KR20160041946A

KR20160041946A - 신규 트리아진 유도체

Info

Publication number: KR20160041946A
Application number: KR1020167004910A
Authority: KR
Inventors: 와타루 카와하타; 토키코 아사미; 마사아키 사와; 유코 아사미츠; 타카유키 이리에; 타카히로 미야케; 타카오 키요이
Original assignee: 카나 바이오사이언스, 인코포레이션
Priority date: 2013-07-26
Filing date: 2014-07-15
Publication date: 2016-04-18
Also published as: PH12016500152A1; CN105683178B; ES2699452T3; CA2919068A1; CN105683178A; AU2014294225B2; IL243737A0; CA2919068C; JP6156953B2; EP3026050A4; IL243737B; SG11201600497VA; DK3026050T3; AU2014294225A1; NO20160292A1; CR20160082A; EP3026050A1; KR101742550B1; US9656995B2; US20160168122A1

Abstract

본 발명의 목적은 하기 화학식 (I)로 표시되는 트리아진 유도체, 그의 약학적으로 허용되는 염을 제공하는 것이다:

상기 식에서,
R¹은 치환되거나 비치환된 저급 알킬기를 나타내고,
R²는 수소 원자 또는 치환되거나 비치환된 저급 알킬기를 나타내고,
A는 질소 원자 또는 C-R³을 나타내고,
R³은 수소 원자, 시아노기, 치환되거나 비치환된 아실기, 치환되거나 비치환된 설포닐기 또는 치환되거나 비치환된 카르바모일기를 나타내고,
R⁴는 치환되거나 비치환된 저급 알킬기 또는 치환되거나 비치환된 사이클로알킬기를 나타낸다.

Description

신규 트리아진 유도체{NOVEL TRIAZINE DERIVATIVE}

본 발명은 의약, 특히 BTK 저해 작용을 갖는 신규 트리아진 유도체, 그의 프로드럭 또는 그의 약학적으로 허용되는 염에 관한 것이다.

브루톤 티로신 키나제(Bruton's tyrosine kinase; BTK)는 비-수용체 티로신 키나제의 Tec 부류 중 하나이며, T 림프구 및 자연 살해 세포를 제외한 모든 조혈계 세포 유형에서 발현되는 중요한 신호전달 효소이다. BTK는 B-세포의 생존, 분화, 증식 및 활성화에 관여하는 중요한 조절 인자이며, B-세포의 신호전달에 중요한 역할을 담당하고 있다 (비특허 문헌 1 및 2). 세포 표면의 B-세포 수용체 (B-cell receptor; BCR)는 BCR의 하류에 존재하는 BTK를 통해 세포 내로 신호를 전달하고, 따라서 B-세포의 신호전달 경로의 비정상적인 활성화는 B-세포 림프종, 만성 림프성 백혈병 등과 같은 암 세포의 증식 및 생존을 촉진하는 것으로 여겨지고 있다 (비특허 문헌 3). 또한 BTK는 다른 수 많은 세포 신호 경로에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 알레르기 질환, 자가 면역 질환 및 염증성 질환 등에도 관여하는 것으로 알려져 있다 (비특허 문헌 1). 예를 들어, BTK는 비만 세포에서 고 친화성 IgE 수용체 (FcεRI)의 신호전달에 중요한 역할을 하고 있으며, BTK-결핍 비만 세포에서는 탈과립 감소와 염증 유발성 사이토카인의 생산이 감소하는 것으로 알려져 있다 (비특허 문헌 4). BTK-결핍 마우스 시험에서 BTK가 전신성 홍반성 루푸스 (SLE)에 관여하고 있음이 제시되었다 (비특허 문헌 5). 또한, BTK 돌연변이 마우스는 콜라겐 유발성 관절염의 발병에 저항성을 나타낸다 (비특허 문헌 6). 따라서, BTK 저해 활성을 갖는 화합물은 BTK 신호전달이 관여하는 질환, 예를 들면, 암, B-세포 림프종 및 만성 림프성 백혈병의 치료에 유용하며, 알레르기 질환, 자가 면역 질환 및 염증성 질환의 치료에도 유용하다.

상기 언급된 BTK 저해 작용을 갖는 화합물이 보고되어 있다 (특허 문헌 1).

선행 문헌

특허 문헌

[특허 문헌 1]: WO 2013/133367

비특허 문헌

[비특허 문헌 1] Satterthwaite, A. B. and000000000000000000000 Witte, O. N., Immunol. Rev., 2000, 175, 120-127

[비특허 문헌 2] Kurosaki T., Curr. Opin. Immunol., 2000, 12, 276-281

[비특허0 문헌 3] Davis R. E. et al., Nature, 2010, 463, 88-92

[비특허 문헌 4] Ellmeier W. et al., FEBS J., 2011, 278, 1990-2000

[비특허 문헌 5] Halcomb K. E., Mol. Immunol., 2008, 46(2), 233-241

[비특허 문헌 6] Jansson L. and Holmdahl R., Clin. Exp. Immunol., 1993, 94, 459-465.

발명의 개요

발명이 이루고자하는 기술적 과제

본 발명은 의약, 특히 BTK 저해 작용을 갖는 신규 트리아진 유도체, 그의 프로드럭 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 제공하는 것을 과제로 한다.

본 발명은 다음 (1) 내지 (2)에 의해 달성된다.

(1) 하기 화학식 (I)로 표시되는 트리아진 유도체 또는 그의 약학적으로 허용되는 염:

[화학식 1]

상기 식에서,

R¹은 치환되거나 비치환된 저급 알킬기를 나타내고,

R²는 수소 원자 또는 치환되거나 비치환된 저급 알킬기를 나타내고,

A는 질소 원자 또는 C-R³을 나타내고,

R³은 수소 원자, 시아노기, 치환되거나 비치환된 아실기, 치환되거나 비치환된 설포닐기 또는 치환되거나 비치환된 카르바모일기를 나타내고,

R⁴는 치환되거나 비치환된 저급 알킬기 또는 치환되거나 비치환된 사이클로알킬기를 나타낸다.

(2) R¹이 -CH₂OR⁵를 나타내고, R⁵는 치환되거나 비치환된 아실기를 나타내는, 상기 (1)에 따른 트리아진 유도체 또는 그의 약학적으로 허용되는 염.

본 발명자들은 상기의 과제를 해결하기 위해 예의 검토한 결과, 상기 화학식 (I)로 표시되는 신규 트리아진 유도체, 그의 프로드럭 또는 그의 약학적으로 허용되는 염이 뛰어난 BTK 저해 작용을 가지며, 또한 콜라겐 유발성 관절염 동물 모델에서 특히 뛰어난 저해 효과를 나타내는 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다. 본 발명에 의해 제공되는 화합물은 BTK를 통한 비정상적인 세포 반응과 관련이 있는 것으로 알려진 질환, 예를 들면, 자가 면역 질환, 염증성 질환, 골 질환 및 림프종과 같은 암의 예방 또는 치료용 의약 (의약 조성물) 또는 프로드럭으로서 유용하다. 이 화합물은 또한 BTK 저해제로서 시험 및 연구에 사용되는 시약용으로 유용하다.

도 1은 실시예 1의 화합물이 농도 의존적으로 Ramos 세포 내에서 BCR 신호를 저해하고 세포 내로의 칼슘 유입을 저해하고 있음을 나타낸다 (시험예 3).
도 2는 실시예 1의 화합물이 PCA 반응 시험에서 용매 군에 비해 유의하게 혈중 색소의 귓바퀴 누출을 저해하는 것을 나타낸다 (시험예 4).
도 3은 콜라겐 유발성 관절염의 마우스 모델에 대한 실시예 1의 화합물의 작용을 나타낸다 (시험예 5).
도 4는 래트 콜라겐 유발성 관절염 모델에 대한 실시예 1의 화합물의 작용을 나타낸다 (시험예 6).

구체예의 설명

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 신규 트리아진 유도체는 다음 화학식 (I)로 표시되는 화합물이다:

[화학식 2]

상기 식에서,

R¹은 치환되거나 비치환된 저급 알킬기를 나타내고,

A는 질소 원자 또는 C-R³를 나타내고,

상기 화학식 (I)에서,

치환되거나 비치환된 저급 알킬기의 저급 알킬기 부분은 탄소수 1 내지 3의 직쇄, 분지쇄 또는 환형 알킬기의 임의의 것일 수 있으며, 그의 구체적인 예로는 메틸기, 이소프로필 기 등을 들 수 있다.

치환되거나 비치환된 사이클로알킬기의 사이클로알킬기 부분은 탄소수 3 내지 6의 환상의 알킬기일 수 있으며, 그의 구체적인 예로는 사이클로프로필기, 사이클로부틸기 등을 들 수 있다.

치환되거나 비치환된 아실기의 아실기 부분은 카르보닐기에 결합된 직쇄, 분지쇄 및 환형 알킬기의 임의의 것일 수 있으며, 치환되거나 비치환된 아실기의 아실기 부분의 그의 구체적인 예로는 포르밀기, 아세틸기, 프로피오닐기, 옥타노일기, 도데카노일기, 피발로일기, 사이클로프로필카르보닐기, 벤조일기 등을 들 수 있다.

치환되거나 비치환된 설포닐기의 설포닐기 부분으로서는, 예를 들면, 메틸설포닐기, 에틸설포닐기 등을 들 수 있다.

치환되거나 비치환된 카르바모일기의 카르바모일기 부분으로서는, 예를 들면, 메틸카르바모일기, 에틸카르바모일기, 디메틸카르바모일기 등을 들 수 있다.

치환되거나 비치환된 저급 알킬기, 치환되거나 비치환된 사이클로알킬기, 치환되거나 비치환된 아실기, 치환되거나 비치환된 설포닐기 또는 치환되거나 비치환된 카르바모일기의 치환기는 치환기를 2개 이상 가지는 경우 동일하거나 상이할 수있고, 화학적으로 가능한 모든 위치에서 1 또는 2개 이상의 모든 종류의 치환기(들)로 치환될 수 있다. 치환기로서는, 예를 들면, 할로겐 원자, 치환되거나 비치환된 알킬기, 치환되거나 비치환된 알콕시기, 치환되거나 비치환된 아미노기, 니트로기, 시아노기, 하이드록시기, 치환되거나 비치환된 알킬아미노기, 치환되거나 비치환된 카르바모일기, 카르복실기, 포르밀기, 아세틸기, 메실기, 벤조일기, 치환되거나 비치환된 아실아미노기 및 치환되거나 비치환된 아실옥시기 등을 들 수 있다.

본 발명의 화합물 (I)은 예를 들어, 치환기의 종류에 따라 이성체가 존재할 수 있다. 본 명세서에서는 이성체가 한 형태 만의 화학 구조로 기재될 수 있지만, 본 발명은 구조상 발생할 수 있는 모든 이성체 (기하 이성체, 광학 이성체, 호변 이성체 등)도 포함하고, 이성체 단독 또는 이들의 혼합물도 포함한다.

또한, 본 발명의 화합물 (I)의 약학적으로 허용되는 염의 예로서는 염산, 황산, 탄산, 인산과의 무기산염; 및 푸마르산, 말레산, 메탄설폰산, p-톨루엔설폰산과의 유기산염을 들 수 있다. 또한, 암모늄염과, 나트륨, 칼륨과의 알칼리 금속염; 마그네슘, 칼슘과의 알칼리 토금속염; 저급 알킬아민, 저급 알코올아민과의 유기 아민 염; 리신, 아르기닌, 오르니틴과의 염기성 아미노산 염도 본 발명에 포함된다.

또한 '본 발명의 화합물 (I)'라고 기재하는 경우에는 별도로 명시하지 않는 한, 프로드럭도 포함된다.

본 발명의 화합물 (I) 및 그의 약학적으로 허용되는 염은 예를 들어 다음의 방법에 의해 제조될 수 있다. 정의된 기가 이하에 나타낸 제조법에 예시된 방법의 조건 하에 화학적으로 영향을 받을 수 있거나, 해당 방법을 실시하기에 적합하지 않은 경우는, 유기 합성 화학에서 통상적으로 사용되는 방법, 예를 들면, 관능기의 보호 또는 탈보호 [T. W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis 3rd Edition, John Wiley & Sons, Inc. 1999] 등의 수단을 적용하는 방법에 의해 용이하게 제조할 수 있다. 또한 필요에 따라 치환기 도입 등의 반응 공정의 순서를 바꿀 수도 있다.

다음의 설명에서 사용되는 약어 및 기호의 의미는 다음과 같다.

DCM: 디클로로메탄

THF: 테트라하이드로푸란

DIEA: N,N-디이소프로필에틸아민

DMF: N,N-디메틸포름아미드

DMSO: 디메틸 설폭사이드

CDCl₃: 중수소화 클로로포름

[본 발명의 화합물 (I)의 제조법]

화학식 (I)로 표시되는 본 발명의 화합물은, 예를 들면 반응식 1에 따라 제조할 수 있다.

[반응식 1]

[화학식 3]

상기 식에서, R¹, R², R⁴및 A는 상기 정의된 바와 같고, W는 보로닐기 또는 보론산 에스테르기를 나타낸다.

본 발명의 화합물 (I)은 화합물 (II)와 화합물 (III)을 이용하여 스즈키 커플링 반응과 같은 크로스 커플링 반응에 의해 제조할 수 있다 (예를 들면, 스즈키 커플링 반응 조건은 문헌 (N. Miyaura, et al, J. Am. Chem. Soc., 107, 972 (1985), N. Miyaura, A. Suzuki, Chem. Rev. 95, 2457 (1995)) 참조). 즉, 반응은 팔라듐 또는 니켈과 같은 금속 촉매의 존재 하에 필요에 따라 염기 및 첨가제를 사용하여 실시할 수 있다. 반응에 사용하는 용매의 예로는 THF, 디옥산, 톨루엔, 디메톡시에탄, 메탄올, 에탄올 및 아세토니트릴을 들 수 있다. 또한 이러한 용매를 2 종 이상 혼합하거나, 이들을 물과 혼합하여 사용하는 것도 적합하다. THF 및 물의 혼합 용매, 톨루엔, 메탄올 및 물의 혼합 용매 또는 디옥산이 용매로 바람직하다. 화합물 (II)는 화합물 (III)에 대하여 동등량 또는 과량 사용하는 것이 바람직하고, 1 당량 내지 10 당량의 양이 보다 바람직하다. 필요에 따라, 반응을 가속시키기 위해 염기를 첨가하여도 좋은데, 염기로는 탄산나트륨, 탄산세슘 및 탄산칼륨이 일반적으로 사용된다. 사용하는 염기의 양은 화합물 (III)에 대하여 1 당량 내지 10 당량을 들 수 있으며, 바람직하게는 1 당량 내지 5 당량이다. 금속 촉매로는 크로스 커플링에 사용되는 상업적으로 입수가능한 팔라듐 촉매 (예를 들면, PdCl₂(dppf), Pd₂(dba)₃, Pd(PPh₃)₄ 등)을 사용할 수 있으며, 화합물 (III)에 대해 촉매량, 즉 0.1 당량 내지 0.5 당량을 사용하는 것이 바람직하다.

필요에 따라 반응을 가속화시키기 위해 첨가제를 추가할 수 있다. 예를 들어, 첨가제로 rac-BINAP가 화합물 (III)에 대해 0.01 당량 내지 1 당량 사용될 수 있다. 0 ℃ 내지 200 ℃ 사이에서 수 분 내지 수 일간, 바람직하게는 10 ℃ 내지 100 ℃ 사이에서 1 시간 내지 36 시간 반응시켜 합성하는 것이 가능하다. 또는, 마이크로파 합성 장치를 이용하여 예를 들어 60 ℃ 내지 150 ℃의 온도 조건에서 수 분에 내지 수 시간동안 반응시킴으로써도 합성할 수 있다.

반응식 1의 출발물질로 사용되는 화합물 (II)는, 예를 들면 반응식 2에 나타내는 방법에 의해 제조할 수 있다.

[반응식 2]

[화학식 4]

상기 식에서, R¹, R⁴ 및 W는 상기 정의된 바와 같고, X는 할로겐을 나타낸다.

화합물 (II)는 화합물 (IV)를 n-부틸리튬으로 활성화한 후, 활성화된 화합물을 붕산 에스테르와 반응시킴으로써 제조할 수 있다. 즉, 화합물 (II)는 화합물 (IV)를 1 내지 5 몰 당량, 바람직하게는 1 내지 1.5 몰 당량의 n-부틸리튬으로 처리하여 리튬화하고, 리튬화된 화합물을 1 내지 5 몰 당량, 바람직하게는 1 내지 1.5 몰 당량의 붕산 에스테르와 반응시킴으로써 얻을 수 있다.

용매는 반응에 불활성이기만 하면 어느 것이나 사용가능하고, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 바람직하게는 THF를 사용할 수 있다.

반응 온도는 통상 -100 ℃ 내지 -30 ℃, 바람직하게는 -80 ℃ 내지 -60 ℃이다. 반응 시간은 특별히 한정되지 않지만, 일반적으로 0.1 시간 내지 12 시간이 예시되고, 0.2 시간 내지 6 시간이 바람직하다.

또한 화합물 (II)는 화합물 (IV)를 1 내지 5 몰 당량, 바람직하게는 1 내지 1.5 몰 당량의 금속 마그네슘과 촉매량의 요오드와 에테르계 용매 중에, -10 ℃ 내지 사용되는 용매의 끓는점 사이의 온도에서 반응시켜 그리냐드 시약을 얻고 이 그리냐드 시약을 1 내지 5 몰 당량, 바람직하게는 1 내지 1.5 몰 당량의 붕산 에스테르와 반응시켜 얻을 수도 있다. 반응 온도는 보통 -30 ℃ 내지 -100 ℃, 바람직하게는 -60 ℃ 내지 -80 ℃이다. 반응 시간은 특별히 한정되지 않지만, 일반적으로 0.1 시간 내지 12 시간이 예시되고 0.2 시간 내지 6 시간이 바람직하다.

또한, 화합물 (II)는 화합물 (IV)를 팔라듐 및 니켈과 같은 금속 촉매 및 염기의 존재 하에 유기 용매 중에서 1 내지 5 몰 당량, 바람직하게는 1 내지 3 몰 당량의 디보론 에스테르와 커플링 반응시킴으로써 수득할 수 있다.

금속 촉매로는 크로스 커플링에 사용되는 상업적으로 입수가능한 팔라듐 촉매 (예를 들면, PdCl₂(dppf), Pd₂(dba)₃, Pd(PPh₃)₄ 등)을 이용할 수 있으며, 촉매는 바람직하게는 촉매량, 즉 크로스 커플링에 사용되는 화합물 (IV)에 대하여 0.1 당량 내지 0.5 당량의 양으로 사용된다. 염기로는 아세트산칼륨이 일반적으로 사용된다. 사용하는 염기의 양은 화합물 (IV)에 대하여 1 당량 내지 10 당량, 바람직하게는 1 당량 내지 5 당량이다.

용매는 반응에 불활성인 것이면 어느 것이나 사용가능하고 특별히 한정되는 것은 아니지만, 바람직하게는 디옥산을 사용할 수 있다.

반응 온도는 일반적으로 0 ℃ 내지 200 ℃, 바람직하게는 10 ℃ 내지 100 ℃이다. 반응 시간은 특별히 한정되지 않지만, 일반적으로 0.2 시간 내지 48 시간, 바람직하게는 1 시간 내지 36 시간이 바람직한 예로 예시될 수 있다.

이러한 반응은 모두 불활성 가스 (아르곤, 질소 등) 분위기 하에서 무수 조건 하에 수행하는 것이 바람직하다.

반응식 2의 출발물질로 사용되는 화합물 (IV)는 예를 들면 반응식 3에서 나타내는 방법에 의해 제조할 수 있다.

[반응식 3]

[화학식 5]

상기 식에서, R¹, R⁴ 및 X는 상기 정의된 바와 같다.

화합물 (IV)는 화합물 (V)를 1 내지 5 몰 당량, 바람직하게는 1.5 내지 3 몰 당량의 화합물 (VI)와 극성 용매 중에 금속 촉매 및 염기의 존재 하에서 반응시켜 수득할 수 있다.

본 커플링 반응에서, 임의로 화합물 (VI)의 R¹ 기를 유기 합성 화학에서 통상적으로 사용되는 방법을 적절히 조합하여 보호 또는 탈보호하여 화합물 (IV)를 제조할 수도 있다. 예를 들어, 화합물 (VI)의 하이드록시기 또는 아미노기와 같은 관능기의 보호 또는 탈보호 [T. W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis 3rd Edition, John Wiley & Sons, Inc. 1999]와 화합물 (VI)의 하이드록시기 전구체인 알데히드 유도체를 사용하는 것도 가능하다.

반응은 일반적으로 80 ℃ 내지 200 ℃ 사이의 온도에서 0.5 시간 내지 200 시간, 바람직하게는 100 ℃ 내지 150 ℃에서 1 시간 내지 100 시간동안 실시할 수 있다. 반응을 마이크로파 합성 장비를 사용해 실시하는 것이 또한 가능하다.

금속 촉매로는 상업적으로 입수가능한 팔라듐 촉매 (예를 들면, PdCl₂(dppf), Pd₂(dba)₃, Pd(PPh₃)₄ 등) 또는 커플링 반응에 사용되는 요오드화구리(I)를 사용할 수 있으며, 촉매는 촉매량, 즉 커플링 반응에 사용되는 화합물 (V)에 대하여 0.01 당량 내지 2 당량의 양으로 사용된다.

사용하는 염기로는 탄산칼륨, 탄산나트륨, 탄산세슘, 탄산수소나트륨이 예시되고, 바람직하게는 탄산세슘, 탄산수소나트륨을 사용할 수 있다. 사용하는 염기의 양은 화합물 (V)에 대해 1 내지 10 몰 당량, 바람직하게는 2 내지 5 몰 당량이다. 또한 필요에 따라, 화합물 (V)에 대해 0.1 당량 내지 0.5 당량의 크산트포스를 반응에 첨가제로서 사용할 수 있다.

화합물 (VI)는 시판 제품으로, 또는 공지의 방법 또는 그에 준한 방법에 의해 얻을 수 있다.

반응식 1의 출발물질로 사용되는 화합물 (III)은 예를 들면 반응식 4에 나타내는 방법에 의해 제조할 수 있다.

[반응식 4]

[화학식 6]

상기 식에서, R² 및 A는 상기 정의된 바와 같다.

화합물 (III)은 아민 (VII)을 1 내지 5 몰 당량, 바람직하게는 1 내지 1.5 몰 당량의 2-아미노-4,6-디클로로-1,3,5-트리아진과 극성 용매 중에서 필요에 따라 염기 촉매의 존재 하에 반응시킴으로써 수득할 수 있다.

용매는 반응에 불활성인 것이면 어느 것이나 사용가능하며 특별히 한정되는 것은 아니지만, 바람직하게는 DMF 및 THF를 사용할 수 있다.

반응 온도는 일반적으로 0 ℃ 내지 200 ℃, 바람직하게는 10 ℃ 내지 100 ℃이다. 반응 시간은 특별히 한정되지 않지만, 일반적으로 0.2 시간 내지 48 시간이 예시되며, 1 시간 내지 36 시간을 바람직한 예로 들 수 있다.

반응식 4의 출발 출발물질인 2-아미노-4,6-디클로로-1,3,5-트리아진은 시판 제품으로 얻을 수 있다. 아민 (VII)은 시판 제품으로 얻을 수 있거나, 또는 공지의 방법 또는 그에 준한 방법에 의해 얻을 수 있다.

반응식 3의 출발물질로 사용되는 화합물 (V)는 예를 들어 반응식 5에 나타내는 방법에 의해 제조할 수 있다.

[반응식 5]

[화학식 7]

상기 식에서, R⁴, X 및 W는 상기 정의된 바와 같고, R'는 저급 알킬기를 나타낸다.

화합물 (V)는 카르복실산을 카르바모일기로 변환한 후, R⁴ 기를 스즈키 커플링 반응과 같은 크로스 커플링 반응에 의해 도입하여 얻어진 화합물 (X)를 N,N-디메틸포름아미드 디메틸아세탈을 사용하여 고리화 반응시킴으로써 제조할 수 있다.

또한 R⁴ 기가 3급 알킬기 부분인 경우는 쿠마다 커플링 반응과 같은 크로스 커플링 반응에 의해서 수득할 수도 있다 [예를 들어 Amruta Joshi-Pangu et al. J. Am. Chem. Soc., 133, 8478-8481 (2011)의 문헌 참조]. 즉, 화합물 (VIII)의 카르복실산 부분을 에스테르화하여 얻은 화합물 (XI)와 3급 알킬 그리냐드 시약 (R⁴MgBr)을, 염화니켈(II) 등의 니켈(II) 금속 및 1,3-디사이클로헥실-1H-이미다졸-3-윰 등의 N-헤테로사이클릭 카르벤 촉매의 존재 하에 빙냉 내지 상온 범위의 온도에서 교반하여 3급 알킬 화합물 (XII)을 합성할 수 있다. 화합물 (XII)를 가수분해한 후 카르복실산기를 카르바모일기로 변환하여 화합물 (X)를 수득할 수 있다.

반응식 5의 출발물질로서 사용되는 화합물 (VIII)은 시판 제품으로 얻을 수 있거나, 또는 공지의 방법 또는 그에 준하는 방법에 의해 제조할 수 있다.

상기 나타낸 반응식에서, W로 표시되는 보로닐기는 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속의 염 형태일 수 있고, 보론산 에스테르기의 구체적인 예로는 보론산 디메틸 에스테르기, 보론산 디에틸 에스테르기, 보론산 디부틸 에스테르기, 보론산 디사이클로헥실기, 보론산 에틸렌 글리콜 에스테르기, 보론산 프로필렌 글리콜 에스테르기 (보론산 1,2-프로판디올에스테르기, 보론산 1,3-프로판디올에스테르기), 보론산 네오펜틸 글리콜 에스테르기, 보론산 카테콜 에스테르기, 보론산 글리세린 에스테르기, 보론산 트리메틸올에탄 에스테르기, 보론산 디에탄올아민 에스테르기, 보론산 트리에탄올아민 에스테르기 등의 보론산 에스테르기; 보론산 무수물 기 등을 들 수 있다.

또한, 상기의 방법을 적절히 조합하여 사용하고 유기 합성 화학에서 통상적으로 사용되는 방법 (예를 들면, 아미노기의 알킬화 반응, 알킬티오기의 설폭사이드기 또는 설폰기로의 산화 반응, 알콕시기의 하이드록시기로의 변환 반응 또는 그 반대로의 변환 반응)을 실시하여 원하는 위치에 원하는 관능기를 갖는 본 발명의 화합물 (I)을 얻을 수 있다.

또한, 본 발명의 화합물 (I)의 프로드럭은 화합물 (I) 또는 그의 중간체를 필요에 따라 관능기의 보호 또는 탈보호를 비롯해 유기 합성 화학에서 통상적으로 사용되는 방법으로 에스테르화함으로써 얻을 수 있다.

[본 발명의 화합물 (I)의 적용]

본 발명의 화합물 (I) 또는 그의 약학적으로 허용되는 염은 경구 투여, 비경구 투여 또는 국소 투여에 적합한 종래 약학 제제 (의약 조성물)의 형태로 제제화할 수 있다.

경구 투여용 제제는 정제, 과립, 분말, 캡슐 등의 고형 제제; 및 시럽 같은 액체 제제를 포함한다. 이들 제제는 통상적인 방법으로 제조할 수 있다. 고형 제제는 예를 들어 락토스; 옥수수 전분 등의 전분; 미결정성 셀룰로오스 등의 결정성 셀룰로오스; 하이드록시프로필 셀룰로오스, 칼슘 카르복시메틸 셀룰로오스, 활석, 스테아르산 마그네슘과 같은 통상적인 약학적 담체를 사용하여 제조할 수 있다. 캡슐은 이렇게 제조된 과립 또는 분말을 캡슐에 포장하여 제조할 수 있다. 시럽은 수크로스, 카르복시메틸 셀룰로오스를 포함한 수용액에 본 발명의 화합물 (I) 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 용해 또는 현탁하여 제조할 수 있다.

비경구 투여용 제제는 점적 등의 주입물을 포함한다. 주입 제제는 또한 전통적인 방법으로 제조할 수 있으며, 등장성 제제(예를 들어, 만니톨, 염화나트륨, 글루코스, 소르비톨, 글리세롤, 자일리톨, 프럭토스, 말토스, 만노스), 안정제 (예를 들어, 아황산나트륨, 알부민) 및 방부제 (예를 들어, 벤질 알코올, 메틸 p-옥시벤조에이트) 중에 적절하게 통합할 수 있다.

본 발명의 화합물 (I) 또는 그의 약학적으로 허용되는 염의 용량은 질환의 중증도, 환자의 연령 및 체중, 투여 형태 등에 따라 변화될 수 있지만, 일반적으로 성인에 대해 하루 1 mg 내지 1,000 mg의 범위이다. 본 발명의 화합물 (I) 또는 그의 약학적으로 허용되는 염은 경구 경로 또는 비경구 경로에 따라 하루에 1회 투여할 수 있거나, 또는 2회 또는 3회 분할하여 투여할 수 있다.

또한, 본 발명의 화합물 (I) 또는 그의 약학적으로 허용되는 염은 BTK 저해제로서 실험적 시험 및/또는 연구에 사용되는 시약으로 사용할 수도 있다.

실시예

이하, 실시예 및 시험예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명할 것이지만, 이들 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

화합물의 동정은 수소 핵자기 공명 스펙트럼(¹H-NMR) 및 질량 스펙트럼(MS)에 의해 실시하였다. ¹H-NMR은 특별한 언급이 없는 한 400 MHz에서 측정된 것이며, 화합물 및 측정 조건에 따라 교환성 수소가 명확하게 관측되지 않는 경우가 있다. 또한 br.은 광범위한 신호(브로드)를 의미한다.

HPLC 제조용 크로마토그래피는 시판 ODS 컬럼을 이용하여 특별한 언급이 없는 한 물/메탄올(포름산 포함)을 용출액으로 하여 구배 모드로 실시하였다.

참고예 1

2-(6-사이클로프로필-8-플루오로-1-옥소이소퀴놀린-2(1H)-일)-6-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤질 아세테이트

[화학식 8]

(제 1 공정)

질소 분위기 하에서, 4-브로모-2-플루오로-6-메틸벤조산 (13.0 g, 55.8 mmol)을 THF (100 mL)에 용해시켰다. 이 용액에 1,1'-카르보닐디이미다졸 (11.8 g, 72.5 mmol)을 0 ℃에서 첨가하고 0 ℃에서 2 시간동안 교반하였다. 이 반응 혼합물에 28% 암모니아수 (10 mL)를 5 분간에 걸쳐 적가하고, 상온에서 2 일 더 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에서 약 50 mL가 될 때까지 농축한 후, 6M 염산 수용액 (30 mL)을 첨가하고 에틸 아세테이트 (2 × 100 mL)로 추출하였다. 유기층을 합하여 포화 탄산수소나트륨 수용액 및 염수로 차례로 세척하고 무수 황산나트륨으로 건조시킨 다음, 여과하고 농축하여 4-브로모-2-플루오로-6-메틸벤즈아미드 (11.0 g)를 수득하였다.

¹HNMR (400 MHz, CDCl₃) δ7.22 (dt, J = 1.8, 0.8 Hz, 1H), 7.15 (dd, J = 9.0, 1.9 Hz, 1H), 6.06 - 5.60 (m, 2H), 2.44 (s, 3H); LCMS (m/z): 231.9 [M+H]⁺.

(제 2 공정)

질소 분위기 하에서, 4-브로모-2-플루오로-6-메틸벤즈아미드 (11.0 g)의 톨루엔 (110 mL)과 물 (11 mL)의 혼합 용액에 사이클로프로필보론산 (6.11 g, 71.1 mmol), 트리사이클로헥실포스핀 (0.80 g, 2.84 mmol), 트리스(디벤질리덴아세톤)디팔라듐 (0) (0.43 g, 0.47 mmol) 및 탄산칼륨 (19.65 g, 142.0 mmol)을 첨가하고 115 ℃에서 14 시간동안 교반하였다. 상온으로 냉각 후, 침전물을 여과 수집하여 에테르 및 물로 세척한 후 건조하여 4-사이클로프로필-2-플루오로-6-메틸벤즈아미드 (3.3 g)를 얻었다. 여액을 에틸 아세테이트 (2 × 200 mL)로 추출하고, 얻어진 유기층을 합해 식염수로 세척하고 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과한 후, 농축하였다. 조 물질을 실리카겔 상에서 헥산/에틸 아세테이트로 용출하면서 크로마토그래피로 정제하여 4-사이클로프로필-2-플루오로-6-메틸벤즈아미드 (5.3 g)를 수득하였다.

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) 6.80 - 6.70 (m, 1H), 6.60 (dd, J = 11.3, 1.6 Hz, 1H), 5.99 - 5.59 (m, 2H), 2.43 (s, 3H), 1.89 - 1.80 (m, 1H), 1.03 - 0.98 (m, 2H), 0.73 - 0.65 (m, 2H); LCMS (m/z): 194.0 [M+H]⁺.

(제3 공정)

질소 분위기 하에서, 4-사이클로프로필-2-플루오로-6-메틸벤즈아미드 (8.6 g, 44.5 mmol)의 2-메틸테트라하이드로푸란 (100 mL) 용액에 N,N-디메틸포름아미드 디메틸 아세탈 (7.0 g, 58.8 mmol)을 첨가하고, 60 ℃에서 2 시간동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축하고, 이 조 물질에 2-메틸테트라하이드로푸란 (10 mL)을 첨가하였다. 이 용액에, 1 mol/L 포타슘 tert-부톡사이드의 THF 용액 (68.1 mL, 68.1 mmol)을 적가하고, 65 ℃에서 하루 교반하였다. 상온으로 냉각한 후, 반응 혼합물을 1M 염산 용액 (200 mL)에 부었다. 이 용액에, 이소프로필 알코올 (300 mL)을 첨가한 후, 용매를 감압 하에 제거하였다. 침전물을 여과 수집하여 6-사이클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (7.7 g)을 수득하였다.

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ11.06 (s, 1H), 7.16 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 7.11 (dd, J = 7.1, 5.7 Hz, 1H), 6.88 (dd, J = 13.3, 1.7 Hz, 1H), 6.41 (dd, J = 7.1, 2.3 Hz, 1H), 2.07 - 1.95 (m, 1H), 1.08 - 1.01 (m, 2H), 0.86 - 0.79 (m, 2H); LCMS (m/z): 204.1 [M+H]⁺.

(제4 공정)

질소 분위기 하에서, 6-사이클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (2.6 g, 12.8 mmol)의 DMF (25 mL) 용액에 2-브로모-6-클로로벤즈알데히드 (3.65 g, 16.63 mmol), 탄산칼륨 (3.54 g, 25.6 mmol) 및 요오드화구리(I) (0.49 g, 2.56 mmol)를 첨가하고, 110 ℃에서 하루 교반하였다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트 (200 mL)로 희석하고, 여과하여 불용 물질을 제거한 후, 여액을 물 및 식염수로 세척하여 황산나트륨으로 건조시킨 다음 여과하고 농축하였다. 조 물질을 실리카겔 상에서 헥산/에틸 아세테이트로 용출하면서 크로마토그래피로 정제하여 2-클로로-6-(6-사이클로프로필-8-플루오로-1-옥소이소퀴놀린-2(1H)-일)벤즈알데히드 (2.7 g)를 수득하였다.

¹HNMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ10.18 (s, 1H), 7.84 - 7.78 (m, 1H), 7.75 (dd, J = 8.2, 1.3 Hz, 1H), 7.49 (dd, J = 7.8, 1.2 Hz, 1H), 7.41 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.27 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 7.00 (dd, J = 13.3, 1.6 Hz, 1H), 6.64 (dd, J = 7.5, 2.2 Hz, 1H), 2.14 - 2.01 (m, 1H), 1.14 - 1.06 (m, 2H), 0.92 - 0.83 (m, 2H); LCMS (m/z): 342.1 [M+H]⁺.

(제5 공정)

질소 분위기 하에서, 2-클로로-6-(6-사이클로프로필-8-플루오로-1-옥소이소퀴놀린-2(1H)-일)벤즈알데히드 (2.5 g, 7.32 mmol)의 DCM (26 mL) 및 이소프로필 알코올 (13 mL)의 혼합 용액을 0 ℃로 냉각하였다. 이 용액에 소듐 보로하이드라이드 (0.42 g, 11.0 mmol)를 0 ℃에서 첨가한 후, 0 ℃에서 2 시간동안 교반하였다. 반응 혼합물에 물 (50 mL)을 첨가하고, 에틸 아세테이트 (2 × 50 mL)로 추출하였다. 유기층을 합해 물 및 식염수로 세척하고 황산나트륨으로 건조시킨 다음, 여과하고 농축하여 2-[3-클로로-2-(하이드록시메틸)페닐]-6-사이클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (2.3 g)을 수득하였다.

¹HNMR (400 MHz, CDCl₃) δ7.55 (dd, J = 8.1, 1.2 Hz, 1H), 7.40 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.15 (dd, J = 8.0, 1.2 Hz, 1H), 7.08 - 7.00 (m, 2H), 6.82 (dd, J = 12.7, 1.7 Hz, 1H), 6.51 (dd, J = 7.4, 2.1 Hz, 1H), 4.71 - 4.61 (m, 1H), 4.46 (d, J = 11.9 Hz, 1H), 3.43 - 3.29 (m, 1H), 2.03 - 1.97 (m, 1H), 1.18 - 1.10 (m, 2H), 0.88 - 0.81 (m, 2H); LCMS (m/z): 343.9 [M+H]⁺.

(제6 공정)

질소 분위기 하에서, 2-[3-클로로-2-(하이드록시메틸)페닐]-6-사이클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (2.26 g, 6.59 mmol)의 DCM (30 mL) 용액에 피리딘 (2.36 mL, 29.3 mmol) 및 아세틸 클로라이드 (1.56 mL, 21.95 mmol)를 첨가하고, 상온에서 하루 교반하였다. 반응 혼합물에 물 (50 mL)을 첨가하고, 에틸 아세테이트 (2 × 50 mL)로 추출하였다. 유기층을 합해 물 및 식염수로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시킨 다음, 여과하고 농축하였다. 조 물질을 실리카겔 상에서 헥산/에틸 아세테이트로 용출하면서 크로마토그래피로 정제하여 2-클로로-6-(6-사이클로프로필-8-플루오로-1-옥소이소퀴놀린-2(1H)-일)벤질 아세테이트 (2.3 g)를 수득하였다.

¹HNMR (400 MHz, CDCl₃) δ7.53 (dd, J = 8.2, 1.2 Hz, 1H), 7.46 - 7.39 (m, 1H), 7.22 (dd, J = 7.9, 1.3 Hz, 1H), 7.04 - 6.98 (m, 2H), 6.80 (dd, J = 12.6, 1.7 Hz, 1H), 6.43 (dd, J = 7.4, 2.1 Hz, 1H), 5.25 (d, J = 12.5 Hz, 1H), 4.98 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 2.02 - 1.96 (m, 1H), 1.96 (s, 3H), 1.16 - 1.10 (m, 2H), 0.86 - 0.81 (m, 2H); LCMS (m/z): 386.0 [M+H]⁺.

(제7 공정)

질소 분위기 하에서, 2-클로로-6-(6-사이클로프로필-8-플루오로-1-옥소이소퀴놀린-2(1H)-일)벤질 아세테이트 (4.8 g, 12.44 mmol)의 1,4-디옥산 (180 mL) 용액에 비스(피나콜레이토)디보론 (9.48 g, 37.3 mmol), 비스(디벤질리덴아세톤)팔라듐 (0) (0.36 g, 0.62 mmol), 2,4,6-트리이소프로필-2'-(디사이클로헥실포스피노)바이페닐 (0.59 g, 1.24 mmol) 및 포타슘 아세테이트 (3.66 g, 37.3 mmol)를 첨가하고, 65 ℃에서 16 시간동안 교반하였다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트 (200 mL)로 희석하고, 셀라이트 패드를 통해 여과하여 불용 물질을 제거하였다. 여액에 물 (200 mL)을 첨가하고, 에틸 아세테이트 (2 × 200 mL)로 추출하였다. 유기층을 합해 식염수로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시킨 다음, 여과하고 농축하였다. 조 물질을 실리카겔 상에서 헥산/에틸 아세테이트로 용출하면서 크로마토그래피로 정제하였다. 유성 물질에 헥산을 첨가한 후, 침전물을 여과 수집하여 표제 화합물 (3.05 g)을 수득하였다.

¹HNMR (400 MHz, CDCl₃) δ7.93 (dd, J = 7.4, 1.4 Hz, 1H), 7.47 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 7.35 (dd, J = 7.8, 1.5 Hz, 1H), 7.02 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 7.00 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 6.78 (dd, J = 12.7, 1.7 Hz, 1H), 6.40 (dd, J = 7.4, 2.1 Hz, 1H), 5.45 (d, J = 11.8 Hz, 1H), 5.03 (d, J = 11.9 Hz, 1H), 2.03 - 1.93 (m, 1H), 1.92 (s, 3H), 1.34 (s, 12H), 1.15 - 1.08 (m, 2H), 0.87 - 0.80 (m, 2H); LCMS (m/z): 478.2 [M+H]⁺.

참고예 2

2-[6-(tert-부틸)-8-플루오로-1-옥소이소퀴놀린-2(1H)-일]-6-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤질 아세테이트

[화학식 9]

(제1 공정)

질소 분위기 하에서, 메틸 4-브로모-2-플루오로-6-메틸벤조에이트 (1.0 g, 4.05 mmol), 염화니켈(II) (0.13 g, 0.81 mmol) 및 1,3-디사이클로헥실-1H-이미다졸-3-윰 (0.26 g, 0.81 mmol)을 THF (10 mL)에 용해시켰다. 이 용액을 0℃로 냉각하고, 1M tert-부틸마그네슘 브로마이드 (THF 용액, 12.1 mL, 12.1 mmol)를 10 분에 걸쳐 적가한 후, 상온에서 24 시간동안 교반하였다. 반응 혼합물을 냉수 (200 mL)에 부어 진한 염산 (ca. 5 mL)으로 pH 2가 되도록 산성화한 후, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기층을 황산나트륨으로 건조시킨 다음, 여과하고 농축하였다. 조 물질을 실리카겔 상에서 헥산/에틸 아세테이트로 용출하면서 크로마토그래피로 정제하여 메틸 4-(tert-부틸)-2-플루오로-6-메틸벤조에이트 (0.45 g)를 수득하였다.

얻은 메틸 4-(tert-부틸)-2-플루오로-6-메틸벤조에이트 (0.35 g)를 THF 및 물 (1:1, 10 mL)의 혼합 용액에 용해시키고, 4M 수산화리튬 수용액 (2 mL)을 첨가한 뒤, 60 ℃에서 6 시간동안 교반하였다. 반응 혼합물을 냉수로 희석하고, 유기 용매를 감압 하에 제거하였다. 이 수용액을 진한 염산 용액으로 pH 2가 되도록 산성화한 후, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기층을 황산나트륨으로 건조시킨 다음, 여과하고 농축하여 4-(tert-부틸)-2-플루오로-6-메틸벤조산의 조 물질 (0.35 g)을 수득하였다.

LCMS (m/z): 211.0 [M+H]⁺.

(제2 공정)

질소 분위기 하에서, 4-(tert-부틸)-2-플루오로-6-메틸벤조산 (0.21 g, 0.10 mmol)을 THF (10 mL)에 용해시켰다. 이 용액에 1,1'-카보닐디니미다졸 (0.21 g, 1.30 mmol)을 0 ℃에서 첨가하고 0 ℃에서 2 시간동안 교반하였다. 이 반응 혼합물에 28% 암모니아수 (10 mL)를 적가하고, 상온에서 이틀 더 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축하고, 6M 염산 용액을 첨가한 후, 에틸 아세테이트로 2회 로 추출하였다. 유기층을 합해 포화 탄산수소나트륨 용액 및 식염수로 세척하여 황산나트륨으로 건조시킨 다음, 여과하고 농축하여 4-(tert-부틸)-2-플루오로-6-메틸벤즈아미드 (0.20 g)를 수득하였다.

¹HNMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ7.85 (s, 1H), 7.58 (s, 1H), 7.10 - 7.07 (m, 1H), 7.05 - 7.00 (m, 1H), 2.29 (s, 3H), 1.26 (s, 9H); LCMS (m/z): 210.1 [M+H]⁺.

(제3 공정)

질소 분위기 하에서, 4-(tert-부틸)-2-플루오로-6-메틸벤즈아미드 (150 mg, 0.72 mmol)의 2-메틸테트라하이드로푸란 (10 mL) 용액에 N,N-디메틸포름아미드 디메틸 아세탈 (113 mg, 0.95 mmol)을 첨가하고 60 ℃에서 2 시간동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축하고, 이 조 물질에 2-메틸테트라하이드로푸란 (10 mL)을 첨가하였다. 이 용액에 1M 포타슘 tert-부톡사이드 (THF 용액, 1.1 mL, 1.1 mmol)를 적가하고, 65 ℃에서 하루 교반하였다. 주변 온도로 냉각한 후, 반응 혼합물을 1M 염산 용액 (10 mL)에 부어 에틸 아세테이트로 2회 추출하였다. 유기층을 합해 물 및 식염수로 세척하여 황산나트륨으로 건조시킨 다음, 여과하고 농축하였다. 조 물질을 실리카겔 상에서 헥산/에틸 아세테이트로 용출하면서 크로마토그래피로 정제하여 6-(tert-부틸)-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (85 mg)을 수득하였다.

¹HNMR (400 MHz, CDCl₃) δ10.84 (s, 1H), 7.28 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 7.18 (dd, J = 13.8, 1.8 Hz, 1H), 6.51 - 6.43 (m, 2H), 1.37 (s, 9H); LCMS (m/z): 220.1 [M+H]⁺.

(제4 공정)

질소 분위기 하에서, DMF (10 mL)에서 제3 공정에 기술된 절차에 따라 유사하게 제조한 6-(tert-부틸)-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (220 mg, 1.00 mmol)의 용액에 2-브로모-6-클로로벤즈알데히드 (330 mg, 2.01 mmol), 탄산칼륨 (277 mg, 2.01 mmol) 및 요오드화구리(I) (382 mg, 2.01 mmol)를 첨가하고, 110 ℃에서 하루 교반하였다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고, 여과하여 불용 물질을 제거한 후, 여액을 물 및 식염수로 세척하여 황산나트륨으로 건조시킨 다음, 여과하고 농축하였다. 조 물질을 실리카겔 상에서 헥산/에틸 아세테이트로 용출하면서 크로마토그래피로 정제하여 2-클로로-6-[6-(tert-부틸)-8-플루오로-1-옥소이소퀴놀린-2(1H)-일]벤즈알데히드 (223 mg)를 수득하였다.

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ10.20 (s, 1H), 7.87 - 7.79 (m, 1H), 7.76 (dd, J = 8.2, 1.3 Hz, 1H), 7.54 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 7.49 (dd, J = 7.6, 1.2 Hz, 1H), 7.43 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 7.38 - 7.26 (m, 1H), 6.74 (dd, J = 7.5, 2.2 Hz, 1H), 1.35 (s, 9H); LCMS (m/z): 358.1 [M+H]⁺.

(제5 공정)

질소 분위기 하에서, 2-클로로-6-[6-(tert-부틸)-8-플루오로-1-옥소이소퀴놀린-2(1H)-일]벤즈알데히드 (200 mg, 0.56 mmol)의 DCM (3.7 mL) 및 이소프로필 알코올 (1.9 mL)의 혼합 용액을 0 ℃로 냉각하였다. 이 용액에 소듐 보로하이드라이드 (32 mg, 0.84 mmol)를 0 ℃에서 첨가하고 상온에서 2 시간동안 교반하였다. 반응 혼합물에 물을 첨가하고, 에틸 아세테이트로 2회 추출하였다. 유기층을 합해 물 및 식염수로 세척하여 황산나트륨으로 건조시킨 다음, 여과하고 농축하였다. 조 물질을 실리카겔 상에서 헥산/에틸 아세테이트로 용출하면서 크로마토그래피로 정제하여 2-[3-클로로-2-(하이드록시메틸)페닐]-6-(tert-부틸)-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (160 mg)을 수득하였다.

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ7.55 (dd, J = 8.1, 1.2 Hz, 1H), 7.43 - 7.36 (m, 1H), 7.32 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 7.23 (dd, J = 13.5, 1.8 Hz, 1H), 7.17 - 7.11 (m, 1H), 7.05 (d, J = 7.4, 1.7 Hz, 1H), 6.58 (dd, J = 7.4, 2.1 Hz, 1H), 4.75 - 4.61 (m, 1H), 4.54 - 4.34 (m, 1H), 3.35 (dd, J = 10.8, 2.5 Hz, 1H), 1.39 (s, 9H); LCMS (m/z): 360.2 [M+H]⁺.

(제6 공정)

질소 분위기 하에서, 2-[3-클로로-2-(하이드록시메틸)페닐]-6-(tert-부틸)-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 (160 mg, 0.89 mmol)의 DCM (5 mL) 용액에 피리딘 (180 μL, 2.24 mmol) 및 아세틸 클로라이드 (119 μL, 1.68 mmol)를 첨가하고, 상온에서 하루 교반하였다. 반응 혼합물에 물을 첨가하고, 에틸 아세테이트로 2회 추출하였다. 유기층을 합해 물 및 식염수로 세척하여 황산나트륨으로 건조시킨 다음, 여과하고 농축하였다. 조 물질을 실리카겔 상에서 헥산/에틸 아세테이트로 용출하면서 크로마토그래피로 정제하여 2-클로로-6-[6-(tert-부틸)-8-플루오로-1-옥소이소퀴놀린-2(1H)-일]벤질 아세테이트 (157 mg)를 수득하였다.

¹HNMR (400 MHz, CDCl₃) δ7.72 - 7.64 (m, 1H), 7.63 - 7.57 (m, 1H), 7.54 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 7.44 - 7.38 (m, 1H), 7.38 - 7.30 (m, 2H), 6.71 (dd, J = 7.4, 2.1 Hz, 1H), 5.08 (d, J = 12.4, 2.4 Hz, 1H), 4.93 (d, J = 12.4, 2.5 Hz, 1H), 1.87 (s, 3H), 1.35 (s, 9H); LCMS (m/z): 402.2 [M+H]⁺.

(제7 공정)

질소 분위기 하에서, 2-클로로-6-[6-(tert-부틸)-8-플루오로-1-옥소이소퀴놀린-2(1H)-일]벤질 아세테이트 (150 mg, 0.37 mmol)의 1,4-디옥산 (5.3 mL) 용액에 비스(피나콜레이토)디보론 (284 mg, 1.12 mmol), 비스(디벤질리덴아세톤)팔라듐 (0) (10.7 mg, 19.0 μmol), 2,4,6-트리이소프로필-2'-(디사이클로헥실포스피노)바이페닐 (17.8 g, 37.0 μmol) 및 포타슘 아세테이트 (110 mg, 1.12 mmol)를 첨가하고, 65 ℃에서 16 시간동안 교반하였다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고, 셀라이트 패드를 통해 여과하여 불용 물질을 제거하였다. 여액에 물을 첨가하고, 에틸 아세테이트로 2회 추출하였다. 유기층을 합해 황산나트륨으로 건조시킨 다음, 여과하고 농축하였다. 조 물질을 실리카겔 상에서 헥산/에틸 아세테이트로 용출하면서 크로마토그래피로 정제하여 표제 화합물 (105 mg)을 수득하였다.

¹HNMR (400 MHz, CDCl₃) δ7.97 - 7.87 (m, 1H), 7.48 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 7.34 (dd, J = 7.9, 1.4 Hz, 1H), 7.27 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 7.18 (dd, J = 13.5, 1.8 Hz, 1H), 7.04 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 6.46 (dd, J = 7.4, 2.1 Hz, 1H), 5.46 (d, J = 11.8 Hz, 1H), 5.02 (d, J = 11.8 Hz, 1H), 1.92 (s, 3H), 1.38 (s, 9H), 1.34 (s, 12H); LCMS (m/z): 494.3 [M+H]⁺.

실시예 1

2-(3-{4-아미노-6-[(1-메틸-1H-피라졸-4-일)아미노]-1,3,5-트리아진-2-일}-2-(하이드록시메틸)페닐)-6-사이클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온

[화학식 10]

(제1 공정)

빙조 냉각 하에 2-아미노-4,6-디클로로-1,3,5-트리아진 (513 mg, 3.11 mmol)의 THF (10.3 mL) 용액에 DIEA (1.08 mL, 6.22 mmol) 및 1-메틸-1H-피라졸-4-아민 (332 mg, 3.42 mmol)의 THF 용액 (5.18 mL)을 천천히 첨가한 후, 상온에서 2.5 시간동안 교반하였다. 침전물을 여과 수집하고, 에틸 아세테이트, 물 및 에탄올로 세척한 후, 건조하여 6-클로로-N ² -(1-메틸-1H-피라졸-4-일)-1,3,5-트리아진-2,4-디아민 (420 mg)을 수득하였다.

¹HNMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ9.89 (s, 1H), 7.91 (s, 1H), 7.56 - 7.49 (m, 3H), 3.79 (s, 3H). ; LCMS (m/z): 225.9 [M+H]⁺.

(제2 공정)

참고예 1에서 수득한 2-(6-사이클로프로필-8-플루오로-1-옥소이소퀴놀린-2(1H)-일)-6-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤질 아세테이트 (141 mg, 0.29 mmol) 및 6-클로로-N ²-(1-메틸-1H-피라졸-4-일)-1,3,5-트리아진-2,4-디아민 (66.7 mg, 0.29 mmol)의 디메톡시에탄 (5 mL) 교반 용액에 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 (0) (17 mg, 0.015 mmol) 및 탄산칼륨 (82 mg, 0.59 mmol)의 수용액 (1.67 mL)을 첨가한 후, 마이크로파 합성 장치를 이용하여 110 ℃에서 20 분간 반응시켰다. 반응 혼합물에 물을 가하여 에틸 아세테이트로 추출하고 얻어진 유기층을 포화 탄산수소나트륨 수용액 및 식염수로 차례로 세척하고 무수 황산나트륨으로 건조시킨 다음, 여과하고 농축하였다. 조 물질을 실리카겔 상에서 헥산/에틸 아세테이트로 용출하면서 크로마토그래피로 정제하여 2-(3-{4-아미노-6-[(1-메틸-1H-피라졸-4-일)아미노]-1,3,5-트리아진-2-일}-2-(하이드록시메틸)페닐)-6-사이클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H)-온 및 그의 아세틸화 생성물의 혼합물을 수득하였다. 혼합 물질을 메탄올 (5 mL)에 용해시키고, 탄산칼륨 (100 mg, 0.724 mmol)을 첨가하여 상온에서 2 시간동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물로 희석하여 침전물을 여과 수집한 후, 물 및 디에틸 에테르로 세척하고, 건조하여 표제 화합물 (85 mg)을 수득하였다.

¹HNMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ9.71 (s, 1H), 8.00 (s, 1H), 7.94 - 7.82 (m, 1H), 7.61 - 7.42 (m, 3H), 7.37 - 7.26 (m, 4H), 7.00 (dd, J = 13.3, 1.7 Hz, 1H), 6.62 (dd, J = 7.5, 2.1 Hz, 1H), 5.25 - 5.13 (m, 1H), 4.55 - 4.44 (m, 1H), 4.16 - 4.02 (m, 1H), 3.84 - 3.75 (m, 3H), 2.12 - 2.04 (m, 1H), 1.14 - 1.06 (m, 2H), 0.91 - 0.84 (m, 2H); LCMS (m/z): 499.2 [M+H]⁺.

실시예 2

4-({4-아미노-6-[3-(6-사이클로프로필-8-플루오로-1-옥소이소퀴놀린-2(1H)-일)-2-(하이드록시메틸)페닐]-1,3,5-트리아진-2-일}아미노)-1-메틸-1H-피롤-2-카보니트릴

[화학식 11]

(제1 공정)

빙조 냉각 하에 4-아미노-1-메틸-1H-피롤-2-카복사미드 하이드로클로라이드 (350 mg, 1.99 mmol) 및 DIEA (0.7 mL, 3.99 mmol)의 THF (5 mL) 현탁액에 DMF (2.5 mL) 및 2-아미노-4,6-디클로로-1,3,5-트리아진 (299 mg, 1.81 mmol)을 첨가하고, 상온에서 5 시간동안 교반하였다. 침전물을 여과 수집하고, 에틸 아세테이트 및 물로 세척한 후, 건조하여 4-[(4-아미노-6-클로로-1,3,5-트리아진-2-일)아미노]-1-메틸-1H-피롤-2-카복사미드 (436 mg)를 수득하였다.

¹HNMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ10.00 - 9.43 (m, 1H), 7.46 (s, 1H), 7.40 (s, 1H), 7.29 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 7.21 - 6.79 (m, 2H), 6.77 - 6.65 (m, 1H), 3.80 (s, 3H). ; LCMS (m/z): 268.1 [M+H]⁺.

(제2 공정)

빙조 냉각 하에 4-[(4-아미노-6-클로로-1,3,5-트리아진-2-일)아미노]-1-메틸-1H-피롤-2-카복사미드 (130 mg, 0.49 mmol)의 DCM (5 mL) 용액에 TEA (0.1 mL, 0.73 mmol) 및 트리플루오로아세트산 무수물 (0.075 mL, 0.53 mmol)을 첨가하고, 상온에서 2 시간동안 교반하였다. 반응 혼합물에 TEA (0.1 mL, 0.73 mmol) 및 트리플루오로아세트산 무수물 (0.075 mL, 0.53 mmol)을 추가하고 상온에서 24 시간동안 교반하였다. 반응 혼합물에 물을 첨가하고, 에틸 아세테이트로 추출한 후, 유기층을 물 및 식염수로 세척하여 황산나트륨으로 건조시킨 다음, 여과하고 농축하였다. 조 물질을 실리카겔 상에서 헥산/에틸 아세테이트로 용출하면서 크로마토그래피로 정제하여 4-[(4-아미노-6-클로로-1,3,5-트리아진-2-일)아미노]-1-메틸-1H-피롤-2-카보니트릴 (100 mg)을 수득하였다.

¹HNMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ10.05 - 9.71 (m, 1H), 7.55 (s, 2H), 7.46 - 7.23 (m, 1H), 7.03 - 6.76 (m, 1H), 3.72 (s, 3H); LCMS (m/z): 250.1 [M+H]⁺.

(제3 공정)

참고예 1에서 얻은 2-(6-사이클로프로필-8-플루오로-1-옥소이소퀴놀린-2(1H)-일)-6-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤질 아세테이트 (45 mg, 0.094 mmol) 및 4-[(4-아미노-6-클로로-1,3,5-트리아진-2-일)아미노]-1-메틸-1H-피롤-2-카보니트릴 (23.5 mg, 0.094 mmol)의 디메톡시에탄 (2 mL)의 교반 용액에 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 (0) (5.4 mg, 0.0047 mmol) 및 탄산칼륨 (26 mg, 0.19 mmol)의 수용액 (0.67 mL)을 첨가한 후, 마이크로파 합성 장치를 이용하여 110 ℃에서 20 분간 반응시켰다. 반응 혼합물에 물을 가하여 에틸 아세테이트로 추출하고 얻어진 유기층을 유기층을 물 및 식염수로 세척하여 황산나트륨으로 건조시킨 다음, 여과하고 농축하였다. 조 물질을 실리카겔 상에서 헥산/에틸 아세테이트로 용출하면서 크로마토그래피로 정제하여 4-({4-아미노-6-[3-(6-사이클로프로필-8-플루오로-1-옥소이소퀴놀린-2(1H)-일)-2-(하이드록시메틸)페닐]-1,3,5-트리아진-2-일}아미노)-1-메틸-1H-피롤-2-카보니트릴 및 그의 아세틸화 생성물의 혼합물을 얻었디. 혼합 물질을 메탄올 (5 mL)에 용해시키고, 탄산칼륨 (100 mg, 0.724 mmol)을 첨가하여 60 ℃에서 1 시긴동안 교반하였다. 반응 혼합물에 물을 첨가하고, 침전물을 여과 수집하여 물 및 헥산으로 세척한 후, 건조하여 표제 화합물 (18 mg)을 수득하였다.

¹HNMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ10.15 - 9.19 (m, 1H), 7.87 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.65 - 7.50 (m, 2H), 7.49 - 7.41 (m, 1H), 7.40 - 7.30 (m, 3H), 7.28 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 7.04 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 7.00 (dd, J = 13.3, 1.6 Hz, 1H), 6.62 (dd, J = 7.5, 2.1 Hz, 1H), 5.23 - 4.91 (m, 1H), 4.50 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 4.19 - 3.94 (m, 1H), 3.74 (s, 3H), 2.16 - 2.00 (m, 1H), 1.15 - 1.03 (m, 2H), 0.95 - 0.77 (m, 2H); LCMS (m/z): 523.2 [M+H]⁺.

실시예 3 내지 33

이하 [표 1-1] 내지 [표 1-3]의 실시예 화합물은 각각 적절한 출발물질 (상업적 공급처로부터 입수하거나, 또는 당업자들에게 공지된 문헌 방법 또는 이에 준하는 방법으로 제조된 물질)을 이용하여 상술한 실시예에 기재된 방법, 또는 필요에 따라 유기 화학의 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 준하여 제조하였다.

또한 각 화합물의 물리화학적 데이터를 [표 2-1] 내지 [표 2-2]에 나타내었다.

실시예 34

[실시예 1의 프로드럭에 상응하는 화합물 (I)의 제조법]

2-{4-아미노-6-[(1-메틸-1H-피라졸-4-일)아미노]-1,3,5-트리아진-2-일}-6-(6-사이클로프로필-8-플루오로-1-옥소이소퀴놀린-2(1H)-일)벤질 옥테이트

[화학식 12]

실시예 1에서 제조한 2-(3-{4-아미노-6-[(1-메틸-1H-피라졸-4-일)아미노]-1,3,5-트리아진-2-일}-2-(하이드록시메틸)페닐)-6-사이클로프로필-8-플루오로이소퀴놀린-1(2H) 온 (0.2 g, 0.4 mmol)의 DMF 용액 (8 mL)에 피리딘 (0.13 mL, 1.6 mmol) 및 n-옥타노일 클로라이드 (0.14 mL, 0.8 mmol)를 적가하고 상온에서 16 시간동안 교반하였다. 반응 혼합물에 물 (50 mL)을 가하고 에틸 아세테이트 (3 × 50 mL)로 추출하였다. 얻어진 유기층을 합하여 물, 1M 염산 용액, 포화 탄산수소나트륨 용액 및 식염수로 차례로 세척하고 무수 황산나트륨으로 건조시킨 다음, 여과하고 농축하였다. 조 물질을 실리카겔 상에서 클로로포름/메탄올로 용출하면서 크로마토그래피로 정제하여 표제 화합물 (201 mg)을 수득하였다.

¹HNMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ9.58 (s, 1H), 7.99 (s, 1H), 7.88 - 7.73 (m, 1H), 7.69 - 7.55 (m, 2H), 7.52 - 7.42 (m, 1H), 7.37 (dd, J = 20.5, 7.4 Hz, 1H), 7.26 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 7.20 - 7.10 (m, 2H), 6.99 (dd, J = 13.2, 1.6 Hz, 1H), 6.60 (dd, J = 7.5, 2.0 Hz, 1H), 5.51 - 5.37 (m, 1H), 5.17 - 5.04 (m, 1H), 3.79 (s, 3H), 2.12 - 2.02 (m, 1H), 1.94 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.27 - 1.00 (m, 10H), 1.02 - 0.90 (m, 2H), 0.91 - 0.76 (m, 5H)； LCMS (m/z): 625.15 [M+H]⁺.

실시예 35 내지 84

이하 [표 3-1] 내지 [표 3-6]에 기재된 실시예 화합물 1의 프로드럭에 해당하는 실시예 화합물 (I)는 각각 적절한 출발물질(상업적 공급처로부터 입수하거나, 또는 당업자들에게 공지된 문헌 방법 또는 이에 준하는 방법으로 제조된 물질)을 이용하여 상기 실시예 34에 기재된 방법, 또는 필요에 따라 유기 화학의 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 준하여 제조하였다.

또한 각 화합물의 물리화학적 데이터를 [표 4-1] 내지 [표 4-4]에 나타내었다.

시험예 1

BTK 활성 저해 시험

(탈인산화 BTK 제조)

탈인산화 BTK는 비오티닐화된 BTK 단백질 BTN-BTK (카르나 바이오사이언스 사(Carna Biosciences, Inc.) 제) 효소 용액에 λ 단백질 포스파타제 (뉴 잉글랜드 바이오랩스사(New England BioLabs, Inc.) 제 Code No.P0753S)와 MnCl₂를 각각 10 U/μg, 2 mM으로 첨가하고, 혼합물을 4 ℃에서 밤새 반응시킨 후, 항 DYKDDDDK-tag 항체 아가로오스 겔 크로마토그래피에 의해 λ 단백질 포스파타제를 제거한 후, 10DG 탈염 컬럼을 사용하여 버퍼 교환함으로써 수득하였다.

(키나제 활성의 측정 방법)

키나제 활성은 QuickScout Screening Assist (상표) MSA(카르나 바이오사이언스 사제의 시판 키트)를 이용하여 이동성 변화 분석(MSA)법에 의해 측정하였다. 키나제 반응의 기질로서 키트에 제공된 FITC-표지 SRCtide 펩티드를 사용하였다. 분석 버퍼 [20 mM HEPES, 0.01% Triton X-100 (상표), 2 mM 디티오트레이톨, pH7.5]를 이용하여 4 μM 기질, 20 mM MgCl₂, 200 μm ATP가 되도록 조정하고 기질 혼합 용액을 수득하였다. 또한 탈인산화 BTK를 0.6 nM가 되도록 분석 버퍼로 희석하여 효소 용액을 제조하였다. 시험 화합물의 10 mM DMSO 용액에서 10개의 농도 (0.00003 mM, 0.0001 mM, 0.0003 mM, 0.001 mM, 0.003 mM, 0.01 mM, 0.03 mM, 0.1 mM, 0.3 mM, 1 mM)가 되도록 DMSO로 더 희석하고, 각각을 분석 버퍼로 25배 희석하여 약물 용액(4% DMSO 용액)을 수득하였다. 약물 용액 또는 대조 용액(4% DMSO-분석 버퍼) 5 μL, 기질 혼합 용액 5 μL 및 효소 용액 10 μL를 폴리프로필렌 384-웰 플레이트의 웰에서 혼합하고 1 시간동안 상온에서 반응시킨 후, 60 μL의 키트에 제공된 터미네이션 버퍼를 첨가하여 반응을 정지시켰다. 이어 반응 용액 중의 기질 (S) 및 인산화된 기질(P)의 양을 LabChip EZ Reader II 시스템(캘리퍼 라이프 사이언스(Caliper Life Sciences) 사 제품)을 이용하여 분석 키트의 프로토콜에 따라 측정하였다.

(BTK 저해 활성의 평가 방법)

분리된 기질과 인산화된 기질의 피크의 높이를 각각 S 및 P로 하고, 블랭크로 효소 용액 대신에 분석 버퍼를 첨가한 것을 측정하였다.

시험 화합물의 저해율(%)은 다음 공식에 따라 계산되었다.

저해율 (%) = (1-(C-A) / (B-A)) × 100

여기서, A, B 및 C는 각각 블랭크 웰의 P / (P + S), 대조 웰의 P / (P + S) 및 화합물 첨가 웰의 P / (P + S)를 나타낸다.

또한 IC₅₀ 값은 저해율(%)과 시험 화합물 농도 (대수값)의 회귀 분석을 통해 산출하였다.

(평가 결과)

실시예 화합물 군이 탈인산화 BTK에 대해 10 nM 이하의 IC₅₀ 값을 나타내는 것으로부터, 본 발명의 화합물 (I)는 강한 BTK 저해 효과를 갖는 것을 보여주고 있다.

시험예 2

세포 내 BTK 자기-인산화 활성 저해 시험

(사용할 세포의 배양)

Ramos 세포(2G6.4C10, ATCC No. CRL-1923)를 T75 플라스크에 10% FBS (AusGene) 및 5% 페니실린-스트렙토마이신 (나카라이 테스퀘사(Nacalai Tesque, Inc.))를 첨가한 RPMI-1640 배지(GIBCO, #A10491-01) (이하, 증식 배지라 함)를 이용하여 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다.

(시험할 화합물의 첨가)

배양한 Ramos 세포를 세포 밀도 7.5 × 10⁶ 세포/mL이 되도록 무혈청 RPM-1640 배지 (이하 배지라 함)로 희석하고, 45 분간 37 ℃에서 유지하였다. 세포 현탁액을 2.0 mL 튜브에 1 mL 씩 소분하였다. 시험 물질의 0.3 mM DMSO 용액을 배지로 희석하여 0.9 μM로 한 시험 화합물 용액 500 μL를 튜브에 첨가하고, 시험 화합물의 최종 농도 0.3 μM의 존재 하에 37 ℃에서 1 시간동안 배양하였다. 그 후, 배지로 희석한 항-IgM 항체 (Invitrogen, H15100)를 최종 농도가 10 μg/mL가 되도록 첨가하고 37 ℃에서 10 분간 배양하였다.

(단백질 추출)

원심분리로 세포를 회수하여 얻은 펠렛에 용해(lysis) 버퍼 [RIPA Buffer (×1) (셀 시그널링 테크놀로지(Cell Signaling Technology) 사제)에 1% 포스파타제 저해제 칵테일 3(시그마(Sigma) 사제, No.P0044), 1% 포스파타제 저해제 칵테일 (나카라이 테스퀘사, No.07575) 및 1 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF)]를 첨가한 것을 100 μL 첨가하고, 가볍게 교반한 후 10 분간 정치하였다. 원심분리 (15,000 rpm, 15 분)하여 상층액을 회수하고 단백질 함량을 정량하였다. 이 부분을 SDS-샘플 버퍼와 혼합하고 95 ℃에서 5 분간 반응시켜 단백질을 변성시켜 샘플 용액으로 하였다. 4-20% 구배 아크릴아미드 겔 (코스모 바이오 사(COSMO BIO Co., Ltd.)제, No.414879)의 각 웰에 샘플 용액을 5 μL씩 적용하고 전기영동을 실시했다. 그 후, iBlot 겔 전송 시스템 (라이프 테크놀로지스사(Life Technologies Corporation))를 이용하여 PVDF 막에 겔 내 단백질을 전사하였다.

(BTK 또는 인산화 BTK 검출)

전사 후 PVDF 막을 2% ECL 프라임 차단 시약(prime blocking Reagent) (GE 헬스케어(GE Healthcare))로 블로킹 처리한 후, 일차 항체로 항-BTK 마우스 항체 (비디트랜스덕션 래보레이토리(BDtransduction laboratory) 사제, No.611116) 또는 항-인산화 BTK 토끼 항체 (pY223, EPITOMICS, No.2207-1)를 이용하여 4 ℃에서 밤새 반응시켰다. 미반응 일차 항체를 TBST 버퍼 (10 mM Tris-HCl (pH7.5), 150 mM NaCl, 0.1% Tween20)로 세척한 후, 이차 항체로 HRP-표지된 항-마우스 IgG 염소 항체 (라이프 테크놀로지스사제, No.62-6520) 또는 항-토끼 IgG 염소 항체 (라이프 테크놀로지스사제, No.65-6120)를 이용하여 2% ECL 프라임 차단 시약을 첨가한 TBST 버퍼 중에서 상온에서 1 시간 반응시켰다. 미반응 이차 항체를 TBST 버퍼로 세척한 후, ECL 프라임 웨스턴 블롯팅 검출 시스템(Prime Western Blotting Detection System)(GE 헬스케어 사)을 이용하여 첨부된 프로토콜에 따라 반응시킨 후, CCD 카메라 (ATTO, Light-Capture II)를 이용하여 각각의 밴드를 화학 발광으로서 검출하였다. 검출된 밴드를 비중계 (ATTO CS Analyzer ver3.0)에 의해 수치화하고, 화합물을 첨가하지 않고 IgM 자극인 군의 인산화 BTK 밴드의 발광을 100%로 하고, 화합물을 첨가하지 않고 IgM 무자극인 군의 인산화 BTK 밴드의 발광을 0%로 하여, 각 군에서 밴드의 강도에 기초해 저해율(%)을 계산하였다. 각각의 인산화 BTK 밴드는 총 BTK에 기초해 보정이 행해졌다.

본 시험에서 사용한 일차 항체와 이차 항체의 조합 및 그의 희석 농도는 다음과 같다.

	일차 항체 (희석 규모)	이차 항체 (희석 규모)
1	항-BTK 마우스 항체 (1/4000)	항-마우스 IgG 염소 항체 (1/5000)
2	항-인산화 BTK 토끼 항체 (1/500)	항-토끼 IgG 염소 항체 (1/5000)

시험 화합물 0.3 μM 농도의 결과를 표 6에 나타내었다. 세포 내 BTK 자기 인산화 저해 활성은 70% 이상인 경우 "***"로 표시하고, 50% 이상 70% 미만인 경우는 "**"로 표시하고, 30% 이상 50% 미만인 경우는 "*"로 표시하였다.

본 시험에서는 표 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명 화합물이 0.3 μM 농도에서 세포 내 BTK 자기 인산화 활성을 강하게 저해하였다.

시험 화합물 (실시예 번호)	BTK 인산화 저해 활성
1	***
2	***

시험예 2의 결과는 본 발명의 화합물이 "세포 내 BTK 자기 인산화 활성"에 대해서도 강한 저해 작용을 갖는 것을 나타내고 있다.

시험예 3

Ramos 세포 내 칼슘 이온 변화에 대한 저해 시험

본 발명의 화합물에 의한 세포 내 BTK 저해를 본 발명의 화합물의 "항-IgM 항체 BCR 자극에 의한 세포 내 칼슘 유입"에 미치는 영향을 측정함으로써 검증하였다.

(세포 현탁액 및 칼슘 지시약 첨가)

측정 하루 전에 Ramos 세포를 세포 밀도 1.0 × 10⁶ 세포/mL이 되도록 신선한 성장 배지(시험예 2에서 사용한 것과 같은 성장 배지)에 다시 현탁시킨 후 배양하고, 다음날 원심분리하여 세포를 회수하고 5% 페니실린 스트렙토마이신 (나카라이 테스퀘 사)를 첨가한 RPMI-1640 배지 (배지 1)로 세척하였다. 이 세포를 세포 밀도 2.0 × 10⁶ 세포/mL이 되도록 1% Ultra Low IgG FBS (GIBCO # 16250)와 5% 페니실린 스트렙토마이신 (나카라이 테스퀘 사)를 첨가한 RPMI-1640 배지 (배지 2)에 다시 현탁한 후, 세포 현탁액을 폴리리신으로 코팅된 마이크로플레이트 (BD BioCoat^TM #356692)의 각 웰에 100 μL씩 첨가하여 원심분리 (700 rpm, 3 분)한 후 37 ℃의 5% CO₂ 배양기에서 1 시간 배양하였다. 칼슘 지시약 Fluo-8NW 염료-로딩 용액 (AAT Bioquest # 36315)을 각 웰에 100 μL씩 첨가하여 37 ℃의 5% CO₂ 인큐베이터에서 추가로 30 분간 배양하였다.

(시험할 화합물의 첨가)

시험 화합물의 10 mM DMSO 스톡 용액을 DMSO로 6개의 농도 (1, 0.3, 0.1, 0.03, 0.01, 0.003 mM)로 추가 희석하고, 시험 화합물을 포함하지 않는 DMSO 용액을 대조군으로 사용하였다. 이어 각각을 배지 2로 47.6-배 희석하고, 상기 플레이트의 각 웰에 10 μL씩 첨가한 후, 37 ℃에서 10 분동안 배양하였다 (시험 화합물의 최종 농도 1, 0.3, 0.1, 0.03, 0.01, 0.003, 0 μM).

(칼슘 이온 농도의 측정)

Ramos 세포 내 칼슘 이온 농도는 마이크로플레이트 리더 (SynergyH1)를 이용하여 칼슘 지시약 Fluo-8NW의 형광 강도로서 측정하였다 (Ex/Em = 490/525 nm). 15 초동안 기준을 측정한 후, 위의 각 웰에 배지 2로 10.4 μg/mL이 되도록 희석한 항-IgM 항체 (Invitrogen # H15100)를 50 μL 첨가 (최종 농도 2.0 μg/mL)하여 BCR 자극하고, 150 초간 측정을 계속하였다.

도 1은 대표적인 예로 실시예 1의 화합물의 결과를 나타낸다. 도 1에 나타난 바와 같이, 본 발명의 화합물은 저농도에서 농도 의존적으로 "BCR 자극에 의한 세포 내 칼슘 이온 변화"를 저해하였고, 이는 BCR 신호를 효과적으로 저해함을 시사한다.

시험예 4

마우스에서 수동적 피부 아나필락시스 반응 시험

BTK는 비만 세포에서 FcεRI의 신호전달에 중요한 역할을 하기 때문에, 비만 세포가 관여하는 즉각적인 알레르기 반응, 즉 비만 세포가 관여하는 즉각적인 알레르기 반응인 수동적 피부 아나필락시스 반응(passive cutaneous anaphylaxis 반응: PCA 반응)이 화합물 투여에 의해 저해되는지를 검토하였다.

(시험 화합물 용액의 제조)

시험 화합물에 DMSO, 폴리에틸렌 글리콜 400 (PEG#400, 나카라이 테스퀘 사, #28215-95) 및 30% (w/v) 하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린 수용액 (HP-β-CD, 시그마 사(Sigma Corporation), # 332607-500)을 이 순서대로 첨가하고 철저히 혼합하여 시험 화합물 용액을 제조하였다 (용매 조성: 5% 시험 화합물 DMSO 용액, 30% PEG#400, 65% HP-β-CD [30% (w/v) 수용액]). 용매 대조군은 시험 화합물 DMSO 용액 대신 DMSO 용액을 사용하였다.

(PCA 반응)

전신 마취하에 ICR 마우스에 항 DNP-IgE 단클론 항체 (50 μg/mL, 산타크루즈 바이오테크놀로지사(Santa Cruz biotechnology, Inc.), #sc-69695)를 양쪽 귓바퀴에 피내 투여하였다 (10 μL/부위). 46 시간 후, 용매 또는 시험 투여 용량이 되도록 용매에 용해시킨 시험 화합물 용액 (3.0 mg/mL)을 경구 투여하였다 (10 mL/마우스 체중 (kg)). 2 시간 후, 0.5% 에반스 블루 염료 (와코 순 약물 주식회사(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) #054-04062)를 함유하는 DNP-BSA (1 mg/mL, LSL, #LG-3017)을 정맥 내 투여 (0.25 mL/마우스)하여 알레르기 반응을 일으켰다. 30 분 후, 전신 마취하에 경추 탈구에 의해 동물을 안락사시키고 양 귓바퀴를 수거하였다. 수거한 귓바퀴 쌍에 1M KOH 용액 (0.7 mL)을 가하고 37 ℃에서 하룻밤 방치하여 귓바퀴를 용해시켰다. 이 현탁액에 아세톤-0.2M 인산 (13: 5) 혼합 용액을 9.3 mL 첨가한 후, 발생한 불용물을 원심분리 (3000 rpm, 10 분) 및 0.2 μm 필터로 제거하였다. 얻어진 여과액의 620 nm에서의 흡광도를 측정하여 색소 누출량의 지표로 하였다. 위 실험은 각 군에 5 마리의 마우스를 이용하여 실시하였고, 색소 누출량의 평가는 이 마우스에 대해 얻어진 값의 평균치를 취하였다.

도 2에 결과를 나타낸다. 도 2에서와 같이 실시예 1의 화합물은 용매군과 비교하여 유의하게 귓바퀴에 색소 누출을 저해하였다. 즉 수동적 피부 아나필락시스 반응 (PCA 반응)에 대한 저해 작용이 확인되었다.

시험예 5

마우스 콜라겐 유발성 관절염 모델에서의 작용

2 ㎎/mL로 건조시킨 M. Tuberculosis H37 Ra (벡톤 딕킨슨 앤드 컴퍼니(Beckton Dickinson and Company), #231141)를 첨가한 불완전 프로인트 보조제 (콘드렉스사(Chondrex, Inc.), #7002)와 소 II 형 콜라겐, 2 ㎎/mL 용액 (Chondrex, Inc., #20022)을 1:1의 비로 혼합하여 에멀젼을 형성하였다.

DBA/1J 마우스의 세 군 (10 마리/군) (6 주령, 수컷)에 0 일째와 21 일째에 마우스 1 마리 당 0.1 mL의 에멀젼을 꼬리 근부에 피내 주사에 의해 소량씩 나누어 주입하여 면역화하였다. 용매 또는 시험 화합물 용액을 18 일째부터 36 일째까지 매일 1일 2회 경구 투여하였다 (각 군에서의 시험 화합물 투여량: 0 mg/kg, 30 mg/kg, 60 mg/kg). 처리 용액은 시험예 4와 유사한 방식으로 유사한 용매로 제조하였다.

21 일에 추가 면역 후, 2 ~ 3 일에 1회, 표 7에 나타내는 기준에 따라 사지 각각의 관절염 발병 상태를 육안으로 점수화했다. 사지 모든 점수를 각 마우스마다 합산하여 각 군 10 마리의 평균값을 관절염 점수로 표시하였다 (정상 "0"에서 최대 "16"까지).

점수	상태
0	정상
1	발 또는 하나의 발가락에 부종 및/또는 발적
2	2 개소 이상의 관절에 부종
3	2 개소 초과 관절에 파급하는 발 전체의 부종
4	발 및 전체 발가락에 중증의 관절염

본 발명의 화합물인 실시예 1의 화합물은 도 3에서와 같이 관절염의 발병을 용량 의존적으로 저해하였다. 게다가, 체중 감소 등의 어떤 독성도 나타내지 않았다. 이 결과로부터 본 발명의 화합물이 뛰어난 항염증 작용을 가짐과 동시에 안전성도 우수할 가능성이 높은 것으로 확인되었다.

시험예 6

래트 콜라겐 유발성 관절염 모델에서의 작용

불완전 프로인트 보조제 (시그마-알드리히(Sigma-Aldrich) 제, #F5506)와 소 II 형 콜라겐, 4 ㎎/mL 용액 (신추안 유니버시티(Sichuan University), Lot. 08H0497)을 1:1의 비로 혼합하여 에멀젼을 형성하였다. 루이스(Lewis) 쥐 3 군 (10 마리/군) (5-6 주령, 암컷)에 0 일째와 7 일째에 쥐 1 마리 당 0.5 mL의 에멀젼을 꼬리 근부 (0.1 mL) 및 꼬리 근부에 가까운 등 2 개소 (각 0.2 mL/부위)의 총 3 개소에 나누어 피내 주사하여 면역화하였다. 용매 또는 시험 화합물 용액을 0 일째부터 20 일째까지 매일 1일 2회 경구 투여하였다 (각 군에서의 시험 화합물 투여량: 0 mg/kg, 30 mg/kg, 60 mg/kg). 처리 용액은 시험예 4와 유사한 방식으로 유사한 용매로 제조하였다.

7 일에 추가 면역 후, 1 주일에 2회, 표 8에 나타낸 기준에 따라 사지 각각의 관절염 발병 상태를 육안으로 점수화했다. 사지 모든 점수를 각 마우스마다 합산하여 각 군 10 마리의 평균값을 관절염 점수로 표시하였다 (정상 "0"에서 최대 "16"까지).

점수	상태
0	정상
1	중족(부골) 또는 족관절에 한정된 발적 및 가벼운 부종
2	족관절에서 중족에 이르는 발적 및 가벼운 부종
3	족관절에서 중족골 관절에 이르는 발적 및 중정도의 부종
4	족관절, 족 및 발가락 전체에 발적 및 중증의 부종

본 발명의 화합물인 실시예 1의 화합물은 도 4에서와 같이 관절염의 발병을 용량 의존적으로 저해하였다. 게다가, 체중 감소 등의 어떤 독성도 나타내지 않았다. 이 결과로부터 본 발명의 화합물이 뛰어난 항염증 작용을 가짐과 동시에 안전성도 우수할 가능성이 높은 것으로 확인되었다.

시험예 7

마우스에 경구 투여 후 혈중 농도 (프로드럭의 대사 확인 시험)

일반적으로 프로드럭은 경구 투여 후 위장관에서 흡수된 후 체내에서 신속히 활성형 약물로 대사되는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 프로드럭에 해당하는 화합물 (I)이 체내에서 신속하게 활성형 약물로 대사되는지를 검토하였다.

ICR 마우스 (3 마리/군) (6 주령, 수컷)에 용매 (0.5% 메틸 셀룰로오스 수용액)에 현탁시킨 시험 화합물 현탁액을 30 mg/kg의 시험 투여량으로 경구 투여하였다. 1 시간 후 전신 마취하에 헤파린 코팅된 주사기를 이용하여 심장 천자를 통해 혈액 샘플을 채취하고 이 샘플을 원심분리 (4 ℃, 10000 rpm, 10 분)하여 혈장 샘플을 수거하였다. 필터가 있는 웰 플레이트에 5 μL의 혈장 샘플과 495 μL의 내부 표준 화합물을 포함하는 메탄올 용액을 첨가하여 혼합하였다. 원심분리 (4 ℃, 3000 rpm, 3 분)에 의해 변성 단백질을 제거하고, 여액 (추출액)을 회수하였다. 검량선 용으로, 내부 표준 화합물을 포함하는 대사물의 메탄올 용액을 준비하여 비처리 마우스에서 채취한 혈장 샘플과 혼합하고, 필터가 있는 플레이트를 사용하여 동일하게 처리하였다. 또한 프로드럭 (미변화 약물)의 검량선에는, 프로드럭의 메탄올 용액과 내부 표준 화합물의 메탄올 용액을 혼합한 표준 검량 용액을 사용하였다.

추출액 중의 프로드럭 및 그 대사물인 실시예 1의 화합물의 농도를, LC/MS (액체 크로마토그래피-질량 분석)를 이용하고 내부 표준 물질의 피크 면적비의 표준선으로부터 측정하였다.

시험 화합물	경구 투여 1 시간후 혈중 농도 (ng/mL)
시험 화합물	프로드럭 (미변화 약물)	대사물 (실시예 화합물 1)
실시예 35	ND	1451
실시예 36	ND	942

ND: 미검출

표 9에서와 같이, 본 발명의 프로드럭 화합물은 경구 투여 후 혈액중에서 관찰되지 않았으나, 그의 대응 대사물인 실시예 1의 화합물은 관찰되었다. 이 결과로부터 본 발명의 프로드럭은 체내에서 그의 활성형으로 빠르게 대사되는 것이 확인되었다.

산업상 이용가능성

본 발명에 의해 제공되는 화합물은 BTK를 통한 비정상적인 세포 반응과 관련이 있는 것으로 알려진 질환, 예를 들면 자가 면역 질환, 염증성 질환, 골 질환 및 림프종과 같은 암에 대한 예방 또는 치료용 의약품 (의약 조성물) 또는 그의 프로드럭으로서 유용하다. 또한 이 화합물은 BTK 저해제로서 시험 및 연구에 사용되는 시약용으로 유용하다.

Claims

하기 화학식 (I)로 표시되는 트리아진 유도체 또는 그의 약학적으로 허용되는 염:

상기 식에서,
R¹은 치환되거나 비치환된 저급 알킬기를 나타내고,
R²는 수소 원자 또는 치환되거나 비치환된 저급 알킬기를 나타내고,
A는 질소 원자 또는 C-R³를 나타내고,
R³는 수소 원자, 시아노기, 치환되거나 비치환된 아실기, 치환되거나 비치환된 설포닐기 또는 치환되거나 비치환된 카르바모일기를 나타내고,
R⁴는 치환되거나 비치환된 저급 알킬기 또는 치환되거나 비치환된 사이클로알킬기를 나타낸다.
제1항에 있어서, R¹은 식 -CH₂OR⁵를 나타내고, R⁵는 치환되거나 비치환된 아실기를 나타내는 트리아진 유도체 또는 그의 약학적으로 허용되는 염.