CN108138143A - 细胞靶向的活性成分递送体系 - Google Patents

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CN108138143A CN201680047507.XA CN201680047507A CN108138143A CN 108138143 A CN108138143 A CN 108138143A CN 201680047507 A CN201680047507 A CN 201680047507A CN 108138143 A CN108138143 A CN 108138143A
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amino acid
cell
cd11b
monocyte
macrophage
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玛格达莱娜·克鲁尔
艾琳·本尼
保拉·贝奥科
托马什·里亚盖尔
阿尔贝托·博菲
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Sal Lis Ltd By Share Ltd
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Abstract

本发明涉及一种经分离的细胞靶向递送体系，其包含CD45+白细胞，在所述细胞中包含一种或更多种铁结合蛋白和活性成分的复合物，本发明还涉及用于制备这种经分离的细胞靶向递送体系的方法，以及该体系用于治疗、特别是用于治疗癌症的用途。

Description

细胞靶向的活性成分递送体系
本发明涉及一种经分离的细胞靶向递送体系，其包含CD45+白细胞，在所述细胞中包含一种或更多种铁结合蛋白和活性成分的复合物，本发明还涉及用于制备这种经分离的细胞靶向递送体系的方法，以及该体系用于治疗、特别是用于治疗癌症的用途。
发明背景
目前的成像工具能够检测大的转移瘤(尺寸大于0.5cm至1cm)。然而，它们很少检测到转移性肿瘤细胞的早期扩散。小于0.5cm的人转移瘤是无血管的，因此没有适当的血液和氧供应。这表示通过血液循环递送造影剂以标记这些转移瘤并使其成像是不可能的。缺氧的存在是微转移瘤的常见特征，其中缺氧部分可以高达90％，几乎没有血液灌注(Li等人，2012，Journal of Solid Tumours，2(2)：28-33)。因此，严重缺氧被认为是微转移瘤的一般特征。
在大群正常细胞中隐藏的一种或更多种微转移瘤的靶向呈现出独特的挑战，因为接近微转移瘤被几种生物屏障、不良血液供应阻碍，微转移瘤的小尺寸和其分散至器官呈现出其他障碍。
出于相同的原因，微转移瘤的治疗常常是困难的。尽管微转移瘤源自的实体瘤对常规治疗通常反应良好，但常常在原发性肿瘤部位或在转移瘤部位再生长。这构成了临床肿瘤学中严重的问题(Muthana等人，2012，Cancer Res；73(2)；490-495)。这与限制药物渗透的实体瘤的微环境特征有关，从而使肿瘤暴露在低于药物有效浓度的浓度下(Hobbs等人，1998，Proc Natl Acad Sci USA：4607-4612)。这是由不足的脉管系统引起的，其导致团块中癌细胞的高异质性、低氧张力(缺氧)、低pH和低葡萄糖浓度(Kizaka-Kondoh等人，2003，Cancer Sci 94(12)：1021-1028)。此外，在一些区域中快速的肿瘤细胞增殖可以超过新血管生长的速度，这促进缺氧区域的形成(Lewis和Murdoch，2005，Am J Pathol 167(3)：627-635)。导致肿瘤缺氧的这种异常的血管结构及其之后受损的功能与患有实体瘤的患者的更恶性的表型和低存活率有关，并且导致由于药物摄取减少的治疗失败和癌细胞中的缺氧诱导性改变(Sun等人，2012，Clin Cancer Res 18(3)：758-770；Sullivan等人，2008 MolCancer Ther 7(7)：1961-1973；Kizaka-Kondoh等人，2003，Cancer Sci 94(12)：1021-1028)。此外，化疗或放疗引起大面积肿瘤缺氧的额外形成，从而使肿瘤的治疗甚至更困难。抗癌治疗的效力受限于缺氧肿瘤细胞存在的事实已经使得引入目标在于克服这种问题的各种治疗方法。
本发明人已经发现CD45+白细胞、特别是活化的巨噬细胞可以摄取与一种或更多种铁结合蛋白在体外复合的活性成分，并在体内递送这些复合物至细胞或细胞中，优选至肿瘤细胞或肿瘤细胞中。基于该成果，本发明人已经克服了现有技术的上述一个或更多个问题。因此，本发明的靶向递送体系尤其提供了一个或更多个以下优点：(i)特异性递送一种或更多种活性成分至吸引上述CD45+白细胞的组织，优选至患病细胞中，(ii)保护活性成分免于在血液循环中失活或从身体中清除，(iii)递送活性成分优选至不良血管化或非血管化的疾病区域的细胞中，所述疾病区域例如转移瘤、较大肿瘤、风湿性病变、无血管伤口、皮肤中的缺氧区域，(iv)降低的活性成分毒性，(V)递送具有不良药代动力学的活性成分，(vi)降低由于药物靶向递送的药物副作用，(vii)由于靶向递送，较低剂量的药物具有较高的治疗效力；和/或(viii)由于施用与铁结合蛋白相连的药物，所述铁结合蛋白负载在CD45+白细胞中，因此在药物施用部位局部组织损伤的风险较低(Pérez-Herrero E，Fernández-Medarde A.2015，Eur J Pharm Biopharm 93：52-79)。
发明概述
在第一个方面，本发明涉及一种经分离的靶向递送体系，其包含CD45+白细胞，所述CD45+白细胞优选地能够内化铁结合蛋白，在所述细胞中包含一种或更多种铁结合蛋白和一种或更多种活性成分的复合物。
在第二个方面，本发明涉及制备本发明第一个方面的经分离的靶向递送体系的方法，其包括以下步骤：
a)提供优选纯化的铁结合蛋白；
b)将活性成分共价或非共价地连接至铁结合蛋白和/或在铁结合蛋白中包封活性成分；
c)提供CD45+白细胞；和
d)在步骤b)中产生的铁结合蛋白和活性成分的复合物的存在下培养CD45+白细胞，直到CD45+白细胞至少部分地负载步骤b)中产生的铁结合蛋白和活性成分的复合物。
在第三个方面，本发明涉及本发明第一个方面的经分离的靶向递送体系，其用作药物。
在第四个方面，本发明涉及包含本发明的经分离的靶向递送体系和药学上可接受的载体和/或合适的赋形剂的药物组合物。
在第五个方面，本发明涉及本发明第一个方面的经分离的靶向递送体系，其用于预防/治疗肿瘤、炎症性疾病或缺血性区域，所述肿瘤优选实体瘤，优选乳腺癌、胰腺癌、膀胱癌、肺癌、结肠癌、或具有缺氧区域的肿瘤，所述缺血性区域特别是在皮肤伤口中或器官梗塞(心脏)或视网膜缺血之后的。
优选实施方案的详细描述
在以下详细描述本发明前，应理解本发明不限于本文描述的特定方法、方案和试剂，因为这些方法、方案和试剂可以变化。还应理解的是，本文使用的术语仅用于描述特定的实施方案，并且不旨在限制本发明范围，本发明范围仅由所附权利要求限制。除非另外限定，本文所使用的所有技术和科学术语都具有与本领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。
下面将描述本发明的要素。这些要素与特定的实施方案一起列出，然而应理解它们可以以任何方式和任何数量组合以产生另外的实施方案。各种描述的实施例和优选实施方案不应理解为仅将本发明限制为明确描述的实施方案。该描述应被理解为支持并包含将明确描述的实施方案与许多公开的和/或优选的要素组合的实施方案。此外，除非上下文另外指出，否则本申请中所有描述的要素的任何排列和组合应被认为由本申请的描述所公开。
贯穿本说明书全文，引用了几篇文献。本文所引用的每个文献(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商说明书、说明书等)，无论是上文还是下文，均通过引用以其整体并入本文。本文没有内容被解释为承认本发明由于在先发明而没有早于该公开内容的权利。
定义
为实践本发明，除非另外说明，使用了本领域文献中所说明的化学、生物化学和重组DNA技术的常规方法(参见例如，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，J.Sambrook等人编辑，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，1989)。
贯穿该说明书和其后的权利要求中，除非上下文需要，否则词“包含”及其变体将被理解为意味着包含所说明的整体或步骤或整体的组或步骤的组，但不排除任何其他整体或步骤或整体的组或步骤的组。如在该说明书和所附权利要求中所使用的，没有数量词修饰的指示物包括复数指示物，除非文中另外明确地规定。
术语“靶向药物递送”指将活性成分递送给患者，这导致当与此患者身体的其他区域相比时，在身体的特定区域中活性成分的浓度增加。优选地，比较身体的患病区域和具有血液循环类似通路的身体其他区域之间的相对浓度。在优选的实施方案中，在施用本发明的靶向递送体系后，优选2至24小时后，在来自患病区域的给定数目的细胞或给定活组织切片体积中的活性成分浓度相比于来自非患病区域的相同数目的细胞或活组织切片体积中的活性成分浓度高至少10％。更优选地，在施用本发明的靶向递送体系后，优选2至24小时后，患者身体的患病区域中活性成分的浓度相比于身体的非患病区域中的活性成分浓度高至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少150％、至少200％、至少250％、至少300％、至少350％、至少400％、至少450％、至少500％、更优选至少1000％。当基于全身分布评估时，优选将至少5％、优选至少10％、更优选至少15％的施用至患者的活性成分递送至身体的患病区域。活性成分的靶向递送限制了活性成分对身体患病区域的潜在有害作用。
术语“靶向药物递送体系”或“靶向递送体系”在本申请中同义地使用，并且指能够将活性成分递送至靶标区域的体系，即能够靶向递送的体系，所述靶标区域优选在患者体内。
术语“活性成分”或“药物”在本发明的上下文中同义地使用，并且指改变或调节细胞活性或能够被活化的任何化合物，即前药，以改变或调节细胞活性，优选地改变或调节在患者体内的细胞活性。这种活性成分的实例包括所谓的“小分子”和肽。术语“小分子”在本发明的上下文中用于指分子量低于1500克/摩尔的碳氢化合物或药学上活性放射性同位素。优选地，可以使用的药物包括抗癌药物、药学上活性放射性同位素或水铁矿。
在本发明上下文中使用的术语“前药”指在施用后，关于至少一种性质，代谢或另外转化为生物学活性或更具活性的成分(或药物)的任何活性成分。与药物相比，前药以使得其相对于药物变为活性较低或无活性的方式被化学地改性，但是化学改性使得在前药施用至患者后通过代谢或其他生物学过程产生相应的药物。例如相对于活性药物，前药可以具有改变的代谢稳定性或输送特性、较少的副作用或较低的毒性，或改善的味道(例如参见，参考文献Nogrady，1985，Medicinal Chemistry A Biochemical Approach，牛津大学出版社，纽约，第388至392页，通过引用并入本文)。前药可以使用除了相应药物以外的反应物来合成。
术语“多核苷酸”和“核酸”在本文中可互换地使用，并且被理解为由核苷酸单体形成的聚合物或低聚物大分子。核苷酸单体由碱基、五碳糖(例如但不限于核糖或2′-脱氧核糖)和一至三个磷酸基团组成。典型地，多核苷酸通过各个核苷酸单体之间的磷酸二酯键形成。在本发明的上下文中提及的核酸分子包括但不限于核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)及其混合物，例如，RNA-DNA杂合体。核酸可以是例如化学地合成的，例如根据磷酸三酯法合成(参见例如，Uhlmann，E.&Peyman，A.(1990)Chemical Reviews，90，543-584)。“适配体”是以高亲和力与多肽结合的核酸。适配体可以通过选择方法从大量不同的单链RNA分子中分离，所述选择方法例如SELEmir146-a(参见例如Jayasena(1999)Clin.Chem.45，1628-50；Klug和Famulok(1994)M.Mol.Biol.Rep.，20，97-107；美国5582981)。适配体也可以以其镜像形式例如作为L-核糖核苷酸合成和选择(Nolte等人(1996)Nat.Biotechnol.，14，1116-9；Klussmann等人(1996)Nat.Biotechnol.，14，1112-5)。已经以这种方式被分离的形式具有不被天然存在的核糖核酸酶降解的优势，因此具有更高的稳定性。
术语“肽”或“多肽”在本发明的上下文中可互换地使用，其指通过肽键连接的至少两个氨基酸的链。因此，本发明上下文中的术语“肽”还用于指具有多于50个、多于100个或多于150个氨基酸的氨基酸链。
如在本发明的上下文中使用的术语“抗体”指属于免疫球蛋白超家族的糖蛋白；术语抗体和免疫球蛋白通常可互换地使用。抗体指由浆细胞产生的蛋白质分子，其被免疫系统用于识别和中和外来物体，例如细菌和病毒。抗体识别外来靶标的独特部分，即其抗原。
本文所使用的术语“抗体片段”指抗体的一个或更多个片段，其保留与抗原特异性结合的能力。在术语“抗体片段”中包含的结合片段的实例包括片段抗原结合(Fab)片段、Fab′片段、F(ab′)2片段、重链抗体、单域抗体(sdAb)、单链可变片段(scFv)、可变片段(Fv)、VH结构域、VL结构域、单域抗体、纳米抗体、IgNAR(免疫球蛋白新抗原受体)、双-scFv、双特异性T细胞衔接器(BITE)、双亲和性重靶向(DART)分子、三抗体(triple body)、双抗体、单链双抗体、替代性支架蛋白及其融合蛋白。
本说明书中使用的术语“双抗体”指可以结合不同抗原的融合蛋白或二价抗体。双抗体由包含抗体片段即可变片段的两条蛋白质单链组成。双抗体包含在相同多肽链(VH-VL或VL-VH)上连接至轻链可变结构域(VL)的重链可变结构域(VH)。通过使用连接两个可变结构域的短肽，使得结构域与另一条链的互补结构域配对，产生两个抗原结合位点。双抗体可以靶向相同(单特异性)或不同(双特异性)的抗原。
“单域抗体”指由抗体的单个单体可变结构域构成的抗体片段。简单地说，它们只包含由骆驼科或软骨鱼类产生的重链抗体的单体重链可变区。由于它们不同的来源，它们也被称为VHH或VNAR(可变的新抗原受体)-片段。或者，可以通过使用基因工程由常规小鼠或人抗体的可变结构域的单体化来获得单域抗体。它们具有约12至15kDa的分子量，因此它们是能够识别抗原的最小抗体片段。其他实例包括纳米抗体。
在本说明书的上下文中使用的术语“拟抗体”指可以与抗体类似地特异性结合抗原的化合物，但其与抗体在结构上不相关。通常，拟抗体是摩尔质量为约3至20kDa的人造肽或蛋白质，其包含一个、两个或更多个特异性结合抗原的暴露结构域。实例尤其包括LACI-D1(脂蛋白相关的凝固抑制剂)；affilin，例如人-γB结晶或人泛素；半胱氨酸蛋白酶抑制剂；来自嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)的Sac7D；脂质运载蛋白和衍生自脂质运载蛋白的anticalin；DARPin(设计的锚蛋白重复结构域)；Fyn的SH3结构域；蛋白酶抑制剂的Kunits结构域；单抗，例如纤连蛋白的第十种III型结构域；adnectin：knottin(半胱氨酸结小蛋白)；atrimer；evibody，例如，基于CTLA4的结合剂，亲和体(affibody)，例如来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的蛋白A的Z-结构域的三螺旋束；Trans-body，例如人转铁蛋白；tetranectin，例如单体或三聚体人C型凝集素结构域；微抗体，例如胰蛋白酶抑制剂II；affilin；犰狳重复蛋白。核酸和小分子有时也被认为是拟抗体(适配体)，但不是人造抗体、抗体片段和由这些构成的融合蛋白。它们相比抗体的共同优点是更好的溶解性、组织渗透性、对热和酶的稳定性以及相对低的生产成本。
贯穿说明书关于多肽和核苷酸序列比对，使用术语“序列一致性”。在比对两个序列并且没有指定计算序列一致性百分比所要比对的参考序列的情况下，如果另外没有特别指出，否则参考待比对的两个序列中较长的序列来计算序列一致性。如果指出了参考序列，如果另外没有特别指出，则序列一致性是基于SEQ ID所示的参考序列的全长确定的。例如，相比于参考的300个氨基酸长的多肽序列，由200个氨基酸组成的多肽序列可以显示出最大百分比为66.6％(200/300)的序列一致性，而具有150个氨基酸长度的序列则可以显示出最大百分比为50％(150/300)的序列一致性。如果这150个氨基酸中的15个与300个氨基酸长的参考序列的相应氨基酸不同，则序列一致性水平减少至45％。核苷酸和氨基酸序列的相似性、即序列一致性的百分比可以通过序列比对来确定。这种比对可以用几种本领域已知的算法进行，优选地用Karlin和Altschul(Karlin&Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877)的数学算法进行，用hmmalign(HMMER软件包，http：//hmmer.wustl.edu/)或用CLUSTAL算法(Thompson，J.D.，Higgins，D.G.&Gibson，T.J.(1994)Nucleic Acids Res.22，4673-80)进行，其例如可以在http：//www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/上或在http：//www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html上或在http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page＝/NPSA/npsa_clustalw.html上获得。优选使用的参数是它们在http：//www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/或http：//www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html上设置的默认参数。序列一致性的等级(序列匹配)可以使用例如BLAST、BLAT或BlastZ(或BlastX)来计算。使用BLASTP程序进行BLAST蛋白质搜索，分数＝50，字长＝3。为了获得用于比对目的的空位比对，使用如Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402中描述的GappedBLAST。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，使用各程序的默认参数。序列匹配分析可以通过已建立的同源作图技术如Shuffle-LAGAN(Brudno M.，Bioinformatics 2003b，19Suppl1：I54-162)或Markov随机场来补充。还可以用使用来自序列数据库检索的信息、具有3D结构的可用同系物和用户定义的限制条件用于多个蛋白质序列的和/或结构的基于结构的比对(Pei J，Grishin NV：PROMALS：towards accurate multiple sequence alignments ofdistantly related proteins；Bioinformatics 2007，23：802-808；3DCoffee@igs：a webserver for combining sequences and structures into a multiple sequencealignment；Poirot O，Suhre K，Abergel C，O′Toole E，Notredame C.Nucleic AcidsRes.2004 Jul 1；32：W37-40)。当在本申请中提及序列一致性的百分比时，如果另外没有特别指出，这些百分比是相对于较长序列的全长计算的。
在本发明的上下文中使用的术语“白细胞”指涉及保护身体免受传染病和外来侵入物的免疫系统的细胞。所有白细胞均由骨髓中的多能细胞产生和衍生，所述多能细胞被称为造血干细胞。白细胞遍及全身而存在，包括血液和淋巴系统。所有白细胞都有细胞核，这将它们与其他血细胞、无核红细胞(RBC)和血小板区分开。白细胞的类型可以按标准方式分类。将它们按结构(粒细胞或无粒白细胞)或细胞分裂谱系(骨髓细胞或淋巴细胞)分类成两对最宽的类别。这些最宽的类别可以进一步分为五种主要类型：嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞。这些类型以其物理和功能性特点进行区分。单核细胞和嗜中性粒细胞是吞噬细胞的。可以分类为进一步的亚型；例如在淋巴细胞中有B细胞、T细胞和NK细胞。通过粒细胞的核形状(叶形相对圆形，即分叶核相对单核)和它们的细胞质颗粒(存在或不存在，或更精确地，在光学显微镜下可见或不可见)，将其与无粒白细胞区分开。另一种二分法是通过谱系：通过造血谱系(细胞分化谱系)将骨髓细胞(嗜中性粒细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)与淋巴样细胞(淋巴细胞)区分开。
本发明已经观察到CD45+表达是白细胞的特征，其适合在本发明靶向递送体系的情况下使用，特别是由于CD45+白细胞被吸引至体内的特定组织和细胞，以及能够将一种或更多种铁结合蛋白和一种或更多种活性成分的复合物递送至细胞或递送至细胞中。技术人员应理解的是除克隆来源的CD45+白细胞外，CD45+白细胞是不同白细胞的混合群，所述不同白细胞具有表达CD45+表面抗原的共同性质。因此，贯穿说明书，不同组的CD45+白细胞内的细胞亚群的特征在于其他功能性和/或结构特征。术语“CD45+”表示细胞群内的大部分细胞或基本上全部细胞表达CD45+表面抗原。关于这点以及关于其他细胞表面抗原，术语“表达”表示表面抗原在细胞内产生并且可检测地暴露在细胞表面上。可检测地暴露在细胞表面上的表面抗原的表达水平以及由此得到的数量可以在不同的白细胞中变化很大。通常，如果表面抗原的至少5个、优选至少10个拷贝可检测地暴露在细胞表面上，则细胞被认为对于细胞表面抗原是阳性的，即表示为“+”。技术人员非常清楚如何检测、定量和选择对于给定的细胞表面抗原为阳性(或阴性)的细胞。优选的方法包括荧光激活细胞分选(FACS)。在该技术中，经荧光标记的抗体被用于结合细胞群的细胞表面抗原，然后将细胞分离为单个细胞，并基于对单个细胞测量的荧光强度，表征为对给定的细胞表面抗原为阳性或阴性的。在本发明的一些实施方案中，表明给定蛋白质的表达为高或低。这表示蛋白质在两种情况下都可检测地表达，即为“+”，然而以不同的水平表达。高表达和低表达分别表示对于不同蛋白质每个细胞的蛋白质的不同绝对数量。因此，如果每个细胞有多于500个可检测的蛋白质拷贝，则可以认为给定的蛋白质以高水平表达，如果每个细胞有1至50个可检测的蛋白质拷贝，则可以认为给定的蛋白质以低水平表达。而如果另一种蛋白质有多于5000个可检测的拷贝，则可以认为其以高水平表达，如果每个细胞有1至500个可检测的拷贝，则可以认为其以低水平表达。如何使用流式细胞术和Becton Dickinson QuantibriteTM珠法(参见例如，Pannu，K.K.，2001，Cytometry.2001 Dec 1；45(4)：250-8)或质谱分析(参见例如，Milo，R.，2013，Bioessays，35(12)：1050-1055)定量细胞中表达或产生的蛋白质数量是本领域众所周知的。出于本发明的目的，术语给定蛋白质的“高表达”指该蛋白质的可检测表达是在健康CD45+白细胞群中发现的最高表达水平、即每个细胞的拷贝数的至少70％。术语给定蛋白质的“低表达”指该蛋白质的可检测表达是在健康CD45+白细胞群中发现的最高表达水平、即每个细胞的该蛋白质拷贝数的30％或更少。优选地，“最高表达水平”被确定为在不同对象的健康CD45+白细胞中发现的最高表达水平的平均值。在一些实施方案中，优选的细胞亚群以“产生”给定蛋白质为特征。这被理解为表示蛋白质不必在细胞表面上是可检测的，而是可以仅存在于细胞内。技术人员非常清楚如何检测和/或定量细胞内产生的蛋白质和/或选择产生这种蛋白质的细胞。
在本发明的情况下，术语“分化的单核细胞”用于指从主要存在于骨髓(但也可以在脾脏中)中的称为巨噬细胞-DC前体(MDP)的定向前体分化、并分化为树突细胞或巨噬细胞的单核细胞。在小鼠中，它们由两个主要亚群组成：(i)具有CX3CR1高表达、CCR2和Ly6C-低表达的CD11b+细胞，和(ii)具有CX3CR1低表达、CCR2和Ly6C+高表达的CD11b+细胞。在离开骨髓后，小鼠Ly6C+单核细胞在循环中分化为Ly6C-单核细胞。类似地，在人单核细胞分化中，认为在外周血循环中，CD14++典型单核细胞离开骨髓并分化为CD14++CD16+中间体单核细胞，并继续分化为CD14+CD16++非典型单核细胞(Yang等人，2014；Biomark Res 2(1)doi.10.1186/2050-7771-2-1)。
巨噬细胞是组织中存在的专门的吞噬细胞和抗原呈递细胞(APC)，其从循环外周血单核细胞(PBM)中分化。在本发明的情况下，使用的术语“活化的巨噬细胞”指任何极化的巨噬细胞。巨噬细胞活化通常通过用白介素、细胞因子和/或生长因子培养来实现。特别地，IL-4和M-CSF可以用作活化剂。不同表型的活化巨噬细胞分为M1-巨噬细胞，典型活化的巨噬细胞(CAM)和M2-巨噬细胞，替代性活化的巨噬细胞(AAM)。典型活化的M1-巨噬细胞包含具有急性炎症表型的免疫效应细胞。这些细胞对细菌具有高度侵略性并产生大量淋巴因子(Murray和Wynn，2011，J Leukoc Biol，89(4)：557-63)。替代性活化的抗炎M2-巨噬细胞可以分为至少三个亚组。这些亚型具有多种不同的功能，包括免疫调节、维持耐受性和组织修复/伤口愈合。在本发明的情况下使用的术语“M1诱导物”指引导PBM分化为M1型巨噬细胞的化合物。在本发明的情况下使用的术语“M2诱导物”指引导PBM分化为M2型巨噬细胞的化合物。技术人员知道许多方式以促进向M1或M2巨噬细胞的分化。
术语“通过巨噬细胞的吞噬作用”是巨噬细胞吞噬实体颗粒以形成被称为吞噬体的内囊泡的过程。
所使用的术语“铁结合蛋白”指与铁离子非共价结合的蛋白质。这种蛋白质的实例包括铁蛋白、血红蛋白、转铁蛋白和乳铁蛋白。铁结合蛋白通过细胞表面受体结合，所述细胞表面受体有助于这些蛋白质内化到细胞中。
在第一个方面，本发明涉及一种经分离的靶向递送体系，其包含CD45+白细胞，其优选地能够内化铁结合蛋白，在所述细胞中包含一种或更多种铁结合蛋白和一种或更多种活性成分的复合物。
给定CD45+白细胞或细胞群内化铁结合蛋白的能力取决于在这种内化过程中涉及的受体的表达。导致铁蛋白内化的受体包括例如TfR、CXCR4、CD163和TIM-2。技术人员非常清楚如何测量铁结合蛋白的摄取量，并且在以下的实施例部分中描述了测量摄取的优选方法。本发明人还注意到，CD45+白细胞的亚群相对于一种铁结合蛋白具有内化另一种铁结合蛋白的一定倾向，因此可以获得更高的复合物浓度和/或显示出细胞中复合物的较少渗出。下面更详细地描述了这种CD45+白细胞亚群。
在本发明的情况下，使用的短语“一种或更多种铁结合蛋白和活性成分的复合物”指其中一种或更多种活性成分分子共价或非共价地结合到一种或更多种铁结合蛋白上的组合物。一种或更多种铁结合蛋白与一种或更多种活性成分之间的共价或非共价结合可以是直接或间接的。在后一种情况下，活性成分通过连接子或间隔物(spacer)与铁结合蛋白连接。连接子或间隔物是技术人员已知的，例如聚丙氨酸、聚甘氨酸、碳水化合物、(CH2)n基团或多肽连接子。因此，技术人员将能够根据相应的应用来选择相应合适的连接子或间隔物。如果铁结合蛋白形成笼、例如铁蛋白，则术语“复合物”还包括在笼中活性成分的外壳(enclosure)，即使在蛋白质和活性化合物之间不存在共价或非共价键。当细胞内化铁结合蛋白时，复合物的形成使得活性成分运输到细胞中。因此，优选活性成分以不干扰运输机制的方式与铁结合蛋白结合。这可以通过技术人员使用本领域已知的摄取试验容易地测试，并在下面的实施例部分中描述。优选复合物足够稳定以在细胞中向体内目标区域的运输中保留下来。因此，优选递送复合物而不是单独的活性成分至目标区域中的细胞或细胞中。这种性质也减少了活性成分对CD45+白细胞的可能有害作用，例如细胞毒性。如果活性成分与铁结合蛋白共价偶联，则这种偶联优选通过已知位于表面区域的氨基酸残基，其不涉及与细胞摄取铁结合蛋白所需的细胞受体结合。在本发明的情况下使用的铁结合蛋白可以与多种活性成分形成稳定的非共价结合的复合物。
CD45+白细胞源于待治疗的患者，在这种情况下，负载复合物的细胞与患者是自体同源的。还预期在用本发明的靶向递送治疗前，患者是MHC类型的，并且用于给定患者的白细胞类型是与患者匹配的MHC。在这两个优选的实施方案中，CD45+白细胞是原代细胞或通过少量分化步骤由原代细胞衍生的。或者，CD45+白细胞可以是来自永生化的但优选未转化的CD45+白细胞细胞系。因此，用于CD45+白细胞优选用于巨噬细胞分离的血液是优选地从待治疗的患者或健康供体获得的。或者，可以从血库获得血液。本文也考虑使用脐带血。
本发明人注意到可由CD34+造血前体细胞产生的CD45+白细胞亚群特别适于活性成分的靶向特异性递送。因此，优选用于产生靶向递送体系的白细胞由CD34+造血前体细胞产生。技术人员非常清楚如何选择CD34+造血前体细胞以及如何将这些细胞分化为白细胞。
优选地，CD45+白细胞选自单核细胞、分化的单核细胞、淋巴细胞和粒细胞。这些一般类别的白细胞中优选的亚群在下文通过结构参数限定，例如，给定蛋白质的存在或不存在、功能性质和/或其产生/分化的方法。如上文概述的，如果细胞群中并非每个细胞具有特定的性质，只要该群中大多数细胞具有该性质，则本发明的靶向递送体系仍会提供上文概述的优点。因此，下文中描述了本发明的靶向递送体系的一种优选细胞的性质。技术人员领会，本发明的药物组合物将包含数百万个细胞，该群内并非每个细胞都具有本文概述的功能性质和/或结构性质，但是如果大多数细胞具有相应的功能性质和/或结构性质，则所述药物组合物仍可以用于治疗疾病。
本发明人已经意识到CD45+白细胞的亚群具有特别有利的性质，尤其包括复合物总体上摄取的效率和/或量，将复合物保留在细胞内的能力，即避免活性成分的渗出和靶向释放，摄取特定铁结合蛋白和/或靶向特定组织或细胞的效率，从而适于治疗或改善特定的疾病。本发明人已经观察到例如CD45+白细胞，其表达以下抗原中的一种或更多种：CD204、CD206、CD200R、CCR2，相比摄取其他铁结合蛋白，其优先摄取铁蛋白。因此，如果复合物中的铁结合蛋白是铁蛋白，则优选选择表达以下抗原中的一种或更多种的CD45+白细胞：CD204、CD206、CD200R、CCR2。因此，在本发明的优选实施方案中
(i)单核细胞是CD11b+单核细胞，优选地选自CD11b+CD14+单核细胞、CD11b+CD16+单核细胞、CD11b+CD14+CD16+单核细胞、CD11b+CD14+MHCII+单核细胞、CD11b+CD14+CD115+单核细胞、CD11b+CD114+单核细胞、CD11b+CD116+单核细胞、CD11b+CCR1+单核细胞、CD11b+CCR2+单核细胞、CD11b+CX3CR+单核细胞、CD11b+CXR4+单核细胞、CD11b+CXR6+单核细胞和CD11b+CD14+CD33+单核细胞；
(ii)分化的单核细胞选自巨噬细胞、活化的巨噬细胞，优选CD11b+巨噬细胞，更优选CD11b+CD16+巨噬细胞、CD11b+CD32+巨噬细胞、CD11b+CD64+巨噬细胞、CD11b+CD68+巨噬细胞，优选CD11b+CD86+M1巨噬细胞，优选其产生诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)和/或分泌白介素12(IL-12)，或优选CD11b+CCR2+M2巨噬细胞、CD11b+CD204+M2巨噬细胞、CD11b+CD206+M2巨噬细胞、CD11b+CD204+CD206+M2巨噬细胞、CD11b+主要组织相容性复合体II+(MHCII+)(低表达或高表达)M2巨噬细胞、CD11b+CD200R+M2巨噬细胞、CD11b+CD163+M2巨噬细胞，或产生和/或分泌精氨酸酶-1和/或白介素10(IL-10)的活化的巨噬细胞；或树突细胞，其优选地具有CD11b CD11c、CD11b CD80、CD11c CD80、CD11c CD86、CD11c MHCII和CD11c CD123的表达，优选分化的单核细胞不是表达凝集素样氧化低密度脂蛋白受体-1(Lox1+)、C-X-C趋化因子受体类型7(CXCR7+)和核因子(红细胞衍生的2)样2(NRF2+)的泡沫细胞。泡沫细胞是一种巨噬细胞，其聚集在血管壁上的脂肪沉积物上，在血管壁上它们摄取低密度脂蛋白并且变为负载脂质，这使它们具有泡沫状外观。这些细胞分泌参与斑块生长的各种物质，且它们的死亡促进炎症，从而导致心血管疾病；
(iii)表达至少一种趋化因子受体的单核细胞或活化的单核细胞，所述趋化因子受体优选地选自CCR1、CCR2、CXR4和CXR6，或表达至少一种生长因子受体的单核细胞或活化的单核细胞，所述生长因子受体优选地选自巨噬细胞集落刺激因子受体(CD115)、粒细胞集落刺激因子受体(CD114)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体(由CD116和CD131组成)；具有这些特征的单核细胞特别适合于治疗炎性病症和癌症；
(iv)淋巴细胞选自CD3+和CD4+或CD8+T淋巴细胞或CD19+、CD20+、CD21+、CD19+CD20+、CD19+CD21+、CD20+CD21+或CD19+CD20+CD21+B淋巴细胞；或
(v)粒细胞选自嗜中性粒细胞，优选CD66b+嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞，优选CD193+嗜酸性粒细胞。
在本发明的靶向递送体系的优选实施方案中，活化的巨噬细胞：
(i)能够通过单核细胞或巨噬细胞或其前体与能够改变巨噬细胞上的表达标志物的因子的体外培养产生，优选地
(a)与至少一种M1诱导物的体外培养产生，
(b)与至少一种M2诱导物的体外培养产生，
(c)或与能够改变巨噬细胞分泌细胞因子优选IL-10和IL-12、趋化因子和/或产生iNOS、精氨酸酶或其他免疫调节酶的能力的因子的体外培养产生；这些因子的实例是：活化的血小板、IL-4、IL-10、IL-13、抗原和抗体的免疫复合物、IgG、热活化的γ-球蛋白，糖皮质激素、肿瘤生长因子-β(TGF-β)、IL-1R、CC-趋化因子配体2(CCL-2)、IL-6、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、过氧化物酶体增殖物活化受体γ(PPARγ)激动剂、白细胞抑制因子(LIF)、腺苷、蠕虫和真菌感染、脂多糖(LPS)、干扰素γ(INF-γ)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)以及病毒感染和细菌感染；在这方面，观察到用M1诱导物活化的单核细胞，特别是LPS会引起细胞表达iNOS，观察到用M1诱导物活化的单核细胞，特别是LPS会引起细胞不表达精氨酸酶-1，观察到用M2诱导物活化的单核细胞，特别是IL-4会引起细胞表达精氨酸酶-1，和观察到用M2诱导物活化的单核细胞，特别是IL-4会引起细胞不表达iNOS，
(ii)特征在于以下抗原中的至少一种的表达：CD64、CD86、CD16、CD32、MHCII的高表达，和/或iNOS和/或IL-12的产生；
(iii)能够通过单核细胞或巨噬细胞与能够诱导巨噬细胞吞噬能力的因子的体外培养产生，所述因子例如IL-18、调理素(例如补体衍生的蛋白质，例如iC3b、免疫球蛋白G)、降钙素基因相关肽(CGRP)、脂多糖(LPS)、干扰素γ(IFN-γ)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、病毒感染和/或细菌感染；
(iv)特征在于以下抗原中的至少一种的表达：CD204、CD206、CD200R；CCR2、转铁蛋白受体(TfR)、CXC模序趋化因子受体4(CXCR4)、CD163和/或T细胞免疫球蛋白结构域和黏蛋白结构域2(TIM-2)，和/或显示MHCII的低表达；具有这些性质的活化的巨噬细胞特别适合包含作为铁结合蛋白的铁蛋白的复合物；
(v)具有吞噬能力；和/或
(vi)能够分泌细胞因子或产生诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)(或其他促炎症性化合物)、精氨酸酶或其他抑制免疫力/抗炎化合物，所述细胞因子优选IL-12或IL-10。
在本发明的靶向递送体系的优选实施方案中，用于将巨噬细胞分化为M1巨噬细胞的M1诱导物选自：脂多糖(LPS)、干扰素γ(IFN-γ)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)以及病毒感染和细菌感染，用于将巨噬细胞分化为M2巨噬细胞的M2诱导物选自：IL-4、IL-10、IL-13、抗原和抗体的免疫复合物、IgG、热活化的γ球蛋白、糖皮质激素、肿瘤生长因子-β(TGF-β)、IL-1R、CC-趋化因子配体2(CCL-2)、IL-6、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、过氧化物酶体增殖物活化受体γ(PPARγ)激动剂、白细胞抑制因子(LIF)、腺苷、蠕虫和真菌感染。
本发明人出人意料地发现，负载M1巨噬细胞和M2巨噬细胞的复合物均适用于将活性剂靶向递送至缺氧组织，优选肿瘤或其转移瘤。一般而言，观察到3％至5％施用的M1巨噬细胞位于肿瘤部位，而约35％的M2巨噬细胞显示肿瘤特异性靶向。然而，当使用包含血红蛋白和药物的复合物时，M2巨噬细胞的这种一般优势被抵消，因为相当大的量的该复合物可以被负载到M1巨噬细胞中而非M2巨噬细胞中。通常这种特异性向性使得M2巨噬细胞更适合于治疗肿瘤和以缺氧组织为特征的疾病。
在本发明的靶向递送体系的优选实施方案中，单核细胞：
(i)能够由CD34+造血前体细胞产生；
(ii)能够通过单核细胞与至少一种诱导物、优选M1或M2诱导物、更优选至少一种M2诱导物的体外培养产生；
(iii)特征在于以下抗原中的至少一种的表达：TfR、CD163、TIM-2、CD14、CD16、CD33和/或CD115；
(iv)特征在于以下抗原中的至少一种的表达：TfR、CD163、TIM-2、CXCR4、CD14和/或CD16；和/或
(v)具有吞噬能力。
在本发明的靶向递送体系的该实施方案中，用于分化单核细胞的M1诱导物选自LPS、IFN-γ、GM-CSF或病毒感染或细菌感染，或用于分化单核细胞的M2诱导物选自IL-4、IL-10、IL-13、抗原和抗体的免疫复合物、IgG、热活化的γ球蛋白、糖皮质激素、TGF-β、IL-1R、CCL-2、IL-6、M-CSF、PPARγ激动剂、白细胞抑制因子(LIF)、癌症条件培养基、癌细胞、腺苷和蠕虫或真菌感染。
本发明人出人意料地发现，单核细胞适用于将活性剂靶向递送至缺氧组织中，优选肿瘤或其转移瘤中，而用M2活化剂处理的单核细胞更适合于将活性剂靶向递送至缺氧组织中，优选肿瘤或其转移瘤中。这种特异性向性使得用M2活化剂处理的单核细胞更适合于治疗肿瘤和缺氧部位。
在本发明的靶向递送体系的优选实施方案中，淋巴细胞：
(i)能够从血液、脾脏或骨髓中获得，或能够由CD34+前体细胞产生，如技术人员已知的并且在例如Lefort和Kim，2010，J Vis Exp 40：2017；Tassone和Fidler，2012，Methodsin Molecular Biology 882：351-357；Kouro等人，2005，Current Protocols inImmunology，66：F22F.1：22F.1.1-22F.1.9中描述的；
(ii)是免疫活性淋巴细胞；
(iii)表达抗原特异性T细胞受体；和/或
(iv)特征在于以下抗原中的至少一种的表达：(a)CD3和CD4或CD8，或(b)：CD19、CD20、CD21、CD19 CD20、CD19 CD21、CD20 CD21、或CD19 CD20 CD21抗原，并优选地能够产生免疫球蛋白。
在本发明的靶向递送体系的优选实施方案中，粒细胞：
(i)能够由血液、脾脏或骨髓获得，或能够由CD34+前体细胞产生，如在例如Kuhs等人，2015，Curr Protoc Immunol 111：7.23-1-7.23.16；Coquery等人，2012，Cytometry A81(9)：806-814；Swemydas和Lionakis 2013，J Vis Exp 77：50586中描述的；
(ii)特征在于以下CD66b和/或CD193中的至少一种的表达；
(iii)是分叶核白细胞，其特征在于其细胞质中存在颗粒；和/或
(iii)特征在于以下物质中的至少一种的表达：TfR、CD163、TIM-2和/或CXCR4。
在本发明的靶向递送体系的优选实施方案中，铁结合蛋白选自铁蛋白，优选重(H)型铁蛋白、轻(L)铁蛋白和/或线粒体铁蛋白；血红蛋白，优选血红蛋白A、血红蛋白AS、血红蛋白SC、血红蛋白C、血红蛋白D、血红蛋白E、血红蛋白F、血红蛋白H；血红蛋白-触珠蛋白复合物、血色素结合蛋白、转铁蛋白；和乳铁蛋白。术语铁蛋白；血红蛋白，优选血红蛋白A、血红蛋白AS、血红蛋白SC、血红蛋白C、血红蛋白D、血红蛋白E、血红蛋白F、血红蛋白H；血红蛋白-触珠蛋白复合物、血色素结合蛋白、转铁蛋白；和乳铁蛋白包括天然存在的蛋白质的结构变体，因此涉及具有相应野生型蛋白质结合铁离子的能力的至少70％、优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少100％的蛋白质。用于本发明情况下的铁结合蛋白优选为来源于哺乳动物，更优选来源于小鼠、来源于大鼠、来源于狗、来源于猿，特别是来源于黑猩猩或人，最优选来源于人。下图1中显示了在本发明的情况下使用的优选铁结合蛋白的共有序列。优选的结构变体基于图1中所示的序列。用X标记的残基在不同的哺乳动物铁蛋白、转铁蛋白和血红蛋白中变化。这些残基的改变对于蛋白质结合铁离子的能力不是至关重要的。因此，优选氨基酸突变或缺失影响用X标记的残基中的一个或更多个。
血浆蛋白一直是癌症治疗中活性药物成分递送的专用载体。因此，作为最充裕的血浆蛋白，白蛋白目前用于紫杉烷分子和阿霉素衍生物递送的治疗方案中(Larsen MT等人，2016，Mol Cell Ther 27；4：3)。
人转铁蛋白和铁蛋白已经被认为是递送小分子或毒素-结合物至特异性靶向癌细胞的有效载体。迄今为止，尽管付出了相当大的努力，然而还没有转铁蛋白或铁蛋白药物复合物成功地用于临床(Luck AN等人，2013，Adv Drug Deliv Rev 65(8)：1012-9)。
铁蛋白具有笼结构和结合铁的能力，其可以用于将药物包封在其腔内。铁蛋白在血浆中不是充裕的，但是其可以作为常见的蛋白质表达载体如大肠杆菌(Escherichiacoli)细胞中的重组蛋白以高产率容易地产生。铁蛋白H链或L链编码为小分子蛋白质(H链和L链分别为21kDa和19kDa)，能够将24聚体组装为笼状结构，限定直径为8nm的腔。本发明人注意到在进行本发明的情况下，H-铁蛋白均聚物代表优选的蛋白质构建体，以特异性地递送包封的药物至表达TfR的CD45+白细胞。此外，H-铁蛋白将复合物活性成分靶向至细胞核(从而直接递送DNA结合蛋白到细胞核中)。
纯化的转铁蛋白可以通过在细胞内适当释放的共价连接子有效地与一些抗癌药物结合(Beyer U等人，1998，J Med Chem 41(15)：2701-2708)。在转铁蛋白的情况下，只有蛋白质表面上的赖氨酸基团可以用于共价连接。
由于血红蛋白与药物化学结合的多功能性、在血液中的丰富性和相对稳定性，其在过去被认为是可能的药物载体(Somatogen，1993，WO1993008842 A1)。但是，受体靶向性质的缺乏没有促进除血液替代物或抗镰状化剂外的生物医学应用。事实上，Hb只可以被白细胞上的CD163(触珠蛋白/血红蛋白受体)表位识别、特别是被来源于单核细胞-巨噬细胞上的CD163表位识别。本申请中描述的基于CD45+白细胞的蛋白递送、特别是基于巨噬细胞的蛋白递送使血红蛋白中心部分作为靶向特异性药物载体而移动。血红蛋白可以容易地共价连接至合适的药物结合物，在血红素结合袋中容纳疏水性药物分子，或甚至运输连接至血红素铁的细胞毒素小分子。通过将适当的药物结合物选择性连接至β93半胱氨酸残基可以容易地修饰Hb，所述β93半胱氨酸残基是蛋白质表面上唯一可滴定的半胱氨酸。马来酰亚胺官能化的药物，例如微管蛋白抑制剂单甲基奥瑞他汀(MonomethylAuristatin，MMAE)或DNA交联药物吡咯并苯并二氮杂卓二聚体(PBD)是极其有效的细胞毒素的最显著的实例，其可以容易且特异性地附着于相关的半胱氨酸β93残基。
或者，Hb表面上的赖氨酸残基(每个Hb四聚体至少10个可滴定的赖氨酸残基)可以容易地通过可裂解的琥珀酰亚胺连接子进行药物结合。血红蛋白还提供了在酸性pH值下释放非共价结合的血红素基团的独特能力。如在紫杉醇的情况下所示，由此获得的Apo-血红蛋白能够在空的血红素袋内容纳几种疏水性分子(Meng Z等人，2015 J Pharm Sci 104(3)：1045-55)。
不管是轭合/吸附/结合方法，一旦将血红蛋白(Hb)、转铁蛋白(Tf)和铁蛋白负载到具有肿瘤靶向性质的合适细胞体系中，例如活化的巨噬细胞中，则本发明显示它们是专用的药物载体。这些蛋白质的简单、快速、便宜和安全的纯化步骤还提供了巨大的附加值。
基于哺乳动物H型铁蛋白、L型铁蛋白、血红蛋白α链、血红蛋白β链和转铁蛋白的序列，对这些蛋白质中的每一种确定共有序列。这些显示在图1中(分别为SEQ ID NO：2、SEQID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：25)。在此基础上，以及在现有技术中公开的缺失和结构分析的基础上，确定H型铁蛋白、L型铁蛋白、血红蛋白α链和血红蛋白β链足以被CD45+白细胞摄取的最小片段。这些示于SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5中(H型铁蛋白)；SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12(L型铁蛋白)，SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：17(血红蛋白α链)和SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：21(血红蛋白β链)。如果包含在一个多肽中且位于间隔的100至450个氨基酸之间、优选间隔的150至400个氨基酸之间、更优选间隔的200至350个氨基酸之间、更优选间隔的250至320个氨基酸之间，则转铁蛋白包含位于N端的结构域和位于C端的结构域，其对于结合铁和被CD45+白细胞摄取是必需的。N端结构域包含全长共有转铁蛋白(SEQ ID NO：25)或全长人转铁蛋白(SEQ ID NO：28)的氨基酸1至82。C端结构域包含全长共有转铁蛋白(SEQ ID NO：25)或全长人转铁蛋白(SEQ ID NO：28)的氨基酸396至510。在每种情况下，在共有序列中显示的X，其独立地代表任何氨基酸，并且表征在哺乳动物H型铁蛋白中不保留或仅不良地保留的氨基酸，其可以在没有或几乎不损害相应铁结合蛋白的铁结合性质的情况下突变。优选X在每种情况下都具有与X比对的相应人铁结合蛋白的氨基酸的含义。该信息可以例如由图1获得，其显示人蛋白的共有序列比对，以及在一些情况下小鼠蛋白的共有序列比对。
优选的H型铁蛋白包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列及其变体或由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列及其变体构成，所述变体具有至少70％的氨基酸一致性，更优选至少75％的氨基酸一致性，更优选至少80％的氨基酸一致性，更优选至少85％的氨基酸一致性，更优选至少90％的氨基酸一致性，更优选至少95％的氨基酸一致性，并且在每种情况下，所述变体具有由根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列构成的H型铁蛋白被CD45+白细胞优选M2巨噬细胞摄取的能力的至少70％。在SEQ ID NO：1中，在第5号位处的X可以存在或不存在，如果存在的话，其表示任何氨基酸，优选Ile，在第6号位处的X表示任何氨基酸，优选Asn，在第14号位处的X表示任何氨基酸，优选Tyr，在第24号位处的X表示任何氨基酸，优选Tyr或Cys，在第66号位处的X表示任何氨基酸，优选Phe，在第68号位处的X表示任何氨基酸，优选Gln，在第75号位处的X表示任何氨基酸，优选Arg或Cys，在第90号位处的X表示任何氨基酸，优选His，在第94号位处的X表示任何氨基酸，优选Ser或Asn，在第120号位处的X可以存在或不存在，如果存在的话，其表示任何氨基酸，优选His或Tyr，更优选His，在第123号位处的X表示任何氨基酸，优选Asn或Ser，更优选Asn，在第128号位处的X表示任何氨基酸，优选Ala或Ser，更优选Ala。
在优选的实施方案中，H型铁蛋白包含根据SEQ ID NO：3的鼠科动物铁蛋白或由其构成。因此，优选的结构变体具有至少70％的氨基酸一致性，更优选至少75％的氨基酸一致性，更优选至少80％的氨基酸一致性，更优选至少85％的氨基酸一致性，更优选至少90％的氨基酸一致性，更优选至少95％的氨基酸一致性，并且在每种情况下，其具有由根据SEQ IDNO：3的氨基酸序列构成的H型铁蛋白被CD45+白细胞优选M2巨噬细胞摄取的能力的至少70％。
在优选的实施方案中，H型铁蛋白包含根据SEQ ID NO：5的人铁蛋白或由其构成。因此，优选的结构变体具有至少70％的氨基酸一致性，更优选至少75％的氨基酸一致性，更优选至少80％的氨基酸一致性，更优选至少85％的氨基酸一致性，更优选至少90％的氨基酸一致性，更优选至少95％的氨基酸一致性，并且在每种情况下，其具有由根据SEQ ID NO：5的氨基酸序列构成的H型铁蛋白被CD45+白细胞优选M2巨噬细胞摄取的能力的至少70％。
在优选的实施方案中，H型铁蛋白包含由比对根据SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：7、优选SEQ ID NO：2的全长H型铁蛋白得到的哺乳动物共有序列或由其构成。因此，优选的结构变体具有至少70％的氨基酸一致性，更优选至少75％的氨基酸一致性，更优选至少80％的氨基酸一致性，更优选至少85％的氨基酸一致性，更优选至少90％的氨基酸一致性，更优选至少95％的氨基酸一致性，并且在每种情况下，其具有由根据SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：7、优选SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的H型铁蛋白被CD45+白细胞优选M2巨噬细胞摄取的能力的至少70％。在SEQ ID NO：2中，在第6号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Pro，在第14号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选His，在第16号位的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Asp，在第21号位处的X可以存在或不存在，如果存在的话，其表示任何氨基酸，优选Ile，在第22号位处的X表示任何氨基酸，优选Asn，在第30号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Tyr，在第40号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Tyr或Cys，更优选Tyr，在第82号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Phe，在第84号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Gln，在第91号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Arg或Cys，更优选Cys，在第106号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选His，在第110号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Asn或Ser，更优选Asn，在第137号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选His或Tyr，更优选His，在第140号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Asn或Ser，更优选Asn，在第145号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Ala或Ser，更优选Ala，在第164号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Ala或Ser，更优选Ser，在第166号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Met或Leu，优选Leu，在第178号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Asp或His，更优选Asp，在第181号位处的X不存在或是任何天然存在的氨基酸，优选Asn，在第182号位处的X不存在或是任何天然存在的氨基酸，优选Glu，在第183号位处的X不存在或是任何天然存在的氨基酸，优选Ser。在SEQ ID NO：7中，在第6号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Pro，在第14号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选His，在第16号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Asp，在第21号位处的X可以存在或不存在，如果存在的话，其表示任何氨基酸，优选Ile，在第29号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Tyr，在第81号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Phe，在第83号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Gln，在第105号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选His，在第144号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Ala或Ser，更优选Ala，在第180号位处的X不存在或是任何天然存在的氨基酸，优选Asn，在第181号位处的X不存在或是任何天然存在的氨基酸，优选Glu，在第182号位处的X不存在或是任何天然存在的氨基酸，优选Ser。
在优选的实施方案中，H型铁蛋白包含根据优选的SEQ ID NO：4的鼠科动物全长铁蛋白或由其构成。因此，优选的结构变体具有至少70％的氨基酸一致性，更优选至少75％的氨基酸一致性，更优选至少80％的氨基酸一致性，更优选至少85％的氨基酸一致性，更优选至少90％的氨基酸一致性，更优选至少95％的氨基酸一致性，并且在每种情况下，其具有由根据SEQ ID NO：4的氨基酸序列构成的鼠科动物H型铁蛋白被CD45+白细胞优选M2巨噬细胞摄取的能力的至少70％。
在优选的实施方案中，H型铁蛋白包含根据优选的SEQ ID NO：6的人全长铁蛋白或由其构成。因此，优选的结构变体具有至少70％的氨基酸一致性，更优选至少75％的氨基酸一致性，更优选至少80％的氨基酸一致性，更优选至少85％的氨基酸一致性，更优选至少90％的氨基酸一致性，更优选至少95％的氨基酸一致性，并且在每种情况下，其具有由根据SEQ ID NO：6的氨基酸序列构成的人H型铁蛋白被CD45+白细胞优选M2巨噬细胞摄取的能力的至少70％。
优选的L型铁蛋白包含SEQ ID NO：8中显示的氨基酸序列及其变体或由SEQ IDNO：8中显示的氨基酸序列及其变体构成，所述变体具有至少70％的氨基酸一致性，更优选至少75％的氨基酸一致性，更优选至少80％的氨基酸一致性，更优选至少85％的氨基酸一致性，更优选至少90％的氨基酸一致性，更优选至少95％的氨基酸一致性，并且在每种情况下，其具有由根据SEQ ID NO：8的氨基酸序列构成的L型铁蛋白被CD45+白细胞优选M2巨噬细胞摄取的能力的至少70％。在SEQ ID NO：8中，在第5号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Asp或Glu，更优选Asp，在第12号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Arg或Ser，更优选Ser，在第17号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Ser或Arg，更优选Ser，在第19号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Arg或Gln，更优选Gln，在第29号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Phe，在第30号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Tyr或Phe，更优选Tyr，在第42号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Ser或Gly，更优选Ser，在第56号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Ala或Tyr，更优选Tyr，在第61号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Glu或Lys，更优选Lys，在第62号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Met或Phe，更优选Met，在第65号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Asp或Gln，更优选Gln，在第75号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Ile或Val，更优选Ile，在第76号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Lys或Gln，更优选Lys，在第79号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Ala或Ser，更优选Ala，在第80号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Glu或Gln，更优选Gln，在第87号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Pro或Gln，更优选Pro，在第88号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Glu或Asp，更优选Asp，在第91号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Glu或Lys，更优选Lys，在第94号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Met或Leu，更优选Leu，在第96号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Met或Leu，更优选Met，在第99号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Lys或Asn，更优选Lys，在第115号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Thr或Ala，更优选Thr，在第119号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Leu，在第125号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Ser或Thr，更优选Thr，在第127号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Tyr或Phe，更优选Phe，在第130号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Lys或Glu，更优选Glu，在第140号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Asp或Asn，更优选Asp，在第146号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Arg或His，更优选His，在第148号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Leu或Val，更优选Leu。
在优选的实施方案中，L型铁蛋白包含根据SEQ ID NO：10的鼠科动物L型铁蛋白或由其构成。因此，优选的结构变体具有至少70％的氨基酸一致性，更优选至少75％的氨基酸一致性，更优选至少80％的氨基酸一致性，更优选至少85％的氨基酸一致性，更优选至少90％的氨基酸一致性，更优选至少95％的氨基酸一致性，并且在每种情况下，其具有由根据SEQ ID NO：10的氨基酸序列构成的L型铁蛋白被CD45+白细胞优选M2巨噬细胞摄取的能力的至少70％。
在优选的实施方案中，L型铁蛋白包含根据SEQ ID NO：12的人铁蛋白或由其构成。因此，优选的结构变体具有至少70％的氨基酸一致性，更优选至少75％的氨基酸一致性，更优选至少80％的氨基酸一致性，更优选至少85％的氨基酸一致性，更优选至少90％的氨基酸一致性，更优选至少95％的氨基酸一致性，并且在每种情况下，具有由根据SEQ ID NO：12的氨基酸序列构成的L型铁蛋白被CD45+白细胞优选M2巨噬细胞摄取的能力的至少70％。
在优选的实施方案中，L型铁蛋白包含由比对根据SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：14、优选SEQ ID NO：9的全长H型铁蛋白得到的哺乳动物共有序列或由其构成。因此，优选的结构变体具有至少70％的氨基酸一致性，更优选至少75％的氨基酸一致性，更优选至少80％的氨基酸一致性，更优选至少85％的氨基酸一致性，更优选至少90％的氨基酸一致性，更优选至少95％的氨基酸一致性，并且在每种情况下，其具有由根据SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：14、优选SEQ ID NO：9的氨基酸序列构成的L型铁蛋白被CD45+白细胞优选被M2巨噬细胞摄取的能力的至少70％。在SEQ ID NO：9中，在第12号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Asp或Glu，更优选Asp，在第19号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Ser或Arg，更优选Ser，在第24号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Ser或Arg，更优选Ser，在第26号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Arg或Gln，更优选Gln，在第36号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Phe，在第37号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Tyr或Phe，更优选Tyr，在第47号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Ser或Gly，更优选Ser，在第63号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Ala或Tyr，更优选Tyr，在第68号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Glu或Lys，更优选Lys，在第69号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Met或Phe，更优选Met，在第72号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Asp或Gln，更优选Gln，在第82号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Ile或Val，更优选Ile，在第83号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Lys或Gln，更优选Lys，在第86号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Ala或Ser，更优选Ala，在第87号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Glu或Gln，更优选Gln，在第94号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Pro或Gln，更优选Pro，在第95号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Glu或Asp，更优选Asp，在第98号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Glu或Lys，更优选Lys，在第101号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Met或Leu，更优选Leu，在第103号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Met或Leu，更优选Met，在第106号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Lys或Asn，更优选Lys，X可以是任何天然存在的氨基酸，在第126号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Leu，在第132号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Ser或Thr，更优选Thr，在第134号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Tyr或Phe，更优选Phe，在第137号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Lys或Glu，更优选Glu，在第147号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Asp或Asn，更优选Asp，在第153号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Arg或His，更优选His，在第155号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Leu或Val，更优选Leu，在第161号位处的X可以不存在或是任何天然存在的氨基酸，优选Ala，在第163号位处的X可以不存在或是任何天然存在的氨基酸，优选Thr，在第166号位处的X可以不存在或是任何天然存在的氨基酸，优选Pro，在第168号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Gly或Ala，更优选Ala。在SEQ ID NO：14中，在第36号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Phe，在第37号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Tyr或Phe，更优选Tyr，在第94号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Pro或Gln，更优选Pro，在第126号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Leu，在第137号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Lys或Glu，更优选Glu，在第147号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Asp或Asn，更优选Asp，X可以是任何天然存在的氨基酸，在第163处的X可以不存在或是任何天然存在的氨基酸，优选Thr，在第166号位处的X可以不存在或是任何天然存在的氨基酸，优选Pro，在第168号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Gly或Ala，更优选Ala。
在优选的实施方案中，L型铁蛋白包含根据优选的SEQ ID NO：11的鼠科动物全长铁蛋白或由其构成。因此，优选的结构变体具有至少70％的氨基酸一致性，更优选至少75％的氨基酸一致性，更优选至少80％的氨基酸一致性，更优选至少85％的氨基酸一致性，更优选至少90％的氨基酸一致性，更优选至少95％的氨基酸一致性，并且在每种情况下，其具有由根据SEQ ID NO：11的氨基酸序列构成的鼠科动物L型铁蛋白被CD45+白细胞优选M2巨噬细胞摄取的能力的至少70％。
在优选的实施方案中，L型铁蛋白包含根据优选的SEQ ID NO：13的人全长铁蛋白或由其构成。因此，优选的结构变体具有至少70％的氨基酸一致性，更优选至少75％的氨基酸一致性，更优选至少80％的氨基酸一致性，更优选至少85％的氨基酸一致性，更优选至少90％的氨基酸一致性，更优选至少95％的氨基酸一致性，并且在每种情况下，其具有由根据SEQ ID NO：13的氨基酸序列构成的人L型铁蛋白被CD45+白细胞优选M2巨噬细胞摄取的能力的至少70％。
在优选的实施方案中，α血红蛋白包含由比对根据SEQ ID NO：15的全长α血红蛋白获得的最小哺乳动物共有序列或由其构成。其优选包含由SEQ ID NO：15中所示的氨基酸序列及其变体或由其构成，所述变体具有至少70％的氨基酸一致性，更优选至少75％的氨基酸一致性，更优选至少80％的氨基酸一致性，更优选至少85％的氨基酸一致性，更优选至少90％的氨基酸一致性，更优选至少95％的氨基酸一致性，并且在每种情况下，其具有由根据SEQ ID NO：15的氨基酸序列构成的α血红蛋白被CD45+白细胞优选M1巨噬细胞摄取的能力的至少70％。
在优选的实施方案中，α血红蛋白包含由根据SEQ ID NO：17的人α血红蛋白获得的最小人氨基酸序列或由其构成。因此，优选的结构变体具有至少70％的氨基酸一致性，更优选至少75％的氨基酸一致性，更优选至少80％的氨基酸一致性，更优选至少85％的氨基酸一致性，更优选至少90％的氨基酸一致性，更优选至少95％的氨基酸一致性，并且在每种情况下，其具有由根据SEQ ID NO：17的氨基酸序列构成的α血红蛋白被CD45+白细胞优选M1巨噬细胞摄取的能力的至少70％。
在优选的实施方案中，α血红蛋白包含由比对根据SEQ ID NO：16的全长α血红蛋白获得的哺乳动物共有序列或由其构成。因此，优选的结构变体具有至少70％的氨基酸一致性，更优选至少75％的氨基酸一致性，更优选至少80％的氨基酸一致性，更优选至少85％的氨基酸一致性，更优选至少90％的氨基酸一致性，更优选至少95％的氨基酸一致性，并且在每种情况下，具有由根据SEQ ID NO：16的氨基酸序列构成的α血红蛋白被CD45+白细胞优选M2巨噬细胞摄取的能力的至少70％。
在优选的实施方案中，α血红蛋白包含根据SEQ ID NO：18的人全长α血红蛋白或由其构成。因此，优选的结构变体具有至少70％的氨基酸一致性，更优选至少75％的氨基酸一致性，更优选至少80％的氨基酸一致性，更优选至少85％的氨基酸一致性，更优选至少90％的氨基酸一致性，更优选至少95％的氨基酸一致性，并且在每种情况下，其具有由根据SEQID NO：18的氨基酸序列构成的人全长α血红蛋白被CD45+白细胞优选M2巨噬细胞摄取的能力的至少70％。
在优选的实施方案中，α血红蛋白包含由比对根据SEQ ID NO：19的全长β血红蛋白获得的最小哺乳动物共有序列及其变体或由其构成，所述变体具有至少70％的氨基酸一致性，更优选至少75％的氨基酸一致性，更优选至少80％的氨基酸一致性，更优选至少85％的氨基酸一致性，更优选至少90％的氨基酸一致性，更优选至少95％的氨基酸一致性，并且在每种情况下，其具有由根据SEQ ID NO：19的氨基酸序列构成的β血红蛋白被CD45+白细胞优选M1巨噬细胞摄取的能力的至少70％。
在优选的实施方案中，α血红蛋白包含由根据SEQ ID NO：21的人β血红蛋白获得的最小人氨基酸序列或由其构成。因此，优选的结构变体具有至少70％的氨基酸一致性，更优选至少75％的氨基酸一致性，更优选至少80％的氨基酸一致性，更优选至少85％的氨基酸一致性，更优选至少90％的氨基酸一致性，更优选至少95％的氨基酸一致性，并且在每种情况下，其具有由根据SEQ ID NO：21的氨基酸序列构成的β血红蛋白被CD45+白细胞优选M1巨噬细胞摄取的能力的至少70％。
在优选的实施方案中，β血红蛋白包含由比对根据SEQ ID NO：20的全长β血红蛋白获得的哺乳动物共有序列或由其构成。因此，优选的结构变体具有至少70％的氨基酸一致性，更优选至少75％的氨基酸一致性，更优选至少80％的氨基酸一致性，更优选至少85％的氨基酸一致性，更优选至少90％的氨基酸一致性，更优选至少95％的氨基酸一致性，并且在每种情况下，其具有由根据SEQ ID NO：20的氨基酸序列构成的β血红蛋白被CD45+白细胞优选M2巨噬细胞摄取的能力的至少70％。
在优选的实施方案中，β血红蛋白包含根据SEQ ID NO：22的人全长β血红蛋白或由其构成。因此，优选的结构变体具有至少70％的氨基酸一致性，更优选至少75％的氨基酸一致性，更优选至少80％的氨基酸一致性，更优选至少85％的氨基酸一致性，更优选至少90％的氨基酸一致性，更优选至少95％的氨基酸一致性，并且在每种情况下，其具有由根据SEQID NO：22的氨基酸序列构成的人全长β血红蛋白被CD45+白细胞优选M2巨噬细胞摄取的能力的至少70％。
在优选的实施方案中，转铁蛋白包含由比对根据SEQ ID NO：25的全长α血红蛋白获得的哺乳动物共有序列或由其构成。因此，特别地，优选的转铁蛋白包含SEQ ID NO：25中显示的氨基酸序列及其变体或由SEQ ID NO：25中显示的氨基酸序列及其变体构成，所述变体具有至少70％的氨基酸一致性，更优选至少75％的氨基酸一致性，更优选至少80％的氨基酸一致性，更优选至少85％的氨基酸一致性，更优选至少90％的氨基酸一致性，更优选至少95％的氨基酸一致性，并且在每种情况下，其具有由根据SEQ ID NO：25的氨基酸序列构成的转铁蛋白被CD45+白细胞优选M1巨噬细胞摄取的能力的至少70％。
在优选的实施方案中，转铁蛋白包含根据SEQ ID NO：28的人转铁蛋白或由其构成。因此，优选的结构变体具有至少70％的氨基酸一致性，更优选至少75％的氨基酸一致性，更优选至少80％的氨基酸一致性，更优选至少85％的氨基酸一致性，更优选至少90％的氨基酸一致性，更优选至少95％的氨基酸一致性，并且在每种情况下，其具有由根据SEQ IDNO：28的氨基酸序列构成的转铁蛋白被CD45+白细胞优选M1巨噬细胞摄取的能力的至少70％。
转铁蛋白的铁结合性质取决于位于N端和C端的结构域。因此，在优选的实施方案中，本发明中使用的转铁蛋白包含至少根据SEQ ID NO：23的N端结构域和根据SEQ ID NO：24的C端结构域。优选的转铁蛋白包括包含SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24中所示的氨基酸序列及其变体的蛋白质，所述变体具有至少70％的氨基酸一致性，更优选至少75％的氨基酸一致性，更优选至少80％的氨基酸一致性，更优选至少85％的氨基酸一致性，更优选至少90％的氨基酸一致性，更优选至少95％的氨基酸一致性，并且在每种情况下，其具有由根据SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24的氨基酸序列构成的转铁蛋白被CD45+白细胞优选M1巨噬细胞摄取的能力的至少70％。SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：24表示哺乳动物转铁蛋白的共有序列。
因此，在优选的实施方案中，本发明中使用的转铁蛋白包含至少根据SEQ ID NO：26的N端结构域和根据SEQ ID NO：27的C端结构域。优选的转铁蛋白包括包含SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27中所示的氨基酸序列及其变体的蛋白质，所述变体具有至少70％的氨基酸一致性，更优选至少75％的氨基酸一致性，更优选至少80％的氨基酸一致性，更优选至少85％的氨基酸一致性，更优选至少90％的氨基酸一致性，更优选至少95％的氨基酸一致性，并且在每种情况下，其具有分别由根据SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27的氨基酸序列构成的转铁蛋白被CD45+白细胞优选M1巨噬细胞摄取的能力的至少70％。
无论给定的氨基酸序列如何，优选的铁蛋白还包括符合四螺旋束蛋白模块的24聚体亚单元组装体的蛋白质，其落入通过基于3D结构的比对所限定的远亲蛋白的给定序列比对中。
本发明人出人意料地观察到，淋巴细胞和M2巨噬细胞在摄取包含一种或更多种铁蛋白和一种或更多种活性成分的复合物方面更好，M1巨噬细胞在摄取包含一种或更多种血红蛋白和一种或更多种活性成分的复合物方面更好，巨噬细胞在摄取包含一种或更多种转铁蛋白和一种或更多种活性成分的复合物方面更好。因此，基于CD45+白细胞：单核细胞、M1和M2巨噬细胞、粒细胞和淋巴细胞的组织和细胞向性，如果M2巨噬细胞、淋巴细胞或单核细胞的向性是期望的，则上述包含一种或更多种铁蛋白和一种或更多种活性成分的复合物被用于负载于M2巨噬细胞、淋巴细胞或单核细胞，如果M1巨噬细胞的向性是期望的，则包含一种或更多种血红蛋白和一种或更多种活性成分的复合物被用于负载于M1巨噬细胞。
在本发明的靶向递送体系的优选实施方案中，活性成分选自蛋白质、核酸、分子量小于1.5kD、更优选小于1kD的非蛋白质非核酸化合物，优选抗癌药物，特别是抑制细胞生长的药物、细胞毒性药物及其前药；抗动脉硬化药物；和消炎药物；和光敏化合物；病毒，特别是溶瘤病毒；发射α或β射线的放射性同位素，其还发射损害细胞的量的γ射线，优选地选自镥-177、镱-90、碘-131、钐-153、磷-32、铯-131、钯-103、镭-233、碘-125和硼-10，或损害细胞的量的α射线，优选地选自锕-225、铋-213、铅-212和钋-212。
优选的抗癌药物选自细胞凋亡/自吞噬或坏死诱导药物。细胞凋亡/自吞噬或坏死诱导药物可以是即使在具有细胞增殖异常的细胞中也能够有效诱导细胞凋亡/自我噬或坏死的任何药物。这些药物优选地以与一种或更多种铁蛋白的复合物的形式使用。
优选的抗癌药物选自细胞凋亡诱导药物、烷基化物质、抗代谢物、抗生素、埃博霉素、核受体激动剂和拮抗剂、抗雄激素、抗雌激素、铂化合物、激素、抗激素、干扰素、细胞周期依赖性蛋白激酶(CDK)的抑制剂、环氧合酶和/或脂氧合酶的抑制剂、生物来源的脂肪酸、生物来源的脂肪酸衍生物，包括前列腺素和白三烯、蛋白激酶的抑制剂、蛋白磷酸酶的抑制剂、脂质激酶的抑制剂、铂配位络合物、乙撑亚胺、甲基三聚氰胺、三嗪、长春花生物碱、嘧啶类似物、嘌呤类似物、烷基磺酸盐、叶酸类似物、蒽二酮、经取代的尿素、和甲基肼衍生物、烯二炔抗生素、微管蛋白聚合抑制剂，例如maytansinoid或奥瑞他汀衍生物、免疫检查点抑制剂、肿瘤特异性蛋白质或标志物的抑制剂，优选Rho-GDP-分解抑制剂，更优选Grp94。
其他优选的抗癌药物选自醋地砜、阿柔比星、安巴腙、氨鲁米特、L-天冬酰胺酶、硫唑嘌呤、banoxantrone、苯达莫司汀、博来霉素、白消安、亚叶酸钙、卡铂、卡培他滨、卡莫司汀、塞来昔布、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、放线菌素D氨苯砜、柔红霉素、双溴丙脒、己烯雌酚、多西他赛、阿霉素、烯二炔类、表柔比星、埃博霉素B、埃博霉素D、estramucin磷酸盐、雌激素、炔雌醇、依托泊苷、夫拉平度、氟尿苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、氟甲睾酮、氟他胺磷雌酚、呋喃唑酮、吉西他滨、促性腺激素释放激素类似物、六甲三聚氰胺、羟基尿素、羟甲基呋喃妥英、己酸羟孕酮、羟基脲、伊达比星、碘苷、异环磷酰胺、干扰素α、伊立替康、亮丙瑞林、洛莫司汀、勒托替康、硫酸磺胺米隆olamide、甲二氯二乙胺、醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、美法仑、米帕林、巯嘌呤、甲氨蝶呤、甲硝哒唑、丝裂霉素C、米托肼、米托坦、米托蒽醌、光神霉素、萘啶酸、硝呋太尔、硝呋酚酰肼、呋喃拉嗪、硝呋替莫、尼莫司汀、ninorazole、呋喃妥因、氮芥、oleomucin、喹酸、喷他脒、喷司他丁、非那吡啶、酞磺胺噻唑、哌泊溴烷、泼尼莫司汀、强的松、preussin、丙卡巴肼、乙胺嘧啶、雷替曲塞、雷帕霉素、罗非考昔、罗格列酮、柳氮磺吡啶、吖啶黄、司莫司汀链脲佐菌素、磺胺脲、磺胺醋酰、磺胺氯哒嗪、磺胺嘧啶、磺胺戊烯、磺胺地索辛、磺胺乙二唑、磺胺异唑、磺胺胍、磺胺胍诺、磺胺甲二唑、磺胺甲唑、复方新诺明、磺胺甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺二甲唑、对氨基苯磺酰胺、磺胺培林、磺胺苯吡唑、磺胺噻唑、磺胺索嘧啶、星形孢菌素、他莫昔芬、紫杉酚、替尼泊苷、tertiposide、睾内脂、丙酸睾酮、硫鸟嘌呤、噻替派、替硝唑、拓扑替康、三亚胺醌、曲奥舒凡、甲氧苄啶、曲磷胺、UCN-01、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春花碱、长春瑞滨和佐柔比星，优选地选自奥瑞他汀、banoxantrone、苯达莫司汀、苯丁酸氮芥、chaliceamycin、环磷酰胺、dynemycin A、美登素、美法仑、mertansine和neocazinostatin，最优选banoxantrone、苯达莫司汀、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、吡咯并苯并二氮卓和美法仑。
特别优选的是，抗癌药物是增殖抑制蛋白或核酸或siRNA或DNA酶，所述增殖抑制蛋白优选是细胞周期抑制剂或抗体或拟抗体，所述抗体或拟抗体特异性结合调节细胞的疾病状态的目标组织中的细胞上或细胞内的靶标，所述靶标优选是增殖促进蛋白，所述核酸优选编码增殖抑制蛋白或抗体或拟抗体，所述抗体或拟抗体特异性结合调节细胞的疾病状态的目标组织中的细胞上或细胞内的靶标，所述靶标优选是增殖促进蛋白。
用于本发明情况下的抗体的优选实例是单链抗体、抗体片段、纳米抗体、轻链或重链、可变轻链或可变重链、或双抗体。优选的抗体片段包括片段抗原结合(Fab)片段、Fab′片段、F(ab′)2片段、重链抗体、单域抗体(sdAb)、单链可变片段(scFv)、可变片段(Fv)、VH结构域、VL结构域、单域抗体、纳米抗体、IgNAR(免疫球蛋白新抗原受体)、双scFv、双特异性T细胞衔接器(BITE)、双亲和性重靶向(DART)分子、三抗体、双抗体、单链双抗体、及其融合蛋白。
如果活性成分是核酸，优选其是miRNA、siRNA、DNA酶或编码药物活性蛋白的核酸，所述药物活性蛋白例如抗体、拟抗体、细胞因子、前药转化酶等。
如上文已概述的，本发明的靶向递送体系特别适用于递送活性成分至缺氧区域。使用在缺氧条件下被活化的活性成分进一步增加活性成分的靶向的特异性和/或进一步减少活性成分的副作用。因此，在特别优选的实施方案中，活性成分是缺氧活化的前药。所有缺氧活化的前药的主链存在五种不同化学部分(硝基、奎宁、芳香族和脂肪族N-氧化物和过渡金属)中的一种，其在组织中在缺氧条件下被酶促地还原。缺氧活化的前药相对于相应的药物是较少活性或没有活性的任何前药，并且包含药物和一种或更多种可生物还原的基团。这种缺氧活化的前药包括由各种还原剂和还原酶活化的所有前药，所述还原酶包括但不限于单电子转移酶(例如细胞色素P450还原酶)和两电子转移(或负氢离子转移(hydridetransferring))酶。根据本发明的优选实施方案，缺氧活化的前药是TH-302。合成TH-302的方法在PCT申请WO 07/002931和WO 08/083101中描述。这种前药的优选实例选自I类组：苯并三嗪N-氧化物、apaziquone(EO9)、替拉扎明(TPN)和SN30000；或选自II类组：硝基化合物PR-104A、TH-302、TH-4000和AQ4N。
在本发明的经分离的靶向递送体系的优选实施方案中，包含在复合物中的铁结合蛋白和活性成分之间的键是共价的和/或非共价的；和/或包含在复合物中的活性成分被铁结合蛋白包埋/包封，优选被铁蛋白或其多聚体包埋/包封。在一个实施方案中，共价和/或非共价的偶联通过连接子或间隔物间接进行。如果期望形成共价键，则使用铁结合蛋白的相关巯基、氨基或羧基将活性成分直接或间接地共价偶联至一种或更多种铁结合蛋白。还可以设想复合物中包含不同的活性成分。例如，一类活性成分可以与铁结合蛋白结合(非共价结合)，而另一类被包封。该方法利用活性物质从铁结合蛋白递送到靶标组织和/或细胞后的不同释放速率。例如，作为活性成分的药物衍生物可以通过利用相关巯基、氨基或羧基的反应性共价地连接到铁蛋白分子的24-聚体表面上或内腔中。这种有用的反应类型在本领域中是众所周知的，并且可以被本领域技术人员采用以具体化活性成分而无需任何另外的工作。这种反应的实例在Behrens CR，Liu B.Methods for site-specific drugconjugation to antibodies.MAbs.2014 Jan-Feb；6(1)：46-53中描述。
在其他方面，本发明涉及制备本发明的经分离的靶向递送体系的方法，其包括以下步骤：
a)提供如上文所定义的经纯化的铁结合蛋白；
b)将活性成分共价或非共价地连接至所述铁结合蛋白和/或在所述铁结合蛋白中包封活性成分；
c)提供如上文所定义的CD45+白细胞；和
d)在步骤b)中产生的铁结合蛋白和活性成分的复合物的存在下培养CD45+白细胞，直到CD45+白细胞至少部分地、优选满载在步骤b)中产生的铁结合蛋白和活性成分的复合物。
蛋白质和药物部分之间加合物的形成可以是与靶蛋白结合的非共价药物分子，并且可以如下文所描述：在铁蛋白的情况下，通过利用铁蛋白大分子自身的缔合和解离性质，药物通常可以被包封在内腔(物理封闭)中。药物分子通过与腔内表面中的氨基酸残基的非共价相互作用保持在适当位置。血红蛋白大分子还提供了所选择的药物分子的非共价结合的可能性，所选择的药物分子可以被容纳在血红蛋白本身的血红素结合袋中。血红素可以被袋转移，并被具有适当疏水性的药物代替。在另一方面，本发明中考虑的所有蛋白质可以共价地连接到被特异性活性连接子部分修饰的药物分子，所述特异性活性连接子部分对蛋白质自身的巯基或氨基具有反应性。同样地，铁蛋白或血红蛋白可以连接至带有基于肽的可裂解连接子(例如，组织蛋白酶敏感性缬氨酸-瓜氨酸序列和对氨基苄基氨基甲酸酯间隔物)的半胱氨酸巯基反应性药物。作为显著的实例，已经使用抗有丝分裂剂单甲基奥瑞他汀E(MMAE)。基于肽的连接子以稳定的方式将蛋白质与细胞毒性化合物结合，因此药物在生理条件下不容易从蛋白质中释放，有助于防止对健康细胞的毒性，确保剂量效率。由此产生的蛋白质药物加合物能够与所选择的受体类型连接，即分别为用于血红蛋白的CD163和用于铁蛋白或转铁蛋白的TfR。一旦结合，蛋白质药物加合物通过内吞作用被内化，从而被靶细胞选择性地摄取。含有药物的囊泡与溶酶体和溶酶体半胱氨酸蛋白酶融合，特别是组织蛋白酶B开始分解缬氨酸-瓜氨酸连接子，MMAE不再与抗体结合并直接释放到肿瘤环境中。
或者，DM1-SMCC是高效的mertansine衍生物，其具有特异性结合赖氨酸残基的连接子，所述赖氨酸残基在对于抗体已成功描述的反应中与铁蛋白、血红蛋白或转铁蛋白产生共价复合物。特别地，血红蛋白、铁蛋白或转铁蛋白可以与DM1-SMCC反应，从而提供共价的蛋白-药物加合物，其可以在细胞内被裂解并以取决于时间的方式释放活性药物。通过DM1抑制微管动力学诱导有丝分裂阻滞和细胞死亡。
在本发明的情况下使用的术语“满载”指与活性成分复合的铁结合蛋白、优选铁蛋白的最大量，所述活性成分可以被CD45+白细胞摄取，优选被巨噬细胞摄取，更优选被活化的巨噬细胞摄取。
在第三个方面，本发明涉及本发明的经分离的靶向递送体系，其用作药物。
在第四个方面，本发明涉及包含本发明的经分离的靶向递送体系和药学上可接受的载体和/或合适的赋形剂的药物组合物。因为经分离的靶向递送体系包含活细胞，因此优选选择保持细胞存活的载体和赋形剂。
“药学上可接受的”指被联邦或州政府的管理机构批准的或在美国药典中列举的或其他一般公认的用于动物、更特别用于人的药典中列举的。
如本文所使用的，术语“载体”指药理上没有活性的物质，例如但不限于稀释剂、赋形剂、表面活性剂、稳定剂、生理缓冲溶液或载剂，其与治疗活性成分一起施用。这种药物载体可以是液体或固体。液体载体包括但不限于无菌液体，例如水或油中的盐溶液，所述油包括但不限于石油来源、动物来源、植物来源或合成来源的那些，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。盐溶液和葡萄糖水溶液和甘油水溶液也可以被用作液体载体，特别是用于可注射溶液。当药物组合物通过静脉内施用时，盐溶液是优选的载体。合适的药物载体的实例在E.W.Martin的“Remington′s Pharmaceutical Sciences”中描述。
合适的药物“赋形剂”包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、胶质、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂乳粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。
“表面活性剂”包括阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂和非离子表面活性剂，例如但不限于脱氧胆酸钠、十二烷基硫酸钠、Triton X-100和聚山梨醇酯，例如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯65和聚山梨醇酯80。
“稳定剂”包括但不限于甘露醇、蔗糖、海藻糖、白蛋白以及蛋白酶和/或核酸酶拮抗剂。
“生理缓冲溶液”包括但不限于氯化钠溶液、软化水以及合适的有机或无机缓冲溶液，例如但不限于磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、tris缓冲液(三羟甲基氨基甲烷)、HEPES缓冲液([4(2-羟乙基)哌嗪基]乙磺酸)或MOPS缓冲液(3-吗啉代-1-丙磺酸)。相应缓冲液的选择通常取决于所期望的缓冲液摩尔浓度。例如，磷酸盐缓冲液适用于注射溶液和输注溶液。
术语“佐剂”指在细胞或体液水平下，增强、刺激、活化、加强或调节对组合物的活性成分的免疫应答的试剂，例如免疫佐剂刺激免疫系统对实际抗原的应答，但其本身不具有免疫学作用。这种佐剂的实例包括但不限于无机佐剂(例如，无机金属盐如磷酸铝或氢氧化铝)、有机佐剂(例如，皂苷或角鲨烯)、基于油的佐剂(例如，Freund完全佐剂和Freund不完全佐剂)、细胞因子(例如，IL-1β、IL-2、IL-7、IL-12、IL-18、GM-CFS和INF-γ)、微粒佐剂(例如，免疫刺激性复合物(ISCOMS)、脂质体或可生物降解的微球)、病毒体、细菌佐剂(例如，单磷酰脂质A或胞壁酰肽)、合成佐剂(例如，非离子嵌段共聚物、胞壁酰肽类似物或合成脂质A)，或合成多核苷酸佐剂(例如，多聚精氨酸或多聚赖氨酸)。
在第五个方面，本发明涉及本发明的经分离的靶向递送体系，其用于预防/治疗肿瘤、炎症性疾病或皮肤伤口、其他伤口中或器官梗塞(心脏)后或视网膜缺血后的缺血性区域，肿瘤优选实体瘤，优选乳腺癌、胰腺癌、膀胱癌、肺癌、结肠癌、或具有缺氧区域的肿瘤。
如本文所使用的，术语“治疗”包括用于不同的目的的用于治疗、暂时缓解、预防等目的医学上所允许的所有类型的预防和/或治疗干预，所述不同的目的包括延缓或阻止疾病进展、使病变消退或消失、预防发作或抑制复发。
根据本发明的靶向递送体系允许(例如，由于溶解度问题)通常不能到达肿瘤的活性成分递送至肿瘤。它还能使活性成分递送到缺氧肿瘤或肿瘤的缺氧区域。该体系还提供了例如在缺血性事件期间或经历炎症过程中将活性成分递送至经受缺氧条件的生物体中的任何区域。
如上所述，本发明还提供了将靶向药物递送到肿瘤块中的方法。该方法包括CD45+白细胞、优选活化的巨噬细胞的制备，活化的巨噬细胞能够使巨噬细胞高效地摄取铁结合蛋白(铁蛋白、血红蛋白和/或转铁蛋白)，其中所述铁蛋白、血红蛋白和/或转铁蛋白负载活性成分(例如，药物/前药)、肿瘤靶向并且铁结合蛋白转移到癌细胞，活性成分在癌细胞处释放。
本发明利用CD45+白细胞、优选负载有与药物/前药连接的铁结合蛋白的活化的巨噬细胞作为靶向肿瘤的递送体系。肿瘤对化学疗法不令人满意的反应或使用成像方法检测它们的困难主要与由于不良的脉管系统造成的抗癌药物至缺氧区域的渗透改变有关。然而，即使在远离血管的区域，这些无血管区域吸引CD45+白细胞、优选活化的巨噬细胞迁移。因此，它们构成了至肿瘤块的颗粒递送体系。这种颗粒中有前景的实例是铁结合蛋白。然而，当作为单一试剂使用时，类似于其他化合物，它们不到达缺氧区域，并在其他器官中积聚。
本发明人使用化学方法将抗癌药物、缺氧活化的前药(用于治疗目的)或同位素与血红蛋白或转铁蛋白相结合，并如实施例中所述用铁结合蛋白溶液处理细胞而将其负载到CD45+白细胞(单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和/或粒细胞)中、优选将其负载到活化的巨噬细胞中。本发明人观察到向动物施用后，负载的CD45+白细胞、优选活化的巨噬细胞迁移至肿瘤缺氧部位，并释放具有包封的活性成分的铁结合蛋白到癌细胞中。该方法允许将活性成分精确地施用至肿瘤部位(尤其是缺氧区域)，避免其积聚在其他器官中。
附图说明
图1：(A)组显示了哺乳动物铁蛋白H链中的共有氨基酸序列的最小活性片段和基于几种哺乳动物铁蛋白H链的两种全长共有序列(分别参见SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：7)，以及小鼠铁蛋白H链的最小氨基酸序列和全长氨基酸序列(SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4)和人铁蛋白H链的最小氨基酸序列和全长氨基酸序列(SEQ ID NO：5和SEQ IDNO：6)。(B)组显示了哺乳动物铁蛋白L链中的共有氨基酸序列的最小活性片段和基于几种哺乳动物铁蛋白L链的两种全长共有序列(分别参见SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ IDNO：14)，以及小鼠铁蛋白L链的最小氨基酸序列和全长氨基酸序列(SEQ ID NO：10和SEQ IDNO：11)和人铁蛋白L链的最小氨基酸序列和全长氨基酸序列(SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13)。(C)组显示了哺乳动物血红蛋白α链中的共有氨基酸序列的最小活性片段和基于几种哺乳动物血红蛋白α链的一种全长共有序列(分别参考SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16)，以及人血红蛋白α链的最小氨基酸序列和全长氨基酸序列(SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18)。(D)组显示了哺乳动物血红蛋白β链中的共有氨基酸序列的最小活性片段和基于几种哺乳动物血红蛋白β链的全长共有序列(分别参见SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20)，以及人血红蛋白β链的最小氨基酸序列和全长氨基酸序列(SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22)。(E)组显示了哺乳动物转铁蛋白中的共有氨基酸序列的N端最小活性片段和C端最小活性片段(SEQ IDNO：23和SEQ ID NO：24)和基于几种哺乳动物转铁蛋白的全长共有序列(SEQ ID NO：25)，以及人转铁蛋白的N端最小活性片段和C端最小活性片段(SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27)和人转铁蛋白的全长氨基酸序列(SEQ ID NO：28)。在共有序列中，X表示可变的位置且代表任何天然氨基酸。优选地，在每种情况下X都独立于其他X，代表人蛋白中存在的氨基酸。
图2：显示小鼠肿瘤块内的巨噬细胞(注射前TRITC染色的，负载有FITC修饰的铁蛋白)。
图3：显示用乳腺癌细胞注射并静脉内施用负载有FITC-铁蛋白(星号)的巨噬细胞的小鼠肿瘤组织的共聚焦显微镜图像——清楚地观察到不仅在巨噬细胞中而且在癌细胞中铁蛋白-FITC在全部肿瘤块中扩散。
图4：显示在起始时间点(A)和用铁蛋白填充癌细胞足够时间后(B)，体外取样的巨噬细胞(用*表示，负载有FITC-铁蛋白)和癌细胞(用箭头表示，其用红色标记染色，因此在摄取铁蛋白前在绿色通道中未观察到)的使用共聚焦显微镜记录的一个通道(在转换为灰度图片的原始绿色通道中)的快照。FITC-铁蛋白被动态地转运至癌细胞中(首先在囊泡中积累；然后扩散到整个细胞质，如该图像所示(细胞出现在绿色通道中)。
图5：显示接受安慰剂和负载有铁蛋白偶联的美法仑和铁蛋白偶联的苯丁酸氮芥的巨噬细胞的小鼠的存活率。
图6：显示由环磷酰胺处理和由包封在负载到巨噬细胞的铁蛋白中的环磷酰胺(以相同剂量给予)处理引起的肿瘤细胞凋亡。
图7：显示小鼠乳腺肿瘤的MRI图像。用负载铁蛋白Ft的巨噬细胞(静脉注射)处理小鼠(在0小时的时间点)。然后观察到填充有注射的巨噬细胞(T2-信号显著减少)的血管(箭头)的直径增加和之后巨噬细胞扩散到组织(点状图案；箭头)中。在所有检查的小鼠中都观察到这些变化(在相同的时间点)。
图8：显示被巨噬细胞摄取的铁蛋白、血红蛋白和转铁蛋白，被单核细胞摄取的铁蛋白和血红蛋白，和被淋巴细胞和粒细胞摄取的铁蛋白。
图9：显示巨噬细胞储存铁蛋白的稳定性。
图10：显示铁蛋白、血红蛋白和转铁蛋白从巨噬细胞向不同癌细胞的转移。
图11：显示铁蛋白从巨噬细胞向癌细胞和非癌细胞的转移。
图12：显示包封有缺氧活化前药的铁蛋白从巨噬细胞向癌细胞的转移。
图13：显示接受来自共培养的巨噬细胞的包封有不同抗癌试剂的铁蛋白或具有相同试剂的可溶性铁蛋白的癌细胞的细胞凋亡。
图14：显示铁蛋白、血红蛋白和转铁蛋白从单核细胞向不同癌细胞的转移。
图15：显示铁蛋白和血红蛋白从粒细胞向不同癌细胞的转移。
图16：显示铁蛋白和血红蛋白从淋巴细胞向不同癌细胞的转移。
图17：显示来自双光子显微镜的图片，其显示来自小鼠的肿瘤，所述小鼠接受(在施用前)预标记的含有铁蛋白-FITC的巨噬细胞。
图18：显示静脉内接受经标记的巨噬细胞的小鼠的全身成像，其显示巨噬细胞在肿瘤部位的积聚及其在其他器官中的分布。
图19：显示巨噬细胞迁移至缺氧组织，来自小鼠的肿瘤的横截面，所述小鼠通过静脉内施用预标记的巨噬细胞，肿瘤缺氧区域用缺氧标志物-pimonidazolone可视化。
图20：显示在肿瘤块内的微环境中含有FITC-负载的铁蛋白(圆形物)的囊泡的定位。将含有FITC-负载的铁蛋白的巨噬细胞向小鼠静脉内施用。
图21：显示由具有转移性4T1癌症的小鼠的全身分析通过PET记录的信号。小鼠静脉内地接受负载有18F-FDG的巨噬细胞。具有微转移瘤(通过病理学检查确认)的小鼠的肺中信号积聚增加。接受未染色18F-FDG的小鼠或没有4T1癌症的小鼠具有较低的PET信号。
实施例部分
实施例1-巨噬细胞的活化
用于本发明的巨噬细胞如下获得、分化和活化。为了活化巨噬细胞，首先从骨髓前体(例如参见论文：Weischenfeld和Porse，2008，CSH Protoc，doi.10.1101/pdb.prot.5080)或血液单核细胞获得它们。或者，它们可以由腹膜获得。巨噬细胞分离、培养、分化和极化/活化的方法对于本领域技术人员来说是众所周知的。例如，Murray等人详细描述了它们(Immunity，2014，41(1)：14-20)。
在本发明的这种实际实施中，从BALB/c或C57B1/6小鼠获得骨髓来源的巨噬细胞，然而，也可以使用犬科动物血液单核细胞来源的巨噬细胞或可商购获得的巨噬细胞细胞系(单核细胞-巨噬细胞谱系小鼠细胞：RAW 264.7、J744、人：THP-1、U937、或犬科动物DH82细胞系)。
不久，将该骨髓来源的巨噬细胞接种在塑料Petri培养皿中的5ml培养基(每个板3ml细胞)中：DMEM：F12+谷氨酰胺/glutamax+10％FBS+青霉素/链霉素和20％的L929条件培养基或M-CSF(50ng/ml)。在之后的五天中，培养基被补充生长因子和活化化合物中的一种或作为一种细胞因子混合物的其组合。
或者，巨噬细胞已经在“M1/M2巨噬细胞生成培养基”(Promocell)或可商购获得的等效物或含有所有必需的细胞因子和白介素的自制培养基中培养，以将它们视为经活化的。
为了从血液单核细胞获得巨噬细胞，使用Histopaque系统1077或等效物将新鲜血液(不超过12小时)离心，在适量的预热的单核细胞附着培养基(或等效物，例如补充有M-CSF的DMEM/RPMI)、例如每个T-75烧瓶15ml培养基中接种白血球(或者仅从血库中收集的白血球)。对于单核细胞含量≥25％的单核细胞，接种密度应为1百万个/cm2至2百万个/cm2，对于单核细胞含量＜25％的单核细胞，接种密度应为1.5百万个/cm2至3百万个/cm2。然后，在5％CO2和37℃下，在没有任何其他操作的情况下，将细胞在培养箱中培养1至1.5小时。
细胞附着后，将它们清洗至少两次，然后将适量的完整“M1巨噬细胞或M2巨噬细胞生成培养基DXF”添加到细胞中(例如每个T-75烧瓶20ml)，并在37℃和5％CO2下将细胞培养6天，不改变培养基。为了活化巨噬细胞，全部培养基应该用由活化化合物补充的培养基替代。
在本发明中使用的活化化合物(用于骨髓来源的细胞或活化来自单核细胞-巨噬细胞系的细胞)如下：IL-4(20ng/ml)、IFN-γ(至少20ng/ml)、LPS(至少10ng/ml)、IL-13(至少20ng/ml)、IL-10(至少20ng/ml)、地塞米松(至少20μg/ml)、oxLDL(至少20ng/ml)、TNF-α(20ng/ml)、TGF-β(20ng/ml)、皮质醇(150ng/ml至300ng/ml)、或作为一种细胞因子混合物的其组合。为了获得未经活化的巨噬细胞，没有添加活化化合物。
巨噬细胞的极化/活化(从经典活化到替代性活化)的逆转可以例如通过在上面列举的合适细胞因子中培养巨噬细胞至少48小时来达成。
实施例2-单核细胞分离
为了在本发明的这种实际实施中获得单核细胞，从BALB/c或C57B1/6小鼠获得骨髓来源的巨噬细胞或脾脏来源的巨噬细胞，然而，使用犬科动物血液单核细胞或可商购获得的单核细胞系(单核细胞-巨噬细胞系小鼠细胞：RAW 264.7、J744、人：THP-1、U937或犬科动物DH82细胞系)。
为了获得血液单核细胞，使用Histopaque系统1077或等效物将新鲜血液(不超过12小时)离心，并将白血球接种在适量的预热的单核细胞附着培养基(或等效物，例如补充有20ng/ml的M-CSF的DMEM/RPMI)中，例如每个T-75烧瓶15ml培养基。或者，可以仅使用从血库(血沉棕黄层)收集的白血球。对于单核细胞含量≥25％的单核细胞，接种密度应为1百万个/cm2至2百万个/cm2，对于单核细胞含量＜25％的单核细胞，接种密度应为1.5百万个/cm2至3百万个/cm2。然后，在5％CO2和37℃下，在没有任何其他操作的情况下，将细胞在培养箱中培养1至1.5小时。细胞附着后，将它们清洗至少两次，附着细胞被认为是单核细胞。
为了获得骨髓来源的单核细胞，在本发明的这种实际实施中，从BALB/c或C57B1/6小鼠获得骨髓来源的巨噬细胞。不久，将该骨髓来源的前体接种在塑料Petri培养皿中的5ml培养基(每个板3ml细胞)中：DMEM：F12+谷氨酰胺/glutamax+10％FBS+青霉素/链霉素和20％的L929条件培养基或20ng/ml的M-CSF。两天后，添加5ml的标准培养基。然后，两天后添加0.5ml/板的L929条件培养基。黏附细胞被认为是单核细胞。
为了获得脾脏来源的单核细胞，在本发明的这种实际实施中，脾脏被机械地分离以获得单细胞悬浮液并通过70μm细胞过滤器。将细胞离心并除去上清液。红细胞裂解后，使用磁性珠纯化法分离单核细胞，例如EasySep小鼠单核细胞富集试剂盒方案和适当的磁铁。
为了在使用前获得其蛋白质负载和迁移的较好效果，它们可以用以下巨噬细胞活化刺激物预处理：IL-4(20ng/ml)、IFN-γ(至少20ng/ml)、LPS(至少10ng/ml)、IL-13(至少20ng/ml)、IL-10(至少20ng/ml)、地塞米松(至少20μg/ml)、oxLDL(至少20ng/ml)、TNF-α(20ng/ml)、TGF-β(20ng/ml)、皮质醇(150ng/ml至300ng/ml)，或作为一种细胞因子混合物的其组合。
实施例3-粒细胞分离
为了从血液中获得粒细胞，用1份ACD缓冲液(含有0.17M d-葡萄糖、0.10M柠檬酸、0.11M柠檬酸三钠)稀释9份血液。将来自该步骤的血液以1∶1的比例进一步用PBS稀释并离心。除去血浆和血沉棕黄层后，将剩余的细胞与PBS混合至第一步(ACD-血液)的初始体积的80％，然后以4∶12的比例用冷蒸馏水稀释。然后，添加6份2.7％的NaCl溶液并离心。除去上清液后，将细胞重新悬浮在RPMI-1640培养基中。这些细胞被认为是粒细胞。
实施例4-淋巴细胞分离
为了获得脾脏来源的淋巴细胞，在本发明的这种实际实施中，脾脏被机械地分离以获得单细胞悬浮液并通过70μm细胞过滤器。将细胞离心并除去上清液。红细胞裂解后，使用磁性珠纯化法分离淋巴细胞，例如EasySep小鼠CD4+富集试剂盒方案和适当的磁铁。
实施例5-铁蛋白复合物的制备
为了将铁蛋白与抗癌药物(例如，经典药物如环磷酰胺、苯丁酸氮芥、美法仑、苯达莫司汀、banoxantrone或缺氧活化的前药如TH-302)结合，必须在巨噬细胞处理前制备铁蛋白。不久，如下获得根据SEQ ID NO：4(图1)的重组小鼠蛋白。将含有编码SEQ ID NO：4的铁蛋白的合成基因的表达载体pET-22b转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。在添加有氨苄青霉素(100mg/L)的1L Luria-Bertani肉汤(LB)中，在37℃下使大肠杆菌培养物生长至OD 600为0.6。通过添加1mM异丙基硫代-b-D-半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白质表达，培育培养物过夜。细胞通过离心(15000g，15分钟)收集，并悬浮在20mM Hepes(pH 7.5)、150mM NaCl、0.1mg/mLDNA酶、10mM MgCl2中并通过超声破碎。将裂解物在15000g下离心30分钟，并将上清液在50℃下处理10分钟，离心以除去变性的蛋白质，然后在70℃下处理10分钟并再次离心。上清液添加30％的(NH)4SO4，在4℃下搅拌1h，并在15000g下离心30分钟。上清液添加70％(NH)4SO4，在4℃下搅拌1h，并在15000g下离心30分钟。将球团重新悬浮在20mM Hepes(pH7.5)、150mM NaCl中，并在4℃下对相同缓冲液透析过夜。将蛋白质负载到HILOAD 26/600SUPERDEX 200凝胶过滤柱(GE-Healthcare)上，然后无菌过滤并在4℃下保存。(图9)使用21000M-1m-1的摩尔消光系数在280nm处采用分光光度法测定蛋白质浓度，并通过Bradford试验测量595nm处的吸光度。
所述铁蛋白包括重组哺乳动物铁蛋白H均聚物和/或L均聚物。
如前所述获得的铁蛋白通过标准方法纯化以获得不含内毒素的临床前级别产品(参见例如：Ceci等人，2011，Extremophiles 15(3)：431-439；Vanucci等人，2012，Int JNanomed 7：1489-1509)。不久，在pH 7.5的含有20mM Hepes的储备溶液中无菌保存的铁蛋白被稀释至在酸性溶液(最终pH＜3.0)或者在高碱性pH值(pH＞9.5)中24聚体的4μM的最终浓度(参见例如Pontillo等人，2016)，从而允许多聚体的解离。药物以非常高的浓度溶解在合适的溶剂中，然后将小体积以过量200摩尔添加到铁蛋白溶液中。然后通过添加适量的NaOH/HCl溶液使PH达到中性，以使得多聚体重构。目前的实验方法表明，在100kDa截留分子量浓缩器中使用PBS进行三次/四次洗涤(浓缩步骤)使得快速和完全除去共溶剂以及未包封的药物，并将负载药物的铁蛋白纳米笼完全恢复。然后将由此获得的铁蛋白-药物复合物在液氮中快速冷冻和冻干。
取决于共溶剂的选择和药物分子的固有化学性质，可以估计在24-聚体铁蛋白笼中最多有150至180个药物分子可以被包埋/吸附。
还可以通过适当选择苯腙、琥珀酰亚胺或马来酰亚胺活化的药物来使药物与铁蛋白氨基酸侧链(赖氨酸或半胱氨酸)共价偶联。因此，i)苯腙衍生物可以分解铁蛋白表面并从铁蛋白表面释放药物，ii)在蛋白质完全降解为氨基酸后，赖氨酸结合的衍生物可以变为活性的，或iii)通过马来酰亚胺硫醚键的还原性水解，半胱氨酸结合的衍生物可以在细胞内释放。
实施例6-血红蛋白-化合物复合物的制备
如Rossi-Fanelli等人(Archives of biochemistry and biophysics 77：478-492，1958)所述，由新鲜的红细胞制备人血红蛋白。不久，将从健康供体获得的肝素化血液在1600rpm下离心30分钟(4℃)以沉降RBC。通过在球团表面上针吸精确地除去血沉棕黄层。丢弃血浆上清液，通过在等渗的0.9％生理盐水溶液中重悬RBC并在4℃下在1600rpm下离心30分钟而将RBC球团洗涤三次。在最后的生理盐水洗涤和离心步骤后，将RBC球团重悬在用5mM磷酸钾缓冲液(PB，pH＝7.2)缓冲的pH 7.2的蒸馏水中，并使得在4℃温和搅拌下过夜溶解。然后将透析的RBC裂解物在4℃下在13000rpm下离心30分钟，并在室温下将上清液直接装载到配备有填装Q-sepharose XL树脂(GE Healthcare)的XK 26/40柱的Explorer系统上。用缓冲液A(20mM Tris-HCl，pH＝8.2)以12mL/分钟的流速平衡柱，并用相同的缓冲液洗涤三次。通过从100％缓冲液A变为75％缓冲液B(20mM Tris-Cl，加上0.2MNaCl pH 8.20)产生线性梯度洗脱，然后100％缓冲液B的不连续梯度。洗脱后，使用级分收集器收集蛋白质级分。通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析由此获得的蛋白质，并在-80℃下冷冻储存。
人血红蛋白(SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：22，参见图1)可以容易地共价连接至合适的药物结合物，在血红素结合袋内容纳疏水性药物分子或甚至输送连接至血红素铁的细胞毒性小分子。通过将适当的药物结合物选择性地连接至β链93位中的半胱氨酸残基、即蛋白质表面上唯一可滴定的半胱氨酸可以容易地修饰Hb。马来酰亚胺基官能化的药物例如微管蛋白抑制剂单甲基奥瑞他汀(MMAE)或琥珀酰亚胺官能化的mertansine类似物(DM1-SMCC)是极其有效的细胞毒素的最显著实例，其可以容易且特异性地分别附着于相关的半胱氨酸β93残基(对于马来酰亚胺基官能化的药物)或附着于一个或更多个赖氨酸残基(琥珀酰亚胺官能化的药物)。根据以下步骤将这些药物便利地结合到人血红蛋白上：
由MedChem Express(普林斯顿，新泽西州)获得奥瑞他汀E类似物、即马来酰亚胺基己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苯甲酰氧基羰基-单甲基奥瑞他汀E(vcMMAE)。如下制备血红蛋白vcMMAE加合物。将人血红蛋白溶液用反应缓冲液(50mM磷酸盐缓冲液pH 6.8，含有0.1mM EDTA)调节至120μM血红素的浓度，并在4℃下在20％v/v乙腈溶液的存在下与10倍摩尔过量的vcMMAE结合过夜。马来酰亚胺基团有效且特异性地与pH 6.5至7.5的游离(还原的)巯基反应，以形成稳定的硫醚键。纯化过量的vcMMAE和使用PM100超滤浓缩器用D-PBS交换缓冲液。结合的产率约为总半胱氨酸的80％。vcMMAE结合物的形成通过LC-MS分析和用对氯汞苯甲酸盐滴定残余的游离巯基来证实。通过紫外可见光谱分析确定Hb-vcMMAE结合物的浓度。
如下制备用于赖氨酸共价连接而官能化的mertansine类似物DM1 SMCC(AlbTechnology Ltd，亨德森，内华达州，美国)。将人血红蛋白溶液用反应缓冲液(0.1mM磷酸盐缓冲液pH 7.4，含有0.5mM EDTA)调节至400μM血红素的浓度，并在4℃下在10％v/v DMSO溶液的存在下与20倍摩尔过量的DM1-SMCC结合16小时。胺反应性琥珀酰亚胺酯与胺偶联，从而与蛋白质表面上的赖氨酸基团产生共价加合物。除去过量的DM1-SMCC和使用PM100超滤浓缩器用D-PBS交换缓冲液。结合的产率为约每个血红蛋白四聚体2.4个mertansine分子。通过LC-MS分析证实DM1-SMCC结合物的形成。通过紫外可见光谱分析确定Hb-DM1-SMCC结合物的浓度。
实施例7-转铁蛋白-化合物复合物的制备
从健康供体获得血清，在作为螯合剂的柠檬酸根离子和碳酸氢盐的存在下添加过量铁碳酸氢盐促进铁与转铁蛋白结合。反应混合物含有6.5mg碳酸氢钠和153.16柠檬酸铁，pH＝8，4℃，1h每100mL血清。然后通过在4℃下以3.5V/V的比率向血清样品添加醇溶液2h，pH＝9.4，通过利凡诺(4％)使白蛋白沉淀。然后，将溶液在3000rpm下离心20分钟，最后通过0.8mm注射器式过滤器过滤。然后通过在0.025M硫酸铵中在Sephadex G-25柱上的凝胶过滤来除去过量利凡诺。然后进行通过pH＝6.5的50％饱和硫酸铵的第一次沉淀，然后在3000rpm下离心10分钟(除去免疫球蛋白)。然后进行80％饱和硫酸铵下的第二次沉淀，从而回收转铁蛋白沉淀。然后将固体沉淀物溶解在含有1M NaCl、pH＝8的0.06M Tris HCl缓冲液中。将溶液在相同的缓冲液中透析以使硫酸铵完全除去。然后将蛋白质溶液用centriconPM50离心浓缩器浓缩至最多10mg/ml至15mg/ml(通过Bradford方法估计)并装载到在流速为15ml/小时的1M NaCl中平衡的Sephadex G-100凝胶过滤柱(2，4×80cm)上。由此获得的转铁蛋白通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳估算为88％至90％纯。然后使用由阴离子交换剂DEAE Sephadex A-50的离子交换色谱作为最终精制步骤。将转铁蛋白样品装载到用pH＝8的0.06M Tris-HCl平衡的柱中，用洗脱缓冲液pH＝8的0.3M Tris HCl通过线性浓度梯度洗脱。蛋白质纯度高于98％，产率为每100mL血清约150mg。
尽管由于不存在游离可滴定的半胱氨酸基团，仅可用赖氨酸修饰，但是与血红蛋白类似的人全转铁蛋白(SEQ ID NO：28，图1)可以容易地共价连接至适当的药物结合物。因此，琥珀酰亚胺官能化的mertansine类似物(DM1-SMCC)已被用于共价连接至一个或更多个赖氨酸残基(琥珀酰亚胺官能化的药物)。根据以下过程，药物已经方便地与转铁蛋白结合：
如下制备用于赖氨酸共价连接的官能化的mertansine类似物DM1 SMCC(AlbTechnology Ltd，亨德森，内华达州，美国)。转铁蛋白溶液用反应缓冲液(0.1mM磷酸盐缓冲液pH 7.4，由于可能的铁螯合作用在这种情况下无EDTA)调节至100μM血红素的浓度，并在4℃下在8％v/v DMSO溶液的存在下与20倍摩尔过量的DM1-SMCC结合16小时。胺反应性琥珀酰亚胺酯与胺偶联，从而与蛋白质表面上的赖氨酸基团产生共价加合物。除去过量的DM1-SMCC和使用PM100超滤浓缩器用D-PBS交换缓冲液。结合的产率为每个转铁蛋白二聚体约1.5个mertansine分子。通过LC-MS分析证实DM1-SMCC结合物的形成。通过紫外可见光谱分析确定转铁蛋白-DM1-SMCC结合物的浓度。
实施例8-获得负载铁蛋白的细胞
获得的细胞在铁蛋白溶液中培养一段时间，所处浓度足以确保铁蛋白/细胞的合适比例以使其满载，以及确保合适的药物含量以获得治疗效果。时间和浓度可以根据包封/吸附到铁蛋白笼中的分子数、细胞活化的状态以及它们预期施用的条件和次数而改变。
例如，为了确保适当地负载铁蛋白，将细胞在标准培养条件下在0.2mg/ml的铁蛋白溶液中培养1至4小时。铁蛋白浓度的范围可以至少在0.01mg/ml至4mg/ml变化，培养时间也可以变化(5分钟至6小时或更久)。调整铁蛋白负载到细胞的时间和浓度，应注意铁蛋白和处理条件对细胞活力的影响。如上所述获得的细胞在相对短的时间(以分钟计；图8)中非常容易摄取铁蛋白。一旦它们吸收铁蛋白，它们就不会将铁蛋白释放到培养基中(图9)。
然而，出于实验室自身的自身目的，本领域技术人员能够重新调整上述条件并优化方案。
实施例9-获得负载血红蛋白的细胞
获得的细胞在血红蛋白溶液中培养一段时间，所处浓度足以确保血红蛋白/细胞的合适比例以使其满载，以及确保合适的药物含量以获得治疗效果。时间和浓度可以根据与血红蛋白分子相连的分子数、细胞活化的状态以及它们预期施用的条件和次数而改变。
例如，为了确保适当地负载血红蛋白，将细胞在标准培养条件下在0.1mg/ml的血红蛋白溶液中培养1至4小时。血红蛋白浓度的范围可以至少在0.01mg/ml至0.2mg/ml变化，以及培养时间可以变化(5分钟至4小时或更久)。调整血红蛋白负载到细胞的时间和浓度，应注意血红蛋白和处理条件对细胞活性的影响。如上所述获得的细胞在相对短的时间(以分钟计；图8)中非常容易摄取血红蛋白。
然而，出于实验室自身的自身目的，本领域技术人员能够重新调整上述条件并优化方案。
实施例10-获得负载转铁蛋白的细胞
获得的细胞在转铁蛋白溶液中培养一段时间，所处浓度足以确保转铁蛋白/细胞的合适比例以使其满载，以及确保合适的药物含量以获得治疗效果。时间和浓度可以根据与转铁蛋白分子相连的分子数、细胞活化的状态以及它们预期施用的条件和次数而改变。
例如，为了确保适当地负载转铁蛋白，将细胞在标准培养条件下在0.1mg/ml的转铁蛋白溶液中培养1至4小时。转铁红蛋白浓度的范围可以至少在0.01mg/ml至0.2mg/ml变化，以及培养时间可以变化(5分钟至4小时或更久)。调整转铁蛋白负载到细胞的时间和浓度，应注意转铁蛋白和处理条件对细胞活性的影响。如上所述获得的细胞在相对短的时间(以分钟计；图8)中非常容易摄取转铁蛋白。
然而，出于实验室自身的自身目的，本领域技术人员能够重新调整上述条件并优化方案。
实施例11-铁蛋白/血红蛋白/转铁蛋白-巨噬细胞复合物作为有用的向癌细胞递送的工具
如实施例8、实施例9和实施例10中所制备的来自实施例1的巨噬细胞非常容易地将铁蛋白、血红蛋白、转铁蛋白运输至癌细胞：小鼠乳腺癌、结肠癌、犬科动物乳腺癌、人乳腺癌、胰腺癌和膀胱癌(图4、图10)。此外，这种转移对于癌细胞比非癌细胞更有特异性(图11)得多。然而，在癌细胞的情况下，两种细胞类型的比例是至关重要的。巨噬细胞越多，运输越好越快。当巨噬细胞与癌细胞的比例为1∶1或更高时，观察到向癌细胞的最有效转移。
这种转移不仅当蛋白质载体与荧光标记物(例如，FITC或Alexa610)结合时发生，而且当它们与其他化合物、例如抗癌药物结合/包封时也发生(图12显示了包封有荧光缺氧活化的前体药物——banoxantrone的铁蛋白的这种转移)。与抗癌药物结合的化合物的这种转移造成引起癌细胞中细胞凋亡的效果(图6、图13)。
实施例12-铁蛋白/血红蛋白/转铁蛋白-单核细胞复合物作为有用的向癌细胞递送的工具
如实施例8、实施例9和实施例10中所制备的来自实施例2的单核细胞非常容易将铁蛋白、血红蛋白、转铁蛋白运输至癌细胞(图14)。但是，两种细胞类型的比例是至关重要的。单核细胞越多，运输越好越快。当单核细胞与癌细胞的比例为1∶1或更高时，观察到向癌细胞的最有效转移。
实施例13-铁蛋白/血红蛋白/转铁蛋白-粒细胞复合物作为有用的向癌细胞递送的工具
如实施例8、实施例9和实施例10中所制备的来自实施例3的粒细胞非常容易将铁蛋白、血红蛋白、转铁蛋白运输至癌细胞(图15)。但是，两种细胞类型的比例是至关重要的。粒细胞越多，运输越好越快。当粒细胞与癌细胞的比例为1∶1或更高时，观察到向癌细胞的最有效转移。
实施例14-铁蛋白/血红蛋白/转铁蛋白-淋巴细胞复合物作为有用的向癌细胞递送的工具
如实施例8、实施例9和实施例10中所制备的来自实施例4的淋巴细胞非常容易将铁蛋白、血红蛋白、转铁蛋白运输至癌细胞(图16)。但是，两种细胞类型的比例是至关重要的。淋巴细胞越多，运输越好越快。当淋巴细胞与癌细胞的比例为1∶1或更高时，观察到向癌细胞的最有效转移。
实施例15-白细胞-蛋白质载体复合物作为向缺氧区域的有用靶向药物递送剂
将如上制备的巨噬细胞注射到具有肿瘤的动物的尾静脉中(应调整适当数量的巨噬细胞以适应肿瘤大小、发展阶段和转移瘤的存在)。如图2和图17中所示，它们特异性地到达肿瘤(几小时后)，并分散在整个动物的其他器官中(图18)。此外，如图19所示，在缺氧模型中，它们也能够迁移至无血管和缺氧部位，并将载体蛋白转移到癌细胞中(图3和图20)。
出于成像目的，将1百万个至5000万个巨噬细胞注射到具有乳腺癌或结肠癌肿瘤的动物的尾静脉中。之前，用细胞追踪器预先标记巨噬细胞并负载铁蛋白-FITC(如实施例8所示)。在巨噬细胞施用于肿瘤块8小时后，使用双光子检测到运载铁蛋白-FITC的巨噬细胞的存在(图17)。使用DIR细胞质染料在预标记巨噬细胞后，使用动物全身成像(IVIS)显示它们对肿瘤的特异性靶向以及它们向其他器官的迁移(图18)。
将负载有包封环磷酰胺、美法仑的铁蛋白和包封苯丁酸氮芥的铁蛋白的1百万至1000万个巨噬细胞通过静脉注射到具有肿瘤的小鼠中(300000个至500000个EMT6细胞被注射到胁腹部皮肤中)。每隔3天注射3次巨噬细胞(在注射癌细胞后的第5天、第8天和第11天，或在注射癌细胞后的第7天、第10天和第13天)或每天连续注射5次，观察到小鼠存活率增加(图5)。
实施例16-白细胞-蛋白质载体复合物或经标记的白细胞作为有用的成像工具
在本发明中描述的靶向递送体系的靶向后可以将铁蛋白偶联至造影剂。如图21所示，在注射如实施例8中描述的1ml至50ml负载有铁蛋白的巨噬细胞与造影剂(在这种情况下为水铁矿，然而用同位素例如123I获得相同的结果)偶联或用同位素标记(在这种情况下，18F-FDG)之后(图21)，它们可以容易地被MRI、PET或SPECT检测。在该实施例中(图7)，在静脉注射负载铁蛋白Fh的巨噬细胞3小时、22小时和24小时后，使用MRI成像具有乳腺肿瘤的小鼠。用巨噬细胞处理小鼠(在时间点0小时)。然后观察到了填充有注射的巨噬细胞的血管(箭头)的直径增加(T2信号显著减少)，并且之后巨噬细胞扩散至组织中(点状图案；箭头)。在所有检查的小鼠中都观察到这些变化(在相同的时间点)。
巨噬细胞还用18F-FDG(5mln至50mln)标记，并在向具有肿瘤的小鼠静脉施用后1小时使用PET成像。在实验前3周对这些小鼠接种4T1转移瘤细胞系，并在组织病理学上确认肺、肝脏和脾脏中的转移瘤。在图21中，可以看出巨噬细胞迁移至具有转移性肿瘤的区域，使得其在PET下可视化。
尽管本发明前述的说明使得普通技术人员能获得和使用其被认为目前最佳的方式，但那些普通技术人员会理解和领会存在本文的特定实施方案、方法和实施例的变化方案、组合方案和等同方案的存在。因此，本发明不应限于上述实施方案、方法和实施例，而限于本发明的范围和精神内的所有实施方案和方法。
本发明还涉及以下方面和这些方面的优选实施方案。以上提供的定义类似地应用于以下方面和实施方案。
1.靶向递送体系，其包含负载运载活性成分的铁蛋白的活化的巨噬细胞。
2.根据实施方案1的靶向递送体系，其中由铁蛋白运载的活性成分是抗癌药物。
3.根据实施方案2的靶向递送体系，其中所述抗癌药物是细胞凋亡诱导药物。
4.根据实施方案2的靶向递送体系，其中所述抗癌药物选自环磷酰胺、苯丁酸氮芥、美法仑、苯达莫司汀和banoxantrone。
5.根据实施方案1的靶向递送体系，其中所述活性成分是缺氧活化的前药。
6.根据实施方案5的靶向递送体系，其中所述缺氧活化的前药是TH-302。
7.制备所述靶向递送体系的方法，所述靶向递送体系包含负载运载活性成分的铁蛋白的活化的巨噬细胞，所述方法包括以下步骤：
a)纯化铁蛋白；
b)通过连接铁蛋白和所述活性成分获得运载活性成分的铁蛋白；
c)活化经分离的巨噬细胞；
d)在足以确保运载活性成分的铁蛋白满载进入巨噬细胞的铁蛋白浓度下，在步骤b)中获得的运载活性成分的铁蛋白的溶液中培养巨噬细胞一段时间。
8.根据实施方案7的方法，其中所述活化的巨噬细胞是骨髓来源的巨噬细胞。
9.根据实施方案7的方法，其中所述活化的巨噬细胞是血液来源的巨噬细胞。
10.根据实施方案7的方法，其中活化的巨噬细胞来源于巨噬细胞系。
11.根据实施方案7至10中任一项的方法，其中活化的巨噬细胞是向M1或M2极化的巨噬细胞。
12.根据实施方案11的方法，其中活化的巨噬细胞已经向M2极化。
13.根据实施方案11的方法，其中活化的巨噬细胞的铁代谢已经被控制。
14.根据实施方案7至13中任一项的方法，其中由铁蛋白运载的活性成分是抗癌药物。
15.根据实施方案14的方法，其中所述抗癌药物是细胞凋亡/自吞噬或坏死诱导药物。
16.根据实施方案14的方法，其中所述抗癌药物选自环磷酰胺、苯丁酸氮芥、美法仑、苯达莫司汀和banoxantrone。
17.根据实施方案7至13中任一项的方法，其中所述活性成分是缺氧活化的前药。
18.根据实施方案17的方法，其中所述缺氧活化的前药是TH-302。
19.如实施方案1至7中任一项所定义的靶向递送体系，其用作抗癌药物靶向递送体系。
20.如实施方案1至7中任一项所定义的靶向递送体系，其用于预防/治疗实体瘤生长中。
21.如实施方案1至7中任一项所定义的靶向递送体系在治疗炎症性疾病中的用途。
22.如实施方案1至7中任一项所定义的靶向递送体系在治疗缺血性区域或使缺血性区域成像中的用途。
在优选的实施方案中，本发明不包括以上第1项至第22项的主题。

Claims (21)

1.一种经分离的靶向递送体系，其包含CD45+白细胞，在所述细胞中包含一种或更多种铁结合蛋白和活性成分的复合物。
2.根据权利要求1所述的经分离的靶向递送体系，其中所述白细胞能够由CD34+造血前体细胞产生。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的经分离的靶向递送体系，其中所述白细胞选自单核细胞、分化的单核细胞、淋巴细胞和粒细胞。
4.根据权利要求3所述的经分离的靶向递送体系，其中
(i)所述单核细胞是CD11b+单核细胞，优选地选自CD11b+CD14+单核细胞、CD11b+CD16+单核细胞、CD11b+CD14+CD16+单核细胞、CD11b+CD14+MHCII+单核细胞、CD11b+CD14+CD115+单核细胞、CD11b+CD114+单核细胞、CD11b+CD116+单核细胞、CD11b+CCR1+单核细胞、CD11b+CCR2+单核细胞、CD11b+CX3CR+单核细胞、CD11b+CXR4+单核细胞、CD11b+CXR6+单核细胞和CD11b+CD14+CD33+单核细胞；
(ii)所述分化的单核细胞选自巨噬细胞、活化的巨噬细胞，优选CD11b+巨噬细胞，更优选CD11b+CD16+巨噬细胞、CD11b+CD32+巨噬细胞、CD11b+CD64+巨噬细胞、CD11b+CD68+巨噬细胞，优选CD11b+CD86+M1巨噬细胞，其优选地产生iNOS和/或分泌白介素12(IL-12)，或优选CD11b+CCR2+M2巨噬细胞、CD11b+CD204+M2巨噬细胞、CD11b+CD206+M2巨噬细胞、CD11b+CD204+CD206+M2巨噬细胞、CD11b+主要组织相容性复合体II+(MHCII+)(低表达或高表达)M2巨噬细胞、CD11b+CD200R+M2巨噬细胞、CD11b+CD163+M2巨噬细胞，或产生精氨酸酶和/或分泌白介素10(IL-10)的活化的巨噬细胞；或树突细胞，其优选地具有CD11b CD11c、CD11b CD80、CD11c CD80、CD11c CD86、CD11c MHCII和CD11c CD123的表达，优选分化的单核细胞不是Lox1+、CXCR7+和NRF2+泡沫细胞；
(iii)表达至少一种趋化因子受体或至少一种生长因子受体的单核细胞或活化的单核细胞，所述趋化因子受体优选地选自CCR1、CCR2+、CXR4+和CXR6+，所述生长因子受体优选地选自巨噬细胞集落刺激因子受体(CD115)、粒细胞集落刺激因子受体(CD114)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体(由CD116和CD131构成)；具有这些特征的单核细胞特别适合于治疗炎症性病症和癌症；
(iv)淋巴细胞选自CD3+和CD4+或CD8+T淋巴细胞或CD19+、CD20+、CD21+、CD19+CD20+、CD19+CD21+、CD20+CD21+或CD19+CD20+CD21+B淋巴细胞；或
(v)粒细胞选自嗜中性粒细胞，优选CD66b+嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞，优选CD193+嗜酸性粒细胞。
5.根据权利要求4所述的经分离的靶向递送体系，其中所述活化的巨噬细胞：
(i)能够通过单核细胞或巨噬细胞与能够改变巨噬细胞上的表达标志物的因子的体外培养产生，优选地
(a)与至少一种M1诱导物的体外培养产生，
(b)与至少一种M2诱导物的体外培养产生，
(c)或与能够改变巨噬细胞分泌细胞因子，优选IL-10和IL-12、趋化因子和/或产生iNOS、精氨酸酶或其他免疫调节酶的能力的因子的体外培养产生；
(ii)特征在于以下抗原中的至少一种的表达：CD64、CD86、CD16、CD32，MHCII的高表达，和/或iNOS和/或IL-12的产生；
(iii)能够通过单核细胞或巨噬细胞与能够诱导巨噬细胞吞噬能力的因子的体外培养产生；
(iv)特征在于以下抗原：CD204、CD206、CD200R中至少一种、CCR2、转铁蛋白受体(TfR)、CXC模序趋化因子受体4(CXCR4)、CD163，和/或T细胞免疫球蛋白结构域和黏蛋白结构域2(TIM-2)的表达，和/或显示MHCII的低表达；
(v)具有吞噬能力；和/或
(vi)能够分泌细胞因子或产生诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)(或其他促炎症性化合物)、精氨酸酶或其他抑制免疫力/抗炎化合物，所述细胞因子优选IL-12或IL-10。
6.根据权利要求5所述的靶向递送体系，其中：
(i)M1诱导物选自LPS、INF-γ、GM-CSF和病毒感染和细菌感染；或
(ii)M2诱导物选自IL-4、IL-10、IL-13、抗原和抗体的免疫复合物、IgG、热活化的γ球蛋白、糖皮质激素、TGF-β、IL-1R、CCL-2、IL-6、M-CSF、PPARγ激动剂、白细胞抑制因子、腺苷、蠕虫和真菌感染。
7.根据权利要求4所述的经分离的靶向递送体系，其中所述单核细胞：
(i)能够由CD34+造血前体细胞产生；
(ii)能够通过单核细胞与至少一种诱导物的体外培养产生，所述诱导物优选M1或M2诱导物，更优选至少一种M2诱导物；
(iii)特征在于以下抗原中的至少一种的表达：TfR+、CD163+、TIM-2+、CD14+、CD16+、CD33+、和/或CD115+；
(iv)特征在于以下抗原中的至少一种的表达：TfR+、CD163+、TIM-2+、CXCR4+、CD14+和/或CD16+；和/或
(v)具有吞噬能力。
8.根据权利要求7所述的靶向递送体系，其中：
(i)M1诱导物选自LPS、INF-γ、GM-CSF或病毒感染或细菌感染；
(ii)M2诱导物选自IL-4、IL-10、IL-13、抗原和抗体的免疫复合物、IgG、热活化的γ球蛋白、糖皮质激素、TGF-β、IL-1R、CCL-2、IL-6、M-CSF、PPARγ激动剂、白细胞抑制因子、癌症条件培养基、癌细胞、腺苷和蠕虫或真菌感染。
9.根据权利要求4所述的经分离的靶向递送体系，其中所述淋巴细胞：
(i)能够由血液、脾脏或骨髓获得，或能够由CD34+前体细胞产生；
(ii)是免疫活性淋巴细胞；
(iii)表达抗原特异性T细胞受体；和/或
(iv)特征在于以下抗原中的至少一种的表达：(a)CD3+和CD4+或CD8+或(b)：CD19+、CD20+、CD21+、CD19+CD20+、CD19+CD21+、CD20+CD21+、或CD19+CD20+CD21+抗原，并优选地能够产生免疫球蛋白。
10.根据权利要求4所述的经分离的靶向递送体系，其中所述粒细胞：
(i)能够由血液、脾脏或骨髓获得，或能够由CD34+前体细胞产生；
(ii)特征在于CD66b+和/或CD193+中的至少一种的表达；
(iii)是分叶核白细胞，其特征在于其细胞质中存在颗粒；和/或
(iii)特征在于以下中的至少一种的表达：TfR+、CD163+、TIM-2+和/或CXCR4+。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的经分离的靶向递送体系，其中所述铁结合蛋白选自铁蛋白，优选重(H)型铁蛋白、轻(L)铁蛋白和/或线粒体铁蛋白；血红蛋白，优选血红蛋白A、血红蛋白AS、血红蛋白SC、血红蛋白C、血红蛋白D、血红蛋白E、血红蛋白F、血红蛋白H；血红蛋白-触珠蛋白复合物、血色素结合蛋白、转铁蛋白；和乳铁蛋白。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的经分离的靶向递送体系，其中所述活性成分选自蛋白质、核酸、分子量小于1kD的化学非蛋白质非核酸化合物，优选抗癌药物，特别是抑制细胞生长的药物、细胞毒性药物及其前药；抗动脉硬化药物；和抗炎药物；和光敏化合物；病毒，特别是溶瘤细胞病毒；发射α或β射线的放射性同位素，其还发射损害细胞量的γ射线，优选地选自镥-177、镱-90、碘-131、钐-153、磷-32、铯-131、钯-103、镭-233、碘-125和硼-10，或损害细胞量的α射线，优选地选自锕-225、铋-213、铅-212和钋-212。
13.根据权利要求12所述的经分离的靶向递送体系，其中所述抗癌药物选自细胞凋亡诱导药物、烷基化物质、抗代谢物、抗生素、埃博霉素、核受体激动剂和拮抗剂、抗雄激素、抗雌激素、铂化合物、激素、抗激素、干扰素、细胞周期依赖性蛋白激酶(CDK)的抑制剂、环氧合酶和/或脂氧合酶的抑制剂、生物来源的脂肪酸、生物来源的脂肪酸衍生物包括前列腺素和白三烯、蛋白激酶的抑制剂、蛋白质磷酸酶的抑制剂、脂质激酶的抑制剂、铂配位络合物、乙撑亚胺、甲基三聚氰胺、三嗪、长春花生物碱、嘧啶类似物、嘌呤类似物、烷基磺酸盐、叶酸类似物、蒽二酮、经取代的尿素、和甲基肼衍生物、烯二炔抗生素、maytansinoid、奥瑞他汀衍生物、免疫检查点抑制剂、肿瘤特异性蛋白质或标志物的抑制剂，优选Rho-GDP-解离抑制剂、更优选Grp94。
14.根据权利要求12所述的经分离的靶向递送体系，其中所述抗癌药物是醋地砜、阿柔比星、安巴腙、氨鲁米特、L-天冬酰胺酶、硫唑嘌呤、banoxantrone、苯达莫司汀、博来霉素、白消安、亚叶酸钙、卡铂、卡培他滨、卡莫司汀、塞来昔布、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、放线菌素D氨苯砜、柔红霉素、双溴丙脒、己烯雌酚、多西他赛、阿霉素、烯二炔类、表柔比星、埃博霉素B、埃博霉素D、estramucin磷酸盐、雌激素、炔雌醇、依托泊苷、夫拉平度、氟尿苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、氟甲睾酮、氟他胺磷雌酚、呋喃唑酮、吉西他滨、促性腺激素释放激素类似物、六甲三聚氰胺、羟基尿素、羟甲基呋喃妥英、己酸羟孕酮、羟基脲、伊达比星、碘苷、异环磷酰胺、干扰素α、伊立替康、亮丙瑞林、洛莫司汀、勒托替康、硫酸磺胺米隆olamide、甲二氯二乙胺、醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、美法仑、米帕林、巯嘌呤、甲氨蝶呤、甲硝哒唑、丝裂霉素C、米托肼、米托坦、米托蒽醌、光神霉素、萘啶酸、硝呋太尔、硝呋酚酰肼、呋喃拉嗪、硝呋替莫、尼莫司汀、ninorazole、呋喃妥因、氮芥、oleomucin、喹酸、喷他脒、喷司他丁、非那吡啶、酞磺胺噻唑、哌泊溴烷、泼尼莫司汀、强的松、preussin、丙卡巴肼、乙胺嘧啶、雷替曲塞、雷帕霉素、罗非考昔、罗格列酮、柳氮磺吡啶、吖啶黄、司莫司汀、链脲佐菌素、磺胺脲、磺胺醋酰、磺胺氯哒嗪、磺胺嘧啶、磺胺戊烯、磺胺地索辛、磺胺乙二唑、磺胺异唑、磺胺胍、磺胺胍诺、磺胺甲二唑、磺胺甲唑、复方新诺明、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺二甲唑、对氨基苯磺酰胺、磺胺培林、磺胺苯吡唑、磺胺噻唑、磺胺索嘧啶、星形孢菌素、他莫昔芬、紫杉酚、替尼泊苷、tertiposide、睾内脂、丙酸睾酮、硫鸟嘌呤、噻替派、替硝唑、拓扑替康、三亚胺醌、曲奥舒凡、甲氧苄啶、曲磷胺、UCN-01、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春花碱、长春瑞滨和佐柔比星，优选地选自奥瑞他汀、banoxantrone、苯达莫司汀、苯丁酸氮芥、chaliceamycin、dynemycin A、美登素、美法仑、mertansine和neocazinostatin。
15.根据权利要求12所述的经分离的靶向递送体系，其中所述抗癌药物是增殖抑制蛋白或核酸或siRNA或DNA酶，所述增殖抑制蛋白优选细胞周期抑制剂或与增殖促进蛋白特异性结合的抗体或抗体样结合蛋白，所述核酸优选编码增殖抑制蛋白或与增殖促进蛋白特异性结合的抗体或抗体样结合蛋白。
16.根据权利要求1至12中任一项所述的经分离的靶向递送体系，其中所述活性成分是缺氧活化的前药，优选地选自苯并三嗪N氧化物、apaziquone(EO9)、替拉扎明(TPN)、SN30000、PR-104A、TH-302、TH-4000、AQ4N。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的经分离的靶向递送体系，其中：
(i)包含在复合物中的铁结合蛋白和活性成分之间的键是共价和/或非共价的；和/或
(ii)包含在复合物中的活性成分被铁结合蛋白或其多聚体包埋/包封。
18.一种制备根据权利要求1至17所述的经分离的靶向递送体系的方法，其包括以下步骤：
a)提供纯化的铁结合蛋白；
b)将活性成分共价或非共价地连接至铁结合蛋白和/或在铁结合蛋白中包封活性成分；
c)提供CD45+白细胞；和
d)在步骤b)中产生的铁结合蛋白的存在下培养CD45+白细胞，直到CD45+白细胞至少部分地负载在步骤b)中产生的铁结合蛋白。
19.根据权利要求1至17中任一项所述的经分离的靶向递送体系，其用作药物。
20.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至17中任一项所述的经分离的靶向递送体系和药学上可接受的载体和/或合适的赋形剂。
21.根据权利要求1至17中任一项所述的经分离的靶向递送体系，其用于预防/治疗肿瘤、炎症性疾病或皮肤伤口中或器官梗塞(心脏)或视网膜缺血后的缺血性区域，所述肿瘤优选实体瘤，优选乳腺癌、胰腺癌、膀胱癌、肺癌、结肠癌、或具有缺氧区域的肿瘤。
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