KR102447396B1 - 세포 표적화된 활성 성분 전달 시스템 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 하나 이상의 철 결합 단백질과 활성 성분의 복합체를 세포 내에 포함하는 CD45+ 백혈구 세포를 포함하는 단리된 세포 표적화 전달 시스템과 더불어 이러한 단리된 세포 표적화 전달 시스템의 제조 방법, 및 치료법을 위한, 특히 암의 치료법을 위한 이러한 시스템의 용도에 관한 것이다.

Description

세포 표적화된 활성 성분 전달 시스템{CELLULAR TARGETED ACTIVE INGREDIENT DELIVERY SYSTEM}
본 발명은 하나 이상의 철 결합 단백질과 활성 성분의 복합체를 세포 내에 포함하는 CD45+ 백혈구 세포를 포함하는 단리된 세포 표적화 전달 시스템과 더불어 이러한 단리된 세포 표적화 전달 시스템의 생성 방법, 및 치료법을 위한, 특히 암의 치료법을 위한 이러한 시스템의 용도에 관한 것이다.
현재의 영상화 수단은 큰 전이(크기가 0.5-1 cm 초과)를 검출할 수 있다. 그러나, 그들은 전이성 종양 세포의 초기 확산을 거의 검출하지 못한다. 0.5 cm 미만의 인간 전이는 무혈관성이므로 적당한 혈액 및 산소 공급이 없다. 그것은 이들 전이를 표지하고 그들을 영상화하는 목적을 위한 혈액 순환을 통한 조형제의 전달이 가능하지 않음을 의미한다. 저산소증의 존재는 미세전이의 통상적 특징이며, 여기에서 혈액 관류가 없거나 거의 없는 경우에 저산소 분획은 90%에 달할 수 있다(문헌[Li, et al. 2012, Journal of Solid Tumours, 2(2): 28-33]). 따라서, 중증 저산소증은 미세-전이의 일반적 특징으로 간주된다.
몇몇 생체-장벽(bio-barrier), 불량한 혈액 공급에 의해 미세전이에 대한 접근이 방해를 받으므로 정상 세포의 큰 개체군 내에 숨겨진 하나 이상의 미세전이의 표적화는 고유의 문제점을 야기하며, 미세전이의 작은 크기 및 그들의 장기에 대한 분산에 의해 추가의 장애가 야기된다.
동일한 이유로 미세전이는 종종 치료법에 대해 난치성(refractive)이다. 그로부터 미세전이가 유래된 고형 종양은 종종 관용적인 치료법에 양호하게 반응하지만 원발 종양의 부위 또는 전이의 부위에 종종 재성장이 있다. 이는 임상 종양학에서 심각한 문제를 구성한다(문헌[Mputhana, et al. 2012, Cancer Res; 73(2); 490-495]). 그것은 약물 침투를 제한함으로써 유효 농도 미만의 약물에 종양을 노출시키는 고형 종양의 미세환경의 특징에 관련된다(문헌[Hobbs, et al. 1998, Proc Natl Acad Sci USA: 4607-4612]). 이는 암 세포의 높은 불균질성, 낮은 산소 분압(저산소증), 매스 내의 낮은 pH 및 낮은 글루코스 농도를 유발하는 부적절한 혈관구조에 의해 야기된다(문헌[Kizaka-Kondoh, et al., 2003, Cancer Sci 94(12):1021-1028]). 부가적으로, 일부 영역에서의 빠른 종양 세포 증식이 신생 혈관 성장 속도를 추월하여 저산소 영역의 형성을 촉진할 수 있다(문헌[Lewis and Murdoch, 2005, Am J Pathol 167(3):627-635]). 이러한 비정상적 혈관 구조, 및 이후의 종양 저산소증을 유발하는 그들의 손상된 작용은 더 악성인 표현형 및 고형 종양을 앓는 환자에서 불량한 생존과 연계되며 감소된 약물 흡수로 인한 치료 실패 및 암 세포에서의 저산소증-유도성 변화 양자 모두를 유발한다(문헌[Sun, et al., 2012, Clin Cancer Res 18(3):758-770]; 문헌[Sullivan, et al., 2008 Mol Cancer Ther 7(7):1961-1973]; 문헌[Kizaka-Kondoh, et al., 2003, Cancer Sci 94(12):1021-1028]). 또한, 화학요법 또는 방사선요법은 종양 저산소증의 큰 영역의 부가적인 형성을 야기함으로써 종양의 치료를 더욱 더 어렵게 만든다. 항암 치료법의 효능이 저산소 종양 세포의 존재에 의해 제한된다는 사실은 이 문제의 극복을 목표로 하는 다양한 치료적 접근법의 도입을 유발했다.
본 발명자들은 CD45+ 백혈구 세포, 특히 활성화 대식세포가 시험관내에서 하나 이상의 철 결합 단백질과 복합체를 형성한 활성 성분을 흡수하고 생체내에서 이들 복합체를 세포에, 또는 세포 내로, 바람직하게 종양 세포에, 또는 종양 세포 내로 전달할 수 있다는 것을 발견하였다. 이러한 관찰을 기반으로 본 발명자들은 선행 기술의 상기 언급된 문제 중 하나 이상을 극복하였다. 따라서, 본 발명의 표적화 전달 시스템은 그 중에서도 하기 이점 중 하나 이상을 제공한다: (i) 상기 언급된 CD45+ 백혈구를 유인하는 조직에 대한, 바람직하게 질환 세포 내로의, 하나 이상의 활성 성분의 특이적 전달, (ii) 혈액 순환 내에서의 불활성화 또는 신체로부터의 청소율로부터의 활성 성분의 보호, (iii) 혈관 형성이 불량하거나 없는 질환 영역의 세포, 예를 들어, 전이, 더 큰 종양 내의 저산소 영역, 류머티스 병변, 무혈관성 상처(avascular wound), 피부에 대한, 바람직하게 그 내로의 활성 성분의 전달, (iv) 활성 성분의 감소된 독성, (v) 약동학이 불량한 활성 성분의 전달, (vi) 약물의 표적화 전달로 인한 약물의 감소된 부작용, (vii) 표적화 전달로 인한 더 낮은 용량의 약물을 이용하는 더 높은 치료 효능; 및/또는 (viii) CD45+ 백혈구 내에 로딩되는 철-결합 단백질과 연결된 약물의 투여로 인한 약물 투여의 부위에서의 국소 조직 손상의 더 낮은 위험(문헌[Perez-Herrero E, Fernandez-Medarde A. 2015, Eur J Pharm Biopharm 93:52-79]).
제1 태양에서 본 발명은, 세포 내에 하나 이상의 철 결합 단백질과 하나 이상의 활성 성분의 복합체를 포함하는, 바람직하게 철 결합 단백질을 내재화할 수 있는 CD45+ 백혈구 세포를 포함하는 단리된 표적화 전달 시스템에 관한 것이다.
제2 태양에서 본 발명은,
a) 바람직하게 정제된 철 결합 단백질을 제공하는 단계;
b) 활성 성분을 철 결합 단백질에 공유적으로 또는 비공유적으로 연결하고/하거나 활성 성분을 철 결합 단백질 내에 캡슐화하는 단계;
c) CD45+ 백혈구 세포를 제공하는 단계; 및
d) CD45+ 백혈구 세포가 단계 b)에서 생성된 철 결합 단백질과 활성 성분의 복합체로 적어도 부분적으로 로딩될 때까지 단계 b)에서 생성된 철 결합 단백질과 활성 성분의 복합체의 존재 하에 CD45+ 백혈구 세포를 인큐베이션하는 단계를 포함하는, 본 발명의 제1 태양의 단리된 표적화 전달 시스템의 제조 방법에 관한 것이다.
제3 태양에서 본 발명은, 의약으로 사용하기 위한 본 발명의 제1 태양의 단리된 표적화 전달 시스템에 관한 것이다.
제4 태양에서 본 발명은, 본 발명의 단리된 표적화 전달 시스템 및 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 적합한 부형제(들)를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
제5 태양에서 본 발명은, 종양, 바람직하게 고형 종양, 바람직하게 유방암, 췌장암, 방광암, 폐암, 대장암(colon cancer), 또는 저산소 영역을 가진 종양, 특히 피부 상처 내의 또는 장기 경색(심장) 또는 허혈성 망막 후의 염증성 질환 또는 허혈성 영역의 예방/치료에 사용하기 위한, 본 발명의 제1 태양의 단리된 표적화 전달 시스템에 관한 것이다.
본 발명을 하기에 상세하게 기재하기 전에, 본 명세서에 기재된 특정 방법론, 프로토콜, 및 시약은 변동될 수 있으므로 본 발명은 이들로 제한되지 않음을 이해해야 한다. 본 명세서에서 사용되는 용어는 단지 특정 실시양태를 기재하는 목적을 위한 것이며, 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 본 발명의 범위를 제한하고자 의도된 것이 아님을 또한 이해해야 한다. 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 당업자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 나타낸다.
하기에 본 발명의 요소들을 기재하고자 한다. 이들 요소들은 특이적 실시양태와 함께 열거되어 있으나, 그들이 임의의 방식 및 임의의 수로 조합되어 부가적인 실시양태를 생성할 수 있음을 이해해야 한다. 다양하게 기재된 실시예 및 바람직한 실시양태는 명시적으로 기재된 실시양태만으로 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 상세한 설명은 명시적으로 기재된 실시양태를 임의의 수의 개시되고/되거나 바람직한 요소들과 조합하는 실시양태를 지지하고 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 추가로, 본 출원에 기재된 모든 요소들의 임의의 순열 및 조합은 맥락이 달리 표시하지 않는 한 본 출원의 상세한 설명에 의해 개시된 것으로 간주되어야 한다.
본 명세서의 본문 전체에 걸쳐 몇몇 문서가 인용된다. 상기 또는 하기의 본 명세서에 인용된 각각의 문서(모든 특허, 특허 출원, 과학 간행물, 제조사 규격서, 설명서 등을 포함함)은 원용에 의해 전체적으로 본 명세서에 포함된다. 본 명세서의 어떠한 것도 선행 발명에 의한 이러한 개시에 대해 본 발명이 선원의 지위가 없음을 시인하는 것으로 해석되어서는 안된다.
정의
달리 표시되지 않는 한, 본 발명을 실시하기 위해 화학, 생화학, 및 재조합 DNA 기술의 관용적인 방법이 채용되며, 이는 본 분야의 문헌에 설명되어 있다(예를 들어, 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989] 참조).
본 명세서 및 이어지는 청구범위 전체에 걸쳐, 맥락이 달리 요구하지 않는 한, 단어 "포함하다", 및 "포함하여" 및 "포함하는"과 같은 변형은, 임의의 다른 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹의 배제가 아니라 언급된 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹의 포함을 시사하는 것으로 이해될 것이다. 본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용되는 바와 같이, 내용이 명백하게 달리 지시하지 않는 한, 단수 형태("a", "an", 및 "the")는 복수의 지시 대상을 포함한다.
용어 "표적화 약물 전달"은 환자에 대한 활성 성분의 전달을 지칭하며, 이는 그 환자의 신체의 다른 지역에 비교할 때 신체의 특정 지역에서 활성 성분의 증가된 농도를 유발한다. 바람직하게, 상대 농도는 신체의 질환 지역(들)과 혈액 순환에 대해 유사한 접근성을 나타내는 신체의 다른 지역 사이에서 비교한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 표적화 전달 시스템의 투여 후에, 바람직하게 2-24 hr 후에, 질환 지역으로부터 주어진 수의 세포 또는 주어진 생검 부피 내의 활성 성분의 농도는 비-질환 지역으로부터의 동일한 수의 세포 또는 생검 부피에 비교할 경우에 적어도 10% 더 높다. 더욱 바람직하게, 본 발명의 표적화 전달 시스템의 투여 후에, 바람직하게 2-24 hr 후에, 환자의 신체의 질환 지역 내의 활성 성분의 농도는 신체의 비-질환 지역 내에서보다 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70% 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 150%, 적어도 200%, 적어도 250%, 적어도 300%, 적어도 350%, 적어도 400%, 적어도 450%, 적어도 500%, 더욱 바람직하게 적어도 1000% 더 높다. 총 신체 분포를 기반으로 평가할 때, 환자에게 투여된 활성 성분의 적어도 5%, 바람직하게 적어도 10%, 더욱 바람직하게 적어도 15%가 신체의 질환 지역에 전달되는 것이 바람직하다. 활성 성분의 표적화 전달은 신체의 질환 지역에 대한 활성 성분의 잠재적 유해 효과를 제한한다.
용어 "표적화 약물 전달 시스템" 또는 "표적화 전달 시스템"은 본 출원에서 동의어로 사용되며, 바람직하게 환자의 신체 내에서, 활성 성분을 표적화 지역에 전달할 수 있는, 즉, 표적화 전달이 가능한 시스템을 지칭한다.
용어 "활성 성분" 또는 "약물"은 본 발명의 맥락에서 동의어로 사용되며, 바람직하게 환자의 신체 내에서, 세포 활성을 개질 또는 조정하거나, 활성화되어 세포 활성을 개질 또는 조정할 수 있는(즉, 전구약물) 임의의 화합물을 지칭한다. 이러한 활성 성분의 예는 소위 "소분자" 및 펩티드를 포함한다. 본 발명의 맥락에서 용어 "소분자"는 분자량이 1.500 g/mol 미만인 탄화수소 또는 약제학적으로 활성인 방사성 동위원소를 지칭하기 위해 사용된다. 사용할 수 있는 바람직한 약물은 항암 약물, 약제학적으로 활성인 방사성 동위원소, 또는 페리하이드라이트를 포함한다.
본 발명의 맥락에서 사용되는 용어 "전구약물"은, 투여 후에 적어도 하나의 특성에 대해 생물학적으로 활성이거나 더 활성인 성분(또는 약물)으로 대사되거나 달리 전환되는 임의의 활성 성분을 지칭한다. 약물에 비교하여, 전구약물은 그것을 약물에 비해 덜 활성이거나 불활성으로 만드는 방식으로 화학적으로 개질되지만, 화학적 개질은 전구약물이 환자에게 투여된 후에 대사 과정 또는 다른 생물학적 과정에 의해 상응하는 약물이 생성되도록 하는 것이다. 예를 들어, 전구약물은 활성 약물에 비해 변경된 대사 안정성 또는 수송 특징, 더 적은 부작용 또는 더 낮은 독성, 또는 개선된 향미를 나타낼 수 있다(예를 들어, 원용에 의해 본 명세서에 포함된 참고문헌[Nogrady, 1985, Medicinal Chemistry A Biochemical Approach, Oxford University Press, New York, pages 388-392] 참조). 전구약물은 상응하는 약물 이외의 반응물을 사용하여 합성할 수 있다.
용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산"은 본 명세서에서 호환적으로 사용되며, 뉴클레오티드 단량체로부터 제조된 중합체성 또는 올리고머성 거대분자로서 이해된다. 뉴클레오티드 단량체는 핵염기, 오탄당(리보오스 또는 2'-데옥시리보오스와 같으나 이로 제한되지 않음), 및 1 내지 3개의 포스페이트 기로 구성된다. 전형적으로, 폴리뉴클레오티드는 개별적인 뉴클레오티드 단량체 사이의 포스포디에스테르 결합을 통해 형성된다. 본 발명의 맥락에서 핵산 분자라고 지칭되는 것은 리보핵산(RNA), 데옥시리보핵산(DNA), 및 예를 들어 RNA-DNA 혼성체와 같은 그의 혼합물을 포함하나 이로 제한되지 않는다. 예를 들어 포스포트리에스테르 방법에 따라, 예를 들어 화학적으로 핵산을 합성할 수 있다(예를 들어, 문헌[Uhlmann, E. & Peyman, A. (1990) Chemical Reviews, 90, 543-584] 참조). "압타머"는 폴리펩티드에 고친화도로 결합하는 핵산이다. 압타머는 SELEmir146-a(예를 들어, 문헌[Jayasena (1999) Clin. Chem., 45, 1628-50]; 문헌[Klug and Famulok (1994) M. Mol. Biol. Rep., 20, 97-107]; 제US 5,582,981호 참조)와 같은 선택 방법에 의해 상이한 단일-가닥 RNA 분자의 큰 풀로부터 단리될 수 있다. 압타머는 또한 그들의 거울상 형태로, 예를 들어 L-리보뉴클레오티드로서 합성되고 선택될 수 있다(문헌[Nolte et al. (1996) Nat. Biotechnol., 14, 1116-9]; 문헌[Klussmann et al. (1996) Nat. Biotechnol., 14, 1112-5]). 이 방식으로 단리된 형태는 천연적으로 발생하는 리보뉴클레아제에 의해 그들이 분해되지 않으므로 더 큰 안정성을 보유한다는 이점을 향유한다.
본 발명의 맥락에서 용어 "펩티드" 또는 "폴리펩티드"는, 펩티드 결합에 의해 연결된 적어도 2개의 아미노산의 사슬을 지칭하기 위해 호환적으로 사용된다. 따라서, 본 발명의 맥락에서 용어 "펩티드"는 또한 50개 초과, 100개 초과, 또는 150개 초과의 아미노산을 가진 아미노산 사슬을 지칭하기 위해 사용된다.
본 발명의 맥락에서 사용되는 용어 "항체"는 면역글로불린 수퍼패밀리에 속하는 당단백질을 지칭하며; 용어 항체 및 면역글로불린은 종종 호환적으로 사용된다. 항체는 형질 세포에 의해 생성되고 면역 시스템에 의해 사용되어 박테리아 및 바이러스와 같은 이물질을 식별하고 중화하는 단백질 분자를 지칭한다. 항체는 외래 표적의 고유 부분인 그의 항원을 인식한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "항체 단편"은, 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유한 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 용어 "항체 단편" 내에 포함되는 결합 단편의 예는 단편 항원 결합(Fab) 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, 중쇄 항체, 단일-도메인 항체(sdAb), 단쇄 가변 단편(scFv), 가변 단편(Fv), VH 도메인, VL 도메인, 단일 도메인 항체, 나노바디(nanobody), IgNAR(면역글로불린 신규 항원 수용체), 디-scFv, 이중특이적 T-세포 관여항체(BITE: bispecific T-cell engager), 이중 친화도 재표적화(DART: dual affinity re-targeting) 분자, 삼중체(triple body), 디아바디(diabody), 단쇄 디아바디, 대체 골격 단백질, 및 그의 융합 단백질을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "디아바디"는 상이한 항원에 결합할 수 있는 융합 단백질 또는 2가 항체를 지칭한다. 디아바디는 항체의 단편, 즉, 가변 단편을 포함하는 2개의 단일 단백질 사슬로 구성된다. 디아바디는 동일한 폴리펩티드 사슬 상의 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함한다(VH-VL, 또는 VL-VH). 2개의 가변 도메인을 연결하는 짧은 펩티드를 사용함으로써, 도메인이 다른 사슬의 상보적 도메인과 쌍을 이루도록 하며, 따라서 2개의 항원-결합 부위를 생성한다. 디아바디는 동일하거나(단일특이적) 상이한(이중특이적) 항원을 표적으로 할 수 있다.
"단일 도메인 항체"는 항체의 단일한 단량체성 가변 도메인으로 구성된 항체 단편을 지칭한다. 그들은 단순히 낙타과 또는 연골 어류에 의해 생성되는 중쇄 항체의 단량체성 중쇄 가변 지역을 포함할 뿐이다. 그들의 상이한 기원으로 인해, 그들은 또한 VHH 또는 VNAR(가변 신규 항원 수용체)-단편이라고 지칭된다. 대안적으로, 단일-도메인 항체는 유전 공학의 사용에 의해 관용적인 마우스 또는 인간 항체의 가변 도메인의 단량체화에 의해 얻어질 수 있다. 그들은 대략 12-15 kDa의 분자량을 나타내므로, 항원 인식이 가능한 최소의 항체 단편이다. 추가의 예는 나노바디 또는 나노항체를 포함한다.
본 명세서의 맥락 내에서 사용되는 용어 "유사 항체"는, 항체와 유사하지만 구조적으로 항체에 관련되지 않는, 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 화합물을 지칭한다. 통상적으로, 유사 항체는 항원에 특이적으로 결합하는 1개, 2개, 또는 그 이상의 노출된 도메인을 포함하는 분자량이 약 3 내지 20 kDa인 인공 펩티드 또는 단백질이다. 예는 특히 LACI-D1(지질단백질-연계 항응고제); 아필린, 예를 들어 인간-γ B 결정질 또는 인간 유비퀴틴; 시스타틴; 설폴로부스 아시도칼다리우스(Sulfolobus acidocaldarius)로부터의 Sac7D; 리포칼린 및 리포칼린으로부터 유도된 안티칼린; DARPin(설계된 안키린 반복 도메인); Fyn의 SH3 도메인; 프로테아제 저해제의 쿠니츠(Kunits) 도메인; 모노바디, 예를 들어 피브로넥틴의 10th 유형 III 도메인; 아드넥틴: 노틴(knottin)(시스테인 노트 미니단백질(cystein knot miniprotein)); 아트리머; 에비바디, 예를 들어 CTLA4-기반의 결합제, 아피바디, 예를 들어 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로부터의 단백질 A의 Z-도메인으로부터의 3-나선 번들; 트랜스-바디, 예를 들어 인간 트랜스페린; 테트라넥틴, 예를 들어 단량체성 또는 삼량체성 인간 C-유형 렉틴 도메인; 마이크로바디, 예를 들어 트립신-저해제-II; 아필린; 아르마딜로 반복 단백질을 포함한다. 핵산 및 소분자도 간혹 유사 항체로 간주되지만(압타머), 이들로 구성된 인공 항체, 항체 단편, 및 융합 단백질은 그렇지 않다. 항체에 비해 통상적인 이점은 더 양호한 용해도, 조직 침투, 열 및 효소에 대한 안정성, 및 비교적 낮은 제조 비용이다.
용어 "서열 동일성"은 본 명세서 전체에 걸쳐 폴리펩티드 및 뉴클레오티드 서열 비교에 관련하여 사용된다. 2개의 서열을 비교하며 서열 동일성 퍼센트를 계산하기 위해 비교할 기준 서열이 규정되지 않는 경우에는, 구체적으로 달리 표시되지 않는다면, 비교할 2개의 서열 중 더 긴 것에 대해 서열 동일성을 계산해야 한다. 기준 서열이 표시되는 경우, 구체적으로 달리 표시되지 않는다면, 서열 번호에 의해 표시된 기준 서열의 전체 길이를 기반으로 서열 동일성을 결정한다. 예를 들어, 300개 아미노산 길이의 기준 폴리펩티드 서열에 비교한 200개 아미노산으로 구성된 폴리펩티드 서열은 66.6%(200/300)의 서열 동일성의 최대 퍼센트를 나타낼 수 있는 반면, 150개 아미노산의 길이를 가진 서열은 50%(150/300)의 서열 동일성의 최대 퍼센트를 나타낼 수 있다. 이들 150개 아미노산 중에서 15개가 300개 아미노산 길이의 기준 서열의 각각의 아미노산과 상이한 경우, 서열 동일성의 수준은 45%로 감소한다. 뉴클레오티드 및 아미노산 서열의 유사성, 즉, 서열 동일성의 퍼센트는 서열 정렬을 통해 결정될 수 있다. 본 기술분야에 공지된 몇몇 알고리듬으로, 바람직하게 칼린(Karlin) 및 알취일(Altschul)의 수학적 알고리듬(문헌[Karlin & Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877])으로, hmmalign(HMMER 패키지, http://hmmer.wustl.edu/)으로, 또는 예를 들어 http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/ 또는 http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html 또는 http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_clustalw.html 상에서 입수가능한 CLUSTAL 알고리듬(문헌[Thompson, J. D., Higgins, D. G. & Gibson, T. J. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 4673-80])으로 이러한 정렬을 실행할 수 있다. 사용되는 바람직한 파라미터는 http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/ 또는 http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html 상에 설정된 바와 같은 기본 파라미터이다. 서열 동일성의 등급(서열 일치)은, 예를 들어 BLAST, BLAT, 또는 BlastZ(또는 BlastX)를 사용하여 계산할 수 있다. BLAST 단백질 검색은 BLASTP 프로그램, 스코어 = 50, 워드 길이 = 3으로 수행한다. 비교 목적으로 갭이 있는 정렬을 얻기 위해서는, 문헌[Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402]에 기재된 바와 같이 Gapped BLAST를 이용한다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 이용할 경우, 각각의 프로그램의 기본 파라미터를 사용한다. 서열 일치 분석은 셔플-라간(Shuffle-LAGAN)(문헌[Brudno M., Bioinformatics 2003b, 19 Suppl 1:I54-I62]) 또는 마르코프 랜덤 필드(Markov random field)와 같은 확립된 상동성 맵핑 기술에 의해 보충될 수 있다. 서열 데이터베이스 검색으로부터의 정보, 3D 구조와 함께 입수가능한 상동체, 및 사용자-정의 한정을 사용하는 다중 단백질 서열 및/또는 구조에 대한 구조 기반의 정렬 또한 사용할 수 있다(문헌[Pei J, Grishin NV:　PROMALS: towards accurate multiple sequence alignments of distantly related proteins.　Bioinformatics　2007,　23:802-808]; 문헌[3DCoffee@igs: a web server for combining sequences and structures into a multiple sequence alignment. Poirot O, Suhre K, Abergel C, O'Toole E, Notredame C. Nucleic Acids Res. 2004 Jul 1;32:W37-40]). 본 출원에서 서열 동일성의 퍼센트를 지칭할 경우, 구체적으로 달리 표시되지 않는다면, 이들 퍼센트는 더 긴 서열의 전체 길이에 관련하여 계산된다.
본 발명의 맥락에서 용어 "백혈구"는 감염성 질환 및 외래 침입체 양자 모두에 대해 신체를 보호하는 것에 관여하는 면역 시스템의 세포를 지칭하기 위해 사용된다. 모든 백혈구는 조혈 모세포라고 공지된 골수 내의 다능성 세포로부터 생성되고 유도된다. 백혈구는 혈액 및 림프 시스템을 포함하는 신체 전체에 걸쳐 발견된다. 모든 백혈구는 핵을 가지고 있으며, 이는 그들을 다른 혈구, 무핵 적혈구(RBC), 및 혈소판으로부터 구별한다. 백혈구의 유형은 표준 방식으로 분류할 수 있다. 2 쌍의 가장 넓은 카테고리가 구조(과립구 또는 무과립구) 또는 세포 분열 계통(골수 세포 또는 림프 세포)에 의해 그들을 분류한다. 이들 가장 넓은 카테고리는 하기 5개의 주요 유형으로 추가로 분할될 수 있다: 호중구, 호산구, 호염기구, 림프구, 및 단핵구. 이들 유형은 그들의 물리적 특징 및 작용적 특징에 의해 구별된다. 단핵구 및 호중구는 식세포성이다. 추가의 하위유형을 분류할 수 있으며, 예를 들어, 림프구 중에는 B 세포, T 세포, 및 NK 세포가 있다. 과립구는 그들의 핵 형상(열편 대 원형, 즉, 다형핵성 대 단핵성) 및 그들의 세포질 과립(존재 또는 부재, 또는 더욱 정확하게 광학 현미경 상에서 가시적이거나 그렇게 가시적이지 않음)에 의해 무과립구로부터 구별된다. 다른 이분법은 하기 계통에 의한 것이다: 골수 세포(호중구, 단핵구, 호산구, 및 호염기구)는 조혈 계통(세포 분화 계통)에 의해 림프 세포(림프구)로부터 구별된다.
특히 CD45+ 백혈구 세포는 신체 내의 특정 조직 및 세포에 유인되며 하나 이상의 철 결합 단백질과 하나 이상의 활성 성분의 복합체를 세포에 또는 세포 내로 전달할 수 있으므로, 본 발명자들은 CD45+ 발현이 본 발명의 표적화 전달 시스템의 맥락에서 사용하기에 적합한 백혈구 세포의 특징임을 관찰했다. CD45+ 백혈구 세포는 클론성 기원의 것이 아닌 한 CD45+ 표면 항원 발현의 공통적 특성을 공유하는 상이한 백혈구의 혼합 개체군임을 당업자는 이해한다. 따라서, CD45+ 백혈구의 다양한 그룹 내의 세포 하위개체군은 본 명세서 전체에 걸쳐 추가의 작용적 특징 및/또는 구조적 특징에 의해 특성화된다. 용어 "CD45+"는 세포 개체군 내의 대부분의 세포 또는 본질적으로 모든 세포가 CD45+ 표면 항원을 발현함을 표시한다. 이러한 맥락에서, 그리고 또한 다른 세포 표면 항원에 관련하여, 용어 "발현하다"는 표면 항원이 세포 내에서 생성되고 세포의 표면 상에 검출가능하게 노출됨을 표시한다. 발현의 수준, 및 따라서 세포의 표면 상에 검출가능하게 노출된 표면 항원의 수는 상이한 백혈구들 사이에서 크게 변동될 수 있다. 일반적으로, 적어도 5 카피, 바람직하게 적어도 10 카피의 표면 항원이 세포의 표면 상에 검출가능하게 노출될 경우, 세포는 양성인 것으로 간주되며, 즉, 세포 표면 항원에 대해 "+"인 것으로 표시된다. 당업자는 주어진 세포 표면 항원에 대해 양성(또는 음성)인 세포를 검출하고 정량화하고 선택하는 방법을 숙지하고 있다. 바람직한 방법은 형광 활성화 세포 분류(FACS: Fluorescence Activated Cell Sorting)를 포함한다. 이 기술에서는 형광 표지된 항체를 사용하여 세포 개체군의 세포 표면 항원에 결합시키고, 이어서 세포를 단일 세포로 단리하고, 단일 세포에 대해 측정된 형광 강도를 기반으로 주어진 세포 표면 항원에 대해 양성 또는 음성인 것으로 특성화한다. 본 발명의 일부 실시양태에서는 주어진 단백질의 발현이 높거나 낮음이 표시된다. 이는 양자 모두의 경우에 단백질이 검출가능하게 발현되지만(즉, "+"임) 상이한 수준으로 발현됨을 의미한다. 높고 낮은 발현은 각각 상이한 단백질에 대해 세포 당 단백질의 상이한 절대 갯수를 의미할 것이다. 따라서, 주어진 단백질은 세포 당 그 단백질의 500개 초과의 검출가능한 카피가 존재한다면 고수준으로 발현되는 것으로 간주될 수 있고, 세포 당 그 단백질의 1 내지 50개의 검출가능한 카피가 존재한다면 저수준으로 발현되는 것으로 간주될 수 있다. 그러나, 다른 단백질은 5000개 초과의 검출가능한 카피가 존재한다면 고수준으로 발현되는 것으로 간주될 수 있고, 세포 당 1 내지 500개의 검출가능한 카피가 존재한다면 저수준으로 발현되는 것으로 간주될 수 있다. 유세포분석 및 벡톤 디킨슨 퀀티브라이트(Becton Dickinson Quantibrite)™ 비드 방법(예를 들어 문헌[Pannu, K.K., 2001, Cytometry.　2001 Dec 1;45(4):250-8] 참조) 또는 질량 분석법(예를 들어 문헌[Milo, R., 2013, Bioessays, 35(12): 1050-1055] 참조)을 사용하여 세포 내에 발현되거나 생성되는 단백질의 수를 정량화하는 방법은 당업계에 주지되어 있다. 본 발명의 목적상, 용어 주어진 단백질의 "고발현"은 건강한 CD45+ 백혈구의 개체군 내에서 발견되는 최고 발현 수준의 적어도 70%인 그 단백질의 검출가능한 발현(즉, 세포 당 카피의 수)을 지칭한다. 용어 주어진 단백질의 "저발현"은 건강한 CD45+ 백혈구의 개체군 내에서 발견되는 최고 발현 수준의 30% 이하인 그 단백질의 검출가능한 발현(즉, 세포 당 그 단백질의 카피의 수)을 지칭한다. 바람직하게, "최고 발현 수준"은 상이한 대상의 건강한 CD45+ 백혈구에서 발견되는 최고 발현 수준의 평균으로서 결정된다. 일부 실시양태에서 바람직한 세포 하위개체군은 주어진 단백질을 "생성"하는 것으로 특성화된다. 이는 단백질이 세포의 표면 상에서 반드시 검출가능하지는 않지만 세포 내부에 단지 존재할 수 있음을 의미하는 것으로 이해된다. 당업자는 세포 내부에서 단백질의 생성을 검출 및/또는 정량화하는 방법 및/또는 이러한 단백질을 생성하는 세포를 선택하는 방법을 숙지하고 있다.
본 발명의 맥락에서 용어 "분화된 단핵구"는 주로 골수 내에 체류하며(그러나 비장 내에도 존재할 수 있음) 수지상 세포 또는 대식세포로 분화하는 대식세포-DC 전구체(MDP)라고 칭하는 수임 전구체(committed precursor)로부터 분화된 단핵구를 지칭하기 위해 사용된다. 마우스에서 그들은 하기 2개의 주요 하위개체군으로 구성된다: (i) CX3CR1의 고발현, CCR2 및 Ly6C-의 저발현을 나타내는 CD11b+ 세포 및 (ii) CX3CR1의 저발현, CCR2 및 Ly6C+의 고발현을 나타내는 CD11b+ 세포. 골수를 떠난 후에, 마우스 Ly6C+　단핵구는 순환 중에 Ly6C- 단핵구로 분화한다. 마찬가지로, 인간 단핵구 분화에서, CD14++　고전적 단핵구는 골수를 떠나 말초 혈액 순환 중에 CD14++CD16+　중간체 단핵구로 분화하고, 순차적으로 CD14+CD16++ 비-고전적 단핵구로 분화한다는 것이 인정된다(문헌[Yang et al. 2014; Biomark Res 2(1) doi. 10.1186/2050-7771-2-1]).
대식세포는 조직-체류 전문 식세포 및 항원-제시 세포(APC: antigen-presenting cell)이며, 이는 순환 말초 혈액 단핵구(PBM: peripheral blood monocyte)로부터 분화한다. 본 발명의 맥락에서 용어 "활성화 대식세포"는 극성화된 임의의 대식세포를 지칭하기 위해 사용된다. 대식세포 활성화는 일반적으로 인터류킨, 사이토카인, 및/또는 성장 인자와 함께 인큐베이션함으로써 달성된다. 특히 IL-4 및 M-CSF를 활성화제로 사용할 수 있다. 상이한 표현형의 활성화 대식세포는 M1-대식세포, 고전적으로 활성화된 대식세포(CAM: classically activated macrophage) 및 M2-대식세포, 대안적으로 활성화된 대식세포(AAM: alternatively activated macrophage)로 분류된다. 고전적으로 활성화된 M1-대식세포는 급성 염증 표현형을 나타내는 면역 효과기 세포(immune effector cell)를 포함한다. 이들은 박테리아에 대해 고도로 공격성이며 다량의 림포카인을 생성한다(문헌[Murray, and Wynn, 2011, J Leukoc Biol, 89(4):557-63]). 대안적으로 활성화된 항-염증 M2-대식세포는 적어도 3개의 하위그룹으로 분리될 수 있다. 이들 하위유형은 면역력의 조절, 용인성의 유지, 및 조직 수복/상처 치유를 포함하는 다양한 상이한 작용을 나타낸다. 본 발명의 맥락에서 용어 "M1 유도제"는 PBM이 M1 유형의 대식세포로 분화하는 것을 지시하는 화합물을 지칭하기 위해 사용된다. 본 발명의 맥락에서 용어 "M2 유도제"는 PBM이 M2 유형의 대식세포로 분화되는 것을 지시하는 화합물을 지칭하기 위해 사용된다. 당업자는 M1 또는 M2 대식세포로의 분화를 촉진하는 다수의 방식을 인지하고 있다.
용어 "대식세포에 의한 식작용"은 대식세포가 고체 입자를 삼켜 포식소체라고 공지된 내부 소포(internal vesicle)를 형성하는 과정이다.
사용되는 용어 "철 결합 단백질"은 철 이온에 비공유적으로 결합하는 단백질을 지칭한다. 이러한 단백질의 예는 페리틴, 헤모글로빈, 트랜스페린; 및 락토페린을 포함한다. 철 결합 단백질은 이들 단백질의 세포 내로의 내재화를 촉진하는 세포 표면 수용체에 의해 결합된다
제1 태양에서 본 발명은, 세포 내에 하나 이상의 철 결합 단백질과 하나 이상의 활성 성분의 복합체를 포함하는, 바람직하게 철 결합 단백질을 내재화할 수 있는 CD45+ 백혈구 세포를 포함하는 단리된 표적화 전달 시스템에 관한 것이다.
주어진 CD45+ 백혈구 세포 또는 세포 개체군이 철 결합 단백질을 내재화하는 능력은 이러한 내재화 과정에 관여하는 수용체의 발현에 따라 달라진다. 페리틴의 내재화를 유발하는 수용체는, 예를 들어 TfR, CXCR4, CD163, 및 TIM-2를 포함한다. 당업자는 철 결합 단백질의 흡수량을 측정하는 방법을 숙지하고 있으며, 바람직한 흡수 측정 방법은 하기 실시예 섹션에 기재되어 있다. 본 발명자들은 또한 CD45+ 백혈구 세포의 하위 개체군이 하나의 철 결합 단백질을 다른 철 결합 단백질에 비해 내재화하는 소정의 성향을 나타냄으로써 더 높은 복합체 농도에 도달하고/하거나 세포로부터 더 적은 복합체의 누출을 나타낼 수 있다는 것에 주목하였다. 이러한 CD45+ 백혈구 하위개체군은 하기에 더욱 상세하게 기재되어 있다.
본 발명의 맥락에서 사용되는 구문 "하나 이상의 철 결합 단백질과 활성 성분의 복합체"는 하나 이상의 활성 성분의 분자가 하나 이상의 철 결합 단백질에 공유적으로 또는 비공유적으로 결합된 조성물을 지칭한다. 하나 이상의 철 결합 단백질과 하나 이상의 활성 성분 사이의 공유 또는 비공유 결합은 직접적이거나 간접적일 수 있다. 후자의 경우에 활성 성분은 링커 또는 스페이서를 통해 철 결합 단백질에 연결된다. 폴리알라닌, 폴리글리신, 탄수화물, (CH2)n 기, 또는 폴리펩티드 링커와 같은 링커 또는 스페이서는 당업자에게 공지되어 있다. 따라서, 당업자는 각각의 응용에 따라 각각의 적합한 링커(들) 또는 스페이서(들)를 선택할 수 있을 것이다. 철 결합 단백질이, 예를 들어 페리틴과 같은 케이지를 형성한다면, 용어 "복합체"는 심지어 단백질(들)과 활성 화합물(들) 사이의 공유 또는 비공유 결합의 부재 하에서 케이지 내의 활성 성분의 봉입 또한 포함한다. 복합체의 형성은 세포가 철 결합 단백질을 내재화할 때 활성 성분의 세포 내로의 수송을 가능하게 한다. 따라서, 활성 성분은 수송 기전을 방해하지 않는 방식으로 철 결합 단백질에 결합하는 것이 바람직하다. 당업계에 공지되고 하기 실시예 섹션에 기재된 흡수 어세이를 사용하여 당업자는 이를 용이하게 시험할 수 있다. 복합체가 신체 내의 표적 지역으로의 세포 내의 수송을 견디기에 충분하게 안정한 것이 바람직하다. 따라서, 활성 성분 단독이 아니라 복합체가 표적 지역 내의 세포에 또는 세포 내로 전달되는 것이 바람직하다. 이러한 특성은 또한 CD45+ 백혈구에 대한 활성 성분의 가능한 유해 효과, 예를 들어 세포독성을 감소시킨다. 활성 성분이 철 결합 단백질에 공유적으로 커플링되는 경우, 이러한 커플링은 바람직하게 철 결합 단백질의 세포 흡수에 요구되는 세포 수용체에 대한 결합에 관여하지 않는 표면 영역에 위치하는 것으로 공지된 아미노산 잔기를 통한 것이다. 본 발명의 맥락에서 사용되는 철 결합 단백질은 매우 다양한 활성 성분과 비공유적으로 결합된 안정한 복합체를 형성할 수 있다.
CD45+ 백혈구는 치료할 환자로부터 유래하며, 이러한 경우에 복합체로 로딩된 세포는 환자에 대해 자가유래(autologous)일 것이다. 본 발명의 표적화 전달로 치료하기 전에 환자를 MHC 유형화하고 주어진 환자에 사용된 백혈구 세포 유형이 환자에 대해 MHC 일치되는 것 또한 예상된다. 이들 2개의 바람직한 실시양태에서 CD45+ 백혈구는 1차 세포이거나 낮은 수의 분화 단계에 의해 1차 세포로부터 유도된다. 대안적으로, CD45+ 백혈구는 불멸화되었지만 바람직하게 형질전환되지 않은 CD45+ 백혈구 세포주로부터의 것일 수 있다. 따라서 CD45+ 백혈구, 바람직하게 대식세포 단리에 사용되는 혈액은 바람직하게 치료할 환자 또는 건강한 공여자로부터 얻어진다. 대안적으로 혈액 은행으로부터 혈액을 얻을 수 있다. 본 명세서에서는 제대혈의 사용 또한 고려된다.
본 발명자들은 CD34+ 조혈 전구 세포로부터 생성가능한 CD45+ 백혈구의 하위개체군이 활성 성분의 표적 특이적 전달에 특히 적합하다는 것에 주목하였다. 따라서, 표적 전달 시스템을 생성하기 위해 사용되는 백혈구가 CD34+ 조혈 전구 세포로부터 유도되는 것이 바람직하다. 당업자는 CD34+ 조혈 전구 세포를 선택하는 방법 및 이러한 세포를 백혈구로 분화시키는 방법을 숙지하고 있다.
바람직하게, CD45+ 백혈구는 단핵구, 분화된 단핵구, 림프구, 및 과립구로 구성된 그룹 중에서 선택된다. 이들 백혈구의 일반적인 카테고리 내의 바람직한 하위개체군은 구조적 파라미터, 예를 들어 주어진 단백질의 존재 또는 부재, 작용적 특성, 및/또는 그들의 생성/분화 방법에 의해 하기에 정의된다. 상기 개관된 바와 같이, 세포 개체군 내에서 모든 세포가 특정 특성을 나타내지는 않더라도 그 개체군 내의 대부분의 세포가 그 특성을 나타내는 한, 본 발명의 표적화 전달 시스템은 여전히 상기 개관된 이점을 제공한다. 따라서, 본 발명의 표적화 전달 시스템의 하나의 바람직한 세포의 특성이 하기에 기재된다. 본 발명의 약제학적 조성물은 수백만개의 세포를 포함할 것이며 개체군 내의 모든 세포가 본 명세서에 개관된 작용적 특성 및/또는 구조적 특성을 나타내지는 않을 것이지만 그럼에도 불구하고 대부분의 세포가 각각의 작용적 특성 및/또는 구조적 특성을 공유한다면 질환을 치료하기 위해 약제학적 조성물을 사용할 수 있음을 당업자는 인정한다.
본 발명자들은 CD45+ 백혈구의 하위개체군이, 특히 효율 및 일반적인 복합체 흡수량, 복합체를 세포 내에 보유하는 능력, 즉, 누출을 방지하고 활성 성분을 표적 방출하는 능력, 특정 철 결합 단백질의 흡수 효율, 및/또는 특정 조직 또는 세포에 대한 표적화, 및 따라서 특정 질환을 치료하거나 완화하기 위한 적합성을 포함하는 유리한 특정 특성을 나타냄을 인식하였다. 본 발명자들은, 예를 들어 하기 항원 중 하나 이상을 발현하는 CD45+ 백혈구가 다른 철 결합 단백질의 흡수에 비해 페리틴 흡수에 바람직함을 관찰하였다: CD204, CD206, CD200R, CCR2. 따라서, 복합체 내의 철 결합 단백질이 페리틴인 경우, 하기 항원 중 하나 이상을 발현하는 CD45+ 백혈구를 선택하는 것이 바람직하다: CD204, CD206, CD200R, CCR2. 따라서, 본 발명의 바람직한 실시양태에서
(i) 단핵구는 CD11b+ CD14+ 단핵구, CD11b+ CD16+ 단핵구, CD11b+ CD14+ CD16+ 단핵구, CD11b+ CD14+ MHCII+ 단핵구, CD11b+ CD14+ CD115+ 단핵구, CD11b+ CD114+ 단핵구, CD11b+ CD116+ 단핵구, CD11b+ CCR1+ 단핵구, CD11b+ CCR2+ 단핵구, CD11b+ CX3CR+ 단핵구, CD11b+ CXR4+ 단핵구, CD11b+ CXR6+ 단핵구, 및 CD11b+ CD14+ CD33+ 단핵구로 구성된 그룹 중에서 바람직하게 선택된 CD11b+ 단핵구이거나;
(ii) 분화된 단핵구는 대식세포, 활성화 대식세포, 바람직하게 CD11b+ 대식세포, 더욱 바람직하게 CD11b+ CD16+ 대식세포, CD11b+ CD32+ 대식세포, CD11b+ CD64+ 대식세포, CD11b+ CD68+ 대식세포, 바람직하게 CD11b+ CD86+ M1 대식세포(바람직하게 유도성 산화질소 합성효소(iNOS)를 생성하고/하거나 인터류킨 12(IL-12)를 분비함), 또는 바람직하게 CD11b+ CCR2+ M2 대식세포, CD11b+ CD204+ M2 대식세포, CD11b+ CD206+ M2 대식세포, CD11b+ CD204+ CD206+ M2 대식세포, CD11b+ 주요 조직적합성 복합체(Major Histocompatibility Complex) II+(MHCII+)(저발현 또는 고발현) M2 대식세포, CD11b+ CD200R+ M2 대식세포, CD11b+ CD163+ M2 대식세포 또는 활성화 대식세포(아르기나제-1 및/또는 인터류킨 10(IL-10)을 생성하고/하거나 분비함); 또는 바람직하게 CD11b CD11c, CD11b CD80, CD11c CD80, CD11c CD86, CD11c MHCII, 및 CD11c CD123의 발현을 나타내는 수지상 세포로 구성된 그룹 중에서 선택되며, 바람직하게 분화된 단핵구는 렉틴-유사 산화된 저밀도 지질단백질 수용체-1(Lox1+), C-X-C 케모카인 수용체 유형 7(CXCR7+), 및 핵 인자(에리트로이드-유도 2)-유사 2(NRF2+)를 발현하는 포말 세포가 아니고, 포말 세포는 혈관 벽 상의 지방 침착물에 편재하는 대식 세포의 유형이며, 여기에서 그들은 저밀도 지질단백질을 섭취하고 그들에게 포말성 외관을 제공하는 지질로 로딩되고, 이들 세포는 플라크 성장에 관여하는 다양한 물질을 분비하며, 그들의 사멸은 염증을 촉진함으로써 심혈관 질환의 원인이 되거나;
(iii) CCR1, CCR2, CXR4, 및 CXR6으로 구성된 그룹 중에서 바람직하게 선택되는 적어도 하나의 케모카인 수용체, 또는 대식세포 콜로니 자극 인자 수용체(CD115), 과립구 콜로니 자극 인자 수용체(CD114), 및 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 수용체(CD116 및 CD131로 구성됨)로 구성된 그룹 중에서 바람직하게 선택되는 적어도 하나의 성장 인자 수용체를 발현하는 단핵구 또는 활성화 단핵구로서; 이들 특징의 단핵구는 염증 병태 및 암을 치료하기에 특히 적합하거나;
(iv) 림프구는 CD3+ 및 CD4+ 또는 CD8+ T 림프구, 또는 CD19+, CD20+, CD21+, CD19+ CD20+, CD19+ CD21+, CD20+ CD21+, 또는 CD19+ CD20+ CD21+ B 림프구로 구성된 그룹 중에서 선택되거나;
(v) 과립구는 호중구, 바람직하게 CD66b+ 호중구, 호산구, 및 호염기구, 바람직하게 CD193+ 호산구로 구성된 그룹 중에서 선택된다.
본 발명의 표적화 전달 시스템의 바람직한 실시양태에서 활성화 대식세포는:
(i) 단핵구 또는 대식세포 또는 그들의 전구체를 대식세포 상의 발현 표지자를 변경할 수 있는 인자와 함께, 바람직하게
(a) 적어도 하나의 M1 유도제와 함께,
(b) 적어도 하나의 M2 유도제와 함께,
(c) 또는 사이토카인, 바람직하게 IL-10 및 IL-12, 케모카인을 분비하고/하거나 iNOS, 아르기나제, 또는 다른 면역조절 효소를 생성하는 대식세포의 능력을 변경할 수 있는 인자(이러한 인자의 예는 활성화 혈소판, IL-4, IL-10, IL-13, 항원과 항체의 면역 복합체, IgG, 열 활성화 감마-글로불린, 글루코코르티코스테로이드, 종양 성장 인자-β(TGF-β), IL-1R, CC-케모카인 리간드 2(CCL-2), IL-6, 대식세포 콜로니-자극 인자(M-CSF), 퍼옥시좀 증식제-활성화 수용체 γ(PPARγ) 작용제, 백혈구 저해 인자(LIF), 아데노신, 기생충 및 진균 감염, 지질다당류(LPS), 인터페론 γ(INF-γ), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 및 바이러스 및 박테리아 감염이고; 이 점에 있어서 M1 유도제, 특히 LPS에 의한 단핵구의 활성화는 세포가 iNOS를 발현하게 할 것이고, M1 유도제, 특히 LPS에 의한 단핵구의 활성화는 세포가 아르기나제-1을 발현하지 않게 할 것이며, M2 유도제, 특히 IL-4에 의한 단핵구의 활성화는 세포가 아르기나제-1을 발현하게 할 것이고, M2 유도제, 특히 IL-4에 의한 단핵구의 활성화는 세포가 iNOS를 발현하지 않게 할 것임이 관찰되었음)와 함께 시험관내 인큐베이션함으로써 생성가능하고/하거나;
(ii) CD64, CD86, CD16, CD32 중 적어도 하나의 항원의 발현, 고발현의 MHCII, 및/또는 iNOS 및/또는 IL-12의 생성에 의해 특성화되고/되거나;
(iii) 단핵구 또는 대식세포를 대식세포의 식작용 능력을 유도할 수 있는 인자, 예를 들어 IL-18, 옵소닌(예를 들어 보체-유도 단백질, 예컨대 iC3b, 면역글로불린 G), 칼시토닌 유전자-관련 펩티드(CGRP), 지질다당류(LPS), 인터페론 γ(INF-γ), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 바이러스 감염 및/또는 박테리아 감염과 함께 시험관내 인큐베이션함으로써 생성가능하고/하거나;
(iv) CD204, CD206, CD200R; CCR2, 트랜스페린 수용체(TfR), CXC-모티브 케모카인 수용체 4(CXCR4), CD163, 및/또는 T 세포 면역글로불린-도메인 및 뮤신-도메인 2(TIM-2) 중 적어도 하나의 항원의 발현에 의해 특성화되고/되거나, MHCII의 저발현을 나타내며; 이들 특성을 나타내는 활성화 대식세포는 철 결합 단백질로서 페리틴을 포함하는 복합체에 특히 적합하고/하거나;
(v) 식작용 능력을 나타내고/나타내거나;
(vi) 바람직하게 IL-12 또는 IL-10의 사이토카인 분비, 또는 유도성 산화질소 합성효소(iNOS)(또는 다른 전-염증 화합물), 아르기나제, 또는 다른 면역억제/항-염증 화합물의 생성이 가능하다.
본 발명의 표적화 전달 시스템의 바람직한 실시양태에서 대식세포를 M1 대식세포로 분화시키기 위한 M1 유도제는 지질다당류(LPS), 인터페론 γ(INF-γ), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 및 바이러스 및 박테리아 감염으로 구성된 그룹 중에서 선택되고 대식세포를 M2 대식세포로 분화시키기 위한 M2 유도제는 IL-4, IL-10, IL-13, 항원과 항체의 면역 복합체, IgG, 열 활성화 감마-글로불린, 글루코코르티코스테로이드, 종양 성장 인자-β(TGF-β), IL-1R, CC-케모카인 리간드 2(CCL-2), IL-6, 대식세포 콜로니-자극 인자(M-CSF), 퍼옥시좀 증식제-활성화 수용체 γ(PPARγ) 작용제, 백혈구 저해 인자(LIF), 아데노신, 기생충 및 진균 감염으로 구성된 그룹 중에서 선택된다.
본 발명자들은 의외로 복합체 로딩된 M1 대식세포 및 M2 대식세포 양자 모두가 저산소 조직, 바람직하게 종양 또는 그의 전이 내로의 표적화 활성 약제 전달에 적합하다는 것을 발견하였다. 일반적으로 본 발명자들은 투여된 M1 대식세포의 3 내지 5%가 종양 부위에 편재된 반면에 M2 대식세포의 약 35%가 종양 특이적 표적화를 나타냈음을 관찰하였다. 그러나, 헤모글로빈 및 약물을 포함하는 복합체를 사용하는 경우, M2 대식세포보다 M1 대식세포 내로 유의적으로 더 많은 양의 이 복합체를 로딩할 수 있었으므로, M2 대식세포의 이러한 일반적 이점은 상쇄되었다. 일반적으로 이러한 특이적 향성은 M2 대식세포를 저산소 조직에 의해 특성화되는 종양 및 질환의 치료에 더욱 적합하게 만든다.
본 발명의 표적화 전달 시스템의 바람직한 실시양태에서 단핵구는:
(i) CD34+ 조혈 전구 세포로부터 생성가능하고/하거나;
(ii) 단핵구를 적어도 하나의 유도제, 바람직하게 M1 또는 M2 유도제, 더욱 바람직하게 적어도 하나의 M2 유도제와 함께 시험관내 인큐베이션함으로써 생성가능하고/하거나;
(iii) TfR, CD163, TIM-2, CD14, CD16, CD33, 및/또는 CD115 중 적어도 하나의 항원의 발현에 의해 특성화되고/되거나;
(iv) TfR, CD163, TIM-2, CXCR4, CD14, 및/또는 CD16 중 적어도 하나의 항원의 발현에 의해 특성화되고/되거나;
(v) 식작용 능력을 나타낸다.
본 발명의 표적화 전달 시스템의 이러한 실시양태에서 단핵구를 분화시키기 위한 M1 유도제는 LPS, INF-γ, GM-CSF, 또는 바이러스 또는 박테리아 감염으로 구성된 그룹 중에서 선택되거나 단핵구를 분화시키기 위한 M2 유도제는 IL-4, IL-10, IL-13, 항원과 항체의 면역 복합체, IgG, 열 활성화 감마-글로불린, 글루코코르티코스테로이드, TGF-β, IL-1R, CCL-2, IL-6, M-CSF, PPARγ 작용제, 백혈구 저해 인자(LIF), 암-조건화 배지(cancer-conditioned medium), 암 세포, 아데노신, 및 기생충 또는 진균 감염으로 구성된 그룹 중에서 선택된다.
본 발명자들은 의외로 단핵구가 저산소 조직, 바람직하게 종양 또는 그의 전이 내로의 표적화 활성 약제 전달에 적합하지만, M2 활성화제로 처리한 단핵구는 저산소 조직, 바람직하게 종양 또는 그의 전이 내로의 표적화 활성 약제 전달에 더욱 적합하다는 것을 발견하였다. 이러한 특이적 향성은 M2 활성화제로 처리한 단핵구를 종양 및 저산소 부위의 치료에 더욱 적합하게 만든다.
본 발명의 표적화 전달 시스템의 바람직한 실시양태에서 림프구는:
(i) 당업자에게 공지되고 예를 들어 문헌[Lefort and Kim, 2010, J Vis Exp 40: 2017]; 문헌[Tassone and Fidler, 2012, Methods in Molecular Biology 882: 351-357]; 문헌[Kouro et al. 2005, Current Protocols in Immunology, 66:F22F.1:22F.1.1-22F.1.9.]에 또한 기재된 바와 같이 혈액, 비장, 또는 골수로부터 얻을 수 있거나 CD34+ 전구 세포로부터 생성가능하고/하거나;
(ii) 면역 적격 림프구이고/이거나;
(iii) 항원 특이적 T 세포 수용체를 발현하고/하거나;
(iv) (a) CD3 및 CD4 또는 CD8 또는 (b) CD19, CD20, CD21, CD19 CD20, CD19 CD21, CD20 CD21, 또는 CD19 CD20 CD21 항원 중 적어도 하나의 항원의 발현에 의해 특성화되고 바람직하게 면역글로불린을 생성할 수 있다.
본 발명의 표적화 전달 시스템의 바람직한 실시양태에서 과립구는:
(i) 예를 들어 문헌[Kuhs et al. 2015, Curr Protoc Immunol 111:7.23-1-7.23.16]; 문헌[Coquery et al. 2012, Cytometry A 81(9): 806-814]; 문헌[Swemydas and Lionakis 2013, J Vis Exp 77: 50586.]에 기재된 바와 같이 혈액, 비장, 또는 골수로부터 얻을 수 있거나 CD34+ 전구 세포로부터 생성가능하고/하거나;
(ii) CD66b 및/또는 CD193 중 적어도 하나의 발현에 의해 특성화되고/되거나;
(iii) 그의 세포질 내의 과립의 존재에 의해 특성화되는 다형핵성 백혈구이고/이거나;
(iii) TfR, CD163, TIM-2, 및/또는 CXCR4 중 적어도 하나의 발현에 의해 특성화된다.
본 발명의 표적화 전달 시스템의 바람직한 실시양태에서 철 결합 단백질은 페리틴, 바람직하게 중쇄(H) 유형 페리틴, 경쇄(L) 페리틴, 및/또는 미토콘드리아 페리틴; 헤모글로빈, 바람직하게 헤모글로빈 A, 헤모글로빈 AS, 헤모글로빈 SC, 헤모글로빈 C, 헤모글로빈 D, 헤모글로빈 E, 헤모글로빈 F, 헤모글로빈 H; 헤모글로빈-합토글로빈 복합체, 헤모펙신, 트랜스페린; 및 락토페린으로 구성된 그룹 중에서 선택된다. 용어 페리틴; 헤모글로빈, 바람직하게 헤모글로빈 A, 헤모글로빈 AS, 헤모글로빈 SC, 헤모글로빈 C, 헤모글로빈 D, 헤모글로빈 E, 헤모글로빈 F, 헤모글로빈 H; 헤모글로빈-합토글로빈 복합체, 헤모펙신, 트랜스페린; 및 락토페린은 천연적으로 발생하는 단백질의 구조적 변이체를 포함하며, 따라서 철 이온(들)에 결합하는 각각의 야생형 단백질의 능력의 적어도 70%, 바람직하게 적어도 75%, 더욱 바람직하게 적어도 80%, 더욱 바람직하게 적어도 85%, 더욱 바람직하게 적어도 90%, 더욱 바람직하게 적어도 95% 더욱 바람직하게 적어도 100%를 나타내는 단백질에 관련된다. 본 발명의 맥락에서 사용되는 철 결합 단백질은 바람직하게 포유류, 더욱 바람직하게 마우스, 랫트, 개, 유인원, 특히 침팬지, 또는 인간의 것이며, 가장 바람직하게 인간 기원의 것이다. 본 발명의 맥락에서 사용되는 바람직한 철 결합 단백질의 공통 서열을 하기 도 1에 나타낸다. 바람직한 구조적 변이체는 도 1에 표시된 서열을 기반으로 한다. X로 표지된 잔기는 상이한 포유류 페리틴, 트랜스페린, 및 헤모글로빈 사이에서 변동된다. 이들 잔기의 변경은 철 이온에 결합하는 단백질의 능력에 결정적이지 않다. 따라서, 아미노산 돌연변이 또는 결실은 X로 표지된 잔기 중 하나 이상에 영향을 주는 것이 바람직하다.
혈장 단백질은 항상 암 치료법에서 활성 약제 성분의 전달을 위한 탁월한 담체가 되어 왔다. 따라서, 가장 풍부한 혈장 단백질인 알부민은 탁산 분자 및 독소루비신 유도체의 전달을 위한 치료 프로토콜에 현재 사용된다(문헌[Larsen MT et al. 2016, Mol Cell Ther 27;4:3]).
인간 트랜스페린 및 페리틴 단백질은 암 세포를 특이적으로 표적화하기 위한 소분자 또는 독소-접합체의 전달에 효과적인 담체로 간주되어 왔다. 그러나 지금까지 상당한 노력에도 불구하고 성공적인 트랜스페린 또는 페리틴 약물 복합체가 임상에 도달한 적은 없다(문헌[Luck AN et al. 2013, Adv Drug Deliv Rev 65(8):1012-9]).
페리틴은 케이지 구조 및 철-결합 역량을 나타내며, 이를 사용하여 그의 공동 내부에 약물을 캡슐화할 수 있을 것이다. 페리틴은 혈장 내에 풍부하지 않지만, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 세포와 같은 통상의 단백질 발현 벡터에서 재조합 단백질로서 고수율로 용이하게 생성될 수 있다. 페리틴 H- 또는 L-사슬은 8 nm 직경 공동의 경계를 설정하는 케이지-유사 구조로 24량체 조립이 가능한 작은 단백질 단량체(H 및 L 사슬에 대해 각각 21 kDa 및 19 KDa)로서 암호화된다. 본 발명에 대한 연구의 맥락에서 본 발명자들은, H-페리틴 단일중합체가 TfR을 발현하는 CD45+ 백혈구 세포에 캡슐화된 약물을 특이적으로 전달하기 위한 바람직한 단백질 작제물에 해당한다는 것에 주목하였다. 추가로 H-페리틴은 복합체 활성 성분을 세포 핵에 표적화하므로, DNA-결합 단백질을 핵 내로 직접 전달한다.
정제된 트랜스페린은 공유적 링커를 통해 일부 항암 약물에 효율적으로 접합될 수 있으며, 이는 세포 내부에서 적절하게 방출된다(문헌[Beyer U et al. 1998, J Med Chem 41(15):2701-2708]). 트랜스페린의 경우, 단백질 표면 상의 리신 기만이 공유적 부착에 용이하게 이용가능하다.
과거에 헤모글로빈은 약물과의 화학적 접합에 있어서의 그의 다능성, 혈액 내에서의 그의 풍부함 및 상대적 안정성으로 인해 가능한 약물 담체로 간주되어 왔다(문헌[Somatogen, 1993, WO1993008842 A1]). 그럼에도 불구하고, 수용체 표적화 특성의 결여로 인해 혈액 대체물 또는 항겸상제(antisickling agent) 이외의 생물의학적 응용이 발전하지 않았다. 사실상, Hb는 특히 단핵구-대식세포 기원의 백혈구 상의 CD163(합토글로빈/헤모글로빈 수용체) 에피토프에 의해서만 인식될 수 있다. 본 출원에 기재된 CD45+ 백혈구, 특히 대식세포 기반의 단백질 전달은 헤모글로빈이 표적 특이적 약물 담체로서 관심의 대상이 되게 했다. 헤모글로빈은 적절한 약물 접합체에 용이하게 공유적으로 연결되거나, 헴 결합 포켓 내에 소수성 약물 분자를 호스팅(hosting)하거나, 심지어 헴 철에 연결된 작은 세포독성 분자를 수송할 수 있다. 단백질 표면 상의 유일한 적정가능한 시스테인인 베타93 시스테인 잔기에 적절한 약물 접합체를 선택적으로 부착함으로써 Hb를 용이하게 개질할 수 있다. 말레이미도 작용화 약물, 예컨대 튜불린 저해제 모노메틸아우리스타틴(MMAE) 또는 DNA 가교결합 약물 피롤로벤조디아제핀 이량체(PBD)는 관련된 cys 베타93 잔기에 용이하게 특이적으로 부착될 수 있는 극도로 강력한 세포독성물질의 가장 주목할만한 예이다.
대안적으로, Hb 표면 상의 리신 잔기(Hb 사량체 당 적어도 10개의 적정가능한 리신 잔기)는 분해가능한 석신이미드 링커를 통한 약물 접합에 용이하게 순응적일 수 있다. 헤모글로빈은 또한 비공유적으로 결합된 헴 기를 산성 pH 값에서 방출하는 고유의 역량을 제공한다. 그렇게 얻어진 아포-헤모글로빈은, 파클리탁셀의 경우에 입증된 바와 같이, 비어 있는 헴 포켓 내에 몇몇 소수성 분자를 호스팅할 수 있다(문헌[Meng Z et al. 2015 J Pharm Sci 104(3):1045-55]).
어떤 접합/흡착/결합 방법이든, 본 발명자들은 헤모글로빈(Hb), 트랜스페린(Tf), 및 페리틴이 종양 표적화 특성을 나타내는 적절한 세포 시스템, 예를 들어 활성화 대식세포 내로 일단 로딩되면 탁월한 약물 담체임을 입증하였다. 이들 단백질의 용이하고 신속하고 저렴하고 안전한 정제 절차 또한 막대한 부가 가치를 제공한다.
포유류 H-유형 페리틴, L-유형 페리틴, 헤모글로빈 알파 사슬, 헤모글로빈 베타 사슬, 및 트랜스페린의 서열을 기반으로 이들 단백질 각각에 대해 공통 서열을 결정하였다. 이들을 도 1에 각각 서열 번호 2, 7, 9, 14, 16, 20, 및 25로 나타낸다. 이를 기반으로, 또한 선행 기술에 개시된 결실 및 구조 분석을 기반으로, H-유형 페리틴, L-유형 페리틴, 헤모글로빈 알파 사슬, 및 헤모글로빈 베타 사슬에 대해 CD45+ 백혈구에 의한 흡수에 충분한 최소 단편을 결정하였다. 이들을 서열 번호 1, 3, 5(H-유형 페리틴); 8, 10 12(L-유형 페리틴), 15 및 17(헤모글로빈 알파 사슬), 및 19 및 21(헤모글로빈 베타 사슬)에 나타낸다. 트랜스페린은 N-말단에 위치하는 도메인 및 C-말단에 위치하는 도메인을 포함하며, 이는 하나의 폴리펩티드에 포함되고 100 내지 450개 아미노산, 바람직하게 150 내지 400개, 더욱 바람직하게 200 내지 350개 아미노산, 더욱 바람직하게 250 내지 320개 아미노산 이격되어 위치하는 경우에 철 결합 및 CD45+ 백혈구에 의한 흡수에 필요하다. N-말단 도메인은 전체 길이 공통 트랜스페린(서열 번호 25) 또는 전체 길이 인간 트랜스페린(서열 번호 28)의 아미노산 1 내지 82를 포함한다. C-말단 도메인은 전체 길이 공통 트랜스페린(서열 번호 25) 또는 전체 길이 인간 트랜스페린(서열 번호 28)의 아미노산 396 내지 510을 포함한다. 공통 서열 내에 X가 표시된 각각의 경우에, 그것은 독립적으로 임의의 아미노산을 의미하고 포유류 H-유형 페리틴 중에서 보존되지 않거나 단지 불량하게 보존된 아미노산을 특성화하며, 이는 각각의 철 결합 단백질의 철 결합 특성을 손상시키지 않거나 거의 손상시키지 않으면서 돌연변이될 수 있다. 각각의 경우에 X는 X와 정렬되는 각각의 인간 철 결합 단백질의 아미노산의 의미를 지니는 것이 바람직하다. 이 정보는, 예를 들어 도 1로부터 얻을 수 있으며, 이는 인간, 및 일부 경우에 마우스 단백질과의 공통 서열의 정렬을 나타낸다.
바람직한 H-유형 페리틴은 서열 번호 1에 표시된 아미노산 서열, 및 적어도 70% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 75% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 80% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 85% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 90% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 95% 아미노산 동일성, 및 각각의 경우에 서열 번호 1에 따른 아미노산 서열로 구성된 H-유형 페리틴이 CD45+ 백혈구, 바람직하게 M2 백혈구에 의해 흡수되는 능력의 적어도 70%를 나타내는 그의 변이체를 포함하거나 이로 구성된다. 서열 번호 1 내에서 위치 5의 X는 존재하거나 부재할 수 있으며, 존재하는 경우에 그것은 임의의 아미노산, 바람직하게 Ile를 의미하고, 위치 6의 X는 임의의 아미노산, 바람직하게 Asn을 의미하며, 위치 14의 X는 임의의 아미노산, 바람직하게 Tyr을 의미하고, 위치 24의 X는 임의의 아미노산, 바람직하게 Tyr 또는 Cys를 의미하며, 위치 66의 X는 임의의 아미노산, 바람직하게 Phe를 의미하고, 위치 68의 X는 임의의 아미노산, 바람직하게 Gln을 의미하며, 위치 75의 X는 임의의 아미노산, 바람직하게 Arg 또는 Cys를 의미하고, 위치 90의 X는 임의의 아미노산, 바람직하게 His를 의미하며, 위치 94의 X는 임의의 아미노산, 바람직하게 Ser 또는 Asn을 의미하고, 위치 120의 X는 존재하거나 부재할 수 있으며, 존재하는 경우에 그것은 임의의 아미노산, 바람직하게 His 또는 Tyr, 더욱 바람직하게 His를 의미하고, 위치 123의 X는 임의의 아미노산, 바람직하게 Asn 또는 Ser, 더욱 바람직하게 Asn을 의미하며, 위치 128의 X는 임의의 아미노산, 바람직하게 Ala 또는 Ser, 더욱 바람직하게 Ala를 의미한다.
바람직한 실시양태에서 H-유형 페리틴은 서열 번호 3에 따른 쥐과 페리틴을 포함하거나 이로 구성된다. 따라서, 바람직한 구조적 변이체는 적어도 70% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 75% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 80% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 85% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 90% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 95% 아미노산 동일성, 및 각각의 경우에 서열 번호 3에 따른 아미노산 서열로 구성된 H-유형 페리틴이 CD45+ 백혈구, 바람직하게 M2 대식세포에 의해 흡수되는 능력의 적어도 70%를 나타낸다.
바람직한 실시양태에서 H-유형 페리틴은 서열 번호 5에 따른 인간 페리틴을 포함하거나 이로 구성된다. 따라서, 바람직한 구조적 변이체는 적어도 70% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 75% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 80% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 85% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 90% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 95% 아미노산 동일성, 및 각각의 경우에 서열 번호 5에 따른 아미노산 서열로 구성된 H-유형 페리틴이 CD45+ 백혈구, 바람직하게 M2 대식세포에 의해 흡수되는 능력의 적어도 70%를 나타낸다.
바람직한 실시양태에서 H-유형 페리틴은 서열 번호 2 또는 7(2가 바람직함)에 따른 전체 길이 H-유형 페리틴의 정렬로부터 유도된 포유류 공통 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 따라서, 바람직한 구조적 변이체는 적어도 70% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 75% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 80% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 85% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 90% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 95% 아미노산 동일성, 및 각각의 경우에 서열 번호 2 또는 7(2가 바람직함)에 따른 아미노산 서열로 구성된 H-유형 페리틴이 CD45+ 백혈구, 바람직하게 M2 대식세포에 의해 흡수되는 능력의 적어도 70%를 나타낸다. 서열 번호 2에서 위치 6의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Pro일 수 있고, 위치 14의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 His일 수 있으며, 위치 16의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Asp일 수 있고, 위치 21의 X는 존재하거나 부재할 수 있으며, 존재하는 경우에 그것은 임의의 아미노산, 바람직하게 Ile를 의미하고, 위치 22의 X는 임의의 아미노산, 바람직하게 Asn을 의미하며, 위치 30의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Tyr일 수 있고, 위치 40의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Tyr 또는 Cys, 더욱 바람직하게 Tyr일 수 있으며, 위치 82의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Phe일 수 있고, 위치 84의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Gln일 수 있으며, 위치 91의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Arg 또는 Cys, 더욱 바람직하게 Cys일 수 있고, 위치 106의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 His일 수 있으며, 위치 110의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Asn 또는 Ser, 더욱 바람직하게 Asn일 수 있고, 위치 137의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 His 또는 Tyr, 더욱 바람직하게 His일 수 있으며, 위치 140의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Asn 또는 Ser, 더욱 바람직하게 Asn일 수 있고, 위치 145의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Ala 또는 Ser, 더욱 바람직하게 Ala일 수 있으며, 위치 164의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Ala 또는 Ser, 더욱 바람직하게 Ser일 수 있고, 위치 166의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Met 또는 Leu, 바람직하게 Leu일 수 있으며, 위치 178의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Asp 또는 His, 더욱 바람직하게 Asp일 수 있고, 위치 181의 X는 부재하거나 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Asn이며, 위치 182의 X는 부재하거나 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Glu이고, 위치 183의 X는 부재하거나 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Ser이다. 서열 번호 7에서 위치 6의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Pro일 수 있고, 위치 14의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 His일 수 있으며, 위치 16의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Asp일 수 있고, 위치 21의 X는 존재하거나 부재할 수 있으며, 존재하는 경우에 그것은 임의의 아미노산, 바람직하게 Ile를 의미하고, 위치 29의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Tyr일 수 있으며, 위치 81의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Phe일 수 있고, 위치 83의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Gln일 수 있으며, 위치 105의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 His일 수 있고, 위치 144의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Ala 또는 Ser, 더욱 바람직하게 Ala일 수 있으며, 위치 180의 X는 부재하거나 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Asn이고, 위치 181의 X는 부재하거나 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Glu이며, 위치 182의 X는 부재하거나 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Ser이다.
바람직한 실시양태에서 H-유형 페리틴은 바람직한 서열 번호 4에 따른 쥐과 전체 길이 페리틴을 포함하거나 이로 구성된다. 따라서, 바람직한 구조적 변이체는 적어도 70% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 75% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 80% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 85% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 90% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 95% 아미노산 동일성, 및 각각의 경우에 서열 번호 4에 따른 아미노산 서열로 구성된 쥐과 H-유형 페리틴이 CD45+ 백혈구, 바람직하게 M2 대식세포에 의해 흡수되는 능력의 적어도 70%를 나타낸다.
바람직한 실시양태에서 H-유형 페리틴은 바람직한 서열 번호 6에 따른 인간 전체 길이 페리틴을 포함하거나 이로 구성된다. 따라서, 바람직한 구조적 변이체는 적어도 70% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 75% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 80% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 85% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 90% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 95% 아미노산 동일성, 및 각각의 경우에 서열 번호 6에 따른 아미노산 서열로 구성된 인간 H-유형 페리틴이 CD45+ 백혈구, 바람직하게 M2 대식세포에 의해 흡수되는 능력의 적어도 70%를 나타낸다.
바람직한 L-유형 페리틴은 서열 번호 8에 표시된 아미노산 서열, 및 적어도 70% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 75% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 80% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 85% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 90% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 95% 아미노산 동일성, 및 각각의 경우에 서열 번호 8에 따른 아미노산 서열로 구성된 L-유형 페리틴이 CD45+ 백혈구, 바람직하게 M2 백혈구에 의해 흡수되는 능력의 적어도 70%를 나타내는 그의 변이체를 포함하거나 이로 구성된다. 서열 번호 8에서 위치 5의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Asp 또는 Glu, 더욱 바람직하게 Asp일 수 있고, 위치 12의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Arg 또는 Ser, 더욱 바람직하게 Ser일 수 있으며, 위치 17의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Ser 또는 Arg, 더욱 바람직하게 Ser일 수 있고, 위치 19의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Arg 또는 Gln, 더욱 바람직하게 Gln일 수 있으며, 위치 29의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Phe일 수 있고, 위치 30의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Tyr 또는 Phe, 더욱 바람직하게 Tyr일 수 있으며, 위치 42의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Ser 또는 Gly, 더욱 바람직하게 Ser일 수 있고, 위치 56의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Ala 또는 Tyr, 더욱 바람직하게 Tyr일 수 있으며, 위치 61의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Glu 또는 Lys, 더욱 바람직하게 Lys일 수 있고, 위치 62의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Met 또는 Phe, 더욱 바람직하게 Met일 수 있으며, 위치 65의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Asp 또는 Gln, 더욱 바람직하게 Gln일 수 있고, 위치 75의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Ile 또는 Val, 더욱 바람직하게 Ile일 수 있으며, 위치 76의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Lys 또는 Gln, 더욱 바람직하게 Lys일 수 있고, 위치 79의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Ala 또는 Ser, 더욱 바람직하게 Ala일 수 있으며, 위치 80의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Glu 또는 Gln, 더욱 바람직하게 Gln일 수 있고, 위치 87의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Pro 또는 Gln, 더욱 바람직하게 Pro일 수 있으며, 위치 88의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Glu 또는 Asp, 더욱 바람직하게 Asp일 수 있고, 위치 91의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Glu 또는 Lys, 더욱 바람직하게 Lys일 수 있으며, 위치 94의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Met 또는 Leu, 더욱 바람직하게 Leu일 수 있고, 위치 96의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Met 또는 Leu, 더욱 바람직하게 Met일 수 있으며, 위치 99의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Lys 또는 Asn, 바람직하게 Lys일 수 있고, 위치 115의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Thr 또는 Ala, 더욱 바람직하게 Thr일 수 있으며, 위치 119의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Leu일 수 있고, 위치 125의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Ser 또는 Thr, 더욱 바람직하게 Thr일 수 있으며, 위치 127의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Tyr 또는 Phe, 더욱 바람직하게 Phe일 수 있고, 위치 130의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Lys 또는 Glu, 더욱 바람직하게 Glu일 수 있으며, 위치 140의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Asp 또는 Asn, 더욱 바람직하게 Asp일 수 있고, 위치 146의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Arg 또는 His, 더욱 바람직하게 His일 수 있으며, 위치 148의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Leu 또는 Val, 더욱 바람직하게 Leu일 수 있다.
바람직한 실시양태에서 L-유형 페리틴은 서열 번호 10에 따른 쥐과 L-유형 페리틴을 포함하거나 이로 구성된다. 따라서, 바람직한 구조적 변이체는 적어도 70% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 75% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 80% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 85% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 90% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 95% 아미노산 동일성, 및 각각의 경우에 서열 번호 10에 따른 아미노산 서열로 구성된 L-유형 페리틴이 CD45+ 백혈구, 바람직하게 M2 대식세포에 의해 흡수되는 능력의 적어도 70%를 나타낸다.
바람직한 실시양태에서 L-유형 페리틴은 서열 번호 12에 따른 인간 페리틴을 포함하거나 이로 구성된다. 따라서, 바람직한 구조적 변이체는 적어도 70% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 75% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 80% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 85% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 90% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 95% 아미노산 동일성, 및 각각의 경우에 서열 번호 12에 따른 아미노산 서열로 구성된 L-유형 페리틴이 CD45+ 백혈구, 바람직하게 M2 대식세포에 의해 흡수되는 능력의 적어도 70%를 나타낸다.
바람직한 실시양태에서 L-유형 페리틴은 서열 번호 9 또는 14(9가 바람직함)에 따른 전체 길이 H-유형 페리틴의 정렬로부터 유도된 포유류 공통 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 따라서, 바람직한 구조적 변이체는 적어도 70% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 75% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 80% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 85% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 90% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 95% 아미노산 동일성, 및 각각의 경우에 서열 번호 9 또는 14(9가 바람직함)에 따른 아미노산 서열로 구성된 L-유형 페리틴이 CD45+ 백혈구, 바람직하게 M2 대식세포에 의해 흡수되는 능력의 적어도 70%를 나타낸다. 서열 번호 9에서 위치 12의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Asp 또는 Glu, 더욱 바람직하게 Asp일 수 있고, 위치 19의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Ser 또는 Arg, 더욱 바람직하게 Ser일 수 있으며, 위치 24의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Ser 또는 Arg, 더욱 바람직하게 Ser일 수 있고, 위치 26의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Arg 또는 Gln, 더욱 바람직하게 Gln일 수 있으며, 위치 36의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Phe일 수 있고, 위치 37의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Tyr 또는 Phe, 더욱 바람직하게 Tyr일 수 있으며, 위치 47의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Ser 또는 Gly, 더욱 바람직하게 Ser일 수 있고, 위치 63의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Ala 또는 Tyr, 더욱 바람직하게 Tyr일 수 있으며, 위치 68의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Glu 또는 Lys, 더욱 바람직하게 Lys일 수 있고, 위치 69의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Met 또는 Phe, 더욱 바람직하게 Met일 수 있으며, 위치 72의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Asp 또는 Gln, 더욱 바람직하게 Gln일 수 있고, 위치 82의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Ile 또는 Val, 더욱 바람직하게 Ile일 수 있으며, 위치 83의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Lys 또는 Gln, 더욱 바람직하게 Lys일 수 있고, 위치 86의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Ala 또는 Ser, 더욱 바람직하게 Ala일 수 있으며, 위치 87의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Glu 또는 Gln, 더욱 바람직하게 Gln일 수 있고, 위치 94의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Pro 또는 Gln, 더욱 바람직하게 Pro일 수 있으며, 위치 95의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Glu 또는 Asp, 더욱 바람직하게 Asp일 수 있고, 위치 98의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Glu 또는 Lys, 더욱 바람직하게 Lys일 수 있으며, 위치 101의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Met 또는 Leu, 더욱 바람직하게 Leu일 수 있고, 위치 103의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Met 또는 Leu, 더욱 바람직하게 Met일 수 있으며, 위치 106의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Lys 또는 Asn, 바람직하게 Lys일 수 있고, X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산일 수 있으며, 위치 126의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Leu일 수 있고, 위치 132의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Ser 또는 Thr, 더욱 바람직하게 Thr일 수 있으며, 위치 134의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Tyr 또는 Phe, 더욱 바람직하게 Phe일 수 있고, 위치 137의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Lys 또는 Glu, 더욱 바람직하게 Glu일 수 있으며, 위치 147의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Asp 또는 Asn, 더욱 바람직하게 Asp일 수 있고, 위치 153의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Arg 또는 His, 더욱 바람직하게 His일 수 있으며, 위치 155의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Leu 또는 Val, 더욱 바람직하게 Leu일 수 있고, 위치 161의 X는 부재하거나 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Ala일 수 있으며, 위치 163의 X는 부재하거나 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Thr일 수 있고, 위치 166의 X는 부재하거나 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Pro일 수 있으며, 위치 168의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Gly 또는 Ala, 더욱 바람직하게 Ala일 수 있다. 서열 번호 14에서 위치 36의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Phe일 수 있고, 위치 37의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Tyr 또는 Phe, 더욱 바람직하게 Tyr일 수 있으며, 위치 94의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Pro 또는 Gln, 더욱 바람직하게, Pro일 수 있고, 위치 126의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Leu일 수 있으며, 위치 137의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Lys 또는 Glu, 더욱 바람직하게 Glu일 수 있고, 위치 147의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Asp 또는 Asn, 더욱 바람직하게 Asp일 수 있으며, X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산일 수 있고, 위치 163의 X는 부재하거나 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Thr일 수 있으며, 위치 166의 X는 부재하거나 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Pro일 수 있고, 위치 168의 X는 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산, 바람직하게 Gly 또는 Ala, 더욱 바람직하게 Ala일 수 있다.
바람직한 실시양태에서 L-유형 페리틴은 바람직한 서열 번호 11에 따른 쥐과 전체 길이 페리틴을 포함하거나 이로 구성된다. 따라서, 바람직한 구조적 변이체는 적어도 70% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 75% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 80% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 85% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 90% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 95% 아미노산 동일성, 및 각각의 경우에 서열 번호 11에 따른 아미노산 서열로 구성된 쥐과 L-유형 페리틴이 CD45+ 백혈구, 바람직하게 M2 대식세포에 의해 흡수되는 능력의 적어도 70%를 나타낸다.
바람직한 실시양태에서 L-유형 페리틴은 바람직한 서열 번호 13에 따른 인간 전체 길이 페리틴을 포함하거나 이로 구성된다. 따라서, 바람직한 구조적 변이체는 적어도 70% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 75% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 80% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 85% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 90% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 95% 아미노산 동일성, 및 각각의 경우에 서열 번호 13에 따른 아미노산 서열로 구성된 인간 L-유형 페리틴이 CD45+ 백혈구, 바람직하게 M2 대식세포에 의해 흡수되는 능력의 적어도 70%를 나타낸다.
바람직한 실시양태에서 알파 헤모글로빈은 서열 번호 15에 따른 전체 길이 알파 헤모글로빈의 정렬로부터 유도된 최소 포유류 공통 서열을 포함하거나 이로 구성되며, 바람직하게 서열 번호 15에 표시된 아미노산 서열, 및 적어도 70% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 75% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 80% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 85% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 90% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 95% 아미노산 동일성, 및 각각의 경우에 서열 번호 15에 따른 아미노산 서열로 구성된 알파 헤모글로빈이 CD45+ 백혈구, 바람직하게 M1 대식세포에 의해 흡수되는 능력의 적어도 70%를 나타내는 그의 변이체를 포함하거나 이로 구성된다.
바람직한 실시양태에서 알파 헤모글로빈은 서열 번호 17에 따른 인간 알파 헤모글로빈으로 유도된 최소 인간 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 따라서, 바람직한 구조적 변이체는 적어도 70% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 75% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 80% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 85% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 90% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 95% 아미노산 동일성, 및 각각의 경우에 서열 번호 17에 따른 아미노산 서열로 구성된 알파 헤모글로빈이 CD45+ 백혈구, 바람직하게 M1 대식세포에 의해 흡수되는 능력의 적어도 70%를 나타낸다.
바람직한 실시양태에서 알파 헤모글로빈은 서열 번호 16에 따른 전체 길이 알파 헤모글로빈의 정렬로부터 유도된 포유류 공통 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 따라서, 바람직한 구조적 변이체는 적어도 70% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 75% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 80% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 85% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 90% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 95% 아미노산 동일성, 및 각각의 경우에 서열 번호 16에 따른 아미노산 서열로 구성된 알파 헤모글로빈이 CD45+ 백혈구, 바람직하게 M2 대식세포에 의해 흡수되는 능력의 적어도 70%를 나타낸다.
바람직한 실시양태에서 알파 헤모글로빈은 서열 번호 18에 따른 인간 전체 길이 알파 헤모글로빈을 포함하거나 이로 구성된다. 따라서, 바람직한 구조적 변이체는 적어도 70% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 75% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 80% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 85% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 90% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 95% 아미노산 동일성, 및 각각의 경우에 서열 번호 18에 따른 아미노산 서열로 구성된 인간 전체 길이 알파 헤모글로빈이 CD45+ 백혈구, 바람직하게 M2 대식세포에 의해 흡수되는 능력의 적어도 70%를 나타낸다.
바람직한 실시양태에서 알파 헤모글로빈은 서열 번호 19에 따른 전체 길이 베타 헤모글로빈의 정렬로부터 유도된 최소 포유류 공통 서열, 및 적어도 70% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 75% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 80% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 85% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 90% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 95% 아미노산 동일성, 및 각각의 경우에 서열 번호 19에 따른 아미노산 서열로 구성된 베타 헤모글로빈이 CD45+ 백혈구, 바람직하게 M1 대식세포에 의해 흡수되는 능력의 적어도 70%를 나타내는 그의 변이체를 포함하거나 이로 구성된다.
바람직한 실시양태에서 알파 헤모글로빈은 서열 번호 21에 따른 인간 베타 헤모글로빈으로 유도된 최소 인간 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 따라서, 바람직한 구조적 변이체는 적어도 70% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 75% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 80% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 85% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 90% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 95% 아미노산 동일성, 및 각각의 경우에 서열 번호 21에 따른 아미노산 서열로 구성된 베타 헤모글로빈이 CD45+ 백혈구, 바람직하게 M1 대식세포에 의해 흡수되는 능력의 적어도 70%를 나타낸다.
바람직한 실시양태에서 베타 헤모글로빈은 서열 번호 20에 따른 전체 길이 베타 헤모글로빈의 정렬로부터 유도된 포유류 공통 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 따라서, 바람직한 구조적 변이체는 적어도 70% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 75% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 80% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 85% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 90% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 95% 아미노산 동일성, 및 각각의 경우에 서열 번호 20에 따른 아미노산 서열로 구성된 베타 헤모글로빈이 CD45+ 백혈구, 바람직하게 M2 대식세포에 의해 흡수되는 능력의 적어도 70%를 나타낸다.
바람직한 실시양태에서 베타 헤모글로빈은 서열 번호 22에 따른 인간 전체 길이 베타 헤모글로빈을 포함하거나 이로 구성된다. 따라서, 바람직한 구조적 변이체는 적어도 70% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 75% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 80% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 85% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 90% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 95% 아미노산 동일성, 및 각각의 경우에 서열 번호 22에 따른 아미노산 서열로 구성된 인간 전체 길이 베타 헤모글로빈이 CD45+ 백혈구, 바람직하게 M2 대식세포에 의해 흡수되는 능력의 적어도 70%를 나타낸다.
바람직한 실시양태에서 트랜스페린은 서열 번호 25에 따른 전체 길이 알파 헤모글로빈의 정렬로부터 유도된 포유류 공통 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 따라서, 특히, 바람직한 트랜스페린은 서열 번호 25에 표시된 아미노산 서열, 및 적어도 70% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 75% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 80% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 85% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 90% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 95% 아미노산 동일성, 및 각각의 경우에 서열 번호 25에 따른 아미노산 서열로 구성된 트랜스페린이 CD45+ 백혈구, 바람직하게 M1 대식세포에 의해 흡수되는 능력의 적어도 70%를 나타내는 그의 변이체를 포함하거나 이로 구성된다.
바람직한 실시양태에서 트랜스페린은 서열 번호 28에 따른 인간 트랜스페린을 포함하거나 이로 구성된다. 따라서, 바람직한 구조적 변이체는 적어도 70% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 75% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 80% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 85% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 90% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 95% 아미노산 동일성, 및 각각의 경우에 서열 번호 28에 따른 아미노산 서열로 구성된 트랜스페린이 CD45+ 백혈구, 바람직하게 M1 대식세포에 의해 흡수되는 능력의 적어도 70%를 나타낸다.
트랜스페린의 철 결합 특성은 N-말단에 위치하는 도메인 및 C-말단에 위치하는 도메인에 따라 달라진다. 따라서, 바람직한 실시양태에서 본 발명에 사용되는 트랜스페린은 적어도 서열 번호 23에 따른 N-말단 도메인 및 서열 번호 24에 따른 C-말단 도메인을 포함한다. 바람직한 트랜스페린은 서열 번호 23 및 24에 표시된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 더불어, 적어도 70% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 75% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 80% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 85% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 90% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 95% 아미노산 동일성, 및 각각의 경우에 서열 번호 23 및 24에 따른 아미노산 서열로 구성된 트랜스페린이 CD45+ 백혈구, 바람직하게 M1 대식세포에 의해 흡수되는 능력의 적어도 70%를 나타내는 그의 변이체를 포함한다. 서열 번호 23 또는 24는 포유류 트랜스페린의 공통 서열을 표시한다.
따라서, 바람직한 실시양태에서 본 발명에 사용되는 트랜스페린은 적어도 서열 번호 26에 따른 N-말단 도메인 및 서열 번호 27에 따른 C-말단 도메인을 포함한다. 바람직한 트랜스페린은 서열 번호 26 및 27에 표시된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 더불어, 적어도 70% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 75% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 80% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 85% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 90% 아미노산 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 95% 아미노산 동일성, 및 각각의 경우에 각각 서열 번호 26 및 27에 따른 아미노산 서열로 구성된 트랜스페린이 CD45+ 백혈구, 바람직하게 M1 대식세포에 의해 흡수되는 능력의 적어도 70%를 나타내는 그의 변이체를 포함한다.
바람직한 페리틴은 또한, 3D 구조 기반의 정렬에 의해 정의되는 바와 같이 관계가 먼 단백질의 주어진 서열 정렬 내에 들어가는, 주어진 아미노산 서열에 무관하게 4 나선 번들 단백질 모듈의 24량체 서브유닛 조립체에 합치되는 단백질을 포함한다.
림프구 및 M2 대식세포는 하나 이상의 페리틴 및 하나 이상의 활성 성분을 포함하는 복합체의 흡수에 있어서 더 양호하다는 것, M1 대식세포는 하나 이상의 헤모글로빈 및 하나 이상의 활성 성분을 포함하는 복합체의 흡수에 있어서 더 양호하다는 것, 및 대식세포는 하나 이상의 트랜스페린 및 하나 이상의 활성 성분을 포함하는 복합체의 흡수에 있어서 더 양호하다는 것이 본 발명자들의 의외의 관찰이다. 따라서, 상기 기재된 CD45+ 백혈구: 단핵구, M1 및 M2 대식세포, 과립구, 및 림프구의 조직 및 세포 향성을 기반으로, M2 대식세포, 림프구, 또는 단핵구의 향성을 원하는 경우에는 하나 이상의 페리틴 및 하나 이상의 활성 성분을 포함하는 복합체를 사용하여 M2 대식세포, 림프구, 또는 단핵구를 로딩하고, M1 대식세포의 향성을 원하는 경우에는 하나 이상의 헤모글로빈 및 하나 이상의 활성 성분을 포함하는 복합체를 사용하여 M1 대식세포를 로딩한다.
본 발명의 표적화 전달 시스템의 바람직한 실시양태에서 활성 성분은 분자량이 1.5 kD 미만, 더욱 바람직하게 1 kD 미만인 단백질, 핵산, 화학적 비-단백질 비-핵산 화합물, 바람직하게 항암 약물, 특히 세포증식억제 약물, 세포독성 약물, 및 그의 전구약물; 항동맥경화증 약물; 및 항-염증 약물; 및 광감작 화합물; 바이러스, 특히 항암 바이러스; 및 세포를 손상시키는 양의 γ 방사선(루테튬-177, 이테르븀-90, 요오드-131, 사마륨-153, 인-32, 세슘-131, 팔라듐-103, 라듐-233, 요오드-125, 및 붕소-10으로 구성된 그룹 중에서 바람직하게 선택됨) 또는 세포를 손상시키는 양의 α 방사선(악티늄-225, 비스무스-213, 납-212, 및 폴로늄-212로 구성된 그룹 중에서 바람직하게 선택됨)을 또한 방출하는, α 또는 β 방사선 방출 방사성동위원소로 구성된 그룹 중에서 선택된다.
바람직한 항암 약물은 세포자멸(apoptosis)/자가포식 또는 세포괴사-유도 약물 중에서 선택된다. 세포자멸/자가포식 또는 세포괴사-유도 약물은 심지어 세포 증식에 있어서 비정상을 나타내는 세포에서도 세포자멸/자가포식 또는 세포괴사를 효과적으로 유도할 수 있는 임의의 약물일 수 있다. 이들 약물은 하나 이상의 페리틴과 함께 복합체에 바람직하게 사용된다.
바람직한 항암 약물은 세포자멸-유도 약물, 알킬화 물질, 항-대사물질, 항생제, 에포틸론, 핵 수용체 작용제 및 길항제, 항안드로겐, 항에스트로겐, 백금 화합물, 호르몬, 항호르몬, 인터페론, 세포 주기-의존성 단백질 키나아제(CDK: cell cycle-dependent kinase)의 저해제, 사이클로옥시게나제 및/또는 리폭시게나제의 저해제, 생물기원 지방산, 생물기원 지방산 유도체, 예컨대 프로스타노이드 및 류코트리엔, 단백질 키나아제의 저해제, 단백질 포스파타아제의 저해제, 지질 키나아제의 저해제, 백금 배위 착물, 에틸렌이민, 메틸멜라민, 트리아진, 빈카 알칼로이드, 피리미딘 유사체, 퓨린 유사체, 알킬설포네이트, 엽산 유사체, 안트라센디온, 치환된 우레아, 및 메틸하이드라진 유도체, 엔-디인 항생제, 튜불린 중합 저해제, 예컨대 메이탄시노이드 또는 아우리스타틴 유도체, 면역 체크-포인트 저해제, 및 종양-특이적 단백질 또는 표지자의 저해제, 바람직하게 Rho-GDP-해리 저해제, 더욱 바람직하게 Grp94로 구성된 그룹 중에서 선택된다.
다른 바람직한 항암 약물은 아세디아설폰, 아클라루비신, 암바존, 아미노글루테티미드, L-아스파라기나제, 아자티오프린, 바녹산트론, 벤다무스틴, 블레오마이신, 부설판, 칼슘 폴리네이트, 카보플라틴, 카페시타빈, 카무스틴, 셀레콕십, 클로람부실, 시스-플라틴, 클라드리빈, 사이클로포스파미드, 사이타라빈, 다카바진, 닥티노마이신 답손, 다우노루비신, 디브롬프로파미딘, 디에틸스틸베스트롤, 도세탁셀, 독소루비신, 엔디인(enediyne), 에피루비신, 에포틸론 B, 에포틸론 D, 에스트라뮤신 포스페이트, 에스트로겐, 에티닐에스트라디올, 에토포시드, 플라보피리돌, 플록수리딘, 플루다라빈, 플루오로우라실, 플루옥시메스테론, 플루타미드 포스페스트롤, 푸라졸리돈, 겜시타빈, 고나도트로핀 방출 호르몬 유사체, 헥사메틸멜라민, 하이드록시카바미드, 하이드록시메틸니트로푸란토인, 하이드록시프로게스테론카프로에이트, 하이드록시우레아, 이다루비신, 이독수리딘, 이포스파미드, 인터페론 α, 이리노테칸, 류프롤리드, 로무스틴, 루르토테칸, 마페니드 설페이트 올라미드, 메클로레타민, 메드록시프로게스테론 아세테이트, 메가스트롤아세테이트, 멜팔란, 메파크린, 머캅토퓨린, 메토트렉세이트, 메트로니다졸, 미토마이신 C, 미토포도지드, 미토탄, 미톡산트론, 미트라마이신, 날리딕스산, 니푸라텔, 니푸록사지드, 니푸랄라진, 니푸르티목스, 니무스틴, 니노라졸, 니트로푸란토인, 질소 머스타드, 올레오뮤신, 옥솔린산, 펜타미딘, 펜토스타틴, 페나조피리딘, 프탈릴설파티아졸, 피포브로만, 프레드니무스틴, 프레드니손, 프레우신, 프로카바진, 피리메타민, 랄티트렉시드, 라파마이신, 로페콕십, 로시글리타존, 살라조설파피리딘, 스크리플라비늄 클로라이드, 세무스틴 스트렙토조신, 설파카바미드, 설파세타미드, 설파클로피리다진, 설파디아진, 설파디크라미드, 설파디메톡신, 설파에티돌, 설파푸라졸, 설파구아니딘, 설파구아놀, 설파메티졸, 설파메톡사졸, 코-트리목사졸, 설파메톡시디아진, 설파메톡시피리다진, 설파목솔, 설파닐아미드, 설파페린, 설파페나졸, 설파티아졸, 설피소미딘, 스타우로스포린, 타목시펜, 탁솔, 테니포시드, 터티포시드, 테스토락톤, 테스토스테론프로피오네이트, 티오구아닌, 티오테파, 티니다졸, 토포테칸, 트리아지쿠온, 트레오설판, 트리메토프림, 트로포스파미드, UCN-01, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 빈블라스틴, 비노렐빈, 및 조루비신으로 구성된 그룹 중에서 선택되며, 바람직하게 아우리스타틴, 바녹산트론, 벤다무스틴, 클로람부실, 칼리세아마이신, 사이클로포스파미드 다이네마이신 A, 메이탄신, 멜팔란, 메르탄신, 및 네오카지노스타틴으로 구성된 그룹 중에서 선택되고, 가장 바람직하게 바녹산트론, 벤다무스틴, 클로람부실, 사이클로포스파미드, 피롤로벤조디아제핀, 및 멜팔란으로 구성된 그룹 중에서 선택된다.
항암 약물이 증식 저해 단백질, 바람직하게 세포 주기 저해제, 또는 세포의 질환 상태를 조정하는 표적 조직 내의 세포 상의 또는 세포 내의 표적, 바람직하게 증식 촉진 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 유사 항체, 또는 바람직하게 증식 저해 단백질 또는 세포의 질환 상태를 조정하는 표적 조직 내의 세포 상의 또는 세포 내의 표적, 바람직하게 증식 촉진 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 유사 항체를 암호화하는 핵산 또는 siRNA 또는 DNAzyme인 것이 특히 바람직하다.
본 발명의 맥락에서 사용될 항체의 바람직한 예는 단쇄 항체, 항체 단편, 나노바디, 경쇄 또는 중쇄, 가변 경쇄 또는 가변 중쇄, 또는 디아바디이다. 바람직한 항체 단편은 단편 항원 결합(Fab) 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, 중쇄 항체, 단일-도메인 항체(sdAb), 단쇄 가변 단편(scFv), 가변 단편(Fv), VH 도메인, VL 도메인, 단일 도메인 항체, 나노바디, IgNAR(면역글로불린 신규 항원 수용체), 디-scFv, 이중특이적 T-세포 관여항체(BITE), 이중 친화도 재표적화(DART) 분자, 삼중체, 디아바디, 단쇄 디아바디, 및 그의 융합 단백질을 포함한다.
활성 성분이 핵산인 경우, 그것이 miRNA, siRNA, DNAzyme, 또는 약제학적으로 활성인 단백질, 예를 들어 항체, 유사 항체, 사이토카인, 전구약물-전환 효소 등을 암호화하는 핵산인 것이 바람직하다.
상기 개관된 바와 같이, 본 발명의 표적화 전달 시스템은 활성 성분을 저산소 영역에 전달하기 위한 특별한 적합성을 나타낸다. 저산소 조건 하에 활성화되는 활성 성분의 사용은 표적화에 추가의 특이성을 부가하고/하거나 활성 성분의 부작용을 추가로 감소시킨다. 따라서, 특히 바람직한 실시양태에서 활성 성분은 저산소증-활성화 전구약물이다. 모든 저산소증-활성화 전구약물의 골격은 조직 내에서 저산소 조건 하에 효소적으로 환원되는 5개의 상이한 화학적 부분(니트로 기, 퀴닌, 방향족 및 지방족 N-옥사이드, 및 전이 금속) 중 하나의 존재이다. 저산소증-활성화 전구약물은 상응하는 약물에 비해 덜 활성이거나 불활성인 임의의 전구약물이며, 약물 및 하나 이상의 생체환원성 기를 포함한다. 이러한 저산소증-활성화 전구약물은 단일 전자 전달 효소(예컨대 사이토크롬 P450 환원효소) 및 2 전자 전달(또는 하이드라이드 전달) 효소를 제한 없이 포함하는 다양한 환원제 및 환원 효소에 의해 활성화되는 모든 전구약물을 포함한다. 본 발명의 바람직한 실시양태에 따라 저산소증-활성화 전구약물은 TH-302이다. TH-302의 합성 방법은 PCT 출원 제WO 07/002931호 및 제WO 08/083101호에 기재되어 있다. 이러한 전구약물의 바람직한 예는 벤조트리아진 N-옥사이드, 아파지쿠온(EO9), 티라파자민(TPN), 및 SN30000으로 구성된 클래스 I 그룹; 또는 니트로 화합물 PR-104A, TH-302, TH-4000, 및 AQ4N으로 구성된 클래스 II 그룹 중에서 선택된다.
본 발명의 단리된 표적화 전달 시스템의 바람직한 실시양태에서 복합체에 포함된 철 결합 단백질(들)과 활성 성분 사이의 결합(들)은 공유적 및/또는 비공유적이고/이거나; 복합체에 포함된 활성 성분은 철 결합 단백질, 바람직하게 페리틴 또는 그의 다량체에 의해 포획/캡슐화된다. 일 실시양태에서 공유적 및/또는 비공유적 커플링은 링커 또는 스페이서를 통해 간접적이다. 공유 결합의 형성을 원하는 경우, 철 결합 단백질의 관련된 티올, 아미노, 또는 카복실 기를 사용하여 활성 성분을 직접적으로 또는 간접적으로 하나 이상의 철 결합 단백질에 공유적으로 커플링한다. 상이한 활성 성분이 복합체에 포함되는 것 또한 예상된다. 예를 들어, 하나의 유형의 활성 성분은 철 결합 단백질(비공유적으로 결합함)에 결합하는 반면에 다른 유형은 캡슐화될 수 있다. 이 접근법은 표적화 조직 및/또는 세포에 일단 전달된 철 결합 단백질로부터의 활성 성분의 상이한 방출 속도를 이용한다. 예를 들어, 활성 성분으로서 작용하는 약물 유도체를 페리틴 분자에(24량체의 표면 상에, 또는 내부 공동 내에) 관련된 티올, 아미노, 또는 카복실 기의 반응성을 활용하여 공유적으로 부착할 수 있다. 이러한 유용한 반응의 유형은 당업계에 주지되어 있으며, 임의의 부가적인 연구 없이 당업자에 의해 구체적인 활성 성분에 대해 채택될 수 있다. 이러한 반응의 예는 문헌[Behrens CR, Liu B. Methods for site-specific drug conjugation to antibodies. MAbs. 2014 Jan-Feb;6(1):46-53]에 기재되어 있다.
추가의 태양에서 본 발명은
a) 상기 정의된 정제된 철 결합 단백질을 제공하는 단계;
b) 활성 성분을 철 결합 단백질에 공유적으로 또는 비공유적으로 연결하고/하거나 활성 성분을 철 결합 단백질 내에 캡슐화하는 단계;
c) 상기 정의된 CD45+ 백혈구 세포를 제공하는 단계; 및
d) CD45+ 백혈구 세포가 단계 b)에서 생성된 철 결합 단백질과 활성 성분의 복합체로 적어도 부분적으로, 바람직하게 완전히 로딩될 때까지 단계 b)에서 생성된 철 결합 단백질과 활성 성분의 복합체의 존재 하에 CD45+ 백혈구 세포를 인큐베이션하는 단계를 포함하는, 본 발명의 단리된 표적화 전달 시스템의 제조 방법에 관한 것이다.
단백질과 약물 부분 사이의 부가물의 형성은 표적 단백질에 대한 비공유 약물 분자 결합일 수 있으며 하기와 같이 기재될 수 있다: 페리틴의 경우, 페리틴 거대분자 자체의 결합 해리 특성을 활용함으로써 전형적으로 내부 공동 내에 약물을 캡슐화할 수 있다(물리적 구속). 약물 분자는 공동 내부 표면 내의 아미노산 잔기와의 비공유 상호작용에 의해 정위치에 유지된다. 헤모글로빈 거대분자 또한 헤모글로빈 자체의 헴 결합 포켓 내에 호스팅될 수 있는 선택된 약물 분자의 비공유 결합의 가능성을 제공한다. 헴은 포켓에 의해 축출되고 적절한 소수성 프로파일을 나타내는 약물에 의해 대체될 수 있다. 추가의 태양에서, 본 발명에서 고려되는 모든 단백질은 단백질 자체의 티올 또는 아미노 기에 대해 반응성인 특이적 활성 링커 부분에 의해 개질된 약물 분자에 공유적으로 부착될 수 있다. 그러므로, 페리틴 또는 헤모글로빈은 펩티드 기반의 분해가능한 링커(예를 들어 카텝신 감수성 발린-시트룰린 서열 및 파라-아미노벤질카바메이트 스페이서)를 보유하는 시스테인 티올 반응성 약물에 연결될 수 있다. 주목할만한 예로서, 항유사분열제 모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE)가 사용되어 왔다. 펩티드-기반의 링커는 안정한 방식으로 단백질을 세포독성 화합물에 결합시키므로 생리학적 조건 하에 약물이 단백질로부터 쉽게 방출되지 않으며 건강한 세포에 대한 독성을 방지하고 투여량 효율을 보장하는 데에 도움이 된다. 그렇게 생성된 단백질 약물 부가물은 선택된 수용체 유형, 즉, 헤모글로빈의 경우에 CD163, 그리고 페리틴 또는 트랜스페린의 경우에 TfR에 각각 부착될 수 있다. 일단 결합되면 단백질 약물 부가물은 세포내이입에 의해 내재화되며, 따라서 표적 세포에 의해 선택적으로 흡수된다. 약물을 함유하는 소포는 리소좀과 융합되고, 리소좀 시스테인 프로테아제, 특히 카텝신 B가 발린-시트룰린 링커를 분해하기 시작하며, MMAE는 더 이상 항체에 결합되어 있지 않고 종양 환경 내로 직접 방출된다.
대안적으로, DM1-SMCC는 항체에 대해 성공적으로 기재된 반응에서 리신 잔기에 특이적으로 결합하여 페리틴, 헤모글로빈, 또는 트랜스페린과의 공유 복합체를 생성하는 링커를 보유하는 효율적인 메르탄신 유도체이다. 특히, 헤모글로빈, 페리틴, 또는 트랜스페린을 DM1-SMCC와 반응시킴으로써 세포 내부에서 분해될 수 있고 시간-의존적 방식으로 활성 약물을 방출하는 공유 단백질-약물 부가물을 제공할 수 있다. DM1에 의한 미세소관 역학의 억제는 유사분열 정지 및 세포 사멸을 유도한다.
본 발명의 맥락에서 용어 "완전 로딩"은 CD45+ 백혈구 세포, 바람직하게 대식세포, 더욱 바람직하게 활성화 대식세포에 의해 흡수될 수 있는 활성 성분과 복합체를 형성하는 철 결합 단백질, 바람직하게 페리틴의 최대량을 지칭하기 위해 사용된다.
제3 태양에서 본 발명은, 의약으로 사용하기 위한 본 발명의 단리된 표적화 전달 시스템에 관한 것이다.
제4 태양에서 본 발명은, 본 발명의 단리된 표적화 전달 시스템 및 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 적합한 부형제(들)를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 단리된 표적화 전달 시스템은 생존 세포를 포함하므로, 담체 및 부형제는 세포가 생존을 유지하도록 선택되는 것이 바람직하다.
"약제학적으로 허용되는"은 동물, 더욱 특히 인간에서의 사용에 대해 연방 정부 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 미국 약전 또는 다른 일반적으로 인식된 약전에 열거됨을 의미한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "담체"는 희석제, 부형제, 계면활성제, 안정화제와 같으나 이로 제한되지 않는 약리학적 불활성 물질, 치료적 활성 성분이 그와 함께 투여되는 생리학적 완충 용액 또는 비히클을 지칭한다. 이러한 약제학적 담체는 액체 또는 고체일 수 있다. 액체 담체는 멸균 액체, 예컨대 물 중의 식염 용액, 및 석유, 동물, 식물, 또는 합성 기원의 것들, 예컨대 낙화생유, 대두유, 광유, 참깨유 등을 포함하나 이로 제한되지 않는 오일을 포함하나 이로 제한되지 않는다. 식염 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액 또한, 특히 주사용 용액을 위한 액체 담체로서 채용할 수 있다. 약제학적 조성물을 정맥내 투여하는 경우에는 식염 용액이 바람직한 담체이다. 적합한 약제학적 담체의 예는 문헌["Remington's Pharmaceutical Sciences" by E. W. Martin]에 기재되어 있다.
적합한 약제학적 "부형제"는 전분, 글루코스, 락토오스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카 겔, 소듐 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 소듐 클로라이드, 탈지 분유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다.
"계면활성제"는 소듐 데옥시콜레이트, 소듐 도데실설페이트, 트리톤(Triton) X-100, 및 폴리소르베이트, 예컨대 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 60, 폴리소르베이트 65, 및 폴리소르베이트 80과 같으나 이로 제한되지 않는 음이온성, 양이온성, 및 비이온성 계면활성제를 포함한다.
"안정화제"는 만니톨, 수크로스, 트레할로스, 알부민과 더불어 프로테아제 및/또는 뉴클레아제 길항제를 포함하나 이로 제한되지 않는다.
"생리학적 완충 용액"은 소듐 클로라이드 용액, 탈염수와 더불어, 포스페이트 완충액, 시트레이트 완충액, 트리스 완충액(트리스(하이드록시메틸)아미노메탄), HEPES 완충액([4 (2 하이드록시에틸)피페라지노]에탄설폰산), 또는 MOPS 완충액(3 모폴리노-1 프로판설폰산)과 같으나 이로 제한되지 않는 적합한 유기 또는 무기 완충 용액을 포함하나 이로 제한되지 않는다. 각각의 완충액의 선택은 일반적으로 원하는 완충 몰농도에 따라 달라진다. 포스페이트 완충액은, 예를 들어, 주사 및 주입 용액에 적합하다.
용어 "보조제"는 세포 수준 또는 체액 수준에서 조성물의 활성 성분에 대한 면역 반응을 증대하거나 자극하거나 활성화하거나 강화하거나 조정하는 약제를 지칭하며, 예를 들어, 면역학적 보조제는 실제 항원에 대한 면역 시스템의 반응을 자극하지만, 그들 자체로는 면역학적 효과를 나타내지 않는다. 이러한 보조제의 예는 무기 보조제(예를 들어 무기 금속 염, 예컨대 알루미늄 포스페이트 또는 알루미늄 하이드록사이드), 유기 보조제(예를 들어 사포닌 또는 스쿠알렌), 오일-기반의 보조제(예를 들어 프로인트 완전 보조제(Freund's complete adjuvant) 및 프로인트 불완전 보조제(Freund's incomplete adjuvant)), 사이토카인(예를 들어 IL-1β, IL-2, IL-7, IL-12, IL-18, GM-CFS, 및 INF-γ) 미립자 보조제(예를 들어 면역-자극 복합체(ISCOMS), 리포좀, 또는 생분해성 미소구체), 바이로좀, 박테리아 보조제(예를 들어 모노포스포릴 지질 A, 또는 뮤라밀 펩티드), 합성 보조제(예를 들어 비이온성 블록 공중합체, 뮤라밀 펩티드 유사체, 또는 합성 지질 A), 또는 합성 폴리뉴클레오티드 보조제(예를 들어 폴리아르기닌 또는 폴리리신)를 포함하나 이로 제한되지 않는다.
제5 태양에서 본 발명은, 종양, 바람직하게 고형 종양, 바람직하게 유방암, 췌장암, 방광암, 폐암, 대장암, 또는 저산소 영역을 가진 종양, 피부 상처, 다른 상처 내의 또는 장기 경색(심장) 또는 허혈성 망막 후의 염증성 질환 또는 허혈성 영역의 예방/치료에 사용하기 위한, 본 발명의 단리된 표적화 전달 시스템에 관한 것이다.
본 명세서에 사용되는 용어 "치료"는, 치유, 일시적 차도, 예방 등의 목적으로, 질환의 진행의 지연 또는 중지, 병변의 퇴행 또는 소멸, 발병의 예방, 또는 재발의 저해를 포함하는 다른 목적으로, 의학적으로 허용되는 모든 유형의 예방적 및/또는 치료적 중재를 포함한다.
본 발명에 따른 표적화 전달 시스템은 정상적으로는 종양에 도달할 수 없을(예를 들어, 용해도 문제로 인해) 활성 성분의 종양 전달을 가능하게 한다. 그것은 또한 저산소 종양 또는 종양의 저산소 영역에 대한 활성 성분의 전달을 가능하게 한다. 이 시스템은 또한, 예를 들어 허혈 사건 중에 저산소 조건을 겪거나 염증 과정을 겪고 있는 유기체 내의 임의의 영역에 대한 활성 성분의 전달을 제공한다.
상기 언급된 바와 같이 본 발명은 또한 종양 매스 내로의 표적화 약물 전달 방법을 제공한다. 이 방법은 대식세포에 의한 고도로 효율적인 철-결합 단백질(페리틴, 헤모글로빈, 및/또는 트랜스페린) 흡수(여기에서 상기 페리틴, 헤모글로빈, 및/또는 트랜스페린은 활성 성분(예를 들어 약물/전구약물)을 운반함), 종양 표적화, 및 암 세포에 대한 철-결합 단백질 전달(여기에서 활성 성분이 방출됨)을 가능하게 하는 CD45+ 백혈구, 바람직하게 활성화 대식세포의 제조를 포함한다.
본 발명은 종양을 표적화하기 위한 전달 시스템으로서 약물/전구약물과 연결된 철-결합 단백질로 로딩된 CD45+ 백혈구, 바람직하게 활성화 대식세포를 활용한다. 화학요법에 대한 종양의 만족스럽지 않은 반응, 또는 영상화 방법을 사용하여 그들을 검출함에 있어서의 난점은 주로 불량한 혈관구조로 인해 저산소 영역에 대한 항암 약물의 침투가 변경되는 것에 관련된다. 그러나, 이들 무혈관성 지역은 심지어 혈관으로부터 멀리 있는 영역에서도 CD45+ 백혈구, 바람직하게 활성화 대식세포가 이동하도록 유인한다. 그러므로, 그들은 종양 매스에 대한 입자의 전달 시스템을 구성한다. 이러한 입자의 유망한 예는 철-결합 단백질이다. 그러나, 단일 약제로서 사용되는 경우에 그들은 다른 화합물과 마찬가지로 저산소 지역에 도달하지 않고 다른 장기에 축적된다.
본 발명자들은 화학적 방법을 사용하여 항암 약물, 저산소증 활성화 전구약물(치료 목적으로) 또는 동위원소를 헤모글로빈 또는 트랜스페린에 연결하고 실시예에 기재된 바와 같이 세포를 철-결합 단백질 용액으로 처리하여 그것을 CD45+ 백혈구(단핵구, 대식세포, 림프구, 및/또는 과립구), 바람직하게 활성화 대식세포 내에 로딩하였다. 본 발명자들은, 동물에 투여시에 로딩된 CD45+ 백혈구, 바람직하게 활성화 대식세포가 종양 저산소 부위로 이동하여 캡슐화된 활성 성분을 가진 철-결합 단백질을 암 세포 내로 방출하는 것을 관찰하였다. 이 방법은 종양 부위에 대한(특히 저산소 지역에 대한) 활성 성분의 정확한 투여를 가능하게 하며, 다른 장기 내의 그들의 축적을 방지한다.
앞서 서술한 본 발명의 상세한 설명은 현재 그의 최선의 방식인 것으로 간주되는 것을 당업자가 제조하고 사용하는 것을 가능하게 하지만, 본 명세서의 특이적 실시양태, 방법, 및 실시예의 변형, 조합, 및 등가물의 존재를 당업자는 이해하고 인정할 것이다. 그러므로 본 발명은 상기 기재된 실시양태, 방법, 및 실시예에 의해 제한되어서는 안되며, 본 발명의 범위 및 사상 내의 모든 실시양태 및 방법에 의해 제한되어야 한다.
본 발명은 또한 하기 태양 및 이들 태양의 바람직한 실시양태에 관한 것이다. 상기 제공된 정의는 하기 태양 및 실시양태에 마찬가지로 적용된다.
1. 활성 성분을 운반하는 페리틴으로 로딩된 활성화 대식세포를 포함하는 표적화 전달 시스템.
2. 실시양태 1에 있어서, 페리틴에 의해 운반되는 활성 성분이 항암 약물인 표적화 전달 시스템.
3. 실시양태 2에 있어서, 항암 약물이 세포자멸-유도 약물인 표적화 전달 시스템.
4. 실시양태 2에 있어서, 항암 약물이 사이클로포스파미드, 클로람부실, 멜팔란, 벤다무스틴, 및 바녹산트론을 포함하는 그룹 중에서 선택되는 표적화 전달 시스템.
5. 실시양태 1에 있어서, 활성 성분이 저산소증-활성화 전구약물인 표적화 전달 시스템.
6. 실시양태 5에 있어서, 저산소증 -활성화 전구약물이 TH-302인 표적화 전달 시스템.
7. a) 페리틴을 정제하는 단계;
b) 페리틴과 활성 성분의 연결에 의해 상기 활성 성분을 운반하는 페리틴을 얻는 단계;
c) 단리된 대식세포를 활성화하는 단계;
d) 활성 성분을 운반하는 페리틴이 대식세포 내로 완전히 로딩되는 것을 보장하기에 충분한 시간 및 페리틴 농도에서, 단계 b)에서 얻어진 활성 성분을 운반하는 페리틴의 용액 중에 대식세포를 인큐베이션하는 단계를 포함하는, 활성 성분을 운반하는 페리틴으로 로딩된 활성화 대식세포를 포함하는 표적화 전달 시스템의 제조 방법.
8. 실시양태 7에 있어서, 활성화 대식세포가 골수 유래 대식세포인 방법.
9. 실시양태 7에 있어서, 활성화 대식세포가 혈액 유래 대식세포인 방법.
10. 실시양태 7에 있어서, 활성화 대식세포가 대식세포 세포주로부터 유도되는 방법.
11. 실시양태 7 내지 실시양태 10 중 어느 한 실시양태에 있어서, 활성화 대식세포가 M1 또는 M2로 극성화된 대식세포인 방법
12. 실시양태 11에 있어서, 활성화 대식세포가 M2로 극성화되는 방법.
13. 실시양태 11에 있어서, 활성화 대식세포가 철 대사작용에 대해 조작되는 방법.
14. 실시양태 7 내지 실시양태 13 중 어느 한 실시양태에 있어서, 페리틴에 의해 운반되는 활성 성분이 항암 약물인 방법.
15. 실시양태 14에 있어서, 항암 약물이 세포자멸/자가포식 또는 세포괴사-유도 약물인 방법.
16. 실시양태 14에 있어서, 항암 약물이 사이클로포스파미드, 클로람부실, 멜팔란, 벤다무스틴, 및 바녹산트론을 포함하는 그룹 중에서 선택되는 방법.
17. 실시양태 7 내지 실시양태 13 중 어느 한 실시양태에 있어서, 활성 성분이 저산소증 -활성화 전구약물인 방법.
18. 실시양태 17에 있어서, 저산소증-활성화 전구약물이 TH-302인 방법.
19. 항암 약물 표적화 전달 시스템으로 사용하기 위한, 실시양태 1 내지 실시양태 7 중 어느 한 실시양태에 정의된 표적화 전달 시스템.
20. 고형 종양 성장의 예방/치료에 사용하기 위한, 실시양태 1 내지 실시양태 7 중 어느 한 실시양태에 정의된 표적화 전달 시스템.
21. 염증성 질환의 치료에 있어서, 실시양태 1 내지 실시양태 7 중 어느 한 실시양태에 정의된 표적화 전달 시스템의 용도.
22. 허혈성 영역의 치료 또는 영상화에 있어서, 실시양태 1 내지 실시양태 7 중 어느 한 실시양태에 정의된 표적화 전달 시스템의 용도.
바람직한 실시양태에서 본 발명은 상기 항목 1 내지 22의 대상을 포함하지 않는다.
본 발명은 하나 이상의 철 결합 단백질과 활성 성분의 복합체를 세포 내에 포함하는 CD45+ 백혈구 세포를 포함하는 단리된 세포 표적화 전달 시스템과 더불어 이러한 단리된 세포 표적화 전달 시스템의 제조 방법, 및 치료법을 위한, 특히 암의 치료법을 위한 이러한 시스템의 용도를 제공한다.
도 1: 패널 (A)는 포유류 페리틴 H 사슬 중의 공통 아미노산 서열의 최소 활성 단편 및 몇몇 포유류 페리틴 H 사슬을 기반으로 하는 2개의 전체 길이 공통 서열(각각 서열 번호 1, 2, 및 7 참조)과 더불어 마우스(서열 번호 3 및 4) 및 인간(서열 번호 5 및 6) 페리틴 H 사슬의 최소 및 전체 길이 아미노산 서열을 나타낸다. 패널 (B)는 포유류 페리틴 L 사슬 중의 공통 아미노산 서열의 최소 활성 단편 및 몇몇 포유류 페리틴 L 사슬을 기반으로 하는 2개의 전체 길이 공통 서열(각각 서열 번호 8, 9, 및 14 참조)과 더불어 마우스(서열 번호 10 및 11) 및 인간(서열 번호 12 및 13) 페리틴 L 사슬의 최소 및 전체 길이 아미노산 서열을 나타낸다. 패널 (C)는 포유류 헤모글로빈 알파 사슬 중의 공통 아미노산 서열의 최소 활성 단편 및 몇몇 포유류 헤모글로빈 알파 사슬을 기반으로 하는 하나의 전체 길이 공통 서열(각각 서열 번호 15 및 16 참조)과 더불어 인간(서열 번호 17 및 18) 헤모글로빈 알파 사슬의 최소 및 전체 길이 아미노산 서열을 나타낸다. 패널 (D)는 포유류 헤모글로빈 베타 사슬 중의 공통 아미노산 서열의 최소 활성 단편 및 몇몇 포유류 헤모글로빈 베타 사슬을 기반으로 하는 전체 길이 공통 서열(각각 서열 번호 19 및 20 참조)과 더불어 인간(서열 번호 21 및 22) 헤모글로빈 베타 사슬의 최소 및 전체 길이 아미노산 서열을 나타낸다. 패널 (E)는 포유류 트랜스페린 중의 공통 아미노산 서열의 N- 및 C-말단 최소 활성 단편(서열 번호 23 및 24) 및 몇몇 포유류 트랜스페린을 기반으로 하는 전체 길이 공통 서열(서열 번호 25)과 더불어 인간 트랜스페린의 N- 및 C-말단 최소 활성 단편(서열 번호 26 및 27) 및 인간 트랜스페린의 전체 길이 아미노산 서열(서열 번호 28)을 나타낸다. 공통 서열에서 X는 가변적인 위치를 표시하며 임의의 천연 아미노산을 의미한다. 바람직하게, 각각의 경우에 X는 다른 X에 독립적으로 인간 단백질에 존재하는 아미노산을 의미한다.
도 2: 마우스 종양 매스 내부의 대식세포를 나타낸다(주사 전에 TRITC 염색함, FITC-도포(decorated) 페리틴으로 로딩됨).
도 3: 유선암 세포로 주사하고 FITC-페리틴으로 로딩된 대식세포를 i.v. 제공한 마우스 종양 조직의 공초점 현미경법 영상(별표)을 나타낸다 - 대식세포에서뿐 아니라 암 세포에서도 페리틴-FITC가 모든 종양 매스 내에 확산됨이 명확하게 관찰된다.
도 4: 시작 시점(A) 및 암 세포를 페리틴으로 충전하기에 충분하게 긴 시간 후(B)에 촬영된, 시험관내 대식세포(*로 표시됨; FITC-페리틴으로 로딩됨) 및 암 세포(화살표로 표시됨; 적색 표지로 염색했으므로 페리틴 흡수 전에 녹색 채널에서 관찰되지 않음)의 공초점 현미경법을 사용하는 1 채널(원래 녹색 채널이 그레이-스케일 사진으로 전환됨) 기록의 스냅 사진을 나타낸다. FITC-페리틴은 역학적으로 암 세포에 수송되었다(최초에 소포 내에 축적된 후; 이 영상에 나타난 바와 같이 전체 세포질로 확산됨(녹색 채널에 세포가 나타남)).
도 5: 위약, 및 페리틴-커플링된 멜팔란 및 페리틴-커플링된 클로람부실로 로딩된 대식세포를 투여 받는 마우스의 생존을 나타낸다.
도 6: 사이클로포스파미드, 및 대식세포에 로딩된 페리틴 내에 캡슐화된 사이클로포스파미드(동일한 용량이 제공됨)를 이용한 치료에 의해 야기되는 종양 세포 세포자멸을 나타낸다.
도 7: 마우스 유선 종양의 MRI 영상을 나타낸다. 페리틴 Fh로 로딩된 대식세포(i.v. 주사)로 마우스를 치료하였다(시점 0 h에). 이어서 본 발명자들은 주사된 대식세포로 충전된(유의적인 T2-신호 감소를 제공함) 혈관의 증가된 직경(화살표)을 관찰하였으며, 그 후에 대식세포가 조직으로 확산되었다(반점-유사 패턴; 화살표). 이들 변화(동일한 시점에)는 시험한 모든 마우스에서 관찰되었다.
도 8: 대식세포에 의한 페리틴, 헤모글로빈, 및 트랜스페린 흡수, 단핵구에 의한 페리틴 및 헤모글로빈 흡수, 및 림프구 및 과립구에 의한 페리틴 흡수를 나타낸다.
도 9: 대식세포에 의한 페리틴 저장의 안정성을 나타낸다.
도 10: 대식세포로부터 다양한 암 세포로의 페리틴, 헤모글로빈, 및 트랜스페린의 전달을 나타낸다.
도 11: 대식세포로부터 암 및 비-암 세포로의 페리틴의 전달을 나타낸다.
도 12: 대식세포로부터 암 세포로의 저산소증 활성화 전구약물과 함께 캡슐화된 페리틴의 전달을 나타낸다.
도 13: 공동-배양된 대식세포로부터의 캡슐화된 다양한 항암제를 가진 페리틴 또는 동일한 약제를 가진 가용성 페리틴을 투여 받은 암 세포에서의 세포자멸을 나타낸다.
도 14: 단핵구로부터 다양한 암 세포로의 페리틴, 헤모글로빈, 및 트랜스페린의 전달을 나타낸다.
도 15: 과립구로부터 다양한 암 세포로의 페리틴 및 헤모글로빈의 전달을 나타낸다.
도 16: 림프구로부터 다양한 암 세포로의 페리틴 및 헤모글로빈의 전달을 나타낸다.
도 17: 페리틴-FITC를 함유하는 사전-표지된(투여 전에) 대식세포를 투여 받은 마우스로부터의 종양을 나타내는 2-광자 현미경법으로부터의 사진을 나타낸다.
도 18: 표지된 대식세포를 정맥내 투여 받은 마우스의 전신 영상을 나타내며, 종양 부위 내의 그들의 축적 및 다른 장기 내의 그들의 분포를 나타낸다.
도 19: 저산소 조직으로의 대식세포의 이동, 사전-표지된 대식세포를 정맥내 투여한 마우스로부터의 종양의 단면을 나타내며, 종양 저산소 영역은 저산소증 표지자 - 피모니다졸론으로 가시화된다.
도 20: 종양 매스 내부의 미세환경 내의 FITC-적재된 페리틴(원형 물체)을 함유하는 소포의 편재를 나타낸다. FITC-적재된 페리틴을 함유하는 대식세포는 마우스에 정맥내 투여되었다.
도 21: 전이성 4T1 암을 가진 마우스의 전신 분석으로부터 PET에 의해 기록된 신호를 나타낸다. 마우스는 18F-FDG로 로딩된 대식세포를 정맥내 투여 받았다. 미세전이(병리 검사에 의해 확인됨)를 가진 마우스의 폐에서 신호 축적이 증가한다. 보통의 18F-FDG를 투여 받은 마우스, 또는 4T1 암이 없는 마우스는 더 낮은 PET 신호를 나타냈다.
실시예 1 - 대식세포의 활성화
본 발명에 따라 사용하기 위한 대식세포는 하기와 같이 얻어지고 분화되고 활성화되었다. 대식세포를 활성화하기 위해, 최초에 그들을 골수 전구체(예를 들어 문헌[Weischenfeld and Porse, 2008, CSH Protoc, doi. 10.1101/pdb.prot.5080] 참조) 또는 혈액 단핵구로부터 얻었다. 대안적으로, 그들은 복막으로부터 얻을 수 있다. 대식세포의 단리, 배양, 분화, 및 극성화/활성화 방법은 당업자에게 주지되어 있다. 예를 들어, 그들은 문헌[Murray et al. Immunity, 2014, 41(1):14-20]에 상세하게 기재되어 있다.
본 발명의 이러한 실제 구현에서 골수 유도 대식세포는 BALB/c 또는 C57Bl/6 마우스로부터 얻어졌으나, 개 혈액-단핵구-유도 대식세포 또는 구매가능한 대식세포 세포주(단핵구-대식세포 계통 마우스 세포: RAW 264.7, J744, 인간: THP-1, U937, 또는 개 DH82 세포주)를 사용하였다.
약술하면, 플라스틱 페트리 디쉬 내에서 이러한 골수 유도 대식세포를 5 ml의 하기 배지 중에 접종한다(3 ml 세포/플레이트): DMEM:F12 + 글루타민/글루타맥스 + 10% FBS + 페니실린/스트렙토마이신 및 20%의 L929 조건화 배지 또는 M-CSF(50ng/ml). 그 후 5 일 동안 배지를 성장 인자 및 활성화 화합물 중 하나 또는 하나의 사이토카인 칵테일로서의 그들의 조합으로 보충한다.
대안적으로, 대식세포를 그들이 활성화된 것으로 간주하기 위해 필요한 모든 사이토카인 및 인터류킨을 함유하는 "M1/M2 대식세포 생성 배지"(프로모셀(Promocell)) 또는 등가의 구매가능하거나 자가-제조된 배지 중에 배양하였다.
혈액 단핵구로부터 대식세포를 얻기 위해, 히스토파크 시스템(Histopaque system) 1077 또는 등가물을 사용하여 신선한 혈액(12 시간 이하가 경과된)을 스핀 다운하고 백혈구(또는 대안적으로, 단지 혈액 은행으로부터 수집된 백혈구)를 적절한 양의 사전-가온된 단핵구 부착 배지(또는 등가물, 예를 들어 M-CSF로 보충된 DMEM/RPMI), 예를 들어 T-75 플라스크 당 15 ml 배지에 접종한다. 접종 밀도는 단핵구 함량이 ≥25%인 단핵성 세포의 경우에는 1-2 백만/cm2이어야 하고 <25%의 단핵구 함량의 경우에는 1.5-3 백만/cm2이어야 한다. 이어서, 5% CO2 및 37 ℃에서 1 - 1.5 시간 동안 세포를 인큐베이터 내에서 임의의 추가 조작 없이 인큐베이션한다.
세포 부착 후에, 그들을 적어도 2회 세척한 후, 적절한 양의 완전 "M1- 또는 M2-대식세포 생성 배지 DXF"를 세포에 첨가하고(예를 들어 T-75 플라스크 당 20 ml) 6 일 동안 37 ℃ 및 5% CO2 에서 배지 교환 없이 세포를 인큐베이션한다. 대식세포를 활성화하기 위해, 활성화 화합물에 의해 보충된 배지로 전체 배지를 대체해야 한다.
본 발명에 사용되는 활성화 화합물(골수 유도 세포에, 또는 단핵구-대식세포 세포주로부터의 세포를 활성화하기 위해)은 하기와 같다: IL-4(20 ng/ml), IFN-γ(적어도 20 ng/ml), LPS(적어도 10 ng/ml), IL-13(적어도 20 ng/ml), IL-10(적어도 20 ng/ml), 덱사메타손(적어도 20 μg/ml), oxLDL(적어도 20 ng/ml), TNF-α(20 ng/ml), TGF-β(20 ng/ml), 코르티솔(150-300 ng/ml), 또는 하나의 사이토카인 칵테일로서의 그들의 조합. 활성화되지 않은 대식세포를 얻기 위해서는 활성화 화합물을 첨가하지 않았다.
대식세포의 극성화/활성화의 역전(고전적으로 활성화된 것으로부터 대안적으로 활성화된 것까지)은, 예를 들어, 상기 열거된 적절한 사이토카인 중에 적어도 48 hr 동안 대식세포를 배양함으로써 도달할 수 있다.
실시예 2 - 단핵구 단리
본 발명의 이러한 실제 구현에서 단핵구를 얻기 위해, 골수 유도 또는 비장-유도 단핵구는 BALB/c 또는 C57Bl/6 마우스로부터 얻어졌으나, 개 혈액 단핵구 또는 구매가능한 단핵구 세포주를 사용하였다(단핵구-대식세포 계통 마우스 세포: RAW 264.7, J744, 인간: THP-1, U937, 또는 개 DH82 세포주).
혈액 단핵구를 얻기 위해, 히스토파크 시스템 1077 또는 등가물을 사용하여 신선한 혈액(12 시간 이하가 경과된)을 스핀 다운하고 백혈구를 적절한 양의 사전-가온된 단핵구 부착 배지(또는 등가물, 예를 들어 20 ng/ml M-CSF로 보충된 DMEM/RPMI), 예를 들어 T-75 플라스크 당 15 ml 배지에 접종한다. 대안적으로, 단지 혈액 은행으로부터 수집된 백혈구(백혈구연층(buffy coat))를 사용할 수 있다. 접종 밀도는 단핵구 함량이 ≥25%인 단핵성 세포의 경우에는 1-2 백만/cm2이어야 하고 <25%의 단핵구 함량의 경우에는 1.5-3 백만/cm2이어야 한다. 이어서, 1 - 1.5 시간 동안 5% CO2 및 37 ℃에서 세포를 인큐베이터 내에서 임의의 추가 조작 없이 인큐베이션한다. 세포 부착 후에, 그들을 적어도 2회 세척하고, 부착 세포를 단핵구로 간주한다.
골수 유도 단핵구를 얻기 위해, 본 발명의 이러한 실제 구현에서 골수 유도 대식세포는 BALB/c 또는 C57Bl/6 마우스로부터 얻어졌다. 약술하면, 플라스틱 페트리 디쉬에서 이러한 골수 유도 전구체를 5 ml의 하기 배지 중에 접종한다(3 ml 세포/플레이트): DMEM:F12 + 글루타민/글루타맥스 + 10% FBS + 페니실린/스트렙토마이신 및 20%의 L929 조건화 배지 또는 20 ng/ml M-CSF. 2 일 후에 5 ml의 표준 배지를 첨가한다. 이어서, 2 일 후에 0.5 ml/플레이트의 L929 조건화 배지를 첨가한다. 부착 세포를 단핵구로 간주한다.
비장 유도 단핵구를 얻기 위해, 본 발명의 이러한 실제 구현에서, 비장을 기계적으로 분쇄하여 단일 세포 현탁액을 얻고 70 ㎛ 세포 여과기에 통과시켰다. 세포를 원심분리하고 상등액을 제거하였다. 적혈구 용해 후에 마그네틱 비드 정제, 예를 들어 이지셉(EasySep) 마우스 단핵구 농축 키트 프로토콜 및 적절한 마그네트를 사용하여 단핵구를 단리하였다.
그들의 단백질 로딩 및 이동의 더 양호한 효과를 얻기 위해 사용 전에 그들을 하기의 대식세포 활성화 자극으로 전처리할 수 있다: IL-4(20 ng/ml), IFN-γ(적어도 20 ng/ml), LPS(적어도 10 ng/ml), IL-13(적어도 20 ng/ml), IL-10(적어도 20 ng/ml), 덱사메타손(적어도 20 μg/ml), oxLDL(적어도 20 ng/ml), TNF-α(20 ng/ml), TGF-β(20 ng/ml), 코르티솔(150-300 ng/ml), 또는 하나의 사이토카인 칵테일로서의 그들의 조합.
실시예 3 - 과립구 단리
혈액으로부터 과립구 세포를 얻기 위해, 9 부의 혈액을 1 부의 ACD 완충액(0.17 M d-글루코스, 0.10 M 시트르산, 0.11 M 트리소듐 시트레이트을 함유함)으로 희석하였다. 이 단계로부터의 혈액을 PBS로 1:1 비로 추가로 희석하고 원심분리하였다. 혈장 및 백혈구연층을 제거한 후, 잔류하는 세포를 제1 단계로부터의 원래 부피(ACD-혈액)의 80%까지 PBS와 혼합하고, 이어서 차가운 증류수로 4:12의 비로 희석하였다. 이어서, 6 부의 2.7% NaCl 용액을 첨가하고 원심분리하였다. 상등액의 제거 후에 세포를 RPMI-1640 배지에 재현탁하였다. 이들 세포를 과립구로 간주하였다.
실시예 4 - 림프구 단리
비장 유도 림프구를 얻기 위해, 본 발명의 이러한 실제 구현에서, 비장을 기계적으로 분쇄하여 단일 세포 현탁액을 얻고 70 ㎛ 세포 여과기에 통과시켰다. 세포를 원심분리하고 상등액을 제거하였다. 적혈구 용해 후에 마그네틱 비드 정제, 예를 들어 이지셉 마우스 CD4+ 농축 키트 프로토콜 및 적절한 마그네트를 사용하여 림프구를 단리하였다.
실시예 5 - 페리틴 복합체의 제조
항암 약물(예를 들어 고전적 약물, 예컨대 사이클로포스파미드, 클로람부실, 멜팔란, 벤다무스틴, 바녹산트론, 또는 저산소증-활성화 전구약물, 예컨대 TH-302)을 가진 페리틴을 혼입하기 위해 대식세포 처리 전에 페리틴을 제조해야 한다. 약술하면, 서열 번호 4(도 1)에 따른 재조합 마우스 단백질을 하기와 같이 얻는다. 서열 번호 4의 페리틴 단백질을 암호화하는 합성 유전자를 함유하는 발현 벡터 pET-22b를 E. 콜라이(E. coli) BL21(DE3) 내로 형질전환하였다. 암피실린(100 mg/L)을 첨가한 1 L의 루리아-베르타니 브로스(LB: Luria-Bertani broth) 중에 E. 콜라이 배양물을 37 ℃에서 OD600 0.6까지 성장시켰다. 1 mM 이소프로필 티오-b-D-갈락토사이드(IPTG)의 첨가에 의해 단백질 발현을 유도하고 배양물을 밤새 인큐베이션하였다. 원심분리(15 min 동안 15000 g)에 의해 세포를 수확하고, 20 mM 헤페스(pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.1 mg/mL DNase, 10 mM MgCl2 에 현탁하고, 초음파처리에 의해 파쇄하였다. 용해물을 15000 g에서 30 min 동안 원심분리하고, 상등액을 50 ℃에서 10 min 처리하고, 원심분리하여 변성 단백질을 제거한 후, 70 ℃에서 10 min 동안 다시 원심분리하였다. 4 ℃에서 1 h 동안 교반하면서 상등액에 30% (NH)4SO4를 첨가하고 15000 g에서 30 min 동안 원심분리하였다. 4 ℃에서 1 h 동안 교반하면서 상등액에 70% (NH)4SO4를 첨가하고 15000 g에서 30 min 동안 원심분리하였다. 펠렛을 20 mM 헤페스(pH 7.5), 150 mM NaCl에 재현탁하고 4 ℃에서 동일한 완충액에 대해 밤새 투석하였다. 단백질을 하이로드 26/600 수퍼덱스 200(HILOAD 26/600 SUPERDEX) 겔-여과 컬럼(GE-헬스케어(GE Healthcare)) 상에 로딩한 후 멸균 여과하고 4 ℃에 저장하였다(도 9). 21000 M-1 m-1의 몰 흡광 계수를 사용하여 280 nm에서 분광광도법으로, 그리고 595 nm에서 흡광도를 측정하는 브래드포드(Bradford) 어세이에 의해 단백질 농도를 결정하였다.
상기 페리틴은 재조합 포유류 페리틴 단백질 H 및/또는 L 단일중합체를 포함한다.
내독소가 없는 전임상 등급의 산물을 얻기 위해, 앞서 기재된 바와 같이 얻어진 페리틴을 표준 방법에 의해 정제한다(예를 들어, 문헌[Ceci et al. 2011, Extremophiles 15(3):431-439; 문헌[Vanucci et al. 2012, Int J Nanomed 7:1489-1509] 참조). 약술하면, 20 mM 헤페스(pH 7.5)를 함유하는 저장 용액 중에 멸균 보존된 페리틴을 산성 용액(최종 pH < 3.0) 중에, 또는 대안적으로, 고도로 염기성인 pH 값(pH > 9.5)에서 24량체로 4 uM의 최종 농도까지 희석함으로써(예를 들어 문헌[Pontillo et al., 2016] 참조), 다량체의 해리를 가능하게 한다. 적절한 용매에 약물을 매우 높은 농도로 용해시킨 후 작은 부피를 200 몰 과량으로 페리틴 용액에 첨가한다. 이어서, 다량체 재구성을 가능하게 하기 위해 적절한 양의 NaOH/HCl 용액을 첨가함으로써 PH를 중성이 되게 한다. 현재의 실험 방법은 100 kDa 컷 오프 농축기에서 PBS를 사용하는 3/4회 세척(농축 단계)이 공-용매와 더불어 비-캡슐화 약물 양자 모두의 신속하고 완전한 제거 및 약물 로딩된 페리틴 나노케이지의 완전 회수를 가능하게 함을 시사한다. 이어서, 그렇게 얻어진 페리틴-약물 복합체를 액체 질소 중에 급속 냉동하고 동결건조하였다.
공-용매의 선택 및 약물 분자의 고유한 화학적 특성에 따라, 최대 150-180개의 약물 분자가 24량체 페리틴 케이지 내에 포획/흡수될 수 있는 것으로 추산될 수 있다.
약물은 또한 페닐하이드라존, 석신이미드, 또는 말레이미드 활성화 약물 중의 적절한 선택에 의해 페리틴 아미노산 측쇄(리신 또는 시스테인)에 공유적으로 커플링될 수 있다. 따라서, i) 페닐하이드라존 유도체는 페리틴 표면으로부터 약물을 절단하여 유리시킬 수 있거나, ii) 리신 결합된 유도체는 아미노산으로의 완전 단백질 분해 후에 활성이 될 수 있거나, iii) 시스테인 결합된 유도체는 말레이미드 티오에테르 연결의 환원적 가수분해를 통해 세포 내에 유리될 수 있다.
실시예 6 - 헤모글로빈-화합물 복합체의 제조
문헌[Rossi-Fanelli et al., Archives of biochemistry and biophysics 77:478-492, 1958])에 기재된 바와 같이 신선한 적혈구로부터 인간 헤모글로빈을 제조한다. 약술하면, 건강한 공여자로부터 얻어진 헤파린 첨가혈을 1600 rpm에서 30 분 동안(4 ℃) 원심분리하여 RBC를 침강시켰다. 바늘 흡인에 의해 펠렛의 표면 상의 백혈구연층을 정확하게 제거하였다. 혈장 상등액을 폐기하고 RBC를 등장성 0.9% 식염 용액에 재현탁하고 1600 rpm에서 30 분 동안 4 ℃에서 원심분리함으로써 RBC 펠렛을 3회 세척하였다. 최종 식염 세척 및 원심분리 단계 후에, RBC 펠렛을 5 mM 포타슘 포스페이트 완충액(PB, pH = 7.2)으로 pH 7.2에서 완충된 증류수에 재현탁하고 온화한 교반 하에 4 ℃에서 밤새 용해되게 하였다. 이어서, 투석한 RBC 용해물을 13.000 rpm에서 30 min 동안 4 ℃에서 원심분리하고 Q-세파로스 XL(Q-sepharose XL) 수지(GE 헬스케어)로 패킹된 XK 26/40 컬럼이 장착된 AKTA 익스플로러(AKTA Explorer) 시스템 상에 실온에서 상등액을 직접 로딩하였다. 컬럼을 완충액 A(20 mM 트리스-HCl, pH=8.2)로 12 mL/min의 유속에서 평형화하고 동일한 완충액으로 3회 세척하였다. 100% 완충액 A로부터 75% 완충액 B(20 mM 트리스-Cl + 0.2 M NaCl pH 8.20)까지 변화시킴으로써 선형 구배 용출이 생성되고 100% 완충액 B의 단계 구배가 이어졌다. 용출시에, 분획 수집기를 사용하여 단백질 분획을 수집하였다. 그렇게 얻어진 단백질을 SDS PAGE로 분석하고 -80 ℃에서 냉동 저장하였다.
인간 헤모글로빈(서열 번호 18 또는 22, 도 1 참조)은 적절한 약물 접합체에 용이하게 공유적으로 연결되거나, 헴 결합 포켓 내에 소수성 약물 분자를 호스팅하거나, 심지어 헴 철에 연결된 작은 세포독성 분자를 수송할 수 있다. Hb는 단백질 표면 상의 유일한 적정가능한 시스테인인 베타 사슬의 위치 93의 시스테인 잔기에 적절한 약물 접합체를 선택적으로 부착함으로써 용이하게 개질될 수 있다. 말레이미도 작용화 약물, 예컨대 튜불린 저해제 모노메틸아우리스타틴(MMAE), 또는 석신이미드 작용화 메르탄신 유사체(DM1-SMCC)는 각각 관련된 cys 베타93 잔기(말레이미도 작용화 약물의 경우) 또는 하나 이상의 리신 잔기(석신이미드 작용화 약물)에 용이하고 특이적으로 부착될 수 있는 극도로 강력한 세포독성물질의 가장 주목할만한 예이다. 이들 약물은 하기 절차에 따라 인간 헤모글로빈에 편리하게 접합되었다:
아우리스타틴 E 유사체, 말레이미도카프로일-발린-시트룰린-p-아미노벤조일옥시카보닐-모노메틸 아우리스타틴 E(vcMMAE)는 메드켐 익스프레스(MedChem Express)(뉴저지주 프린스턴 소재)로부터 입수하였다. 헤모글로빈 vcMMAE 부가물은 하기와 같이 제조되었다. 인간 헤모글로빈 용액을 반응 완충액(0,1 mM EDTA를 함유하는 50 mM 포스페이트 완충액 pH 6,8)으로 120 μM 헴의 농도까지 조정하고 20% v/v 아세토니트릴 용액의 존재 하에 4 ℃에서 밤새 10-배 몰 과량의 vcMMAE와 접합하였다. 말레이미드 기는 pH 6.5-7.5에서 자유(환원된) 설프하이드릴과 효율적이고 특이적으로 반응하여 안정한 티오에테르 결합을 형성한다. PM 100 한외여과 농축기를 사용하여 과량의 vcMMAE를 정제하고 D-PBS로 완충액-교환하였다. 접합의 수율은 총 시스테인의 80%였다. LC-MS 분석에 의해, 그리고 p-클로로머큐리벤조에이트로 잔류 자유 티올 기를 적정함으로써 vcMMAE 접합체의 형성을 확인하였다. Hb-vcMMAE 접합체의 농도를 UV-vis 분광법 분석에 의해 결정하였다.
리신 공유 부착에 대해 작용화된 메르탄신 유사체 DM1 SMCC(미국 네바다주 헨더슨 소재의 Alb 테크놀로지 리미티드(Alb Technology Ltd))를 하기와 같이 제조하였다. 인간 헤모글로빈 용액을 반응 완충액(0.5 mM EDTA를 함유하는 0.1 mM 포스페이트 완충액 pH 7.4)으로 400 μM 헴의 농도까지 조정하고 10% v/v DMSO 용액의 존재 하에 4 ℃에서 16 시간 동안 20-배 몰 과량의 DM1-SMCC와 접합하였다. 아민-반응성 석신이미딜 에스테르가 아민에 커플링됨으로써 단백질의 표면 상의 리신 기와 공유 부가물을 생성한다. PM 100 한외여과 농축기를 사용하여 과량의 DM1-SMCC를 제거하고 D-PBS로 완충액-교환하였다. 접합의 수율은 대략 헤모글로빈 사량체 당 2.4 메르탄신 분자였다. LC-MS 분석에 의해 DM1-SMCC 접합체의 형성을 확인하였다. Hb-DM1-SMCC 접합체의 농도를 UV-vis 분광법 분석에 의해 결정하였다.
실시예 7 - 트랜스페린-화합물 복합체의 제조
건강한 공여자로부터 혈청을 얻고 킬레이터로서의 시트레이트 이온 및 비카보네이트의 존재 하에 과량의 철을 첨가하였으며, 이는 트랜스페린에 대한 철 결합을 촉진한다. 반응 혼합물은 100 mL의 혈청 당 6.5 mg 소듐 비카보네이트 및 153.16 페릭 시트레이트를 함유하였다(pH=8, 4 oC, 1 h). 이어서, 3.5 V/V 비로 4 oC 및 pH=9.4에서 2 h 동안 혈청 샘플에 알코올 용액을 첨가함으로써 리바놀(4%)에 의해 알부민을 침전시켰다. 이어서, 용액을 3000 rpm에서 20 min 동안 원심분리하고 최종적으로 0.8 mm 주사기 필터 상에서 필터에 의해 여과하였다. 이어서, 암모늄 설페이트 0.025 M 중의 세파덱스(Sephadex) G-25 컬럼 상에서 겔-여과에 의해 과량의 리바놀을 제거하였다. 이어서, pH=6.5에서 포화 암모늄 설페이트 50%에 의한 제1 침전을 실행한 후 3000 rpm에서 10 min 동안 원심분리하였다(면역글로불린 제거). 이어서, 80% 포화 암모늄 설페이트에서의 제2 침전을 실행함으로써 트랜스페린 침전이 회수되도록 하였다. 이어서, 1 M NaCl을 함유하는 0.06 M 트리스 HCl 완충액(pH=8)의 완충액에 고체 침전을 용해시켰다. 동일한 완충액 중에 용액을 투석하여 암모늄 설페이트가 완전히 제거되도록 하였다. 이어서, 센트리콘(centricon) PM50 원심분리 농축기로 단백질 용액을 최대 10-15 mg/ml(브래드포드 방법에 의해 추산됨)까지 농축하고 15 ml/h의 유속으로 1M NaCl 중에 평형화된 세파덱스 G-100 겔-여과 컬럼(2,4 x 80 cm) 상에 로딩하였다. 그렇게 얻어진 트랜스페린은 SDS PAGE에 의해 88-90% 순도인 것으로 추산되었다. 이어서, 최종 마무리 단계로서 음이온 교환 DEAE 세파덱스 A-50에 의한 이온-교환 크로마토그래피를 사용하였다. pH=8에서 0.06 M 트리스 HCl로 평형화된 컬럼에 트랜스페린 샘플을 로딩하고 용출 완충액(0.3 M 트리스 HCl, pH=8)으로 선형 농도 구배에 의해 용출시켰다. 단백질 순도는 98% 초과였고 수율은 100 mL의 혈청 당 약 150 mg이었다.
인간 홀로-트랜스페린(서열 번호 28, 도 1)은 헤모글로빈과 마찬가지로 적절한 약물 접합체에 용이하게 공유적으로 연결될 수 있으나, 자유롭게 적정가능한 시스테인 기의 부재로 인해 리신 개질에 대한 이용가능성만 존재한다. 따라서, 하나 이상의 리신 잔기에 공유적으로 부착하기 위해 석신이미드 작용화 메르탄신 유사체(DM1-SMCC)가 사용되어 왔다(석신이미드 작용화 약물). 약물은 하기 절차에 따라 트랜스페린에 편리하게 접합되었다:
리신 공유 부착을 위해 작용화된 메르탄신 유사체 DM1 SMCC(미국 네바다주 헨더슨 소재의 Alb 테크놀로지 리미티드)는 하기와 같이 제조되었다. 트랜스페린 용액을 반응 완충액(0.1 mM 포스페이트 완충액 pH 7.4, 이 경우에는 가능한 철 킬레이트화 효과로 인해 EDTA가 없음)으로 100 μM 헴의 농도까지 조정하고 8% v/v DMSO 용액의 존재 하에 4 ℃에서 16 시간 동안 20-배 몰 과량의 DM1-SMCC와 접합하였다. 아민-반응성 석신이미딜 에스테르가 아민에 커플링됨으로써 단백질의 표면 상의 리신 기와 공유 부가물을 생성한다. PM 100 한외여과 농축기를 사용하여 과량의 DM1-SMCC를 제거하고 D-PBS로 완충액-교환하였다. 접합의 수율은 대략 트랜스페린 이량체 당 1.5 메르탄신 분자였다. LC-MS 분석에 의해 DM1-SMCC 접합체의 형성을 확인하였다. 트랜스페린-DM1-SMCC 접합체의 농도를 UV-vis 분광법 분석에 의해 결정하였다.
실시예 8 - 페리틴 로딩된 세포를 얻는 단계
얻어진 세포를, 그들의 완전 로딩을 위해 적당한 페리틴/세포의 비를 보장하고 또한 치료 효과를 얻기 위해 적당한 약물 함량을 보장하기에 충분한 농도 및 시간 동안 페리틴 용액 중에 인큐베이션한다. 시간 및 농도는 페리틴 케이지 내에 캡슐화/흡착된 분자의 수, 세포 활성화의 상태, 그들의 의도된 투여의 조건 및 수에 따라 변동될 수 있다
예를 들어, 페리틴에 의한 적당한 로딩을 보장하기 위해, 표준 배양 조건에서 페리틴 용액 0.2 mg/ml 중에 1-4 hr 동안 세포를 인큐베이션한다. 인큐베이션 시간(5 min - 6 hr 이상)과 더불어 페리틴 농도의 프레임은 적어도 0.01 내지 4 mg/ml로 변동될 수 있다. 시간 및 세포에 로딩된 페리틴의 농도를 조정함에 있어서, 세포 생존도에 대한 페리틴 및 처리 조건의 영향에 유의해야 한다. 상기 언급된 바와 같이 얻어진 세포는 상대적으로 짧은 시간에 매우 용이하게 페리틴을 흡수한다(수 분 내에; 도 8). 일단 그들이 페리틴을 흡수하면, 그들은 배양 배지에 그것을 방출하지 않는다(도 9).
그러나, 당업자는 자체 실험실의 자체 목적을 위해 상기 조건을 재조정하고 프로토콜을 최적화할 수 있다.
실시예 9 - 헤모글로빈 로딩된 세포를 얻는 단계
얻어진 세포를, 그들의 완전 로딩을 위해 적당한 헤모글로빈/세포의 비를 보장하고 또한 치료 효과를 얻기 위해 적당한 약물 함량을 보장하기에 충분한 농도 및 시간 동안 헤모글로빈 용액 중에 인큐베이션한다. 시간 및 농도는 헤모글로빈 분자와 연결된 분자의 수, 세포 활성화의 상태, 그들의 의도된 투여의 조건 및 수에 따라 변동될 수 있다
예를 들어, 헤모글로빈에 의한 적당한 로딩을 보장하기 위해, 표준 배양 조건에서 헤모글로빈 용액 0.1 mg/ml 중에 1-4 hr 동안 세포를 인큐베이션한다. 인큐베이션 시간(5 min - 4 hr 이상)과 더불어 헤모글로빈 농도의 프레임은 적어도 0.01 내지 0.2 mg/ml로 변동될 수 있다. 시간 및 세포에 로딩된 헤모글로빈의 농도를 조정함에 있어서, 세포 생존도에 대한 페리틴 및 처리 조건의 영향에 유의해야 한다. 상기 언급된 바와 같이 얻어진 세포는 상대적으로 짧은 시간에 매우 용이하게 헤모글로빈을 흡수한다(수 분 내에; 도 8).
그러나, 당업자는 자체 실험실의 자체 목적을 위해 상기 조건을 재조정하고 프로토콜을 최적화할 수 있다.
실시예 10 - 트랜스페린 로딩된 세포를 얻는 단계
얻어진 세포를, 그들의 완전 로딩을 위해 적당한 트랜스페린/세포의 비를 보장하고 또한 치료 효과를 얻기 위해 적당한 약물 함량을 보장하기에 충분한 농도 및 시간 동안 트랜스페린 용액 중에 인큐베이션한다. 시간 및 농도는 트랜스페린 분자와 연결된 분자의 수, 세포 활성화의 상태, 그들의 의도된 투여의 조건 및 수에 따라 변동될 수 있다
예를 들어, 트랜스페린에 의한 적당한 로딩을 보장하기 위해, 표준 배양 조건에서 트랜스페린 용액 0.1 mg/ml 중에 1-4 hr 동안 세포를 인큐베이션한다. 인큐베이션 시간(5 min - 4 hr 이상)과 더불어 트랜스페린 농도의 프레임은 적어도 0.01 내지 0.2 mg/ml로 변동될 수 있다. 시간 및 세포에 로딩된 트랜스페린의 농도를 조정함에 있어서, 세포 생존도에 대한 트랜스페린 및 처리 조건의 영향에 유의해야 한다. 상기 언급된 바와 같이 얻어진 세포는 상대적으로 짧은 시간에 매우 용이하게 트랜스페린을 흡수한다(수 분 내에; 도 8).
그러나, 당업자는 자체 실험실의 자체 목적을 위해 상기 조건을 재조정하고 프로토콜을 최적화할 수 있다.
실시예 11 - 암 세포에 대한 유용한 전달 수단으로서의 페리틴/헤모글로빈/트랜스페린-대식세포 복합체
실시예 8, 9, 및 10에 기재된 바와 같이 제조된 실시예 1로부터의 대식세포는 페리틴, 헤모글로빈, 트랜스페린을 하기 암 세포에 매우 용이하게 수송한다: 마우스 유선암, 대장암, 개 유선암, 인간 유방암, 췌장암, 및 방광암(도 4, 10). 또한, 이러한 전달은 비-암 세포보다 암 세포에 훨씬 더 특이적이다(도 11). 그러나, 암 세포의 경우에 양자 모두의 세포 유형의 비가 결정적이다. 대식세포가 많을수록 수송이 더 양호하고 더 신속하다. 암 세포에 대한 가장 효율적인 전달은 대식세포 대 암 세포의 비가 1:1 이상인 경우에 관찰되었다.
이러한 전달은 단백질 담체가 형광 표지(예를 들어 FITC 또는 알렉사(Alexa)610)와 접합된 경우 뿐 아니라, 그들이 다른 화합물, 예를 들어 항암 약물과 접합/캡슐화된 경우에도 일어났다(도 12는 형광 저산소증 활성화 전구약물 - 바녹산트론과 캡슐화된 페리틴의 이러한 전달을 나타냄). 항암 약물과 접합된 화합물의 이러한 전달은 암 세포에서 세포자멸을 유도하는 효과를 나타냈다(도 6, 13).
실시예 12 - 암 세포에 대한 유용한 전달 수단으로서의 페리틴/헤모글로빈/트랜스페린-단핵구 복합체
실시예 8, 9, 및 10에 기재된 바와 같이 제조된 실시예 2로부터의 단핵구는 페리틴, 헤모글로빈, 트랜스페린을 암 세포에 매우 용이하게 수송한다(도 14). 그러나, 양자 모두의 세포 유형의 비가 결정적이다. 단핵구가 많을수록 수송이 더 양호하고 더 신속하다. 암 세포에 대한 가장 효율적인 전달은 단핵구 대 암 세포의 비가 1:1 이상인 경우에 관찰되었다.
실시예 13 - 암 세포에 대한 유용한 전달 수단으로서의 페리틴/헤모글로빈/트랜스페린-과립구 복합체
실시예 8, 9, 및 10에 기재된 바와 같이 제조된 실시예 3으로부터의 과립구는 페리틴, 헤모글로빈, 트랜스페린을 암 세포에 매우 용이하게 수송한다(도 15). 그러나, 양자 모두의 세포 유형의 비가 결정적이다. 과립구가 많을수록 수송이 더 양호하고 더 신속하다. 암 세포에 대한 가장 효율적인 전달은 과립구 대 암 세포의 비가 1:1 이상인 경우에 관찰되었다.
실시예 14 - 암 세포에 대한 유용한 전달 수단으로서의 페리틴/헤모글로빈/트랜스페린-림프구 복합체
실시예 8, 9, 및 10에 기재된 바와 같이 제조된 실시예 4로부터의 림프구는 페리틴, 헤모글로빈, 트랜스페린을 암 세포에 매우 용이하게 수송한다(도 16). 그러나, 양자 모두의 세포 유형의 비가 결정적이다. 림프구가 많을수록 수송이 더 양호하고 더 신속하다. 암 세포에 대한 가장 효율적인 전달은 림프구 대 암 세포의 비가 1:1 이상인 경우에 관찰되었다.
실시예 15 - 저산소 지역에 대한 유용한 표적화 약물 전달제로서의 백혈구-단백질 담체 복합체
상기와 같이 제조된 대식세포를 종양을 가진 동물의 꼬리 정맥 내로 주사한다(대식세포의 적절한 수는 종양 크기, 전이의 존재 및 진행 단계에 따라 조정해야 함). 도 2 및 17에 나타낸 바와 같이, 그들은 특이적으로 종양에 도달하며(수 시간 후에) 전체 동물의 다른 장기에도 분산된다(도 18). 또한, 도 19에 나타낸 바와 같이, 저산소 모델에서 그들은 또한 무혈관성 부위 및 저산소 부위로 이동하여 담체 단백질을 암 세포에 전달할 수 있다(도 3 및 20).
영상화의 목적으로, 백만개 내지 오천만개의 대식세포를 유선암 종양 또는 대장암 종양을 보유한 동물의 꼬리 정맥 내로 주사하였다. 그 전에, 대식세포를 셀 트래커(Cell Tracker)로 사전-표지하고 페리틴-FITC로 로딩하였다(실시예 8에 나타낸 바와 같음). 종양 매스의 2-광자를 사용하여 대식세포의 투여 후 8 hr에 페리틴-FITC를 운반하는 대식세포의 존재를 검출하였다(도 17). DIR 세포질 염료를 사용하는 대식세포 사전-표지 후에 동물 전신 영상화(IVIS)를 사용하여 그들의 특이적 종양 표적화와 더불어 다른 장기로의 그들의 이동 또한 나타냈다(도 18).
페리틴 캡슐화 사이클로포스파미드, 멜팔란 및 페리틴 캡슐화 클로람부실로 로딩된 백만개 내지 천만개의 대식세포를 종양-보유 마우스 내로 i.v. 주사하였다(300 000 - 500 000개의 EMT6 세포를 옆구리 피부 내로 주사함). 본 발명자들은 대식세포를 3 일 간격으로 3회 주사하거나(암 세포 주사 후 제5일, 제8일, 및 제11일에, 또는 암 세포 주사 후 제7일, 제10일, 및 제13일에) 매일 연이어 5회 주사하였으며, 본 발명자들은 증가된 마우스 생존을 관찰하였다(도 5).
실시예 16 - 유용한 영상화 수단으로서의 백혈구-단백질 담체 복합체 또는 표지된 백혈구
본 발명에 기재된 표적화 전달 시스템의 표적화는 페리틴을 조영제에 커플링함으로써 추적할 수 있다. 도 21 상에 제공된 바와 같이, 실시예 8에 기재된 바와 같이 조영제(이 경우에는 페리하이드라이트이나, 동위원소, 예를 들어 123I으로도 동일한 결과가 얻어짐)와 커플링되거나 동위원소(이 경우에는 18F-FDG)로 표지된 페리틴으로 로딩된 대식세포 1-50 ml를 주사한 후에(도 21) MRI, PET, 또는 SPECT에 의해 그들을 용이하게 검출할 수 있다. 본 실시예에서는(도 7), 페리틴 Fh로 로딩된 대식세포의 i.v. 주사 후 3, 22, 및 24 시간에 MRI를 사용하여 유선-종양 보유 마우스를 영상화하였다. 마우스를 (시점 0 h에) 대식세포로 치료하였다. 이어서, 주사된 대식세포로 충전된(유의적인 T2-신호 감소를 제공함) 혈관의 증가된 직경(화살표)이 관찰되었으며, 그 후에 대식세포가 조직으로 확산되었다(반점-유사 패턴; 화살표). 이들 변화(동일한 시점에)는 시험한 모든 마우스에서 관찰되었다.
대식세포를 또한 18F-FDG(5-50 mln)로 표지하고 종양-보유 마우스에 i.v. 투여 후 1 h에 PET를 사용하여 영상화하였다. 실험 전 3 주에 이들 마우스를 4T1 전이성 세포주로 접종하고 폐, 간, 및 비장에서의 전이를 조직병리학적으로 확인하였다. 도 21에서는 대식세포가 전이성 종양을 가진 지역으로 이동하여 PET에서 그들이 가시화되는 것이 보인다.
SEQUENCE LISTING <110> Cellis Sp. Z o.o. <120> CELLULAR TARGETED ACTIVE INGREDIENT DELIVERY SYSTEM <130> IPA180076-DE-D1D1 <150> P412787 <151> 2015-06-22 <160> 28 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Minimal consensus sequence of mammalian ferritin H chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa at position 5 may be present or absent, if present it means any naturally occurring amino acid, preferably Ile <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa at position 6 means any naturally occurring amino acid, preferably Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa at position 14 means any naturally occurring amino acid, preferably Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa at position 24 means any naturally occurring amino acid, preferably Tyr or Cys, more preferably Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (66)..(66) <223> Xaa at position 66 means any naturally occurring amino acid, preferably Phe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(68) <223> Xaa at position 68 means any naturally occurring amino acid, preferably Gln <220> <221> MISC_FEATURE <222> (75)..(75) <223> Xaa at position 75 means any naturally occurring amino acid, preferably Arg or Cys, more preferably Cys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (90)..(90) <223> Xaa at position 90 means any naturally occurring amino acid, preferably His <220> <221> MISC_FEATURE <222> (94)..(94) <223> Xaa at position 94 means any naturally occurring amino acid, preferably Ser or Asn, more preferably Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (120)..(120) <223> Xaa at position 120 may be present or absent, if present it means any naturally occurring amino acid, preferably His or Tyr, more preferably His <220> <221> MISC_FEATURE <222> (123)..(123) <223> Xaa at position 123 means any naturally occurring amino acid, preferably Asn or Ser, more preferably Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (128)..(128) <223> Xaa at position 128 means any naturally occurring amino acid, preferably Ala or Ser, more preferably Ala <400> 1 Ser Glu Ala Ala Xaa Xaa Arg Gln Ile Asn Leu Glu Leu Xaa Ala Ser 1 5 10 15 Tyr Val Tyr Leu Ser Met Ser Xaa Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala 20 25 30 Leu Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Glu Arg 35 40 45 Glu His Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg 50 55 60 Ile Xaa Leu Xaa Asp Ile Lys Lys Pro Asp Xaa Asp Asp Trp Glu Ser 65 70 75 80 Gly Leu Asn Ala Met Glu Cys Ala Leu Xaa Leu Glu Lys Xaa Asn Gln 85 90 95 Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro His 100 105 110 Leu Cys Asp Phe Ile Glu Thr Xaa Tyr Leu Xaa Glu Gln Val Lys Xaa 115 120 125 Ile Lys Glu Leu 130 <210> 2 <211> 183 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence of mammalian ferritin H chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa at position 6 can be any naturally occurring amino acid, preferably Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa at position 14 can be any naturally occurring amino acid, preferably His <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa at position 16 can be any naturally occurring amino acid, preferably Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Xaa at position 21 may be present or absent, if present it means any naturally occurring amino acid, preferably Ile <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> Xaa at position 22 means any naturally occurring amino acid, preferably Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Xaa at position 30 can be any naturally occurring amino acid, preferably Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (40)..(40) <223> Xaa at position 40 can be any naturally occurring amino acid, preferably Tyr or Cys, more preferably Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (82)..(82) <223> Xaa at position 82 can be any naturally occurring amino acid, preferably Phe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (84)..(84) <223> Xaa at position 84 can be any naturally occurring amino acid, preferably Gln <220> <221> MISC_FEATURE <222> (91)..(91) <223> Xaa at position 91 can be any naturally occurring amino acid, preferably Arg or Cys, more preferably Cys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (106)..(106) <223> Xaa at position 106 can be any naturally occurring amino acid, preferably His <220> <221> MISC_FEATURE <222> (110)..(110) <223> Xaa at position 110 can be any naturally occurring amino acid, preferably Asn or Ser, more preferably Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (137)..(137) <223> Xaa at position 137 can be any naturally occurring amino acid, preferably His or Tyr, more preferably His <220> <221> MISC_FEATURE <222> (140)..(140) <223> Xaa at position 140 can be any naturally occurring amino acid, preferably Asn or Ser, more preferably Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (145)..(145) <223> Xaa at position 145 can be any naturally occurring amino acid, preferably Ala or Ser, more preferably Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (164)..(164) <223> Xaa at position 164 can be any naturally occurring amino acid, preferably Ala or Ser, more preferably Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (166)..(166) <223> Xaa at position 166 can be any naturally occurring amino acid, preferably Met or Leu, prerferably Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (178)..(178) <223> Xaa at position 178 can be any naturally occurring amino acid, preferably Asp or His, more preferably Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (181)..(181) <223> Xaa at position 181 is absent or any naturally occurring amino acid, preferably Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (182)..(182) <223> Xaa at position 182 is absent or any naturally occurring amino acid, preferably Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (183)..(183) <223> Xaa at position 183 is absent or any naturally occurring amino acid, preferably Ser <400> 2 Met Thr Thr Ala Ser Xaa Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr Xaa Gln Xaa 1 5 10 15 Ser Glu Ala Ala Xaa Xaa Arg Gln Ile Asn Leu Glu Leu Xaa Ala Ser 20 25 30 Tyr Val Tyr Leu Ser Met Ser Xaa Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala 35 40 45 Leu Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Glu Arg 50 55 60 Glu His Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg 65 70 75 80 Ile Xaa Leu Xaa Asp Ile Lys Lys Pro Asp Xaa Asp Asp Trp Glu Ser 85 90 95 Gly Leu Asn Ala Met Glu Cys Ala Leu Xaa Leu Glu Lys Xaa Val Asn 100 105 110 Gln Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro 115 120 125 His Leu Cys Asp Phe Ile Glu Thr Xaa Tyr Leu Xaa Glu Gln Val Lys 130 135 140 Xaa Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly 145 150 155 160 Ala Pro Glu Xaa Gly Xaa Ala Glu Tyr Leu Phe Asp Lys His Thr Leu 165 170 175 Gly Xaa Ser Asp Xaa Xaa Xaa 180 <210> 3 <211> 133 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 Ala Glu Ala Ala Ile Asn Arg Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser 1 5 10 15 Tyr Val Tyr Leu Ser Met Ser Cys Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala 20 25 30 Leu Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Glu Arg 35 40 45 Glu His Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg 50 55 60 Ile Phe Leu Gln Asp Ile Lys Lys Pro Asp Arg Asp Asp Trp Glu Ser 65 70 75 80 Gly Leu Asn Ala Met Glu Cys Ala Leu His Leu Glu Lys Ser Val Asn 85 90 95 Gln Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro 100 105 110 His Leu Cys Asp Phe Ile Glu Thr Tyr Tyr Leu Ser Glu Gln Val Lys 115 120 125 Ser Ile Lys Glu Leu 130 <210> 4 <211> 180 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Met Thr Thr Ala Ser Pro Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp 1 5 10 15 Ala Glu Ala Ala Ile Asn Arg Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser 20 25 30 Tyr Val Tyr Leu Ser Met Ser Cys Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala 35 40 45 Leu Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Glu Arg 50 55 60 Glu His Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg 65 70 75 80 Ile Phe Leu Gln Asp Ile Lys Lys Pro Asp Arg Asp Asp Trp Glu Ser 85 90 95 Gly Leu Asn Ala Met Glu Cys Ala Leu His Leu Glu Lys Ser Val Asn 100 105 110 Gln Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro 115 120 125 His Leu Cys Asp Phe Ile Glu Thr Tyr Tyr Leu Ser Glu Gln Val Lys 130 135 140 Ser Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly 145 150 155 160 Ala Pro Glu Ala Gly Met Ala Glu Tyr Leu Phe Asp Lys His Thr Leu 165 170 175 Gly His Gly Asp 180 <210> 5 <211> 132 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Ser Glu Ala Ala Asn Arg Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser Tyr 1 5 10 15 Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala Leu 20 25 30 Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Glu Arg Glu 35 40 45 His Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg Ile 50 55 60 Phe Leu Gln Asp Ile Lys Lys Pro Asp Cys Asp Asp Trp Glu Ser Gly 65 70 75 80 Leu Asn Ala Met Glu Cys Ala Leu His Leu Glu Lys Asn Val Asn Gln 85 90 95 Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro His 100 105 110 Leu Cys Asp Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys Ala 115 120 125 Ile Lys Glu Leu 130 <210> 6 <211> 179 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp 1 5 10 15 Ser Glu Ala Ala Asn Arg Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser Tyr 20 25 30 Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala Leu 35 40 45 Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Glu Arg Glu 50 55 60 His Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg Ile 65 70 75 80 Phe Leu Gln Asp Ile Lys Lys Pro Asp Cys Asp Asp Trp Glu Ser Gly 85 90 95 Leu Asn Ala Met Glu Cys Ala Leu His Leu Glu Lys Asn Val Asn Gln 100 105 110 Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro His 115 120 125 Leu Cys Asp Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys Ala 130 135 140 Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly Ala 145 150 155 160 Pro Glu Ser Gly Leu Ala Glu Tyr Leu Phe Asp Lys His Thr Leu Gly 165 170 175 Asp Ser Asp <210> 7 <211> 182 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence of mammalian ferritin H chains 2nd version <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa at position 6 can be any naturally occurring amino acid, preferably Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa at position 14 can be any naturally occurring amino acid, preferably His <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa at position 16 can be any naturally occurring amino acid, preferably Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Xaa at position 21 may be present or absent, if present it means any naturally occurring amino acid, preferably Ile <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa at position 29 can be any naturally occurring amino acid, preferably Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (81)..(81) <223> Xaa at position 81 can be any naturally occurring amino acid, preferably Phe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (83)..(83) <223> Xaa at position 83 can be any naturally occurring amino acid, preferably Gln <220> <221> MISC_FEATURE <222> (105)..(105) <223> Xaa at position 105 can be any naturally occurring amino acid, preferably His <220> <221> MISC_FEATURE <222> (144)..(144) <223> Xaa at position 144 can be any naturally occurring amino acid, preferably Ala or Ser, more preferably Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (180)..(180) <223> Xaa at position 180 is absent or any naturally occuring amino acid, preferably Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (181)..(181) <223> Xaa at position 181 is absent or any naturally occuring amino acid, preferably Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (182)..(182) <223> Xaa at position 182 is absent or any naturally occuring amino acid, preferably Ser <400> 7 Met Thr Thr Ala Ser Xaa Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr Xaa Gln Xaa 1 5 10 15 Ser Glu Ala Ala Xaa Arg Gln Ile Asn Leu Glu Leu Xaa Ala Ser Tyr 20 25 30 Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala Leu 35 40 45 Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Glu Arg Glu 50 55 60 His Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg Ile 65 70 75 80 Xaa Leu Xaa Asp Ile Lys Lys Pro Asp Cys Asp Asp Trp Glu Ser Gly 85 90 95 Leu Asn Ala Met Glu Cys Ala Leu Xaa Leu Glu Lys Asn Val Asn Gln 100 105 110 Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro His 115 120 125 Leu Cys Asp Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys Xaa 130 135 140 Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly Ala 145 150 155 160 Pro Glu Ser Gly Leu Ala Glu Tyr Leu Phe Asp Lys His Thr Leu Gly 165 170 175 Asp Ser Asp Xaa Xaa Xaa 180 <210> 8 <211> 150 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Minimal consensus sequence of mammalian ferritin L chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa at position 5 can be any naturally occurring amino acid, preferably Asp or Glu, more preferably Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa at position 12 can be any nnaturally occurring amino acid, preferably Arg or Ser, more preferably Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Xaa at position 17 can be any naturally occurring amino acid, preferably Ser or Arg, more preferably Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> Xaa at position 19 can be any naturally occurring amino acid, preferably Arg or Gln, more preferably Gln <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa at position 29 can be any naturally occurring amino acid, preferably Phe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Xaa at position 30 can be any naturally occurring amino acid, preferably Tyr or Phe, more preferably Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (42)..(42) <223> Xaa at position 42 can be any naturally occurring amino acid, preferably Ser or Gly, more preferably Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (56)..(56) <223> Xaa at position 56 can be any naturally occurirng amino acid, preferably Ala or Tyr, more preferably Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (61)..(61) <223> Xaa at position 61 can be any naturally occurring amino acid, preferably Glu or Lys, more preferably Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (62)..(62) <223> Xaa at position 62 can be any naturally occurring amino acid, preferably Met or Phe, more preferably Met <220> <221> MISC_FEATURE <222> (65)..(65) <223> Xaa at position 65 can be any naturally occurring amino acid, preferably Asp or Gln, more preferably Gln <220> <221> MISC_FEATURE <222> (75)..(75) <223> Xaa at position 75 can be any naturally occurring amino acid, preferably Ile or Val, more preferably Ile <220> <221> MISC_FEATURE <222> (76)..(76) <223> Xaa at position 76 can be any naturally occurring amino acid, preferably Lys or Gln, more preferably Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (79)..(79) <223> Xaa at position 79 can be any naturally occurring amino acid, preferably Ala or Ser, more preferably Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (80)..(80) <223> Xaa at position 80 can be any naturally occurring amino acid, preferably Glu or Gln, more preferably Gln <220> <221> MISC_FEATURE <222> (87)..(87) <223> Xaa at position 87 can be any naturally occurring amino acid, preferably Pro or Gln, more preferably Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (88)..(88) <223> Xaa at position 88 can be any naturally occurring amino acid, preferably Glu or Asp, more preferably Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (91)..(91) <223> Xaa at position 91 can be any naturally occurring amino acid, preferably Glu or Lys, more preferably Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (94)..(94) <223> Xaa at position 94 can be any naturally occurring amino acid, preferably Met or Leu, more preferably Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (96)..(96) <223> Xaa at position 96 can be any naturally occurring amino acid, preferably Met or Leu, more preferably Met <220> <221> MISC_FEATURE <222> (99)..(99) <223> Xaa at position 99 can be any naturally occurring amino acid, preferably Lys or Asn, preferably Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (115)..(115) <223> Xaa at position 115 can be any naturally occurring amino acid, preferably Thr or Ala, more preferably Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (119)..(119) <223> Xaa at position 119 can be any naturally occurring amino acid, preferably Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (125)..(125) <223> Xaa at position 125 can be any naturally occurring amino acid, preferably Ser or Thr, more preferably Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (127)..(127) <223> Xaa at position 127 can be any naturally occurring amino acid, preferably Tyr or Phe, more preferably Phe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (130)..(130) <223> Xaa at position 130 can be any naturally occurring amino acid, preferably Lys or Glu, more preferably Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (140)..(140) <223> Xaa at position 140 can be any naturally occurring amino acid, preferably Asp or Asn, more preferably Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (146)..(146) <223> Xaa at position 146 can be any naturally occurring amino acid, preferably Arg or His, more preferably His <220> <221> MISC_FEATURE <222> (148)..(148) <223> Xaa at position 148 can be any naturally occurring amino acid, preferably Leu or Val, more preferably Leu <400> 8 Asn Tyr Ser Thr Xaa Val Glu Ala Ala Val Asn Xaa Leu Val Asn Leu 1 5 10 15 Xaa Leu Xaa Ala Ser Tyr Thr Tyr Leu Ser Leu Gly Xaa Xaa Phe Asp 20 25 30 Arg Asp Asp Val Ala Leu Glu Gly Val Xaa His Phe Phe Arg Glu Leu 35 40 45 Ala Glu Glu Lys Arg Glu Gly Xaa Glu Arg Leu Leu Xaa Xaa Gln Asn 50 55 60 Xaa Arg Gly Gly Arg Ala Leu Phe Gln Asp Xaa Xaa Lys Pro Xaa Xaa 65 70 75 80 Asp Glu Trp Gly Lys Thr Xaa Xaa Ala Met Xaa Ala Ala Xaa Ala Xaa 85 90 95 Glu Lys Xaa Leu Asn Gln Ala Leu Leu Asp Leu His Ala Leu Gly Ser 100 105 110 Ala Arg Xaa Asp Pro His Xaa Cys Asp Phe Leu Glu Xaa His Xaa Leu 115 120 125 Asp Xaa Glu Val Lys Leu Ile Lys Lys Met Gly Xaa His Leu Thr Asn 130 135 140 Leu Xaa Arg Xaa Ala Gly 145 150 <210> 9 <211> 183 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence of mammalian ferritin L chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa at position 12 can be any naturally occurring amino acid, preferably Asp or Glu, more preferably Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> Xaa at position 19 can be any naturally occurring amino acid, preferably Ser or Arg, more preferably Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa at position 24 can be any naturally occurring amino acid, preferably Ser or Arg, more preferably Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(26) <223> Xaa at position 26 can be any naturally occurring amino acid, preferably Arg or Gln, more preferably Gln <220> <221> MISC_FEATURE <222> (36)..(36) <223> Xaa at position 36 can be any naturally occurring amino acid, preferably Phe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (37)..(37) <223> Xaa at position 37 can be any naturally occurring amino acid, preferably Tyr or Phe, more preferably Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (49)..(49) <223> Xaa at position 47 can be any naturally occurring amino acid, preferably Ser or Gly, more preferably Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (63)..(63) <223> Xaa at position 63 can be any naturally occurring amino acid, preferably Ala or Tyr, more preferably Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(68) <223> Xaa at position 68 can be any naturally occurring amino acid, preferably Glu or Lys, more preferably Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (69)..(69) <223> Xaa at position 69 can be any naturally occurring amino acid, preferably Met or Phe, more preferably Met <220> <221> MISC_FEATURE <222> (72)..(72) <223> Xaa at position 72 can be any naturally occurring amino acid, preferably Asp or Gln, more preferably Gln <220> <221> MISC_FEATURE <222> (82)..(82) <223> Xaa at position 82 can be any naturally occurring amino acid, preferably Ile or Val, more preferably Ile <220> <221> MISC_FEATURE <222> (83)..(83) <223> Xaa at position 83 can be any naturally occurring amino acid, preferably Lys or Gln, more preferably Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (86)..(86) <223> Xaa at position 86 can be any naturally occurring amino acid, preferably Ala or Ser, more preferably Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (87)..(87) <223> Xaa at position 87 can be any naturally occurring amino acid, preferably Glu or Gln, more preferably Gln <220> <221> MISC_FEATURE <222> (94)..(94) <223> Xaa at position 94 can be any naturally occurring amino acid, preferably Pro or Gln, more preferably Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (95)..(95) <223> Xaa at position 95 can be any naturally occurring amino acid, preferably Glu or Asp, more preferably Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (98)..(98) <223> Xaa at position 98 can be any naturally occurring amino acid, preferably Glu or Lys, more preferably Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (101)..(101) <223> Xaa at position 101 can be any naturally occurring amino acid, preferably Met or Leu, more preferably Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (103)..(103) <223> Xaa at position 103 can be any naturally occurring amino acid, preferably Met or Leu, more preferably Met <220> <221> MISC_FEATURE <222> (106)..(106) <223> Xaa at position 106 can be any naturally occurring amino acid, preferably Lys or Asn, preferably Lys <220> <221> misc_feature <222> (122)..(122) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (126)..(126) <223> Xaa at position 126 can be any naturally occurring amino acid, preferably Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (132)..(132) <223> Xaa at position 132 can be any naturally occurring amino acid, preferably Ser or Thr, more preferably Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (134)..(134) <223> Xaa at position 134 can be any naturally occurring amino acid, preferably Tyr or Phe, more preferably Phe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (137)..(137) <223> Xaa at position 137 can be any naturally occurring amino acid, preferably Lys or Glu, more preferably Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (147)..(147) <223> Xaa at position 147 can be any naturally occurring amino acid, preferably Asp or Asn, more preferably Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (153)..(153) <223> Xaa at position 153 can be any naturally occurring amino acid, preferably Arg or His, more preferably His <220> <221> MISC_FEATURE <222> (155)..(155) <223> Xaa at position 155 can be any naturally occurring amino acid, preferably Leu or Val, more preferably Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (161)..(161) <223> Xaa at position 161 can be absent or any naturally occurring amino acid, preferably Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (163)..(163) <223> Xaa at position 163 can be absent or any naturally occurring amino acid, preferably Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (166)..(166) <223> Xaa at position 166 can be absent or any naturally occurring amino acid, preferably Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (168)..(168) <223> Xaa at position 168 can be any naturally occurring amino acid, preferably Gly or Ala, more preferably Ala <400> 9 Met Thr Ser Gln Ile Arg Gln Asn Tyr Ser Thr Xaa Val Glu Ala Ala 1 5 10 15 Val Asn Xaa Leu Val Asn Leu Xaa Leu Xaa Ala Ser Tyr Thr Tyr Leu 20 25 30 Ser Leu Gly Xaa Xaa Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala Leu Glu Gly Val 35 40 45 Xaa His Phe Phe Arg Glu Leu Ala Glu Glu Lys Arg Glu Gly Xaa Glu 50 55 60 Arg Leu Leu Xaa Xaa Gln Asn Xaa Arg Gly Gly Arg Ala Leu Phe Gln 65 70 75 80 Asp Xaa Xaa Lys Pro Xaa Xaa Asp Glu Trp Gly Lys Thr Xaa Xaa Ala 85 90 95 Met Xaa Ala Ala Xaa Ala Xaa Glu Lys Xaa Leu Asn Gln Ala Leu Leu 100 105 110 Asp Leu His Ala Leu Gly Ser Ala Arg Xaa Asp Pro His Xaa Cys Asp 115 120 125 Phe Leu Glu Xaa His Xaa Leu Asp Xaa Glu Val Lys Leu Ile Lys Lys 130 135 140 Met Gly Xaa His Leu Thr Asn Leu Xaa Arg Xaa Ala Gly Pro Gln Pro 145 150 155 160 Xaa Gln Xaa Gly Val Xaa Gln Xaa Ser Leu Gly Glu Tyr Leu Phe Glu 165 170 175 Arg Leu Thr Leu Lys His Asp 180 <210> 10 <211> 150 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa at position 5 can be any naturally occuring amino acid, preferably Asp or Glu, more preferably Asp <400> 10 Asn Tyr Ser Thr Glu Val Glu Ala Ala Val Asn Arg Leu Val Asn Leu 1 5 10 15 His Leu Arg Ala Ser Tyr Thr Tyr Leu Ser Leu Gly Phe Phe Phe Asp 20 25 30 Arg Asp Asp Val Ala Leu Glu Gly Val Gly His Phe Phe Arg Glu Leu 35 40 45 Ala Glu Glu Lys Arg Glu Gly Ala Glu Arg Leu Leu Glu Phe Gln Asn 50 55 60 Asp Arg Gly Gly Arg Ala Leu Phe Gln Asp Val Gln Lys Pro Ser Gln 65 70 75 80 Asp Glu Trp Gly Lys Thr Gln Glu Ala Met Glu Ala Ala Leu Ala Met 85 90 95 Glu Lys Asn Leu Asn Gln Ala Leu Leu Asp Leu His Ala Leu Gly Ser 100 105 110 Ala Arg Ala Asp Pro His Leu Cys Asp Phe Leu Glu Ser His Tyr Leu 115 120 125 Asp Lys Glu Val Lys Leu Ile Lys Lys Met Gly Asn His Leu Thr Asn 130 135 140 Leu Arg Arg Val Ala Gly 145 150 <210> 11 <400> 11 000 <210> 12 <211> 149 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Asn Tyr Ser Thr Asp Val Glu Ala Ala Val Asn Ser Leu Val Asn Leu 1 5 10 15 Tyr Leu Gln Ala Ser Tyr Thr Tyr Leu Ser Leu Gly Phe Tyr Phe Asp 20 25 30 Arg Asp Asp Val Ala Leu Glu Gly Val Ser His Phe Phe Arg Glu Leu 35 40 45 Ala Glu Glu Lys Arg Glu Gly Tyr Glu Arg Leu Leu Lys Met Gln Asn 50 55 60 Gln Arg Gly Gly Arg Ala Leu Phe Gln Asp Ile Lys Lys Pro Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Trp Gly Lys Thr Pro Asp Ala Met Lys Ala Ala Met Ala Leu 85 90 95 Glu Lys Lys Leu Asn Gln Ala Leu Leu Asp Leu His Ala Leu Gly Ser 100 105 110 Ala Arg Thr Asp Pro His Leu Cys Asp Phe Leu Glu Thr His Phe Leu 115 120 125 Asp Glu Glu Val Lys Leu Ile Lys Lys Met Gly Asp His Leu Thr Asn 130 135 140 Leu His Arg Leu Gly 145 <210> 13 <211> 175 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Met Ser Ser Gln Ile Arg Gln Asn Tyr Ser Thr Asp Val Glu Ala Ala 1 5 10 15 Val Asn Ser Leu Val Asn Leu Tyr Leu Gln Ala Ser Tyr Thr Tyr Leu 20 25 30 Ser Leu Gly Phe Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala Leu Glu Gly Val 35 40 45 Ser His Phe Phe Arg Glu Leu Ala Glu Glu Lys Arg Glu Gly Tyr Glu 50 55 60 Arg Leu Leu Lys Met Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg Ala Leu Phe Gln 65 70 75 80 Asp Ile Lys Lys Pro Ala Glu Asp Glu Trp Gly Lys Thr Pro Asp Ala 85 90 95 Met Lys Ala Ala Met Ala Leu Glu Lys Lys Leu Asn Gln Ala Leu Leu 100 105 110 Asp Leu His Ala Leu Gly Ser Ala Arg Thr Asp Pro His Leu Cys Asp 115 120 125 Phe Leu Glu Thr His Phe Leu Asp Glu Glu Val Lys Leu Ile Lys Lys 130 135 140 Met Gly Asp His Leu Thr Asn Leu His Arg Leu Gly Gly Pro Glu Ala 145 150 155 160 Gly Leu Gly Glu Tyr Leu Phe Glu Arg Leu Thr Leu Lys His Asp 165 170 175 <210> 14 <211> 183 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus seqeuence of mammaliam ferritin L chain 2nd version <220> <221> MISC_FEATURE <222> (36)..(36) <223> Xaa at position 36 can be any naturally occuring amino acid, preferably Phe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (37)..(37) <223> Xaa at position 37 can be any naturally occuring amino acid, preferably Tyr or Phe, more preferably Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (94)..(94) <223> Xaa at position 94 can be any naturally occurring amino acid, preferably Pro or Gln, more preferably Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (126)..(126) <223> Xaa at position 126 can be any naturally occurring amino acid, preferably Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (137)..(137) <223> Xaa at position 137 can be any naturally occurring amino acid, preferably Lys or Glu, more preferably Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (147)..(147) <223> Xaa at position 147 can be any naturally occurring amino acid, preferably Asp or Asn, more preferably Asp <220> <221> misc_feature <222> (161)..(161) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (163)..(163) <223> Xaa at position 163 can be absent or any naturally occurring amino acid, preferably Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (166)..(166) <223> Xaa at position 166 can be absent or any naturally occurring amino acid, preferably Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (168)..(168) <223> Xaa at position 168 can be any naturally occurring amino acid, preferably Gly or Ala, more preferably Ala <400> 14 Met Thr Ser Gln Ile Arg Gln Asn Tyr Ser Thr Glu Val Glu Ala Ala 1 5 10 15 Val Asn Arg Leu Val Asn Leu His Leu Arg Ala Ser Tyr Thr Tyr Leu 20 25 30 Ser Leu Gly Xaa Xaa Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala Leu Glu Gly Val 35 40 45 Gly His Phe Phe Arg Glu Leu Ala Glu Glu Lys Arg Glu Gly Ala Glu 50 55 60 Arg Leu Leu Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg Ala Leu Phe Gln 65 70 75 80 Asp Val Gln Lys Pro Ala Gln Asp Glu Trp Gly Lys Thr Xaa Glu Ala 85 90 95 Met Glu Ala Ala Leu Ala Leu Glu Lys Asn Leu Asn Gln Ala Leu Leu 100 105 110 Asp Leu His Ala Leu Gly Ser Ala Arg Thr Asp Pro His Xaa Cys Asp 115 120 125 Phe Leu Glu Asn His Phe Leu Asp Xaa Glu Val Lys Leu Ile Lys Lys 130 135 140 Met Gly Xaa His Leu Thr Asn Leu Arg Arg Leu Ala Gly Pro Gln Pro 145 150 155 160 Xaa Gln Xaa Gly Val Xaa Gln Xaa Ser Leu Gly Glu Tyr Leu Phe Glu 165 170 175 Arg Leu Thr Leu Lys His Asp 180 <210> 15 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Minimal consensus sequence of mammalian haemoglobin alpha chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (38)..(38) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Gln <220> <221> MISC_FEATURE <222> (41)..(41) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (48)..(48) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (49)..(49) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (55)..(55) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (59)..(59) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Aap <220> <221> MISC_FEATURE <222> (60)..(60) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Met <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(68) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (76)..(76) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (79)..(79) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (90)..(90) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (91)..(91) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (94)..(94) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (102)..(102) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (108)..(108) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (117)..(117) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Ser <400> 15 Val Gly Ala His Xaa Gly Glu Tyr Xaa Ala Glu Ala Leu Glu Xaa Met 1 5 10 15 Phe Leu Ser Phe Xaa Xaa Thr Lys Thr Tyr Phe Pro His Phe Asp Leu 20 25 30 Ser His Gly Ser Ala Xaa Val Lys Xaa His Gly Lys Lys Val Ala Xaa 35 40 45 Xaa Leu Thr Asn Ala Val Xaa His Val Asp Xaa Xaa Pro Asn Ala Leu 50 55 60 Ser Ala Leu Xaa Asp Leu His Ala His Lys Leu Xaa Val Asp Xaa Val 65 70 75 80 Asn Phe Lys Leu Leu Ser His Cys Leu Xaa Xaa Thr Leu Xaa Ala His 85 90 95 Leu Pro Ala Glu Phe Xaa Pro Ala Val His Ala Xaa Leu Asp Lys Phe 100 105 110 Leu Ala Ser Val Xaa 115 <210> 16 <211> 142 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence of mammalian alpha chain haemoglobins <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Met <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(26) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (32)..(32) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (38)..(38) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (39)..(39) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (55)..(55) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Gln <220> <221> MISC_FEATURE <222> (58)..(58) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (65)..(65) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (66)..(66) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (72)..(72) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (76)..(76) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (77)..(77) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Met <220> <221> MISC_FEATURE <222> (85)..(85) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (93)..(93) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (96)..(96) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (107)..(107) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (108)..(108) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (111)..(111) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (119)..(119) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (125)..(125) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (134)..(134) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (142)..(142) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Arg <400> 16 Xaa Xaa Leu Ser Pro Ala Asp Lys Thr Asn Val Lys Ala Xaa Trp Gly 1 5 10 15 Xaa Val Gly Ala His Xaa Gly Glu Tyr Xaa Ala Glu Ala Leu Glu Xaa 20 25 30 Met Phe Leu Ser Phe Xaa Xaa Thr Lys Thr Tyr Phe Pro His Phe Asp 35 40 45 Leu Ser His Gly Ser Ala Xaa Val Lys Xaa His Gly Lys Lys Val Ala 50 55 60 Xaa Xaa Leu Thr Asn Ala Val Xaa His Val Asp Xaa Xaa Pro Asn Ala 65 70 75 80 Leu Ser Ala Leu Xaa Asp Leu His Ala His Lys Leu Xaa Val Asp Xaa 85 90 95 Val Asn Phe Lys Leu Leu Ser His Cys Leu Xaa Xaa Thr Leu Xaa Ala 100 105 110 His Leu Pro Ala Glu Phe Xaa Pro Ala Val His Ala Xaa Leu Asp Lys 115 120 125 Phe Leu Ala Ser Val Xaa Thr Val Leu Thr Ser Lys Tyr Xaa 130 135 140 <210> 17 <211> 117 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Val Gly Ala His Ala Gly Glu Tyr Gly Ala Glu Ala Leu Glu Arg Met 1 5 10 15 Phe Leu Ser Phe Pro Thr Thr Lys Thr Tyr Phe Pro His Phe Asp Leu 20 25 30 Ser His Gly Ser Ala Gln Val Lys Gly His Gly Lys Lys Val Ala Asp 35 40 45 Ala Leu Thr Asn Ala Val Ala His Val Asp Asp Met Pro Asn Ala Leu 50 55 60 Ser Ala Leu Ser Asp Leu His Ala His Lys Leu Arg Val Asp Pro Val 65 70 75 80 Asn Phe Lys Leu Leu Ser His Cys Leu Leu Val Thr Leu Ala Ala His 85 90 95 Leu Pro Ala Glu Phe Thr Pro Ala Val His Ala Ser Leu Asp Lys Phe 100 105 110 Leu Ala Ser Val Ser 115 <210> 18 <211> 142 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Met Val Leu Ser Pro Ala Asp Lys Thr Asn Val Lys Ala Ala Trp Gly 1 5 10 15 Lys Val Gly Ala His Ala Gly Glu Tyr Gly Ala Glu Ala Leu Glu Arg 20 25 30 Met Phe Leu Ser Phe Pro Thr Thr Lys Thr Tyr Phe Pro His Phe Asp 35 40 45 Leu Ser His Gly Ser Ala Gln Val Lys Gly His Gly Lys Lys Val Ala 50 55 60 Asp Ala Leu Thr Asn Ala Val Ala His Val Asp Asp Met Pro Asn Ala 65 70 75 80 Leu Ser Ala Leu Ser Asp Leu His Ala His Lys Leu Arg Val Asp Pro 85 90 95 Val Asn Phe Lys Leu Leu Ser His Cys Leu Leu Val Thr Leu Ala Ala 100 105 110 His Leu Pro Ala Glu Phe Thr Pro Ala Val His Ala Ser Leu Asp Lys 115 120 125 Phe Leu Ala Ser Val Ser Thr Val Leu Thr Ser Lys Tyr Arg 130 135 140 <210> 19 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Minimal consensus sequence of mammalian haemoglobin beta chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa can be absent or any naturally occurring amino acid, preferably Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa can be absent or any naturally occurring amino acid, preferably Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa can be absent or any naturally occurring amino acid, preferably Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Xaa can be absent or any naturally occurring amino acid, preferably Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(27) <223> Xaa can be absent or any naturally occurring amino acid, preferably Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (35)..(35) <223> Xaa can be absent or any naturally occurring amino acid, preferably Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (36)..(36) <223> Xaa can be absent or any naturally occurring amino acid, preferably Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (49)..(49) <223> Xaa can be absent or any naturally occurring amino acid, preferably Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (52)..(52) <223> Xaa can be absent or any naturally occurring amino acid, preferably Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (66)..(66) <223> Xaa can be absent or any naturally occurring amino acid, preferably Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(68) <223> Xaa can be absent or any naturally occurring amino acid, preferably Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (69)..(69) <223> Xaa can be absent or any naturally occurring amino acid, preferably Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (86)..(86) <223> Xaa can be absent or any naturally occurring amino acid, preferably Glu <220> <221> misc_feature <222> (121)..(121) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (122)..(122) <223> Xaa can be absent or any naturally occurring amino acid, preferably Val <400> 19 Gly Lys Val Xaa Val Asp Glu Val Xaa Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Leu 1 5 10 15 Leu Val Val Tyr Pro Trp Thr Gln Arg Phe Xaa Glu Ser Phe Gly Asp 20 25 30 Leu Ser Xaa Xaa Asp Ala Val Met Gly Asn Pro Lys Val Lys Ala His 35 40 45 Xaa Lys Lys Xaa Leu Gly Ala Phe Ser Asp Gly Leu Ala His Leu Asp 50 55 60 Asn Xaa Lys Xaa Xaa Phe Ala Thr Leu Ser Glu Leu His Cys Asp Lys 65 70 75 80 Leu His Val Asp Pro Xaa Asn Phe Arg Leu Leu Gly Asn Val Leu Val 85 90 95 Cys Val Leu Ala His His Phe Gly Lys Glu Phe Thr Pro Pro Val Gln 100 105 110 Ala Ala Tyr Gln Lys Val Val Ala Xaa Xaa Ala Asn 115 120 <210> 20 <211> 147 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence of mammalian haemoglobin beta chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(26) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(43) <223> Xaa can be absent or any naturally occurring amino acid, preferably Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(51) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (52)..(52) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (65)..(65) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(68) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (82)..(82) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (84)..(84) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (85)..(85) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (102)..(102) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (137)..(137) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (138)..(138) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (147)..(147) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably His <400> 20 Met Val His Leu Thr Pro Glu Glu Lys Xaa Xaa Val Thr Ala Xaa Trp 1 5 10 15 Gly Lys Val Xaa Val Asp Glu Val Xaa Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Leu 20 25 30 Leu Val Val Tyr Pro Trp Thr Gln Arg Phe Xaa Glu Ser Phe Gly Asp 35 40 45 Leu Ser Xaa Xaa Asp Ala Val Met Gly Asn Pro Lys Val Lys Ala His 50 55 60 Xaa Lys Lys Xaa Leu Gly Ala Phe Ser Asp Gly Leu Ala His Leu Asp 65 70 75 80 Asn Xaa Lys Xaa Xaa Phe Ala Thr Leu Ser Glu Leu His Cys Asp Lys 85 90 95 Leu His Val Asp Pro Xaa Asn Phe Arg Leu Leu Gly Asn Val Leu Val 100 105 110 Cys Val Leu Ala His His Phe Gly Lys Glu Phe Thr Pro Pro Val Gln 115 120 125 Ala Ala Tyr Gln Lys Val Val Ala Xaa Xaa Ala Asn Ala Leu Ala His 130 135 140 Lys Tyr Xaa 145 <210> 21 <211> 124 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Gly Lys Val Asn Val Asp Glu Val Gly Gly Glu Ala Leu Gly Arg Leu 1 5 10 15 Leu Val Val Tyr Pro Trp Thr Gln Arg Phe Leu Glu Ser Phe Gly Asp 20 25 30 Leu Ser Thr Pro Asp Ala Val Met Gly Asn Pro Lys Val Lys Ala His 35 40 45 Gly Lys Lys Val Leu Gly Ala Phe Ser Asp Gly Leu Ala His Leu Asp 50 55 60 Asn Leu Lys Gly Thr Phe Ala Thr Leu Ser Glu Leu His Cys Asp Lys 65 70 75 80 Leu His Val Asp Pro Glu Asn Phe Arg Leu Leu Gly Asn Val Leu Val 85 90 95 Cys Val Leu Ala His His Phe Gly Lys Glu Phe Thr Pro Pro Val Gln 100 105 110 Ala Ala Tyr Gln Lys Val Val Ala Gly Val Ala Asn 115 120 <210> 22 <211> 147 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Met Val His Leu Thr Pro Glu Glu Lys Ser Ala Val Thr Ala Leu Trp 1 5 10 15 Gly Lys Val Asn Val Asp Glu Val Gly Gly Glu Ala Leu Gly Arg Leu 20 25 30 Leu Val Val Tyr Pro Trp Thr Gln Arg Phe Leu Glu Ser Phe Gly Asp 35 40 45 Leu Ser Thr Pro Asp Ala Val Met Gly Asn Pro Lys Val Lys Ala His 50 55 60 Gly Lys Lys Val Leu Gly Ala Phe Ser Asp Gly Leu Ala His Leu Asp 65 70 75 80 Asn Leu Lys Gly Thr Phe Ala Thr Leu Ser Glu Leu His Cys Asp Lys 85 90 95 Leu His Val Asp Pro Glu Asn Phe Arg Leu Leu Gly Asn Val Leu Val 100 105 110 Cys Val Leu Ala His His Phe Gly Lys Glu Phe Thr Pro Pro Val Gln 115 120 125 Ala Ala Tyr Gln Lys Val Val Ala Gly Val Ala Asn Ala Leu Ala His 130 135 140 Lys Tyr His 145 <210> 23 <211> 80 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-terminal region of a consensus sequence of mammalian transferrins <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (32)..(32) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (42)..(42) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (47)..(47) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Ser <220> <221> misc_feature <222> (59)..(59) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (64)..(64) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (65)..(65) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (71)..(71) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Ile <220> <221> MISC_FEATURE <222> (73)..(73) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (77)..(77) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (78)..(78) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Ala <400> 23 Met Xaa Leu Ala Val Gly Ala Leu Xaa Xaa Cys Ala Val Leu Xaa Leu 1 5 10 15 Cys Leu Ala Val Pro Asp Lys Xaa Xaa Arg Trp Cys Ala Val Xaa Xaa 20 25 30 His Glu Ala Thr Lys Cys Gln Ser Phe Xaa Asp His Met Lys Xaa Val 35 40 45 Ile Pro Ser Asp Gly Pro Ser Val Ala Cys Xaa Lys Lys Ala Ser Xaa 50 55 60 Xaa Asp Cys Ile Arg Ala Xaa Ala Xaa Asn Glu Ala Xaa Xaa Val Thr 65 70 75 80 <210> 24 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminal region of a consensus sequence of mammalian transferrins <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Met <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(23) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (61)..(61) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (62)..(62) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (75)..(75) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (78)..(78) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (96)..(96) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (97)..(97) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (105)..(105) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Phe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (107)..(107) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (110)..(110) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Ser <400> 24 Glu Thr Xaa Glu Asp Cys Ile Ala Lys Ile Met Asn Gly Glu Ala Xaa 1 5 10 15 Ala Xaa Xaa Leu Asp Gly Xaa Phe Xaa Tyr Ile Xaa Gly Xaa Cys Gly 20 25 30 Leu Val Pro Val Leu Ala Glu Asn Tyr Asn Lys Ser Asp Asn Cys Glu 35 40 45 Asp Thr Pro Glu Ala Gly Tyr Phe Ala Val Ala Val Xaa Xaa Lys Ser 50 55 60 Ala Ser Asp Leu Thr Trp Asp Asn Leu Lys Xaa Lys Lys Xaa Cys His 65 70 75 80 Thr Ala Val Gly Arg Thr Ala Gly Trp Asn Ile Pro Met Gly Leu Xaa 85 90 95 Xaa Asn Lys Ile Asn His Cys Arg Xaa Asp Xaa Phe Phe Xaa Glu Gly 100 105 110 Cys Ala <210> 25 <211> 698 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence of mammalian transferrins <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Arg <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (32)..(32) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (42)..(42) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (47)..(47) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (59)..(59) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (64)..(64) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (65)..(65) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Leu <220> <221> misc_feature <222> (71)..(71) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (73)..(73) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Ile <220> <221> MISC_FEATURE <222> (77)..(77) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (78)..(78) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (84)..(84) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (87)..(87) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (88)..(88) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (94)..(94) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (98)..(98) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (104)..(104) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (107)..(107) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (108)..(108) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (115)..(115) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (116)..(116) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (121)..(121) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (124)..(124) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (129)..(129) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (146)..(146) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (152)..(152) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (153)..(153) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (161)..(161) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (179)..(179) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (188)..(188) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Gln <220> <221> MISC_FEATURE <222> (204)..(204) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (224)..(224) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (238)..(238) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (245)..(245) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (255)..(255) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (268)..(268) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably His <220> <221> MISC_FEATURE <222> (275)..(275) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Met <220> <221> MISC_FEATURE <222> (276)..(276) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (286)..(286) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (293)..(293) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Phe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (309)..(309) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (310)..(310) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (326)..(326) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (327)..(327) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (357)..(357) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (381)..(381) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (393)..(393) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (406)..(406) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (408)..(408) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Met <220> <221> MISC_FEATURE <222> (409)..(409) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (413)..(413) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (415)..(415) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (418)..(418) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (420)..(420) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (451)..(451) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (452)..(452) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (465)..(465) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (468)..(468) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (486)..(486) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (487)..(487) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (495)..(495) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Phe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (497)..(497) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (500)..(500) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (505)..(505) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (509)..(509) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (529)..(529) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (536)..(536) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (558)..(558) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Pro <220> <221> misc_feature <222> (559)..(559) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (563)..(563) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (586)..(586) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (592)..(592) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (603)..(603) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (607)..(607) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (622)..(622) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Gln <220> <221> MISC_FEATURE <222> (635)..(635) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (648)..(648) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (652)..(652) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (678)..(678) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (692)..(692) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (696)..(696) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (698)..(698) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably Pro <400> 25 Met Xaa Leu Ala Val Gly Ala Leu Xaa Xaa Cys Ala Val Leu Xaa Leu 1 5 10 15 Cys Leu Ala Val Pro Asp Lys Xaa Xaa Arg Trp Cys Ala Val Xaa Xaa 20 25 30 His Glu Ala Thr Lys Cys Gln Ser Phe Xaa Asp His Met Lys Xaa Val 35 40 45 Ile Pro Ser Asp Gly Pro Ser Val Ala Cys Xaa Lys Lys Ala Ser Xaa 50 55 60 Xaa Asp Cys Ile Arg Ala Xaa Ala Xaa Asn Glu Ala Xaa Xaa Val Thr 65 70 75 80 Leu Asp Ala Xaa Leu Val Xaa Xaa Ala Tyr Leu Ala Pro Xaa Asn Leu 85 90 95 Lys Xaa Val Val Ala Glu Phe Xaa Gly Ser Xaa Xaa Asp Pro Gln Thr 100 105 110 Phe Tyr Xaa Xaa Val Ala Val Val Xaa Lys Asp Xaa Gly Phe Gln Met 115 120 125 Xaa Gln Leu Arg Gly Lys Lys Ser Cys His Thr Gly Leu Gly Arg Ser 130 135 140 Ala Xaa Trp Asn Ile Pro Ile Xaa Xaa Leu Tyr Cys Asp Leu Pro Glu 145 150 155 160 Xaa Arg Lys Pro Leu Glu Lys Ala Val Ala Asn Phe Phe Ser Gly Ser 165 170 175 Cys Ala Xaa Cys Ala Asp Gly Thr Asp Phe Pro Xaa Leu Cys Gln Leu 180 185 190 Cys Pro Gly Cys Gly Cys Ser Thr Leu Asn Gln Xaa Phe Gly Tyr Ser 195 200 205 Gly Ala Phe Lys Cys Leu Lys Asp Gly Ala Gly Asp Val Ala Phe Xaa 210 215 220 Lys His Ser Thr Ile Phe Glu Asn Leu Ala Asn Lys Ala Xaa Arg Asp 225 230 235 240 Gln Tyr Glu Leu Xaa Cys Leu Asp Asn Thr Arg Lys Pro Val Xaa Glu 245 250 255 Tyr Lys Asp Cys His Leu Ala Gln Val Pro Ser Xaa Thr Val Val Ala 260 265 270 Arg Ser Xaa Xaa Gly Lys Glu Asp Leu Ile Trp Glu Leu Xaa Asn Gln 275 280 285 Ala Gln Glu His Xaa Gly Lys Asp Lys Ser Lys Glu Phe Gln Leu Phe 290 295 300 Ser Ser Pro His Xaa Xaa Asp Leu Leu Phe Lys Asp Ser Ala His Gly 305 310 315 320 Phe Leu Lys Val Pro Xaa Xaa Met Asp Ala Lys Met Tyr Leu Gly Tyr 325 330 335 Glu Tyr Val Thr Ala Ile Arg Asn Leu Arg Glu Gly Thr Cys Pro Glu 340 345 350 Ala Pro Thr Asp Xaa Cys Lys Pro Val Lys Trp Cys Ala Leu Ser His 355 360 365 His Glu Arg Leu Lys Cys Asp Glu Trp Ser Val Asn Xaa Val Gly Lys 370 375 380 Ile Glu Cys Val Ser Ala Glu Thr Xaa Glu Asp Cys Ile Ala Lys Ile 385 390 395 400 Met Asn Gly Glu Ala Xaa Ala Xaa Xaa Leu Asp Gly Xaa Phe Xaa Tyr 405 410 415 Ile Xaa Gly Xaa Cys Gly Leu Val Pro Val Leu Ala Glu Asn Tyr Asn 420 425 430 Lys Ser Asp Asn Cys Glu Asp Thr Pro Glu Ala Gly Tyr Phe Ala Val 435 440 445 Ala Val Xaa Xaa Lys Ser Ala Ser Asp Leu Thr Trp Asp Asn Leu Lys 450 455 460 Xaa Lys Lys Xaa Cys His Thr Ala Val Gly Arg Thr Ala Gly Trp Asn 465 470 475 480 Ile Pro Met Gly Leu Xaa Xaa Asn Lys Ile Asn His Cys Arg Xaa Asp 485 490 495 Xaa Phe Phe Xaa Glu Gly Cys Ala Xaa Gly Ser Lys Xaa Asp Ser Ser 500 505 510 Leu Cys Lys Leu Cys Met Gly Ser Gly Leu Asn Leu Cys Glu Pro Asn 515 520 525 Xaa Lys Glu Gly Tyr Tyr Gly Xaa Thr Gly Ala Phe Arg Cys Leu Val 530 535 540 Glu Lys Gly Asp Val Ala Phe Val Lys His Gln Thr Val Xaa Xaa Asn 545 550 555 560 Thr Gly Xaa Lys Asn Pro Asp Pro Trp Ala Lys Asn Leu Asn Glu Lys 565 570 575 Asp Tyr Glu Leu Leu Cys Leu Asp Gly Xaa Arg Lys Pro Val Glu Xaa 580 585 590 Tyr Ala Asn Cys His Leu Ala Arg Ala Pro Xaa His Ala Val Xaa Thr 595 600 605 Arg Lys Asp Lys Glu Ala Cys Val His Lys Ile Leu Arg Xaa Gln Gln 610 615 620 His Leu Phe Gly Ser Asn Val Thr Asp Cys Xaa Gly Asn Phe Cys Leu 625 630 635 640 Phe Arg Ser Glu Thr Lys Asp Xaa Leu Phe Arg Xaa Asp Thr Val Cys 645 650 655 Leu Ala Lys Leu His Asp Arg Asn Thr Tyr Glu Lys Tyr Leu Gly Glu 660 665 670 Glu Tyr Val Lys Ala Xaa Gly Asn Leu Arg Lys Cys Ser Thr Ser Ser 675 680 685 Leu Leu Glu Xaa Cys Thr Phe Xaa Arg Xaa 690 695 <210> 26 <211> 80 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Met Arg Leu Ala Val Gly Ala Leu Leu Val Cys Ala Val Leu Gly Leu 1 5 10 15 Cys Leu Ala Val Pro Asp Lys Thr Val Arg Trp Cys Ala Val Ser Glu 20 25 30 His Glu Ala Thr Lys Cys Gln Ser Phe Arg Asp His Met Lys Ser Val 35 40 45 Ile Pro Ser Asp Gly Pro Ser Val Ala Cys Val Lys Lys Ala Ser Tyr 50 55 60 Leu Asp Cys Ile Arg Ala Ile Ala Ala Asn Glu Ala Asp Ala Val Thr 65 70 75 80 <210> 27 <211> 114 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Glu Thr Thr Glu Asp Cys Ile Ala Lys Ile Met Asn Gly Glu Ala Asp 1 5 10 15 Ala Met Ser Leu Asp Gly Gly Phe Val Tyr Ile Ala Gly Lys Cys Gly 20 25 30 Leu Val Pro Val Leu Ala Glu Asn Tyr Asn Lys Ser Asp Asn Cys Glu 35 40 45 Asp Thr Pro Glu Ala Gly Tyr Phe Ala Val Ala Val Val Lys Lys Ser 50 55 60 Ala Ser Asp Leu Thr Trp Asp Asn Leu Lys Gly Lys Lys Ser Cys His 65 70 75 80 Thr Ala Val Gly Arg Thr Ala Gly Trp Asn Ile Pro Met Gly Leu Leu 85 90 95 Tyr Asn Lys Ile Asn His Cys Arg Phe Asp Glu Phe Phe Ser Glu Gly 100 105 110 Cys Ala <210> 28 <211> 698 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Met Arg Leu Ala Val Gly Ala Leu Leu Val Cys Ala Val Leu Gly Leu 1 5 10 15 Cys Leu Ala Val Pro Asp Lys Thr Val Arg Trp Cys Ala Val Ser Glu 20 25 30 His Glu Ala Thr Lys Cys Gln Ser Phe Arg Asp His Met Lys Ser Val 35 40 45 Ile Pro Ser Asp Gly Pro Ser Val Ala Cys Val Lys Lys Ala Ser Tyr 50 55 60 Leu Asp Cys Ile Arg Ala Ile Ala Ala Asn Glu Ala Asp Ala Val Thr 65 70 75 80 Leu Asp Ala Gly Leu Val Tyr Asp Ala Tyr Leu Ala Pro Asn Asn Leu 85 90 95 Lys Pro Val Val Ala Glu Phe Tyr Gly Ser Lys Glu Asp Pro Gln Thr 100 105 110 Phe Tyr Tyr Ala Val Ala Val Val Lys Lys Asp Ser Gly Phe Gln Met 115 120 125 Asn Gln Leu Arg Gly Lys Lys Ser Cys His Thr Gly Leu Gly Arg Ser 130 135 140 Ala Gly Trp Asn Ile Pro Ile Gly Leu Leu Tyr Cys Asp Leu Pro Glu 145 150 155 160 Pro Arg Lys Pro Leu Glu Lys Ala Val Ala Asn Phe Phe Ser Gly Ser 165 170 175 Cys Ala Pro Cys Ala Asp Gly Thr Asp Phe Pro Gln Leu Cys Gln Leu 180 185 190 Cys Pro Gly Cys Gly Cys Ser Thr Leu Asn Gln Tyr Phe Gly Tyr Ser 195 200 205 Gly Ala Phe Lys Cys Leu Lys Asp Gly Ala Gly Asp Val Ala Phe Val 210 215 220 Lys His Ser Thr Ile Phe Glu Asn Leu Ala Asn Lys Ala Asp Arg Asp 225 230 235 240 Gln Tyr Glu Leu Leu Cys Leu Asp Asn Thr Arg Lys Pro Val Asp Glu 245 250 255 Tyr Lys Asp Cys His Leu Ala Gln Val Pro Ser His Thr Val Val Ala 260 265 270 Arg Ser Met Gly Gly Lys Glu Asp Leu Ile Trp Glu Leu Leu Asn Gln 275 280 285 Ala Gln Glu His Phe Gly Lys Asp Lys Ser Lys Glu Phe Gln Leu Phe 290 295 300 Ser Ser Pro His Gly Lys Asp Leu Leu Phe Lys Asp Ser Ala His Gly 305 310 315 320 Phe Leu Lys Val Pro Pro Arg Met Asp Ala Lys Met Tyr Leu Gly Tyr 325 330 335 Glu Tyr Val Thr Ala Ile Arg Asn Leu Arg Glu Gly Thr Cys Pro Glu 340 345 350 Ala Pro Thr Asp Glu Cys Lys Pro Val Lys Trp Cys Ala Leu Ser His 355 360 365 His Glu Arg Leu Lys Cys Asp Glu Trp Ser Val Asn Ser Val Gly Lys 370 375 380 Ile Glu Cys Val Ser Ala Glu Thr Thr Glu Asp Cys Ile Ala Lys Ile 385 390 395 400 Met Asn Gly Glu Ala Asp Ala Met Ser Leu Asp Gly Gly Phe Val Tyr 405 410 415 Ile Ala Gly Lys Cys Gly Leu Val Pro Val Leu Ala Glu Asn Tyr Asn 420 425 430 Lys Ser Asp Asn Cys Glu Asp Thr Pro Glu Ala Gly Tyr Phe Ala Val 435 440 445 Ala Val Val Lys Lys Ser Ala Ser Asp Leu Thr Trp Asp Asn Leu Lys 450 455 460 Gly Lys Lys Ser Cys His Thr Ala Val Gly Arg Thr Ala Gly Trp Asn 465 470 475 480 Ile Pro Met Gly Leu Leu Tyr Asn Lys Ile Asn His Cys Arg Phe Asp 485 490 495 Glu Phe Phe Ser Glu Gly Cys Ala Pro Gly Ser Lys Lys Asp Ser Ser 500 505 510 Leu Cys Lys Leu Cys Met Gly Ser Gly Leu Asn Leu Cys Glu Pro Asn 515 520 525 Asn Lys Glu Gly Tyr Tyr Gly Tyr Thr Gly Ala Phe Arg Cys Leu Val 530 535 540 Glu Lys Gly Asp Val Ala Phe Val Lys His Gln Thr Val Pro Gln Asn 545 550 555 560 Thr Gly Gly Lys Asn Pro Asp Pro Trp Ala Lys Asn Leu Asn Glu Lys 565 570 575 Asp Tyr Glu Leu Leu Cys Leu Asp Gly Thr Arg Lys Pro Val Glu Glu 580 585 590 Tyr Ala Asn Cys His Leu Ala Arg Ala Pro Asn His Ala Val Val Thr 595 600 605 Arg Lys Asp Lys Glu Ala Cys Val His Lys Ile Leu Arg Gln Gln Gln 610 615 620 His Leu Phe Gly Ser Asn Val Thr Asp Cys Ser Gly Asn Phe Cys Leu 625 630 635 640 Phe Arg Ser Glu Thr Lys Asp Leu Leu Phe Arg Asp Asp Thr Val Cys 645 650 655 Leu Ala Lys Leu His Asp Arg Asn Thr Tyr Glu Lys Tyr Leu Gly Glu 660 665 670 Glu Tyr Val Lys Ala Val Gly Asn Leu Arg Lys Cys Ser Thr Ser Ser 675 680 685 Leu Leu Glu Ala Cys Thr Phe Arg Arg Pro 690 695

Claims (21)

  1. CD45+ 백혈구 세포, 그리고 약제학적으로 허용되는 담체, 적합한 부형제(들) 또는 이들의 조합을 포함하는, 종양 세포 내로 활성 성분의 표적화 전달을 위한 약제학적 조성물로서, 상기 CD45+ 백혈구 세포가 하나 이상의 철 결합 단백질과 활성 성분의 복합체를 포함하고, 상기 복합체에 포함된 활성 성분이 철 결합 단백질 또는 그의 다량체에 의해 포획되거나 캡슐화되고, 상기 활성 성분이 비-단백질 화합물인 것인, 약제학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 복합체에 포함된 활성 성분이 공유 결합의 부재하에서 철 결합 단백질 또는 그의 다량체에 의해 포획되거나 캡슐화되는 것인, 약제학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 활성 성분이 항암 약물, 항동맥경화증 약물, 항염증 약물, 광감작 화합물, 바이러스 및 약제학적으로 활성인 방사성 동위원소로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 약제학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 활성 성분이 종양의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 것인, 약제학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 활성 성분이 고형 종양, 유방암, 췌장암, 방광암, 폐암, 대장암 (colon cancer), 또는 저산소 영역을 가진 종양의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 것인, 약제학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 백혈구 세포가 CD34+ 조혈 전구 세포로부터 생성가능한 것인, 약제학적 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 백혈구가 단핵구, 분화된 단핵구, 림프구, 및 과립구로 구성된 그룹 중에서 선택되는 것인, 약제학적 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    (i) 단핵구가 CD11b+ 단핵구, CD11b+ CD14+ 단핵구, CD11b+ CD16+ 단핵구, CD11b+ CD14+ CD16+ 단핵구, CD11b+ CD14+ MHCII+ 단핵구, CD11b+ CD14+ CD115+ 단핵구, CD11b+ CD114+ 단핵구, CD11b+ CD116+ 단핵구, CD11b+ CCR1+ 단핵구, CD11b+ CCR2+ 단핵구, CD11b+ CX3CR+ 단핵구, CD11b+ CXR4+ 단핵구, CD11b+ CXR6+ 단핵구, 및 CD11b+ CD14+ CD33+ 단핵구로 구성된 그룹 중에서 선택되거나;
    (ii) 분화된 단핵구가 대식세포, 활성화 대식세포, CD11b+ 대식세포, CD11b+ CD16+ 대식세포, CD11b+ CD32+ 대식세포, CD11b+ CD64+ 대식세포, CD11b+ CD68+ 대식세포, CD11b+ CD86+ M1 대식세포, iNOS를 생성하거나 인터류킨 12(IL-12)를 분비하거나 둘 다인 CD11b+ CD86+ M1 대식세포, CD11b+ CCR2+ M2 대식세포, CD11b+ CD204+ M2 대식세포, CD11b+ CD206+ M2 대식세포, CD11b+ CD204+ CD206+ M2 대식세포, CD11b+ 주요 조직적합성 복합체(Major Histocompatibility Complex) II+(MHCII+)(저발현 또는 고발현) M2 대식세포, CD11b+ CD200R+ M2 대식세포, 아르기나제를 생성하거나 인터류킨 10(IL-10)을 분비하거나 둘 다인 CD11b+ CD163+ M2 대식세포 또는 활성화 대식세포; 수지상 세포, 및 CD11b CD11c, CD11b CD80, CD11c CD80, CD11c CD86, CD11c MHCII 및 CD11c CD123의 발현을 나타내는 수지상 세포로 구성된 그룹 중에서 선택되고, 분화된 단핵구는 Lox1+, CXCR7+, 및 NRF2+ 포말 세포가 아니거나;
    (iii) 적어도 하나의 케모카인 수용체, 또는 CCR1, CCR2+, CXR4+, 및 CXR6+로 구성된 그룹 중에서 선택되는 적어도 하나의 케모카인 수용체, 또는 적어도 하나의 성장 인자 수용체 또는 대식세포 콜로니 자극 인자 수용체(CD115), 과립구 콜로니 자극 인자 수용체(CD114), 및 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 수용체(CD116 및 CD131로 구성됨)로 구성된 그룹 중에서 선택되는 적어도 하나의 성장 인자 수용체를 발현하는 단핵구 또는 활성화 단핵구로서; 이들 특징의 단핵구는 염증 병태 및 암을 치료하기에 적합하거나;
    (iv) 림프구가 CD3+ 및 CD4+ 또는 CD8+ T 림프구, 또는 CD19+, CD20+, CD21+, CD19+ CD20+, CD19+ CD21+, CD20+ CD21+, 또는 CD19+ CD20+ CD21+ B 림프구로 구성된 그룹 중에서 선택되거나; 또는
    (v) 과립구가 호중구, CD66b+ 호중구, 호산구, 호염기구, 및 CD193+ 호산구로 구성된 그룹 중에서 선택되는 것인, 약제학적 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 활성화 대식세포가
    (i) 단핵구 또는 대식세포를
    (a) 대식세포 상의 발현 표지자를 변경할 수 있는 인자와 함께,
    (b) 적어도 하나의 M1 유도제와 함께,
    (c) 적어도 하나의 M2 유도제와 함께, 또는
    (d) 사이토카인, IL-10, IL-12, 또는 케모카인을 분비하거나 iNOS, 아르기나제, 또는 다른 면역조절 효소를 생성하는 대식세포 능력을 변경할 수 있는 인자와 함께
    시험관내 인큐베이션함으로써 생성가능하거나;
    (ii) CD64, CD86, CD16, 및 CD32 중 적어도 하나의 항원의 발현; 고발현의 MHCII; iNOS, IL-12 또는 둘 다의 생성, 또는 이들의 조합을 특징으로 하거나;
    (iii) 단핵구 또는 대식세포를 대식세포의 식작용 능력을 유도할 수 있는 인자와 함께 시험관내 인큐베이션함으로써 생성가능하거나;
    (iv) CD204, CD206, CD200R; CCR2, 트랜스페린 수용체(TfR), CXC-모티브 케모카인 수용체 4(CXCR4), CD163, T 세포 면역글로불린-도메인 및 뮤신-도메인 2(TIM-2) 중 적어도 하나의 항원의 발현을 특징으로 하거나, MHCII의 저발현을 나타내거나, 또는 둘 다이거나;
    (v) 식작용 능력을 나타내거나;
    (vi) 사이토카인 분비, IL-12 분비 또는 IL-10 분비, 또는 유도성 산화질소 합성효소(iNOS) 또는 다른 전-염증 화합물, 아르기나제, 또는 다른 면역억제/항-염증 화합물의 생성이 가능하거나; 또는
    (vii) 이들의 조합을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    (i) M1 유도제가 LPS, INF-γ, GM-CSF, 및 바이러스 및 박테리아 감염으로 구성된 그룹 중에서 선택되거나;
    (ii) M2 유도제가 IL-4, IL-10, IL-13, 항원과 항체의 면역 복합체, IgG, 열 활성화 감마-글로불린, 글루코코르티코스테로이드, TGF-β, IL-1R, CCL-2, IL-6, M-CSF, PPARγ 작용제, 백혈구 저해 인자, 아데노신, 기생충 및 진균 감염으로 구성된 그룹 중에서 선택되는 것인, 약제학적 조성물.
  11. 제8항에 있어서, 단핵구가
    (i) CD34+ 조혈 전구 세포로부터 생성가능하거나;
    (ii) 단핵구를 적어도 하나의 유도제, 또는 M1 및 M2 유도제로부터 선택되는 적어도 하나의 유도제와 함께 시험관내 인큐베이션함으로써 생성가능하거나;
    (iii) TfR+, CD163+, TIM-2+, CD14+, CD16+, CD33+, 및 CD115+ 중 적어도 하나의 항원의 발현을 특징으로 하거나;
    (iv) TfR+, CD163+, TIM-2+, CXCR4+, CD14+, 및 CD16+ 중 적어도 하나의 항원의 발현을 특징으로 하거나;
    (v) 식작용 능력을 갖거나; 또는
    (vi) 이들의 조합을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
  12. 제11항에 있어서,
    (i) M1 유도제가 LPS, INF-γ, GM-CSF, 또는 바이러스 또는 박테리아 감염으로 구성된 그룹 중에서 선택되고;
    (ii) M2 유도제가 IL-4, IL-10, IL-13, 항원과 항체의 면역 복합체, IgG, 열 활성화 감마-글로불린, 글루코코르티코스테로이드, TGF-β, IL-1R, CCL-2, IL-6, M-CSF, PPARγ 작용제, 백혈구 저해 인자, 암-조건화 배지(cancer-conditioned medium), 암 세포, 아데노신, 및 기생충 또는 진균 감염으로 구성된 그룹 중에서 선택되는 것인, 약제학적 조성물.
  13. 제8항에 있어서, 림프구가
    (i) 혈액, 비장, 또는 골수로부터 얻을 수 있거나 CD34+ 전구 세포로부터 생성가능하거나;
    (ii) 면역 적격 림프구이거나;
    (iii) 항원 특이적 T 세포 수용체를 발현하거나;
    (iv) (a) CD3+ 및 CD4+ 또는 CD8+, 또는 (b) CD19+, CD20+, CD21+, CD19+ CD20+, CD19+ CD21+, CD20+ CD21+, 또는 CD19+ CD20+ CD21+ 항원 중 적어도 하나의 항원의 발현을 특징으로 하거나;
    (v) 면역글로불린을 생성할 수 있거나; 또는
    (vi) 이들의 조합을 특징으로 하는 것인, 약제학적 조성물.
  14. 제8항에 있어서, 과립구가
    (i) 혈액, 비장, 또는 골수로부터 얻을 수 있거나 CD34+ 전구 세포로부터 생성가능하거나;
    (ii) CD66b+ 및 CD193+ 중 적어도 하나의 발현을 특징으로 하거나;
    (iii) 세포질 내 과립의 존재를 특징으로 하는 다형핵성 백혈구이거나;
    (iv) TfR+, CD163+, TIM-2+, 및 CXCR4+ 중 적어도 하나의 발현을 특징으로 하거나; 또는
    (v) 이들의 조합을 특징으로 하는 것인, 약제학적 조성물.
  15. 제1항에 있어서, 백혈구가
    (i) 단핵구 또는 대식세포와 적어도 하나의 M2 유도제와의 시험관내 인큐베이션에 의해 생성가능하거나;
    (ii) CD11b+ CCR2+ M2 대식세포, CD11b+ CD204+ M2 대식세포, CD11b+ CD206+ M2 대식세포, CD11b+ CD204+ CD206+ M2 대식세포, CD11b+ MHCII+(저발현 또는 고발현) M2 대식세포, CD11b+ CD200R+ M2 대식세포 및 CD11b+ CD163+ M2 대식세포로 구성된 군으로부터 선택되거나; 또는
    (iii) 둘 다를 특징으로 하는
    활성화 M2 대식세포인 것인, 약제학적 조성물.
  16. 제1항에 있어서, 철 결합 단백질이 페리틴, 중쇄(H) 유형 페리틴, 경쇄(L) 페리틴, 미토콘드리아 페리틴; 헤모글로빈, 헤모글로빈 A, 헤모글로빈 AS, 헤모글로빈 SC, 헤모글로빈 C, 헤모글로빈 D, 헤모글로빈 E, 헤모글로빈 F, 헤모글로빈 H; 헤모글로빈-합토글로빈 복합체, 헤모펙신, 트랜스페린; 및 락토페린으로 구성된 그룹 중에서 선택되는 것인, 약제학적 조성물.
  17. 제1항에 있어서, 활성 성분이 핵산, 1 kD 미만의 분자량을 갖는 화학적 비-단백질 비-핵산 화합물, 항암 약물, 세포증식억제 약물, 세포독성 약물 및 그의 전구약물; 항동맥경화증 약물; 및 항-염증 약물; 광감작 화합물; 바이러스, 항암 바이러스; 세포를 손상시키는 양의 γ 방사선 또는 세포를 손상시키는 양의 α 방사선을 방출하는, α 또는 β 방사선 방출 방사성동위원소, 루테튬-177, 이테르븀-90, 요오드-131, 사마륨-153, 인-32, 세슘-131, 팔라듐-103, 라듐-233, 요오드-125, 붕소-10, 악티늄-225, 비스무스-213, 납-212, 및 폴로늄-212로 구성된 그룹 중에서 선택되는 것인, 약제학적 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 항암 약물이 세포자멸(apoptosis)-유도 약물, 알킬화 물질, 항-대사물질, 항생제, 에포틸론, 핵 수용체 작용제 및 길항제, 항안드로겐, 항에스트로겐, 백금 화합물, 비-단백질 호르몬, 비-단백질 항호르몬, 세포 주기-의존성 단백질 키나아제(CDK: cell cycle-dependent kinase)의 저해제, 사이클로옥시게나제의 저해제, 리폭시게나제의 저해제, 사이클로옥시게나제 및 리폭시게나제의 저해제, 생물기원 지방산, 생물기원 지방산 유도체, 프로스타노이드, 류코트리엔, 단백질 키나아제의 저해제, 단백질 포스파타아제의 저해제, 지질 키나아제의 저해제, 백금 배위 착물, 에틸렌이민, 메틸멜라민, 트리아진, 빈카 알칼로이드, 피리미딘 유사체, 퓨린 유사체, 알킬설포네이트, 엽산 유사체, 안트라센디온, 치환된 우레아, 메틸하이드라진 유도체, 엔-디인 항생제, 메이탄시노이드 아우리스타틴 유도체, 면역 체크-포인트 저해제, 종양-특이적 단백질의 저해제, 종양-특이적 표지자의 저해제, 및 Rho-GDP-해리 저해제로 구성된 그룹 중에서 선택되는 것인, 약제학적 조성물.
  19. 제17항에 있어서, 항암 약물이 아세디아설폰, 아클라루비신, 암바존, 아미노글루테티미드, L-아스파라기나제, 아자티오프린, 바녹산트론, 벤다무스틴, 블레오마이신, 부설판, 칼슘 폴리네이트, 카보플라틴, 카페시타빈, 카무스틴, 셀레콕십, 클로람부실, 시스-플라틴, 클라드리빈, 사이클로포스파미드, 사이타라빈, 다카바진, 닥티노마이신 답손, 다우노루비신, 디브롬프로파미딘, 디에틸스틸베스트롤, 도세탁셀, 독소루비신, 엔디인, 에피루비신, 에포틸론 B, 에포틸론 D, 에스트라뮤신 포스페이트, 에스트로겐, 에티닐에스트라디올, 에토포시드, 플라보피리돌, 플록수리딘, 플루다라빈, 플루오로우라실, 플루옥시메스테론, 플루타미드 포스페스트롤, 푸라졸리돈, 겜시타빈, 고나도트로핀 방출 호르몬 유사체, 헥사메틸멜라민, 하이드록시카바미드, 하이드록시메틸니트로푸란토인, 하이드록시프로게스테론카프로에이트, 하이드록시우레아, 이다루비신, 이독수리딘, 이포스파미드, 이리노테칸, 류프롤리드, 로무스틴, 루르토테칸, 마페니드 설페이트 올라미드, 메클로레타민, 메드록시프로게스테론 아세테이트, 메가스트롤아세테이트, 멜팔란, 메파크린, 머캅토퓨린, 메토트렉세이트, 메트로니다졸, 미토마이신 C, 미토포도지드, 미토탄, 미톡산트론, 미트라마이신, 날리딕스산, 니푸라텔, 니푸록사지드, 니푸랄라진, 니푸르티목스, 니무스틴, 니노라졸, 니트로푸란토인, 질소 머스타드, 올레오뮤신, 옥솔린산, 펜타미딘, 펜토스타틴, 페나조피리딘, 프탈릴설파티아졸, 피포브로만, 프레드니무스틴, 프레드니손, 프레우신, 프로카바진, 피리메타민, 랄티트렉시드, 라파마이신, 로페콕십, 로시글리타존, 살라조설파피리딘, 스크리플라비늄 클로라이드, 세무스틴 스트렙토조신, 설파카바미드, 설파세타미드, 설파클로피리다진, 설파디아진, 설파디크라미드, 설파디메톡신, 설파에티돌, 설파푸라졸, 설파구아니딘, 설파구아놀, 설파메티졸, 설파메톡사졸, 코-트리목사졸, 설파메톡시디아진, 설파메톡시피리다진, 설파목솔, 설파닐아미드, 설파페린, 설파페나졸, 설파티아졸, 설피소미딘, 스타우로스포린, 타목시펜, 탁솔, 테니포시드, 터티포시드, 테스토락톤, 테스토스테론프로피오네이트, 티오구아닌, 티오테파, 티니다졸, 토포테칸, 트리아지쿠온, 트레오설판, 트리메토프림, 트로포스파미드, UCN-01, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 빈블라스틴, 비노렐빈, 조루비신, 아우리스타틴, 칼리세아마이신, 다이네마이신 A, 메이탄신, 메르탄신, 및 네오카지노스타틴으로 구성된 그룹 중에서 선택되는 것인, 약제학적 조성물.
  20. 제17항에 있어서, 항암 약물이 세포 주기 저해제; 핵산; 증식 저해 단백질을 암호화하는 핵산 또는 증식 촉진 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 유사 결합 단백질을 암호화하는 핵산; 또는 siRNA 또는 DNAzyme인 것인, 약제학적 조성물.
  21. 제1항에 있어서, 활성 성분이 저산소증-활성화 전구약물, 벤조트리아진 N-옥사이드, 아파지쿠온(EO9), 티라파자민(TPN), SN30000, PR-104A, TH-302, TH-4000, 및 AQ4N으로 구성된 그룹 중에서 선택되는 것인, 약제학적 조성물.
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