリーニング方法。
  9. 　請求項８に記載の急速進行型ＡＬＳの進行を抑制する医薬をスクリーニングする方法であって、
    　前記培養細胞がリファレンスＳＮＰ　ＩＤ番号：ｒｓ１２０５２９８３、ｒｓ２３１１４５８２、ｒｓ２３０３５３７、ｒｓ４８９４０２０、ｒｓ６４５３７０９、ｒｓ６００１７６、ｒｓ９５７８７５がマイナーホモアレルであることを特徴とするスクリーニング方法。
  10. 　請求項８又は９に記載のスクリーニング方法であって、
    　上記培養細胞が急速進行型ＡＬＳ患者の末梢血から樹立したリンパ球細胞株であることを特徴とするスクリーニング方法。
  11. 　請求項８～１０いずれか１項記載のスクリーニング方法であって、
    　前記チチン発現は、ｍＲＮＡ及び／又はタンパク質を測定することによることを特徴とするスクリーニング方法。
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