KR102565546B1 - 신규 옥소이소퀴놀린 유도체 - Google Patents

신규 옥소이소퀴놀린 유도체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 식(I)(식 중, Q 및 R1은 명세서 참조)으로 표시되는 옥소이소퀴놀린 유도체 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 제공하며, 이는 암, B세포 림프종, 만성 림프성 백혈병 등을 치료하기 위한 브루톤 키나제 저해제(Bruton's kinase inhibitor)로서 유용하다.

Description

신규 옥소이소퀴놀린 유도체
본 발명은 의약, 특히 BTK 저해 효과를 갖는 신규 옥소이소퀴놀린 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염에 관한 것이다.
브루톤 티로신 키나제(Bruton's tyrosine kinase; BTK)는 비-수용체 티로신 키나제의 Tec 패밀리의 구성원이며, T 림프구와 자연 살해 세포(natural killer cell)를 제외한 모든 조혈 세포 유형에서 발현되는 중요한 신호 전달 효소이다.
BTK는 B세포의 생존, 분화, 증식 및 활성화 등과 관련된 중요한 조절 인자이고, B세포의 신호 전달에서 중요한 역할을 담당하고 있다(비특허문헌 1 및 2). 세포 표면의 B세포 수용체(B-cell receptor; BCR)는 BCR의 하류에 존재하는 BTK를 통해 세포 내로 신호를 전달하므로, B-세포의 신호전달 경로가 비정상적으로 활성화되면 B-세포 림프종, 만성 림프성 백혈병 등의 암세포의 증식과 생존이 촉진되는 것으로 생각된다(비특허문헌 3). 또한 BTK는 다수의 다른 세포의 신호 경로에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 알레르기 질환, 자가면역 질환 및 염증성 질환 등에 관여한다고 알려져 있다(비특허문헌 1). 예를 들면, BTK는 비만 세포(mast cell)에서 높은 친화성 IgE 수용체(FcεRI)의 신호전달에 중요한 역할을 하고, BTK가 결핍된 비만 세포는 탈과립의 감소 및 염증성 사이토카인의 생성이 감소하는 것이 알려져 있다(비특허문헌 4). BTK 결손 마우스 실험에서 전신성 홍반루푸스(SLE)에 BTK가 관여하는 것이 시사되어 있다(비특허문헌 5). 또한, BTK 돌연변이 마우스는 콜라겐 유도 관절염의 발병에 저항성을 나타낸다(비특허문헌 6). 비가역적인 BTK 저해제인 이브루티닙(ibrutinib)은 B세포성 종양의 치료에 유용한 항암제이다. 최근 들어 이브루티닙 치료에서 BTK의 C481S 돌연변이로 인해 이브루티닙 내성이 생기는 것으로 밝혀지고 있다(비특허문헌 7). 또한 BTK의 이소폼인 p65 BTK는 혈액 암 이외의 고형암에서 RAS 신호의 하류에서 발현되며, 결장암 세포와 같은 고형암의 증식에 관여하는 것으로 보고되고 있다(비특허문헌 8). 따라서, BTK 저해 활성을 갖는 화합물은 BTK 신호와 연관된 질환, 예를 들어, 암, B세포 림프종 및 만성 림프성 백혈병뿐만 아니라, p65BTK가 발현되는 고형암의 치료에도 유용하다. 또한 알레르기 질환, 자가면역 질환 및 염증성 질환의 치료에 유용하다. 또한, 이브루티닙과 같은 비가역적인 BTK 저해제에 저항성이고 BTK 돌연변이를 갖는, 암을 치료하는 데 효과적인 BTK 저해제가 필요하다.
트리아진 유도체는 본 발명자들에 의해 BTK 저해 활성을 갖는 화합물로서 보고되어 있다(특허문헌 1 및 특허문헌 2).
본 발명의 화합물과 구조가 유사한 화합물도 개시되어 있다(특허문헌 3 및 4). 그러나, 본 발명의 신규 옥소이소퀴놀린 유도체는 개시되어 있지 않다.
WO2013/133367 WO2015/012149 WO2013/157022 CN104211703
Satterthwaite,A.B. and Witte, O.N., Immunol.Rev., 2000, 175, 120-127. Kurosaki,T., Curr.Opin.Immunol., 2000, 12, 276-281. Davis,R.E.et al., Nature, 2010, 463, 88-92. Ellmeier,W., et al., FEBS J., (2011), 278, 1990-2000. Halcomb,K.E., Mol.Immunol., 2008, 46(2), 233-241. Jansson, L. and Holmdahl, R., Clin. Exp. Immunol., 1993, 94, 459-465. Cheng,S. et al., Leukemia, 2015, 29, 895-900. Grassili.E., et al., Oncogene, 2016, 35, 4368-4378.
본 발명의 목적은 의약, 특히 BTK 저해 효과를 갖는 신규 옥소이소퀴놀린 유도체 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 하기 (1) 내지 (6)에 의해 달성될 수 있다:
(1) 하기 식(I)으로 표시되는 옥소이소퀴놀린 유도체 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염:
(식 중, R1은 치환기를 가지고 있어도 되는 저급 알킬 기를 나타내고, Q는 하기 구조 (a), (b) 및 (c)에서 선택되는 구조를 나타내며,
여기서, R2 및 R3은 각각 독립적으로 수소 원자, 치환기를 가지고 있어도 되는 저급 알킬 기, 치환기를 가지고 있어도 되는 시클로알킬 기, 치환기를 가지고 있어도 되는 아릴 기, 치환기를 가지고 있어도 되는 헤테로아릴 기 또는 치환기를 가지고 있어도 되는 헤테로고리 기임);
(2) Q는 구조 (a)이고, R1은 하이드록시메틸 기인, 상기 (1)에 기재된 옥소이소퀴놀린 유도체 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염;
(3) 하기 식(Ia)으로 표시되는, 옥소이소퀴놀린 유도체 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염:
(식 중, R3a는 치환기를 가지고 있어도 되는 테트라하이드로피리딜 기임);
(4) 상기 테트라하이드로피리딜 기의 치환기는, 옥세타닐 기, 아세틸 기, 프로피오닐 기, 모르폴리노아세틸 기, 디메틸카바모일 기, 피롤리딘카보닐 기, 메틸설포닐 기 및 이소프로필설포닐 기로 이루어진 군에서 선택되는, 식(Ia)으로 표시되는 옥소이소퀴놀린 유도체 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염;
(5) 하기 식(Ib)으로 표시되는, 옥소이소퀴놀린 유도체 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염:
(식 중, R3b는 저급 알킬 기로 치환되어 있어도 되는 페닐 기임);
(6) 하기 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염:
2-[3-(2-아미노-6-페닐-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-2-(하이드록시메틸)페닐]-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 1)
2-[3-(2-아미노-8-페닐-9H-퓨린-6-일)-2-(하이드록시메틸)페닐]-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 2)
2-[3-(6-아미노-3-페닐-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-4-일)-2-(하이드록시메틸)페닐]-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 3)
2-[3-(2-아미노-9H-퓨린-6-일)-2-(하이드록시메틸)페닐]-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 4)
2-[3-(6-아미노-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-4-일)-2-(하이드록시메틸)페닐]-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 5)
2-[3-(2-아미노-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-2-(하이드록시메틸)페닐]-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 6)
2-[3-(2-아미노-6-메틸-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-2-(하이드록시메틸)페닐]-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 7)
2-[3-(2-아미노-6-{4-[(4-메틸피페라진-1-일)메틸]페닐}-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-2-(하이드록시메틸)페닐]-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 8)
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2-[3-(6-아미노-3-메틸-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-4-일)-2-(하이드록시메틸)페닐]-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 10)
2-{3-[2-아미노-6-(하이드록시메틸)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일]-2-(하이드록시메틸)페닐}-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 11)
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2-{3-[2-아미노-6-(3-메톡시페닐)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일]-2-(하이드록시메틸)페닐}-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 15)
2-{3-[2-아미노-6-(4-메톡시페닐)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일]-2-(하이드록시메틸)페닐}-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 16)
2-{3-[2-아미노-6-(피리딘-3-일)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일]-2-(하이드록시메틸)페닐}-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 17)
2-{3-[2-아미노-8-(3-메톡시페닐)-9H-퓨린-6-일]-2-(하이드록시메틸)페닐}-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 18)
2-{3-[2-아미노-6-(피리딘-4-일)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일]-2-(하이드록시메틸)페닐}-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 19)
2-{3-[6-아미노-3-(4-메톡시페닐)-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-4-일]-2-(하이드록시메틸)페닐}-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 20)
2-{3-[6-아미노-3-(2-메톡시페닐)-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-4-일]-2-(하이드록시메틸)페닐}-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 21)
2-{3-[6-아미노-3-(3-메톡시페닐)-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-4-일]-2-(하이드록시메틸)페닐}-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 22)
2-(3-{2-아미노-6-[1-(옥세탄-3-일)-1,2,3,6-테트라하이드로피리딘-4-일]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일}-2-(하이드록시메틸)페닐)-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 23)
2-{3-[2-아미노-8-(2-메톡시페닐)-9H-퓨린-6-일]-2-(하이드록시메틸)페닐}-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 24)
2-{3-[2-아미노-8-(피리딘-3-일)-9H-퓨린-6-일]-2-(하이드록시메틸)페닐}-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 25)
2-(3-{2-아미노-6-[4-(모르폴리노메틸)페닐]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일}-2-(하이드록시메틸)페닐)-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 26)
4-{2-아미노-4-[3-(6-시클로프로필-8-플루오로-1-옥소이소퀴놀린-2(1H)-일)-2-(하이드록시메틸)페닐]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-6-일}벤조니트릴 (실시예 27)
2-[3-(2-아미노-5-페닐-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-2-(하이드록시메틸)페닐]-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 28)
2-{3-[2-아미노-6-(3-플루오로페닐)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일]-2-(하이드록시메틸)페닐}-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 29)
N-({2-아미노-4-[3-(6-시클로프로필-8-플루오로-1-옥소이소퀴놀린-2(1H)-일)-2-(하이드록시메틸)페닐]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-6-일}메틸)아크릴아미드 (실시예 30)
2-{3-[2-아미노-8-(1-메틸-1H-피라졸-4-일)-9H-퓨린-6-일]-2-(하이드록시메틸)페닐}-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 31)
2-{3-[2-아미노-6-(티오펜-3-일)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일]-2-(하이드록시메틸)페닐}-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 32)
2-{3-[2-아미노-6-(2-플루오로페닐)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일]-2-(하이드록시메틸)페닐}-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 33)
2-{3-[2-아미노-6-(4-플루오로페닐)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일]-2-(하이드록시메틸)페닐}-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 34)
2-{3-[2-아미노-6-(2,4-디플루오로페닐)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일]-2-(하이드록시메틸)페닐}-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 35)
2-{3-[2-아미노-6-(3,4-디플루오로페닐)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일]-2-(하이드록시메틸)페닐}-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 36)
2-(3-{2-아미노-6-[4-(트리플루오로메틸)페닐]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일}-2-(하이드록시메틸)페닐)-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 37)
2-(3-{2-아미노-6-[4-(트리플루오로메톡시)페닐]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일}-2-(하이드록시메틸)페닐)-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 38)
2-{3-[2-아미노-6-(아미노메틸)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일]-2-(하이드록시메틸)페닐}-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 39)
2-(3-{2-아미노-6-[3-(트리플루오로메틸)페닐]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일}-2-(하이드록시메틸)페닐)-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 40)
2-(3-{2-아미노-6-[4-(메틸설포닐)페닐]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일}-2-(하이드록시메틸)페닐)-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 41)
2-{3-[2-아미노-6-(6-플루오로피리딘-2-일)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일]-2-(하이드록시메틸)페닐}-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 42)
2-{3-[2-아미노-6-(2-플루오로피리딘-4-일)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일]-2-(하이드록시메틸)페닐}-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 43)
2-{3-[2-아미노-6-(3,5-디플루오로페닐)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일]-2-(하이드록시메틸)페닐}-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 44)
2-{3-[2-아미노-6-(5-플루오로피리딘-2-일)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일]-2-(하이드록시메틸)페닐}-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 45)
2-{3-[2-아미노-6-(5-플루오로피리딘-3-일)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일]-2-(하이드록시메틸)페닐}-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 46)
2-(3-{2-아미노-6-[6-(메틸아미노)피리딘-3-일]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일}-2-(하이드록시메틸)페닐)-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 47)
2-{3-[2-아미노-6-(6-모르폴리노피리딘-3-일)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일]-2-(하이드록시메틸)페닐}-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 48)
2-{3-[2-아미노-6-(2-메톡시피리딘-4-일)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일]-2-(하이드록시메틸)페닐}-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 49)
2-(3-{2-아미노-6-[2-(메틸아미노)피리딘-4-일]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일}-2-(하이드록시메틸)페닐)-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 50)
2-[3-(2-아미노-6-{4-[(디메틸아미노)메틸]페닐}-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-2-(하이드록시메틸)페닐]-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 51)
2-[3-(2-아미노-6-{4-[(디에틸아미노)메틸]페닐}-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-2-(하이드록시메틸)페닐]-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 52)
2-(3-{2-아미노-6-[4-(피롤리딘-1-일메틸)페닐]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일}-2-(하이드록시메틸)페닐)-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 53)
2-(3-{2-아미노-6-[4-(피페리딘-1-일메틸)페닐]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일}-2-(하이드록시메틸)페닐)-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 54)
2-[3-(2-아미노-6-{4-[(4-메틸-3-옥소피페라진-1-일)메틸]페닐}-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-2-(하이드록시메틸)페닐]-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 55)
2-{3-[2-아미노-6-(p-톨릴)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일]-2-(하이드록시메틸)페닐}-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 56)
2-{3-[2-아미노-6-(tert-부틸)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일]-2-(하이드록시메틸)페닐}-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 57)
2-{3-[2-아미노-6-(1-벤질-1H-피라졸-4-일)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일]-2-(하이드록시메틸)페닐}-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 58)
2-(3-{2-아미노-6-[6-(디메틸아미노)피리딘-3-일]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일}-2-(하이드록시메틸)페닐)-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 59)
2-[3-(2-아미노-6-{5-[(2-메톡시에틸)아미노]피리딘-3-일}-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-2-(하이드록시메틸)페닐}-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 60)
2-{3-[2-아미노-6-(4-{[4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-일]메틸}페닐)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일]-2-(하이드록시메틸)페닐}-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 61)
2-{3-[2-아미노-6-(1-에틸-1H-피라졸-4-일)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일]-2-(하이드록시메틸)페닐}-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 62)
2-{3-[2-아미노-6-(1-이소프로필-1H-피라졸-4-일)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일]-2-(하이드록시메틸)페닐}-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 63)
2-{3-[2-아미노-6-(1-페닐-1H-피라졸-4-일)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일]-2-(하이드록시메틸)페닐}-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 64)
2-{3-[2-아미노-6-(6-메톡시피리딘-3-일)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일]-2-(하이드록시메틸)페닐}-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 65)
2-[3-(2-아미노-6-{4-[(3-옥소피페라진-1-일)메틸]페닐}-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-2-(하이드록시메틸)페닐}-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 66)
2-(3-{2-아미노-6-[4-(티아졸리딘-3-일메틸)페닐]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-2-(하이드록시메틸)페닐}-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 67)
tert-부틸 4-{2-아미노-4-[3-(6-시클로프로필-8-플루오로-1-옥소이소퀴놀린-2(1H)-일)-2-(하이드록시메틸)페닐]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-6-일}-5,6-디하이드로피리딘-1(2H)-카복실레이트 (실시예 68)
2-{3-[6-(1-아세틸-1,2,3,6-테트라하이드로피리딘-4-일)-2-아미노-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일]-2-(하이드록시메틸)페닐}-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 69)
2-(3-{2-아미노-6-[1-(모르폴린-4-카보닐)-1,2,3,6-테트라하이드로피리딘-4-일]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일}-2-(하이드록시메틸)페닐)-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 70)
2-(3-{2-아미노-6-[1-(4-메틸피페라진-1-카보닐)-1,2,3,6-테트라하이드로피리딘-4-일]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일}-2-(하이드록시메틸)페닐)-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 71)
2-(3-{2-아미노-6-[1-(tert-부틸)-1H-피라졸-4-일]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일}-2-(하이드록시메틸)페닐)-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 72)
2-[3-(2-아미노-6-{4-[(4-하이드록시피페리딘-1-일)메틸)페닐}-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-2-(하이드록시메틸)페닐]-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 73)
2-[3-(2-아미노-6-{4-[(4-메톡시피페리딘-1-일)메틸]페닐}-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-2-(하이드록시메틸)페닐]-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 74)
2-[3-(6-{4-[(4-아세틸피페라진-1-일)메틸]페닐}-2-아미노-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-2-(하이드록시메틸)페닐]-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 75)
2-[3-(2-아미노-6-{4-[(2,6-디메틸모르폴리노)메틸]페닐}-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-2-(하이드록시메틸)페닐]-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 76)
2-[3-(2-아미노-6-{4-[(4,4-디플루오로피페리딘-1-일)메틸]페닐}-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-2-(하이드록시메틸)페닐]-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 77)
2-{3-[2-아미노-6-(1-메틸-1H-피라졸-3-일)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일]-2-(하이드록시메틸)페닐}-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 78)
2-{3-[2-아미노-6-(4-{[4-(2,2,2-트리플루오로에틸)피페라진-1-일]메틸}페닐)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일]-2-(하이드록시메틸)페닐}-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 79)
2-[3-(2-아미노-6-{4-[(3,3-디메틸피페리딘-1-일)메틸]페닐}-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-2-(하이드록시메틸)페닐]-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 80)
2-{3-[2-아미노-6-(시클로헥스-1-엔-1-일)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일]-2-(하이드록시메틸)페닐}-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 81)
2-{3-[2-아미노-6-(3,6-디하이드로-2H-티오피란-4-일)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일]-2-(하이드록시메틸)페닐}-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 82)
2-{3-[2-아미노-6-(1,1-디옥시도-3,6-디하이드로-2H-티오피란-4-일)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일]-2-(하이드록시메틸)페닐}-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 83)
2-{3-[2-아미노-6-(1-프로피오닐-1,2,3,6-테트라하이드로피리딘-4-일)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일]-2-(하이드록시메틸)페닐}-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 84)
2-[3-(2-아미노-6-{1-[2-(디메틸아미노)아세틸]-1,2,3,6-테트라하이드로피리딘-4-일}-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-2-(하이드록시메틸)페닐]-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 85)
2-(3-{2-아미노-6-[1-(2-모르폴리노아세틸)-1,2,3,6-테트라하이드로피리딘-4-일]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일}-2-(하이드록시메틸)페닐)-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 86)
4-{2-아미노-4-[3-(6-시클로프로필-8-플루오로-1-옥소이소퀴놀린-2(1H)-일)-2-(하이드록시메틸)페닐]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-6-일}-N,N-디메틸-5,6-디하이드로피리딘-1(2H)-카복스아미드 (실시예 87)
2-(3-{2-아미노-6-[1-(피롤리딘-1-카보닐)-1,2,3,6-테트라하이드로피리딘-4-일]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일}-2-(하이드록시메틸)페닐)-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 88)
2-(3-{2-아미노-6-[1-(메틸설포닐)-1,2,3,6-테트라하이드로피리딘-4-일]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일}-2-(하이드록시메틸)페닐)-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 89)
2-(3-{2-아미노-6-[1-(이소프로필설포닐)-1,2,3,6-테트라하이드로피리딘-4-일]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일}-2-(하이드록시메틸)페닐)-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 90)
2-{3-[2-아미노-6-(1-에틸-1,2,3,6-테트라하이드로피리딘-4-일)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일]-2-(하이드록시메틸)페닐}-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 91)
2-(3-{2-아미노-6-[1-(시클로프로필메틸)-1,2,3,6-테트라하이드로피리딘-4-일]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일}-2-(하이드록시메틸)페닐)-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 92)
2-{3-[2-아미노-6-(1,2,3,6-테트라하이드로피리딘-4-일)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일]-2-(하이드록시메틸)페닐}-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (실시예 93)
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위하여 예의 검토한 결과, 전술한 식(I)으로 표시되는 옥소이소퀴놀린 유도체 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염이 탁월한 BTK 저해 활성을 갖는 것을 발견하였다.
추가로, OCI-Ly10 세포주를 사용하는 암 마우스 모델에서, 상기 옥소이소퀴놀린 유도체 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 경구 투여하여 강력한 항 종양 효과가 나타나는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 BTK를 통해 비정상 세포 반응에 관여하는 것으로 알려진 질환, 예를 들어, 자가 면역 질환, 염증성 질환, 뼈 질환, 및 림프종과 같은 암의 예방 또는 치료에 유용한 화합물을 제공하며, 상기 화합물을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물은 특히 경구 투여되는 경우에 바람직하게 사용된다.
또한, 본 발명에 의해 제공되는 화합물은 BTK 저해제로서, 실험용, 연구용 시약에 유용하다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 신규 옥소이소퀴놀린 유도체는 하기 식(I)으로 표시되는 화합물이다:
(식 중, R1은 치환기를 가지고 있어도 되는 저급 알킬 기를 나타내고,
Q는 하기 구조 (a), (b) 및 (c)에서 선택되는 구조를 나타내며:
,
여기서, R2 및 R3은 각각 독립적으로 수소 원자, 치환기를 가지고 있어도 되는 저급 알킬 기, 치환기를 가지고 있어도 되는 시클로알킬 기, 치환기를 가지고 있어도 되는 아릴 기, 치환기를 가지고 있어도 되는 헤테로아릴 기 또는 치환기를 가지고 있어도 되는 헤테로고리 기임).
Q의 구조로서 상기 구조 (a)가 바람직하다.
본 출원의 명세서에서, "치환기를 가지고 있어도 되는 저급 알킬 기"에서의 저급 알킬 기의 모이어티는, 1개 내지 3개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형의 알킬 기 중 어느 것일 수 있고, 구체적으로는 메틸 기, 에틸 기 및 이소프로필 기 등을 예로 들 수 있다.
"치환기를 가지고 있어도 되는 시클로알킬 기"에서의 시클로알킬 기의 모이어티는, 3개 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 시클릭 알킬 기 중 어느 것일 수 있고, 구체적으로는 시클로프로필 기, 시클로부틸 기, 시클로헥실 기 등을 예로 들 수 있다.
"치환기를 가지고 있어도 되는 아릴 기"에서의 아릴 기의 모이어티는, 6개 내지 14개의 탄소 원자를 갖는 모노시클릭 또는 바이시클릭 아릴 기 중 어느 것일 수 있고, 바이시클릭 아릴 기는 부분적으로 수소화될 수 있다. 구체적으로는 페닐 기, 나프틸 기, 테트라하이로나프틸 기, 인데닐 기 등을 예로 들 수 있다.
"치환기를 가지고 있어도 되는 헤테로아릴 기"에서의 헤테로아릴 기의 모이어티는, 모노시클릭 방향족 헤테로고리 기 및 축합 방향족 헤테로고리 기를 포함하고, 모노시클릭 방향족 헤테로고리 기로서는, 예를 들어, 질소 원자, 황 원자 및 산소 원자에서 선택되는 적어도 하나의 헤테로원자를 함유하는 5원 또는 6원의 모노시클릭 방향족 헤테로고리 기를 포함한다. 구체적으로는 피롤릴, 이미다졸릴, 피라졸릴, 티에닐, 티아졸릴, 푸라닐, 피리딜, 피리미딜, 피리다질 등을 예로 들 수 있고, 축합 방향족 헤테로고리 기의 예로는 3원 내지 8원 고리가 축합한, 질소 원자, 황 원자 및 산소 원자에서 선택되는 적어도 하나의 헤테로원자를 함유하는 축합 바이시클릭 헤테로고리 기를 포함한다. 구체적으로는 테트라하이드로이소퀴놀릴, 벤조티오페닐, 벤즈이미다졸릴, 벤조옥사졸릴, 벤조티아졸릴, 인돌릴 및 이소퀴놀릴 등을 예로 들 수 있다.
"치환기를 가지고 있어도 되는 헤테로고리 기"에서의 헤테로고리 기의 모이어티는, 질소 원자, 황 원자 및 산소 원자에서 선택되는 적어도 하나의 헤테로원자를 함유하는 4원 내지 6원의 모노시클릭 포화 헤테로고리 기이고, 고리에서 부분적으로 불포화 결합을 포함할 수 있다. 구체적으로는 디하이드로티오피라닐 기, 1,1-디옥소-디하이드로티오피라닐 기 및 테트라하이드로피리딜 기 등을 예로 들 수 있고, 특히 바람직하게는 테트라하이드로피리딜 기를 예로 들 수 있다.
치환기를 가지고 있어도 되는 저급 알킬 기, 치환기를 가지고 있어도 되는 시클로알킬 기, 치환기를 가지고 있어도 되는 아릴 기, 치환기를 가지고 있어도 되는 헤테로아릴 기 및 치환기를 가지고 있어도 되는 헤테로고리 기에서, 용어 "치환기를 가지고 있어도 되는"의 치환기로는, 1개 또는 2개 이상의 임의의 종류의 치환기(들)가 화학적으로 가능한 임의의 위치에 있어도 되고, 치환기가 2개 이상인 경우 각 치환기는 동일하거나 상이해도 된다.
치환기를 가지고 있어도 되는 저급 알킬 기의 치환기로는, 예를 들면, 할로겐 원자, C1-C4 알콕시 기, 1개 또는 2개의 C1-C4 알킬 기로 치환되어 있어도 되는 아미노 기, 니트로 기, 시아노 기, 하이드록시 기, 1개 또는 2개의 C1-C4 알킬 기로 치환되어 있어도 되는 카바모일 기, 카복시 기, 포르밀 기, 아세틸 기, 메실 기, 벤조일 기, C1-C6 아실아미노 기, C1-C6 아실옥시 기 등을 포함한다.
치환기를 가지고 있어도 되는 저급 알킬 기의 치환기로서, 하이드록시메틸 기를 예로 들 수 있다.
치환기를 가지고 있어도 되는 시클로알킬 기, 치환기를 가지고 있어도 되는 아릴 기, 치환기를 가지고 있어도 되는 헤테로아릴 기, 치환기를 가지고 있어도 되는 헤테로고리 기의 용어 "치환기를 가지고 있어도 되는"과 관련된 치환기의 예로는, 할로겐 원자, 산소 원자, C1-C4 알킬 기, C1-C4 알콕시 기, 1개 또는 2개의 C1-C4 알킬 기로 치환되어 있어도 되는 아미노 기, 니트로 기, 시아노 기, 하이드록시 기, 1개 또는 2개의 C1-C4 알킬 기로 치환되어 있어도 되는 카바모일 기, C1-C4 알킬 기로 치환되어 있어도 되는 설포닐 기, 카복시 기, 포르밀 기, 아세틸 기, 메실 기, 벤조일 기, 옥세타닐 기, C1-C6 아실아미노 기 및 C1-C6 아실옥시 기 등을 포함한다.
본 발명의 화합물(I)에는, 예를 들어, 치환기의 종류에 따라 이성체가 존재할 수 있다. 본 명세서에는 그것들의 이성체의 오직 하나의 형태의 화학 구조로 기재할 수 있지만, 본 발명은 구조상 형성될 수 있는 모든 이성체(기하 이성체, 광학 이성체, 호변 이성체 등)를 포함하며, 또한 이성체 단독 또는 이들의 혼합물을 포함한다.
본 발명의 화합물(I)의 약학적으로 허용가능한 염의 예로는 염산, 황산, 탄산 및 인산 등의 무기산 염; 및 푸마르산, 말레산, 메탄설폰산 및 p-톨루엔설폰산 등의 유기산 염을 포함한다. 본 발명은 또한 나트륨 및 칼륨 등의 알칼리 금속 염; 마그네슘 및 칼슘 등의 알칼리 토금속 염; 트리에틸아민 및 에탄올아민 등의 유기 아민 염; 및 리신, 아르기닌 및 오르니틴 등의 염기성 아미노산 염과, 기타 암모늄 염 등을 포함한다.
달리 지시되지 않는 한, '본 발명의 화합물(I)'은 그의 프로드러그(prodrug)도 포함한다.
본 발명에서 화합물(I) 및 그의 약학적으로 허용가능한 염은, 예를 들어, 하기에 나타내는 방법에 의해 제조할 수 있다. 하기에 나타낸 제조방법에서, 정의된 기가 예시된 방법의 조건 하에서 화학적으로 영향받을 수 있거나, 방법을 수행하는 데 사용하기 부적합한 경우, 유기 합성 화학에서 통상적으로 사용되는 방법, 예를 들어 관능기의 보호 또는 탈보호와 같은 수단을 적용하는 방법(문헌[T. W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis 3rd Edition, John Wiley&Sons, Inc., 1999])에 의해 용이하게 제조할 수 있다. 필요에 따라, 치환기의 도입 등의 반응 단계의 순서를 변경할 수도 있다.
하기의 설명에 사용되는 약어 및 기호의 의미는 다음과 같다.
DCM: 디클로로메탄
THF: 테트라하이드로푸란
DIEA: N,N-디이소프로필에틸아민
DMF: N,N-디메틸포름아미드
DMSO: 디메틸 설폭사이드
Pd(PPh3)4: 테트라키스[트리페닐포스핀]팔라듐(0)
[본 발명의 화합물(I)의 제조 방법]
본 발명의 화합물(I)은 예를 들어 스킴 1에 따라 제조될 수 있다;
[스킴 1]
(식 중, W는 보로닐 기 또는 보론산 에스테르 기이고, R1 및 Q는 상기와 동일한 의미를 나타냄).
본 발명의 화합물(I)은, 화합물(II) 및 화합물(III)을 사용하여, 스즈키(Suzuki) 커플링 반응 등의 크로스커플링 반응에 의해 제조할 수 있다(스즈키 커플링 반응의 조건에 대해서는, 예를 들어 문헌[N. Miyaura et al., J. Am. Chem. Soc., 107, 972 (1985)., N. Miyaura, A. Suzuki, Chem. Rev. 95, 2457 (1995)] 참조). 즉, 반응은 팔라듐 또는 니켈 등의 금속 촉매의 존재 하에, 필요에 따라 염기 및 첨가제를 사용하여 수행될 수 있다.
반응에 사용되는 용매의 예로는, THF, 디옥산, 톨루엔, 디메톡시에탄, 메탄올, 에탄올 및 아세토니트릴 등을 포함한다. 또한 이러한 용매 중 2종 이상을 사용하거나, 그들을 추가로 물과 배합하여 사용해도 적합하다. 용매는 바람직하게는 THF 및 물의 혼합 용매, 또는 톨루엔, 메탄올 및 물의 혼합 용매, 또는 디옥산이다.
화합물(II)은, 화합물(III)을 기준으로, 바람직하게는 등량 또는 과량으로, 더욱 바람직하게는 1당량 내지 5당량의 양으로 사용된다. 필요에 따라, 반응을 가속시키기 위해 염기가 첨가될 수 있고, 염기로는 탄산나트륨, 탄산세슘 및 탄산칼륨 등이 일반적으로 사용된다. 사용하는 염기의 양은, 화합물(III)을 기준으로, 1당량 내지 10당량, 바람직하게는 1당량 내지 5당량이다. 금속 촉매로는, 크로스커플링에 사용되는 구매 가능한 팔라듐 촉매(예를 들어, PdCl2(dppf), Pd2(dba)3, Pd(PPh3)4 등)를 사용할 수 있고, 촉매는 바람직하게는 촉매량으로, 즉, 화합물(III)을 기준으로 0.1당량 내지 0.5당량의 양으로 사용된다.
반응을 가속시키기 위해 필요에 따라 첨가제가 첨가될 수 있다. 첨가제는 예를 들어 rac-BINAP 등을 포함하고, 화합물(III)을 기준으로 0.01당량 내지 1당량의 양으로 사용될 수 있다. 0℃ 내지 200℃의 범위의 온도에서 수 분 내지 수 일 동안, 바람직하게는 10℃ 내지 100℃에서 1시간 내지 36시간 동안 반응시켜 생성물을 합성할 수 있다. 또한, 마이크로파 합성 장치를 사용하여, 60℃ 내지 150℃의 온도 조건에서 수 분 내지 수 시간 동안 반응시켜 생성물을 합성할 수 있다.
또한, 필요에 따라 합성 유기 화학에 사용되는 통상적인 기술을 사용하여, 화합물(II) 및 (III)의 관능기를 보호함으로써, 그리고 커플링 반응 후 이들을 탈보호함으로써, 본 발명의 화합물(I)을 제조할 수 있다.
또한, 스킴 1에 출발 물질로 사용된 화합물(II)은, 예를 들어 특허문헌 2에 기재된 방법에 따라 제조할 수 있다.
Q가 구조(a)인 화합물(III-a)은, 스킴 1에서 출발 물질로 사용되는 화합물(III) 중 하나이고, 예를 들어 스킴 2에 따라 제조할 수 있다;
[스킴 2]
(식 중, X는 할로겐 원자이고, R2 및 R3은 상기와 동일한 의미를 나타냄).
화합물(III-a)은 2,4-디아미노-6-하이드록시피리미딘 및 화합물(IV)을 고리축합시키고 이어서 옥시염화 인에 의한 염소화 반응에 의해 얻어진다. 즉, 화합물(V)은, 극성 용매 중에서, 필요에 따라 염기 촉매의 존재 하에, 1 내지 5몰당량, 바람직하게는 1 내지 1.5몰당량의 화합물(IV)을 2,4-디아미노-6-하이드록시피리미딘과 반응시켜 얻는다.
임의의 용매가 반응에 불활성이 아닌 한 제한없이 사용될 수 있지만, 물 및 DMF가 바람직하게 사용된다. 반응 온도는 일반적으로 0℃ 내지 200℃, 바람직하게는 실온 내지 150℃이다. 반응 시간은 제한되지 않지만, 일반적으로 0.2 내지 48시간을 예로 들 수 있으며, 바람직하게는 1 내지 24시간을 예로 들 수 있다.
화합물(III-a)은 1 내지 50몰당량, 바람직하게는 5 내지 20몰당량의 옥시염화 인을 화합물(V)과 반응시켜 얻는다. 반응 온도는 일반적으로 실온 내지 200℃, 바람직하게는 50℃ 내지 150℃이다. 반응 시간은 제한되지 않지만, 일반적으로 1 내지 48시간을 예로 들 수 있으며, 바람직하게는 5 내지 24시간을 예로 들 수 있다.
스킴 2의 출발 물질 중 하나인 2,4-디아미노-6-하이드록시피리미딘은 구매 가능하고, 화합물(IV) 또한 구매 가능하거나 널리 알려진 방법 또는 그에 준하는 방법에 의해 제조할 수 있다.
스킴 1의 출발 물질로 사용되는 화합물(III) 중 Q가 구조(b)인 화합물(III-b)은 예를 들어 스킴 3에 따라 제조할 수 있다;
[스킴 3]
(식 중, R3은 상기와 동일한 의미를 나타냄).
화합물(III-b)은 2,5,6-트리아미노피리미딘-4(3H)-온과 산 염화물(VI)을 축합시키고, 이어서 옥시염화 인에 의한 탈수소고리화 반응 및 염소화 반응에 의해 얻어진다. 즉, 화합물(VII)은, 용매 중에서, 염기의 존재 하에, 1 내지 10몰당량, 바람직하게는 1 내지 3몰당량의 산 염화물(VI)을 2,5,6-트리아미노피리미딘-4(3H)-온과 반응시켜 얻는다.
DIEA, 트리에틸아민 등의 유기 염기 또는 수산화나트륨 또는 탄산칼슘 등의 무기 염기가 일반적으로 사용되며, 산 염화물(VI)을 기준으로 1 내지 10당량, 바람직하게는 1 내지 5 당량의 염기를 사용한다. 임의의 용매가 반응에 불활성이 아닌 한 제한없이 사용될 수 있지만, 물, DMF 및 THF가 바람직하게 사용된다. 반응 온도는 일반적으로 -20℃ 내지 100℃, 바람직하게는 0℃ 내지 80℃이다. 반응 시간은 제한되지 않지만, 일반적으로 0.2 내지 48시간을 예로 들 수 있으며, 바람직하게는 1 내지 24시간을 예로 들 수 있다.
화합물(III-b)은 1 내지 100몰당량, 바람직하게는 10 내지 50몰당량의 옥시염화 인을 화합물(VII)과 반응시켜 얻는다. 반응 온도는 일반적으로 실온 내지 200℃, 바람직하게는 50℃ 내지 150℃이다. 반응 시간은 제한되지 않지만, 일반적으로 1 내지 48시간을 예로 들 수 있으며, 바람직하게는 5 내지 24시간을 예로 들 수 있다.
스킴 3의 출발 물질 중 하나인 2,5,6-트리아미노피리미딘-4(3H)-온은 구매 가능하고, 화합물(VI) 또한 구매 가능하거나 널리 알려진 방법 또는 그에 준하는 방법에 의해 제조할 수 있다.
스킴 1의 출발 물질로 사용되는 화합물(III) 중 Q가 구조(c)인 화합물(III-c)은 예를 들어 스킴 4에 따라 제조할 수 있다;
[스킴 4]
(식 중, R2 및 X는 상기와 동일한 의미를 나타냄).
화합물(III-c)은 2-아미노-4,6-디클로로피리미딘-5-카브알데하이드와 R2MgX를 축합시키고, 이어서 산화 반응 및 하이드라진 일수화물에 의한 고리화 반응에 의해 얻어진다. 즉, 화합물(VIII)은, 용매 중에서, 1 내지 10몰당량, 바람직하게는 1 내지 5몰당량의 R2MgX를 2-아미노-4,6-디클로로피리미딘-5-카브알데하이드와 반응시켜 얻는다.
임의의 용매가 반응에 불활성이 아닌 한 제한없이 사용될 수 있지만, THF가 바람직하게 사용된다. 반응 온도는 일반적으로 -100℃ 내지 -30℃, 바람직하게는 -80℃ 내지 -60℃이다. 반응 시간은 제한되지 않지만, 일반적으로 0.1 내지 12시간을 예로 들 수 있으며, 바람직하게는 0.2 내지 6시간을 예로 들 수 있다.
화합물(IX)은 1 내지 50몰당량, 바람직하게는 2 내지 20몰당량의 산화제로 화합물(VIII)을 산화시켜 얻으며, 산화제로 산화크롬(VI) 및 이산화망간 등의 금속 산화제, 또는 Dess-Martin Periodinane 등의 다가의 요오드 산화제를 사용할 수 있다. 임의의 용매가 반응에 불활성이 아닌 한 제한없이 사용될 수 있지만, 아세톤, DCM 및 1,2-디클로로에탄이 바람직하게 사용된다. 반응 온도는 일반적으로 -20℃ 내지 100℃, 바람직하게는 0℃ 내지 80℃이다. 반응 시간은 제한되지 않지만, 일반적으로 0.2 내지 24시간을 예로 들 수 있으며, 바람직하게는 1 내지 12시간을 예로 들 수 있다.
화합물(III-c)은, 용매 중에서, 그리고 필요에 따라 염기 촉매의 존재 하에, 1 내지 10몰당량, 바람직하게는 1 내지 5몰당량의 하이드라진 일수화물을 화합물(IX)과 반응시켜 얻는다. 임의의 용매가 반응에 불활성이 아닌 한 제한없이 사용될 수 있지만, 1,4-디옥산 또는 THF가 바람직하게 사용된다. 반응 온도는 일반적으로 0℃ 내지 100℃, 바람직하게는 실온 내지 60℃이다. 반응 시간은 제한되지 않지만, 일반적으로 0.2 내지 48시간을 예로 들 수 있으며, 바람직하게는 0.5 내지 24시간을 예로 들 수 있다.
스킴 4의 출발 물질 중 2-아미노-4,6-디클로로피리미딘-5-카브알데하이드는 구매 가능하고, R2MgX 또한 구매 가능하거나 널리 알려진 방법 또는 그에 준하는 방법에 의해 제조할 수 있다.
스킴 1의 출발 물질로 사용되는 화합물(III) 중 Q가 구조(a)이고 R2가 수소 원자인 화합물(III- a')은 예를 들어 스킴 5에 따라 제조할 수 있다;
[스킴 5]
(식 중, PG는 보호기를 나타내고, Y는 브롬 원자, 요오드 원자 또는 트리플루오로메탄설포닐 기를 나타내고, R3은 상기와 동일한 의미를 나타냄).
화합물(III-a')은 디아미노피리미딘(X)과 화합물(XI)의 소노가시라(Sonogashira) 커플링 반응에 의해 얻어지는 화합물(XII)을, 염기에 의해 고리화 반응시켜 얻어진다.
구체적으로는, 화합물(VII)은, 극성 용매 중에서, 요오드화 구리, 팔라듐 촉매 및 염기의 존재 하에, 1 내지 10몰당량, 바람직하게는 2 내지 5몰당량의 화합물(XI)을 디아미노피리미딘(X)과 반응시킨 후, 수산화나트륨 수용액과 불화 테트라-n-부틸암모늄으로 처리하여 얻는다.
반응에 첨가되는 요오드화 구리의 양은, 디아미노피리미딘(X)을 기준으로 0.01 내지 2당량, 바람직하게는 0.05 내지 0.5당량이고, 팔라듐 촉매로는 Pd(PPh3)4 및 PDCl2(PPh3)2 등의 0가 팔라듐 촉매가 일반적으로 사용된다. 반응에 첨가되는 팔라듐 촉매의 양은 디아미노피리미딘(X)을 기준으로 0.01 내지 2당량, 바람직하게는 0.05 내지 0.5당량이다. 염기로는 DIEA 및 트리에틸아민 등의 유기 염기가 일반적으로 반응에 사용되며, 디아미노피리미딘(X)을 기준으로 1 내지 10당량, 바람직하게는 1 내지 5당량의 염기가 반응에 첨가된다. 임의의 용매가 반응에 불활성이 아닌 한 제한없이 사용될 수 있지만, 1,4-디옥산 또는 DMF가 바람직하게 사용된다. 반응 온도는 일반적으로 0℃ 내지 200℃, 바람직하게는 실온 내지 80℃이다. 반응 시간은 제한되지 않지만, 일반적으로 0.2 내지 5시간을 예로 들 수 있으며, 바람직하게는 0.5 내지 2시간을 예로 들 수 있다.
화합물(III-a')은, 화합물(XII)을 1 내지 50몰당량, 바람직하게는 2 내지 20몰당량의 염기로 고리화 반응시켜 얻는다. 염기로는 칼륨 tert-부톡시드 또는 탄산세슘 등을 사용할 수 있다. 임의의 용매가 반응에 불활성이 아닌 한 제한없이 사용될 수 있지만, N-메틸피롤리돈, 1,4-디옥산 및 DMF가 바람직하게 사용된다. 반응 온도는 일반적으로 -20℃ 내지 100℃, 바람직하게는 0℃ 내지 80℃이다. 반응 시간은 제한되지 않지만, 일반적으로 0.2 내지 10시간을 예로 들 수 있으며, 바람직하게는 0.5 내지 2시간을 예로 들 수 있다.
또한 스킴 5의 화합물(XII)은 디아미노피리미딘(X)과 말단 보호 아세틸렌의 소노가시라 커플링 반응과 이어서 탈보호 반응에 의해 얻어지는 화합물(XIII)에, 추가로 화합물(XIV)을 소노가시라 커플링 반응을 통해 R3 모이어티를 도입하여 합성할 수 있다.
즉, 화합물(XIII)은, 극성 용매 중에서, 요오드화 구리, 팔라듐 촉매 및 염기의 존재 하에, 트리메틸실릴아세틸렌 등의 말단 보호 아세틸렌을 1 내지 10몰당량, 바람직하게는 2 내지 5몰당량을 디아미노피리미딘(X)과 반응시킨 후, 수산화나트륨 수용액 및 불화 테트라-n-부틸암모늄으로 처리하여 얻는다.
반응에 첨가되는 요오드화 구리의 양은, 디아미노피리미딘(X)을 기준으로 0.01 내지 2당량, 바람직하게는 0.05 내지 0.5당량이고, 팔라듐 촉매로는 Pd(PPh3)4 및 PDCl2(PPh3)2 등의 0가 팔라듐 촉매가 일반적으로 사용된다. 반응에 첨가되는 팔라듐 촉매의 양은 디아미노피리미딘(X)을 기준으로 0.01 내지 2당량, 바람직하게는 0.05 내지 0.5당량이다. 염기로는 DIEA 및 트리에틸아민 등의 유기 염기가 일반적으로 반응에 사용되며, 디아미노피리미딘(X)을 기준으로 1 내지 10당량, 바람직하게는 1 내지 5당량의 염기가 반응에 첨가된다. 임의의 용매가 반응에 불활성이 아닌 한 제한없이 사용될 수 있지만, 1,4-디옥산 또는 DMF가 바람직하게 사용된다. 반응 온도는 일반적으로 0℃ 내지 200℃, 바람직하게는 실온 내지 80℃이다. 반응 시간은 제한되지 않지만, 일반적으로 0.2 내지 5시간을 예로 들 수 있으며, 바람직하게는 0.5 내지 2시간을 예로 들 수 있다.
화합물(XII)은, 극성 용매 중에서, 요오드화 구리, 팔라듐 촉매 및 염기의 존재 하에, 1 내지 10몰당량, 바람직하게는 1 내지 5몰당량의 화합물(XIV)을 화합물(XIII)과 반응시켜 얻는다. 반응에 첨가되는 요오드화 구리의 양은, 화합물(XIII)을 기준으로 0.01 내지 2당량, 바람직하게는 0.05 내지 0.5당량이고, 팔라듐 촉매로는 Pd(PPh3)4 및 PDCl2(PPh3)2 등의 0가 팔라듐 촉매가 일반적으로 사용된다. 반응에 첨가되는 팔라듐 촉매의 양은 화합물(XIII)을 기준으로 0.01 내지 2당량, 바람직하게는 0.05 내지 0.5당량이다. 염기로는 DIEA 및 트리에틸아민 등의 유기 염기가 일반적으로 반응에 사용되며, 화합물(XIII)을 기준으로 1 내지 10당량, 바람직하게는 1 내지 5당량의 염기가 반응에 첨가된다. 임의의 용매가 반응에 불활성이 아닌 한 제한없이 사용될 수 있지만, 1,4-디옥산 또는 DMF가 바람직하게 사용된다. 반응 온도는 일반적으로 0℃ 내지 200℃, 바람직하게는 실온 내지 120℃이다. 반응 시간은 제한되지 않지만, 일반적으로 0.2 내지 5시간을 예로 들 수 있으며, 바람직하게는 0.5 내지 2시간을 예로 들 수 있다.
스킴 5의 출발 물질 중 디아미노피리미딘(X), 말단 보호 아세틸렌(XI) 및 화합물(XIV)은 또한 구매 가능하거나 널리 알려진 방법 또는 그에 준하는 방법에 의해 제조할 수 있다.
상기 스킴에서, W는 보로닐 기를 나타내고, 알칼리금속 또는 알칼리토금속의 염을 사용할 수 있다. 보론산 에스테르 기의 예로는 보론산 디메틸 에스테르 기, 보론산 디에틸 에스테르 기, 보론산 디부틸 에스테르 기, 보론산 디시클로헥실 기, 보론산 에틸렌 글리콜 에스테르 기, 보론산 프로필렌 글리콜 에스테르 기(보론산 1,2-프로판디올 에스테르 기, 보론산 1,3-프로판디올 에스테르 기), 보론산 네오펜틸 글리콜 에스테르 기, 보론산 카테콜 에스테르 기, 보론산 글리세린 에스테르 기, 보론산 트리메틸올 에탄 에스테르 기, 보론산 디에탄올아민 에스테르 기, 보론산 트리에탄올아민 에스테르 기 등; 및 보론산 무수물 등을 포함한다.
상기 방법을 적절하게 조합하여 사용하고, 이어서 유기 합성 화학에 일반적으로 사용되는 방법(예를 들어, 아미노 기의 알킬화 반응, 알킬티오 기의 설폭사이드 기 또는 설폰 기로의 산화 반응, 알콕시 기의 하이드록실 기로의 전환 반응, 또는 그 역으로 전환하는 반응)을 수행하여, 원하는 위치에 원하는 관능기를 갖는 본 발명의 화합물(I)을 얻을 수 있다.
[본 발명의 화합물(I)의 용도]
본 발명의 화합물(I) 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염은, 경구 투여, 비경구 투여 또는 국소 투여에 적합한 종래의 약학 제제(의약 조성물)의 형태로 제조할 수 있다.
경구 투여를 위한 제제는 정제, 과립, 분말 및 캡슐 등의 고형 제제; 시럽 등의 액체 제제를 포함한다. 이러한 제제는 종래의 방법에 의해 제조할 수 있다. 고형 제제는 종래의 약학적 담체, 예를 들어, 락토스; 옥수수 전분 등의 전분; 미세결정질 셀룰로스 등의 결정질 셀룰로스; 및 하이드록시프로필 셀룰로스, 칼슘 카복시메틸 셀룰로스, 탈크 및 마그네슘 스테아레이트 등을 사용하여 제조할 수 있다. 캡슐은 이렇게 조제한 과립 또는 분말을 캡슐에 포장하여 제조할 수 있다. 시럽은 본 발명의 화합물(I) 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을, 수크로스 및 카복시메틸 셀룰로스 등을 함유하는 수용액 중에서, 용해하거나 현탁하여 제조할 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제는 점적 주입 등의 주입물을 포함한다. 주입 제제 또한 종래의 방법으로 제조할 수 있고, 등장화제(예를 들어, 만니톨, 염화나트륨, 글루코스, 소르비톨, 글리세롤, 자일리톨, 프룩토스, 말토스, 만노스), 안정화제(예를 들어, 황산나트륨, 알부민), 및 방부제(예를 들어, 벤질 알코올, 메틸 p-옥시벤조에이트) 중에 적절히 혼입할 수 있다.
본 발명의 화합물(I) 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염의 투여량은 질환의 중증도, 환자의 연령 및 체중, 투여 형태 등에 따라 변할 수 있고, 일반적으로 성인에 대해 1일당 1 mg 내지 1,000 mg의 범위 내이다. 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염은 경구 또는 비경구 경로에 의해, 1일 1회 투여될 수 있거나, 1일 2회 또는 3회로 나누어 투여될 수 있다.
본 발명의 화합물(I) 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염은 BTK 저해제로서, 실험용 및/또는 연구용 시약으로 사용할 수도 있다.
실시예
본 발명은 하기 실시예 및 시험예에 의해 더욱 구체적으로 설명될 것이지만, 이들 실시예에 의해 본 발명이 제한되는 것은 아니다.
화합물의 동정은 수소핵자기공명스펙트럼(1H-NMR) 및 질량 스펙트럼(MS)에 의해 수행되었다. 1H-NMR은 다른 언급이 없는 한 400 MHz 또는 500 MHz에서 측정된 것이며, 때때로 교환성 수소가 화합물 및 측정 조건에 따라 명확하게 관찰되지 않는 경우가 있다. 또한, "br."은 폭이 넓은 신호(broad)를 의미한다.
HPLC 분취용 크로마토그래피는, 명세서에 달리 언급하지 않는 한, 구매 가능한 ODS 컬럼에 의해 물/메탄올(포름산을 함유함) 또는 물/아세토니트릴(탄산수소 암모늄을 함유함)을 용출액으로 사용하여 구배 모드로 수행되었다.
실시예 1
2-[3-(2-아미노-6-페닐-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-2-(하이드록시메틸)페닐]-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온
(제1 단계)
아세트산나트륨(0.65 g, 7.93 mmol)을, 2,4-디아미노-6-하이드록시피리미딘(1.0 g, 7.93 mmol)의 수용액(20 ml)에 첨가하고, 혼합물을 100℃에서 1시간 동안 교반하였다. 2-브로모-아세토페논(1.89 g, 9.51 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 100℃에서 8시간 동안 교반하였다. 석출된 고체를 수집하여 조 생성물로서 2-아미노-6-페닐-7H-피롤로[2,3-d]-피리미딘-4-올(1.5 g)을 얻었다.
LCMS (m/z): 227.11 [M+H]+.
(제2 단계)
2-아미노-6-페닐-7H-피롤로[2,3-d]-피리미딘-4-올(1.5 g, 6.64 mmol)과 피발산 무수물(5 ml)의 혼합물을 190℃에서 5시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물에 n-펜탄을 첨가하고, 실온에서 30분 동안 교반하였다. 석출된 고체를 여과에 의해 수집하여 조 생성물로서 N-(4-하이드록시-6-페닐-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일)피발아미드(1.4 g)를 얻었다.
LCMS (m/z): 311.33 [M+H]+.
(제3 단계)
N-(4-하이드록시-6-페닐-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일)피발아미드(1.4 g, 4.52 mmol)와 옥시염화 인(5 ml)의 혼합물을 100℃에서 10시간 동안 가열하였다. 과량의 옥시염화 인을 감압증류하고, 포화 탄산수소나트륨 수용액을 잔류물에 첨가하고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 얻어진 유기 층을 물 및 포화 식염수로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 용매를 감압증류하고, 얻어진 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(실리카겔, 석유 에테르/에틸 아세테이트)로 정제하여 N-(4-클로로-6-페닐-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일)피발아미드(0.4 g)를 얻었다.
1H NMR (500MHz, DMSO-d6) δ = 12.93 (s, 1H), 10.06 (s, 1H), 7.99 - 7.97 (m, 2H), 7.53 - 7.47 (m, 2H), 7.41 - 7.38 (m, 1H), 7.04 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 1.25 (s, 9H)； LCMS (m/z): 329.26 [M+H]+.
(제4 단계)
DME-물의 혼합 용액(5:1, 12 ml)을 2-(6-시클로프로필-8-플루오로-1-옥소이소퀴놀린-2(1H)-일)-6-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보란-2-일)벤질 아세테이트(0.392 g, 0.82 mmol), N-(4-클로로-6-페닐-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-일)피발아미드(0.27 g, 0.82 mmol) 및 탄산칼륨(0.227 g, 1.65 mmol)에 첨가하고, 혼합물을 아르곤 가스 분위기 하에서 30분 동안 탈기시켰다. 그에 Pd(PPh3)4(95 mg, 0.08 mmol)을 첨가하고, 마이크로파 반응 장치에서 100℃에서 10분 동안 반응시켰다. 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하고, 여액에 물을 가하고, 생성물을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 얻어진 유기 층을 물 및 포화 식염수로 순차적으로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 용매를 감압증류하여 조 생성물로서 2-(6-시클로프로필-8-플루오로-1-옥소이소퀴놀린-2(1H)-일)-6-(6-페닐-2-피발아미드-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)벤질 아세테이트를 얻었다. 얻어진 조 생성물을 메탄올(2 ml) 중에 용해하고, 5% 수산화나트륨 수용액을 첨가하고, 혼합물을 70℃에서 30분 동안 교반하였다. 용매를 감압증류하고, 얻어진 잔류물을 분취용 HPLC로 정제하여 표제 화합물(35 mg)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.89 (s, 1H), 7.91 - 7.83 (m, 2H), 7.80 (dd, J = 7.7, 1.3 Hz, 1H), 7.62 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 7.52 - 7.33 (m, 4H), 7.34 - 7.25 (m, 2H), 7.00 (dd, J = 13.3, 1.7 Hz, 1H), 6.76 (s, 1H), 6.63 (dd, J = 7.5, 2.1 Hz, 1H), 6.42 (s, 2H), 5.18 (s, 1H), 4.33 - 4.25 (m, 1H), 4.12 - 4.04 (m, 1H), 2.14 - 2.02 (m, 1H), 1.15 - 1.01 (m, 2H), 0.96 - 0.81 (m, 2H)； LCMS (m/z): 518.42 [M+H]+.
실시예 2
2-[3-(2-아미노-8-페닐-9H-퓨린-6-일)-2-(하이드록시메틸)페닐]-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온
[제1 단계]
얼음 냉각 하에 2M 수산화나트륨 수용액(25 ml)에 2,5,6-트리아미노피리미딘-4(3H)-온(1g, 7.092 mmol) 및 염화벤조일(1.63 ml, 14.18 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물에 아세트산을 첨가하여 산도를 pH 5로 조정하고, 석출된 고체를 여과 수집하여 N-(2,4-디아미노-6-하이드록시피리미딘-5-일)벤즈아미드(1.7 g)를 수득하였다.
1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 10.07 (s, 1H), 8.74 (s, 1H), 7.96 - 7.92 (m, 2H), 7.53 - 7.43 (m, 3H), 6.18 (br. s, 2H), 5.79 (br. s, 2H)； LCMS (m/z): 246.08 [M+H]+.
[제2 단계]
N-(2,4-디아미노-6-하이드록시피리미딘-5-일)벤즈아미드(2.5 g, 10.2 mmol)와 옥시염화 인(50 ml)의 혼합물을 환류 하에 24시간 동안 교반하였다. 과량의 옥시염화 인을 감압증류하고, 얻어진 잔류물에 암모니아 수용액을 가하여 알칼리성으로 만들고, 생성물을 10% MeOH-DCM으로 추출하였다. 얻어진 유기 층을 물 및 포화 식염수로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 용매를 감압증류하고, 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(실리카겔, DCM/메탄올)로 정제하여 6-클로로-8-페닐-9H-퓨린-2-아민(0.25 g)을 수득하였다.
LCMS (m/z): 245.87 [M+H] +.
[제3 단계]
2-(6-시클로프로필-8-플루오로-1-옥소이소퀴놀린-2(1H)-일)-6-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보란-2-일)벤질 아세테이트(0.25 g, 0.52 mmol), 6-클로로-8-페닐-9H-퓨린-2-아민(0.128 g, 0.524 mmol) 및 탄산칼륨(0.216 g, 1.57 mmol)에 DME-물의 혼합 용액(3:1, 13 ml)을 첨가하고, 혼합물을 아르곤 분위기 하에서 30분 동안 탈기하였다. Pd(PPh3)4(60 mg, 0.05 mmol)를 첨가하고 마이크로파 장치 내에서 110℃에서 30분 동안 반응시켰다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고, 물과 포화 식염수로 순차적으로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 용매를 감압증류하고, 얻어진 잔류물을 분취용 HPLC로 정제하여 표제 화합물(12 mg)을 수득하였다.
1H NMR (500MHz, DMSO-d6) δ 13.30 (s, 1H), 8.07 (d, J = 6.7 Hz, 2H), 7.91 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 7.63 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 7.54 - 7.48 (m, 4H), 7.41 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 7.28 (d, J = 1.2 Hz, 1H), 7.00 (d, J = 13.1 Hz, 1H), 6.68 (br. s, 2H), 6.63 (dd, J = 1.5, 7.3 Hz, 1H), 5.49 (br. s, 1H), 4.36 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 4.13 - 4.09 (m, 1H), 2.10 - 2.05 (m, 1H), 1.12 - 1.08 (m, 2H), 0.89 - 0.86 (m, 2H)； LCMS (m/z): 519.39 [M+H]+.
실시예 3
2-[3-(6-아미노-3-페닐-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-4-일)-2-(하이드록시메틸)페닐]-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온
[제1 단계]
2-아미노-4,6-디클로로피리미딘-5-카브알데하이드(1.0 g, 5.2 mmol)의 THF 용액(100 ml)에 페닐 마그네슘 브로마이드(1M THF 용액, 26 ml, 26 mmol)을 -78℃에서 서서히 첨가하고, 2시간 동안 교반하였다. 염화암모늄 포화 수용액을 반응 혼합물에 첨가하고, 셀라이트를 통해 여과하고, 여과물을 10%MeOH-DCM로 추출하였다. 얻어진 유기 층을 물 및 포화 식염수로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 용매를 감압증류하고, 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(실리카겔, 석유 에테르/에틸 아세테이트)로 정제하여, (2-아미노-4,6-디클로로피리미딘-5-일)(페닐)메탄올(0.6 g)을 수득하였다.
1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ = 7.52 (br. s, 2H), 7.33 - 7.30 (m, 4H), 7.26 - 7.18 (m, 1H), 6.20 (d, J = 4.4 Hz, 1H), 6.03 (d, J = 4.9 Hz, 1H)； LCMS (m/z): 270.05 [M+H]+.
[제2 단계]
얼음 냉각 하에, (2-아미노-4,6-디클로로피리미딘-5-일)(페닐)메탄올(0.6 g, 2.2 mmol)의 1,2-디클로로 에탄 용액(15 ml)에 이산화망간(3.88 g, 44.6 mmol)을 첨가하고, 80℃에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하고, 용매를 감압증류하여 (2-아미노-4,6-디클로로피리미딘-5-일)(페닐)메탄온(0.5 g)을 수득하였다.
1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 7.97 - 7.92 (m, 4H), 7.75 - 7.72 (m, 1H), 7.60 - 7.56 (m, 2H)； LCMS (m/z): 267.94 [M+H]+.
[제3 단계]
(2-아미노-4,6-디클로로피리미딘-5-일)(페닐)메탄온(0.5 g, 1.87 mmol)의 THF-용액(15 ml)에 하이드라진 일수화물(0.1 ml, 1.87 mmol)을 첨가하고, 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물의 용매를 감압증류하고, 얻어진 잔류물에 물을 첨가하고, 석출된 고체를 여과 수집하여 4-클로로-3-페닐-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-6-아민(0.35 g)을 수득하였다.
1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 13.38 (br. s, 1H), 7.70 - 7.68 (m, 2H), 7.50 - 7.44 (m, 3H), 7.18 (br. s, 2H)； LCMS (m/z): 246.1 [M+H]+.
[제4 단계]
2-(6-시클로프로필-8-플루오로-1-옥소이소퀴놀린-2(1H)-일)-6-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보란-2-일)벤질 아세테이트(0.193 g, 0.4 mmol), 4-클로로-3-페닐-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-6-아민(0.1 g, 0.4 mmol) 및 탄산칼륨(0.11 g, 0.8 mmol)에 DME-물의 혼합 용액(4:1, 10 ml)을 첨가하고, 혼합물을 아르곤 분위기 하에서 30분 동안 탈기시켰다. Pd(PPh3)4(23 mg, 0.02 mmol)를 첨가하고, 마이크로파 장치 내에서 110℃에서 15분간 반응시켰다. 반응 혼합물에 물을 첨가하고, 석출된 고체를 여과 수집하여, 조 생성물로서 2-(6-아미노-3-페닐-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-4-일)-6-(6-시클로프로필-8-플루오로-1-옥소이소퀴놀린-2(1H)-일)벤질 아세테이트(0.3 g)를 수득하였다. 조 생성물을 메탄올(20 ml)에 용해시키고, 탄산칼륨(0.4 g)을 첨가하고 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 용매를 감압증류하고, 얻어진 잔류물에 물을 첨가하고, 석출된 고체를 여과 수집하고, 분취용 HPLC로 정제하여 표제 화합물(45 mg)을 수득하였다.
1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 13.18 (br. s, 1H), 7.28 - 6.94 (m, 13H), 6.61 (d, J = 5.9 Hz, 1H), 4.69 (br. s, 1H), 4.49 - 4.12 (m, 2H), 2.11 - 2.04 (m, 1H), 1.12 - 1.07 (m, 2H), 0.89 - 0.85 (m, 2H)； LCMS (m/z): 519.39 [M+H]+.
실시예 4~22 및 24~93
다음 표 1-1 및 표 1-2의 각각의 실시예 화합물은 각각 대응하는 원료(상업적인 공급원으로부터 수득하거나, 당업자에게 공지된 문헌 방법 또는 문헌 방법의 변형에 의해 제조됨)를 사용하여, 상기 실시예에 기재된 방법에 따라, 또는 필요에 따라 유기 화학 기술 분야에서 널리 알려진 통상의 방법과 적절히 조합하여 제조되었다.
각 화합물의 물리화학 데이터는 표 2-1 및 표 2-2에 나타내었다.
[표 1-1]
[실시예 23]
2-(3-{2-아미노-6-[1-(옥세탄-3-일)-1,2,3,6-테트라하이드로피리딘-4-일]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일}-2-(하이드록시메틸)페닐)-6-시클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온
[제1 단계]
6-클로로-5-요오도-피리미딘-2,4-디아민(7.1 g, 26.3 mmol)의 DMF-용액(52.5 ml)에 요오드화구리(0.25 g, 1.31 mmol), PdCl2(PPh3)2(0.92 g, 1.31 mmol), 트리메틸실릴아세틸렌(3.87 g, 39.4 mmol) 및 트리에틸아민(7.32 ml, 52.5 mmol)을 첨가하고, 45℃에서 30분 동안 교반하였다. 트리메틸실릴아세틸렌(3.87 g, 39.4 mmol)을 반응 용액에 첨가하고, 추가로 혼합물을 45℃에서 30분 동안 교반하였다. 물을 반응 혼합물에 첨가하고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 얻어진 유기 층을 물 및 포화 식염수로 순차적으로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 용매를 감압증류하고, 플래시 크로마토그래피로 정제하여, 6-클로로-5-((트리메틸실릴)에티닐)피리미딘-2,4-디아민(6.3 g)을 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 6.78 (s, 2H), 0.21 (s, 9H)； LCMS (m/z): 241.14 [M+H]+.
[제2 단계]
6-클로로-5-((트리메틸실릴)에티닐)피리미딘-2,4-디아민(7.0 g, 29.1 mmol)의 THF-용액(291 ml)에 0.1M 수산화나트륨 수용액(58.1 ml, 5.81 mmol)을 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물에 물을 첨가하고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 얻어진 유기 층을 물 및 포화 식염수로 순차적으로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 용매를 감압증류하여 6-클로로-5-에티닐피리미딘-2,4-디아민(4.85 g)을 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 6.75 (s, 2H), 4.50 (s, 1H)； LCMS (m/z): 169.01 [M+H]+.
[제3 단계]
6-클로로-5-에티닐피리미딘-2,4-디아민(3.8 g, 22.5 mmol)의 DMF-용액(225 ml)에 요오드화구리(0.215 g, 1.13 mmol), PdCl2(PPh3)2(1.58 g, 2.25 mmol), tert-부틸 4-{[(트리플루오로메틸)설포닐]옥시}-5,6-디하이드로피리딘-1(2H)-카복실레이트(7.47 g, 22.5 mmol) 및 트리에틸아민(6.28 ml, 45.1 mmol)을 첨가하고, 90℃에서 30분 동안 교반하였다. 반응 혼합물에 물을 넣고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 얻어진 유기 층을 물 및 포화 식염수로 순차적으로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 용매를 감압증류하고, 잔류물을 플래시 크로마토그래피로 정제하여, tert-부틸 4-[(2,4-디아미노-6-클로로피리딘-5-일)에티닐]-5,6-디하이드로피리딘-1(2H)-카복실레이트(4.92 g)를 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 6.73 (s, 2H), 6.14 (s, 1H), 3.97 - 3.90 (m, 2H), 3.44 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 2.28 - 2.24 (m, 2H), 1.41 (s, 9H)； LCMS (m/z): 350.13 [M+H]+.
[제4 단계]
tert-부틸 4-[(2,4-디아미노-6-클로로피리미딘-5-일)에티닐]-5,6-디하이드로피리딘-1(2H)-카복실레이트(4.9 g, 14 mmol)의 N-메틸 피롤리돈 용액(140 ml)에 칼륨 tert-부톡시드(4.72 g, 42 mmol)를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물에 물을 첨가하고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 얻어진 유기 층을 물 및 포화 식염수로 순차적으로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 용매를 감압증류하고, 잔류물을 플래시 크로마토그래피로 정제하여, tert-부틸 4-(2-아미노-4-클로로-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-6-일)-5,6-디하이드로피리딘-1(2H)-카복실레이트(2.93 g)를 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.73 - 11.55 (m, 1H), 6.57 (s, 2H), 6.32 (s, 1H), 6.29 - 6.16 (m, 1H), 4.14 - 3.90 (m, 2H), 3.61 - 3.43 (m, 2H), 2.49 - 2.35 (m, 2H), 1.42 (s, 9H)；LCMS (m/z): 350.18 [M+H]+.
[제5 단계]
2-(6-시클로프로필-8-플루오로-1-옥소이소퀴놀린-2(1H)-일)-6-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보란-2-일)벤질 아세테이트(3.96 g, 8.29 mmol), tert-부틸 4-(2-아미노-4-클로로-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘--6-일)-5,6-디하이드로피리딘-1(2H)-카복실레이트(2.9 g, 8.29 mmol) 및 제삼인산칼륨(3.52 g, 16.6 mmol)에 DMF-물의 혼합 용액(5:1, 165 ml)을 첨가하고, 혼합물을 질소 가스 분위기 하에서 30분 동안 탈기하였다. Pd(PPh3)4(0.96 g, 0.829 mmol)을 첨가하고, 110℃에서 20분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고, 물 및 포화 식염수로 순차적으로 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 용매를 감압증류하여 tert-부틸 4-{4-[2-(아세톡시메틸)-3-(6-시클로프로필-8-플루오로-1-옥소이소퀴놀린-2(1H)-일)페닐]-2-아미노-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-6-일}-5,6-디하이드로피리딘-1(2H)-카복실레이트(5.43 g)을 수득하였다.
LCMS (m/z): 665.37 [M+H]+.
[제6 단계]
tert-부틸 4-{4-[2-(아세톡시메틸)-3-(6-시클로프로필-8-플루오로-1-옥소이소퀴놀린-2(1H)-일)페닐]-2-아미노-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-6-일}-5,6-디하이드로피리딘-1(2H)-카복실레이트(3.54 g, 5.33 mmol)의 THF-용액(53 ml)에 트리에틸아민(4.45 ml, 32 mmol)과 아세틸 클로라이드(1.89 ml, 26.6mmol)를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물에 물을 첨가하고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 얻어진 유기 층을 물, 1M 수산화나트륨 수용액 및 포화 식염수로 순차적으로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 용매를 감압증류하여 조 생성물로서 tert-부틸 4-{2-아세트아미드-4-[2-(아세톡시메틸)-3-(6-시클로프로필-8-플루오로-1-옥소이소퀴놀린-2(1H)-일)페닐]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-6-일}-5,6-디하이드로피리딘-1(2H)-카복실레이트(5.44 g)를 수득하였다.
LCMS (m/z): 707.43 [M+H]+.
[제7 단계]
tert-부틸 4-{2-아세트아미드-4-[2-(아세톡시메틸)-3-(6-시클로프로필-8-플루오로-1-옥소이소퀴놀린-2(1H)-일)페닐]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-6-일}-5,6-디하이드로피리딘-1(2H)-카복실레이트(6.66 g, 9.42 mmol)의 DCM 용액(150 ml)에 4M 염산 1,4-디옥산 용액(50 ml)을 첨가하고, 실온에서 6시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물에 4M 수산화나트륨 수용액(50 ml)을 첨가하고, 물을 거기에 첨가하고, 클로로포름으로 추출하였다. 얻어진 유기 층을 물 및 포화 식염수로 순차적으로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 용매를 감압증류하고, 얻어진 잔류물을 플래시 크로마토그래피로 정제하여, 2-[2-아세트아미드-6-(1,2,3,6-테트라하이드로피리딘-4-일)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일]-6-(6-시클로프로필-8-플루오로-1-옥소이소퀴놀린-2(1H)-일)벤질 아세테이트(2.66g)를 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.47 (s, 1H), 10.53 (s, 1H), 7.77 - 7.66 (m, 2H), 7.54 (dd, J = 6.8, 2.4 Hz, 1H), 7.40 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 7.28 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 7.00 (dd, J = 13.3, 1.7 Hz, 1H), 6.64 (dd, J = 7.5, 2.1 Hz, 1H), 6.57 - 6.50 (m, 1H), 6.41 (s, 1H), 5.21 (d, J = 12.6 Hz, 1H), 4.99 (d, J = 12.6 Hz, 1H), 3.71 - 3.66 (m, 2H), 3.18 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.62 - 2.57 (m, 2H), 2.15 (s, 3H), 2.13 - 2.02 (m, 1H), 1.51 (s, 3H), 1.15 - 1.05 (m, 2H), 0.94 - 0.86 (m, 2H)； LCMS (m/z): 607.31 [M+H]+.
[제8 단계]
2-[2-아세트아미드-6-(1,2,3,6-테트라하이드로피리딘-4-일)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일]-6-(6-시클로프로필-8-플루오로-1-옥소이소퀴놀린-2(1H)-일)벤질 아세테이트(2.1 g, 3.46 mmol)의 DCM 용액(69 mmol)에 옥세탄-3-온(1.25 g, 17.3 mmol) 및 트리아세톡시수소화붕소 나트륨(3.67 g, 17.3 mmol)을 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물에 옥세탄-3-온(1.25 g, 17.3 mmol) 및 트리아세톡시수소화붕소 나트륨(3.67 g, 17.3 mmol)을 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 추가로 교반하였다. 반응 혼합물에 물을 첨가하고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 얻어진 유기 층을 물, 1M 수산화나트륨 수용액, 및 포화 식염수로 순차적으로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 용매를 감압증류하여 2-{2-아세트아미드-6-[1-(옥세탄-3-일)-1,2,3,6-테트라하이드로피리딘-4-일]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일}-6-(6-시클로프로필-8-플루오로-1-옥소이소퀴놀린-2(1H)-일)벤질 아세테이트(2.29 g)를 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.48 (s, 1H), 10.52 (s, 1H), 7.77 - 7.66 (m, 2H), 7.53 (dd, J = 7.0, 2.2 Hz, 1H), 7.44 - 7.35 (m, 1H), 7.28 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 7.00 (dd, J = 13.3, 1.7 Hz, 1H), 6.63 (dd, J = 7.6, 2.1 Hz, 1H), 6.59 - 6.52 (m, 1H), 6.31 (s, 1H), 5.22 (d, J = 12.6 Hz, 1H), 4.99 (d, J = 12.6 Hz, 1H), 4.67 - 4.46 (m, 4H), 3.61 - 3.50 (m, 1H), 3.06 - 3.01 (m, 2H), 2.51 - 2.43 (m, 4H), 2.16 (s, 3H), 2.12 - 2.02 (m, 1H), 1.51 (s, 3H), 1.15 - 1.01 (m, 2H), 0.94 - 0.80 (m, 2H)； LCMS (m/z): 663.37 [M+H]+.
[제9 단계]
2-{2-아세트아미드-6-[1-(옥세탄-3-일)-1,2,3,6-테트라하이드로피리딘-4-일]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일}-6-(6-시클로프로필-8-플루오로-1-옥소이소퀴놀린-2(1H)-일)벤질 아세테이트(2.3 g, 3.47 mmol)의 메탄올 용액(100 ml)에 2M 수산화나트륨 수용액(50 ml)을 첨가하고, 70℃에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물에 물을 첨가하고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 얻어진 유기 층을 물 및 포화 식염수로 순차적으로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 용매를 감압증류하여 표제의 생성물(1.4 g)을 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.52 (s, 1H), 7.72 (dd, J = 7.8, 1.3 Hz, 1H), 7.64 - 7.53 (m, 1H), 7.46 (dd, J = 7.8, 1.3 Hz, 1H), 7.37 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 7.28 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 6.99 (dd, J = 13.2, 1.7 Hz, 1H), 6.62 (dd, J = 7.4, 2.1 Hz, 1H), 6.41 (s, 2H), 6.38 - 6.32 (m, 1H), 6.27 - 6.18 (m, 1H), 5.20 (dd, J = 8.8, 4.5 Hz, 1H), 4.61 - 4.46 (m, 4H), 4.25 (dd, J = 12.0, 4.2 Hz, 1H), 4.06 (dd, J = 12.0, 8.8 Hz, 1H), 3.60 - 3.48 (m, 1H), 3.04 - 2.98 (m, 2H), 2.48 - 2.43 (m, 4H), 2.14 - 2.00 (m, 1H), 1.15 - 1.01 (m, 2H), 0.92 - 0.82 (m, 2H)； LCMS (m/z): 579.60 [M+H]+.
[표 1-2]
[표 2-1]
[표 2-2]
시험예 1
BTK 활성 저해 시험
(탈인산화 BTK의 제조)
탈인산화 BTK는, 비오티닐화 BTK 단백질 BTN-BTK(Carna Biosciences, Inc. 제조) 효소 용액에 λ protein phosphatase(New England BioLabs Inc. 제조, Code No.P0753S)와 MnCl2를 각각 10 U/μg 및 2 mM로 첨가하고, 혼합물을 4℃에서 하룻밤 반응시키고, 항 DYKDDDDK-태그 항체 아가로스 겔 크로마토그래피로 λ protein phosphatase를 제거한 후, 10DG Desalting Column을 사용하여 버퍼 교환을 행하여 얻었다.
(키나제 활성 측정 방법)
키나제 활성은, QuickScout Screening Assist(상표명) MSA(Carna Biosciences, Inc.의 시판 키트)를 사용하여, 모빌리티 시프트 분석(MSA)법으로 측정할 수 있다. 키나제 반응의 기질은, 키트에 포함되는 FITC-표지 SRCtide 펩티드이었다. 분석 버퍼(20mM HEPES, 0.01% Triton X-100(상표명), 2mM 디티오트레이톨, pH7.5)를 사용하고, 4 μM의 기질, 20 mM의 MgCl2 및 200 μM의 ATP가 되도록 조정하여 기질 혼합 용액을 얻었다. 또한, 분석 버퍼를 사용하여 탈인산화 BTK를 0.46 nM이 되도록 희석하여 효소 용액을 제조하였다. 시험 화합물의 10 mM DMSO 용액을 10개의 농도(0.00003 mM, 0.0001 mM, 0.0003 mM, 0.001 mM, 0.003 mM, 0.01 mM, 0.03 mM, 0.1 mM, 0.3 mM, 1 mM)로 DMSO로 추가 희석하고, 이들 각각을 분석 버퍼로 25배 희석하여, 약물용액(4% DMSO 용액)을 얻었다. 5 μL의 약물 용액 또는 대조군 용액(4% DMSO-분석 버퍼), 5 μL의 기질 혼합물 용액, 및 10 μL의 효소 용액을 폴리프로필렌제 384-웰의 웰에서 혼합하고, 실온에서 2시간 동안 반응시킨 후, 키트에 포함된 터미네이션 버퍼를 60 μL 첨가하여 반응을 정지시켰다. 이어서, 반응 용액의 기질(S) 및 인산화 기질(P)의 양을 LabChip EZ Reader II 시스템(Caliper Life Sciences 제조)을 사용하여 분석 키트의 프로토콜에 따라 측정하였다.
(BTK 저해 활성 평가 방법)
분리된 기질 및 인산화된 기질의 피크의 높이를 각각 S 및 P로 나타내고, 또한 공백으로 효소 용액 대신 분석 버퍼를 함유한 것을 측정하였다.
시험 화합물의 저해율(%)을 하기 식에 따라 계산하였다;
저해율(%) = (1-(C-A)/(B-A)) × 100
여기서, A, B 및 C는 각각 공백 웰의 P/(P+S), 대조군 웰의 P/(P+S) 및 화합물 함유 웰의 P/(P+S)를 나타낸다.
IC50 값은 저해율(%)과 시험 화합물 농도(대수)의 회귀 분석을 통해 계산되었다.
(평가 결과)
실시예 화합물 군은 탈인산화 BTK에 대하여 10 nM 이하 내지 100 nM 이하의 IC50 값을 나타내고 있으므로, 본 발명의 화합물(I)은 강력한 BTK 저해 효과를 갖는 것을 나타낸다. 본 발명의 대표 화합물의 탈인산화 BTK에 대한 저해 활성을 표 3에 나타내었다. BTK 저해 활성은 IC50 값이 0.01 μM 미만일 경우 "***" 표시, IC50 값이 0.01 μM 내지 0.1 μM 미만일 경우 "**" 표시, IC50 값이 0.1 μM 내지 1.0 μM 미만일 경우 "*" 표시로 나타내었다.
[표 3]
시험예 2
세포내 BTK의 자기-인산화 활성 저해 시험
(사용된 세포 배양)
Ramos 세포(2G6.4C10, ATCC No.CRL-1923)는, T75 플라스크 중 10% FBS(AusGene) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(Nacalai Tesque, Inc.)(이하, 증식 배지)를 첨가한 RPMI-1640 배지(GIBCO, #A10491-01)를 이용하여 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다.
(시험 화합물의 첨가)
배양한 Ramos 세포를 혈청이 없는 RPMI-1640(이하, 배지)을 이용하여 7.5Х106 cells/mL의 세포 밀도가 되도록 희석하고, 37℃에서 45분 동안 유지하였다. 세포 현탁액을 2.0 mL 튜브에 1 mL씩 소분한 후 희석하였다. 시험 화합물의 0.03 mM DMSO 용액을 배지로 희석하여 0.09 μM로 만든 시험 화합물 용액을 500 μL 튜브에 첨가하고, 시험 화합물의 최종 농도가 0.03 μM인 조건에서 37℃에서 1시간 동안 배양했다. 그 후, 배지로 희석한 항-IgM 항체(Invitrogen, No.H15100)를 10 μg/mL의 최종 농도로 첨가하고, 37℃에서 10분 동안 배양하였다.
(단백질의 추출)
원심분리기에 의해 세포를 회수하여 얻은 펠릿에 라이시스 버퍼(RIPA 버퍼(Х1)(Cell Signaling Technology, Inc.)에, 1% 포스파타아제 저해제 칵테일 3(Sigma Corporation, No.P0044), 1% 포스파타아제 저해제 칵테일(Nacalai Tesque, Inc., No.07575) 및 1 mM 불화페닐메틸설포닐(PMSF)를 첨가한 것)을 100 μL 첨가하고, 가볍게 교반한 후 10분간 정치하였다. 원심분리(15,000 rpm, 15분)에 의해 상청액을 회수하여 단백질 함량을 측정하였다. SDS-샘플 버퍼와 혼합하여, 95℃에서 5분 동안 반응시켜 단백질을 변성시켜 샘플 용액을 얻었다. 5~20%의 구배 아크릴아미드 겔(Nacalai Tesque, Inc., No.13064-04)을 함유하는 각각의 웰에 각각 5 μL의 샘플 용액을 적용시키고 전기영동을 실시했다. 그 후, iBlot 겔 트랜스퍼 시스템(Life Technologies Corporation)을 사용하여 PVDF 막 상에 겔 중의 단백질을 전사했다.
(BTK 또는 인산화 BTK의 검출)
전사한 PVDF 막을 2% ECL prime blocking Reagent(GE Healthcare)로 블로킹 처리한 후, 1차 항체로 항-BTK 마우스 항체(BD transduction laboratory, No.611116) 또는 항-인산화 BTK 토끼 항체(pY223, EPITOMICS, No.2207-1)를 이용하여, 4℃에서 하룻밤 반응시켰다. 미반응 1차 항체를 TBST 버퍼(10mM Tris-HCl (pH7.5), 150mM NaCl, 0.1% Tween 20)로 세척한 후, 제2 항체로서 HRP-표지된 항-마우스 IgG 말 항체(Cell Signaling Technology, No.7076) 또는 항-토끼 IgG 염소 항체(Cell Signaling Technology, No.7074)를 이용하여, 반응물을 2% ECL prime blocking Reagent를 첨가한 TBST 버퍼 중에서 실온에서 1시간 반응시켰다. 미반응 2차 항체를 TBST 버퍼로 세척한 후, Chemi-Lumi One Super(Nacalai Tesque, Inc.)를 이용하여 첨부된 프로토콜에 따라 반응시킨 후, CCD 카메라(GE Healthcare, ImageQuant LAS 500)를 이용하여 각각의 밴드를 화학발광 검출하였다. 검출된 밴드를 덴시토메트리(ImageQuant TL 분석 소프트웨어 v8.1)에 의해 수치화하고, 화합물을 첨가하지 않고 IgM 자극을 갖는 군의 인산화 BTK 밴드의 발광을 100%로 하고, 화합물을 첨가하지 않고 IgM 자극이 없는 군의 인산화 BTK 밴드의 발광을 0%로 하여, 각 군에서 밴드의 강도를 기준으로 저해율(%)을 산출하였다. 각각의 인산화 BTK의 밴드는 총 BTK를 기준으로 보정하였다.
1차 항체와 2차 항체의 조합이 본 시험에 사용되었으며, 이의 희석 농도는 하기에 나타나 있다.
[표 4]
0.03 μM의 시험 화합물 농도에서 얻어진 결과는 표 5에 나타나 있다. 세포내 BTK의 자기인산화 저해 활성은, 90% 이상의 경우 "***" 표시, 70% 이상 90% 미만의 경우 "**" 표시, 50% 이상 70% 미만의 경우 "*" 표시로 나타낸다,
세포내 BTK의 자기인산화에 대한 본 발명의 대표 화합물의 저해 효과를 표 5에 나타내었다. 표에 보여지는 바와 같이, 본 발명의 화합물(I)은 0.03 μM의 농도에서 세포내 BTK의 자기인산화 활성을 강하게 저해했다.
[표 5]
시험예 2의 결과는 본 발명의 화합물(I)이 "세포내 BTK의 자기인산화 활성작용"에 대해서도, 강한 저해 효과를 가지고 있음을 나타낸다.
시험예 3
C481S 돌연변이 BTK 저해 활성 시험
(키나제 활성의 측정 방법)
키나제 활성은, QuickScout Screening Assist(상표명) MSA(Carna Biosciences, Inc. 제조 시판 키트)를 이용하여, 모빌리티 시프트 분석(MSA) 방법으로 측정하였다. 키나제 반응의 기질은 키트에 포함된 FITC-표지 SRCtide 펩티드를 사용하였다. 분석 버퍼(20mM HEPES, 0.01% Triton X-100(상표명), 2mM 디티오트레이톨, pH7.5)를 사용하고, 4 μM의 기질, 20 mM의 MgCl2 및 120 μm 또는 100 μm의 ATP(ATP 농도는 각각 야생형 BTK 및 C481S 돌연변이 BTK의 Km 값 부근임)가 되도록 조정하여 기질 혼합 용액을 얻었다. 또한, 야생형 BTK 또는 C481S 돌연변이 BTK를 분석 버퍼를 사용하여 0.28 nM로 희석하여 효소 용액을 제조하였다. 시험 화합물의 10 mM DMSO 용액을 10개의 농도(0.00003 mM, 0.0001 mM, 0.0003 mM, 0.001 mM, 0.003 mM, 0.01 mM, 0.03 mM, 0.1 mM, 0.3 mM, 1 mM)로 DMSO로 추가로 희석하고, 이들 각각을 분석 버퍼로 25배 희석하여, 약물용액(4% DMSO solutions)을 얻었다. 5 μL의 약물 용액 또는 대조군 용액(4% DMSO-분석 버퍼), 5 μL의 기질 혼합물 용액, 및 10 μL의 효소 용액을 폴리프로필렌제 384-웰의 웰에서 혼합하고, 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후, 키트에 포함된 터미네이션 버퍼를 60 μL 첨가하여 반응을 정지시켰다. 이어서, 반응 용액의 기질(S) 및 인산화 기질(P)의 양을 LabChip EZ Reader II 시스템(Caliper Life Sciences 제조)을 사용하여 분석 키트의 프로토콜에 따라 측정하였다.
(BTK 저해 활성 평가 방법)
분리된 기질 및 인산화된 기질의 피크의 높이를 각각 S 및 P로 나타내고, 또한 공백으로 효소 용액 대신 분석 버퍼를 함유한 것을 측정하였다.
시험 화합물의 저해율(%)을 하기 식에 따라 계산하였다;
저해율(%) = (1-(C-A)/(B-A)) × 100
여기서, A, B 및 C는 각각 공백 웰의 P/(P+S), 대조군 웰의 P/(P+S) 및 화합물 함유 웰의 P/(P+S)를 나타낸다.
IC50 값은 저해율(%)과 시험 화합물 농도(대수)의 회귀 분석을 통해 계산되었다.
본 발명의 대표 화합물의 야생형 BTK[BTK(WT)] 및 C481S 돌연변이 BTK[BTK(C481S)]에 대한 저해 활성은 표 6에 나타내었다. 또한, C481S 돌연변이 저항성의 대략적인 지표로서 IC50[BTK(C481S)]/IC50[BTK(WT)]의 값을 표에 기재하였다.
[표 6]
시험예 3에 보여지는 바와 같이, 본 발명의 화합물(I)은 C481S 돌연변이 BTK에 대하여도 강한 활성을 가진다.
시험예 4
미만성 대세포형 B세포 림프종 OCI-Ly10 세포주에 대한 증식 억제 시험
OCI-Ly10 세포는 20% 소태아혈청 및 1% 페니실린 스트렙토마이신(Nacalai Tesque, Inc.)를 함유하는 IMDM 배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium, Thermo Fisher Scientific Inc. 제조, 이하 "배지")를 이용하여, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. OCI-Ly10 세포를 96-웰 플레이트에 파종하고(20000 cells/well), 배지로 희석된 화합물을 최종 농도가 0.9 nM 내지 30000 nM(최종 DMSO 농도, 0.3%)가 되도록 첨가하고, 96시간 동안 배양 후, 아라마-블루 시약(Thermo Fisher Scientific Inc.)을 첨가했다. 3시간 후, 570~600 nm에서 흡광도를 측정하고, 화합물을 함유하지 않고 세포가 없는 웰의 흡광도를 100%로 하고, 세포를 함유하고 화합물을 함유하지 않는 웰의 흡광도를 0%로 하는 조건에서 저해 활성의 IC50 값을 산출하였다.
본 발명의 대표 화합물(I)의 OCI-Ly10 세포주에 대한 증식 저해 활성을 표 7에 나타낸다.
[표 7]
시험예 4의 결과에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 화합물(I)은 OCI-Ly10 세포주에 대한 증식 저해 활성을 갖는다.
본 발명은 BTK를 통해 비정상적인 세포 반응에 관련된 것으로 알려진 질환, 예를 들어, 자가 면역 질환, 염증성 질환, 뼈 질환 및 림프종과 같은 암 등에 대한 예방 또는 치료용 의약품(의약 조성물)로서 유용한 화합물을 제공한다. 또한, 본 화합물은 BTK 저해제로서, 실험용 및 연구용 시약에 유용하다.

Claims (5)

  1. 하기 식(Ia)으로 표시되는 옥소이소퀴놀린 유도체 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염:

    (식 중, R3a는 치환기를 가지고 있어도 되는 테트라하이드로피리딜 기이며, 상기 치환기는 옥세타닐 기, 아세틸 기, 프로피오닐 기, 모르폴리노아세틸 기, 디메틸카바모일 기, 피롤리딘카보닐 기, 메틸설포닐 기 및 이소프로필설포닐 기로 이루어진 군에서 선택됨).
  2. 제1항에 있어서, 하기 식(Ib)으로 표시되는 옥소이소퀴놀린 유도체 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염:

    (식 중, R3b는 C1-C4 알킬 기로 치환되어 있어도 되는 페닐 기임).
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
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