WO2015012149A1 - 新規トリアジン誘導体 - Google Patents

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WO2015012149A1
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亘 川畑
斉子 浅見
匡明 澤
優子 朝光
隆行 入江
隆弘 三宅
孝夫 清位
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カルナバイオサイエンス株式会社
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    • C07D403/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing three or more hetero rings

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical, particularly a novel triazine derivative having a BTK inhibitory action, a prodrug thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • Bruton's tyrosine kinase is a member of the Tec family of non-receptor tyrosine kinases and is an important expression expressed in all hematopoietic cell types except T lymphocytes and natural killer cells. It is a signaling enzyme. BTK is an important regulator of B cell survival, differentiation, proliferation, activation, and the like, and plays an important role in B cell signal transduction (Non-patent Documents 1 and 2).
  • B-cell receptor (BCR) on the cell surface transmits a signal into the cell via BTK existing downstream thereof, and thus abnormal activation of the signal transduction pathway of B cell is It is thought to promote the growth and survival of cancer cells such as B cell lymphoma and chronic lymphocytic leukemia (Non-patent Document 3).
  • BTK is also known to play an important role in the signal pathways of many other cells and is said to be involved in allergic diseases, autoimmune diseases and inflammatory diseases.
  • Non-Patent Document 1 For example, BTK plays an important role in high-affinity IgE receptor (Fc ⁇ RI) signaling in mast cells. BTK-deficient mast cells have reduced degranulation and production of pro-inflammatory cytokines.
  • Fc ⁇ RI high-affinity IgE receptor
  • Non-patent Document 5 systemic lupus erythematosus
  • BTK mutant mice are resistant to the development of collagen-induced arthritis
  • a compound having BTK inhibitory activity is useful for the treatment of diseases involving BTK signals, such as cancer, B cell lymphoma and chronic lymphocytic leukemia, as well as allergic diseases, autoimmune diseases and inflammation. It is also useful for the treatment of sexual diseases.
  • diseases involving BTK signals such as cancer, B cell lymphoma and chronic lymphocytic leukemia, as well as allergic diseases, autoimmune diseases and inflammation. It is also useful for the treatment of sexual diseases.
  • Various compounds having the above BTK inhibitory action have been reported (Patent Document 1).
  • An object of the present invention is to provide a novel triazine derivative having a BTK inhibitory action, a prodrug thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the present invention is achieved by the following (1) to (2).
  • R 1 represents a lower alkyl group which may have a substituent
  • R 2 represents a hydrogen atom or a lower alkyl group which may have a substituent
  • A represents a nitrogen atom or C —R 3
  • R 3 represents a hydrogen atom, a cyano group, an acyl group which may have a substituent, a sulfonyl group which may have a substituent, or a carbamoyl group which may have a substituent.
  • R 4 represents a lower alkyl group which may have a substituent or a cycloalkyl group which may have a substituent.
  • the novel triazine derivative represented by the above formula (I), a prodrug thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof is excellent.
  • the present invention has been completed by finding that it has a BTK inhibitory action and shows a particularly excellent inhibitory effect in a collagen-induced arthritis animal model.
  • the compounds provided by the present invention against diseases known to be associated with abnormal cellular responses mediated by BTK such as autoimmune diseases, inflammatory diseases, bone diseases, cancers such as lymphoma, etc. It is useful as a prophylactic or therapeutic drug (pharmaceutical composition) or a prodrug thereof. Further, it is useful as a BTK inhibitor in reagents for experiments and research.
  • Example 3 It shows that the compound of Example 1 inhibits BCR signal in Ramos cells in a concentration-dependent manner and suppresses calcium influx into cells (Test Example 3). It shows that the compound of Example 1 suppressed significantly the leakage of the blood pigment
  • novel triazine derivative of the present invention is a compound represented by the following formula (I).
  • R 1 represents a lower alkyl group which may have a substituent
  • R 2 represents a hydrogen atom or a lower alkyl group which may have a substituent
  • A represents a nitrogen atom or C —R 3
  • R 3 represents a hydrogen atom, a cyano group, an acyl group which may have a substituent, a sulfonyl group which may have a substituent, or a carbamoyl group which may have a substituent
  • R 4 represents a lower alkyl group which may have a substituent or a cycloalkyl group which may have a substituent.
  • the lower alkyl group part of the lower alkyl group which may have a substituent may be any of linear, branched or cyclic alkyl groups having 1 to 3 carbon atoms, specifically, a methyl group, An isopropyl group etc. can be mentioned.
  • the cycloalkyl group portion of the cycloalkyl group which may have a substituent may be any of a cyclic alkyl group having 3 to 6 carbon atoms, and specific examples thereof include a cyclopropyl group and a cyclobutyl group. it can.
  • the acyl group part of the acyl group which may have a substituent may be any of linear, branched and cyclic groups bonded to a carbonyl group, for example, a formyl group, an acetyl group, a propionyl group. , Octanoyl group, dodecanoyl group, pivaloyl group, cyclopropylcarbonyl group, benzoyl group and the like.
  • Examples of the sulfonyl group which may have a substituent include a methylsulfonyl group and an ethylsulfonyl group.
  • Examples of the carbamoyl group that may have a substituent include a methylcarbamoyl group, an ethylcarbamoyl group, and a dimethylcarbamoyl group.
  • substituent of “may have a substituent” of the carbamoyl group that may be optionally substituted one or two or more arbitrary types of substituents may be used as long as they are chemically possible.
  • Each of the substituents may be the same or different, for example, a halogen atom, a substituted or unsubstituted alkyl group, a substituted or unsubstituted alkoxy group.
  • the compound (I) of the present invention may have an isomer depending on, for example, the type of substituent.
  • the chemical structure of only one form of those isomers may be described, but the present invention includes all isomers (geometric isomers, optical isomers, tautomers) that can occur structurally. Etc.) and also includes isomers alone or a mixture thereof.
  • Examples of the pharmaceutically acceptable salt of the compound (I) of the present invention include inorganic acid salts with hydrochloric acid, sulfuric acid, carbonic acid, phosphoric acid, fumaric acid, maleic acid, methanesulfonic acid, ptoluenesulfonic acid, and the like. And organic acid salts. Also, alkali metal salts with sodium, potassium, etc., alkaline earth metal salts with magnesium, calcium, etc., organic amine salts with lower alkyl amines, lower alcohol amines, etc., basic amino acid salts with lysine, arginine, ornithine, etc. In addition, ammonium salts and the like are also included in the present invention.
  • compound (I) of the present invention includes prodrugs unless otherwise specified.
  • Compound (I) of the present invention and a pharmaceutically acceptable salt thereof can be produced, for example, by the following method.
  • a method usually used in organic synthetic chemistry for example, a functional group Protection, deprotection [T. W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis 3rd Edition, John Wiley & Sons, Inc. , 1999] can be easily manufactured. Further, the order of reaction steps such as introduction of substituents can be changed as necessary.
  • R 1 , R 2 , R 4 , and A are as defined above, and W represents a boronyl group or a boronic ester group.
  • the compound (I) of the present invention can be produced by a cross-coupling reaction such as a Suzuki coupling reaction using the compound (II) and the compound (III) (for example, known conditions for the conditions of the Suzuki coupling reaction) (See N. Miyaura, et al, J. Am. Chem. Soc., 107, 972 (1985), N. Miyaura, A. Suzuki, Chem. Rev. 95, 2457 (1995))). That is, it can be carried out using a base and an additive as necessary in the presence of a metal catalyst such as palladium or nickel.
  • a cross-coupling reaction such as a Suzuki coupling reaction using the compound (II) and the compound (III) (for example, known conditions for the conditions of the Suzuki coupling reaction) (See N. Miyaura, et al, J. Am. Chem. Soc., 107, 972 (1985), N. Miyaura, A. Suzuki, Chem. Rev. 95, 2457 (1995)). That is,
  • Examples of the solvent used for the reaction include THF, dioxane, toluene, dimethoxyethane, methanol, ethanol, acetonitrile and the like. It is also suitable to use a mixture of two or more of these solvents, or a mixture of these with water. Preferred is a mixed solvent of THF and water, a mixed solvent of toluene, methanol and water, or dioxane.
  • Compound (II) is preferably used in an equivalent amount or an excess amount relative to compound (III), more preferably 1 equivalent to 10 equivalents.
  • a base may be added to accelerate the reaction, and sodium carbonate, cesium carbonate, potassium carbonate, etc. are usually used as the base.
  • the amount of the base to be used is 1 to 10 equivalents, preferably 1 to 5 equivalents, relative to compound (III).
  • a commercially available palladium catalyst used for cross coupling for example, PdCl 2 (dppf), Pd 2 (dba) 3 , Pd (PPh 3 ) 4, etc.
  • a catalytic amount that is, 0.1 equivalent to 0.5 equivalent relative to compound (III).
  • an additive can be added as necessary.
  • the additive include rac-BINAP and the like, and 0.01 to 1 equivalent can be used with respect to compound (III).
  • the reaction can be synthesized by reacting between 0 ° C. and 200 ° C. for several minutes to several days, preferably between 10 ° C. and 100 ° C. for 1 hour to 36 hours.
  • the synthesis can also be performed by using a microwave synthesizer, for example, by reacting for several minutes to several hours under a temperature condition of 60 ° C. to 150 ° C.
  • the compound (II) used as a raw material of Scheme 1 can be produced by, for example, the method shown in Scheme 2. [Scheme 2]
  • R 1 , R 4 and W are as defined above, and X represents halogen.
  • Compound (II) can be produced by activating compound (IV) with n-butyllithium or the like and then reacting with borate ester. That is, compound (II) is lithiated by treating compound (IV) with 1 to 5 molar equivalents, preferably 1 to 1.5 molar equivalents of n-butyllithium, and 1 to 5 molar equivalents, preferably 1 to 5 molar equivalents. It can be obtained by reacting with 1.5 molar equivalent borate ester.
  • the solvent may be any solvent as long as it is inert to the reaction, and is not particularly limited, but preferably THF can be used.
  • the reaction temperature is usually ⁇ 100 ° C. to ⁇ 30 ° C., preferably ⁇ 80 ° C. to ⁇ 60 ° C.
  • reaction time is not specifically limited, Usually, 0.1 to 12 hours are illustrated, and 0.2 to 6 hours are mentioned as a preferable example.
  • compound (II) has a boiling point of a solvent using 1 to 5 molar equivalents, preferably 1 to 1.5 molar equivalents of metal magnesium and a catalytic amount of iodine in an ether solvent from ⁇ 10 ° C. It can also be obtained by reacting at a temperature between 1 to 5 molar equivalents, preferably 1 to 1.5 molar equivalents of boric acid ester.
  • the reaction temperature is generally ⁇ 30 ° C. to ⁇ 100 ° C., preferably ⁇ 60 ° C. to ⁇ 80 ° C.
  • reaction time is not specifically limited, Usually, 0.1 to 12 hours are illustrated, and 0.2 to 6 hours are mentioned as a preferable example.
  • compound (II) is coupled with 1 to 5 molar equivalents, preferably 1 to 3 molar equivalents of a diboron ester in an organic solvent in the presence of a metal catalyst such as palladium or nickel and a base. It can be obtained by reacting.
  • a metal catalyst such as palladium or nickel and a base.
  • a commercially available palladium catalyst for example, PdCl 2 (dppf), Pd 2 (dba) 3 , Pd (PPh 3 ) 4 etc.
  • potassium acetate or the like is usually used. With respect to the dose of the base used, it can be 1 to 10 equivalents, preferably 1 to 5 equivalents, relative to compound (IV).
  • the solvent is not particularly limited as long as it is inert to the reaction, but dioxane can be preferably used.
  • reaction temperature is usually 0 ° C. to 200 ° C., preferably 10 ° C. to 100 ° C.
  • reaction time is not specifically limited, Usually, 0.2 to 48 hours are illustrated, and 1 to 36 hours are preferable examples.
  • These reactions are desirably carried out under an inert gas (argon, nitrogen, etc.) atmosphere under anhydrous conditions.
  • Compound (IV) used as a raw material of Scheme 2 can be produced, for example, by the method shown in Scheme 3.
  • Compound (IV) is obtained by reacting Compound (V) with 1 to 5 molar equivalents, preferably 1.5 to 3 molar equivalents of Compound (VI) in a polar solvent in the presence of a metal catalyst. Is obtained.
  • the solvent is not particularly limited as long as it is inert to the reaction, but dioxane can be preferably used.
  • compound (IV) can also be produced by protecting and deprotecting R 1 of compound (VI) by appropriately combining methods usually used in organic synthetic chemistry as necessary. .
  • protecting and deprotection of the functional group of the hydroxyl group and amino group of compound (VI) [T. W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis 3rd Edition, John Wiley & Sons, Inc. , 1999] or an aldehyde derivative which is a hydroxyl precursor of compound (VI).
  • the reaction is usually carried out by reacting at 80 to 200 ° C. for 0.5 to 200 hours, preferably 100 to 150 ° C. for 1 to 100 hours.
  • the reaction is also preferably carried out under microwave irradiation conditions.
  • metal catalyst to be used a commercially available palladium catalyst (for example, PdCl 2 (dppf), Pd 2 (dba) 3 , Pd (PPh 3 ) 4 etc.) or copper iodide (I) can be used. It is preferable to add 0.01 equivalent to 2 equivalents relative to compound (V).
  • Examples of the base to be used include potassium carbonate, sodium carbonate, cesium carbonate, and sodium hydrogen carbonate.
  • cesium carbonate and sodium hydrogen carbonate can be used, and 1 to 10 molar equivalents relative to compound (V), preferably Examples are 2 to 5 molar equivalents.
  • it is compoundable even if 0.1 equivalent of 0.5 equivalent of xanthophos is added as needed.
  • Compound (VI) can be obtained as a commercial product, or by a known method or a method analogous thereto.
  • Compound (III) requires 1 to 5 molar equivalents, preferably 1 to 1.5 molar equivalents of 2-amino-4,6-dichloro-1,3,5-triazine and amine (VII) in a polar solvent. Depending on the reaction, it is obtained by reacting in the presence of a base catalyst.
  • the solvent is not particularly limited as long as it is inert to the reaction, and DMF and THF can be preferably used.
  • the reaction temperature is usually 0 ° C. to 200 ° C., preferably 10 ° C. to 100 ° C. Although reaction time is not specifically limited, Usually, 0.2 to 48 hours are illustrated, and 1 to 36 hours are preferable examples.
  • 2-Amino-4,6-dichloro-1,3,5-triazine which is the starting material of Scheme 4, is a commercially available product
  • amine (VII) is a commercially available product or can be obtained by a known method or a method analogous thereto. it can.
  • the compound (V) used as the raw material of Scheme 3 can be produced, for example, by the method shown in Scheme 5.
  • R 4 , X and W are as defined above, and R ′ represents lower alkyl.
  • the compound (V) is obtained by converting the carboxylic acid of the compound (VIII) into a carbamoyl group, and then introducing the R 4 group by a cross-coupling reaction such as a Suzuki coupling reaction.
  • -It can be produced by subjecting it to a cyclization reaction using dimethylformamide dimethyl acetal.
  • R 4 group is a tertiary alkyl group can be introduced by cross-coupling reactions such as Kumada coupling reaction [for example, Amruta Joshi-Pangu et al. J. Am. Chem. Soc., 133, 8478-8481 (2011)]. That is, compound (XI) obtained by esterifying the carboxylic acid of compound (VIII) and tertiary alkyl Grignard reagent (R 4 MgBr) are mixed with divalent nickel such as nickel (II) chloride and 1,3-dicyclohexyl-1H-imidazole.
  • divalent nickel such as nickel (II) chloride and 1,3-dicyclohexyl-1H-imidazole.
  • the tertiary alkyl compound (XII) can be synthesized by stirring at room temperature under ice cooling in the presence of an N-heterocyclic carbene catalyst such as -3-ium. After the compound (XII) is hydrolyzed, it can be converted to a carbamoyl group to lead to the compound (X).
  • the boronyl group represented by W may be in the form of an alkali metal or alkaline earth metal salt.
  • boronic acid ester groups include boronic acid dimethyl ester group, boronic acid diethyl ester group, boron Acid dibutyl ester group, boronic acid dicyclohexyl group, boronic acid ethylene glycol ester group, boronic acid propylene glycol ester group (boronic acid 1,2-propanediol ester group, boronic acid 1,3-propanediol ester group), boronic acid neo Boronic acid ester groups such as pentyl glycol ester group, boronic acid catechol ester group, boronic acid glycerin ester group, boronic acid trimethylolethane ester group, boronic acid diethanolamine ester group, boronic acid triethanolamine ester group; Group, and the like.
  • the above methods are appropriately combined, and methods commonly used in organic synthetic chemistry (for example, alkylation reaction of amino group, reaction of oxidizing alkylthio group to sulfoxide group or sulfone group, alkoxy group to hydroxyl group, or vice versa)
  • alkylation reaction of amino group for example, alkylation reaction of amino group, reaction of oxidizing alkylthio group to sulfoxide group or sulfone group, alkoxy group to hydroxyl group, or vice versa
  • the compound (I) of the present invention having a desired functional group at a desired position can be obtained.
  • prodrugs can be synthesized by synthetic organic chemistry while protecting or deprotecting functional groups of the compound (I) of the present invention or synthetic intermediates as necessary. It can be obtained by esterification that is usually used.
  • the compound (I) of the present invention can be prepared in the form of a conventional pharmaceutical preparation (pharmaceutical composition) suitable for oral administration, parenteral administration or topical administration.
  • Preparations for oral administration include solid preparations such as tablets, granules, powders and capsules, and liquid preparations such as syrups. These formulations can be prepared by conventional methods. Solid preparations can be prepared by using conventional pharmaceutical carriers such as lactose, starch such as corn starch, crystalline cellulose such as microcrystalline cellulose, hydroxypropylcellulose, calcium carboxymethylcellulose, talc, magnesium stearate, etc. it can. Capsules can be prepared by wrapping the granules or powders thus prepared in capsules. A syrup can be prepared by dissolving or suspending the compound (I) of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof in an aqueous solution containing sucrose, carboxymethylcellulose and the like.
  • Preparations for parenteral administration include infusions such as instillation.
  • Injectable formulations can also be prepared by conventional methods, including isotonic agents (eg, mannitol, sodium chloride, glucose, sorbitol, glycerol, xylitol, fructose, maltose, mannose), stabilizers (eg, sodium sulfite, Albumin) and preservatives (eg, benzyl alcohol, methyl p-oxybenzoate).
  • isotonic agents eg, mannitol, sodium chloride, glucose, sorbitol, glycerol, xylitol, fructose, maltose, mannose
  • stabilizers eg, sodium sulfite, Albumin
  • preservatives eg, benzyl alcohol, methyl p-oxybenzoate
  • the dose of the compound (I) of the present invention, or a pharmaceutically acceptable salt thereof can be varied according to the severity of the disease, the age and weight of the patient, the dosage form, etc. It is in the range of 1 mg to 1,000 mg, which can be administered once or divided into 2 or 3 doses by the oral or parenteral route.
  • the compound (I) of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof can also be used as a BTK inhibitor, as a reagent for experiment or research.
  • reaction mixture was concentrated to about 50 mL under reduced pressure, 6M hydrochloric acid (30 mL) was added, and the mixture was extracted with ethyl acetate (2 ⁇ 100 mL). The obtained organic layers were combined, washed successively with a saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution and saturated brine, and dried over anhydrous sodium sulfate. The solvent was distilled off under reduced pressure to obtain 4-bromo-2-fluoro-6-methylbenzamide (11.0 g).
  • the reaction mixture was diluted with ethyl acetate (200 mL), the insoluble material was filtered off, the filtrate was washed successively with water and saturated brine, and dried over anhydrous sodium sulfate.
  • the solvent was distilled off under reduced pressure, and the resulting residue was purified by column chromatography (silica gel, hexane / ethyl acetate) to give 2-chloro-6- (6-cyclopropyl-8-fluoro-1-oxoisoquinoline-2). (1H) -yl) benzaldehyde (2.7 g) was obtained.
  • the reaction mixture was added to cold water (200 mL), adjusted to pH 2 with concentrated hydrochloric acid (about 5 mL), and extracted with ethyl acetate.
  • the obtained organic layer was dried over anhydrous sodium sulfate, and the solvent was distilled off under reduced pressure.
  • the obtained residue was purified by column chromatography (silica gel, hexane / ethyl acetate) to obtain methyl 4- (tert-butyl) -2-fluoro-6-methylbenzoate (0.45 g).
  • Example compounds [Table 1-1] to [Table 1-3] were prepared by using the corresponding starting materials (commercially available products, or compounds derivatized from commercially available compounds by a known method or a method analogous thereto). According to the method described in the examples, the methods usually used in organic synthetic chemistry were appropriately combined as necessary.
  • Example 34 [Production Example of Compound (I) Corresponding to Prodrug of Example 1] Octanoic acid 2- ⁇ 4-amino-6-[(1-methyl-1H-pyrazol-4-yl) amino] -1,3,5-triazin-2-yl ⁇ -6- (6-cyclopropyl-8) -Fluoro-1-oxoisoquinolin-2 (1H) -yl) benzyl
  • Example compounds (I) described in [Table 3-1] to [Table 3-6] corresponding to the prodrugs of Example 1 listed below are known from the corresponding raw materials (commercial products or commercially available compounds). Or a compound derivatized by a method analogous thereto) according to the method described in Example 34 above, and optionally combining methods commonly used in organic synthetic chemistry as necessary.
  • Test example 1 BTK activity inhibition test (adjustment of dephosphorylated BTK)
  • Dephosphorylated BTK is 10 U / ⁇ g and 2 mM of biotinylated BTK protein BTN-BTK (manufactured by Carna Biosciences), ⁇ protein phosphate (manufactured by New England BioLabs, Code No. P0753S) and MnCl 2 respectively.
  • the mixture was reacted at 4 ° C. overnight, and after removing ⁇ protein phosphate by anti-DYKDDDDK-tag antibody agarose gel chromatography, the buffer was exchanged using 10DG Desalting Column.
  • the kinase activity was measured by a mobility shift assay (MSA) method using QuickScct Screening Assist TM (trademark) MSA (commercially available kit manufactured by Carna Biosciences).
  • MSA mobility shift assay
  • Assay buffer [20 mM HEPES, 0.01% Triton X-100 TM, 2 mM dithiothreitol, pH 7.5], adjusting to be substrate (4 ⁇ M), MgCl 2 (20 mM), ATP (200 ⁇ M), A substrate mixture was prepared.
  • an enzyme solution was prepared by diluting dephosphorylated BTK with an assay buffer so as to be 0.6 nM. From 10 mM DMSO solution of test compound to 10 concentrations (0.00003 mM, 0.0001 mM, 0.0003 mM, 0.001 mM, 0.003 mM, 0.01 mM, 0.03 mM, 0.1 mM, 0.3 mM, 1 mM) Further diluted with DMSO, each was diluted 25-fold with assay buffer to give a drug solution (4% DMSO solution).
  • Test example 2 Inhibition test of autophosphorylation activity of intracellular BTK
  • Ramos cells (2G6.4C10, ATCC No. CRL-1923) were used in RPMI-1640 medium (GIBCO, # A10491) supplemented with 10% FBS (AusGene) and 5% penicillin streptomycin (Nacalai) in a T75 flask. -01) (hereinafter referred to as growth medium) in a 5% CO 2 incubator.
  • the cultured Ramos cells were diluted with RPM-1640 medium (hereinafter referred to as medium) excluding serum so that the cell density was 7.5 ⁇ 10 6 cells / mL, and incubated at 37 ° C. for 45 minutes. After subdividing the cell suspension into 1 mL portions in a 2.0 mL tube, dilute a 0.3 mM DMSO solution of the test compound with the medium, add 500 ⁇ L of the test compound solution adjusted to 0.9 ⁇ M, and the final concentration of the test compound is Incubation was performed at 37 ° C. for 1 hour under the condition of 0.3 ⁇ M. Thereafter, anti-IgM antibody (Invitrogen, H15100) diluted in medium was added to a final concentration of 10 ⁇ g / mL and incubated at 37 ° C. for 10 minutes.
  • medium RPM-1640 medium
  • serum excluding serum
  • the pellets obtained by collecting the cells by centrifugation were added to a Lysis buffer [RIPA Buffer ( ⁇ 1) (Cell Signaling Technology), 1% Phosphase Inhibitor Cocktail 3 (Sigma, No. P0044), 1% Phosphaitase 100 ⁇ L of (Nacalai Co., No. 07575) and 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) added] was added, stirred gently, and allowed to stand for 10 minutes. The supernatant was collected by centrifugation (15,000 rpm, 15 minutes), and the amount of protein was quantified. The sample was mixed with SDS-sample buffer and reacted at 95 ° C.
  • RIPA Buffer ( ⁇ 1) Cell Signaling Technology
  • Phosphase Inhibitor Cocktail 3 Sigma, No. P0044
  • PMSF phenylmethylsulfonyl fluoride
  • the detected band was quantified by densitometry (ATTO CS Analyzer ver3.0), and the luminescence of the phosphorylated BTK band with no compound added and IgM-stimulated group was 100%, phosphorylated with no compound added and IgM-unstimulated group
  • the inhibition rate was calculated from the intensity of the band in each group, assuming that the emission of the BTK band was 0%.
  • Each phosphorylated BTK band was corrected by total BTK.
  • the combinations and dilution concentrations of the primary antibody and the secondary antibody used in this test are as follows.
  • Intracellular BTK autophosphorylation inhibitory activity is indicated by ** for 70% or more, ** for 50% or more and less than 70%, and * for 30% or more and less than 50%.
  • the compound of the present invention strongly inhibited the autophosphorylation activity of intracellular BTK at a concentration of 0.3 ⁇ M.
  • Test Example 2 shows that the compound of the present invention also has a strong inhibitory action on “autophosphorylation activity of intracellular BTK”.
  • Test example 3 Ramos Intracellular Calcium Ion Fluctuation Inhibition Test Intracellular BTK inhibition by the compound of the present invention was verified by measuring the effect of the compound of the present invention on “intracellular calcium influx by BCR stimulation of anti-IgM antibody”.
  • Ramos cells were resuspended and cultured in fresh growth medium (the same growth medium as in Test Example 2) to a cell density of 1.0 ⁇ 10 6 cells / mL, and centrifuged the next day.
  • the cells were recovered by washing with RPMI-1640 medium (medium 1) supplemented with 5% penicillin streptomycin (Nacalai).
  • RPMI-1640 medium medium (medium) supplemented with 1% Ultra Low IgG FBS (GIBCO, # 16250) and 5% penicillin streptomycin (Nacalai) so that the cell density becomes 2.0 ⁇ 10 6 cells / mL.
  • the cell suspension Poly Lysine Coated microplate (BD BioCoat TM, was added in 100 ⁇ L per well of # 356692), after centrifugation (700 rpm, 3 min), 5 of 37 ° C. Incubated for 1 hour in% CO 2 incubator. 100 ⁇ L of calcium indicator Fluo-8NW dye-loading solution (AAT Bioquest, # 36315) was added to each well and incubated for another 30 minutes in a 37 ° C. 5% CO 2 incubator.
  • test compound A 10 mM DMSO stock solution of the test compound is further diluted with DMSO to 6 concentrations (1, 0.3, 0.1, 0.03, 0.01, 0.003 mM), and a DMSO solution containing no test compound is diluted. As controls, each was diluted 47.6-fold with Medium 2, and 10 ⁇ L was added to each well of the plate, followed by incubation at 37 ° C. for 10 minutes (final concentration of test compound, 1, 0.3, 0.00). 1, 0.03, 0.01, 0.003, 0 ⁇ M).
  • FIG. 1 shows the results of the compound of Example 1 as a representative example.
  • the compound of the present invention suppresses “intracellular calcium ion fluctuation by BCR stimulation of anti-IgM antibody” in a concentration-dependent manner from a low concentration, and effectively inhibits BCR signal. I can understand that.
  • PCA passive cutaneous anaphylaxis reaction
  • test compound solution preparation of test compound solution
  • the test compounds were DMSO, polyethylene glycol 400 (PEG # 400, Nacalai Tesque, # 28215-95), 30% (w / v) hydroxypropyl- ⁇ -cyclodextrin aqueous solution (HP- ⁇ -CD, Sigma, # 332607) -500) were added in order and mixed well to prepare a test compound solution (solvent composition: 5% test compound DMSO solution, 30% PEG # 400, 65% HP- ⁇ -CD [30% (w / v) aqueous solution) ]).
  • solvent administration group a DMSO solution was used instead of the test compound DMSO solution.
  • Figure 2 shows the results. As shown in FIG. 2, as compared with the solvent group, the compound of Example 1 significantly suppressed dye leakage into the auricle. That is, the inhibitory effect on the passive skin anaphylactic reaction (PCA reaction) was confirmed.
  • PCA reaction passive skin anaphylactic reaction
  • Test Example 5 Action in mouse collagen-induced arthritis model
  • Incomplete Freund's Adjuvant (Chondrex, # 7002) Tubelucosis H37 Ra, Desiccated (Becton Dickinson, # 2311141) added to 2.5 mg / mL and Bovine Type II Collagen, 2 mg / mL Solution (Chondrex, # 20022) were mixed 1: 1.
  • an emulsified emulsion was prepared.
  • Three groups of DBA / 1J mice (10 mice / group) (6 weeks old, male) were injected on days 0 and 21 with 0.1 mL of emulsion per mouse divided into ridge skins. And immunized.
  • the solvent or the test compound solution was orally administered twice daily from the 18th day to the 36th day (test compound dose to each group: 0 mg / kg, 30 mg / kg, 60 mg / kg).
  • the preparation of the administration liquid was similarly performed using the same solvent as in Test Example 4.
  • the onset of arthritis in each limb was visually scored according to the criteria shown in Table 7.
  • the scores of all the limbs were summed for each mouse, and the average value of 10 mice in each group was used as the arthritis score (normal 0 to maximum 16).
  • Example 1 which is a compound of the present invention suppressed the onset of arthritis in a dose-dependent manner as shown in FIG. Moreover, at this time, it did not show toxicity such as weight loss. From these results, it was confirmed that the compound of the present invention has an excellent anti-inflammatory action and is highly likely to be excellent in safety.
  • Test Example 6 Action in rat collagen-induced arthritis model
  • the preparation of the administration liquid was similarly performed using the same solvent as in Test Example 4. After the 7th day of booster immunization, the arthritis development state of each limb was visually scored twice a week according to the criteria shown in Table 8. The scores of all the limbs were summed for each rat, and the average value of 10 animals in each group was used as the arthritis score (normal 0 to maximum 16).
  • Example 1 which is a compound of the present invention suppressed the onset of arthritis in a dose-dependent manner as shown in FIG. Moreover, at this time, it did not show toxicity such as weight loss. From these results, it was confirmed that the compound of the present invention has an excellent anti-inflammatory action and is highly likely to be excellent in safety.
  • Test Example 7 Measurement of blood concentration in mice by oral administration (prodrug metabolism confirmation test)
  • a prodrug is desirably metabolized rapidly in the body after being absorbed from the digestive tract to produce an active drug. Therefore, it was examined whether compound (I) corresponding to the prodrug of the present invention is rapidly metabolized into an active drug in the body.
  • a test compound solution suspended in a solvent (0.5% aqueous methylcellulose solution) was orally administered to ICR mice (3 mice / group) (6 weeks old, male) at a test dose of 30 mg / kg. .
  • a blood sample collected from the heart of a mouse under general anesthesia using a heparin-coated syringe was centrifuged (4 ° C., 10,000 rpm, 10 minutes), and a plasma sample was collected.
  • a methanol solution containing 5 ⁇ L of the plasma sample and 495 ⁇ L of the internal standard compound was added and mixed.
  • the denatured protein was removed by centrifugation (4 ° C., 3000 rpm, 3 minutes), and the filtrate (extract) was recovered.
  • a methanol solution of a metabolite containing an internal standard compound was prepared, mixed with plasma collected from an untreated mouse, and processed similarly using a plate with a filter.
  • a calibration curve standard solution prepared by mixing a methanol solution of the prodrug and a methanol solution of the internal standard compound was used.
  • the concentration of the prodrug and its metabolite compound of Example 1 in the extract was determined from the calibration curve using the peak area ratio with the internal standard substance using LC / MS (liquid chromatograph mass spectrometry). The concentration was quantified.
  • the prodrug compound of the present invention was not observed in the blood after oral administration, and the compound of Example 1 as a metabolite was observed. From this, it was confirmed that the prodrug form of the present invention was rapidly metabolized in the body and converted into an active form.
  • the compounds provided by the present invention against diseases known to be associated with abnormal cellular responses mediated by BTK such as autoimmune diseases, inflammatory diseases, bone diseases, cancers such as lymphoma, etc. It is useful as a prophylactic or therapeutic drug (pharmaceutical composition) or a prodrug thereof. Further, it is useful as a BTK inhibitor in reagents for experiments and research.

Abstract

　下記式（Ｉ）で表されるトリアジン誘導体又はその薬学的に許容される塩を提供することを目的とする。 （式中、Ｒ１は、置換基を有してもよい低級アルキル基を表し、Ｒ２は、水素原子、置換基を有してもよい低級アルキル基を表し、Ａは、窒素原子もしくはＣ－Ｒ３を表し、Ｒ３は、水素原子、シアノ基、置換基を有してもよいアシル基、置換基を有してもよいスルホニル基、置換基を有してもよいカルバモイル基を表し、Ｒ４は、置換基を有してもよい低級アルキル基、置換基を有してもよいシクロアルキル基を表す。）

Description

新規トリアジン誘導体
　本発明は、医薬、特にＢＴＫ阻害作用を有する新規なトリアジン誘導体、そのプロドラッグまたはそれらの薬学的に許容される塩に関する。
　ブルトンチロシンキナーゼ（Ｂｒｕｔｏｎ’ｓ　ｔｙｒｏｓｉｎｅ　ｋｉｎａｓｅ； ＢＴＫ）は、非受容体チロシンキナーゼのＴｅｃファミリーの一つであり、Ｔリンパ球およびナチュラルキラー細胞以外のすべての造血系細胞型において発現している重要なシグナル伝達酵素である。ＢＴＫは、Ｂ細胞の生存、分化、増殖および活性化等にかかる重要な制御因子であり、Ｂ細胞のシグナル伝達に重要な役割を担っている（非特許文献１、２）。細胞表面のＢ細胞受容体(Ｂ‐ｃｅｌｌ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＢＣＲ)は、その下流に存在するＢＴＫを介して細胞内にシグナルを伝達しており、そのためＢ細胞のシグナル伝達経路の異常な活性化は、Ｂ細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病等のがん細胞の増殖と生存を促進すると考えられている（非特許文献３）。また、ＢＴＫは、他の数多くの細胞のシグナル経路においても重要な役割を果たしていることが知られており、アレルギー疾患、自己免疫疾患および炎症性疾患などにも関与していると言われている（非特許文献１）。例えば、ＢＴＫはマスト細胞において、高親和性ＩｇＥレセプター（ＦｃεＲＩ）のシグナル伝達に重要な役割を果たしており、ＢＴＫが欠損するマスト細胞は、脱顆粒の減少や炎症誘発性サイトカインの産生が減少していることが知られている（非特許文献４）。また、ＢＴＫ欠損マウスの実験において、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）にＢＴＫが関与していることが示唆されている（非特許文献５）。更にＢＴＫ変異マウスはコラーゲン誘導関節炎の発症に抵抗性を示す（非特許文献６）。従って、ＢＴＫ阻害活性を有する化合物は、ＢＴＫのシグナルが関与している疾患、例えば、癌、Ｂ細胞リンパ腫および慢性リンパ性白血病等の治療に有用であり、さらにはアレルギー疾患、自己免疫疾患および炎症性疾患等の治療にも有用である。
　上記ＢＴＫ阻害作用を有する化合物が種々報告されている（特許文献１）。
ＷＯ２０１３／１３３３６７号公報
Ｓａｔｔｅｒｔｈｗａｉｔｅ，Ａ．Ｂ．ａｎｄ　Ｗｉｔｔｅ，Ｏ．Ｎ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，２０００，１７５，１２０-１２７ Ｋｕｒｏｓａｋｉ，Ｔ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０００，１２，２７６－２８１ Ｄａｖｉｓ，Ｒ．Ｅ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１０，４６３，８８－９２ Ｅｌｌｍｅｉｅｒ，Ｗ．，ｅｔ　ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｊ.，２０１１），２７８，１９９０－２０００ Ｈａｌｃｏｍｂ，Ｋ．Ｅ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００８，４６（２）、２３３－２４１ Ｊａｎｓｓｏｎ，Ｌ．ａｎｄ Ｈｏｌｍｄａｈｌ，Ｒ.，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９３，９４，４５９－４６５
　本発明は、医薬、特にＢＴＫ阻害作用を有する新規なトリアジン誘導体、そのプロドラッグ、またはそれらの薬学的に許容される塩を提供することを課題とする。
　本発明は、以下の（１）から（２）によって達成される。
（１）下式（Ｉ）で示されるトリアジン誘導体、その薬学的に許容される塩。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
  
（式中、Ｒ１は、置換基を有してもよい低級アルキル基を表し、Ｒ２は、水素原子、置換基を有してもよい低級アルキル基を表し、Ａは、窒素原子もしくはＣ－Ｒ３を表し、Ｒ３は、水素原子、シアノ基、置換基を有してもよいアシル基、置換基を有してもよいスルホニル基、置換基を有してもよいカルバモイル基を表し、Ｒ４は、置換基を有してもよい低級アルキル基、置換基を有してもよいシクロアルキル基を表す。）
（２）Ｒ１が、式－ＣＨ２ＯＲ5を示し、式中Ｒ5は、置換基を有してもよいアシル基である、（１）に記載のトリアジン誘導体、またはその薬学的に許容される塩。
　本発明者らは、上記の課題を解決するために種々検討を重ねた結果、前記式（Ｉ）で示される新規なトリアジン誘導体、そのプロドラッグまたはそれらの薬学的に許容される塩が、優れたＢＴＫ阻害作用を有し、また、コラーゲン誘導関節炎動物モデルに特に優れた抑制効果を示すことを見出し、本発明を完成させた。
　本発明により提供される化合物は、ＢＴＫを介した異常な細胞応答に関連していることが知られている疾患、例えば、自己免疫疾患、炎症性疾患、骨疾患、リンパ腫のような癌等に対する予防または治療用医薬品（医薬組成物），またはそのプロドラッグとして有用である。また、ＢＴＫ阻害剤として、実験用、研究用の試薬に有用である。
実施例１の化合物が、濃度依存的にＲａｍｏｓ細胞内においてＢＣＲシグナルを阻害し、細胞内へのカルシウム流入を抑制していることを示す（試験例３）。 実施例１の化合物が、ＰＣＡ反応試験において、溶媒群と比較して有意に血中色素の耳介への漏出を抑制したことを示す（試験例４）。 実施例１の化合物のマウスコラーゲン誘発関節炎モデルに対する作用を示す（試験例５）。 実施例１の化合物のラットコラーゲン誘発関節炎モデルに対する作用を示す（試験例６）。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明の新規なトリアジン誘導体は、下式（Ｉ）で示される化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
  
（式中、Ｒ１は、置換基を有してもよい低級アルキル基を表し、Ｒ２は、水素原子、置換基を有してもよい低級アルキル基を表し、Ａは、窒素原子もしくはＣ－Ｒ３を表し、Ｒ３は、水素原子、シアノ基、置換基を有してもよいアシル基、置換基を有してもよいスルホニル基、置換基を有してもよいカルバモイル基を表し、Ｒ４は、置換基を有してもよい低級アルキル基、置換基を有してもよいシクロアルキル基を表す。）
　前記式（Ｉ）において、
　置換基を有してもよい低級アルキル基の低級アルキル基部分としては、炭素数１から３の直鎖状、分枝状もしくは環状のアルキル基のいずれでもよく、具体的には、メチル基、イソプロピル基等を挙げることができる。
　置換基を有してもよいシクロアルキル基のシクロアルキル基部分としては、炭素数３から６の環状のアルキル基のいずれでもよく、具体的には、シクロプロピル基、シクロブチル基等を挙げることができる。
　置換基を有してもよいアシル基のアシル基部分としては、直鎖状、分岐鎖状及び環状のいずれの基がカルボニル基に結合したものでもよく、例えば、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、オクタノイル基、ドデカノイル基、ピバロイル基、シクロプロピルカルボニル基、ベンゾイル基等を挙げることができる。
　置換基を有してもよいスルホニル基としては、例えば、メチルスルホニル基、エチルスルホニル基等を挙げることができる。
　置換基を有してもよいカルバモイル基としては、例えば、メチルカルバモイル基、エチルカルバモイル基、ジメチルカルバモイル基等を挙げることができる。
　置換基を有してもよい低級アルキル基、置換基を有してもよいシクロアルキル基、置換基を有してもよいアシル基、置換基を有してもよいスルホニル基、置換基を有してもよいカルバモイル基の「置換基を有しても良い」の置換基としては、特に記載のない限り、１または２個以上の任意の種類の置換基を、化学的に可能な任意の位置に有してもよく、置換基が２個以上の場合、それぞれの置換基は同一であっても異なっていてもよく、例えば、ハロゲン原子、置換もしくは非置換アルキル基、置換もしくは非置換アルコキシ基、置換もしくは非置換アミノ基、ニトロ基、シアノ基、ヒドロキシ基、置換もしくは非置換アルキルアミノ基、置換もしくは非置換カルバモイル基、カルボキシル基、ホルミル基、アセチル基、メシル基、ベンゾイル基、置換もしくは非置換アシルアミノ基、置換もしくは非置換アシルオキシ基などが挙げられる。
　本発明の化合物（Ｉ）は、例えば、置換基の種類によって、異性体が存在する場合がある。本明細書において、それらの異性体の一形態のみの化学構造で記載することがあるが、本発明には、構造上生じ得るすべての異性体（幾何異性体、光学異性体、互変異性体など）も含有し、異性体単体、またはそれらの混合物も含有する。
　また、本発明の化合物（Ｉ）の薬学的に許容される塩としては、塩酸、硫酸、炭酸、リン酸等との無機酸塩、フマル酸、マレイン酸、メタンスルホン酸、ｐトルエンスルホン酸等との有機酸塩等が挙げられる。また、ナトリウム、カリウム等とのアルカリ金属塩、マグネシウム、カルシウム等とのアルカリ土類金属塩、低級アルキルアミン、低級アルコールアミン等との有機アミン塩、リジン、アルギニン、オルニチン等との塩基性アミノ酸塩の他、アンモニウム塩等も本発明に包含される。
　また、「本発明の化合物（Ｉ）」と記載する場合には、特に断りの無い限り、プロドラッグも包含される。
　本発明の化合物（Ｉ）およびその薬学的に許容される塩は、例えば以下の方法によって製造することができる。なお、以下に示した製造法において、定義した基が実施方法の条件下で変化するか、または当該方法を実施するのに不向きな場合、有機合成化学で通常用いられる方法、例えば、官能基の保護、脱保護［Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　３ｒｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９９］等の手段を付すことにより容易に製造することができる。また、必要に応じて置換基導入等の反応工程の順序を変えることもできる。
　以下の説明で使用される略語、記号の意味は次の通りである。
ＤＣＭ　：　ジクロロメタン
ＴＨＦ　：　テトラヒドロフラン
ＤＩＥＡ　：　Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ　：　ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ　：　ジメチルスルホキシド
ＣＤＣｌ３　：　重クロロホルム
［本発明の化合物（Ｉ）の製法］
　式（Ｉ）で表される本発明の化合物は、例えばスキーム１によって製造することができる。
［スキーム１］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
  
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ａは前記と同義であり、Ｗはボロニル基またはボロン酸エステル基を表す。）
　本発明の化合物（Ｉ）は、化合物（ＩＩ）と化合物（ＩＩＩ）を用いて鈴木カップリング反応などのクロスカップリング反応により製造することができる（例えば、鈴木カップリング反応の条件については公知文献（Ｎ．Ｍｉｙａｕｒａ，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０７，９７２（１９８５）．，Ｎ．Ｍｉｙａｕｒａ，Ａ．Ｓｕｚｕｋｉ，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９５，２４５７（１９９５））などを参照）。すなわち、パラジウムやニッケルなどの金属触媒の存在下、必要に応じて塩基および添加剤を使用して実施することができる。反応に用いる溶媒としてはＴＨＦ、ジオキサン、トルエン、ジメトキシエタン、メタノール、エタノール、アセトニトリルなどが挙げられる。また、これらの溶媒を２種以上混合して、或いはそれらを更に水と混合して用いても好適である。好ましくは、ＴＨＦと水の混合溶媒、トルエンとメタノールおよび水との混合溶媒、またはジオキサンである。化合物（ＩＩ）は化合物（ＩＩＩ）に対し当量または過剰量用いることが好ましく、より好ましくは１当量から１０当量である。必要に応じて反応を加速させるために塩基を添加してもよく、塩基としては炭酸ナトリウム、炭酸セシウム、炭酸カリウムなどが通常用いられる。使用する塩基の用量は化合物（ＩＩＩ）に対し１当量から１０当量が挙げられ、好ましくは１当量から５当量である。金属触媒としては、クロスカップリングに用いられている市販で入手容易なパラジウム触媒（例えば、ＰｄＣｌ２（ｄｐｐｆ）、Ｐｄ２（ｄｂａ）３、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４など）を用いることができ、化合物（ＩＩＩ）に対して触媒量、すなわち０．１当量から０．５当量を添加することが好ましい。
　反応を加速させるために必要に応じて添加剤を加えることができ、例えば、添加剤としｒａｃ－ＢＩＮＡＰなどが挙げられ、化合物（ＩＩＩ）に対して０．０１当量から１当量用いることができる。反応は０℃から２００℃の間で数分間から数日間、好ましくは１０℃から１００℃の間で、1時間から３６時間反応させることにより合成することができる。もしくは、マイクロウェーブ合成装置を用い、例えば６０℃から１５０℃の温度条件下で、数分から数時間反応させることによっても合成することができる。
　また、スキーム１の原料として用いられる化合物（ＩＩ）は、例えばスキーム２に表す方法によって製造することができる。
［スキーム２］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
  
（式中、Ｒ１、Ｒ４およびＷは前記と同義であり、Ｘはハロゲンを表す。）
　化合物（ＩＩ）は、化合物（ＩＶ）をｎ－ブチルリチウムなどで活性化したのち、ホウ酸エステルと反応させることにより製造することができる。すなわち、化合物（ＩＩ）は、化合物（ＩＶ）を１～５モル当量、好ましくは１～１．５モル当量のｎ－ブチルリチウムで処理してリチウム化し、１～５モル当量、好ましくは１～１．５モル当量のホウ酸エステルと反応させることにより得ることができる。
　溶媒は、反応に不活性なものであればいずれでもよく、特に限定されるものではないが、好ましくはＴＨＦを用いることができる。
　反応温度は、通常－１００℃から－３０℃、好ましくは－８０℃から－６０℃である。反応時間は特に限定されないが、通常、０．１時間から１２時間が例示され、０．２時間から６時間が好ましい例として挙げられる。
　また、化合物（ＩＩ）は、化合物（ＩＶ）と１～５モル当量、好ましくは１～１．５モル当量の金属マグネシウムと触媒量のヨウ素をエーテル系溶媒中、－１０℃から用いる溶媒の沸点の間の温度で反応させてグリニヤール試薬とし、１～５モル当量、好ましくは１～１．５モル当量のホウ酸エステルと反応させることでも得ることができる。反応温度は、通常－３０℃から－１００℃、好ましくは－６０℃から－８０℃である。反応時間は、特に限定されないが、通常、０．１時間から１２時間が例示され、０．２時間から６時間が好ましい例として挙げられる。
　さらに、化合物（ＩＩ）は、化合物（ＩＶ）とパラジウムやニッケルなどの金属触媒および塩基の存在下、有機溶媒中、１～５モル当量、好ましくは１～３モル当量のジボロンエステルとカップリング反応させることにより得ることができる。
　金属触媒としては、クロスカップリングに用いられる市販で入手容易なパラジウム触媒（例えば、ＰｄＣｌ２（ｄｐｐｆ）、Ｐｄ２（ｄｂａ）３、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４など）を用いることができ、化合物（ＩＶ）に対して触媒量、すなわち０．１当量から０．５当量を添加することが好ましい。塩基としては酢酸カリウムなどが通常用いられる。使用する塩基の用量は、化合物（ＩＶ）に対し１当量から１０当量が挙げられ、好ましくは１当量から５当量である。
　溶媒は反応に不活性なものであればいずれでもよく、特に限定されるものではないが、好ましくはジオキサンを用いることができる。
　反応温度は、通常０℃から２００℃、好ましくは１０℃から１００℃である。反応時間は、特に限定されないが、通常、０．２時間から４８時間が例示され、1時間から３６時間が好ましい例として挙げられる。
これらの反応は、いずれも不活性ガス(アルゴン、窒素等)雰囲気下、無水条件で行うことが望ましい。
　スキーム２の原料として用いられる化合物（ＩＶ）は、例えばスキーム３に表す方法によって製造することができる。
［スキーム３］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
  
（式中、Ｒ１、Ｒ４およびＸは前記と同義である。）
　化合物（ＩＶ）は、化合物（Ｖ）と１～５モル当量、好ましくは１．５～３モル当量の化合物（ＶＩ）を極性溶媒中、金属触媒の存在下、塩基を使用して反応させることにより得られる。
　溶媒は反応に不活性なものであればいずれでもよく、特に限定されるものではないが、好ましくはジオキサンを用いることができる。
　本カップリング反応を実施するにあたり、必要に応じて化合物（ＶＩ）のＲ１を有機合成化学で通常用いられる方法を適宜組み合わせて保護、脱保護することでも化合物（ＩＶ）を製造することができる。例えば、化合物（ＶＩ）の水酸基やアミノ基の官能基の保護、脱保護［Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　３ｒｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９９］や化合物（ＶＩ）の水酸基前駆体であるアルデヒド誘導体を用いることができる。
　反応は、通常８０℃から２００℃の間で、０．５時間から２００時間が例示され、好ましくは１００℃から１５０℃で、1時間から１００時間反応させることにより実施できる。反応はマイクロウェーブ照射条件下において実施しても好適である。
　使用する金属触媒としては市販で入手容易なパラジウム触媒（例えば、ＰｄＣｌ２（ｄｐｐｆ）、Ｐｄ２（ｄｂａ）3、Ｐｄ（ＰＰｈ3）４など）もしくは、ヨウ化銅（Ｉ）を用いることができ、化合物（Ｖ）に対して０．０１当量から２当量を添加することが好ましい。
　使用する塩基としては炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸セシウム、炭酸水素ナトリウムが例示され、好ましくは炭酸セシウム、炭酸水素ナトリウムを用いることができ、化合物（Ｖ）に対して１～１０モル当量、好ましくは２～５モル当量が例示される。また必要に応じて０．１当量から０．５当量のキサントホスを添加しても合成できる。
　化合物（ＶＩ）は市販品として、または公知の方法もしくはそれに準じた方法により得ることができる。
　スキーム１の原料として用いられる化合物（ＩＩＩ）は、例えばスキーム４に表す方法によって製造することができる。
［スキーム４］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
  
（式中、Ｒ２、Ａは前記と同義である。）
　化合物（ＩＩＩ）は、アミン（ＶＩＩ）と１～５モル当量、好ましくは１～１．５モル当量の２－アミノ－４，６－ジクロロ－１，３，５－トリアジンを極性溶媒中、必要に応じて塩基触媒存在下、反応させることにより得られる。
　溶媒は反応に不活性なものであればいずれでもよく、特に限定されるものではないが、好ましくはＤＭＦおよびＴＨＦを用いることができる。
　反応温度は、通常０℃から２００℃、好ましくは１０℃から１００℃である。反応時間は特に限定されないが、通常、０．２時間から４８時間が例示され、1時間から３６時間が好ましい例として挙げられる。
　スキーム４の出発原料である２－アミノ－４，６－ジクロロ－１，３，５－トリアジンは市販品として、アミン（ＶＩＩ）は、市販品または公知の方法もしくはそれに準じた方法により得ることができる。
スキーム３の原料として用いられる化合物（Ｖ）は、例えばスキーム５に表す方法によって製造することができる。
［スキーム５］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
  
（式中、Ｒ４、ＸおよびＷは前記と同義であり、Ｒ’は低級アルキルを表す。）
　化合物（Ｖ）は、化合物（ＶＩＩＩ）のカルボン酸をカルバモイル基に変換したのち、Ｒ４基を鈴木カップリング反応などのクロスカップリング反応で導入して得られた化合物（Ｘ）をＮ，Ｎ‐ジメチルホルムアミドジメチルアセタールを使用した環化反応に供することにより製造することができる。
　また、Ｒ４基が３級アルキル基である場合は、熊田カップリング反応などのクロスカップリング反応でも導入することができる［例えば、Amruta Joshi-Pangu et al. J. Am. Chem. Soc., 133, 8478-8481 (2011)参照］。すなわち、化合物（ＶＩＩＩ）のカルボン酸をエステル化した化合物（ＸＩ）と３級アルキルグリニャール試薬（Ｒ４ＭｇＢｒ）を、塩化ニッケル（II）等の二価ニッケルならびに１、３－ジシクロヘキシル－１Ｈ－イミダゾール－３－イウム等のＮ－ヘテロ環状カルベン触媒存在下、氷冷下から室温条件にて攪拌することで、３級アルキル化合物（ＸＩＩ）を合成することができる。化合物（ＸＩＩ）を加水分解後、カルバモイル基に変換することで化合物（Ｘ）に導くことができる。
　スキーム５の出発原料である（ＶＩＩＩ）は市販品または公知の方法もしくはそれに準じた方法により得ることができる。
　上記スキーム中、Ｗで示されるボロニル基は、アルカリ金属やアルカリ土類金属の塩の形でもよく、またボロン酸エステル基の具体例としては、ボロン酸ジメチルエステル基、ボロン酸ジエチルエステル基、ボロン酸ジブチルエステル基、ボロン酸ジシクロヘキシル基、ボロン酸エチレングリコールエステル基、ボロン酸プロピレングリコールエステル基（ボロン酸１，２－プロパンジオールエステル基、ボロン酸１，３－プロパンジオールエステル基）、ボロン酸ネオペンチルグリコールエステル基、ボロン酸カテコールエステル基、ボロン酸グリセリンエステル基、ボロン酸トリメチロールエタンエステル基、ボロン酸ジエタノールアミンエステル基、ボロン酸トリエタノールアミンエステル基等のボロン酸エステル基；ボロン酸無水物基等が挙げられる。
　なお、上記の方法を適宜組み合わせ、有機合成化学で通常用いられる方法（例えば、アミノ基のアルキル化反応、アルキルチオ基をスルホキシド基もしくはスルホン基へ酸化する反応、アルコキシ基をヒドロキシル基、もしくはその逆へ変換する反応）を実施することにより、所望の位置に所望の官能基を有する本発明の化合物（Ｉ）を得ることができる。
　また、本発明の化合物（Ｉ）のうち、プロドラッグは、本発明の化合物（Ｉ）あるいはその合成中間体を、必要に応じて官能基の保護、脱保護を実施しながら、有機合成化学で通常用いられるエステル化することにより得ることができる。
［本発明の化合物（Ｉ）の用途］
　本発明の化合物（Ｉ）、またはその薬学的に許容される塩は、経口投与、非経口投与または局所的投与に適した従来の薬学製剤（医薬組成物）の形態に調製することができる。
　経口投与のための製剤は、錠剤、顆粒、粉末、カプセルなどの固形剤、およびシロップなどの液体製剤を含む。これらの製剤は従来の方法によって調製することができる。固形剤は、ラクトース、コーンスターチなどのデンプン、微結晶性セルロースなどの結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルシウムカルボキシメチルセルロース、タルク、ステアリン酸マグネシウムなどのような従来の薬学的担体を用いることによって調製することができる。カプセルは、このように調製した顆粒または粉末をカプセルに包むことによって調製することができる。シロップは、ショ糖、カルボキシメチルセルロースなどを含む水溶液中で、本発明の化合物（Ｉ）またはその薬学的に許容される塩を溶解または懸濁することによって調製することができる。
　非経口投与のための製剤は、点滴注入などの注入物を含む。注入製剤もまた従来の方法によって調製することができ、等張化剤（例えば、マンニトール、塩化ナトリウム、グルコース、ソルビトール、グリセロール、キシリトール、フルクトース、マルトース、マンノース）、安定化剤（例えば、亜硫酸ナトリウム、アルブミン）、防腐剤（例えば、ベンジルアルコール、ｐ－オキシ安息香酸メチル）中に適宜組み入れることができる。
　本発明の化合物（Ｉ）、またはその薬学的に許容される塩の用量は、疾患の重症度、患者の年齢および体重、投薬形態などに従って変化させることができるが、通常は成人において１日あたり１ｍｇ～１，０００ｍｇの範囲であり、それは経口経路または非経口経路によって、１回、または２回もしくは３回に分割して投与することができる。
　また、本発明の化合物（Ｉ）、またはその薬学的に許容される塩は、ＢＴＫ阻害剤として、実験用、研究用の試薬として用いることもできる。
　以下に実施例および試験例などを挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、これらの実施例により本発明が限定されるものではない。
　化合物の同定は水素核磁気共鳴スペクトル（1Ｈ－ＮＭＲ）およびマススペクトル（ＭＳ）により行った。1Ｈ－ＮＭＲは、特に指示のないかぎりは４００ＭＨｚで測定されたものであり、また化合物および測定条件によっては交換性水素が明瞭に観測されない場合がある。なお、ｂｒ．は幅広いシグナル（ブロード）を意味する。
　ＨＰＬＣ分取クロマトグラフィーは、市販のＯＤＳカラムを用い、特に記載のない限りは水/メタノール（ギ酸を含む）を溶出液としてグラジェントモードにて分取した。
参考例１
　酢酸　２－（６－シクロプロピル－８－フルオロ－１－オキソイソキノリン－２（１Ｈ）－イル）－６－（４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン－２－イル）ベンジル
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
  
（第１工程）
　窒素雰囲気下、０℃に冷却した４－ブロモ－２－フルオロ－６－メチル安息香酸（１３．０ｇ，５５．８ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（１００ｍＬ）に、１，１’－カルボニルジイミダゾール（１１．８ｇ，７２．５ｍｍｏｌ）を加え、０℃で２時間攪拌した。本反応液に、２８％アンモニア水溶液（１０ｍＬ）を５分間かけて滴加し、室温でさらに２日間攪拌した。反応混合物を減圧下で約５０ｍＬになるまで濃縮したのち、６Ｍ塩酸（３０ｍＬ）を加え、酢酸エチル（２×１００ｍＬ）で抽出した。得られた有機層を合わせ、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および飽和食塩水で順に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧留去し、４－ブロモ－２－フルオロ－６－メチルベンズアミド（１１．０ｇ）を得た。
1H  NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.22 (dt, J = 1.8, 0.8 Hz, 1H), 7.15 (dd, J = 9.0, 1.9 Hz, 1H), 6.06 - 5.60 (m, 2H), 2.44 (s, 3H)；LCMS (m/z): 231.9 [M+H] +. 
（第２工程）
　窒素雰囲気下、４－ブロモ－２－フルオロ－６－メチルベンズアミド（１１．０ｇ）のトルエン（１１０ｍＬ）および水（１１ｍＬ）の混合溶液に、シクロプロピルボロン酸（６．１１ｇ，７１．１ｍｍｏｌ）、トリシクロヘキシルホスフィン（０．８０ｇ，２．８４ｍｍｏｌ）、トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（０）（０．４３ｇ，０．４７ｍｍｏｌ）及び炭酸カリウム（１９．６５ｇ，１４２．０ｍｍｏｌ）を加え、１１５℃で１４時間攪拌した。室温まで冷却後、析出した固体をろ取し、得られた固体をエーテル及び水で洗浄し、４－シクロプロピル－２－フルオロ－６－メチルベンズアミド（３．３ｇ）を得た。更に、ろ液を酢酸エチル（２×２００ｍＬ）で抽出し、得られた有機層を合わせ、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧留去し、得られた残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘキサン／酢酸エチル）で精製して、４－シクロプロピル－２－フルオロ－６－メチルベンズアミド（５．３ｇ）を得た。
1H  NMR (400 MHz, CDCl3) 6.80 - 6.70 (m, 1H), 6.60 (dd, J = 11.3, 1.6 Hz, 1H), 5.99 - 5.59 (m, 2H), 2.43 (s, 3H), 1.89 - 1.80 (m, 1H), 1.03 - 0.98 (m, 2H), 0.73 - 0.65 (m, 2H)；LCMS (m/z): 194.0 [M+H] +. 
（第３工程）
　窒素雰囲気下、４－シクロプロピル－２－フルオロ－６－メチルベンズアミド（８．６ｇ，４４．５ｍｍｏｌ）の２-メチルテトラヒドロフラン溶液（１００ｍＬ）に、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドジメチルアセタール（７．０ｇ，５８．８ｍｍｏｌ）を加え、６０℃で２時間攪拌した。反応溶液を減圧濃縮したのち、得られた残渣に２－メチルテトラヒドロフラン（１０ｍＬ）を加えた。この溶液に、１ｍｏｌ/Ｌのカリウム ｔｅｒｔ－ブトキシドのＴＨＦ溶液（６８．１ｍＬ、６８．１ｍｍｏｌ）を滴下して加え、６５℃で1日間攪拌した。室温まで冷却したのち、反応混合物を１Ｍ塩酸水溶液（２００ｍＬ）に加えた。この溶液に、イソプロピルアルコール（３００ｍＬ）を加え、溶媒を減圧留去した。得られた固体をろ取し、６－シクロプロピル－８－フルオロイソキノリン－１（２Ｈ）－オン（７．７ｇ）を得た。
1H  NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ11.06 (s, 1H), 7.16 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 7.11 (dd, J = 7.1, 5.7 Hz, 1H), 6.88 (dd, J = 13.3, 1.7 Hz, 1H), 6.41 (dd, J = 7.1, 2.3 Hz, 1H), 2.07 - 1.95 (m, 1H), 1.08 - 1.01 (m, 2H), 0.86 - 0.79 (m, 2H)；LCMS (m/z): 204.1 [M+H] +. 
（第４工程）
　窒素雰囲気下、６－シクロプロピル－８－フルオロイソキノリン－１（２Ｈ）－オン（２．６ｇ，１２．８ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（２５ｍＬ）に、２－ブロモ－６－クロロベンズアルデヒド（３．６５ｇ，１６．６３ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（３．５４ｇ，２５．６ｍｍｏｌ）及びヨウ化銅（Ｉ）（０．４９ｇ、２．５６ｍｍｏｌ）を加え、１１０℃で１日間攪拌した。反応混合物を酢酸エチル（２００ｍＬ）で希釈したのち、不溶物をろ過し、ろ液を水及び飽和食塩水で順に洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧留去し、得られた残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘキサン／酢酸エチル）で精製して、２－クロロ－６－（６－シクロプロピル－８－フルオロ－１－オキソイソキノリン－２（１Ｈ）－イル）ベンズアルデヒド（２．７ｇ）を得た。
1H  NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ10.18 (s, 1H), 7.84 - 7.78 (m, 1H), 7.75 (dd, J = 8.2, 1.3 Hz, 1H), 7.49 (dd, J = 7.8, 1.2 Hz, 1H), 7.41 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.27 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 7.00 (dd, J = 13.3, 1.6 Hz, 1H), 6.64 (dd, J = 7.5, 2.2 Hz, 1H), 2.14 - 2.01 (m, 1H), 1.14 - 1.06 (m, 2H), 0.92 - 0.83 (m, 2H)；LCMS (m/z): 342.1 [M+H] +. 
（第５工程）
　窒素雰囲気下、０℃に冷却した２－クロロ－６－（６－シクロプロピル－８－フルオロ－１－オキソイソキノリン－２（１Ｈ）－イル）ベンズアルデヒド（２．５ｇ，７．３２ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（２６ｍＬ）及びイソプロピルアルコール（１３ｍＬ）の混合溶液に、水素化ホウ素ナトリウム（０．４２ｇ,１１．０ｍｍｏｌ）を加え、０℃で２時間攪拌した。反応溶液に水（５０ｍＬ）を加え、酢酸エチル（２×５０ｍＬ）で抽出した。得られた有機層を合わせ、水および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧留去し、２－［３－クロロ－２－（ヒドロキシメチル）フェニル］－６－シクロプロピル－８－フルオロイソキノリン－１（２Ｈ）－オン（２．３ｇ）を得た。
1H  NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.55 (dd, J = 8.1, 1.2 Hz, 1H), 7.40 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.15 (dd, J = 8.0, 1.2 Hz, 1H), 7.08 - 7.00 (m, 2H), 6.82 (dd, J = 12.7, 1.7 Hz, 1H), 6.51 (dd, J = 7.4, 2.1 Hz, 1H), 4.71 - 4.61 (m, 1H), 4.46 (d, J = 11.9 Hz, 1H), 3.43 - 3.29 (m, 1H), 2.03 - 1.97 (m, 1H), 1.18 - 1.10 (m, 2H), 0.88 - 0.81 (m, 2H)；LCMS (m/z): 343.9 [M+H] +. 
（第６工程）
　窒素雰囲気下、２－［３－クロロ－２－（ヒドロキシメチル）フェニル］－６－シクロプロピル－８－フルオロイソキノリン－１（２Ｈ）－オン（２．２６ｇ，６．５９ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（３０ｍＬ）に、ピリジン（２．３６ｍＬ，２９．３ｍｍｏｌ）及び塩化アセチル（１．５６ｍＬ，２１．９５ｍｍｏｌ）を加え、室温で１日間攪拌した。反応混合物に水（５０ｍＬ）を加え、酢酸エチル（２×５０ｍＬ）で抽出した。得られた有機層を合わせ、水および飽和食塩水で順に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧留去し、得られた残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘキサン／酢酸エチル）で精製して、酢酸　２－クロロ－６－（６－シクロプロピル－８－フルオロ－１－オキソイソキノリン－２（１Ｈ）－イル）ベンジル（２．３ｇ）を得た。
1H  NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.53 (dd, J = 8.2, 1.2 Hz, 1H), 7.46 - 7.39 (m, 1H), 7.22 (dd, J = 7.9, 1.3 Hz, 1H), 7.04 - 6.98 (m, 2H), 6.80 (dd, J = 12.6, 1.7 Hz, 1H), 6.43 (dd, J = 7.4, 2.1 Hz, 1H), 5.25 (d, J = 12.5 Hz, 1H), 4.98 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 2.02 - 1.96 (m, 1H), 1.96 (s, 3H), 1.16 - 1.10 (m, 2H), 0.86 - 0.81 (m, 2H)；LCMS (m/z): 386.0 [M+H] +. 
（第７工程）
　窒素雰囲気下、酢酸　２－クロロ－６－（６－シクロプロピル－８－フルオロ－１－オキソイソキノリン－２（１Ｈ）－イル）ベンジル（４．８ｇ，１２．４４ｍｍｏｌ）のジオキサン溶液（１８０ｍＬ）に、ビス（ピナコラト）ジボロン（９．４８ｇ，３７．３ｍｍｏｌ）、ビス（ジベンジリデンアセトン）パラジウム（０）（０．３６ｇ，０．６２ｍｍｏｌ）、２，４，６－トリイソプロピル－２'－（ジシクロヘキシルホスフィノ）ビフェニル（０．５９ｇ，１．２４ｍｍｏｌ）、および酢酸カリウム（３．６６ｇ，３７．３ｍｍｏｌ）を加え、６５℃で１６時間加熱した。反応混合物を酢酸エチル（２００ｍＬ）で希釈したのち、不溶物をセライトろ過した。ろ液に水（２００ｍＬ）を加え、酢酸エチル（２×２００ｍＬ）で抽出した。得られた有機層を合わせ、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧留去し、得られた残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘキサン／酢酸エチル）で精製した。得られた油状の残渣にヘキサンを加え、析出した固体をろ取して、標記化合物（３．０５ｇ）を得た。
1H  NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.93 (dd, J = 7.4, 1.4 Hz, 1H), 7.47 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 7.35 (dd, J = 7.8, 1.5 Hz, 1H), 7.02 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 7.00 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 6.78 (dd, J = 12.7, 1.7 Hz, 1H), 6.40 (dd, J = 7.4, 2.1 Hz, 1H), 5.45 (d, J = 11.8 Hz, 1H), 5.03 (d, J = 11.9 Hz, 1H), 2.03 - 1.93 (m, 1H), 1.92 (s, 3H), 1.34 (s, 12H), 1.15 - 1.08 (m, 2H), 0.87 - 0.80 (m, 2H)；LCMS (m/z): 478.2 [M+H] +. 
参考例２
　酢酸　２－［６－（ｔｅｒｔ－ブチル）－８－フルオロ－１－オキソイソキノリン－２（１Ｈ）－イル］－６－（４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン－２－イル）ベンジル
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
  
（第１工程）
　窒素雰囲気下、０℃に冷却した４－ブロモ－２－フルオロ－６－メチル安息香酸メチル（１．０ｇ，４．０５ｍｍｏｌ）、塩化ニッケル（II）（０．１３ｇ，０．８１ｍｍｏｌ）、１、３－ジシクロヘキシル－１Ｈ－イミダゾール－３－イウム（０．２６ｇ，０．８１ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（１０ｍＬ）に１Ｍ　ｔｅｒｔ－ブチルマグネシウムブロミド（ＴＨＦ溶液、１２．１ｍＬ，１２．１ｍｍｏｌ）を１０分間かけて滴下し、その後、室温で２４時間攪拌した。本反応液を冷水（２００ｍＬ）へ加え、濃塩酸（約５ｍＬ）でｐＨ２に調節し、酢酸エチルで抽出した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘキサン／酢酸エチル）で精製して、４－（ｔｅｒｔ－ブチル）－２－フルオロ－６－メチル安息香酸メチル（０．４５ｇ）を得た。
　得られた４－（ｔｅｒｔ－ブチル）－２－フルオロ－６－メチル安息香酸メチル（０．３５ｇ）をＴＨＦ－メタノール混合溶液（１：１、１０ｍＬ）に溶解し、４Ｍ水酸化リチウム水溶液（２ｍＬ）を加え、６０℃で６時間攪拌した。
　反応溶液を冷水で希釈したのち、有機溶媒を減圧下に留去して水溶液とした。この水溶液を濃塩酸でｐＨ２に調整し、酢酸エチルで抽出した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去し、４－（ｔｅｒｔ－ブチル）－２－フルオロ－６－メチル安息香酸の粗生成物（０．３５ｇ）を得た。
LCMS (m/z): 211.0 [M+H] +. 
（第２工程）
　窒素雰囲気下、０℃に冷却した４－（ｔｅｒｔ－ブチル）－２－フルオロ－６－メチル安息香酸（０．２１ｇ，１．０ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（１０ｍＬ）に、１，１’－カルボニルジイミダゾール（０．２１ｇ，１．３０ｍｍｏｌ）を加え、０℃で２時間攪拌した。本反応液に、２８％アンモニア水溶液（１０ｍＬ）を滴加し、室温でさらに２日間攪拌した。反応混合物を減圧下で濃縮したのち、６Ｍ塩酸を加え、酢酸エチルで２回抽出した。得られた有機層を合わせ、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および飽和食塩水で順に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧留去し、４－（ｔｅｒｔ－ブチル）－２－フルオロ－６－メチルベンズアミド（０．２０ｇ）を得た。
1H  NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ 7.85 (s, 1H), 7.58 (s, 1H), 7.10 - 7.07 (m, 1H), 7.05 - 7.00 (m, 1H), 2.29 (s, 3H), 1.26 (s, 9H)；LCMS (m/z): 210.1 [M+H] +. 
（第３工程）
　窒素雰囲気下、４－（ｔｅｒｔ－ブチル）－２－フルオロ－６－メチルベンズアミド（１５０ｍｇ，０．７２ｍｍｏｌ）の２-メチルテトラヒドロフラン溶液（１０ｍＬ）に、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドジメチルアセタール（１１３ｍｇ，０．９５ｍｍｏｌ）を加え、６０℃で２時間攪拌した。反応溶液を減圧濃縮したのち、得られた残渣に２－メチルテトラヒドロフラン（１０ｍＬ）を加えた。この溶液に、１Ｍカリウム ｔｅｒｔ－ブトキシド（ＴＨＦ溶液、１．１ｍＬ、１．１ｍｍｏｌ）を滴下して加え、６５℃で1日間攪拌した。室温まで冷却したのち、反応混合物を１Ｍ塩酸水溶液（１０ｍＬ）に加え、酢酸エチルで２回抽出した。得られた有機層を合わせ、水および飽和食塩水で順に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧留去し、得られた残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘキサン／酢酸エチル）で精製して、６－（ｔｅｒｔ－ブチル）－８－フルオロイソキノリン－１（２Ｈ）－オン（８５ｍｇ）を得た。
1H  NMR (400 MHz, CDCl3) δ 10.84 (s, 1H), 7.28 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 7.18 (dd, J = 13.8, 1.8 Hz, 1H), 6.51 - 6.43 (m, 2H), 1.37 (s, 9H)；LCMS (m/z): 220.1 [M+H] +. 
（第４工程）
　窒素雰囲気下、第３工程と同様の方法で製造した６－（ｔｅｒｔ－ブチル）－８－フルオロイソキノリン－１（２Ｈ）－オン（２２０ｍｇ，１．００ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（１０ｍＬ）に、２－ブロモ－６－クロロベンズアルデヒド（３３０ｍｇ，１．５０ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（２７７ｍｇ，２．０１ｍｍｏｌ）及びヨウ化銅（Ｉ）（３８２ｍｇ、２．０１ｍｍｏｌ）を加え、１１０℃で１日間攪拌した。反応混合物を酢酸エチルで希釈したのち、不溶物をろ過し、ろ液を水及び飽和食塩水で順に洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧留去し、得られた残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘキサン／酢酸エチル）で精製して、２－クロロ－６－［６－（ｔｅｒｔ－ブチル）－８－フルオロ－１－オキソイソキノリン－２（１Ｈ）－イル］ベンズアルデヒド（２２３ｍｇ）を得た。
1H  NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.20 (s, 1H), 7.87 - 7.79 (m, 1H), 7.76 (dd, J = 8.2, 1.3 Hz, 1H), 7.54 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 7.49 (dd, J = 7.6, 1.2 Hz, 1H), 7.43 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 7.38 - 7.26 (m, 1H), 6.74 (dd, J = 7.5, 2.2 Hz, 1H), 1.35 (s, 9H)；LCMS (m/z): 358.1 [M+H] +. 
（第５工程）
　窒素雰囲気下、０℃に冷却した２－クロロ－６－［６－（ｔｅｒｔ－ブチル）－８－フルオロ－１－オキソイソキノリン－２（１Ｈ）－イル］ベンズアルデヒド（２００ｍｇ，０．５６ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（３．７ｍＬ）及びイソプロピルアルコール（１．９ｍＬ）の混合溶液に、水素化ホウ素ナトリウム（３２ｍｇ，０．８４ｍｍｏｌ）を加え、室温に戻し２時間攪拌した。反応混合物に水を加え、酢酸エチルで２回抽出した。得られた有機層を合わせ、水および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧留去し、得られた残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘキサン／酢酸エチル）で精製して、２－［３－クロロ－２－（ヒドロキシメチル）フェニル］－６－（ｔｅｒｔ－ブチル）－８－フルオロイソキノリン－１（２Ｈ）－オン（１６０ｍｇ）を得た。
1H  NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.55 (dd, J = 8.1, 1.2 Hz, 1H), 7.43 - 7.36 (m, 1H), 7.32 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 7.23 (dd, J = 13.5, 1.8 Hz, 1H), 7.17 - 7.11 (m, 1H), 7.05 (d, J = 7.4, 1.7 Hz, 1H), 6.58 (dd, J = 7.4, 2.1 Hz, 1H), 4.75 - 4.61 (m, 1H), 4.54 - 4.34 (m, 1H), 3.35 (dd, J = 10.8, 2.5 Hz, 1H), 1.39 (s, 9H)；LCMS (m/z): 360.2 [M+H] +.（第６工程）
　窒素雰囲気下、２－［３－クロロ－２－（ヒドロキシメチル）フェニル］－６－（ｔｅｒｔ－ブチル）－８－フルオロイソキノリン－１（２Ｈ）－オン（１６０ｍｇ，０．４４ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（５ｍＬ）に、ピリジン（１８０μＬ，２．２４ｍｍｏｌ）及び塩化アセチル（１１９μＬ，１．６８ｍｍｏｌ）を加え、室温で１日間攪拌した。反応混合物に水を加え、酢酸エチルで２回抽出した。得られた有機層を合わせ、水および飽和食塩水で順に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧留去し、得られた残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘキサン／酢酸エチル）で精製して、酢酸　２－クロロ－６－［６－（ｔｅｒｔ－ブチル）－８－フルオロ－１－オキソイソキノリン－２（１Ｈ）－イル］ベンジル（１５７ｍｇ）を得た。
1H  NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.72 - 7.64 (m, 1H), 7.63 - 7.57 (m, 1H), 7.54 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 7.44 - 7.38 (m, 1H), 7.38 - 7.30 (m, 2H), 6.71 (dd, J = 7.4, 2.1 Hz, 1H), 5.08 (d, J = 12.4, 2.4 Hz, 1H), 4.93 (d, J = 12.4, 2.5 Hz, 1H), 1.87 (s, 3H), 1.35 (s, 9H)；LCMS (m/z): 402.2 [M+H] +. 
（第７工程）
　窒素雰囲気下、酢酸　２－クロロ－６－［６－（ｔｅｒｔ－ブチル）－８－フルオロ－１－オキソイソキノリン－２（１Ｈ）－イル］ベンジル（１５０ｍｇ，０．３７ｍｍｏｌ）のジオキサン溶液（５．３ｍＬ）に、ビス（ピナコラト）ジボロン（２８４ｍｇ，１．１２ｍｍｏｌ）、ビス（ジベンジリデンアセトン）パラジウム（０）（１０．７ｍｇ，１９．０μｍｏｌ）、２，４，６－トリイソプロピル－２'－（ジシクロヘキシルホスフィノ）ビフェニル（１７.８ｍｇ，３７．０μｍｏｌ）、および酢酸カリウム（１１０ｍｇ，１．１２ｍｍｏｌ）を加え、６５℃で１６時間加熱した。反応混合物を酢酸エチルで希釈したのち、不溶物をセライトろ過した。ろ液に水を加え、酢酸エチルで２回抽出した。得られた有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧留去し、得られた残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘキサン／酢酸エチル）で精製して、標記化合物（１０５ｍｇ）を得た。
1H  NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.97 - 7.87 (m, 1H), 7.48 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 7.34 (dd, J = 7.9, 1.4 Hz, 1H), 7.27 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 7.18 (dd, J = 13.5, 1.8 Hz, 1H), 7.04 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 6.46 (dd, J = 7.4, 2.1 Hz, 1H), 5.46 (d, J = 11.8 Hz, 1H), 5.02 (d, J = 11.8 Hz, 1H), 1.92 (s, 3H), 1.38 (s, 9H), 1.34 (s, 12H)；LCMS (m/z): 494.3 [M+H] +. 
実施例１
　２－（３－｛４－アミノ－６－［（１－メチル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）アミノ］－１，３，５－トリアジン－２－イル｝－２－（ヒドロキシメチル）フェニル）－６－シクロプロピル－８－フルオロイソキノリン－１（２Ｈ）－オン
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
  
（第１工程）
　氷冷下、２－アミノ－４，６－ジクロロ－１，３，５－トリアジン（５１３ｍｇ，３．１１ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（１０．３ｍＬ）に、ＤＩＥＡ（１．０８ｍＬ，６．２２ｍｍｏｌ）および１－メチル－１Ｈ－ピラゾール－４－アミン（３３２ｍｇ，３．４２ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（５．１８ｍＬ）をゆっくり加え、室温で２．５時間攪拌した。析出した固体を濾取し、酢酸エチル、水、エタノールで洗浄、乾燥させて、６－クロロ－Ｎ２－（１－メチル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）－１，３，５－トリアジン－２，４－ジアミン（４２０ｍｇ）を得た。
1H  NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.89 (s, 1H), 7.91 (s, 1H), 7.56 - 7.49 (m, 3H), 3.79 (s, 3H). ；LCMS (m/z): 225.9 [M+H] +.
（第２工程）
　参考例１で製造した酢酸　２－（６－シクロプロピル－８－フルオロ－１－オキソイソキノリン－２（１Ｈ）－イル）－６－（４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン－２－イル）ベンジル（１４１ｍｇ，０．２９ｍｍｏｌ）および６－クロロ－Ｎ２－（１－メチル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）－１，３，５－トリアジン－２，４－ジアミン（６６．７ｍｇ，０．２９ｍｍｏｌ）のジメトキシエタン溶液（５ｍＬ）に、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（１７ｍｇ，０．０１５ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム（８２ｍｇ，０．５９ｍｍｏｌ）の水溶液（１．６７ｍＬ）を加え、マイクロウェーブ反応装置を用いて１１０℃で２０分間反応させた。反応混合物に水を加え、酢酸エチルで抽出した。得られた有機層を、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および飽和食塩水で順に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧留去して得られた残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘキサン／酢酸エチル）で精製して、２－（３－｛４－アミノ－６－［（１－メチル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）アミノ］－１，３，５－トリアジン－２－イル｝－２－（ヒドロキシメチル）フェニル）－６－シクロプロピル－８－フルオロイソキノリン－１（２Ｈ）－オンとそのアセチル保護体の混合物を得た。得られた混合物をメタノール（５ｍＬ）に溶解し、炭酸カリウム（１００ｍｇ，０．７２４ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間攪拌した。反応混合物を水で希釈し、析出した固体をろ取し、水及びジエチルエーテルで順に洗浄した。得られた固体を乾燥して、標記化合物（８５ｍｇ）を得た。
1H  NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.71 (s, 1H), 8.00 (s, 1H), 7.94 - 7.82 (m, 1H), 7.61 - 7.42 (m, 3H), 7.37 - 7.26 (m, 4H), 7.00 (dd, J = 13.3, 1.7 Hz, 1H), 6.62 (dd, J = 7.5, 2.1 Hz, 1H), 5.25 - 5.13 (m, 1H), 4.55 - 4.44 (m, 1H), 4.16 - 4.02 (m, 1H), 3.84 - 3.75 (m, 3H), 2.12 - 2.04 (m, 1H), 1.14 - 1.06 (m, 2H), 0.91 - 0.84 (m, 2H); LCMS (m/z): 499.2 [M+H] +.
実施例２
　４－（｛４－アミノ－６－［３－（６－シクロプロピル－８－フルオロ－１－オキソイソキノリン－２（１Ｈ）－イル）－２－（ヒドロキシメチル）フェニル］－１，３，５－トリアジン－２－イル｝アミノ）－１－メチル－１Ｈ－ピロール－２－カルボニトリル
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
  
（第１工程）
　氷冷下、４－アミノ－１－メチル－１Ｈ－ピロール－２－カルボキサミド塩酸塩（３５０ｍｇ，１．９９ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（０．７ｍＬ，３．９９ｍｍｏｌ）のＴＨＦ縣濁液（５ｍＬ）に、ＤＭＦ（２．５ｍＬ）、２－アミノ－４，６－ジクロロ－１，３，５－トリアジン（２９９ｍｇ，１．８１ｍｍｏｌ）を順次加え、室温で５時間攪拌した。析出した固体を濾取し、酢酸エチルおよび水で洗浄、乾燥させて、４－［（４－アミノ－６－クロロ－１，３，５－トリアジン－２－イル）アミノ］－１－メチル－１Ｈ－ピロール－２－カルボキサミド（４３６ｍｇ）を得た。
1H  NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.00 - 9.43 (m, 1H), 7.46 (s, 1H), 7.40 (s, 1H), 7.29 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 7.21 - 6.79 (m, 2H), 6.77 - 6.65 (m, 1H), 3.80 (s, 3H). ；LCMS (m/z): 268.1 [M+H] +.
（第２工程）
　氷冷下、４－［（４－アミノ－６－クロロ－１，３，５－トリアジン－２－イル）アミノ］－１－メチル－１Ｈ－ピロール－２－カルボキサミド（１３０ｍｇ，０．４９ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（５ｍＬ）にＴＥＡ（０．１ｍＬ，０．７３ｍｍｏｌ）および無水トリフルオロ酢酸（０．０７５ｍＬ，０．５３ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間攪拌した。反応溶液にＴＥＡ（０．１ｍＬ，０．７３ｍｍｏｌ）および無水トリフルオロ酢酸（０．０７５ｍＬ，０．５３ｍｍｏｌ）を追加し、室温でさらに２４時間攪拌した。反応混合物に水を加え、酢酸エチルで抽出した。得られた有機層を、水および飽和食塩水で順に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧留去して得られた残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘキサン／酢酸エチル）で精製して、４－［（４－アミノ－６－クロロ－１，３，５－トリアジン－２－イル）アミノ］－１－メチル－１Ｈ－ピロール－２－カルボニトリル（１００ｍｇ）を得た。
1H  NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.05 - 9.71 (m, 1H), 7.55 (s, 2H), 7.46 - 7.23 (m, 1H), 7.03 - 6.76 (m, 1H), 3.72 (s, 3H); LCMS (m/z): 250.1 [M+H] +.
（第３工程）
　参考例１で製造した酢酸　２－（６－シクロプロピル－８－フルオロ－１－オキソイソキノリン－２（１Ｈ）－イル）－６－（４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン－２－イル）ベンジル（４５ｍｇ，０．０９４ｍｍｏｌ）および４－［（４－アミノ－６－クロロ－１，３，５－トリアジン－２－イル）アミノ］－１－メチル－１Ｈ－ピロール－２－カルボニトリル（２３．５ｍｇ，０．０９４ｍｍｏｌ）のジメトキシエタン溶液（２ｍＬ）に、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（５．４ｍｇ，０．００４７ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム（２６ｍｇ，０．１９ｍｍｏｌ）の水溶液（０．６７ｍＬ）を加え、マイクロウェーブ反応装置を用いて１１０℃で２０分間反応させた。反応混合物に水を加え、酢酸エチルで抽出した。得られた有機層を、水および飽和食塩水で順に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧留去して得られた残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘキサン／酢酸エチル）で精製して、４－（｛４－アミノ－６－［３－（６－シクロプロピル－８－フルオロ－１－オキソイソキノリン－２（１Ｈ）－イル）－２－（ヒドロキシメチル）フェニル］－１，３，５－トリアジン－２－イル｝アミノ）－１－メチル－１Ｈ－ピロール－２－カルボニトリルとそのアセチル保護体の混合物を得た。得られた混合物をメタノール（５ｍＬ）に溶解し、炭酸カリウム（１００ｍｇ，０．７２４ｍｍｏｌ）を加え、６０℃で１時間攪拌した。反応混合物を水で希釈し、析出した固体をろ取し、水及びヘキサンで順に洗浄した。得られた固体を乾燥して、標記化合物（１８ｍｇ）を得た。
1H  NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.15 - 9.19 (m, 1H), 7.87 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.65 - 7.50 (m, 2H), 7.49 - 7.41 (m, 1H), 7.40 - 7.30 (m, 3H), 7.28 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 7.04 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 7.00 (dd, J = 13.3, 1.6 Hz, 1H), 6.62 (dd, J = 7.5, 2.1 Hz, 1H), 5.23 - 4.91 (m, 1H), 4.50 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 4.19 - 3.94 (m, 1H), 3.74 (s, 3H), 2.16 - 2.00 (m, 1H), 1.15 - 1.03 (m, 2H), 0.95 - 0.77 (m, 2H); LCMS (m/z): 523.2 [M+H] +.
実施例３～３３
以下の実施例化合物［表１－１］～［表１－３］は、それぞれ対応する原料（市販品、または市販化合物から公知の方法もしくはそれに準じた方法により誘導体化した化合物）を用い、上述の実施例記載の方法に従い、必要に応じて、有機合成化学で通常用いられる方法を適宜組み合わせて製造した。
　また、各々の化合物の物理化学データを［表２－１］～［表２－２］に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
  　
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
  
実施例３４
［実施例１のプロドラッグに相当する化合物（Ｉ）の製造例］
オクタン酸　２－｛４－アミノ－６－［（１－メチル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）アミノ］－１，３，５－トリアジン－２－イル｝－６－（６－シクロプロピル－８－フルオロ－１－オキソイソキノリン－２（１Ｈ）－イル）ベンジル
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
  
　実施例１にて製造した２－（３－｛４－アミノ－６－［（１－メチル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）アミノ］－１，３，５－トリアジン－２－イル｝－２－（ヒドロキシメチル）フェニル）－６－シクロプロピル－８－フルオロイソキノリン－１（２Ｈ）－オン（０．２ｇ，０．４ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（８ｍＬ）にピリジン（０．１３ｍＬ，１．６ｍｍｏｌ）およびｎ－オクタノイルクロリド（０．１４ｍＬ，０．８ｍｍｏｌ）を滴下し、室温で１６時間攪拌した。反応混合物に水（５０ｍＬ）を加え、酢酸エチル（３×５０ｍＬ）で抽出した。得られた有機層を合わせ、水、１Ｍ塩酸水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および飽和食塩水で順に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧留去し、得られた残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、クロロホルム／メタノール）で精製して、標記化合物（２０１ｍｇ）を得た。
1H  NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.58 (s, 1H), 7.99 (s, 1H), 7.88 - 7.73 (m, 1H), 7.69 - 7.55 (m, 2H), 7.52 - 7.42 (m, 1H), 7.37 (dd, J = 20.5, 7.4 Hz, 1H), 7.26 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 7.20 - 7.10 (m, 2H), 6.99 (dd, J = 13.2, 1.6 Hz, 1H), 6.60 (dd, J = 7.5, 2.0 Hz, 1H), 5.51 - 5.37 (m, 1H), 5.17 - 5.04 (m, 1H), 3.79 (s, 3H), 2.12 - 2.02 (m, 1H), 1.94 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.27 - 1.00 (m, 10H), 1.02 - 0.90 (m, 2H), 0.91 - 0.76 (m, 5H) ；LCMS (m/z): 625.15 [M+H] +.
 
実施例３５～８４
以下に挙げる実施例１のプロドラッグに相当する、［表３－１］～［表３－６］に記載の実施例化合物（Ｉ）は、それぞれ対応する原料（市販品、または市販化合物から公知の方法もしくはそれに準じた方法により誘導体化した化合物）を用い、上述の実施例３４記載の方法に従い、必要に応じて、有機合成化学で通常用いられる方法を適宜組み合わせて製造した。
　また、各々の化合物の物理化学データを［表４－１］～［表４－４］に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
  　
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000027
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000028
  
試験例１
ＢＴＫに対する活性阻害試験
（脱リン酸化ＢＴＫの調整）
　脱リン酸化ＢＴＫは、ビオチン化ＢＴＫ蛋白質ＢＴＮ－ＢＴＫ(カルナバイオサイエンス社製）酵素溶液にλ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ社製、Ｃｏｄｅ　Ｎｏ．Ｐ０７５３Ｓ）とＭｎＣｌ２をそれぞれ１０Ｕ／μｇ、２ｍＭとなるように添加し、４℃で一晩反応させた後、抗ＤＹＫＤＤＤＤＫ－ｔａｇ抗体アガロースゲルクロマトグラフィーによりλ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅを除去したのち、１０ＤＧ　Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ　Ｃｏｌｕｍｎを用いてバッファー交換を行うことによって得た。
（キナーゼ活性の測定方法）
　キナーゼ活性の測定は、ＱｕｉｃｋＳｃｏｕｔ　Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　Ａｓｓｉｓｔ（商標）　ＭＳＡ（カルナバイオサイエンス社製市販キット）を用い、モビリティシフトアッセイ（ＭＳＡ）法により行った。キナーゼ反応の基質は、キット付属のＦＩＴＣ標識ＳＲＣｔｉｄｅペプチドを用いた。アッセイバッファー［２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、０．０１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００（商標）、２ｍＭ　ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ、ｐＨ７．５]を用い、基質（４μＭ）、ＭｇＣｌ２（２０ｍＭ）、ＡＴＰ（２００μＭ）となるように調整し、基質混合液を作成した。また脱リン酸化ＢＴＫを０．６ｎＭとなるようアッセイバッファーで希釈して酵素溶液を調製した。被験化合物の１０ｍＭ　ＤＭＳＯ溶液から、１０濃度（０．００００３ｍＭ、０．０００１ｍＭ、０．０００３ｍＭ、０．００１ｍＭ、０．００３ｍＭ、０．０１ｍＭ、０．０３ｍＭ、０．１ｍＭ、０．３ｍＭ、１ｍＭ）にＤＭＳＯでさらに希釈し、それぞれをアッセイバッファーで２５倍希釈して、薬物溶液とした（４％ＤＭＳＯ溶液）。薬物溶液もしくはコントロール溶液（４％ＤＭＳＯ－アッセイバッファー）５μＬ、基質混合液５μＬ、および酵素溶液１０μＬをポリプロピレン製３８４穴プレートのウェル中で混合し、１時間室温で反応させた後、６０μＬのキット付属のターミネーションバッファーを添加し反応を停止させた。ついで、反応溶液中の基質（Ｓ）およびリン酸化された基質（Ｐ）の量をＬａｂＣｈｉｐ　ＥＺ　Ｒｅａｄｅｒ IIシステム（Ｃａｌｉｐｅｒ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用い、アッセイキットのプロトコールに従って測定した。
（ＢＴＫ阻害活性の評価方法）
　分離された基質およびリン酸化された基質の各ピークの高さをそれぞれＳおよびＰとし、またブランクとして酵素溶液の代わりにアッセイバッファーを添加したものを測定した。
被験化合物の阻害率（％）は、次の式に従って算出した。
阻害率（％）＝（１－（Ｃ－Ａ）／（Ｂ－Ａ））×１００
ただし、Ａ、Ｂ、Ｃは、それぞれブランクウェルのＰ／（Ｐ＋Ｓ）、コントロール溶液ウェルのＰ／（Ｐ＋Ｓ）、化合物添加ウェルのＰ／（Ｐ＋Ｓ）を示す。
　また、ＩＣ５０値は、阻害率と被験化合物濃度（対数）の回帰分析により算出した。
（評価結果）
　実施例の化合物群は、脱リン酸化ＢＴＫに対して１０ｎＭ以下のＩＣ５０値を示したことから、本発明の化合物（Ｉ）が、強いＢＴＫ阻害活性を有することを示している。
試験例２
細胞内ＢＴＫの自己リン酸化活性阻害試験
（使用する細胞の培養）
　Ｒａｍｏｓ細胞（２Ｇ６．４Ｃ１０、ＡＴＣＣ社Ｎｏ．ＣＲＬ－１９２３）は、Ｔ７５フラスコ中、１０％ＦＢＳ（ＡｕｓＧｅｎｅ社）および５％ペニシリンストレプトマイシン（ナカライ社）を添加したＲＰＭＩ－１６４０培地（ＧＩＢＣＯ社、＃Ａ１０４９１－０１）（以下、増殖培地）を用いて５％ＣＯ２インキュベーター内で培養した。
（被験化合物の添加）
　培養したＲａｍｏｓ細胞を細胞密度７．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように、血清を除いたＲＰＭ－１６４０培地（以後、培地）で希釈して、４５分間３７℃で保温した。細胞懸濁液を２．０ｍＬチューブに１ｍＬずつ小分けした後、被験化合物の０．３ｍＭ　ＤＭＳＯ溶液を培地で希釈し、０．９μＭとした被験化合物溶液を、５００μＬ添加し、被験化合物の最終濃度が０．３μＭの条件下で１時間３７℃インキュベーションした。その後、培地で希釈した抗ＩｇＭ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、　Ｈ１５１００）を最終濃度が１０μｇ／ｍＬになるように添加して、１０分間３７℃でインキュベーションした。
（タンパク質の抽出）
　遠心操作により細胞を回収して得られたペレットにＬｙｓｉｓバッファー[ＲＩＰＡ　Ｂｕｆｆｅｒ（×１）（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）に、１％　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　Ｃａｃｋｔａｉｌ　３（Ｓｉｇｍａ社、Ｎｏ．Ｐ００４４）、１％　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　Ｃａｃｋｔａｉｌ　（ナカライ社、Ｎｏ．０７５７５）および１ｍＭ　フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）を添加したもの］を１００μＬ添加し、軽く攪拌したのち１０分間静置した。遠心操作（１５，０００ｒｐｍ、１５分間）により上清を回収し、タンパク質量を定量した。ＳＤＳ－サンプルバッファーと混合し、９５℃５分間反応させてタンパク質を変性させて、サンプル溶液とした。４－２０％のグラジエントアクリルアミドゲル（コスモバイオ社、Ｎｏ．４１４８７９）の各ウェルにサンプル溶液を５μＬずつアプライし、電気泳動を行った。その後、ｉＢｌｏｔゲルトランスファーシステム（ライフテクノロジーズ社）を用いてＰＶＤＦ膜にゲル中のタンパク質を転写した。
（ＢＴＫまたはリン酸化ＢＴＫの検出）
　転写したＰＶＤＦ膜を２％ＥＣＬ　ｐｒｉｍｅ　ｂｌｏｃｋｉｎｇ　Ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＥヘルスケア社）でブロッキング処理した後、一次抗体として抗ＢＴＫマウス抗体（ＢＤｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社、Ｎｏ．６１１１１６）もしくは抗リン酸化ＢＴＫウサギ抗体（ｐＹ２２３、ＥＰＩＴＯＭＩＣＳ社、Ｎｏ．２２０７－１）を用い、４℃で１晩反応させた。未反応の一次抗体をＴＢＳＴバッファー（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．１％　Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄後、二次抗体としてＨＲＰラベルした抗マウスＩｇＧヤギ抗体（ライフテクノロジーズ社、Ｎｏ．６２－６５２０）あるいは抗ウサギＩｇＧヤギ抗体（ライフテクノロジーズ社、Ｎｏ．６５－６１２０）を用い、２％ＥＣＬ　ｐｒｉｍｅ　ｂｌｏｃｋｉｎｇ　Ｒｅａｇｅｎｔを添加したＴＢＳＴバッファー中で、室温で１時間反応させた。未反応の二次抗体をＴＢＳＴバッファーで洗浄後、ＥＣＬ　Ｐｒｉｍｅ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔｔｉｎｇ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥヘルスケア社）を用いて添付のプロトコールどおりに反応させた後、ＣＣＤカメラ（ＡＴＴＯ、Ｌｉｇｈｔ－ＣａｐｔｕｒｅＩＩ）を用いて、それぞれのバンドを化学発光で検出した。検出されたバンドをデンシトメトリー（ＡＴＴＯ　ＣＳ　Ａｎａｌｙｚｅｒ　ｖｅｒ３．０）により数値化し、化合物非添加かつＩｇＭ刺激群のリン酸化ＢＴＫのバンドの発光を１００％、化合物非添加かつＩｇＭ無刺激群のリン酸化ＢＴＫのバンドの発光を０％として、各群におけるバンドの強度から阻害率を算出した。なお、それぞれのリン酸化ＢＴＫのバンドは、総ＢＴＫにより補正を行なった。
　本試験で用いた一次抗体と二次抗体の組み合わせおよび希釈濃度は以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000029
  
　被験化合物濃度０．３μＭの濃度における結果を、表６に示す。細胞内ＢＴＫの自己リン酸化阻害活性は、７０％以上のものは＊＊＊印、５０％以上７０％未満のものは＊＊印、３０％以上５０％未満のものは＊印で示した。
　本試験において、表６に示すとおり、本発明化合物は０．３μＭの濃度で細胞内ＢＴＫの自己リン酸化活性を強く阻害した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000030
  
　試験例２の結果は、本発明の化合物が、“細胞内ＢＴＫの自己リン酸化活性作用”についても、強い阻害作用を有することを示している。
試験例３
Ｒａｍｏｓ細胞内カルシウムイオン変動阻害試験
　本発明の化合物による細胞内ＢＴＫ阻害を、本発明の化合物の、「抗ＩｇＭ抗体のＢＣＲ刺激による細胞内カルシウム流入」に及ぼす作用を測定することにより検証した。
（細胞懸濁液、およびカルシウム指示薬の添加）
　測定の１日前に、Ｒａｍｏｓ細胞を細胞密度１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように、新鮮な増殖培地（試験例２と同じ増殖培地）に再懸濁して培養し、翌日、遠心操作により細胞を回収し、５％ペニシリンストレプトマイシン（ナカライ社）を添加したＲＰＭＩ－１６４０培地（培地１）で洗浄した。この細胞を、細胞密度２．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように、１％Ｕｌｔｒａ　Ｌｏｗ　ＩｇＧ　ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ、＃１６２５０）と５％ペニシリンストレプトマイシン（ナカライ社）を添加したＲＰＭＩ－１６４０培地（培地２）に再懸濁したのち、細胞懸濁液をＰｏｌｙ　Ｌｙｓｉｎｅ　ｃｏａｔｅｄマイクロプレート（ＢＤ　ＢｉｏＣｏａｔＴＭ、＃３５６６９２）の各ウェルに１００μＬずつ添加し、遠心操作（７００ｒｐｍ、３分間）後、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内において１時間インキュベーションした。カルシウム指示薬Ｆｌｕｏ-８ＮＷ　ｄｙｅ-ｌｏａｄｉｎｇ溶液（ＡＡＴ　Ｂｉｏｑｕｅｓｔ、＃３６３１５）を各ウェルに１００μＬずつ添加し、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で、さらに３０分間インキュベーションした。
（被験化合物の添加）
　被験化合物の１０ｍＭ　ＤＭＳＯストック溶液から、ＤＭＳＯでさらに６濃度（１、０．３、０．１、０．０３、０．０１、０．００３ｍＭ）に希釈し、また被験化合物を含まないＤＭＳＯ溶液を対照とし、それぞれを培地２で４７．６倍希釈して、上記のプレートの各ウェルに１０μＬずつ添加後、１０分間３７℃でインキュベーションした（被験化合物の最終濃度、１、０．３、０．１、０．０３、０．０１、０．００３、０μＭ）。
（カルシウムイオン濃度の測定）
　Ｒａｍｏｓ細胞内カルシウムイオン濃度は、カルシウム指示薬Ｆｌｕｏ-８ＮＷの蛍光強度を、マイクロプレートリーダー（ＳｙｎｅｒｇｙＨ１）を用いて測定した（Ｅｘ／Ｅｍ＝４９０／５２５ｎｍ）。１５秒間ベースラインを測定した後、上述の各ウェルに、培地２で１０．４μｇ／ｍＬに希釈した抗ＩｇＭ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃Ｈ１５１００）を５０μＬ添加（最終濃度２．０μｇ／ｍＬ）してＢＣＲ刺激し、さらに１５０秒間測定した。
　図１に、代表例として実施例１の化合物の結果を示す。図１に示されるように本発明の化合物は、低濃度から濃度依存的に、「抗ＩｇＭ抗体のＢＣＲ刺激による細胞内カルシウムイオン変動」を抑制しており、ＢＣＲシグナルを効果的に阻害していることが理解できる。
試験例４
マウス受動的皮膚アナフィラキシー反応試験
　ＢＴＫは、マスト細胞においてＦｃεＲＩのシグナル伝達に重要な役割を果たしていることから、マスト細胞が関与する即時型アレルギー反応である受動的皮膚アナフィラキシー反応（ｐａｓｓｉｖｅ　ｃｕｔａｎｅｏｕｓ　ａｎａｐｈｙｌａｘｉｓ　ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣＡ反応）が、化合物投与により、抑制されるかを検討した。
（被験化合物溶液の調製）
　被験化合物にＤＭＳＯ、ポリエチレングリコール４００（ＰＥＧ＃４００、ナカライテスク社、＃２８２１５－９５）、３０％(ｗ／ｖ)ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン水溶液（ＨＰ－β－ＣＤ、シグマ社、＃３３２６０７－５００）を順に加えてよく混合し、被験化合物溶液を調整した（溶媒組成：５％被験化合物ＤＭＳＯ溶液、３０％ＰＥＧ＃４００、６５％ＨＰ－β－ＣＤ［３０％（ｗ／ｖ）水溶液］）。また、溶媒投与群は、被験化合物ＤＭＳＯ溶液の代わりにＤＭＳＯ溶液を用いた。
（ＰＣＡ反応）
　全身麻酔下、ＩＣＲマウス（６週齢、雄）に抗ＤＮＰ－ＩｇＥモノクローナル抗体（５０μｇ／ｍＬ、Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ社、＃ｓｃ－６９６９５）を両側耳介に皮内投与した（１０μＬ／ｓｉｔｅ）。４６時間後、溶媒または、試験投与用量になるように溶媒に溶解させた被験化合物溶液（３．０ｍｇ／ｍＬ）を経口投与した（１０ｍＬ／マウス体重（ｋｇ））。２時間後、０．５％エバンスブルー色素（和光純薬株式会社、＃０５４-０４０６２）を含むＤＮＰ－ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍＬ、エル・エス・エル社、＃ＬＧ－３０１７）を静脈内投与し（０．２５ｍＬ／マウス）、アレルギー反応を惹起した。３０分後、全身麻酔下、頚椎脱臼により動物を安楽死させ、両耳介を採取した。採取した耳介一対に１Ｍ　ＫＯＨ溶液（０．７ｍＬ）を加え、３７℃で一晩放置し、耳介を溶解させた。この懸濁液にアセトン－０．２Ｍ　リン酸（１３:５）混合液を９．３ｍＬ添加したのち、生じた不溶物を遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分）および０．２μｍフィルターで除去した。得られたろ液の６２０ｎｍにおける吸光度を測定し、色素漏出量の指標とした。上記実験は各群５匹のマウスを用いて行い、色素漏出量の評価はこれらマウスについて得られた値の平均値をとった。
　図２に結果を示す。図２に示すように溶媒群と比較して、実施例１の化合物では有意に耳介への色素漏出を抑えた。すなわち受動的皮膚アナフィラキシー反応（ＰＣＡ反応）に対する抑制作用が確認された。
試験例５
マウスコラーゲン誘発関節炎モデルでの作用
　Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ　Ａｄｊｕｖａｎｔ（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ社、＃７００２）にＭ．Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　Ｈ３７　Ｒａ、Ｄｅｓｉｃｃａｔｅｄ（ベクトンディッキンソン社、＃２３１１４１）を２．５ｍｇ／ｍＬとなるように添加したものと、Ｂｏｖｉｎｅ　ＴｙｐｅII　Ｃｏｌｌａｇｅｎ，２ｍｇ／ｍＬ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ社、＃２００２２）とを１対１で混合して乳化させたエマルジョンを作製した。
ＤＢＡ／１Ｊマウス３群（１０匹／群）（６週齢、雄）に、０日目と２１日目に、マウス１匹あたり０．１ｍＬのエマルジョンを尾根部皮内に少量ずつ分けて注入して免疫した。溶媒または、被験化合物溶液を、１８日目から３６日目まで毎日１日２回経口投与した（各群への被験化合物投与量：０ｍｇ／ｋｇ，３０ｍｇ／ｋｇ，６０ｍｇ／ｋｇ）。投与液の調整は、試験例４と同じ溶媒を用いて同様に行った。
２１日目の追加免疫以降、２～３日に１回、表７に示す基準に従って、四肢各々の関節炎発症状態を目視でスコア化した。四肢すべてのスコアを各マウス毎に合計し、各群１０匹の平均値を関節炎スコアとした（正常０から最高１６）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000031
  
　本発明の化合物である実施例１の化合物は、図３に示すように関節炎の発症を用量依存的に抑制した。しかもこの時、体重減少などの毒性を示さなかった。この結果より、本発明の化合物が優れた抗炎症作用を有するとともに、安全性にも優れている可能性が高いことが確認された。
試験例６
ラットコラーゲン誘発関節炎モデルでの作用
　Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ　とＦｒｅｕｎｄ’ｓ　Ａｄｊｕｖａｎｔ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、＃Ｆ５５０６）と、Ｂｏｖｉｎｅ　ＴｙｐｅII　Ｃｏｌｌａｇｅｎ，４ｍｇ／ｍＬ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｉｃｈｕａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｌｏｔ．０８Ｈ０４９７）とを１対１で混合して乳化したエマルジョンを作製した。Ｌｅｗｉｓラット３群（１０匹／群）（５－６週齢、雌）に、０日目と７日目に、ラット１匹あたり０．５ｍＬのエマルジョンを尾根部（０．１ｍＬ）および尾根部に近い背部皮内２箇所（各０．２ｍＬ）の合計３箇所に分けて注入して免疫した。溶媒または、被験化合物溶液を０日目から２０日目まで毎日１日２回経口投与した（各群への被験化合物投与量：０ｍｇ／ｋｇ，３０ｍｇ／ｋｇ，６０ｍｇ／ｋｇ）。投与液の調整は、試験例４と同じ溶媒を用いて同様に行った。
７日目の追加免疫以降、１週間に２回、表８に示す基準に従って、四肢各々の関節炎発症状態を目視でスコア化した。四肢すべてのスコアを各ラット毎に合計し、各群１０匹の平均値を関節炎スコアとした（正常０から最高１６）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000032
  
　
　本発明の化合物である実施例１の化合物は、図４に示すように関節炎の発症を用量依存的に抑制した。しかもこの時、体重減少などの毒性を示さなかった。この結果より、本発明の化合物が優れた抗炎症作用を有するとともに、安全性にも優れている可能性が高いことが確認された。
試験例７
マウスでの経口投与による血中濃度測定（プロドラッグの代謝確認試験）
　一般にプロドラッグは、経口投与後には、消化管から吸収されたのちに体内で速やかに代謝されて活性型の薬剤に生じることが望ましい。そこで、本発明のプロドラッグに相当する化合物（Ｉ）が、体内で速やかに活性型の薬剤に代謝されるかを検討した。
　ＩＣＲマウス（３匹／群）（６週齢、雄）に、溶媒（０．５％メチルセルロース水溶液）に懸濁させた被験化合物溶液を、３０ｍｇ/ｋｇの試験投与用量になるように経口投与した。１時間後、全身麻酔下のマウスの心臓からヘパリンコートした注射器を用いて採取した血液サンプルを、遠心分離（４℃、１００００ｒｐｍ、１０分）し、血漿サンプルを回収した。フィルター付きプレートの各ウェルに、５μＬの血漿サンプルと４９５μＬの内部標準化合物を含むメタノール溶液を添加し混合した。遠心分離（４℃、３０００ｒｐｍ、３分）により変性タンパク質を除去し、ろ液（抽出液）を回収した。検量線用として、内部標準化合物を含む代謝物のメタノール溶液を調整し、未処置のマウスから採取した血漿と混合し、フィルター付きプレートを用いて同様に処理した。またプロドラッグ（未変化体）の検量線に関しては、プロドラッグのメタノール溶液と内部標準化合物のメタノール溶液を混合して検量線用標準液を調製したものを用いた。
　抽出液中の、プロドラッグおよびその代謝物である実施例１の化合物の濃度は、LC/MS（液体クロマトグラフ質量分析）を用い、内部標準物質とのピーク面積比を用いた検量線から化合物濃度を定量した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000033
  
ＮＤ：未検出
　表９に示すように、本発明のプロドラッグ化合物は、経口投与後、血中に観測されず、代謝物である実施例１の化合物が観察された。このことから、本発明のプロドラッグ体は、体内で迅速に代謝され、活性型に変換されることが確認された。
　本発明により提供される化合物は、ＢＴＫを介した異常な細胞応答に関連していることが知られている疾患、例えば、自己免疫疾患、炎症性疾患、骨疾患、リンパ腫のような癌等に対する予防または治療用医薬品（医薬組成物），またはそのプロドラッグとして有用である。また、ＢＴＫ阻害剤として、実験用、研究用の試薬に有用である。

Claims (2)

  1. 下式（Ｉ）で示されるトリアジン誘導体、またはその薬学的に許容される塩。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
      
    （式中、Ｒ１は、置換基を有してもよい低級アルキル基を表し、Ｒ２は、水素原子、置換基を有してもよい低級アルキル基を表し、Ａは、窒素原子もしくはＣ－Ｒ３を表し、Ｒ３は、水素原子、シアノ基、置換基を有してもよいアシル基、置換基を有してもよいスルホニル基、置換基を有してもよいカルバモイル基を表し、Ｒ４は、置換基を有してもよい低級アルキル基、置換基を有してもよいシクロアルキル基を表す。）
  2. Ｒ１が、式－ＣＨ２ＯＲ5を示し、式中Ｒ5は、置換基を有してもよいアシル基である、請求項１に記載のトリアジン誘導体、またはその薬学的に許容される塩。
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