JP7092505B2 - 細胞標的化有効成分送達系 - Google Patents

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Description

本発明は、CD45+白血球細胞を含み、該細胞内に1つ以上の鉄結合タンパク質と有効成分との複合体を含む単離細胞標的化送達系、及びかかる単離細胞標的化送達系を作製する方法、及び療法、特に癌の療法へのかかる系の使用に関する。
現行のイメージングツールは、大きな転移（サイズが0.5 cm～1 cm超）を検出することが可能である。しかしながら、これらのイメージングツールは転移性腫瘍細胞の早期拡大を検出することは殆どない。0.5 cm未満のヒト転移は無血管であるため、適当な血液及び酸素供給を有しない。これは、それらの転移の標識及びそれらのイメージングを目的とする血液循環を介した造影剤の送達が可能でないことを意味する。低酸素状態の存在は微小転移に共通の特徴であり、血液灌流が殆ど又は全くない低酸素画分は90%に達し得る（非特許文献1）。このため、重度の低酸素状態が微小転移の一般的特徴と考えられる。
大きな正常細胞集団内に隠された1つ以上の微小転移の標的化は、微小転移へのアクセスが幾つかの生物学的障壁、低い血液供給により妨げられることから特有の問題となり、微小転移の小さなサイズ及び器官へのそれらの分散により更なる障害が示される。
同じ理由から、微小転移は療法に反応しない（refractive）ことが多い。微小転移の元となる固形腫瘍は多くの場合、従来の療法に良好に応答するが、原発腫瘍の部位又は転移の部位に再成長が見られることが多い。このことは臨床腫瘍学において深刻な問題となる（非特許文献2）。これは薬物透過を制限する固形腫瘍の微小環境の特徴に関連し、腫瘍は有効濃度より低い薬物に曝される（非特許文献3）。これは、塊内の癌細胞の高い不均一性、低い酸素圧（低酸素状態）、低いpH及び低いグルコース濃度をもたらす不適切な血管系に起因する（非特許文献4）。付加的に、幾つかの領域では急速な腫瘍細胞増殖が新たな血管の成長速度を上回り、低酸素領域の形成を促進する場合がある（非特許文献5）。腫瘍低酸素状態をもたらす、この異常な血管構造、続くそれらの機能障害は固形腫瘍を患う患者におけるより悪性の表現型及び低い生存率と関連し、癌細胞における薬物取込みの減少及び低酸素状態により誘導される変化による両方の治療の失敗を引き起こす（非特許文献6、非特許文献7、非特許文献4）。さらに、化学療法又は放射線療法が大きな腫瘍低酸素領域の付加的な形成を引き起こし、腫瘍の治療を一層困難なものとしている。抗癌療法の有効性が低酸素腫瘍細胞の存在によって制限されることから、この問題の克服を目的とする様々な治療アプローチの導入につながっている。
本発明者らは、CD45+白血球細胞、特に活性化マクロファージが1つ以上の鉄結合タンパク質と複合した有効成分をin vitroで取り込み、これらの複合体を細胞に又は細胞内に、好ましくは腫瘍細胞に又は腫瘍細胞内にin vivoで送達することができることを発見した。この観察結果に基づいて、本発明者らは上述の従来技術の問題の1つ以上を克服した。このため、本発明の標的化送達系は特に（inter alia）、以下の利点の1つ以上をもたらす：（i）上述のCD45+白血球を誘引する組織への、好ましくは罹患細胞内への1つ以上の有効成分の特異的送達、（ii）血液循環中での不活性化又は身体からの除去からの有効成分の保護、（iii）血管新生が乏しい又は血管新生されない疾患領域、例えば転移、より大きな腫瘍内の低酸素領域、リウマチ性病変、無血管創傷、皮膚の細胞への、好ましくは細胞内への有効成分の送達、（iv）有効成分の毒性の低減、（v）薬物動態が低い有効成分の送達、（vi）薬物の標的化送達に起因する副作用の低減、（vii）標的化送達によるより低用量の薬物を用いたより高い治療有効性、及び／又は（viii）CD45+白血球内にロードされる鉄結合タンパク質に連結した薬物の投与に起因する薬物投与部位での局所組織傷害のより低いリスク（非特許文献8）。
Li, et al. 2012, Journal of Solid Tumours, 2(2): 28-33 Muthana, et al. 2012, Cancer Res; 73(2); 490-495 Hobbs, et al. 1998, Proc Natl Acad Sci USA: 4607-4612 Kizaka-Kondoh, et al., 2003, Cancer Sci94(12):1021-1028 Lewis and Murdoch, 2005, Am J Pathol 167(3):627-635 Sun, et al., 2012, Clin Cancer Res 18(3):758-770 Sullivan, et al., 2008 Mol Cancer Ther 7(7):1961-1973 Perez-HerreroE, Fernandez-MedardeA. 2015, Eur J Pharm Biopharm 93:52-79
第1の態様では、本発明は、好ましくは鉄結合タンパク質を内在化させることが可能なCD45+白血球細胞を含み、該細胞内に1つ以上の鉄結合タンパク質と1つ以上の有効成分との複合体を含む単離標的化送達系に関する。
第2の態様では、本発明は、本発明の第1の態様の単離標的化送達系を作製する方法であって、
a）好ましくは精製鉄結合タンパク質を準備する工程と、
b）有効成分を鉄結合タンパク質に共有結合的若しくは非共有結合的に連結する、及び／又は有効成分を鉄結合タンパク質に封入する工程と、
c）CD45+白血球細胞を準備する工程と、
d）CD45+白血球細胞を、工程b）において作製される鉄結合タンパク質と有効成分との複合体の存在下で、該CD45+白血球細胞に工程b）において作製される該鉄結合タンパク質と有効成分との複合体が少なくとも部分的にロードされるまでインキュベートする工程と、
を含む、方法に関する。
第3の態様では、本発明は、薬剤として使用される、本発明の第1の態様の単離標的化送達系に関する。
第4の態様では、本発明は、本発明の単離標的化送達系と、薬学的に許容可能な担体及び／又は好適な賦形剤（複数の場合もある）とを含む医薬組成物に関する。
第5の態様では、本発明は、腫瘍、好ましくは固形腫瘍、好ましくは乳癌、膵癌、膀胱癌、肺癌、結腸癌、又は特に皮膚創傷中、若しくは臓器梗塞（organ infarctus）（心臓）若しくは網膜虚血の後の低酸素領域、炎症性疾患若しくは虚血領域を有する腫瘍の予防／治療に使用される、本発明の第1の態様の単離標的化送達系に関する。
パネル（A）は、哺乳動物フェリチンH鎖におけるコンセンサスアミノ酸配列の最小活性フラグメント及び幾つかの哺乳動物フェリチンH鎖に基づく2つの完全長コンセンサス配列（それぞれ配列番号1、2及び7を参照されたい）、並びにマウス（配列番号3及び4）及びヒト（配列番号5及び6）フェリチンH鎖の最小及び完全長のアミノ酸配列を示す。パネル（B）は、哺乳動物フェリチンL鎖におけるコンセンサスアミノ酸配列の最小活性フラグメント及び幾つかの哺乳動物フェリチンL鎖に基づく2つの完全長コンセンサス配列（それぞれ配列番号8、9及び14を参照されたい）、並びにマウス（配列番号10及び11）及びヒト（配列番号12及び13）フェリチンL鎖の最小及び完全長のアミノ酸配列を示す。パネル（C）は、哺乳動物ヘモグロビンα鎖におけるコンセンサスアミノ酸配列の最小活性フラグメント及び幾つかの哺乳動物ヘモグロビンα鎖に基づく1つの完全長コンセンサス配列（それぞれ配列番号15及び16を参照されたい）、並びにヒトヘモグロビンα鎖の最小及び完全長のアミノ酸配列（配列番号17及び18）を示す。パネル（D）は、哺乳動物ヘモグロビンβ鎖におけるコンセンサスアミノ酸配列の最小活性フラグメント及び幾つかの哺乳動物ヘモグロビンβ鎖に基づく完全長コンセンサス配列（それぞれ配列番号19及び20を参照されたい）、並びにヒトヘモグロビンβ鎖の最小及び完全長のアミノ酸配列（配列番号21及び22）を示す。パネル（E）は、哺乳動物トランスフェリンにおけるコンセンサスアミノ酸配列のN末端及びC末端の最小活性フラグメント（配列番号23及び24）、並びに幾つかの哺乳動物トランスフェリンに基づく完全長コンセンサス配列（配列番号25）、並びにヒトトランスフェリンのN末端及びC末端の最小活性フラグメント（配列番号26及び27）、並びにヒトトランスフェリンの完全長アミノ酸配列（配列番号28）を示す。コンセンサス配列において、Xは可変の位置を示し、任意の天然アミノ酸を表す。好ましくは、いずれの場合にも、Xは他のXと独立してヒトタンパク質中に存在するアミノ酸を表す。 同上 同上 マウス腫瘍塊内のマクロファージを示す図である（注射前にTRITC染色し、FITC装飾フェリチンをロードした）。 乳癌細胞を注射し、FITC-フェリチンをロードしたマクロファージを静脈内で与えたマウスの腫瘍組織の共焦点顕微鏡画像を示す図である（星印（asterisk））。マクロファージだけでなく、癌細胞においてもフェリチン-FITCが全ての腫瘍塊に広がることが明らかに観察される。 開始時点（A）及び癌細胞にフェリチンを満たすのに十分に長い時間後（B）にin vitroで撮影された、共焦点顕微鏡法を用いてマクロファージ（*で示す；FITC-フェリチンをロードした）及び癌細胞（矢印で示す；赤色標識で染色したため、フェリチン取込み前の緑色チャンネルでは観察されない）を記録する1つのチャンネルのスナップショット（グレースケール写真へと変換した元の緑色チャンネル）を示す図である。FITC-フェリチンは癌細胞へと動的に輸送された（この画像に見られるように初めに小胞内に蓄積し、続いて全細胞質へと広がる（緑色チャンネルに現れる細胞））。 プラシーボ、並びにフェリチンにカップリングしたメルファラン及びフェリチンにカップリングしたクロラムブシルをロードしたマクロファージを与えたマウスの生存を示す図である。 シクロホスファミド及びマクロファージにロードしたフェリチンに封入されたシクロホスファミドでの処理（同じ用量で与えた）によって引き起こされる腫瘍細胞アポトーシスを示す図である。 マウス乳腺腫瘍のMRI画像を示す図である。マウスを、フェリチンFhをロードしたマクロファージ（静脈内注射）で処理した（0時間の時点）。次いで、注射したマクロファージで満たされた血管の直径の増大（矢印）（顕著なT2-シグナルの低減をもたらす）、その後（afterward）マクロファージの組織への広がり（スポット状パターン；矢印）が観察された。これらの変化（同じ時点）は検査した全てのマウスに観察された。 マクロファージによるフェリチン、ヘモグロビン及びトランスフェリンの取込み、単球によるフェリチン及びヘモグロビンの取込み、並びにリンパ球及び顆粒球によるフェリチンの取込みを示す図である。 マクロファージによるフェリチン貯蔵の安定性を示す図である。 マクロファージから様々な癌細胞へのフェリチン、ヘモグロビン及びトランスフェリンの移行を示す図である。 マクロファージから癌及び非癌細胞へのフェリチンの移行を示す図である。 マクロファージから癌細胞への低酸素活性化プロドラッグを封入したフェリチンの移行を示す図である。 共培養マクロファージに由来する様々な抗癌剤を封入したフェリチン、又は同じ作用物質を封入した可溶性フェリチンを受けた癌細胞におけるアポトーシスを示す図である。 単球から様々な癌細胞へのフェリチン、ヘモグロビン及びトランスフェリンの移行を示す図である。 顆粒球から様々な癌細胞へのフェリチン及びヘモグロビンの移行を示す図である。 リンパ球から様々な癌細胞へのフェリチン及びヘモグロビンの移行を示す図である。 フェリチン-FITCを含有する前標識（投与前）マクロファージを与えたマウスの腫瘍を示す二光子顕微鏡法による写真を示す図である。 腫瘍部位におけるそれらの蓄積及び他の器官におけるそれらの分布を示す、標識マクロファージを静脈内に与えたマウスの全身イメージングを示す図である。 低酸素組織へのマクロファージの移動、前標識マクロファージを静脈内投与したマウスの腫瘍の断面を示す図である。腫瘍低酸素領域を低酸素マーカーpimonidazolone（pimonidazole?)で可視化する。 腫瘍塊内の微小環境におけるFITCロード（loaded）フェリチン（円形の対象）を含有する小胞の局在化を示す図である。FITCロードフェリチンを含有するマクロファージをマウスに静脈内投与した。 転移性4T1癌を有するマウスの全身分析のPETによって記録されたシグナルを示す図である。マウスに18F-FDGをロードしたマクロファージを静脈内に与えた。シグナル蓄積は、微小転移を有するマウスの肺において増大する（病理学検査によって確認される）。素18F-FDGを与えたマウス又は4T1癌を有しないマウスはより低いPETシグナルを有していた。
本発明を下記に詳細に説明する前に、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコル及び試薬は変更することができるため、本発明がこれらに限定されないことを理解されたい。本明細書で使用される専門用語は特定の実施形態を説明することを目的とするものに過ぎず、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図するものではないことも理解されたい。他に定義のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。
下記で本発明の要素を記載する。これらの要素は特定の実施形態とともに挙げられているが、更なる実施形態を作成するのに、これらの要素をどのような方法及びどのような数でも組み合わせることができることを理解されたい。多様に記載された実施例及び好ましい実施形態は、本発明を例示的に記載された実施形態のみに限定するものとは解釈されない。本明細書は例示的に記載された実施形態と、あらゆる数の開示された及び／又は好ましい要素とを組み合わせた実施形態を支持及び包含するものであると理解されたい。さらに文脈上他に指定のない限り、本出願において記載された全ての要素のあらゆる並び替え（permutations）及び組合せが本出願の明細書により開示されていると見なされる。
幾つかの文献が本明細書の文章全体を通して引用される。本明細書に引用される各々の文献（特許、特許出願、科学出版物、製造者の仕様書、使用説明書等の全てを含む）は、上記又は下記を問わず、それらの全体が引用することにより本明細書の一部をなす。本明細書中のいずれの記載も、本発明が先行発明のためにかかる開示に先行する権利がないことを認めるものと解釈されるものではない。
定義
本発明の実施には、特に示されない限り、当該技術分野での文献（例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J.Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989を参照）に説明される化学、生化学、及び組換えDNA技法の慣用の方法が使用される。
本明細書及び添付の特許請求の範囲の全体を通して、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「含む」という語（the word "comprise", and variations such as"comprises" and "comprising"）は、提示の整数若しくは工程又は整数若しくは工程の群を含むが、任意の他の整数若しくは工程又は整数若しくは工程の群を除外しないことを意味するものと理解される。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、数量を特定していない単数形（thesingular forms "a", "an", and "the"）は、文脈上他に明確に示されていない限り、複数の指示対象を含む。
「標的化薬物送達」という用語は、患者の身体の他の領域と比較した場合に身体の特定の領域における有効成分の濃度の増大をもたらす患者への有効成分の送達を指す。相対濃度を身体の罹患領域（複数の場合もある）と、同様の血液循環へのアクセスを有する身体の他の領域との間で比較するのが好ましい。好ましい実施形態では、罹患領域に由来する所与の数の細胞又は所与の生検量における有効成分の濃度は、本発明の標的化送達系の投与後、好ましくは2時間～24時間後に非罹患領域に由来する同一の数の細胞又は生検量と比較した場合に少なくとも10%高い。より好ましくは、患者の身体の罹患領域における有効成分の濃度は、本発明の標的化送達系の投与後、好ましくは2時間～24時間後に身体の非罹患領域における濃度よりも少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも100%、少なくとも150%、少なくとも200%、少なくとも250%、少なくとも300%、少なくとも350%、少なくとも400%、少なくとも450%、少なくとも500%、より好ましくは少なくとも1000%高い。全身分布に基づいて判定した場合に、患者に投与される有効成分の少なくとも5%、好ましくは少なくとも10%、より好ましくは少なくとも15%が身体の罹患領域へと送達されるのが好ましい。有効成分の標的化送達により、身体の罹患領域への有効成分の潜在的有害作用が制限される。
「標的化薬物送達系」又は「標的化送達系」という用語は、本願において同義的に使用され、有効成分を標的化領域へと送達することが可能な、すなわち好ましくは患者の身体内での標的化送達が可能な系を指す。
「有効成分」又は「薬物」という用語は本発明において同義的に使用され、好ましくは患者の身体における細胞活性を改変若しくは変調する任意の化合物、又は細胞活性を改変若しくは変調するよう活性化されることが可能な任意の化合物、すなわちプロドラッグを指す。かかる有効成分の例としては、いわゆる「小分子」及びペプチドが挙げられる。「小分子」という用語は、分子質量が1.500 g/mol（1,500g/mol)未満の炭化水素、又は薬学的に活性のある放射性同位体を指すために本発明において使用される。使用することができる薬物が抗癌剤、薬学的に活性のある放射性同位体又はフェリハイドライトを含むのが好ましい。
「プロドラッグ」という用語は、本発明において使用される場合、投与後に少なくとも1つの特性に関して生物学的に活性のある又はより活性のある成分（又は薬物）へと代謝されるか、又はそうでなければ変換される任意の有効成分を指す。薬物と比較して、プロドラッグは、薬物と比べて活性が低いか又は不活性となるように化学的に修飾されるが、化学修飾はプロドラッグが患者に投与された後に代謝過程又は他の生物学的過程によって対応する薬物が生成されるようなものである。プロドラッグは例えば、活性薬物と比べて変更された代謝的安定性若しくは輸送特徴、より少ない副作用若しくはより低い毒性、又は改善された風味を有し得る（例えば、参照文献のNogrady, 1985, Medicinal Chemistry A BiochemicalApproach, Oxford University Press, New York, pages 388-392（引用することにより本明細書の一部をなす）を参照されたい）。プロドラッグは、対応する薬物以外の反応物を使用して合成することができる。
「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は本明細書で区別なく使用され、ヌクレオチドモノマーから作られるポリマー又はオリゴマー巨大分子として理解される。ヌクレオチドモノマーは核酸塩基、五炭糖（リボース又は2'-デオキシリボース等であるが、これらに限定されない）、及び1つ～3つのリン酸基から構成される。通例、ポリヌクレオチドは個々のヌクレオチドモノマー間のホスホジエステル結合によって形成される。本発明において、言及される核酸分子としては、リボ核酸（RNA）、デオキシリボ核酸（DNA）、及び例えばRNA-DNAハイブリッド等のそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。核酸は例えば、化学的に、例えばホスホトリエステル法（例えば、Uhlmann, E. & Peyman, A. (1990) Chemical Reviews,90, 543-584を参照されたい）に従って合成することができる。「アプタマー」は、高い親和性でポリペプチドと結合する核酸である。アプタマーは、SELEmir146-a（例えば、Jayasena(1999) Clin. Chem., 45, 1628-50、Klugand Famulok (1994) M. Mol. Biol. Rep., 20, 97-107、米国特許第5,582,981号を参照されたい）等の選択法によって、種々の一本鎖RNA分子の大きなプールから単離することができる。アプタマーはそれらの鏡像形態で、例えばL-リボヌクレオチドとして合成し、選択することもできる（Nolte et al. (1996) Nat. Biotechnol., 14, 1116-9、Klussmann et al. (1996) Nat. Biotechnol., 14, 1112-5）。このようにして単離された形態には、自然発生リボヌクレアーゼによって分解されず、したがってより大きな安定性を有するという利点がある。
「ペプチド」又は「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合によって連結した少なくとも2アミノ酸の鎖を指すために本発明において区別なく使用される。このため、本発明における「ペプチド」という用語は50超、100超又は150超のアミノ酸を含むアミノ酸鎖を指すためにも使用される。
「抗体」という用語は本発明において使用される場合、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する糖タンパク質を指し、抗体及び免疫グロブリンという用語は区別なく使用されることが多い。抗体は血漿細胞によって産生されるタンパク質分子を指し、細菌及びウイルス等の異物を特定し、中和する免疫系によって使用される。抗体は、その抗原である外来標的の独自部分を認識する。
「抗体フラグメント」という用語は本明細書で使用される場合、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の1つ以上のフラグメントを指す。「抗体フラグメント」という用語に包含される結合フラグメントの例としては、フラグメント抗原結合（Fab）フラグメント、Fab'フラグメント、F(ab')2フラグメント、重鎖抗体、シングルドメイン抗体（sdAb）、一本鎖可変フラグメント（scFv）、可変フラグメント（Fv）、VHドメイン、VLドメイン、シングルドメイン抗体、ナノボディ、IgNAR（免疫グロブリン新抗原受容体）、di-scFv、二重特異性T細胞エンゲージャー（BITE）、二重親和性再標的化（DART）分子、トリプルボディ（triple body）、ダイアボディ（diabody）、一本鎖ダイアボディ、代替足場タンパク質及びそれらの融合タンパク質が挙げられる。
「ダイアボディ」という用語は本明細書内で使用される場合、異なる抗原に結合することができる融合タンパク質又は二価抗体を指す。ダイアボディは抗体のフラグメント、すなわち可変フラグメントを含む2つの単一タンパク質鎖から構成される。ダイアボディは、同じポリペプチド鎖上の軽鎖可変ドメイン（VL）に接続した重鎖可変ドメイン（VH）を含む（VH-VL又はVL-VH）。2つの可変ドメインを接続する短ペプチドを使用することによって、ドメインを別の鎖の相補的なドメインと対にすることで、2つの抗原結合部位を作り出す。ダイアボディは同じ（単一特異性）又は異なる抗原（二重特異性）を標的とすることができる。
「シングルドメイン抗体」は、抗体の単一単量体可変ドメインからなる抗体フラグメントを指す。簡潔に述べると、シングルドメイン抗体はラクダ科動物又は軟骨魚類によって産生される重鎖抗体の単量体重鎖可変領域のみを含む。それらの異なる起源のために、シングルドメイン抗体はVHH又はVNAR（可変新抗原受容体）フラグメントとも称される。代替的には、シングルドメイン抗体は、遺伝子工学を用いた従来のマウス又はヒト抗体の可変ドメインのモノマー化によって得ることができる。シングルドメイン抗体はおよそ12 kDa～15 kDaの分子質量を示し、抗原認識の可能な最小の抗体フラグメントである。更なる例としては、ナノボディ又はナノ抗体が挙げられる。
「抗体模倣物」という用語は本明細書の文脈内で使用される場合、抗体と同様に抗原に特異的に結合することができるが、抗体とは構造的に関係していない化合物を指す。通常は、抗体模倣物は抗原に特異的に結合する1つ、2つ又はそれ以上の露出ドメインを含む、モル質量が約3 kDa～20 kDaの人工ペプチド又はタンパク質である。例としては、特にLACI-D1（リポタンパク質結合凝固阻害剤）；アフィリン、例えばヒトγ Bクリスタリン（crystalline）又はヒトユビキチン；シスタチン；スルホロブス・アシドカルダリウス（Sulfolobus acidocaldarius）に由来するSac7D；リポカリン及びリポカリンに由来するアンチカリン；DARPin（設計アンキリンリピートドメイン）；FynのSH3ドメイン；プロテアーゼ阻害剤のクニッツ（Kunits）ドメイン；モノボディ（monobodies）、例えばフィブロネクチンの第10タイプIIIドメイン；アドネクチン；ノッチン（システインノットミニタンパク質）；アトリマー；エビボディ（evibodies）、例えばCTLA4ベースの結合剤、アフィボディ（affibodies）、例えば黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）に由来するプロテインAのZドメインの3ヘリックスバンドル；トランスボディ（Trans-bodies）、例えばヒトトランスフェリン；テトラネクチン、例えば単量体又は三量体ヒトC型レクチンドメイン；ミクロボディ、例えばトリプシン阻害剤II；アフィリン；アルマジロリピートタンパク質が挙げられる。核酸及び小分子が抗体模倣物とみなされる場合もあるが（アプタマー）、人工抗体、抗体フラグメント及びこれらから構成される融合タンパク質ではない。抗体に対する一般的な利点は、より良好な溶解性、組織透過性、熱及び酵素に対する安定性、並びに比較的低い生産コストである。
「配列同一性」という用語が、ポリペプチド及びヌクレオチド配列比較に関して本明細書全体を通して使用される。2つの配列を比較し、配列同一性パーセンテージを算出するために比較される参照配列が指定されない場合、他に具体的な指示がない限り、配列同一性は比較対象の2つの配列のうち長い方を参照して算出される。参照配列が指示される場合、配列同一性は他に具体的な指示がない限り、配列番号によって指示される参照配列の完全長に基づいて決定される。例えば、200アミノ酸からなるポリペプチド配列は、参照300アミノ酸長ポリペプチド配列と比較して66.6%（200/300）という配列同一性の最大パーセンテージを示し得るが、150アミノ酸長の配列は50%（150/300）という配列同一性の最大パーセンテージを示し得る。これら150個のアミノ酸のうち15個が300アミノ酸長参照配列のそれぞれのアミノ酸と異なる場合、配列同一性のレベルは45%まで減少する。ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の類似性、すなわち配列同一性のパーセンテージは、配列アラインメントを介して決定することができる。そのようなアラインメントは、幾つかの当該技術分野において知られているアルゴリズムを用いて、好ましくはKarlin及びAltschulの数学的アルゴリズム（Karlin & Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877）、hmmalignアルゴリズム（HMMERパッケージ、http://hmmer.wustl.edu/）又はCLUSTALアルゴリズム（Thompson, J. D., Higgins, D. G. & Gibson, T. J. (1994) NucleicAcids Res. 22, 4673-80）を用いて、例えばhttp://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/又はhttp://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html又はhttp://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_clustalw.htmlで入手することができるアルゴリズムを用いて実施することができる。使用される好ましいパラメータは、http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/又はhttp://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.htmlで設定されるデフォルトパラメータである。配列同一性（配列マッチング）の度合いは、例えばBLAST、BLAT又はBlastZ（又はBlastX）を使用して算出することができる。BLASTタンパク質検索をBLASTPプログラム、スコア＝50、ワード長＝3を用いて行う。比較目的でギャップドアラインメントを得るために、Gapped BLASTをAltschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402に記載のように利用する。BLAST及びGappedBLASTプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータを使用する。配列マッチング分析を、Shuffle-LAGAN（BrudnoM., Bioinformatics 2003b, 19 Suppl 1:I54-I62）又はマルコフ確率場のような確立されている相同性マッピング法により補足することができる。配列データベース検索からの情報を用いた多数のタンパク質配列及び／又は構造についての構造ベースのアラインメントでは、3D構造及びユーザー定義制約を有する利用可能なホモログを使用することもできる（Pei J, Grishin NV: PROMALS: towards accurate multiplesequence alignments of distantly related proteins. Bioinformatics 2007, 23:802-808、3DCoffee@igs: a web server for combining sequences andstructures into a multiple sequence alignment. Poirot O,Suhre K, Abergel C, O'Toole E, Notredame C. Nucleic Acids Res. 2004 Jul 1;32:W37-40）。配列同一性のパーセンテージが本願において言及される場合、これらのパーセンテージは他に具体的な指示がない限り、より長い配列の完全長との関連で算出される。
「白血球」という用語は、感染性疾患及び外来侵入物の両方からの身体の保護に関与する免疫系の細胞を指すために本発明において使用される。全ての白血球が造血幹細胞として知られる骨髄中の多能性細胞から産生され、それに由来する。白血球は血液及びリンパ系を含む全身に見られる。全ての白血球は核を有し、他の血液細胞である無核赤血球（RBC）及び血小板から区別される。白血球のタイプは標準的方法で分類することができる。2組の最も広いカテゴリーにより、白血球は構造（顆粒球又は無顆粒球）又は細胞分裂系統（骨髄細胞又はリンパ系細胞）によって分類される。これらの最も広いカテゴリーは更に、5つの主要タイプ：好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球及び単球に分けることができる。これらのタイプは、それらの物理的特徴及び機能的特徴によって区別される。単球及び好中球は食作用を示す。更なるサブタイプを分類することができる。例えば、リンパ球にはB細胞、T細胞及びNK細胞がある。顆粒球は、それらの核形状（分葉対円形、すなわち多形核対単核）及びそれらの細胞質顆粒（存在若しくは非存在、又はより正確には、光学顕微鏡で見ることができる若しくはそれにより見ることができない）によって無顆粒球から区別される。他の二分法は系統によるものである。骨髄細胞（好中球、単球、好酸球及び好塩基球）は、造血系統（細胞分化系統）によるリンパ系細胞（リンパ球）と区別される。
本発明者らにより、特にCD45+白血球細胞が身体内の特定の組織及び細胞に誘引され、1つ以上の鉄結合タンパク質と1つ以上の有効成分との複合体を細胞へ又は細胞内へ送達することが可能であるため、CD45+発現が本発明の標的化送達系との関連で使用するのに好適な白血球細胞に特徴的であることが観察された。クローン起源を除くCD45+白血球細胞が、CD45+表面抗原を発現する共通特性を有する異なる白血球の混合集団であることが当業者には理解される。したがって、多様なCD45+白血球群内の細胞の亜集団が、本明細書全体を通して更なる機能的及び／又は構造的特徴によって特徴付けられる。「CD45+」という用語は、細胞集団内の細胞の大部分又は本質的に全ての細胞がCD45+表面抗原を発現することを示す。これに関連して、また他の細胞表面抗原に関して、「発現する」という用語は、表面抗原が細胞内で産生され、細胞の表面上に検出可能に露出することを示す。発現のレベル、ひいては細胞の表面上に検出可能に露出した表面抗原の数は、白血球によって大幅に異なり得る。概して、少なくとも5個、好ましくは少なくとも10個の表面抗原のコピーが細胞の表面上に検出可能に露出する場合に、細胞は細胞表面抗原について陽性であるとみなされ、すなわち「+」と示される。当業者は、所与の細胞表面抗原について陽性（又は陰性）である細胞を検出、定量化及び選択する方法を十分に認識している。好ましい方法には蛍光活性化細胞選別（FACS）が含まれる。この技術では、蛍光標識抗体を用いて細胞集団の細胞表面抗原に結合させ、細胞を続いて単一細胞へと単離し、単一細胞について測定される蛍光強度に基づいて、所与の細胞表面抗原について陽性又は陰性として特徴付ける。本発明の幾つかの実施形態では、所与のタンパク質の発現が高い又は低いことが示される。これは、タンパク質が異なるレベルではあるが、どちらの場合も検出可能に発現する、すなわち「+」であることを意味する。高発現及び低発現はそれぞれ、異なるタンパク質について細胞1つ当たりの異なる絶対数のタンパク質を意味する。このため、所与のタンパク質は、細胞1つ当たり500個を超える検出可能なコピーのそのタンパク質が存在する場合に高レベルで発現し、細胞1つ当たり1個～50個の検出可能なコピーのそのタンパク質が存在する場合に低レベルで発現するとみなすことができる。しかしながら、別のタンパク質は、細胞1つ当たり5000個を超える検出可能なコピーが存在する場合に高レベルで発現し、1個～500個の検出可能なコピーが存在する場合に低レベルで発現するとみなすことができる。フローサイトメトリー及びBecton Dickinson Quantibrite（商標）ビーズ法（例えば、Pannu, K.K., 2001, Cytometry. 2001 Dec 1;45(4):250-8を参照されたい）又は質量分析（例えば、Milo, R., 2013, Bioessays, 35(12): 1050-1055を参照されたい）を用いて、細胞内で発現又は産生されるタンパク質の数を定量化する方法が当該技術分野で既知である。本発明の目的上、所与のタンパク質の「高発現」という用語は、健常CD45+白血球集団において見られる最高発現レベル、すなわち細胞1つ当たりのコピー数の少なくとも70%である、そのタンパク質の検出可能な発現を指す。所与のタンパク質の「低発現」という用語は、健常CD45+白血球集団において見られる最高発現レベル、すなわち細胞1つ当たりのそのタンパク質のコピー数の30%以下である、そのタンパク質の検出可能な発現を指す。「最高発現レベル」は、種々の被験体の健常CD45+白血球において見られる最高発現レベルの平均として決定するのが好ましい。幾つかの実施形態では、細胞の好ましい亜集団は、所与のタンパク質を「産生する」として特徴付けられる。これは、タンパク質が必ずしも細胞の表面上で検出可能でなく、細胞内にのみ存在していてもよいことを意味すると理解される。当業者は、細胞内のタンパク質の産生を検出及び／又は定量化し、及び／又はかかるタンパク質を産生する細胞を選択する方法を十分に認識している。
「分化単球」という用語は、主に骨髄に常在し（脾臓にも見られ得る）、樹状細胞又はマクロファージのいずれかへと分化するマクロファージ-DC前駆体（MDP）と呼ばれる関与前駆体から分化した単球を指すために本発明において使用される。マウスにおいては、これらは2つの主要亜集団：（i）CX3CR1の高発現、CCR2及びLy6C-の低発現を有するCD11b+細胞、並びに（ii）CX3CR1の低発現、CCR2及びLy6C+の高発現を有するCD11b+細胞からなる。骨髄から離れた後、マウスLy6C+単球は循環中でLy6C-単球へと分化する。同様に、ヒト単球分化においては、CD14++古典的単球が骨髄から離れ、末梢血循環中でCD14++ CD16+中間単球、また順次CD14+CD16++非古典的単球へと分化することが認められている（Yang et al.2014; Biomark Res 2(1) doi. 10.1186/2050-7771-2-1）。
マクロファージは、循環末梢血単球（PBM）から分化する組織常在性プロフェッショナル食細胞及び抗原提示細胞（APC）である。「活性化マクロファージ」という用語は、偏向した任意のマクロファージを指すために本発明において使用される。マクロファージ活性化は概して、インターロイキン、サイトカイン及び／又は成長因子とのインキュベーションによって達成される。特に、IL-4及びM-CSFを活性化剤として使用することができる。異なる表現型の活性化マクロファージがM1-マクロファージ、古典的活性化マクロファージ（CAM）及びM2-マクロファージ、代替活性化マクロファージ（AAM）へと分類される。古典的活性化M1-マクロファージは、急性炎症表現型を有する免疫エフェクター細胞を含む。これらは細菌に対して非常に攻撃的であり、多量のリンホカインを産生する（Murray, and Wynn, 2011, J Leukoc Biol, 89(4):557-63）。代替活性化抗炎症M2-マクロファージは少なくとも3つのサブグループに分けることができる。これらのサブタイプは免疫の調節、耐性の維持及び組織修復／創傷治癒を含む様々な異なる機能を有する。「M1誘導因子」という用語は、M1型のマクロファージへのPBMの分化を指向する化合物を指すために本発明において使用される。「M2誘導因子」という用語は、M2型のマクロファージへのPBMの分化を指向する化合物を指すために本発明において使用される。当業者は、M1又はM2マクロファージのいずれかへの分化を促進する多数の方法を認識している。
「マクロファージによる食作用」という用語は、マクロファージが固体粒子を飲み込み、ファゴソームとして知られる内部小胞を形成するプロセスである。
使用される「鉄結合タンパク質」という用語は、鉄イオンを非共有結合するタンパク質を指す。かかるタンパク質の例はフェリチン、ヘモグロビン、トランスフェリン及びラクトフェリンを含む。鉄結合タンパク質に細胞表面受容体が結合することで、これらのタンパク質の細胞への内在化が促進される。
第1の態様では、本発明は、好ましくは鉄結合タンパク質を内在化させることが可能なCD45+白血球細胞を含み、該細胞内に1つ以上の鉄結合タンパク質と1つ以上の有効成分との複合体を含む単離標的化送達系に関する。
鉄結合タンパク質を内在化する所与のCD45+白血球細胞又は細胞集団の能力は、この内在化プロセスに関与する受容体の発現によって決まる。フェリチンの内在化をもたらす受容体には、例えばTfR、CXCR4、CD163及びTIM-2が含まれる。当業者は、鉄結合タンパク質の取込み量を測定する方法を十分に認識しており、取込みを測定する好ましい方法を下記の実施例の項に記載する。本発明者らは、CD45+白血球細胞の亜集団が或る鉄結合タンパク質を別の鉄結合タンパク質よりも内在化する或る特定の傾向を有し、より高い複合体濃度に達し、及び／又は細胞からの複合体のより少ない漏出を示すことができることにも注目した。かかるCD45+白血球亜集団を下記により詳細に記載する。
「1つ以上の鉄結合タンパク質と有効成分との複合体」という表現は本発明において使用される場合、有効成分の1つ以上の分子が1つ以上の鉄結合タンパク質に共有結合又は非共有結合した組成物を指す。1つ以上の鉄結合タンパク質と1つ以上の有効成分との間の共有結合又は非共有結合は、直接的であっても又は間接的であってもよい。後者の場合、有効成分はリンカー又はスペーサーを介して鉄結合タンパク質に連結される。ポリアラニン、ポリグリシン、炭水化物、（CH2）n基又はポリペプチドリンカー等のリンカー又はスペーサーが当業者に既知である。このため、当業者は、それぞれの用途に応じてそれぞれの好適なリンカー（複数の場合もある）又はスペーサー（複数の場合もある）を選択することが可能である。鉄結合タンパク質が、例えばフェリチンのようなケージを形成する場合、「複合体」という用語は、タンパク質（複数の場合もある）と活性化合物（複数の場合もある）との間の共有結合又は非共有結合の非存在下でのケージ内への有効成分の封入も包含する。複合体の形成は、細胞に鉄結合タンパク質が内在化する場合の細胞への有効成分の輸送を可能にする。このため、輸送機構を妨げないように有効成分を鉄結合タンパク質に結合することが好ましい。当業者はこれを当該技術分野で既知の取込みアッセイを用いて容易に試験することができ、下記の実施例の項に記載する。複合体が身体内の標的領域への細胞内での輸送を切り抜けるよう、十分に安定していることが好ましい。このため、有効成分単独ではなく、複合体を細胞又は標的領域の細胞へと送達することが好ましい。この特性により、CD45+白血球に対する有効成分の潜在的有害作用、例えば細胞毒性も低減する。有効成分を鉄結合タンパク質に共有結合する場合、かかるカップリングは、鉄結合タンパク質の細胞取込みに必要とされる細胞受容体への結合に関与しない表面領域に位置することが知られるアミノ酸残基によるものであるのが好ましい。本発明において使用される鉄結合タンパク質は、広範な有効成分と安定な非共有結合複合体を形成することができる。
CD45+白血球は治療対象の患者に由来し、そのような場合に複合体がロードされる細胞は患者に対して自己であり得る。患者が本発明の標的化送達による治療前にMHCタイピングされ、所与の患者に使用される白血球細胞型のMHCが患者と一致していることも想定される。これら2つの好ましい実施形態では、CD45+白血球は初代細胞であるか、又は少数の分化工程により初代細胞から誘導される。代替的には、CD45+白血球は不死化されているが、好ましくは形質転換されていないCD45+白血球細胞株に由来するものであってもよい。このため、CD45+白血球、好ましくはマクロファージの単離に使用される血液は治療対象の患者又は健常ドナーから得るのが好ましい。代替的には、血液は血液バンクから得ることができる。臍帯血の使用も本明細書で検討される。
本発明者らは、CD34+造血前駆細胞から作製可能なCD45+白血球の亜集団が、有効成分の標的特異的送達に特に好適であることに注目した。したがって、標的送達系の作製に使用される白血球がCD34+造血前駆細胞に由来することが好ましい。当業者は、CD34+造血前駆細胞を選択する方法及びかかる細胞を白血球へと分化させる方法を十分に認識している。
好ましくは、CD45+白血球は、単球、分化単球、リンパ球及び顆粒球からなる群から選択される。これらの白血球の一般的カテゴリー内の好ましい亜集団は、以下の構造パラメータ、例えば所与のタンパク質の存在又は非存在、機能的特性及び／又はそれらの作製／分化方法によって規定される。上記に概説されるように、集団内の細胞の大部分が特定の特性を有する限りにおいて、細胞の集団における全ての細胞がその特性を有するわけではない場合であっても、本発明の標的化送達系は上記に概説される利点をもたらす。このため、以下に本発明の標的化送達系の或る好ましい細胞の特性を記載する。本発明の医薬組成物が何百万もの細胞を含み、集団内の全ての細胞が本明細書で概説される機能的及び／又は構造的特性を有するわけではないが、それにもかかわらず、細胞の大部分がそれぞれの機能的及び／又は構造的特性を共有する場合に、医薬組成物を疾患の治療に使用することができることが当業者に認められる。
本発明者らにより、CD45+白血球の亜集団が、特に複合体取込みの効率及び／又は量、概して複合体を細胞内に保持する、すなわち漏出を回避する能力、及び有効成分の標的放出の効率及び／又は量、特定の鉄結合タンパク質の取込み、及び／又は特定の組織若しくは細胞への標的化の効率、ひいては特定の疾患の治療又は改善への適合性を含む特定の有利な特性を有することが認識された。本発明者らにより、例えば以下の抗原：CD204、CD206、CD200R、CCR2の1つ以上を発現するCD45+白血球が他の鉄結合タンパク質の取込みに対してフェリチン取込みへの選好を有することが観察された。このため、複合体中の鉄結合タンパク質がフェリチンである場合、以下の抗原：CD204、CD206、CD200R、CCR2の1つ以上を発現するCD45+白血球を選択するのが好ましい。したがって、本発明の好ましい実施形態では、
（i）単球が、好ましくはCD11b+ CD14+単球、CD11b+ CD16+単球、CD11b+CD14+ CD16+単球、CD11b+ CD14+MHCII+単球、CD11b+ CD14+ CD115+単球、CD11b+ CD114+単球、CD11b+CD116+単球、CD11b+ CCR1+単球、CD11b+ CCR2+単球、CD11b+CX3CR+単球、CD11b+ CXR4+単球、CD11b+ CXR6+単球及びCD11b+CD14+ CD33+単球からなる群から選択されるCD11b+単球である；
（ii）分化単球が、マクロファージ、活性化マクロファージ、好ましくはCD11b+マクロファージ、より好ましくはCD11b+ CD16+マクロファージ、CD11b+CD32+マクロファージ、CD11b+ CD64+マクロファージ、CD11b+ CD68+マクロファージ、好ましくはCD11b+ CD86+ M1マクロファージ、好ましくは誘導性一酸化窒素合成酵素（iNOS）を産生する及び／又はインターロイキン12（IL-12）を分泌するもの、又は好ましくはCD11b+ CCR2+M2マクロファージ、CD11b+ CD204+ M2マクロファージ、CD11b+ CD206+ M2マクロファージ、CD11b+ CD204+ CD206+ M2マクロファージ、CD11b+主要（Major）組織適合遺伝子複合体II+（MHCII+）（低発現又は高発現）M2マクロファージ、CD11b+ CD200R+ M2マクロファージ、CD11b+ CD163+ M2マクロファージ、若しくはアルギナーゼ-1及び／又はインターロイキン10（IL-10）を産生及び／又は分泌する活性化マクロファージ、又は好ましくはCD11b CD11c、CD11b CD80、CD11c CD80、CD11c CD86、CD11c MHCII及びCD11c CD123の発現を有する樹状細胞からなる群から選択され、好ましくは、分化単球はレクチン様酸化低密度リポタンパク質受容体-1（Lox1+）、C-X-Cケモカイン受容体タイプ7（CXCR7+）及び核因子（赤血球由来2）様2（NRF2+）を発現する泡沫細胞ではない。泡沫細胞は、血管壁の脂肪性沈着物に局在化し、そこで低密度リポタンパク質を捕食し、脂質がロードされ、泡沫状外観が与えられるマクロファージの一種である。これらの細胞はプラーク成長に関与する様々な物質を分泌し、それらの死により炎症が促進されるため、心血管疾患に寄与する；
（iii）単球又は活性化単球が、好ましくはCCR1、CCR2、CXR4及びCXR6からなる群から選択される少なくとも1つのケモカイン受容体、又は好ましくはマクロファージコロニー刺激因子受容体（CD115）、顆粒球コロニー刺激因子受容体（CD114）及び顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子受容体（CD116及びCD131からなる）からなる群から選択される少なくとも1つの成長因子受容体を発現する。これらの特徴の単球は炎症状態及び癌の治療に特に好適である；
（iv）リンパ球が、CD3+及びCD4+若しくはCD8+ Tリンパ球、若しくはCD19+、CD20+、CD21+、CD19+ CD20+、CD19+ CD21+、CD20+CD21+若しくはCD19+ CD20+ CD21+Bリンパ球からなる群から選択される；又は、
（v）顆粒球が、好中球、好ましくはCD66b+好中球、好酸球及び好塩基球、好ましくはCD193+好酸球からなる群から選択される。
本発明の標的化送達系の好ましい実施形態では、活性化マクロファージは、
（i）マクロファージ上の発現マーカーを変化させることが可能な因子との、好ましくは、
（a）少なくとも1つのM1誘導因子との、
（b）少なくとも1つのM2誘導因子との、若しくは、
（c）サイトカイン、好ましくはIL-10及びIL-12、ケモカインを分泌する、及び／又はiNOS、アルギナーゼ若しくは他の免疫調節酵素を産生するマクロファージの能力を変化させることが可能な因子（かかる因子の例は活性化血小板、IL-4、IL-10、IL-13、抗原と抗体との免疫複合体、IgG、熱活性化γ-グロブリン、糖質コルチコステロイド、腫瘍成長因子-β（TGF-β）、IL-1R、CC-ケモカインリガンド2（CCL-2）、IL-6、マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（PPARγ）アゴニスト、白血球阻止因子（LIF）、アデノシン、蠕虫感染及び真菌感染、リポ多糖（LPS）、インターフェロンγ（INF-γ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、並びにウイルス感染及び細菌感染である；この点で、M1誘導因子、特にLPSによる単球の活性化が細胞にiNOSを発現させ、M1誘導因子、特にLPSによる単球の活性化が細胞にアルギナーゼ-1を発現させず、M2誘導因子、特にIL-4による単球の活性化が細胞にアルギナーゼ-1を発現させ、M2誘導因子、特にIL-4による単球の活性化が細胞にiNOSを発現させないことが観察された）との、
単球若しくはマクロファージ、若しくはそれらの前駆体のin vitroインキュベーションによって作製可能であり、
（ii）以下の抗原：CD64、CD86、CD16、CD32の少なくとも1つの発現、MHCIIの高発現、及び／又はiNOS及び／又はIL-12の産生を特徴とし、
（iii）マクロファージの貪食能力を誘導することが可能な因子、例えばIL-18、オプソニン（例えば、iC3b等の補体由来タンパク質、免疫グロブリンG）、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（CGRP）、リポ多糖（LPS）、インターフェロンγ（INF-γ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、ウイルス感染及び／又は細菌感染との単球若しくはマクロファージのin vitroインキュベーションによって作製可能であり、
（iv）以下の抗原：CD204、CD206、CD200R；CCR2、トランスフェリン受容体（TfR）、CXC-モチーフ（motif）ケモカイン受容体4（CXCR4）、CD163、及び／又はT細胞免疫グロブリン－ドメイン及びムチン－ドメイン2（TIM-2）の少なくとも1つの発現を特徴とし、及び／又はMHCIIの低発現を示し（これらの特性を有する活性化マクロファージは、フェリチンを鉄結合タンパク質として含む複合体に特に好適である）、
（v）貪食能力を有し、及び／又は、
（vi）サイトカイン、好ましくはIL-12若しくはIL-10の分泌、若しくは誘導性一酸化窒素合成酵素（iNOS）（又は他の炎症誘発性化合物）、アルギナーゼ若しくは他の免疫抑制性／抗炎症性化合物の産生が可能である。
本発明の標的化送達系の好ましい実施形態では、マクロファージをM1マクロファージへと分化させるためのM1誘導因子はリポ多糖（LPS）、インターフェロンγ（INF-γ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、並びにウイルス感染及び細菌感染からなる群から選択され、マクロファージをM2マクロファージへと分化させるためのM2誘導因子はIL-4、IL-10、IL-13、抗原と抗体との免疫複合体、IgG、熱活性化γ-グロブリン、糖質コルチコステロイド、腫瘍成長因子-β（TGF-β）、IL-1R、CC-ケモカインリガンド2（CCL-2）、IL-6、マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（PPARγ）アゴニスト、白血球阻止因子（LIF）、アデノシン、蠕虫感染及び真菌感染からなる群から選択される。
驚くべきことに、複合体をロードしたM1マクロファージ及びM2マクロファージの両方が低酸素組織、好ましくは腫瘍又はその転移への標的化活性物質送達に好適であることが本発明者らによって見出された。概して、投与されたM1マクロファージの3%～5%が腫瘍部位に局在化し、M2マクロファージの約35%が腫瘍特異的な標的化を示すことが観察された。しかしながら、このM2マクロファージの一般的利点は、ヘモグロビンと薬物とを含む複合体を使用した場合に、M2マクロファージよりも顕著に多量のこの複合体がM1マクロファージへとロードされることから相殺された。概して、この特異的指向性から、M2マクロファージは低酸素組織を特徴とする腫瘍及び疾患の治療により好適である。
本発明の標的化送達系の好ましい実施形態では、単球が、
（i）CD34+造血前駆細胞から作製可能であり、
（ii）少なくとも1つの誘導因子、好ましくはM1又はM2誘導因子、より好ましくは少なくとも1つのM2誘導因子との単球のinvitroインキュベーションによって作製可能であり、
（iii）以下の抗原：TfR、CD163、TIM-2、CD14、CD16、CD33及び／又はCD115の少なくとも1つの発現を特徴とし、
（iv）以下の抗原：TfR、CD163、TIM-2、CXCR4、CD14及び／又はCD16の少なくとも1つの発現を特徴とし、及び／又は、
（v）貪食能力を有する。
本発明の標的化送達系のこの実施形態では、単球を分化させるためのM1誘導因子がLPS、INF-γ、GM-CSF、若しくはウイルス感染若しくは細菌感染からなる群から選択されるか、又は単球を分化させるためのM2誘導因子がIL-4、IL-10、IL-13、抗原と抗体との免疫複合体、IgG、熱活性化γ-グロブリン、糖質コルチコステロイド、TGF-β、IL-1R、CCL-2、IL-6、M-CSF、PPARγアゴニスト、白血球阻止因子（LIF）、癌馴化培地、癌細胞、アデノシン、及び蠕虫感染若しくは真菌感染からなる群から選択される。
驚くべきことに、単球が低酸素組織、好ましくは腫瘍又はその転移への標的化活性物質送達に好適であり、M2活性化因子で処理した単球が低酸素組織、好ましくは腫瘍又はその転移への標的化活性物質送達により好適であることが本発明者らによって見出された。この特異的指向性から、M2活性化因子で処理した単球は腫瘍及び低酸素部位の治療により好適である。
本発明の標的化送達系の好ましい実施形態では、リンパ球が、
（i）血液、脾臓若しくは骨髄から得られるか、又は当業者に既知であり、また例えばLefort and Kim, 2010, J Vis Exp 40: 2017、Tassone and Fidler, 2012, Methods in Molecular Biology882: 351-357、Kouro et al. 2005, Current Protocols inImmunology, 66:F22F.1:22F.1.1-22F.1.9.に記載されるようにCD34+前駆細胞から作製可能であり、
（ii）免疫適格リンパ球であり、
（iii）抗原特異的T細胞受容体を発現し、及び／又は、
（iv）以下の抗原：（a）CD3及びCD4若しくはCD8、又は（b）CD19、CD20、CD21、CD19 CD20、CD19 CD21、CD20CD21若しくはCD19 CD20 CD21抗原の少なくとも1つの発現を特徴とし、好ましくは免疫グロブリンを産生することが可能である。
本発明の標的化送達系の好ましい実施形態では、顆粒球が、
（i）血液、脾臓若しくは骨髄から得られるか、又は例えばKuhs et al. 2015, Curr Protoc Immunol 111:7.23-1-7.23.16、Coquery et al. 2012, Cytometry A 81(9): 806-814、Swemydas and Lionakis 2013, J Vis Exp 77: 50586.に記載のようにCD34+前駆細胞から作製可能であり、
（ii）CD66b及び／又はCD193の少なくとも1つの発現を特徴とし、
（iii）その細胞質における顆粒の存在を特徴とする多形核白血球であり、及び／又は、
（iii）TfR、CD163、TIM-2及び／又はCXCR4の少なくとも1つの発現を特徴とする。
本発明の標的化送達系の好ましい実施形態では、鉄結合タンパク質はフェリチン、好ましくは重鎖（H）型フェリチン、軽鎖（L）フェリチン及び／又はミトコンドリアのフェリチン；ヘモグロビン、好ましくはヘモグロビンA、ヘモグロビンAS、ヘモグロビンSC、ヘモグロビンC、ヘモグロビンD、ヘモグロビンE、ヘモグロビンF、ヘモグロビンH；ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体、ヘモペキシン（haemopexin）、トランスフェリン；並びにラクトフェリンからなる群から選択される。フェリチン；ヘモグロビン、好ましくはヘモグロビンA、ヘモグロビンAS、ヘモグロビンSC、ヘモグロビンC、ヘモグロビンD、ヘモグロビンE、ヘモグロビンF、ヘモグロビンH；ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体、ヘモペキシン、トランスフェリン；及びラクトフェリンという用語は自然発生タンパク質の構造変異体を包含し、それぞれの野生型タンパク質の鉄イオン（複数の場合もある）に結合する能力の少なくとも70%、好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも100%を有するタンパク質に関する。本発明において使用される鉄結合タンパク質は、好ましくは哺乳動物、より好ましくはマウス、ラット、イヌ、類人猿、特にチンパンジー又はヒト、最も好ましくはヒト起源のものである。本発明において使用される好ましい鉄結合タンパク質のコンセンサス配列を図1に示す。好ましい構造変異体は図1に示される配列に基づくものである。Xで印される残基は哺乳動物フェリチン、トランスフェリン及びヘモグロビンによって異なる。これらの残基の変化は、鉄イオンに結合するタンパク質の能力にとって重要でない。したがって、アミノ酸の突然変異又は欠失がXで印される残基の1つ以上に生じるのが好ましい。
血漿タンパク質は常に、癌療法における医薬品有効成分（active pharma ingredients）の送達にとって特権的な担体であった。このため、最も豊富な血漿タンパク質であるアルブミンが、タキサン分子及びドキソルビシン誘導体の送達のための治療プロトコルに現在使用されている（Larsen MT et al. 2016, Mol Cell Ther 27;4:3）。
ヒトトランスフェリン及びフェリチンタンパク質が、特定の標的癌細胞への小分子又は毒素－コンジュゲートの送達に効果的な担体とみなされている。しかしながら、これまで、多大な労力にもかかわらず、トランスフェリン又はフェリチン薬物複合体は臨床への到達に成功していない（Luck AN et al. 2013, Adv Drug Deliv Rev 65(8):1012-9）。
フェリチンはケージ構造及び鉄結合能力を有するため、その空洞内に薬物を封入するために使用することができる。フェリチンは血漿中で豊富ではないが、大腸菌（Escherichia coli）細胞等の一般的なタンパク質発現ベクターにおいて組み換えタンパク質として高収率で容易に作製することができる。フェリチンH鎖又はL鎖は、直径8 nmの空洞を画定するケージ様構造への24マー集合が可能な低分子タンパク質モノマー（H鎖及びL鎖のそれぞれについて21 kDa及び19KDa）としてコードされる。本発明者らは、本発明の取組みにおいて、H-フェリチンホモポリマーがTfRを発現するCD45+白血球細胞へと封入薬物を特異的に送達するために好ましいタンパク質構築物であることに注目した。さらに、H-フェリチン標的により有効成分が細胞核と複合する（したがって、DNA結合タンパク質が核内に直接送達される）。
精製トランスフェリンは、細胞内に適切に放出される幾つかの抗癌剤に共有結合リンカーを介して効率的にコンジュゲートすることができる（Beyer U et al. 1998, J Med Chem 41(15):2701-2708）。トランスフェリンの場合、タンパク質表面上のリシン基のみが共有結合的付着に即時に利用可能である。
ヘモグロビンは従来、薬物との化学的コンジュゲーションにおけるその多用途性、血中でのその豊富さ及び相対的安定性から有力な薬物担体とみなされてきた（Somatogen, 1993、国際公開第1993008842号）。それにもかかわらず、受容体標的化特性の欠如から、代用血液又は抗鎌状化剤以外の生物医学的用途は発展していない。実際のところ、Hbは特に単球－マクロファージ起源の白血球上のCD163（ハプトグロビン／ヘモグロビン受容体）エピトープによってのみ認識され得る。本願に記載されるCD45+白血球、特にマクロファージベースのタンパク質送達により、ヘモグロビンは標的特異的薬物担体としての中心的な立場へと移行している。ヘモグロビンは、ヘム結合ポケット内のホスト疎水性薬物分子である適切な薬物コンジュゲートに容易に共有結合的に連結し、又は更にはヘム鉄に連結した小細胞毒性分子を輸送することができる。Hbは、タンパク質表面上の唯一の滴定可能なシステインであるβ93システイン残基への適切な薬物コンジュゲートの選択的付着によって容易に修飾することができる。チューブリン（tubulin）阻害剤モノメチルオーリスタチン（MMAE）等のマレイミド官能化薬物又はDNA架橋薬物ピロロベンゾジアゼピン二量体（PBD）が、関連cys β93残基に容易かつ特異的に付着することができる極めて強力な細胞毒性薬の最も顕著な例である。
代替的には、Hb表面上のリシン残基（Hb四量体1つ当たり少なくとも10個の滴定可能なリシン残基）に、切断可能なスクシンイミドリンカーを介した薬物コンジュゲーションを容易に行うことができる。ヘモグロビンも非共有結合したヘム基を酸性pH値で放出する独自の能力を示す。このようにして得られるアポヘモグロビンは、パクリタキセルの場合に示されるように、幾つかの疎水性分子を空のヘムポケット内に受け入れることが可能である（Meng Z et al. 2015 J Pharm Sci 104(3):1045-55）。
いずれのコンジュゲーション／吸着／結合方法であっても、腫瘍標的化特性を有する適切な細胞系、例えば活性化マクロファージにロードされる場合にヘモグロビン（Hb）、トランスフェリン（Tf）及びフェリチンが特権的な薬物担体であることが本発明によって示された。これらのタンパク質の容易、迅速、安価かつ安全な精製手順も多大な付加価値をもたらす。
哺乳動物H型フェリチン、L型フェリチン、ヘモグロビンα鎖、ヘモグロビンβ鎖及びトランスフェリンの配列に基づいて、コンセンサス配列をこれらのタンパク質の各々について決定した（これらを図1の配列番号2、7、9、14、16、20及び25のそれぞれに示す）。これに基づいて、また従来技術において開示される欠失及び構造分析に基づいて、CD45+白血球による取込みに十分な最小フラグメントをH型フェリチン、L型フェリチン、ヘモグロビンα鎖及びヘモグロビンβ鎖について決定した。これらを配列番号1、3、5（H型フェリチン）、8、10、12（L型フェリチン）、15及び17（ヘモグロビンα鎖）、並びに19及び21（ヘモグロビンβ鎖）に示す。トランスフェリンは、1つのポリペプチドに含まれ、100アミノ酸～450アミノ酸離れて、好ましくは150アミノ酸～400アミノ酸、より好ましくは200アミノ酸～350アミノ酸、より好ましくは250アミノ酸～320アミノ酸離れて位置する場合に、鉄の結合及びCD45+白血球による取込みに必要とされるN末端に位置したドメイン及びC末端に位置したドメインを含む。N末端ドメインは、完全長コンセンサストランスフェリン（配列番号25）又は完全長ヒトトランスフェリン（配列番号28）のアミノ酸1～82を含む。C末端ドメインは、完全長コンセンサストランスフェリン（配列番号25）又は完全長ヒトトランスフェリン（配列番号28）のアミノ酸396～510を含む。いずれの場合も、Xがコンセンサス配列中に示され、独立して任意のアミノ酸を表し、哺乳動物H型フェリチンにおいて保存されない又は僅かしか保存されないアミノ酸を特徴とし、それぞれの鉄結合タンパク質の鉄結合特性を損なうことなく又は僅かしか損なわずに突然変異することができる。Xはいずれの場合にも、Xと一致するそれぞれのヒト鉄結合タンパク質のアミノ酸を意味することが好ましい。この情報は、例えばヒト、場合によってはマウスタンパク質とのコンセンサス配列のアラインメントを示す図1から引き出すことができる。
好ましいH型フェリチンは、配列番号1に示されるアミノ酸配列、並びに少なくとも70%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも75%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも80%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも85%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも90%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも95%のアミノ酸同一性、及びいずれの場合にも配列番号1によるアミノ酸配列からなるH型フェリチンのCD45+白血球、好ましくはM2白血球に取り込まれる能力の少なくとも70%を有するその変異体含むか、又はそれからなる。配列番号1において、5位のXは存在しても又は存在しなくてもよく、存在する場合に任意のアミノ酸、好ましくはIleを意味し、6位のXは任意のアミノ酸、好ましくはAsnを意味し、14位のXは任意のアミノ酸、好ましくはTyrを意味し、24位のXは任意のアミノ酸、好ましくはTyr又はCysを意味し、66位のXは任意のアミノ酸、好ましくはPheを意味し、68位のXは任意のアミノ酸、好ましくはGlnを意味し、75位のXは任意のアミノ酸、好ましくはArg又はCysを意味し、90位のXは任意のアミノ酸、好ましくはHisを意味し、94位のXは任意のアミノ酸、好ましくはSer又はAsnを意味し、120位のXは存在しても又は存在しなくてもよく、存在する場合に任意のアミノ酸、好ましくはHis又はTyr、より好ましくはHisを意味し、123位のXは任意のアミノ酸、好ましくはAsn又はSer、より好ましくはAsnを意味し、128位のXは任意のアミノ酸、好ましくはAla又はSer、より好ましくは（preferably）Alaを意味する。
好ましい実施形態では、H型フェリチンは、配列番号3によるネズミフェリチンを含むか、又はそれからなる。したがって、好ましい構造変異体は少なくとも70%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも75%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも80%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも85%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも90%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも95%のアミノ酸同一性、及びいずれの場合にも配列番号3によるアミノ酸配列からなるH型フェリチンのCD45+白血球、好ましくはM2マクロファージに取り込まれる能力の少なくとも70%を有する。
好ましい実施形態では、H型フェリチンは、配列番号5によるヒトフェリチンを含むか、又はそれからなる。したがって、好ましい構造変異体は少なくとも70%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも75%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも80%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも85%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも90%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも95%のアミノ酸同一性、及びいずれの場合にも配列番号5によるアミノ酸配列からなるH型フェリチンのCD45+白血球、好ましくはM2マクロファージに取り込まれる能力の少なくとも70%を有する。
好ましい実施形態では、H型フェリチンは、配列番号2又は7（2が好ましい）による整列完全長H型フェリチンに由来する哺乳動物コンセンサス配列を含むか、又はそれからなる。したがって、好ましい構造変異体は少なくとも70%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも75%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも80%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも85%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも90%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも95%のアミノ酸同一性、及びいずれの場合にも配列番号2又は7（2が好ましい）によるアミノ酸配列からなるH型フェリチンのCD45+白血球、好ましくはM2マクロファージに取り込まれる能力の少なくとも70%を有する。配列番号2において、6位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはProとすることができ、14位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはHisとすることができ、16位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはAspとすることができ、21位のXは存在しても又は存在しなくてもよく、存在する場合に任意のアミノ酸、好ましくはIleを意味し、22位のXは任意のアミノ酸、好ましくはAsnを意味し、30位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはTyrとすることができ、40位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはTyr又はCys、より好ましくはTyrとすることができ、82位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはPheとすることができ、84位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはGlnとすることができ、91位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはArg又はCys、より好ましくはCysとすることができ、106位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはHisとすることができ、110位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはAsn又はSer、より好ましくはAsnとすることができ、137位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはHis又はTyr、より好ましくはHisとすることができ、140位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはAsn又はSer、より好ましくはAsnとすることができ、145位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはAla又はSer、より好ましくはAlaとすることができ、164位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはAla又はSer、より好ましくはSerとすることができ、166位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはMet又はLeu、好ましくはLeuとすることができ、178位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはAsp又はHis、より好ましくはAspとすることができ、181位のXは存在しないか、又は任意の自然発生アミノ酸、好ましくはAsnであり、182位のXは存在しないか、又は任意の自然発生アミノ酸、好ましくはGluであり、183位のXは存在しないか、又は任意の自然発生アミノ酸、好ましくはSerである。配列番号7において、6位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはProとすることができ、14位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはHisとすることができ、16位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはAspとすることができ、21位のXは存在しても又は存在しなくてもよく、存在する場合に任意のアミノ酸、好ましくはIleを意味し、29位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはTyrとすることができ、81位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはPheとすることができ、83位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはGlnとすることができ、105位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはHisとすることができ、144位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはAla又はSer、より好ましくはAlaとすることができ、180位のXは存在しないか、又は任意の自然発生（naturallyoccurring）アミノ酸、好ましくはAsnであり、181位のXは存在しないか、又は任意の自然発生アミノ酸、好ましくはGluであり、182位のXは存在しないか、又は任意の自然発生アミノ酸、好ましくはSerである。
好ましい実施形態では、H型フェリチンは、好ましくは配列番号4によるネズミ完全長フェリチンを含むか、又はそれからなる。したがって、好ましい構造変異体は少なくとも70%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも75%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも80%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも85%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも90%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも95%のアミノ酸同一性、及びいずれの場合にも配列番号4によるアミノ酸配列からなるネズミH型フェリチンのCD45+白血球、好ましくはM2マクロファージに取り込まれる能力の少なくとも70%を有する。
好ましい実施形態では、H型フェリチンは、好ましくは配列番号6によるヒト完全長フェリチンを含むか、又はそれからなる。したがって、好ましい構造変異体は少なくとも70%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも75%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも80%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも85%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも90%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも95%のアミノ酸同一性、及びいずれの場合にも配列番号6によるアミノ酸配列からなるヒトH型フェリチンのCD45+白血球、好ましくはM2マクロファージに取り込まれる能力の少なくとも70%を有する。
好ましいL型フェリチンは、配列番号8に示されるアミノ酸配列、並びに少なくとも70%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも75%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも80%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも85%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも90%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも95%のアミノ酸同一性、及びいずれの場合にも配列番号8によるアミノ酸配列からなるL型フェリチンのCD45+白血球、好ましくはM2白血球に取り込まれる能力の少なくとも70%を有するその変異体を含むか、又はそれからなる。配列番号8において、5位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはAsp又はGlu、より好ましくはAspとすることができ、12位のXは任意の自然発生（naturally occurring）アミノ酸、好ましくはArg又はSer、より好ましくはSerとすることができ、17位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはSer又はArg、より好ましくはSerとすることができ、19位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはArg又はGln、より好ましくはGlnとすることができ、29位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはPheとすることができ、30位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはTyr又はPhe、より好ましくはTyrとすることができ、42位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはSer又はGly、より好ましくはSerとすることができ、56位のXは任意の自然発生（naturally occurring）アミノ酸、好ましくはAla又はTyr、より好ましくはTyrとすることができ、61位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはGlu又はLys、より好ましくはLysとすることができ、62位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはMet又はPhe、より好ましくはMetとすることができ、65位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはAsp又はGln、より好ましくはGlnとすることができ、75位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはIle又はVal、より好ましくはIleとすることができ、76位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはLys又はGln、より好ましくはLysとすることができ、79位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはAla又はSer、より好ましくはAlaとすることができ、80位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはGlu又はGln、より好ましくはGlnとすることができ、87位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはPro又はGln、より好ましくはProとすることができ、88位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはGlu又はAsp、より好ましくはAspとすることができ、91位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはGlu又はLys、より好ましくはLysとすることができ、94位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはMet又はLeu、より好ましくはLeuとすることができ、96位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはMet又はLeu、より好ましくはMetとすることができ、99位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはLys又はAsn、好ましくはLysとすることができ、115位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはThr又はAla、より好ましくはThrとすることができ、119位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはLeuとすることができ、125位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはSer又はThr、より好ましくはThrとすることができ、127位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはTyr又はPhe、より好ましくはPheとすることができ、130位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはLys又はGlu、より好ましくはGluとすることができ、140位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはAsp又はAsn、より好ましくはAspとすることができ、146位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはArg又はHis、より好ましくはHisとすることができ、148位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはLeu又はVal、より好ましくはLeuとすることができる。
好ましい実施形態では、L型フェリチンは、配列番号10によるネズミL型フェリチンを含むか、又はそれからなる。したがって、好ましい構造変異体は少なくとも70%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも75%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも80%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも85%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも90%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも95%のアミノ酸同一性、及びいずれの場合にも配列番号10によるアミノ酸配列からなるL型フェリチンのCD45+白血球、好ましくはM2マクロファージに取り込まれる能力の少なくとも70%を有する。
好ましい実施形態では、L型フェリチンは、配列番号12によるヒトフェリチンを含むか、又はそれからなる。したがって、好ましい構造変異体は少なくとも70%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも75%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも80%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも85%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも90%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも95%のアミノ酸同一性、及びいずれの場合にも配列番号12によるアミノ酸配列からなるL型フェリチンのCD45+白血球、好ましくはM2マクロファージに取り込まれる能力の少なくとも70%を有する。
好ましい実施形態では、L型フェリチンは、配列番号9又は14（9が好ましい）による整列完全長H(L?)型フェリチンに由来する哺乳動物コンセンサス配列を含むか、又はそれからなる。したがって、好ましい構造変異体は少なくとも70%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも75%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも80%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも85%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも90%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも95%のアミノ酸同一性、及びいずれの場合にも配列番号9又は14（9が好ましい）によるアミノ酸配列からなるL型フェリチンのCD45+白血球、好ましくはM2マクロファージに取り込まれる能力の少なくとも70%を有する。配列番号9において、12位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはAsp又はGlu、より好ましくはAspとすることができ、19位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはSer又はArg、より好ましくはSerとすることができ、24位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはSer又はArg、より好ましくはSerとすることができ、26位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはArg又はGln、より好ましくはGlnとすることができ、36位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはPheとすることができ、37位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはTyr又はPhe、より好ましくはTyrとすることができ、47位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはSer又はGly、より好ましくはSerとすることができ、63位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはAla又はTyr、より好ましくはTyrとすることができ、68位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはGlu又はLys、より好ましくはLysとすることができ、69位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはMet又はPhe、より好ましくはMetとすることができ、72位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはAsp又はGln、より好ましくはGlnとすることができ、82位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはIle又はVal、より好ましくはIleとすることができ、83位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはLys又はGln、より好ましくはLysとすることができ、86位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはAla又はSer、より好ましくはAlaとすることができ、87位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはGlu又はGln、より好ましくはGlnとすることができ、94位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはPro又はGln、より好ましくはProとすることができ、95位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはGlu又はAsp、より好ましくはAspとすることができ、98位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはGlu又はLys、より好ましくはLysとすることができ、101位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはMet又はLeu、より好ましくはLeuとすることができ、103位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはMet又はLeu、より好ましくはMetとすることができ、106位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはLys又はAsn、好ましくはLysとすることができ、Xは任意の自然発生アミノ酸とすることができ、126位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはLeuとすることができ、132位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはSer又はThr、より好ましくはThrとすることができ、134位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはTyr又はPhe、より好ましくはPheとすることができ、137位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはLys又はGlu、より好ましくはGluとすることができ、147位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはAsp又はAsn、より好ましくはAspとすることができ、153位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはArg又はHis、より好ましくはHisとすることができ、155位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはLeu又はVal、より好ましくはLeuとすることができ、161位のXは存在しないか、又は任意の自然発生アミノ酸、好ましくはAlaとすることができ、163位のXは存在しないか、又は任意の自然発生アミノ酸、好ましくはThrとすることができ、166位のXは存在しないか、又は任意の自然発生アミノ酸、好ましくはProとすることができ、168位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはGly又はAla、より好ましくはAlaとすることができる。配列番号14において、36位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはPheとすることができ、37位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはTyr又はPhe、より好ましくはTyrとすることができ、94位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはPro又はGln、より好ましくはProとすることができ、126位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはLeuとすることができ、137位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはLys又はGlu、より好ましくはGluとすることができ、147位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはAsp又はAsn、より好ましくはAspとすることができ、Xは任意の自然発生アミノ酸とすることができ、163位のXは存在しないか、又は任意の自然発生アミノ酸、好ましくはThrとすることができ、166位のXは存在しないか、又は任意の自然発生アミノ酸、好ましくはProとすることができ、168位のXは任意の自然発生アミノ酸、好ましくはGly又はAla、より好ましくはAlaとすることができる。
好ましい実施形態では、L型フェリチンは、好ましくは配列番号11によるネズミ完全長フェリチンを含むか、又はそれからなる。したがって、好ましい構造変異体は少なくとも70%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも75%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも80%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも85%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも90%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも95%のアミノ酸同一性、及びいずれの場合にも配列番号11によるアミノ酸配列からなるネズミL型フェリチンのCD45+白血球、好ましくはM2マクロファージに取り込まれる能力の少なくとも70%を有する。
好ましい実施形態では、L型フェリチンは、好ましくは配列番号13によるヒト完全長フェリチンを含むか、又はそれからなる。したがって、好ましい構造変異体は少なくとも70%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも75%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも80%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも85%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも90%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも95%のアミノ酸同一性、及びいずれの場合にも配列番号13によるアミノ酸配列からなるヒトL型フェリチンのCD45+白血球、好ましくはM2マクロファージに取り込まれる能力の少なくとも70%を有する。
好ましい実施形態では、αヘモグロビンは、配列番号15による整列完全長αヘモグロビンに由来する最小哺乳動物コンセンサス配列を含むか、又はそれからなり、好ましくは配列番号15に示されるアミノ酸配列、並びに少なくとも70%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも75%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも80%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも85%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも90%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも95%のアミノ酸同一性、及びいずれの場合にも配列番号15によるアミノ酸配列からなるαヘモグロビンのCD45+白血球、好ましくはM1マクロファージに取り込まれる能力の少なくとも70%を有するその変異体を含むか、又はそれからなる。
好ましい実施形態では、αヘモグロビンは、配列番号17によるヒトαヘモグロビンに由来する最小ヒトアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。したがって、好ましい構造変異体は少なくとも70%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも75%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも80%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも85%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも90%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも95%のアミノ酸同一性、及びいずれの場合にも配列番号17によるアミノ酸配列からなるαヘモグロビンのCD45+白血球、好ましくはM1マクロファージに取り込まれる能力の少なくとも70%を有する。
好ましい実施形態では、αヘモグロビンは、配列番号16による整列完全長αヘモグロビンに由来する哺乳動物コンセンサス配列を含むか、又はそれからなる。したがって、好ましい構造変異体は少なくとも70%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも75%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも80%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも85%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも90%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも95%のアミノ酸同一性、及びいずれの場合にも配列番号16によるアミノ酸配列からなるαヘモグロビンのCD45+白血球、好ましくはM2(M1?)マクロファージに取り込まれる能力の少なくとも70%を有する。
好ましい実施形態では、αヘモグロビンは、配列番号18によるヒト完全長αヘモグロビンを含むか、又はそれからなる。したがって、好ましい構造変異体は少なくとも70%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも75%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも80%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも85%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも90%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも95%のアミノ酸同一性、及びいずれの場合にも配列番号18によるアミノ酸配列からなるヒト完全長αヘモグロビンのCD45+白血球、好ましくはM2(M1?)マクロファージに取り込まれる能力の少なくとも70%を有する。
好ましい実施形態では、α(β?)ヘモグロビンは、配列番号19による整列完全長βヘモグロビンに由来する最小哺乳動物コンセンサス配列、並びに少なくとも70%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも75%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも80%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも85%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも90%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも95%のアミノ酸同一性、及びいずれの場合にも配列番号19によるアミノ酸配列からなるβヘモグロビンのCD45+白血球、好ましくはM1マクロファージに取り込まれる能力の少なくとも70%を有するその変異体を含むか、又はそれからなる。
好ましい実施形態では、α(β?)ヘモグロビンは、配列番号21によるヒトβヘモグロビンに由来する最小ヒトアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。したがって、好ましい構造変異体は少なくとも70%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも75%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも80%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも85%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも90%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも95%のアミノ酸同一性、及びいずれの場合にも配列番号21によるアミノ酸配列からなるβヘモグロビンのCD45+白血球、好ましくはM1マクロファージに取り込まれる能力の少なくとも70%を有する。
好ましい実施形態では、βヘモグロビンは、配列番号20による整列完全長βヘモグロビンに由来する哺乳動物コンセンサス配列を含むか、又はそれからなる。したがって、好ましい構造変異体は少なくとも70%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも75%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも80%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも85%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも90%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも95%のアミノ酸同一性、及びいずれの場合にも配列番号20によるアミノ酸配列からなるβヘモグロビンのCD45+白血球、好ましくはM2(M1?)マクロファージに取り込まれる能力の少なくとも70%を有する。
好ましい実施形態では、βヘモグロビンは、配列番号22によるヒト完全長βヘモグロビンを含むか、又はそれからなる。したがって、好ましい構造変異体は少なくとも70%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも75%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも80%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも85%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも90%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも95%のアミノ酸同一性、及びいずれの場合にも配列番号22によるアミノ酸配列からなるヒト完全長βヘモグロビンのCD45+白血球、好ましくはM2(M1?)マクロファージに取り込まれる能力の少なくとも70%を有する。
好ましい実施形態では、トランスフェリンは、配列番号25による整列完全長αヘモグロビン（トランスフェリン？）に由来する哺乳動物コンセンサス配列を含むか、又はそれからなる。このため、特に、好ましいトランスフェリンは配列番号25に示されるアミノ酸配列、並びに少なくとも70%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも75%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも80%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも85%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも90%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも95%のアミノ酸同一性、及びいずれの場合にも配列番号25によるアミノ酸配列からなるトランスフェリンのCD45+白血球、好ましくはM1マクロファージに取り込まれる能力の少なくとも70%を有するその変異体を含むか、又はそれからなる。
好ましい実施形態では、トランスフェリンは、配列番号28によるヒトトランスフェリンを含むか、又はそれからなる。したがって、好ましい構造変異体は少なくとも70%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも75%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも80%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも85%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも90%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも95%のアミノ酸同一性、及びいずれの場合にも配列番号28によるアミノ酸配列からなるトランスフェリンのCD45+白血球、好ましくはM1マクロファージに取り込まれる能力の少なくとも70%を有する。
トランスフェリンの鉄結合特性は、N末端及びC末端に位置するドメインに依存する。このため、好ましい実施形態では、本発明に使用されるトランスフェリンは、少なくとも配列番号23によるN末端ドメイン及び配列番号24によるC末端ドメインを含む。好ましいトランスフェリンは配列番号23及び24に示されるアミノ酸配列、並びに少なくとも70%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも75%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも80%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも85%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも90%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも95%のアミノ酸同一性、並びにいずれの場合にも配列番号23及び24によるアミノ酸配列からなるトランスフェリンのCD45+白血球、好ましくはM1マクロファージに取り込まれる能力の少なくとも70%を有するその変異体を含むタンパク質を含む。配列番号23又は24は、哺乳動物トランスフェリンのコンセンサス配列を示す。
このため、好ましい実施形態では、本発明に使用されるトランスフェリンは、少なくとも配列番号26によるN末端ドメイン及び配列番号27によるC末端ドメインを含む。好ましいトランスフェリンは配列番号26及び27に示されるアミノ酸配列、並びに少なくとも70%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも75%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも80%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも85%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも90%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも95%のアミノ酸同一性、並びにいずれの場合にも、それぞれ配列番号26及び27によるアミノ酸配列からなるトランスフェリンのCD45+白血球、好ましくはM1マクロファージに取り込まれる能力の少なくとも70%を有するその変異体を含むタンパク質を含む。
好ましいフェリチンは、所与のアミノ酸配列に関わらず、4ヘリックスバンドルタンパク質モジュールの24マーサブユニット集合に適合し、3D構造ベースのアラインメントによって規定される遠縁タンパク質の所与の配列アラインメントの範囲内にあるタンパク質も含む。
本発明者らの驚くべき観察結果は、リンパ球及びM2マクロファージが1つ以上のフェリチンと1つ以上の有効成分とを含む複合体の取込みにより良好であり、M1マクロファージが1つ以上のヘモグロビンと1つ以上の有効成分とを含む複合体の取込みにより良好であり、マクロファージが1つ以上のトランスフェリンと1つ以上の有効成分とを含む複合体の取込みにより良好であることである。したがって、上記のCD45+白血球：単球、M1及びM2マクロファージ、顆粒球並びにリンパ球の組織及び細胞指向性に基づくと、M2マクロファージ、リンパ球又は単球の指向性が所望される場合、1つ以上のフェリチンと1つ以上の有効成分とを含む複合体がM2マクロファージ、リンパ球又は単球にロードするために使用され、M1マクロファージの指向性が所望される場合、1つ以上のヘモグロビンと1つ以上の有効成分とを含む複合体がM1マクロファージにロードするために使用される。
本発明の標的化送達系の好ましい実施形態では、有効成分はタンパク質、核酸、分子量が1.5 kD未満、より好ましくは1 kD未満の化学非タンパク質非核酸化合物、好ましくは抗癌剤、特に細胞増殖抑制薬、細胞毒性薬及びそれらのプロドラッグ；抗動脈硬化薬；並びに抗炎症薬；並びに光感作化合物；ウイルス、特に腫瘍溶解性ウイルス；並びに好ましくはルテチウム-177、イッテルビウム-90、ヨウ素-131、サマリウム-153、リン-32、セシウム-131、パラジウム-103、ラジウム-233、ヨウ素-125及びホウ素-10からなる群から選択される細胞傷害量のγ線、又は好ましくはアクチニウム-225、ビスマス-213、鉛-212及びポロニウム-212からなる群から選択される細胞傷害量のα線も放出するα又はβ線放出放射性同位体からなる群から選択される。
好ましい抗癌剤はアポトーシス／自食作用又は壊死誘導剤から選択される。アポトーシス／自食作用又は壊死誘導剤は、細胞増殖に異常を有する細胞内であってもアポトーシス／自食作用又は壊死を効果的に誘導することが可能な任意の薬物であり得る。これらの薬物は1つ以上のフェリチンとの複合体で使用するのが好ましい。
好ましい抗癌剤はアポトーシス誘導剤、アルキル化物質、代謝拮抗物質、抗生物質、エポチロン、核内受容体アゴニスト及びアンタゴニスト、抗アンドロゲン（anti-androgen）、抗エストロゲン、白金化合物、ホルモン、抗ホルモン、インターフェロン、細胞周期依存性タンパク質キナーゼ（CDK）の阻害剤、シクロオキシゲナーゼ及び／又はリポキシゲナーゼの阻害剤、生体（biogenic）脂肪酸、プロスタノイド及びロイコトリエンを含む生体脂肪酸誘導体、プロテインキナーゼの阻害剤、プロテインホスファターゼの阻害剤、脂質キナーゼの阻害剤、白金配位錯体、エチレンイミン、メチルメラミン、トリアジン、ビンカアルカロイド、ピリミジン類似体、プリン類似体、スルホン酸アルキル、葉酸類似体、アントラセンジオン、置換尿素及びメチルヒドラジン誘導体、エン－ジイン抗生物質、メイタンシノイド又はオーリスタチン誘導体等のチューブリン重合阻害剤、免疫チェックポイント阻害剤、並びに腫瘍特異的タンパク質又はマーカーの阻害剤、好ましくはRho-GDP解離阻害剤、より好ましくはGrp94からなる群から選択される。
他の好ましい抗癌剤はアセジアスルホン、アクラルビシン（aclarubicine）、アンバゾン、アミノグルテチミド、L-アスパラギナーゼ、アザチオプリン、バノキサントロン、ベンダムスチン、ブレオマイシン、ブスルファン、フォリン酸カルシウム、カルボプラチン、カペシタビン（capecitabine）、カルムスチン、セレコキシブ、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダプソン、ダウノルビシン、ジブロムプロパミジン、ジエチルスチルベストロール（diethylstilbestrole）、ドセタキセル、ドキソルビシン、エンジイン、エピルビシン、エポチロンB、エポチロンD、リン酸エストラムスチン（estramustine）、エストロゲン、エチニルエストラジオール（ethinylestradiole）、エトポシド、フラボピリドール、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミド、ホスフェストロール、フラゾリドン、ゲムシタビン、ゴナドトロピン放出ホルモン類似体、ヘキサメチルメラミン、ヒドロキシカルバミド、ヒドロキシメチルニトロフラントイン、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン（hydroxyprogesterone caproate）、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イドクスウリジン、イホスファミド、インターフェロンα、イリノテカン、ロイプロリド、ロムスチン、ラルトテカン、マフェニドスルフェートオラミド（mafenide sulfate olamide）、メクロレタミン、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール（megestrolacetate）、メルファラン、メパクリン、メルカプトプリン、メトトレキサート、メトロニダゾール、マイトマイシンC、ミトポドジド、ミトタン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、ナリジクス酸、ニフラテル、ニフロキサジド、ニフララジン（nifuralazine）、ニフルチモクス、ニムスチン、ニモラゾール（nimorazole）、ニトロフラントイン、ナイトロジェンマスタード、オレオムシン（oleomucin）、オキソリン酸、ペンタミジン、ペントスタチン、フェナゾピリジン、フタリルスルファチアゾール、ピポブロマン、プレドニムスチン、プレドニゾン、プロイシン、プロカルバジン、ピリメタミン、ラルチトレキセド、ラパマイシン、ロフェコキシブ、ロシグリタゾン、サラゾスルファピリジン、塩化スクリフラビニウム（scriflavinium chloride）、セムスチン、ストレプトゾシン（streptozocine）、スルファカルバミド、スルファセタミド、スルファクロロピリダジン（sulfachloropyridazine）、スルファジアジン、スルファジクラミド、スルファジメトキシン、スルファエチドール、スルファフラゾール、スルファグアニジン、スルファグアノール、スルファメチゾール、スルファメトキサゾール、コトリモキサゾール、スルファメトキシジアジン、スルファメトキシピリダジン、スルファモキソール、スルファニルアミド、スルファペリン、スルファフェナゾール、スルファチアゾール、スルフイソミジン、スタウロスポリン（staurosporin）、タモキシフェン、タキソール、テニポシド、ターチポシド（tertiposide）、テストラクトン、プロピオン酸テストステロン（testosterone propionate）、チオグアニン、チオテパ、チニダゾール、トポテカン、トリアジコン、トレオスルファン、トリメトプリム、トロホスファミド、UCN-01、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビンブラスチン、ビノレルビン及びゾルビシンからなる群から選択され、好ましくはオーリスタチン、バノキサントロン、ベンダムスチン、クロラムブシル、カリケアマイシン（calicheamicin）、シクロホスファミド、ジネマイシン（dynemycin）A、メイタンシン、メルファラン、メルタンシン及びネオカルチノスタチン（neocarzinostatin）からなる群から選択され、最も好ましくはバノキサントロン、ベンダムスチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、ピロロベンゾジアゼピン及びメルファランである。
抗癌剤が増殖阻害タンパク質、好ましくは細胞周期阻害剤、又は細胞の疾患状態を変調する標的化組織中の細胞上若しくは細胞内の標的に特異的に結合する抗体若しくは抗体模倣物、好ましくは増殖促進タンパク質、又は好ましくは増殖阻害タンパク質、若しくは細胞の疾患状態を変調する標的化組織中の細胞上若しくは細胞内の標的に特異的に結合する抗体若しくは抗体模倣物をコードする核酸、好ましくは増殖促進タンパク質又はsiRNA又はDNAザイムであるのが特に好ましい。
本発明において使用される抗体の好ましい例は、一本鎖抗体、抗体フラグメント、ナノボディ、軽鎖若しくは重鎖、可変軽鎖若しくは可変重鎖、又はダイアボディである。好ましい抗体フラグメントはフラグメント抗原結合（Fab）フラグメント、Fab'フラグメント、F(ab')2フラグメント、重鎖抗体、シングルドメイン抗体（sdAb）、一本鎖可変フラグメント（scFv）、可変フラグメント（Fv）、VHドメイン、VLドメイン、シングルドメイン抗体、ナノボディ、IgNAR（免疫グロブリン新抗原受容体）、di-scFv、二重特異性T細胞エンゲージャー（BITE）、二重親和性再標的化（DART）分子、トリプルボディ、ダイアボディ、一本鎖ダイアボディ、及びそれらの融合タンパク質を含む。
有効成分が核酸である場合、miRNA、siRNA、DNAザイム、又は薬学的に活性のあるタンパク質、例えば抗体、抗体模倣物、サイトカイン、プロドラッグ変換酵素等をコードする核酸であるのが好ましい。
上記で概説したように、本発明の標的化送達系は有効成分を低酸素領域へと送達する特定の適合性を有する。低酸素条件下で活性化される有効成分の使用は、更なる標的化の特異性を与え、及び／又は有効成分の悪影響を更に低減する。このため、特に好ましい実施形態では、有効成分は低酸素活性化プロドラッグである。全ての低酸素活性化プロドラッグの骨格は、組織において低酸素条件下で酵素的に還元される5つの異なる化学的部分（ニトロ基、キニン、芳香族及び脂肪族N-オキシド、並びに遷移金属）の1つの存在である。低酸素活性化プロドラッグは、対応する薬物と比べて活性が低い又は不活性な任意のプロドラッグであり、薬物及び1つ以上の生体還元性（bioreducible）基を含む。かかる低酸素活性化プロドラッグは、様々な還元剤及び還元酵素によって活性化される全てのプロドラッグを含み、限定されるものではないが、単一電子転移酵素（シトクロムP450レダクターゼ等）及び2電子転移（又は水素化物転移）酵素が含まれる。本発明の好ましい実施形態によると、低酸素活性化プロドラッグはTH-302である。TH-302を合成する方法は国際公開第07/002931号及び国際公開第08/083101号に記載されている。好ましくは、かかるプロドラッグの例はベンゾトリアジンN-オキシド、アパジコン（EO9）、チラパザミン（TPN）及びSN30000からなるクラスI群、又はニトロ化合物PR-104A、TH-302、TH-4000及びAQ4NからなるクラスII群から選択される。
本発明の単離標的化送達系の好ましい実施形態では、複合体に含まれる鉄結合タンパク質（複数の場合もある）と有効成分との間の結合（複数の場合もある）が共有結合性及び／又は非共有結合性であり、及び／又は、複合体に含まれる有効成分が鉄結合タンパク質、好ましくはフェリチン又はその多量体によって捕捉／封入される。一実施形態では、共有結合及び／又は非共有結合カップリングは、リンカー又はスペーサーによる間接的なものである。共有結合の形成が所望される場合、鉄結合タンパク質の関連チオール、アミノ又はカルボキシル基が、有効成分を直接的又は間接的に1つ以上の鉄結合タンパク質に共有結合的にカップリングするために使用される。異なる有効成分が複合体に含まれることも想定される。例えば、或るタイプの有効成分を鉄結合タンパク質に結合（非共有結合）させることができ、この場合別のタイプが封入される。このアプローチでは、標的化組織及び／又は細胞へと送達された場合に鉄結合タンパク質からの放出率が異なる有効成分を利用する。例えば、有効成分として作用する薬物誘導体を、関連チオール、アミノ又はカルボキシル基の反応性を利用することによって、24マーの表面上又は内部空洞内のいずれかでフェリチン分子へと共有結合的に付着させることができる。かかる有用な反応のタイプは当該技術分野で既知であり、当業者は任意の付加的な作業なしに具体的な有効成分に対して採用することができる。かかる反応の例は、Behrens CR, Liu B. Methods for site-specific drugconjugation to antibodies. MAbs. 2014 Jan-Feb;6(1):46-53に記載されている。
更なる態様では、本発明は、本発明の単離標的化送達系を作製する方法であって、
a）上記の精製鉄結合タンパク質を準備する工程と、
b）有効成分を鉄結合タンパク質に共有結合的若しくは非共有結合的に連結する、及び／又は有効成分を鉄結合タンパク質に封入する工程と、
c）上記のCD45+白血球細胞を準備する工程と、
d）CD45+白血球細胞を、工程b）において作製される鉄結合タンパク質と有効成分との複合体の存在下で、該CD45+白血球細胞に工程b）において作製される該鉄結合タンパク質と有効成分との複合体が少なくとも部分的にロードされるまでインキュベートする工程と、
を含む、方法に関する。
タンパク質と薬物部分との間の付加物の形成は、標的タンパク質への薬物分子の非共有結合であってもよく、以下のように説明することができる。フェリチンの場合、薬物は通例、フェリチン巨大分子自体の会合解離特性を利用することによって内部空洞内に封入することができる（物理的な閉じ込め）。薬物分子は、空洞内部表面のアミノ酸残基との非共有相互作用によって適所に保たれる。ヘモグロビン巨大分子も、ヘモグロビン自体のヘム結合ポケット内に受け入れることができる選択薬物分子の非共有結合の可能性をもたらす。ヘムはポケットによって移動され、適切な疎水性プロファイルを有する薬物に置き換えられ得る。更なる態様では、本発明において検討される全てのタンパク質を、タンパク質自体のチオール又はアミノ基に対して反応性の特定の活性リンカー部分によって修飾される薬物分子に共有結合的に付着させることができる。このように、フェリチン又はヘモグロビンを、ペプチドベースの切断可能なリンカー（例えば、カテプシン感受性バリン－シトルリン配列及びパラアミノベンジルカルバメートスペーサー）を保有するシステインチオール反応性薬物に連結することができる。顕著な例として、抗有糸分裂剤モノメチルオーリスタチンE（MMAE）が使用されている。ペプチドベースのリンカーは、薬物が生理的条件下でタンパク質から容易に放出されず、健常細胞に対する毒性の予防を補助し、投与効率を確実にするように安定してタンパク質を細胞毒性化合物へと結合する。このように生成するタンパク質薬物付加物は選択受容体型、すなわちヘモグロビンについてはCD163、フェリチン又はトランスフェリンについてはTfRにそれぞれ付着することが可能である。結合後、タンパク質薬物付加物はエンドサイトーシスによって内在化し、選択的に標的化細胞に取り込まれる。薬物を含有する小胞はリソソームと融合し、リソソームシステインプロテアーゼ、特にカテプシンBがバリン－シトルリンリンカーの破壊を開始し、MMAEの抗体への結合がなくなり、腫瘍環境へと直接放出される。
代替的には、DM1-SMCCがリシン残基に特異的に結合するリンカーを保有する効率的なメルタンシン誘導体であり、抗体について首尾よく説明されている反応においてフェリチン、ヘモグロビン又はトランスフェリンとの共有結合複合体を生成する。特に、ヘモグロビン、フェリチン又はトランスフェリンはDM1-SMCCと反応し、細胞内で切断され、活性薬物を時間依存的に放出し得る共有結合タンパク質－薬物付加物をもたらすことができる。DM1による微小管動態の抑制は、有糸分裂停止及び細胞死を誘導する。
「完全なロード」という用語は、CD45+白血球細胞、好ましくはマクロファージ、より好ましくは活性化マクロファージに取り込まれることができる有効成分と複合した最大量の鉄結合タンパク質、好ましくはフェリチンを指すために本発明において使用される。
第3の態様では、本発明は、薬剤として使用される、本発明の単離標的化送達系に関する。
第4の態様では、本発明は、本発明の単離標的化送達系と、薬学的に許容可能な担体及び／又は好適な賦形剤（複数の場合もある）とを含む医薬組成物に関する。単離標的化送達系が生細胞を含むことから、担体及び賦形剤には細胞を生きたままに保つようなものを選ぶのが好ましい。
「薬学的に許容可能な」は、連邦規制機関若しくは州政府によって承認された、又は米国薬局方、若しくは動物、より特にはヒトにおける使用について一般に認められる他の薬局方に記載されるものを意味する。
「担体」という用語は本明細書で使用される場合、治療有効成分とともに投与される希釈剤、賦形剤、界面活性剤、安定剤、生理的緩衝溶液又はビヒクル等であるが、これらに限定されない薬理学的に不活性な物質を指す。かかる医薬担体は液体であっても又は固体であってもよい。液体担体としては、水、及び石油、動物、植物又は合成起源のものを含むが、これらに限定されない油、例えばラッカセイ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油等における生理食塩溶液等の滅菌液が挙げられるが、これらに限定されない。生理食塩溶液、並びに水性デキストロース及びグリセロール溶液を特に注射溶液の液体担体として用いることもできる。医薬組成物を静脈内投与する場合、生理食塩溶液が好ましい担体である。好適な医薬担体の例は、E. W. Martinによる"Remington'sPharmaceutical Sciences"に記載されている。
好適な医薬「賦形剤」としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等が挙げられる。
「界面活性剤」としては、デオキシコール酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、Triton X-100、並びにポリソルベート20、ポリソルベート40、ポリソルベート60、ポリソルベート65及びポリソルベート80等のポリソルベート等であるが、これらに限定されない陰イオン、陽イオン及び非イオン界面活性剤が挙げられる。
「安定剤」としては、マンニトール、スクロース、トレハロース、アルブミン、並びにプロテアーゼ及び／又はヌクレアーゼアンタゴニストが挙げられるが、これらに限定されない。
「生理的緩衝溶液」としては、塩化ナトリウム溶液、脱塩水、及びリン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、HEPES緩衝液（［4（2ヒドロキシエチル）ピペラジノ］エタンスルホン酸）又はMOPS緩衝液（3モルホリノ-1プロパンスルホン酸）等であるが、これらに限定されない好適な有機又は無機緩衝溶液が挙げられるが、これらに限定されない。それぞれの緩衝液の選択は概して、所望の緩衝液モル濃度によって決まる。リン酸緩衝液は、例えば注射溶液及び輸液に好適である。
「アジュバント」という用語は、組成物の有効成分に対する免疫応答を細胞又は体液レベルで高める、刺激する、活性化する、増強する又は変調する作用物質を指し、例えば免疫学的アジュバントは、実際の抗原に対する免疫系の応答を刺激するが、それ自体は免疫学的効果を有しない。かかるアジュバントの例としては、無機アジュバント（例えば、リン酸アルミニウム又は水酸化アルミニウム等の無機金属塩）、有機アジュバント（例えばサポニン又はスクアレン）、油性アジュバント（例えばフロイント完全アジュバント及びフロイント不完全アジュバント）、サイトカイン（例えばIL-1β、IL-2、IL-7、IL-12、IL-18、GM-CFS及びINF-γ）、微粒子アジュバント（例えば、免疫刺激複合体（ISCOMS）、リポソーム又は生分解性ミクロスフェア）、ビロソーム、細菌アジュバント（例えば、モノホスホリルリピドA又はムラミルペプチド）、合成アジュバント（例えば、非イオン性ブロックコポリマー、ムラミルペプチド類似体又は合成リピドA）、又は合成ポリヌクレオチドアジュバント（例えば、ポリアルギニン又はポリリシン）が挙げられるが、これらに限定されない。
第5の態様では、本発明は、腫瘍、好ましくは固形腫瘍、好ましくは乳癌、膵癌、膀胱癌、肺癌、結腸癌、又は皮膚創傷、他の創傷中、若しくは臓器梗塞（心臓）若しくは網膜虚血の後の低酸素領域、炎症性疾患若しくは虚血領域を有する腫瘍の予防／治療に使用される本発明の単離標的化送達系に関する。
「治療」という用語は本明細書で使用される場合、治癒、一時的回復、予防等の目的、疾患の進行を遅らせる若しくは止める、病変を退縮若しくは消失させる、発症を予防する、又は再発を抑制することを含む種々の目的を医学的に可能にする全てのタイプの予防的及び／又は治療的介入を含む。
本発明による標的化送達系は、通常は（例えば、溶解性の問題のために）腫瘍に到達することが可能でない有効成分の腫瘍送達を可能にする。この系は、低酸素腫瘍又は腫瘍の低酸素領域への有効成分の送達も可能にする。この系は、例えば虚血性事例中に低酸素状態となる、又は炎症過程にある生物内での任意の領域への有効成分の送達ももたらす。
上述のように、本発明は腫瘍塊への標的化薬物送達の方法も提供する。この方法は、マクロファージによる高効率の鉄結合タンパク質（フェリチン、ヘモグロビン及び／又はトランスフェリン（transferrin））の取込みを可能にするCD45+白血球、好ましくは活性化マクロファージの調製（上記フェリチン、ヘモグロビン及び／又はトランスフェリンが有効成分（例えば薬物／プロドラッグ）を運ぶ）、腫瘍の標的化及び鉄結合タンパク質の癌細胞への移行を含み、有効成分が癌細胞で放出される。
本発明では、腫瘍を標的とする送達系として薬物／プロドラッグと連結した鉄結合タンパク質がロードされるCD45+白血球、好ましくは活性化マクロファージを利用する。化学療法に対する腫瘍の不十分な応答又はイメージング法を用いたそれらの検出の困難さは、血管系の不良に起因する低酸素領域への抗癌剤の透過度の変更に主に関連する。しかしながら、これらの無血管領域は血管から遠く離れた領域であってもCD45+白血球、好ましくは活性化マクロファージの移動を誘引する。したがって、これらは腫瘍塊への粒子の送達系を構成する。かかる粒子の有望な例は鉄結合タンパク質である。しかしながら、単一作用物質として使用した場合に、これらは他の化合物と同様、低酸素領域に到達せず、他の器官に蓄積する。
本発明者らは実施例に記載されるように、化学的方法を用いて抗癌剤、低酸素活性化プロドラッグ（治療目的）又はアイソトープをヘモグロビン又はトランスフェリンへと連結し、それをCD45+白血球（単球、マクロファージ、リンパ球及び／又は顆粒球）、好ましくは活性化マクロファージにロードし、細胞を鉄結合タンパク質溶液で処理した。動物への投与時に、ロードされたCD45+白血球、好ましくは活性化マクロファージが腫瘍低酸素部位へと移動し、鉄結合タンパク質とともに封入された有効成分を癌細胞へと放出することが本発明者らにより観察された。この方法は腫瘍部位（特に低酸素領域）への有効成分の正確な投与を可能とし、他の器官におけるそれらの蓄積を回避する。
実施例1 － マクロファージの活性化
本発明に使用されるマクロファージを以下のように得て、分化させ、活性化させた。マクロファージを活性化するために、マクロファージを初めに骨髄前駆体（例えば、論文：Weischenfeld and Porse, 2008, CSHProtoc, doi. 10.1101/pdb.prot.5080を参照されたい）又は血液単球から得る。代替的には、マクロファージを腹膜から得ることができる。マクロファージの単離、培養、分化及び極性化／活性化の方法は当業者に既知である。例えば、これらはMurray et al. (Immunity, 2014,41(1):14-20)によって詳細に記載されている。
本発明のこの実用化において、骨髄由来マクロファージをBALB/c又はC57Bl/6マウスから得た。また、イヌ血液単球由来マクロファージ又は市販のマクロファージ細胞株（単球－マクロファージ系統マウス細胞：RAW 264.7、J744、ヒト：THP-1、U937、又はイヌDH82細胞株）を使用した。
簡潔に述べると、かかる骨髄由来マクロファージを、プラスチックペトリ皿内の5 mlの培地（1プレート当たり3 mlの細胞）：DMEM:F12＋グルタミン／glutamax＋10%FBS＋ペニシリン／ストレプトマイシン及び20%L929条件培地又はM-CSF（50 ng/ml）中に播種した。その後5日間で、培地に成長因子及び活性化化合物の1つ、又は1つのサイトカインカクテルとしてのそれらの組合せを添加した。
代替的には、マクロファージを全ての必須サイトカイン及びインターロイキンを含有する「M1/M2 Macrophage Generation Medium」（Promocell）又は市販の同等物又は自製培地中で培養し、これを活性化されているとみなした。
血液単球からマクロファージを得るために、新鮮血液（12時間を超えない）を、Histopaqueシステム1077又は同等物、及び適切な量の予め加温したMonocyte Attachment Medium（又は同等物、例えばM-CSFを添加したDMEM/RPMI）、例えばT-75フラスコ1本当たり15 mlの培地中の白血球細胞（又は代替的には、血液バンクから収集した白血球細胞のみ）を用いて遠沈する。播種密度は、単球含量が25%以上の単核細胞については100万個／cm2～200万個／cm2、単球含量が25%未満の単核細胞については150万個／cm2～300万個／cm2とする。次いで、細胞を更に操作することなく5%CO2及び37℃のインキュベーター内で1時間～1.5時間インキュベートする。
細胞付着後に、少なくとも2回洗浄した後、適切な量の完全「M1-又はM2-MacrophageGeneration Medium DXF」を細胞に添加し（例えば、T-75フラスコ1本当たり20 ml）、細胞を37℃及び5%CO2で6日間、培地を交換することなくインキュベートする。マクロファージを活性化するために、活性化化合物を添加した培地で全培地を置き換える必要がある。
本発明に使用される活性化化合物（骨髄由来細胞に対して、又は単球－マクロファージ細胞株に由来する細胞を活性化するため）は以下のとおりである：IL-4（20 ng/ml）、IFN-γ（少なくとも20 ng/ml）、LPS（少なくとも10ng/ml）、IL-13（少なくとも20 ng/ml）、IL-10（少なくとも20 ng/ml）、デキサメタゾン（少なくとも20 μg/ml）、oxLDL（少なくとも20 ng/ml）、TNF-α（20 ng/ml）、TGF-β（20 ng/ml）、コルチゾール（150 ng/ml～300 ng/ml）、又は1つのサイトカインカクテルとしてのそれらの組合せ。活性化されていないマクロファージを得るためには、活性化化合物を添加しなかった。
マクロファージの極性化／活性化の逆転（古典的活性化から代替活性化まで）は、例えば上記に挙げた適切なサイトカイン中での少なくとも48時間のマクロファージの培養によって達成することができる。
実施例2 － 単球の単離
本発明のこの実用化において単球を得るために、骨髄由来又は脾臓由来単球をBALB/c又はC57Bl/6マウスから得た。また、イヌ血液単球又は市販の単球細胞株（単球－マクロファージ系統マウス細胞：RAW 264.7、J744、ヒト：THP-1、U937又はイヌDH82細胞株）を使用した。
血液単球を得るために、新鮮血液（12時間を超えない）をHistopaqueシステム1077又は同等物を用いて遠沈し、白血球細胞を適切な量の予め加温したMonocyte Attachment Medium（又は同等物、例えば20 ng/ml M-CSFを添加したDMEM/RPMI）、例えばT-75フラスコ1本当たり15 mlの培地中に播種する。代替的には、血液バンクから収集した白血球細胞（バフィーコート）のみを使用してもよい。播種密度は、単球含量が25%以上の単核細胞については100万個／cm2～200万個／cm2、単球含量が25%未満の単核細胞については150万個／cm2～300万個／cm2とする。次いで、細胞を更に操作することなく5%CO2及び37℃のインキュベーター内で1時間～1.5時間インキュベートする。細胞付着後に、少なくとも2回洗浄し、接着細胞を単球とみなす。
本発明のこの実用化において骨髄由来単球を得るために、骨髄由来マクロファージをBALB/c又はC57Bl/6マウスから得た。簡潔に述べると、かかる骨髄由来前駆体をプラスチックペトリ皿内の5 mlの培地（1プレート当たり3 mlの細胞）：DMEM:F12＋グルタミン／glutamax＋10%FBS＋ペニシリン／ストレプトマイシン及び20%L929条件培地又は20 ng/ml M-CSF中に播種する。2日後に5 mlの標準培地を添加する。次いで、2日後に1プレート当たり0.5 mlのL929条件培地を添加する。接着細胞を単球とみなす。
本発明のこの実用化において脾臓由来単球を得るために、脾臓を機械的に解離して単一細胞懸濁液を得て、70 μmセルストレーナーに通した。細胞を遠心分離し、上清を除去した。赤血球溶解後に、単球を磁性ビーズ精製、例えばEasySep Mouse Monocyte EnrichmentKitプロトコル及び適切な磁石を用いて単離した。
それらのタンパク質ロード及び移動のより良好な効果を得るために、使用前にマクロファージ活性化刺激：IL-4（20 ng/ml）、IFN-γ（少なくとも20 ng/ml）、LPS（少なくとも10ng/ml）、IL-13（少なくとも20 ng/ml）、IL-10（少なくとも20 ng/ml）、デキサメタゾン（少なくとも20 μg/ml）、oxLDL（少なくとも20 ng/ml）、TNF-α（20 ng/ml）、TGF-β（20 ng/ml）、コルチゾール（150 ng/ml～300 ng/ml）、又は1つのサイトカインカクテルとしてのそれらの組合せによって前処理してもよい。
実施例3 － 顆粒球の単離
顆粒球細胞を血液から得るために、9部の血液を1部のACD緩衝液（0.17 M d-グルコース、0.10 Mクエン酸、0.11 Mクエン酸三ナトリウムを含有する）で希釈した。この工程からの血液を1:1比のPBSで更に希釈し、遠心分離した。血漿及びバフィーコートを除去した後、残りの細胞を第1の工程（ACD-血液）の元の容量の80%までPBSと混合し、続いて4:12の比率の冷蒸留水で希釈した。次いで、6部の2.7%NaCl溶液を添加し、遠心分離した。上清を除去した後、細胞をRPMI-1640培地に再懸濁した。これらの細胞を顆粒球とみなした。
実施例4 － リンパ球の単離
本発明のこの実用化において脾臓由来リンパ球を得るために、脾臓を機械的に解離して単一細胞懸濁液を得て、70 μmセルストレーナーに通した。細胞を遠心分離し、上清を除去した。赤血球溶解の後、リンパ球を磁性ビーズ精製、例えばEasySep Mouse CD4+Enrichment Kitプロトコル及び適切な磁石を用いて単離した。
実施例5 － フェリチン複合体の調製
フェリチンに抗癌剤（例えばシクロホスファミド、クロラムブシル、メルファラン、ベンダムスチン、バノキサントロンのような古典的薬物、又はTH-302のような低酸素活性化プロドラッグ）を組み込むために、フェリチンをマクロファージ処理前に調製する必要がある。簡潔に述べると、配列番号4による組み換えマウスタンパク質（図1）を以下のように得る。配列番号4のフェリチンタンパク質をコードする合成遺伝子を含有する発現ベクターpET-22bを、大腸菌（E. coli）BL21(DE3)に形質転換した。大腸菌培養物を、アンピシリン（100 mg/L）を添加した1 LのLuria-Bertaniブロス（LB）中、37℃でOD600 0.6まで成長させた。タンパク質発現を1 mMイソプロピルチオ-b-D-ガラクトシド（IPTG）の添加によって誘導し、培養物を一晩インキュベートした。細胞を遠心分離（15000gで15分間）によって採取し、20 mM Hepes（pH 7.5）、150 mM NaCl、0.1mg/mL DNase、10 mM MgCl2中に懸濁し、超音波処理によって破壊した。溶解物を15000 gで30分間遠心分離し、上清を50℃で10分間処理し、遠心分離して変性タンパク質を除去した後、70℃で10分間再び遠心分離した。上清に30%(NH)4SO4を4℃で添加し、1時間撹拌し、15000 gで30分間遠心分離した。上清に70%(NH)4SO4を4℃で添加し、1時間撹拌し、15000 gで30分間遠心分離した。ペレットを20 mM Hepes（pH 7.5）、150 mM NaCl中に再懸濁し、同じ緩衝液に対して4℃で一晩透析した。タンパク質をHILOAD 26/600 SUPERDEX 200ゲル濾過カラム（GE-Healthcare）にロードした後、滅菌濾過し、4℃で保管した（図9）。タンパク質濃度を、21000 M-1 m-1のモル吸光係数を用いた280 nmでの分光光度法及び595 nmでの吸光度を測定するブラッドフォードアッセイによって決定した。
上記フェリチンは、組み換え哺乳動物フェリチンタンパク質H及び／又はLホモポリマーを含む。
前述のように得られるフェリチンを標準方法によって精製して、エンドトキシンを含まない前臨床グレードの生成物を得る（例えば、Ceci et al. 2011, Extremophiles15(3):431-439、Vanucciet al. 2012, Int J Nanomed 7:1489-1509を参照されたい）。簡潔に述べると、20 mM Hepes（pH 7.5）を含有する貯蔵溶液中で滅菌保存したフェリチンを、酸性24マー溶液（最終pH<3.0）中4uMの最終濃度、又は代替的には高塩基性のpH値（pH>9.5）まで希釈して（例えば、Pontillo et al., 2016を参照されたい）、多量体の解離を可能にする。薬物を適切な溶媒中に非常に高い濃度で溶解した後、少量を200モル過剰のフェリチン溶液に添加する。次いで、pHを適切な量のNaOH/HCl溶液の添加によって中性にして、多量体再構成を可能にする。本実験方法により、100 kDaカットオフ濃縮器内でのPBSを用いた3回／4回の洗浄（濃縮工程）により共溶媒及び封入されていない薬物の両方の急速かつ完全な排除、並びに薬物をロードしたフェリチンナノケージの完全な回収が可能となることが示される。次いで、これにより得られるフェリチン－薬物複合体を液体窒素中で急速凍結し、凍結乾燥した。
共溶媒の選択及び薬物分子の固有の化学的特性に応じて、最大150個～180個の薬物分子を24マーフェリチンケージ内に捕捉／吸着し得ると推定することができる。
薬物を適切なフェニルヒドラゾン、スクシンイミド又はマレイミド活性化薬物の選択によってフェリチンアミノ酸側鎖（リシン又はシステイン）に共有結合することもできる。したがって、i）フェニルヒドラゾン誘導体は、薬物をフェリチン表面から分離し、遊離させることができ、ii）リシン結合誘導体は、アミノ酸への完全なタンパク質分解後に活性となることができ、又はiii）システイン結合誘導体は、マレイミド（maleimide）チオエーテル結合の還元的加水分解により細胞内で遊離することができる。
実施例6 － ヘモグロビン－化合物複合体の調製
ヒトヘモグロビンを、Rossi-Fanelli et al. (Archives of biochemistry and biophysics77:478-492, 1958)に記載のように新鮮赤血球から調製する。簡潔に述べると、健常ドナーから得られるヘパリン化血を、1600 rpmで30分間遠心分離し（4℃）、RBCを沈殿させた。バフィーコートをペレットの表面上の針吸引によって正確に除去した。血漿上清を捨て、等張0.9%生理食塩溶液中にRBCを再懸濁し、1600 rpm、4℃で30分間遠心分離することによってRBCペレットを3回洗浄した。最終生理食塩水洗浄及び遠心分離工程後に、RBCペレットを5 mMリン酸カリウム緩衝液（PB、pH=7.2）でpH 7.2に緩衝化した蒸留水中に再懸濁し、穏やかに撹拌しながら4℃で一晩溶解させた。透析RBC溶解物を続いて13.000 (13000?)rpm、4℃で30分間遠心分離し、Q-sepharose XL樹脂（GE Healthcare）を充填したXK 26/40カラムを備えるAKTA Explorerシステムに上清を室温で直接ロードした。カラムを緩衝液A（20 mMトリス-HCl、pH=8.2）により12 mL／分の流速で平衡化し、同じ緩衝液で3回洗浄した。線形勾配溶出を、100%緩衝液Aから75%緩衝液B（20 mMトリス-Cl＋0.2 MNaCl（pH 8.20））、続いて100%緩衝液Bの段階勾配へと変化させることによって生成した。溶出時に、フラクションコレクターを用いてタンパク質画分を回収した。このようにして得られたタンパク質をSDS pageによって分析し、-80℃で凍結保管した。
ヒトヘモグロビン（配列番号18又は22、図1を参照されたい）は、ヘム結合ポケット内のホスト疎水性薬物分子である適切な薬物コンジュゲートに容易に共有結合的に連結し、又は更にはヘム鉄に連結した小細胞毒性分子を輸送することができる。Hbは、タンパク質表面上の唯一の滴定可能なシステインであるβ鎖の93位のシステイン残基への適切な薬物コンジュゲートの選択的付着によって容易に修飾することができる。チューブリン（tubulin）阻害剤モノメチルオーリスタチン（MMAE）等のマレイミド官能化薬物又はスクシンイミド官能化メルタンシン類似体（DM1-SMCC）が、関連cys β93残基（マレイミド官能化薬物）又は1つ以上のリシン残基（スクシンイミド官能化薬物）のそれぞれに容易かつ特異的に付着することができる極めて強力な細胞毒性薬の最も顕著な例である。これらの薬物は、以下の手順に従ってヒトヘモグロビンへと好都合にコンジュゲートされた。
オーリスタチンE類似体であるマレイミドカプロイル-バリン-シトルリン-p-アミノベンゾイルオキシカルボニル-モノメチルオーリスタチンE（vcMMAE）は、MedChem Express（Princeton，NJ）から入手した。ヘモグロビンvcMMAE付加物を以下のように調製した。ヒトヘモグロビン溶液を反応緩衝液（0.1 mM EDTAを含有する50 mMリン酸緩衝液（pH 6.8））により120 μMヘムの濃度に調整し、20%(v/v)アセトニトリル溶液の存在下、4℃で一晩10倍モル過剰のvcMMAEとコンジュゲートした。マレイミド基は、pH 6.5～7.5で遊離（還元型）スルフヒドリルと効率的かつ特異的に反応し、安定したチオエーテル結合を形成する。過剰なvcMMAEを精製し、PM 100限外濾過濃縮器を用いて緩衝液をD-PBSと交換した。コンジュゲーションの収率は、総システインのおよそ80%であった。vcMMAEコンジュゲートの形成を、LC-MS分析及びp-クロロメルクリベンゾエートを用いた残留遊離チオール基の滴定によって確認した。Hb-vcMMAEコンジュゲートの濃度をUV-vis分光分析によって決定した。
リシン共有結合的付着について官能化したメルタンシン（mertansine）類似体DM1SMCC（Alb TechnologyLtd，Hederson，NV，USA）を以下のように調製した。ヒトヘモグロビン溶液を反応緩衝液（0.5 mM EDTAを含有する0.1 mMリン酸緩衝液（pH 7.4））により400 μMヘムの濃度に調整し、10%(v/v)DMSO溶液の存在下、4℃で16時間20倍モル過剰のDM1-SMCCとコンジュゲートした。アミン反応性スクシンイミジルエステルはアミンとカップリングし、タンパク質の表面上にリシン基を有する共有結合付加物をもたらす。過剰なDM1-SMCCを排除し、PM 100限外濾過濃縮器を用いて緩衝液をD-PBSと交換した。コンジュゲーションの収率は、ヘモグロビン四量体1つ当たりおよそ2.4個のメルタンシン分子であった。DM1-SMCCコンジュゲートの形成をLC-MS分析によって確認した。Hb-DM1-SMCCコンジュゲートの濃度をUV-vis分光分析によって決定した。
実施例7 － トランスフェリン－化合物複合体の調製
血清を健常ドナーから得て、キレート剤としてのクエン酸イオン及びトランスフェリンへの鉄結合を促進する重炭酸塩の存在下で過剰な鉄を添加した。反応混合物は、血清100 mL当たり6.5 mgの重炭酸ナトリウム及び153.16のクエン酸酸化鉄（pH=8、4℃、1時間）を含有していた。アルブミンを続いて、アルコール溶液を血清サンプルに3.5V/V比で添加することにより、4℃及びpH=9.4で2時間Rivanol（4%）によって沈殿させた。次いで、溶液を3000 rpmで20分間遠心分離し、0.8mmシリンジフィルターで濾過することによって最後に濾過した。過剰なRivanolを続いて、0.025 M硫酸アンモニウム中のSephadex G-25カラムでのゲル濾過によって除去した。50%飽和硫酸アンモニウム（pH=6.5）による最初の沈殿を続いて行い、その後3000 rpmで10分間の遠心分離を行った（免疫グロブリン除去）。次いで、80%飽和硫酸アンモニウムでの2回目の沈殿を行い、トランスフェリン沈殿物を回収した。次いで、固体沈殿物を、1 M NaClを含有する0.06 MトリスHCl緩衝液（pH=8）中の緩衝液に溶解した。溶液を同じ緩衝液中で透析して、硫酸アンモニウムを完全に除去した。次いで、タンパク質溶液を、centricon PM50遠心濃縮器を用いて10 mg/ml～15 mg/ml（ブラッドフォード法によって推定される）まで濃縮し、1M NaClで平衡化したSephadex G-100ゲル濾過カラム（2.4×80 cm）に15 ml／時間の流速でロードした。このようにして得られたトランスフェリンは、SDS pageにより純度88%～90%であることが推定された。次いで、陰イオン交換体DEAE Sephadex A-50によるイオン交換クロマトグラフィーを最終精製（polishing）工程として使用した。トランスフェリンサンプルを0.06 MトリスHCl（pH=8）で平衡化したカラムにロードし、溶出緩衝液0.3 MトリスHCl（pH=8）を用いた線形濃度勾配により溶出した。タンパク質純度は98%超であり、収率は血清100 mL当たり約150 mgであった。
ヒトホロトランスフェリン（配列番号28、図1）は、自由に滴定可能なシステイン基の非存在のためにリシン修飾しか利用可能でないにもかかわらず、ヘモグロビンと同様、適切な薬物コンジュゲートに容易に共有結合的に連結することができる。このため、スクシンイミド官能化メルタンシン類似体（DM1-SMCC）を使用して、1つ以上のリシン残基に共有結合的に付着させた（スクシンイミド官能化薬物）。薬物は、以下の手順に従ってトランスフェリンへと好都合にコンジュゲートされた。
リシン共有結合的付着について官能化したメルタンシン類似体DM1 SMCC（AlbTechnology Ltd，Hederson，NV，USA）を以下のように調製した。トランスフェリン（Transferrin）溶液を反応緩衝液（0.1 mMリン酸緩衝液（pH 7.4）、この場合、起こり得る鉄キレート化効果のためにEDTAを含まない）により100 μMヘムの濃度に調整し、8%(v/v)DMSO溶液の存在下、4℃で16時間20倍モル過剰のDM1-SMCCとコンジュゲートした。アミン反応性スクシンイミジルエステルはアミンとカップリングし、タンパク質の表面上にリシン基を有する共有結合付加物をもたらす。過剰なDM1-SMCCを排除し、PM 100限外濾過濃縮器を用いて緩衝液をD-PBSと交換した。コンジュゲーションの収率は、トランスフェリン二量体1つ当たりおよそ1.5個のメルタンシン分子であった。DM1-SMCCコンジュゲートの形成をLC-MS分析によって確認した。トランスフェリン-DM1-SMCCコンジュゲートの濃度をUV-vis分光分析によって決定した。
実施例8 － フェリチンをロードした細胞を得る
得られる細胞をフェリチン溶液中、それらの完全なロードに適当なフェリチン／細胞比を確実にし、また治療効果を得るために適当な薬物含量を確実にするのに十分な時間及び濃度でインキュベートする）。時間及び濃度はフェリチンケージに封入／吸着される分子の数、細胞活性化の状態、条件及びそれらの意図される投与の回数に応じて変更することができる。
例えば、フェリチンの適当なロードを確実にするために、細胞を0.2 mg/mlフェリチン溶液中、標準培養条件で1時間～4時間インキュベートする。少なくとも0.01 mg/ml～4 mg/mlのフェリチン濃度枠及びインキュベーション時間（5分間～6時間以上）を変更することができる。細胞へのフェリチンロードの時間及び濃度を調整することで、細胞生存能力に対するフェリチン及び処理条件の影響に注意を払う必要がある。上述のように得られる細胞は、フェリチンを比較的短時間（分単位；図8）で非常に容易に取り込む。フェリチンを吸収した後、細胞はフェリチンを培養培地へと放出しない（図9）。
それにもかかわらず、当業者は独自の研究室内で上記の条件を再調整し、プロトコルを独自の目的に最適化することが可能である。
実施例9 － ヘモグロビンをロードした細胞を得る
得られる細胞をヘモグロビン溶液中、それらの完全なロードに適当なヘモグロビン／細胞比を確実にし、また治療効果を得るために適当な薬物含量を確実にするのに十分な時間及び濃度でインキュベートする）。時間及び濃度はヘモグロビン分子に連結する分子の数、細胞活性化の状態、条件及びそれらの意図される投与の回数に応じて変更することができる。
例えば、ヘモグロビンの適当なロードを確実にするために、細胞を0.1 mg/mlヘモグロビン溶液中、標準培養条件で1時間～4時間インキュベートする。少なくとも0.01 mg/ml～0.2 mg/mlのヘモグロビン濃度枠及びインキュベーション時間（5分間～4時間以上）を変更することができる。細胞へのヘモグロビンロードの時間及び濃度を調整することで、細胞生存能力に対するフェリチン及び処理条件の影響に注意を払う必要がある。上述のように得られる細胞は、ヘモグロビンを比較的短時間（分単位；図8）で非常に容易に取り込む。
それにもかかわらず、当業者は独自の研究室内で上記の条件を再調整し、プロトコルを独自の目的に最適化することが可能である。
実施例10 － トランスフェリンをロードした細胞を得る
得られる細胞をトランスフェリン溶液中、それらの完全なロードに適当なトランスフェリン／細胞比を確実にし、また治療効果を得るために適当な薬物含量を確実にするのに十分な時間及び濃度でインキュベートする）。時間及び濃度はトランスフェリン分子に連結する分子の数、細胞活性化の状態、条件及びそれらの意図される投与の回数に応じて変更することができる。
例えば、トランスフェリンの適当なロードを確実にするために、細胞を0.1 mg/mlトランスフェリン溶液中、標準培養条件で1時間～4時間インキュベートする。少なくとも0.01 mg/ml～0.2 mg/mlのトランスフェリン濃度枠及びインキュベーション時間（5分間～4時間以上）を変更することができる。細胞へのトランスフェリンロードの時間及び濃度を調整することで、細胞生存能力に対するトランスフェリン及び処理条件の影響に注意を払う必要がある。上述のように得られる細胞は、トランスフェリンを比較的短時間（分単位；図8）で非常に容易に取り込む。
それにもかかわらず、当業者は独自の研究室内で上記の条件を再調整し、プロトコルを独自の目的に最適化することが可能である。
実施例11 － 癌細胞への有用な送達ツールとしてのフェリチン／ヘモグロビン／トランスフェリン－マクロファージ複合体
実施例8、9及び10に記載のように調製した実施例1によるマクロファージは、フェリチン、ヘモグロビン、トランスフェリンを癌細胞：マウス乳癌、結腸癌、イヌ乳癌、ヒト乳癌、膵癌及び膀胱癌へと非常に容易に輸送する（図4、図10）。さらに、この移行は非癌細胞よりも癌細胞にはるかに特異的である（図11）。しかしながら、癌細胞の場合、両方の細胞型の比率が非常に重要である。マクロファージが多いほど、輸送はより良好かつ迅速となる。最も効率的な癌細胞への移行は、マクロファージと癌細胞との比率が1:1以上である場合に観察された。
この移行は、タンパク質担体を蛍光標識（例えば、FITC又はAlexa610）とコンジュゲートした場合だけでなく、それらに他の化合物、例えば抗癌剤をコンジュゲート／封入した場合にも生じた（図12に、蛍光低酸素活性化プロドラッグであるバノキサントロンを封入したフェリチンのこの移行を示す）。抗癌剤とコンジュゲートした化合物のこの移行は、癌細胞においてアポトーシスを誘導する効果を生じた（図6、図13）。
実施例12 － 癌細胞への有用な送達ツールとしてのフェリチン／ヘモグロビン／トランスフェリン－単球複合体
実施例8、9及び10に記載のように調製した実施例2による単球は、フェリチン、ヘモグロビン、トランスフェリンを癌細胞へと非常に容易に輸送する（図14）。しかしながら、両方の細胞型の比率が非常に重要である。単球が多いほど、輸送はより良好かつ迅速となる。最も効率的な癌細胞への移行は、単球と癌細胞との比率が1:1以上である場合に観察された。
実施例13 － 癌細胞への有用な送達ツールとしてのフェリチン／ヘモグロビン／トランスフェリン－顆粒球複合体
実施例8、9及び10に記載のように調製した実施例3による顆粒球は、フェリチン、ヘモグロビン、トランスフェリンを癌細胞へと非常に容易に輸送する（図15）。しかしながら、両方の細胞型の比率が非常に重要である。顆粒球が多いほど、輸送はより良好かつ迅速となる。最も効率的な癌細胞への移行は、顆粒球と癌細胞との比率が1:1以上である場合に観察された。
実施例14 － 癌細胞への有用な送達ツールとしてのフェリチン／ヘモグロビン／トランスフェリン－リンパ球複合体
実施例8、9及び10に記載のように調製した実施例4によるリンパ球は、フェリチン、ヘモグロビン、トランスフェリンを癌細胞へと非常に容易に輸送する（図16）。しかしながら、両方の細胞型の比率が非常に重要である。リンパ球が多いほど、輸送はより良好かつ迅速となる。最も効率的な癌細胞への移行は、リンパ球と癌細胞との比率が1:1以上である場合に観察された。
実施例15 － 低酸素領域への有用な標的化薬物送達剤としての白血球－タンパク質担体複合体
上記のように調製したマクロファージを、腫瘍を有する動物の尾静脈へと注射する（適切な数のマクロファージを腫瘍サイズ、発生の段階及び転移の存在に対して調整する必要がある）。図2及び図17に示されるように、マクロファージは特異的に腫瘍に到達し（数時間後）、動物全体の他の器官にも分散する（図18）。さらに、図19に示されるように、低酸素モデルでは、マクロファージは無血管の低酸素部位へと移動し、担体タンパク質を癌細胞へと移行することが可能である（図3及び図20）。
イメージング目的で、100万個～5000万個のマクロファージを乳癌又は結腸癌腫瘍担持動物の尾静脈に注射した。先に、マクロファージをCell Trackerで前標識し、フェリチン-FITCをロードした（実施例8に示される）。マクロファージ投与の8時間後に、腫瘍塊の二光子顕微鏡法を用いて、フェリチン-FITCを運搬するマクロファージの存在を検出した（図17）。それらの特異的な腫瘍の標的化だけでなく、他の器官へのそれらの移動も、DIR細胞質染料を用いたマクロファージ前標識化後の動物全身イメージング（IVIS）を用いて示された（図18）。
シクロホスファミド、メルファランを封入するフェリチン及びクロラムブシルを封入するフェリチンをロードした100万個～1000万個のマクロファージを、腫瘍担持マウスに静脈内注射した（300000個～500000個のEMT6細胞を脇腹の皮膚に注射した）。マクロファージの3回の注射を3日毎に（癌細胞注射の5日、8日及び11日後、又は癌細胞注射の7日、10日及び13日後）、又は5回連続の注射を毎日行い、マウス生存の増大が観察された（図5）。
実施例16 － 有用なイメージングツールとしての白血球－タンパク質担体複合体又は標識白血球
本発明に記載される標的化送達系の標的化は、フェリチンと造影剤とのカップリングによって追跡することができる。図21に示されるように、実施例8に記載のように造影剤（この場合、フェリハイドライト、しかしながらアイソトープ、例えば123Iによっても同じ結果が得られる）とカップリングした又はアイソトープ（この場合、18F-FDG）（図21）で標識したフェリチンをロードした1 ml～50 mlのマクロファージの注射後に、これらをMRI、PET又はSPECTによって容易に検出することができる。本実施例では（図7）、乳腺腫瘍担持マウスを、フェリチンFhをロードしたマクロファージの静脈内注射の3時間、22時間及び24時間後にMRIによってイメージングした。マウスをマクロファージで処理した（0時間の時点）。次いで、注射したマクロファージで満たされた血管の直径の増大（矢印）（顕著なT2-シグナルの低減をもたらす）、その後マクロファージの組織への広がり（スポット状パターン；矢印）が観察された。これらの変化（同じ時点）は検査した全てのマウスに観察された。
また、マクロファージを18F-FDG（5 mln～50 mln）で標識し、腫瘍担持マウスへの静脈内投与の1時間後にPETを用いてイメージングした。実験の3週間前に、これらのマウスに4T1転移性細胞株を接種し、肺、肝臓及び脾臓における転移を病理組織学的に（histopathologically）確認した。マクロファージが転移性腫瘍を有する領域へと移動し、PETでのそれらの可視化が可能となることが図21に見られる。
本発明の以上の明細書により当業者が現在その最良の形態とみなされるものを作製及び使用することが可能となるが、本明細書の具体的な実施形態、方法及び実施例の変更、組合せ及び均等物の存在が当業者により理解及び認識される。したがって、本発明は上記の実施形態、方法及び実施例ではなく、本発明の範囲及び趣旨に含まれる全ての実施形態及び方法によって限定される。
本発明は、以下の態様及びこれらの態様の好ましい実施形態にも関する。上記で提示される定義が下記の態様及び実施形態にも同様に当てはまる。
1. 有効成分を運搬するフェリチンがロードされた活性化マクロファージを含む標的化送達系。
2. フェリチンによって運搬される有効成分が抗癌剤である、実施形態1による標的化送達系。
3. 抗癌剤がアポトーシス誘導剤である、実施形態2による標的化送達系。
4. 抗癌剤がシクロホスファミド、クロラムブシル、メルファラン、ベンダムスチン及びバノキサントロンを含む群から選択される、実施形態2による標的化送達系。
5. 有効成分が低酸素活性化プロドラッグである、実施形態1による標的化送達系。
6. 低酸素活性化プロドラッグがTH-302である、実施形態5による標的化送達系。
7. 有効成分を運搬するフェリチンがロードされた活性化マクロファージを含む標的化送達系を作製する方法であって、
a）フェリチンを精製する工程と、
b）フェリチンと上記有効成分とを連結することによって、有効成分を運搬するフェリチンを得る工程と、
c）単離マクロファージを活性化する工程と、
d）有効成分を運搬するフェリチンのマクロファージへの完全なロードを確実にするのに十分な時間及びフェリチン濃度で、工程b）において得られる有効成分を運搬するフェリチンの溶液中でマクロファージをインキュベートする工程と、
を含む、方法。
8. 活性化マクロファージが骨髄由来のマクロファージである、実施形態7の方法。
9. 活性化マクロファージが血液由来のマクロファージである、実施形態7の方法。
10. 活性化マクロファージがマクロファージ細胞株に由来する、実施形態7の方法。
11. 活性化マクロファージがM1又はM2へと偏向したマクロファージである、実施形態7～10のいずれか1つの方法。
12. 活性化マクロファージがM2へと偏向している、実施形態11の方法。
13. 活性化マクロファージが鉄代謝に関して操作されている、実施形態11の方法。
14. フェリチンによって運搬される有効成分が抗癌剤である、実施形態7～13のいずれか1つの方法。
15. 抗癌剤がアポトーシス／自食作用又は壊死誘導剤である、実施形態14の方法。
16. 抗癌剤がシクロホスファミド、クロラムブシル、メルファラン、ベンダムスチン及びバノキサントロンを含む群から選択される、実施形態14の方法。
17. 有効成分が低酸素活性化プロドラッグである、実施形態7～13のいずれか1つの方法。
18. 低酸素活性化プロドラッグがTH-302である、実施形態17の方法。
19. 抗癌剤標的化送達系として使用される、実施形態1～6のいずれかに規定の標的化送達系。
20. 固形腫瘍成長の予防／治療に使用される、実施形態1～6のいずれかに規定の標的化送達系。
21. 炎症性疾患の治療における実施形態1～6のいずれかに規定の標的化送達系の使用。
22. 虚血領域の治療又はイメージング（imaging）における実施形態1～6のいずれかに規定の標的化送達系の使用。
好ましい実施形態において、本発明は上記項目1～22の主題を含まない。
図面訳
図1
Mammalianferritin H chain (SEQ ID NO: 1 to 7) 哺乳動物フェリチンH鎖（配列番号1～7）
SEQ ID NO 配列番号
Mammalianferritin L chain (SEQ ID NO: 8 to 14) 哺乳動物フェリチンL鎖（配列番号8～14）
Mammalianhaemoglobin alpha chains (SEQ ID NO: 15 to 18) 哺乳動物ヘモグロビンα鎖（配列番号15～18）
Mammalianhaemoglobin beta chains (SEQ ID NO: 19 to 22) 哺乳動物ヘモグロビンβ鎖（配列番号19～22）
Mammaliantransferrins (SEQ ID NO: 23 to 28) 哺乳動物トランスフェリン（配列番号23～28）
Transferrin トランスフェリン

図5
Survival 生存
Percentsurvival 生存率
Time (d) 時間（日）
Melphalan メルファラン
Chlorambucil クロラムブシル

図6
Cancer cellapoptosis (due to cyclophosphamide treatment) 癌細胞アポトーシス（シクロホスファミド処理による）
Number ofapoptotic cells アポトーシス細胞の数
condition 条件
ctrl 対照
drug 薬物
Feritin フェリチン

図8
uptake 取込み
MFI of FITC FITCのMFI
Time ofincubation インキュベーション時間
min 分
Monocyte Ftand Hb uptake 単球によるFt及びHbの取込み
Mean FluorescenceIntensity 平均蛍光強度
treatment 処理
untreated 未処理
MFI ofGranulocyte-Ft 顆粒球-FtのMFI
Time oftreatment 処理時間
MFI ofLymphocyte-Ft リンパ球-FtのMFI

図9
Ft-Banoxantrone(0.8 mg/ml) leakage from cells to the medium 細胞から培地へのFt-バノキサントロン（0.8 mg/ml）の漏出
FACS analysis FACS分析
Percentage ofcancer cells 癌細胞のパーセンテージ
h 時間
hrs 時間
Ft-Banoxantrone(0.2 mg/ml) leakage from cells to the medium 細胞から培地へのFt-バノキサントロン（0.2 mg/ml）の漏出
Relative MeanFluorescence Intensity 相対平均蛍光強度

図10
No. of cancercells loaded with Ft-FITC after 2 hrs of co-culture with macrophages pre-loadedwith Ft-FITC Ft-FITCを予めロードしたマクロファージとの共培養の2時間後のFt-FITCをロードした癌細胞の数
No. of loadedcells ロードした細胞の数
cell line 細胞株
No. of cancercells loaded with Hb-FITC after 2 hrs of co-culture with acrophages pre-loadedwith Hb-FITC Hb-FITCを予めロードしたマクロファージ（macrophages）との共培養の2時間後のHb-FITCをロードした癌細胞の数
Transferbetween species 種間の移行
Transfer frommouse RAW246.7 to human cancer cell line MDA-MB361 マウスRAW246.7からヒト癌細胞株MDA-MB361への移行
protein タンパク質
human bladdercancer ヒト膀胱癌
human breastcancer ヒト乳癌
Panc01 andMiaPaCe Panc01及びMiaPaCe
humanpancreatic cancer ヒト膵癌
caninemammary carcinoma イヌ乳癌

図11
Percentage ofacceptor cells with Ft-FITC Ft-FITCを有する受容細胞のパーセンテージ
time of co-culture 共培養の時間

図12
EMT6 load ofFt-Banoxantrone (0.2 mg/ml Ft-0.65 mg Banox) after 2 hrs co-culture withRAW264.7 pre-loaded with Ft-Banox Ft-Banoxを予めロードしたRAW264.7との共培養の2時間後のFt-バノキサントロン（0.2 mg/ml Ft-0.65 mg Banox）のEMT6ロード
MeanFluorescence Intensity 平均蛍光強度
treatment 処理
No. of loadedcells ロードされた細胞の数

図13
Number ofapoptotic cells アポトーシス細胞の数

図14
% of cellsrecieving iron-binding protein-FITC from human monocyte due to co-culture 共培養によりヒト単球から鉄結合タンパク質-FITCを受ける（receiving）細胞の%
No. of loadedcells ロードされた細胞の数
Transporter 輸送体

図15
MFI ofCMT-U27 cells cultured with loaded granulocytes ロードされた顆粒球と培養したCMT-U27細胞のMFI
MeanFluorescence Intensity 平均蛍光強度
untreated 未処理
transferedcompound 移行した化合物
MFI ofCMT-U309 cells cultured with loaded granulocytes ロードされた顆粒球と培養したCMT-U309細胞のMFI
Number ofCMT-U27 cells cultured with loaded granulocytes ロードされた顆粒球と培養したCMT-U27細胞の数
No. of cells 細胞の数
Number ofCMT-U309 cells cultured with loaded granulocytes ロードされた顆粒球と培養したCMT-U309細胞の数

図16
MFI of EMT6 cellscultured with loaded CD4+ cells ロードされたCD4+細胞と培養したEMT6細胞のMFI
MeanFluorescence Intensity 平均蛍光強度
untreated 未処理
Ferritin フェリチン
Hemoglobin ヘモグロビン
transferedcompound 移行した化合物
MFI of 4T1cells cultured with loaded CD4+ cells ロードされたCD4+細胞と培養した4T1細胞のMFI
MFI of CT26cells cultured with loaded CD4+ cells ロードされたCD4+細胞と培養したCT26細胞のMFI
Number of EMT6cells cultured with loaded CD4+ ロードされたCD4+と培養したEMT6細胞の数
No. of cells 細胞の数
Number of 4T1cells cultured with loaded CD4+ ロードされたCD4+と培養した4T1細胞の数
Number of CT26cells cultured with loaded CD4+ ロードされたCD4+と培養したCT26細胞の数

図17
macrophage マクロファージ
plainferritin-FITC 素フェリチン-FITC

図18
control 対照
tumor 腫瘍
injectionsite 注射部位

図21
LungRadioactivity 肺放射活性
naive miceMQ-FDG ナイーブマウスMQ-FDG
Graph legend グラフの説明
Mice withmetastatic 4T1 tumour + intravenous macrophages loaded with 18F-FDG 転移性4T1腫瘍を有するマウス＋18F-FDGをロードした静脈内マクロファージ
Mice withmetastatic 4T1 tumour + intravenous free18F-FDG 転移性4T1腫瘍を有するマウス＋静脈内遊離18F-FDG
Naive micewithout tumour + intravenous macrophages loaded with 18F-FDG 腫瘍を有しないナイーブマウス＋18F-FDGをロードした静脈内マクロファージ

Claims (21)

  1. CD45+白血球細胞を含み、該細胞内に1つ以上の鉄結合タンパク質と薬物との複合体を含む、腫瘍、炎症領域、及び／又は低酸素マーカーpimonidazoloneで可視化可能な低酸素領域のin vivoで標的化するための単離標的化送達系。
  2. 前記白血球細胞がCD34+造血前駆細胞から作製可能である、請求項1に記載の単離標的化送達系。
  3. 前記白血球が単球、マクロファージを含む分化単球、リンパ球及び顆粒球からなる群から選択される、請求項1又は2に記載の単離標的化送達系。
  4. （i）前記単球がCD11b+ CD14+単球、CD11b+CD16+単球、CD11b+ CD14+ CD16+単球、CD11b+ CD14+ MHCII+単球、CD11b+ CD14+CD115+単球、CD11b+ CD114+単球、CD11b+CD116+単球、CD11b+ CCR1+単球、CD11b+ CCR2+単球、CD11b+CX3CR+単球、CD11b+ CXR4+単球、CD11b+ CXR6+単球及びCD11b+CD14+ CD33+単球からなる群から選択されるCD11b+単球であり、
    （ii）前記分化単球がマクロファージ、活性化マクロファージ若しくはCD11b+マクロファージ若しくはCD11b+CD16+マクロファージ、CD11b+ CD32+マクロファージ、CD11b+ CD64+マクロファージ、CD11b+CD68+マクロファージ若しくはCD11b+ CD86+ M1マクロファージ、若しくはiNOSを産生する及び／又はインターロイキン12（IL-12）を分泌するもの、若しくはCD11b+CCR2+ M2マクロファージ、CD11b+ CD204+M2マクロファージ、CD11b+ CD206+M2マクロファージ、CD11b+ CD204+ CD206+ M2マクロファージ、CD11b+主要組織適合遺伝子複合体II+（MHCII+）（低発現又は高発現）M2マクロファージ、CD11b+ CD200R+ M2マクロファージ、CD11b+ CD163+ M2マクロファージ、若しくはアルギナーゼを産生する及び／又はインターロイキン10（IL-10）を分泌する活性化マクロファージ；若しくはCD11bCD11c、CD11b CD80、CD11c CD80、CD11c CD86、CD11c MHCII及びCD11c CD123の発現を有する樹状細胞からなる群から選択され、若しくは前記分化単球がLox1+、CXCR7+及びNRF2+泡沫細胞ではなく、
    （iii）単球若しくは活性化単球がCCR1、CCR2+、CXR4+及びCXR6+からなる群から選択される少なくとも1つのケモカイン受容体、若しくはマクロファージコロニー刺激因子受容体（CD115）、顆粒球コロニー刺激因子受容体（CD114）及び顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子受容体（CD116及びCD131からなる）からなる群から選択される少なくとも1つの成長因子受容体を発現し、これらの特徴の単球が炎症状態及び癌の治療に好適であり、
    （iv）前記リンパ球がCD3+及びCD4+若しくはCD8+ Tリンパ球、若しくはCD19+、CD20+、CD21+、CD19+ CD20+、CD19+ CD21+、CD20+CD21+若しくはCD19+ CD20+ CD21+Bリンパ球からなる群から選択され、又は、
    （v）前記顆粒球が好中球、若しくはCD66b+好中球、好酸球及び好塩基球、若しくはCD193+好酸球からなる群から選択される、
    請求項3に記載の単離標的化送達系。
  5. 前記活性化マクロファージが、
    （i）マクロファージ上の発現マーカーを変化させることが可能な因子との、若しくは、
    （a）少なくとも1つのM1誘導因子との、
    （b）少なくとも1つのM2誘導因子との、若しくは、
    （c）サイトカイン、若しくはIL-10及びIL-12、ケモカインを分泌する、及び／又はiNOS、アルギナーゼ若しくは他の免疫調節酵素を産生するマクロファージの能力を変化させることが可能な因子との、
    単球又はマクロファージのin vitroインキュベーションによって作製可能であり、
    （ii）以下の抗原：CD64、CD86、CD16、CD32の少なくとも1つの発現、MHCIIの高発現、及び／又はiNOS及び／又はIL-12の産生を特徴とし、
    （iii）マクロファージの貪食能力を誘導することが可能な因子との単球又はマクロファージのinvitroインキュベーションによって作製可能であり、
    （iv）以下の抗原：CD204、CD206、CD200R；CCR2、トランスフェリン受容体（TfR）、CXC-モチーフケモカイン受容体4（CXCR4）、CD163、及び／又はT細胞免疫グロブリン－ドメイン及びムチン－ドメイン2（TIM-2）の少なくとも1つの発現を特徴とし、及び／又はMHCIIの低発現を示し、
    （v）貪食能力を有し、及び／又は、
    （vi）サイトカイン若しくはIL-12若しくはIL-10の分泌、又は誘導性一酸化窒素合成酵素（iNOS）又は他の炎症誘発性化合物、アルギナーゼ又は他の免疫抑制性／抗炎症性化合物の産生が可能である、
    請求項4に記載の単離標的化送達系。
  6. （i）前記M1誘導因子がLPS、INF-γ、GM-CSF、並びにウイルス感染及び細菌感染からなる群から選択され、又は、
    （ii）前記M2誘導因子がIL-4、IL-10、IL-13、抗原と抗体との免疫複合体、IgG、熱活性化γ-グロブリン、糖質コルチコステロイド、TGF-β、IL-1R、CCL-2、IL-6、M-CSF、PPARγアゴニスト、白血球阻止因子、アデノシン、蠕虫感染及び真菌感染からなる群から選択される、
    請求項5に記載の標的化送達系。
  7. 前記単球が、
    （i）CD34+造血前駆細胞から作製可能であり、
    （ii）少なくとも1つの誘導因子、若しくはM1又はM2誘導因子、若しくは少なくとも1つのM2誘導因子との単球のinvitroインキュベーションによって作製可能であり、
    （iii）以下の抗原：TfR+、CD163+、TIM-2+、CD14+、CD16+、CD33+及び／又はCD115+の少なくとも1つの発現を特徴とし、
    （iv）以下の抗原：TfR+、CD163+、TIM-2+、CXCR4+、CD14+及び／又はCD16+の少なくとも1つの発現を特徴とし、及び／又は、
    （v）貪食能力を有する、
    請求項4に記載の単離標的化送達系。
  8. （i）前記M1誘導因子がLPS、INF-γ、GM-CSF、又はウイルス感染若しくは細菌感染からなる群から選択され、
    （ii）前記M2誘導因子がIL-4、IL-10、IL-13、抗原と抗体との免疫複合体、IgG、熱活性化γ-グロブリン、糖質コルチコステロイド、TGF-β、IL-1R、CCL-2、IL-6、M-CSF、PPARγアゴニスト、白血球阻止因子、癌馴化培地、癌細胞、アデノシン、及び蠕虫感染又は真菌感染からなる群から選択される、
    請求項7に記載の標的化送達系。
  9. 前記リンパ球が、
    （i）血液、脾臓若しくは骨髄から得られるか、又はCD34+前駆細胞から作製可能であり、
    （ii）免疫適格リンパ球であり、
    （iii）抗原特異的T細胞受容体を発現し、及び／又は、
    （iv）以下の抗原：（a）CD3+及びCD4+若しくはCD8+、又は（b）CD19+、CD20+、CD21+、CD19+ CD20+、CD19+ CD21+、CD20+CD21+若しくはCD19+ CD20+ CD21+抗原の少なくとも1つの発現を特徴とし、若しくは免疫グロブリンを産生することが可能である、
    請求項4に記載の単離標的化送達系。
  10. 前記顆粒球が、
    （i）血液、脾臓若しくは骨髄から得られるか、又はCD34+前駆細胞から作製可能であり、
    （ii）CD66b+及び／又はCD193+の少なくとも1つの発現を特徴とし、
    （iii）それらの細胞質中の顆粒の存在を特徴とする多形核白血球であり、及び／又は、
    （iv）TfR+、CD163+、TIM-2+及び／又はCXCR4+の少なくとも1つの発現を特徴とする、
    請求項4に記載の単離標的化送達系。
  11. 前記鉄結合タンパク質がフェリチン若しくは重鎖（H）型フェリチン、軽鎖（L）フェリチン及び／又はミトコンドリアのフェリチン；ヘモグロビン若しくはヘモグロビンA、ヘモグロビンAS、ヘモグロビンSC、ヘモグロビンC、ヘモグロビンD、ヘモグロビンE、ヘモグロビンF、ヘモグロビンH；ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体、ヘモペキシン、トランスフェリン；並びにラクトフェリンからなる群から選択される、請求項1～10のいずれか一項に記載の単離標的化送達系。
  12. 前記薬物が、タンパク質、核酸、抗癌剤若しくは細胞増殖抑制薬、又は細胞毒性薬；抗動脈硬化薬；並びに抗炎症薬；並びに光感作化合物；ウイルス、若しくは腫瘍溶解性ウイルス；並びに薬学的に活性のある放射性同位体、細胞傷害量のα線も放出するα又はβ線放出放射性同位体、若しくはルテチウム-177、イッテルビウム-90、ヨウ素-131、サマリウム-153、リン-32、セシウム-131、パラジウム-103、ラジウム-233、ヨウ素-125及びホウ素-10からなる群から選択される細胞傷害量のγ線、又はアクチニウム-225、ビスマス-213、鉛-212及びポロニウム-212からなる群から選択される細胞傷害量のα線も放出するα又はβ線放出放射性同位体からなる群から選択される、請求項1～11のいずれか一項に記載の単離標的化送達系。
  13. 前記抗癌剤がアポトーシス誘導剤、アルキル化物質、代謝拮抗物質、抗生物質、エポチロン、核内受容体アゴニスト及びアンタゴニスト、抗アンドロゲン、抗エストロゲン、白金化合物、ホルモン、抗ホルモン、インターフェロン、細胞周期依存性タンパク質キナーゼ（CDK）の阻害剤、シクロオキシゲナーゼ及び／又はリポキシゲナーゼの阻害剤、生体脂肪酸、プロスタノイド及びロイコトリエン、プロテインキナーゼの阻害剤、プロテインホスファターゼの阻害剤、脂質キナーゼの阻害剤、白金配位錯体、エチレンイミン、メチルメラミン、トリアジン、ビンカアルカロイド、ピリミジン類似体、プリン類似体、スルホン酸アルキル、葉酸類似体、アントラセンジオン、置換尿素及びメチルヒドラジン誘導体、エン－ジイン抗生物質、メイタンシノイド、オーリスタチン誘導体、免疫チェックポイント阻害剤、並びに腫瘍特異的タンパク質又はマーカーの阻害剤、若しくはRho-GDP解離阻害剤若しくはGrp94からなる群から選択される、請求項12に記載の単離標的化送達系。
  14. 前記抗癌剤がアセジアスルホン、アクラルビシン、アンバゾン、アミノグルテチミド、L-アスパラギナーゼ、アザチオプリン、バノキサントロン、ベンダムスチン、ブレオマイシン、ブスルファン、フォリン酸カルシウム、カルボプラチン、カペシタビン、カルムスチン、セレコキシブ、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダプソン、ダウノルビシン、ジブロムプロパミジン、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドキソルビシン、エンジイン、エピルビシン、エポチロンB、エポチロンD、リン酸エストラムスチン、エストロゲン、エチニルエストラジオール、エトポシド、フラボピリドール、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミド、ホスフェストロール、フラゾリドン、ゲムシタビン、ヘキサメチルメラミン、ヒドロキシカルバミド、ヒドロキシメチルニトロフラントイン、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イドクスウリジン、イホスファミド、インターフェロンα、イリノテカン、ロイプロリド、ロムスチン、ラルトテカン、マフェニドスルフェートオラミド、メクロレタミン、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール、メルファラン、メパクリン、メルカプトプリン、メトトレキサート、メトロニダゾール、マイトマイシンC、ミトポドジド、ミトタン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、ナリジクス酸、ニフラテル、ニフロキサジド、ニフララジン、ニフルチモクス、ニムスチン、ニモラゾール、ニトロフラントイン、ナイトロジェンマスタード、オレオムシン、オキソリン酸、ペンタミジン、ペントスタチン、フェナゾピリジン、フタリルスルファチアゾール、ピポブロマン、プレドニムスチン、プレドニゾン、プロイシン、プロカルバジン、ピリメタミン、ラルチトレキセド、ラパマイシン、ロフェコキシブ、ロシグリタゾン、サラゾスルファピリジン、塩化スクリフラビニウム、セムスチン、ストレプトゾシン、スルファカルバミド、スルファセタミド、スルファクロロピリダジン、スルファジアジン、スルファジクラミド、スルファジメトキシン、スルファエチドール、スルファフラゾール、スルファグアニジン、スルファグアノール、スルファメチゾール、スルファメトキサゾール、コトリモキサゾール、スルファメトキシジアジン、スルファメトキシピリダジン、スルファモキソール、スルファニルアミド、スルファペリン、スルファフェナゾール、スルファチアゾール、スルフイソミジン、スタウロスポリン、タモキシフェン、タキソール、テニポシド、ターチポシド、テストラクトン、プロピオン酸テストステロン、チオグアニン、チオテパ、チニダゾール、トポテカン、トリアジコン、トレオスルファン、トリメトプリム、トロホスファミド、UCN-01、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビンブラスチン、ビノレルビン及びゾルビシンであり、又はオーリスタチン、バノキサントロン、ベンダムスチン、クロラムブシル、カリケアマイシン、ジネマイシンA、メイタンシン、メルファラン、メルタンシン及びネオカルチノスタチンからなる群から選択される、請求項12に記載の単離標的化送達系。
  15. 前記抗癌剤が増殖阻害タンパク質、若しくは細胞周期阻害剤、又は増殖促進タンパク質に特異的に結合する抗体若しくは抗体様結合タンパク質、又は増殖阻害タンパク質、若しくは増殖促進タンパク質に特異的に結合する抗体若しくは抗体様結合タンパク質をコードする核酸、又はsiRNA若しくはDNAザイムである、請求項12に記載の単離標的化送達系。
  16. 前記薬物が、ベンゾトリアジンN-オキシド、アパジコン（EO9）、チラパザミン（TPN）、SN30000、PR-104A、TH-302、TH-4000、AQ4Nからなる群から選択される、請求項1～12のいずれか一項に記載の単離標的化送達系。
  17. （i）前記複合体に含まれる前記鉄結合タンパク質（複数の場合もある）と前記薬物との間の結合（複数の場合もある）が共有結合性及び／又は非共有結合性であり、及び／又は、
    （ii）前記複合体に含まれる前記薬物が前記鉄結合タンパク質又はその多量体によって捕捉／封入される、
    請求項1～16のいずれか一項に記載の単離標的化送達系。
  18. 請求項1～17のいずれか一項に記載の単離標的化送達系を作製する方法であって、
    a）精製鉄結合タンパク質を準備する工程と、
    b）薬物を鉄結合タンパク質に共有結合的若しくは非共有結合的に連結する、及び／又は薬物を鉄結合タンパク質に封入する工程と、
    c）CD45+白血球細胞を準備する工程と、
    d）前記CD45+白血球細胞を、工程b）において作製される前記鉄結合タンパク質の存在下で、該CD45+白血球細胞に工程b）において作製される該鉄結合タンパク質が少なくとも部分的にロードされるまでインキュベートする工程と、
    を含む、方法。
  19. 薬剤として使用される、請求項1～17のいずれか一項に記載の単離標的化送達系。
  20. 請求項1～17のいずれか一項に記載の単離標的化送達系と、薬学的に許容可能な担体及び／又は好適な賦形剤（複数の場合もある）とを含む医薬組成物。
  21. 腫瘍、若しくは固形腫瘍、又は乳癌、膵癌、膀胱癌、肺癌、結腸癌、又は皮膚創傷中、若しくは臓器梗塞（心臓）若しくは網膜虚血の後の低酸素マーカーpimonidazoloneで可視化可能な低酸素領域、炎症性疾患若しくは虚血領域を有する腫瘍の予防／治療に使用される、請求項1～17のいずれか一項に記載の単離標的化送達系。
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