WO2015012315A1 - 末梢循環腫瘍細胞又は希少細胞分離用デバイス、及び末梢循環腫瘍細胞又は希少細胞分離方法 - Google Patents

末梢循環腫瘍細胞又は希少細胞分離用デバイス、及び末梢循環腫瘍細胞又は希少細胞分離方法 Download PDF

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Definitions

  • the present invention is a specific porous metal filter (hereinafter also simply referred to as “CTC separation filter”) for separating peripheral circulating tumor cells (Circulating Tumor Cell; hereinafter referred to as “CTC”) or rare cells in body fluids.
  • CTC separation filter a specific porous metal filter for separating peripheral circulating tumor cells (Circulating Tumor Cell; hereinafter referred to as “CTC”) or rare cells in body fluids.
  • CTC separation device for separating peripheral circulating tumor cells or rare cells.
  • the present invention further relates to a method for separating peripheral circulating tumor cells or rare cells from bodily fluids, comprising separating CTCs or rare cells from bodily fluids such as blood of cancer patients using the device.
  • CTC Tumor cells or cancer cells that circulate in the blood of cancer patients are called CTCs.
  • CTC is considered to be one of the causes of metastatic cancer, and it has been suggested that CTC detection may be effective for early diagnosis of metastatic cancer.
  • CTC is one of the rare cells and is extremely low in the blood, for example, about 1 per 10 8 to 10 9 blood cell components. For this reason, several methods for separating CTC have been proposed. .
  • separation methods include magnetic particles with anti-EpCAM (epithelial cell adhesion molecule) antibodies immobilized, or microfluidic devices with capture antibodies bound to resin surfaces such as columnar structures, and CTCs and blood cells
  • EpCAM epidermal cell adhesion molecule
  • microfluidic devices with capture antibodies bound to resin surfaces such as columnar structures, and CTCs and blood cells
  • a method of separating using a filter using a difference in size is known (Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology.
  • Sunitha Nagrath et al. Nature, 2007, 450: 1235-1239) JP 2011-163830, JP 2013-42689, JP 2005-10177, JP 2007-525642, JP 2009-106936).
  • the material of the filter is parylene (US Patent Application No. 20110111412 A1), polycarbonate (F. Farace et al., Br. J. Cancer, 2011, 105: 847-853 ), Etc., and a microfilter having a large number of pores of 7 to 10 ⁇ m on its surface.
  • the filter has a pore size that allows blood cells to pass through and capture CTC on the filter.
  • a preferable metal is selected from gold, silver, copper, aluminum, tungsten, nickel, chromium, stainless steel, or an alloy thereof.
  • the short side length is 5.0 to 15.0 ⁇ m
  • the average aperture ratio is 0.1 to 50%
  • the filter thickness is 3 to 100 ⁇ m.
  • a nickel filter average aperture ratio: 1.4%, pore size: 8 ⁇ 30 ⁇ m, pore shape: rounded rectangle
  • the cancer cell recovery rate is 74.9 ⁇ 10.5% and the remaining white blood cell count is 697 ⁇ 84.
  • the size-selective CTC concentrator using a filter as described in the background art above has advantages such as simplicity and low cost as compared with the magnetic bead method.
  • pretreatment is required to hemolyze the blood sample, and a pump is used as the driving force for filtration, cell stress is applied to CTC, and living cells are used for cell fixation and flow path closure. 1 cell sorting was difficult.
  • the present invention aims to achieve high-rate recovery of living CTCs or rare cells, and to enable simple and soft single living cell sorting.
  • the present invention includes the following features. [1] It has a dent that can capture peripheral circulating tumor cells or rare cells in body fluids, and a hole that is formed in the dent and allows the peripheral circulating tumor cells or body fluid cells other than the rare cells to pass therethrough.
  • Peripheral circulating tumor cell or rare cell separation device provided with a metal filter.
  • a bodily fluid selected from blood, ascites or peritoneal lavage fluid of a cancer patient is injected into the peripheral circulating tumor cell or rare cell separation device according to any one of [1] to [7], and the bodily fluid A peripheral circulating tumor cell or a rare cell separation method in which the peripheral circulating tumor cell or the rare cell therein is captured in the depression of the metal filter and then recovered alive.
  • the body fluid is mixed with the magnetic nanoparticle-containing cationic liposome, and the magnetic nanoparticles are incorporated into the peripheral circulating tumor cells or the rare cells and white blood cells in the body fluid.
  • MKN-45 cells were cultured for 3 days in a medium containing a small piece of metal filter, and the cytotoxicity of the metal filter was examined. Cell growth curves in the presence of a control, palladium (Pd) / nickel (Ni) alloy (80:20) filter and nickel (Ni) filter are shown. MKN-45 cells in the presence of Pd • Ni filter showed almost the same growth rate (low cytotoxicity) as the control. The Pd / Ni filter was clearly less cytotoxic than the Ni filter. MKN-45 cells were cultured for 3 days in a medium containing metal filter pieces, and the morphology of the cells was observed. 3 shows cell morphology on day 3.
  • MKN-45 cells in the presence of the Ni filter were rounder in shape than in the presence of the control or Pd ⁇ / Ni filter, and some apoptotic cells were also observed. It is a SEM image of 3D Pd * Ni filter. Indentation diameter 30 ⁇ m, indentation depth 10 ⁇ m, hole diameter 8 ⁇ m, hole density 99,178 / cm 2 (ultra-high hole density), houndstooth arrangement It is a SEM image of 3D Pd * Ni filter.
  • FIG. 1 It is a schematic diagram of the component of a device. It is a front view which shows typically the device which assembled each unit. It is a SEM image of the 3D filter which captured the cancer cell (arrow) in the hollow (the right is an enlarged view on the left).
  • the upper left is a GFP fluorescence image (cancer cell detection), and the upper right is a stained image (leukocyte detection) of a PE-labeled anti-CD45 antibody. Only a small number of white blood cells are observed, and no image of cancer cells and white blood cells coexisting in the same depression is observed.
  • the lower right is a bright-field image when a manipulator (glass capillary) is manually operated on the filter cassette and one cancer cell is collected.
  • the arrow is the manipulator.
  • a sample of 500 ml of cultured cancer cell sputum (COLM5-EGFP) mixed with 2.5 mL of healthy human blood and diluted 10-fold with PBS is filtered using a 3D Pd / Ni filter, and the cancer cells are changed by changing the flow rate of the device.
  • the recovery rate (%) of was investigated.
  • a sample of healthy human blood (2.5 mL) mixed with cultured cancer cell sputum (COLM5-EGFP) and diluted 10-fold with PBS is filtered using a 3D Pd ⁇ Ni filter, and the number of cancer cells is changed. The recovery rate (%) was examined.
  • the flow rate of the device is 2 ml / min.
  • Peripheral blood of a gastric cancer patient was filtered through a 3D Pd / Ni filter, and the cells were stained with a fluorescently labeled antibody.
  • the upper left is a stained image of Alexa488-labeled anti-EpCAM antibody
  • the upper right is a stained image of PE-labeled anti-CD45 antibody
  • the lower left is a stained image of Hoechst 33342
  • the lower right is a bright field image.
  • the arrow is CTC.
  • the peripheral blood of a breast cancer patient was filtered through a 3D Pd / Ni filter, and the cells were stained with a fluorescently labeled antibody.
  • Peripheral circulating tumor cells or metal filters that separate rare cells ⁇ CTC '' in this specification refers to circulating tumor cells contained in the blood of cancer patients and is much more in comparison with body fluid cells such as blood cells. A rare cell with a small number of cells.
  • rare cells refers to rare tumor cells (“rare cancer cells”) contained in body fluids such as ascites, peritoneal lavage fluid, lymph fluid, and spinal fluid of cancer patients.
  • the metal filter 17 of the present embodiment is a porous metal filter in which a very large number of holes (pore density of 1 ⁇ 10 4 / cm 2 or more) are uniformly or regularly formed in an ultrathin plate made of a specific metal.
  • a conventionally known CTC separation filter is formed from a resin (or polymer) such as parylene or polycarbonate, or silicon.
  • the CTC separation filter of the present embodiment is a metal filter 17, and has excellent characteristics different from a resin filter and the like as described below.
  • the material of the metal filter 17 includes, for example, at least one of palladium (Pd), platinum (Pt), gold (Au), silver (Ag), iridium (Ir), rhodium (Rh), and ruthenium (Ru). .
  • This material may be a single metal of palladium (Pd), platinum (Pt), gold (Au), silver (Ag), iridium (Ir), rhodium (Rh) or ruthenium (Ru) or, for example, palladium (Pd ) / Nickel (Ni) alloy, platinum (Pt) / nickel (Ni) alloy, or gold (Au) / nickel (Ni) alloy.
  • the ratio of the above metal is preferably large with respect to a counterpart metal such as nickel.
  • These metals for example, have very low toxicity to cells such as CTC and rare cells compared to metals such as nickel (Ni) (FIG. 1). This is because palladium (Pd) itself has low toxicity, and an alloy of Pd and nickel (Ni) can prevent elution of nickel (Ni) by forming a solid solution.
  • palladium or an alloy of palladium (Pd) / nickel (Ni) is preferable.
  • the metal filters of this embodiment such as Pd and Ni alloy filters and Pd filters are acid and heat resistant, and can be dyed in various ways such as the FISH method as they are. be able to.
  • the cells are hard and durable, and the cells are difficult to adhere without surface treatment, micromanipulation with a glass capillary on the filter is easy (FIG. 4B). Therefore, the metal filter 17 of the present embodiment has an excellent advantage that it can immediately cope with the automation of sorting of one cell.
  • the shape of the metal filter 17 is not particularly limited as long as it can be arranged on a filter ring (cassette) attached to the filtration unit of the CTC separation device, but includes, for example, a circular shape, a square shape, and preferably a circular shape.
  • the size of the metal filter 17 can be appropriately determined in consideration of physical factors such as sample (blood) volume, pore size, time, flow rate, pressure resistance, operability, cost, and the like. For example, when processing 5 mL of blood, the diameter (in the case of a circle) or the length and width (in the case of a rectangle) is usually about 10 to 15 mm, but the size is not limited depending on the blood volume For example, it may be in the range of about 5 to 20 mm.
  • the thickness of the metal filter 17 is appropriately determined in consideration of the relationship with the hole density, pressure resistance, cost, etc., and is usually 10 to 40 ⁇ m, preferably about 15 to 40 ⁇ m.
  • the metal filter 17 has a large number of holes 101 that are uniformly and regularly arranged.
  • the hole 101 is formed in a recess 102 described later.
  • the density of the holes 101 per 1 cm 2 of the filter surface area varies depending on the arrangement form such as a lattice arrangement or a staggered arrangement, but is usually 1 ⁇ 10 4 to 2 ⁇ 10 5 / cm 2 , preferably 5 ⁇ 10 4 to 1 ⁇ 10 5 / cm 2 .
  • the pore diameter of the hole 101 has a size that does not allow CTC or rare cells to pass therethrough and allows blood components such as blood cells to pass through body fluid cells other than CTC or rare cells.
  • the size (major axis) of human blood cell components is about 6-7 ⁇ m for red blood cells, about 7-9 ⁇ m for white blood cells, and less than 5 ⁇ m for platelets as a result of histogram analysis. About 10 to 20 ⁇ m. Therefore, the hole diameter of the hole 101 at the opening position to the recess 102 is usually about 7 to 10 ⁇ m, preferably about 7.5 to 9 ⁇ m, and more preferably about 7.5 to 8.5 ⁇ m.
  • the metal filter 17 further has a recess 102 (or a recess) having a size capable of capturing CTC or rare cells.
  • the size of the recess 102 may be any size that can be captured by CTC or rare cells.
  • the size is 20 to 30 ⁇ m in diameter and 5 to 15 ⁇ m in depth, preferably 25 to 30 ⁇ m in diameter and 10 ⁇ m in depth.
  • the recess 102 may be formed above all or a part of the holes 101, and such a form is preferable in order to maintain a high hole density. If the depth is less than 5 ⁇ m, CTC cannot enter. A depth of at least about 5-15 ⁇ m is required to allow CTC to penetrate almost completely.
  • the number of the depressions 102 is preferably 80 to 100%, more preferably 100% with respect to the number of the holes 101 (that is, the depressions 102 are present above all the holes 101).
  • the “regularly arranged” holes 101 in the metal filter 17 means that the holes 101 are arranged as densely as possible, and all the holes 101 are arranged with a specific regularity. .
  • regularity includes, for example, a lattice arrangement, a staggered arrangement, a radial arrangement, a concentric arrangement, and the like (FIGS. 2A, 2B, and 2C).
  • 2A and 2B (houndstooth arrangement) has a recess 102 having a depth of 10 ⁇ m formed in the upper portion of the hole 101 and has a three-dimensional structure as a whole. This filter is called a 3D filter.
  • 2C (lattice arrangement) has a recess having a depth of 1 ⁇ m at the top of the hole 101, but has a structure close to a plane as a whole. In this specification, the depth of such a recess is 5 ⁇ m.
  • a filter of the form below is called a 2D filter. This 2D filter corresponds to the size selection microcavity array described in FIG. 5 of JP 2011-163830 A. This 2D filter cavity is too shallow for the size of the CTC or rare cells, so the CTC or rare cells trapped in the pores cannot be isolated from the surrounding residual blood cells.
  • the metal filter 17 of the present embodiment is a 3D filter, and by providing the depression 102, 1) CTCs can be arrayed (patterned) one by one without contamination of blood cells, and 2) certain conditions.
  • the strength with which the cells are trapped in the hole 101 can be controlled.
  • Soft one-cell picking is possible (FIG. 4A).
  • the depth of the dent 102 is deep (over 15 ⁇ m)
  • there will be no effect on CTC recovery and filtration speed but conversely, one-cell patterning will be incomplete or resistance will be caused during picking. Can occur.
  • the peripheral edge of the metal filter 17 is edged without a hole.
  • the presence of the edge makes CTC measurements accurate and allows pinching with tweezers without damaging the metal filter 17.
  • the metal filter 17 may be slightly warped depending on the electroforming conditions by providing the depression 102, the warp can be corrected if the support material such as polycarbonate is edged by ultrasonic welding from above and below. is there.
  • the metal filter 17 of the present embodiment can be manufactured by using, for example, LIGA (Lithogaphie Galvanoformung Abfomung) technology (Hattori Tadashi, Surface Technology, Vol. 62, No. 12, 619-624, 2011; W. Elufeld and H. Lhe, Radiat. Phys. Chem., 45 (3): 340-365, 1995).
  • LIGA LiGA
  • a resist, an absorber (optional component), and a mask are stacked on a substrate, and a resist pattern is formed by irradiation with ultraviolet rays, X-rays, or synchrotron radiation, and then electroforming is performed using the substrate as an electrode.
  • An electroformed filter can be produced by a method including performing metal plating, finishing electroforming where a predetermined opening is left, and further removing the resist (see FIGS. 8A to 8F).
  • Peripheral circulating tumor cell (CTC) or rare cell separation device This embodiment further comprises a porous metal filter 17, a device for separating CTC or rare cells from body fluids such as blood. provide.
  • Porous metal filter 17 is as described in section 1 above.
  • a preferable filter is a palladium (Pd) filter or a palladium (Pd) / nickel (Ni) alloy filter.
  • the metal filter 17 is mounted so that the flow path is perpendicular to the metal filter 17.
  • the metal filter 17 is usually set to be removable or non-removable to the filter cassette 16, and the filter cassette 16 is fixed to the device.
  • the filter cassette 16 is composed of two upper and lower members (upper and lower filters) having an edge with an appropriate width for fixing the metal filter 17 and an open space inside.
  • the metal filter 17 is fixed between the members. If necessary, packing (for example, Teflon (registered trademark), rubber, paper, etc.) may be sandwiched between the member and the metal filter 17, thereby enabling deformation of the metal filter 17 and prevention of liquid leakage. (FIGS. 3B to 3C).
  • the members of the filter cassette 16 are made of a material such as resin (polymer), rubber, or metal, and the two members are provided with means for fixing the filter. Examples of such means include a screw groove.
  • the filter cassette 16 may have a structure in which the metal filter 17 is simply fixed (press-fit) with pressure from above and below.
  • the filter cassette 16 may be manufactured so that the metal filter 17 and the filter cassette 16 are integrated. In this case, the metal filter 17 is fixed to the filter cassette 16 so that it cannot be removed.
  • the device can further include a reservoir unit 10, a flow rate adjustment unit 12, and a drainage recovery unit 14 (a liquid reservoir base) in addition to a filtration unit 11 including a filter cassette 16 to which a metal filter 17 is attached (see FIG. 3A).
  • the reservoir unit 10 is a container for storing a body fluid sample such as blood.
  • the reservoir unit 10 is made of a material that can distinguish the liquid level such as glass or polymer (for example, transparent). You may have.
  • the filtration unit 11 is as described above and includes a filter cassette 16 for detachably mounting the metal filter 17.
  • the flow rate adjusting unit 12 has a device for adjusting the flow rate or flow rate of a body fluid such as blood that naturally flows down by its own weight (ie, gravity) through the filtration unit 11 including the reservoir unit 10 and the filter cassette 16.
  • a device for example, a screw-in type convex screw having a sharp-angled structure tip, and when the screw is tightened, the waste tube is squeezed and the flow rate is reduced or zero (stopped), while When opening the screw, the flow rate increases.
  • the screw is made of a material such as metal, resin, or polymer.
  • the drainage recovery unit 14 includes a container (a sump base) that collects body fluid such as blood after filtration, drainage when the device is washed, and the like.
  • the drainage recovery unit 14 is made of a material such as glass, resin, polymer, or metal.
  • the fixing between the units may be performed using, for example, a screw mechanism 9 (FIG. 3A) that is attached or removed by rotation, or may be performed using a plug-in gap fitting 18 (FIG. 3C).
  • a screw mechanism 9 FIG. 3A
  • a plug-in gap fitting 18 FIG. 3C
  • other conventional fixtures may be used.
  • a stand for installing a structure in which the units are assembled can be provided.
  • FIG. 3A An example of the device is shown in FIG. 3A (appearance), FIG. 3B (component), and FIG. 3C (front view of the device during assembly).
  • the filtration unit 11 includes a filter cassette 16.
  • the flow rate adjusting unit 12 includes a liquid amount adjusting screw 8.
  • the drainage recovery unit 14 is provided with a liquid storage lid 13 on the upper surface and an air hole 7 on the upper side surface.
  • the device further includes a stand 15.
  • the device is preferably formed of a resin or polymer such as acrylic as a whole in terms of ease of processing and cost.
  • a transparent material is preferable because the flow rate of the liquid can be monitored.
  • the size of the device is about 10 to 15 cm in width and about 20 to 30 cm in height for an assembled structure excluding the stand 15, and is a size suitable for filtering a blood sample of about 5 to 7.5 ⁇ mL. Even if the sample volume is large, this size can be adequately handled by applying it in small portions.
  • the above description is the specifications of the prototype, and the mass production type is separately manufactured based on the prototype, and is made of a material such as resin or plastic. Production is possible.
  • the device of the present embodiment is a pumpless (that is, no pump used) system that obtains a flow rate for filtration by its own weight (gravity), and is therefore a release system. This is different from the driving force of the pump type or negative pressure tube type employed in the known filter type CTC separation device.
  • these conventional methods there are problems such as applying stress to the cells, fixing the cells, and making it difficult to sort one living cell due to the closing of the flow path. Can solve such a problem.
  • the device of this embodiment is applied to the metal filter 17 such as palladium, which has very low toxicity to cells, the ultra-high pore density of the metal filter 17, flat surface processing, and 3D conversion of the metal filter 17, thereby Even without pretreatment of bodily fluids, high-speed filtration of blood cells was enabled while maintaining a relatively low flow rate at which CTC or rare cells were trapped in the pore 101. Specifically, the flow rate through the hole 101 is relatively slow while high-speed filtration in about 30 minutes including washing is possible for 5 ml of whole blood. In addition, since the surface properties of the pore 101 are extremely smooth, stress and damage to cells are low. As a result, CTCs or rare cells can be aligned in a state where there is little contamination such as blood cells.
  • the metal filter 17 such as palladium
  • CTC Peripheral Circulating Tumor Cell
  • Rare Cell Separation Method This embodiment further provides a method for separating CTC or rare cells from body fluid of cancer patients using a device equipped with the metal filter 17 described above. .
  • this method involves injecting a body fluid selected from, for example, blood, ascites, peritoneal lavage fluid, cerebrospinal fluid or lymph fluid of a cancer patient into the device of this embodiment, and a flow rate that relies solely on gravity.
  • a body fluid selected from, for example, blood, ascites, peritoneal lavage fluid, cerebrospinal fluid or lymph fluid of a cancer patient
  • a flow rate that relies solely on gravity.
  • the body fluid of a cancer patient as a specimen is a body fluid containing CTC or rare cells or suspected of containing CTC or rare cells, and is mainly blood or lymph.
  • the amount (volume) of body fluid used for separation of CTC or rare cells is usually 1 to 20 mL, preferably 3 to 7 mL.
  • body fluid particularly blood
  • PBS phosphate buffered saline
  • PBS PBS containing 0.25 to 1 mM EDTA depending on the purpose
  • the following pretreatment may be performed.
  • the pretreatment is performed, for example, by mixing a body fluid with a magnetic nanoparticle-containing cationic liposome (MCL) and incorporating the magnetic nanoparticles into CTC or rare cells and leukocytes in the body fluid, and then the metal filter of this embodiment.
  • MCL magnetic nanoparticle-containing cationic liposome
  • This method includes removing cells such as erythrocytes that are not magnetized with a magnet disposed in the middle of the flow path from the body fluid (prefilter). This utilizes the property that magnetic nanoparticles are not normally taken up by red blood cells, whereas magnetic nanoparticles are taken up by CTC or rare cells or white blood cells.
  • This method is a simple method of injecting body fluid into the device and filtering by gravity flow rate, but it is a 3D metal with ultra-high pore density (eg 5 ⁇ 10 4 to 1.5 ⁇ 10 5 / cm 2 )
  • a sufficiently rapid process that is acceptable can be achieved.
  • about 5.0 mL of specimen (whole blood) can be processed in about 30 minutes including washing.
  • the washing solution uses phosphate buffered saline (PBS), but may contain EDTA if necessary.
  • a fluorescently labeled antibody that specifically binds to CTC or rare cells such as Alexa488-labeled anti-EpCAM antibody or PE label that specifically binds to leukocytes.
  • an antibody mixture such as an anti-CD45 antibody
  • CTC or rare cells are stained, and the number of CTC or rare cells is measured with a microscope. At this time, the staining can be performed directly on the metal filter 17 fixed to the device.
  • the FISH method for examining the presence or absence of gene amplification can be performed by removing the metal filter 17 from the filter cassette 16 and fixing it as it is.
  • the 3D-Pd / Ni alloy filter device of the present embodiment can also be used for measuring CTC in the peripheral blood of cancer-bearing mice.
  • the present inventors have developed a CTC model (mouse) that can detect CTC with high reproducibility using a subcutaneous transplantation natural metastasis model such as a GFP-introduced colon cancer cell line (COLM5-EGFP) and a gastric cancer cell line (GCIY-EGFP). Multiple strains were prepared.
  • the mouse vena cava blood 1 to 3 months after transplantation was collected and filtered with the 3D-Pd / Ni alloy filter device of this embodiment, and the number of CTCs was measured using GFP fluorescence as an index.
  • the method of this embodiment can be expected to play an important role in both the diagnosis and treatment of metastatic cancer, such as early diagnosis of metastasis recurrence, companion diagnosis and evaluation of therapeutic effects of drugs.
  • the device and method of the present embodiment are expected to be useful for basic research such as elucidation of metastasis mechanisms such as CTC in vivo.
  • Example 1 [Production method of palladium / nickel filter] As shown in FIG. 8A, a photosensitive resist 20 was applied to the substrate 19 to a predetermined thickness.
  • a conductive film layer for example, copper
  • a conductive material such as a stainless steel substrate, a nickel substrate, or a copper substrate may be used.
  • a photosensitive resist 20 was patterned on the substrate 19 through a development process.
  • a deposited film 23 of palladium / nickel alloy (Pd: Ni weight ratio, for example, 80:20) is deposited from the surface of the substrate 19 by electroforming and patterned.
  • the Pd / Ni deposition film 23 was continuously deposited by electroforming so as to cover the photosensitive resist 20, and the electroforming was terminated when a predetermined hole 24 was left.
  • the formed photosensitive resist 20 was removed with an organic solvent.
  • This photosensitive resist 20 may be removed by dry etching using oxygen plasma.
  • the substrate 19 was peeled off or removed by etching.
  • a palladium / nickel filter also referred to as “3D filter” or “Pd / Ni filter” was produced.
  • Example 2 [Characteristics of palladium / nickel filters] Since this palladium / nickel filter is manufactured by microfabrication using a unique and advanced electroforming technology, it has a high pore density of more than 100,000 / cm 2 and 10% or more compared to other polycarbonate, parylene or silicon filters. Usually, high aperture ratio of 50% or more can be achieved. As a result, high-speed filtration of whole blood became possible, and CTC could be collected at a high rate and quickly without clogging (FIGS. 2A and 2B). In addition, high-precision processing such as smooth surface properties and uniformity of pores and the use of palladium, which has low cytotoxicity, can significantly reduce cell damage (FIGS. 1A and 1B).
  • this palladium / nickel filter can be heat-treated at 121 ° C for 30 minutes (Autoclave), and in chemical resistance tests (1 hour) with hypochlorous acid (commercially 1% hyter) and 1N hydrochloric acid. There was no change in shape, and there was no change in functionality such as CTC recovery. As a result, sterilization can be performed, and cost reduction such as use and reuse in the medical field can be achieved.
  • Example 3 [Cell Spike experiment using cultured cancer cells] Human gastric cancer cells MKN-45, GCIY and human colon cancer cells COLM-5 were seeded in RPMI medium containing 10% fetal bovine serum so that the concentration was 1.0 ⁇ 10 6 cells / 10 cm dish, and the temperature was 37 ° C. / Static culture was performed under 5% CO 2 . After 3 to 4 days of culture, the medium was removed by suction, washed with PBS (pH 7.2), 0.2% trypsin / 2 mM EDTA was added, and the mixture was incubated at 37 ° C./5% CO 2 for 3 to 5 minutes. .
  • RPMI medium containing serum was added to stop the action of trypsin, and then pipetting was performed to collect the cells.
  • the collected cells were centrifuged (1200 rpm, 3 minutes), the supernatant was aspirated and resuspended in fresh RPMI medium.
  • the number of viable cells was counted by a dye exclusion method using trypan blue, adjusted to 1 ⁇ 10 6 cells / ml, and then seeded on a new dish.
  • COLM5-EGFP cells which are cell lines in which the green fluorescent protein (GFP) gene is forcibly expressed in human colon cancer cells COLM-5 and human gastric cancer cells GCIY.
  • GFP cells were used.
  • 50 to 500 or 5000 cultured cancer cells were mixed with 2 to 2.5 ml of blood collected from a healthy person into a vacuum blood collection tube containing EDTA2Na to prepare a sample. .
  • the fluid volume adjusting screw is tightened, the flow path is closed, and 500 ⁇ l of cell staining solution (Alexa488-labeled anti-EpCAM antibody, PE-labeled anti-CD45 antibody and Hoechst 33342, 0.5 ⁇ g / ml each).
  • cell staining solution Alexa488-labeled anti-EpCAM antibody, PE-labeled anti-CD45 antibody and Hoechst 33342, 0.5 ⁇ g / ml each.
  • the latter two cell staining solutions were introduced. After reacting at room temperature for 30 minutes with light shielding, the liquid volume adjusting screw was opened and the cell staining solution was discharged.
  • the cells on the filter were washed by introducing PBS containing 5 ml of 1 mM EDTA / 0.5% BSA into the reservoir. Perform this operation once more with PBS alone, tighten the liquid volume adjustment screw, then immediately remove the filter cassette from the CTC separation device, add 100-200 ⁇ l PBS to the liquid reservoir at the top of the filter cassette, and place it on the microscope stage. The fluorescence microscope observation was performed as it was.
  • an upright reflection fluorescent microscope (Eclipse LV100ND; Nikon) equipped with a cooled CCD camera (Ri-1; Nikon) was used. Images were acquired using UV-1A, FITC, and Cy3 filters, respectively, to observe fluorescence from Hoechst 33342, Alexa 488, and PE. NIS-Elements (Nikon) was used as image acquisition and analysis software.
  • the CTC separation device equipped with the 3D filter has a liquid amount adjusting screw, and the flow rate can be controlled by adjusting the amount of liquid flowing by its own weight.
  • the flow rate is changed to 2 ml / min, 4 ml / min, or 8 ml / min using 10-fold diluted blood mixed with 500 cultured cancer cells (2.5 ml of blood diluted 10-fold with PBS) The recovery rate was examined.
  • a Pd / Ni filter having a depression diameter of 30 ⁇ m, a depression depth of 10 ⁇ m, a hole diameter of 8 ⁇ m, a hole density of 99,178 / cm 2 , and a staggered lattice arrangement was used.
  • high recovery rates of about 90% and 80% were exhibited at 2 ml / min and 4 ml / min, respectively, but at 8 ml / min, the recovery rate was 70% or less. Since it was found that a recovery rate of 80 to 90% can be obtained at a flow rate of 2 to 4 ml / min, the subsequent experiments were conducted at a flow rate in this range (FIG. 5A).
  • the flow rate of the device is 2 ml / min.
  • the recovery rate from diluted blood mixed with 50 cells, 500 cells, and 5000 cells was 85 to 95% (FIG. 5B).
  • the recovery rate from diluted blood mixed with only 10 cells was 70% on average, and it was shown that even when a small number of cells were taken into consideration, the recovery rate was high even when the number of cells was counted.
  • the metal filter is processed into a 3D shape having a recess in the upper part of the through hole as shown in FIG. 2A.
  • This shape is preferably 20 to 30 ⁇ m in diameter and 5 to 15 ⁇ m in depth.
  • the hollow is most recovered when the diameter is 30 ⁇ m. It was easy.
  • FIG. 4B shows a bright-field image when one cancer cell is collected with a manipulator.
  • Example 4 [Separation of CTC from CTC model mouse] Since in vitro cultured cells and in vivo CTC have significantly different cell living environments, it is difficult to accurately evaluate the performance of the CTC separation device only by the Cell Spike experiment in which cultured cancer cells are added to the blood of healthy persons. On the other hand, for patient clinical specimens, it is difficult to evaluate the performance of a device unless many cases with different degrees of cancer progression (Stage) are collected, measured, and statistically analyzed. On the other hand, if there is a mouse in which CTC appears reproducibly with time after cancer cell transplantation (hereinafter referred to as “CTC model mouse”), rapid and accurate evaluation of the performance of the CTC separation device can be expected. .
  • the CTC model mouse is also extremely useful for basic research of CTC, such as analysis of CTC in vivo dynamics. Therefore, a CTC model mouse was independently produced.
  • lung metastases are limited to a small number of micrometastasis until 1 to 2 months after transplantation, and the number of CTCs is almost 0 (zero), rarely 1 to 2 CTCs are detected. It was the degree that was done.
  • lung metastases are also observed macroscopically, and a small number of metastases are also observed in the liver and kidneys. At this time, about 10 to 100 CTCs are detected, and more than 1000 are detected. CTCs were detected (results are shown in FIGS. 6A and 6B).
  • CTCs were detected in accordance with the appearance of gross and systemic metastases.
  • this device was also used for experiments in a lung cancer model using the mouse Lewis lung cancer cell line (Lewis-GFP), and it was revealed that the appearance of CTC was synchronized with multi-organ metastasis to the liver, kidney, and the like. Since CTC appears synchronously with gross metastasis and systemic metastasis, it was suggested that CTC detection may be useful for early diagnosis of cancer metastasis.
  • studies using CTC model mice showed that this device has sufficient sensitivity and accuracy to accurately capture the in-vivo dynamics of CTC.
  • Example 5 [Separation of CTC from peripheral blood of gastric cancer patients and breast cancer patients] 5 ml of blood was collected from the elbow vein of 4 gastric cancer patients, 6 breast cancer patients, and 4 healthy persons using a blood collection tube containing EDTA2Na.
  • Four stomach cancer patients and six breast cancer patients are patients admitted to Aichi Cancer Center Central Hospital (Nagoya, Japan). Blood collection from the patients was approved by the Aichi Cancer Center Ethics Committee (Nagoya, Japan), and the consent was obtained from the patients.
  • a 3D Pd ⁇ Ni filter having a recess diameter of 24 ⁇ m, a recess depth of 10 ⁇ m, a hole diameter of 8 ⁇ m, and a hole density of 136,325 / cm 2 was used. Filtration was performed at a flow rate of 2.5 ml / min.
  • the cells on the filter cassette were washed with PBS, fixed with 10% formalin for 10 minutes at room temperature, washed, and then stained with Alexa488-labeled anti-EpCAM antibody, PE-labeled anti-CD45 antibody, and optionally Alexa350-labeled anti-CK Oscar antibody.
  • the solution was added onto the filter cassette and allowed to react for 30 minutes at room temperature. Further, after washing with PBS, nuclear staining was performed with Hoechst 33342. After washing with PBS, the entire filter cassette was transferred to an upright fluorescent microscope, EpCAM + / (CK Oscar + ) / CD45 ⁇ / Hoechst 33342 + cells were determined as CTC, and the number of CTCs was counted.
  • FIG. 7A shows a stained image of a stomach cancer patient
  • FIG. 7B shows a stained image of a breast cancer patient
  • FIG. 7C shows the measurement result of the number of CTCs.
  • Example 6 [Combination of magnetic separation of cells by magnetic nanoparticles] Aiming for total recovery of CTC using gastric cancer cell N87, combined with magnetic separation using magnetic nanoparticles (pretreatment) and separation by size using 3D Pd / Ni filter to improve recovery rate Tried.
  • Magnetic Cationic Liposome (diameter 150 nm) 100 pg / cell was allowed to act on a suspension of 100 N87 cells for 2 hours, mixed with bovine serum containing 200,000 white blood cells, and then combined with a magnetic separation channel and a filter. Captured with device. Approximately 80 to 90% of cells could be captured and recovered, and an improvement in recovery rate was observed compared to the filter alone.
  • the device equipped with the metal filter of the present invention achieves the separation of CTC or rare cells in body fluids such as blood at a high recovery rate, and CTC or rare cells can be collected in an almost intact state. It can be used for genetic analysis of single CTC cells as well as evaluation of the number, and may be used effectively for early diagnosis of metastatic recurrence, monitoring of therapeutic effects, and Liquid biopsy (fluid biopsy) high.

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Abstract

　末梢循環腫瘍細胞又は希少細胞分離用デバイスは、体液中の末梢循環腫瘍細胞又は希少細胞を捕捉することができる窪みと、該窪みに形成され末梢循環腫瘍細胞又は希少細胞以外の体液細胞を通過させることができる孔とを有する金属フィルターを備える。

Description

末梢循環腫瘍細胞又は希少細胞分離用デバイス、及び末梢循環腫瘍細胞又は希少細胞分離方法
　本発明は、体液中の末梢循環腫瘍細胞(Circulating Tumor Cell;以下「CTC」とも称する)又は希少細胞を分離するための、特定の多孔性金属フィルター（以下、単に「CTC分離フィルター」とも称する）を備えた末梢循環腫瘍細胞又は希少細胞分離用デバイス（以下、単に「CTC分離デバイス」とも称する）に関する。
　本発明はさらに、前記デバイスを用いて、がん患者の血液等の体液からCTC又は希少細胞を分離することを含む、体液からの末梢循環腫瘍細胞又は希少細胞分離方法に関する。
　がん患者の血液中を循環する腫瘍細胞又はがん細胞はCTCと呼ばれている。CTCは、転移がんの原因の一つであると考えられており、CTC検出が転移がんの早期診断に有効であるかもしれないという示唆がされている。しかし、CTCは、希少細胞の1つであり、血中に極めて少なく、例えば血球成分108～109個あたり約1個であり、このため、いくつかのCTCの分離法が提案されてきた。例えば、分離法には、抗EpCAM（上皮細胞接着分子）抗体を固定化した磁性粒子、又は柱状構造などの樹脂表面にキャプチャー抗体を結合させたマイクロ流体デバイスを利用する方法、さらにCTCと血球細胞のサイズの違いを利用してフィルターを用いて分離する方法などが知られている（Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology. Sunitha Nagrath et al. Nature, 2007, 450: 1235-1239）、（特開2011-163830号公報、特開2013-42689号公報、特開2005-10177号公報、特表2007-525642号公報、特開2009-106936号公報）。
　フィルターを利用するCTC分離方法では、フィルターの材質が、パリレン(parylene)（米国特許出願第20110111412 A1号）、ポリカーボネート（F. Farace et al., Br. J. Cancer, 2011, 105: 847-853）などのポリマー、シリコン、金属（特開2013-42689号公報）などからなり、その表面上に7～10μmの孔を多数有するマイクロフィルターが使用される。原理的には、フィルターは、血液細胞を通過させ、CTCをフィルター上に捕捉する孔サイズを有する。
　特開2013-42689号公報に記載される金属フィルターでは、好ましい金属として、金、銀、銅、アルミニウム、タングステン、ニッケル、クロム、ステンレス又はこれらの合金から選択され、また、好ましくは、貫通孔の短辺の長さが5.0～15.0μmであり、平均開口率が0.1～50％であり、フィルターの厚さが3～100μmである。その実施例では、ニッケルフィルター（平均開口率：1.4％、孔の大きさ：8×30μm、孔の形状：角丸長方形）を使用して、血液中にスパイクしたヒト小細胞肺がん細胞株を回収している。その実験において、がん細胞回収率が74.9±10.5％であり、残存白血球数が697±84であると記載されている。
　上記の背景技術に記載したような、フィルターを用いたサイズ選択性CTC濃縮装置は、磁気ビーズ方式と比べて、簡便、低コストなどの利点を有する。しかしながら、検体である血液を溶血する前処理を必要としたり、濾過の駆動力としてポンプを使用するため、CTCに細胞ストレスを与えたり、細胞の固定や、流路の閉鎖性のために生細胞の１細胞分取が困難であった。
　本発明は、上記事実を考慮して、生きたCTC又は希少細胞の高率な回収を達成し、さらに簡便、ソフトな１生細胞分取を可能にすることを目的とする。
　本発明は、以下の特徴を包含する。
　[1] 体液中の末梢循環腫瘍細胞又は希少細胞を捕捉することができる窪みと、該窪みに形成され前記末梢循環腫瘍細胞又は前記希少細胞以外の体液細胞を通過させることができる孔とを有する金属フィルターを備えた末梢循環腫瘍細胞又は希少細胞分離用デバイス。
　[2] 前記フィルターの金属材質が、パラジウム又はパラジウム・ニッケル合金である[1]に記載の末梢循環腫瘍細胞又は希少細胞分離用デバイス。
　[3] 前記窪みの直径は20～30μmであり、前記窪みの深さは5～15μmである[1]又は[2]に記載の末梢循環腫瘍細胞又は希少細胞分離用デバイス。
　[4] 前記孔の直径は7～10μmである[1]～[3]のいずれか１つに記載の末梢循環腫瘍細胞又は希少細胞分離用デバイス。
　[5] 前記窪み及び前記孔の孔密度は1cm2あたり1×104～2×105個である[1]～[4]のいずれか１つに記載の末梢循環腫瘍細胞又は希少細胞分離用デバイス。
　[6] 前記金属フィルターの厚さは、10～40μmである[1]～[5]のいずれかに記載の末梢循環腫瘍細胞又は希少細胞分離用デバイス。
　[7] 前記金属フィルターを装着するためのフィルターカセットを有する[1]～[6]のいずれかに記載の末梢循環腫瘍細胞又は希少細胞分離用デバイス。
　[8] [1]～[7]のいずれかに記載の末梢循環腫瘍細胞又は希少細胞分離用デバイスに、がん患者の血液、腹水又は腹腔洗浄液から選択される体液を注入して、該体液中の前記末梢循環腫瘍細胞又は前記希少細胞を、前記金属フィルターの前記窪みで捕捉した後、生きたまま回収する末梢循環腫瘍細胞又は希少細胞分離方法。
　[9] 前記末梢循環腫瘍細胞又は前記希少細胞を特異的に染色することをさらに含む、[8]に記載の末梢循環腫瘍細胞又は希少細胞分離方法。
　[10] 前記体液を希釈又は前処理することを含む、[8]又は[9]に記載の末梢循環腫瘍細胞又は希少細胞分離方法。
　[11] 前記前処理が、前記体液を磁性ナノ粒子含有カチオン性リポソームと混合して、前記体液中の前記末梢循環腫瘍細胞又は前記希少細胞及び白血球細胞中に前記磁性ナノ粒子を取り込ませたのち、前記金属フィルターに通じる流路に流し込み、前記金属フィルターの前に配置された磁石で磁性ナノ粒子を取り込まない赤血球等の細胞を該体液から除去することを含む、[10]に記載の末梢循環腫瘍細胞又は希少細胞分離方法。
　本発明によれば、生きたCTC又は希少細胞の高率な回収を達成し、さらに簡便、ソフトな１生細胞分取を可能にすることができる。
金属フィルター小片を含む培地中で、ＭＫＮ－４５細胞を３日間培養し、金属フィルターの細胞毒性を調べた。対照、パラジウム（Ｐｄ）・ニッケル（Ｎｉ）合金（８０：２０）フィルター存在下、及びニッケル（Ｎｉ）フィルター存在下の細胞増殖曲線を示す。Ｐｄ・Ｎｉフィルター存在下のＭＫＮ－４５細胞は、対照とほぼ同じ増殖速度（低細胞毒性）を示した。Ｐｄ・Ｎｉフィルターは、Ｎｉフィルターと比べると、細胞毒性が明らかに低かった。 金属フィルター小片を含む培地中で、ＭＫＮ－４５細胞を３日間培養し、細胞の形態を観察した。３日目の細胞の形態を示す。Ｎｉフィルター存在下のＭＫＮ－４５細胞は、対照やＰｄ ・Ｎｉフィルター存在下に比べて形態が丸くなり、一部にＡｐｏｐｔｏｔｉｃな細胞も見られた。 ３Ｄ Ｐｄ・ＮｉフィルターのＳＥＭ像である。窪みの直径３０μｍ、窪みの深さ１０μｍ、孔の直径８μｍ、孔密度９９，１７８／ｃｍ２（超高孔密度）、千鳥格子配列 ３Ｄ Ｐｄ・ＮｉフィルターのＳＥＭ像である。窪みの直径３０μｍ、窪みの深さ１０μｍ、孔の直径８μｍ、孔密度７１，６５６／ｃｍ２（高孔密度）、千鳥格子配列 ２Ｄ Ｐｄ・ＮｉフィルターフィルターのＳＥＭ像である。窪みの直径３０μｍ、窪みの深さ１μｍ、孔の直径８μｍ、孔密度４０，０００／ｃｍ２、格子配列 市販のポリカーボネートフィルター（孔径８μｍ、 Ｗｈａｔｍａｎ社）のＳＥＭ像である。 図２Ａに示される金属フィルターを模式的に示す断面図である。 デバイスの外観の模式図である。デバイスは、例えば、幅１５ｃｍ、奥行き１２ｃｍ、高さ２２ｃｍである。 デバイスの構成部品の模式図である。 各ユニットを組み立てたデバイスを模式的に示す正面図である。 窪みにがん細胞（矢印）を捕捉した３ＤフィルターのＳＥＭ像である（右は左の拡大図）。 １０倍希釈した健常人血液２ｍＬに培養がん細胞（ＣＯＬＭ５－ＥＧＦＰ）５００個を混ぜＰＢＳで１０倍に希釈した試料を、３Ｄ Ｐｄ・Ｎｉフィルター（窪みの直径３０μｍ、窪みの深さ１０μｍ、孔の直径８μｍ、孔密度９９，１７８／ｃｍ２、千鳥格子配列）で濾過し、細胞をＰＥ標識抗ＣＤ４５抗体で染色した。左上は、ＧＦＰ蛍光像（がん細胞検出）、右上は、ＰＥ標識抗ＣＤ４５抗体の染色像（白血球検出）である。白血球は少数しか認められず、がん細胞と白血球が同一の窪みに共在する像は認められない。右下は、フィルターカセット上でマニピュレーター（ガラスキャピラリー）を手動で操作し、がん細胞を１細胞分取しているときの明視野像である。矢印はマニピュレーターである。 健常人血液２．５ｍＬに培養がん細胞 (ＣＯＬＭ５－ＥＧＦＰ）５００個を混ぜＰＢＳで１０倍に希釈した試料を、３Ｄ Ｐｄ・Ｎｉフィルターを用いて濾過し、デバイスの流速を変えてがん細胞の回収率（％）を調べた。 健常人血液２．５ｍＬに培養がん細胞 (ＣＯＬＭ５－ＥＧＦＰ）を混ぜＰＢＳで１０倍に希釈した試料を、３Ｄ Ｐｄ・Ｎｉフィルターを用いて濾過し、がん細胞数を変えてがん細胞の回収率（％）を調べた。デバイスの流速は２ｍｌ／ｍｉｎである。 培養がん細胞 (ＣＯＬＭ５－ＥＧＦＰ）を皮下移植したヌードマウスから移植３か月後に採血した血液を、３Ｄ Ｐｄ・Ｎｉフィルターで濾過し、ＧＦＰ蛍光を観察した。左はＧＦＰ蛍光像、右は位相差顕微鏡の明視野像である。矢印はＣＴＣである。 培養がん細胞 (ＣＯＬＭ５－ＥＧＦＰ）を皮下移植したヌードマウスから、移植１～２か月後及び２～３か月後に採血した血液を、３Ｄ Ｐｄ・Ｎｉフィルターで濾過し、ＣＴＣ数を測定した。 胃がん患者の末梢血を３Ｄ Ｐｄ・Ｎｉフィルターで濾過し、細胞を蛍光標識抗体で染色した。左上はＡｌｅｘａ４８８標識抗ＥｐＣＡＭ抗体の染色像、右上はＰＥ標識抗ＣＤ４５抗体の染色像、左下はＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２の染色像、右下は明視野像である。矢印はＣＴＣである。 乳がん患者の末梢血を３Ｄ Ｐｄ・Ｎｉフィルターで濾過し、細胞を蛍光標識抗体で染色した。左から順に、Ａｌｅｘａ４８８標識抗ＥｐＣＡＭ抗体の染色像、ＰＥ標識抗ＣＤ４５抗体の染色像、Ａｌｅｘａ３５０標識抗ＣＫ Ｏｓｃａｒ抗体の染色像、明視野像である。矢印はＣＴＣである。 進行乳がん患者（６名）、進行胃がん患者（４名）、及び健常人（４名）の末梢血５ｍＬ中のＣＴＣ数を測定した。 Ｘ線又は紫外線によるリソグラフィー、及び電鋳を利用したパラジウム・ニッケルフィルターの作製方法を説明する模式図である。 Ｘ線又は紫外線によるリソグラフィー、及び電鋳を利用したパラジウム・ニッケルフィルターの作製方法を説明する模式図である。 Ｘ線又は紫外線によるリソグラフィー、及び電鋳を利用したパラジウム・ニッケルフィルターの作製方法を説明する模式図である。 Ｘ線又は紫外線によるリソグラフィー、及び電鋳を利用したパラジウム・ニッケルフィルターの作製方法を説明する模式図である。 Ｘ線又は紫外線によるリソグラフィー、及び電鋳を利用したパラジウム・ニッケルフィルターの作製方法を説明する模式図である。 Ｘ線又は紫外線によるリソグラフィー、及び電鋳を利用したパラジウム・ニッケルフィルターの作製方法を説明する模式図である。
　本発明の実施形態について詳細に説明する。
１．末梢循環腫瘍細胞(CTC)又は希少細胞を分離する金属フィルター
　本明細書中の「CTC」とは、がん患者の血液に含まれる循環腫瘍細胞であり、血液細胞等の体液細胞に比べて非常に細胞数が少ない希少な細胞をいう。
　本明細書中の「希少細胞」とは、がん患者の腹水、腹腔洗浄液、リンパ液、髄液などの体液に含まれる希少な腫瘍細胞（「希少がん細胞」）をいう。
　本実施形態の金属フィルター17は、特定の金属からなる極薄板に非常に多数の孔（孔密度1×104 /cm2以上）が均一に又は規則的に形成された多孔性金属フィルターである。従来公知のCTC分離フィルターは、パリレン(parylene)、ポリカーボネートなどの樹脂（又はポリマー）、シリコンから形成されたものである。これに対し、本実施形態のCTC分離フィルターは、金属フィルター17であり、以下に記載するような、樹脂フィルター等と異なる優れた特性を有している。
　金属フィルター17の材質は、例えばパラジウム(Pd)、白金(Pt)、金(Au)、銀(Ag)、イリジウム(Ir)、ロジウム(Rh)又はルテニウム(Ru)の少なくともいずれか１つを含む。この材質は、パラジウム(Pd)、白金(Pt)、金(Au)、銀(Ag)、イリジウム(Ir)、ロジウム(Rh)又はルテニウム(Ru)の単体金属でもよく、又は例えば、パラジウム(Pd)・ニッケル(Ni)合金、白金(Pt)・ニッケル(Ni)合金、又は金(Au)・ニッケル(Ni)合金等でもよい。合金の場合、好ましくは、ニッケルなどの相手金属に対し、上記の金属の比率が多い。これらの金属は、例えばニッケル(Ni)などの金属と比べると、CTC、希少細胞などの細胞に対する毒性が非常に低い（図１）。理由としては、パラジウム(Pd)自体の毒性が低いことと、Pdとニッケル(Ni)の合金は固溶体を形成することによりニッケル(Ni)の溶出を防ぐことができるからである。これらのうち、金属コスト、低毒性の点で、パラジウム又はパラジウム(Pd)・ニッケル(Ni)の合金が好ましく、Pd・Ni合金の場合、Pdが50％（重量）超である合金、例えばPd80％・Ni20％の合金が好ましい。PdとNiの合金フィルター、Pdフィルターなどの本実施形態の金属フィルターは、耐酸性、耐熱性であり、フィルターのままFISH法などの種々の染色が可能であり、そのまま（正立）顕微鏡観察することができる。また、硬性かつ耐久性が高く、表面処理なしでも細胞が接着しにくいためフィルター上のガラスキャピラリーによるマイクロマニピュレーション(micromanipulation)が容易である（図４Ｂ）。そのため、本実施形態の金属フィルター17は、１細胞分取の自動化に直ちに対応可能であるという優れた利点を有している。
　金属フィルター17の形状は、CTC分離デバイスの濾過ユニットに装着されるフィルターリング（カセット）に配置可能であれば特に限定されないが、例えば円形、方形などの形状を含み、好ましくは、円形である。また、金属フィルター17のサイズは、サンプル（血液）量、孔径、時間、流速、耐圧などの物理的ファクター、操作性、コストなどを考慮して適宜決定されうる。例えば血液5mLを処理する場合、直径（円形の場合）、又は、縦、横の長さ（方形の場合）が、通常、約10～15mmであるが、血液量に応じてサイズを、非限定的に、例えば約5～20mmの範囲とすることもできる。また、金属フィルター17の厚さは、孔密度、耐圧、コストなどとの関係を考慮して適宜決定されるものとし、通常、10～40μm、好ましくは約15～40μmである。
　図２Ａ，図２Ｂ，図２Ｅに示されるように、金属フィルター17は、均一で規則的に配置された孔101を多数有する。この孔101は、後述する窪み102に形成されている。フィルター表面積1cm2あたりの孔101の密度は、格子配列、千鳥配列など配列の形態により異なるが、通常1×104～2×105/cm2、好ましくは5×104～1×105/cm2である。また、孔101の孔径は、CTC又は希少細胞を通過させない、かつ、血球等の血液成分等、CTC又は希少細胞以外の体液細胞を通過させることができるサイズを有するものである。ヒト血球成分の大きさ（長径）は、ヒストグラム解析の結果、赤血球で約6～7μmであり、白血球で約7～9μmであり、血小板で5μm未満であるのに対して、CTC又は希少細胞で約10～20μmである。したがって、孔101の窪み102への開口位置での孔径は、通常約7～10μm、好ましくは約7.5～9μm、さらに好ましくは約7.5～8.5μmである。
　金属フィルター17はさらに、CTC又は希少細胞を捕捉することができる大きさの窪み102（又は凹部）を有している。窪み102のサイズは、CTC又は希少細胞が捕捉可能なサイズであればよく、非限定的に、例えば直径20～30μm及び深さ5～15μm、好ましくは直径25～30μm及び深さ10μmである。前記の窪み102は、上記の全部又は一部の孔101の上部に形成してもよく、高い孔密度を維持するためには、このような形態が好ましい。深さが5μm未満では、CTCが入り込めない。CTCがほぼ完全に入り込むようにするには、少なくとも約5～15μmの深さが必要である。このような窪み102の数は、孔101の数に対して好ましくは80～100％、さらに好ましくは100％（すなわち、すべての孔101の上部に窪み102が存在する）である。
　金属フィルター17において孔101が「規則的に配置」されているとは、できるかぎり高密度になるような配置であって、すべての孔101が、特定の規則性をもって配列されていることを指す。そのような規則性には、例えば格子状の配列、千鳥格子の配列、放射状の配列、同心円状の配列などが包含される（図２Ａ，図２Ｂ及び図２Ｃ）。図２Ａ，図２Ｂ（千鳥格子配列）は、孔101の上部に深さ10μmの窪み102が形成されており、全体的に立体構造となっているため、本明細書では、このような形態のフィルターを3Dフィルターと称する。一方、図２Ｃ（格子配列）は、孔101の上部に深さ1μmの窪みが存在するが、全体的に平面に近い構造を有するため、本明細書では、このような窪みの深さが5μm未満の形態のフィルターを2Dフィルターと称する。この2Dフィルターは、特開2011-163830号公報の図５に記載のサイズ選択マイクロキャビティアレイに相当する。この2Dフィルターの窪みは、CTC又は希少細胞の大きさに対して浅すぎるため、孔にトラップされた該CTC又は希少細胞を周囲の残存血液細胞から隔離することができない。これに対し、本実施形態の金属フィルター17は、3Dフィルターであり、窪み102を設けることによって、1）血球細胞のコンタミネーションなく、CTCを１個づつ配列（パターニング）できること、2）一定の条件下で発生する重力とは逆向きの流れを利用し、水圧とのバランスを最適化することにより、細胞が孔101にトラップされる強さを制御できること、などの理由によりマニピュレーションによる正確かつ簡便で、ソフトな１細胞ピッキングが可能となる（図４Ａ）。ただし、窪み102の深さが深いと（15μmを超えると）、CTCの回収率や濾過速度には影響はないものの、逆に１細胞パターニングが不完全になったり、ピッキングに際し抵抗となるなど不具合が生じうる。
　金属フィルター17の周縁は、孔なしに縁取りされていることが好ましい。縁部が存在することによって、CTC計測が正確になり、また金属フィルター17を傷つけることなしにピンセットでつまむことが可能になる。また窪み102を設けることによって電鋳の条件によっては金属フィルター17に若干反りが生じる場合があるが、ポリカーボネートなどのサポート材を上下から超音波溶着するなどによって縁取りすれば、反りの矯正は可能である。
　本実施形態の金属フィルター17は、例えばLIGA(Lithogaphie Galvanoformung Abfomung)技術を利用することによって作製することができる（服部正、表面技術、Vol. 62, No. 12, 619-624, 2011; W. Elufeld and H. Lhe, Radiat. Phys. Chem., 45(3): 340-365, 1995）。１つの例として、基板上にレジスト、吸収材（任意成分）、マスクを積層し、紫外線、X線又はシンクロトロン放射光を照射してレジストパターンを形成したのち、基板を電極として電鋳を行う金属メッキを行い、所定の開孔を残すところで電鋳を終え、さらにレジストの除去を行うことを含む方法により電鋳フィルターを作製することができる（図８Ａ～図８Ｆ参照）。
２．末梢循環腫瘍細胞(CTC)又は希少細胞分離用デバイス
　本実施形態はさらに、多孔性の金属フィルター17を備えたことを特徴とする、血液等の体液からCTC又は希少細胞を分離するためのデバイスを提供する。
　多孔性の金属フィルター17は、上記1節で説明したとおりである。コストなどの面で、好ましいフィルターは、パラジウム(Pd)フィルターまたはパラジウム(Pd)・ニッケル(Ni)合金フィルターである。
　本実施形態のデバイスでは、金属フィルター17に対して流路が垂直となるように該金属フィルター17を装着する。金属フィルター17は、通常、フィルターカセット16に脱着可能に又は脱着不能にセットされ、該フィルターカセット16がデバイスに固定される。フィルターカセット16は、金属フィルター17を固定するための適当な幅をもつ縁を有し、かつ、内側が開放スペースとなっている、上下2枚の部材（フィルターリング上、下）で構成されており、該部材間に金属フィルター17が固定される。必要により、該部材と金属フィルター17の間には、パッキング（例えば、テフロン（登録商標）、ゴム、紙など）を挟んでもよく、これにより、金属フィルター17の変形と液漏れの防止を可能にする（図３Ｂ～図３Ｃ）。フィルターカセット16の部材は、樹脂（ポリマー）、ゴム、金属などの材質からなり、2つの部材には、フィルターを固定するための手段が施されている。そのような手段には、例えばネジ溝などが挙げられる。或いは、フィルターカセット16は、単純に上下からの圧力で金属フィルター17を固定する（圧入）ような構造であってもよい。或いは、金属フィルター17とフィルターカセット16が一体となるようにフィルターカセット16を作製してもよく、この場合、金属フィルター17は、取り外せないようにフィルターカセット16に固定される。
　デバイスは、金属フィルター17が装着されたフィルターカセット16を含む濾過ユニット11の他に、リザーバーユニット10、流量調節ユニット12、及び排液回収ユニット14（液だめベース）をさらに含むことができる（図３Ａ）。
　リザーバーユニット10は、血液等の体液サンプルを入れる容器であり、ガラス、ポリマーなどの液面が判別可能な（例えば透明な）材質からなり、必要に応じて、液量（すなわち、計量）目盛りを有していてもよい。
　濾過ユニット11は、上で説明したとおりであり、金属フィルター17を脱着可能に装着するためのフィルターカセット16を含む。
　流量調節ユニット12は、リザーバーユニット10、フィルターカセット16を含む濾過ユニット11を通って自重（すなわち、重力）により自然流下する血液等の体液の流量又は流速を調節するための装置を有する。そのような装置は、例えば、鋭角構造の先端を有するネジ込み式の凸型ネジであり、ネジを締めこむとき、廃液チューブを圧迫し、流量が減少するか又はゼロ（停止）となり、一方、ネジを開放するとき、流量が増加する。ネジは、例えば金属、樹脂、ポリマーなどの材質からなる。
　排液回収ユニット14は、濾過した後の血液等の体液や、デバイスを洗浄したときの排液などを回収する容器（液だめベース）を含む。該排液回収ユニット14は、例えばガラス、樹脂、ポリマー、金属などの材質からなる。
　各ユニット間の固定は、例えば回転による取付け又は取外しが行われるねじ機構9（図３Ａ）を利用して固定してもよいし、差込み式の隙間はめ18（図３Ｃ）で行ってもよいし、或いは、その他の慣用の固定具で行ってもよい。さらに、上記の各ユニットに加えて、ユニットを組み立てた構造体を設置するためのスタンドを設けることができる。
　デバイスの一例を、図３Ａ（外観）、図３Ｂ（構成部品）、及び図３Ｃ（組み立て時のデバイスの正面図）に示す。図中、濾過ユニット11は、フィルターカセット16を含んでいる。流量調節ユニット12は、液量調節ねじ8を含んでいる。排液回収ユニット14は、その上面に液だめフタ13、その側面上部に空気孔7が設けられている。デバイスには、さらにスタンド15が含まれている。
　デバイスは、加工のしやすさやコストの面で、その全体についてアクリルなどの樹脂又はポリマーで形成されているのが好ましい。透明な材質であれば、液体の流下速度を監視できるので好ましい。デバイスの大きさは、スタンド15を除く組み立て構造体の場合、横幅約10～15cm、高さ約20～30cmであり、約5～7.5 mLの血液サンプルを濾過するのに適するサイズであるが、サンプルの容量が大きい場合でも小分けしてアプライすることにより本サイズで十分対応ができる。
　なお、以上の記載は試作機の仕様であって、量産型は別途、本試作機をもとに金型を作製し、例えば樹脂、プラスチック等の材料により作製するため，低コストな使い捨て型デバイスの生産が可能である。
　本実施形態のデバイスは、自重（重力）で濾過のための流速を得るポンプレス(すなわち、ポンプ不使用)方式であり、従って解放系である。これは、公知のフィルター型CTC分離デバイスで採用されるポンプ方式又は陰圧チューブ方式の駆動力と異なる。これら従来の方式では、細胞にストレスを与えたり、細胞の固定や、流路の閉鎖性のために生細胞の１細胞分取が困難であるなどの課題があったが、本実施形態のデバイスは、このような課題を解消することができる。
　本実施形態のデバイスは、細胞への毒性が非常に低いパラジウム等の金属フィルター17への適用、該金属フィルター17の超高孔密度、平坦表面加工および金属フィルター17の3D化により、血液等の体液の前処理なしでもCTC或は稀少細胞が孔101にトラップされる流速を比較的低速に維持したままで血液細胞の高速濾過を可能とした。具体的には、5mlの全血を洗浄も含めて30分程度での高速濾過が可能でありながら、孔101を通過する流速は比較的遅い。また、きわめて平滑な孔101の表面性状を有するため、細胞に与えるストレスや傷害性が低い。
その結果、血球細胞などのコンタミネーションが少ない状態で、CTC又は希少細胞を整列させることができる。しかも孔101の上に窪み102を設けることにより、一定の条件下では流体力学的に重力と逆方向の流れが発生すると考えられる。このため、CTCが孔101に深くトラップされることなく、従ってCTCにかかる剪断応力を最小限に抑えることができる。このため、CTC又は希少細胞の細胞傷害を最小限に抑えることができ、CTC又は希少細胞をほぼ100％の生存率でかつ約80％以上の回収率で分離することが可能である。
３．末梢循環腫瘍細胞(CTC)又は希少細胞分離方法
　本実施形態はさらに、上で説明した金属フィルター17を装着したデバイスを使用してがん患者の体液からCTC又は希少細胞を分離する方法を提供する。
　具体的には、この方法は、本実施形態のデバイスにがん患者の、例えば血液、腹水、腹腔洗浄液、髄液又はリンパ液から選択される体液を注入すること、及び、重力のみに頼った流速により、CTC又は希少細胞を金属フィルター17の上部に分離することを含む、体液からCTC又は希少細胞を分離する方法である。
　検体としてのがん患者の体液は、CTC又は希少細胞を含有する又はCTC又は希少細胞が含有することが疑われる体液であり、主として血液又はリンパ液である。
　CTC又は希少細胞の分離に使用する体液の量（体積）は、通常1～20mL、好ましくは3～7mLである。通常、体液（特に血液）はリン酸緩衝生理食塩水(PBS)（目的に応じて0.25～1 mM EDTA含有のPBS）で、例えば2～20倍に希釈した後に濾過する。特に血液量や血球数の多い場合には、以下の前処理を行ってもよい。
　前処理は、例えば、体液を磁性ナノ粒子含有カチオン性リポソーム(MCL)と混合して、体液中のCTC又は希少細胞及び白血球中に該磁性ナノ粒子を取り込ませたのち、本実施形態の金属フィルター17に通じる流路に流し込み、流路の途中に配置された磁石で磁性化されない赤血球等の細胞を予め該体液から除去することを含む（プレフィルター）。これは、通常、赤血球細胞には、磁性ナノ粒子は取り込まれないこと、一方、CTC又は希少細胞や白血球には、磁性ナノ粒子が取り込まれることの性質を利用したものである。赤血球を、このプレフィルターを通して除去し、磁気を解除してCTC又は希少細胞及び白血球細胞を本フィルターデバイスに導くことにより、金属フィルター17の流速を大幅に遅くした状態で白血球を除去することができるため、CTC又は希少細胞は孔101に強くトラップされずに金属フィルター17の窪み102に残留する。このような前処理と本実施形態の金属フィルター17による処理を併用する場合、金属フィルター17による処理を単独で行う場合に比べ、CTC又は希少細胞にかかる剪断応力が軽減され、より高い回収率(80～90%)で回収することができる（図５Ａ，図５Ｂ）。
　本方法は、体液をデバイスに注入し、重力での流速により濾過を行うという単純な方法であるが、超高孔密度（例えば、5×104～1.5×105/cm2）の3D金属フィルター17を使用することによって許容可能な十分な迅速処理を達成できる。例えば、検体(全血)約5.0mLは洗浄を含めて約30分で処理することができる。洗浄液にはリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を用いるが、必要によりEDTAを含んでもよい。
　次に、金属フィルター17上のCTC又は希少細胞の数を計測するために、CTC又は希少細胞に特異的に結合する蛍光標識抗体、例えばAlexa488標識抗EpCAM抗体や白血球に特異的に結合するPE標識抗CD45抗体などの抗体混合物を用いて、CTC又は希少細胞を染色し、顕微鏡によりCTC又は希少細胞の個数などを計測する。このとき染色は、デバイスに固定された金属フィルター17上で直接行うことができる。
　染色後、フィルターカセット16をデバイスから取り外し、フィルターカセット16のまま正立型蛍光顕微鏡下でCTC数をカウントし，さらにCTC又は希少細胞を金属フィルター17の窪み102から1個ずつ微細なガラスキャピラリーからなるマニピュレーターを用いて回収することができる。また遺伝子増幅の有無を調べるFISH法は金属フィルター17をフィルターカセット16から取り出し、そのまま固定して行うことができる。
　また、本実施形態の3D Pd・Ni合金フィルターデバイスは、担がんマウスの末梢血中のCTCの測定にも用いることができる。本発明者らは、GFP導入大腸がん細胞株（COLM5-EGFP）や胃がん細胞株(GCIY-EGFP)などの皮下移植自然転移モデルを用いてCTCを再現性よく検出できるCTCモデル（マウス）を複数株作製した。移植1～3か月後のマウス後大静脈血を採血し、本実施形態の3D Pd・Ni合金フィルターデバイスで濾過を行い、GFP蛍光を指標にCTC数を測定した。その結果、転移の程度に相関して、マウス血液中にCTCが検出されることを確認した（図６Ａ，図６Ｂ）。さらに、回収したCTC数個からRNA, DNAを抽出し、特定の遺伝子の発現や遺伝子変異を解析可能なことを確認した。
　さらに、乳がん患者及び胃がん患者などの実際の臨床検体（末梢血）でも、本実施形態の3D Pd・Ni合金フィルターデバイスで濾過を行い、CTC染色の後CTC数を測定したところ、マウスCTCモデルと同様に、転移性患者検体では健常人の血液に比べ、有意に多くのCTCを検出し、本実施形態の臨床検体における有効性も確認した（図７Ａ，図７Ｂ，図７Ｃ）。
　以上のことから、本実施形態の方法は、転移再発の早期診断、コンパニオン診断や薬剤の治療効果の評価など、転移がんの診断と治療法の両面で今後重要な役割を担うことが期待できる。また、本実施形態のデバイス及び方法によって、CTCの生体内における動態など転移メカニズムの解明など基礎的研究にも多いに役立つと予想される。
　以下に実施例を示して本実施形態をさらに詳細に説明するが、本実施形態の技術的範囲は、これらの具体例によって制限されないものとする。
[実施例１]
[パラジウム・ニッケルフィルターの製作方法]
　図８Ａに示すように、基板19に感光性レジスト20を所定の厚さに塗布した。尚、基板19として、導電性のないシリコン基板やガラス基板を用いる場合は導電膜層（例えば銅）を付加するが、ステンレス基板、ニッケル基板、銅基板などの導電性を有するものでもよい。
　次に図８Ｂに示すように、所定のパターンが描画されたCrマスク21を介して紫外線22を照射することで露光を実施した。ここで、紫外線22の代わりにX線を光源とする場合はCrマスク21の代わりにX線マスクを用いることになる。
　次に、図８Ｃに示すように、現像工程を経ることで基板19上に感光性レジスト20をパターン化した。
　次に図８Ｄに示すように、基板19の表面から電鋳によってパラジウム・ニッケル合金(Pd・Ni) (Pd:Ni重量比、例えば80:20)の析出成膜23を析出させ、パターン化した感光性レジスト20を覆いかぶさるように電鋳によるPd・Niの析出成膜23の析出を連続的に実施し、所定の開孔24を残すところで電鋳を終了させた。
　次には図８Ｅに示すように、形成した感光性レジスト20を有機溶媒により除去した。この感光性レジスト20の除去は酸素プラズマによるドライエッチングを利用してもよい。
　最後に図８Ｆに示すように、基板19を剥離、もしくはエッチング除去した。
　このような工程を経て、パラジウム・ニッケルフィルター（「3Dフィルター」又は「Pd・Niフィルター」ともいう）を製作した。
[実施例２]
[パラジウム・ニッケルフィルターの特徴づけ]
　本パラジウム・ニッケルフィルターは、独自かつ高度の電鋳技術で微細加工して作製されるため、他のポリカーボネート、パリレンまたはシリコン製のフィルターにくらべて100,000/cm2以上の高孔密度、10％以上、通常50％以上の高開口率を達成できる。これにより全血の高速濾過が可能になり、目詰まりもなく、CTCの高率かつ迅速な回収が可能となった(図２Ａおよび図２Ｂ)。また、平滑な表面性状や孔の均一性など高精度な加工と細胞毒性の少ないパラジウムを材質とすることが相まって細胞障害も大幅に低減しうる（図１Ａ，図１Ｂ）。
　さらにまた、本パラジウム・ニッケルフィルターは、121℃ 、30分の熱処理(Autoclave)が可能で、さらに次亜塩素酸（市販の1％ハイター）や１規定塩酸による化学薬品耐性試験（1時間）において、なんら形状に変化なく、またCTC回収率など機能的にも変化は認めなかった。これにより滅菌処理が可能となり医療分野での利用や再利用など低コスト化を達成できる。
［実施例３］
［培養がん細胞を用いたＣｅｌｌ Ｓｐｉｋｅ実験］
　ヒト胃がん細胞ＭＫＮ－４５、ＧＣＩＹおよびヒト大腸がん細胞ＣＯＬＭ－５を、１０％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ培地に、１．０×１０６個／１０ｃｍ ｄｉｓｈとなるように播種し、３７℃／５％ＣＯ２下で静置培養した。培養３～４日後、培地を吸引除去し、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で洗浄した後、０．２％トリプシン／２ｍＭ ＥＤＴＡを添加し、３７℃／５％ＣＯ２下で３～５分インキュベートした。検鏡し細胞がｄｉｓｈから剥離していることを確認して、血清を含むＲＰＭＩ培地を加え、トリプシンの作用を停止させた後ピペッティングし、細胞を回収した。回収した細胞は遠心分離（１２００ｒｐｍ、３分）し、上清を吸引除去して新鮮なＲＰＭＩ培地に再懸濁した。トリパンブルーを用いた色素排除法により生細胞数を計数し、１×１０６細胞／ｍｌに調製後、新しいｄｉｓｈに播種した。
　細胞捕捉（Ｃｅｌｌ Ｓｐｉｋｅ）実験には、ヒト大腸がん細胞ＣＯＬＭ－５およびヒト胃がん細胞ＧＣＩＹに、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を強制的に発現させた細胞株であるＣＯＬＭ５－ＥＧＦＰ細胞、ＧＣＩＹ－ＥＧＦＰ細胞を用いた。上記のように調製した細胞懸濁液を用い、健常人からＥＤＴＡ２Ｎａ入り真空採血管に採血した血液２～２．５ｍｌに５０、５００、又は５０００個の培養がん細胞を混合しサンプルを用意した。
［フィルターデバイスによる培養がん細胞の分離方法と検出操作］
　３Ｄフィルターを装着したＣＴＣ分離デバイスのリザーバーユニットに１ｍＭ ＥＤＴＡ/０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳを５ｍｌ導入してリザーバーおよびフィルターを洗浄した後、ＧＦＰ導入あるいは非導入培養がん細胞 （５０、５００、又は５０００個）を添加した血液（２～２．５ｍｌ）をＰＢＳで５～１０倍に希釈し導入した。約１０分間の濾過後、残留する血球成分を洗浄するためＰＢＳを５ｍｌ導入した。ＧＦＰ非導入培養がん細胞の場合、ＰＢＳ洗浄液を流しきった後、液量調節ねじを締め、流路を閉じた後、５００μｌの細胞染色液（Ａｌｅｘａ４８８標識抗ＥｐＣＡＭ抗体、ＰＥ標識抗ＣＤ４５抗体およびＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２。それぞれ０．５μｇ／ｍｌ）を導入した。ＧＦＰ導入培養がん細胞の場合、後２者からなる細胞染色液を導入した。遮光して３０分室温で反応させた後、液量調節ねじを開放し、細胞染色液を排出した。リザーバーに５ｍｌの１ｍＭ ＥＤＴＡ/０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳを導入してフィルター上の細胞を洗浄した。この作業をＰＢＳのみでもう１回行い、液量調節ねじを締めた後、ＣＴＣ分離デバイスからフィルターカセットを直ちに取り出し、フィルターカセット上部の液貯めに１００～２００μｌのＰＢＳを添加し、顕微鏡ステージに載せ、そのまま蛍光顕微鏡観察を行った。
　光透過性のない金属フィルター上に捕捉、回収されたがん細胞を観察するために、冷却ＣＣＤカメラ（Ｒｉ－１；Ｎｉｋｏｎ）を装備した正立反射蛍光顕微鏡（Ｅｃｌｉｐｓｅ ＬＶ１００ＮＤ；Ｎｉｋｏｎ）を用い、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２、Ａｌｅｘａ４８８、ＰＥ由来の蛍光を観察するためにＵＶ－１Ａ、ＦＩＴＣ、Ｃｙ３フィルターを用いてそれぞれ画像を取得した。画像取得および解析ソフトウェアにはＮＩＳ－Ｅｌｅｍｅｎｔｓ（Ｎｉｋｏｎ）を用いた。
［フィルターデバイスを用いた培養がん細胞の回収率の検討］
　３Ｄフィルターを装着したＣＴＣ分離デバイスには液量調節ねじがあり、自重によって流れる液量を調節することにより、流速を制御することができる。培養がん細胞５００個を混合した１０倍希釈血液（２．５ｍｌの血液をＰＢＳで１０倍に希釈）を用いて、２ｍｌ／ｍｉｎ、４ｍｌ／ｍｉｎ、又は８ｍｌ／ｍｉｎに流速を変化させた場合の回収率を検討した。３Ｄフィルターは、窪みの直径３０μｍ、窪みの深さ１０μｍ、孔の直径８μｍ、孔密度９９，１７８／ｃｍ２、千鳥格子配列のＰｄ・Ｎｉフィルターを使用した。その結果、２ｍｌ／ｍｉｎ、４ｍｌ／ｍｉｎでは各々約９０％、８０％と高い回収率を示したが、８ｍｌ／ｍｉｎでは７０％以下であった。２～４ｍｌ／ｍｉｎの流速であれば、８０～９０％の回収率を得られることが分かったので、以降の実験はこの範囲の流速で行うこととした（図５Ａ）。
　次に、２．５ｍｌの血液をＰＢＳで１０倍に希釈し、１０、５０、５００、又は５０００個の培養がん細胞を混合し、がん細胞の回収率を検討した。デバイスの流速は２ｍｌ／ｍｉｎである。５０、 ５００、５０００個の細胞を混合した希釈血液からの回収率は８５～９５％であった（図５Ｂ）。わずか１０個の細胞を混合した希釈血液からの回収率は平均７０％であり、細胞数のカウントのバラツキを考慮すると少数の細胞であっても高い回収効率を有することが示された。
［回収した細胞の生存率の検討結果］
　５０００個の培養がん細胞を混合した希釈血液（２．５ｍｌの血液をＰＢＳで１０倍に希釈）を３Ｄフィルターで分離し、捕捉した細胞の生存率についてトリパンブルーを用いた色素排除法により計数した。３Ｄフィルターは、窪みの直径３０μｍ、窪みの深さ１０μｍ、孔の直径８μｍ、孔密度９９，１７８／ｃｍ２のＰｄ・Ｎｉフィルターを使用した。回収した細胞の生存率は９９％で、非常に細胞傷害性の低い回収方法であることが示された。ただし、１ｍＭ以上のＥＤＴＡ存在下で濾過した場合、回収したがん細胞の増殖性を見ると、対照（ＥＤＴＡ無添加）に比べて有意に低かった。しかし、抗凝固剤としてヘパリンを用い、コラーゲンコートｄｉｓｈを用いて接着を促進させると増殖性は有意に回復した。従って、ＥＤＴＡ存在下で濾過した場合の回収がん細胞の増殖性の低下はフィルターデバイスからのストレスよりも長時間のＥＤＴＡ処理が原因と考えられた。
［３Ｄフィルターを用いた培養がん細胞の１細胞回収の検討］
　がん細胞の捕捉、整列および回収の効率を向上させる目的で、金属フィルターは図２Ａに示すように貫通孔の上部に窪みを設けた３Ｄ形状に加工している。この形状は直径２０～３０μｍ、深さ５～１５μｍが望ましいが、先端径を４０μｍ程度に加工したガラスキャピラリーを用いて捕捉した細胞を吸引回収する場合、窪みの直径は３０μｍの場合が最も回収しやすかった。窪みの深さ５μｍと１０μｍとを比較すると、深さは５μｍよりも１０μｍの方が、マニピュレーション等により液面が動いても細胞は捕捉された窪みから移動しにくいため、安定して、しかもコンタミネーションなく、目標とする１細胞の回収が可能であった（図４Ｂに、マニピュレーターでがん細胞１個を回収しているときの明視野像を示す。）。抗凝固剤としてヘパリンを用いると、細胞の金属フィルターへの接着性が増し（なお、ＥＤＴＡ存在下では細胞は金属フィルターへの接着性を殆ど示さない）、マニピュレーターによる細胞の回収率が低下した。従って、抗凝固剤は目的に応じて使い分ける必要があると考えられる。
［実施例４］
［ＣＴＣモデルマウスからのＣＴＣの分離］
　ｉｎ ｖｉｔｒｏの培養細胞とｉｎ ｖｉｖｏのＣＴＣでは細胞の生存環境が著しく異なるため、健常人血液に培養がん細胞を添加するＣｅｌｌ Ｓｐｉｋｅ実験だけではＣＴＣ分離デバイスの性能を正確に評価することは難しい。一方、患者の臨床検体では、がんの進行度（Ｓｔａｇｅ）の異なる多数の症例を収集し、これを測定し、統計的に解析しないとデバイスの性能を評価することは難しい。これらに対し、がん細胞移植後、経時的に再現性をもってＣＴＣが出現するマウス（以下「ＣＴＣ モデルマウス」と呼ぶ）が存在すれば、ＣＴＣ分離デバイスの性能の迅速かつ正確な評価が期待できる。また、ＣＴＣモデルマウスは、ＣＴＣの生体内におけるダイナミックスの解析など、ＣＴＣの基礎的な研究にも極めて有用である。そこで独自にＣＴＣモデルマウスの作製を行った。
［ＣＴＣモデルマウスの作製とそれを用いたフィルターデバイスの評価］
　ＧＦＰ遺伝子が導入されたことにより高輝度の緑色蛍光を発する転移性の高い、胃がん細胞株（ＧＣＩＹ－ＥＧＦＰ）と大腸がん細胞株（ＣＯＬＭ５－ＥＧＦＰ）をそれぞれ、ヌードマウスの皮下に移植した。経時的にマウスを屠殺し、後大静脈から０．５～１．０ｍｌの血液を採取し、ＰＢＳで１０倍希釈後にＣＴＣ分離デバイスでＣＴＣを測定した。同時に倒立型蛍光顕微鏡で肺、肝、腎などの微小転移の有無を検討した。大腸がんＣＯＬＭ５－ＥＧＦＰ皮下移植モデルでは、移植後１～２ヶ月までは肺転移は少数の微小転移に限られ、ＣＴＣ数もほとんど０（ゼロ）で、稀に１～２個のＣＴＣが検出された程度であった。一方、移植後２～３ヶ月では、肉眼的にも肺転移が認められ、少数ながら肝、腎にも転移が認められ、このとき１０～１００個程度のＣＴＣが検出され、多いときには１０００個以上のＣＴＣが検出された（図６Ａ及び図６Ｂに結果を示す）。胃がんＧＣＩＹ－ＥＧＦＰ皮下移植モデルでも、肉眼的転移および全身転移の出現に合わせてＣＴＣが検出された。同様に本デバイスを用いてマウスＬｅｗｉｓ肺がん細胞株（Ｌｅｗｉｓ－ＧＦＰ）を用いた肺がんモデルでも実験を行い、ＣＴＣの出現が肝、腎などへの多臓器転移と同期することを明らかにした。ＣＴＣが肉眼的転移や全身的転移と同期して出現することから、ＣＴＣ検出は、がん転移の早期診断に有用である可能性が示唆された。また、ＣＴＣモデルマウスを用いた検討から、本デバイスはＣＴＣの生体内動態を正確にとらえることができる充分な感度と精度を備えていることが示された。
　モデルマウスから分離したＣＴＣに対し、各種の遺伝子解析を行った。免疫蛍光染色では金属フィルター上で直接染色が可能であり、ＨＥＲ２陽性胃がん担がんマウスＣＴＣにおいてはＨＥＲ２の過剰発現を検出し得た。マニピュレーターを用いて回収したＣＴＣの遺伝子解析を行ったところ、１～数個のＣＴＣがあれば、それからＲＮＡやＤＮＡを抽出・増幅し、ＲＴ－ＰＣＲ法によるＨＥＲ２等の遺伝子発現の解析や、ダイレクトシーケンス法によるＫ－Ｒａｓ等の遺伝子配列の解析などが可能であることを確認した。
［実施例５］
［胃がん患者及び乳がん患者の末梢血からのＣＴＣ分離］
　胃がん患者４名、乳がん患者６名、健常人４名の肘静脈からＥＤＴＡ２Ｎａ入り採血管で５ｍｌの採血を行った。胃がん患者４名および乳がん患者６名は、愛知県がんセンター中央病院（日本、名古屋）に入院した患者である。患者からの採血は、愛知県がんセンター倫理委員会（日本、名古屋）で承認され、患者から同意書を取得した上で行われた。
　各人から採血後、１時間以内にＰＢＳで１０倍に希釈し、ＣＴＣ分離デバイスにアプライし、濾過を行った。ＣＴＣ分離デバイスの金属フィルターは、窪みの直径２４μｍ、窪みの深さ１０μｍ、孔の直径８μｍ、孔密度１３６，３２５／ｃｍ２の３Ｄ Ｐｄ・Ｎｉフィルターを用いた。濾過は流速２．５ｍｌ／ｍｉｎで行った。フィルターカセット上の細胞をＰＢＳで洗浄し、１０％ホルマリンで室温で１０分間固定し、洗浄後、Ａｌｅｘａ４８８標識抗ＥｐＣＡＭ抗体、ＰＥ標識抗ＣＤ４５抗体、また場合によりＡｌｅｘａ３５０標識抗ＣＫ Ｏｓｃａｒ抗体を含む細胞染色液をフィルターカセット上に添加し、室温で３０分間反応させた。さらにＰＢＳで洗浄後、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２で核染色を行った。ＰＢＳで洗浄後、フィルターカセットごと正立型蛍光顕微鏡に移し、ＥｐＣＡＭ＋／（ＣＫ Ｏｓｃａｒ＋ )／ＣＤ４５－／Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２＋細胞をＣＴＣとして判定し、ＣＴＣ数を計測した。その結果、健常人では４名ともＣＴＣは０個であったのに対し、進行胃がん患者４名ではそれぞれ０、２、４、１１個、進行乳がん患者６名ではそれぞれ１、３、４、１１、１５、２２個であった。胃がん患者の染色像を図７Ａに、乳がん患者の染色像を図７Ｂに、ＣＴＣ数の測定結果を図７Ｃに示す。
［実施例６］
［磁性ナノ粒子による細胞の磁気分離の併用］
　胃がん細胞Ｎ８７を用いて、ＣＴＣの全回収を目指し、磁性ナノ粒子を用いた磁気分離（前処理）と、３Ｄ Ｐｄ・Ｎｉフィルターを用いた大きさによる分離とを併用し、回収率の向上を試みた。Magnetic Cationic Liposome（直径１５０ｎｍ）１００ｐｇ／細胞をＮ８７細胞１００個の細胞懸濁液に２時間作用させ、白血球細胞２０万個を含むウシ血清に混和させた後、磁気分離流路とフィルターを組み合わせたデバイスで捕捉した。約８０～９０％の細胞を捕捉回収することができ、フィルター単独に比べて回収率の向上が認められた。
　本発明の金属フィルターを装着したデバイスは、血液などの体液中のCTC又は希少細胞の分離を高い回収率で実現するとともに、CTC又は希少細胞を無傷（intact）に近い状態で回収できるため、CTC数の評価ばかりではなく、単一CTC細胞の遺伝子解析に使用することを可能にし、転移性再発の早期診断、治療効果のモニターやLiquid biopsy（体液生検）などに有効に使用できる可能性が高い。
（符号の説明）
7・・空気孔
8・・液量調節ねじ
9・・ねじ機構（固定用）
10・・リザーバーユニット
11・・濾過ユニット（中にフィルターカセットを含む）
12・・流量調節ユニット
13・・液だめフタ
14・・排液回収ユニット（液だめベース）
15・・スタンド
16・・フィルターカセット（フィルターリングとも呼ぶ）
17・・金属フィルター
18・・隙間はめ（差込み式）
19・・基板
20・・感光性レジスト
21・・Crマスク
22・・紫外線
23・・パラジウム(Pd)・ニッケル(Ni)合金の析出成膜
24・・開孔

Claims (11)

  1. 　体液中の末梢循環腫瘍細胞又は希少細胞を捕捉することができる窪みと、該窪みに形成され前記末梢循環腫瘍細胞又は前記希少細胞以外の体液細胞を通過させることができる孔とを有する金属フィルターを備えた末梢循環腫瘍細胞又は希少細胞分離用デバイス。
  2. 　前記金属フィルターの材質が、パラジウム又はパラジウム・ニッケル合金である請求項１に記載の末梢循環腫瘍細胞又は希少細胞分離用デバイス。
  3. 　前記窪みの直径は20～30μmであり、前記窪みの深さは5～15μmである請求項１又は請求項２に記載の末梢循環腫瘍細胞又は希少細胞分離用デバイス。
  4. 　前記孔の直径は7～10μmである請求項１～請求項３のいずれか１項に記載の末梢循環腫瘍細胞又は希少細胞分離用デバイス。
  5. 　前記窪み及び前記孔の孔密度は、1cm2あたり1×104～2×105個である請求項１～請求項４のいずれか１項に記載の末梢循環腫瘍細胞又は希少細胞分離用デバイス。
  6. 　前記金属フィルターの厚さは、10～40μmである請求項１～５のいずれか１項に記載の末梢循環腫瘍細胞又は希少細胞分離用デバイス。
  7. 　前記金属フィルターを装着するためのフィルターカセットを有する請求項１～請求項６のいずれか１項に記載の末梢循環腫瘍細胞又は希少細胞分離用デバイス。
  8. 　請求項１～７のいずれか１項に記載の末梢循環腫瘍細胞又は希少細胞分離用デバイスに、がん患者の血液、腹水又は腹腔洗浄液から選択される体液を注入して、該体液中の前記末梢循環腫瘍細胞又は前記希少細胞を、前記金属フィルターの前記窪みで捕捉した後、生きたまま回収する末梢循環腫瘍細胞又は希少細胞分離方法。
  9. 　前記末梢循環腫瘍細胞又は希少細胞を特異的に染色することをさらに含む、請求項８に記載の末梢循環腫瘍細胞又は希少細胞分離方法。
  10. 　前記体液を希釈又は前処理することを含む、請求項８又は請求項９に記載の末梢循環腫瘍細胞又は希少細胞分離方法。
  11. 　前記前処理が、前記体液を磁性ナノ粒子含有カチオン性リポソームと混合して、前記体液中の前記末梢循環腫瘍細胞又は前記希少細胞及び白血球細胞中に前記磁性ナノ粒子を取り込ませたのち、前記金属フィルターに通じる流路に流し込み、前記金属フィルターの前に配置された磁石で磁性ナノ粒子を取り込まない赤血球等の細胞を該体液から除去することを含む、請求項１０に記載の末梢循環腫瘍細胞又は希少細胞分離方法。
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