JP7045370B2 - 細胞標的化された薬学的に活性な物質または標識送達系 - Google Patents

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ベニ，イレーナ
バイオッコ，パオラ
ライジール，トマシュ
ボッフィ，アルベルト
シュルツ，アレクサンドラ
ピルヒ，ゾフィア
トネカ，カタジーナ
ウレヴィツ，カタジーナ
タチアク，バルトウォミェイ
キラガ，ウーカシュ
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Description

本発明は、１以上の鉄結合タンパク質と活性のある薬学的活性物質および／または標識との複合体を細胞内に含むCD45+白血球細胞を含む単離された細胞標的化送達系、ならびに、このような単離された細胞標的化送達系の製造方法、および、このような系の予防、治療、診断または治療診断（theragnosis）、特に予防または治療的ワクチン接種、がん、特に転移性癌または炎症性疾患の治療のための使用に関する。
現在の画像化ツールは、大きな転移（0.5～1cmより大きいサイズ）を検出することができる。しかしながら、それらは転移性腫瘍細胞の早期の広がりをほとんど検出しない。0.5cmより小さなヒトの腫瘍転移は無血管であり、したがって血液および酸素の適切な供給はない。このことは、これらの腫瘍転移を標識し、それらを画像化する目的のために、血液循環を介した造影剤の送達が不可能であることを意味する。低酸素症の存在は、血液灌流が殆どまたは全くない低酸素分画が90％もの高さで存在する可能性がある微小転移の共通の特徴である (非特許文献１)。したがって、重度の低酸素症は微小転移の一般的な特徴と考えられている。
微小転移へのアクセスは、いくつかのバイオ障壁、血液供給不足によって妨げられるので、正常細胞の大集団の中に隠された１以上の微小転移の標的化が独特な課題を提示し、さらに障壁が微小転移の小さなサイズとそれらの器官への分散によって提示される。
同じ理由から、微小転移はしばしば治療に対して屈折性である。微小転移が発生した固形腫瘍では、しばしば従来の療法によく反応するが、原発腫瘍の部位または転移部位で再増殖することがしばしばある。これは、臨床腫瘍学において深刻な問題を構成する(非特許文献２)。これは、薬物浸透を制限する固形腫瘍の微小環境の特性に関連し、それにより薬物の有効濃度よりも低く腫瘍がさらされることになる(非特許文献３)。これは、癌細胞の高い異種性、低い酸素張力（低酸素）、低いpHおよび低いグルコース濃度をもたらす不十分な脈管構造によって引き起こされる (非特許文献４)。さらに、いくつかの領域で急速な腫瘍細胞の増殖は、新しい血管の成長速度を上回り、低酸素領域の形成を促進する可能性がある(非特許文献５)。この異常な血管構造およびその後の腫瘍低酸素症の原因となる機能障害は、固形腫瘍に罹患した患者のより悪性の表現型および不良な生存と関連し、薬物摂取の減少による治療不全および癌細胞における低酸素誘導性変化を生じさせる (非特許文献６～８)。さらに、化学療法または放射線療法は、腫瘍低酸素症の大きな領域のさらなる形成を引き起こし、腫瘍の治療をさらに困難にする。低酸素腫瘍細胞の存在によって抗癌療法の有効性が制限されるという事実は、この問題を克服することを目的とした様々な治療法の導入をもたらした。
Liら 2012, JournalofSolid Tumours, 2(2): 28-33 Muthanaら2012, CancerRes; 73(2); 490-495 Hobbsら1998, Proc NatlAcad Sci USA: 4607-4612 Kizaka-Kondohら 2003,Cancer Sci 94(12):1021-1028 LewisおよびMurdoch,2005,Am J Pathol 167(3):627-635 Sunら2012, Clin CancerRes 18(3):758-770 Sullivanら2008 MolCancer Ther 7(7):1961-1973 Kizaka-Kondohら 2003,Cancer Sci 94(12):1021-1028
本発明者らはCD45+白血球細胞、特に活性化されたマクロファージ、その前駆体である単球、リンパ球および顆粒球が、インビトロで１以上の鉄結合タンパク質と複合体化した薬学的に活性な物質、標識または薬学的に活性な物質と標識を取り込むことができ、これらの複合体を細胞、好ましくは、生体内の腫瘍細胞、またはストレス（例えば、酸化的ストレス）を受けている他の細胞に送達できることを発見した。この知見に基づいて、本発明者らは先行技術の上述の課題の１つ以上を克服した。したがって、本発明の標的送達システムは、とりわけ、以下の利点のうちの１以上を提供する：（ｉ）上記のCD45+白血球、好ましくは罹患細胞への１以上の薬学的に活性な物質、標識または薬学的に活性な物質と標識の特異的送達、（ｉｉ）薬学的に活性な物質、標識または薬学的に活性な物質と標識の、血液循環中の不活性化または身体からの排除からの保護、（ｉｉｉ）薬学的に活性な物質、標識または薬学的に活性な物質と標識の、好ましくは、例えば、転移腫瘍、より大きな腫瘍内の低酸素領域、リウマチ性病変、炎症性リンパ節、無血管創、皮膚などの疾患の血管の乏しい領域または非血管新生領域の細胞への送達、（ｉｖ）薬学的に活性な物質、標識または薬学的に活性な物質と標識の毒性の低下、（ｖ）乏しい薬物動態を有する、薬学的に活性な物質、標識または薬学的に活性な物質と標識の送達、（ｖｉ）標的送達に起因する薬物の副作用の減少、（ｖｉｉ）、標的送達によるより低い用量の薬物でのより高い治療効力、および／または、（ｖｉｉｉ）CD45+白血球の内部に充填された鉄結合タンパク質と結合した薬物の投与による薬剤投与部位での局所組織傷害のより低いリスク、および／または、（ｉｘ）高度に低酸素状態の小転移を検出する可能性、および／または、（ｘ）炎症性疾患の早期発見。
第一の態様において本発明は、CD45+単球-マクロファージ、CD45+リンパ球、特にCD45+ナチュラルキラー細胞（NK細胞）、これらの細胞型のいずれかの前駆体、好ましくはMDSC、および／またはCD45+顆粒球、（「CD45+白血球細胞」）、またはそれらの前駆体、 好ましくは、細胞内に１以上の鉄結合タンパク質と薬学的に活性な物質、標識または薬学的に活性な物質と標識との複合体を含むMDSCを含む、単離された標的化送達系に関連する。
第二の態様において本発明は、好ましくは１以上の標識、好ましくは放射性標識またはそれらのコンジュゲートおよび組合せを含む、好ましくは標識され得るCD45+白血球細胞を含む、単離された標的送達標識系に関連する。
第三の態様において本発明は、以下の工程：
ａ） 精製された鉄結合タンパク質を提供すること、
ｂ） 薬学的に活性な物質、標識または薬学的に活性な物質と標識を共有結合的または非共有結合的に連結し、および／または、薬学的に活性な物質、標識または薬学的に活性な物質と標識を鉄結合タンパク質中に封入すること、
ｃ） CD45+白血球細胞を提供すること、および
ｄ１） 鉄結合タンパク質と、工程ｂ）で産生された薬学的に活性な物質、標識または薬学的に活性な物質と標識の複合体がCD45+白血球細胞に少なくとも部分的に負荷されるまで、工程ｂ）で産生した鉄結合タンパク質の存在下でCD45+白血球細胞をインキュベートすること、および／または
ｄ２） CD45+白血球細胞が少なくとも部分的に標識で標識されるまで、標識の存在下でCD45+白血球細胞をインキュベートすること
を含む、請求項１～２５の単離された標的化送達系の作製方法に関する。
第四の態様において本発明は、本発明の第一の態様または第二の態様の単離された標的化送達系または医薬品もしくは診断薬として使用するための本発明の第三の態様の方法によって生産可能な単離された標的化送達系に関連する。
第五の態様において本発明は、本発明の第一の態様または第二の態様の単離された標的化送達系または本発明の第三の態様の方法によって生産可能な単離された標的化送達系と薬学的に許容される担体および／または適切な賦形剤を含む医薬組成物または診断組成物に関する。
第六の態様において本発明は、本発明の第一の態様または第二の態様の単離された標的化送達系または 疾患組織内の低酸素領域および／または酸化ストレス領域；腫瘍、好ましくは固形腫瘍および／またはその転移、好ましくは乳がん、膵臓がん、膀胱がん、肺がん、大腸がん、または、低酸素領域を有する腫瘍、炎症性疾患、炎症性組織、好ましくは炎症性関節または関節炎、炎症を起こした肺、炎症を起こした腸、または他の炎症を起こした組織；リンパ節、好ましくは炎症を起こしたリンパ節、または好ましくは感染中、癌または自己免疫疾患の間だけでなく病気中に発生する他の非生理学的リンパ節；または虚血領域、特に皮膚創傷または臓器梗塞（心臓）または虚血性網膜の後の虚血領域によって特徴づけられる疾患の予防、治療もしくは診断に使用するための、または予防的または治療的ワクチン接種のための、特に感染性疾患または癌を予防または治療するための本発明の第三の態様の方法によって生産可能な単離された標的化送達系に関連する。この態様は個々にワクチン接種するため、または免疫記憶を誘導するための、生理学的または非生理学的リンパ節への抗原をも含む。
好ましい態様の詳細な説明
以下に本発明を詳細に記載する前に、本発明は、本明細書に記載された特定の方法論、プロトコールおよび試薬には限定されず、異なる場合があることを理解されたい。本明細書で使用する用語は、特定の態様のみを説明するためのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定するものではないことも理解されたい。他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
以下、本発明の要素について記載する。これらの要素は特定の態様と共に列挙されるが、態様を追加するために任意の方法および任意の数を組み合わせられることを理解されたい。様々に記載された実施例および好ましい態様は、本発明を明示的に記載された態様のみに限定すると解釈されるべきではない。本明細書は、明示的に記載された態様を任意の数の開示されたおよび／または好ましい要素と組み合わせる態様をサポートし包含すると理解すべきである。さらに、本出願に記載された全ての要素の任意の順列および組み合わせは、文脈が別のことを示さない限り、本出願の記載によって開示されると考えられるべきである。
本明細書の本文中にはいくつかの文献が引用されている。本明細書に引用された各文献（すべての特許、特許出願、科学刊行物、製造業者の説明書、指示書などを含む）は、上記または下記のいずれかにかかわらず、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書中いかなる場合も、本発明が先行発明による開示よりも先行する資格がないことを認めるものとして解釈されるものではない。
定義
本発明を実施するために、他に示さない限り、本分野の文献に説明されている化学、生化学、および組換えDNA技術の従来の方法（例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrookら eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989）が用いられる。
本明細書および添付の特許請求の範囲を通じて、文脈が他を必要としない限り、「含む」という単語および「含む」および「含む」などの変形は、記載された整数またはステップまたは整数またはステップのグループを含むが、他の整数またはステップまたは整数またはステップのグループを除外するものではないことを意味する。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される単数形「a」、「an」および「the」は、その文脈において明確に指示がない限り、複数の指示対象を含む。
用語「標的化された薬学的に活性な物質送達」は、その患者の身体の他の領域と比較した場合、身体の特定の領域における薬学的に活性な物質の濃度の増加をもたらす、薬学的に活性な物質の患者への送達をいう。好ましくは、相対濃度は、身体の疾患領域と、血液循環へ同様のアクセスを有する身体の他の領域との間で比較される。好ましい態様において、所与の数の細胞における薬学的に活性な物質の濃度または患部からの所与の生検体積は、本発明の標的化された薬学的に活性な物質送達系を投与後、好ましくは2～24時間後の非疾患領域からの同一の細胞数または生検体積と比較して、少なくとも10％高い。より好ましくは、患者の体の疾患領域における薬学的に活性な物質の濃度は、本発明の標的化された薬学的に活性な物質送達系の投与後、好ましくは2～24時間後の身体の非疾患領域よりも、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも100％、少なくとも150％、少なくとも200％、少なくとも250％、少なくとも300％、少なくとも350％、少なくとも400％、少なくとも450％、少なくとも500％、より好ましくは少なくとも1000％高い。全身分布に基づいて評価する場合、患者に投与される薬学的に活性な物質の少なくとも5％、好ましくは少なくとも10％、より好ましくは少なくとも15％が身体の患部に送達されることが好ましい。薬学的に活性な物質の標的化された送達では、薬学的に活性な物質の潜在的な有害な作用は身体の患部に限定される。
用語「標的化された標識送達」または「標的化された造影剤送達」は、患者の身体の他の領域と比較した場合、身体の特定の領域における標識、特に造影剤の濃度の増加をもたらす、標識、特に造影剤の患者または診断をされる人への送達をいう。
好ましくは、相対濃度は、身体の疾患領域と、血液循環に同様のアクセスを有する身体の他の領域との間で比較される。好ましい態様において、所与の細胞数または疾患領域由来の所与の生検体積における標識、特に造影剤の濃度は、本発明の標的化送達系の投与後、好ましくは1～24時間後の非疾患領域からの同一の細胞数または生検体積と比較した場合、少なくとも10％高い。より好ましくは、標識の濃度、特に患者の体の疾患領域における造影剤の濃度は、本発明の標的化送達系の投与後、好ましくは2～24時間後の身体の非罹患領域よりも、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70 少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも100％、少なくとも150％、少なくとも200％、少なくとも250％、少なくとも300％、少なくとも350％、少なくとも400％、少なくとも450％、少なくとも500％、より好ましくは少なくとも1000％高い。全身体分布に基づいて評価する場合、標識、特に患者または診断される人に投与される造影剤の少なくとも5％、好ましくは少なくとも10 ％、より好ましくは少なくとも15％は、身体の疾患領域に送達されることが好ましい。標識、特に造影剤の標的化送達は、標識、特に造影剤の身体の疾患領域への潜在的に有害な影響を制限する。
用語「標的化された治療診断（theragnostic）送達」は、「標的化された薬学的に活性な物質」および「標的化標識送達」に関する上記のものと同様の意味を有するが、薬学的に活性な物質または標識を送達するだけではなく、この態様では、鉄結合タンパク質の複合体が薬学的に活性な物質および標識の両方を含み、それにより、薬学的に活性な物質および標識の両方を同時に送達することを可能にする。
本願において、用語「標的化された薬学的に活性な物質の送達系」は、薬学的に活性な物質を標的領域、すなわち、患者の体内で標的送達が可能である領域、好ましくは疾患領域に送達することができる系をいうために使用される。
本願において用語「標的化された標識送達系」は、可能な標的領域、すなわち患者の体内、好ましくは疾患領域に標識を送達することができる、標的化送達ができる系をいうために使用される。
本願において用語「標的化された治療診断送達系」は、薬学的に活性な物質の複合体を、患者の体内、好ましくは疾患領域に送達することができ、そのことにより同時の治療および診断および／または治療のモニタリングが可能となる、同時に標的領域に標識を送達することができる系をいうために使用される。
用語「標的化送達系」は、「標的化された薬学的に活性な物質送達系」、「標的化された標識送達系」および「標的化された治療診断（theragnostic）送達系」と共通するものをいうために使用される。
本明細書において「薬学的に活性な物質」は、細胞活性、好ましくは患者の疾患を引き起こす細胞活性を改変または調節する物質をいうために使用される。この用語は、既に薬学的に活性であるか、または活性化され得る物質、すなわちプロドラッグの両方を包含する。そのような薬学的に活性な物質の例には、いわゆる（ｉ）「小分子」、（ｉｉ）ポリヌクレオチドおよび（ｉｉｉ）ペプチドまたはタンパク質が含まれる。本願において用語「小分子」は、分子量が1.500g/mol未満の炭化水素または薬学的に活性な放射性同位体をいうために使用される。好ましくは、薬物は、抗癌剤、薬学的に活性な放射性同位体またはフェリハイドライトを含み使用することができる。
本発明に関して使用される用語「プロドラッグ」は、投与後に代謝され、または他の方法で生物学的に活性な、または少なくとも１つの特性に関してより有効な成分（または薬物）に変換される任意の活性成分をいう。薬物と比較して、プロドラッグは、薬物に対して相対的に活性が低いかまたは不活性になるように化学的に修飾されるが、化学修飾は、対応する薬物が、プロドラッグが患者に投与された後代謝または他の生物学的プロセスによって生成される薬物に対応するようなものである。プロドラッグは、例えば、活性薬物に対して、変化した代謝安定性または輸送特性、より少ない副作用またはより低い毒性、または改善された風味を有してよい(例えば、 文献Nogrady, 1985, Medicinal ChemistryABiochemical Approach, Oxford University Press, New York, pages 388-392を参照のこと、参照により本明細書に組み込まれる)。プロドラッグは、対応する薬物以外の反応物を用いて合成することができる。
用語「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書では交換可能に使用され、ヌクレオチドモノマーから作製されるポリマーまたはオリゴマーの高分子として理解される。ヌクレオチドモノマーは、核酸塩基、５炭素糖（リボースまたは2'-デオキシリボースなどであるが、これに限定されない）および1～3個のリン酸基から構成される。典型的には、ポリヌクレオチドは、個々のヌクレオチドモノマー間のホスホジエステル結合を介して形成される。本発明に関して言及される核酸分子は、これに限定されるものではないが、リボ核酸（RNA）、デオキシリボ核酸（DNA）、およびその混合物、例えばRNA-DNAハイブリッドを含む。核酸は、例えば、 ホスホトリエステル法に従って化学的に合成することができる（例えば、Uhlmann, E. & Peyman, A. (1990) Chemical Reviews, 90, 543-584を参照）。「アプタマー」は、ポリペプチドに高親和性で結合する核酸である。アプタマーは異なる一本鎖RNA分子の大きなプールからSELEmir146-a のような方法での選択により単離できる(例えば、Jayasena (1999) Clin. Chem., 45,1628-50；Klug and Famulok (1994) M. Mol. Biol. Rep., 20,97-107； US 5,582,981を参照) 。アプタマーは、鏡像体形態、例えばL-リボヌクレオチドとして合成および選択することもできる (Nolteら (1996) Nat. Biotechnol., 14, 1116-9；Klussmannら (1996) Nat. Biotechnol., 14, 1112-5)。このようにして単離された形態は、天然に存在するリボヌクレアーゼによって分解されず、したがってより大きな安定性を有するという利点を有する。
本発明に関する用語「ペプチド」または「ポリペプチド」は相互入れ替え可能に使用され、ペプチド結合によって連結された少なくとも２つのアミノ酸の鎖をいう。従って、本発明に関して使用される用語「ペプチド」は、50個を超えるアミノ酸、100個を超えるアミノ酸または150個を超えるアミノ酸を有するアミノ酸鎖をいうためにも使用される。
本発明に関して使用される用語「抗体」は免疫グロブリンスーパーファミリーに属する糖タンパク質をいう。用語抗体および免疫グロブリンはしばしば交換可能に使用される。抗体は、形質細胞によって産生されたタンパク質分子をいい、細菌やウイルスなどの異物を同定中和するために免疫系によって使用される。抗体は外来標的の独特な部分、その抗原を認識する。
本明細書で使用される用語「抗体断片」は、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１以上の断片をいう。用語「抗体断片」に包含される結合断片の例としては、抗原結合断片（Fab）、Fab’断片、F（ab’）2断片、重鎖抗体、単一ドメイン抗体（sdAb）、一本鎖可変断片（scFv）、可変断片（Fv ）、VHドメイン、VLドメイン、単一ドメイン抗体、ナノボディ、IgNAR（免疫グロブリン新規抗原受容体）、di-scFv、二重特異性T細胞エンゲージャー（BITE）、二重親和性再ターゲティング（DART ）分子、三重体、二重特異性抗体、一本鎖二重特異性抗体、代替裏打ちタンパク質（alternativescaffoldprotein）およびそれらの融合タンパク質を含む。
本明細書で使用される用語「二重特異性抗体」は、異なる抗原に結合し得る融合タンパク質または二価抗体をいう。二重特異性抗体は、抗体の断片、すなわち可変断片を含む２つの単一タンパク質鎖から構成される。二重特異性抗体は、同じポリペプチド鎖（VH-VLまたはVL-VH）上の軽鎖可変ドメイン（VL）に連結された重鎖可変ドメイン（VH）を含む。２つの可変ドメインを連結する短いペプチドを使用することにより、該ドメインは別の鎖の相補的ドメインと対になるように強制され、したがって２つの抗原結合部位を作り出す。二重特異性抗体は、同一（単一特異性）または異なる抗原（二重特異性）を標的とすることができる。
「単一ドメイン抗体」とは、抗体の単一の単量体可変ドメインからなる抗体断片をいう。単純に、それらは、ラクダ科動物または軟骨魚によって産生される重鎖抗体の単量体重鎖可変領域を含むのみである。これらの異なる起源のため、これらはVHHまたはVNAR（可変性新規抗原受容体）断片ともいう。あるいは、単一ドメイン抗体は、遺伝子工学の使用による従来のマウスまたはヒト抗体の可変ドメインの単量体化によって得ることができる。それらは、約12～15kDaの分子量を示し、従って、抗原認識が可能な最小の抗体断片である。さらなる例には、ナノボディまたはナノ抗体が含まれる。
本明細書において使用される用語「抗体模倣体」は、抗体と同様に抗原に特異的に結合することができるが、抗体と構造的に関連しない化合物をいう。通常、抗体模倣物は、抗原に特異的に結合する１つ、２つまたはそれ以上の露出ドメインを含む約3～20kDaの分子量を有する人工のペプチドまたはタンパク質である。例としては、とりわけ、LACI-D1（リポタンパク質関連凝固阻害剤）；アフィリン、例えば、ヒトγ-B結晶またはヒトユビキチン；シスタチン；スルフォロブスアシドカルダリウス（Sulfolobusacidocaldarius）由来のSac7D; リポカリンおよびリポカリン由来のアンチカリン；DARPins（設計されたアンキリンリピートドメイン）；FynのSH3ドメイン；プロテアーゼ阻害剤のKunitsドメイン；モノボディー、例えば、フィブロネクチンの10番目のタイプIIIドメイン；アドネクチン(adnectin)：ノッチン(knottin)（システインノットミニタンパク質）；アトリマー(atrimer); エビボディ(evibody)、例えば、 CTLA4ベースの結合剤、アフィボディ、例えば、 スタフィロコッカス アウレウス（Staphylococcusaureus）由来のプロテインＡのＺドメイン由来の３ヘリックスバンドル；トランスボディー、例えば、ヒトトランスフェリン；テトラネクチン、例えば、単量体または三量体のヒトＣ型レクチンドメイン；ミクロボディ、例えば、 トリプシン阻害剤-II；アフィリン；アルマジロリピートタンパク質を含む。核酸および小分子は時に抗体模倣物（アプタマー）と考えられるが、人工抗体、抗体断片およびこれらから構成される融合タンパク質ではない。抗体に対して共通する利点は、よりよい溶解性、組織浸透、熱および酵素に対する安定性、および比較的低い生産コストである。
用語「抗原」は、少なくとも１つのエピトープ、好ましくはＢ細胞またはＴ細胞応答またはＢ細胞およびＴ細胞応答を誘発するエピトープを含む物質、好ましくは免疫原性ペプチドをいうために使用される。
抗原決定基としても知られる「エピトープ」は、物質の一部、例えば免疫系によって認識される免疫原性ポリペプチドである。好ましくは、この認識は、問題のエピトープへの抗体、B細胞またはT細胞の結合によって媒介される。本明細書において、用語「結合」は好ましくは特異的結合に関する。エピトープは、通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面群からなり、通常、特異的な三次元構造特性ならびに特異的な電荷特性を有する。用語「エピトープ」は、立体構造および非立体構造エピトープの両方を含む。立体構造および非立体構造エピトープは、変性溶媒の存在下で前者への結合が後者ではなく失われる点で区別される。
特定の態様において、本発明に係る免疫原性ポリペプチドは、好ましくはウイルス、細菌、原虫からなる群から選択される病原体に由来する。しかしながら、本発明の別の態様において、免疫原性ポリペプチドは、腫瘍抗原、すなわち癌によって特異的に発現されるポリペプチドまたはポリペプチドの断片である。
用語「配列同一性」は、ポリペプチド配列およびヌクレオチド配列の比較に関して本明細書を通じて使用される。２つの配列が比較され、配列同一性パーセンテージが計算される基準配列が比較において特定されない場合、別段の指示がない限り、配列同一性は、比較されるべき２つの配列のうちより長いものを基準として計算される。基準配列が示されている場合、配列同一性は、別段の指示がない限り、配列番号で示される基準配列の全長に基づいて決定される。例えば、基準の300アミノ酸長のポリペプチド配列と比較される200アミノ酸からなるポリペプチド配列は、66.6％（200/300）の配列同一性の最大パーセンテージを示してよく、長さ150アミノ酸の配列の場合は、50％（150/300）の配列同一性の最大パーセントを示してよい。150アミノ酸のうち15アミノ酸が300アミノ酸長の基準配列のそれぞれのアミノ酸と異なる場合、配列同一性のレベルは45％に低下する。ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の類似性、すなわち配列同一性のパーセンテージは、配列アライメントを介して決定することができる。そのようなアライメントは、いくつかの当技術分野で知られているアルゴリズム、好ましくはKarlin and Altschulの数学的アルゴリズム (Karlin&Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877)、hmmalign (HMMER package, http://hmmer.wustl.edu/) または、CLUSTALアルゴリズム (Thompson, J. D., Higgins,D.G. & Gibson, T. J. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 4673-80)で実施することができ、例えば、下記で利用可能である：
http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/ またはhttp://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html またはonhttp://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_clustalw.html.好ましいパラメーターはhttp://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/ またはhttp://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.htmlに設定されているデフォルトのパラメーターが使用される。配列同一性（配列一致）の程度は例えばBLAST、BLATまたはBlastZ(または BlastX)を使用して計算してよい。BLASTタンパク検索は、BLASTPプログラム、スコア= 50、語長= 3で実施する。比較目的のためのギャップのあるアライメントを得るために、Altschulら (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402に記載されているGapped BLASTを利用する。BLASTおよびGapped BLASTプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメーターが使用される。配列一致分析は、Shuffle-LAGAN (Brudno M., Bioinformatics 2003b, 19 Suppl 1:I54-I62)やマルコフ確率場のような確立された相同性マッピング技術によって補完してよい。配列データベース検索からの情報、３Ｄ構造およびユーザ定義の制約を有する利用可能な相同配列を使用して（Pei J、Grishin NV：PROMALS：towards accurate multiple sequence alignments of distantly related proteins.Bioinformatics 2007、23：802-808；3DCoffee@ igs：配列と構造を複数の配列アライメントに結合するためのWebサーバー；Poirot O, Suhre K, Abergel C, O'Toole E, Notredame C. NucleicAcidsRes. 2004 Jul 1;32:W37-40）、複数のタンパク質配列および／または構造のための構造ベースアライメントを使用してもよい。本願において配列同一性のパーセンテージが参照される場合、特に示さない限り、これらのパーセンテージは、より長い配列の全長に関して計算される。
本発明に関して使用される用語「標識」は、診断目的に適した任意の種類の化合物をいう。好ましい化合物は、蛍光色素、放射性同位体および造影剤から選択される。造影剤は、体内の異常な領域を示すのに役立つ染料または他の物質である。１つの態様において用語標識は二価または三価の金属カチオンと錯体を形成するキレート剤を含む化合物をいう。好ましい放射性同位体／蛍光発光同位体は、アルファ線放射同位体、ガンマ線放射同位体、オージェ電子放射同位体、Ｘ線放射同位体、蛍光同位体、例えば65Tb蛍光放射同位体、例えば、18F、 51Cr、67Ga、68Ga、111In、99mTc、140La、175Yb、153Sm、166Ho、88Y、89Zr、90Y、149Pm、177Lu、47Sc、142Pr、159Gd、212Bi、72As、72Se、97Ru、109Pd、105Rh、101m15Rh、119Sb、128Ba、123I、124I、131I、197Hg、211At、169Eu、203Pb、212Pb、64Cu、67Cu、188Re、186Re、198Au および 199Ag結合体、そのような同位体を含む化合物、および上記のタンパク質、ペプチド、小分子阻害剤、抗体または他の化合物との組み合わせ、例えば18Fフルオロデオキシグルコース（18F -FDG）、89Zr -オキシドまたは64Cu -ポルフィリンからなる群から選択される。好ましい蛍光色素は、以下の種類の色素から選択される：キサンテン（例えばフルオレセイン）、アクリジン（例えばアクリジンイエロー）、オキサジン（例えばオキサジン１）、シニン（例えばCy7／Cy3）、スチリル色素（例えば色素-28）、クマリン（例えばAlexa Fluor 350）、ポルフィン（例えばクロロフィルII B）、金属リガンド複合体（例えばPtOEPK）、蛍光タンパク質（例えばAPC、R-フィコエリトリン）、ナノ結晶（例えばQuantumDot 705）、ペリレン（例えばLumogen Red F300）およびフタロシアニン（例えばIRDYE（商標） 700DX）並びに結合体およびこれらの種類の色素または蛍光性の65Tb発光の組み合わせ。好ましい造影剤は、常磁性剤、例えば、 Gd、Eu、WおよびMnであり、好ましくはキレート剤と複合体を形成したものから選択される。さらなる選択肢は、超常磁性鉄（Fe）錯体および粒子、原子番号の高い原子を含む化合物、すなわちコンピュータ断層撮影（CT）用のヨウ素、マイクロバブルおよびこれらの造影剤を含むリポソームなどの担体である。
本発明に関して使用される用語「白血球」は、感染性疾患および外来性感染の両方から身体を保護することに関する免疫系の細胞をいうために使用される。全ての白血球は、造血幹細胞として知られる骨髄中の多分化能細胞から産生され由来する。白血球は、血液およびリンパ系を含む体全体に見出される。すべての白血球は、核を有し、他の血液細胞、無核赤血球（RBC）および血小板と区別される。白血球の種類は標準的な方法で分類することができる。最も広いカテゴリーの２つの対は、構造（顆粒球または無顆粒球）または細胞分裂系統（骨髄細胞またはリンパ球）によってそれらを分類する。これらの最も広いカテゴリーは、５つの主なタイプにさらに分けることができる：好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球および単球。これらのタイプは、その物理的および機能的特性によって区別される。単球および好中球は貪食性である。さらにサブタイプに分類される；例えばリンパ球にはＢ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞がある。顆粒球は、それらの核の形状（分葉対丸、すなわち多形核対単核）およびそれらの細胞質顆粒（存在または不在、またはより正確には、光学顕微鏡で可視または不可視）によって無顆粒球と区別される。その他の二分法は系統である：骨髄細胞（好中球、単球、好酸球および好塩基球）は、造血系統（細胞分化系統）によってリンパ系細胞（リンパ球）と区別される。
本発明者らは、CD45+発現が本発明の標的化送達系に関して使用するのに適している白血球細胞の亜集団、すなわち、単球、単球マクロファージ、リンパ球、顆粒球、NK細胞の特徴であることを観察した。特に、CD45+白血球細胞は、体内の特定の組織および細胞に引き付けられ、１つまたは複数の鉄結合タンパク質および１つまたは複数の薬学的に活性な物質、標識または薬学的に活性な物質と標識の複合体を細胞に送達することができる。白血球のこの亜集団は、以下「CD45+白血球細胞」または「CD45+白血球」という。好ましくは、単球は樹状細胞ではなく、分化は以下の転写因子の１つ以上によって制御される：IFN調節因子8（IRF8）、核因子インターロイキン（IL）-3調節タンパク質（NFIL3）、塩基性ロイシンジッパー転写因子ATF様3（BATF3）または転写因子RelB（NF-KBサブユニット）-RELB、Spi-1プロトオンコジーン（PU/1）、組換え結合タンパク質サプレッサーオブヘアレス（RBPJ）、IFN調節因子4（IRF4）または転写因子E2-2（TCF4としても知られる）。
クローン起源でない限り、上記で定義されたCD45+白血球細胞は、CD45+表面抗原を発現する共通の特性を共有する異なる白血球の混合集団であることが当業者に理解される。すなわち、上記で定義されたCD45+白血球細胞の多様な群内の細胞の亜集団は、さらなる機能的および／または構造的特徴によって本明細書を通して特徴付けられる。用語「CD45+」は、細胞集団内の大多数の細胞または本質的にすべての細胞がCD45+表面抗原を発現することを示す。この明細書において、他の細胞表面抗原に関しても、用語「発現する」は、表面抗原が細胞内で産生され、細胞の表面上に検出可能に曝されることを示す。従って発現レベル、および細胞の表面上に検出可能に露出される表面抗原の数は、異なる白血球の間で大きく変化し得る。一般に、表面抗原の少なくとも5コピー、好ましくは少なくとも10コピーが細胞の表面上に検出可能に露出されている場合、細胞表面抗原については陽性であるとみなされ、すなわち「+」と示される。当業者は、所与の細胞表面抗原について陽性（または陰性）である細胞を検出、定量および選択する方法をよく知っている。好ましい方法としては、蛍光活性化細胞選別（FACS）が含まれる。この技術では、蛍光標識された抗体を使用して細胞集団の細胞表面抗原に結合させ、続いて細胞を単一細胞に単離し、単一細胞について測定した蛍光強度に基づいて、所与の細胞表面に対して陽性または陰性であると特徴付ける。本発明のいくつかの態様において、所与のタンパク質の発現が高いか低いかが示される。しかしながら、これは、タンパク質が両方の場合において検出可能に発現され、すなわち異なるレベルで「+」であることを意味する。高発現および低発現はそれぞれ、異なるタンパク質の細胞あたりのタンパク質の絶対数が異なることを意味する。したがって、所与のタンパク質は、細胞当たり500を超える検出可能なコピー数のタンパク質が存在する場合には高レベルで発現し、細胞あたり1～50の検出可能なコピーが存在する場合には低レベルで発現されると考えてよい。しかしながら、1つの細胞あたり1～500の検出可能なコピーが存在する場合、5000を超える検出可能なコピーが存在して低レベルで発現する場合、別のタンパク質が高レベルで発現すると考えてよい。フローサイトメトリーおよびBecton Dickinson Quantibrite（商標）ビーズ法(例えばPannu,K.K., 2001, Cytometry. 2001 Dec 1;45(4):250-8を参照)または質量分析 (例えばMilo,R., 2013, Bioessays, 35(12): 1050-1055を参照)を用いて、細胞において発現または産生されるタンパク質の数を定量する方法が当業者に周知である。本発明の目的のため、所与のタンパク質の「高発現」という用語は、見出された最も高い発現レベル、すなわち、健常なCD45+細胞の集団における細胞あたりのコピー数の少なくとも70％のタンパク質の検出可能な発現をいう。所与のタンパク質の「低発現」という用語は、健常なCD45+白血球の集団における、見出された最も高い発現レベル、すなわち細胞あたりのそのタンパク質のコピー数の30％以下のそのタンパク質の検出可能な発現をいう。好ましくは、「最高発現レベル」は、異なる対象の健常なCD45+白血球において見出される最も高い発現レベルの平均として決定される。いくつかの好ましい態様において、細胞の亜集団は、所与のタンパク質を「産生」することを特徴とする。これは、タンパク質が細胞の表面上で必ずしも検出可能ではなく、細胞内にのみ存在する可能性があることを意味すると理解される。当業者は、細胞内のタンパク質の産生を検出および／または定量する方法および／またはこのようなタンパク質を産生する細胞を選択する方法を十分に認識している。あるいは、細胞集団は、特異的な転写因子の発現によって定義することができる。ある細胞の集団または単一の細胞においてさえ、所与のタンパク質またはそれをコードするmRNAの発現をどのようにして決定するかは、本技術分野において周知であり、例えば、インビボでの抗体の標識、FISHアッセイ、インビボでの単一分子蛍光顕微鏡(Crawford, R.ら Biophys J. (2013) 105(11): 2439)を単独または蛍光活性化細胞選別（FACS）またはPrimeFlow技術(eBioscience), (Adam S. Venableら(2015) Methods inMolecular Biology)と組み合わせて使用する。
用語 「分化した単球」は、主に骨髄に存在するが（脾臓にも存在する可能性もある）マクロファージ-DC前駆体（MDP）と名付けられた運命決定された前駆体から分化した単球をいい、 樹状細胞かマクロファージのいずれかに分化する。マウスでは２つの主な亜集団からなる：（ｉ）CX3CR1を高発現しCCR2および Ly6C-を低発現するCD11b+細胞および（ｉｉ）CX3CR1を低発現し、CCR2およびLy6C+を高発現するCD11b+細胞。骨髄を離れた後、マウスLy6 C+単球は、循環中のLy6C-単球に分化する。同様に、ヒト単球分化において、CD14++古典的単球は骨髄を離れ、CD14++CD16+中間体単球に分化し、末梢血循環においてCD14+CD16++非古典的単球に順次分化することが認められている(Yangら2014; Biomark Res 2(1)doi.10.1186/2050-7771-2-1)。好ましくは分化した単球は樹状細胞ではなく、分化は以下の転写因子の１つ以上によって制御され、より好ましくは樹状細胞ではない： IRF8、NFIL3、BATF3、 RELB、PU/1、RBPJ、IIRF4、および／またはTCF4。
マクロファージは、循環末梢血単球（PBM）とは区別される、組織常在プロフェッショナル食細胞および抗原提示細胞（APC）である。用語「活性化マクロファージ」は、極性化されたあらゆるマクロファージをいうために本発明に関して使用される。マクロファージ活性化は、一般に、インターロイキン、サイトカインおよび／または成長因子とのインキュベーションによって達成される。特にIL-4およびM-CSFは活性化剤として使用することができる。異なる表現型の活性化マクロファージは、M1-マクロファージ、古典的に活性化されたマクロファージ（CAM）およびM2-マクロファージ、選択的活性化マクロファージ（AAM）に分類される。古典的に活性化されたM1-マクロファージは、急性炎症表現型を有する免疫エフェクター細胞を含む。これらは細菌に対して非常に攻撃的であり、大量のリンホカインを産生する(Murray, and Wynn, 2011, J Leukoc Biol, 89(4):557-63) 。選択的活性化抗炎症性M2-マクロファージは、少なくとも3つの亜集団に分けることができる。これらのサブタイプは、免疫の調節、寛容の維持および組織修復／創傷治癒を含む様々な異なる機能を有する。用語「M1誘導因子」は、PBMのM1型のマクロファージへの分化を指向する化合物をいうために本発明に関して使用される。用語「M2誘導因子」は、PBMのM2型のマクロファージへの分化を指向する化合物をいうために本発明に関して使用される。当業者は、M1またはM2マクロファージのいずれかへの分化を促進する多数の方法を認識している。
用語「マクロファージによる食作用」は、マクロファージが固体粒子を包み込んでファゴソームとして知られる内部小胞を形成するプロセスである。
用語「鉄結合タンパク質」は、鉄イオンと非共有結合するタンパク質をいう。そのようなタンパク質の例は、フェリチン、ヘモグロビン、トランスフェリンおよびラクトフェリンを含む。鉄結合タンパク質は、これらのタンパク質の細胞内への内在化を促進する細胞表面受容体によって結合される。
本発明の第一の態様では細胞内に１つ以上の鉄結合タンパク質の錯体および薬学的に活性な物質、標識または薬学的に活性な物質と標識を含む、CD45+単球、CD45+単球マクロファージ、CD45+リンパ球、CD45+ NK細胞および／またはCD45+顆粒球（以下、「CD45+白血球細胞」という）を含む単離された標的化送達系に関する。好ましくは、CD45+単球は 樹状細胞ではなく、以下の転写因子：IRF8、NFIL3、BATF3、RELB、PU/1、RBPJ、IIRF4および／またはTCF4のうちの１つまたは複数によって分化が制御され、より好ましくは、樹状細胞ではない。
驚くべきことに、本発明者らによってCD45+白血球細胞、好ましくは活性化マクロファージ、好ましくはM1マクロファージ、より好ましくはM2マクロファージは、薬学的に活性な物質、標識または薬学的に活性な物質と標識を獲得し、薬学的に活性な物質、標識または薬学的に活性な物質と標識を（ｉ）撮像システムを使用して検出され、身体内のそれらの位置を追跡するために使用されるのに十分な量で送達することが見出された。18F -FDGの場合、これは単球および活性化単球、マクロファージ、活性化マクロファージ、好ましくはM1マクロファージ、および最も好ましくはM2マクロファージの場合に特に好適であった。標識（18F-FDG、89Zr -酸化物）、好ましくは放射性標識で負荷された細胞の投与は、好ましくは陽電子放射断層撮影法（PET）画像化による標識細胞の蓄積を伴う器官の視覚化、（ii）予防または治療効果の誘発または同時に疾患の治療および診断を可能にすることができる。
本発明の第二の態様はCD45+白血球細胞を含む単離された標的標識送達系であって、好ましくは1つまたは複数の標識、好ましくは放射性標識またはそれらの結合体および組合せで標識され得るものに関連する。本発明の第二の態様の好ましい態様としては、細胞は標識に直接リンクされるか、標識で標識される。標識は、前記セル内またはその表面にあってもよいが、好ましくは細胞の表面上にある。
以下の好ましい態様は、それぞれ本発明の第一および第二のそれぞれの態様の両方をさらに特定する。
所与のCD45+白血球細胞または細胞集団が鉄結合タンパク質を内在化する能力は、この内部移行プロセスに関与する受容体の発現に依存する。フェリチンの内在化をもたらす受容体は、例えば、 TfR、CXCR4、CD163、およびTIM-2を含む。当業者は、鉄結合タンパク質の取り込み量をどのように測定するかを十分に認識しており、取り込みを測定する好ましい方法は、以下の実施例の節に記載されている。本発明者らは、CD45+白血球細胞の亜集団は、ある鉄結合タンパク質を別の鉄結合タンパク質よりも内在化する特定の傾向を有し、したがって、より高い複合体濃度を達成することができ、および／または細胞からの複合体の漏出が少なくできることについて指摘する。このようなCD45+白血球亜集団は、以下でより詳細に記載される。
本発明に関して使用される用語「１つまたは複数の鉄結合タンパク質および薬学的に活性な物質、標識または薬学的に活性な物質と標識との複合体」は、薬学的に活性な物質、標識または薬学的に活性な物質と標識の１つまたは複数の分子が、１つまたは複数の鉄結合タンパク質に共有結合的にまたは非共有結合的に結合している組成物をいう。１つまたは複数の鉄結合タンパク質と１つまたは複数の薬学的に活性な物質、標識または薬学的に活性な物質と標識との間の共有結合または非共有結合は、直接的または間接的であり得る。後者の場合、薬学的に活性な物質、標識または薬学的に活性な物質と標識は、リンカーまたはスペーサーを介して鉄結合タンパク質に連結される。リンカーまたはスペーサーは、例えば、ポリアラニン、ポリグリシン、炭水化物、(CH2)n基またはポリペプチドリンカーのように、当業者に知られている。したがって、当業者は、それぞれの用途に応じて、それぞれの適切なリンカーまたはスペーサーを選択することができるであろう。鉄結合タンパク質が、例えば、フェリチンのようなケージを形成する場合、用語「複合体」以上に、タンパク質と活性化合物との間に共有結合または非共有結合がない場合でも、ケージ内の薬学的に活性な物質、標識または薬学的に活性な物質と標識の封入をも包含する。複合体の形成は、細胞が鉄結合タンパク質を内部移行している場合に、薬学的に活性な物質、標識または薬学的に活性な物質と標識の細胞への輸送を可能にする。したがって、薬学的に活性な物質、標識または薬学的に活性な物質と標識は、輸送メカニズムを妨げないように鉄結合タンパク質に結合することが好ましい。これは当業者に公知の取り込みアッセイを用いて容易に試験することができ、以下の実施例の節で記載する。複合体は、細胞内の体内の標的領域への輸送に耐えるのに十分に安定であることが好ましい。したがって、薬学的に活性な物質、標識または薬学的に活性な物質と標識ではなく、複合体を細胞または標的領域の細胞に送達することが好ましい。この特性はまた、可能性のある有害な影響、例えば薬学的に活性な物質、標識または薬学的に活性な物質と標識のCD45+白血球細胞に対する細胞毒性を低減する。薬学的に活性な物質、標識または薬学的に活性な物質と標識が鉄結合タンパク質に共有結合している場合、そのような結合は、好ましくは、細胞の鉄結合タンパク質の取り込みに必要な細胞受容体への結合に関与しない表面領域に位置することが知られているアミノ酸残基を介する。本発明に関して使用される鉄結合タンパク質は、広範囲の様々な薬学的に活性な物質、標識、または薬学的に活性な物質と標識と安定して非共有結合した複合体を形成することができる。薬学的に活性な物質または標識がペプチド、例えば、抗原性ペプチドである場合、鉄結合タンパク質からの該ペプチドの放出は鉄結合タンパク質ペプチド融合タンパク質全体のエンドソーム処理を必要とするため、抗原性ペプチドは鉄結合タンパク質との融合体として発現しないことが好ましい。
複合体を負荷した細胞が患者にとって自己のものであるような場合に、CD45+白血球細胞は治療される患者に由来するものである。患者は、本発明の標的化送達での治療前にMHCが分類され、所与の患者に使用される白血球細胞型は、患者のMHCに適合していることも想定される。これらの２つの好ましい態様において、CD45+白血球細胞は、初代細胞であるか、または初代細胞から少ない回数の分化段階によって誘導される。あるいは、CD45+白血球細胞は、不死化されているが、好ましくは形質転換されていないCD45+白血球細胞株由来のものであってよい。したがって、CD45+白血球細胞、すなわちCD45+単球、CD45+単球マクロファージ、CD45+顆粒球、またはCD45 +リンパ球、特にCD45+ NK細胞に使用される血液は、好ましくは、治療される患者または健康なドナーから得られる。あるいは、血液バンクから血液を得ることができる。本明細書では、臍帯血の使用も考慮する。
CD34+造血前駆細胞から産生されるCD45+白血球細胞の亜集団は、薬学的に活性な物質、標識または薬学的に活性な物質と標識の標的特異的送達に特に適していることを本発明者らは言及する。すなわち、標的化送達系を産生するために使用される白血球は、CD34+造血前駆細胞に由来することが好ましい。当業者は、CD34+造血前駆細胞を選択する方法およびそのような細胞を白血球に分化させる方法を十分に認識している。
上述の通り、用語「CD45+白血球細胞」は、本明細書を通して、CD45+単球、CD45+単球マクロファージ、CD45+リンパ球および／またはCD45+をいうために使用される。好ましくは、単球は樹状細胞ではなく、分化は以下の転写因子の１つ以上によって制御される：IRF8、NFIL3、BATF3、RELB、PU/1、RBPJ、IIRF4、および／またはTCF4、また、好ましくは単球は樹状細胞ではない。これらの一般的なカテゴリーの白血球における好ましい亜集団は、構造パラメーター、例えば、所与のタンパク質の存在または非存在、機能的特性および／またはその産生／分化の方法に依存する。上記に概説したように、本発明の標的化送達系は、細胞の集団において、その集団内の細胞の大部分がその特性を有する限り、すべての細胞が特定の特性を有さないものではない場合、上述した利点をなお提供する。したがって、以下では、本発明の標的化送達系の１つの好ましい細胞の特性が記載される。当業者であれば、本発明の医薬組成物は何百万もの細胞を含み、集団内のすべての細胞が本明細書に概説された機能的および／または構造的特性を有するわけではないが、大部分の細胞がそれぞれの機能的および／または構造的性質を共有する場合、疾患の治療に使用され得ることがわかる。
本発明者らは、CD45+白血球細胞の亜集団が一般的な複合体の取り込みの効率および／または量、細胞内で複合体を保持する能力、すなわち、薬学的に活性な物質、標識または薬学的に活性な物質と標識の漏出および標的放出の回避、特定の鉄結合タンパク質の取り込み効率および／または特定の組織または細胞への標的化、およびこのように特定の疾患を治療または寛解するのに適していることを含む特に有利な特性を有することを認識した。本発明者らは、例えば、以下の抗原の１つ以上を発現するCD45+白血球細胞を観察した：他の鉄結合タンパク質の取り込みよりもフェリチンの取り込みを優先するCD204、CD206、CD200R、CCR2。したがって、複合体中の鉄結合タンパク質がフェリチンである場合、以下の抗原：CD204、CD206、CD200R、CCR2の１つ以上を発現するCD45+白血球細胞を選択することが好ましい。
すなわち、本発明の好ましい態様において、
(i) 単球は、CD11b+単球であり、好ましくは、CD11b+CD14+単球、CD11b+CD16+単球、CD11b+ CD14+CD16+単球、CD11b+ CD14+MHCII+単球、CD11b+ CD14+CD115+単球、CD11b+ CD114+単球、CD11b+CD116+単球、CD11b+CCR1+単球、CD11b+ CCR2+単球、CD11b+CX3CR+単球、CD11b+CXR4+単球、CD11b+ CXR6+単球およびCD11b+CD14+ CD33+単球からなる群から選択され、
好ましくは単球はIRF8、NFIL3、BATF3、RELB、PU/1、RBPJ、IIRF4、および／またはTCF4のうちの１つ以上の転写因子によって分化が制御される樹状細胞ではなく、および、より好ましくは単球は樹状細胞ではない、
(ii) M-CSF分化した単球または単球マクロファージは、M-CSFによって分化し、 マクロファージ、活性化マクロファージ、好ましくはCD11 b+マクロファージ、より好ましくはCD11b+ CD16+マクロファージ、CD11b+CD32+マクロファージ、CD11b+ CD64+マクロファージ、CD11b+CD68+マクロファージ、好ましくは、CD11b+ CD86+M1マクロファージ、好ましくは誘導性酸化窒素合成酵素（inducible nitric oxidesynthetase：iNOS）を産生するマクロファージ、および／または分泌性インターロイキン12（IL-12）を産生するマクロファージまたは好ましくはCD11b+ CCR2+ M2マクロファージ、CD11b+ CD204+ M2マクロファージ、CD11b+ CD206+ M2マクロファージ、CD11b+ CD204+ CD206+ M2マクロファージ、CD11b+主要組織適合性複合体II+（MHC II+）（低発現または高発現）M2マクロファージ、CD11b+ CD200R+ M2マクロファージ、CD11b+ CD163+ M2マクロファージ、またはアルギナーゼ-1および／またはインターロイキン10（IL-10）を産生および／または分泌する活性化マクロファージからなる群から選択され、好ましくは、分化した単球は、レクチン様酸化低密度リポタンパク質受容体-1 (Lox1+)、C-X-Cケモカインレセプタータイプ7（CXCR7+）および核因子（赤血球由来2）様2（NRF2+）を発現する泡沫細胞ではない。泡沫細胞は、低密度リポタンパク質を摂取し、脂質を負荷して泡沫の外観を与える血管壁の脂肪性沈着物に局在する一種のマクロファージである。これらの細胞は、プラーク増殖に関与する種々の物質を分泌し、その死により炎症が促進され、それにより心血管疾患に寄与する、
(iii) 単球マクロファージまたは活性化単球マクロファージはM-CSFによって分化され、好ましくは少なくとも1つのケモカイン受容体であって、好ましくはCCR1、CCR2、CXCR4、およびCXCR6からなる群から選択されるケモカイン受容体、または少なくとも１つの増殖因子受容体であって、好ましくはマクロファージコロニー刺激因子受容体（CD115）、顆粒球コロニー刺激因子受容体（CD114）、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子受容体（CD116およびCD131からなる）からなる群から選択される増殖因子受容体を発現する。これらの特徴の単球は、炎症状態および癌を治療するのに特に適している、
(iv) リンパ球は、CD3+およびCD4+ またはCD8+ Tリンパ球、またはCD19+、CD20+、CD21+、CD19+ CD20+、CD19+ CD21+、CD20+CD21+、もしくはCD19+ CD20+CD21+ Bリンパ球、またはナチュラルキラー（NK）細胞であって、好ましくはNK細胞はCD56+でありCD3を発現しない細胞、または、CD16+CD56+、CD56+CD94+、CD56+CD158a+、CD56+CD158f+、CD56+CD314+、CD56+CD335+細胞からなる群から選択される、または
(v) 顆粒球は、好中球、好ましくはCD66 b+好中球、好酸球および好塩基球、好ましくはCD193+好酸球からなる群より選択される。
本発明の標的化送達系の好ましい態様の１つにおいて、
活性化マクロファージは：
(i) 単球またはマクロファージまたはそれらの前駆体を、マクロファージ上の発現マーカーを変更することができる因子でインビトロでインキュベートすることによって産生され得るものであり、好ましくは
(a) 少なくとも１つのM1誘導因子で
(b) 少なくとも１つのM2誘導因子で
(c) またはサイトカイン、好ましくはIL-10およびIL-12、ケモカインを分泌する能力、および/またはiNOS、アルギナーゼまたは他の免疫調節酵素を産生する能力を変化させることができる因子で；そのような因子の例としては：活性化血小板、IL-4、IL-10、IL-13、抗原と抗体の免疫複合体、IgG、熱活性化ガンマグロブリン、グルココルチコステロイド、腫瘍成長因子-β（TGF-β）、IL-1R、CC- ケモカインリガンド2（CCL-2）、IL-6、マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（PPARγ）アゴニスト、白血球阻害因子（LIF）、アデノシン、蠕虫および真菌感染症、リポ多糖類（LPS）、インターフェロンγ（INF-γ）、ウイルスおよび細菌感染症が挙げられる；この点に関し、M1誘導因子、特にLPSによる単球の活性化は、細胞にiNOSを発現させ、M1誘導因子、特にLPSによる単球の活性化はアルギナーゼ-1を発現しない細胞を誘導し、M2誘導因子、特にIL-4による単球の活性化は細胞にアルギナーゼ-1を発現させ、およびM2誘導因子、特にIL-4での単球の活性化は細胞にiNOSを発現しないようすることが観察された、
(ii) 以下の抗原：CD64、CD86、CD16、CD32、MHCIIの高発現、および／またはiNOSおよび／またはIL-12の産生の少なくとも１つの発現を特徴とする、
(iii) マクロファージの貪食能を誘導することができる因子、例えば、IL-18、オプソニン（例えば、iC3b、免疫グロブリンGなどの補体由来タンパク質）、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（CGRP）、リポ多糖（LPS）、インターフェロンγ（INF-γ）、ウイルス感染および／または細菌感染との単球またはマクロファージのインビトロインキュベーションによって産生される、
(iv) 以下の抗原の少なくとも１つの発現によって特徴づけられる：CD204、CD206、CD200R；CCR2、トランスフェリン受容体 (TfR)、CXC-モチーフケモカイン受容体4 (CXCR4)、CD163、および／またはＴ細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン2(TIM-2)、および／またはMHCIIの低発現を示す；これらの特性を有する活性化マクロファージは、鉄結合タンパク質としてフェリチンを含む複合体に特に適している、
(v) 貪食する能力を有する；および／または
(vi) サイトカイン分泌、好ましくはIL-12もしくはIL-10、または誘導型一酸化窒素合成酵素（iNOS）（もしくは他の前炎症性化合物）、アルギナーゼまたは他の免疫抑制性／抗炎症性化合物の産生が可能である。
本発明の標的化送達系の１つの好ましい態様において、マクロファージをM1マクロファージに分化させるためのM1誘導因子は、リポ多糖（LPS）、インターフェロンγ（INF-γ）、ならびにウイルス感染症および細菌感染症からなる群から選択され、マクロファージをM2マクロファージに分化させるためのM2誘導因子は、IL-4、IL-10、IL-13、抗原と抗体の免疫複合体、IgG、熱活性化γ-グロブリン、糖質コルチコイド、腫瘍増殖因子－β（TGF-β）、IL-1R、CC-ケモカインリガンド2 （ＣＣＬ－２）、ＩＬ－６、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ）アゴニスト、白血球阻害因子（ＬＩＦ）、アデノシン、蠕虫および真菌感染からなる群から選択される。
本発明者らは驚くべきことに、複合体を負荷したＭ１マクロファージおよびＭ２マクロファージは両方とも、低酸素組織、好ましくは腫瘍またはその転移への標的化活性化剤の送達に適していることを発見した。一般的に、投与されたＭ１マクロファージの３～５％が腫瘍部位に局在し、一方で、Ｍ２マクロファージの約３５％が腫瘍特異的標的化を示すことを我々は観察した。しかしながら、ヘモグロビンおよび薬物を含む複合体を使用する場合、Ｍ２マクロファージよりも有意に大量のこの複合体をＭ１マクロファージは負荷することができるので、Ｍ２マクロファージのこの一般的な利点は相殺された。一般にこの特異的な向性は、Ｍ２マクロファージを腫瘍および低酸素組織を特徴とする疾患を治療するためにより適したものにする。
本発明者らはCCL-2活性化マクロファージ（骨髄由来）が特にリンパ節、好ましくは炎症リンパ節を標的化するのに適していることも見出した。したがって、このようなマクロファージの使用は、リンパ節の標的化が望まれる全ての用途において、特に予防的または治療的ワクチン接種ならびに炎症性リンパ節の診断のために好ましい。すなわち、CCL2活性化マクロファージに鉄結合タンパク質と抗原の複合体を負荷することが好ましい。
本発明の標的化送達系の１つの好ましい態様において、
単球マクロファージは、
(i) CD34+造血前駆細胞から産生される、
(ii) 少なくとも１つの誘導因子、好ましくはＭ１またはＭ２誘導因子、より好ましくは少なくとも１つのＭ２誘導因子と単球をインビトロでインキュベートすることによって産生できる、
(iii) 以下の抗原のうち少なくとも１つの発現によって特徴付けられる：TfR、CD163、TIM-2、CD14、CD16、CD33、および／またはCD115、
(iv) 以下の抗原のうち少なくとも１つの発現によって特徴付けられる：TfR、CD163、TIM-2、CXCR4、CD14、および／またはCD16、および／または
(v) 貪食作用する能力を有する、および／または
(vi) 分化が以下の転写因子のうちの１つ以上によって制御される樹状細胞ではない：IRF8、NFIL3、BATF3またはRELB、PU/1、RBPJ、IRF4またはTCF4。
本発明の標的化送達系の態様において、単球-マクロファージ細胞を分化させるためのＭ１誘導因子は、ＬＰＳ、INF-γまたはウイルス感染もしくは細菌感染からなる群から選択される、または単球を分化させるためのＭ２誘導因子は、IL-4、IL-10、IL-13、抗原と抗体の免疫複合体、ＩｇＧ、熱活性化ガンマ－グロブリン、糖質コルチコイド、TGF-β、IL-1R、CCL-2、IL-6、M-CSF、PPARγアゴニスト、白血球抑制因子（LIF）、癌馴化培地、癌細胞、アデノシンおよび蠕虫または真菌感染からなる群から選択される。
驚くべきことに本発明者らによって、単球は、低酸素組織、好ましくは腫瘍またはその転移への標的化活性化剤の送達に適しており、一方で、Ｍ２活性化剤で処理された単球は、低酸素組織、好ましくは腫瘍またはその転移への標的化活性化剤の送達にさらに適していることが見出された。この特異的な向性は、単球をＭ２活性化剤で処理したものを、腫瘍および低酸素部位、例えば、炎症部位を標的化するのにより適したものにする。
本発明の標的化送達系の１つの好ましい態様において、
リンパ球は：
(i) 血液、脾臓、または骨髄から入手可能であるか、または当業者に知られているように、および、例えば、LefortおよびKim, 2010, J Vis Exp 40: 2017；Tassone andFidler, 2012, Methods in Molecular Biology 882: 351-357；Kouroら2005, Current Protocols in Immunology,66:F22F.1:22F.1.1-22F.1.9.にも記載されているように、CD34+前駆細胞から生産可能である、
(ii) 免疫学的に能力のあるリンパ球である、
(iii) 抗原特異的Ｔ細胞受容体を発現する、および／または
(iv) 以下の抗原のうち少なくとも1つの発現によって特徴付けられる： (a) CD3 および CD4 またはCD8、または (b): CD19、CD20、CD21、CD19 CD20、CD19CD21、CD20CD21、またはCD19 CD20CD21 抗原、および好ましくは免疫グロブリンを産生可能である。
１つの特に好ましい態様において、CD45+リンパ球はＮＫ細胞であって、それは、
(i) 血液、脾臓または骨髄から得ることが可能であるか、またはCD34+前駆細胞から産生可能であるか、および／または
(ii) CD3発現の欠失および以下のCD56+および／またはCD94+、CD158a+ CD158f+CD314+CD335+の少なくとも１つの発現によって特徴づけられる。
本発明の標的化送達系の１つの好ましい態様において、
顆粒球は：
(i) 血液、脾臓または骨髄から得ることが可能であるか、または、例えば、Kuhsら 2015, Curr Protoc Immunol111:7.23-1-7.23.16; Coqueryら 2012, Cytometry A 81(9):806-814; Swemydas および Lionakis 2013, J Vis Exp 77:50586.に記載されているとおりCD34+前駆細胞から生産可能である、
(ii) 以下のCD66bおよび／またはCD193少なくとも１つの発現によって特徴づけられる、
(iii) その細胞質中に顆粒が存在することを特徴とする多形核白血球である、および／または
(iv) 以下のTfR、CD163、TIM-2、および／またはCXCR4の少なくとも１つの発現によって特徴づけられる。
本発明の標的化送達系の１つの好ましい態様において、鉄結合タンパク質は、フェリチン、好ましくは重（Ｈ）型フェリチン、軽（Ｌ）フェリチンおよび／またはミトコンドリアフェリチン；ヘモグロビン、好ましくはヘモグロビンＡ、ヘモグロビンＡＳ、ヘモグロビンＳＣ、ヘモグロビンＣ、ヘモグロビンＤ、ヘモグロビンＥ、ヘモグロビンＦ、ヘモグロビンＨ；ヘモグロビン-ハプトグロビン複合体、ヘモペキシン、トランスフェリン；およびラクトフェリンからなる群から選択される。用語フェリチン；ヘモグロビン、好ましくはヘモグロビンＡ、ヘモグロビンＡＳ、ヘモグロビンＳＣ、ヘモグロビンＣ、ヘモグロビンＤ、ヘモグロビンＥ、ヘモグロビンＦ、ヘモグロビンＨ；ヘモグロビン-ハプトグロビン複合体、ヘモペキシン、トランスフェリン；およびラクトフェリンは、天然に存在するタンパク質の構造変異体を包含し、したがってそれぞれの野生型タンパク質の少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも１００％の鉄イオンを結合するための能力を有するタンパク質に関する。本発明に関して使用される鉄結合タンパク質は、好ましくは哺乳動物、より好ましくはマウス、ラット、イヌ、類人猿、特にチンパンジー、またはヒト、最も好ましくはヒト起源のものである。本発明に関して使用される好ましい鉄結合タンパク質のコンセンサス配列は、以下の図１に示される。好ましい構造変異体は、図１に示される配列に基づいている。Ｘで印を付けた残基は、異なる哺乳動物フェリチン、トランスフェリン、およびヘモグロビンの間で異なる。これらの残基の変化は、タンパク質が鉄イオンに結合する能力にとって重要ではない。すなわち、アミノ酸の突然変異または欠失は、Ｘで印を付けた残基の１つ以上に影響を与えることが好ましい。
血漿タンパク質は癌治療における活性医薬成分の送達のための常に特権的な担体である。したがって、最も豊富な血漿タンパク質であるアルブミンは、タキサン分子およびドキソルビシン誘導体の送達のための治療プロトコールにおいて現在使用されている(Larsen MTら 2016, Mol Cell Ther 27;4:3)。
ヒトトランスフェリンおよびフェリチンタンパク質は、癌細胞を特異的に標的とするための小分子または毒素結合体の送達のための有効な担体と考えられてきた。今日まで、多大な努力にもかかわらず、成功したトランスフェリンまたはフェリチン薬物複合体は臨床段階に到達していない(Luck ANら 2013, Adv DrugDelivRev65(8):1012-9)。
フェリチンは、ケージ構造および鉄結合能を有し、これを用いて薬学的に活性な物質および／またはその空洞内に標識を封入するために使用することができる。フェリチンは豊富な血漿ではないが、大腸菌細胞のような一般的なタンパク質発現ベクター中の組換えタンパク質として高収率で容易に産生され得る。フェリチンのＨ鎖またはＬ鎖は、直径８ｎｍの空洞を画定する、２４ｍｅｒのケージ様構造に組み立てることが可能な小タンパク質モノマー（Ｈ鎖およびＬ鎖それぞれ２１ｋＤａおよび１９ｋＤａ）としてコードされる。本発明に関して、Ｈ－フェリチンホモポリマーが、TfRを発現するCD45+白血球細胞にカプセル化薬物を特異的に送達するために好ましいタンパク質構築物を代表することに本発明者らは注目した。さらに、Ｈ－フェリチンは、薬学的に活性な物質、標識、または薬学的に活性な物質と標識の複合体を細胞核に標的化する（したがって、DNA結合タンパク質を核に直接送達する）。
精製トランスフェリンは、細胞内に適切に放出される共有結合リンカーを介して抗癌薬を含む様々な分子に効率的に結合することができる(Beyer Uら 1998, J Med Chem41(15):2701-2708).トランスフェリンの場合、タンパク質表面上のリジン基のみが共有結合に利用可能である。
ヘモグロビンは、薬物との化学的結合体におけるその汎用性、その豊富さおよび血中での相対的安定性のために、過去において可能性のある薬物担体と考えられてきた(Somatogen, 1993, WO1993008842 A1)。それにもかかわらず、受容体標的化特性の欠如が、代用血液または抗鎌状化剤以外の生物医学的用途を発展させなかった。実際のところ、Ｈｂはの白血球（特に単球-マクロファージ起源）上のＣＤ１６３（ハプトグロビン／ヘモグロビン受容体）エピトープによってのみ認識され得る。本願に記載されているCD45+白血球、特にマクロファージベースのタンパク質送達は、薬学的に活性な物質および／または標識の標的特異的担体としてヘモグロビンを中心的立場に動かした。ヘモグロビンは、ヘム結合ポケット内で適切な薬学的に活性な物質および／または標識、宿主の疎水性の薬学的に活性な物質および／または標識に容易に共有結合させることができ、または小分子、例えば、ヘム鉄に結合した細胞毒性分子を輸送することさえできる。Ｈｂは、タンパク質表面上の唯一の滴定可能なシステインであるベータ９３システイン残基への適切な薬物結合体の選択的結合によって容易に修飾することができる。チューブリン阻害剤モノメチルアウリスタチン（ＭＭＡＥ）またはＤＮＡ架橋剤ピロロベンゾジアゼピン二量体（ＰＢＤ）などのマレイミド官能化薬物は、関連するシスベータ９３残基に容易かつ特異的に結合することができる極めて強力な細胞傷害剤の最も顕著な例である。
あるいは、Ｈｂ表面上のリジン残基（Ｈｂ四量体あたり少なくとも１０個の滴定可能なリジン残基）は、切断可能なスクシンイミドリンカーを介した薬物結合体を容易に受けやすいかもしれない。ヘモグロビンはまた、酸性ｐＨ値で非共有結合ヘム基を放出するという独特の能力を提供する。このように得られるアポヘモグロビンは、パクリタキセルの場合に示されるように(Meng Zら 2015 J Pharm Sci 104(3):1045-55)、または蛍光特性を有する標識の場合に示されるように(Dong J ら J Photochem Photobiol B2014,140:163-172)、空のヘムポケット内にいくつかの疎水性分子を収容することができる。
共役／吸着／結合方法がどのようなものであっても、ヘモグロビン（Ｈｂ）、トランスフェリン（Ｔｆ）およびフェリチンは、一旦腫瘍標的化特性、例えば活性化マクロファージを有する適切な細胞系に負荷されると、薬学的に活性な物質および標識の特権的な担体であることが本発明者によって示された。これらのタンパク質の簡単で、速く、安くそして安全な精製手順はまた、途方もない付加価値を提供する。
哺乳動物のＨ型フェリチン、Ｌ型フェリチン、ヘモグロビンアルファ鎖、ヘモグロビンベータ鎖およびトランスフェリンの配列に基づいて、これらのタンパク質のそれぞれについてコンセンサス配列を決定した。これらは、図１の配列番号２、７、９、１４、１６、２０、および２５にそれぞれ示されている。これに基づくが先行技術において開示された欠失および構造分析にも基づき、ＣＤ４５＋白血球による取り込みに十分なＨ型フェリチン、Ｌ型フェリチン、ヘモグロビンアルファ鎖およびヘモグロビンベータ鎖について最小断片が決定された。これらは配列番号１、３、５（Ｈ型フェリチン）；配列番号８、１０、１２（Ｌ型フェリチン）；配列番号１５および１７（ヘモグロビンアルファ鎖）および配列番号１９および２１（ヘモグロビンベータ鎖）に示される。１００～４５０アミノ酸、好ましくは１５０～４００アミノ酸、より好ましくは２００～３５０アミノ酸、より好ましくは２５０～３２０アミノ酸離れて配置される１つのポリペプチド中に含まれる場合、トランスフェリンは鉄を結合しＣＤ４５＋白血球による取り込みに必要なＮ末端に位置するドメインとＣ末端に位置するドメインを含む。Ｎ末端ドメインは、全長コンセンサストランスフェリン（配列番号２５）または全長ヒトトランスフェリン（配列番号２８）のアミノ酸１～８２を含む。Ｃ末端ドメインは、全長コンセンサストランスフェリン（配列番号２５）または全長ヒトトランスフェリン（配列番号２８）のアミノ酸３９６～５１０を含む。各場合において、Ｘは、それが独立して任意のアミノ酸を表し、そして哺乳動物Ｈ型フェリチン間で保存されていないか、またはほとんど保存されていないアミノ酸を特徴付けるコンセンサス配列で示され、それぞれの鉄結合タンパク質の鉄結合特性を損なうことなく、またはほとんど損なうことなく変異させることができる。各場合において、Ｘは、Ｘと整列するそれぞれのヒト鉄結合タンパク質のアミノ酸の意味をもつことが好ましい。この情報は、例えば、コンセンサス配列とヒト場合によってマウスのタンパク質とのアラインメントを示す図１から、取得することができる。
好ましいＨ型フェリチンは、配列番号１に示されるアミノ酸配列および少なくとも７０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも７５％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも８０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも８５％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するその変異体を含むかまたはからなり、いずれの場合にも、配列番号１のアミノ酸配列からなるＨ型フェリチンがＣＤ４５＋白血球、好ましくはＭ２白血球によって取り込まれる能力の少なくとも７０％である。配列番号１のうち、５位のＸは存在してもしなくてもよく、存在する場合、それは任意のアミノ酸を意味し、好ましくはＩｌｅを意味し、６位のＸは任意のアミノ酸、好ましくはＡｓｎを意味し、１４位のＸは任意のアミノ酸、好ましくはＴｙｒを意味し、２４位のＸは任意のアミノ酸、好ましくはＴｙｒまたはＣｙｓを意味し、６６位のＸは任意のアミノ酸、好ましくはＰｈｅを意味し、６８位のＸは任意のアミノ酸、好ましくはＧｌｎを意味し、７５位のＸは任意のアミノ酸、好ましくはＡｒｇまたはＣｙｓを意味し、９０位のＸは任意のアミノ酸、好ましくはＨｉｓを意味し、９４位のＸは任意のアミノ酸、好ましくはＳｅｒまたはＡｓｎを意味し、位置１２０のＸは存在しても存在しなくてもよく、存在する場合それは任意のアミノ酸、好ましくはＨｉｓまたはＴｙｒを意味し、より好ましくはＨｉｓを意味し、位置１２３のＸは任意のアミノ酸、好ましくはＡｓｎまたはＳｅｒ、より好ましくはＡｓｎを意味し、位置１２８のＸは任意のアミノ酸、好ましくはＡｌａまたはＳｅｒ、より好ましくはＡｌａを意味する。
１つの好ましい態様において、Ｈ型フェリチンは、配列番号３のマウスフェリチンを含むかまたはからなる。すなわち、好ましい構造変異体は少なくとも７０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも７５％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも８０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも８５％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有し、および、各場合において、配列番号３のアミノ酸配列からなるＨ型フェリチンがＣＤ４５＋白血球、好ましくはＭ２マクロファージによって取り込まれる能力の少なくとも７０％である。
１つの好ましい態様において、Ｈ型フェリチンは、配列番号５のヒトフェリチンを含むかまたはからなる。すなわち、好ましい構造変異体は少なくとも７０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも７５％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも８０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも８５％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有し、および、各場合において、配列番号５のアミノ酸配列からなるＨ型フェリチンがＣＤ４５＋白血球、好ましくはＭ２マクロファージによって取り込まれる能力の少なくとも７０％である。
１つの好ましい態様において、Ｈ型フェリチンは、配列番号２または７、好ましくは配列番号２の全長Ｈ型フェリチンを整列させることから誘導される哺乳動物コンセンサス配列を含むかまたはからなる。すなわち、好ましい構造変異体は、少なくとも７０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも７５％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも８０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも８５％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有し、かつ、各場合において、配列番号２または７、好ましくは配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＨ型フェリチンがＣＤ４５＋白血球、好ましくはＭ２マクロファージによって取り込まれる能力の少なくとも７０％である。配列番号２において、６位のＸは任意の天然アミノ酸、好ましくはＰｒｏであってよく、１４位のＸは任意の天然アミノ酸、好ましくはＨｉｓであってよく、１６位のＸは任意の天然アミノ酸、好ましくはＡｓｐであってよく、２１位のＸは存在しても存在しなくてもよく、存在する場合は任意のアミノ酸、好ましくはＩｌｅを意味し、２２位のＸは任意のアミノ酸、好ましくはＡｓｎを意味し、３０位のＸは任意の天然アミノ酸、好ましくはＴｙｒであってよく、４０位のＸは任意の天然アミノ酸、好ましくはＴｙｒまたはＣｙｓであってよく、より好ましくはＴｙｒであってよく、８２位のＸは任意の天然アミノ酸、好ましくはＰｈｅであってよく、８４位のＸは任意の天然アミノ酸、好ましくはＧｌｎであってよく、９１位のＸは任意の天然アミノ酸、好ましくはＡｒｇまたはＣｙｓであってよく、より好ましくはＣｙｓであってよく、１０６位のＸは任意の天然アミノ酸、好ましくはＨｉｓであってよく、１１０位のＸは任意の天然アミノ酸、好ましくはＡｓｎまたはＳｅｒであってよく、より好ましくはＡｓｎであってよく、１３７位のＸは任意の天然アミノ酸、好ましくはＨｉｓまたはＴｙｒであってよく、より好ましくはＨｉｓであってよく、１４０位のＸは任意の天然アミノ酸、好ましくはＡｓｎまたはＳｅｒであってよく、より好ましくはＡｓｎであってよく、１４５位のＸは任意の天然アミノ酸、好ましくはＡｌａまたはＳｅｒであってよく、より好ましくはＡｌａであってよく、１６４位のＸは任意の天然アミノ酸、好ましくはＡｌａまたはＳｅｒであってよく、より好ましくはＳｅｒであってよく。１６６位のＸは任意の天然アミノ酸、好ましくはＭｅｔまたはＬｅｕであってよく、好ましくはＬｅｕであってよく、１７８位のＸは任意の天然アミノ酸、好ましくはＡｓｐまたはＨｉｓであってよく、より好ましくはＡｓｐであってよく、１８１位のＸは存在しないかまたは任意の天然アミノ酸、好ましくはＡｓｎであってよく、１８２位のＸは存在しないかまたは任意の天然アミノ酸、好ましくはＧｌｕであってよく、１８３位のＸは存在しないかまたは任意の天然アミノ酸、好ましくはＳｅｒである。配列番号７において、６位のＸは任意の天然アミノ酸、好ましくはＰｒｏであってよく、１４位のＸは任意の天然アミノ酸、好ましくはＨｉｓであってよく、１６位のＸは任意の天然アミノ酸、好ましくはＡｓｐであってよく、２１位のＸは存在しても存在しなくてもよく、存在する場合は任意のアミノ酸、好ましくはＩｌｅを意味し、２９位のＸは任意の天然アミノ酸、好ましくはＴｙｒであってよく、８１位のＸは任意の天然アミノ酸、好ましくはＰｈｅであってよく、８３位のＸは任意の天然アミノ酸、好ましくはＧｌｎであってよく、１０５位のＸは任意の天然アミノ酸、好ましくはＨｉｓであってよく、１４４位のＸは任意の天然アミノ酸、好ましくはＡｌａまたはＳｅｒであってよく、より好ましくはＡｌａであってよく、１８０位のＸは存在しないかまたは任意の天然アミノ酸、好ましくはＡｓｎ、１８１位のＸは存在しないかまたは任意の天然アミノ酸、好ましくはＧｌｕ、１８２位のＸは存在しないかまたは任意の天然アミノ酸、好ましくはＳｅｒである。
１つの好ましい態様において、Ｈ型フェリチンは、配列番号４のマウス全長フェリチンを含むかまたはからなるのが好ましい。すなわち、好ましい構造変異体は、少なくとも７０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも７５％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも８０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも８５％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有し、かつ、各場合において、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるマウスＨ型フェリチンがＣＤ４５＋白血球、好ましくはＭ２マクロファージによって取り込まれる能力の少なくとも７０％である。
１つの好ましい態様において、Ｈ型フェリチンは、配列番号６のヒト全長フェリチンを含むかまたはからなるのが好ましい。すなわち、好ましい構造変異体は、少なくとも７０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも７５％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも８０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも８５％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有し、かつ、各場合において、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるヒトＨ型フェリチンがＣＤ４５＋白血球、好ましくはＭ２マクロファージによって取り込まれる能力の少なくとも７０％である。
好ましくはＬ型フェリチンは、配列番号８に示されるアミノ酸配列を含むかまたはからなり、その変異体は、少なくとも７０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも７５％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも８０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも８５％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有し、かつ、各場合において、配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるＬ型フェリチンがＣＤ４５＋白血球、好ましくはＭ２マクロファージによって取り込まれる能力の少なくとも７０％である。配列番号８において、５位のＸは任意の天然アミノ酸、好ましくはＡｓｐまたはＧｌｕであってよく、より好ましくはＡｓｐであってよく、１２位のＸは任意の天然アミノ酸、好ましくはＡｒｇまたはＳｅｒであってよく、さらに好ましくはＳｅｒであってよく、１７位のＸは任意の天然アミノ酸、好ましくはＳｅｒまたはＡｒｇであってよく、より好ましくはＳｅｒであってよく、１９位のＸは任意の天然アミノ酸、好ましくはＡｒｇまたはＧｌｎであってよく、より好ましくはＧｌｎであってよく、２９位のＸは任意の天然アミノ酸であってよく、好ましくはＰｈｅであってよく、３０位のＸは、任意の天然アミノ酸、好ましくはＴｙｒまたはＰｈｅであってよく、より好ましくはＴｙｒであってよく、４２位のＸは、任意の天然アミノ酸、好ましくはＳｅｒまたはＧｌｙであってよく、より好ましくはＳｅｒであってよく、５６位のＸは、任意の天然アミノ酸、好ましくはＡｌａまたはＴｙｒであってよく、より好ましくはＴｙｒであってよく、６１位のＸは任意の天然アミノ酸、好ましくはＧｌｕまたはＬｙｓであってよく、より好ましくはＬｙｓであってよく、６２位のＸは任意の天然アミノ酸、好ましくはＭｅｔまたはＰｈｅであってよく、さらに好ましくはＭｅｔであってよく、６５位のＸは任意の天然アミノ酸であってよく、好ましくはＡｓｐまたはＧｌｎであってよく、より好ましくはＧｌｎであってよく、７５位のＸは任意の天然アミノ酸、好ましくはＩｌｅまたはＶａｌであってよく、より好ましくはＩｌｅであって、７６位のＸは任意の天然アミノ酸、好ましくはＬｙｓまたはｇｌｎであってよく、より好ましくはＬｙｓであってよく、７９位のＸは任意の天然アミノ酸であってよく、好ましくはＡｌａまたはＳｅｒであってよく、より好ましくはＡｌａであってよく、８０位のＸは任意の天然アミノ酸、好ましくはＧｌｕまたはＧｌｎであってよく、より好ましくはＧｌｎであってよく、８７位のＸは任意の天然アミノ酸、好ましくはＰｒｏまたはＧｌｎであってよく、さらに好ましくはＰｒｏであってよく、８８位のＸは任意の天然アミノ酸であってよく、好ましくはＧｌｕまたはＡｓｐであってよく、より好ましくはＡｓｐであってよく、９１位のＸは任意の天然アミノ酸、好ましくはＧｌｕまたはＬｙｓであってよく、より好ましくはＬｙｓであってよく、９４位のＸは任意の天然アミノ酸、好ましくはＭｅｔまたはＬｅｕであってよく、より好ましくはＬｅｕであってよく、９６位のＸは任意の天然アミノ酸であってよく、好ましくはＭｅｔまたはＬｅｕであってよく、より好ましくはＭｅｔであってよく、９９位のＸは任意の天然アミノ酸、好ましくはＬｙｓまたはＡｓｎであってよく、好ましくはＬｙｓであってよく、１１５位のＸは任意の天然アミノ酸、好ましくはＴｈｒまたはＡｌａであってよく、より好ましくはＴｈｒであってよく、１１９位のＸは任意の天然アミノ酸であってよく、好ましくはＬｅｕであってよく、１２５位のＸは任意の天然アミノ酸、好ましくはＳｅｒまたはＴｈｒであってよく、より好ましくはＴｈｒであってよく、１２７位のＸは任意の天然アミノ酸、好ましくはＴｙｒまたはＰｈｅであってよく、より好ましくはＰｈｅであってよく、１３０位のＸは任意の天然アミノ酸であってよく、好ましくはＬｙｓまたはＧｌｕであってよく、より好ましくはＧｌｕであってよく、１４０位のＸは任意の天然アミノ酸、好ましくはＡｓｐまたはＡｓｎであってよく、より好ましくはＡｓｐであってよく、１４６位のＸは任意の天然アミノ酸、好ましくはＡｒｇまたはＨｉｓであってよく、さらに好ましくはＨｉｓであってよく、１４８位のＸは任意の天然アミノ酸であってよく、好ましくはＬｅｕまたはＶａｌであってよく、より好ましくはＬｅｕであってよい。
１つの好ましい態様において、Ｌ型フェリチンは、配列番号１０のマウスＬ型フェリチンを含むかまたはからなる。すなわち、好ましい構造変異体は、少なくとも７０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも７５％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも８０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも８５％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有し、かつ、各場合において、配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなるＬ型フェリチンがＣＤ４５＋白血球、好ましくはＭ２マクロファージによって取り込まれる能力の少なくとも７０％である。
１つの好ましい態様において、Ｌ型フェリチンは、配列番号１２のヒトＬ型フェリチンを含むかまたはからなる。すなわち、好ましい構造変異体は、少なくとも７０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも７５％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも８０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも８５％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有し、かつ、各場合において、配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるＬ型フェリチンがＣＤ４５＋白血球、好ましくはＭ２マクロファージによって取り込まれる能力の少なくとも７０％である。
１つの好ましい態様において、Ｌ型フェリチンは、配列番号９または１４、好ましくは配列番号９の全長Ｌ型フェリチンを整列させることから誘導される哺乳動物コンセンサス配列を含むかまたはからなる。すなわち、好ましい構造変異体は、少なくとも７０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも７５％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも８０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも８５％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有し、かつ、各場合において、配列番号９または１４、好ましくは配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるＬ型フェリチンがＣＤ４５＋白血球、好ましくはＭ２マクロファージによって取り込まれる能力の少なくとも７０％である。配列番号９において、１２位のＸは任意の天然アミノ酸、好ましくはＡｓｐまたはＧｌｕであってよく、より好ましくはＡｓｐであってよく、１９位のＸは任意の天然アミノ酸、好ましくはＳｅｒまたはＡｒｇであってよく、より好ましくはＳｅｒであってよく、２４位のＸは任意の天然アミノ酸、好ましくはＳｅｒまたはＡｒｇであってよく、より好ましくはＳｅｒであってよく、２６位のＸは任意の天然アミノ酸、好ましくはＡｒｇまたはＧｌｎであってよく、より好ましくはＧｌｎであってよく、３６位のＸは任意の天然アミノ酸、好ましくはＰｈｅであってよく、３７位のＸは任意の天然アミノ酸、好ましくはＴｙｒまたはＰｈｅであってよく、より好ましくはＴｙｒであってよく、４７位のＸは任意の天然アミノ酸、好ましくはＳｅｒまたはＧｌｙであってよく、より好ましくはＳｅｒであってよく、位置６３のＸは任意の天然アミノ酸、好ましくはＡｌａまたはＴｙｒであってよく、より好ましくはＴｙｒであってよく、位置６８のＸは任意の天然アミノ酸、好ましくはＧｌｕまたはＬｙｓであってよく、より好ましくはＬｙｓであってよく、６９位のＸは任意の天然アミノ酸、好ましくはＭｅｔまたはＰｈｅであってよく、より好ましくはＭｅｔであってよく、７２位のＸは任意の天然アミノ酸、好ましくはＡｓｐまたはＧｌｎであってよく、より好ましくはＧｌｎであってよく、８２位のＸは任意の天然アミノ酸、好ましくはＩｌｅまたはＶａｌであってよく、より好ましくはＩｌｅであってよく、８３位のＸは任意の天然アミノ酸、好ましくはＬｙｓまたはＧｌｎであってよく、より好ましくはＬｙｓであってよく、８６位のＸは任意の天然アミノ酸、好ましくはＡｌａまたはＳｅｒであってよく、より好ましくはＡｌａであってよく、８７位のＸは任意の天然アミノ酸、好ましくはＧｌｕまたはＧｌｎであってよく、より好ましくはＧｌｎであってよく、９４位のＸは任意の天然アミノ酸、好ましくはＰｒｏまたはＧｌｎであってよく、より好ましくはＰｒｏであってよく、９５位のＸは、任意の天然アミノ酸、好ましくはＧｌｕまたはＡｓｐであってよく、より好ましくはＡｓｐであってよく、９８位のＸは任意の天然アミノ酸、好ましくはＧｌｕまたはＬｙｓであってよく、より好ましくはＬｙｓであってよく、１０１位のＸは任意の天然アミノ酸、好ましくはＭｅｔまたはＬｅｕであってよく、より好ましくはＬｅｕであってよく、１０３位のXは任意の天然アミノ酸、好ましくはＭｅｔまたはＬｅｕであってよく、より好ましくはＭｅｔであってよく、１０６位のＸは任意の天然アミノ酸、好ましくはＬｙｓまたはＡｓｎであってよく、好ましくはＬｙｓであってよく、１２６位のＸは任意の天然アミノ酸、好ましくはＬｅｕであってよく、１３２位のＸは、任意の天然アミノ酸、好ましくはＳｅｒまたはＴｈｒであってよく、より好ましくはＴｈｒであってよく、１３４位のＸは任意の天然アミノ酸、好ましくはＴｙｒまたはＰｈｅであってよく、より好ましくはＰｈｅであってよく、１３７位のＸは任意の天然アミノ酸であってよく、好ましくはＬｙｓまたはＧｌｕであってよく、より好ましくはＧｌｕであってよく、１４７位のＸは任意の天然アミノ酸、好ましくはＡｓｐまたはＡｓｎであってよく、より好ましくはＡｓｐであってよく、１５３位のＸは任意の天然アミノ酸、好ましくはＡｒｇまたはＨｉｓであってよく、さらに好ましくはＨｉｓであってよく、１５５位のＸは、任意の天然アミノ酸、好ましくはＬｅｕまたはＶａｌであってよく、より好ましくはＬｅｕであってよく、１６１位のＸは存在しないか、または任意の天然アミノ酸であってよく、好ましくはＡｌａであってよく、１６３位のＸは存在しないか任意の天然アミノ酸であってよく、好ましくはＴｈｒであってよく、１６６位のＸは存在しないか、任意の天然アミノ酸であってよく、好ましくはＰｒｏであってよく、１６８位のＸは任意の天然アミノ酸、好ましくはＧｌｙまたはＡｌａであってよく、より好ましくはＡｌａであってよい。配列番号１４において、３６位のＸは任意の天然アミノ酸、好ましくはＰｈｅであってよく、３７位のＸは任意の天然アミノ酸、好ましくはＴｙｒまたはＰｈｅであってよく、より好ましくはＴｙｒであってよく、９４位のＸは任意の天然アミノ酸、好ましくはＰｒｏまたはＧｌｎであってよく、より好ましくはＰｒｏであってよく、１２６位のＸは任意の天然アミノ酸、好ましくはＬｅｕであってよく、１３７位のＸは任意の天然アミノ酸、好ましくはＬｙｓまたはＧｌｕであってよく、より好ましくはＧｌｕであってよく、１４７位のＸは任意の天然アミノ酸、好ましくはＡｓｐまたはＡｓｎであってよく、より好ましくはＡｓｐであってよく、１６３位のＸは存在しないかまたは任意の天然アミノ酸であってよく、好ましくはＴｈｒであってよく、１６６位のＸは存在しないかまたは任意の天然アミノ酸であってよく、好ましくはＰｒｏであってよく、１６８位のＸは任意の天然アミノ酸、好ましくはＧｌｙまたはＡｌａであってよく、より好ましくはＡｌａであってよい。
１つの好ましい態様において、Ｌ型フェリチンは、配列番号１１のマウス全長フェリチンを含むかまたはからなるのが好ましい。すなわち、好ましい構造変異体は、少なくとも７０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも７５％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも８０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも８５％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有し、かつ、各場合において、配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなるマウスＬ型フェリチンがＣＤ４５＋白血球、好ましくはＭ２マクロファージによって取り込まれる能力の少なくとも７０％である。
１つの好ましい態様において、Ｌ型フェリチンは、配列番号１３のヒト全長フェリチンを含むかまたはからなるのが好ましい。すなわち、好ましい構造変異体は、少なくとも７０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも７５％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも８０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも８５％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有し、かつ、各場合において、配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなるヒトＬ型フェリチンがＣＤ４５＋白血球、好ましくはＭ２マクロファージによって取り込まれる能力の少なくとも７０％である。
１つの好ましい態様において、アルファヘモグロビンは、配列番号１５の全長アルファヘモグロビンを整列させることから誘導される哺乳動物コンセンサス配列を含むかまたはからなる。好ましくは配列番号１５のアミノ酸配列を含むかまたはからなり、その構造変異体は、少なくとも７０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも７５％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも８０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも８５％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有し、かつ、各場合において、配列番号１５に示されるアミノ酸配列からなるアルファヘモグロビンがＣＤ４５＋白血球、好ましくはＭ１マクロファージによって取り込まれる能力の少なくとも７０％である。
１つの好ましい態様において、アルファヘモグロビンは、配列番号１７のヒトアルファヘモグロビンに由来する最小ヒトアミノ酸配列を含むかまたはからなる。すなわち、好ましい構造変異体は、少なくとも７０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも７５％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも８０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも８５％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有し、かつ、各場合において、配列番号１７に示されるアミノ酸配列からなるアルファヘモグロビンがＣＤ４５＋白血球、好ましくはＭ１マクロファージによって取り込まれる能力の少なくとも７０％である。
１つの好ましい態様において、アルファヘモグロビンは、配列番号１６の全長アルファヘモグロビンに由来する哺乳類コンセンサス配列を含むかまたはからなる。すなわち、好ましい構造変異体は、少なくとも７０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも７５％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも８０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも８５％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有し、かつ、各場合において、配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなるアルファヘモグロビンがＣＤ４５＋白血球、好ましくはＭ２マクロファージによって取り込まれる能力の少なくとも７０％である。
１つの好ましい態様において、アルファヘモグロビンは、配列番号１８のヒト全長アルファヘモグロビンを含むかまたはからなる。すなわち、好ましい構造変異体は、少なくとも７０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも７５％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも８０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも８５％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有し、かつ、各場合において、配列番号１８に示されるアミノ酸配列からなるヒト全長アルファヘモグロビンがＣＤ４５＋白血球、好ましくはＭ２マクロファージによって取り込まれる能力の少なくとも７０％である。
１つの好ましい態様において、アルファヘモグロビンは、配列番号１９の全長ベータヘモグロビンを整列させることから誘導される哺乳動物コンセンサス配列を含むかまたはからなり、その構造変異体は、少なくとも７０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも７５％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも８０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも８５％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有し、かつ、各場合において、配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなるベータヘモグロビンがＣＤ４５＋白血球、好ましくはＭ１マクロファージによって取り込まれる能力の少なくとも７０％である。
１つの好ましい態様において、アルファヘモグロビンは、配列番号２１のヒトベータヘモグロビンに由来する最小ヒトアミノ酸配列を含むかまたはからなる。すなわち、好ましい構造変異体は、少なくとも７０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも７５％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも８０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも８５％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有し、かつ、各場合において、配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなるベータヘモグロビンがＣＤ４５＋白血球、好ましくはＭ１マクロファージによって取り込まれる能力の少なくとも７０％である。
１つの好ましい態様において、ベータヘモグロビンは、配列番号２０の全長ベータヘモグロビンに由来する哺乳類コンセンサス配列を含むかまたはからなる。すなわち、好ましい構造変異体は、少なくとも７０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも７５％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも８０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも８５％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有し、かつ、各場合において、配列番号２０に示されるアミノ酸配列からなるベータヘモグロビンがＣＤ４５＋白血球、好ましくはＭ２マクロファージによって取り込まれる能力の少なくとも７０％である。
１つの好ましい態様において、ベータヘモグロビンは、配列番号２２のヒト全長ベータヘモグロビンを含むかまたはからなる。すなわち、好ましい構造変異体は、少なくとも７０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも７５％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも８０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも８５％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有し、かつ、各場合において、配列番号２２に示されるアミノ酸配列からなるヒト全長ベータヘモグロビンがＣＤ４５＋白血球、好ましくはＭ２マクロファージによって取り込まれる能力の少なくとも７０％である。
１つの好ましい態様において、トランスフェリンは、配列番号２５の全長アルファヘモグロビンを整列させることから誘導される哺乳動物コンセンサス配列を含むかまたはからなる。従って、特に、好ましくは、トランスフェリンは、配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含むかまたはからなり、その構造変異体は、少なくとも７０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも７５％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも８０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも８５％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有し、かつ、各場合において、配列番号２５に示されるアミノ酸配列からなるトランスフェリンがＣＤ４５＋白血球、好ましくはＭ１マクロファージによって取り込まれる能力の少なくとも７０％である。
１つの好ましい態様において、トランスフェリンは、配列番号２８のヒトトランスフェリンを含むかまたはからなる。すなわち、好ましい構造変異体は、少なくとも７０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも７５％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも８０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも８５％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有し、かつ、各場合において、配列番号２８に示されるアミノ酸配列からなるトランスフェリンがＣＤ４５＋白血球、好ましくはＭ１マクロファージによって取り込まれる能力の少なくとも７０％である。
トランスフェリンの鉄結合特性は、Ｎ末端およびＣ末端に位置するドメインに依存している。したがって、１つの好ましい態様において本発明で使用されるトランスフェリンは、少なくとも配列番号２３に示されるＮ末端ドメインおよび配列番号２４に示されるＣ末端ドメインを含む。好ましいトランスフェリンは配列番号２３および２４に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を含み、また、その変異体は少なくとも７０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも７５％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも８０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも８５％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有し、かつ、各場合において、配列番号２３または２４に示されるアミノ酸配列からなるトランスフェリンがＣＤ４５＋白血球、好ましくはＭ１マクロファージによって取り込まれる能力の少なくとも７０％である。配列番号２３または２４は哺乳動物トランスフェリンのコンセンサス配列を示す。
このように、１つの好ましい態様において本発明で使用されるトランスフェリンは、少なくとも配列番号２６に示されるＮ末端ドメインおよび配列番号２７に示されるＣ末端ドメインを含む。好ましいトランスフェリンは配列番号２６および２７に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を含み、また、その変異体は少なくとも７０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも７５％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも８０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも８５％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有し、かつ、各場合において、配列番号２６または２７に示されるアミノ酸配列からなるトランスフェリンがＣＤ４５＋白血球、好ましくはＭ１マクロファージによって取り込まれる能力の少なくとも７０％である。
好ましいフェリチンは、また、所与のアミノ酸配列とは無関係に、４つのヘリックスバンドルタンパク質モジュールの２４ｍｅｒサブユニットアセンブリに適合するタンパク質を含み、３Ｄ構造に基づくアライメントによって定義される遠縁タンパク質の所与の配列アライメント内に入る。
単球、マクロファージ、そして好ましくはＭ２マクロファージは、それらの蓄積の部位（例えば、腫瘍またはその転移、低酸素部位）で画像化方法を用いてそれらを可視化するのに十分な量の標識を取り込むことができることは本発明者らの驚くべき観察である。驚くべきことに、本発明者らは、リンパ球およびＭ２マクロファージが、１つ以上のフェリチンと１つ以上の薬学的に活性な物質、標識または薬学的に活性な物質と標識とを含む複合体の取り込みにおいてより優れていること、およびＭ１マクロファージが、１つ以上のヘモグロビンと１つ以上の薬学的に活性な物質、標識または薬学的に活性な物質と標識とを含む複合体の取り込みにおいてより優れていること、およびマクロファージが、１つ以上のトランスフェリンと１つ以上の薬学的に活性な物質、標識または薬学的に活性な物質と標識とを含む複合体の取り込みにおいてより優れていることを見出した。すなわち、CD45+白血球の組織と細胞指向性に基づき：Ｍ２マクロファージ、リンパ球または単球の指向性が望まれ、および、１つまたは複数のヘモグロビンおよび１つまたは複数の薬学的に活性な物質、標識または薬学的に活性な物質と標識を含む複合体を用いてＭ１マクロファージをロードする場合、Ｍ１マクロファージの指向性が望まれる場合、単球、Ｍ１およびＭ２マクロファージ、顆粒球およびリンパ球、１以上のフェリチンおよび１以上の薬学的に活性な物質、標識または薬学的に活性な物質と標識を含む上記複合体は、Ｍ２マクロファージ、リンパ球または単球を負荷するために使用される。
本発明の標的化送達系の１つの好ましい態様において、薬学的に活性な物質、標識または薬学的に活性な物質と標識は、タンパク質、核酸、１．５ｋＤ未満、より好ましくは１ｋＤ未満の分子量を有する化学的非タンパク質非核酸化合物、好ましくは抗癌剤、特に細胞分裂阻害薬、細胞毒性剤およびそれらのプロドラッグ；抗動脈硬化薬；および抗炎症薬；光感作化合物およびウイルス、特に腫瘍溶解性ウイルス；および細胞に損傷を与える量のγ線を放射もする、好ましくは、ルテチウム－１７７、イッテルビウム－９０、ヨウ素－１３１、サマリウム－１５３、リン－３２、セシウム－１３１、パラジウム－１０３、ラジウム－２３３、ヨウ素－１２５、およびホウ素－１０からなる群から選択される、α線またはβ線を放射する放射性同位体、または好ましくはアクチニウム２２５、ビスマス２１３、鉛２１２、およびポロニウム２１２からなる群から選択される細胞に損傷を与える量のα線を放射する放射性同位体からなる群から選択される。またナノ粒子（例えば、金、銀、グラフェン）またはこれらのナノ粒子に結合した上記化合物および同位体の複合体が好ましい。
好ましい抗癌薬はアポトーシス／オートファジーまたは壊死誘導薬から選択される。アポトーシス／オートファジーまたは壊死誘導薬は、細胞増殖に異常がある細胞においてもアポトーシス／オートファジーまたは壊死を効果的に誘導することができる任意の薬剤であり得る。これらの薬物は、好ましくは１つ以上のフェリチンとの複合体として使用される。
好ましい抗癌薬は、アポトーシス誘導薬、アルキル化物質、代謝拮抗剤、抗生物質、エポチロン、核内受容体アゴニストおよびアンタゴニスト、抗アンドロゲン、抗エストロゲン、白金化合物、ホルモン、抗ホルモン、インターフェロン、細胞周期依存性プロテインキナーゼ（CDK）の阻害剤、シクロオキシゲナーゼおよび／またはリポキシゲナーゼの阻害剤、生体脂肪酸、プロスタノイドおよびロイコトリエンを含む生体脂肪酸誘導体、プロテインキナーゼ阻害剤、プロテインホスファターゼ阻害剤、脂質キナーゼ阻害剤、白金配位錯体、エチレンイミン、メチルメラミン、トリアジン、ビンカアルカロイド、ピリミジン類似体、プリン類似体、アルキルスルホン酸塩、葉酸類似体、アントラセンジオン、置換尿素、およびメチルヒドラジン誘導体、エン-ジイン抗生物質、メイタンシノイドまたはオーリスタチン誘導体などのチューブリン重合阻害剤、免疫チェックポイント阻害剤、および腫瘍特異的タンパク質またはマーカーの阻害剤、好ましくはＲｈｏ－ＧＤＰ解離阻害剤、より好ましくはＧｒｐ９４、またはＡＸＬ阻害剤からなる群から選択される。
他の好ましい抗癌薬は、アセジアスルホン、アクラルルビシン、アンバゾン、アミノグルテチミド、Ｌ－アスパラギナーゼ、アザチオプリン、バノキサントロン、ベンダムスチン、ブレオマイシン、ブスルファン、フォリン酸カルシウム、カルボプラチン、カルペシタビン、カルムスチン、セレコキシブ、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシンダプソン、ダウノルビシン、ジブロムプロパミジン、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドキソルビシン、エンジイン、エピルビシン、エポチロンＢ、エポチロンＤ、エストラムシンホスフェート、エストロゲン、エチニルエストラジオール、エトポシド、フラボピリドール、フロキスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミドホスフェストロール、フラゾリドン、ゲムシタビン、ゴナドトロピン放出ホルモン類似体、ヘキサメチルメラミン、ヒドロキシカルバミド、ヒドロキシメチルニトロフラントイン、ヒドロキシプロゲステロンカプロート、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イドクスウリジン、イホスファミド、インターフェロンα、イリノテカン、ロイプロリド、ロムスチン、ルルトテカン、硫酸マフェニドオラミド、メクロレタミン、酢酸メドロキシプロゲステロン、メガストロアセテート、メルファラン、メパクリン、メルカプトプリン、メトトレキサート、メトロニダゾール、マイトマイシンC、ミトポドジド、ミトタン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、ナリジクス酸、ニフラテル、ニフロキサジド、ニフララジン、ニフルチモックス、ニムスチン、ニノラゾール、ニトロフラントイン、ニトロジェンマスタード、オレオムチン、オキソリン酸、ペンタミジン、ペントスタチン、フェナゾピリジン、フタルスルファチアゾール、ピポブロマン、プレドニムスチン、プレドニゾン、プレシン、プロカルバジン、ピリメタミン、ラルチトレックスド（raltitrexed）、ラパマイシン、ロフェコキシブ、ロシグリタゾン、サラゾスルファピリジン、スクリフラビニウムクロライド（scriflavinium chloride）、セムスチン、ストレプトゾシン、スルファカルバミド、スルファセタミド、スルファクロピリダジン、スルファジアジン、スルファジクラミド、スルファジメトキシン、スルファエチドール、スルファフラゾール、スルファグアニジン、スルファグアノール、スルファメチゾール、スルファメトキサゾール、コ-トリモキサゾール、スルファメトキシジアジン、スルファメトキシピリダジン、スルファモキソール、スルファニルアミド、スルファペリン、スルファフェナゾール、スルファチアゾール、スルフイソミジン、スタウロスポリン、タモキシフェン、タキソール、テニポシド、ターチポシド、テストラクトン、テストステロンプロピオネート、チオグアニン、チオテパ、チニダゾール、トポテカン、トリアジコン、トレオスルファン、トリメトプリム、トロホスファミド、UCN-01、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビンブラスチン、ビノレルビン、およびゾルビシンからなる群から選択され、好ましくは、アウリスタチン、バノキサントロン、ベンダムスチン、クロラムブシル、チャリセアマイシン（chaliceamycin）、シクロホスファミド、ダイナマイシンA、メイタンシン、メルファラン、メルタンシン、およびネオカジノスタチンからなる群から選択され、最も好ましくは、バノキサントロン、ベンダムスチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、ピロロベンゾジアゼピンおよびメルファランからなる群から選択される。
特に好ましい抗癌薬は、増殖阻害タンパク質、好ましくは細胞周期阻害剤、または増殖促進タンパク質に特異的に結合する抗体もしくは抗体様結合タンパク質または、好ましくは、増殖促進タンパク質またはｓｉＲＮＡもしくはＤＮＡザイムに特異的に結合する抗体または抗体様結合タンパク質をコードする核酸である。
好ましい免疫調節薬は、免疫細胞の活性を活性化または阻害する。これらは、天然または合成のリガンドまたはパターン認識受容体、特にＴｏｌｌ様受容体、ＮＯＤ様受容体（ＮＬＲ）、ＲＩＧ－１様受容体（ＲＬＲ）のアンタゴニストであり得る。生理学的には、これらの受容体は病原体関連分子パターン（PAMP）および損傷関連分子パターン（DAMP）として知られるクラスのシグナルを認識する。
本発明に関して使用される抗体の好ましい例は、一本鎖抗体、抗体断片、ナノボディ、軽鎖もしくは重鎖、可変軽鎖もしくは可変重鎖、またはダイアボディである。好ましい抗体断片は、抗原結合（Fab）断片、Fab '断片、F（ab'）2断片、重鎖抗体、単一ドメイン抗体（sdAb）、一本鎖可変断片（scFv）、可変断片（Ｆｖ）、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、単一ドメイン抗体、ナノボディ、ＩｇＮＡＲ（免疫グロブリン新抗原受容体）、ｄｉ－ｓｃＦｖ、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢＩＴＥ）、二重親和性再標的化（ＤＡＲＴ）分子、トリプルボディ、ダイアボディ、単鎖ダイアボディ、およびそれらの融合タンパク質である。
驚くべきことに、炎症を起こした関節がマクロファージ－単球、好ましくは活性化マクロファージによって標的化されることが本発明者らによって見出された。このように、炎症を起こした関節が検出されるべき診断用途においては、マクロファージ－単球は、好ましくは、標識または鉄結合タンパク質および標識を含む複合体を負荷している。治療用途では、好ましくは、複合体は、炎症組織に抗炎症物質を送達するための抗炎症活性を有する薬学的に活性な物質を含む。
驚くべきことに、本発明の標的化送達系はリンパ節を標的とし、それがリンパ節に存在する樹状細胞への抗原の送達に特に適したものにすることを本発明者らは見出した。複合体を負荷した細胞がマクロファージ、特に活性化マクロファージ、より好ましくはCCL-2活性化骨髄由来活性化マクロファージ、またはリンパ球、特にB細胞またはT細胞である場合、リンパ節標的化は特に顕著である。このように、１つの好ましい態様において、標的化送達系は、１つ以上の抗原に対する予防的および／または治療的免疫応答を誘導するために、１つ以上の抗原を送達するために使用される。好ましい抗原は、病原体、すなわち、細菌、ウイルスに由来するか、または、腫瘍特異的抗原である。用語「腫瘍特異的抗原」は、非腫瘍細胞と比較して腫瘍細胞上でより高く発現するタンパク質またはエピトープ（グリコシル化パターンが変化したペプチドを含む）、好ましくは腫瘍細胞上でのみ発現する抗原またはエピトープをいう。好ましい抗原は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ－１、ＨＥＲ１）、ＥｒｂＢ－２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、ＥｒｂＢ－３／ＨＥＲ３、ＥｒｂＢ－４／ＨＥＲ４、ＥＧＦＲリガンドファミリー；インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦＲ）ファミリー、ＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）、ＩＧＦＲリガンドファミリー；血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）ファミリー、ＰＤＧＦＲリガンドファミリー；線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）ファミリー、ＦＧＦＲリガンドファミリー、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）ファミリー、ＶＥＧＦファミリー；ＨＧＦ受容体ファミリー；ＴＲＫ受容体ファミリー；エフリン（EPH）受容体ファミリー；ＡＸＬ受容体ファミリー；白血球チロシンキナーゼ（ＬＴＫ）受容体ファミリー； ＴＩＥ受容体ファミリー、アンジオポエチン１，２；受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体（ＲＯＲ）受容体ファミリー；ジスコイジンドメイン受容体（ＤＤＲ）ファミリー；ＲＥＴ受容体ファミリー；ＫＬＧ受容体ファミリー；ＲＹＫ受容体ファミリー；ＭｕＳＫ受容体ファミリー；トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦ－α）受容体、ＴＧＦ－β；サイトカイン受容体、クラスＩ（ヘマトポイエチンファミリー）およびクラスＩＩ（インターフェロン／ＩＬ－１０ファミリー）受容体、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）、細胞死受容体ファミリー；癌精巣（ＣＴ）抗原、株特異的抗原、分化抗原、アルファ-アクチニン-４、ＡＲＴＣ１、ブレークポイントクラスター領域-アベルソン（Bcr-abl）融合産物、Ｂ－ＲＡＦ、カスパーゼ－５（ＣＡＳＰ－５）、カスパーゼ－８（ＣＡＳＰ－８）、β－カテニン（ＣＴＮＮＢ１）、細胞分裂周期２７（ＣＤＣ２７）、サイクリン依存性キナーゼ４（ＣＤＫ４）、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＯＡ－１、ｄｅｋ－ｃａｎ融合タンパク質、ＥＦＴＵＤ－２、伸長因子２（ＥＬＦ２）、Ｅｔｓ変異型遺伝子６／急性骨髄性白血病１遺伝子ＥＴＳ（ＥＴＣ６－ＡＭＬ１）融合タンパク質、フィブロネクチン（ＦＮ）、ＧＰＮＭＢ、低密度脂質受容体／ＧＤＰ－Ｌフコース：β－Ｄガラクトース２－α－Ｌフコシルトランスフェラーゼ（ＬＤＬＲ／ＦＵＴ）融合タンパク質、ＨＬＡ－Ａ２、ＨＬＡ－Ａ２遺伝子のα２－ドメインのα－ヘリックスの残基１７０におけるアルギニンからイソロイシンへの交換（ＨＬＡ－Ａ＊２０１－Ｒ１７０Ｉ）、ＨＬＡ－Ａ１１、熱ショックタンパク質７０－２変異（ＨＳＰ７０－２Ｍ）、ＫＩＡＡ０２０５、ＭＡＲＴ２、黒色腫偏在性変異１、２、３（ＭＵＭ－１、２、３）、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、ｎｅｏ－ＰＡＰ、ミオシンクラスＩ、ＮＦＹＣ、ＯＧＴ、ＯＳ－９、ｐｍｌ－ＲＡＲアルファ融合タンパク質、ＰＲＤＸ５、ＰＴＰＲＫ、Ｋ－ｒａｓ（ＫＲＡＳ２）、Ｎ－ｒａｓ（ＮＲＡＳ）、ＨＲＡＳ、ＲＢＡＦ６００、ＳＩＲＴ２、ＳＮＲＰＤ１、ＳＹＴ－ＳＳＸ１または－ＳＳＸ２融合タンパク質、トリオースリン酸イソメラーゼ、ＢＡＧＥ、ＢＡＧＥ－１、ＢＡＧＥ－２、３、４、５、ＧＡＧＥ－１、２、３、４、５、６、７、８、ＧｎＴ－Ｖ（異常なＮ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ、ＭＧＡＴ５）、ＨＥＲＶ－Ｋ－ＭＥＬ、ＫＫ－ＬＣ、ＫＭ－ＨＮ－１、ＬＡＧＥ、ＬＡＧＥ－１、メラノーマに対するＣＴＬ認識抗原（ＣＡＭＥＬ）、ＭＡＧＥ－Ａ１（ＭＡＧＥ－１）、ＭＡＧＥ－Ａ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ５、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ９、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ－Ａ１１、ＭＡＧＥ－Ａ１２、ＭＡＧＥ－３、ＭＡＧＥ－Ｂ１、ＭＡＧＥ－Ｂ２、ＭＡＧＥ－Ｂ５、ＭＡＧＥ－Ｂ６、ＭＡＧＥ－Ｃ１、ＭＡＧＥ－Ｃ２、ムチン１（ＭＵＣ１）、ＭＡＲＴ－１／メラン－Ａ（ＭＬＡＮＡ）、ｇｐ１００、ｇｐ１００／Ｐｍｅｌ１７（ＳＩＬＶ）、チロシナーゼ（ＴＹＲ）、ＴＲＰ－１、ＨＡＧＥ、ＮＡ－８８、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＮＹ－ＥＳＯ－１／ＬＡＧＥ－２、ＳＡＧＥ、Ｓｐ１７、ＳＳＸ－１、２、３、４、ＴＲＰ２－ＩＮＴ２、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、カリクレイン４、マンマグロビン－Ａ、ＯＡ１、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＴＲＰ－１／ｇｐ７５、ＴＲＰ－２、メラノーマに存在しないインターフェロン誘導タンパク質２（ＡＩＭ－２）、ＢＩＮＧ－４、ＣＰＳＦ、サイクリンＤ１、上皮細胞接着分子（Ｅｐ－ＣＡＭ）、ＥｐｈＡ３、線維芽細胞増殖因子－５（ＦＧＦ－５）、糖タンパク質２５０（ｇｐ２５０）、ＥＧＦＲ（ＥＲＢＢ１）、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ（ＥＲＢＢ２）、インターロイキン１３受容体α２鎖（ＩＬ１３Ｒアルファ２）、ＩＬ－６受容体、腸管カルボキシルエステラーゼ（ｉＣＥ）、アルファーフェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ｍ－ＣＳＦ、ｍｄｍ－２、ＭＵＣ１、ｐ５３（ＴＰ５３）、ＰＢＦ、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ、ＲＡＧＥ－１、ＲＮＦ４３、ＲＵ２ＡＳ、ＳＯＸ１０、ＳＴＥＡＰ１、サバイビン（ＢＩＲＣ５）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、テロメラーゼ、ウィルムス腫瘍遺伝子（ＷＴ１）、ＳＹＣＰ１、ＢＲＤＴ、ＳＰＡＮＸ、ＸＡＧＥ、ＡＤＡＭ２、ＰＡＧＥ－５、ＬＩＰ１、ＣＴＡＧＥ－１、ＣＳＡＧＥ、ＭＭＡ１、ＣＡＧＥ、ＢＯＲＩＳ、ＨＯＭ－ＴＥＳ－８５、ＡＦ１５ｑ１４、ＨＣＡ６６１、ＬＤＨＣ、ＭＯＲＣ、ＳＧＹ－１、ＳＰＯ１１、ＴＰＸ１、ＮＹ－ＳＡＲ－３５、ＦＴＨＬ１７、ＮＸＦ２、ＴＤＲＤ１、ＴＥＸ１５、ＦＡＴＥ、ＴＰＴＥ、免疫グロブリンのイディオタイプ、Ｂｅｎｃｅ－Ｊｏｎｅｓタンパク質、エストロゲン受容体（ＥＲ）、アンドロゲン受容体（ＡＲ）、ＣＤ４０、ＣＤ３０、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ３３、癌抗原７２－４（ＣＡ７２－４）、癌抗原１５－３（ＣＡ１５－３）、癌抗原２７－２９（ＣＡ２７－２９）、癌抗原１２５（ＣＡ１２５）、癌抗原１９－９（ＣＡ１９－９）、β－ヒト絨毛性ゴナドトロピン、１－２ミクログロブリン、扁平上皮細胞癌抗原、ニューロン特異的エノラーゼ、熱ショックタンパク質ｇｐ９６、ＧＭ２、サルグラモスティム、ＣＴＬＡ－４、７０７アラニンプロリン（７０７－ＡＰ）、Ｔ細胞によって認識される腺癌抗原４（ＡＲＴ－４）、癌胎児性抗原ペプチド－１（ＣＡＰ－１）、カルシウム活性化クロライドチャンネル２（ＣＬＣＡ２）、シクロフィリンＢ（Ｃｙｐ－Ｂ）、ヒト印環腫瘍－２（ＨＳＴ－２）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タンパク質（ＨＰＶ－Ｅ６、ＨＰＶ－Ｅ７、メジャーまたはマイナーキャプシド抗原、他）、エプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）タンパク質（ＥＢＶ潜在性膜タンパク質－ＬＭＰ１、ＬＭＰ２；他）、Ｂ型またはＣ型肝炎ウイルスタンパク質、およびＨＩＶタンパク質からなる群から選択される。
薬学的に活性な物質が核酸の場合、それはｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、化学的に修飾されたＲＮＡ、ＤＮＡザイムまたは薬学的に活性なタンパク質、例えば、抗体、抗体模倣物、サイトカイン、プロドラッグ変換酵素、免疫原性ペプチドなどをコードする核酸が好ましい。
本発明の標的化送達系の１つの好ましい態様において、標識は、蛍光染料、蛍光発光同位体、放射性同位体、検出可能なポリペプチド、またはそのような検出可能なポリペプチドをコードする核酸および造影剤から選択される。
本発明の標的化送達系の１つの好ましい態様において、標識は、二価または三価の金属カチオンと錯体を形成するキレート剤を含む。
本発明の標的化送達系の１つの好ましい態様において、キレート剤は、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－Ｎ，Ｎ’，Ｎ，Ｎ’ －四酢酸（ＤＯＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１，４，７－トリアザシクロノナン-１，４，７－三酢酸（ＮＯＴＡ）、トリエチレンテトラミン（ＴＥＴＡ）、イミノ二酢酸、ジエチレントリアミン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’’-ペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）および６－ヒドラジノピリジン－３－カルボン酸（HYNIC）からなる群から選択される。
本発明の標的化送達系の１つの好ましい態様において、造影剤は、好ましくはGd、Eu、WおよびMnから選択される常磁性剤、またはフェリハイドライドを含む。
本発明の標的化送達系の１つの好ましい態様において、放射性同位体／蛍光放出同位体は、アルファ線放出同位体、ガンマ線放出同位体、オージェ電子放出同位体、Ｘ線放出同位体、蛍光放出同位体、例えば、18F、51Cr、蛍光性 65Tb、67Ga、68Ga、111In、99mTc、140La、175Yb、153Sm、166Ho、88Y、90Y、149Pm、177Lu、47Sc、142Pr、159Gd、212Bi、72As、72Se、97Ru、109Pd、105Rh、101m15Rh、119Sb、128Ba、123I、124I、131I、197Hg、211At、169Eu、203Pb、212Pb、64Cu、89Zr、67Cu、188Re、186Re、198Auおよび199Agならびに、タンパク質、ペプチド、小分子阻害剤、抗体または他の化合物と上記との結合体および組み合わせ（例えば、18F-FDG、89Zr酸化物または64Cuポルフィリン）からなる群から選択される。
本発明の標的化送達系の１つの好ましい態様において、蛍光染料は、以下のクラスの蛍光染料からなる群から選択される：キサンテン、アクリジン、オキサジン、シニン、スチリル染料、クマリン、ポルフィン、金属－配位子－錯体、蛍光タンパク質、ナノクリスタル、ペリレンおよびフタロシアニンならびにこれらの種類の染料の結合体および組合せ。
本発明の標的化送達系の１つの好ましい態様において、検出可能なポリペプチドは、自己蛍光タンパク質、好ましくは緑色蛍光タンパク質、または改変された吸着および／または発光スペクトルを有するその任意の構造的変異体である。
上記で概説したように、本発明の標的化送達系は、薬学的に活性な物質、標識、または薬学的に活性な物質と標識を低酸素領域に送達するのに特に適している。低酸素は、癌および炎症性疾患を含む様々な疾患に特徴的であり、したがってそのような疾患を標的化することを可能にする。
低酸素条件下で活性化される薬学的に活性な物質の使用を標的化することに加えて、標的化にさらなる特異性を付加し、および／または薬学的に活性な物質、標識、または薬学的に活性な物質と標識の悪影響をさらに減少させる。したがって、特に好ましい態様において、薬学的に活性な物質、標識、または薬学的に活性な物質と標識は低酸素活性化プロドラッグである。全ての低酸素活性化プロドラッグの骨格は、組織中の低酸素条件下で酵素的に還元される５つの異なる化学部分（ニトロ基、キニーネ、芳香族および脂肪族Ｎ－オキシドおよび遷移金属）のうちの１つの存在である。低酸素活性化プロドラッグは、対応する薬物と比較して活性が低いかまたは不活性であり、薬物と１つまたは複数の生物学的に還元可能な基を含む。そのような低酸素活性化プロドラッグには、単一電子伝達酵素（チトクロームP450還元酵素など）および２つの電子伝達（または水素化物伝達）酵素を含むがこれらに限定されず、さまざまな還元剤および還元酵素によって活性化されるすべてのプロドラッグが含まれる。本発明の好ましい態様によれば、低酸素活性化プロドラッグはTH-302である。TH-302の合成方法はPCT出願である、WO 07/002931および WO 08/083101に記載されている。そのようなプロドラッグの好ましい例は、ベンゾトリアジンＮ－オキシド、アパジコン（EO9）、チラパザミン（TPN）およびSN30000からなるクラスＩ群またはニトロ化合物PR-104A、TH-302、TH-4000、AQ4NからなるクラスＩＩ群から選択される。
本発明の単離された標的化送達系の１つの好ましい態様において、複合体中に含まれる鉄結合タンパク質と薬学的に活性な物質、標識、または薬学的に活性な物質と標識との間の結合は、共有および／または非共有であり；および／または複合体中に含まれる薬学的に活性な物質、標識、または薬学的に活性な物質と標識が鉄結合タンパク質、好ましくはフェリチンまたはその多量体によって捕捉／封入されている。１つの態様において、共有結合および／または非共有結合はリンカーまたはスペーサーを介して間接的である。共有結合の形成が望まれる場合、鉄結合タンパク質関連チオール基、アミノ基またはカルボキシル基が、薬学的に活性な物質、標識、または薬学的に活性な物質と標識を１つまたは複数の鉄結合タンパク質に直接的または間接的に共有結合させるのに使用される。
異なる薬学的に活性な物質、標識、または薬学的に活性な物質と標識が複合体に含まれることもまた想定される。例えば、あるタイプの薬学的に活性な物質、標識、または薬学的に活性な物質と標識は、鉄結合タンパク質に結合（非共有結合）することができ、一方、別のタイプはカプセル化されている。このアプローチは、一旦標的組織および／または細胞に送達されると、鉄結合タンパク質からの薬学的に活性な物質、標識、または薬学的に活性な物質と標識の異なる放出速度を利用する。例えば、薬学的に活性な物質、標識、または薬学的に活性な物質と標識は、関連するチオール基、アミノ基またはカルボキシル基の反応性を利用することによって、２４ｍｅｒの表面上または内部空洞内のいずれかでフェリチン分子に共有結合することができる。そのような有用な反応の種類は当技術分野において周知であり、そしてさらなる作業なしに、特定の薬学的に活性な物質、標識、または薬学的に活性な物質と標識は当業者によって採用され得る。そのような反応の例としては、Behrens CR, Liu B. Methods for site-specific drug conjugationtoantibodies. MAbs. 2014 Jan-Feb;6(1):46-53に記載されている。
薬学的に活性な物質と標識の両方を含む複合体における治療診断適用において、標識は鉄結合タンパク質に共有結合し、薬学的に活性な物質は鉄結合タンパク質に非共有結合および／または鉄結合タンパク質の組み立て時に形成された内部空洞に閉じ込められることが好ましい。
本発明の第一の態様または第二の態様の単離された標的化送達系の調製方法に関する本発明の第三の態様の方法において、以下の工程：
ａ） 精製された鉄結合タンパク質を提供すること、
ｂ） 薬学的に活性な物質、標識または薬学的に活性な物質と標識を共有結合的または非共有結合的に連結し、および／または、薬学的に活性な物質、標識または薬学的に活性な物質と標識を鉄結合タンパク質中に封入すること、
ｃ） CD45+白血球細胞を提供すること、および
ｄ１） 鉄結合タンパク質と、工程ｂ）で産生された薬学的に活性な物質、標識または薬学的に活性な物質と標識の複合体がCD45+白血球細胞に少なくとも部分的に負荷されるまで、工程ｂ）で産生した鉄結合タンパク質の存在下でCD45 +白血球細胞をインキュベートすること、および／または
ｄ２） CD45+白血球細胞が少なくとも部分的に標識で標識されるまで、標識の存在下でCD45+白血球細胞をインキュベートすること
を含む。
本発明のさらなる態様は、本発明の第三の態様による方法によって生産可能な単離された標的化送達系に関する。
タンパク質と薬学的に活性な物質および／または標識との間の付加物の形成は、好ましくは鉄結合タンパク質への非共有結合によるものであり、そして以下のように記載され得る。フェリチンの場合において、薬学的に活性な物質および／または標識は、典型的には、フェリチン巨大分子自体の会合解離特性を利用することによって内部空洞内に封入（物理的閉じ込め）することができる。薬学的に活性な物質および／または標識分子は、空洞の内部表面内のアミノ酸残基との非共有相互作用によって適切な位置に保持される。ヘモグロビン巨大分子はまた、選択された薬学的に活性な物質の非共有結合および／またはヘモグロビン自体のヘム結合ポケット内に収容され得る分子を標識する可能性を提供する。当該ポケット中のヘムは置換されることができ、そして薬学的に活性な物質および／または適切な疎水性特性を有する標識によって置き換えられ得る。さらなる一態様において、本発明において考慮される全てのタンパク質は、タンパク質自体のチオール基またはアミノ基に対して反応性の特定の活性リンカー部分によって修飾された薬学的に活性な物質および／または標識分子が共有結合されてもよい。そのようなものとして、フェリチンまたはヘモグロビンは、システインチオール反応性の薬学的に活性な物質および／またはペプチドベースの切断可能なリンカーを有する標識（例えば、カテプシン感受性バリン - シトルリン配列およびパラ-アミノベンジルカルバメートスペーサー）に連結されてもよい。注目すべき例として、抗有糸分裂剤モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）が使用されてきた。ペプチドベースのリンカーは、タンパク質が細胞傷害性化合物に安定した方法で結合するので、生理学的条件下で薬物はタンパク質から容易に放出されず、健康な細胞に対する毒性を防ぎ、投与効率を確実にする。このようにして生成されたタンパク質薬学的に活性な物質および／または標識付加物は、選択された受容体型、すなわちそれぞれヘモグロビンについてはＣＤ１６３、およびフェリチンまたはトランスフェリンについてはＴｆＲに結合することができる。一旦結合したタンパク質薬学的に活性な物質および／または標識付加物は、エンドサイトーシスによって内在化され、このように標的細胞によって選択的に取り込まれる。薬物を含む小胞は、リソソームおよびリソソームシステインプロテアーゼ、特にカテプシンＢと融合してバリン-シトルリンリンカーを分解し始め、そしてＭＭＡＥはもはや鉄結合タンパク質に結合せず、そして腫瘍環境に直接放出される。
あるいは、ＤＭ１－ＳＭＣＣは、抗体について首尾よく記載されている反応において、フェリチン、ヘモグロビンまたはトランスフェリンと共有結合複合体を生成するリジン残基に特異的に結合するリンカーを有する効率的なメルタンシン誘導体である。特に、ヘモグロビン、フェリチンまたはトランスフェリンはＤＭ１－ＳＭＣＣと反応させることができ、それにより細胞内で切断することができ、そして時間依存的に活性薬物を放出することができる、共有結合タンパク質-薬物付加物を提供する。ＤＭ１による微小管動態の抑制は、有糸分裂停止および細胞死を誘導する。
本発明に関して使用される用語「全負荷」は、ＣＤ４５＋白血球細胞、好ましくはマクロファージ、より好ましくは、活性化マクロファージによって取り込まれ得る薬学的に活性な物質、標識または薬学的に活性な物質と標識と複合体を形成した、最大量の鉄結合タンパク質、好ましくはフェリチンをいう。
第四の態様において本発明は、本発明の第一の態様または第二の態様の単離された標的化送達系または医薬品もしくは診断薬として使用するための本発明の第三の態様の方法によって生産可能な単離された標的化送達系に関する。
第五の態様において本発明は、本発明の第一の態様または第二の態様の単離された標的化送達系または本発明の第三の態様の方法によって生産可能な単離された標的化送達系と薬学的に許容される担体および／または適切な賦形剤を含む医薬組成物または診断組成物に関する。単離された標的化送達系は生細胞を含むので、細胞を生存させるために、そのようなものにおいて担体および賦形剤を選択することが好ましい。
「薬学的に許容される」とは、連邦政府または州政府の規制当局によって承認された、または米国薬局方または他の一般に認められている薬局方に動物、特にヒトに使用するために収載されていることを意味する。
本明細書において使用される用語「担体」は、これに限定されるものではないが、希釈剤、賦形剤、界面活性剤、安定化剤、生理的緩衝液または薬学的に活性な物質と共に投与されるビヒクルなどの薬学的に不活性な物質をいう。そのような薬学的な担体は液体または固体であり得る。液体担体には、これに限定されるものではないが、水中の食塩水などの無菌液体および油が含まれ、油はこれに限定されるものではないが、ピーナッツ油、大豆油、鉱物油、ゴマ油などの石油、動物、植物または合成由来のものを含む。食塩水および水性デキストロースおよびグリセロール溶液もまた、特に注射用溶液のための液体担体として使用することができる。医薬組成物を静脈内投与する場合、食塩水が好ましい担体である。適切な薬学的な担体の例は、E. W. Martinによる「Remington'sPharmaceuticalSciences」に記載されている。
適切な薬学的な「賦形剤」としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどを含む。
「界面活性剤」は、これに限定されるものではないが、デオキシコール酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、TritonX-100、ならびにポリソルベート20、ポリソルベート40、ポリソルベート60、ポリソルベート65およびポリソルベート80などのポリソルベートなどの、アニオン性、カチオン性、および非イオン性界面活性剤を含む。
「安定化剤」は、これに限定されるものではないが、マンニトール、スクロース、トレハロース、アルブミン、ならびにプロテアーゼおよび／またはヌクレアーゼアンタゴニストを含む。
「生理学的緩衝溶液」は、これに限定されるものではないが、塩化ナトリウム溶液、脱塩水、ならびに適切な有機または無機緩衝溶液、例えば、これに限定されるものではないが、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（［４（２－ヒドロキシエチル）ピペラジノ］エタンスルホン酸）またはＭＯＰＳ緩衝液（３－モルホリノ－１－プロパンスルホン酸）を含む。それぞれの緩衝液の選択は一般に所望の緩衝液モル濃度に依存する。リン酸緩衝液は、例えば、注射液および注入液に適している。
用語「アジュバント」は、細胞レベルまたは体液レベルのいずれかで組成物に含まれる薬学的に活性な物質に対する免疫応答を増大、刺激、活性化、増強、または調整する薬剤をいい、例えば、免疫学的アジュバントは、実際の抗原に対する免疫系の応答を刺激するが、それ自体免疫学的効果はもたない。そのようなアジュバントの例としては、これに限定されるものではないが、無機アジュバント（例えば、リン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウムなどの無機金属塩）、有機アジュバント（例えば、サポニンまたはスクアレン）、油性アジュバント（例えば、フロイント完全アジュバントおよびフロイント不完全アジュバント）、サイトカイン（例えば、IL-1β、IL-2、IL-7、IL-12、IL-18、GM-CFS、およびINF-γ）、粒状アジュバント（例えば、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）、リポソーム、または生分解性ミクロスフェア）、ビロソーム、細菌アジュバント（例えば、モノホスホリルリピドＡ、またはムラミルペプチド）、合成アジュバント（例えば、非イオン性ブロックコポリマー、ムラミルペプチド類似体、または合成リピドＡ）、または合成ポリヌクレオチドアジュバント（例えば、ポリアルギニンまたはポリリジン）が含まれる。
本発明の標的化送達系の疾患特異的ホーミングで著しい知見があった。CD45+白血球細胞は低酸素領域と酸化ストレス領域に向性を持っているようである。低酸素は酸化ストレスと同様に様々な病気の特徴である。すなわち、第六の態様において、本発明は、疾患組織内の低酸素領域および／または酸化ストレス領域(Fig. 27)；腫瘍、好ましくは、固形腫瘍および/またはその転移、好ましくは乳がん、膵臓がん、膀胱がん、肺がん、結腸がん、または、低酸素領域を有する腫瘍、炎症性疾患、炎症組織、好ましくは炎症を起こした関節または関節炎の関節、炎症を起こした肺、炎症を起こした腸または他の炎症を起こした組織；リンパ節、好ましくは炎症を起こしたリンパ節；または疾患の間に発症する他の非生理学的リンパ節、好ましくは感染症、癌、または自己免疫疾患の間に限定されるものではない；または虚血性領域、特に皮膚創傷中のまたは、臓器梗塞（心臓）または虚血性網膜の後の、または予防的または治療的ワクチン接種のための、特に感染症もしくは癌を予防または治療するための虚血領域によって特徴付けられる疾患の予防、治療または診断に使用するための、本発明の第一または第二の態様の単離された標的化送達系または本発明の第三の態様の方法により生産可能な単離された標的化送達系に関連する。この態様はまた、個体にワクチン接種するためのまたは免疫記憶を誘導するための生理学的または非生理学的リンパ節に対する抗原も含む。
本明細書で使用される用語「治療」は、疾患の進行を遅らせるまたは停止すること、病変を退行させるか消失させること、発症を予防すること、または再発を阻害することを含む様々な目的のために治療、一時的寛解、予防などを目的とした医学的に許可されるあらゆる種類の予防的および／または治療的介入を含む。
本発明の標的化送達系は、（例えば、溶解度の問題のために）通常は腫瘍に到達することができないであろう薬学的に活性な物質、標識、または薬学的に活性な物質と標識の腫瘍への送達を可能にする。それはまた、薬学的に活性な物質、標識、または薬学的に活性な物質と標識を低酸素腫瘍または腫瘍の低酸素領域に送達することを可能にする。この系はまた、例えば虚血が起こっている間、または炎症過程を経ている低酸素状態にさらされる生物内の任意の領域への薬学的に活性な物質、標識または薬学的に活性な物質と標識の送達を提供する。
上述のとおり本発明ははまた、腫瘍塊への標的化送達のための方法も提供する。この方法は、ＣＤ４５＋白血球、好ましくはマクロファージによる非常に効率的な鉄結合タンパク質（フェリチン、ヘモグロビンおよび／またはトランスフェリン）の取り込みを可能にする活性化マクロファージの調製を含み、前記フェリチン、ヘモグロビンおよび／またはトランスフェリンは薬学的に活性な物質、標識、または薬学的に活性な物質と標識（例えば薬物／プロドラッグ）、腫瘍標的化および鉄結合タンパク質を癌細胞へ運搬し、そこで薬学的に活性な物質、標識、または薬学的に活性な物質と標識が放出される。
本発明は、腫瘍を標的とするための送達系として、ＣＤ４５＋白血球、好ましくは薬物／プロドラッグと結合した鉄結合タンパク質を負荷した活性化マクロファージを利用する。化学療法に対する腫瘍の不満足な反応または画像化方法を用いたそれらの検出の困難性は、血管系の不良による低酸素領域への抗癌剤の浸透の変化に主に関連している。しかしながら、これらの無血管領域はＣＤ４５＋白血球、好ましくは活性化マクロファージを引き付け、血管から遠く離れた領域にすら移動する。したがって、それらは腫瘍塊への粒子の送達系を構成する。そのような粒子の有望な例は鉄結合タンパク質である。しかしながら、単剤として使用した場合、それらは他の化合物と同様に低酸素領域には到達せず、他の臓器に蓄積する。
本発明者らは、化学的方法を用いて抗癌剤、低酸素活性化プロドラッグ（治療目的用途）、標識または同位体をヘモグロビンまたはトランスフェリンに結合させ、そして、実施例に記載されるとおり、それをＣＤ４５＋白血球（単球、マクロファージ、リンパ球および／または顆粒球）、好ましくは鉄結合タンパク質溶液で細胞を処理する活性化マクロファージに負荷した。本発明者らは、動物に投与すると、負荷されたＣＤ４５＋白血球、好ましくは活性化マクロファージが腫瘍低酸素部位に移動し、カプセル化された薬学的に活性な物質、標識、または薬学的に活性な物質と標識を有する鉄結合タンパク質を癌細胞に放出することを観察した。この方法は、薬学的に活性な物質、標識、または薬学的に活性な物質と標識を腫瘍部位（特に低酸素領域）に正確に投与することを可能にし、それらが他の器官に蓄積するのを回避する。
パネル（Ａ）は、哺乳動物フェリチンＨ鎖といくつかの哺乳動物フェリチンＨ鎖に基づく２つの全長コンセンサス配列との間のコンセンサスアミノ酸配列の最小活性断片（それぞれ配列番号１、２および７を参照）、ならびに、マウスのフェリチンＨ鎖の最小および全長アミノ酸配列（配列番号３および４）およびヒトのフェリチンＨ鎖の最小および全長アミノ酸配列（配列番号５および６）を示す。パネル（Ｂ）は、哺乳動物フェリチンＬ鎖といくつかの哺乳動物フェリチンＬ鎖に基づく２つの全長コンセンサス配列との間のコンセンサスアミノ酸配列の最小活性断片（それぞれ配列番号８、９および１４を参照）、ならびに、マウスのフェリチンＬ鎖の最小および全長アミノ酸配列（配列番号１０および１１）およびヒトのフェリチンＬ鎖の最小および全長アミノ酸配列（配列番号１２および１３）を示す。パネル（Ｃ）は、哺乳動物ヘモグロビンアルファ鎖といくつかの哺乳動物ヘモグロビンアルファ鎖に基づく１つの全長コンセンサス配列との間のコンセンサスアミノ酸配列の最小活性断片（それぞれ配列番号１５および１６を参照）、ならびに、ヒトのヘモグロビンアルファ鎖の最小および全長アミノ酸配列（配列番号１７および１８）を示す。パネル（Ｄ）は、哺乳動物ヘモグロビンベータ鎖といくつかの哺乳動物ヘモグロビンベータ鎖に基づく１つの全長コンセンサス配列との間のコンセンサスアミノ酸配列の最小活性断片（それぞれ配列番号１９および２０を参照）、ならびに、ヒトのヘモグロビンアルファ鎖の最小および全長アミノ酸配列（配列番号２１および２２）を示す。パネル（Ｅ）は、哺乳動物トランスフェリン間のコンセンサスアミノ酸配列のＮおよびＣ末端最小活性断片（配列番号２３および２４）およびいくつかの哺乳動物トランスフェリンに基づく完全長コンセンサス配列（配列番号２５）ならびに、ヒトトランスフェリンのＮ末端およびＣ末端最小活性断片（配列番号２６および２７）およびヒトトランスフェリンの全長アミノ酸配列（配列番号２８）を示す。コンセンサス配列中のＸは可変でありそして任意の天然アミノ酸を表す位置を示す。好ましくは、いずれの場合も、他のＸとは無関係にＸは、ヒトタンパク質中に存在するアミノ酸を表す。 同上 同上 マウス腫瘍塊内部のマクロファージを示す（注射前にＴＲＩＴＣ染色され、ＦＩＴＣ装飾フェリチンを負荷した）。 乳癌細胞を注射し、ＦＩＴＣ－フェリチン（アスタリスク）を負荷したマクロファージを静脈内投与した腫瘍組織マウスの共焦点顕微鏡画像を示す。マクロファージだけでなく癌細胞においても、フェリチン－ＦＩＴＣが全ての腫瘍塊内に広がることが明らかに観察される。 マクロファージ（*で表示；FITC-フェリチンを負荷）と癌細胞（矢印で表示；赤色の標識で染色されているため、フェリチンの取り込み前に緑色のチャンネルでは観察されない）をインビトロで撮影した開始時点（Ａ）と、癌細胞をフェリチンで満たすのに十分な時間後（Ｂ）の共焦点顕微鏡を使用して記録した１チャンネル（グレースケール画像に変換されたオリジナルは緑色のチャンネル）のスナップショットを示す。ＦＩＴＣ－フェリチンは癌細胞に動的に輸送された（最初に小胞に蓄積し、次いでこの画像に見られるように細胞質全体に広がった（細胞は緑色のチャネルに現れた））。 プラセボおよびフェリチン結合メルファランおよびフェリチン結合クロラムブシルを負荷したマクロファージを投与したマウスの生存率を示す。 シクロホスファミドおよびマクロファージに負荷されたフェリチンに封入されたシクロホスファミド（同じ用量で与えられた）での処理によって引き起こされた腫瘍細胞アポトーシスを示す。 マウス乳房腫瘍のMRI像を示す。マウスをフェリチンＦｈを負荷したマクロファージ（静脈内注射）で処置した（０時間の時点）。次に我々は、注射されたマクロファージで満たされた血管の直径の増大（有意なＴ２シグナルの減少を与える）およびその後のマクロファージが組織に広がる（スポット様のパターン；矢印）ことを観察した。これらの変化は（同じ時点で）試験したすべてのマウスで観察された。 マクロファージによるフェリチン、ヘモグロビンおよびトランスフェリンの取り込み、単球によるフェリチンおよびヘモグロビンの取り込み、ならびにリンパ球および顆粒球によるフェリチンの取り込みを示す。 マクロファージによるフェリチン貯蔵の安定性を示す。 マクロファージから様々な癌細胞へのフェリチン、ヘモグロビン、トランスフェリンの移動を示す。 マクロファージから癌細胞および非癌細胞へのフェリチンの移動を示す。 低酸素活性化プロドラッグでカプセル化されたフェリチンのマクロファージから癌細胞への移動を示す。 共培養マクロファージ由来のカプセル化された様々な抗癌剤を有するフェリチンまたは同じ薬剤を有する可溶性フェリチンを受けとった癌細胞におけるアポトーシスを示す。 単球からさまざまな癌細胞へのフェリチン、ヘモグロビンおよびトランスフェリンの移動を示す。 顆粒球からさまざまな癌細胞へのフェリチンとヘモグロビンの移動を示す。 リンパ球からさまざまな癌細胞へのフェリチンとヘモグロビンの移動を示す。 フェリチン－ＦＩＴＣを含有する予め（投与前に）標識されたマクロファージを受け取ったマウスからの腫瘍を示す二光子顕微鏡法による画像を示す。 標識マクロファージを静脈内投与されたマウスの全身画像を示し、腫瘍部位におけるそれらの蓄積および他の器官におけるそれらの分布を示す。 低酸素組織へのマクロファージの移動、予め標識されたマクロファージを静脈内投与したマウスからの腫瘍の断面を示し、腫瘍低酸素領域は低酸素マーカー - ピモニダゾロンで可視化される。 腫瘍塊内部の微小環境における、ＦＩＴＣを付加したフェリチン（丸い物体）を含む小胞の現在の局在を示す。ＦＩＴＣを付加したフェリチンを含有するマクロファージがマウスに静脈内投与された。 転移性4T1癌を有するマウスの全身分析からのPETによって記録された信号を示す。マウスに18F-FDGを負荷したマクロファージを静脈内投与した。微小転移を有するマウスの肺においてシグナル蓄積が増加する（病理学検査により確認される）。単純な18F-FDGを投与されたマウス、または4T1癌を有さないマウスは、より低いPETシグナルを有していた。 MQ-FDG：18F-FDGを負荷した転移性4T1腫瘍＋静脈内マクロファージを有するマウスを示す。FDG：転移性4T1腫瘍＋静脈内遊離18F-FDGを有するマウスを示す。ナイーブマウスMQ-FDG：18F-FDGを負荷した腫瘍＋静脈内マクロファージを有さないナイーブマウスを示す。 本発明の標的化送達系において使用可能な異なるＣＤ４５＋白血球細胞型による腫瘍ホーミングを示す。ＣＴ２６腫瘍を有するマウス（矢印で示す）にＰＢＳまたは蛍光標識細胞を静脈内注射した。パネルＡ－PBS、細胞加えず、パネルＢ－CD45+白血球亜集団のホーミングを示す、パネルＣ－活性化CD4+Tリンパ球のホーミングを示す、パネルＤ－マクロファージ単球細胞株のホーミングを示す。注射２４時間後のマウスを麻酔し画像化した。パネルＥは異なるＣＤ４５＋白血球細胞による腫瘍ホーミングの定量化を示す。 フェリチン－シスプラチンを負荷した単球による治療を受けているＣＴ２６腫瘍を有するマウスの生存を示す。ｎ＝６～８マウス／グループ 。マウスの生存は、最大許容腫瘍体積（式Ａ×Ｂ２に従って、キャリパーにより測定）に達する（１５００ｍｍ３）ことにより計算した。 炎症を起こした（関節炎）関節への静脈内投与細胞の標的化を示す。対照マウス（パネルＡ）または関節の重度の炎症を有するマウス（パネルＢ）にマクロファージ-単球細胞株を静脈内注射した。注射前に細胞を蛍光トレーサーで標識した。注射２４時間後に関節を取り除き、単細胞懸濁液を生成した。細胞はフローサイトメトリーによって分析された。蛍光標識された細胞はＰ２領域に存在する。パネルＣは対照の関節と比較した炎症を起こしたものにおける蛍光細胞の定量化を示す。マクロファージ-単球細胞は、対照の関節よりも炎症を起こしたものの方で多数存在する。 リンパ節への静脈内投与細胞の標的化を示す。対照マウス（パネルＡ）または関節の重度の炎症を有するマウス（パネルＢ）に活性化マクロファージを（Ｍ－ＣＳＦおよびＣＣＬ２と共に）静脈内注射した。注射前に細胞を蛍光トレーサーで標識した。注射の２４時間後にマウスを麻酔し画像化した。炎症状態のマウスは、リンパ節からの細胞トレーサー由来の陽性シグナルを有する（白い矢印で示される）。 ＰＥＴ画像化のための、単離された89Zr－オキシン酸（oxinate）を有し、すなわち鉄結合タンパク質を有さない（～１．８５ＭＢｑ）単球-マクロファージ細胞株の放射性標識を示す。89Zrを負荷した後の細胞の放射能はＭＢｑで示される。 フェリチン負荷マクロファージ（RAW264.7）と２時間共培養した癌細胞（EMT6）においてフェリチン移動を調べた。３つの実験条件を使用した：「ｃｔｒｌ」（通常の共培養、ストレスなし）； EMT6細胞を共培養前に酸化ストレスにさらした後、正常酸素条件でマクロファージと共培養した場合の「EMT6 OS」および両方の細胞型が共培養前に酸化ストレスを受けた場合の「共培養ＯＳ」。結果は、酸化ストレスを受けた癌細胞が（マクロファージから）対照細胞よりも多くのフェリチンを受けとったことを示した。両方の細胞型が酸化ストレスを受けた場合、取り込みはさらに効率的であった。それは、酸化ストレスによるフェリチンのより高い負荷、したがってより効率的な伝達に関連し得るか、または酸化ストレスは、隣接細胞における酸化ストレスを減少させるために癌細胞により効率的にフェリチンを送達するマクロファージを誘発する。パネルＡは酸化ストレス（１６時間の酸化的グルコース処理）におけるマクロファージ（２時間の共培養）からのフェリチンの取り込みを示す。パネルＢは酸化ストレス（１６時間の酸化的グルコース処理）におけるマクロファージ（２時間の共培養）からのフェリチンの取り込みを示す。
実施例１－マクロファージの活性化
本発明で使用されるマクロファージは、以下のとおり、得られ、分化され、活性化された。マクロファージを活性化するために、それらは第一に骨髄前駆体(例えば以下の文献参照： Weischenfeld and Porse,2008,CSH Protoc, doi. 10.1101/pdb.prot.5080)または血液単球から得られる。あるいは、それらは腹膜から得られる。マクロファージの単離、培養、分化および極性化／活性化の方法は当業者によく知られている。例えば、それらは詳細にMurrayら (Immunity, 2014, 41(1):14-20)に記載されている。
本発明のこの実用的な実現において、骨髄由来マクロファージはBALB/cまたはC57Bl/6マウスから得られたが、イヌ血液単球由来マクロファージまたは市販のマクロファージ細胞株が使用された（単球-マクロファージ系譜マウス細胞：RAW 264.7、J744、ヒト：THP-1、U937、またはイヌDH82細胞系譜）。
簡潔にいえば、そのような骨髄由来マクロファージは、プラスチック製ペトリ皿中の５ｍｌの培地（プレートあたり３ｍｌの細胞）：DMEM：F12＋グルタミン／グルタマックス＋10％FBS＋ペニシリン／ストレプトマイシンおよび20％のL929馴化培地またはM-CSF(50ng/ml) に播種される。次の５日間で、培地は成長因子および活性化化合物の１つまたはそれらの組み合わせを１つのサイトカインカクテルとして補充される。
あるいは、マクロファージは「M1/M2マクロファージ産生培地」（Promocell）または同等の市販のものまたはそれらが活性化されていると見なすために必要なすべてのサイトカインおよびインターロイキンを含有する自作培地中で培養された。
血液単球からマクロファージを得るために、新鮮な血液（１２時間以内）細胞を、Histopaqueシステム1.077 g/mlまたは同等物を用いた遠心分離によって精製し、例えば、T-75フラスコで１５ｍｌの培地の適量の予熱した白血球付着培地（または同等のもの、例えばM-CSFを添加したDMEM/RPMI）中の白血球（あるいは血液バンクから採取した白血球のみ）に播種した。播種密度は、単球含有量が２５％以上の単核細胞では１～２百万／ｃｍ２、単球含有量が２５％未満の場合は１．５～３百万／ｃｍ２とすべきである。その後、細胞をインキュベーター内で５％ＣＯ２および３７℃で１～１．５時間インキュベートする。
細胞付着後、それらを少なくとも２回洗浄し、次いで適切な量の完全な「Ｍ１－またはＭ２－マクロファージ生成培地ＤＸＦ」を細胞に添加し（例えば、T-75フラスコ当たり２０ｍｌ）、細胞を培地交換なしで３７℃および５％ＣＯ２で６日間インキュベートする。 マクロファージを活性化するために、培地全体を活性化化合物を添加した培地と交換する。
本発明で使用される活性化化合物（骨髄由来細胞のためまたは単球－マクロファージ細胞株由来の細胞を活性化するため）は以下の通りである：IL-4（20 ng/ml）、IFN-γ（少なくとも20 ng/ml）、LPS（少なくとも10ng/ml）、IL-13（少なくとも20 ng/ml）、IL-10（少なくとも20 ng/ml）、デキサメタゾン（少なくとも20μg/ml）、CCL2（少なくとも20ng/ml）、oxLDL（少なくとも20 ng/ml）、TNF-α（20 ng/ml）、TGF-β（20 ng/ml）、コルチゾール（150～300ng/ml）または１つのサイトカインカクテルとしてのそれらの組み合わせ。非活性化マクロファージを得るために、活性化化合物は添加されない。
マクロファージの極性化／活性化の逆転（古典的活性化から代替的活性化へ）は、例えばマクロファージを上記列挙された適切なサイトカイン中で少なくとも４８時間培養することによって達成することができる。
実施例２－単球単離
本発明のこの実用的な実現において単球を得るために、骨髄由来または脾臓由来の単球は、BALB/cまたはC57Bl/6マウスから得たが、イヌ血液単球または市販の単球細胞株が使用された（単球－マクロファージ系譜マウス細胞：RAW 264.7、J744、ヒト細胞：THP-1、U937、またはイヌ細胞DH82）。
血液単球を得るために、新鮮な血液（１２時間以内）細胞を、Histopaqueシステム1.077 g/mlまたは同等物を用いた遠心分離によって精製し、そして白血球を例えば、T-75フラスコで１５ｍｌの培地の適量の予熱した単球付着培地（または同等のもの、例えば20ng/ml M-CSFを添加したDMEM/RPMI）に播種する。あるいは、血液バンク（バフィーコート）から採取した白血球のみを使用してもよい。細胞付着後、それらは少なくとも２回洗浄され、そして付着細胞は単球と見なされる。
骨髄由来単球を得るために、本発明のこの実用的な実現において、単球はBALB/cまたはC57Bl/6マウスから得られた。簡潔にいえば、そのような骨髄由来前駆体は、マウス単球富化キット（Mouse Monocyte Enrichment Kit）（StemCells）を製造元の指示に従って使用し単離した。脾臓由来の単球を得るために、本発明のこの実用的な実現において、脾臓は、単細胞懸濁液を得るために機械的に解離され、そして70μm細胞ストレーナーを通過させた。細胞を遠心分離し、そして上清を除去した。任意で、製造元の指示に従ったEasySep（商標）マウス単球富化キット（Mouse Monocyte Enrichment Kit） (StemCells)による単球単離の前に赤血球溶解を行った。
使用前にそれらのタンパク質負荷および移動のより良い効果を得るために、それらは活性化刺激：IL-4（20 ng/ml）、IFN-γ（少なくとも20 ng/ml）、LPS（少なくとも10ng/ml）、IL-13（少なくとも20 ng/ml）、IL-10（少なくとも 20 ng/ml）、デキサメタゾン（少なくとも20μg/ml）、CCL-2（少なくとも20ng/ml）、oxLDL（少なくとも20 ng/ml）、TNF-α（20 ng/ml）、TGF-β（20 ng/ml）、コルチゾール（150～300 ng/ml）または１つのサイトカインカクテルとしてのそれらの組み合わせ、で前処理されてもよい。
実施例３－顆粒球の単離
血液から顆粒球細胞を得るために、９部の血液を１部のＡＣＤ緩衝液（0.17 Mのｄ－グルコース、0.10 Mのクエン酸、0.11Mのクエン酸三ナトリウムを含有する）で希釈した。この工程からの血液をPBSで１：１の比率でさらに希釈し、そして遠心分離した。血漿およびバフィーコートを除去した後、残りの細胞をPBSと最初の工程（ＡＣＤ－血液）からの元の容量の８０％まで混合し、次いで４：１２の比率で冷蒸留水で希釈した。次に、６部の２．７％NaCl溶液を添加しそして遠心分離した。上清を除去した後、細胞をRPMI-1640培地に再懸濁した。これらの細胞は顆粒球と見なされた。
実施例４－リンパ球の単離
脾臓由来リンパ球を得るために、本発明のこの実用的な実現において、脾臓は、単細胞懸濁液を得るために機械的に解離され、そして７０μｍ細胞ストレーナーを通過させた。細胞を遠心分離し、そして上清を除去した。赤血球溶解後、製造元の指示に従ったEasySep（商標）CD4+富化キット（CD4+ Enrichment Kit） (Stemcell)を用いてネガティブ細胞単離戦略を用いてリンパ球を単離した。
製造元の指示に従った抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８（Ｇｉｂｃｏ）で覆われたビーズの存在下で、グルタミン／グルタマックス、１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ培地中での３～５日間の培養によりリンパ球を活性化した。
リンパ球の活性化は、フローサイトメトリーによってモニターされた、ＣＤ２５およびＣＤ６９細胞表面発現の上方制御によって確認された。
実施例５－白血球（CD45+細胞）の単離
血液単球からマクロファージを得るために、新鮮な血液（１２時間以内）をHistopaqueシステム1.077 g/mlまたは同等物を使用する遠心分離によって精製し、そして白血球（または、血液バンクから採取された白血球のみ）を手順のさらなる工程のために使用する。あるいは、白血球は、本発明のこの実用的な実現において行われたように、全血の赤血球溶解後に得られる。
実施例６－フェリチン複合体の調製
フェリチンを抗癌剤（例えば、シクロホスファミド、クロラムブシル、メルファラン、ベンダムスチン、バノキサントロン、低酸素活性化プロドラッグ（TH-302）など）または「造影剤」（例えば、フェリヒドリドまたは同位体）と組み合わせるために、マクロファージ治療の前にフェリチンを調製する必要がある。簡潔にいえば、配列番号４（図１）による組換えマウスタンパク質は以下のようにして得られる。配列番号４のフェリチンタンパク質をコードする合成遺伝子を含む発現ベクターpET-22bを大腸菌BL21 (DE3)に形質転換した。大腸菌培養液は、アンピシリン（100 mg/L）を添加した１ＬのLuria-Bertaniブロス（LB）中、37℃でOD600 0.6まで増殖させた。１ｍＭイソプロピルチオ－ｂ－Ｄ－ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加することによってタンパク質発現を誘導し、そして培養物を一晩インキュベートした。細胞を遠心分離（１５０００ｇで１５分間）により回収し、そして２０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１ｍｇ／ｍＬのＤＮａｓｅ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２中に懸濁し、そして超音波処理により破壊した。溶解物を１５０００ｇで３０分間遠心分離し、上清を５０℃で１０分間処理し、遠心分離して変性タンパク質を除去し、次いで７０℃で１０分間処理し、そして再び遠心分離した。上清を４℃で１時間撹拌しながら３０％（ＮＨ）４ＳＯ４を加え、１５０００ｇで３０分間遠心分離した。上清を４℃で１時間撹拌しながら７０％（ＮＨ）４ＳＯ４を加え、１５０００ｇで３０分間遠心分離した。ペレットを２０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌに再懸濁し、そして同じ緩衝液に対して４℃で一晩透析した。タンパク質をHILOAD 26/600 SUPERDEX 200ゲル濾過カラム（GE-Healthcare）にロードし、次いで滅菌濾過して４℃で保存した (図９)。タンパク質濃度は、モル吸光係数２１０００Ｍ－１ｍ－１を使用し、５９５ｎｍでの吸光度を測定するブラッドフォードアッセイによって、２８０ｎｍの分光光度的に決定した。
前記フェリチンは、組換え哺乳動物フェリチンタンパク質Ｈおよび／またはＬホモポリマーを含む。
前述のようにして得られたフェリチンは、エンドトキシンを含まない前臨床グレードの産物を得るために標準的な方法で精製される(例えば、Ceci et al. 2011,Extremophiles15(3):431-439; Vanucci et al. 2012, Int J Nanomed 7:1489-1509を参照)。簡潔にいえば、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ ｐＨ７．５を含有する保存溶液中に滅菌保存されたフェリチンを、酸性溶液（最終ｐＨ＜３．０）中２４ｍｅｒ中で最終濃度４μＭに希釈するか、あるいは高度に塩基性のｐＨ値（ｐＨ＞９．５）に希釈し(例えば、Pontillo et al., 2016を参照)、このようにして多量体の解離を可能にする。薬物を非常に高濃度で適切な溶媒に溶解し、次いで少量を２００モル過剰でフェリチン溶液に添加する。次いで、多量体の再構成を可能にするために、適切な量のＮａＯＨ／ＨＣｌ溶液を添加することによってＰＨを中性にする。現在の実験方法は、１００ｋＤａカットオフ濃縮器中のＰＢＳ（濃縮ステップ）を用いた３／４洗浄が、共溶媒ならびに非カプセル化薬物および薬物充填フェリチンナノケージの完全回収の両方を迅速かつ完全に排除することを可能にする。このようにして得られたフェリチン－薬物複合体を次に液体窒素中で瞬間凍結しそして凍結乾燥した。
共溶媒の選択および薬物分子の固有の化学的特性に応じて、最大１５０～１８０個の薬物分子を２４ｍｅフェリチンケージ内に捕捉／吸着できると推定できる。
薬学的に活性な物質または標識はまた、フェニルヒドラゾン、スクシンイミドまたはマレイミド活性化薬物の適切な選択によってフェリチンアミノ酸側鎖（リジンまたはシステイン）に共有結合させることもできる。すなわち、ｉ）フェニルヒドラゾン誘導体は、フェリチン表面から薬物を破壊し遊離させる可能性があり、ｉｉ）リジン結合誘導体はアミノ酸への完全なタンパク質分解後に活性になる可能性があり、またはｉｉｉ）システイン結合誘導体は、マレイミドチオエーテル結合の還元的加水分解を介して細胞内で遊離される可能性がある。
実施例７－ヘモグロビン-化合物複合体の調製
ヒトヘモグロビンはRossi-Fanelliら（Archivesofbiochemistry and biophysics 77:478-492, 1958）に記載のとおり、新鮮な赤血球から調製する。簡潔に言えば、健康なドナーから得たヘパリン処理した血液を、1600rpmで30分間（4℃）遠心分離してRBCを沈殿させた。バフィーコートはペレットの表面上の針吸引によって正確に除去された。血漿上清を捨て、そしてＲＢＣを等張の０．９％食塩水中に再懸濁し、そして４℃で３０分間１６００ｒｐｍで遠心分離することによりＲＢＣペレットを３回洗浄した。最終食塩水洗浄および遠心分離工程の後、ＲＢＣペレットを５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ＰＢ、ｐＨ＝７．２）でｐＨ７．２に緩衝化した蒸留水に再懸濁し、そして穏やかに撹拌しながら４℃で一晩溶解させた。続いて透析したＲＢＣ溶解物を４℃で３０分間１３．０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を室温でＱ－セファロースＸＬ樹脂（GEHealthcare）を充填したＸＫ ２６／４０カラムを備えたＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒシステムに直接ロードした。カラムを緩衝液Ａ（２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ＝８．２）で流速１２ｍＬ／分で平衡化し、同じ緩衝液で３回洗浄した。１００％緩衝液Ａから７５％緩衝液Ｂ（２０ｍＭＴｒｉｓ－Ｃｌ、および０．２ＭＮａＣｌ ｐＨ８．２０）に変更し、続いて１００％緩衝液Ｂの段階的勾配変化によって線形勾配溶出を行った。溶出時に、フラクションコレクターを使用してタンパク質画分を収集した。このようにして得られたタンパク質をSDS pageで分析し、-80℃で凍結保存した。
ヒトヘモグロビン（配列番号１８または２２、図１参照）は、適切な薬物結合体に容易に共有結合することができ、ヘム結合ポケット内に疎水性薬物分子を収容することができ、あるいはヘム鉄に結合する小さい細胞傷害性分子を輸送することさえできる。Ｈｂは、タンパク質表面上の唯一の滴定可能なシステインである、ベータ鎖の９３位のシステイン残基に適切な薬物結合体を選択的に付着させることによって容易に修飾することができる。チューブリン阻害剤モノメチルアウリスタチン（ＭＭＡＥ）またはスクシンイミド官能化メルタンシン類似体（ＤＭ１－ＳＭＣＣ）のようなマレイミド官能化薬物は、極めて強力な細胞毒性薬の最も注目に値する例であり、関連するｃｙｓベータ９３残基（マレイミド官能化薬物用）または１つ以上のリジン残基（スクシンイミド官能化薬物）にそれぞれ容易かつ特異的に結合することができる。これらの薬物は、以下の手順に従ってヒトヘモグロビンに都合よく結合されている：
アウリスタチンＥ類似体、マレイミドカプロイル-バリン-シトルリン-p-アミノベンゾイルオキシカルボニル-モノメチルアウリスタチンＥ（ｖｃＭＭＡＥ）は、MedChem Express（プリンストン、ＮＪ）から得た。ヘモグロビンｖｃＭＭＡＥ付加物は以下のように調製した。ヒトヘモグロビン溶液を、反応緩衝液（０．１ｍＭＥＤＴＡを含む、５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ６．８）で１２０μＭヘムの濃度に調整し、４℃で一晩２０％ ｖ／ｖアセトニトリル溶液の存在下で１０倍モル過剰のｖｃＭＭＡＥと結合させた。マレイミド基は、ｐＨ６．５～７．５で遊離（還元）スルフヒドリルと効率的かつ特異的に反応して安定なチオエーテル結合を形成する。過剰のｖｃＭＭＡＥを精製し、ＰＭ１００限外濾過濃縮器を用いてD-PBSと緩衝液交換した。結合体の収率は全システインの約８０％であった。ｖｃＭＭＡＥ結合体の形成は、LC-MS分析およびp-クロロメルクリベンゾエートによる残存遊離チオール基の滴定によって確認した。Ｈｂ－ｖｃＭＭＡＥ結合体の濃度は、紫外可視分光分析によって決定した。
リジン共有結合のために官能化されたメルタンシン類似体ＤＭ１ ＳＭＣＣ（Alb Technology Ltd、ヘンダーソン、ＮＶ、ＵＳＡ）を以下のように調製した。ヒトヘモグロビン溶液を、反応緩衝液（０．５ｍＭＥＤＴＡを含む、０．１ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４）を用いて４００μＭヘムの濃度に調整し、そして４℃で１６時間１０％ ｖ／ｖ ＤＭＳＯ溶液の存在下で２０倍モル過剰のＤＭ１－ＳＭＣＣと結合させた。アミン反応性スクシンイミジルエステルはアミンとカップリングし、そしてタンパク質の表面にリジン基を有する共有結合付加物を生じる。過剰のＤＭ１－ＳＭＣＣを除去し、ＰＭ１００限外濾過濃縮器を用いてＤ－ＰＢＳと緩衝液交換した。結合体の収率は、ヘモグロビン４量体あたり約２．４メルタンシン分子であった。ＤＭ１－ＳＭＣＣ結合体の形成はＬＣ－ＭＳ分析により確認した。Ｈｂ－ＤＭ１－ＳＭＣＣ結合体の濃度は、紫外可視分光分析によって決定した。
別法で、アポタンパク質溶液は再構成工程の間氷浴上に保たれなければならない。０．１ＭのＮａＯＨ中の１．５倍モル過剰のCuT-CPP（Cu-TCPP 4、4’、4’ ’、4’ ’ ’-（ポルフィン-5、10、15、20-テトライル）テトラキス（安息香酸）-Cu67）を０．２ＭのＫＰｉ緩衝液（ｐＨ７．０）中のアポグロビン溶液に滴下して室温で素早くボルテックスし加え、その後３０分氷浴中に再度静置しなければならない。タンパク質溶液は使用前にシリンジフィルターで濾過しなければならない。
実施例８－トランスフェリン-化合物複合体の調製
血清を健康なドナーから入手し、過剰の鉄をキレート剤および重炭酸塩としてクエン酸イオンの存在下で添加し、トランスフェリンへの鉄の結合を促進させた。反応混合物は、１００ｍＬの血清当たり１時間、ｐＨ＝８、４℃で６．５ｍｇの重炭酸ナトリウムおよび１５３．１６クエン酸第二鉄を含有していた。続いて、アルコール溶液を血清試料に４℃で３．５Ｖ／Ｖの比で、ｐＨ＝９．４で２時間添加することによって、アルブミンをリバノール（４％）によって沈殿させた。次に、該溶液を３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、最後に０．８ｍｍシリンジフィルターで濾過した。続いて、硫酸アンモニウム０．０２５Ｍ中、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２５カラムでゲル濾過することにより、過剰のリバノールを除去した。続いて、ｐＨ＝６．５で５０％飽和硫酸アンモニウムによる沈殿を行い、続いて３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した（免疫グロブリン除去）。次いで、８０％飽和硫酸アンモニウムで２回目の沈殿を行い、沈殿物中のトランスフェリンを回収した。次いで、固体沈殿物を、１ＭのＮａＣｌを含有する０．０６ＭのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液、ｐＨ＝８の緩衝液に溶解した。溶液を同じ緩衝液中で透析して硫酸アンモニウムを完全に除去した。次にタンパク質溶液をセントリコンPM50遠心濃縮機で10～15 mg/ml（ブラッドフォード法で推定）まで濃縮し、1M NaClで平衡化したSephadex G-100ゲル濾過カラム（2.4 x 80 cm）にロードし、流速１５ｍｌ／ｈで実施した。このようにして得られたトランスフェリンは、ＳＤＳｐａｇｅにより純度８８～９０％であると推定された。次いで陰イオン交換DEAE Sephadex A-50によるイオン交換クロマトグラフィーを最終研磨工程として使用した。トランスフェリン試料を、ｐＨ＝８の０．０６ＭＴｒｉｓＨＣｌで平衡化したカラムにロードし、溶出緩衝液、０．３ＭＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ＝８を用いて直線濃度勾配により溶出した。タンパク質純度は９８％より高く、血清１００ｍＬ当たり約１５０ｍｇの収量であった。
ヘモグロビンと同様にヒトホロトランスフェリン（配列番号２８、図１）は、適切な薬物結合体に容易に共有結合することができるが、自由に滴定可能なシステイン基が存在しないため、リジン修飾の利用可能性のみが存在する。したがって、スクシンイミド官能化メルタンシン類似体（ＤＭ１－ＳＭＣＣ）は、１つ以上のリジン残基（スクシンイミド官能化薬物）に共有結合するために使用されてきた。薬物は、以下の手順に従ってトランスフェリンに都合よく結合されている：
リジン共有結合のために官能化されたメルタンシン類似体ＤＭ１ ＳＭＣＣ（Alb Technology Ltd、ヘンダーソン、ＮＶ、ＵＳＡ）を以下のように調製した。トランスフェリン溶液を、反応緩衝液（０．１ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４、鉄キレート化の可能性があるため、この場合はＥＤＴＡは使用できない）を用いて１００μＭヘムの濃度に調整し、そして４℃で１６時間８％ ｖ／ｖ ＤＭＳＯ溶液の存在下で２０倍モル過剰のＤＭ１－ＳＭＣＣと結合させた。アミン反応性スクシンイミジルエステルはアミンとカップリングし、そしてタンパク質の表面にリジン基を有する共有結合付加物を生じる。過剰のＤＭ１－ＳＭＣＣを除去し、ＰＭ１００限外濾過濃縮器を用いてＤ－ＰＢＳと緩衝液交換した。結合体の収率は、トランスフェリン２量体あたり約１．５メルタンシン分子であった。ＤＭ１－ＳＭＣＣ結合体の形成はＬＣ－ＭＳ分析により確認した。トランスフェリン－ＤＭ１－ＳＭＣＣ結合体の濃度は、紫外可視分光分析によって決定した。
別法で、アポタンパク質溶液は再構成工程の間氷浴上に保たれなければならない。A ０．１ＭのＮａＯＨ中の１．５倍モル過剰のCuT-CPP（Cu-TCPP 4、4’、4’ ’、4’ ’ ’-（ポルフィン-5、10、15、20-テトライル）テトラキス（安息香酸）-Cu67）を０．２ＭのＫＰｉ緩衝液（ｐＨ７．０）中のアポグロビン溶液に滴下して室温で素早くボルテックスし加え、その後３０分氷浴中に再度静置しなければならない。タンパク質溶液は使用前にシリンジフィルターで濾過しなければならない。
実施例９－フェリチン負荷細胞の取得
得られた細胞は、それらの全負荷に対するフェリチン／細胞の適切な比率を確実にし、また適切な画像化のための治療効果またはコントラストを得るのに適切な薬物含量を確実にするために十分な時間および濃度のフェリチン溶液中でインキュベートする。時間および濃度は、フェリチンケージ中に封入／吸着された分子の数、細胞活性化の状態、それらの意図される投与の状態および数に応じて変わってよい。
例えば、フェリチンの適切な負荷を確実にするために、細胞を標準培養条件で０．８ｍｇ／ｍｌのフェリチン溶液中で１～４時間インキュベートする。フェリチン濃度の枠組みは、インキュベーション時間（５分～６時間以上）と同様に少なくとも０．０１～４ｍｇ／ｍｌの間で変動してよい。細胞へのフェリチン負荷の時間および濃度、細胞生存率に対するフェリチンの影響および処理条件を調整する必要がある。上記のようにして得られた細胞は、比較的短時間（数分、図８）でフェリチンを非常に容易に取り込む。一旦それらがフェリチンを吸収すると、それらはそれを培地に放出しない（図９）。
それにもかかわらず、当業者は、上記の条件を再調整し、そして自身の実験室においてそれ自身の目的のためにプロトコールを最適化することができる。
実施例１０－ヘモグロビン負荷細胞の取得
得られた細胞は、それらの全負荷に対するヘモグロビン／細胞の適切な比率を確実にし、また適切な画像化のための治療効果またはコントラストを得るのに適切な薬物含量を確実にするために十分な時間および濃度のヘモグロビン溶液中でインキュベートする。時間および濃度は、ヘモグロビン分子内に結合した分子の数、細胞活性化の状態、それらの意図される投与の状態および数に応じて変わってよい。
例えば、ヘモグロビンの適切な負荷を確実にするために、細胞を標準培養条件で０．１ｍｇ／ｍｌのヘモグロビン溶液中で１～４時間インキュベートする。ヘモグロビン濃度の枠組みは、インキュベーション時間（５分～４時間以上）と同様に少なくとも０．０１～０．２ｍｇ／ｍｌの間で変動してよい。細胞へのヘモグロビン負荷の時間および濃度、細胞生存率に対するヘモグロビンの影響および処理条件を調整する必要がある。上記のようにして得られた細胞は、比較的短時間（数分、図８）でヘモグロビンを非常に容易に取り込む。
それにもかかわらず、当業者は、上記の条件を再調整し、そして自身の実験室においてそれ自身の目的のためにプロトコールを最適化することができる。
実施例１１－トランスフェリン負荷細胞の取得
得られた細胞は、それらの全負荷に対するトランスフェリン／細胞の適切な比率を確実にし、また適切な画像化のための治療効果またはコントラストを得るのに適切な薬物含量を確実にするために十分な時間および濃度のトランスフェリン溶液中でインキュベートする。時間および濃度は、トランスフェリン分子内に結合した分子の数、細胞活性化の状態、それらの意図される投与の状態および数に応じて変わってよい。
例えば、トランスフェリンの適切な負荷を確実にするために、細胞を標準培養条件で０．１ｍｇ／ｍｌのトランスフェリン溶液中で１～４時間インキュベートする。トランスフェリン濃度の枠組みは、インキュベーション時間（５分～４時間以上）と同様に少なくとも０．０１～０．２ｍｇ／ｍｌの間で変動してよい。細胞へのトランスフェリン負荷の時間および濃度、細胞生存率に対するトランスフェリンの影響および処理条件を調整する必要がある。上記のようにして得られた細胞は、比較的短時間（数分、図８）でトランスフェリンを非常に容易に取り込む。
それにもかかわらず、当業者は、上記の条件を再調整し、そして自身の実験室においてそれ自身の目的のためにプロトコールを最適化することができる。
実施例１１－癌細胞への有用な送達ツールとしてのフェリチン／ヘモグロビン／トランスフェリン－マクロファージ複合体
実施例８、９および１０に記載のように調製した実施例１からのマクロファージは、非常に容易にフェリチン、ヘモグロビン、トランスフェリンを癌細胞：マウス乳癌、結腸癌、イヌ乳癌、ヒト乳癌、膵臓癌、および膀胱癌に送達する（図４、１０）。さらに、この送達は、非癌細胞よりも癌細胞にはるかに特異的である（図１１）。しかしながら、癌細胞の場合、両者の細胞型の比率が非常に重要である。マクロファージが多いほど、送達はより良くより速くなる。癌細胞への最も効率的な送達は、癌細胞に対するマクロファージの比が１：１以上のときに観察された。
この送達は、タンパク質担体が蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣまたはＡｌｅｘａ６１０）と結合されているときだけでなく、それらが他の化合物、例えば抗がん剤と結合体化／カプセル化されているときにも起こった（図１２は、蛍光低酸素活性化プロドラッグ-バノキサントロンでカプセル化されたフェリチンのこの送達を示す）。抗癌剤と結合した化合物のこの送達は、癌細胞においてアポトーシスを誘導する効果をもたらした（図６，１３）。
実施例１２－癌細胞への有用な送達ツールとしてのフェリチン／ヘモグロビン／トランスフェリン－単球複合体
実施例８、９および１０に記載のように調製した実施例２からの単球は、非常に容易にフェリチン、ヘモグロビン、トランスフェリンを癌細胞に送達する（図１４）。しかしながら、両者の細胞型の比率が非常に重要である。単球が多いほど、送達はより良くより速くなる。癌細胞への最も効率的な送達は、癌細胞に対する単球の比が１：１以上のときに観察された。
実施例１３－癌細胞への有用な送達ツールとしてのフェリチン／ヘモグロビン／トランスフェリン－顆粒球複合体
実施例８、９および１０に記載のように調製した実施例３からの顆粒球は、非常に容易にフェリチン、ヘモグロビン、トランスフェリンを癌細胞に送達する（図１５）。しかしながら、両者の細胞型の比率が非常に重要である。顆粒球が多いほど、送達はより良くより速くなる。癌細胞への最も効率的な送達は、癌細胞に対する顆粒球の比が１：１以上のときに観察された。
実施例１４－癌細胞への有用な送達ツールとしてのフェリチン／ヘモグロビン／トランスフェリン－リンパ球複合体
実施例８、９および１０に記載のように調製した実施例４からのリンパ球は、非常に容易にフェリチン、ヘモグロビン、トランスフェリンを癌細胞に送達する（図１６）。しかしながら、両者の細胞型の比率が非常に重要である。リンパ球が多いほど、送達はより良くより速くなる。癌細胞への最も効率的な送達は、癌細胞に対するリンパ球の比が１：１以上のときに観察された。
実施例１５－放射性同位体による細胞標識
本発明において、細胞はＰＥＴ上で画像化されるようにするために、１８Ｆ－ＦＤＧまたは８９Ｚｒ－オキシネートで標識した。細胞をプレートから分離し、そして細胞による最も最適な１８Ｆ－ＦＤＧまたは８９Ｚｒ－オキシネート取り込みを確実にするために、適切な濃度の１８Ｆ－ＦＤＧまたは８９Ｚｒ－オキシネート溶液と共にインキュベートし、それらの蓄積部位でのそれらの放射線検出を可能にした。本発明のこの実施において細胞を、５百万の細胞あたり３～９ＭＢｑを含有する８９Ｚｒ－オキシネート溶液中、室温で少なくとも９０分間インキュベートした。しかしながら、放射性同位体と細胞の比率は反応効率に有意に影響する（図２６）。標識後、細胞を遠心分離し、そして上清を除去した。この工程は上清中に放射能が検出されなくなるまで繰り返すべきである。
実施例１６－腫瘍、関節炎の関節およびリンパ節への有用な送達ツールとしてのフェリチン／ヘモグロビン／トランスフェリン／標識白血球複合体
実施例９、１０、１１および１１に記載のように調製した実施例１からのマクロファージ；実施例９、１０、１１および１２に記載のように調製した実施例２からの単球；実施例９、１０、１１および１２に記載のように調製した実施例３からの顆粒球；ならびに、実施例９、１０、１１および１２に記載のように調製した実施例４からのリンパ球は、非常に効率的に腫瘍（図２２、２３）、関節炎の関節（図２４）、（特定の実施例において単球マクロファージ細胞株を使用）および炎症を起こしたリンパ節（図２５）、（特定の実施例においてＭ－ＣＳＦおよびＣＣＬ－２を用いて活性化した単球／若いマクロファージを使用）に移動する。それらが腫瘍または他の組織に移動すると、それらは、画像化システムを用いて検出されるのに十分な量で腫瘍にフェリチン、ヘモグロビン、トランスフェリンおよび標識を非常に容易に送達する（図２、３、７、１７、および１８）。
実施例１７－低酸素領域に有用な標的化された薬学的に活性な物質の送達システムとしての白血球－タンパク質担体複合体
上記のように調製したマクロファージを腫瘍のある動物の尾静脈に注射する（適切な数のマクロファージは、腫瘍の大きさ、発生段階、および転移の有無に合わせて調整する必要がある）。図２および１７に示されるように、それらは特異的に腫瘍に到達し（数時間後）、そして動物全体の他の器官にも分散する（図１８）。さらに、図１９に示されるように、低酸素モデルにおいて、それらは無血管および低酸素部位に移動し、そして担体タンパク質を癌細胞に送達することもできる（図３および２０）。
画像化目的のため、１～５０百万のマクロファージを乳癌または結腸癌の担癌動物の尾静脈に注射した。前もって、マクロファージをCell Trackerで事前標識し、（実施例８に示すように）フェリチン-FITCを負荷した。マクロファージ投与の８時間後の腫瘍塊の二光子を用いて、フェリチン－ＦＩＴＣを担持するマクロファージの存在を検出した（図１７）。それらの腫瘍の特異的標的化、また他の器官へのそれらの移動は、ＤＩＲ細胞質色素を用いたマクロファージ事前標識の後に全身動物画像化（ＩＶＩＳ）を用いて示された（図１８）。
フェリチン封入シクロホスファミド、メルファランおよびフェリチン封入クロラムブシルを負荷した１～１０百万個のマクロファージを担腫瘍マウスに静脈内注射した（３０００００～５０００００のＥＭＴ６細胞は皮膚の側面に注入された）。我々は３日ごとに３回マクロファージを注射するか（がん細胞注射後５、８および１１日目、またはがん細胞注射後７、１０および１３日目）、または毎日５回連続して注射し、マウスの生存率の増加を観察した（図５）。
実施例１８－有用な標的化標識送達剤としての白血球－タンパク質担体複合体または標識白血球
本発明に記載の標的化送達系の標的化に続いて、フェリチンを造影剤に結合することができる。図２１に示されるとおり、実施例８に記載のように造影剤（この場合、フェリハイドライト、しかしながら、同位体、例えば１２３Ｉを用いて同じ結果が得られる）でカップリングした、または同位体（この場合、８９Ｚｒ－オキシネートまたは１８Ｆ－ＦＤＧ）で標識したフェリチンを負荷した１～５０ｍｌのマクロファージの注射後、それらはＭＲＩ、ＰＥＴまたはＳＰＥＣＴにより容易に検出することができる。この実施例（図７）において、乳房腫瘍担持マウスを、フェリチンＦｈを負荷したマクロファージの静脈内投与後３、２２および２４時間にＭＲＩを用いて画像化した。マウスをマクロファージで処置した（時点０ｈ）。次いで、注射されたマクロファージで満たされた血管（矢印）の直径の増大が観察され（有意なＴ２シグナルの減少をもたらす）、その後マクロファージが組織に広がった（スポット様のパターン；矢印）。これらの（同じ時点での）変化は試験したすべてのマウスで観察された。
マクロファージも８９Ｚｒ－オキシネートまたは１８Ｆ－ＦＤＧで標識し（５～５０百万）、それらの放射能は担腫瘍マウスへの静脈内投与後にＰＥＴを用いて画像化されることを確認した。実験の３週間前にこれらのマウスに４Ｔ１転移細胞株を接種し、そして肺、肝臓および脾臓における転移を組織病理学的に確認した。図２１においてマクロファージが転移性腫瘍を有する領域に移動してＰＥＴでのそれらの可視化を可能にすることが見られる。
本発明の前述の説明は、当業者が現在その最良の形態であると考えられているものを製造および使用することを可能にするものであり、当業者は、本明細書中の特定の実施態様、方法、および実施例の変形、組み合わせ、および等価物の存在を理解し認識するであろう。したがって、本発明は、上記の実施態様、方法、および実施例によって限定されるべきではなく、本発明の範囲および精神内のすべての実施態様および方法によって限定されるべきである。
図面の用語
Mammalian ferritin H chain (SEQ ID NO: 1 to7) 哺乳動物フェリチンＨ鎖（配列番号１～７）
Mammalian ferritin L chain (SEQ ID NO: 8 to14) 哺乳動物フェリチンＬ鎖（配列番号８～１４）
Mammalian haemoglobin alpha chains (SEQ IDNO: 15 to 18) 哺乳動物ヘモグロビンアルファ鎖（配列番号１５～１８）
Mammalian haemoglobin beta chains (SEQ IDNO: 19 to 22) 哺乳動物ヘモグロビンベータ鎖（配列番号１９～２２）
Mammalian transferrins (SEQ ID NO: 23 to28) 哺乳動物トランスフェリン（配列番号２３～２８）
Survival 生存
Percent survival 生存率
Time(d) 時間（日）
Ft-Melphalan フェリチン－メルファラン
Ft-Chlorambucil フェリチン－クロラムブシル
Cancer cell apoptosis がん細胞アポトーシス
due to cyclophosphamide treatment シクロホスファミド治療による
Number of apoptotic cells (%) アポトーシス細胞数（％）
ctrl 対照
drug 薬物
Mq+Feritin+drug マクロファージ＋フェリチン＋薬物
condition 条件
uptake 取り込み
MFI of FITC ＦＩＴＣの平均蛍光強度
min 分
Time of incubation インキュベーション時間
Monocyte Ft and Hb uptake 単球のフェリチンおよびヘモグロビン取り込み
Mean Fluorescence Intensity 平均蛍光強度
untreated 未処理
treatment 処理
MFI of Granulocyte-Ft 顆粒球－フェリチンの平均蛍光強度
MFI of Lymphocyte-Ft リンパ球－フェリチンの平均蛍光強度
Time of treatment 処理時間
Ft-Banoxantrone leakage from cells to themedium 細胞から培地へのフェリチン－バノキサントロン漏出
FACS analysis ＦＡＣＳ解析
Percentage of cancer cells がん細胞の割合
Relative Mean Fluorescence Intensity 相対平均蛍光強度
No. of cancer cells loaded with Ft-FITCafter 2 hrs of co-culture withmacrophages pre-loaded with Ft-FITC フェリチン－ＦＩＴＣ事前負荷マクロファージと２時間共培養後のフェリチン－ＦＩＴＣ負荷がん細胞の数
No. of loaded cells (%) 負荷された細胞の数（％）
cell line 細胞株
human bladder cancer ヒト膀胱がん
human breast cancer ヒト乳がん
human pancreatic cancer ヒト膵臓癌
canine mammary carcinoma イヌ乳癌
Transfer between species 種間の移動
Transfer from mouse RAW264.7 to humancancer cell line MDA-MB361 マウスRAW264.7からヒトがん細胞株MDA-MB361への移動
% of loaded cells 負荷細胞の％
protein タンパク質
Percentage of acceptor cells with Ft-FITC フェリチン－ＦＩＴＣを有する受容細胞の割合
time of co-culture 共培養の時間
EMT6 load of Ft-Banoxantrone (0.2 mg/mlFt-0.65 mg Banox) after 2 hrs co-culturewith RAW264.7 pre-loaded with Ft-Banox フェリチン－バノキサントロン事前負荷RAW264.7と２時間共培養後フェリチン－バノキサントロン（0.2 mg/mlフェリチン、0.65 mgバノキサントロン）負荷EMT6
Number of apoptotic cells (%) アポトーシス細胞の数（％）
% of cells receiving iron-bindinprotein-FITC from human monocyte due toco-culture 共培養によるヒト単球から鉄結合タンパク質－ＦＩＴＣを受け取る細胞の％
Transporter 輸送体
MFI of CMT-U27 cells cultured with loadedgranulocytes 負荷された顆粒球で培養されたCMT-U27細胞の平均蛍光強度
MFI of CMT-U309 cells cultured with loadedgranulocytes 負荷された顆粒球で培養されたCMT-U309細胞の平均蛍光強度
transferred compound 移動した化合物
No. of cells [%] 細胞の数［％］
MFI of EMT6 cells cultured with loaded CD4+cells 負荷されたＣＤ４＋細胞で培養されたEMT6細胞の平均蛍光強度
MFI of 4T1 cells cultured with loaded CD4+cells 負荷されたＣＤ４＋細胞で培養された4T1細胞の平均蛍光強度
MFI of CT26 cells cultured with loaded CD4+cells 負荷されたＣＤ４＋細胞で培養されたCT26細胞の平均蛍光強度
Number of EMT6 cells cultured with loadedCD4+ 負荷されたＣＤ４＋で培養されたEMT6細胞の数
Number of 4T1 cells cultured with loadedCD4+ 負荷されたＣＤ４＋で培養された4T1細胞の数
Number of CT26 cells cultured with loadedCD4+ 負荷されたＣＤ４＋で培養されたCT26細胞の数
macrophage マクロファージ
plain ferritin-FITC 明白なフェリチン－ＦＩＴＣ
control 対照
tumor 腫瘍
injection site 注射部位
Lung Radioactivity 肺放射能
native mice ネイティブマウス
Tumour 腫瘍
Avg Radiant Efficiency 平均放射効率
Leukocytes 白血球
CD4+Tcells ＣＤ４＋Ｔ細胞
macrophage + monocyte cells マクロファージ＋単球細胞
Therapy 治療
Days 8-12 ８～１２日
Cisplatin 5mg/kg i.p. シスプラチン5mg/kg腹腔内投与
Ft-Cisplatin 0.1 mg/kg i.v. フェリチン－シスプラチン0.1 mg/kg静脈内投与
MQ-Ft-Cisplatin マクロファージ－フェリチン－シスプラチン
Fluorescence 蛍光
positive cells 陽性細胞
healthy feet 健常な足
inflamed knees 炎症した膝
+ labeled macrophages intravenously 標識されたマクロファージを静脈内に
5 mln of cells 細胞５百万
10 mln of cells 細胞１０百万
20 mln of cells 細胞２０百万
Number of ferritin-loaded EMT6 cells (%) フェリチン負荷されたEMT6細胞の数（％）
MFI of ferritin-loaded EMT6 cells フェリチン負荷されたEMT6細胞の平均蛍光強度

Claims (17)

  1. 細胞内に１以上の鉄結合タンパク質と薬学的に活性な物質、標識または薬学的に活性な物質と標識との複合体を含む、CD45+リンパ球、CD45+顆粒球、CD45+単球および／またはCD45+単球-マクロファージ、（以下、「CD45+白血球細胞」という）を含む、単離された標的化送達系であって、
    前記標的化送達系は、薬学的に活性な物質、標識または薬学的に活性な物質と標識を別の細胞に送達することによって、腫瘍および／または炎症の領域および／または低酸素マーカーであるピモニダゾロンで可視化可能な低酸素領域を標的化するためのものであり、前記別の細胞は腫瘍細胞、または前記炎症の領域または前記低酸素領域の細胞である、標的化送達系。
  2. CD45+白血球細胞がCD34+造血前駆細胞から産生され得る、請求項１に記載の単離された標的化送達系。
  3. (i) リンパ球は、CD3+およびCD4+またはCD8+ Tリンパ球、またはCD19+、CD20+、CD21+、CD19+ CD20+、CD19+CD21+、CD20+CD21+、もしくはCD19+ CD20+CD21+ Bリンパ球、またはナチュラルキラー（NK）細胞からなる群から選択され、
    (ii) 顆粒球は、好中球、もしくはCD66 b+好中球、好酸球および好塩基球、もしくはCD193+好酸球からなる群より選択され、
    (iii) 単球は、CD11b+単球であり、もしくは、CD11b+ CD14+単球、CD11b+CD16+単球、CD11b+ CD14+CD16+単球、CD11b+ CD14+MHCII+単球、CD11b+ CD14+CD115+単球、CD11b+ CD114+単球、CD11b+CD116+単球、CD11b+CCR1+単球、CD11b+CCR2+単球、CD11b+CX3CR+単球、CD11b+CXR4+単球、CD11b+CXR6+単球およびCD11b+CD14+CD33+単球からなる群から選択されるが、
    単球はIFN調節因子8（IRF8）、核因子インターロイキン（IL）-3調節タンパク質（NFIL3）、塩基性ロイシンジッパー転写因子ATF様3（BATF3）または転写因子RelB（NF-KBサブユニット）-RELB、Spi-1プロトオンコジーン（PU/1）、組換え結合タンパク質サプレッサーオブヘアレス（RBPJ）、IFN調節因子4（IRF4）または転写因子E2-2（TCF4としても知られる）の転写因子によって分化が制御される樹状細胞ではなく、
    (iv) 分化した単球は、マクロファージ、活性化マクロファージ、もしくはCD11 b+マクロファージ、もしくはCD11b+ CD16+マクロファージ、CD11b+CD32+マクロファージ、CD11b+ CD64+マクロファージ、CD11b+CD68+マクロファージ、もしくは、CD11b+ CD86+M1マクロファージ、またはiNOSを産生するマクロファージ、 および／または分泌性インターロイキン12（IL-12）を産生するマクロファージまたはCD11b+CCR2+ M2マクロファージ、CD11b+CD204+M2マクロファージ、CD11b+ CD206+M2マクロファージ、CD11b+ CD204+ CD206+M2マクロファージ、CD11b+主要組織適合性複合体II+（MHC II+）（低発現または高発現）M2マクロファージ、CD11b+ CD200R+M2マクロファージ、CD11b+ CD163+ M2マクロファージ、またはアルギナーゼおよび／またはインターロイキン10（IL-10）を産生および／または分泌する活性化マクロファージからなる群から選択され、分化した単球-マクロファージは、Lox1+、CXCR7+およびNRF2+を発現する泡沫細胞ではなく、または、
    (v) 単球マクロファージまたは活性化単球マクロファージは、少なくとも1つのケモカイン受容体、もしくはCCR1、CCR2+、CXCR4+、およびCXCR6+からなる群から選択されるケモカイン受容体、または少なくとも１つの増殖因子受容体、もしくはマクロファージコロニー刺激因子受容体（CD115）、顆粒球コロニー刺激因子受容体（CD114）、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子受容体（CD116およびCD131からなる）からなる群から選択される増殖因子受容体を発現し、これらの特徴の単球は、炎症状態および癌を治療するのに適している、
    請求項２に記載の単離された標的化送達系。
  4. リンパ球は、
    (i) 血液、脾臓、または骨髄から入手可能であるか、またはCD34+前駆細胞から生産可能である、
    (ii) 免疫学的に能力のあるリンパ球である、
    (iii) 抗原特異的T細胞受容体を発現する、および／または
    (iv) 以下の抗原のうち少なくとも1つの発現によって特徴付けられる： (a) CD3+ および CD4+ または CD8+、または (b): CD19+、CD20+、CD21+、CD19+ CD20+、CD19+CD21+、CD20+ CD21+、またはCD19+ CD20+ CD21+ 抗原、および／または免疫グロブリンを産生可能である、
    請求項３に記載の単離された標的化送達系。
  5. 顆粒球は、
    (i) 血液、脾臓または骨髄から得ることが可能であるか、または、CD34+前駆細胞から生産可能である、
    (ii) 以下のCD66b+および／またはCD193+の少なくとも１つの発現によって特徴づけられる、
    (iii) その細胞質中に顆粒が存在することを特徴とする多形核白血球である、および／または
    (iv) 以下のTfR+、CD163+、TIM-2+、および／またはCXCR4+の少なくとも１つの発現によって特徴づけられる、
    請求項３に記載の単離された標的化送達系。
  6. NK細胞は、
    (i) 血液、脾臓または骨髄から得ることが可能であるか、またはCD34+前駆細胞から産生可能であるか、および／または
    (ii) CD3発現の欠失および以下のCD56+および／またはCD94+、CD158a+ CD158f+CD314+CD335+の少なくとも１つの発現によって特徴づけられる、
    請求項３に記載の単離された標的化送達系。
  7. 活性化マクロファージは、
    (i) 単球またはマクロファージを、マクロファージ上の発現マーカーを変更することができる因子でインビトロでインキュベートすることによって産生され得るものであり、または、単球またはマクロファージを、マクロファージ上の発現マーカーを変更することができる因子でインビトロでインキュベートすることによって産生され得るものであって、
    (a) 少なくとも１つのM1誘導因子で、M1誘導因子は、ＬＰＳ、INF-γならびにウイルス感染および細菌感染からなる群から選択され、
    (b) 少なくとも１つのM2誘導因子で、M2誘導因子は、IL-4、IL-10、IL-13、抗原と抗体の免疫複合体、ＩｇＧ、熱活性化ガンマ－グロブリン、糖質コルチコイド、TGF-β、IL-1R、CCL-2、IL-6、M-CSF、PPARγアゴニスト、白血球抑制因子、アデノシンおよび蠕虫感染および真菌感染からなる群から選択され、
    (c) またはサイトカイン、もしくはIL-10およびIL-12、ケモカインを分泌するマクロファージの能力、および/またはiNOS、アルギナーゼまたは他の免疫調節酵素を産生するマクロファージの能力を変化させることができる因子で、
    (ii) 以下の抗原：CD64、CD86、CD16、CD32、MHCIIの高発現、および／またはiNOSおよび／またはIL-12の産生の少なくとも1つの発現を特徴とする、
    (iii) マクロファージの貪食能を誘導することができる因子との単球またはマクロファージのインビトロインキュベーションによって産生される、
    (iv) 以下の抗原の少なくとも１つの発現によって特徴づけられる：CD204、CD206、CD200R；CCR2、トランスフェリン受容体 (TfR)、CXC-モチーフケモカイン受容体4 (CXCR4)、CD163、および／またはＴ細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン2(TIM-2)、および／またはMHCIIの低発現を示す、
    (v) 貪食する能力を有する；および／または
    (vi) サイトカイン分泌、もしくはIL-12もしくはIL-10の分泌、または誘導型一酸化窒素合成酵素（iNOS）（もしくは他の前炎症性化合物）、アルギナーゼまたは他の免疫抑制性／抗炎症性化合物の産生が可能である、
    請求項３に記載の単離された標的化送達系。
  8. 鉄結合タンパク質は、フェリチン、もしくは重（Ｈ）型フェリチン、軽（Ｌ）フェリチンおよび／またはミトコンドリアフェリチン；ヘモグロビン、もしくはヘモグロビンＡ、ヘモグロビンＡＳ、ヘモグロビンＳＣ、ヘモグロビンＣ、ヘモグロビンＤ、ヘモグロビンＥ、ヘモグロビンＦ、ヘモグロビンＨ；ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体、ヘモペキシン、トランスフェリン；およびラクトフェリンからなる群から選択される、請求項１～７のいずれか１項に記載の単離された標的化送達系。
  9. 薬学的に活性な物質は、タンパク質、核酸、１．５ｋＤ未満の分子量を有する非タンパク質非核酸化合物、もしくは抗癌剤、もしくは細胞分裂阻害薬、細胞毒性剤；抗動脈硬化薬；免疫調節薬；抗炎症薬；光感作化合物；ウイルス、もしくは腫瘍溶解性ウイルス；および細胞に損傷を与える量のγ線を放射もするα線またはβ線を放射する放射性同位体、もしくは、ルテチウム－１７７、イッテルビウム－９０、ヨウ素－１３１、サマリウム－１５３、リン－３２、セシウム－１３１、パラジウム－１０３、ラジウム－２３３、ヨウ素－１２５、およびホウ素－１０からなる群から選択される、または細胞に損傷を与える量のα線を放射する放射性同位体、もしくはアクチニウム２２５、ビスマス２１３、鉛２１２、およびポロニウム２１２からなる群から選択される、またはナノ粒子に結合した上記化合物または同位体の複合体である、
    請求項１～８のいずれか１項に記載の単離された標的化送達系。
  10. （i）抗癌剤は、アポトーシス誘導薬、アルキル化物質、代謝拮抗剤、抗生物質、エポチロン、核内受容体アゴニストおよびアンタゴニスト、抗アンドロゲン、抗エストロゲン、白金化合物、ホルモン、抗ホルモン、インターフェロン、細胞周期依存性プロテインキナーゼ（CDK）の阻害剤、シクロオキシゲナーゼおよび／またはリポキシゲナーゼの阻害剤、生体脂肪酸、プロスタノイドおよびロイコトリエンを含む生体脂肪酸誘導体、プロテインキナーゼ阻害剤、プロテインホスファターゼ阻害剤、脂質キナーゼ阻害剤、白金配位錯体、エチレンイミン、メチルメラミン、トリアジン、ビンカアルカロイド、ピリミジン類似体、プリン類似体、アルキルスルホン酸塩、葉酸類似体、アントラセンジオン、置換尿素、およびメチルヒドラジン誘導体、エン-ジイン抗生物質、メイタンシノイド、オーリスタチン誘導体、免疫チェックポイント阻害剤、および腫瘍特異的タンパク質またはマーカーの阻害剤、もしくはＲｈｏ－ＧＤＰ解離阻害剤、もしくはＧｒｐ９４、またはＡＸＬ阻害剤からなる群から選択され、
    （ii）抗癌剤は、アセジアスルホン、アクラルルビシン、アンバゾン、アミノグルテチミド、Ｌ－アスパラギナーゼ、アザチオプリン、バノキサントロン、ベンダムスチン、ブレオマイシン、ブスルファン、フォリン酸カルシウム、カルボプラチン、カルペシタビン、カルムスチン、セレコキシブ、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダプソン、ダウノルビシン、ジブロムプロパミジン、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドキソルビシン、エンジイン、エピルビシン、エポチロンＢ、エポチロンＤ、エストラムシンホスフェート、エストロゲン、エチニルエストラジオール、エトポシド、フラボピリドール、フロキスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミドホスフェストロール、フラゾリドン、ゲムシタビン、ゴナドトロピン放出ホルモン類似体、ヘキサメチルメラミン、ヒドロキシカルバミド、ヒドロキシメチルニトロフラントイン、ヒドロキシプロゲステロンカプロート、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イドクスウリジン、イホスファミド、インターフェロンα、イリノテカン、ロイプロリド、ロムスチン、ルルトテカン、硫酸マフェニドオラミド、メクロレタミン、酢酸メドロキシプロゲステロン、メガストロアセテート、メルファラン、メパクリン、メルカプトプリン、メトトレキサート、メトロニダゾール、マイトマイシンＣ、ミトポドジド、ミトタン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、ナリジクス酸、ニフラテル、ニフロキサジド、ニフララジン、ニフルチモックス、ニムスチン、ニノラゾール、ニトロフラントイン、ニトロジェンマスタード、オレオムチン、オキソリン酸、ペンタミジン、ペントスタチン、フェナゾピリジン、フタルスルファチアゾール、ピポブロマン、プレドニムスチン、プレドニゾン、プレシン、プロカルバジン、ピリメタミン、ラルチトレックスド（raltitrexed）、ラパマイシン、ロフェコキシブ、ロシグリタゾン、サラゾスルファピリジン、スクリフラビニウムクロライド（scriflaviniumchloride）、セムスチン、ストレプトゾシン、スルファカルバミド、スルファセタミド、スルファクロピリダジン、スルファジアジン、スルファジクラミド、スルファジメトキシン、スルファエチドール、スルファフラゾール、スルファグアニジン、スルファグアノール、スルファメチゾール、スルファメトキサゾール、コ-トリモキサゾール、スルファメトキシジアジン、スルファメトキシピリダジン、スルファモキソール、スルファニルアミド、スルファペリン、スルファフェナゾール、スルファチアゾール、スルフイソミジン、スタウロスポリン、タモキシフェン、タキソール、テニポシド、ターチポシド、テストラクトン、テストステロンプロピオネート、チオグアニン、チオテパ、チニダゾール、トポテカン、トリアジコン、トレオスルファン、トリメトプリム、トロホスファミド、UCN-01、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビンブラスチン、ビノレルビン、およびゾルビシンからなる群から選択され、または、アウリスタチン、バノキサントロン、ベンダムスチン、クロラムブシル、チャリセアマイシン（chaliceamycin）、ダイナマイシンＡ、メイタンシン、メルファラン、メルタンシン、およびネオカジノスタチンからなる群から選択され、
    （iii）免疫調節薬は、免疫細胞の活性を活性化または阻害し、または、免疫調節薬は、リガンドもしくはパターン認識受容体、もしくはＴｏｌｌ様受容体、ＮＯＤ様受容体（ＮＬＲ）、ＲＩＧ－１様受容体（ＲＬＲ）のアンタゴニストであり、
    （iv）抗癌剤は、増殖阻害タンパク質、または細胞周期阻害剤、または増殖促進タンパク質に特異的に結合する抗体もしくは抗体様結合タンパク質または、増殖促進タンパク質またはｓｉＲＮＡもしくはＤＮＡザイムに特異的に結合する抗体または抗体様結合タンパク質、もしくは抗体様結合タンパク質をコードする核酸であり、
    （v）薬学的に活性な物質は、ベンゾトリアジンＮ－オキシド、アパジコン（EO9）、チラパザミン（TPN）、SN30000、PR-104A、TH-302、TH-4000、AQ4Nからなる群から選択される低酸素活性化プロドラッグであり、または、
    （vi）薬学的に活性な物質は、抗原または抗原をコードする核酸である、
    請求項９に記載の単離された標的化送達系。
  11. 標識は、
    （i）蛍光染料、蛍光発光同位体、放射性同位体、検出可能なポリペプチド、または検出可能なポリペプチドをコードする核酸および造影剤からなる群から選択され、または造影剤は、Gd、Eu、WおよびMnから選択される常磁性剤、もしくはGd、Eu、WおよびMnから選択される常磁性剤であって、フェリハイドライドを含む、または、
    （ii）二価もしくは三価の金属カチオンと錯体を形成するキレート剤を含む、または、キレート剤は、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－Ｎ，Ｎ’，Ｎ，Ｎ’－四酢酸（ＤＯＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１，４，７－トリアザシクロノナン-１，４，７－三酢酸（ＮＯＴＡ）、トリエチレンテトラミン（ＴＥＴＡ）、イミノ二酢酸、ジエチレントリアミン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’’－ペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）および６－ヒドラジノピリジン－３－カルボン酸（HYNIC）からなる群から選択される、
    請求項１～１０のいずれか１項に記載の単離された標的化送達系。
  12. （i）放射性同位体／蛍光放出同位体は、アルファ線放出同位体、ガンマ線放出同位体、オージェ電子放出同位体、Ｘ線放出同位体、蛍光同位体、蛍光放出同位体、ならびに、タンパク質、ペプチド、小分子阻害剤、抗体または他の化合物と上記との結合体および組み合わせからなる群から選択され、
    （ii）蛍光染料は、以下のクラスの蛍光染料からなる群から選択される：キサンテン、アクリジン、オキサジン、シニン、スチリル染料、クマリン、ポルフィン、金属－配位子－錯体、蛍光タンパク質、ナノクリスタル、ペリレンおよびフタロシアニンならびにこれらの種類の染料の結合体および組合せ、または、
    （iii）検出可能なポリペプチドは、自己蛍光タンパク質、もしくは緑色蛍光タンパク質、または改変された吸着および／または発光スペクトルを有するその構造的変異体である、
    請求項１１に記載の単離された標的化送達系。
  13. （ｉ） 複合体中に含まれる鉄結合タンパク質と薬学的に活性な物質、標識または薬学的に活性な物質と標識との間の結合は共有結合および／または非共有結合である、および／または
    （ｉｉ） 複合体中に含まれる薬学的に活性な物質、標識または薬学的に活性な物質と標識は鉄結合タンパク質またはその多量体によって捕捉／封入されている、
    請求項１～１２のいずれか１項に記載の単離された標的化送達系。
  14. ａ） 精製された鉄結合タンパク質を提供すること、
    ｂ） 薬学的に活性な物質、標識または薬学的に活性な物質と標識を共有結合的または非共有結合的に連結し、および／または、薬学的に活性な物質、標識または薬学的に活性な物質と標識を鉄結合タンパク質中に封入すること、
    ｃ） 採取されたCD45+白血球細胞を準備すること、および
    ｄ１） 鉄結合タンパク質と、工程ｂ）で産生された薬学的に活性な物質、標識または薬学的に活性な物質と標識の複合体がCD45+白血球細胞に少なくとも部分的に負荷されるまで、工程ｂ）で産生した鉄結合タンパク質の存在下でCD45+白血球細胞をインキュベートすること、および／または
    ｄ２） CD45+白血球細胞が少なくとも部分的に標識で標識されるまで、標識の存在下でCD45+白血球細胞をインキュベートすること、
    の工程を含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載の単離された標的化送達系の製造方法。
  15. 医薬または診断剤の製造に使用するための、請求項１～１３のいずれか１項に記載の単離された標的化送達系。
  16. 請求項１～１３のいずれか１項に記載の単離された標的化送達系と薬学的に許容される担体および／または適切な賦形剤を含む医薬組成物。
  17. 腫瘍、もしくは固形腫瘍および／またはその転移、もしくは乳がん、膵臓がん、膀胱がん、肺がん、大腸がん、または、低酸素マーカーであるピモニダゾロンで可視化可能な低酸素領域を有する腫瘍、炎症性疾患の予防、治療もしくは診断に使用するための、または予防的または治療的ワクチン接種のための、感染性疾患もしくは癌を予防または治療するための、請求項１～１３のいずれか１項に記載の単離された標的化送達系。
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