JP6024880B2 - 環状デプシペプチドの新規使用方法 - Google Patents
環状デプシペプチドの新規使用方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6024880B2 JP6024880B2 JP2012193433A JP2012193433A JP6024880B2 JP 6024880 B2 JP6024880 B2 JP 6024880B2 JP 2012193433 A JP2012193433 A JP 2012193433A JP 2012193433 A JP2012193433 A JP 2012193433A JP 6024880 B2 JP6024880 B2 JP 6024880B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- group
- cell
- cyclic depsipeptide
- culture
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- A61K38/12—Cyclic peptides, e.g. bacitracins; Polymyxins; Gramicidins S, C; Tyrocidins A, B or C
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0657—Cardiomyocytes; Heart cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Cardiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明は、環状デプシペプチドを含有する医薬組成物ならびに環状デプシペプチドを用いて心筋細胞および/または心筋前駆細胞を効率よく分化増殖させるための方法に関する
。
。
成体の心筋細胞は分裂能を失っていることから、心筋梗塞、心筋炎または老化等により心筋が損傷された場合、修復をすることが困難と考えられていた。しかし、Beltramiらにより、心筋細胞の中にも梗塞後に再生能を獲得する細胞があることが確認された（非特許文献１）。さらに、Laugwitzらが、出生後の個体の心臓に心筋前駆細胞の存在を明らかとした（非特許文献２）。しかしながら、心筋梗塞後の心機能の低下を鑑みると、成体内に存在する心筋前駆細胞の通常の分化再生能のみでは、心機能を回復するには十分でないと考えられる。そこで、心筋細胞を増殖させる化合物なども報告されている（特許文献１）。
近年、胚性幹細胞（ES細胞）や人工多能性幹細胞（iPS細胞）などの多能性幹細胞から
心筋細胞の発生段階を模倣して製造した心筋前駆細胞（特許文献２）を分化増殖させる試薬が報告されている（特許文献３）。
心筋細胞の発生段階を模倣して製造した心筋前駆細胞（特許文献２）を分化増殖させる試薬が報告されている（特許文献３）。
アプラトキシンＡ は、2001 年にLueschらによって、シアノバクテリアより単離され、構造決定された25員環デプシペプチドであり（非特許文献３）、抗腫瘍活性を有することが知られているが、心筋分化増殖制御に関する機能については知られていない。
Beltrami AP, et al. N Engl J Med. 344:1750, 2001
Laugwitz KL, et al. Nature. 433:647, 2005
Luesch H, et al. J. Am. Chem. Soc. 123, 5418, 2001
本発明は心筋細胞および/または心筋前駆細胞を効率よく分化増殖させるための化合物
を提供することである。
を提供することである。
本発明者らはマウスES細胞から分化誘導した心筋細胞および/または心筋前駆細胞の分
化増殖を促進させる薬剤をスクリーニングしたところ、複数の環状デプシペプチドにより該細胞の分化増殖が促進されることが明らかとなった。本発明はこのような知見に基づき完成するに至ったものである。
化増殖を促進させる薬剤をスクリーニングしたところ、複数の環状デプシペプチドにより該細胞の分化増殖が促進されることが明らかとなった。本発明はこのような知見に基づき完成するに至ったものである。
すなわち、本発明は以下の特徴を有する。
[１] 以下の式（I）または式（II）（式中、R1およびR3はそれぞれHまたはC1-C6アルキ
ル基であり、R2はH、C1-C6アルキル基、トリメチルシリル基およびトリエチルシリル基からなる群から選択される置換基であり、R4はH、OH、C1-C6アルコキシ基、F、Cl、Brおよ
びIからなる群から選択される置換基であり、L-MはCH=C(Me)、CH=CH、CH2-CH2およびCH2-CH(Me)からなる群から選択される構造を有し、Xは、OまたはSであり、nは、1または2である）で表される環状デプシペプチドまたはその薬学上許容される塩、溶媒和物もしくはプロドラッグを有効成分として含有する医薬組成物。
[２] R1がイソプロピル基またはt-ブチル基であり、R2がHであり、R3がメチル基であり
、R4がメトキシ基であり、L-MがCH=C(Me)であり、XがOまたはSであり、nが1である、[１]に記載の医薬組成物。
[３] 環状デプシペプチドが、次の式（III）から式（VIII）で表される化合物から成る
群より選択される、[１]に記載の医薬組成物；
[４] 心不全、虚血性心疾患または心筋症から選択される心疾患の治療に用いられる[１]〜[３]のいずれかに記載の医薬組成物。
[５] 以下の式（I）または式（II）（式中、R1およびR3はそれぞれHまたはC1-C6アルキ
ル基であり、R2はH、C1-C6アルキル基、トリメチルシリル基およびトリエチルシリル基からなる群から選択される置換基であり、R4はH、OH、C1-C6アルコキシ基、F、Cｌ、BrおよびIからなる群から選択される置換基であり、L-MはCH=C(Me)、CH=CH、CH2-CH2およびCH2-CH(Me)からなる群から選択される構造を有し、Xは、OまたはSであり、nは、1または2である）で表される環状デプシペプチドを心筋前駆細胞へ添加する工程を含む、心筋細胞の製造方法。
[６] R1がイソプロピル基またはt-ブチル基であり、R2がHであり、R3がメチル基であり
、R4がメトキシ基であり、L-MがCH=C(Me)であり、XがOまたはSであり、nが1である、[５]に記載の方法。
[７] 環状デプシペプチドが、次の式（III）から式（VIII）で表される化合物から成る
群より選択される、[５]に記載の方法。
[８] 前記心筋前駆細胞が、side population細胞（SP細胞）を含む生体内の心筋前駆細
胞、または多能性幹細胞から誘導された心筋前駆細胞である、[５]〜[７]のいずれかに記載の方法。
[９] 前記多能性幹細胞から誘導された心筋前駆細胞が、Flk1 (KDR)陽性の細胞である、[８]に記載の方法。
[１] 以下の式（I）または式（II）（式中、R1およびR3はそれぞれHまたはC1-C6アルキ
ル基であり、R2はH、C1-C6アルキル基、トリメチルシリル基およびトリエチルシリル基からなる群から選択される置換基であり、R4はH、OH、C1-C6アルコキシ基、F、Cl、Brおよ
びIからなる群から選択される置換基であり、L-MはCH=C(Me)、CH=CH、CH2-CH2およびCH2-CH(Me)からなる群から選択される構造を有し、Xは、OまたはSであり、nは、1または2である）で表される環状デプシペプチドまたはその薬学上許容される塩、溶媒和物もしくはプロドラッグを有効成分として含有する医薬組成物。
、R4がメトキシ基であり、L-MがCH=C(Me)であり、XがOまたはSであり、nが1である、[１]に記載の医薬組成物。
[３] 環状デプシペプチドが、次の式（III）から式（VIII）で表される化合物から成る
群より選択される、[１]に記載の医薬組成物；
[５] 以下の式（I）または式（II）（式中、R1およびR3はそれぞれHまたはC1-C6アルキ
ル基であり、R2はH、C1-C6アルキル基、トリメチルシリル基およびトリエチルシリル基からなる群から選択される置換基であり、R4はH、OH、C1-C6アルコキシ基、F、Cｌ、BrおよびIからなる群から選択される置換基であり、L-MはCH=C(Me)、CH=CH、CH2-CH2およびCH2-CH(Me)からなる群から選択される構造を有し、Xは、OまたはSであり、nは、1または2である）で表される環状デプシペプチドを心筋前駆細胞へ添加する工程を含む、心筋細胞の製造方法。
、R4がメトキシ基であり、L-MがCH=C(Me)であり、XがOまたはSであり、nが1である、[５]に記載の方法。
[７] 環状デプシペプチドが、次の式（III）から式（VIII）で表される化合物から成る
群より選択される、[５]に記載の方法。
胞、または多能性幹細胞から誘導された心筋前駆細胞である、[５]〜[７]のいずれかに記載の方法。
[９] 前記多能性幹細胞から誘導された心筋前駆細胞が、Flk1 (KDR)陽性の細胞である、[８]に記載の方法。
心筋前駆細胞に、上記式（I）または式（II）で表される化合物を接触させると、心筋
細胞の誘導効率を顕著に向上させることができるので、これらの化合物は、心筋前駆細胞または心筋細胞の分化増殖のために特に有用であり、心筋梗塞等の心疾患の治療に用いられる医薬組成物へ含有される。または、心筋前駆細胞を当該化合物と接触させることで、心筋細胞を効率良く得るために特に有用である。
細胞の誘導効率を顕著に向上させることができるので、これらの化合物は、心筋前駆細胞または心筋細胞の分化増殖のために特に有用であり、心筋梗塞等の心疾患の治療に用いられる医薬組成物へ含有される。または、心筋前駆細胞を当該化合物と接触させることで、心筋細胞を効率良く得るために特に有用である。
本発明は、上記の式（I）式または式（II）で表される環状デプシペプチドまたはその
塩を有効成分として含有する医薬組成物を提供する。さらに、当該環状デプシペプチドは、心筋前駆細胞と接触させることにより、心筋細胞を効率良く入手できることから、当該化合物と心筋前駆細胞を接触させる工程を含む心筋細胞の製造方法を提供する。
塩を有効成分として含有する医薬組成物を提供する。さらに、当該環状デプシペプチドは、心筋前駆細胞と接触させることにより、心筋細胞を効率良く入手できることから、当該化合物と心筋前駆細胞を接触させる工程を含む心筋細胞の製造方法を提供する。
本発明において、デプシペプチドとは、一つ以上のエステル結合を有するペプチドであり、環状デプシペプチドとは、少なくとも１つの環構造を有するデプシペプチドである。
本発明において好ましい環状デプシペプチドは、式（I）または式（II）で表される化
合物、またはその薬学上許容される塩、溶媒和物若しくはプロドラッグである。
（式中、R1およびR3がそれぞれH（水素原子）またはC1-C6アルキル基であり、
R2はH、C1-C6アルキル基、トリメチルシリル（TMS）基およびトリエチルシリル（TES）基からなる群から選択される置換基であり、R4はH、OH、C1-C6アルコキシ基、F、Cl、Brお
よびIからなる群から選択される置換基であり、L-MはC(Me)=CH、CH=CH、CH2-CH2およびCH(Me)-CH2からなる群から選択される構造を有し、Xは、O（酸素原子）またはS（硫黄原子
）であり、nは、1または2である。）
合物、またはその薬学上許容される塩、溶媒和物若しくはプロドラッグである。
R2はH、C1-C6アルキル基、トリメチルシリル（TMS）基およびトリエチルシリル（TES）基からなる群から選択される置換基であり、R4はH、OH、C1-C6アルコキシ基、F、Cl、Brお
よびIからなる群から選択される置換基であり、L-MはC(Me)=CH、CH=CH、CH2-CH2およびCH(Me)-CH2からなる群から選択される構造を有し、Xは、O（酸素原子）またはS（硫黄原子
）であり、nは、1または2である。）
本発明において、「C1-C6アルキル基」は、直鎖状、分枝状もしくは環状のアルキル基
を意味し、例えば、メチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、n-ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、シクロブチル基、n-ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、tert-ペンチル基、シクロペエンチ
ル基、n-ヘキシル基、2,2-ジメチルブチル基、3,3-ジメチルブチル基、2-エチルブチル基、およびシクロヘキシル基が挙げられる。
本発明において、「C1-C6アルコキシ基」は、直鎖状、分枝状もしくは環状のアルコキ
シ基を意味し、例えば、メトキシ基、エトキシ基、n-プロポキシ基、イソプロポキシ基、
シクロプロピルオキシ基、1-エチルプロポキシ基、2,2-ジメチルプロポキシ基、n-ブトキシ基、イソブチルオキシ基、tert-ブトキシ基、n-ペンチルオキシ基、シクロペエンチル
オキシ基、n-ヘキシルオキシ基、およびシクロヘキシルオキシ基等が挙げられる。
を意味し、例えば、メチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、n-ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、シクロブチル基、n-ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、tert-ペンチル基、シクロペエンチ
ル基、n-ヘキシル基、2,2-ジメチルブチル基、3,3-ジメチルブチル基、2-エチルブチル基、およびシクロヘキシル基が挙げられる。
本発明において、「C1-C6アルコキシ基」は、直鎖状、分枝状もしくは環状のアルコキ
シ基を意味し、例えば、メトキシ基、エトキシ基、n-プロポキシ基、イソプロポキシ基、
シクロプロピルオキシ基、1-エチルプロポキシ基、2,2-ジメチルプロポキシ基、n-ブトキシ基、イソブチルオキシ基、tert-ブトキシ基、n-ペンチルオキシ基、シクロペエンチル
オキシ基、n-ヘキシルオキシ基、およびシクロヘキシルオキシ基等が挙げられる。
好ましくは、環状デプシペプチドは、表１に記載された置換基を有する式（III）から
式（VIII）に記載された化合物である。
式（VIII）に記載された化合物である。
本発明において、前記環状デプシペプチドは光学異性体、又はラセミ体を含む。
本発明において、環状デプシペプチドの薬学上許容される塩としてしては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩、硝酸塩等の無機酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、アスコルビン酸塩、マロン酸塩、シュウ酸塩、グリコール酸塩、フタル酸塩、ベンゼンスルホン酸塩等の有機酸との塩、または、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩等のアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩；アンモニウム塩；トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、2,6-ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、N,N-ジエチルアミン、シクロヘキシルアミン、N,N'-ジシクロヘキシルアミン、N,N'-ジベンジルエチレンジアミン、N,N-ジメチルアミノピリジン（DMAP）、1,4-ジアザビシクロ〔2.2.2
〕オクタン（DABCO）、1,5-ジアザビシクロ〔4.3.0〕ノネン-5（DBN）、1,8-ジアザビシ
クロ〔5.4.0〕ウンデ-7-セン（DBU）等の有機塩基との塩；アルギニン、リジン、オルニ
チン等の塩基性アミノ酸との塩、または、アスパラギン酸、グルタミン酸等の酸性アミノ酸との塩等が挙げられる。また、これらの塩を組合せて用いることもできる。
本発明において、環状デプシペプチドの薬学上許容される塩としてしては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩、硝酸塩等の無機酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、アスコルビン酸塩、マロン酸塩、シュウ酸塩、グリコール酸塩、フタル酸塩、ベンゼンスルホン酸塩等の有機酸との塩、または、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩等のアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩；アンモニウム塩；トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、2,6-ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、N,N-ジエチルアミン、シクロヘキシルアミン、N,N'-ジシクロヘキシルアミン、N,N'-ジベンジルエチレンジアミン、N,N-ジメチルアミノピリジン（DMAP）、1,4-ジアザビシクロ〔2.2.2
〕オクタン（DABCO）、1,5-ジアザビシクロ〔4.3.0〕ノネン-5（DBN）、1,8-ジアザビシ
クロ〔5.4.0〕ウンデ-7-セン（DBU）等の有機塩基との塩；アルギニン、リジン、オルニ
チン等の塩基性アミノ酸との塩、または、アスパラギン酸、グルタミン酸等の酸性アミノ酸との塩等が挙げられる。また、これらの塩を組合せて用いることもできる。
環状デプシペプチドのプロドラッグとは、生体内で加水分解されて環状デプシペプチドに変換される化合物をいい、例えば、アミノ基をアルカノイル基（アシル基）に置換した誘導体（すなわちアミド化した誘導体）、ヘミアミナールエーテル誘導体、アルコキシカルボニルオキシメチル基に置換した誘導体、Ｎ−オキシド誘導体等が挙げられる。
本発明において、環状デプシペプチドは、Doi T, et al. Chem. Asian J.6, 180, 2011、Doi T, et al. Org. Lett., 8, 531, 2006、Numajiri Y, et al. Chem Asian J, 4, 111, 2009、Zou B, et al. Org Lett, 5, 3503, 2003およびQi-Yin Chen, et al. ACS Med.
Chem. Lett., 2, 861−865, 2011に記載の方法及びそれに準じた方法によって合成する
ことができる。または、Hendrik L, et al. J. Am. Chem. Soc. 123, 5418, 2001に記載
されたようにシアノバクテリアを凍結乾燥し、有機溶媒への溶解層より抽出することができる。
Chem. Lett., 2, 861−865, 2011に記載の方法及びそれに準じた方法によって合成する
ことができる。または、Hendrik L, et al. J. Am. Chem. Soc. 123, 5418, 2001に記載
されたようにシアノバクテリアを凍結乾燥し、有機溶媒への溶解層より抽出することができる。
本発明はまた、環状デプシペプチドを含有する医薬組成物を提供する。本発明において対象となる疾患は、心疾患であり、例えば、心不全、虚血性心疾患または心筋症等が上げられる。
本発明の環状デプシペプチドはそのまま単独で、または薬理学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤等と混合し、適当な剤型の医薬組成物として経口的又は非経口的に投与することができる。
経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等が挙げられる。一方、非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を包含しても良い。これらの製剤は、賦形剤（例えば、乳糖、白糖、葡萄糖、マンニトール、ソルビトールのような糖誘導体；トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、α澱粉、デキストリンのような澱粉誘導体；結晶セルロースのようなセルロース誘導体；アラビアゴム；デキストラン；プルランのような有機系賦形剤；及び、軽質無水珪酸、合成珪酸アルミニウム、珪酸カルシウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウムのような珪酸塩誘導体；燐酸水素カルシウムのような燐酸塩；炭酸カルシウムのような炭酸塩；硫酸カルシウムのような硫酸塩等の無機系賦形剤である）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウムのようなステアリン酸金属塩；タルク；コロイドシリカ；ビーズワックス、ゲイ蝋のようなワックス類；硼酸；アジピン酸；硫酸ナトリウムのような硫酸塩；グリコール；フマル酸
；安息香酸ナトリウム；ＤＬロイシン；ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウムのようなラウリル硫酸塩；無水珪酸、珪酸水和物のような珪酸類；及び、上記澱粉誘導体である）、結合剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴール、及び、前記賦形剤と同様の化合物である）、崩壊剤（例えば、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、内部架橋カルボキシメチルセルロースナトリウムのようなセルロース誘導体；カルボキシメチルスターチ、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドンのような化学修飾されたデンプン・セルロース類である）、乳化剤（例えば、ベントナイト、ビーガムのようなコロイド性粘土；水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウムのような金属水酸化物；ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸カルシウムのような陰イオン界面活性剤；塩化ベンザルコニウムのような陽イオン界面活性剤；及び、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステルのような非イオン界面活性剤である）、安定剤（メチルパラベン、プロピルパラベンのようなパラオキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコールのようなアルコール類；塩化ベンザルコニウム；フェノール、クレゾールのようなフェノール類；チメロサール；デヒドロ酢酸；及び、ソルビン酸である）、矯味矯臭剤（例えば、通常使用される、甘味料、酸味料、香料等である）、希釈剤等の添加剤を用いて周知の方法で製造される。
；安息香酸ナトリウム；ＤＬロイシン；ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウムのようなラウリル硫酸塩；無水珪酸、珪酸水和物のような珪酸類；及び、上記澱粉誘導体である）、結合剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴール、及び、前記賦形剤と同様の化合物である）、崩壊剤（例えば、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、内部架橋カルボキシメチルセルロースナトリウムのようなセルロース誘導体；カルボキシメチルスターチ、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドンのような化学修飾されたデンプン・セルロース類である）、乳化剤（例えば、ベントナイト、ビーガムのようなコロイド性粘土；水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウムのような金属水酸化物；ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸カルシウムのような陰イオン界面活性剤；塩化ベンザルコニウムのような陽イオン界面活性剤；及び、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステルのような非イオン界面活性剤である）、安定剤（メチルパラベン、プロピルパラベンのようなパラオキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコールのようなアルコール類；塩化ベンザルコニウム；フェノール、クレゾールのようなフェノール類；チメロサール；デヒドロ酢酸；及び、ソルビン酸である）、矯味矯臭剤（例えば、通常使用される、甘味料、酸味料、香料等である）、希釈剤等の添加剤を用いて周知の方法で製造される。
本発明における環状デプシペプチドの投与量は、患者の症状、年齢、体重等の種々の条件により変化し得る。
その投与量は症状、年齢等により異なるが、経口投与の場合には、１回当たり下限0.1mg（好適には0.5mg）、上限1000mg（好適には500mg）を、非経口的投与の場合には、１回
当たり下限0.01mg（好適には0.05mg）、上限100mg（好適には50mg）を、成人に対して１
日当たり1乃至6回投与することができる。症状に応じて増量もしくは減量してもよい。
当たり下限0.01mg（好適には0.05mg）、上限100mg（好適には50mg）を、成人に対して１
日当たり1乃至6回投与することができる。症状に応じて増量もしくは減量してもよい。
本発明は、また、環状デプシペプチドを心筋前駆細胞へ添加する工程を含む、心筋細胞の製造方法を提供する。当該工程は、in vitroであってもin vivoであっても良いが、好
ましくは環状デプシペプチドを単離された心筋前駆細胞へ添加する、in vitroの方法である。
ここで、心筋細胞とは、自己拍動の特性を有する心筋の細胞を意味する。
また、心筋前駆細胞とは、前記心筋細胞の前駆細胞であって、培養または成熟によって心筋細胞を生じる能力を有する細胞であり、例えば、生体の心臓に含まれる心筋幹細胞および心筋前駆細胞、多能性幹細胞から分化誘導された細胞、骨髄細胞、骨格筋芽細胞または脂肪由来間葉系細胞に含まれる細胞またはこれらの細胞から分化誘導された細胞（特開2006-115771、特開2003-325169および特開2008-307205）が挙げられる。また、心筋幹細
胞および心筋前駆細胞は、別段の記載がなければ特に区別されない。ここで、生体の心臓に含まれる心筋前駆細胞として、心臓に含まれる細胞のうちside populationに存在する
細胞（SP細胞）が例示される（Oyama T, et al. J Cell Biol. 176, 329-341, 2007）。SP細胞とは、Hoechst33342 というＤＮＡ蛍光色素に対して高い排出能を有する細胞を意味する。心筋細胞および心筋前駆細胞は互いに混在していても良く、また、単離されていても良い。
ましくは環状デプシペプチドを単離された心筋前駆細胞へ添加する、in vitroの方法である。
ここで、心筋細胞とは、自己拍動の特性を有する心筋の細胞を意味する。
また、心筋前駆細胞とは、前記心筋細胞の前駆細胞であって、培養または成熟によって心筋細胞を生じる能力を有する細胞であり、例えば、生体の心臓に含まれる心筋幹細胞および心筋前駆細胞、多能性幹細胞から分化誘導された細胞、骨髄細胞、骨格筋芽細胞または脂肪由来間葉系細胞に含まれる細胞またはこれらの細胞から分化誘導された細胞（特開2006-115771、特開2003-325169および特開2008-307205）が挙げられる。また、心筋幹細
胞および心筋前駆細胞は、別段の記載がなければ特に区別されない。ここで、生体の心臓に含まれる心筋前駆細胞として、心臓に含まれる細胞のうちside populationに存在する
細胞（SP細胞）が例示される（Oyama T, et al. J Cell Biol. 176, 329-341, 2007）。SP細胞とは、Hoechst33342 というＤＮＡ蛍光色素に対して高い排出能を有する細胞を意味する。心筋細胞および心筋前駆細胞は互いに混在していても良く、また、単離されていても良い。
本発明において、心筋細胞はまた、心筋マーカーである心筋トロポニン（cTNTまたはtroponin T type 2）および/またはαMHC（α myosin heavy chain）が陽性であることによって特徴づけられる。
また、心筋前駆細胞は、特に限定されないが、Flk1/KDR、islet1、Wt1および/またはN-Cadherinが陽性であること、および/またはFACS解析においてside population（SP細胞分
画）に存在することによって特徴づけられる。
また、心筋前駆細胞は、特に限定されないが、Flk1/KDR、islet1、Wt1および/またはN-Cadherinが陽性であること、および/またはFACS解析においてside population（SP細胞分
画）に存在することによって特徴づけられる。
本発明において、心筋前駆細胞は、in vitroで多能性幹細胞を分化させることによって用意されても良い。ここで、多能性幹細胞とは、生体に存在するすべての細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、増殖能をも併せもつ幹細胞であり、それには、特に限定されないが、例えば胚性幹(ES)細胞、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹(ntES)細胞、精子幹細胞（「GS細胞」）、胚性生殖細胞（「EG細胞」）、人工多能性幹(iPS)細胞
、培養線維芽細胞や骨髄幹細胞由来の多能性細胞（Muse細胞）などが含まれる。
、培養線維芽細胞や骨髄幹細胞由来の多能性細胞（Muse細胞）などが含まれる。
(A) 胚性幹細胞
ES細胞は、ヒトやマウスなどの哺乳動物の初期胚（例えば胚盤胞）の内部細胞塊から樹立された、多能性と自己複製による増殖能を有する幹細胞である。
ES細胞は、ヒトやマウスなどの哺乳動物の初期胚（例えば胚盤胞）の内部細胞塊から樹立された、多能性と自己複製による増殖能を有する幹細胞である。
ES細胞は、受精卵の8細胞期、桑実胚後の胚である胚盤胞の内部細胞塊に由来する胚由
来の幹細胞であり、成体を構成するあらゆる細胞に分化する能力、いわゆる分化多能性と、自己複製による増殖能とを有している。ES細胞は、マウスで1981年に発見され (M.J. Evans and M.H. Kaufman (1981), Nature 292:154-156)、その後、ヒト、サルなどの霊長
類でもES細胞株が樹立された (J.A. Thomson et al. (1998), Science 282:1145-1147; J.A. Thomson et al. (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:7844-7848;J.A. Thomson
et al. (1996), Biol. Reprod., 55:254-259; J.A. Thomson and V.S. Marshall (1998), Curr. Top. Dev. Biol., 38:133-165)。
来の幹細胞であり、成体を構成するあらゆる細胞に分化する能力、いわゆる分化多能性と、自己複製による増殖能とを有している。ES細胞は、マウスで1981年に発見され (M.J. Evans and M.H. Kaufman (1981), Nature 292:154-156)、その後、ヒト、サルなどの霊長
類でもES細胞株が樹立された (J.A. Thomson et al. (1998), Science 282:1145-1147; J.A. Thomson et al. (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:7844-7848;J.A. Thomson
et al. (1996), Biol. Reprod., 55:254-259; J.A. Thomson and V.S. Marshall (1998), Curr. Top. Dev. Biol., 38:133-165)。
ES細胞は、対象動物の受精卵の胚盤胞から内部細胞塊を取出し、内部細胞塊を線維芽細胞のフィーダー上で培養することによって樹立することができる。また、継代培養による細胞の維持は、白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor (LIF))、塩基性線維芽細胞成長因子(basic fibroblast growth factor (bFGF))などの物質を添加した培養液を用い
て行うことができる。ヒトおよびサルのES細胞の樹立と維持の方法については、例えばUSP5,843,780; Thomson JA, et al. (1995), Proc Natl. Acad. Sci. U S A. 92:7844-7848； Thomson JA, et al. (1998), Science. 282:1145-1147； H. Suemori et al. (2006),
Biochem. Biophys. Res. Commun., 345:926-932； M. Ueno et al. (2006), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:9554-9559； H. Suemori et al. (2001), Dev. Dyn., 222:273-279;H. Kawasaki et al. (2002), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:1580-1585；Klimanskaya I, et al. (2006), Nature. 444:481-485などに記載されている。
て行うことができる。ヒトおよびサルのES細胞の樹立と維持の方法については、例えばUSP5,843,780; Thomson JA, et al. (1995), Proc Natl. Acad. Sci. U S A. 92:7844-7848； Thomson JA, et al. (1998), Science. 282:1145-1147； H. Suemori et al. (2006),
Biochem. Biophys. Res. Commun., 345:926-932； M. Ueno et al. (2006), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:9554-9559； H. Suemori et al. (2001), Dev. Dyn., 222:273-279;H. Kawasaki et al. (2002), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:1580-1585；Klimanskaya I, et al. (2006), Nature. 444:481-485などに記載されている。
ES細胞作製のための培養液として、例えば0.1mM 2-メルカプトエタノール、0.1mM 非必須アミノ酸、2mM L-グルタミン酸、20% KSRおよび4ng/ml bFGFを補充したDMEM/F-12培養
液を使用し、37℃、2% CO2/98% 空気の湿潤雰囲気下でヒトES細胞を維持することができ
る(O. Fumitaka et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26:215-224)。また、ES細胞は、3〜4日おきに継代する必要があり、このとき、継代は、例えば1mM CaCl2および20% KSRを含
有するPBS中の0.25% トリプシンおよび0.1mg/mlコラゲナーゼIVを用いて行うことができ
る。
液を使用し、37℃、2% CO2/98% 空気の湿潤雰囲気下でヒトES細胞を維持することができ
る(O. Fumitaka et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26:215-224)。また、ES細胞は、3〜4日おきに継代する必要があり、このとき、継代は、例えば1mM CaCl2および20% KSRを含
有するPBS中の0.25% トリプシンおよび0.1mg/mlコラゲナーゼIVを用いて行うことができ
る。
ES細胞の選択は、一般に、アルカリホスファターゼ、Oct-3/4、Nanogなどの遺伝子マーカーの発現を指標にしてReal-Time PCR法で行うことができる。特に、ヒトES細胞の選択
では、OCT-3/4、NANOG、ECADなどの遺伝子マーカーの発現を指標とすることができる(E. Kroon et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26:443-452)。
では、OCT-3/4、NANOG、ECADなどの遺伝子マーカーの発現を指標とすることができる(E. Kroon et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26:443-452)。
ヒトＥＳ細胞株は、例えばWA01(H1)およびWA09(H9)は、WiCell Reserch Instituteから、KhES-1、KhES-2およびKhES-3は、京都大学再生医科学研究所(京都、日本)から入手可能である。
(B) 精子幹細胞
精子幹細胞は、精巣由来の多能性幹細胞であり、精子形成のための起源となる細胞である。この細胞は、ES細胞と同様に、種々の系列の細胞に分化誘導可能であり、例えばマウス胚盤胞に移植するとキメラマウスを作出できるなどの性質をもつ(M. Kanatsu-Shinohara et al. (2003) Biol. Reprod., 69:612-616; K. Shinohara et al. (2004), Cell, 119:1001-1012)。神経膠細胞系由来神経栄養因子(glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF))を含む培養液で自己複製可能であるし、またES細胞と同様の培養条件下で
継代を繰り返すことによって、精子幹細胞を得ることができる(竹林正則ら(2008),実験医学,26巻,5号(増刊),41〜46頁,羊土社(東京、日本))。
精子幹細胞は、精巣由来の多能性幹細胞であり、精子形成のための起源となる細胞である。この細胞は、ES細胞と同様に、種々の系列の細胞に分化誘導可能であり、例えばマウス胚盤胞に移植するとキメラマウスを作出できるなどの性質をもつ(M. Kanatsu-Shinohara et al. (2003) Biol. Reprod., 69:612-616; K. Shinohara et al. (2004), Cell, 119:1001-1012)。神経膠細胞系由来神経栄養因子(glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF))を含む培養液で自己複製可能であるし、またES細胞と同様の培養条件下で
継代を繰り返すことによって、精子幹細胞を得ることができる(竹林正則ら(2008),実験医学,26巻,5号(増刊),41〜46頁,羊土社(東京、日本))。
(C) 胚性生殖細胞
胚性生殖細胞は、胎生期の始原生殖細胞から樹立される、ES細胞と同様な多能性をもつ細胞であり、LIF、bFGF、幹細胞因子(stem cell factor)などの物質の存在下で始原生殖
細胞を培養することによって樹立しうる(Y. Matsui et al. (1992), Cell, 70:841-847; J.L. Resnick et al. (1992), Nature, 359:550-551)。
胚性生殖細胞は、胎生期の始原生殖細胞から樹立される、ES細胞と同様な多能性をもつ細胞であり、LIF、bFGF、幹細胞因子(stem cell factor)などの物質の存在下で始原生殖
細胞を培養することによって樹立しうる(Y. Matsui et al. (1992), Cell, 70:841-847; J.L. Resnick et al. (1992), Nature, 359:550-551)。
(D) 人工多能性幹細胞
人工多能性幹(iPS)細胞は、特定の初期化因子を、DNA又はタンパク質の形態で体細胞に導入することによって作製することができる、ES細胞とほぼ同等の特性、例えば分化多能性と自己複製による増殖能、を有する体細胞由来の人工の幹細胞である（K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126:663-676; K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131:861-872; J. Yu et al. (2007), Science, 318:1917-1920; Nakagawa, M.ら,Nat. Biotechnol. 26:101-106 (2008)；国際公開WO 2007/069666）。初期化因子は、ES細胞に特異的に発現している遺伝子、その遺伝子産物もしくはnon-cording RNAまたはES細胞の未分化維
持に重要な役割を果たす遺伝子、その遺伝子産物もしくはnon-coding RNA、あるいは低分子化合物によって構成されてもよい。初期化因子に含まれる遺伝子として、例えば、Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、beta-catenin、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3またはGlis1等が例示され、これらの初期化因子は、単独で用いても良く、組み合
わせて用いても良い。初期化因子の組み合わせとしては、WO2007/069666、WO2008/118820、WO2009/007852、WO2009/032194、WO2009/058413、WO2009/057831、WO2009/075119、WO2009/079007、WO2009/091659、WO2009/101084、WO2009/101407、WO2009/102983、WO2009/114949、WO2009/117439、WO2009/126250、WO2009/126251、WO2009/126655、WO2009/157593、WO2010/009015、WO2010/033906、WO2010/033920、WO2010/042800、WO2010/050626、WO 2010/056831、WO2010/068955、WO2010/098419、WO2010/102267、WO 2010/111409、WO 2010/111422、WO2010/115050、WO2010/124290、WO2010/147395、WO2010/147612、Huangfu D,
et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26: 795-797、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 2: 525-528、Eminli S, et al. (2008), Stem Cells. 26:2467-2474、Huangfu D, et al. (2008), Nat Biotechnol. 26:1269-1275、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3, 568-574、Zhao Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3:475-479、Marson A, (2008), Cell Stem Cell, 3, 132-135、Feng B, et al. (2009), Nat Cell Biol. 11:197-203、R.L. Judson et al., (2009), Nat. Biotech., 27:459-461、Lyssiotis CA, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:8912-8917、Kim JB, et al. (2009), Nature. 461:649-643、Ichida JK, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:491-503、Heng JC, et al. (2010), Cell Stem Cell. 6:167-74、Han J, et al. (2010), Nature. 463:1096-100、Mali
P, et al. (2010), Stem Cells. 28:713-720、Maekawa M, et al. (2011), Nature. 474:225-9.に記載の組み合わせが例示される。
人工多能性幹(iPS)細胞は、特定の初期化因子を、DNA又はタンパク質の形態で体細胞に導入することによって作製することができる、ES細胞とほぼ同等の特性、例えば分化多能性と自己複製による増殖能、を有する体細胞由来の人工の幹細胞である（K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126:663-676; K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131:861-872; J. Yu et al. (2007), Science, 318:1917-1920; Nakagawa, M.ら,Nat. Biotechnol. 26:101-106 (2008)；国際公開WO 2007/069666）。初期化因子は、ES細胞に特異的に発現している遺伝子、その遺伝子産物もしくはnon-cording RNAまたはES細胞の未分化維
持に重要な役割を果たす遺伝子、その遺伝子産物もしくはnon-coding RNA、あるいは低分子化合物によって構成されてもよい。初期化因子に含まれる遺伝子として、例えば、Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、beta-catenin、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3またはGlis1等が例示され、これらの初期化因子は、単独で用いても良く、組み合
わせて用いても良い。初期化因子の組み合わせとしては、WO2007/069666、WO2008/118820、WO2009/007852、WO2009/032194、WO2009/058413、WO2009/057831、WO2009/075119、WO2009/079007、WO2009/091659、WO2009/101084、WO2009/101407、WO2009/102983、WO2009/114949、WO2009/117439、WO2009/126250、WO2009/126251、WO2009/126655、WO2009/157593、WO2010/009015、WO2010/033906、WO2010/033920、WO2010/042800、WO2010/050626、WO 2010/056831、WO2010/068955、WO2010/098419、WO2010/102267、WO 2010/111409、WO 2010/111422、WO2010/115050、WO2010/124290、WO2010/147395、WO2010/147612、Huangfu D,
et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26: 795-797、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 2: 525-528、Eminli S, et al. (2008), Stem Cells. 26:2467-2474、Huangfu D, et al. (2008), Nat Biotechnol. 26:1269-1275、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3, 568-574、Zhao Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3:475-479、Marson A, (2008), Cell Stem Cell, 3, 132-135、Feng B, et al. (2009), Nat Cell Biol. 11:197-203、R.L. Judson et al., (2009), Nat. Biotech., 27:459-461、Lyssiotis CA, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:8912-8917、Kim JB, et al. (2009), Nature. 461:649-643、Ichida JK, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:491-503、Heng JC, et al. (2010), Cell Stem Cell. 6:167-74、Han J, et al. (2010), Nature. 463:1096-100、Mali
P, et al. (2010), Stem Cells. 28:713-720、Maekawa M, et al. (2011), Nature. 474:225-9.に記載の組み合わせが例示される。
上記初期化因子には、ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）阻害剤［例えば、バルプロ酸 (
VPA)、トリコスタチンA、酪酸ナトリウム、MC 1293、M344等の低分子阻害剤、HDACに対するsiRNAおよびshRNA（例、HDAC1 siRNA Smartpool( (Millipore)、HuSH 29mer shRNA Constructs against HDAC1 (OriGene)等）等の核酸性発現阻害剤など］、MEK阻害剤（例えば、PD184352、PD98059、U0126、SL327およびPD0325901）、Glycogen synthase kinase-3阻害剤（例えば、BioおよびCHIR99021）、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、5-azacytidine）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、BIX-01294 等の低分子阻害剤、Suv39hl、Suv39h2、SetDBlおよびG9aに対するsiRNAおよびshRNA等の核酸性
発現阻害剤など）、L-channel calcium agonist (例えばBayk8644)、酪酸、TGFβ阻害剤
またはALK5阻害剤（例えば、LY364947、SB431542、616453およびA-83-01）、p53阻害剤（例えばp53に対するsiRNAおよびshRNA）、ARID3A阻害剤（例えば、ARID3Aに対するsiRNAおよびshRNA）、miR-291-3p、miR-294、miR-295およびmir-302などのmiRNA、Wnt Signaling（例えばsoluble Wnt3a）、神経ペプチドY、プロスタグランジン類（例えば、プロスタグランジンE2およびプロスタグランジンJ2）、hTERT、SV40LT、UTF1、IRX6、GLISl、PITX2
、DMRTBl等の樹立効率を高めることを目的として用いられる因子も含まれており、本明細書においては、これらの樹立効率の改善目的にて用いられた因子についても初期化因子と別段の区別をしないものとする。
VPA)、トリコスタチンA、酪酸ナトリウム、MC 1293、M344等の低分子阻害剤、HDACに対するsiRNAおよびshRNA（例、HDAC1 siRNA Smartpool( (Millipore)、HuSH 29mer shRNA Constructs against HDAC1 (OriGene)等）等の核酸性発現阻害剤など］、MEK阻害剤（例えば、PD184352、PD98059、U0126、SL327およびPD0325901）、Glycogen synthase kinase-3阻害剤（例えば、BioおよびCHIR99021）、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、5-azacytidine）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、BIX-01294 等の低分子阻害剤、Suv39hl、Suv39h2、SetDBlおよびG9aに対するsiRNAおよびshRNA等の核酸性
発現阻害剤など）、L-channel calcium agonist (例えばBayk8644)、酪酸、TGFβ阻害剤
またはALK5阻害剤（例えば、LY364947、SB431542、616453およびA-83-01）、p53阻害剤（例えばp53に対するsiRNAおよびshRNA）、ARID3A阻害剤（例えば、ARID3Aに対するsiRNAおよびshRNA）、miR-291-3p、miR-294、miR-295およびmir-302などのmiRNA、Wnt Signaling（例えばsoluble Wnt3a）、神経ペプチドY、プロスタグランジン類（例えば、プロスタグランジンE2およびプロスタグランジンJ2）、hTERT、SV40LT、UTF1、IRX6、GLISl、PITX2
、DMRTBl等の樹立効率を高めることを目的として用いられる因子も含まれており、本明細書においては、これらの樹立効率の改善目的にて用いられた因子についても初期化因子と別段の区別をしないものとする。
初期化因子は、タンパク質の形態の場合、例えばリポフェクション、細胞膜透過性ペプチド（例えば、HIV由来のTATおよびポリアルギニン）との融合、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入してもよい。
一方、DNAの形態の場合、例えば、ウイルス、プラスミド、人工染色体などのベクター
、リポフェクション、リポソーム、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入することができる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター（以上、Cell, 126, pp.663-676, 2006; Cell, 131, pp.861-872, 2007; Science, 318, pp.1917-1920, 2007）、アデノウイルスベクター(Science, 322, 945-949, 2008)、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクター（WO 2010/008054）などが例示される。また、人工染色体ベクターとしては、例えばヒト人工染色体(HAC)、酵母人工染色体(YAC)、細菌人工染色体(BAC、PAC)などが含まれる。プラスミドとして
は、哺乳動物細胞用プラスミドを使用しうる(Science, 322:949-953, 2008)。ベクターには、核初期化物質が発現可能なように、プロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合配列、ターミネーター、ポリアデニル化サイトなどの制御配列を含むことができるし、さらに、必要に応じて、薬剤耐性遺伝子(例えばカナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性
遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子など）、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリアトキシン遺伝子などの選択マーカー配列、緑色蛍光タンパク質(GFP)、βグルクロニダーゼ(GUS)、FLAGなどのレポーター遺伝子配列などを含むことができる。また、上記ベクターには、体細胞への導入後、初期化因子をコードする遺伝子もしくはプロモーターとそれに結合する初期化因子をコードする遺伝子を共に切除するために、それらの前後にLoxP配列を有してもよい。
、リポフェクション、リポソーム、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入することができる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター（以上、Cell, 126, pp.663-676, 2006; Cell, 131, pp.861-872, 2007; Science, 318, pp.1917-1920, 2007）、アデノウイルスベクター(Science, 322, 945-949, 2008)、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクター（WO 2010/008054）などが例示される。また、人工染色体ベクターとしては、例えばヒト人工染色体(HAC)、酵母人工染色体(YAC)、細菌人工染色体(BAC、PAC)などが含まれる。プラスミドとして
は、哺乳動物細胞用プラスミドを使用しうる(Science, 322:949-953, 2008)。ベクターには、核初期化物質が発現可能なように、プロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合配列、ターミネーター、ポリアデニル化サイトなどの制御配列を含むことができるし、さらに、必要に応じて、薬剤耐性遺伝子(例えばカナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性
遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子など）、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリアトキシン遺伝子などの選択マーカー配列、緑色蛍光タンパク質(GFP)、βグルクロニダーゼ(GUS)、FLAGなどのレポーター遺伝子配列などを含むことができる。また、上記ベクターには、体細胞への導入後、初期化因子をコードする遺伝子もしくはプロモーターとそれに結合する初期化因子をコードする遺伝子を共に切除するために、それらの前後にLoxP配列を有してもよい。
また、RNAの形態の場合、例えばリポフェクション、マイクロインジェクションなどの
手法によって体細胞内に導入しても良く、分解を抑制するため、5-メチルシチジンおよびpseudouridine (TriLink Biotechnologies)を取り込ませたRNAを用いても良い（Warren L, (2010) Cell Stem Cell. 7:618-630）。
手法によって体細胞内に導入しても良く、分解を抑制するため、5-メチルシチジンおよびpseudouridine (TriLink Biotechnologies)を取り込ませたRNAを用いても良い（Warren L, (2010) Cell Stem Cell. 7:618-630）。
iPS細胞誘導のための培養液としては、例えば、10〜15％FBSを含有するDMEM、DMEM/F12又はDME培養液（これらの培養液にはさらに、LIF、penicillin/streptomycin、puromycin、L-グルタミン、非必須アミノ酸類、β-メルカプトエタノールなどを適宜含むことがで
きる。）または市販の培養液[例えば、マウスES細胞培養用培養液(TX-WES培養液、トロンボＸ社)、霊長類ES細胞培養用培養液（霊長類ES/iPS細胞用培養液、リプロセル社）、無
血清培地（mTeSR、Stemcell Technology社）]などが含まれる。
きる。）または市販の培養液[例えば、マウスES細胞培養用培養液(TX-WES培養液、トロンボＸ社)、霊長類ES細胞培養用培養液（霊長類ES/iPS細胞用培養液、リプロセル社）、無
血清培地（mTeSR、Stemcell Technology社）]などが含まれる。
培養法の例としては、たとえば、37℃、5％CO2存在下にて、10％FBS含有DMEM又はDMEM/F12培養液上で体細胞と初期化因子とを接触させ約4〜7日間培養し、その後、細胞をフィ
ーダー細胞(たとえば、マイトマイシンC処理STO細胞、SNL細胞等)上にまきなおし、体細
胞と初期化因子の接触から約10日後からbFGF含有霊長類ES細胞培養用培養液で培養し、該接触から約30〜約45日又はそれ以上ののちにiPS様コロニーを生じさせることができる。
ーダー細胞(たとえば、マイトマイシンC処理STO細胞、SNL細胞等)上にまきなおし、体細
胞と初期化因子の接触から約10日後からbFGF含有霊長類ES細胞培養用培養液で培養し、該接触から約30〜約45日又はそれ以上ののちにiPS様コロニーを生じさせることができる。
あるいは、37℃、5% CO2存在下にて、フィーダー細胞(たとえば、マイトマイシンC処理STO細胞、SNL細胞等)上で10％FBS含有DMEM培養液（これにはさらに、LIF、ペニシリン/ストレプトマイシン、ピューロマイシン、L-グルタミン、非必須アミノ酸類、β-メルカプ
トエタノールなどを適宜含むことができる。）で培養し、約25〜約30日又はそれ以上ののちにES様コロニーを生じさせることができる。望ましくは、フィーダー細胞の代わりに、初期化される体細胞そのものを用いる（Takahashi K, et al. (2009), PLoS One. 4:e8067またはWO2010/137746）、もしくは細胞外基質（例えば、Laminin-5（WO2009/123349）およびマトリゲル（BD社））を用いる方法が例示される。
トエタノールなどを適宜含むことができる。）で培養し、約25〜約30日又はそれ以上ののちにES様コロニーを生じさせることができる。望ましくは、フィーダー細胞の代わりに、初期化される体細胞そのものを用いる（Takahashi K, et al. (2009), PLoS One. 4:e8067またはWO2010/137746）、もしくは細胞外基質（例えば、Laminin-5（WO2009/123349）およびマトリゲル（BD社））を用いる方法が例示される。
この他にも、血清を含有しない培地を用いて培養する方法も例示される（Sun N, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:15720-15725）。さらに、樹立効率を上げる
ため、低酸素条件（0.1％以上、15％以下の酸素濃度）によりiPS細胞を樹立しても良い（Yoshida Y, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:237-241またはWO2010/013845）。
ため、低酸素条件（0.1％以上、15％以下の酸素濃度）によりiPS細胞を樹立しても良い（Yoshida Y, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:237-241またはWO2010/013845）。
上記培養の間には、培養開始2日目以降から毎日1回新鮮な培養液と培養液交換を行う。また、核初期化に使用する体細胞の細胞数は、限定されないが、培養ディッシュ100cm2あたり約5×103〜約5×106細胞の範囲である。
iPS細胞は、形成したコロニーの形状により選択することが可能である。一方、体細胞
が初期化された場合に発現する遺伝子（例えば、Oct3/4、Nanog）と連動して発現する薬
剤耐性遺伝子をマーカー遺伝子として導入した場合は、対応する薬剤を含む培養液（選択培養液）で培養を行うことにより樹立したiPS細胞を選択することができる。また、マー
カー遺伝子が蛍光タンパク質遺伝子の場合は蛍光顕微鏡で観察することによって、発光酵素遺伝子の場合は発光基質を加えることによって、また発色酵素遺伝子の場合は発色基質を加えることによって、iPS細胞を選択することができる。
が初期化された場合に発現する遺伝子（例えば、Oct3/4、Nanog）と連動して発現する薬
剤耐性遺伝子をマーカー遺伝子として導入した場合は、対応する薬剤を含む培養液（選択培養液）で培養を行うことにより樹立したiPS細胞を選択することができる。また、マー
カー遺伝子が蛍光タンパク質遺伝子の場合は蛍光顕微鏡で観察することによって、発光酵素遺伝子の場合は発光基質を加えることによって、また発色酵素遺伝子の場合は発色基質を加えることによって、iPS細胞を選択することができる。
本明細書中で使用する「体細胞」なる用語は、卵子、卵母細胞、ES細胞などの生殖系列細胞または分化全能性細胞を除くあらゆる動物細胞（好ましくは、ヒトを含む哺乳動物細胞）をいう。体細胞には、非限定的に、胎児(仔)の体細胞、新生児(仔)の体細胞、および成熟した健全なもしくは疾患性の体細胞のいずれも包含されるし、また、初代培養細胞、継代細胞、および株化細胞のいずれも包含される。具体的には、体細胞は、例えば（1）
神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）、（2）組織前駆細胞、（3）リンパ球、上皮細胞、内皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞（皮膚細胞等）、毛細胞、肝細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞(膵外分泌細胞等)、脳細胞、肺細胞、腎細胞および脂肪細胞等の分化した細胞などが例示される。
神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）、（2）組織前駆細胞、（3）リンパ球、上皮細胞、内皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞（皮膚細胞等）、毛細胞、肝細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞(膵外分泌細胞等)、脳細胞、肺細胞、腎細胞および脂肪細胞等の分化した細胞などが例示される。
また、iPS細胞を移植用細胞の材料として用いる場合、拒絶反応が起こらないという観
点から、移植先の個体のHLA遺伝子型が同一もしくは実質的に同一である体細胞を用いる
ことが望ましい。ここで、「実質的に同一」とは、移植した細胞に対して免疫抑制剤により免疫反応が抑制できる程度にHLA遺伝子型が一致していることであり、例えば、HLA-A、HLA-BおよびHLA-DRの3遺伝子座あるいはHLA-Cを加えた4遺伝子座が一致するHLA型を有す
る体細胞である。
点から、移植先の個体のHLA遺伝子型が同一もしくは実質的に同一である体細胞を用いる
ことが望ましい。ここで、「実質的に同一」とは、移植した細胞に対して免疫抑制剤により免疫反応が抑制できる程度にHLA遺伝子型が一致していることであり、例えば、HLA-A、HLA-BおよびHLA-DRの3遺伝子座あるいはHLA-Cを加えた4遺伝子座が一致するHLA型を有す
る体細胞である。
(E) 核移植により得られたクローン胚由来のES細胞
nt ES細胞は、核移植技術によって作製されたクローン胚由来のES細胞であり、受精卵
由来のES細胞とほぼ同じ特性を有している （T. Wakayama et al. (2001), Science, 292:740-743; S. Wakayama et al. (2005), Biol. Reprod., 72:932-936; J. Byrne et al.
(2007), Nature, 450:497-502）。すなわち、未受精卵の核を体細胞の核と置換することによって得られたクローン胚由来の胚盤胞の内部細胞塊から樹立されたES細胞がnt ES(nuclear transfer ES)細胞である。nt ES細胞の作製のためには、核移植技術（J.B. Cibelli et al. (1998), Nature Biotechnol., 16:642-646）とES細胞作製技術(上記)との組み
合わせが利用される(若山清香ら(2008),実験医学,26巻,5号(増刊), 47〜52頁)。核移植においては、哺乳動物の除核した未受精卵に、体細胞の核を注入し、数時間培養することで初期化することができる。
nt ES細胞は、核移植技術によって作製されたクローン胚由来のES細胞であり、受精卵
由来のES細胞とほぼ同じ特性を有している （T. Wakayama et al. (2001), Science, 292:740-743; S. Wakayama et al. (2005), Biol. Reprod., 72:932-936; J. Byrne et al.
(2007), Nature, 450:497-502）。すなわち、未受精卵の核を体細胞の核と置換することによって得られたクローン胚由来の胚盤胞の内部細胞塊から樹立されたES細胞がnt ES(nuclear transfer ES)細胞である。nt ES細胞の作製のためには、核移植技術（J.B. Cibelli et al. (1998), Nature Biotechnol., 16:642-646）とES細胞作製技術(上記)との組み
合わせが利用される(若山清香ら(2008),実験医学,26巻,5号(増刊), 47〜52頁)。核移植においては、哺乳動物の除核した未受精卵に、体細胞の核を注入し、数時間培養することで初期化することができる。
(F) Multilineage-differentiating Stress Enduring cells（Muse細胞）
Muse細胞は、WO2011/007900に記載された方法にて製造された多能性幹細胞であり、詳
細には、線維芽細胞または骨髄間質細胞を長時間トリプシン処理、好ましくは8時間また
は16時間トリプシン処理した後、浮遊培養することで得られる多能性を有した細胞であり、SSEA-3およびCD105が陽性である。
Muse細胞は、WO2011/007900に記載された方法にて製造された多能性幹細胞であり、詳
細には、線維芽細胞または骨髄間質細胞を長時間トリプシン処理、好ましくは8時間また
は16時間トリプシン処理した後、浮遊培養することで得られる多能性を有した細胞であり、SSEA-3およびCD105が陽性である。
本発明では、多能性幹細胞から心筋前駆細胞への分化誘導方法は特に限定されないが、例えば、以下の方法を用いることができる。
多能性幹細胞を任意の方法で分離し、浮遊培養もしくはコーティング処理された培養皿を用いて接着培養または/およびフィーダー細胞との共培養を行ってもよい。また、浮遊
培養および接着培養を組み合わせて行っても良い。ここで、分離の方法としては、力学的、プロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性を有する分離溶液（例えば、Accutase(TM)およびAccumax(TM)が挙げられる）またはコラゲナーゼ活性のみを有する分離液を用いても良い
。ここで、浮遊培養においては、培養皿の表面が、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリックス等によるコーティング処理）されていないもの、もしくは、人工的に接着を抑制する処理（例えば、ポリヒドロキシエチルメタクリル酸（poly-HEMA）によるコーティング処理）したものを使用できる。接着培養においては、
例えば、マトリゲル（BD）、I型コラーゲン、IV型コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、ヘ
パラン硫酸プロテオグリカン、またはエンタクチン、およびこれらの組み合わせを用いてコーティング処理された培養皿を使用できる。また、共培養に用いられる細胞は、OP9細
胞(Nishikawa, S.I. et al, Development 125, 1747-1757 (1998))またはEND-2細胞（Mummery C, et al, Circulation. 107:2733-40 (2003)）が例示される。
培養および接着培養を組み合わせて行っても良い。ここで、分離の方法としては、力学的、プロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性を有する分離溶液（例えば、Accutase(TM)およびAccumax(TM)が挙げられる）またはコラゲナーゼ活性のみを有する分離液を用いても良い
。ここで、浮遊培養においては、培養皿の表面が、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリックス等によるコーティング処理）されていないもの、もしくは、人工的に接着を抑制する処理（例えば、ポリヒドロキシエチルメタクリル酸（poly-HEMA）によるコーティング処理）したものを使用できる。接着培養においては、
例えば、マトリゲル（BD）、I型コラーゲン、IV型コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、ヘ
パラン硫酸プロテオグリカン、またはエンタクチン、およびこれらの組み合わせを用いてコーティング処理された培養皿を使用できる。また、共培養に用いられる細胞は、OP9細
胞(Nishikawa, S.I. et al, Development 125, 1747-1757 (1998))またはEND-2細胞（Mummery C, et al, Circulation. 107:2733-40 (2003)）が例示される。
本工程における培地は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えばIMDM培地、Medium 199培地、Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)培地、αMEM培地、Doulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM)培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、およびこれらの混合培地などが
包含される。好ましくは、αMEMまたはDMEMである。培地には、血清が含有されていても
よいし、あるいは無血清でもよい。必要に応じて、例えば、アルブミン、トランスフェリン、Knockout Serum Replacement(KSR)(ES細胞培養時のFBSの血清代替物)、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール、3'-チオールグリセロ
ール、ITS−サプリメントなどの1つ以上の血清代替物を含んでもよいし、B27-サプリメント、N2-サプリメント、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、Glutamax（Invitrogen）、非必
須アミノ酸、ビタミン、サイトカイン、Wntシグナル阻害剤、抗生物質、抗酸化剤、ピル
ビン酸、緩衝剤、無機塩類などの1つ以上の物質も含有しうる。サイトカインとして、ア
クチビンＡおよびＢＭＰ４が例示される。Wntシグナル阻害剤として、XAV939（Shih-Min
A. Huang, et al, Nature 461, 614-620, 2009）、ビタミンA（レチノイン酸），リチウ
ム，フラボノイド、Dickkopf1（Dkk1）、インスリン様増殖因子結合タンパク質（IGFBP）（WO2009/131166）、βカテニンに対するsiRNA等が例示される。
包含される。好ましくは、αMEMまたはDMEMである。培地には、血清が含有されていても
よいし、あるいは無血清でもよい。必要に応じて、例えば、アルブミン、トランスフェリン、Knockout Serum Replacement(KSR)(ES細胞培養時のFBSの血清代替物)、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール、3'-チオールグリセロ
ール、ITS−サプリメントなどの1つ以上の血清代替物を含んでもよいし、B27-サプリメント、N2-サプリメント、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、Glutamax（Invitrogen）、非必
須アミノ酸、ビタミン、サイトカイン、Wntシグナル阻害剤、抗生物質、抗酸化剤、ピル
ビン酸、緩衝剤、無機塩類などの1つ以上の物質も含有しうる。サイトカインとして、ア
クチビンＡおよびＢＭＰ４が例示される。Wntシグナル阻害剤として、XAV939（Shih-Min
A. Huang, et al, Nature 461, 614-620, 2009）、ビタミンA（レチノイン酸），リチウ
ム，フラボノイド、Dickkopf1（Dkk1）、インスリン様増殖因子結合タンパク質（IGFBP）（WO2009/131166）、βカテニンに対するsiRNA等が例示される。
培養温度は、以下に限定されないが、約30〜40℃、好ましくは約37℃であり、CO2含有
空気の雰囲気下で培養が行われ、CO2濃度は、好ましくは約2〜5％である。培養時間は、Flk1/KDRが発現するために必要な日数であり、例えば4日以上である。
空気の雰囲気下で培養が行われ、CO2濃度は、好ましくは約2〜5％である。培養時間は、Flk1/KDRが発現するために必要な日数であり、例えば4日以上である。
本発明において、心筋細胞を製造するための環状デプシペプチドを心筋前駆細胞へ添加する工程では、上記多能性幹細胞から心筋前駆細胞への分化誘導方法と同様の条件下において実施され得る。環状デプシペプチドを添加する期間は、cTNTまたはαMHCが発現する
ために必要な日数であり、例えば6日以上である。環状デプシペプチドを添加する濃度は
用いる前駆細胞と環状デプシペプチドの種類に応じて適宜選択されるが、好ましくは0.25nM〜25nMである。
ために必要な日数であり、例えば6日以上である。環状デプシペプチドを添加する濃度は
用いる前駆細胞と環状デプシペプチドの種類に応じて適宜選択されるが、好ましくは0.25nM〜25nMである。
[実施例]
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明がこれらに限定されないことは言うまでもない。
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明がこれらに限定されないことは言うまでもない。
マウスα−ミオシン重鎖（MHC）プロモーターにより駆動されるEGFP遺伝子を有するEMG7マウスES細胞から分化誘導し、純化されたFlk1陽性細胞を心筋前駆細胞とし、環状デプ
シペプチドを添加して培養することにより、心筋細胞へ分化誘導した（Yamashita, J.K. et al, FASEB J. 19, 1534-1536 (2005)）。このFlk1陽性細胞をOP9間質細胞上へ播種す
ると同時に、シクロスポリンA、21-2（式（III））（Luesch, Bioorg Med Chem, 2002）
およびAPT-1（式（IV））（Luesch, J Am Chem Soc, 2001）を添加した。同様に、対照として、薬剤の無添加による培養を行った。OP9細胞上へ播種した後、6日後に細胞を回収して、FACSによりEGFP陽性細胞数をカウントした。ここで、回収した全細胞数に対するEGFP陽性細胞数を算出し、対照である無添加群に対するこの値の比率（Fold increase）を用
いて各薬剤について評価した。その結果を図１および表２に示す。21-2は、2 nMから4nM
の濃度範囲において顕著な活性が確認できた。また、APT-1は、3 nMから4.5nMの濃度範囲において顕著な活性が確認できた。これらの活性は、シクロスポリンAより高かった。
シペプチドを添加して培養することにより、心筋細胞へ分化誘導した（Yamashita, J.K. et al, FASEB J. 19, 1534-1536 (2005)）。このFlk1陽性細胞をOP9間質細胞上へ播種す
ると同時に、シクロスポリンA、21-2（式（III））（Luesch, Bioorg Med Chem, 2002）
およびAPT-1（式（IV））（Luesch, J Am Chem Soc, 2001）を添加した。同様に、対照として、薬剤の無添加による培養を行った。OP9細胞上へ播種した後、6日後に細胞を回収して、FACSによりEGFP陽性細胞数をカウントした。ここで、回収した全細胞数に対するEGFP陽性細胞数を算出し、対照である無添加群に対するこの値の比率（Fold increase）を用
いて各薬剤について評価した。その結果を図１および表２に示す。21-2は、2 nMから4nM
の濃度範囲において顕著な活性が確認できた。また、APT-1は、3 nMから4.5nMの濃度範囲において顕著な活性が確認できた。これらの活性は、シクロスポリンAより高かった。
実施例１と同様の方法を用いて、APT-7（式（V））、APT-8（式（VI））（Numajiri Y, et al, Chem. Asian J. 2009, 4, 111 − 125）、APT-9（式（VII））（Numajiri Y, et al, Chem. Asian J. 2009, 4, 111 − 125）およびAPT-10（式（VIII））（Doi T, et
al, Chem. Asian J. 2011, 6, 180 − 188）についても評価を行った。その結果を図２
および表３に示す。APT-7、APT-8、APT-9およびAPT-10は、それぞれ、10nM、7.5 nM、7.5
nM から20nMおよび1 nM から1.5nMの濃度範囲において顕著な活性が確認できた。これらの活性は、シクロスポリンAより高かった。
al, Chem. Asian J. 2011, 6, 180 − 188）についても評価を行った。その結果を図２
および表３に示す。APT-7、APT-8、APT-9およびAPT-10は、それぞれ、10nM、7.5 nM、7.5
nM から20nMおよび1 nM から1.5nMの濃度範囲において顕著な活性が確認できた。これらの活性は、シクロスポリンAより高かった。
心筋細胞中のside population細胞（SP細胞）は、Oyamaらの方法を用いて単離した（Oyama T, et al. J Cell Biol. 176, 329-341, 2007）。詳細には、新生児ラットより抽出
した心筋細胞を1.0×106 cells/mlで3％FBS含有PBS 中に懸濁させ、1μg/ml Hoechst 33342を添加し、37℃で60分間暗所にてインキュベート後、フローサイトメーターを用いてSP細胞として単離した。SP細胞は、350nmのUVレーザーでHoechst 33342を励起させ、450nm
（Hoechst blue）と675nm（Hoechst red）において特異的位置に検出される細胞として分離した (Goodell MA, et al. J Exp Med. 183:1797-1806, 1996)。この時、Propidium iodideで染色される細胞を死細胞として除去した。得られたSP細胞は、10%FBSを含有するIMDM中で培養し、24時間後に21-2を添加して72時間培養を続けた。さらに、21-2の非添加の条件で培養を継続し、SP細胞単離から3週間後にcTNT抗体染色により細胞を観察した（図3A）。その結果を図３Bに示す。サルコメア構造を持った心筋細胞が誘導され、一部拍動することが確認された。以上より、21-2は、これまで報告されてきた心筋SP細胞から心筋細胞への分化誘導が可能であったオキシトシンやトリコスタチンAと少なくとも同等の機能
を有していると推定される。
した心筋細胞を1.0×106 cells/mlで3％FBS含有PBS 中に懸濁させ、1μg/ml Hoechst 33342を添加し、37℃で60分間暗所にてインキュベート後、フローサイトメーターを用いてSP細胞として単離した。SP細胞は、350nmのUVレーザーでHoechst 33342を励起させ、450nm
（Hoechst blue）と675nm（Hoechst red）において特異的位置に検出される細胞として分離した (Goodell MA, et al. J Exp Med. 183:1797-1806, 1996)。この時、Propidium iodideで染色される細胞を死細胞として除去した。得られたSP細胞は、10%FBSを含有するIMDM中で培養し、24時間後に21-2を添加して72時間培養を続けた。さらに、21-2の非添加の条件で培養を継続し、SP細胞単離から3週間後にcTNT抗体染色により細胞を観察した（図3A）。その結果を図３Bに示す。サルコメア構造を持った心筋細胞が誘導され、一部拍動することが確認された。以上より、21-2は、これまで報告されてきた心筋SP細胞から心筋細胞への分化誘導が可能であったオキシトシンやトリコスタチンAと少なくとも同等の機能
を有していると推定される。
以上の結果から、ここで示した環状デプシペプチドには心筋前駆細胞からの心筋細胞の分化誘導能を有することが確認された。
本発明を好ましい態様を強調して説明してきたが、好ましい態様が変更され得ることは当業者にとって自明であろう。本発明は、本発明が本明細書に詳細に記載された以外の方法で実施され得ることを意図する。したがって、本発明は添付の「請求の範囲」の精神及び範囲に包含されるすべての変更を含むものである。
ここで述べられた特許及び特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
ここで述べられた特許及び特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
本発明によれば、心筋前駆細胞からの心筋細胞誘導効率を顕著に向上させることができるので、心疾患の治療または多能性幹細胞を用いた細胞移植治療への応用に特に有用である。
Claims (4)
- 以下の式（I）または式（II）（式中、R 1 がイソプロピル基またはt-ブチル基であり、R 2 がHまたはトリエチルシリル基であり、R 3 がメチル基であり、R 4 がメトキシ基であり、L-MがC(Me)=CHであり、XがOまたはSであり、nが1である）で表される環状デプシペプチドまたはその薬学上許容される塩、もしくは溶媒和物を有効成分として含有する、心不全、虚血性心疾患または心筋症から選択される心疾患の治療用医薬組成物。
- 環状デプシペプチドが、次の式（III）から式（VIII）で表される化合物から成る群より選択される、請求項１に記載の医薬組成物。
- 以下の式（I）または式（II）（式中、R 1 がイソプロピル基またはt-ブチル基であり、R 2 がHまたはトリエチルシリル基であり、R 3 がメチル基であり、R 4 がメトキシ基であり、L-MがC(Me)=CHであり、XがOまたはSであり、nが1である）で表される環状デプシペプチドを心筋前駆細胞へ添加する工程を含む、心筋細胞の製造方法であって、前記心筋前駆細胞が、side population細胞（SP細胞）を含む生体内の心筋前駆細胞、または多能性幹細胞から誘導されたFlk1 (KDR)陽性の心筋前駆細胞である、心筋細胞の製造方法。
- 環状デプシペプチドが、次の式（III）から式（VIII）で表される化合物から成る群より選択される、請求項３に記載の方法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2012193433A JP6024880B2 (ja) | 2012-09-03 | 2012-09-03 | 環状デプシペプチドの新規使用方法 |
| PCT/JP2013/077279 WO2014042290A1 (ja) | 2012-09-03 | 2013-10-07 | 環状デプシペプチドの新規使用方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2012193433A JP6024880B2 (ja) | 2012-09-03 | 2012-09-03 | 環状デプシペプチドの新規使用方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2014047193A JP2014047193A (ja) | 2014-03-17 |
| JP6024880B2 true JP6024880B2 (ja) | 2016-11-16 |
Family
ID=50278388
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2012193433A Expired - Fee Related JP6024880B2 (ja) | 2012-09-03 | 2012-09-03 | 環状デプシペプチドの新規使用方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP6024880B2 (ja) |
| WO (1) | WO2014042290A1 (ja) |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2059380A1 (en) * | 1991-01-24 | 1992-07-25 | Yiu-Kuen T. Lam | Endothelin receptor antagonists isolated from microbispora |
| JPH11171897A (ja) * | 1997-05-29 | 1999-06-29 | Meiji Milk Prod Co Ltd | 環状デプシペプチド及びこれを有効成分とする医薬 |
| JP4950996B2 (ja) * | 2005-10-27 | 2012-06-13 | リード ビリオン リミテッド | 虚血性心疾患の治療に有用な、血管新生／血行再建のための医薬組成物及び方法 |
| WO2009032338A1 (en) * | 2007-09-09 | 2009-03-12 | University Of Florida Research Foundation | Apratoxin therapeutic agents: mechanism and methods of treatment |
| US20110294720A1 (en) * | 2008-12-01 | 2011-12-01 | University Of Florida Research Foundation | Apratoxin therapeutic agents: mechanism and methods of treatment |
-
2012
- 2012-09-03 JP JP2012193433A patent/JP6024880B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2013
- 2013-10-07 WO PCT/JP2013/077279 patent/WO2014042290A1/ja active Application Filing
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2014047193A (ja) | 2014-03-17 |
| WO2014042290A1 (ja) | 2014-03-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7166631B2 (ja) | 新規軟骨細胞誘導方法 | |
| JP6429280B2 (ja) | 効率的な心筋細胞の誘導方法 | |
| JP6461787B2 (ja) | 肺胞上皮前駆細胞の誘導方法 | |
| JP6143027B2 (ja) | アストロサイトの誘導方法 | |
| JP6694215B2 (ja) | 新規軟骨細胞誘導方法 | |
| JP6373253B2 (ja) | 新規心筋細胞マーカー | |
| JP5995247B2 (ja) | 多能性幹細胞から樹状細胞を製造する方法 | |
| JP6025067B2 (ja) | 新規心筋細胞マーカー | |
| WO2016114354A1 (ja) | 骨格筋前駆細胞の選択方法 | |
| JP6730709B2 (ja) | 気道上皮細胞の分化誘導法 | |
| JP6646311B2 (ja) | 多能性幹細胞から中胚葉前駆細胞および血液血管前駆細胞への分化誘導法 | |
| WO2021085462A1 (ja) | 多能性幹細胞から造血性内皮細胞および／または造血前駆細胞を製造する方法 | |
| JP6024880B2 (ja) | 環状デプシペプチドの新規使用方法 | |
| JP7429294B2 (ja) | 骨格筋前駆細胞及びその精製方法、筋原性疾患を治療するための組成物、並びに骨格筋前駆細胞を含む細胞群の製造方法 | |
| WO2017073794A1 (ja) | 多能性幹細胞から３次元の心筋組織を製造する方法 | |
| WO2021015086A1 (ja) | 骨格筋幹細胞から成熟筋管細胞を製造する方法 | |
| JP7072756B2 (ja) | 多能性幹細胞から中胚葉前駆細胞および血液血管前駆細胞への分化誘導法 | |
| JP2020115771A (ja) | 多能性幹細胞から軟骨組織を製造する方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20150903 |
|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20150903 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20150904 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20150930 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20151211 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20151211 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20160614 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160809 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20160830 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20160927 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6024880 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |