WO2014192200A1 - 糖化ヘモグロビンを定量する方法 - Google Patents

糖化ヘモグロビンを定量する方法 Download PDF

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    • G01N2440/38—Post-translational modifications [PTMs] in chemical analysis of biological material addition of carbohydrates, e.g. glycosylation, glycation

Definitions

  • the present invention relates to a method for quantifying glycated hemoglobin contained in a sample.
  • HbA1c Glycated hemoglobin
  • HbA1c is a kind of glycated protein formed by non-enzymatic binding of glucose to hemoglobin A (hereinafter referred to as “HbA”) contained in erythrocytes. HbA1c is used as a diabetes marker.
  • Patent Document 1 discloses a method for quantifying HbA1c by enzyme assay. More specifically, the method disclosed in Patent Document 1 includes the following steps (a) and (b): (A) a step of degrading HbA1c using a protease to produce a fructosyl peptide; and (b) a fructosyl peptide produced in step (a) is converted to a fructosyl peptide oxidase (hereinafter referred to as “FPOX”). The process of quantifying using.
  • FPOX fructosyl peptide oxidase
  • Patent Document 2 also discloses a method for obtaining a fructosyl peptide. This method is characterized in that a sample containing a protein such as HbA1c is subjected to protease treatment in the presence of a tetrazolium compound. Patent Document 2 further discloses that not only a tetrazolium compound but also a surfactant further promotes protease treatment.
  • Patent Document 3 also discloses a method for obtaining a fructosyl peptide.
  • Hb1Ac is subjected to protease treatment in the presence of an isothiazoline derivative and a surfactant.
  • the step (a) needs to be performed promptly. More specifically, it is necessary to further improve the degradation rate of HbA1c caused by proteases.
  • step (a) must not adversely affect step (b). More specifically, the reagent used in step (a) must not inactivate FPOX.
  • An object of the present invention is to provide a method for rapidly quantifying glycated hemoglobin.
  • the present invention is a method for quantifying glycated hemoglobin (HbA1c) contained in a sample, comprising the following steps: (A) mixing the sample with a protease in the presence of a composition of a cationic surfactant and a tetrazolium salt to obtain a glycated peptide aqueous solution containing a glycated peptide; (B) A step of mixing the aqueous glycated peptide obtained in the step (a) with FPOX (fructosyl peptide oxidase) to obtain hydrogen peroxide, wherein the solution contains the composition.
  • FPOX structurallycated hemoglobin
  • the present invention is a method for quantifying glycated hemoglobin (HbA1c) contained in a sample, comprising the following steps: (A) mixing the sample with a protease and FPOX (fructosyl peptide oxidase) in the presence of a composition of a cationic surfactant and a tetrazolium salt to obtain a hydrogen peroxide solution; and (b) step (a The method comprises a step of calculating the concentration of the glycated hemoglobin (HbA1c) based on the amount of hydrogen peroxide obtained in (1).
  • the gist of the present invention includes a composition for activating a protease, which contains a cationic surfactant and a tetrazolium salt.
  • the present invention provides a method for rapidly quantifying glycated hemoglobin.
  • FIG. 1A shows the results of Test Example 1.
  • FIG. 1B shows the results of Test Example 1.
  • FIG. 2A shows the results of Test Example 2.
  • FIG. 2B shows the results of Test Example 2.
  • FIG. 3 shows the results of Test Example 3.
  • FIG. 4 shows the results of Test Example 4.
  • FIG. 5 shows the results of Test Example 5.
  • Embodiment 1 First, Embodiment 1 will be described.
  • a sample containing HbA1c is mixed with a protease in the presence of a cationic surfactant and a tetrazolium salt composition.
  • the sample is an aqueous solution.
  • HbA1c is decomposed by protease to produce a glycated peptide.
  • An example of a glycated peptide is a fructosyl peptide.
  • An example of a fructosyl peptide is fructosyl valine histidine (hereinafter referred to as “Fru-Val-His”). In this way, an aqueous solution containing the glycated peptide is obtained.
  • sample containing HbA1c is human-derived blood. Dilutions of blood from humans are also included in samples containing HbA1c.
  • cationic surfactants are quaternary ammonium salts, alkylamine salts, or pyridine derivatives.
  • a preferred cationic surfactant is a quaternary ammonium salt represented by the chemical formula R 1 R 2 R 3 R 4 N + X ⁇ .
  • R 1 is an alkyl group having 8 to 18 carbon atoms.
  • R 2 , R 3 , and R 4 are independently lower alkyl groups. More preferably, R 2 , R 3 , and R 4 are independently a methyl group or an ethyl group. Even more preferred is a methyl group.
  • X represents a halogen. Preferably X represents chlorine or bromine.
  • Examples of preferred tetrazolium salts are listed below.
  • proteases are thermolysin, papain, chymotrypsin, subtilisin, caspase, pepsin, or cathepsin D. Thermolysin and papain are preferred.
  • the combination of the cationic surfactant and the tetrazolium salt significantly improves the decomposition rate of HbA1c.
  • the synergistic effect of the cationic surfactant and the tetrazolium salt significantly improves the decomposition rate of HbA1c. See FIGS. 1A, 1B, 2A, and 2B.
  • anionic surfactants such as sodium dodecyl sulfate (hereinafter referred to as “SDS”) also have a degradation rate of HbA1c. Improve. However, in the present invention, an anionic surfactant should not be used. The reason is described in the description of the step (b).
  • Step (b) is performed after step (a).
  • the aqueous glycated peptide solution obtained in the step (a) is mixed with fructosyl peptide oxidase (hereinafter referred to as “FPOX”). As disclosed in Patent Document 2, the glycated peptide reacts with FPOX to generate hydrogen peroxide. Similar to step (a), also in step (b), the aqueous glycated peptide solution contains a composition of a cationic surfactant and a tetrazolium salt.
  • sample solutions C8 to C10, D8 to D10, and E8 to E10 included in Test Examples 3 to 5 to be described later when only a cationic surfactant is used (sample solutions C2, D2 , And E2), glycated peptides react more rapidly with FPOX when compositions of cationic surfactants and tetrazolium salts are used.
  • An anionic surfactant improves the decomposition rate of HbA1c.
  • anionic surfactants inactivate FPOX. Therefore, HbA1c cannot be quantified when an anionic surfactant is used.
  • Step (c) is performed after step (b).
  • the amount of hydrogen peroxide generated in the step (b) is described in Patent Document 4 (especially column 8, lines 6 to 37) and Patent Document 5 (particularly columns 10, 63 to 11, columns 7, line 7). ) Is proportional to the amount of HbA1c contained in the sample. These patent documents are incorporated herein by reference. The following home page also discloses that the amount of hydrogen peroxide generated in step (b) is proportional to the amount of HbA1c contained in the sample. http: // www. sekisuimedical. jp / english / business / diagnostics / biochemistry / hba1c / index.jp / english / business / diagnostics / biochemistry / hba1c / index. html
  • the amount of HbA1c contained in the sample is calculated using a calibration curve obtained in advance. In this way, HbA1c contained in the sample is quantified. In other words, the concentration of Hb1Ac1 is measured.
  • step (d) a sample containing HbA1c is mixed with protease and FPOX in the presence of a cationic surfactant and tetrazolium salt composition to obtain hydrogen peroxide.
  • the sample is an aqueous solution.
  • Step (e) is performed after step (d).
  • Hb1Ac is quantified based on the amount of hydrogen peroxide obtained in step (d).
  • step (d) step (a) and step (b) are performed simultaneously.
  • Step (e) is the same as step (c). Therefore, detailed description of the step (d) and the step (e) is omitted.
  • sample solution P Human whole blood (manufactured by BIOPREDIC International) was diluted to prepare a 10-fold diluted solution. In this way, a sample solution containing hemoglobin was prepared. Hereinafter, this sample solution is referred to as “sample solution P”.
  • Test Example 1 preparation of sample solution
  • SDS Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • TTAB tetradecyltrimethylammonium bromide
  • TritonX-100 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Tween 20: Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • sample solution A1 Sample solution P Thermolysin PBS solution: 150,000 U / mL SDS PBS solution: 10% by weight (Sample solution A2) Sample solution P Thermolysin PBS solution: 150,000 U / mL TTAB: 10% by weight (Sample solution A3) Sample solution P Thermolysin PBS solution: 150,000 U / mL Triton X-100 PBS solution: 10% by weight (Sample solution A4) Sample solution P Thermolysin PBS solution: 150,000 U / mL Tween 20 in PBS: 10% by weight (Sample solution A5) Sample solution P Thermolysin PBS solution: 150,000 U / mL WST-3 aqueous solution: 2% by weight (Sample solution A6) Sample solution P Thermolysin PBS solution: 150,000 U / mL WST
  • sample solutions A1 to A16 and comparative sample solution a1 were subjected to polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE).
  • PAGE polyacrylamide gel electrophoresis
  • 1A and 1B show electrophoresis patterns.
  • M in FIGS. 1A and 1B indicates a protein marker.
  • the degree of HbA1c degradation is reflected in the color strength of the band around 64.5 KDa corresponding to the hemoglobin molecular region included in the electrophoresis pattern. As the color density of the band near 64.5 KDa decreases, a larger amount of HbA1c is decomposed.
  • sample solution A1 composition of TTAB and WST-3 (sample solution A8), composition of TTAB and WST-4 (sample solution A9), and composition of TTAB and WST-5 (sample solution A10) , Improving the decomposition rate of HbA1c using thermolysin.
  • composition of TTAB and WST-3 uses thermolysin compared to the case where TTAB is used alone (sample solution A2) and the case where WST-3 is used alone (sample solution A5). Improve the decomposition rate of HbA1c.
  • composition of TTAB and WST-4 uses thermolysin compared to the case where TTAB is used alone (sample solution A2) and the case where WST-4 is used alone (sample solution A6). Improve the decomposition rate of HbA1c.
  • composition of TTAB and WST-5 uses thermolysin compared to the case where TTAB is used alone (sample solution A2) and the case where WST-5 is used alone (sample solution A7). Improve the decomposition rate of HbA1c.
  • Sample solutions B1 to B16 were prepared.
  • a sample solution for comparison b1 was also prepared.
  • the source of the used reagent is as follows. Papain: Roche Diagnostics Co., Ltd. SDS: Wako Pure Chemical Industries, Ltd. TTAB (tetradecyltrimethylammonium bromide): Wako Pure Chemical Industries, Ltd. TritonX-100: Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Tween20: Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • sample solution B1 Sample solution P Papain PBS solution: 300 U / mL SDS PBS solution: 10% by weight (Sample solution B2) Sample solution P Papain PBS solution: 300 U / mL TTAB: 10% by weight (Sample solution B3) Sample solution P Papain PBS solution: 300 U / mL Triton X-100 PBS solution: 10% by weight (Sample solution B4) Sample solution P Papain PBS solution: 300 U / mL Tween 20 in PBS: 10% by weight (Sample solution B5) Sample solution P Papain PBS solution: 300 U / mL WST-3 aqueous solution: 2% by weight (Sample solution B6) Sample solution P Papain PBS solution: 300 U / mL WST-4 PBS solution: 0.5% by weight (Sample solution B7) Sample solution P Papain PBS solution: 300 U / mL W
  • sample solutions B1 to B16 and comparative sample solution b1 were subjected to polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE).
  • PAGE polyacrylamide gel electrophoresis
  • 2A and 2B show the electrophoresis pattern.
  • M in FIGS. 2A and 2B indicates a protein marker.
  • the degree of HbA1c degradation is reflected in the color strength of the band around 64.5 KDa corresponding to the hemoglobin molecular region included in the electrophoresis pattern. As the color density of the band near 64.5 KDa decreases, a larger amount of HbA1c is decomposed.
  • sample solution B1 composition of TTAB and WST-3 (sample solution B8), composition of TTAB and WST-4 (sample solution B9), and composition of TTAB and WST-5 (sample solution B10) Improve the degradation rate of HbA1c using papain.
  • composition of TTAB and WST-3 uses papain compared to the case where TTAB is used alone (sample solution B2) and the case where WST-3 is used alone (sample solution B5). Improve the decomposition rate of HbA1c.
  • composition of TTAB and WST-4 uses papain compared to the case where TTAB is used alone (sample solution B2) and the case where WST-4 is used alone (sample solution B6). Improve the decomposition rate of HbA1c.
  • composition of TTAB and WST-5 uses papain compared to the case where TTAB is used alone (sample solution B2) and the case where WST-5 is used alone (sample solution B7). Improve the decomposition rate of HbA1c.
  • Sample solutions C1 to C12 were prepared.
  • a comparative sample solution c1 was also prepared.
  • the source of the used reagent is as follows.
  • FPOX-CE Kikkoman Corporation SDS: Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Peroxidase: Wako Pure Chemical Industries, Ltd. KN-111 (Coloring Dye): Dojindo Laboratories TTAB (Tetradecyltrimethylammonium bromide): Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Triton X-100: Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Tween 20: Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • WST-3 Dojin Chemical Laboratory
  • WST-4 Dojin Chemical Laboratory
  • WST-5 Dojin Chemical Laboratory
  • SDS PBS solution 10% by weight FPOX-CE PBS solution: 28 U / mL Peroxidase: 20 U / mL KN-111: 2 mM
  • TTAB 10% by weight FPOX-CE PBS solution: 28 U / mL Peroxidase: 20 U / mL KN-111: 2 mM
  • Triton X-100 PBS solution 10% by weight FPOX-CE PBS solution: 28 U / mL Peroxidase: 20 U / mL KN-111: 2 mM
  • Tween 20 in PBS 10% by weight FPOX-CE PBS solution: 28 U / mL Peroxidase: 20 U / mL KN-111: 2 mM
  • Example solution C5 Dojin Chemical Laboratory
  • SDS PBS solution 10% by weight FPOX-CE PBS solution
  • reaction of glycated peptide with FPOX The temperatures of the sample solutions C1 to C12 and the comparative sample solution c1 were maintained at 37 ° C. for 10 minutes to cause a reaction.
  • Glycated peptide Fru-Val-His reacts with FPOX to generate hydrogen peroxide. Hydrogen peroxide reacts with the coloring dye KN-111 and changes the coloring dye KN-111 to red. Therefore, FPOX activity is evaluated by measuring the absorbance of the chromogenic dye KN-111 at a wavelength of 660 nm (red).
  • SDS which is an anionic surfactant, inactivates FPOX (refer to the result of the mixed solution C1). Therefore, SDS is not used in the present quantification method of HbA1c using FPOX.
  • the cationic surfactant and the nonionic surfactant do not inactivate FPOX (see the results of the mixed solutions C2 to C12 and the comparative mixed solution c1).
  • composition of TTAB and WST-3, the composition of TTAB and WST-4, or the composition of TTAB and WST-5 are compared with the case where TTAB is used alone (mixed solution C2).
  • TTAB is used alone
  • FPOX reacts more quickly with the glycated peptide.
  • Sample solutions D1 to D16 were prepared.
  • a comparative sample solution d1 was also prepared.
  • the source of the used reagent is as follows.
  • FPOX-CE Kikkoman Corporation Thermolysin: Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • SDS Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • Peroxidase Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • TritonX-100 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Tween 20: Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • WST-3 Dojin Chemical Laboratory
  • WST-4 Dojin Chemical Laboratory
  • WST-5 Dojin Chemical Laboratory
  • Thermolysin PBS solution 150,000 U / mL SDS PBS solution: 10% by weight FPOX-CE PBS solution: 28 U / mL Peroxidase: 20 U / mL KN-111: 2 mM
  • Thermolysin PBS solution 150,000 U / mL TTAB: 10% by weight FPOX-CE PBS solution: 28 U / mL Peroxidase: 20 U / mL KN-111: 2 mM
  • Thermolysin PBS solution 150,000 U / mL Triton X-100 PBS solution: 10% by weight FPOX-CE PBS solution: 28 U / mL Peroxidase: 20 U / mL KN-111: 2 mM
  • Thermolysin PBS solution 150,000 U / mL Triton X-
  • reaction of glycated peptide with FPOX The temperature of the sample solutions D1 to D12 and the comparative sample solution d1 was maintained at 37 ° C. for 10 minutes to cause a reaction.
  • Glycated peptide Fru-Val-His reacts with FPOX to generate hydrogen peroxide. Hydrogen peroxide reacts with the coloring dye KN-111 and changes the coloring dye KN-111 to red. Therefore, FPOX activity is evaluated by measuring the absorbance of the chromogenic dye KN-111 at a wavelength of 660 nm (red).
  • SDS which is an anionic surfactant, inactivates FPOX (refer to the result of the mixed solution D1). Therefore, SDS is not used in the HbA1c quantification method using FPOX.
  • the cationic surfactant and the nonionic surfactant do not inactivate FPOX (see the results of the mixed solutions D2 to D12 and the comparative mixed solution d1). Thermolysin also does not inactivate FPOX.
  • composition of TTAB and WST-3, the composition of TTAB and WST-4, or the composition of TTAB and WST-5 are compared with the case where TTAB is used alone (mixed solution D2).
  • TTAB is used alone
  • FPOX reacts more quickly with the glycated peptide.
  • Sample solutions E1 to E12 were prepared.
  • a comparative sample solution e1 was also prepared.
  • the source of the used reagent is as follows.
  • FPOX-CE Kikkoman Corporation Papain: Roche Diagnostics Inc.
  • SDS Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • Peroxidase Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • TritonX-100 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Tween 20: Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • WST-3 Dojin Chemical Laboratory WST-4: Dojin Chemical Laboratory WST-5: Dojin Chemical Institute (Sample solution E1) Papain: 300 U / mL SDS PBS solution: 10% by weight FPOX-CE PBS solution: 28 U / mL Peroxidase: 20 U / mL KN-111: 2 mM (Sample solution E2) Papain: 300 U / mL TTAB: 10% by weight FPOX-CE PBS solution: 28 U / mL Peroxidase: 20 U / mL KN-111: 2 mM (Sample solution E3) Papain: 300 U / mL Triton X-100 PBS solution: 10% by weight FPOX-CE PBS solution: 28 U / mL Peroxidase: 20 U / mL KN-111: 2 mM (Sample solution E4) Papain: 300 U / mL Tween 20 in PBS: 10% by weight FPOX-CE
  • reaction of glycated peptide with FPOX The temperatures of the sample solutions E1 to E12 and the comparative sample solution e1 were maintained at 37 ° C. for 10 minutes to cause a reaction.
  • Glycated peptide Fru-Val-His reacts with FPOX to generate hydrogen peroxide. Hydrogen peroxide reacts with the coloring dye KN-111 and changes the coloring dye KN-111 to red. Therefore, FPOX activity is evaluated by measuring the absorbance of the chromogenic dye KN-111 at a wavelength of 660 nm (red).
  • SDS which is an anionic surfactant, inactivates FPOX (see results for mixed solution E1). Therefore, SDS is not used in the HbA1c quantification method using FPOX.
  • the cationic surfactant and the nonionic surfactant do not inactivate FPOX (see the results of the mixed solutions E2 to E12 and the comparative mixed solution e1). Papain also does not inactivate FPOX.
  • composition of TTAB and WST-3, the composition of TTAB and WST-4, or the composition of TTAB and WST-5 are compared with the case where TTAB is used alone (mixed solution E2).
  • TTAB is used alone
  • FPOX reacts more quickly with the glycated peptide.
  • the present invention is useful for diagnosis of diabetes.

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Abstract

　本発明は、試料に含有される糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）を定量する方法であって、以下の工程：（ａ）カチオン性界面活性剤およびテトラゾリウム塩の組成物の存在下において、前記試料をプロテアーゼと混合し、糖化ペプチドを含有する糖化ペプチド水溶液を得る工程、（ｂ）前記工程（ａ）において得られた糖化ペプチド水溶液をフルクトシルペプチドオキシダーゼと混合し、過酸化水素を得る工程、ここで、前記糖化ペプチド水溶液は前記組成物を含有するものである、および（ｃ）工程（ｂ）において得られた過酸化水素水の量に基づいて、前記糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）の濃度を算出する工程を具備する方法を提供する。本発明はまた、試料に含有される糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）を定量する方法であって、以下の工程：（ａ）カチオン性界面活性剤およびテトラゾリウム塩の組成物の存在下において、前記試料をプロテアーゼおよびフルクトシルペプチドオキシダーゼと混合し、過酸化水素水を得る工程、および（ｂ）工程（ａ）において得られた過酸化水素の量に基づいて、前記糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）の濃度を算出する工程を具備する方法を提供する。

Description

糖化ヘモグロビンを定量する方法
　本発明は、試料に含有される糖化ヘモグロビンを定量する方法に関する。
　糖化ヘモグロビン（以下、「ＨｂＡ１ｃ」という）は、赤血球に含まれるヘモグロビンＡ（以下、「ＨｂＡ」という）にグルコースを非酵素的に結合することによって形成される糖化タンパク質の一種である。ＨｂＡ１ｃは、糖尿病マーカーとして用いられる。
　特許文献１は、酵素アッセイ法によって、ＨｂＡ１ｃを定量する方法を開示している。より具体的には、特許文献１に開示された方法は、以下の工程（ａ）および（ｂ）を有する：
　（ａ）プロテアーゼを用いてＨｂＡ１ｃを分解し、フルクトシルペプチドを生成する工程、および
　（ｂ）工程（ａ）において生成されたフルクトシルペプチドを、フルクトシルペプチドオキシダーゼ（以下、「ＦＰＯＸ」という）を用いて定量する工程。
　特許文献２も、フルクトシルペプチドを得る方法を開示している。この方法は、ＨｂＡ１ｃのようなタンパク質を含有する試料が、テトラゾリウム化合物の存在下においてプロテアーゼ処理に供されることを特徴とする。特許文献２は、さらに、テトラゾリウム化合物だけでなく界面活性剤がプロテアーゼ処理をより促進することを開示している。
　特許文献３も、フルクトシルペプチドを得る方法を開示している。この方法では、Ｈｂ１Ａｃが、イソチアゾリン誘導体および界面活性剤の存在下でプロテアーゼ処理に供される。
米国特許出願公開第２００７／００３７２４３号 米国特許出願公開第２００３／０１８６３４６号 カナダ特許出願公開第２　８０６　２６１　Ａ号 米国特許第７，２３５，３７８号 米国特許第７，８５５，０７９号
　酵素アッセイ法では、工程（ａ）が速やかに実施されることが必要とされる。より詳細には、プロテアーゼによって引き起こされるＨｂＡ１ｃの分解速度をより向上させることが必要とされる。
　さらに、工程（ａ）において用いられた試薬が、工程（ｂ）に悪影響を与えてはならない。より詳細には、工程（ａ）において用いられた試薬が、ＦＰＯＸを不活性化してはならない。
　本発明の目的は、糖化ヘモグロビンを速やかに定量する方法を提供することである。
　本発明は、試料に含有される糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）を定量する方法であって、以下の工程：
　（ａ）カチオン性界面活性剤およびテトラゾリウム塩の組成物の存在下において、前記試料をプロテアーゼと混合し、糖化ペプチドを含有する糖化ペプチド水溶液を得る工程、
　（ｂ）前記工程（ａ）において得られた糖化ペプチド水溶液をＦＰＯＸ（フルクトシルペプチドオキシダーゼ）と混合し、過酸化水素を得る工程、ここで、前記溶液は前記組成物を含有するものである、および
　（ｃ）工程（ｂ）において得られた過酸化水素水の量に基づいて、前記糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）の濃度を算出する工程
を具備する、方法に関する。
　本発明は、試料に含有される糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）を定量する方法であって、以下の工程：
　（ａ）カチオン性界面活性剤およびテトラゾリウム塩の組成物の存在下において、前記試料をプロテアーゼおよびＦＰＯＸ（フルクトシルペプチドオキシダーゼ）と混合し、過酸化水素水を得る工程、および
　（ｂ）工程（ａ）において得られた過酸化水素の量に基づいて、前記糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）の濃度を算出する工程
を具備する、方法に関する。
　本発明の趣旨は、カチオン性界面活性剤およびテトラゾリウム塩を含有する、プロテアーゼを活性化するための組成物を含む。
　本発明は、糖化ヘモグロビンを速やかに定量する方法を提供する。
図１Ａは、試験例１の結果を示す。 図１Ｂは、試験例１の結果を示す。 図２Ａは、試験例２の結果を示す。 図２Ｂは、試験例２の結果を示す。 図３は、試験例３の結果を示す。 図４は、試験例４の結果を示す。 図５は、試験例５の結果を示す。
　本発明の実施形態が、以下、説明される。
　（実施形態１）
　まず、実施形態１が説明される。
　（工程（ａ））
　工程（ａ）では、ＨｂＡ１ｃを含有する試料がカチオン性界面活性剤およびテトラゾリウム塩の組成物の存在下においてプロテアーゼと混合される。好ましくは、試料は水溶液である。
　ＨｂＡ１ｃはプロテアーゼによって分解され、糖化ペプチドを生成する。糖化ペプチドの例は、フルクトシルペプチドである。フルクトシルペプチドの例は、フルクトシルバリンヒスチジン（以下、「Ｆｒｕ－Ｖａｌ－Ｈｉｓ」という）である。このようにして、糖化ペプチドを含有する水溶液が得られる。
　ＨｂＡ１ｃを含有する試料の例は、ヒト由来の血液である。ヒト由来の血液の希釈物もまた、ＨｂＡ１ｃを含有する試料に含まれる。
　カチオン性界面活性剤の例は、第４級アンモニウム塩、アルキルアミン塩、またはピリジン誘導体である。好ましいカチオン性界面活性剤は、化学式Ｒ１Ｒ２Ｒ３Ｒ４Ｎ＋Ｘ－により表される第４級アンモニウム塩である。
　好ましくは、Ｒ１は、８以上１８以下の炭素数を有するアルキル基である。好ましくは、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、独立して低級アルキル基である。より好ましくは、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、独立してメチル基またはエチル基である。メチル基がさらにより好ましい。Ｘはハロゲンを表す。好ましくは、Ｘは塩素または臭素を表す。
　好ましいカチオン性界面活性剤の例が以下に列記される。
　トリメチルオクチルアンモニウムクロリド
　トリメチルデシルアンモニウムクロリド
　トリメチルドデシルアンモニウムクロリド
　トリメチルテトラデシルアンモニウムクロリド
　トリメチルセチルアンモニウムクロリド
　トリメチルステアリルアンモニウムクロリド
　トリメチルオクチルアンモニウムブロミド
　トリメチルデシルアンモニウムブロミド
　トリメチルドデシルアンモニウムブロミド
　トリメチルテトラデシルアンモニウムブロミド
　トリメチルセチルアンモニウムブロミド
　トリメチルステアリルアンモニウムブロミド
　好ましいテトラゾリウム塩の例が以下に列記される。
　２－（４－ヨードフェニル）－３－（４－ニトロフェニル）－５－（２，４－ジスルホフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム，モノナトリウム塩（ＷＳＴ－１）
　２－（４－ヨードフェニル）－３－（２，４－ジニトロフェニル）－５－（２，４－ジスルホフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム，モノナトリウム塩（ＷＳＴ－３）
　２－（２－ベンゾチアゾリル）－３－（４－カルボキシ－２－メトキシフェニル）－５－［４－［（２－ソジオスルホエチル）カルバモイル］フェニル］－２Ｈ－テトラゾール－３－イウム（ＷＳＴ－４）
　２，２’－（３，３’－ジメトキシ－４，４’－ビフェニリレン）ビス［３－（２－ベンゾチアゾリル）－５－［４－［Ｎ－［２－（ソジオオキシスルホニル）エチル］－Ｎ－（２－スルホエチル）カルバモイル］フェニル］－２Ｈ－テトラゾール－３－イウム］（ＷＳＴ－５）
　５－［２，４－ビス（ソジオオキシスルホニル）フェニル］－３－（２－メトキシ－４－ニトロフェニル）－２－（４－ニトロフェニル）－２Ｈ－テトラゾール－３－イウム（ＷＳＴ－８）
　２－（４－ニトロフェニル）－５－フェニル－３－［４－（４－スルホフェニルアゾ）－２－スルホフェニル］－２Ｈ－テトラゾリウム，モノナトリウム塩（ＷＳＴ－９）
　２，５－ジ（４－ニトロフェニル）－３－［４－（４－スルホフェニルアゾ）－２－スルホフェニル］－２Ｈ－テトラゾリウム，モノナトリウム塩（ＷＳＴ－１０）
　２－（４－ニトロフェニル）－５－（２－スルホフェニル）－３－［４－（４－スルホフェニルアゾ）－２－スルホフェニル］－２Ｈ－テトラゾリウム，ジナトリウム塩（ＷＳＴ－１１）
　プロテアーゼの例は、サーモリシン、パパイン、キモトリプシン、スブチリシン、カスパーゼ、ペプシン、またはカテプシンＤである。サーモリシンおよびパパインが好ましい。
　後述される試験例１および試験例２に含まれる試料溶液Ａ８～Ａ１０およびＢ８～Ｂ１０において実証されているように、カチオン性界面活性剤およびテトラゾリウム塩の組合せが、ＨｂＡ１ｃの分解速度を顕著に向上させる。言い換えれば、カチオン性界面活性剤およびテトラゾリウム塩の相乗効果が、ＨｂＡ１ｃの分解速度を顕著に向上させる。図１Ａ、図１Ｂ、図２Ａ、および図２Ｂを参照のこと。
　試験例１および試験例２にそれぞれ含まれる試料溶液Ａ１およびＢ１において実証されているように、ドデシル硫酸ナトリウム（以下、「ＳＤＳ」という）のようなアニオン性界面活性剤も、ＨｂＡ１ｃの分解速度を向上させる。しかし、本発明では、アニオン性界面活性剤は用いられてはならない。その理由は、工程（ｂ）の説明において記述される。
　試験例１および試験例２にそれぞれ含まれる試料溶液Ａ２およびＢ２において実証されているように、カチオン性界面活性剤が単独で用いられた場合、ＨｂＡ１ｃの分解速度は向上されない。同様に、試験例１および試験例２に含まれる試料溶液Ａ５～Ａ７およびＢ５～Ｂ７において実証されているように、テトラゾリウム塩が単独で用いられた場合でも、ＨｂＡ１ｃの分解速度は向上されない。
　試験例１および試験例２に含まれる試料溶液Ａ３、Ａ４、Ｂ３、およびＢ４において実証されているように、カチオン性界面活性剤に代えて非イオン性界面活性剤が用いられた場合、ＨｂＡ１ｃの分解速度は向上されない。試験例１および試験例２に含まれる試料溶液Ａ１１～Ａ１６およびＢ１１～Ｂ１６において実証されているように、非イオン性界面活性剤がテトラゾリウム塩と組み合わせて用いられた場合でも、ＨｂＡ１ｃの分解速度は向上されない。
　（工程（ｂ））
　工程（ｂ）は、工程（ａ）の後に行われる。
　工程（ａ）において得られた糖化ペプチド水溶液は、フルクトシルペプチドオキシダーゼ（以下、「ＦＰＯＸ」という）と混合される。特許文献２に開示されているように、糖化ペプチドはＦＰＯＸと反応して、過酸化水素が発生する。工程（ａ）と同様、工程（ｂ）においても、糖化ペプチド水溶液はカチオン性界面活性剤およびテトラゾリウム塩の組成物を含有する。
　後述される試験例３～５に含まれる試料溶液Ｃ８～Ｃ１０、Ｄ８～Ｄ１０、およびＥ８～Ｅ１０において実証されているように、カチオン性界面活性剤のみが用いられた場合（試料溶液Ｃ２、Ｄ２、およびＥ２を参照のこと）と比較して、カチオン性界面活性剤およびテトラゾリウム塩の組成物が用いられた場合、糖化ペプチドはＦＰＯＸとより速やかに反応する。
　アニオン性界面活性剤は、ＨｂＡ１ｃの分解速度を向上させる。しかし、後述される試験例３、４、および５に含まれる試料溶液Ｃ１、Ｄ１、およびＥ１において実証されているように、アニオン性界面活性剤はＦＰＯＸを不活性化する。そのため、アニオン性界面活性剤が用いられた場合、ＨｂＡ１ｃを定量することはできない。
　（工程（ｃ））
　工程（ｃ）は、工程（ｂ）の後に行われる。
　工程（ｂ）において発生する過酸化水素の量は、特許文献４（特に第８欄、６～３７行目）および特許文献５（特に第１０欄、６３行目～第１１欄、７行目）に開示されているように、試料に含有されるＨｂＡ１ｃの量に比例する。これらの特許文献は、出典明示により本明細書に組み込まれる。以下のホームページもまた、工程（ｂ）において発生する過酸化水素の量が試料に含有されるＨｂＡ１ｃの量に比例することを開示している。
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｅｋｉｓｕｉｍｅｄｉｃａｌ．ｊｐ／ｅｎｇｌｉｓｈ／ｂｕｓｉｎｅｓｓ／ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ／ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ／ｈｂａ１ｃ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ
　従って、過酸化水素の量を元に、予め得られた検量線を用いて、試料に含有されるＨｂＡ１ｃの量が算出される。このようにして、試料に含有されるＨｂＡ１ｃが定量される。言い換えれば、Ｈｂ１Ａｃ１の濃度が測定される。
　（実施形態２）
　次に、実施形態２が説明される。
　（工程（ｄ））
　工程（ｄ）では、ＨｂＡ１ｃを含有する試料がカチオン性界面活性剤およびテトラゾリウム塩の組成物の存在下においてプロテアーゼおよびＦＰＯＸと混合され、過酸化水素を得る。好ましくは、試料は水溶液である。
　（工程（ｅ））
　工程（ｅ）は、工程（ｄ）の後に行われる。工程（ｅ）では、工程（ｄ）において得られた過酸化水素の量に基づいて、Ｈｂ１Ａｃが定量される。
　工程（ｄ）では、工程（ａ）および工程（ｂ）が同時に行なわれる。工程（ｅ）は、工程（ｃ）と同一である。よって、工程（ｄ）及び工程（ｅ）の詳細な説明は省略される。
　（試験例）
　（試料溶液の調製）
　ヒト全血（ＢＩＯＰＲＥＤＩＣ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）を希釈して、１０倍希釈液を作成した。このようにして、ヘモグロビンを含む試料溶液を調製した。以下、この試料溶液は「試料溶液Ｐ」と呼ばれる。
　（試験例１）
　（試料溶液の調製）
　以下の試料溶液Ａ１～Ａ１６を調製した。比較用試料溶液ａ１も調製した。
　用いられた試薬の入手先は以下の通りである。
　サーモリシン：和光純薬工業株式会社
　ＳＤＳ：和光純薬工業株式会社
　ＴＴＡＢ（テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド）：和光純薬工業株式会社
　ＴｒｉｔｏｎＸ－１００：和光純薬工業株式会社
　Ｔｗｅｅｎ２０：和光純薬工業株式会社
　ＷＳＴ－３：同仁化学研究所
　ＷＳＴ－４：同仁化学研究所
　ＷＳＴ－５：同仁化学研究所

　（試料溶液Ａ１）
　試料溶液Ｐ
　サーモリシン　ＰＢＳ溶液：１５０，０００Ｕ／ｍＬ
　ＳＤＳ　ＰＢＳ溶液：１０重量％
　（試料溶液Ａ２）
　試料溶液Ｐ
　サーモリシン　ＰＢＳ溶液：１５０，０００Ｕ／ｍＬ
　ＴＴＡＢ：１０重量％
　（試料溶液Ａ３）
　試料溶液Ｐ
　サーモリシン　ＰＢＳ溶液：１５０，０００Ｕ／ｍＬ
　ＴｒｉｔｏｎＸ－１００　ＰＢＳ溶液：１０重量％
　（試料溶液Ａ４）
　試料溶液Ｐ
　サーモリシン　ＰＢＳ溶液：１５０，０００Ｕ／ｍＬ
　Ｔｗｅｅｎ２０　ＰＢＳ溶液：１０重量％
　（試料溶液Ａ５）
　試料溶液Ｐ
　サーモリシン　ＰＢＳ溶液：１５０，０００Ｕ／ｍＬ
　ＷＳＴ－３　水溶液：２重量％
　（試料溶液Ａ６）
　試料溶液Ｐ
　サーモリシン　ＰＢＳ溶液：１５０，０００Ｕ／ｍＬ
　ＷＳＴ－４　ＰＢＳ溶液：０．５重量％
　（試料溶液Ａ７）
　試料溶液Ｐ
　サーモリシン　ＰＢＳ溶液：１５０，０００Ｕ／ｍＬ
　ＷＳＴ－５　ＰＢＳ溶液：２重量％
　（試料溶液Ａ８）
　試料溶液Ｐ
　サーモリシン　ＰＢＳ溶液：１５０，０００Ｕ／ｍＬ
　ＴＴＡＢ：１０重量％
　ＷＳＴ－３　ＰＢＳ溶液：２重量％
　（試料溶液Ａ９）
　試料溶液Ｐ
　サーモリシン　ＰＢＳ溶液：１５０，０００Ｕ／ｍＬ
　ＴＴＡＢ：１０重量％
　ＷＳＴ－４　ＰＢＳ溶液：０．５重量％
　（試料溶液Ａ１０）
　試料溶液Ｐ
　サーモリシン　ＰＢＳ溶液：１５０，０００Ｕ／ｍＬ
　ＴＴＡＢ：１０重量％
　ＷＳＴ－５　ＰＢＳ溶液：２重量％
　（試料溶液Ａ１１）
　試料溶液Ｐ
　サーモリシン　ＰＢＳ溶液：１５０，０００Ｕ／ｍＬ
　ＴｒｉｔｏｎＸ－１００　ＰＢＳ溶液：１０重量％
　ＷＳＴ－３　ＰＢＳ溶液：２重量％
　（試料溶液Ａ１２）
　試料溶液Ｐ
　サーモリシン　ＰＢＳ溶液：１５０，０００Ｕ／ｍＬ
　ＴｒｉｔｏｎＸ－１００　ＰＢＳ溶液：１０重量％
　ＷＳＴ－４　ＰＢＳ溶液：０．５重量％
　（試料溶液Ａ１３）
　試料溶液Ｐ
　サーモリシン　ＰＢＳ溶液：１５０，０００Ｕ／ｍＬ
　ＴｒｉｔｏｎＸ－１００　ＰＢＳ溶液：１０重量％
　ＷＳＴ－５　ＰＢＳ溶液：２重量％
　（試料溶液Ａ１４）
　試料溶液Ｐ
　サーモリシン　ＰＢＳ溶液：１５０，０００Ｕ／ｍＬ
　Ｔｗｅｅｎ２０　ＰＢＳ溶液：１０重量％
　ＷＳＴ－３　ＰＢＳ溶液：２重量％
　（試料溶液Ａ１５）
　試料溶液Ｐ
　サーモリシン　ＰＢＳ溶液：１５０，０００Ｕ／ｍＬ
　Ｔｗｅｅｎ２０　ＰＢＳ溶液：１０重量％
　ＷＳＴ－４　ＰＢＳ溶液：０．５重量％
　（試料溶液Ａ１６）
　試料溶液Ｐ
　サーモリシン　ＰＢＳ溶液：１５０，０００Ｕ／ｍＬ
　Ｔｗｅｅｎ２０　ＰＢＳ溶液：１０重量％
　ＷＳＴ－５　ＰＢＳ溶液：２重量％
　（比較用試料溶液ａ１）
　試料溶液Ｐ
　サーモリシン　ＰＢＳ溶液：１５０，０００Ｕ／ｍＬ
　（サーモリシンを用いたＨｂＡ１ｃ分解反応）
　試料溶液Ａ１～Ａ１６および比較用試料溶液ａ１の温度は、３７℃に１０分間維持され、反応を生じさせた。
　（分解反応進行状況の比較）
　反応後、試料溶液Ａ１～Ａ１６および比較用試料溶液ａ１は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）供された。図１Ａおよび図１Ｂは、電気泳動パターンを示す。図１Ａおよび図１Ｂ中の「Ｍ」は、タンパク質マーカーを指し示す。
　ＨｂＡ１ｃ分解の度合いは、電気泳動パターンに含まれるヘモグロビン分子領域に対応する６４．５ＫＤａ付近のバンドの色の濃さ（ｃｏｌｏｒ　ｓｔｒｅｎｇｔｈ）に反映される。６４．５ＫＤａ付近のバンドの色の濃さが低下すると、より多くの量のＨｂＡ１ｃが分解している。
　図１Ａおよび図１Ｂに示される電気泳動パターンから明らかなように、比較用試料溶液ａ１と比較して、試料溶液Ａ１、Ａ８、Ａ９、およびＡ１０において、より多くの量のＨｂＡ１ｃが分解した。試料溶液Ａ２、Ａ５、Ａ６、およびＡ７と比較して、試料溶液Ａ８、Ａ９、およびＡ１０において、より多くのＨｂＡ１ｃが分解した。
　ＳＤＳ（試料溶液Ａ１）、ＴＴＡＢおよびＷＳＴ－３の組成物（試料溶液Ａ８）、ＴＴＡＢおよびＷＳＴ－４の組成物（試料溶液Ａ９）、ならびにＴＴＡＢおよびＷＳＴ－５の組成物（試料溶液Ａ１０）が、サーモリシンを用いるＨｂＡ１ｃの分解速度を向上させる。
　ＴＴＡＢおよびＷＳＴ－３の組成物（試料溶液Ａ８）は、ＴＴＡＢが単独で用いられる場合（試料溶液Ａ２）およびＷＳＴ－３が単独で用いられる場合（試料溶液Ａ５）と比較して、サーモリシンを用いるＨｂＡ１ｃの分解速度を向上させる。
　ＴＴＡＢとＷＳＴ－４の組成物（試料溶液Ａ９）は、ＴＴＡＢが単独で用いられる場合（試料溶液Ａ２）およびＷＳＴ－４が単独で用いられる場合（試料溶液Ａ６）と比較して、サーモリシンを用いるＨｂＡ１ｃの分解速度を向上させる。
　ＴＴＡＢとＷＳＴ－５の組成物（試料溶液Ａ１０）は、ＴＴＡＢが単独で用いられる場合（試料溶液Ａ２）およびＷＳＴ－５が単独で用いられる場合（試料溶液Ａ７）と比較して、サーモリシンを用いるＨｂＡ１ｃの分解速度を向上させる。
　（試験例２）
　（試料溶液の調製）
　試料溶液Ｂ１～Ｂ１６が調製された。比較用試料溶液ｂ１も調製された。
　用いられた試薬の入手先は以下の通りである。
　パパイン：ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社
　ＳＤＳ：和光純薬工業株式会社
　ＴＴＡＢ（テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド）：和光純薬工業株式会社
　ＴｒｉｔｏｎＸ－１００：和光純薬工業株式会社
　Ｔｗｅｅｎ２０：和光純薬工業株式会社
　ＷＳＴ－３：同仁化学研究所
　ＷＳＴ－４：同仁化学研究所
　ＷＳＴ－５：同仁化学研究所

　（試料溶液Ｂ１）
　試料溶液Ｐ
　パパイン　ＰＢＳ溶液：３００Ｕ／ｍＬ
　ＳＤＳ　ＰＢＳ溶液：１０重量％
　（試料溶液Ｂ２）
　試料溶液Ｐ
　パパイン　ＰＢＳ溶液：３００Ｕ／ｍＬ
　ＴＴＡＢ：１０重量％
　（試料溶液Ｂ３）
　試料溶液Ｐ
　パパイン　ＰＢＳ溶液：３００Ｕ／ｍＬ
　ＴｒｉｔｏｎＸ－１００　ＰＢＳ溶液：１０重量％
　（試料溶液Ｂ４）
　試料溶液Ｐ
　パパイン　ＰＢＳ溶液：３００Ｕ／ｍＬ
　Ｔｗｅｅｎ２０　ＰＢＳ溶液：１０重量％
　（試料溶液Ｂ５）
　試料溶液Ｐ
　パパイン　ＰＢＳ溶液：３００Ｕ／ｍＬ
　ＷＳＴ－３　水溶液：２重量％
　（試料溶液Ｂ６）
　試料溶液Ｐ
　パパイン　ＰＢＳ溶液：３００Ｕ／ｍＬ
　ＷＳＴ－４　ＰＢＳ溶液：０．５重量％
　（試料溶液Ｂ７）
　試料溶液Ｐ
　パパイン　ＰＢＳ溶液：３００Ｕ／ｍＬ
　ＷＳＴ－５　ＰＢＳ溶液：２重量％
　（試料溶液Ｂ８）
　試料溶液Ｐ
　パパイン　ＰＢＳ溶液：３００Ｕ／ｍＬ
　ＴＴＡＢ：１０重量％
　ＷＳＴ－３　ＰＢＳ溶液：２重量％
　（試料溶液Ｂ９）
　試料溶液Ｐ
　パパイン　ＰＢＳ溶液：３００Ｕ／ｍＬ
　ＴＴＡＢ：１０重量％
　ＷＳＴ－４　ＰＢＳ溶液：０．５重量％
　（試料溶液Ｂ１０）
　試料溶液Ｐ
　パパイン　ＰＢＳ溶液：３００Ｕ／ｍＬ
　ＴＴＡＢ：１０重量％
　ＷＳＴ－５　ＰＢＳ溶液：２重量％
　（試料溶液Ｂ１１）
　試料溶液Ｐ
　パパイン　ＰＢＳ溶液：３００Ｕ／ｍＬ
　ＴｒｉｔｏｎＸ－１００　ＰＢＳ溶液：１０重量％
　ＷＳＴ－３　ＰＢＳ溶液：２重量％
　（試料溶液Ｂ１２）
　試料溶液Ｐ
　パパイン　ＰＢＳ溶液：３００Ｕ／ｍＬ
　ＴｒｉｔｏｎＸ－１００　ＰＢＳ溶液：１０重量％
　ＷＳＴ－４　ＰＢＳ溶液：０．５重量％
　（試料溶液Ｂ１３）
　試料溶液Ｐ
　パパイン　ＰＢＳ溶液：３００Ｕ／ｍＬ
　ＴｒｉｔｏｎＸ－１００　ＰＢＳ溶液：１０重量％
　ＷＳＴ－５　ＰＢＳ溶液：２重量％
　（試料溶液Ｂ１４）
　試料溶液Ｐ
　パパイン　ＰＢＳ溶液：３００Ｕ／ｍＬ
　Ｔｗｅｅｎ２０　ＰＢＳ溶液：１０重量％
　ＷＳＴ－３　ＰＢＳ溶液：２重量％
　（試料溶液Ｂ１５）
　試料溶液Ｐ
　パパイン　ＰＢＳ溶液：３００Ｕ／ｍＬ
　Ｔｗｅｅｎ２０　ＰＢＳ溶液：１０重量％
　ＷＳＴ－４　ＰＢＳ溶液：０．５重量％
　（試料溶液Ｂ１６）
　試料溶液Ｐ
　パパイン　ＰＢＳ溶液：３００Ｕ／ｍＬ
　Ｔｗｅｅｎ２０　ＰＢＳ溶液：１０重量％
　ＷＳＴ－５　ＰＢＳ溶液：２重量％
　（比較用試料溶液ｂ１）
　試料溶液Ｐ
　パパイン　ＰＢＳ溶液：３００Ｕ／ｍＬ
　（サーモリシンを用いたＨｂＡ１ｃ分解反応）
　試料溶液Ｂ１～Ｂ１６および比較用試料溶液ｂ１の温度は、３７℃に１０分間維持され、反応を生じさせた。
　（分解反応進行状況の比較）
　反応後、試料溶液Ｂ１～Ｂ１６および比較用試料溶液ｂ１は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）に供された。図２Ａおよび図２Ｂは、電気泳動パターンを示す。図２Ａおよび図２Ｂ中の「Ｍ」は、タンパク質マーカーを指し示す。
　ＨｂＡ１ｃ分解の度合いは、電気泳動パターンに含まれるヘモグロビン分子領域に対応する６４．５ＫＤａ付近のバンドの色の濃さ（ｃｏｌｏｒ　ｓｔｒｅｎｇｔｈ）に反映される。６４．５ＫＤａ付近のバンドの色の濃さが低下すると、より多くの量のＨｂＡ１ｃが分解している。
　図２Ａおよび図２Ｂに示される電気泳動パターンから明らかなように、比較用試料溶液ｂ１と比較して、試料溶液Ｂ１、Ｂ８、Ｂ９、およびＢ１０において、より多くの量のＨｂＡ１ｃが分解した。試料溶液Ｂ２、Ｂ５、Ｂ６、およびＢ７と比較して、試料溶液Ｂ９、Ｂ１０、およびＢ１１において、より多くのＨｂＡ１ｃが分解した。
　ＳＤＳ（試料溶液Ｂ１）、ＴＴＡＢおよびＷＳＴ－３の組成物（試料溶液Ｂ８）、ＴＴＡＢおよびＷＳＴ－４の組成物（試料溶液Ｂ９）、ならびにＴＴＡＢおよびＷＳＴ－５の組成物（試料溶液Ｂ１０）が、パパインを用いるＨｂＡ１ｃの分解速度を向上させる。
　ＴＴＡＢおよびＷＳＴ－３の組成物（試料溶液Ｂ８）は、ＴＴＡＢが単独で用いられる場合（試料溶液Ｂ２）およびＷＳＴ－３が単独で用いられる場合（試料溶液Ｂ５）と比較して、パパインを用いるＨｂＡ１ｃの分解速度を向上させる。
　ＴＴＡＢとＷＳＴ－４の組成物（試料溶液Ｂ９）は、ＴＴＡＢが単独で用いられる場合（試料溶液Ｂ２）およびＷＳＴ－４が単独で用いられる場合（試料溶液Ｂ６）と比較して、パパインを用いるＨｂＡ１ｃの分解速度を向上させる。
　ＴＴＡＢとＷＳＴ－５の組成物（試料溶液Ｂ１０）は、ＴＴＡＢが単独で用いられる場合（試料溶液Ｂ２）およびＷＳＴ－５が単独で用いられる場合（試料溶液Ｂ７）と比較して、パパインを用いるＨｂＡ１ｃの分解速度を向上させる。
　（試験例３）
　（試料溶液の調製）
　試料溶液Ｃ１～Ｃ１２が調製された。比較用試料溶液ｃ１も調製された。
　用いられた試薬の入手先は以下の通りである。
　ＦＰＯＸ－ＣＥ：キッコーマン株式会社
　ＳＤＳ：和光純薬工業株式会社
　ペルオキシダーゼ：和光純薬工業株式会社
　ＫＮ－１１１（発色色素）：同仁化学研究所
　ＴＴＡＢ（テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド）：和光純薬工業株式会社
　ＴｒｉｔｏｎＸ－１００：和光純薬工業株式会社
　Ｔｗｅｅｎ２０：和光純薬工業株式会社
　ＷＳＴ－３：同仁化学研究所
　ＷＳＴ－４：同仁化学研究所
　ＷＳＴ－５：同仁化学研究所

　（試料溶液Ｃ１）
　ＳＤＳ　ＰＢＳ溶液：１０重量％
　ＦＰＯＸ－ＣＥ　ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
　ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
　ＫＮ－１１１：２ｍＭ
　（試料溶液Ｃ２）
　ＴＴＡＢ：１０重量％
　ＦＰＯＸ－ＣＥ　ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
　ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
　ＫＮ－１１１：２ｍＭ
　（試料溶液Ｃ３）
　ＴｒｉｔｏｎＸ－１００　ＰＢＳ溶液：１０重量％
　ＦＰＯＸ－ＣＥ　ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
　ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
　ＫＮ－１１１：２ｍＭ
　（試料溶液Ｃ４）
　Ｔｗｅｅｎ２０　ＰＢＳ溶液：１０重量％
　ＦＰＯＸ－ＣＥ　ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
　ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
　ＫＮ－１１１：２ｍＭ
　（試料溶液Ｃ５）
　ＷＳＴ－３　ＰＢＳ溶液：２重量％
　ＦＰＯＸ－ＣＥ　ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
　ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
　ＫＮ－１１１：２ｍＭ
　（試料溶液Ｃ６）
　ＷＳＴ－４　ＰＢＳ溶液：０．５重量％
　ＦＰＯＸ－ＣＥ　ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
　ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
　ＫＮ－１１１：２ｍＭ
　（試料溶液Ｃ７）
　ＷＳＴ－５　ＰＢＳ溶液：２重量％
　ＦＰＯＸ－ＣＥ　ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
　ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
　ＫＮ－１１１：２ｍＭ
　（試料溶液Ｃ８）
　ＴＴＡＢ：１０重量％
　ＷＳＴ－３　ＰＢＳ溶液：２重量％
　ＦＰＯＸ－ＣＥ　ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
　ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
　ＫＮ－１１１：２ｍＭ
　（試料溶液Ｃ９）
　ＴＴＡＢ：１０重量％
　ＷＳＴ－４　ＰＢＳ溶液：０．５重量％
　ＦＰＯＸ－ＣＥ　ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
　ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
　ＫＮ－１１１：２ｍＭ
　（試料溶液Ｃ１０）
　ＴＴＡＢ：１０重量％
　ＷＳＴ－５　ＰＢＳ溶液：２重量％
　ＦＰＯＸ－ＣＥ　ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
　ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
　ＫＮ－１１１：２ｍＭ
　（試料溶液Ｃ１１）
　ＴｒｉｔｏｎＸ－１００　ＰＢＳ溶液：１０重量％
　ＷＳＴ－３　ＰＢＳ溶液：２重量％
　ＦＰＯＸ－ＣＥ　ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
　ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
　ＫＮ－１１１：２ｍＭ
　（試料溶液Ｃ１２）
　Ｔｗｅｅｎ２０　ＰＢＳ溶液：１０重量％
　ＷＳＴ－３　ＰＢＳ溶液：２重量％
　ＦＰＯＸ－ＣＥ　ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
　ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
　ＫＮ－１１１：２ｍＭ
　（比較用試料溶液ｃ１）
　ＦＰＯＸ－ＣＥ　ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
　ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
　ＫＮ－１１１：２ｍＭ
　（糖化ペプチドのＦＰＯＸとの反応）
　試料溶液Ｃ１～Ｃ１２および比較用試料溶液ｃ１の温度が３７℃で１０分間維持され、反応を生じさせた。
　反応後、試料溶液Ｃ１～Ｃ１２および比較用試料溶液ｃ１（９５マイクロリットル）に、５マイクロリットルのＦｒｕ－Ｖａｌ－Ｈｉｓ　１ｍＭ　ＰＢＳ溶液（株式会社ペプチド研究所社より入手可能）が添加された。このようにして、混合溶液Ｃ１～Ｃ１２および比較用混合溶液ｃ１が得られた。
　（ＦＰＯＸ活性の評価）
　波長６６０ナノメートルでの混合溶液Ｃ１～Ｃ１２および比較用混合溶液ｃ１の吸光度が、吸光度計（ＴＥＣＡＮ　Ｇｒｏｕｐ社より入手可能、商品名Ｉｎｆｉｎｉｔｅ　２００　Ｐｒｏ）を用いて、１分毎に測定した。図３は、結果を示す。
　糖化ペプチドＦｒｕ－Ｖａｌ－ＨｉｓはＦＰＯＸと反応して、過酸化水素を発生させる。過酸化水素は、発色色素ＫＮ－１１１と反応し、発色色素ＫＮ－１１１を赤色に変化させる。従って、波長６６０ｎｍ（赤）での発色色素ＫＮ－１１１の吸光度を測定することによって、ＦＰＯＸ活性が評価される。
　図３に示されるように、混合溶液Ｃ１以外の全ての混合溶液Ｃ２～Ｃ１２および比較用混合溶液ｃ１において吸光度変化が観察された。その中でも、混合溶液Ｃ２を除き、吸光度変化は比較用混合試料ｃ１の吸光度変化と類似することが観察された。混合溶液Ｃ２の吸光度変化は、比較用混合試料ｃ１のそれと比べて緩やかであることが観察された。
　一方、試料溶液Ｃ１においては、吸光度変化は全く観察されなかった。
　このように、アニオン性界面活性剤であるＳＤＳは、ＦＰＯＸを不活性化する（混合溶液Ｃ１の結果を参照のこと）。従って、ＳＤＳは、ＦＰＯＸを用いるＨｂＡ１ｃの本願定量方法に用いられない。一方、カチオン性界面活性剤および非イオン性界面活性剤は、ＦＰＯＸを不活性化しない（混合溶液Ｃ２～Ｃ１２および比較用混合溶液ｃ１の結果を参照のこと）。
　図３から明らかなように、ＴＴＡＢが単独で用いられる場合（混合溶液Ｃ２）と比較して、ＴＴＡＢおよびＷＳＴ－３の組成物、ＴＴＡＢおよびＷＳＴ－４の組成物、またはＴＴＡＢおよびＷＳＴ－５の組成物（混合溶液Ｃ８～Ｃ１０）が用いられた場合に、ＦＰＯＸは糖化ペプチドとより速やかに反応する。
　（試験例４）
　［試料溶液の調製］
　試料溶液Ｄ１～Ｄ１６が調製された。比較用試料溶液ｄ１もまた、調製された。
　用いられた試薬の入手先は以下の通りである。
　ＦＰＯＸ－ＣＥ：キッコーマン株式会社
　サーモリシン：和光純薬工業株式会社
　ＳＤＳ：和光純薬工業株式会社
　ペルオキシダーゼ：和光純薬工業株式会社
　ＫＮ－１１１（発色色素）：同仁化学研究所
　ＴＴＡＢ（テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド）：和光純薬工業株式会社
　ＴｒｉｔｏｎＸ－１００：和光純薬工業株式会社
　Ｔｗｅｅｎ２０：和光純薬工業株式会社
　ＷＳＴ－３：同仁化学研究所
　ＷＳＴ－４：同仁化学研究所
　ＷＳＴ－５：同仁化学研究所

　（試料溶液Ｄ１）
　サーモリシン　ＰＢＳ溶液：１５０，０００Ｕ／ｍＬ
　ＳＤＳ　ＰＢＳ溶液：１０重量％
　ＦＰＯＸ－ＣＥ　ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
　ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
　ＫＮ－１１１：２ｍＭ
　（試料溶液Ｄ２）
　サーモリシン　ＰＢＳ溶液：１５０，０００Ｕ／ｍＬ
　ＴＴＡＢ：１０重量％
　ＦＰＯＸ－ＣＥ　ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
　ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
　ＫＮ－１１１：２ｍＭ
　（試料溶液Ｄ３）
　サーモリシン　ＰＢＳ溶液：１５０，０００Ｕ／ｍＬ
　ＴｒｉｔｏｎＸ－１００　ＰＢＳ溶液：１０重量％
　ＦＰＯＸ－ＣＥ　ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
　ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
　ＫＮ－１１１：２ｍＭ
　（試料溶液Ｄ４）
　サーモリシン　ＰＢＳ溶液：１５０，０００Ｕ／ｍＬ
　Ｔｗｅｅｎ２０　ＰＢＳ溶液：１０重量％
　ＦＰＯＸ－ＣＥ　ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
　ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
　ＫＮ－１１１：２ｍＭ
　（試料溶液Ｄ５）
　サーモリシン　ＰＢＳ溶液：１５０，０００Ｕ／ｍＬ
　ＷＳＴ－３　ＰＢＳ溶液：２重量％
　ＦＰＯＸ－ＣＥ　ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
　ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
　ＫＮ－１１１：２ｍＭ
　（試料溶液Ｄ６）
　サーモリシン　ＰＢＳ溶液：１５０，０００Ｕ／ｍＬ
　ＷＳＴ－４　ＰＢＳ溶液：０．５重量％
　ＦＰＯＸ－ＣＥ　ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
　ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
　ＫＮ－１１１：２ｍＭ
　（試料溶液Ｄ７）
　サーモリシン　ＰＢＳ溶液：１５０，０００Ｕ／ｍＬ
　ＷＳＴ－５　ＰＢＳ溶液：２重量％
　ＦＰＯＸ－ＣＥ　ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
　ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
　ＫＮ－１１１：２ｍＭ
　（試料溶液Ｄ８）
　サーモリシン　ＰＢＳ溶液：１５０，０００Ｕ／ｍＬ
　ＴＴＡＢ：１０重量％
　ＷＳＴ－３　ＰＢＳ溶液：２重量％
　ＦＰＯＸ－ＣＥ　ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
　ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
　ＫＮ－１１１：２ｍＭ
　（試料溶液Ｄ９）
　サーモリシン　ＰＢＳ溶液：１５０，０００Ｕ／ｍＬ
　ＴＴＡＢ：１０重量％
　ＷＳＴ－４　ＰＢＳ溶液：０．５重量％
　ＦＰＯＸ－ＣＥ　ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
　ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
　ＫＮ－１１１：２ｍＭ
　（試料溶液Ｄ１０）
　サーモリシン　ＰＢＳ溶液：１５０，０００Ｕ／ｍＬ
　ＴＴＡＢ：１０重量％
　ＷＳＴ－５　ＰＢＳ溶液：２重量％
　ＦＰＯＸ－ＣＥ　ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
　ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
　ＫＮ－１１１：２ｍＭ
　（試料溶液Ｄ１１）
　サーモリシン　ＰＢＳ溶液：１５０，０００Ｕ／ｍＬ
　ＴｒｉｔｏｎＸ－１００　ＰＢＳ溶液：１０重量％
　ＷＳＴ－３　ＰＢＳ溶液：２重量％
　ＦＰＯＸ－ＣＥ　ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
　ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
　ＫＮ－１１１：２ｍＭ
　（試料溶液Ｄ１２）
　サーモリシン　ＰＢＳ溶液：１５０，０００Ｕ／ｍＬ
　Ｔｗｅｅｎ２０　ＰＢＳ溶液：１０重量％
　ＷＳＴ－３　ＰＢＳ溶液：２重量％
　ＦＰＯＸ－ＣＥ　ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
　ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
　ＫＮ－１１１：２ｍＭ
　（比較用試料溶液ｄ１）
　サーモリシン　ＰＢＳ溶液：１５０，０００Ｕ／ｍＬ
　ＦＰＯＸ－ＣＥ　ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
　ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
　ＫＮ－１１１：２ｍＭ
　（糖化ペプチドのＦＰＯＸとの反応）
　試料溶液Ｄ１～Ｄ１２および比較用試料溶液ｄ１の温度が３７℃で１０分間維持され、反応を生じさせた。
　反応後、試料溶液Ｄ１～Ｄ１２および比較用試料溶液ｄ１（９５マイクロリットル）に、５マイクロリットルのＦｒｕ－Ｖａｌ－Ｈｉｓ　１ｍＭ　ＰＢＳ溶液（株式会社ペプチド研究所社より入手可能）が添加された。このようにして、混合溶液Ｄ１～Ｄ１２および比較用混合溶液ｄ１が得られた。
　（ＦＰＯＸ活性の評価）
　波長６６０ナノメートルでの混合溶液Ｄ１～Ｄ１２および比較用混合溶液ｄ１の吸光度が、吸光度計（ＴＥＣＡＮ　Ｇｒｏｕｐ社より入手可能、商品名Ｉｎｆｉｎｉｔｅ　２００　Ｐｒｏ）を用いて、１分毎に測定した。図４は、結果を示す。
　糖化ペプチドＦｒｕ－Ｖａｌ－ＨｉｓはＦＰＯＸと反応して、過酸化水素を発生させる。過酸化水素は、発色色素ＫＮ－１１１と反応し、発色色素ＫＮ－１１１を赤色に変化させる。従って、波長６６０ｎｍ（赤）での発色色素ＫＮ－１１１の吸光度を測定することによって、ＦＰＯＸ活性が評価される。
　図４に示されるように、混合溶液Ｄ１以外の全ての混合溶液Ｄ２～Ｄ１２および比較用混合溶液ｄ１において吸光度変化が観察された。その中でも、混合溶液Ｄ２を除き、吸光度変化は比較用混合試料ｄ１の吸光度変化と類似することが観察された。混合溶液Ｄ２の吸光度変化は、比較用混合試料ｄ１のそれと比べて緩やかであることが観察された。
　一方、試料溶液Ｄ１においては、吸光度変化は全く観察されなかった。
　このように、アニオン性界面活性剤であるＳＤＳは、ＦＰＯＸを不活性化する（混合溶液Ｄ１の結果を参照のこと）。従って、ＳＤＳは、ＦＰＯＸを用いるＨｂＡ１ｃの定量方法に用いられない。一方、カチオン性界面活性剤および非イオン性界面活性剤は、ＦＰＯＸを不活性化しない（混合溶液Ｄ２～Ｄ１２および比較用混合溶液ｄ１の結果を参照のこと）。サーモリシンもまた、ＦＰＯＸを不活性化しない。
　図４から明らかなように、ＴＴＡＢが単独で用いられる場合（混合溶液Ｄ２）と比較して、ＴＴＡＢおよびＷＳＴ－３の組成物、ＴＴＡＢおよびＷＳＴ－４の組成物、またはＴＴＡＢおよびＷＳＴ－５の組成物（混合溶液Ｄ８～Ｄ１０）が用いられた場合に、ＦＰＯＸは糖化ペプチドとより速やかに反応する。
　（試験例５）
　（試料溶液の調製）
　試料溶液Ｅ１～Ｅ１２が調製された。比較用試料溶液ｅ１もまた、調製された。
　用いられた試薬の入手先は以下の通りである。
　ＦＰＯＸ－ＣＥ：キッコーマン株式会社
　パパイン：ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社
　ＳＤＳ：和光純薬工業株式会社
　ペルオキシダーゼ：和光純薬工業株式会社
　ＫＮ－１１１（発色色素）：同仁化学研究所
　ＴＴＡＢ（テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド）：和光純薬工業株式会社
　ＴｒｉｔｏｎＸ－１００：和光純薬工業株式会社
　Ｔｗｅｅｎ２０：和光純薬工業株式会社
　ＷＳＴ－３：同仁化学研究所
　ＷＳＴ－４：同仁化学研究所
　ＷＳＴ－５：同仁化学研究所

　（試料溶液Ｅ１）
　パパイン：３００Ｕ／ｍＬ
　ＳＤＳ　ＰＢＳ溶液：１０重量％
　ＦＰＯＸ－ＣＥ　ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
　ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
　ＫＮ－１１１：２ｍＭ
　（試料溶液Ｅ２）
　パパイン：３００Ｕ／ｍＬ
　ＴＴＡＢ：１０重量％
　ＦＰＯＸ－ＣＥ　ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
　ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
　ＫＮ－１１１：２ｍＭ
　（試料溶液Ｅ３）
　パパイン：３００Ｕ／ｍＬ
　ＴｒｉｔｏｎＸ－１００　ＰＢＳ溶液：１０重量％
　ＦＰＯＸ－ＣＥ　ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
　ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
　ＫＮ－１１１：２ｍＭ
　（試料溶液Ｅ４）
　パパイン：３００Ｕ／ｍＬ
　Ｔｗｅｅｎ２０　ＰＢＳ溶液：１０重量％
　ＦＰＯＸ－ＣＥ　ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
　ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
　ＫＮ－１１１：２ｍＭ
　（試料溶液Ｅ５）
　パパイン：３００Ｕ／ｍＬ
　ＷＳＴ－３　ＰＢＳ溶液：２重量％
　ＦＰＯＸ－ＣＥ　ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
　ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
　ＫＮ－１１１：２ｍＭ
　（試料溶液Ｅ６）
　パパイン：３００Ｕ／ｍＬ
　ＷＳＴ－４　ＰＢＳ溶液：０．５重量％
　ＦＰＯＸ－ＣＥ　ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
　ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
　ＫＮ－１１１：２ｍＭ
　（試料溶液Ｅ７）
　パパイン：３００Ｕ／ｍＬ
　ＷＳＴ－５　ＰＢＳ溶液：２重量％
　ＦＰＯＸ－ＣＥ　ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
　ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
　ＫＮ－１１１：２ｍＭ
　（試料溶液Ｅ８）
　パパイン：３００Ｕ／ｍＬ
　ＴＴＡＢ：１０重量％
　ＷＳＴ－３　ＰＢＳ溶液：２重量％
　ＦＰＯＸ－ＣＥ　ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
　ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
　ＫＮ－１１１：２ｍＭ
　（試料溶液Ｅ９）
　パパイン：３００Ｕ／ｍＬ
　ＴＴＡＢ：１０重量％
　ＷＳＴ－４　ＰＢＳ溶液：０．５重量％
　ＦＰＯＸ－ＣＥ　ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
　ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
　ＫＮ－１１１：２ｍＭ
　（試料溶液Ｅ１０）
　パパイン：３００Ｕ／ｍＬ
　ＴＴＡＢ：１０重量％
　ＷＳＴ－５　ＰＢＳ溶液：２重量％
　ＦＰＯＸ－ＣＥ　ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
　ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
　ＫＮ－１１１：２ｍＭ
　（試料溶液Ｅ１１）
　パパイン：３００Ｕ／ｍＬ
　ＴｒｉｔｏｎＸ－１００　ＰＢＳ溶液：１０重量％
　ＷＳＴ－３　ＰＢＳ溶液：２重量％
　ＦＰＯＸ－ＣＥ　ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
　ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
　ＫＮ－１１１：２ｍＭ
　（試料溶液Ｅ１２）
　パパイン：３００Ｕ／ｍＬ
　Ｔｗｅｅｎ２０　ＰＢＳ溶液：１０重量％
　ＷＳＴ－３　ＰＢＳ溶液：２重量％
　ＦＰＯＸ－ＣＥ　ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
　ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
　ＫＮ－１１１：２ｍＭ
　（比較用試料溶液ｅ１）
　パパイン：３００Ｕ／ｍＬ
　ＦＰＯＸ－ＣＥ　ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
　ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
　ＫＮ－１１１：２ｍＭ
　（糖化ペプチドのＦＰＯＸとの反応）
　試料溶液Ｅ１～Ｅ１２および比較用試料溶液ｅ１の温度が３７℃で１０分間維持され、反応を生じさせた。
　反応後、試料溶液Ｅ１～Ｅ１２および比較用試料溶液ｅ１（９５マイクロリットル）に、５マイクロリットルのＦｒｕ－Ｖａｌ－Ｈｉｓ　１ｍＭ　ＰＢＳ溶液（株式会社ペプチド研究所社より入手可能）が添加された。このようにして、混合溶液Ｅ１～Ｅ１２および比較用混合溶液ｅ１が得られた。
　（ＦＰＯＸ活性の評価）
　波長６６０ナノメートルでの混合溶液Ｅ１～Ｅ１２および比較用混合溶液ｄ１の吸光度が、吸光度計（ＴＥＣＡＮ　Ｇｒｏｕｐ社より入手可能、商品名Ｉｎｆｉｎｉｔｅ　２００　Ｐｒｏ）を用いて、１分毎に測定した。図５は、結果を示す。
　糖化ペプチドＦｒｕ－Ｖａｌ－ＨｉｓはＦＰＯＸと反応して、過酸化水素を発生させる。過酸化水素は、発色色素ＫＮ－１１１と反応し、発色色素ＫＮ－１１１を赤色に変化させる。従って、波長６６０ｎｍ（赤）での発色色素ＫＮ－１１１の吸光度を測定することによって、ＦＰＯＸ活性が評価される。
　図５に示されるように、混合溶液Ｅ１以外の全ての混合溶液Ｅ２～Ｅ１２および比較用混合溶液ｅ１において吸光度変化が観察された。その中でも、混合溶液Ｅ２を除き、吸光度変化は比較用混合試料ｅ１の吸光度変化と類似することが観察された。混合溶液Ｅ２の吸光度変化は、比較用混合試料ｅ１のそれと比べて緩やかであることが観察された。
　一方、試料溶液Ｅ１においては、吸光度変化は全く観察されなかった。
　このように、アニオン性界面活性剤であるＳＤＳは、ＦＰＯＸを不活性化する（混合溶液Ｅ１の結果を参照のこと）。従って、ＳＤＳは、ＦＰＯＸを用いるＨｂＡ１ｃの定量方法に用いられない。一方、カチオン性界面活性剤および非イオン性界面活性剤は、ＦＰＯＸを不活性化しない（混合溶液Ｅ２～Ｅ１２および比較用混合溶液ｅ１の結果を参照のこと）。パパインもまた、ＦＰＯＸを不活性化しない。
　図５から明らかなように、ＴＴＡＢが単独で用いられる場合（混合溶液Ｅ２）と比較して、ＴＴＡＢおよびＷＳＴ－３の組成物、ＴＴＡＢおよびＷＳＴ－４の組成物、またはＴＴＡＢおよびＷＳＴ－５の組成物（混合溶液Ｅ８～Ｅ１０）が用いられた場合に、ＦＰＯＸは糖化ペプチドとより速やかに反応する。
　本発明は、糖尿病の診断に有用である。

Claims (14)

  1. 　試料に含有される糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）を定量する方法であって、以下の工程：
    　（ａ）カチオン性界面活性剤およびテトラゾリウム塩の組成物の存在下において、前記試料をプロテアーゼと混合し、糖化ペプチドを含有する糖化ペプチド水溶液を得る工程、
    　（ｂ）前記工程（ａ）において得られた糖化ペプチド水溶液をフルクトシルペプチドオキシダーゼと混合し、過酸化水素を得る工程、ここで、前記糖化ペプチド水溶液は前記組成物を含有するものである、および
    　（ｃ）工程（ｂ）において得られた過酸化水素水の量に基づいて、前記糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）の濃度を算出する工程
    を具備する、方法。
  2. 　請求項１に記載の方法であって、前記プロテアーゼが、サーモリシンおよびパパインからなる群から選択される、方法。
  3. 　請求項１に記載の方法であって、前記カチオン性界面活性剤が、第４級アンモニウム塩である、方法。
  4. 　請求項１に記載の方法であって、前記テトラゾリウム塩が、
    　２－（４－ヨードフェニル）－３－（２，４－ジニトロフェニル）－５－（２，４－ジスルホフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム，モノナトリウム塩、
    　２－（２－ベンゾチアゾリル）－３－（４－カルボキシ－２－メトキシフェニル）－５－［４－［（２－ソジオスルホエチル）カルバモイル］フェニル］－２Ｈ－テトラゾール－３－イウム、および
    　２，２’－（３，３’－ジメトキシ－４，４’－ビフェニリレン）ビス［３－（２－ベンゾチアゾリル）－５－［４－［Ｎ－［２－（ソジオオキシスルホニル）エチル］－Ｎ－（２－スルホエチル）カルバモイル］フェニル］－２Ｈ－テトラゾール－３－イウム］からなる群から選択される、方法。
  5. 　請求項１に記載の方法であって、前記糖化ペプチドがフルクトシルペプチドである、方法。
  6. 　請求項５に記載の方法であって、前記フルクトシルペプチドが、フルクトシル－バリン－ヒスチジンである、方法。
  7. 　試料に含有される糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）を定量する方法であって、以下の工程：
    　（ａ）カチオン性界面活性剤およびテトラゾリウム塩の組成物の存在下において、前記試料をプロテアーゼおよびフルクトシルペプチドオキシダーゼと混合し、過酸化水素水を得る工程、および
    　（ｂ）工程（ａ）において得られた過酸化水素の量に基づいて、前記糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）の濃度を算出する工程
    を具備する、方法。
  8. 　請求項７に記載の方法であって、前記プロテアーゼが、サーモリシンおよびパパインからなる群から選択される、方法。
  9. 　請求項７に記載の方法であって、前記界面活性剤が、第４級アンモニウム塩である、方法。
  10. 　請求項７に記載の方法であって、前記テトラゾリウム塩が、
    　２－（４－ヨードフェニル）－３－（２，４－ｄｉニトロフェニル）－５－（２，４－ジスルホフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム，モノナトリウム塩、
    　２－（２－ベンゾチアゾリル）－３－（４－カルボキシ－２－メトキシフェニル）－５－［４－［（２－ソジオスルホエチル）カルバモイル］フェニル］－２Ｈ－テトラゾール－３－イウム、および
    　２，２’－（３，３’－ジメトキシ－４，４’－ビフェニリレン）ビス［３－（２－ベンゾチアゾリル）－５－［４－［Ｎ－［２－（ソジオオキシスルホニル）エチル］－Ｎ－（２－スルホエチル）カルバモイル］フェニル］－２Ｈ－テトラゾール－３－イウム］からなる群から選択される、方法。
  11. 　請求項７に記載の方法であって、前記糖化ペプチドがフルクトシルペプチドである、方法。
  12. 　請求項１１に記載の方法であって、前記フルクトシルペプチドが、フルクトシル－バリン－ヒスチジンである、方法。
  13. 　カチオン性界面活性剤およびテトラゾリウム塩を含有する、プロテアーゼを活性化するための組成物。
  14. 　請求項１３に記載の組成物であって、前記プロテアーゼが、サーモリシンおよびパパインからなる群から選択される、組成物。
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