WO2014196549A1 - ファイバー・オン・ファイバーを用いた細胞の３次元培養方法及びそのための基材 - Google Patents

ファイバー・オン・ファイバーを用いた細胞の３次元培養方法及びそのための基材 Download PDF

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fiber
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culture
pluripotent stem
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謙一郎 亀井
憲夫 中辻
劉　莉
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国立大学法人京都大学
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Definitions

  • the present invention relates to a culture medium suitable for culturing cells, for example, pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ES cells) and induced pluripotent stem cells (iPS cells), particularly human pluripotent stem cells.
  • the present invention relates to a material, and a method for culturing stem cells using the material. More specifically, the present invention relates to a cell culture substrate in which nanofibers (bionanofibers) made of biopolymers such as gelatin, collagen, and cellulose are coated on a support such as gauze or sponge, and the culture substrate.
  • the present invention relates to a method for maintaining and amplifying cells, a method for freezing cells, and the like by dispersing cells to a single cell without performing enzyme treatment at the time of subculture using the cell freezing agent containing the material and the culture substrate.
  • Human pluripotent stem cells can grow indefinitely under appropriate conditions, and have the property of being able to differentiate into any cell in living tissue (multipotency), so cell transplantation therapy, drug screening, and regenerative medicine Application to various fields is expected.
  • multipotency multipotency
  • feeder cells and various polymers have been used as cell culture substrates.
  • these methods are complicated in preparation and quality is not stable. Therefore, stable culture and supply of human pluripotent stem cells has been difficult.
  • development of a high-quality, large-scale, fully automatic culture method for human pluripotent stem cells requires a more stable and inexpensive method, but such a method has not yet been established.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 culture methods using suspension culture, microbeads, etc. have been developed (Non-Patent Documents 1 and 2), however, shearing stress on the cell surface due to aggregation or agitation of cell mass has become a problem, It has not been put into practical use.
  • Non-patent Document 3 Non-patent Document 3
  • Non-Patent Documents 4 and 5 the development of cell culture substrates using polymers such as polymers has also been reported (Non-Patent Documents 4 and 5), and although they have been commercialized, stable products can be obtained. However, it is very expensive and may not be suitable depending on the cell line. Thus, a stable and inexpensive cell culture substrate has not been prepared.
  • Nanofibers are ultrafine fibers with a fiber diameter on the order of nanometers, and the structure composed of nanofibers is similar in size to the extracellular matrix, and the cell adhesion is improved by increasing the specific surface area. Since there are advantages such as being possible, a nanofiber made of a synthetic polymer (Non-patent Document 6) or a mixture of a synthetic polymer and a biopolymer such as collagen or gelatin (Non-Patent Documents 6 and 7) is produced.
  • Non-patent Document 7 it has been reported that human ES cells cannot be maintained and grown in a culture system that does not use feeder cells. On the other hand, there has been no report of using nanofibers composed only of biopolymers as a culture substrate for pluripotent stem cells.
  • the present inventors have focused on using a biomaterial that is highly biocompatible and inexpensive as a substrate for culturing human pluripotent stem cells, and using electrospinning to convert the biomaterial into nanofibers. I was devising. Therefore, in order to achieve the above object, an attempt was made to apply the nanofiber to a support such as gauze or sponge in order to further increase the physical strength of the nanofiber.
  • the obtained culture substrate was named “fiber on fiber”.
  • Fiber-on-fiber can be folded and used because its shape can be changed flexibly. Therefore, the present inventors placed a suspension of human ES cells or human iPS cells dispersed into single cells on four fiber-on-fibers, folded them and cultured them in a medium for ES cells. .
  • human pluripotent stem cells cultured on this fiber-on-fiber substrate showed approximately twice the number of cells compared to culture on matrigel-coated dishes. The cell density was higher than that.
  • gauze, sponge, etc. are more porous than glass / plastic substrates, etc., when the fiber-on-fiber is immersed in the culture solution, the culture solution will naturally permeate so that the culture solution to the cells Supply has also improved.
  • This fiber-on-fiber is flexible in shape, so there is no need to select a container, and it can be cultured in any container as long as the nutrients reach the cells. That is, stem cells such as pluripotent stem cells It has become clear that desired cells such as can be easily cultured in large quantities. Furthermore, the present inventors have confirmed that pluripotent stem cells maintain pluripotent and normal karyotype even after long-term subculture using this fiber-on-fiber substrate. Moreover, even when freezing and thawing operations were performed using a fiber-on-fiber substrate, it was found that pluripotent stem cells formed colonies and the cell viability was high, and the present invention was completed.
  • a cell culture substrate comprising a nanofiber made of a biopolymer selected from the group consisting of gelatin, collagen and cellulose on a support.
  • a nanofiber made of a biopolymer selected from the group consisting of gelatin, collagen and cellulose on a support.
  • the biopolymer is gelatin or collagen.
  • the cell is a stem cell.
  • the stem cells are pluripotent stem cells.
  • the pluripotent stem cells are ES cells or iPS cells.
  • the pluripotent stem cells are derived from human.
  • the culture is a maintenance amplification culture of cells.
  • a cell freezing agent comprising the substrate according to any one of [1] to [6] above.
  • a method for culturing cells comprising seeding cells on the substrate according to any one of [1] to [6], and culturing the cells stationary.
  • the culture substrate of the present invention Since the culture substrate of the present invention has high physical strength and is flexible in shape, three-dimensional culture is possible, and a large amount of cells can be supplied while realizing space saving. In addition, since the culture substrate of the present invention is highly biocompatible and inexpensive, stable supply is facilitated. Furthermore, since the shape of the culture substrate of the present invention can be easily changed, it can be stored frozen regardless of the container. In addition, when the culture substrate of the present invention is used, since the culture solution penetrates when the culture solution is immersed, the culture solution can be easily supplied to the cells.
  • SSEA4 pluripotent stem cell marker
  • SSEA1 differentiation marker
  • FIG. 1 Shows that human ES cells (H1) subcultured 10 times or more on fiber-on-fiber can differentiate into all germ layers of mesoderm (left), ectoderm (center), and endoderm (right)
  • FIG. 1 Photomicrographs of immunostaining with anti- ⁇ -SMA antibody, anti-tubulin III antibody, and anti-SOX17 antibody (nuclear double staining with DAPI) are shown. It is a figure which shows the teratoma formation ability in the human ES cell (H1, H9) and the human iPS cell (253G1) which were subcultured 10 times or more on a fiber on fiber.
  • the present invention relates to a cell culture substrate comprising nanofibers composed of a biopolymer selected from the group consisting of gelatin, collagen and cellulose (hereinafter sometimes abbreviated as the culture substrate of the present invention). )I will provide a.
  • Cells to which the culture substrate of the present invention can be applied are not particularly limited, and any cell that can be cultivated stationary (for example, lymphocytes, epithelial cells, endothelial cells, muscle cells, fibroblasts (skin cells, etc.), Hair cells, hepatocytes, gastric mucosa cells, intestinal cells, spleen cells, pancreatic cells (pancreatic exocrine cells, etc.), differentiated cells such as brain cells, lung cells, kidney cells, adipocytes, undifferentiated tissue precursor cells and stem cells Etc.).
  • stationary for example, lymphocytes, epithelial cells, endothelial cells, muscle cells, fibroblasts (skin cells, etc.), Hair cells, hepatocytes, gastric mucosa cells, intestinal cells, spleen cells, pancreatic cells (pancreatic exocrine cells, etc.), differentiated cells such as brain cells, lung cells, kidney cells, adipocytes, undifferentiated tissue precursor cells and stem cells Etc
  • stem cells may be mentioned.
  • Stem cells are not particularly limited as long as they have the ability to differentiate into self-replicating cells and other types of cells (other than stem cells), and are pluripotent stem cells that can differentiate into all three germ layers, generally beyond germ layers It can be applied to both pluripotent stem cells that cannot be differentiated but can be differentiated into various cell tumors, and unipotent stem cells that are limited to one type of differentiateable cell tumor.
  • the pluripotent stem cell is not particularly limited as long as it is an undifferentiated cell having ⁇ self-renewal ability '' that can proliferate while maintaining an undifferentiated state and ⁇ differentiated pluripotency '' that can differentiate into all three germ layers.
  • the ES cell may be a nuclear transplanted ES (ntES) cell produced by nuclear reprogramming from a somatic cell. ES cells or iPS cells are preferred.
  • stem cells having multipotency include, but are not limited to, neural stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, hepatic stem cells, pancreatic stem cells, skin stem cells, and the like.
  • unipotent stem cells include, but are not limited to, muscle stem cells, reproductive stem cells, and dental pulp stem cells.
  • the cells cultured by the method of the present invention are differentiated cells, tissue progenitor cells, pluripotent stem cells, or unipotent stem cells
  • these cells can be obtained by any known method according to any method in which they exist. It can be isolated from mammalian tissue. The isolated cells can be applied as they are as primary cultured cells, or can be applied after maintenance culture by a method known per se. Moreover, various cell lines obtained by immortalizing these cultured cells can also be used.
  • the method of the present invention can be applied in any mammal in which any pluripotent stem cell is established or can be established, for example, human, Examples include mouse, monkey, pig, rat, dog and the like, preferably human or mouse, more preferably human.
  • the preparation method of various pluripotent stem cells is demonstrated concretely below, the other well-known method can also be used without a restriction
  • ES cells can be established by removing an inner cell mass from a blastocyst of a fertilized egg of a subject animal and culturing the inner cell mass on a fibroblast feeder. In addition, maintenance of cells by subculture is performed using a culture solution supplemented with substances such as leukemia inhibitory factor (LIF) and basic fibroblast growth factor (bFGF). It can be carried out.
  • LIF leukemia inhibitory factor
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • a culture solution for ES cell production for example, DMEM / F-12 culture solution supplemented with 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 0.1 mM non-essential amino acid, 2 mM L-glutamic acid, 20% KSR and 4 ng / mL bFGF (Alternatively, human ES cells can be maintained in a humid atmosphere of 37 ° C, 2% CO 2 /98% air using a synthetic medium (mTeSR, Stem Pro, etc.) (O. Fumitaka et al. (2008) Nat. Biotechnol., 26: 215-224).
  • ES cells also need to be passaged every 3-4 days, where passage is eg 0.25% trypsin and 0.1 mg / mL collagenase in PBS containing 1 mM CaCl 2 and 20% KSR. Can be performed using IV.
  • ES cells can be generally selected by Real-Time PCR using the expression of gene markers such as alkaline phosphatase, Oct-3 / 4, Nanog as an index.
  • gene markers such as alkaline phosphatase, Oct-3 / 4, Nanog
  • OCT-3 / 4, NANOG, and ECAD can be used as an index (E. Kroon et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26: 443). -452).
  • Human ES cell lines for example, WA01 (H1) and WA09 (H9) are obtained from the WiCell Research Institute, and KhES-1, KhES-2 and KhES-3 are obtained from the Institute of Regenerative Medicine, Kyoto University (Kyoto, Japan) Is possible.
  • sperm stem cells are testis-derived pluripotent stem cells that are the origin of sperm formation. Like ES cells, these cells can be induced to differentiate into various types of cells.For example, when transplanted into a mouse blastocyst, a chimeric mouse can be produced (M. Kanatsu-Shinohara et al. ( 2003) Biol. Reprod., 69: 612-616; K. Shinohara et al. (2004), Cell, 119: 1001-1012).
  • Spermatozoa can replicate in culture medium containing glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) and repeat passages under the same culture conditions as ES cells. Stem cells can be obtained (Masatake Takebayashi et al. (2008), Experimental Medicine, Vol. 26, No. 5 (extra number), 41-46, Yodosha (Tokyo, Japan)).
  • GDNF glial cell line-derived neurotrophic factor
  • Embryonic germ cells are cells that are established from embryonic primordial germ cells and have the same pluripotency as ES cells, and they are primitive in the presence of substances such as LIF, bFGF, and stem cell factor. It can be established by culturing germ cells (Y. Matsui et al. (1992), Cell 70: 841-847; JL Resnick et al. (1992), Nature, 359: 550-551).
  • iPS cells can be created by introducing specific reprogramming factors into somatic cells in the form of DNA or protein, such as almost the same characteristics as ES cells, such as differentiation pluripotency And an artificial stem cell derived from a somatic cell having proliferation ability by self-replication (K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126: 663-676; K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131) : 861-872; J. Yu et al. (2007), Science, 318: 1917-1920; Nakagawa, M. et al., Nat. Biotechnol. 26: 101-106 (2008); WO 2007/069666).
  • the reprogramming factor is a gene that is specifically expressed in ES cells, its gene product or non-coding RNA, a gene that plays an important role in maintaining undifferentiation of ES cells, its gene product or non-coding RNA, or It may be constituted by a low molecular compound.
  • genes included in the reprogramming factor include Oct3 / 4, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Klf4, Klf2, c-Myc, N-Myc, L-Myc, Nanog, Lin28, Fbx15, ERas, ECAT15 -2, Tcl1, beta-catenin, Lin28b, Sall1, Sall4, Esrrb, Nr5a2, Tbx3 or Glis1 etc. are exemplified, and these reprogramming factors may be used alone or in combination.
  • the reprogramming factors include histone deacetylase (HDAC) inhibitors [eg small molecule inhibitors such as valproic acid (VPA), trichostatin A, sodium butyrate, MC 1293, M344, siRNA and shRNA against HDAC (eg Nucleic acid expression inhibitors such as HDAC1 siRNA Smartpool (registered trademark) (Millipore), HuSH 29 mer shRNA Constructs against HDAC1 (OriGene), etc.], MEK inhibitors (eg, PD184352, PD98059, U0126, SL327 and PD0325901) , Glycogen synthase kinase-3 inhibitors (for example, Bio and CHIR99021), DNA methyltransferase inhibitors (for example, 5-azacytidine), histone methyltransferase inhibitors (for example, small molecule inhibitors such as BIX-01294, Suv39hl, Suv39h2 , Nucleic acid expression inhibitors such
  • the reprogramming factor may be introduced into a somatic cell by a technique such as lipofection, fusion with a cell membrane-permeable peptide (for example, HIV-derived TAT and polyarginine), or microinjection.
  • a cell membrane-permeable peptide for example, HIV-derived TAT and polyarginine
  • Virus vectors include retrovirus vectors, lentivirus vectors (cell, 126, pp.663-676, 2006; Cell, 131, pp.861-872, 2007; Science, 318, pp.1917-1920, 2007 ), Adenovirus vectors (Science, 322, 945-949, 2008), adeno-associated virus vectors, Sendai virus vectors (WO 2010/008054) and the like.
  • artificial chromosome vectors examples include human artificial chromosomes (HAC), yeast artificial chromosomes (YAC), and bacterial artificial chromosomes (BAC, PAC).
  • HAC human artificial chromosomes
  • YAC yeast artificial chromosomes
  • BAC bacterial artificial chromosomes
  • a plasmid a plasmid for mammalian cells can be used (Science, 322: 949-953, 2008).
  • the vector can contain regulatory sequences such as a promoter, an enhancer, a ribosome binding sequence, a terminator, a polyadenylation site, etc., so that a nuclear reprogramming substance can be expressed.
  • Selectable marker sequences such as kanamycin resistance gene, ampicillin resistance gene, puromycin resistance gene, thymidine kinase gene, diphtheria toxin gene, reporter gene sequences such as green fluorescent protein (GFP), ⁇ -glucuronidase (GUS), FLAG, etc.
  • GFP green fluorescent protein
  • GUS ⁇ -glucuronidase
  • FLAG FLAG
  • the above vector has a LoxP sequence before and after the introduction of the gene into a somatic cell in order to excise the gene or promoter encoding the reprogramming factor and the gene encoding the reprogramming factor that binds to it. May be.
  • RNA it may be introduced into somatic cells by techniques such as lipofection and microinjection, and in order to suppress degradation, RNA incorporating 5-methylcytidine and pseudouridine® (TriLink® Biotechnologies) is used. Yes (Warren L, (2010) Cell Stem Cell. 7: 618-630).
  • a culture solution for inducing iPS cells for example, DMEM, DMEM / F12 or DME culture solution containing 10-15% FBS (in addition to these culture solutions, LIF, penicillin / streptomycin, puromycin, L-glutamine) , Non-essential amino acids, ⁇ -mercaptoethanol, etc.) or a commercially available culture medium [eg, culture medium for mouse ES cell culture (TX-WES culture medium, Thrombo X), primate ES cells Culture medium for culture (primate ES / iPS cell culture medium, Reprocell), serum-free medium (mTeSR, Stemcell Technology) are included.
  • a culture medium for mouse ES cell culture TX-WES culture medium, Thrombo X
  • primate ES cells Culture medium for culture (primate ES / iPS cell culture medium, Reprocell), serum-free medium (mTeSR, Stemcell Technology) are included.
  • the somatic cell is brought into contact with the reprogramming factor on DMEM or DMEM / F12 containing 10% FBS for about 4 to 7 days. Then, re-spread the cells on feeder cells (eg, mitomycin C-treated STO cells, SNL cells, etc.), and use bFGF-containing primate ES cell culture medium about 10 days after contact of the somatic cells with the reprogramming factor. Culturing and generating iPS-like colonies about 30 to about 45 days or more after the contact.
  • feeder cells eg, mitomycin C-treated STO cells, SNL cells, etc.
  • 10% FBS-containing DMEM culture medium including LIF, penicillin / streptomycin, etc.
  • feeder cells eg, mitomycin C-treated STO cells, SNL cells, etc.
  • 5% CO 2 at 37 ° C. can be suitably included with puromycin, L-glutamine, non-essential amino acids, ⁇ -mercaptoethanol, etc.
  • somatic cells to be initialized themselves are used (Takahashi K, et al. (2009), PLoS One. 4: e8067 or WO2010 / 137746), or an extracellular matrix (for example, Laminin ( WO2009 / 123349) and Matrigel (BD)) are exemplified.
  • iPS cells may be established under hypoxic conditions (oxygen concentration of 0.1% or more and 15% or less) (Yoshida Y, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5: 237 -241 or WO2010 / 013845).
  • hypoxic conditions oxygen concentration of 0.1% or more and 15% or less
  • the culture medium is exchanged with a fresh culture medium once a day from the second day onward.
  • the number of somatic cells used for nuclear reprogramming is not limited, but ranges from about 5 ⁇ 10 3 to about 5 ⁇ 10 6 cells per 100 cm 2 of culture dish.
  • IPS cells can be selected according to the shape of the formed colonies.
  • a drug resistance gene that is expressed in conjunction with a gene that is expressed when somatic cells are initialized for example, Oct3 / 4, Nanog
  • a culture solution containing the corresponding drug selection The established iPS cells can be selected by culturing with the culture medium.
  • the marker gene is a fluorescent protein gene
  • iPS cells are selected by observing with a fluorescence microscope, in the case of a luminescent enzyme gene, by adding a luminescent substrate, and in the case of a chromogenic enzyme gene, by adding a chromogenic substrate can do.
  • ES cells derived from cloned embryos obtained by nuclear transfer have almost the same characteristics as ES cells derived from fertilized eggs (T. Wakayama et al. (2001), Science, 292: 740). -743; S. Wakayama et al. (2005), Biol. Reprod., 72: 932-936; J. Byrne et al. (2007), Nature, 450: 497-502).
  • an ES cell established from an inner cell mass of a blastocyst derived from a cloned embryo obtained by replacing the nucleus of an unfertilized egg with a nucleus of a somatic cell is an nt ES (nuclear transfer ES) cell.
  • nt ES nuclear transfer ES
  • nuclear transfer technology JB Cibelli et al. (1998), Nature Biotechnol., 16: 642-646) and ES cell production technology (above) is used (Wakayama). Seika et al. (2008), Experimental Medicine, Vol. 26, No. 5 (extra number), pp. 47-52).
  • Nuclear transfer can be initialized by injecting a somatic cell nucleus into a mammal's enucleated unfertilized egg and culturing for several hours.
  • Multilineage-differentiating Stress Enduring cells are pluripotent stem cells produced by the method described in WO2011 / 007900. Specifically, fibroblasts or bone marrow stromal cells are treated with trypsin for a long time. Preferably, it is a pluripotent cell obtained by trypsin treatment for 8 hours or 16 hours and then suspension culture, and is positive for SSEA-3 and CD105.
  • Biopolymer used in the culture substrate of the present invention is selected from the group consisting of gelatin, collagen and cellulose.
  • Gelatin is mainly produced from cow bone, cow skin, and pig skin, but it may be made from fish skin and scales such as salmon, and its origin is not particularly limited. Methods for extracting and purifying gelatin from these raw materials are well known. Commercially available gelatin can also be used.
  • Collagen can be purified from collagen raw material before modification with acid or alkali in the course of gelatin production. There is no particular limitation on the origin of collagen. Commercially available collagen such as those commercially available as a coating substrate for cell culture can also be used. Cellulose can be extracted and purified from plants by a known method, and any cellulose may be used.
  • the molecular weight of the biopolymer is not particularly limited, but if the molecular weight is small, nanofibers may not be formed by electrospinning.
  • 10 kDa or more preferably 20-70 kDa, more preferably 30 It can be appropriately selected within the range of -40 kDa.
  • the method of producing nanofibers from these biopolymers is not particularly limited, and examples include electrospinning, conjugate melt spinning, and meltblowing.
  • a spinning method is preferably used.
  • the biopolymer is first dissolved in an appropriate solvent.
  • any solvent can be used regardless of whether it is an inorganic solvent or an organic solvent as long as it can dissolve gelatin, collagen, and cellulose.
  • acetic acid is used in the production of gelatin nanofibers.
  • formic acid can be preferably used.
  • 1,1,1,2,2,2-hexafluoro-2-propanol can be used.
  • highly polar ionic liquids can be used in the production of cellulose nanofibers.
  • concentration of the biopolymer solution is not particularly limited, but in order to obtain a preferable fiber diameter and uniformity, for example, when using an acetic acid solution of gelatin, 5-15 w / v%, preferably 8-12 w It is desirable to use in the concentration range of / v%.
  • the electrospinning method can be carried out according to a method known per se.
  • the principle of the electrospinning method is to spray the material with electric force to form nano-sized fibers.
  • a biopolymer solution is filled in a syringe, and a syringe pump is connected to a tip provided with a nozzle such as an injection needle to give a flow rate.
  • a collector that collects nanofibers at an appropriate distance from the nozzle (a flat plate or a take-up type can be used.
  • a support described later is placed on a flat collector and the nanofiber is directly placed on the support.
  • a fiber can be formed to form the culture substrate of the present invention), and the positive electrode of the power source is connected to the nozzle side and the negative electrode is connected to the collector side.
  • Nanofibers By turning on the power of the syringe pump and applying a voltage, the biopolymer is jetted onto the collector to form nanofibers.
  • the fiber form and the fiber diameter vary depending on the voltage, the distance from the nozzle to the collector, the inner diameter of the nozzle, etc., but those skilled in the art can appropriately select these to have a desired fiber diameter and be uniform.
  • Nanofibers can be produced. For example, various conditions used in examples described later can be employed, and the conditions described in Non-Patent Documents 4 and 5 described above can be appropriately used.
  • the nanofibers produced as described above may be those having a fiber diameter of 1-1000 nm, preferably 10-800 nm, more preferably 50-500 nm.
  • the produced nanofiber is preferably crosslinked using an appropriate crosslinking agent.
  • the type of the crosslinking agent is not particularly limited, but preferred crosslinking agents include water-soluble carbodiimide (WSC), N-hydroxysuccinimide (NHS) and the like. Two or more kinds of crosslinking agents may be mixed and used.
  • the crosslinking treatment can be performed, for example, by dissolving a crosslinking agent in an appropriate solvent and immersing the nanofibers obtained in the crosslinking agent solution. A person skilled in the art can appropriately set the solution concentration and the crosslinking treatment time according to the type of the crosslinking agent.
  • the cross-linking treatment simultaneously imparts the functional peptide onto the nanofiber substrate. It is also useful in terms.
  • a fiber-on-fiber can be fabricated by applying the nanofibers produced as described above onto a support.
  • the method of coating is not limited as long as the nanofibers are uniformly coated on the support, but a method of generating nanofibers on the support by an electrospinning method that is simple and has wide applicability is preferably used.
  • the support is preferably flexible and strong.
  • the type of the support is not particularly limited, and preferred examples of the support include gauze and sponge. These materials are not particularly limited, but are preferably biocompatible polymers such as cotton, linen, collagen sponge, biological cellulose derivatives, silicone polymers, segmented polyurethanes, etc. It is not limited to.
  • the culture substrate of the present invention (fiber-on-fiber) containing the nanofibers made of biopolymer on the support thus obtained.
  • the fiber base material) is used for culturing various cells including stem cells such as pluripotent stem cells (for example, maintenance amplification culture, differentiation induction culture, dedifferentiation induction culture, etc.). Therefore, the present invention also provides a method for culturing the cells by seeding the cells, preferably stem cells, more preferably pluripotent stem cells on the culture substrate of the present invention, and culturing the cells stationary, preferably A maintenance amplification culture method is provided.
  • the present invention will be described more specifically by taking a method for maintaining and culturing pluripotent stem cells as an example, but when differentiation induction from pluripotent stem cells or other stem cells to various differentiated cells, tissue precursor cells or In the case where tissue stem cells or differentiated cells are dedifferentiated to a more undifferentiated state, or other stem cells, tissue precursor cells or differentiated cells are maintained and amplified, conventional methods are used respectively.
  • tissue stem cells or differentiated cells are dedifferentiated to a more undifferentiated state, or other stem cells, tissue precursor cells or differentiated cells are maintained and amplified.
  • pluripotent stem cells that have been established and adhered and cultured on a matrix such as feeder cells, Matrigel, collagen, etc. are dissociated by enzyme treatment, and preferably a ROCK inhibitor (for example, Y- 27632 and the like can be used in the same manner as described above as a culture medium for pluripotent stem cells in I.
  • a serum-free medium more preferably a pluripotent culture
  • a stem cell is a medium that does not contain a protein derived from a different animal (Xeno-free), more preferably a medium that does not contain a protein such as serum albumin or bFGF is used, and is suspended in a culture vessel (eg, a dish).
  • the culture substrate Prior to seeding of pluripotent stem cells, the culture substrate is preferably impregnated with a medium having the same composition as the above medium (no ROCK inhibitor is required) and pre-incubated under the same conditions as in the main culture. .
  • the medium is preferably removed from the culture vessel, replaced with a fresh medium (preferably containing a ROCK inhibitor), and cultured for 1 day.
  • a fresh medium preferably containing a ROCK inhibitor
  • the culture is performed, for example, in a CO 2 incubator under an atmosphere having a CO 2 concentration of about 1 to about 10%, preferably about 2 to about 5%, at about 30 to about 40 ° C., preferably about 37 ° C. It is desirable to replace the medium with no ROCK inhibitor the next day, and thereafter replace with a fresh medium every 1-2 days.
  • the culture is performed for 1-7 days, preferably 3-6 days, more preferably 4-5 days.
  • the present invention also dissociates cells (eg, stem cells such as pluripotent stem cells) from a substrate using a dissociation solution that does not contain an enzyme, and reseeds the cells on the culture substrate of the present invention.
  • a method for culturing the cell for example, a maintenance amplification method
  • Human pluripotent stem cells may be subcultured as a cell mass of a certain size because there is a problem that cell death tends to occur when they are made into single cells by the conventional subculture method.
  • a culture substrate When a culture substrate is used, cells can be easily dissociated from the substrate using a dissociation solution that does not contain an enzyme, and can be dispersed to a single cell by a slight pipetting operation.
  • the form of the base material is maintained, so that it becomes easier to separate the base material and the cells.
  • a dissociation solution conventionally used in mechanically dissociating cells can be used in the same manner, and examples thereof include Hank's solution and a solution in which citric acid and EDTA are combined. It is done.
  • a notable point of the present invention is that when human pluripotent stem cells are dispersed into single cells, the rate of cell death is significantly suppressed in single-cell pluripotent stem cells. It is done. This is because a more uniform cell population of human pluripotent stem cells can be prepared. Therefore, the present invention also suppresses cell death by dispersing pluripotent stem cells into single cells without performing enzyme treatment at the time of subculture using the culture substrate of the present invention.
  • a method for maintaining and amplifying pluripotent stem cells is provided. In order to disperse the cells dissociated from the substrate into single cells, it is only necessary to gently pipette the cells about 10 times in a medium containing a ROCK inhibitor.
  • Stem cells are expected to be applied to transplantation medicine and the like. Therefore, in order to enable safe transplantation, it is necessary to avoid contamination of viruses and other contaminants harmful to the human body as much as possible. Therefore, particularly in the maintenance amplification culture of human stem cells, it is desired to use a serum-free medium, more preferably a xeno-free medium containing no xenogeneic component, and more preferably a protein-free medium. If subculture is continued using the culture substrate of the present invention, a growth efficiency comparable to that of a serum-containing medium or the like can be obtained in any of these media.
  • examples of serum-free medium include mTeSR medium containing recombinant animal protein
  • examples of xeno-free medium include TeSR2 medium containing human serum albumin and human bFGF as examples of protein-free medium.
  • E8 medium respectively.
  • the pluripotent stem cells dissociated from the culture substrate of the present invention are subcultured from the adherent culture using the feeder cells and the like according to the present invention.
  • the cell density is about 0.5 ⁇ 10 4 to about 10 ⁇ 10 4 cells / cm 2 , preferably about 2 ⁇ 10 4 to about 6 ⁇ 10 4 cells / cm 2. Sow on a new culture substrate.
  • this culture substrate is also impregnated with a medium having the same composition as the main culture (ROCK inhibitor is not required) prior to seeding with pluripotent stem cells, and preincubated under the same conditions as in the main culture. It is desirable to keep it.
  • the medium is preferably removed from the culture vessel, replaced with a fresh medium (preferably containing a ROCK inhibitor), and cultured for 1 day.
  • a fresh medium preferably containing a ROCK inhibitor
  • the culture is performed, for example, in a CO 2 incubator under an atmosphere having a CO 2 concentration of about 1 to about 10%, preferably about 2 to about 5%, at about 30 to about 40 ° C., preferably about 37 ° C. It is desirable to replace the medium with no ROCK inhibitor the next day, and thereafter replace with a fresh medium every 1-2 days.
  • the culture is performed for 1-7 days, preferably 3-6 days, more preferably 4-5 days.
  • pluripotent stem cells By repeatedly performing the above operation, pluripotent stem cells can be maintained and amplified with extremely good proliferation efficiency in a state where pluripotency and normal traits are maintained over a long period of time. In this way, it is possible to stably amplify high-quality pluripotent stem cells in large quantities, and supply a sufficient amount of pluripotent stem cells as a source of differentiated cells for cell transplantation therapy and drug screening Can do.
  • the cells cultured on the fiber-on-fiber substrate can be cryopreserved by inserting the substrate together with the substrate.
  • the container only needs to be suitable for freezing, and is not limited in capacity, shape (tube, bag, ampoule, vial, etc.). A person skilled in the art can appropriately select a suitable container. Moreover, those skilled in the art can change the shape of the substrate after culturing with tweezers and insert it into the container.
  • a cell freezing solution can be added as needed by those skilled in the art.
  • the solution may be any solution that can protect cells under freezing.
  • commercial products such as mFreSR (Veritas), cryopreservation solution for primate ES cells (Reprocell), CRYO-GOLD Human ESC / iPSC Cryopreservation Medium (System Bioscience), Cell Banker 3 (Juji Field), etc. You can also
  • Example 1 Preparation of gelatin nanofiber (1) Material gelatin solution / gelatin (SIGMA G2625 MW: 30 kDa; Nippi Nippi High Grade Gelatin AP MW: 8 kDa) ⁇ Glacial acetic acid (AA; SIGMA P-338826) ⁇ Anhydrous ethyl acetate (EA; SIGMA P270989) Cross-linking buffer / water-soluble carbodiimide (WSC; DOJINDO Catalog 344-03633) ⁇ N-hydroxysuccinimide (NHS; SIGMA Catalog56480) ⁇ 99.5% ethanol (Wako) Gauze BEMCOT (registered trademark) S-2 (Asahi Kasei) Culture cover glass 25mm ⁇ and 32mm ⁇ Silicon wafer high-voltage power supply (TECHDEMPAZ Japan) Vacuum pump
  • gelatin nanofibers to the support by electrospinning method
  • the gelatin solutions of various concentrations prepared as described above are put into a syringe equipped with a 23G blunt needle (Nipro), air bubbles are removed, and then the microsyringe pump is used.
  • the flow rate was set at 0.2 mL / h.
  • Two culture cover glasses were placed side by side in the center of the silicon wafer, and part of both ends of the glass was fixed with cello tape.
  • the silicon wafer was fixed vertically in a vise and placed at a distance of about 10 cm from the needle of the syringe set in the micro syringe pump.
  • Gelatin nanofibers (fiber-on-fiber or control nanofiber) dried with a cross-linking desiccator were immersed in a cross-linking buffer in an amount sufficient to immerse the surface for 4 hours.
  • the nanofibers were taken out and washed by immersing them in 99.5% ethanol for 5 to 10 minutes (this operation was repeated twice).
  • the nanofibers were air-dried on a petri dish laid with Kimwipe, and then placed in a desiccator and allowed to dry overnight.
  • Example 2 Method for Passing Human Pluripotent Stem Cells onto Fiber-on-Fiber
  • Material mTeSR 1 STEM CELL Veritas ST-05850 Y-27632 Wako 257-00511 (1 mg) 255-200513 (5 mg) Cell Dissociation Buffer enzyme-free, Hanks'-based GIBCO 13150-016 TrypLE Express GIBCO 12605-010 Human embryonic stem cells: H9, H1 Human induced pluripotent stem cells: 253G1
  • Fiber-on-fiber prepared by spraying gelatin nanofibers with a diameter of 300nm ⁇ 100nm onto cotton gauze (BEMCOT (registered trademark) S-2) was set in a 35 mm dish (6-well plate). Then, it was washed 3 times with 1 mL of 99.5% ethanol and sterilized. The third time, it was carefully aspirated and dried in a clean bench. Fiber on fiber was immersed in the medium and incubated at 37 ° C. 2 mL of mTeSR 1 was placed in a 35-mm dish.
  • BEMCOT registered trademark
  • the mixture was centrifuged at 1000 rpm for 3 minutes, the supernatant was removed by aspiration, and resuspended to the required cell concentration with mTeSR 1 (+ Y27632).
  • the medium on the fiber-on-fiber that had been pretreated was removed by suction, and 1 to 1.5 mL (cell density was 2 ⁇ 10 5 to 3 ⁇ 10 5 cells / sample) was seeded on the fiber-on-fiber.
  • the medium was replaced with 2 mL of mTeSR 1 (+ Y27632). From the second day, the medium was cultured with mTeSR 1 not containing Y-27632, and the medium was changed every day.
  • FIG. 1 shows a scanning electron micrograph of the fiber on fiber obtained by the above-described method. It was found that gelatin nanofibers were reticulated between cotton gauze fibers. In the subsequent experiments, the fiber-on-fiber was used.
  • the shape of the fiber-on-fiber can be freely changed by picking up the fiber-on-fiber with tweezers etc. at any timing during culture, after culture, and after staining. It was possible. That is, it was shown that fiber-on-fiber can culture human pluripotent stem cells while maintaining a flexible shape.
  • pluripotent stem cell marker (SSEA4) and differentiation marker (SSEA1) in cells after subculturing human ES cells (H1, H9) and human iPS cells (253G1) more than 20 times on fiber-on-fiber The expression of was analyzed using flow cytometry. The results are shown in FIG. It was confirmed that 98.4% (H1), 98.6% (H9) and 96.3% (253G1) cells strongly expressed SSEA4. On the other hand, in any pluripotent stem cell, almost no cells expressing SSEA1 were confirmed.
  • FIG. 16 shows the results of staining with fluorescently labeled antibodies (anti-tubulin III antibody, anti- ⁇ -SMA antibody, and anti-SOX17 antibody, respectively) for detection markers of ectoderm, mesoderm, and endoderm. It has been confirmed that human pluripotent stem cells can be differentiated into ectoderm, mesoderm and endoderm even after being passaged and cultured more than 10 times on fiber-on-fiber (human ES cells). (H9, FIG. 16A), human ES cells (H1, FIG. 16B)).
  • Example 3 Cryopreservation of human pluripotent stem cells cultured on fiber-on-fiber
  • Sexual stem cells were inserted into a tube in a different shape using tweezers and frozen (FIG. 18).
  • the morphology of the cells before freezing and 4 days after thawing is shown in FIG. It was confirmed that the cells formed colonies even after freezing and thawing.
  • Example 4 Mass culture of human ES cells using fiber-on-fiber
  • a gas-permeable cell culture bag manufactured by Nipro; FIG. 23A
  • mTeSR-1 culture solution 55 mL of mTeSR-1 culture solution
  • H1 mTeSR-1 culture solution
  • 1.2 ⁇ 10 6 cells were encapsulated and cultured at 5% CO 2 and 37 ° C. for 7 days.
  • the medium was changed twice during the culture period.
  • SSEA4 pluripotent stem cell marker
  • SSEA1 differentiation marker
  • the production rate of the present invention reaches 10 times every 5 days. This efficiency rate is much superior to that of about 5 times that in the previously reported dispersed culture of human pluripotent stem cells. Compared with conventional manual adhesion culture methods (about 4 times every 4 days, or about 3 times every 3 days) at the laboratory level, the growth rate is also excellent.
  • the fiber-on-fiber method developed this time is a method that can increase the number of cells per unit volume in the medium by culturing in 3D cells. Practical mass culture of human pluripotent stem cells The road to Furthermore, since a polymer having high biocompatibility is used as the support, application to cell transplantation therapy can be pioneered.

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Abstract

　本発明は、支持体上に、ゼラチン、コラーゲン及びセルロースからなる群より選択される生体高分子からなるナノファイバーを含有してなる、細胞の培養用基材、該基材を含む細胞凍結剤、該基材上に細胞を播種し、該細胞を静置培養することを含む、細胞の培養方法、酵素を含まない解離液を用いて基材から細胞を解離させ、該細胞を別の上記培養基材上に播種し、該細胞をさらに静置培養することを含む、前記方法、特に、継代時に、細胞を単一細胞にまで分散させることを含む、方法、該細胞凍結剤を用いて、多能性幹細胞を凍結保存する方法等を提供する。

Description

ファイバー・オン・ファイバーを用いた細胞の３次元培養方法及びそのための基材
　本発明は、細胞、例えば、胚性幹細胞（ES細胞）や人工多能性幹細胞（iPS細胞）などの多能性幹細胞をはじめとする幹細胞、特にヒト多能性幹細胞の培養に適した培養基材、並びにそれを用いた幹細胞の培養方法等に関する。より詳細には、本発明は、ゼラチン、コラーゲン、セルロース等の生体高分子からなるナノファイバー（バイオナノファイバー）をガーゼやスポンジ等の支持体上に塗布した細胞の培養用基材、当該培養用基材を含む細胞凍結剤、並びに当該培養用基材を用いて、継代時、酵素処理を行うことなく単一細胞にまで分散させることによる、細胞の維持増幅方法、細胞凍結方法等に関する。
　ヒト多能性幹細胞は適切な条件下において無制限に増殖が可能であり、また生体組織のどの細胞にも分化できる性質（多分化能）を持つことから、細胞移植治療・創薬スクリーニング・再生医療など様々な分野への応用が期待されている。しかし、従来のヒト多能性幹細胞の培養法では、フィーダー細胞や各種高分子などを細胞培養基材として用いてきたが、これらの方法は準備操作が煩雑である上に品質が安定していないため、安定したヒト多能性幹細胞の培養・供給は困難であった。特に、ヒト多能性幹細胞の高品質・大量・全自動培養法の開発には、より安定・安価な方法が必要であるが、未だにそのような方法は確立されていない。
　従来行われてきた培養皿を用いる2次元培養では、培養皿が100枚単位で必要であること、個々の培養皿から継代操作が必要であること等の事情から、ヒト多能性幹細胞の高品質・大量・全自動培養法の開発には不向きである。そこで、限られたスペースでの多能性幹細胞の大量培養を可能にするためには、3次元培養化が必須となっている。これまで、浮遊培養やマイクロビーズなどを用いた培養法が開発されてきたが（非特許文献１、２）、細胞塊の凝集や撹拌による細胞表面でのずり応力などが問題となっており、実用化には至っていない。
　近年、フィーダー細胞を用いない新規ヒト多能性幹細胞培養法の開発が盛んに行われている。現在、広く使用されている細胞培養基材としては、マトリゲルや組換えタンパク質（非特許文献３）等が挙げられるが、これらの材料はコストが高く、また、ロット間による品質の差が大きいなど安定性に欠けている。
　このような条件で培養されたヒト多能性幹細胞は不安定な状態になり、その結果、細胞増殖速度の異常、非常に不均一な細胞群への変質、分化能の損失、核型の変異等の異常を引き起こしてしまう。
　これに代わるものとして、ポリマーなどの高分子を用いた細胞培養基材の開発も報告され（非特許文献４、５）、製品化されるようになってきたが、安定した製品は得られるものの、非常に高価であり、また細胞株によっては適さない場合もあるなど、安定・安価な細胞培養基材を作製するには至っていない。
　細胞培養基材は、目的の細胞群に必要な酸素と栄養を供給し、しかも安定的な形状を保持することが条件であるが、近年ナノファイバーが注目されている。ナノファイバーは、繊維径がナノメートルのオーダーの極細繊維であり、ナノファイバーからなる構造体は細胞外マトリクスと近似したサイズであり、比表面積の増大により細胞接着性が向上する、3次元培養が可能となる等の利点があることから、合成ポリマー（非特許文献６）や、合成ポリマーとコラーゲンやゼラチン等の生体高分子との混合物（非特許文献６、７）からなるナノファイバーが作製されているが、フィーダー細胞を用いない培養系では、ヒトES細胞を維持増殖することができないと報告されている（非特許文献７）。
　一方、生体高分子のみからなるナノファイバーを多能性幹細胞の培養基材として用いたという報告は皆無である。
　加えて、従来、ヒト多能性幹細胞の継代には、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、トリプシン、等の酵素を用いた手法か、セルストレイナーやピペッティング等による機械的継代方法が行われてきたが、酵素を用いた手法では、酵素反応による細胞へのダメージがあり、また細胞に対する酵素反応が不均一である。しかも、単一細胞まで分散させると細胞が死滅してしまうといった問題点がある。一方、機械的な継代方法は、細胞のダメージが非常に大きく、問題点が多い。
Tissue Eng Part C Methods., 16(4), 573-582 (2010) Curr Protoc Stem Cell Biol Chapter 1, Unit 1C 11 (2010) Nataure Biotechnology, 28(6): 581-583 (2010) Nataure Biotechnology, 28(6): 606-610 (2010) Nataure Biotechnology, 28(6): 611-615 (2010) Advanced Drug Delivery Reviews, 61(12): 1084-1096 (2009) Journal of Cellular and Molecular Medicine, 13(9B): 3475-3484 (2009)
　本発明の目的は、ヒト多能性幹細胞を安定して大量に供給することができる、安価な新規培養基材を提供し、それを用いた安価かつ簡便なヒト多能性幹細胞の培養方法を提供することである。また、本発明の別の目的は、継代時に酵素処理を必要とせず、かつ単一細胞に分散させても細胞が死滅しないような、ヒト多能性幹細胞の培養用基材を提供し、もって、より均一なヒト多能性幹細胞の培養物を提供することである。さらに、本発明の別の目的は、当該培養基材を含む細胞凍結剤、及び細胞凍結方法も提供することである。
　本発明者らは、ヒト多能性幹細胞の培養用基材として、生体適合性が高く安価な生体材料を用いることに着目し、エレクトロスピニング法を用いて、生体材料をナノファイバー化することを考案していた。そこで、上記の目的を達成すべく、当該ナノファイバーの物理的な強度をさらに高めるために、ガーゼやスポンジ等の支持体に、当該ナノファイバーを塗布することを試みた。そして、得られた培養用基材を「ファイバー・オン・ファイバー」と命名した。
　ファイバー・オン・ファイバーはその形状をフレキシブルに変えることができるため、折り畳んで使用することができる。そこで、本発明者らは、単一細胞にまで分散させたヒトES細胞又はヒトiPS細胞の懸濁液を4枚のファイバー・オン・ファイバー上に載せ、折り畳んでES細胞用培地中で培養した。その結果、このファイバー・オン・ファイバー基材上で培養したヒト多能性幹細胞は、マトリゲルでコーティングしたディッシュ上での培養と比べて約2倍増の細胞数を示し、マトリゲル上で培養した細胞に比べて細胞密度がより高かった。加えて、ガーゼやスポンジ等はガラス・プラスチック基材等と比べて多孔性であるため、培養液に当該ファイバー・オン・ファイバーを浸漬すると、培養液が自然に浸透することで細胞への培養液の供給も改善された。
　このファイバー・オン・ファイバーは形状がフレキシブルであるため、容器を選ぶ必要がなく、細胞に栄養が届く条件であれば任意の容器で培養が可能であること、すなわち、多能性幹細胞等の幹細胞をはじめとする所望の細胞を大量かつ容易に培養することができることが明らかとなった。さらに本発明者らは、このファイバー・オン・ファイバー基材を用いて長期継代培養しても、多能性幹細胞が多能性及び正常な核型を維持していることを確認した。しかも、ファイバー・オン・ファイバー基材を用いて凍結・解凍操作を行っても、多能性幹細胞がコロニーを形成し、細胞生存率が高いことも見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下の通りのものである。
[1] 支持体上に、ゼラチン、コラーゲン及びセルロースからなる群より選択される生体高分子からなるナノファイバーを含有してなる、細胞の培養用基材。
[2] 該ナノファイバーが架橋処理されている、上記[1]記載の基材。
[3] 生体高分子がゼラチン又はコラーゲンである、上記[1]又は[2]記載の基材。
[4] 生体高分子がゼラチンである、上記[1]又は[2]記載の基材。
[5] ナノファイバーがエレクトロスピニング法により得られる、上記[1]～[4]のいずれかに記載の基材。
[6] 支持体が、ガーゼ及びスポンジからなる群より選択される上記[1]～[5]のいずれかに記載の基材。
[7] 細胞が幹細胞である、上記[1]～[6]のいずれかに記載の基材。
[8] 幹細胞が多能性幹細胞である、上記[7]記載の基材。
[9] 多能性幹細胞がES細胞又はiPS細胞である、上記[8]記載の基材。
[10] 多能性幹細胞がヒト由来である、上記[8]又は[9]記載の基材。
[11] 培養が細胞の維持増幅培養である、上記[1]～[10]のいずれかに記載の基材。
[12] 上記[1]～[6]のいずれかに記載の基材を含む、細胞凍結剤。
[13] 上記[1]～[6]のいずれかに記載の基材上に細胞を播種し、該細胞を静置培養することを特徴とする、細胞の培養方法。
[14] 酵素を含まない解離液を用いて基材から細胞を解離させ、該細胞を上記[1]～[6]のいずれかに記載の基材上に播種し、該細胞をさらに静置培養することを特徴とする、上記[13]記載の方法。
[15] 継代時に、細胞を単一細胞にまで分散させることを特徴とする、上記[14]記載の方法。
[16] 細胞を無血清培地で培養することを特徴とする、上記[13]～[15]のいずれかに記載の方法。
[17] 無血清培地がxenoフリー培地である、上記[16]記載の方法。
[18] 無血清培地がタンパク質不含培地である、上記[16]記載の方法。
[19] 細胞が幹細胞である、上記[13]～[18]のいずれかに記載の方法。
[20] 幹細胞が多能性幹細胞である、上記[19]記載の方法。
[21] 多能性幹細胞がES細胞又はiPS細胞である、上記[20]記載の方法。
[22] 多能性幹細胞がヒト由来である、上記[20]又は[21]記載の方法。
[23] 培養が細胞の維持増幅培養である、上記[13]～[22]のいずれかに記載の方法。
[24] [12]に記載の凍結剤を用いて細胞を凍結保存する方法。
　本発明の培養基材は、物理的な強度が高い上に形状がフレキシブルであるので、3次元培養が可能となり、省スペース化を実現しつつ細胞の大量供給が可能となる。また、本発明の培養基材は生体適合性が高く安価であるので、安定供給が容易となる。さらに、本発明の培養基材は容易に形状を変化させることができるので、容器を選ばず凍結保存することができる。
　また、本発明の培養基材を用いると、培養液の浸漬により培養液が浸透するため、細胞への培養液の容易な供給が可能となる。
コットンガーゼ上にナノファイバーを塗布して得られたファイバー・オン・ファイバーの電顕写真（左）、コットンガーゼの電顕写真（右）である。 ファイバー・オン・ファイバーを培養液に浸漬し、その上にヒトES細胞（H9）を播いた際の写真である。 ファイバー・オン・ファイバー上で5日間培養したヒトES細胞（H9）の電顕写真である。 ファイバー・オン・ファイバー上で培養したヒトES細胞（H9）を多能性幹細胞マーカーであるアルカリフォスファターゼ染色した写真である。 アルカリフォスファターゼ染色されたヒトES細胞（H9）の顕微鏡写真である。 コットンガーゼ上にヒトES細胞（H9）を培養し、その後アルカリフォスファターゼ染色を行った対照試験の写真である。 ファイバー・オン・ファイバー上で培養したヒトES細胞（H9）における多能性幹細胞マーカー（SSEA4）の発現を示すフローサイトメトリーの結果を示す図である。 ファイバー・オン・ファイバー上で培養したヒトES細胞（H9）における多能性幹細胞マーカーの発現を示す免疫細胞染色写真である。 35-mmディッシュ中で、1枚又は4枚のファイバー・オン・ファイバーを折り畳むことで3次元培養化を行った写真である。 1枚又は4枚のファイバー・オン・ファイバー上にヒトES細胞（H9）を播いてこれらを折り畳み、3次元培養化を行った後の細胞数を示す図である。 32枚のファイバー・オン・ファイバーを折り畳み、ヒト多能性幹細胞を大量培養（100 mL）する際の写真である。 ファイバー・オン・ファイバー上で10回継代培養したヒトES細胞（H9）のアルカリフォスファターゼ染色写真である。 ファイバー・オン・ファイバー上で10回継代培養したヒトES細胞（H9）の多能性幹細胞マーカーの発現を示すフローサイトメトリーの結果を示す図である。 ファイバー・オン・ファイバー上で20回以上継代培養したヒトES細胞（H1、H9）及びヒトiPS細胞（253G1）の多能性幹細胞マーカー（SSEA4）及び分化マーカー（SSEA1）の発現を示すフローサイトメトリーの結果を示す図である。 ファイバー・オン・ファイバー上で長期間（10回以上継代）培養したヒトES細胞（H9）及びヒトiPS細胞（253G1）の核型解析の結果を示す図である。 Ａ．ファイバー・オン・ファイバー上で培養したヒトES細胞（H9）が、外胚葉（左）、中胚葉（中央）、内胚葉（右）全ての胚葉に分化可能であることを示す図である。上段は、それぞれの胚葉の検出マーカーに対する蛍光標識抗体（左から順に、抗チューブリンIII抗体、抗α-SMA抗体、抗SOX17抗体）で染色した顕微鏡写真を、下段はDAPI染色した細胞の顕微鏡写真を示す。Ｂ．ファイバー・オン・ファイバー上で10回以上継代培養したヒトES細胞（H1）が、中胚葉（左）、外胚葉（中央）、内胚葉（右）全ての胚葉に分化可能であることを示す図である。左から順に、抗α-SMA抗体、抗チューブリンIII抗体、抗SOX17抗体で免疫染色（核をDAPIで二重染色）した顕微鏡写真を示す。 ファイバー・オン・ファイバー上で10回以上継代培養したヒトES細胞（H1、H9）及びヒトiPS細胞（253G1）におけるテラトーマ形成能を示す図である。神経上皮（外胚葉）、軟骨（中胚葉）及び内肺葉（腸管様上皮）の三胚葉系列すべてに分化することが確認された。 ファイバー・オン・ファイバー上で培養したヒトES細胞（H9）をピンセットで形を変え、チューブに挿入する際の写真である。 ファイバー・オン・ファイバー上で培養したヒトES細胞（H9）の凍結前（左）、解凍4日後（右）の細胞の電顕写真である。 ファイバー・オン・ファイバー上で培養したヒトES細胞（H1）を、凍結・解凍した後の細胞における多能性幹細胞マーカーの発現を示すフローサイトメトリーの結果を示す図である。 ファイバー・オン・ファイバー上で培養したヒトES細胞（H1）を、凍結・解凍した後の細胞をアルカリフォスファターゼ染色した写真である。 ファイバー・オン・ファイバー上で培養したヒトES細胞（H1）を凍結保存液に入れ、凍結・解凍した後の細胞生存率を示す図である。 Ａ．ファイバー・オン・ファイバーを培養基質として用いたヒト多能性幹細胞の大量培養装置の写真である。Ｂ．Ａの装置で大量培養したヒトES細胞（H1）の多能性幹細胞マーカー（SSEA4）及び分化マーカー（SSEA1）の発現を示すフローサイトメトリーの結果を示す図である。
　本発明は、ゼラチン、コラーゲン及びセルロースからなる群より選択される生体高分子からなるナノファイバーを含有してなる、細胞の培養用基材（以下、本発明の培養基材と略記する場合がある）を提供する。
　本発明の培養基材が適用可能な細胞は特に制限されず、静置培養が可能な任意の細胞（例えば、リンパ球、上皮細胞、内皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞（皮膚細胞等）、毛細胞、肝細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞(膵外分泌細胞等)、脳細胞、肺細胞、腎細胞、脂肪細胞等の分化した細胞、未分化な組織前駆細胞や幹細胞など）に用いることが可能である。
　好ましい一実施態様においては幹細胞が挙げられる。幹細胞は、自己複製能と別の種類の（幹細胞以外の）細胞に分化する能力を有するものであれば特に制限されず、三胚葉系列すべてに分化し得る多能性幹細胞、一般に胚葉を超えた分化は行えないが多様な細胞腫に分化可能な多分化能を有する幹細胞、分化可能な細胞腫が一種類に限定されている単能性幹細胞のいずれにも適用できる。
　多能性幹細胞は、未分化状態を保持したまま増殖できる「自己再生能」と三胚葉系列すべてに分化できる「分化多能性」とを有する未分化細胞であれば特に制限されず、例えば、ES細胞、iPS細胞の他、始原生殖細胞に由来する胚性生殖（EG）細胞、精巣組織からのGS細胞の樹立培養過程で単離されるmultipotent germline stem（mGS）細胞、骨髄から単離されるmultipotent adult progenitor cell（MAPC）、培養線維芽細胞や骨髄幹細胞由来の多能性細胞（Muse細胞）等が挙げられる。ES細胞は体細胞から核初期化されて生じた核移植ES（ntES）細胞であってもよい。好ましくはES細胞またはiPS細胞である。
　多分化能を有する幹細胞としては、例えば、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、皮膚幹細胞等が挙げられるが、これらに限定されない。また、単能性幹細胞としては、例えば、筋幹細胞、生殖幹細胞、歯髄幹細胞等が挙げられるが、これらに限定されない。
　本発明の方法により培養される細胞が、分化細胞、組織前駆細胞、多分化能を有する幹細胞、あるいは単能性幹細胞である場合、これらの細胞は自体公知の方法により、それらが存在する任意の哺乳動物の組織から単離することができる。単離された細胞は、初代培養細胞としてそのまま適用することもできるし、あるいは自体公知の方法により維持培養した後で適用することができる。また、これらの培養細胞を不死化して得られる種々の細胞株を用いることもできる。
　一方、細胞が多能性幹細胞の場合、本発明の方法は、いずれかの多能性幹細胞が樹立されているか、樹立可能である、任意の哺乳動物において適用することができ、例えば、ヒト、マウス、サル、ブタ、ラット、イヌ等が挙げられるが、好ましくはヒトまたはマウス、より好ましくはヒトである。以下に種々の多能性幹細胞の調製方法について具体的に説明するが、他の公知の手法も制限なく使用することができる。
I. 多能性幹細胞の調製
　ES細胞は、対象動物の受精卵の胚盤胞から内部細胞塊を取出し、内部細胞塊を線維芽細胞のフィーダー上で培養することによって樹立することができる。また、継代培養による細胞の維持は、白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor (LIF))、塩基性線維芽細胞成長因子(basic fibroblast growth factor (bFGF))などの物質を添加した培養液を用いて行うことができる。ヒトおよびサルのES細胞の樹立と維持の方法については、例えばUS5,843,780; Thomson JA, et al. (1995), Proc Natl. Acad. Sci. U S A. 92:7844-7848；Thomson JA, et al. (1998), Science. 282:1145-1147；H. Suemori et al. (2006), Biochem. Biophys. Res. Commun., 345:926-932；M. Ueno et al. (2006), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:9554-9559；H. Suemori et al. (2001), Dev. Dyn., 222:273-279;H. Kawasaki et al. (2002), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:1580-1585；Klimanskaya I, et al. (2006), Nature. 444:481-485などに記載されている。
　ES細胞作製のための培養液として、例えば0.1 mM 2-メルカプトエタノール、0.1 mM 非必須アミノ酸、2 mM L-グルタミン酸、20% KSRおよび4 ng/mL bFGFを補充したDMEM/F-12培養液(もしくは、合成培地：mTeSR、Stem Proなど)を使用し、37℃、2% CO2/98% 空気の湿潤雰囲気下でヒトES細胞を維持することができる(O. Fumitaka et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26:215-224)。また、ES細胞は、3～4日おきに継代する必要があり、このとき、継代は、例えば1 mM CaCl2および20% KSRを含有するPBS中の0.25% トリプシンおよび0.1 mg/mLコラゲナーゼIVを用いて行うことができる。
　ES細胞の選択は、一般に、アルカリホスファターゼ、Oct-3/4、Nanogなどの遺伝子マーカーの発現を指標にしてReal-Time PCR法で行うことができる。特に、ヒトES細胞の選択では、OCT-3/4、NANOG、ECADなどの遺伝子マーカーの発現を指標とすることができる(E. Kroon et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26:443-452)。
　ヒトES細胞株は、例えばWA01(H1)およびWA09(H9)は、WiCell Reserch Instituteから、KhES-1、KhES-2およびKhES-3は、京都大学再生医科学研究所(京都、日本)から入手可能である。
　精子幹細胞は、精巣由来の多能性幹細胞であり、精子形成のための起源となる細胞である。この細胞は、ES細胞と同様に、種々の系列の細胞に分化誘導可能であり、例えばマウス胚盤胞に移植するとキメラマウスを作出できるなどの性質をもつ(M. Kanatsu-Shinohara et al. (2003) Biol. Reprod., 69:612-616; K. Shinohara et al. (2004), Cell, 119:1001-1012)。神経膠細胞系由来神経栄養因子(glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF))を含む培養液で自己複製可能であるし、またES細胞と同様の培養条件下で継代を繰り返すことによって、精子幹細胞を得ることができる（竹林正則ら(2008),実験医学,26巻,5号(増刊),41～46頁,羊土社(東京、日本)）。
　胚性生殖細胞は、胎生期の始原生殖細胞から樹立される、ES細胞と同様な多能性をもつ細胞であり、LIF、bFGF、幹細胞因子(stem cell factor)などの物質の存在下で始原生殖細胞を培養することによって樹立し得る(Y. Matsui et al. (1992), Cell, 70:841-847; J.L. Resnick et al. (1992), Nature, 359:550-551)。
　人工多能性幹(iPS)細胞は、特定の初期化因子を、DNA又はタンパク質の形態で体細胞に導入することによって作製することができる、ES細胞とほぼ同等の特性、例えば分化多能性と自己複製による増殖能、を有する体細胞由来の人工の幹細胞である（K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126:663-676; K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131:861-872; J. Yu et al. (2007), Science, 318:1917-1920; Nakagawa, M.ら,Nat. Biotechnol. 26:101-106 (2008)； WO 2007/069666）。初期化因子は、ES細胞に特異的に発現している遺伝子、その遺伝子産物もしくはnon-coding RNAまたはES細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子、その遺伝子産物もしくはnon-coding RNA、あるいは低分子化合物によって構成されてもよい。初期化因子に含まれる遺伝子として、例えば、Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、beta-catenin、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3またはGlis1等が例示され、これらの初期化因子は、単独で用いても良く、組み合わせて用いても良い。初期化因子の組み合わせとしては、WO2007/069666、WO2008/118820、WO2009/007852、WO2009/032194、WO2009/058413、WO2009/057831、WO2009/075119、WO2009/079007、WO2009/091659、WO2009/101084、WO2009/101407、WO2009/102983、WO2009/114949、WO2009/117439、WO2009/126250、WO2009/126251、WO2009/126655、WO2009/157593、WO2010/009015、WO2010/033906、WO2010/033920、WO2010/042800、WO2010/050626、WO2010/056831、WO2010/068955、WO2010/098419、WO2010/102267、WO2010/111409、WO2010/111422、WO2010/115050、WO2010/124290、WO2010/147395、WO2010/147612、Huangfu D,et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26: 795-797、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 2: 525-528、Eminli S, et al. (2008), Stem Cells. 26:2467-2474、Huangfu D, et al. (2008), Nat Biotechnol. 26:1269-1275、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3, 568-574、Zhao Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3:475-479、Marson A, (2008), Cell Stem Cell, 3, 132-135、Feng B, et al. (2009), Nat Cell Biol. 11:197-203、R.L. Judson et al., (2009), Nat. Biotech., 27:459-461、Lyssiotis CA, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:8912-8917、Kim JB, et al. (2009), Nature. 461:649-643、Ichida JK, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:491-503、Heng JC, et al. (2010), Cell Stem Cell. 6:167-174、Han J, et al. (2010), Nature. 463:1096-1100、Mali P, et al. (2010), Stem Cells. 28:713-720、Maekawa M, et al. (2011), Nature. 474:225-229に記載の組み合わせが例示される。
　上記初期化因子には、ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）阻害剤［例えば、バルプロ酸 (VPA)、トリコスタチンA、酪酸ナトリウム、MC 1293、M344等の低分子阻害剤、HDACに対するsiRNAおよびshRNA（例、HDAC1 siRNA Smartpool（登録商標） (Millipore)、HuSH 29 mer shRNA Constructs against HDAC1 (OriGene)等）等の核酸性発現阻害剤など］、MEK阻害剤（例えば、PD184352、PD98059、U0126、SL327およびPD0325901）、Glycogen synthase kinase-3阻害剤（例えば、BioおよびCHIR99021）、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害
剤（例えば、5-azacytidine）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、BIX-01294 等の低分子阻害剤、Suv39hl、Suv39h2、SetDBlおよびG9aに対するsiRNAおよびshRNA等の核酸性発現阻害剤など）、L-channel calcium agonist （例えばBayk8644）、酪酸、TGFβ阻害剤またはALK5阻害剤（例えば、LY364947、SB431542、616453およびA-83-01）、p53阻害剤（例えばp53に対するsiRNAおよびshRNA）、ARID3A阻害剤（例えば、ARID3Aに対するsiRNAおよびshRNA）、miR-291-3p、miR-294、miR-295およびmir-302などのmiRNA、Wnt Signaling（例えば、soluble Wnt3a）、神経ペプチドY、プロスタグランジン類（例えば、プロスタグランジンE2およびプロスタグランジンJ2）、hTERT、SV40LT、UTF1、IRX6、GLISl、PITX2、DMRTBl等の樹立効率を高めることを目的として用いられる因子も含まれており、本明細書においては、これらの樹立効率の改善目的にて用いられた因子についても初期化因子と別段の区別をしないものとする。
　初期化因子は、タンパク質の形態の場合、例えばリポフェクション、細胞膜透過性ペプチド（例えば、HIV由来のTATおよびポリアルギニン）との融合、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入してもよい。
　一方、DNAの形態の場合、例えば、ウイルス、プラスミド、人工染色体などのベクター、リポフェクション、リポソーム、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入することができる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター（以上、Cell, 126, pp.663-676, 2006; Cell, 131, pp.861-872, 2007; Science, 318, pp.1917-1920, 2007）、アデノウイルスベクター(Science, 322, 945-949, 2008)、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクター（WO 2010/008054）などが例示される。また、人工染色体ベクターとしては、例えばヒト人工染色体（HAC）、酵母人工染色体（YAC）、細菌人工染色体（BAC、PAC）などが含まれる。プラスミドとしては、哺乳動物細胞用プラスミドを使用しうる（Science, 322:949-953, 2008）。ベクターには、核初期化物質が発現可能なように、プロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合配列、ターミネーター、ポリアデニル化サイトなどの制御配列を含むことができるし、さらに、必要に応じて、薬剤耐性遺伝子（例えばカナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子など）、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリアトキシン遺伝子などの選択マーカー配列、緑色蛍光タンパク質（GFP）、βグルクロニダーゼ（GUS）、FLAGなどのレポーター遺伝子配列などを含むことができる。また、上記ベクターには、体細胞への導入後、初期化因子をコードする遺伝子もしくはプロモーターとそれに結合する初期化因子をコードする遺伝子を共に切除するために、それらの前後にLoxP配列を有してもよい。
　また、RNAの形態の場合、例えばリポフェクション、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入しても良く、分解を抑制するため、5-メチルシチジンおよびpseudouridine (TriLink Biotechnologies)を取り込ませたRNAを用いても良い（Warren L, (2010) Cell Stem Cell. 7:618-630）。
　iPS細胞誘導のための培養液としては、例えば、10～15% FBSを含有するDMEM、DMEM/F12又はDME培養液（これらの培養液にはさらに、LIF、penicillin/streptomycin、puromycin、L－グルタミン、非必須アミノ酸類、β-メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）または市販の培養液[例えば、マウスES細胞培養用培養液（TX-WES培養液、トロンボＸ社）、霊長類ES細胞培養用培養液（霊長類ES/iPS細胞用培養液、リプロセル社）、無血清培地（mTeSR、Stemcell Technology社）などが含まれる。
　培養法の例としては、例えば、37℃、5% CO2存在下にて、10% FBS含有DMEM又はDMEM/F12培養液上で体細胞と初期化因子とを接触させ約4～7日間培養し、その後、細胞をフィーダー細胞（例えば、マイトマイシンC処理STO細胞、SNL細胞等）上にまきなおし、体細胞と初期化因子の接触から約10日後からbFGF含有霊長類ES細胞培養用培養液で培養し、該接触から約30～約45日又はそれ以上ののちにiPS様コロニーを生じさせることができる。
　あるいは、37℃、5% CO2存在下にて、フィーダー細胞（例えば、マイトマイシンC処理STO細胞、SNL細胞等）上で10% FBS含有DMEM培養液（これにはさらに、LIF、ペニシリン/ストレプトマイシン、ピューロマイシン、L－グルタミン、非必須アミノ酸類、β-メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）で培養し、約25～約30日又はそれ以上ののちにES様コロニーを生じさせることができる。望ましくは、フィーダー細胞の代わりに、初期化される体細胞そのものを用いる（Takahashi K, et al. (2009), PLoS One. 4:e8067またはWO2010/137746）、もしくは細胞外基質（例えば、Laminin（WO2009/123349）およびマトリゲル（BD社））を用いる方法が例示される。
　この他にも、血清を含有しない培地を用いて培養する方法も例示される（Sun N, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:15720-15725）。さらに、樹立効率を上げるため、低酸素条件（0.1%以上、15%以下の酸素濃度）によりiPS細胞を樹立しても良い（Yoshida Y, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:237-241またはWO2010/013845）。
　上記培養の間には、培養開始2日目以降から毎日1回新鮮な培養液と培養液交換を行う。また、核初期化に使用する体細胞の細胞数は、限定されないが、培養ディッシュ100cm2あたり約5×103～約5×106細胞の範囲である。
　iPS細胞は、形成したコロニーの形状により選択することが可能である。一方、体細胞が初期化された場合に発現する遺伝子（例えば、Oct3/4、Nanog）と連動して発現する薬剤耐性遺伝子をマーカー遺伝子として導入した場合は、対応する薬剤を含む培養液（選択培養液）で培養を行うことにより樹立したiPS細胞を選択することができる。また、マーカー遺伝子が蛍光タンパク質遺伝子の場合は蛍光顕微鏡で観察することによって、発光酵素遺伝子の場合は発光基質を加えることによって、また発色酵素遺伝子の場合は発色基質を加えることによって、iPS細胞を選択することができる。
　核移植により得られたクローン胚由来のES細胞（nt ES細胞）は、受精卵由来のES細胞とほぼ同じ特性を有している（T. Wakayama et al. (2001), Science, 292:740-743; S. Wakayama et al. (2005), Biol. Reprod., 72:932-936; J. Byrne et al. (2007), Nature, 450:497-502）。すなわち、未受精卵の核を体細胞の核と置換することによって得られたクローン胚由来の胚盤胞の内部細胞塊から樹立されたES細胞がnt ES(nuclear transfer ES)細胞である。nt ES細胞の作製のためには、核移植技術（J.B. Cibelli et al. (1998), Nature Biotechnol., 16:642-646）とES細胞作製技術(上記)との組み合わせが利用される(若山清香ら(2008),実験医学,26巻,5号(増刊), 47～52頁)。核移植においては、哺乳動物の除核した未受精卵に、体細胞の核を注入し、数時間培養することで初期化することができる。
　Multilineage-differentiating Stress Enduring cells（Muse細胞）は、WO2011/007900に記載された方法にて製造された多能性幹細胞であり、詳細には、線維芽細胞または骨髄間質細胞を長時間トリプシン処理、好ましくは8時間または16時間トリプシン処理した後、浮遊培養することで得られる多能性を有した細胞であり、SSEA-3およびCD105が陽性である。
II. 生体高分子
　本発明の培養基材に用いられる生体高分子は、ゼラチン、コラーゲン及びセルロースからなる群より選択される。
　ゼラチンは、主として牛骨および牛皮、豚皮を原料として製造されるが、鮭などの魚の皮や鱗を原料とする場合もあり、その由来については特に限定されない。これらの原料からゼラチンを抽出・精製する方法は周知である。また、市販のゼラチンを用いることもできる。
　コラーゲンは、ゼラチン製造の過程で酸・アルカリによる変性前のコラーゲン原料から精製することができる。コラーゲンの由来にも特に限定はない。また、市販のコラーゲン、例えば、細胞培養用のコーティング基質として市販されているもの等を用いることもできる。
　セルロースは植物等から周知の方法によって抽出・精製することができ、いかなるものを用いてもよい。
　生体高分子の分子量は特に限定されないが、分子量が小さいとエレクトロスピニング法によりナノファイバーを形成できない場合があるので、例えば、ゼラチンの場合、10 kDa以上、好ましくは20-70 kDa、より好ましくは30-40 kDaの範囲で適宜選択することができる。
III. ナノファイバーの作製
　これらの生体高分子からナノファイバーを作製する方法は特に限定されず、例えばエレクトロスピニング法、コンジュゲート溶融紡糸法、メルトブロー法等が挙げられるが、簡便で応用性が広いエレクトロスピニング法が好ましく用いられる。
　エレクトロスピニング法による場合、まず生体高分子を適当な溶媒に溶解する。ここで用いられる溶媒としては、ゼラチン、コラーゲン、セルロースを溶解し得る溶媒であれば、無機溶媒、有機溶媒を問わずいかなるものも使用可能であるが、例えば、ゼラチンナノファイバーの作製においては、酢酸やギ酸等が好ましく用いられ得る。コラーゲンナノファイバーの作製においては、例えば、1,1,1,2,2,2-ヘキサフルオロ-2-プロパノール等が用いられ得る。あるいは、セルロースナノファイバーの作製においては、高極性イオン液体が用いられ得る。
　生体高分子溶液の濃度は特に限定されないが、好ましい繊維径及び均一性を得るためには、例えば、ゼラチンの酢酸溶液を用いる場合には、5-15 w/v%、好ましくは8-12 w/v%の濃度範囲で使用することが望ましい。
　エレクトロスピニング法は自体公知の手法に従って実施することができる。エレクトロスピニング法の原理は、電気の力で材料をスプレーし、ナノサイズの繊維にすることである。生体高分子溶液をシリンジに充てんし、先端に注射針のようなノズルを設置したものに、シリンジポンプを接続して流速を与えるようにする。ノズルから適当な距離の位置にナノファイバーが収集するコレクタ（平板でもよいし、巻き取り式とすることもできる。平板なコレクタ上に後述の支持体を設置して、直接、支持体上にナノファイバーを形成させて本発明の培養基材とすることもできる）を設置し、ノズル側に電源の＋極、コレクタ側に－極を接続する。シリンジポンプの電源を入れるとともに、電圧をかけることにより、コレクタ上に生体高分子が噴射され、ナノファイバーが形成される。ここで、電圧、ノズルからコレクタまでの距離、ノズルの内径などにより、繊維形態や繊維径が変動するが、当業者であれば、これらを適宜選択して所望の繊維径を有し、かつ均一なナノファイバーを作製することができる。例えば、後述の実施例で用いた各種条件を採用することもできるし、上述の非特許文献４および５に記載の条件を適宜用いることもできる。
　上記のようにして生成するナノファイバーは、1-1000 nm、好ましくは10-800 nm、より好ましくは50-500 nmの繊維径を有するものであればよい。
　ナノファイバーに好適な3次元特性を与え、かつ継代時の細胞の解離を容易にするために、生成したナノファイバーは適当な架橋剤を用いて架橋処理することが好ましい。架橋剤の種類は特に制限はないが、好ましい架橋剤として、水溶性カルボジイミド（WSC）、N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）等が挙げられる。2種類以上の架橋剤を混合して用いてもよい。架橋処理は、例えば、架橋剤を適当な溶媒に溶解し、該架橋剤溶液中に得られたナノファイバーを浸漬することにより行うことができる。当業者であれば、架橋剤の種類に応じて、溶液濃度、架橋処理時間を適宜設定することができる。
　尚、架橋剤と培養基材に機能性を付与する公知のペプチドをコンジュゲートしておけば、当該架橋処理により、同時にナノファイバー基材上に機能性ペプチドが付与されることになるので、この点でも有用である。
IV. ファイバー・オン・ファイバーの作製
　上記のようにして生成するナノファイバーを、支持体上に塗布することで、ファイバー・オン・ファイバーを作製することができる。
　塗布する方法は、ナノファイバーが支持体上に均一に塗布されれば、限定されないが、簡便で応用性が広いエレクトロスピニング法により、ナノファイバーを支持体上に生成される方法が好ましく用いられる。
　支持体としては、フレキシブルかつ強度が保持されるものが好ましい。支持体の種類は特に制限はないが、好ましい支持体として、ガーゼ、及びスポンジ等が挙げられる。これらの素材としては、特に限定されないが、生体適合性のポリマーであることが好ましく、例えば、コットン、リネン、コラーゲンスポンジ、生物由来のセルロース誘導体、シリコーンポリマー、セグメント化ポリウレタン等が挙げられるが、これらに限定されない。
V. ファイバー・オン・ファイバー基材を用いた細胞の培養
　このようにして得られた、支持体上に生体高分子からなるナノファイバーを含有してなる本発明の培養基材（ファイバー・オン・ファイバー基材）は、多能性幹細胞等の幹細胞をはじめとする各種細胞の培養（例えば、維持増幅培養、分化誘導培養、脱分化誘導培養など）のために使用される。従って、本発明はまた、本発明の培養基材上に細胞、好ましくは幹細胞、より好ましくは多能性幹細胞を播種し、該細胞を静置培養することによる、該細胞の培養方法、好ましくは維持増幅培養方法を提供する。
　以下に、多能性幹細胞の維持増幅培養方法を例にとって本発明をより具体的に説明するが、多能性幹細胞や他の幹細胞から種々の分化細胞へ分化誘導する場合や、組織前駆細胞もしくは組織幹細胞、あるいは分化細胞をより未分化な状態に脱分化させたり、他の幹細胞、組織前駆細胞又は分化細胞を維持増幅培養したりする場合についても、それぞれ、公知の方法を、従来使用されている培養基材に代えて本発明の培養基材を適用することで、容易に実施することができる。
　まず、樹立され、フィーダー細胞やマトリゲル、コラーゲン等のマトリクス上で付着培養されていた多能性幹細胞を酵素処理により解離した後、好ましくは細胞死を抑制するためにROCK阻害剤（例えば、Y-27632等）を添加した培地（上記I.において多能性幹細胞の培養用培地として例示したものを同様に使用することができる。好ましくは無血清培地であり、より好ましくは培養される多能性幹細胞とは異種の動物由来のタンパク質を含まない（Xenoフリー）培地であり、さらに好ましくは血清アルブミンやbFGF等のタンパク質を含まない培地が使用される。）に懸濁し、培養容器（例えば、ディッシュ、ペトリディッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック等）中に載置した、上記本発明の培養基材上に、約0.5×104-約10×104細胞/cm2、好ましくは約2×104-約6×104細胞/cm2の細胞密度となるように播種する。該培養基材は、多能性幹細胞の播種に先立って、上記培地と同じ組成（ROCK阻害剤は不要）の培地を含浸させ、本培養と同様の条件下でプレインキュベートしておくことが望ましい。
　多能性幹細胞を播種後、好ましくは培養容器から培地を除去し、新鮮な培地（ROCK阻害剤を含むことが望ましい）と交換し、1日培養する。培養は、例えば、CO2インキュベーター中、約1-約10%、好ましくは約2-約5%のCO2濃度の雰囲気下、約30-約40℃、好ましくは約37℃で行われる。翌日ROCK阻害剤を含まない培地と交換し、以後は1-2日毎に新鮮な培地と交換することが望ましい。培養は1-7日間、好ましくは3-6日間、より好ましくは4-5日間行われる。
　本発明はまた、酵素を含まない解離液を用いて基材から細胞（例えば、多能性幹細胞等の幹細胞など）を解離させ、該細胞を本発明の培養基材上に再播種し、該細胞をさらに静置培養することによる、該細胞の培養方法（例えば、維持増幅方法など）を提供する。ヒト多能性幹細胞は、従来の継代培養法で単一細胞化すると、細胞死を起こしやすいという問題点があるため、ある程度のサイズの細胞塊として継代されたりもするが、本発明の培養基材を用いた場合、酵素を含まない解離液を用いて容易に基材から細胞を解離させることができ、さらにわずかなピペッティング操作により単一細胞まで分散させることができる。上記の架橋された基材を用いれば、基材の形態は保持されるので、より基材と細胞の分離が容易になる。
　酵素を含まない解離液としては、従来から機械的に細胞を解離する方法において使用されている解離液を同様に用いることができ、例えば、ハンクス液やクエン酸とEDTAを組み合わせた溶液等が挙げられる。
　本発明の特筆すべき点は、ヒト多能性幹細胞を単一細胞にまで分散させた際、単一細胞化された多能性幹細胞において、細胞死の割合が顕著に抑制されることが挙げられる。これにより、より均一なヒト多能性幹細胞の細胞集団を調製することが可能となるからである。したがって、本発明はまた、本発明の培養基材を用いて、継代時に、酵素処理を行うことなく多能性幹細胞を単一細胞にまで分散させることによる、細胞死が抑制され、かつ細胞の均一化を可能とする、多能性幹細胞の維持増幅方法を提供する。基材から解離された細胞を、単一細胞にまで分散させるには、ROCK阻害剤を含む培地中で該細胞を10回程度緩やかにピペッティングするだけでよい。本方法によれば単一細胞化された細胞の死滅が顕著に抑制されるので、ROCK阻害剤を培地に添加するのは約1日間で十分である。ROCK阻害剤を長期間細胞に接触させるのは安全面から避けることが望ましいので、本発明の当該効果は極めて有意義である。
　幹細胞、とりわけヒト幹細胞は移植医療等への応用が期待されることから、安全な移植を可能とするため、ウイルスやその他に人体にとって有害な夾雑物質の混入を極力避ける必要がある。従って、特にヒト幹細胞の維持増幅培養においては、無血清培地の使用、より好ましくは異種動物由来成分を含まないxenoフリー培地の使用、さらに好ましくはタンパク質不含培地の使用が望まれる。本発明の培養基材を用いて継代培養を続ければ、これらのいずれの培地を用いた場合でも血清含有培地などと遜色ない増殖効率を得ることができる。
　ここで、無血清培地の例としては、組換え動物タンパク質を含むmTeSR培地などが、xenoフリー培地の例としては、ヒト血清アルブミン、ヒトbFGFを含むTeSR2培地などが、タンパク質不含培地の例としては、E8培地などが、それぞれ挙げられる。
　本発明の培養基材から解離された（好ましくは単一細胞にまで分散させた）多能性幹細胞は、継代培養の際には、上記のフィーダー細胞等を用いた付着培養から本発明の培養基材上に移行させる場合と同様に、約0.5×104-約10×104細胞/cm2、好ましくは約2×104-約6×104細胞/cm2の細胞密度となるように、新しい培養基材上に播種する。この培養基材も、上記と同様、多能性幹細胞の播種に先立って、本培養の際と同じ組成（ROCK阻害剤は不要）の培地を含浸させ、本培養と同様の条件下でプレインキュベートしておくことが望ましい。
　多能性幹細胞を再播種後、好ましくは培養容器から培地を除去し、新鮮な培地（ROCK阻害剤を含むことが望ましい）と交換し、1日培養する。培養は、例えば、CO2インキュベーター中、約1-約10%、好ましくは約2-約5%のCO2濃度の雰囲気下、約30-約40℃、好ましくは約37℃で行われる。翌日ROCK阻害剤を含まない培地と交換し、以後は1-2日毎に新鮮な培地と交換することが望ましい。培養は1-7日間、好ましくは3-6日間、より好ましくは4-5日間行われる。
　上記の操作を繰り返し実施することにより、多能性幹細胞を、長期にわたって多能性と正常な形質を維持した状態で、極めて良好な増殖効率で維持増幅することができる。このようにして、良質の多能性幹細胞を安定して大量に増幅することが可能となり、細胞移植治療や薬剤スクリーニングのための分化細胞のソースとして十分な量の多能性幹細胞を供給することができる。
VI. ファイバー・オン・ファイバー基材を用いた細胞の凍結保存
　ファイバー・オン・ファイバー基材上で培養した細胞を、当該基材ごと容器に挿入して凍結保存することができる。容器は凍結に適したものであればよく、容量、形（チューブ、バッグ、アンプル、バイアル等）など限定されない。当業者は適宜、好適な容器を選択することができる。また、当業者は該培養後の基材をピンセット等でその形を変えて、容器に挿入することもできる。
　細胞の凍結には、当業者必要に応じて、細胞凍結用の溶液を添加することができる。当該溶液としては、凍結下で細胞を保護することができる溶液であればよい。例えば、mFreSR（ベリタス社）、霊長類ES細胞用凍結保存液（リプロセル社）、CRYO-GOLD Human ESC / iPSC Cryopreservation Medium（システムバイオサイエンス）、セルバンカー3（十慈フィールド）等の市販品を使用することもできる。
　以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１　ゼラチンナノファイバーの作製
（１）材料
ゼラチン溶液
・ゼラチン (SIGMA G2625 MW: 30 kDa; ニッピ　ニッピハイグレードゼラチン AP MW: 8 kDa)
・氷酢酸 (AA; SIGMA P-338826)
・無水酢酸エチル (EA; SIGMA P270989) 
 
架橋バッファー
・水溶性カルボジイミド (WSC; DOJINDO Catalog344-03633)
・N－ヒドロキシスクシンイミド(NHS; SIGMA Catalog56480)
・99.5% エタノール (Wako)
 
ガーゼ BEMCOT（登録商標）S-2（旭化成）
カルチャーカバーガラス25mmφ及び32mmφ
シリコンウェハー
高圧電源 (TECHDEMPAZ Japan)
真空ポンプ(Vacuum Pump)
（２）操作手順
10%w/v ゼラチン溶液(AA:EA = 3:2) 1 mLの調製
　2 mLチューブに30 kDaゼラチン0.1 g（最終濃度10%w/v）、滅菌蒸留水0.2 mLを入れた。次にドラフト内で氷酢酸0.42 mL（最終濃度42%w/v）、無水酢酸エチル0.31 mL（最終濃度28%w/v）を加え、チューブをボルテックスしてよく攪拌した。ゼラチンが十分に溶けたら、チューブをローターにセットし、一昼夜転倒混和した（室温度：20℃以上）。
エレクトロスピニング法によるゼラチンナノファイバーの支持体への塗布
　上記のようにして調製した各種濃度のゼラチン溶液を23Gのブラント針（ニプロ）を付けたシリンジに入れ、気泡を抜いた後、マイクロシリンジポンプに流速0.2 mL/hでセットした。シリコンウェハーの中央にカルチャーカバーガラスを2枚並べて置き、ガラスの両端の一部をセロテープで固定した。シリコンウェハーを万力で垂直に固定し、マイクロシリンジポンプにセットするシリンジの針から10 cmほどの距離に置いた。ブラント針に＋電極（赤線）、シリコンウェハーに－電極（緑線）を取り付け、マイクロシリンジポンプのスイッチを入れ、11 kVの電圧をかけて、シリコンウェハー上のガーゼ又はガラスにファイバーを噴出させた。電圧を止め、シリコンウェハーを180度回転させて再度ファイバーを同じ時間噴出させた。ファイバー噴出後、ウェハー上のガーゼ（ファイバー・オン・ファイバー）又はガラス（対照ナノファイバー）を静かに外してシャーレに入れた。このシャーレをデシケーターに入れ、真空ポンプをかけながら一昼夜乾燥させた。
0.2 M WSC/NHS架橋バッファーの調製（40 mL）
　50 mLファルコンチューブにWSC を1.52 g、NHSを0.92 g入れた。該チューブに99.5% エタノールを30 mL加えてボルテックスし、試薬を溶かした後、40 mLになるように99.5%エタノールで定量し、再度ボルテックスした。
架橋処理
　デシケーターで乾燥させたゼラチンナノファイバー（ファイバー・オン・ファイバー又は対照ナノファイバー）を表面が浸る程度の量の架橋バッファーに4時間浸漬した。ナノファイバーを取り出し、99.5%エタノールに5～10分浸けて洗浄した（この操作を2回繰り返した)。次にキムワイプを敷いたシャーレの上でナノファイバーを風乾した後、デシケーターに入れ、一昼夜乾燥させた。
実施例２　ヒト多能性幹細胞のファイバー・オン・ファイバー上への継代方法
（１）材料
mTeSR 1 STEM CELL　ベリタス ST-05850 
Y-27632 Wako 257-00511（1 mg）253-00513（5 mg）
Cell Dissociation Buffer enzyme-free, Hanks’-based GIBCO 13150-016 
TrypLE Express GIBCO 12605-010
ヒト胚性幹細胞：H9、H1
ヒト人工多能性幹細胞：253G1
（２）操作手順
ナノファイバーの前処理
　直径300nm±100nmのゼラチンナノファイバーをコットンガーゼ（BEMCOT（登録商標）S-2）に吹きかけることによって作製したファイバー・オン・ファイバーを35 mmディッシュ (6-well プレート) にセットし、99.5%エタノール1 mLで3回洗浄し滅菌処理した。3回目は丁寧に吸引し、クリーンベンチ内で乾燥した。ファイバー・オン・ファイバーを培地に浸し、37℃でインキュベートした。35-mmディッシュにmTeSR 1を2 mL入れた。
MEFフィーダーからナノファイバー上へのヒト多能性幹細胞の移行
　MEFフィーダー上のヒト多能性幹細胞コロニー（60 mmディッシュ）に、酵素解離液TrypLE Express 2 mLを加え、そのままインキュベートし、約2分後にディッシュをゆすって顕微鏡下で、MEFが剥がれてきていること及びコロニーが丸くなっていることを確認した後、酵素解離液を吸引除去した（必要に応じてmTeSR 1 1～2 mLでリンスした）。10 μM Y-27632を含有するmTeSR 1（mTeSR 1（+Y27632））4 mLで細胞を回収して、10回ぐらいピペッティングし、シングルセルにした。細胞数をカウントした後、1000 rpmで3分間遠心し上清を吸引除去し、mTeSR 1（+Y27632）で、必要な細胞濃度に再懸濁した。前処理していたファイバー・オン・ファイバー上の培地を吸引除去し、該ファイバー・オン・ファイバーに1～1.5 mL（細胞密度は2×105～3×105cells/sample）を播種した。翌日、培地をmTeSR 1（+Y27632）2 mLに交換し、2日目からY-27632を含まないmTeSR 1で培養し、毎日培地交換を行った。
ナノファイバーからナノファイバーへの継代
　PBSで2回細胞をリンスした後、酵素不含細胞解離液Cell Dissociation Buffer 1 mLを加え、37℃で5分間インキュベートした後、該解離液を吸引除去した（TrypLE Expressを用いる場合1 mLを加えたら、すぐ吸引除去した後、2分ほどインキュベートした）。mTeSR1（+Y27632）2 mLで細胞を回収し (1 mL×2回)、10回ぐらいピペッティングし、シングルセルにした。以後の操作はMEFフィーダーからの移行の場合と同様に行った。
複数のファイバー・オン・ファイバーを折り畳んでの使用
　35-mmディッシュ中で4枚のファイバー・オン・ファイバーを折り畳むことで、3次元培養化を行った。平面培養で使用する培養液量（35-mmディッシュで3 mLの培地）で、より多くの細胞数を培養することが可能となった。
（３）結果
ファイバー・オン・ファイバーの構造
　上述の方法で得られたファイバー・オン・ファイバーの走査電子顕微鏡写真を図１に示す。ゼラチンナノファイバーがコットンガーゼの繊維間に網目状になっていることが分かった。以後の実験には、当該ファイバー・オン・ファイバーを用いた。
ファイバー・オン・ファイバー上でのヒト多能性幹細胞の培養
　ファイバー・オン・ファイバーを培養液に浸漬し、その上でヒト多能性幹細胞（H9ヒトES細胞）を培養した（図２）。結果を図３に示す。ヒト多能性幹細胞がコロニーを形成することが確認された。当該細胞を多能性幹細胞マーカーであるアルカリフォスファターゼ染色した結果を図４に示す。赤色に染色されたコロニーが観察され、ヒト多能性幹細胞が培養後でもアルカリフォスファターゼを強く発現していることが確認された。しかも、染色された細胞は繊維上に均一に分散していた（図５）。また、当該ファイバー・オン・ファイバーは培養中・培養後・染色後のどのタイミングにおいても、当該ファイバー・オン・ファイバーをピンセット等でつまみ上げる等を行うことで、その形状を自由に変更することが可能であった。つまり、ファイバー・オン・ファイバーはフレキシブルな形状を保持しつつ、ヒト多能性幹細胞を培養することができることが示された。
　これに対し、コットンガーゼ上にヒトES細胞（H9）を培養し、その後アルカリフォスファターゼ染色を行った対照試験では、数個のコロニーが確認されたものの、図４で示されるようなコロニー数を確認することができなかった（図６）。この結果から、ゼラチンナノファイバーの存在により、細胞接着や細胞増殖が促進されることが示された。
フローサイトメトリーによる多能性幹細胞マーカーの定量的発現量解析
　ヒトES細胞（H9）をファイバー・オン・ファイバー上で培養した後の細胞について、多能性幹細胞マーカー（SSEA4）の発現を、フローサイトメトリーを用いて解析した（図７）。当該細胞のうち、98.7％の細胞がSSEA4を強く発現していることを確認することできた。また、細胞群が均一であることも確認することができた。
免疫細胞染色法による多能性幹細胞マーカー発現の確認
　ヒトES細胞（H9）をファイバー・オン・ファイバー上で培養した後の細胞について、免疫細胞染色により、未分化マーカー（TRA-1-60）の発現を調べた。比較のために、マトリゲル上で1回継代したヒトES細胞（H9）における当該マーカーの発現も調べた。結果を図８に示す。ヒトES細胞（H9）において、未分化マーカーが強く発現していることが確認された。
複数枚のファイバー・オン・ファイバーを折り畳んでの使用
　35-mmディッシュ中で、1枚又は4枚のファイバー・オン・ファイバーを折り畳むことで3次元培養化を行い（図９）、細胞数を測定した。結果を図１０に示す。対照として、平面基板上に塗布したナノファイバーを用いた。平面培養で使用する培養液量（35-mmディッシュで3 mLの培地）で、より多くの細胞数を培養することが可能であった。
　さらに、図１１に示すように32枚のファイバー・オン・ファイバーを折り畳み、ヒト多能性幹細胞を大量に培養する（100 mL）等、容器の形状・容量に応じて基材を入れる量をコントロールすることも可能となった。
ファイバー・オン・ファイバー上でのヒト多能性幹細胞の長期培養
　ファイバー・オン・ファイバー上でヒトES細胞（H9）を10回継代培養した後、アルカリフォスファターゼ染色した結果を図１２に示す。長期培養後も未分化マーカーを強く発現していることが確認された。
フローサイトメトリーによる多能性幹細胞マーカーの定量的発現量解析
　ファイバー・オン・ファイバー上でヒトES細胞（H9）を10回継代培養した後の細胞における多能性幹細胞マーカー（SSEA4）の発現を、フローサイトメトリーを用いて解析した。比較のために、マトリゲル上で1回継代したヒトES細胞（H9）における当該マーカーの発現も調べた。結果を図１３に示す。ファイバー・オン・ファイバーで培養したヒトES細胞（H9）の大半でSSEA4が強く発現していることを確認することができた。また、マトリゲル上で培養したものと比べ、細胞群がより均一であることも確認された。
　さらに、ファイバー・オン・ファイバー上でヒトES細胞（H1、H9）及びヒトiPS細胞（253G1）を20回以上継代培養した後の細胞における多能性幹細胞マーカー（SSEA4）及び分化マーカー（SSEA1）の発現を、フローサイトメトリーを用いて解析した。結果を図１４に示す。98.4％（H1）、98.6％（H9）及び96.3％（253G1）の細胞がSSEA4を強く発現していることを確認することできた。一方、いずれの多能性幹細胞においても、SSEA1を発現している細胞はほとんど確認できなかった。
ファイバー・オン・ファイバー上で長期間培養したヒト多能性幹細胞の核型解析
　ファイバー・オン・ファイバー上で10回以上継代培養したヒトES細胞（H9）及びヒトiPS細胞（253G1）の細胞について、マルチカラーFISHによる核型解析を行った。結果を図１５に示す。ファイバー・オン・ファイバー上で10回以上継代・培養後も、両細胞共に正常な核型を保持していることを確認することができた（図１５）。
ファイバー・オン・ファイバー上で長期間（10回以上継代）培養したヒト多能性幹細胞の分化能の確認
　胚様体（Embryoid body）形成による、ファイバー・オン・ファイバー上で培養したヒト多能性幹細胞の分化能の確認を行った。外胚葉、中胚葉、内胚葉の検出マーカーに対する蛍光標識抗体（それぞれ、抗チューブリンIII抗体、抗α-SMA抗体、抗SOX17抗体）で染色した結果を図１６に示す。ファイバー・オン・ファイバー上で10回以上継代・培養した後でも、ヒト多能性幹細胞は、外胚葉、中胚葉及び内胚葉全ての胚葉に分化可能であることが確認された（ヒトES細胞（H9，図１６Ａ）、ヒトES細胞（H1，図１６Ｂ））。
ファイバー・オン・ファイバー上で長期間（10回以上継代）培養したヒト多能性幹細胞のテラトーマ形成能の確認
　ファイバー・オン・ファイバー上で10回以上継代・培養したヒトES細胞（H1、H9）又はヒトiPS細胞（253G1）1x106細胞を、Materigel/DMEM-F12培地に懸濁し、免疫不全マウス（C.B-17/Icr-scid/scid Jcl、雌、６～８週齢、3匹）の皮下と腹膜の間に注入した。4～8週間後、腫瘍を切除し、固定・パラフィン包埋した後、切片標本をヘマトキシリン－エオシン染色した。結果を図１７に示す。いずれのヒト多能性幹細胞についても、すべての胚葉に分化可能であることが確認された。
実施例３　ファイバー・オン・ファイバー上で培養したヒト多能性幹細胞の凍結保存ファイバー・オン・ファイバー上で培養したヒト多能性幹細胞の凍結・解凍
　ファイバー・オン・ファイバー上で培養したヒト多能性幹細胞を、ピンセットを用いてその形を変えてチューブに挿入し凍結した（図１８）。凍結前、解凍4日後の当該細胞の形態を図１９に示す。凍結及び解凍を行っても当該細胞はコロニーを形成することが確認された。
フローサイトメトリーによる凍結・解凍後の多能性幹細胞マーカーの定量的発現量解析
　市販の細胞凍結保存液（セルバンカー3、mFreSR）にファイバー・オン・ファイバー上で培養したヒトES細胞（H1）を入れ、2日間凍結後解凍した細胞における多能性幹細胞マーカー（SSEA4、TRA-1-60）及び分化マーカー（SSEA1）の発現を、フローサイトメトリーを用いて解析した。結果を図２０に示す。ファイバー・オン・ファイバー上で培養したヒトES細胞（H1）の大半でSSEA4、TRA-1-60が強く発現していたのに対し、SSEA1を発現している細胞を確認することはほぼなかった。
免疫細胞染色法による凍結・解凍後の多能性幹細胞マーカー発現の確認
　ファイバー・オン・ファイバー上で培養したヒトES細胞（H1）を、3日間凍結後、解凍した当該細胞をアルカリフォスファターゼ染色した。結果を図２１に示す。凍結及び解凍を行っても未分化マーカーを強く発現していることが確認された。
ファイバー・オン・ファイバー上で培養したヒト多能性幹細胞の凍結・解凍後の細胞数
　細胞凍結保存液（セルバンカー3、mFreSR）にファイバー・オン・ファイバー上で培養したヒトES細胞（H1）を入れ、2日以上凍結後解凍し、細胞数を測定した。結果を図２２に示す。いずれの細胞凍結保存液を用いても、約75%（セルバンカー3）、約85%（mFreSR）の高生存率を示した。
実施例４　ファイバー・オン・ファイバーを用いたヒトES細胞の大量培養
　mTeSR-1培養液55 mLを含むガス透過性の細胞培養バッグ（ニプロ製；図２３Ａ）中に、ファイバー・オン・ファイバー上で培養したヒトES細胞（H1）1.2x106細胞を封入し、5％ CO2、37℃で7日間培養した。培養期間中、2回培地交換を行った。培養終了後に細胞数を測定したところ、9.55x107細胞/55 mL（=3.47x109細胞/L）であり、7日間で細胞数は79.6倍に増加した。大量培養後の細胞における多能性幹細胞マーカー（SSEA4）及び分化マーカー（SSEA1）の発現を、フローサイトメトリーを用いて解析した。結果を図２３Ｂに示す。99.7％の細胞がSSEA4を強く発現していることを確認することできた。一方、SSEA1を発現している細胞はほとんど確認できなかった。
　細胞を継続培養して増殖生産できる効率速度としては、今回の発明では5日間毎に10倍の生産速度に到達している。この効率速度は、既報のヒト多能性幹細胞の分散培養における5倍程度などに比較して格段に優れている。また従来の実験室レベルで複雑な手作業による接着培養方法（4日毎に4倍程度、または3日毎に3倍程度）に比較しても、優れた増殖速度である。今回開発したファイバー・オン・ファイバーの手法は、3次元細胞培養化することによって、培地中における単位体積当りの細胞数を増加することができる方法であり、ヒト多能性幹細胞の大量培養実用化への道となる。さらに、支持体として生体適合性の高いポリマーを用いるので、細胞移植治療への応用も拓くことができる。
　本発明を好ましい態様を強調して説明してきたが、好ましい態様が変更され得ることは当業者にとって自明であろう。例えば、3次元培養が可能であり、省スペース化を実現しつつ細胞の大量供給が可能となること、培養液の浸漬により培養液が浸透して、細胞への培養液の供給が容易になること等の本発明の培養基材の特徴は、多能性幹細胞をはじめとする幹細胞の維持増幅培養のみならず、任意の細胞のあらゆる培養に有利な効果をもたらすものである。よって、本発明は、本発明が本明細書に詳細に記載された以外の方法で実施され得ることを意図する。即ち、本発明は添付の「請求の範囲」の精神及び範囲に包含されるすべての変更を含むものである。
　ここで述べられた特許及び特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
　本出願は、2013年6月3日付で日本国に出願された特願2013-117242を基礎としており、ここで言及することにより、その内容はすべて本明細書に包含される。

Claims (24)

  1. 　支持体上に、ゼラチン、コラーゲン及びセルロースからなる群より選択される生体高分子からなるナノファイバーを含有してなる、細胞の培養用基材。
  2. 　該ナノファイバーが架橋処理されている、請求項１記載の基材。
  3. 　生体高分子がゼラチン又はコラーゲンである、請求項１又は２記載の基材。
  4. 　生体高分子がゼラチンである、請求項１又は２記載の基材。
  5. 　ナノファイバーがエレクトロスピニング法により得られる、請求項１～４のいずれか１項に記載の基材。
  6. 　支持体が、ガーゼ及びスポンジからなる群より選択される請求項１～５のいずれかに記載の基材。
  7. 　細胞が幹細胞である、請求項１～６のいずれか１項に記載の基材。
  8. 　幹細胞が多能性幹細胞である、請求項７記載の基材。
  9. 　多能性幹細胞がES細胞又はiPS細胞である、請求項８記載の基材。
  10. 　多能性幹細胞がヒト由来である、請求項８又は９記載の基材。
  11. 　培養が細胞の維持増幅培養である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の基材。
  12. 　請求項１～６のいずれか１項に記載の基材を含む、細胞凍結剤。
  13. 　請求項１～６のいずれか１項に記載の基材上に細胞を播種し、該細胞を静置培養することを特徴とする、細胞の培養方法。
  14. 　酵素を含まない解離液を用いて基材から細胞を解離させ、該細胞を請求項１～６のいずれか１項に記載の基材上に播種し、該細胞をさらに静置培養することを特徴とする、請求項１３記載の方法。
  15. 　継代時に、細胞を単一細胞にまで分散させることを特徴とする、請求項１４記載の方法。
  16. 　細胞を無血清培地で培養することを特徴とする、請求項１３～１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 　無血清培地がxenoフリー培地である、請求項１６記載の方法。
  18. 　無血清培地がタンパク質不含培地である、請求項１６記載の方法。
  19. 　細胞が幹細胞である、請求項１３～１８のいずれか１項に記載の方法。
  20. 　幹細胞が多能性幹細胞である、請求項１９記載の方法。
  21. 　多能性幹細胞がES細胞又はiPS細胞である、請求項２０記載の方法。
  22. 　多能性幹細胞がヒト由来である、請求項２０又は２１記載の方法。
  23. 　培養が細胞の維持増幅培養である、請求項１３～２２のいずれか１項に記載の方法。
  24. 　請求項１２に記載の凍結剤を用いて細胞を凍結保存する方法。
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Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016068266A1 (ja) * 2014-10-31 2016-05-06 国立大学法人京都大学 生分解性ポリマーを用いた３次元培養方法、及び細胞移植を可能にする培養基材
CN107149704A (zh) * 2017-04-21 2017-09-12 芜湖扬展新材料科技服务有限公司 一种胎盘干细胞复合再生纤维素组织修复材料的制备方法
WO2017199737A1 (ja) * 2016-05-16 2017-11-23 富士フイルム株式会社 培養細胞の回収方法および培養細胞分散液
WO2018199194A1 (ja) 2017-04-25 2018-11-01 北海道公立大学法人札幌医科大学 間葉系幹細胞の製造方法、間葉系幹細胞の治療効果マーカー及び治療効果判定方法、並びに間葉系幹細胞を含む細胞製剤
WO2018235745A1 (ja) * 2017-06-20 2018-12-27 日本毛織株式会社 生体適合長繊維不織布、その製造方法、細胞培養用立体足場及びこれを用いた細胞培養方法
JP2019172720A (ja) * 2018-03-27 2019-10-10 大日精化工業株式会社 水不溶性成形体の製造方法及び水不溶性成形体
WO2019208688A1 (ja) 2018-04-25 2019-10-31 北海道公立大学法人札幌医科大学 生体移植用細胞シート及びその製造方法
WO2019245005A1 (ja) * 2018-06-20 2019-12-26 株式会社 東芝 検査デバイス、この検査デバイスの製造方法、この検査デバイスを用いた細胞検出方法、この検査デバイス用セル、この検査デバイス用セルの製造方法、及び検査方法
JPWO2020262458A1 (ja) * 2019-06-28 2020-12-30
WO2021100718A1 (ja) 2019-11-21 2021-05-27 日本毛織株式会社 細胞集合体、その製造方法、その作製キット、及びそれを用いた化合物の評価方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008514341A (ja) * 2004-09-29 2008-05-08 ナショナル ユニバーシティ オブ シンガポール 複合物、複合物の製造方法、およびその使用方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007325543A (ja) * 2006-06-08 2007-12-20 Toray Ind Inc 細胞足場材料およびその製造方法
JP5910505B2 (ja) * 2010-12-06 2016-04-27 味の素株式会社 医療用材料及びその製造方法
KR101970368B1 (ko) * 2011-05-17 2019-04-18 론자 워커스빌 아이엔씨. 인간 다능성 줄기세포의 계대 및 수득을 위한 제제 및 방법
CA2792081C (en) * 2011-10-11 2020-10-27 Bond University Ltd Layered compositions comprising 3d nanofibre webbing for tissue repair

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008514341A (ja) * 2004-09-29 2008-05-08 ナショナル ユニバーシティ オブ シンガポール 複合物、複合物の製造方法、およびその使用方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
TUZLAKOGLU, K ET AL: "DESIGN OF NANO- AND MICROFIBER COMBINED SCAFFOLDS BY ELECTROSPINNING OF COLLAGEN ONTO STARCH BASED FIBER MESHES: A MAN MADE EQUIVALENT OF NATURAL EXTRACELLULAR MATRIX", TISSUE ENGINEERING PART A, vol. 17, no. 3-4, 2011, pages 463 - 473 *

Cited By (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016068266A1 (ja) * 2014-10-31 2016-05-06 国立大学法人京都大学 生分解性ポリマーを用いた３次元培養方法、及び細胞移植を可能にする培養基材
WO2017199737A1 (ja) * 2016-05-16 2017-11-23 富士フイルム株式会社 培養細胞の回収方法および培養細胞分散液
JPWO2017199737A1 (ja) * 2016-05-16 2019-03-07 富士フイルム株式会社 培養細胞の回収方法および培養細胞分散液
CN107149704A (zh) * 2017-04-21 2017-09-12 芜湖扬展新材料科技服务有限公司 一种胎盘干细胞复合再生纤维素组织修复材料的制备方法
WO2018199194A1 (ja) 2017-04-25 2018-11-01 北海道公立大学法人札幌医科大学 間葉系幹細胞の製造方法、間葉系幹細胞の治療効果マーカー及び治療効果判定方法、並びに間葉系幹細胞を含む細胞製剤
WO2018235745A1 (ja) * 2017-06-20 2018-12-27 日本毛織株式会社 生体適合長繊維不織布、その製造方法、細胞培養用立体足場及びこれを用いた細胞培養方法
JP6450894B1 (ja) * 2017-06-20 2019-01-09 日本毛織株式会社 生体適合長繊維不織布、その製造方法、細胞培養用立体足場及びこれを用いた細胞培養方法
JP2019172720A (ja) * 2018-03-27 2019-10-10 大日精化工業株式会社 水不溶性成形体の製造方法及び水不溶性成形体
WO2019208688A1 (ja) 2018-04-25 2019-10-31 北海道公立大学法人札幌医科大学 生体移植用細胞シート及びその製造方法
WO2019245005A1 (ja) * 2018-06-20 2019-12-26 株式会社 東芝 検査デバイス、この検査デバイスの製造方法、この検査デバイスを用いた細胞検出方法、この検査デバイス用セル、この検査デバイス用セルの製造方法、及び検査方法
JPWO2019245005A1 (ja) * 2018-06-20 2021-05-13 株式会社東芝 検査デバイス、この検査デバイスの製造方法、この検査デバイスを用いた細胞検出方法、この検査デバイス用セル、この検査デバイス用セルの製造方法、及び検査方法
JP7030977B2 (ja) 2018-06-20 2022-03-07 株式会社東芝 検査デバイス及び検査方法
JP2022058439A (ja) * 2018-06-20 2022-04-12 株式会社東芝 検査デバイス、この検査デバイスの製造方法、この検査デバイスを用いた細胞検出方法、この検査デバイスの検査デバイス用セル、及びこの検査デバイス用セルの製造方法
JPWO2020262458A1 (ja) * 2019-06-28 2020-12-30
WO2020262458A1 (ja) * 2019-06-28 2020-12-30 日本毛織株式会社 細胞シート、その製造方法及び作製キット
JP7362652B2 (ja) 2019-06-28 2023-10-17 日本毛織株式会社 細胞シート、その製造方法及び作製キット
WO2021100718A1 (ja) 2019-11-21 2021-05-27 日本毛織株式会社 細胞集合体、その製造方法、その作製キット、及びそれを用いた化合物の評価方法

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