CN108026514A - 细胞靶向标记物递送体系 - Google Patents

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CN108026514A
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amino acid
delivery system
cd11b
monocyte
cell
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CN201680047506.5A
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玛格达莱娜·克鲁尔
艾琳·本尼
保拉·贝奥科
托马什·里亚盖尔
阿尔贝托·博菲
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Sellis Stock Company
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Sal Lis Ltd By Share Ltd
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Abstract

本发明涉及一种经分离的细胞靶向递送体系，其包含CD45+白细胞，在所述细胞中包含一种或更多种铁结合蛋白和/或标记物的复合物，本发明还涉及用于制备这种经分离的细胞靶向递送体系的方法，以及该体系用于治疗诊断、尤其是用于诊断癌症特别是转移性癌、尤其是癌症治疗的用途。

Description

细胞靶向标记物递送体系
本发明涉及一种经分离的细胞靶向递送体系，其包含CD45+白细胞，在所述细胞中包含一种或更多种铁结合蛋白和/或标记物的复合物，本发明还涉及用于制备这种经分离的细胞靶向递送体系的方法，以及该体系用于诊断、尤其是用于诊断癌症、特别是转移癌的用途。
发明背景
目前的成像工具能够检测大的转移瘤(尺寸大于0.5至1cm)。然而，它们很少检测到转移性肿瘤细胞的早期扩散。小于0.5cm的人转移瘤是无血管的，因此没有适当的血液和氧供应。这表示通过血液循环递送造影剂以标记这些转移瘤并使其成像是不可能的。缺氧的存在是微转移瘤的常见特征，其中缺氧部分可以高达90％，几乎没有血液灌注(Li等人，2012，Journal of Solid Tumours，2(2)：28-33)。因此，严重缺氧被认为是微转移瘤的一般特征。
在大群正常细胞中隐藏的一种或更多种微转移瘤的靶向呈现出独特的挑战，因为接近微转移瘤被几种生物屏障、不良血液供应阻碍，微转移瘤的小尺寸及其分散至器官呈现了其他障碍。
出于相同的原因，微转移瘤对治疗常常是难治的。尽管微转移瘤源自的实体瘤对常规治疗通常良好地响应，但常常在原发性肿瘤部位或在转移瘤部位再生长。这构成了临床肿瘤学中的严重问题(Muthana等人，2012，Cancer Res；73(2)；490-495)。这与限制药物渗透的实体瘤的微环境特征有关，从而使肿瘤暴露在低于药物有效浓度的浓度下(Hobbs等人，1998，Proc Natl Acad Sci USA：4607-4612)。这是由不足的脉管系统引起的，其导致团块中癌细胞的高异质性、低氧张力(缺氧)、低pH和低葡萄糖浓度(Kizaka-Kondoh等人，2003，Cancer Sci 94(12)：1021-1028)。此外，在一些区域中快速的肿瘤细胞增殖可以超过新血管生长的速度，这促进缺氧区域的形成(Lewis和Murdoch，2005，Am J Pathol 167(3)：627-635)。导致肿瘤缺氧的这种异常的血管结构及其之后受损的功能与患有实体瘤的患者的更恶性的表型和低存活率有关，并且导致由于药物摄取减少的治疗失败和癌细胞中的缺氧诱导性改变(Sun等人，2012，Clin Cancer Res 18(3)：758-770；Sullivan等人，2008 MolCancer Ther 7(7)：1961-1973；Kizaka-Kondoh等人，2003，Cancer Sci 94(12)：1021-1028)。此外，化疗或放疗引起大面积肿瘤缺氧的额外形成，从而使肿瘤的治疗甚至更困难。抗癌治疗的效力受限于缺氧肿瘤细胞存在的事实已经使得引入目标在于克服这种问题的各种治疗方法。
本发明人已经发现CD45+白细胞、特别是活化的巨噬细胞可以摄取与或不与一种或更多种铁结合蛋白在体外复合的一种或更多种标记物，并体内递送这些复合物至细胞或细胞中，优选至肿瘤细胞或肿瘤细胞中。基于该成果，本发明人克服了现有技术的上述一个或更多个问题。因此，本发明的靶向递送体系尤其提供了以下优点中的一个或更多个：(i)特异性递送一种或更多种标记物至吸引上述CD45+白细胞的组织，优选至患病细胞中，(ii)保护标记物免于在血液循环中失活或从身体中清除，(iii)递送标记物优选至疾病的不良血管化或非血管化的区域的细胞中，所述疾病例如转移瘤、较大肿瘤、风湿性病变、无血管伤口、皮肤中的缺氧区域，(iv)降低的标记物毒性，(v)递送具有不良药代动力学的标记物，(vi)降低由于标记物靶向递送的标记物副作用，(vii)由于靶向递送，较低剂量的标记物具有较高的诊断效力；(viii)由于施用与铁结合蛋白相连的标记物，所述铁结合蛋白负载在CD45+白细胞中，因此在标记物施用部位局部组织损伤的风险较低；和/或(ix)检测高度缺氧的小转移瘤的可能性(Pérez-Herrero E，Fernández-Medarde A.2015，Eur J PharmBiopharm 93：52-79)。
发明概述
在第一个方面，本发明涉及一种经分离的靶向递送体系，其包含CD45+白细胞，所述CD45+白细胞优选地能够内化铁结合蛋白，在所述细胞中包含一种或更多种铁结合蛋白和一种或更多种标记物的复合物。
在第二个方面，本发明涉及一种经分离的靶向递送标记物体系，其包含CD45+白细胞，所述CD45+白细胞优选地能够被标记，其包含一种或更多种标记物，优选放射性标记物或其结合物和组合。
在第三个方面，本发明涉及制备本发明第一个方面的经分离的靶向递送体系的方法，其包括以下步骤：
a)提供铁结合蛋白，其优选是纯化的；
b)将标记物共价或非共价地连接至铁结合蛋白和/或在铁结合蛋白中包封标记物；
c)提供CD45+白细胞；和
d1)在步骤b)中产生的铁结合蛋白和标记物的复合物的存在下培养CD45+白细胞，直到CD45+白细胞至少部分地负载步骤b)中产生的铁结合蛋白和标记物的复合物，和/或
d2)在标记物的存在下培养CD45+白细胞直到CD45+白细胞至少部分地标记有标记物。
在第四个方面，本发明涉及本发明第一个方面的经分离的靶向递送体系或根据本发明第三个方面的方法可以制备的经分离的靶向递送体系，其用作诊断试剂。
在第五个方面，本发明涉及诊断组合物，其包含本发明第一个方面的经分离的靶向递送体系或根据本发明第三个方面的方法可以制备的经分离的靶向递送体系和药学上可接受的载体和/或合适的赋形剂。
在第六个方面，本发明涉及本发明第一个方面的经分离的靶向递送体系或根据本发明第三个方面的方法可以制备的经分离的靶向递送体系，其用于诊断肿瘤、炎症性疾病或缺血性区域，所述肿瘤优选实体瘤和/或其转移瘤，优选乳腺癌、胰腺癌、膀胱癌、肺癌、结肠癌或其转移瘤、或具有缺氧区域的肿瘤，所述缺血性区域特别是在皮肤伤口中或器官梗塞(心脏)或视网膜缺血后的缺血性区域。
优选实施方案的详细描述
在以下详细描述本发明前，应理解本发明不限于本文描述的特定方法、方案和试剂，因为这些方法、方案和试剂可以变化。还应理解的是，本文使用的术语仅用于描述特定的实施方案，并且不旨在限制本发明范围，本发明范围仅由所附权利要求限制。除非另外限定，本文所使用的所有技术和科学术语都具有与本领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。
下面将描述本发明的要素。这些要素与特定的实施方案一起列出，然而应理解它们可以以任何方式和任何数量组合以产生另外的实施方案。各种描述的实施例和优选实施方案不应理解为仅将本发明限制为明确描述的实施方案。该描述应被理解为支持并包含将明确描述的实施方案与许多公开的和/或优选的要素组合的实施方案。此外，除非上下文另外指出，否则本申请中所有描述的要素的任何排列和组合应被认为由本申请的描述所公开。
贯穿本说明书全文，引用几篇文献。本文所引用的每个文献(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商说明书、说明书等)，无论在上文还是下文，均通过引用以其整体并入本文。本文没有内容被解释为承认本发明由于在先发明而没有早于该公开内容的权利。
定义
为了实践本发明，除非另外说明，使用了本领域文献中所说明的化学、生物化学和重组DNA技术的常规方法(参见例如，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，J.Sambrook等人编著，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，1989)。
在本说明书和其后的权利要求全文中，除非上下文需要，否则词“包含”及其变体将被理解为意味着包括所说明的整体或步骤或整体的组或步骤的组，但不排除任何其他整体或步骤或整体的组或步骤的组。如在该说明书和所附权利要求中所使用的，没有数量词修饰的指示物包括复数指示物，除非文中另外明确地规定。
术语“靶向标记物递送”或“靶向造影剂递送”指递送标记物、尤其是造影剂至患者或待诊断的人，其导致当与该患者身体的其他区域相比时，在身体特定区域中的标记物、特别是造影剂的浓度增加。优选地，比较身体的患病区域和身体的具有类似血液循环通路的其他区域之间的相对浓度。在优选的实施方案中，在施用本发明的靶向递送体系后，优选1至24小时后，在来自患病区域的给定数目的细胞或给定活组织切片体积中标记物、特别是造影剂的浓度相比于来自非患病区域的相同数目的细胞或活组织切片体积中的标记物、特别是造影剂的浓度高至少10％。更优选地，在施用本发明的靶向递送体系后，优选2至24小时后，患者身体的患病区域中标记物、特别是造影剂的浓度相比于身体的非患病区域中的标记物、特别是造影剂的浓度高至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少150％、至少200％、至少250％、至少300％、至少350％、至少400％、至少450％、至少500％、更优选至少1000％。当基于全身分布评估时，优选将施用至患者或待诊断的人的至少5％、优选至少10％、更优选至少15％的标记物、特别是造影剂递送至身体的患病区域。标记物、特别是造影剂的靶向递送限制了标记物、特别是造影剂对身体患病区域的潜在有害作用。
术语“靶向标记物递送体系”或“靶向递送体系”在本申请中同义地使用，并且指优选在患者体内能够将标记物、特别是造影剂递送至靶向区域的体系，即能够靶向递送的体系。
在本发明的情况下使用的术语“标记物”指适用于诊断目的的任何种类的化合物。优选的化合物选自荧光染料、放射性同位素和造影剂。造影剂是有助于显示体内异常区域的染料或其他物质。在一个实施方案中，术语标记物指包含螯合剂的化合物，所述螯合剂与二价或三价金属阳离子形成复合物。优选的放射性同位素/荧光发射同位素选自α辐射发射同位素、γ辐射发射同位素、俄歇电子发射同位素、X射线发射同位素、荧光同位素例如65Tb荧光发射同位素例如18F、51Cr、67Ga、68Ga、111In、99mTc、140La、175Yb、153Sm、166Ho、88Y、89Zr、90Y、149Pm、177Lu、47Sc、142Pr、159Gd、212Bi、72As、72Se、97Ru、109Pd、105Rh、101m15Rh、119Sb、128Ba、123I、124I、131I、197Hg、211At、169Eu、203Pb、212Pb、64Cu、67Cu、188Re、186Re、198Au和199Ag，以及上述同位素与蛋白质、肽、小分子抑制剂、抗体或其他化合物的结合物和组合，例如18F氟脱氧葡萄糖(18F-FDG)或64Cu-卟啉。优选的荧光染料选自以下类型的染料：氧杂蒽类(例如荧光素)、吖啶类(例如吖啶黄)、嗪类(例如嗪1)、青色素类(例如Cy7/Cy3)、苯乙烯基染料(例如Dye-28)、香豆素类(例如Alexa Fluor 350)、卟吩类(例如叶绿素B)、金属配体络合物(例如PtOEPK)、荧光蛋白(例如APC、R-藻红蛋白)、纳米晶体(例如QuantumDot 705)、苝类(例如Lumogen Red F300)和酞菁类(例如IRDYETM 700DX)以及这些类别的染料的结合物和组合或放射荧光的65Tb。优选的造影剂选自顺磁剂，例如Gd、Eu、W和Mn，优选地与螯合剂复合。其他选择是超顺磁性铁(Fe)络合物和颗粒，含有高原子序数的原子的化合物即用于计算机断层成像(CT)的碘，微泡和载体，例如包含这些造影剂的脂质体。
术语“肽”或“多肽”在本发明的情况下可互换地使用，其指通过肽键连接的至少两个氨基酸的链。因此，本发明情况下的术语“肽”还用于指具有多于50个、多于100个或多于150个氨基酸的氨基酸链。
贯穿说明书关于多肽和核苷酸序列比对，使用术语“序列一致性”。在比对两个序列并且没有指定计算序列一致性百分比所要对比的参考序列的情况下，如果没有另外特别指出，否则参考待比对的两个序列中较长的序列来计算序列一致性。如果指出了参考序列，如果没有另外特别指出，则序列一致性是基于SEQ ID所示的参考序列的全长确定的。例如，相比于参考的300个氨基酸长的多肽序列，由200个氨基酸组成的多肽序列可以显示出最大百分比为66.6％(200/300)的序列一致性，而具有150个氨基酸长度的序列则可以显示出最大百分比为50％(150/300)的序列一致性。如果这150个氨基酸中的15个与300个氨基酸长的参考序列的相应氨基酸不同，则序列一致性水平减少至45％。核苷酸和氨基酸序列的相似性、即序列一致性的百分比可以通过序列比对来确定。这种比对可以用几种本领域已知的算法进行，优选地用Karlin和Altschul(Karlin&Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877)的数学算法进行，用hmmalign(HMMER软件包，http：//hmmer.wustl.edu/)或用CLUSTAL算法(Thompson，J.D.，Higgins，D.G.&Gibson，T.J.(1994)Nucleic Acids Res.22，4673-80)进行，其例如可以在http：//www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/上或在http：//www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html上或在http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page＝/NPSA/npsa_clustalw.html上获得。优选使用的参数是它们在http：//www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/或http：//www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html上设置的默认参数。序列一致性的等级(序列匹配)可以使用例如BLAST、BLAT或BlastZ(或BlastX)来计算。使用BLASTP程序进行BLAST蛋白质搜索，分数＝50，字长＝3。为了获得用于比对目的的空位比对，使用如Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402中描述的GappedBLAST。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，使用各程序的默认参数。序列匹配分析可以通过已建立的同源作图技术如Shuffle-LAGAN(Brudno M.，Bioinformatics 2003b，19 Suppl1：I54-162)或马尔可夫随机场来补充。还可以用使用来自序列数据库检索的信息、具有3D结构的可用同系物和用户定义的限制条件用于多个蛋白质序列和/或结构的基于结构的比对(Pei J，Grishin NV：PROMALS：towards accurate multiple sequence alignments ofdistantly related proteins；Bioinformatics 2007，23：802-808；3DCoffee@igs：a webserver for combining sequences and structures into a multiple sequencealignment；Poirot O，Suhre K，Abergel C，O′Toole E，Notredame C.Nucleic AcidsRes.2004 Jul 1；32：W37-40)。当在本申请中提及序列一致性的百分比时，如果另外没有特别指出，这些百分比是相对于较长序列的全长计算的。
在本发明的上下文中使用的术语“白细胞”指涉及保护身体免受传染病和外来侵入物的免疫系统的细胞。所有白细胞均由骨髓中的多能细胞产生和衍生，所述多能细胞被称为造血干细胞。白细胞遍及全身而存在，包括血液和淋巴系统。所有白细胞都有细胞核，这将它们与其他血细胞、无核红细胞(RBC)和血小板区分开。白细胞的类型可以按标准方式分类。将它们按结构(粒细胞或无粒细胞)或细胞分裂谱系(骨髓细胞或淋巴细胞)分类为两对最宽的类别。这些最宽的类别可以进一步分为五种主要类型：嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞。这些类型以其物理和功能性特点进行区分。单核细胞和嗜中性粒细胞是吞噬细胞的。可以分类进一步的亚型；例如在淋巴细胞中有B细胞、T细胞和NK细胞。通过粒细胞的核形状(叶形相对圆形，即分叶核相对单核)和它们的细胞质颗粒(存在或不存在，或更精确地，在光学显微镜下可见或不可见)，将其与无粒白细胞区分开。另一种二分法是通过谱系：通过造血谱系(细胞分化谱系)将骨髓细胞(嗜中性粒细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)与淋巴样细胞(淋巴细胞)区分开。
本发明已经观察到CD45+表达是白细胞的特征，其适合在本发明靶向递送体系的情况下使用，特别是由于CD45+白细胞被吸引至体内的特定组织和细胞，以及能够将一种或更多种铁结合蛋白和一种或更多种标记物、特别是造影剂的复合物递送至细胞或递送至细胞中。技术人员应理解的是除克隆来源的CD45+白细胞外，CD45+白细胞是不同白细胞的混合群，所述不同白细胞享有表达CD45+表面抗原的共同性质。因此，贯穿说明书，不同组的CD45+白细胞内的细胞亚群的特征在于其他功能性和/或结构特征。术语“CD45+”表示细胞群内的大部分细胞或基本上全部细胞表达CD45+表面抗原。关于这点以及关于其他细胞表面抗原，术语“表达”表示表面抗原在细胞内产生并且可检测地暴露在细胞表面上。可检测地暴露在细胞表面上的表面抗原的表达水平以及数量因此可以在不同的白细胞中变化很大。通常，如果表面抗原的至少5个、优选至少10个拷贝可检测地暴露在细胞表面上，则细胞被认为对于细胞表面抗原是阳性的，即被表示为“+”。技术人员非常清楚如何检测、定量和选择对于给定的细胞表面抗原为阳性(或阴性)的细胞。优选的方法包括荧光活化细胞分选(FACS)。在该技术中，经荧光标记的抗体被用于结合细胞群的细胞表面抗原，然后将细胞分离为单个细胞，并基于对单个细胞测量的荧光强度，表征为对给定的细胞表面抗原阳性或阴性的。在本发明的一些实施方案中，表明给定蛋白质的表达为高或低。这表示蛋白质在两种情况下都可检测地表达，即为“+”，然而以不同的水平表达。高表达和低表达分别表示对于不同蛋白质每个细胞的蛋白质的不同绝对数量。因此，如果每个细胞有多于500个可检测的蛋白质拷贝，则可以认为给定的蛋白质以高水平表达，如果每个细胞有1至50个可检测的蛋白质拷贝，则可以认为给定的蛋白质以低水平表达。而如果另一种蛋白质有多于5000个可检测的拷贝，则可以认为其以高水平表达，如果每个细胞有1至500个可检测的拷贝，则可以认为另一种蛋白质以低水平表达。如何使用流式细胞术和Becton Dickinson QuantibriteTM珠法(参见例如，Pannu，K.K.，2001，Cytometry.2001 Dec 1；45(4)：250-8)或质谱分析(参见例如，Milo，R.，2013，Bioessays，35(12)：1050-1055)定量细胞中表达或产生的蛋白质数量是本领域众所周知的。出于本发明的目的，术语给定蛋白质的“高表达”指该蛋白质的可检测表达是在健康CD45+白细胞群中发现的最高表达水平、即在健康CD45+白细胞群中每个细胞的拷贝数的至少70％。术语给定蛋白质的“低表达”指该蛋白质的可检测表达是在健康CD45+白细胞群中发现的最高表达水平、即在健康的CD45+白细胞群中每个细胞的该蛋白质拷贝数的30％或更少。优选地，“最高表达水平”被确定为在不同对象的健康CD45+白细胞中发现的最高表达水平的平均值。在一些实施方案中，优选的细胞亚群以“产生”给定蛋白质为特征。这被理解为表示蛋白质在细胞表面上不必是可检测的，而是可以仅存在于细胞内。技术人员非常清楚如何检测和/或定量细胞内产生的蛋白质和/或选择产生这种蛋白质的细胞。
在本发明的情况下，术语“分化的单核细胞”用于指从主要存在于骨髓(但也可以在脾脏中)中的称为巨噬细胞-DC前体(MDP)的定向前体分化、并分化为树突细胞或巨噬细胞的单核细胞。在小鼠中，它们由两个主要亚群组成：(i)具有CX3CR1高表达、CCR2和Ly6C-低表达的CD11b+细胞，和(ii)具有CX3CR1低表达、CCR2和Ly6C+高表达的CD11b+细胞。在离开骨髓后，小鼠Ly6C+单核细胞在循环中分化为Ly6C-单核细胞。类似地，在人单核细胞分化中，认为在外周血循环中，CD14++典型单核细胞离开骨髓并分化为CD14++CD16+中间体单核细胞，并继续分化为CD14+CD16++非典型单核细胞(Yang等人，2014；Biomark Res 2(1)doi.10.1186/2050-7771-2-1)。
巨噬细胞是组织中存在的专门的吞噬细胞和抗原呈递细胞(APC)，其从循环外周血单核细胞(PBM)中分化。在本发明的情况下，使用的术语“活化的巨噬细胞”指任何极化的巨噬细胞。巨噬细胞活化通常通过用白介素、细胞因子和/或生长因子培养来实现。特别地，IL-4和M-CSF可以用作活化剂。不同表型的活化的巨噬细胞分为M1-巨噬细胞，典型活化的巨噬细胞(CAM)和M2-巨噬细胞，替代性活化的巨噬细胞(AAM)。典型活化的M1-巨噬细胞包含具有急性炎症表型的免疫效应细胞。这些细胞对细菌具有高度侵略性并产生大量淋巴因子(Murray和Wynn，2011，J Leukoc Biol，89(4)：557-63)。替代性活化的抗炎M2-巨噬细胞可以分为至少三个亚组。这些亚型具有多种不同的功能，包括免疫调节、耐受性维持和组织修复/伤口愈合。在本发明的情况下使用的术语“M1诱导物”指引导PBM分化为M1型巨噬细胞的化合物。在本发明的情况下使用的术语“M2诱导物”指引导PBM分化为M2型巨噬细胞的化合物。技术人员知道许多方式以促进向M1或M2巨噬细胞的分化。
术语“通过巨噬细胞的吞噬作用”是巨噬细胞吞噬实体颗粒以形成被称为吞噬体的内囊泡的过程。
所使用的术语“铁结合蛋白”指与铁离子非共价结合的蛋白质。这种蛋白质的实例包括铁蛋白、血红蛋白、转铁蛋白；和乳铁蛋白。铁结合蛋白通过细胞表面受体结合，所述细胞表面受体有助于这些蛋白质内化到细胞中。
在第一个方面，本发明涉及一种经分离的靶向递送标记物体系，其包含CD45+白细胞，其优选地能够内化铁结合蛋白，在所述细胞中包含一种或更多种铁结合蛋白和一种或更多种标记物、特别是造影剂的复合物。
本申请人出人意料地发现，CD45+白细胞、优选单核细胞或活化的单核细胞和巨噬细胞、优选活化的巨噬细胞、优选M1巨噬细胞、更优选M2巨噬细胞捕获标记物并递送使用成像系统足以检测的量的标记物以使得它们被用于在体内追踪其位置。在18F-FDG的情况下，在单核细胞和活化的单核细胞、巨噬细胞、活化的巨噬细胞、优选M1巨噬细胞和最优选M2巨噬细胞的情况下，这是特别优选的。施用负载标记物(18F-FDG)、优选放射性标记物的细胞可以优选地通过正电子成像术(PET)成像使积聚经标记的细胞的器官可视化。因此，在第二个方面，本发明涉及经分离的靶向递送标记物体系，其包含CD45+白细胞，优选地能够被一种或更多种标记物、优选放射性标记物或其结合物和组合标记。本发明第二个方面的优选实施方案是细胞直接连接标记物或用标记物标记。标记物可以在所述细胞内或其表面上，优选在细胞表面上。
以下优选实施方案在每种情况下进一步详细说明了本发明的第一个方面和第二个方面。
给定CD45+白细胞或细胞群内化铁结合蛋白的能力取决于在这种内化过程中涉及的受体的表达。导致铁蛋白内化的受体包括例如TfR、CXCR4、CD163和TIM-2。技术人员非常清楚如何测量铁结合蛋白的摄取量，并且在以下的实施例部分中描述了测量摄取的优选方法。本发明人还注意到，CD45+白细胞的亚群具有相对一种铁结合蛋白内化另一种铁结合蛋白的一定倾向，因此可以获得更高的复合物浓度和/或显示细胞中复合物的较少渗出。下面更详细地描述了这种CD45+白细胞亚群。
在本发明的情况下，使用的短语“一种或更多种铁结合蛋白和标记物的复合物”指其中一种或更多种标记物分子共价或非共价地结合到一种或更多种铁结合蛋白的组合物。一种或更多种铁结合蛋白与一种或更多种标记物之间的共价或非共价结合可以是直接或间接的。在后一种情况下，标记物通过连接子或间隔物与铁结合蛋白连接。连接子或间隔物是技术人员已知的，例如聚丙氨酸、聚甘氨酸、碳水化合物、(CH2)n基团或连接多肽。因此，技术人员将能够根据相应的应用来选择相应合适的连接子或间隔物。如果铁结合蛋白形成笼例如铁蛋白，则术语“复合物”还包括在笼中标记物的外壳(enclosure)，即使在蛋白质和活性化合物之间不存在共价或非共价键。当细胞内化铁结合蛋白时，复合物的形成使得标记物运输到细胞中。因此，优选标记物以不干扰运输机制的方式与铁结合蛋白结合。这可以通过技术人员使用本领域已知的吸收试验容易地测试，并在下面的实施例部分中描述。优选复合物足够稳定以至体内目标区域的细胞中的运输中保留下来。因此，优选递送复合物而不是单独的标记物至目标区域中的细胞或细胞中。这种性质也减少了标记物对CD45+白细胞的可能有害作用，例如细胞毒性。如果标记物与铁结合蛋白共价偶联，则这种偶联优选通过已知位于表面区域的氨基酸残基，其不涉及与细胞摄取铁结合蛋白所需的细胞受体结合。在本发明的情况下使用的铁结合蛋白可以与多种标记物形成稳定的非共价结合的复合物。
CD45+白细胞源于待治疗的患者，在这种情况下，负载复合物的细胞与患者自体同源的。还预期在用本发明的靶向递送治疗前，患者是MHC类型的，并且用于给定患者的白细胞类型是与患者匹配的MHC。在这两个优选的实施方案中，CD45+白细胞是原代细胞或通过少量分化步骤由原代细胞产生的。或者，CD45+白细胞可以是来自永生化的但优选未转化的CD45+白细胞细胞系。因此，用于CD45+白细胞优选巨噬细胞分离的血液是优选地从待治疗的患者或健康供体获得的。或者，可以从血库获得血液。本文也考虑使用脐带血。
本发明人注意到可由CD34+造血前体细胞产生的CD45+白细胞亚群特别适于标记物的靶向特异性递送。因此，优选用于产生靶向递送体系的白细胞由CD34+造血前体细胞产生。技术人员非常清楚如何选择CD34+造血前体细胞以及如何将这些细胞分化为白细胞。
优选地，CD45+白细胞选自单核细胞、分化的单核细胞、淋巴细胞和粒细胞。这些一般类别的白细胞中优选的亚群体在下文中通过结构参数限定，例如，给定蛋白质的存在或不存在、功能性质和/或其产生/分化的方法。如上文概述的，如果细胞群中并非每个细胞具有特定的性质，只要该群体中大多数细胞具有该性质，则本发明的靶向递送体系仍会提供上文概述的优点。因此，在下文中描述了本发明的靶向递送体系的一种优选细胞的性质。技术人员会领会，本发明的药物组合物将包含数百万个细胞，该群内并非每个细胞具有本文概述的功能性质和/或结构性质，但是如果大多数细胞具有相应的功能性质和/或结构性质，则所述药物组合物仍可以用于治疗疾病。
本发明人已经意识到CD45+白细胞的亚群具有特别有利的性质，尤其包括总体上复合物摄取的效率和/或量，将复合物保留在细胞内的能力，即避免标记物的渗出和靶向释放，摄取特定铁结合蛋白和/或靶向特定组织或细胞的效率，从而适于治疗或改善特定的疾病。本发明人已经观察到例如CD45+白细胞，其表达以下抗原中的一种或更多种：CD204、CD206、CD200R、CCR2，相比摄取其他铁结合蛋白，其优先摄取铁蛋白。因此，如果复合物中的铁结合蛋白是铁蛋白，则优选选择表达以下抗原中的一种或更多种的CD45+白细胞：CD204、CD206、CD200R、CCR2。因此，在本发明的优选实施方案中
(i)单核细胞是CD11b+单核细胞，优选地选自CD11b+CD14+单核细胞、CD11b+CD16+单核细胞、CD11b+CD14+CD16+单核细胞、CD11b+CD14+MHCII+单核细胞、CD11b+CD14+CD115+单核细胞、CD11b+CD114+单核细胞、CD11b+CD116+单核细胞、CD11b+CCR1+单核细胞、CD11b+CCR2+单核细胞、CD11b+CX3CR+单核细胞、CD11b+CXR4+单核细胞、CD11b+CXR6+单核细胞和CD11b+CD14+CD33+单核细胞；
(ii)分化的单核细胞选自巨噬细胞、活化的巨噬细胞，优选CD11b+巨噬细胞，更优选CD11b+CD16+巨噬细胞、CD11b+CD32+巨噬细胞、CD11b+CD64+巨噬细胞、CD11b+CD68+巨噬细胞，优选CD11b+CD86+M1巨噬细胞，其优选地产生诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)和/或分泌白介素12(IL-12)，或优选CD11b+CCR2+M2巨噬细胞、CD11b+CD204+M2巨噬细胞、CD11b+CD206+M2巨噬细胞、CD11b+CD204+CD206+M2巨噬细胞、CD11b+主要组织相容性复合物II+(MHCII+)(低表达或高表达)M2巨噬细胞、CD11b+CD200R+M2巨噬细胞、CD11b+CD163+M2巨噬细胞或产生和/或分泌精氨酸酶-1和/或白介素10(IL-10)的活化的巨噬细胞；或树突细胞，其优选地具有CD11b CD11c、CD11b CD80、CD11c CD80、CD11c CD86、CD11c MHCII和CD11c CD123的表达，优选分化的单核细胞不是表达凝集素样氧化低密度脂蛋白受体-1(Lox1+)、C-X-C趋化因子受体7型(CXCR7+)和核因子(红细胞衍生2)-样2(NRF2+)的泡沫细胞。泡沫细胞是一种巨噬细胞，其聚集在血管壁上的脂肪沉积物上，在血管壁上它们吸收低密度脂蛋白并且变为负载脂质，这使它们具有泡沫状外观。这些细胞分泌参与斑块生长的各种物质，且它们的死亡促进炎症，从而导致心血管疾病；
(iii)表达至少一种趋化因子受体或至少一种生长因子受体的单核细胞或活化的单核细胞，所述趋化因子优选地选自CCR1、CCR2、CXR4和CXR6，生长因子受体优选地选自巨噬细胞集落刺激因子受体(CD115)、粒细胞集落刺激因子受体(CD114)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体(由CD116和CD131构成)的；具有这些特征的单核细胞特别适合于治疗炎症性病症和癌症；
(iv)淋巴细胞选自CD3+和CD4+或CD8+T淋巴细胞或CD19+、CD20+、CD21+、CD19+CD20+、CD19+CD21+、CD20+CD21+或CD19+CD20+CD21+B淋巴细胞；或
(v)粒细胞选自嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞，所述嗜中性粒细胞优选CD66b+嗜中性粒细胞，所述嗜酸性粒细胞优选CD193+嗜酸性粒细胞。
在本发明的靶向递送体系的优选实施方案中，活化的巨噬细胞：
(i)能够通过单核细胞或巨噬细胞或其前体与能够改变巨噬细胞上表达标志物的因子的体外培养产生，优选地
(a)与至少一种M1诱导物的体外培养产生，
(b)与至少一种M2诱导物的体外培养产生，
(c)或与能够改变巨噬细胞分泌细胞因子优选IL-10和IL-12、趋化因子和/或产生iNOS、精氨酸酶或其他免疫调节酶能力的因子的体外培养产生；这些因子的实例是：活化的血小板、IL-4、IL-10、IL-13、抗原和抗体的免疫复合物、IgG、热活化的γ球蛋白、糖皮质激素、肿瘤生长因子-β(TGF-β)、IL-1R、CC-趋化因子配体2(CCL-2)、IL-6、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、过氧化物酶体增殖物活化受体γ(PPARγ)激动剂、白细胞抑制因子(LIF)、腺苷、蠕虫和真菌感染、脂多糖(LPS)、干扰素γ(IFN-γ)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和病毒感染和细菌感染；在这方面，观察到用M1诱导物活化单核细胞的，特别是LPS会引起细胞表达iNOS，用M1诱导物活化单核细胞，特别是LPS会引起细胞不表达精氨酸酶-1，用M2诱导物活化单核细胞，特别是IL-4会引起细胞表达精氨酸酶-1，用M2诱导物活化单核细胞，特别是IL-4会引起细胞不表达iNOS，
(ii)特征在于抗原CD64、CD86、CD16、CD32中的至少一种的表达、MHCII的高表达，和/或iNOS和/或IL-12的产生；
(iii)能够通过单核细胞或巨噬细胞与能够诱导巨噬细胞吞噬能力的因子的体外培养产生，所述因子例如IL-18、调理素(例如补体衍生的蛋白质，例如iC3b、免疫球蛋白G)、降钙素基因相关肽(CGRP)、脂多糖(LPS)、干扰素γ(IFN-γ)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、病毒感染和/或细菌感染；
(iv)特征在于抗原CD204、CD206、CD200R中的至少一种、CCR2、转铁蛋白受体(TfR)、CXC模序趋化因子受体4(CXCR4)、CD163和/或T细胞免疫球蛋白结构域和黏蛋白结构域2(TIM-2)的表达，和/或显示MHCII的低表达；具有这些性质的活化的巨噬细胞特别适合包含作为铁结合蛋白的铁蛋白的复合物；
(v)具有吞噬能力；和/或
(vi)能够分泌细胞因子或产生诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)(或其他促炎性化合物)、精氨酸酶或其他抑制免疫力/抗炎性化合物，所述细胞因子优选IL-12或IL-10。
在本发明的靶向递送体系的优选实施方案中，用于将巨噬细胞分化为M1巨噬细胞的M1诱导物选自：脂多糖(LPS)、干扰素γ(IFN-γ)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和病毒感染和细菌感染，用于将巨噬细胞分化为M2巨噬细胞的M2诱导物选自：IL-4、IL-10、IL-13、抗原和抗体的免疫复合物、IgG、热活化的γ球蛋白、糖皮质激素、肿瘤生长因子-β(TGF-β)、IL-1R、CC-趋化因子配体2(CCL-2)、IL-6、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、过氧化物酶体增殖物活化受体γ(PPARγ)激动剂、白细胞抑制因子(LIF)、腺苷、蠕虫和真菌感染。
本发明人出人意料地发现，负载M1巨噬细胞和M2巨噬细胞的复合物均适用于将活性剂靶向递送至缺氧组织，优选肿瘤或其转移瘤。一般而言，观察到3％至5％的施用的M1巨噬细胞集中在肿瘤部位，而约35％的M2巨噬细胞显示肿瘤特异性靶向。然而，当使用包含血红蛋白和标记物的复合物时，M2巨噬细胞的这种一般优势被抵消，因为相当大的量的该复合物可以被负载到M1巨噬细胞中而非M2巨噬细胞中。通常这种特异性向性使得M2巨噬细胞更适合于治疗肿瘤和以缺氧组织为特征的疾病。
在本发明的靶向递送体系的优选实施方案中，单核细胞：
(i)能够由CD34+造血前体细胞产生；
(ii)能够通过单核细胞与至少一种诱导物、优选M1或M2诱导物、更优选至少一种M2诱导物的体外培养产生；
(iii)特征在于以下抗原中的至少一种的表达：TfR、CD163、TIM-2、CD14、CD16、CD33和/或CD115；
(iv)特征在于以下抗原中的至少一种的表达：TfR、CD163、TIM-2、CXCR4、CD14和/或CD16；和/或
(v)具有吞噬能力。
在本发明的靶向递送体系的该实施方案中，用于分化单核细胞的M1诱导物选自LPS、IFN-γ、GM-CSF或病毒感染或细菌感染，或用于分化单核细胞的M2诱导物选自IL-4、IL-10、IL-13、抗原和抗体的免疫复合物、IgG、热活化的γ球蛋白、糖皮质激素、TGF-β、IL-1R、CCL-2、IL-6、M-CSF、PPARγ激动剂、白细胞抑制因子(LIF)、癌症条件培养基、癌细胞、腺苷和蠕虫或真菌感染。
本发明人出人意料地发现，单核细胞适用于将活性剂靶向递送至缺氧组织中，优选肿瘤或其转移瘤中，而用M2活化剂处理的单核细胞更适合于将活性剂靶向递送至缺氧组织中，优选肿瘤或其转移瘤中。这种特异性向性使得用M2活化剂处理的单核细胞更适合于靶向肿瘤和缺氧部位。
在本发明的靶向递送体系的优选实施方案中，淋巴细胞：
(i)能够从血液、脾脏或骨髓中获得，或能够由CD34+前体细胞产生，如技术人员已知的，并在例如Lefort和Kim，2010，J Vis Exp 40：2017；Tassone和Fidler，2012，Methodsin Molecular Biology 882：351-357；Kouro等人，2005，Current Protocols inImmunology，66：F22F.1：22F.1.1-22F.1.9中描述的；
(ii)是免疫活性淋巴细胞；
(iii)表达抗原特异性T细胞受体；和/或
(iv)特征在于以下抗原中的至少一种的表达：(a)CD3和CD4或CD8，或(b)：CD19、CD20、CD21、CD19 CD20、CD19 CD21、CD20 CD21或CD19 CD20 CD21抗原，并优选地能够产生免疫球蛋白。
在本发明的靶向递送体系的优选实施方案中，粒细胞：
(i)能够由血液、脾脏或骨髓获得，或能够由CD34+前体细胞产生，如在例如Kuhs等人，2015，Curr Protoc Immunol 111：7.23-1-7.23.16；Coquery等人，2012，Cytometry A81(9)：806-814；Swemydas和Lionakis 2013，J Vis Exp 77：50586中描述的；
(ii)特征在于以下CD66b和/或CD193中的至少一种的表达；
(iii)是分叶核白细胞，其特征在于其细胞质中存在颗粒；和/或
(iii)特征在于以下物质中的至少一种的表达：TfR、CD163、TIM-2和/或CXCR4。
在本发明的靶向递送体系的优选实施方案中，铁结合蛋白选自铁蛋白，优选重(H)铁蛋白、轻(L)铁蛋白和/或线粒体铁蛋白；血红蛋白，优选血红蛋白A、血红蛋白AS、血红蛋白SC、血红蛋白C、血红蛋白D、血红蛋白E、血红蛋白F、血红蛋白H；血红蛋白-触珠蛋白复合物、血色素结合蛋白、转铁蛋白；和乳铁蛋白。术语铁蛋白；血红蛋白，优选血红蛋白A、血红蛋白AS、血红蛋白SC、血红蛋白C、血红蛋白D、血红蛋白E、血红蛋白F、血红蛋白H；血红蛋白-触珠蛋白复合物、血色素结合蛋白、转铁蛋白；和乳铁蛋白包含天然存在的蛋白质的结构变体，因此涉及具有相应野生型蛋白质结合铁离子的能力的至少70％、优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少100％的蛋白质。用于本发明情况下的铁结合蛋白优选为来源于哺乳动物，更优选来源于小鼠、来源于大鼠、来源于狗、来源于猿，特别是来源于黑猩猩或人，最优选来源于人。下图1中显示了在本发明的情况下使用的优选的铁结合蛋白的共有序列。优选的结构变体基于图1中所示的序列。用X标记的残基在不同的哺乳动物铁蛋白、转铁蛋白和血红蛋白中变化。这些残基的改变对于蛋白质结合铁离子的能力不是至关重要的。因此，优选氨基酸突变或缺失影响用X标记的残基中的一个或更多个。
血浆蛋白一直是癌症治疗中活性药物成分递送的专用载体。因此，作为最充裕的血浆蛋白，白蛋白目前用于紫杉烷分子和阿霉素衍生物递送的治疗方案中(Larsen MT等人，2016，Mol Cell Ther 27；4：3)。
人转铁蛋白和铁蛋白已经被认为是递送小分子至特异性靶向癌细胞的有效载体。迄今为止，尽管付出了相当大的努力，然而还没有转铁蛋白或铁蛋白复合物成功地用于临床(Luck AN等人，2013，Adv Drug Deliv Rev 65(8)：1012-9)。
铁蛋白具有笼结构和结合铁的能力，其可以用于将标记物包封在其腔内。铁蛋白在血浆中不充裕，但是其可以作为常见的蛋白质表达载体如大肠杆菌(Escherichia coli)细胞中的重组蛋白以高产率容易地产生。铁蛋白H链或L链编码为小分子蛋白质(H链和L链分别为21kDa和19kDa)，能够将24聚体组装为笼状结构，限定直径为8nm的腔。本发明人注意到在进行本发明的情况下，H-铁蛋白均聚物代表优选的蛋白质构建体，以特异性地递送包封的药物至表达TfR的CD45+白细胞。此外，H-铁蛋白将复合的标记物靶向至细胞核(从而直接递送DNA结合蛋白到细胞核中)。
纯化的转铁蛋白可以通过在细胞内被适当释放的共价连接子有效地与各种分子结合(Beyer U等人，1998，J Med Chem 41(15)：2701-2708)。在转铁蛋白的情况下，只有蛋白质表面上的赖氨酸基团可以用于共价连接。
由于血红蛋白与多种分子化学结合的多功能性、在血液中大量和相对稳定性，其在过去被认为是载体(Somatogen，1993，WO1993008842 A1)。但是，受体靶向性质的缺乏没有促进除血液替代物或抗镰状化剂外的生物医学应用。事实上，Hb只可以被白细胞上的CD163(触珠蛋白/血红蛋白受体)表位识别、特别是被来源于单核细胞-巨噬细胞上的CD163表位识别。本申请中描述的基于CD45+白细胞的蛋白递送、特别是基于巨噬细胞的蛋白递送，使血红蛋白中心部分作为靶标特异性标记物载体而移动。通过交换血红素游离荧光卟啉或与放射性标记物偶联的卟啉或甚至运输连接至血红素铁的与标记物结合的小分子，血红蛋白可以容易地共价连接至合适的标记物、在血红素结合袋中容纳疏水性标记物分子。通过将适当的标记结合物选择性连接至β93半胱氨酸残基可以容易地修饰Hb，所述β93半胱氨酸残基是蛋白质表面上唯一可滴定的半胱氨酸。马来酰亚胺官能化的标记物是可以容易且特异性附着于相关的半胱氨酸β93残基的标记物的实例。或者，Hb表面上的赖氨酸残基(每个Hb四聚体至少10个可滴定的赖氨酸残基)可以容易地通过可裂解的琥珀酰亚胺连接子进行标记物结合。血红蛋白还提供了在酸性pH值下释放非共价结合的血红素基团的独特能力。由此获得的Apo-血红蛋白能够在空的血红素袋内容纳具有显著荧光性质的几种疏水性分子(例如，氯e6、hyperycin、酞菁衍生物)(Dong J等人，J Photochem Photobiol B2014，140：163-172)。
不管轭合/吸附/结合方法如何，一旦血红蛋白(Hb)、转铁蛋白(Tf)和铁蛋白负载到具有肿瘤靶向性质的合适细胞体系中，例如活化的巨噬细胞中，则本发明显示它们是专门的标记物载体。这些蛋白质的简单、快速、便宜和安全的纯化步骤还提供了巨大的附加值。
基于哺乳动物H型铁蛋白、L型铁蛋白、血红蛋白α链、血红蛋白β链和转铁蛋白的序列，对这些蛋白质中的每一种确定共有序列。这些显示在图1中(分别为SEQ ID NO：2、SEQID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：25)。在此基础上，以及在现有技术中公开的缺失和结构分析的基础上，确定H型铁蛋白、L型铁蛋白、血红蛋白α链和血红蛋白β链足以被CD45+白细胞吸收的最小片段。这些示于SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5中(H型铁蛋白)；SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12(L型铁蛋白)，SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：17(血红蛋白α链)和SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：21(血红蛋白β链)。如果包含在一个多肽中且位于间隔的100至450个氨基酸之间，优选间隔的150至400个氨基酸之间，更优选间隔的200至350个氨基酸之间，更优选间隔的250至320个氨基酸之间，则转铁蛋白包含位于N端的结构域和位于C端的结构域，其对于结合铁和被CD45+白细胞吸收是必需的。N端结构域包含全长共有转铁蛋白(SEQ ID NO：25)或全长人转铁蛋白(SEQ ID NO：28)的氨基酸1至82。C端结构域包含全长共有转铁蛋白(SEQ ID NO：25)或全长人转铁蛋白(SEQ ID NO：28)的氨基酸396至510。在每种情况下，在共有序列中显示的X，其独立地代表任何氨基酸，并且表征在哺乳动物H型铁蛋白中不保留或仅不良地保留的氨基酸，其可以在没有或几乎不损害相应铁结合蛋白的铁结合性质的情况下突变。优选X在每种情况下都具有与X比对的相应人铁结合蛋白的氨基酸的含义。该信息可以例如由图1获得，其显示人蛋白的共有序列比对，以及在一些情况下，小鼠蛋白的共有序列比对。
优选的H型铁蛋白包含SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列及其变体或由SEQ IDNO：1中所示的氨基酸序列及其变体构成，所述变体具有至少70％的氨基酸一致性，更优选至少75％的氨基酸一致性，更优选至少80％的氨基酸一致性，更优选至少85％的氨基酸一致性，更优选至少90％的氨基酸一致性，更优选至少95％的氨基酸一致性，并且在每种情况下，所述变体具有由根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列构成的H型铁蛋白被CD45+白细胞优选M2白细胞摄取的能力的至少70％。在SEQ ID NO：1中，在第5号位处的X可以存在或不存在，如果存在的话，其表示任何氨基酸，优选Ile，在第6号位处的X表示任何氨基酸，优选Asn，在第14号位处的X表示任何氨基酸，优选Tyr，在第24号位处的X表示任何氨基酸，优选Tyr或Cys，在第66号位处的X表示任何氨基酸，优选Phe，在第68号位处的X表示任何氨基酸，优选Gln，在第75号位处的X表示任何氨基酸，优选Arg或Cys，在第90号位处的X表示任何氨基酸，优选His，在第94号位处的X表示任何氨基酸，优选Ser或Asn，在第120号位处的X可以存在或不存在，如果存在的话，其表示任何氨基酸，优选His或Tyr，更优选His，在第123号位处的X表示任何氨基酸，优选Asn或Ser，更优选Asn，在第128号位处的X表示任何氨基酸，优选Ala或Ser，更优选Ala。
在优选的实施方案中，H型铁蛋白包含根据SEQ ID NO：3的鼠科动物铁蛋白或由其构成。因此，优选的结构变体具有至少70％的氨基酸一致性，更优选至少75％的氨基酸一致性，更优选至少80％的氨基酸一致性，更优选至少85％的氨基酸一致性，更优选至少90％的氨基酸一致性，更优选至少95％的氨基酸一致性，并且在每种情况下，其具有由根据SEQ IDNO：3的氨基酸序列构成的H型铁蛋白被CD45+白细胞优选M2巨噬细胞摄取的能力的至少70％。
在优选的实施方案中，H型铁蛋白包含根据SEQ ID NO：5的人铁蛋白或由其构成。因此，优选的结构变体具有至少70％的氨基酸一致性，更优选至少75％的氨基酸一致性，更优选至少80％的氨基酸一致性，更优选至少85％的氨基酸一致性，更优选至少90％的氨基酸一致性，更优选至少95％的氨基酸一致性，并且在每种情况下，其具有由根据SEQ ID NO：5的氨基酸序列构成的H型铁蛋白被CD45+白细胞优选M2巨噬细胞摄取的能力的至少70％。
在优选的实施方案中，H型铁蛋白包含由比对根据SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：7、优选SEQ ID NO：2的全长H型铁蛋白得到的哺乳动物共有序列或由其构成。因此，优选的结构变体具有至少70％的氨基酸一致性，更优选至少75％的氨基酸一致性，更优选至少80％的氨基酸一致性，更优选至少85％的氨基酸一致性，更优选至少90％的氨基酸一致性，更优选至少95％的氨基酸一致性，并且在每种情况下，具有由根据SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：7、优选SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的H型铁蛋白被CD45+白细胞优选M2巨噬细胞摄取的能力的至少70％。在SEQ ID NO：2中，在第6号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Pro，在第14号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选His，在第16号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Asp，在第21号位处的X可以存在或不存在，如果存在的话，其表示任何氨基酸，优选Ile，在第22号位处的X表示任何氨基酸，优选Asn，在第30号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Tyr，在第40号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Tyr或Cys，更优选Tyr，在第82号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Phe，在第84号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Gln，在第91号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Arg或Cys，更优选Cys，在第106号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选His，在第110号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Asn或Ser，更优选Asn，在第137号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选His或Tyr，更优选His，在第140号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Asn或Ser，更优选Asn，在第145号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Ala或Ser，更优选Ala，在第164号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Ala或Ser，更优选Ser，在第166号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Met或Leu，优选Leu，在第178号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Asp或His，更优选Asp，在第181号位处的X不存在或是任何天然存在的氨基酸，优选Asn，在第182号位处的X不存在或是任何天然存在的氨基酸，优选Glu，在第183号位处的X不存在或是任何天然存在的氨基酸，优选Ser。在SEQ ID NO：7中，在第6号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Pro，在第14号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选His，在第16号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Asp，在第21号位处的X可以存在或不存在，如果存在的化，其表示任何氨基酸，优选Ile，在第29号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Tyr，在第81号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Phe，在第83号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Gln，在第105号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选His，在第144号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Ala或Ser，更优选Ala，在第180号位处的X不存在或是任何天然存在的氨基酸，优选Asn，在第181号位处的X不存在或是任何天然存在的氨基酸，优选Glu，在第182号位处的X不存在或是任何天然存在的氨基酸，优选Ser。
在优选的实施方案中，H型铁蛋白包含根据优选的SEQ ID NO：4的鼠科动物全长铁蛋白或由其构成。因此，优选的结构变体具有至少70％的氨基酸一致性，更优选至少75％的氨基酸一致性，更优选至少80％的氨基酸一致性，更优选至少85％的氨基酸一致性，更优选至少90％的氨基酸一致性，更优选至少95％的氨基酸一致性，并且在每种情况下，其具有由根据SEQ ID NO：4的氨基酸序列构成的鼠科动物H型铁蛋白被CD45+白细胞优选M2巨噬细胞摄取的能力的至少70％。
在优选的实施方案中，H型铁蛋白包含根据优选的SEQ ID NO：6的人全长铁蛋白或由其构成。因此，优选的结构变体具有至少70％的氨基酸一致性，更优选至少75％的氨基酸一致性，更优选至少80％的氨基酸一致性，更优选至少85％的氨基酸一致性，更优选至少90％的氨基酸一致性，更优选至少95％的氨基酸一致性，并且在每种情况下，其具有由根据SEQ ID NO：6的氨基酸序列构成的人H型铁蛋白被CD45+白细胞优选M2巨噬细胞摄取的能力的至少70％。
优选的L型铁蛋白包含SEQ ID NO：8中显示的氨基酸序列及其变体或由SEQ IDNO：8中显示的氨基酸序列及其变体构成，所述变体具有至少70％的氨基酸一致性，更优选至少75％的氨基酸一致性，更优选至少80％的氨基酸一致性，更优选至少85％的氨基酸一致性，更优选至少90％的氨基酸一致性，更优选至少95％的氨基酸一致性，并且在每种情况下，其具有由根据SEQ ID NO：8的氨基酸序列构成的L型铁蛋白被CD45+白细胞优选M2巨噬细胞摄取的能力的至少70％。在SEQ ID NO：8中，在第5号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Asp或Glu，更优选Asp，在第12号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Arg或Ser，更优选Ser，在第17号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Ser或Arg，更优选Ser，在第19号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Arg或Gln，更优选Gln，在第29号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Phe，在第30号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Tyr或Phe，更优选Tyr，在第42号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Ser或Gly，更优选Ser，在第56号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Ala或Tyr，更优选Tyr，在第61号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Glu或Lys，更优选Lys，在第62号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Met或Phe，更优选Met，在第65号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Asp或Gln，更优选Gln，在第75号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Ile或Val，更优选Ile，在第76号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Lys或Gln，更优选Lys，在第79号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Ala或Ser，更优选Ala，在第80号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Glu或Gln，更优选Gln，在第87号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Pro或Gln，更优选Pro，在第88号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Glu或Asp，更优选Asp，在第91号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Glu或Lys，更优选Lys，在第94号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Met或Leu，更优选Leu，在第96号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Met或Leu，更优选Met，在第99号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Lys或Asn，更优选Lys，在第115号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Thr或Ala，更优选Thr，在第119号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Leu，在第125号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Ser或Thr，更优选Thr，在第127号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Tyr或Phe，更优选Phe，在第130号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Lys或Glu，更优选Glu，在第140号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Asp或Asn，更优选Asp，在第146号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Arg或His，更优选His，在第148号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Leu或Val，更优选Leu。
在优选的实施方案中，L型铁蛋白包含根据SEQ ID NO：10的鼠科动物L型铁蛋白或由其构成。因此，优选的结构变体具有至少70％的氨基酸一致性，更优选至少75％的氨基酸一致性，更优选至少80％的氨基酸一致性，更优选至少85％的氨基酸一致性，更优选至少90％的氨基酸一致性，更优选至少95％的氨基酸一致性，并且在每种情况下，其具有由根据SEQ ID NO：10的氨基酸序列构成的L型铁蛋白被CD45+白细胞优选M2巨噬细胞摄取的能力的至少70％。
在优选的实施方案中，L型铁蛋白包含根据SEQ ID NO：12的人铁蛋白或由其构成。因此，优选的结构变体具有至少70％的氨基酸一致性，更优选至少75％的氨基酸一致性，更优选至少80％的氨基酸一致性，更优选至少85％的氨基酸一致性，更优选至少90％的氨基酸一致性，更优选至少95％的氨基酸一致性，并且在每种情况下，其具有由根据SEQ ID NO：12的氨基酸序列构成的L型铁蛋白被CD45+白细胞优选M2巨噬细胞摄取的能力的至少70％。
在优选的实施方案中，L型铁蛋白包含由比对根据SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：14、优选SEQ ID NO：9的全长H型铁蛋白得到的哺乳动物共有序列或由其构成。因此，优选的结构变体具有至少70％的氨基酸一致性，更优选至少75％的氨基酸一致性，更优选至少80％的氨基酸一致性，更优选至少85％的氨基酸一致性，更优选至少90％的氨基酸一致性，更优选至少95％的氨基酸一致性，并且在每种情况下，其具有由根据SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：14、优选SEQ ID NO：9的氨基酸序列构成的L型铁蛋白被CD45+白细胞优选M2巨噬细胞摄取的能力的至少70％。在SEQ ID NO：9中，在第12号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Asp或Glu，更优选Asp，在第19号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Ser或Arg，更优选Ser，在第24号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Ser或Arg，更优选Ser，在第26号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Arg或Gln，更优选Gln，在第36号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Phe，在第37号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Tyr或Phe，更优选Tyr，在第47号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Ser或Gly，更优选Ser，在第63号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Ala或Tyr，更优选Tyr，在第68号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Glu或Lys，更优选Lys，在第69号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Met或Phe，更优选Met，在第72号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Asp或Gln，更优选Gln，在第82号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Ile或Val，更优选Ile，在第83号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Lys或Gln，更优选Lys，在第86号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Ala或Ser，更优选Ala，在第87号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Glu或Gln，更优选Gln，在第94号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Pro或Gln，更优选Pro，在第95号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Glu或Asp，更优选Asp，在第98号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Glu或Lys，更优选Lys，在第101号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Met或Leu，更优选Leu，在第103号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Met或Leu，更优选Met，在第106号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Lys或Asn，更优选Lys，X可以是任何天然存在的氨基酸，在第126号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Leu，在第132号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Ser或Thr，更优选Thr，在第134号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Tyr或Phe，更优选Phe，在第137号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Lys或Glu，更优选Glu，在第147号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Asp或Asn，更优选Asp，在第153号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Arg或His，更优选His，在第155号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Leu或Val，更优选Leu，在第161号位处的X可以不存在或是任何天然存在的氨基酸，优选Ala，在第163号位处的X可以不存在或是任何天然存在的氨基酸，优选Thr，在第166号位处的X可以不存在或是任何天然存在的氨基酸，优选Pro，在第168号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Gly或Ala，更优选Ala。在SEQ ID NO：14中，在第36号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Phe，在第37号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Tyr或Phe，更优选Tyr，在第94号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Pro或Gln，更优选Pro，在第126号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Leu，在第137号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Lys或Glu，更优选Glu，在第147号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Asp或Asn，更优选Asp，X可以是任何天然存在的氨基酸，在第163号位处的X可以不存在或是任何天然存在的氨基酸，优选Thr，在第166号位处的X可以不存在或是任何天然存在的氨基酸，优选Pro，在第168号位处的X可以是任何天然存在的氨基酸，优选Gly或Ala，更优选Ala。
在优选的实施方案中，L型铁蛋白包含根据优选的SEQ ID NO：11的鼠科动物全长铁蛋白或由其构成。因此，优选的结构变体具有至少70％的氨基酸一致性，更优选至少75％的氨基酸一致性，更优选至少80％的氨基酸一致性，更优选至少85％的氨基酸一致性，更优选至少90％的氨基酸一致性，更优选至少95％的氨基酸一致性，并且在每种情况下，其具有由根据SEQ ID NO：11的氨基酸序列构成的鼠科L型铁蛋白被CD45+白细胞优选M2巨噬细胞摄取的能力的至少70％。
在优选的实施方案中，L型铁蛋白包含根据优选的SEQ ID NO：13的人全长铁蛋白或由其构成。因此，优选的结构变体具有至少70％的氨基酸一致性，更优选至少75％的氨基酸一致性，更优选至少80％的氨基酸一致性，更优选至少85％的氨基酸一致性，更优选至少90％的氨基酸一致性，更优选至少95％的氨基酸一致性，并且在每种情况下，其具有由根据SEQ ID NO：13的氨基酸序列构成的人L型铁蛋白被CD45+白细胞优选M2巨噬细胞摄取的能力的至少70％。
在优选的实施方案中，α血红蛋白包含由比对根据SEQ ID NO：15的全长α血红蛋白获得的最小哺乳动物共有序列或由其构成。优选包含由SEQ ID NO：15中显示的氨基酸序列及其变体或由其组成，所述变体具有至少70％的氨基酸一致性，更优选至少75％的氨基酸一致性，更优选至少80％的氨基酸一致性，更优选至少85％的氨基酸一致性，更优选至少90％的氨基酸一致性，更优选至少95％的氨基酸一致性，并且在每种情况下，其具有由根据SEQ ID NO：15的氨基酸序列构成的α血红蛋白CD45+白细胞优选M1巨噬细胞摄取的能力的至少70％。
在优选的实施方案中，α血红蛋白包含由根据SEQ ID NO：17的人α血红蛋白获得的最小人氨基酸序列或由其构成。因此，优选的结构变体具有至少70％的氨基酸一致性，更优选至少75％的氨基酸一致性，更优选至少80％的氨基酸一致性，更优选至少85％的氨基酸一致性，更优选至少90％的氨基酸一致性，更优选至少95％的氨基酸一致性，并且在每种情况下，其具有由根据SEQ ID NO：17的氨基酸序列构成的α血红蛋白被CD45+白细胞优选M1巨噬细胞摄取的能力的至少70％。
在优选的实施方案中，α血红蛋白包含由比对根据SEQ ID NO：16的全长α血红蛋白获得的哺乳动物共有序列或由其构成。因此，优选的结构变体具有至少70％的氨基酸一致性，更优选至少75％的氨基酸一致性，更优选至少80％的氨基酸一致性，更优选至少85％的氨基酸一致性，更优选至少90％的氨基酸一致性，更优选至少95％的氨基酸一致性，并且在每种情况下，其具有由根据SEQ ID NO：16的氨基酸序列构成的α血红蛋白被CD45+白细胞优选M2巨噬细胞摄取的能力的至少70％。
在优选的实施方案中，α血红蛋白包含根据SEQ ID NO：18的人全长α血红蛋白或由其构成。因此，优选的结构变体具有至少70％的氨基酸一致性，更优选至少75％的氨基酸一致性，更优选至少80％的氨基酸一致性，更优选至少85％的氨基酸一致性，更优选至少90％的氨基酸一致性，更优选至少95％的氨基酸一致性，并且在每种情况下，其具有由根据SEQID NO：18的氨基酸序列构成的人全长α血红蛋白被CD45+白细胞优选M2巨噬细胞摄取的能力的至少70％。
在优选的实施方案中，α血红蛋白包含由比对根据SEQ ID NO：19的全长β血红蛋白获得的最小哺乳动物共有序列及其变体或由比对根据SEQ ID NO：19的全长β血红蛋白获得的最小哺乳动物共有序列及其变体构成，所述变体具有至少70％的氨基酸一致性，更优选至少75％的氨基酸一致性，更优选至少80％的氨基酸一致性，更优选至少85％的氨基酸一致性，更优选至少90％的氨基酸一致性，更优选至少95％的氨基酸一致性，并且在每种情况下，其具有由根据SEQ ID NO：19的氨基酸序列构成的β血红蛋白被CD45+白细胞优选M1巨噬细胞摄取的能力的至少70％。
在优选的实施方案中，α血红蛋白包含根据SEQ ID NO：21的人β血红蛋白获得的最小人氨基酸序列或由其构成。因此，优选的结构变体具有至少70％的氨基酸一致性，更优选至少75％的氨基酸一致性，更优选至少80％的氨基酸一致性，更优选至少85％的氨基酸一致性，更优选至少90％的氨基酸一致性，更优选至少95％的氨基酸一致性，并且在每种情况下，其具有由根据SEQ ID NO：21的氨基酸序列构成的β血红蛋白被CD45+白细胞优选M1巨噬细胞摄取的能力的至少70％。
在优选的实施方案中，β血红蛋白包含由比对根据SEQ ID NO：20的全长β血红蛋白获得的哺乳动物共有序列或由其构成。因此，优选的结构变体具有至少70％的氨基酸一致性，更优选至少75％的氨基酸一致性，更优选至少80％的氨基酸一致性，更优选至少85％的氨基酸一致性，更优选至少90％的氨基酸一致性，更优选至少95％的氨基酸一致性，并且在每种情况下，其具有由根据SEQ ID NO：20的氨基酸序列构成的β血红蛋白被CD45+白细胞优选M2巨噬细胞摄取的能力的至少70％。
在优选的实施方案中，β血红蛋白包含根据SEQ ID NO：22的人全长β血红蛋白或由其构成。因此，优选的结构变体具有至少70％的氨基酸一致性，更优选至少75％的氨基酸一致性，更优选至少80％的氨基酸一致性，更优选至少85％的氨基酸一致性，更优选至少90％的氨基酸一致性，更优选至少95％的氨基酸一致性，并且在每种情况下，其具有由根据SEQID NO：22的氨基酸序列构成的人全长β血红蛋白被CD45+白细胞优选M2巨噬细胞摄取的能力的至少70％。
在优选的实施方案中，转铁蛋白包含由比对根据SEQ ID NO：25的全长α血红蛋白获得的哺乳动物共有序列或由其构成。因此，特别优选的转铁蛋白包含SEQ ID NO：25中显示的氨基酸序列及其变体或由SEQ ID NO：25中显示的氨基酸序列及其变体构成，所述变体具有至少70％的氨基酸一致性，更优选至少75％的氨基酸一致性，更优选至少80％的氨基酸一致性，更优选至少85％的氨基酸一致性，更优选至少90％的氨基酸一致性，更优选至少95％的氨基酸一致性，并且在每种情况下，其具有由根据SEQ ID NO：25的氨基酸序列构成的转铁蛋白被CD45+白细胞优选M1巨噬细胞摄取的能力的至少70％。
在优选的实施方案中，转铁蛋白包含根据SEQ ID NO：28的人转铁蛋白或由其构成。因此，优选的结构变体具有至少70％的氨基酸一致性，更优选至少75％的氨基酸一致性，更优选至少80％的氨基酸一致性，更优选至少85％的氨基酸一致性，更优选至少90％的氨基酸一致性，更优选至少95％的氨基酸一致性，并且在每种情况下，其具有由根据SEQ IDNO：28的氨基酸序列构成的转铁蛋白被CD45+白细胞优选M1巨噬细胞摄取的能力的至少70％。
转铁蛋白的铁结合性质取决于位于N端和C端的结构域。因此，在优选的实施方案中，本发明中使用的转铁蛋白包含至少根据SEQ ID NO：23的N端结构域和根据SEQ ID NO：24的C端结构域。优选的转铁蛋白包括包含SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24中所示的氨基酸序列及其变体的蛋白质，所述变体具有至少70％的氨基酸一致性，更优选至少75％的氨基酸一致性，更优选至少80％的氨基酸一致性，更优选至少85％的氨基酸一致性，更优选至少90％的氨基酸一致性，更优选至少95％的氨基酸一致性，并且在每种情况下，其具有由根据SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24的氨基酸序列构成的转铁蛋白被CD45+白细胞优选M1巨噬细胞摄取的能力的至少70％。SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：24表示哺乳动物转铁蛋白的共有序列。
因此，在优选的实施方案中，本发明中使用的转铁蛋白包含至少根据SEQ ID NO：26的N端结构域和根据SEQ ID NO：27的C端结构域。优选的转铁蛋白包括包含SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27中所示的氨基酸序列及其变体的蛋白质，所述变体具有至少70％的氨基酸一致性，更优选至少75％的氨基酸一致性，更优选至少80％的氨基酸一致性，更优选至少85％的氨基酸一致性，更优选至少90％的氨基酸一致性，更优选至少95％的氨基酸一致性，并且在每种情况下，其具有由根据SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27的氨基酸序列构成的转铁蛋白被CD45+白细胞优选M1巨噬细胞摄取的能力的至少70％。
不考虑给定的氨基酸序列，优选的铁蛋白还包括以下蛋白质：其符合四螺旋束蛋白模块的24聚体亚单元组装体，落入通过基于3D结构的比对所限定的远亲蛋白的给定序列比对中。
本发明人出人意料地观察到，单核细胞、巨噬细胞和优选地M2巨噬细胞能够摄取标记物的量足以使其在积聚部位(例如在肿瘤或其转移瘤中，缺氧部位)使用成像方法可见。出人意料地，发明人发现淋巴细胞和M2巨噬细胞在摄取包含一种或更多种铁蛋白和一种或更多种标记物的复合物方面更好，M1巨噬细胞在摄取包含一种或更多种血红蛋白和一种或更多种标记物的复合物方面更好，巨噬细胞在摄取包含一种或更多种转铁蛋白和一种或更多种标记物的复合物方面更好。因此，基于CD45+白细胞：单核细胞、M1和M2巨噬细胞、粒细胞和淋巴细胞的组织和细胞向性，如果M2巨噬细胞、淋巴细胞或单核细胞的向性是期望的，则上述包含一种或更多种铁蛋白和一种或更多种标记物的复合物被用于负载M2巨噬细胞、淋巴细胞或单核细胞，如果M1巨噬细胞的向性是期望的，则包含一种或更多种血红蛋白和一种或更多种标记物的复合物被用于负载M1巨噬细胞。
在本发明靶向递送体系的优选实施方案中，标记物选自荧光染料、荧光发射同位素、放射性同位素、可检测的多肽或编码这种可检测的多肽的核酸和造影剂。
在本发明靶向递送体系的优选实施方案中，标记物包括与二价或三价金属阳离子形成复合物的螯合剂。
在本发明靶向递送体系的优选实施方案中，螯合剂选自1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N′，N，N′-四乙酸(DOTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、1，4，7-三氮杂环壬烷-1，4，7-三乙酸(NOTA)、三亚乙基四胺(TETA)、亚氨基二乙酸、二亚乙基三胺-N，N，N′，N′，N″-五乙酸(DTPA)和6-肼基吡啶-3-羧酸(HYNIC)。
在本发明靶向递送体系的优选实施方案中，造影剂包括顺磁剂，优选地选自Gd、Eu、W和Mn或铁氢化物(ferrihydride)。
在本发明靶向递送体系的优选实施方案中，放射性同位素/荧光发射同位素选自α辐射放射同位素、γ辐射放射同位素、俄歇电子放射同位素、X射线放射同位素、荧光发射同位素，例如18F、51Cr，荧光65Tb、67Ga、68Ga、111In、99mTc、140La、175Yb、153Sm、166Ho、88Y、90Y、149Pm、177Lu、47Sc、142Pr、159Gd、212Bi、72As、72Se、97Ru、109Pd、105Rh、101m15Rh、119Sb、128Ba、123I、124I、131I、197Hg、211At、169Eu、203Pb、212Pb、64Cu、89Zr、67Cu、188Re、186Re、198Au和199Ag，以及上述同位素与蛋白质、肽、小分子抑制剂、抗体或其他化合物的结合物和组合(例如18F-FDG或64Cu-卟啉)。
在本发明靶向递送体系的优选实施方案中，荧光染料选自以下类别的荧光染料：氧杂蒽、吖啶、嗪、青色素、苯乙烯基染料、香豆素、卟吩、金属配体络合物、荧光蛋白、纳米晶体、苝和酞菁以及这些类别染料的结合物和组合。
在本发明靶向递送体系的优选实施方案中，可检测的多肽是自发荧光蛋白，优选绿色荧光蛋白，或具有改变的吸收和/或发射光谱的其任意结构变体。
如上文已概述的，本发明的靶向递送体系具有递送标记物至缺氧区域的特别的适用性。
在本发明的经分离的靶向递送体系的优选实施方案中，包含在复合物中的铁结合蛋白和标记物之间的键是共价的和/或非共价的；和/或包含在复合物中的标记物被铁结合蛋白、优选被铁蛋白或其多聚体包埋/包封。在一个实施方案中，共价和/或非共价的偶联通过连接子或间隔物是间接的。如果期望形成共价键，则使用铁结合蛋白的相关巯基、氨基或羧基将标记物直接或间接地共价偶联至一种或更多种铁结合蛋白。还可以设想复合物中包含不同的标记物。例如，一类标记物可以与铁结合蛋白结合(非共价结合)，而另一类标记物被包封。该方法利用标记物从铁结合蛋白递送到目标组织和/或细胞后的不同释放速率。
在第三个方面，本发明涉及制备本发明的经分离的靶向递送体系的方法，其包括以下步骤：
a)提供如上定义的纯化的铁结合蛋白；
b)将标记物共价或非共价地连接至铁结合蛋白和/或在铁结合蛋白中包封标记物；
c)提供如上定义的CD45+白细胞；和
d1)在步骤b)中产生的铁结合蛋白和标记物的复合物的存在下培养CD45+白细胞，直到CD45+白细胞至少部分地、优选满载步骤b)中产生的铁结合蛋白和标记物的复合物，和/或
d2)在标记物的存在下培养CD45+白细胞直到CD45+白细胞至少部分地标记有标记物。
在另一个方面，本发明涉及经分离的靶向递送体系，其可根据本发明的第二个方面的方法产生。
蛋白质和标记物之间加合物的形成可以是与靶蛋白结合的非共价标记物，并且可以如下描述：在铁蛋白的情况下，通过利用铁蛋白大分子本身的缔合和解离性质，标记物通常可以被包封在内腔(物理封闭)中。标记物分子通过与腔内表面中的氨基酸残基的非共价相互作用适当保持。血红蛋白大分子还提供了选择的标记物分子的非共价结合的可能，所述药物分子可以被容纳在血红蛋白本身的血红素结合袋中。血红素可以被袋代替，和被具有适当疏水性的标记物代替。在另一方面，本发明中考虑的所有蛋白质可以共价地连接到被特异性活性连接子部分来修饰的标记物，所述特异性活性连接子部分对蛋白质本身的巯基或氨基具有反应性。同样地，铁蛋白或血红蛋白可以连接至带有基于肽的可裂解连接子(例如，组织蛋白酶敏感性缬氨酸-瓜氨酸序列和对氨基苄基氨基甲酸酯间隔物)的半胱氨酸巯基反应性标记物。基于肽的连接子以稳定的方式将蛋白质与标记物结合，因此标记物在生理条件下不容易从蛋白质中释放，有助于防止对健康细胞的毒性和渗出，确保标记的特异性。由此产生的蛋白质标记物加合物能够与所选择的受体类型连接，即分别为用于血红蛋白的CD163和用于铁蛋白或转铁蛋白的TfR。一旦结合，蛋白质标记物加合物通过内吞作用被内化，从而被靶细胞选择性地摄取。含有标记物的囊泡与溶酶体和溶酶体半胱氨酸蛋白酶融合，特别是组织蛋白酶B开始分解缬氨酸-瓜氨酸连接子，标记物不再与抗体结合并直接释放到肿瘤环境中。
或者，使用具有特异性结合赖氨酸残基的连接子的标记物，所述赖氨酸残基在反应中与铁蛋白、血红蛋白或转铁蛋白产生共价复合物。
在本发明的情况下使用的术语“满载”指与标记物复合的铁结合蛋白、优选铁蛋白的最大量，其可以被CD45+白细胞、优选巨噬细胞、更优选活化的巨噬细胞摄取。
在第四个方面，本发明涉及本发明第一个方面的经分离的靶向递送体系或根据本发明第二个方面的方法可以产生的经分离的靶向递送体系，其用作诊断试剂。
在第五个方面，本发明涉及诊断组合物，其包含本发明第一个方面的经分离的靶向递送体系或根据本发明第二个方面的方法可以产生的经分离的靶向递送体系和药学上可接受的载体和/或合适的赋形剂。因为经分离的靶向递送体系包含活细胞，优选选择保持细胞存活的载体和赋形剂。
“药学上可接受的”指被联邦或州政府的管理机构批准的或在美国药典或其他一般公认的用于动物、更特别用于人的药典中列举的。
如本文所使用的，术语“载体”指药理学上无活性的物质，例如但不限于稀释剂、赋形剂、表面活性剂、稳定剂、生理缓冲溶液或载剂，其与标记物一起施用。这种药物载体可以是液体或固体。液体载体包括但不限于无菌液体，例如水或油中的盐溶液，所述油包括但不限于石油来源、动物来源、植物来源或合成来源的那些，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。盐溶液和葡萄糖水溶液和甘油水溶液也可以被用作液体载体，特别是用于可注射溶液。当药物组合物通过静脉内施用时，盐溶液是优选的载体。合适的药物载体的实例在E.W.Martin的“Remington′s Pharmaceutical Sciences”中描述。
合适的药物“赋形剂”包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、胶质、麦芽、米饭、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂乳粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。
“表面活性剂”包括阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂和非离子表面活性剂，例如但不限于脱氧胆酸钠、十二烷基硫酸钠、Triton X-100和聚山梨醇酯，例如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯65和聚山梨醇酯80。
“稳定剂”包括但不限于甘露醇、蔗糖、海藻糖、白蛋白以及蛋白酶和/或核酸酶拮抗剂。
“生理缓冲溶液”包括但不限于氯化钠溶液、软化水以及合适的有机或无机缓冲溶液，例如但不限于磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、tris缓冲液(三羟甲基氨基甲烷)、HEPES缓冲液([4(2-羟乙基)哌嗪基]乙磺酸)或MOPS缓冲液(3-吗啉代-1-丙磺酸)。相应缓冲液的选择通常取决于所期望的缓冲液摩尔浓度。例如，磷酸盐缓冲液适用于注射溶液和输注溶液。
在第六个方面，本发明涉及本发明第一个方面的经分离的靶向递送体系或根据本发明第二个方面的方法可以产生的经分离的靶向递送体系，其用于诊断肿瘤、炎症性疾病或缺血性区域，所述肿瘤优选实体瘤和/或其转移瘤，优选乳腺癌、胰腺癌、膀胱癌、肺癌、结肠癌、或其转移瘤，或具有缺氧区域的肿瘤，所述缺血性区域特别是在皮肤伤口、其他伤口中或器官梗塞(心脏)或视网膜缺血后的缺血性区域。
根据本发明的靶向递送体系使得标记物、优选造影剂能够递送至肿瘤，所述标记物、优选造影剂通常不能到达肿瘤(例如，由于溶解度问题或缺少脉管系统)。它还能使标记物、优选造影剂递送到缺氧肿瘤或肿瘤的缺氧区域。该体系还提供了例如在缺血性事件期间或经历炎症过程中将造影剂递送至经受低氧条件的生物体中的任何区域。
如上所述，本发明还提供了将标记物靶向递送到肿瘤块中的方法。该方法包括制备CD45+白细胞，其能使巨噬细胞高效摄取标记物或铁结合蛋白(铁蛋白、血红蛋白和/或转铁蛋白)，其中所述铁蛋白、血红蛋白和/或转铁蛋白运载标记物优选造影剂
并靶向肿瘤。
此外，本发明允许放射性标记物靶向到肿瘤块中。这些方法包括CD45+白细胞、优选活化的巨噬细胞，其负载包封造影剂的铁蛋白或用造影剂修饰，该造影剂用于MRI成像(例如铁氢化物)或PET/SPECT成像(如α辐射或β辐射放射性同位素，其还放射细胞损害量的γ辐射，优选地选自镥-177、镱-90、碘-131、钐-153、磷-32、铯-131、钯-103、镭-233、碘-125和硼-10或细胞损害量的α辐射，优选地选自锕-225、铋-213、铅-212和钋-212)。
本发明利用负载有与标记物优选造影剂连接的铁结合蛋白的CD45+白细胞，优选活化的巨噬细胞作为靶向肿瘤的递送体系。或者，用标记物、优选造影剂标记的CD45+白细胞，优选活化的巨噬细胞构成递送标记物体系以靶向肿瘤并使用成像方法(例如PET)可视化。使用成像方法检测它们的困难主要与造影剂至缺氧区域的改变的渗透有关，缺血区域由于不良的脉管系统造成，大多在实体瘤、尤其是其微转移瘤中观察到。然而，这些无血管区域吸引CD45+白细胞、优选活化的巨噬细胞甚至在远离血管的区域迁移。因此，它们构成了至肿瘤块的颗粒递送体系。这种颗粒的有前景的实例是铁结合蛋白。然而，当作为单一试剂使用时，类似于其他化合物，它们不会到达缺氧区域，并在其他器官中积聚。
本发明人使用化学方法将标记物或同位素与血红蛋白或转铁蛋白相结合，并如实施例中所述用铁结合蛋白溶液处理细胞而将其负载到CD45+白细胞(单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和/或粒细胞)中，优选活化的巨噬细胞中。本发明人观察到向动物施用后，负载的CD45+白细胞、优选活化的巨噬细胞迁移至肿瘤缺氧部位，并释放具有包封标记物的铁结合蛋白到癌细胞中。该方法允许将标记物精确地施用至肿瘤部位(尤其是缺氧区域)，避免其积聚在其他器官中。
附图说明
图1：(A)组显示了哺乳动物铁蛋白H链中的共有氨基酸序列的最小活性片段和基于几种哺乳动物铁蛋白H链的两种全长共有序列(分别参见SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：7)，以及小鼠铁蛋白H链的最小氨基酸序列和全长氨基酸序列(SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4)和人铁蛋白H链的最小氨基酸序列和全长氨基酸序列(SEQ ID NO：5和SEQ IDNO：6)。(B)组显示了哺乳动物铁蛋白L链中的共有氨基酸序列的最小活性片段和基于几种哺乳动物铁蛋白L链的两种全长共有序列(分别参见SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ IDNO：14)，以及小鼠铁蛋白L链的最小氨基酸序列和全长氨基酸序列(SEQ ID NO：10和SEQ IDNO：11)和人铁蛋白L链的最小氨基酸序列和全长氨基酸序列(SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13)。(C)组显示了哺乳动物血红蛋白α链中的共有氨基酸序列的最小活性片段和基于几种哺乳动物血红蛋白α链的一种全长共有序列(分别参见SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16)，以及人血红蛋白α链的最小氨基酸序列和全长氨基酸序列(SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18)。组(D)显示了哺乳动物血红蛋白β链中的共有氨基酸序列的最小活性片段和基于几种哺乳动物血红蛋白β链的全长共有序列(分别参见SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20)，以及人血红蛋白β链的最小氨基酸序列和全长氨基酸序列(SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22)。组(E)显示了哺乳动物转铁蛋白中的共有氨基酸序列的N端最小活性片段和C端最小活性片段(SEQ IDNO：23和SEQ ID NO：24)和基于几种哺乳动物转铁蛋白的全长共有序列(SEQ ID NO：25)，以及人转铁蛋白的N端最小活性片段和C端最小活性片段(SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27)和人转铁蛋白的全长氨基酸序列(SEQ ID NO：28)。在共有序列中，X表示可变的位置且代表任何天然氨基酸。优选地，在每种情况下X都独立于其他X，代表人蛋白中存在的氨基酸。
图2：显示小鼠肿瘤块内的巨噬细胞(注射前TRITC染色的，负载有FITC修饰的铁蛋白)。
图3：显示用乳腺癌细胞注射并静脉内施用负载有FITC-铁蛋白(星号)的巨噬细胞的小鼠肿瘤组织的共聚焦显微镜图像——清楚地观察到不仅在巨噬细胞中而且在癌细胞中铁蛋白-FITC在全部肿瘤块中扩散。
图4：显示小鼠乳腺肿瘤的MRI图像。用负载铁蛋白Fh的巨噬细胞(静脉注射)处理小鼠(在0小时的时间点)。然后观察到填充有注射的巨噬细胞(T2-信号显著减少)的血管(箭头)的直径增加和之后巨噬细胞扩散到组织(点状图案；箭头)中。在所有检查的小鼠中都观察到这些变化(在相同的时间点)。
图5：显示被巨噬细胞摄取的铁蛋白、血红蛋白和转铁蛋白，被单核细胞摄取的铁蛋白和血红蛋白，和被淋巴细胞和粒细胞摄取的铁蛋白。
图6：显示巨噬细胞储存铁蛋白的稳定性。
图7：显示来自双光子显微镜的图片，其显示来自小鼠的肿瘤，所述小鼠接受(在施用前)预标记的含有铁蛋白-FITC的巨噬细胞。
图8：显示静脉内接受经标记的巨噬细胞的小鼠的全身成像，其显示巨噬细胞在肿瘤部位的积聚及其在其他器官中的分布。
图9：显示巨噬细胞迁移至缺氧组织，来自小鼠的肿瘤横截面，所述小鼠通过静脉内施用预标记的巨噬细胞，肿瘤缺氧区域用缺氧标志物-pimonidazolone可视化。
图10：显示由具有转移性4T1癌症的小鼠的全身分析通过PET记录的信号。小鼠静脉内地接受的负载有18F-FDG的巨噬细胞。具有微转移瘤(通过病理学检查确认)的小鼠的肺中信号积聚增加。接受未染色18F-FDG的小鼠或没有4T1癌症的小鼠具有较低的PET信号。
实施例部分
实施例1-巨噬细胞的活化
用于本发明的巨噬细胞如下获得、分化和活化。为了活化巨噬细胞，首先从骨髓前体(例如参见论文：Weischenfeld和Porse，2008，CSH Protoc，doi.10.1101/pdb.prot.5080)或血液单核细胞获得它们。或者，它们可以由腹膜获得。巨噬细胞分离、培养、分化和极化/活化的方法对于本领域技术人员来说是众所周知的。例如，Murray等人详细描述了它们(Immunity，2014，41(1)：14-20)。
在本发明的这种实际实施中，从BALB/c或C57B1/6小鼠获得骨髓来源的巨噬细胞，然而，也可以使用犬科动物血液单核细胞来源的巨噬细胞或可商购获得的巨噬细胞细胞谱系(单核细胞-巨噬细胞系小鼠细胞：RAW 264.7、J744、人细胞：THP-1、U937或犬科动物细胞DH82)。
不久，将该骨髓来源的巨噬细胞接种在塑料Petri培养皿中的5ml培养基(每个板3ml细胞)：DMEM：F12+谷氨酰胺/glutamax+10％FBS+青霉素/链霉素和20％的L929条件培养基或M-CSF(50ng/ml)中。在之后的五天中，培养基补充生长因子和活化化合物中的一种或作为一种细胞因子混合物其组合。
或者，巨噬细胞已经在“M1/M2巨噬细胞生成培养基”(Promocell)或可商购获得的等效物或含有所有必需的细胞因子和白介素的自制培养基中培养，以认为它们是经活化的。
为了从血液单核细胞获得巨噬细胞，使用Histopaque系统1077或等效物将新鲜血液(不超过12小时)分离，在适量的预热的单核细胞附着培养基(或等效物，例如补充有M-CSF的DMEM/RPMI)中接种白血球(或者仅从血库中收集的白血球)，例如每个T-75烧瓶15ml培养基。对于单核细胞含量≥25％的单核细胞，接种密度应为1百万个/cm2至2百万个/cm2，对于单核细胞含量＜25％的单核细胞，接种密度应为1.5百万个/cm2至3百万个/cm2。然后，在5％CO2和37℃下，在没有任何其他操作的情况下，将细胞在培养箱中培养1至1.5小时。
细胞附着后，将它们清洗至少两次，然后将适量的完整“M1巨噬细胞或M2巨噬细胞生成培养基DXF”添加到细胞中(例如每个T-75烧瓶20ml)，并在37℃和5％CO2下将细胞培养6天，不改变培养基。为了活化巨噬细胞，全部培养基应该用由活化化合物补充的培养基替代。
在本发明中使用的活化化合物(用于骨髓来源的细胞或活化来自单核细胞-巨噬细胞系的细胞)如下：IL-4(20ng/ml)、IFN-γ(至少20ng/ml)、LPS(至少10ng/ml)、IL-13(至少20ng/ml)、IL-10(至少20ng/ml)、地塞米松(至少20μg/ml)、oxLDL(至少20ng/ml)、TNF-α(20ng/ml)、TGF-β(20ng/ml)、皮质醇(150ng/ml至300ng/ml)、或作为一种细胞因子混合物的其组合。为了获得未经活化的巨噬细胞，还没有添加活化化合物。
巨噬细胞的极化/活化的逆转(从经典活化到替代性活化)可以例如通过在上面列举的合适的细胞因子中培养巨噬细胞至少48小时来达成。
实施例2-单核细胞分离
为了在本发明的这种实际实施中获得单核细胞，从BALB/c或C57B1/6小鼠获得骨髓来源的巨噬细胞或脾脏来源的巨噬细胞，然而，使用犬科动物血液单核细胞或可商购获得的单核细胞系(单核细胞-巨噬细胞谱系小鼠细胞：RAW 264.7、J744、人：THP-1、U937或犬科动物DH82细胞系)。
为了获得血液单核细胞，使用Histopaque系统1077或等效物将新鲜血液(不超过12小时)分离，并将白血球接种在适量的预热的单核细胞附着培养基(或等效物，例如补充有20ng/ml的M-CSF的DMEM/RPMI)中，例如每个T-75烧瓶15ml培养基。或者，可以仅使用从血库收集的白血球(血沉棕黄层)。对于单核细胞含量≥25％的单核细胞，接种密度应为1百万个/cm2至2百万个/cm2，对于单核细胞含量＜25％的单核细胞，接种密度应为1.5百万个/cm2至3百万个/cm2。然后，在没有任何其他操作的情况下，在5％CO2和37℃下，将细胞在培养箱中培养1至1.5小时。细胞附着后，将它们清洗至少两次，附着细胞被认为是单核细胞。
为了获得骨髓来源的单核细胞，在本发明的这种实际实施中，从BALB/c或C57B1/6小鼠获得骨髓来源的巨噬细胞。不久，将该骨髓来源的前体接种在塑料Petri培养皿中的5ml培养基(每个板3ml细胞)中：DMEM：F12+谷氨酰胺/glutamax+10％FBS+青霉素/链霉素和20％的L929条件培养基或20ng/ml的M-CSF。两天后，添加5ml的标准培养基。然后，两天后添加0.5ml/板的L929条件培养基。附着细胞被认为是单核细胞。
为了获得脾脏来源的单核细胞，在本发明的这种实际实施中，脾脏被机械地分离以获得单细胞悬浮液并通过70μm细胞过滤器。将细胞离心并除去上清液。红细胞裂解后，使用磁性珠纯化法分离单核细胞，例如EasySep小鼠单核细胞富集试剂盒方案和适当的磁铁。
为了在使用前获得其蛋白质负载和迁移的较好效果，它们可以用巨噬细胞活化刺激物预处理：IL-4(20ng/ml)、IFN-γ(至少20ng/ml)、LPS(至少10ng/ml)、IL-13(至少20ng/ml)、IL-10(至少20ng/ml)、地塞米松(至少20μg/ml)、oxLDL(至少20ng/ml)、TNF-α(20ng/ml)、TGF-β(20ng/ml)、皮质醇(150ng/ml至300ng/ml)、或作为一种细胞因子混合物的其组合。
实施例3-粒细胞分离
为了从血液中获得粒细胞，用1份ACD缓冲液(含有0.17M d-葡萄糖、0.10M柠檬酸、0.11M柠檬酸三钠)稀释9份血液。将来自该步骤的血液以1∶1的比例进一步用PBS稀释并离心。除去血浆和血沉棕黄层后，将剩余的细胞与PBS混合至第一步(ACD-血液)的初始体积的80％，然后以4∶12的比例用冷蒸馏水稀释。然后，添加6份2.7％的NaCl溶液并离心。除去上清液后，将细胞重新悬浮在RPMI-1640培养基中。这些细胞被认为是粒细胞。
实施例4-淋巴细胞分离
为了获得脾脏来源的淋巴细胞，在本发明的这种实际实施中，脾脏被机械地分离以获得单细胞悬浮液并通过70μm细胞过滤器。将细胞离心并除去上清液。红细胞裂解后，使用磁性珠纯化法分离淋巴细胞，例如EasySep小鼠CD4+富集试剂盒方案和适当的磁铁。
实施例5-铁蛋白复合物的制备
为了将铁蛋白与抗癌药物(例如，经典药物如环磷酰胺、苯丁酸氮芥、美法仑、苯达莫司汀、banoxantrone或缺氧活化的前药如TH-302)或与“成像造影剂”(例如，铁氢化物或同位素)结合，必须在巨噬细胞处理前制备铁蛋白。不久，如下获得根据SEQ ID NO：4(图1)的重组小鼠蛋白。含有编码SEQ ID NO：4的铁蛋白的合成基因的表达载体pET-22b被转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。在添加有氨苄青霉素(100mg/L)的1L Luria-Bertani肉汤(LB)中，在37℃下使大肠杆菌培养物生长至OD 600为0.6。通过添加1mM异丙基硫代-b-D-半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白质表达，培育培养物过夜。细胞通过离心(15000g，15分钟)收集，并悬浮在20mM Hepes(pH 7.5)、150mM NaCl、0.1mg/mL DNA酶、10mM MgCl2中并通过超声破碎。将裂解物在15000g下离心30分钟，并将上清液在50℃下处理10分钟，离心以除去变性的蛋白质，然后在70℃下处理10分钟并再次离心。上清液添加30％的(NH)4SO4，在4℃下搅拌1h，并在15000g下离心30分钟。上清液添加70％(NH)4SO4，在4℃下搅拌1h，并在15000g下离心30分钟。将球团重新悬浮在20mM Hepes(pH7.5)、150mM NaCl中，并在4℃下对相同缓冲液透析过夜。将蛋白质负载到HILOAD 26/600 SUPERDEX 200凝胶过滤柱(GE-Healthcare)上，然后无菌过滤并在4℃下保存。(图9)使用21000M-1m-1的摩尔消光系数在280nm处采用分光光度法测定蛋白质浓度，并通过Bradford试验测量595nm处的吸光度。
所述铁蛋白包括重组哺乳动物铁蛋白H均聚物和/或L均聚物。
如前所述获得的铁蛋白通过标准方法纯化以获得不含内毒素的临床前级别产品(参见例如：Ceci等人，2011，Extremophiles 15(3)：431-439；Vanucci等人，2012，Int JNanomed 7：1489-1509)。不久，在pH 7.5的含有20mM Hepes的储备溶液中无菌保存的铁蛋白被稀释至在酸性溶液(最终pH＜3.0)或者在高碱性pH值(pH＞9.5)中24聚体的4μM的最终浓度(参见例如Pontillo等人，2016)，从而使得多聚体的解离。药物以非常高的浓度溶解在合适的溶剂中，然后将小体积以过量200摩尔添加到铁蛋白溶液中。然后通过添加适量的NaOH/HCl溶液使PH达到中性，以使得多聚体重构。目前的实验方法表明，在100kDa截留分子量浓缩器中使用PBS进行三次/四次洗涤(浓缩步骤)，使得快速和完全除去共溶剂以及未包封的药物，并将负载药物的铁蛋白纳米笼完全回收。然后将由此获得的铁蛋白-药物复合物在液氮中快速冷冻和冻干。
根据共溶剂的选择和药物分子的固有化学性质，可以估计在24-聚体铁蛋白笼中最多有150至180个药物分子可以被包埋/吸附。
还可以通过适当选择苯腙、琥珀酰亚胺或马来酰亚胺活化的标记物来使标记物与铁蛋白氨基酸侧链(赖氨酸或半胱氨酸)共价偶联。因此，i)可以分解苯腙衍生物并从铁蛋白表面释放标记物，ii)在蛋白质完全降解为氨基酸后，赖氨酸结合的衍生物可以变为活性的，或iii)通过马来酰亚胺硫醚键的还原性水解，半胱氨酸结合的衍生物可以在细胞内释放。
实施例6-血红蛋白-化合物复合物的制备
如Rossi-Fanelli等人(Archives of biochemistry and biophysics 77：478-492，1958)中所述的由新鲜红细胞制备人血红蛋白。不久，将从健康供体获得的肝素化血液在1600rpm下离心30分钟(4℃)以沉降RBC。通过在球团表面上针吸精确地除去血沉棕黄层。丢弃血浆上清液，通过在等渗的0.9％盐水溶液中重悬RBC并在4℃下在1600rpm下离心30分钟而将RBC球团洗涤三次。在最后的盐水洗涤和离心步骤后，将RBC球团重悬浮在用5mM磷酸钾缓冲液(PB，pH＝7.2)缓冲的pH 7.2的蒸馏水中，并使得在4℃温和搅拌下过夜裂解。然后将透析的RBC裂解物在4℃下在13000rpm下离心30分钟，并在室温下将上清液直接负载到配备有填装Q-sepharose XL树脂(GE Healthcare)的XK 26/40柱的Explorer系统上。用缓冲液A(20mM Tris-HCl，pH＝8.2)以12mL/分钟的流速平衡柱，并用相同的缓冲液洗涤三次。通过从100％缓冲液A变为75％缓冲液B(20mM Tris-Cl，加上0.2M NaCl pH 8.20)产生线性梯度洗脱，然后是100％缓冲液B的不连续梯度洗脱。洗脱后，用级分收集器收集蛋白质级分。通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析由此获得的蛋白质，并在-80℃下冷冻储存。
人血红蛋白(SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：22，参见图1)可以容易地共价连接至合适的药物结合物，在血红素结合袋内容纳疏水性药物分子或甚至输送连接至血红素铁的细胞毒性小分子。通过将适当的药物结合物选择性地连接至β链第93号位中的半胱氨酸残基、即蛋白质表面上唯一可滴定的半胱氨酸可以容易地修饰Hb。在重构过程中，apo-蛋白溶液必须保持在冰浴中。在0.1M NaOH中1.5倍摩尔过量的CuT-CPP(Cu-TCPP 4，4′，4″，4″′-(卟吩-5，10，15，20-四基)四(苯甲酸)-Cu67)必须滴加到pH 7.0的0.2M KPi缓冲液中的apo-球蛋白溶液中，在室温下快速涡旋，然后放回冰浴中持续30分钟。然后蛋白质溶液必须在使用前在针筒式过滤器中被过滤。
实施例7-转铁蛋白-化合物复合物的制备
从健康供体获得血清，在作为螯合剂的柠檬酸根离子和碳酸氢盐的存在下添加过量铁，碳酸氢盐促进铁与转铁蛋白的结合。反应混合物含有6.5mg碳酸氢钠和153.16柠檬酸铁，pH＝8，4℃，1h每100mL血清。然后白蛋白通过利凡诺(4％)沉淀，通过在4℃下，以3.5V/V的比率向血清样品添加醇溶液2h，pH＝9.4。然后，将溶液在3000rpm下离心20分钟，最后通过0.8mm针筒式过滤器进行过滤。然后通过在0.025M硫酸铵中在Sephadex G-25柱上的凝胶过滤来除去过量利凡诺。然后通过pH＝6.5的50％饱和硫酸铵进行第一次沉淀，然后在3000rpm下离心10分钟(除去免疫球蛋白)。然后通过80％饱和硫酸铵进行第二次沉淀，从而从沉淀中回收转铁蛋白。然后将固体沉淀物溶解在含有1M NaCl、pH＝8的0.06M Tris HCl缓冲液中。将溶液在相同的缓冲液中透析以使硫酸铵完全除去。然后将蛋白质溶液用centricon PM50离心浓缩器浓缩至最多10mg/ml至15mg/ml(通过Bradford方法估计)并装载到在流速为15ml/小时的1M NaCl中平衡的Sephadex G-100凝胶过滤柱(2，4×80cm)上。由此获得的转铁蛋白通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳估算为88至90％纯。然后使用由阴离子交换剂DEAE Sephadex A-50的离子交换色谱作为最终精制步骤。将转铁蛋白样品装载到用pH＝8的0.06M Tris-HCl平衡的柱中，用洗脱缓冲液pH＝8的0.3M Tris HCl通过线性浓度梯度洗脱。蛋白质纯度高于98％，产率为每100mL血清约150mg。
与血红蛋白类似，人全转铁蛋白(SEQ ID NO：28，图1)可以容易地共价连接至合适的标记物结合物。在重构过程中，apo-蛋白溶液必须保持在冰浴中。在0.1M NaOH中1.5倍摩尔过量的CuT-CPP(Cu-TCPP 4，4′，4″，4″′-(卟吩-5，10，15，20-四基)四(苯甲酸)-Cu67)必须滴加到pH 7.0的0.2M KPi缓冲液中的apo-球蛋白溶液中，在室温下快速涡旋，然后放回冰浴中持续30分钟。然后蛋白质溶液必须在使用前在针筒式过滤器中被过滤。
实施例8-获得负载铁蛋白的细胞
使获得的细胞在铁蛋白溶液中培养一段时间，所处浓度足以确保铁蛋白/细胞的合适比例以使其满载，以及确保合适的造影剂含量以获得适当的成像。时间和浓度可以根据包封/吸附到铁蛋白笼中的分子数、细胞活化的状态以及它们预期施用的条件和次数而改变。
例如，为了确保适当地负载铁蛋白，将细胞在标准培养条件下在0.2mg/ml的铁蛋白溶液中培养1至4小时。铁蛋白浓度的范围可以至少在0.01mg/ml至4mg/ml变化，以及培养时间可以变化(5分钟至6小时或更久)。调整铁蛋白负载到细胞的时间和浓度，应注意铁蛋白和处理条件对细胞活性的影响。如上所述获得的细胞非常容易在相对短的时间(以分钟计；图5)摄取铁蛋白。一旦它们摄取铁蛋白，它们就不会将铁蛋白释放到培养基中(图6)。
然而，出于实验室自身的自身目的，本领域技术人员能够重新调整上述条件并优化方案。
实施例9-获得负载血红蛋白的细胞
使获得的细胞在血红蛋白溶液中培养一段时间，所处浓度足以确保血红蛋白/细胞的合适比例以使其满载，以及确保合适的造影剂含量以获得适当的成像。时间和浓度可以根据与血红蛋白分子相连的分子数、细胞活化的状态以及它们预期施用的条件和次数而改变。
例如，为了确保适当地负载血红蛋白，将细胞在标准培养条件下在0.1mg/ml的血红蛋白溶液中培养1至4小时。血红蛋白浓度的范围可以至少在0.01mg/ml至0.2mg/ml变化，以及培养时间可以变化(5分钟至4小时或更久)。调整血红蛋白负载到细胞的时间和浓度，应注意血红蛋白和处理条件对细胞活性的影响。如上所述获得的细胞非常容易在相对短的时间(以分钟计；图5)摄取血红蛋白。
然而，出于实验室自身的自身目的，本领域技术人员能够重新调整上述条件并优化方案。
实施例10-获得负载转铁蛋白的细胞
使获得的细胞在转铁蛋白溶液中培养一段时间，所处浓度足以确保转铁蛋白/细胞的合适比例以使其满载，以及确保合适的造影剂含量以获得适当的成像。时间和浓度可以根据与转铁蛋白分子相连的分子数、细胞活化的状态以及它们预期施用的条件和次数而改变。
例如，为了确保适当地负载转铁蛋白，将细胞在标准培养条件下在0.1mg/ml的转铁蛋白溶液中培养1至4小时。转铁蛋白浓度的范围可以至少在0.01mg/ml至0.2mg/ml变化，以及培养时间可以变化(5分钟至4小时或更久)。调整转铁蛋白负载到细胞的时间和浓度，应注意转铁蛋白和处理条件对细胞活性的影响。如上所述获得的细胞非常容易在相对短的时间(以分钟计；图5)中摄取转铁蛋白。
然而，出于实验室自身的自身目的，本领域技术人员能够重新调整上述条件并优化方案。
实施例11-用放射性同位素标记细胞
在本发明中，用18F-FDG标记细胞以在PET上成像。细胞已从板上分离，并以足以确保细胞最优摄取18F-FDG的浓度用18F-FDG溶液培养以允许在细胞积聚部位的放射性检测。在该实际发明中，细胞用不同细胞因子混合物、生长因子和影响其活化状态的其他因子预处理，以增强它们对标记物的摄取，并在含有20至60MBq的温热18F-FDG溶液中培养。标记后，细胞应被离心，上清液应被除去。应该重复该步骤直到上清液中没有检测到放射性。
实施例12-铁蛋白/血红蛋白/转铁蛋白/标记物-白细胞复合物作为有用的向肿瘤递送的工具
如实施例8、实施例9、实施例10和实施例11所述而制备的来自实施例1的巨噬细胞；如实施例8、实施例9、实施例10和实施例11所述而制备的来自实施例2的单核细胞，如实施例8、实施例9、实施例10和实施例11所述而制备的来自实施例3的粒细胞和如实施例8、实施例9、实施例10和实施例11所述而制备的来自实施例4的淋巴细胞非常容易以足以使用成像系统检测的量将铁蛋白、血红蛋白、转铁蛋白和标记物运输至肿瘤(图2、图3、图4、图7和图8)。
实施例13-白细胞-蛋白质载体复合物作为有用的向缺氧区域的靶向药物递送剂
将如上制备的巨噬细胞注射到具有肿瘤的动物的尾静脉中(应调整适当数量的巨噬细胞以适应肿瘤大小、发展阶段和转移瘤的存在)。如图2、图3、图4、图7、图8和图10中所示，(几小时后)它们特异性地到达肿瘤，还分散在整个动物的其他器官中。此外，如图9所示，在缺氧模型中，它们也能够迁移至无血管和缺氧部位。
为了成像目的，将1百万至5000万个巨噬细胞注射到具有乳腺癌或结肠癌肿瘤的动物的尾静脉中。之前，用细胞追踪物预标记巨噬细胞并负载铁蛋白-FITC(如实施例8所示)。在施用巨噬细胞8小时后，使用双光子成像肿瘤块，检测到运载铁蛋白-FITC的巨噬细胞的存在(图7)。使用XenoLight DiR亲脂性DIR细胞质染料预标记巨噬细胞后，使用全动物体成像(IVIS)显示它们对肿瘤的特异性靶向以及它们向其他器官的迁移(图8)。
实施例14-白细胞-蛋白质载体复合物或标记的白细胞作为有用的成像工具
在本发明中描述的靶向递送体系构成非常有用的成像工具。如图4和图10所示，在注射1ml至50ml负载铁蛋白的巨噬细胞后，所述铁蛋白如实施例8中描述的与造影剂(在该实施例中为水铁矿，然而用同位素例如123I获得相同的结果)偶联或者用同位素标记(在这种情况下为18F-FDG)(图10)，它们可以容易地被MRI、PET或SPECT检测。在该实施例中(图4)，在静脉注射负载铁蛋白Fh的巨噬细胞3小时、22小时和24小时后，使用MRI成像具有乳腺肿瘤的小鼠。如图4所示，铁蛋白/巨噬细胞复合物是非常有用的成像工具。用巨噬细胞处理小鼠(在时间点0小时)。然后观察到填充有注射的巨噬细胞的血管(箭头)的直径增加(T2信号显著减少)，并且之后巨噬细胞扩散至组织中(点状图案；箭头)。在所有检查的小鼠中都观察到这些变化(在相同的时间点)。
巨噬细胞还用18F-FDG(1mln至50mln)标记，并在向具有肿瘤的小鼠静脉注射施用1小时后使用PET成像。在实验前3周对这些小鼠接种4T1转移瘤细胞系，并在组织病理学上确认肺、肝脏和脾脏中的转移瘤。在图10中，可以看出巨噬细胞迁移至具有转移瘤的区域，使得其在PET下可视化。
尽管本发明前述的说明使得普通技术人员能获得和使用其被认为目前最佳的方式，但那些普通技术人员会理解和领会存在本文的特定实施方案、方法和实施例的变化方案、组合方案和等同方案的存在。因此，本发明不应限于上述实施方案、方法和实施例，而限于本发明的范围和精神内的所有实施方案和方法。
本发明还涉及以下方面和这些方面的优选实施方案。以上提供的定义类似地应用于以下方面和实施方案。
1.靶向递送体系，其包含负载载有造影剂的铁蛋白的活化的巨噬细胞。
2.根据实施方案1的靶向递送体系，其中造影剂是铁氢化物或同位素。
3.靶向递送体系的制备方法，所述靶向递送体系包含负载载有造影剂的铁蛋白的活化的巨噬细胞，所述方法包括以下步骤：
a)纯化铁蛋白；
b)通过连接铁蛋白和所述造影剂获得载有造影剂的铁蛋白；
c)活化经分离的巨噬细胞；
d)在步骤b)中获得的载有造影剂的铁蛋白的溶液中，并在足以确保载有造影剂的铁蛋白满载进入巨噬细胞的铁蛋白浓度下培养巨噬细胞一段时间。
4.根据实施方案3的方法，其中活化的巨噬细胞是骨髓来源的巨噬细胞。
5.根据实施方案3的方法，其中活化的巨噬细胞是血液来源的巨噬细胞。
6.根据实施方案3的方法，其中活化的巨噬细胞来源于巨噬细胞系。
7.根据实施方案3至6中任一项的方法，其中活化的巨噬细胞是向M1或M2极化的巨噬细胞。
8.根据实施方案7的方法，其中活化的巨噬细胞已经向M2极化。
9.根据实施方案7的方法，其中活化的巨噬细胞的铁代谢已经被控制。
10.根据实施方案3至9中任一项的方法，其中造影剂是铁氢化物或同位素。
11.根据实施方案1或2中任一项限定的靶向递送体系，其用作成像工具。
在优选的实施方案中，本发明不包括以上第1项至11项的主题。

Claims (25)

1.一种经分离的靶向递送体系，其包含CD45+白细胞，在所述细胞中包含一种或更多种铁结合蛋白和标记物的复合物。
2.一种经分离的靶向递送体系，其包含CD45+白细胞，所述CD45+白细胞包含一种或更多种标记物，特别是放射性标记物或其结合物和组合。
3.根据权利要求1或2所述的经分离的靶向递送体系，其中所述白细胞能够由CD34+造血前体细胞产生。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的经分离的靶向递送体系，其中所述白细胞选自单核细胞、分化的单核细胞、淋巴细胞和粒细胞。
5.根据权利要求4所述的经分离的靶向递送体系，其中
(i)单核细胞是CD11b+单核细胞，优选地选自CD11b+CD14+单核细胞、CD11b+CD16+单核细胞、CD11b+CD14+CD16+单核细胞、CD11b+CD14+MHCII+单核细胞、CD11b+CD14+CD115+单核细胞、CD11b+CD114+单核细胞、CD11b+CD116+单核细胞、CD11b+CCR1+单核细胞、CD11b+CCR2+单核细胞、CD11b+CX3CR+单核细胞、CD11b+CXR4+单核细胞、CD11b+CXR6+单核细胞和CD11b+CD14+CD33+单核细胞；
(ii)分化的单核细胞选自巨噬细胞、活化的巨噬细胞，优选CD11b+巨噬细胞，更优选CD11b+CD16+巨噬细胞、CD11b+CD32+巨噬细胞、CD11b+CD64+巨噬细胞、CD11b+CD68+巨噬细胞，优选CD11b+CD86+M1巨噬细胞，其优选地产生iNOS和/或分泌白介素12(IL-12)，或优选CD11b+CCR2+M2巨噬细胞、CD11b+CD204+M2巨噬细胞、CD11b+CD206+M2巨噬细胞、CD11b+CD204+CD206+M2巨噬细胞、CD11b+主要组织相容性复合物II+(MHCII+)(低表达或高表达)M2巨噬细胞、CD11b+CD200R+M2巨噬细胞、CD11b+CD163+M2巨噬细胞，或产生精氨酸酶和/或分泌白介素10(IL-10)的活化的巨噬细胞；或树突细胞，其优选地具有CD11b CD11c、CD11b CD80、CD11cCD80、CD11c CD86、CD11c MHCII和CD11c CD123的表达，优选分化的单核细胞不是Lox1+，CXCR7+和NRF2+泡沫细胞；
(iii)单核细胞或活化的单核细胞，其表达至少一种趋化因子受体，优选地选自CCR1、CCR2+、CXR4+和CXR6+，或至少一种生长因子受体，优选地选自巨噬细胞集落刺激因子受体(CD115)、粒细胞集落刺激因子受体(CD114)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体(由CD116和CD131组成)；具有这些特征的单核细胞特别适合于治疗炎症性病症和癌症；
(iv)所述淋巴细胞选自CD3+和CD4+或CD8+T淋巴细胞，或CD19+、CD20+、CD21+、CD19+CD20+、CD19+CD21+、CD20+CD21+或CD19+CD20+CD21+B淋巴细胞；或
(v)所述粒细胞选自嗜中性粒细胞，优选CD66b+嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞，优选CD193+嗜酸性粒细胞。
6.根据权利要求5所述的经分离的靶向递送体系，其中所述活化的巨噬细胞：
(i)能够通过单核细胞或巨噬细胞与能够改变巨噬细胞上的表达标志物的因子的体外培养产生，优选地
(a)与至少一种M1诱导物的体外培养产生，
(b)与至少一种M2诱导物的体外培养产生，
(c)或与能够改变巨噬细胞分泌细胞因子，优选IL-10和IL-12、趋化因子和/或产生iNOS、精氨酸酶或其他免疫调节酶的能力的因子的体外培养产生；
(ii)特征在于以下抗原CD64、CD86、CD16、CD32中的至少一种的表达、MHCII的高表达和/或iNOS和/或IL-12的产生；
(iii)能够通过单核细胞或巨噬细胞与能够诱导巨噬细胞吞噬能力的因子的体外培养产生；
(iv)特征在于抗原CD204、CD206、CD200R中的至少一种、CCR2、转铁蛋白受体(TfR)、CXC模序趋化因子受体4(CXCR4)、CD163，和/或T细胞免疫球蛋白结构域和黏蛋白结构域2(TIM-2)的表达，和/或显示MHCII的低表达；
(v)具有吞噬能力；和/或
(vi)能够分泌细胞因子，优选IL-12或IL-10，或能够产生诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)(或其他促炎性化合物)、精氨酸酶或其他抑制免疫力/抗炎性化合物。
7.根据权利要求6所述的靶向递送体系，其中：
(i)M1诱导物选自LPS、INF-γ、GM-CSF和病毒感染和细菌感染；或
(ii)M2诱导物选自IL-4、IL-10、IL-13、抗原和抗体的免疫复合物、IgG、热活化的γ球蛋白、糖皮质激素、TGF-β、IL-1R、CCL-2、IL-6、M-CSF、PPARγ激动剂、白细胞抑制因子、腺苷、蠕虫和真菌感染。
8.根据权利要求5所述的经分离的靶向递送体系，其中所述单核细胞：
(i)能够由CD34+造血前体细胞产生；
(ii)能够通过单核细胞与至少一种诱导物、优选M1诱导物或M2诱导物、更优选至少一种M2诱导物的体外培养产生；
(iii)特征在于以下抗原中的至少一种的表达：TfR+、CD163+、TIM-2+、CD14+、CD16+、CD33+和/或CD115+；
(iv)特征在于以下抗原中的至少一种的表达：TfR+、CD163+、TIM-2+、CXCR4+、CD14+和/或CD16+；和/或
(v)具有吞噬能力。
9.根据权利要求8所述的靶向递送体系，其中：
(i)所述M1诱导物选自LPS、INF-γ、GM-CSF或病毒感染或细菌感染；
(ii)所述M2诱导物选自IL-4、IL-10、IL-13、抗原和抗体的免疫复合物、IgG、热活化的γ球蛋白、糖皮质激素、TGF-β、IL-1R、CCL-2、IL-6、M-CSF、PPARγ激动剂、白细胞抑制因子、癌症条件培养基、癌细胞、腺苷和蠕虫或真菌感染。
10.根据权利要求5所述的经分离的靶向递送体系，其中所述淋巴细胞：
(i)能够由血液、脾脏或骨髓获得，或能够由CD34+前体细胞产生；
(ii)是免疫活性的淋巴细胞；
(iii)表达抗原特异性T细胞受体；和/或
(iv)特征在于以下抗原中的至少一种的表达：(a)CD3+和CD4+或CD8+或(b)：CD19+、CD20+、CD21+、CD19+CD20+、CD19+CD21+、CD20+CD21+、或CD19+CD20+CD21+抗原，并优选地能够产生免疫球蛋白。
11.根据权利要求5所述的经分离的靶向递送体系，其中所述粒细胞：
(i)能够由血液、脾脏或骨髓获得，或能够由CD34+前体细胞产生；
(ii)特征在于以下CD66b+和/或CD193+中的至少一种的表达；
(iii)是分叶核白细胞，其特征在于其细胞质中存在颗粒；和/或
(iii)特征在于以下至少一种的表达：TfR+、CD163+、TIM-2+和/或CXCR4+。
12.根据权利要求1和3至11中任一项所述的经分离的靶向递送体系，其中所述铁结合蛋白选自铁蛋白，优选重(H)型铁蛋白、轻(L)铁蛋白和/或线粒体铁蛋白；血红蛋白，优选血红蛋白A、血红蛋白AS、血红蛋白SC、血红蛋白C、血红蛋白D、血红蛋白E、血红蛋白F、血红蛋白H；血红蛋白-触珠蛋白复合物、血色素结合蛋白、转铁蛋白；和乳铁蛋白。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的经分离的靶向递送体系，其中所述标记物选自荧光染料、荧光发射同位素、放射性同位素、可检测的多肽或编码可检测的多肽的核酸和造影剂。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的经分离的靶向递送体系，其中所述标记物包括与二价或三价金属阳离子形成复合物的螯合剂。
15.根据权利要求14所述的经分离的靶向递送体系，其中所述螯合剂选自1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N′，N，N′-四乙酸(DOTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、1，4，7-三氮杂环壬烷-1，4，7-三乙酸(NOTA)、三亚乙基四胺(TETA)、亚氨基二乙酸、二亚乙基三胺-N，N，N′，N′，N″-五乙酸(DTPA)和6-肼基吡啶-3-羧酸(HYNIC)。
16.根据权利要求13所述的经分离的靶向递送体系，其中所述造影剂包括顺磁剂，优选地选自Gd、Eu、W和Mn，或铁氢化物。
17.根据权利要求13所述的经分离的靶向递送体系，其中所述放射性同位素/荧光发射同位素选自α辐射发射同位素、γ辐射发射同位素、俄歇电子发射同位素、X射线发射同位素、荧光同位素例如65Tb、荧光发射同位素例如18F、51Cr、67Ga、68Ga、89Zr、111In、99mTc、140La、175Yb、153Sm、166Ho、88Y、90Y、149Pm、177Lu、47Sc、142Pr、159Gd、212Bi、72As、72Se、97Ru、109Pd、105Rh、101m15Rh、119Sb、128Ba、123I、124I、131I、197Hg、211At、169Eu、203Pb、212Pb、64Cu、67Cu、188Re、186Re、198Au和199Ag，以及以上同位素与蛋白质、肽、小分子抑制剂、抗体或其他化合物的结合物和组合。
18.根据权利要求13所述的经分离的靶向递送体系，其中荧光染料选自以下类别的荧光剂染料：氧杂蒽类、吖啶类、嗪类、青色素类、苯乙烯基染料、香豆素类、卟吩类、金属配体络合物、荧光蛋白、纳米晶体、苝类和酞菁类以及这些类别的染料的结合物和组合。
19.根据权利要求13所述的经分离的靶向递送体系，其中所述可检测的多肽是自发荧光蛋白，优选绿色荧光蛋白，或具有改变的吸收和/或发射光谱的其任意结构变体。
20.根据权利要求1和3至19中任一项所述的经分离的靶向递送体系，其中：
(i)包含在复合物中的铁结合蛋白和标记物之间的键是共价和/或非共价的；和/或
(ii)包含在复合物中的标记物被铁结合蛋白或其多聚体包埋/包封。
21.根据权利要求2至19中任一项所述的经分离的靶向递送体系，其中所述标记物直接或间接地通过连接子或间隔物与细胞连接。
22.一种制备根据权利要求1至21所述的经分离的靶向递送体系的方法，其包括以下步骤：
a)提供纯化的铁结合蛋白；
b)将标记物共价或非共价地连接至铁结合蛋白和/或在铁结合蛋白中包封标记物；
c)提供CD45+白细胞；和
d1)在步骤b)中产生的铁结合蛋白和标记物的复合物的存在下培养CD45+白细胞，直到CD45+白细胞至少部分地负载步骤b)中产生的铁结合蛋白和标记物的复合物，和/或
d2)在标记物的存在下培养CD45+白细胞直到CD45+白细胞至少部分地被标记物标记。
23.根据权利要求1至21中任一项所述的经分离的靶向递送体系，或根据权利要求22所述的方法能够产生的经分离的靶向递送体系，其用作诊断试剂。
24.一种诊断组合物，其包含根据权利要求1至21中任一项所述的经分离的靶向递送体系，或根据权利要求22所述的方法能够产生的经分离的靶向递送体系和药学上可接受的载体和/或合适的赋形剂。
25.一种权利要求1至21中任一项所述的经分离的靶向递送体系，或根据权利要求22所述的方法能够产生的经分离的靶向递送体系，其用于诊断肿瘤、炎症性疾病或缺血性区域，所述肿瘤优选实体瘤、其转移瘤，优选乳腺癌、胰腺癌、膀胱癌、肺癌、结肠癌或其转移瘤，或具有缺氧区域的肿瘤，所述缺血性区域优选皮肤伤口中或器官梗塞(心脏)或视网膜缺血后的缺血性区域。
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