WO2014103847A1 - 親水性組換えタンパク質の粗精製方法 - Google Patents

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WO2014103847A1
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protein
recombinant protein
amino acid
hydrophilic
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PCT/JP2013/083972
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大澤利昭
森田啓介
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スパイバー株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a method for crude purification of a hydrophilic recombinant protein, and in particular, the hydrophilic recombination protein from a host expressing a hydrophilic recombinant protein such as a recombinant spider silk protein having a hydropathic index of 0 or less.
  • the present invention relates to a method for roughly purifying protein.
  • Spider silk fibers are fibers having high strength and toughness, and are known to have higher strength and toughness than high-strength steel, nylon (registered trademark) 6 fibers, and the like. Because of these characteristics, spider silk has attracted attention as a novel material, and spider silk proteins, which are raw materials for spider silk, are expressed and recovered in host cells such as Escherichia coli by genetic recombination techniques.
  • Patent Document 1 discloses spiders such as the Nephila cavipes large ampolate silk thread protein and the American ampoule small silk thread protein by recombinant DNA technology. It is disclosed to produce silk protein.
  • Patent Document 1 when cells are lysed to release and recover recombinant spider silk protein present in the cells, the spider silk protein is repeatedly treated with a solvent that dissolves cell residues but does not dissolve spider silk proteins. Is precipitating. However, it is effective when the recombinant spider silk protein is a water-insoluble protein, but when the recombinant protein is a hydrophilic recombinant protein, it is not an effective means, and simplification of the process is desired.
  • the present invention provides simple and efficient hydrophilic recombination from a host expressing a hydrophilic recombinant protein such as a recombinant spider silk protein having a hydropathic index of 0 or less.
  • a hydrophilic recombinant protein such as a recombinant spider silk protein having a hydropathic index of 0 or less.
  • a method for crude purification of a hydrophilic recombinant protein which can crudely purify a protein.
  • the present invention is a method for roughly purifying a hydrophilic recombinant protein from a host expressing a hydrophilic recombinant protein, wherein a solvent for dissolution is added to the host expressing the hydrophilic recombinant protein, A lysate obtaining step of lysing host cells and separating insolubles to obtain a lysate, wherein the hydrophilic recombinant protein has a hydropathic index of 0 or less, and the lysis solvent is an aprotic polar solvent
  • the present invention relates to a method for crude purification of hydrophilic recombinant protein.
  • the dissolution solvent preferably has a dipole moment of 3.0D or more, and includes dimethyl sulfoxide, N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide. More preferably, the solvent is one or more aprotic polar solvents selected from the group consisting of 1,3-dimethyl-2-imidazolidone and N-methyl-2-pyrrolidone.
  • the dissolution solvent is preferably a solvent obtained by adding an inorganic salt to the aprotic polar solvent. The insoluble matter can be separated by filtration and / or centrifugation.
  • the dissolution solvent is preferably added in a volume (mL) / mass (g) ratio of 0.5 times or more with respect to the mass of the host. It is preferable to replace the solution with an aqueous solvent. More preferably, the solvent-substituted lysate is further treated by one or more means selected from the group consisting of column, filtration, and centrifugation.
  • the hydrophilic recombinant protein is preferably one protein selected from the group consisting of recombinant spider silk protein, recombinant resilin, and recombinant collagen.
  • an aprotic polar solvent is used as a solvent for dissolution, a host expressing a hydrophilic recombinant protein having a hydropathic index of 0 or less is dissolved in the solvent for dissolution, and insoluble matter is separated and dissolved.
  • a hydrophilic recombinant protein having a hydropathic index of 0 or less can be roughly purified from the host simply and efficiently.
  • a recombinant spider silk protein having a hydropathic index of 0 or less, a recombinant resilin, Hydrophilic recombinant proteins such as recombinant collagen can be roughly purified.
  • FIG. 1 is a photograph showing the results of SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) of the proteins obtained in Example 1 and Comparative Example 1.
  • FIG. 2 is a photograph showing the results of SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) of the proteins obtained in Examples 2-6.
  • FIG. 3 is a photograph showing the results of SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) of the protein obtained in Comparative Example 2.
  • 4 is a photograph showing the results of SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) of the protein obtained in Example 8.
  • FIG. 1 is a photograph showing the results of SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) of the proteins obtained in Example 1 and Comparative Example 1.
  • FIG. 2 is a photograph showing the results of SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) of the proteins obtained in Examples 2-6.
  • the protein hydropathic index is calculated as follows. First, the sum total of hydropathic indexes of amino acids present in the protein is obtained. Next, an average value is obtained by dividing the sum by the number of amino acid residues in the protein, and the calculated average value is used as the hydropathy index of the protein.
  • the hydropathic index of amino acids a known index (Hydropathy index: Kyte, J. & Doolittle, R. F. (1982) A simple method for displaying the hydropathic character of a protein. J. Mol. Biol. 157 , 105-132.). Specifically, the hydropathic index (hereinafter also referred to as HI) of each amino acid is as shown in Table 1 below.
  • the present inventors add an aprotic polar solvent to a host expressing a hydrophilic recombinant protein having a hydropathic index of 0 or less to dissolve host cells and separate insoluble matters.
  • the hydrophilic recombinant protein having a hydropathic index of 0 or less was recovered in the supernatant and roughly purified, and the present invention was achieved. That is, the present inventors found that hydrophilic recombinant proteins having a hydropathic index of 0 or less are dissolved in an aprotic polar solvent by dissolving host cells with an aprotic polar solvent.
  • the hydrophilic protein means a hydrophilic protein having a hydropathic index of 0 or less.
  • the recombinant protein means a hydrophilic recombinant protein having a hydropathic index of 0 or less.
  • the aprotic polar solvent is not particularly limited, but from the viewpoint of reducing impurities, the purity is preferably 90% or more, and more preferably 95% or more.
  • the aprotic polar solvent preferably has a dipole moment of 3.0D or more. The dipole moment is used as an index indicating the strength of the polarity of the molecule. The greater the dipole moment, the greater the strength of the polarity. In general, a molecule having a dipole moment of 3.0D or more is considered to have a strong polarity, and a solvent having a large polarity is effective in dissolving a compound having a polarity such as a protein.
  • Table 2 below shows the dipole moments of various organic compounds (organic solvents) based on the solvent handbook (2007) published by Kodansha Scientific.
  • aprotic polar solvents having a dipole moment of 3.0D or more include dimethyl sulfoxide (DMSO), N, N-dimethylformamide (DMF), N, N-dimethylacetamide (DMA), and 1,3-dimethyl-2 -Imidazolidone (DMI), N-methyl-2-pyrrolidone (NMP), acetonitrile and the like.
  • the concentration is not particularly limited, but the concentration of the inorganic salt is 0.1 M or more from the viewpoint of increasing the purity (purification degree) of the recombinant protein. It is preferable that it is 0.25M or more, more preferably 0.5M or more.
  • the upper limit of the concentration of the inorganic salt is not particularly limited, but is preferably saturated or lower, for example, 2.5 M or lower.
  • the addition amount of the solvent for dissolution is not particularly limited as long as it is an amount capable of dissolving the host, but from the viewpoint of enhancing solubility, the volume (mL) / mass ( g)
  • the ratio is preferably 0.5 times or more, more preferably 0.75 times or more, and further preferably 1 time or more.
  • the addition amount of the dissolution solvent is preferably 10 times or less, more preferably 6 times as a volume (mL) / mass (g) ratio with respect to the mass of the host. Or less, more preferably 4 times or less.
  • the host (cell) may be in a dry state or a moist state.
  • the step of adding the lysis solvent to the host and lysing the host cells is not particularly limited, but is preferably performed at 20 ° C. or higher, more preferably at 45 ° C. or higher, from the viewpoint of solubility of the recombinant protein. Preferably, it is more preferably performed at 50 ° C. or higher.
  • the lysate acquisition step is preferably performed at 100 ° C. or less, and more preferably at 95 ° C. or less.
  • the solution obtaining step is not particularly limited, but for example, it is preferably performed for 10 to 300 minutes, more preferably 30 to 180 minutes.
  • the separation of the insoluble matter is not particularly limited as long as the precipitate can be separated. It is preferable to carry out separation by filtration and / or centrifugation because of easy handling. Separation by filtration can be performed using, for example, a filter paper, a filtration membrane, or the like.
  • the conditions for centrifugation are not particularly limited. For example, the treatment can be performed at room temperature (20 ⁇ 5 ° C.) at 8000 ⁇ g to 15000 ⁇ g for 5 to 20 minutes.
  • the insoluble matter may be separated twice or more.
  • the above-mentioned recombinant protein is not particularly limited as long as it is a hydrophilic recombinant protein having a hydropathic index of 0 or less.
  • the hydropathic index is preferably ⁇ 0.1 or less, and more preferably ⁇ 0.3 or less.
  • the recombinant protein is not particularly limited, but is preferably one protein selected from the group consisting of recombinant spider silk protein, recombinant resilin, recombinant collagen, and the like.
  • the recombinant spider silk protein is not particularly limited as long as it is a recombinant spider silk protein derived from a natural spider silk protein.
  • a mutant, analog or derivative of a natural spider silk protein is included.
  • the recombinant spider silk protein is preferably a recombinant spider silk protein derived from a large sphincter bookmark thread protein produced from a spider large bottle-like line.
  • the large sputum bookmark thread protein include large bottle-shaped wire spidroins MaSp1 and MaSp2 derived from Nephila clavipes, and ADF3 and ADF4 derived from two-banded spider (Araneus diadematus).
  • the recombinant spider silk protein may be a recombinant spider silk protein derived from a small sputum bookmarker thread produced by a spider's small line.
  • the small sputum bookmarker protein include small bottle-shaped spidroin MiSp1 and MiSp2 derived from Nephila clavies.
  • the recombinant spider silk protein may be a recombinant spider silk protein derived from a weft protein produced in the flagellate form of a spider. Examples of the weft protein include flagellum silk protein derived from Nephila clavipes.
  • Examples of the recombinant spider silk protein derived from the above-mentioned large sphincter bookmark silk protein include a polypeptide comprising 2 or more, preferably 4 or more, more preferably 6 or more amino acid sequence units represented by Formula 1: REP1-REP2. Can be mentioned.
  • the unit of the amino acid sequence represented by Formula 1: REP1-REP2 may be the same or different.
  • REP1 means polyalanine.
  • the alanine arranged continuously is preferably 2 residues or more, more preferably 3 residues or more, still more preferably 4 residues or more, particularly preferably 5 residues or more. It is.
  • the alanine arranged continuously is preferably 20 residues or less, more preferably 16 residues or less, still more preferably 14 residues or less, and particularly preferably 12 residues.
  • REP2 is an amino acid sequence consisting of 10 to 200 amino acids, and the total number of residues of glycine, serine, glutamine, proline and alanine contained in the amino acid sequence is based on the total number of amino acid residues. 40% or more, preferably 50% or more, more preferably 60% or more.
  • the REP1 corresponds to a crystalline region that forms a crystalline ⁇ -sheet in the fiber
  • the REP2 is an amorphous region that is more flexible in the fiber and largely lacks a regular structure.
  • [REP1-REP2] corresponds to a repetitive region (repetitive sequence) composed of a crystal region and an amorphous region, and is a characteristic sequence of a bookmark thread protein.
  • Examples of the polypeptide containing two or more amino acid sequence units represented by the above formula 1: REP1-REP2 include ADF3-derived recombinant spider silk protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is the start codon at the N-terminus of the partial amino acid sequence of ADF3 obtained from the NCBI database (NCBI Genebank accession number: AAC47010, GI: 1263287), This is an amino acid sequence from the first residue to the 136th residue of the amino acid sequence to which an amino acid sequence (SEQ ID NO: 3) consisting of a His10 tag and an HRV 3C protease (Human rhinovirus 3C protease) recognition site is added.
  • a gene encoding a recombinant spider silk protein derived from ADF3 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 a gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 can be used.
  • a polypeptide containing two or more units of the amino acid sequence represented by the above formula 1: REP1-REP2 one or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 are substituted, deleted, inserted and / or
  • a polypeptide having an added amino acid sequence, a repeating region consisting of a crystalline region and an amorphous region, and having an HI of 0 or less may be used.
  • the HI of the polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (ADF3Kai-small-M) is ⁇ 0.948.
  • “one or more” means, for example, 1 to 40, 1 to 35, 1 to 30, 1 to 25, 1 to 20, 1 to 15, 1 to 10, Or one or several.
  • “one or several” means 1 to 9, 1 to 8, 1 to 7, 1 to 6, 1 to 5, 1 to 4, 1 to 3, Means 2 or 1.
  • Examples of the polypeptide containing two or more amino acid sequence units represented by the above formula 1: REP1-REP2 include an ADF3-derived recombinant spider silk protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 consists of a partial amino acid sequence of ADF3 obtained from the NCBI database (NCBI Genebank accession number: AAC47010, GI: 1263287), the initiation codon, His10 tag and It is an amino acid sequence from the 1st residue to the 542nd residue of the amino acid sequence to which an amino acid sequence (SEQ ID NO: 3) consisting of a recognition site for HRV 3C protease (Human rhinovirus 3C protease) is added.
  • a gene encoding a recombinant spider silk protein derived from ADF3 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 a gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 can be used.
  • a polypeptide containing two or more units of the amino acid sequence represented by the above formula 1: REP1-REP2 one or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 are substituted, deleted, inserted and / or
  • a polypeptide having an added amino acid sequence, a repeating region consisting of a crystalline region and an amorphous region, and having an HI of 0 or less may be used.
  • the HI of the polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (ADF3Kai-NN) is ⁇ 0.92.
  • Examples of the polypeptide containing two or more units of the amino acid sequence represented by the above formula 1: REP1-REP2 include an ADF4-derived recombinant spider silk protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6. .
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 consists of a partial amino acid sequence of ADF4 (NCBI Genebank accession number: AAC47011, GI: 1263289) obtained from the NCBI database, the initiation codon, His10 tag and It is an amino acid sequence from the 1st residue to the 318th residue of an amino acid sequence to which an amino acid sequence (SEQ ID NO: 3) consisting of a recognition site for HRV3C protease (Human rhinovirus 3C protease) is added.
  • a gene encoding a recombinant spider silk protein derived from ADF4 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 a gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 can be used.
  • a polypeptide containing two or more units of the amino acid sequence represented by the above formula 1: REP1-REP2 one or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 are substituted, deleted, inserted and / or
  • a polypeptide having an added amino acid sequence, a repeating region consisting of a crystalline region and an amorphous region, and having an HI of 0 or less may be used.
  • the HI of the polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 (ADF4Kai-W) is ⁇ 0.357.
  • the recombinant spider silk protein derived from the above-mentioned small sputum bookmarker protein includes a polypeptide comprising an amino acid sequence represented by the formula 2: (Gly-Gly-Z) m (Gly-Ala) l (Ala) o Can be mentioned.
  • Z means any one amino acid, but it is particularly preferably one amino acid selected from the group consisting of Ala, Tyr and Gln.
  • M is preferably an integer in the range of 1 to 4
  • l is preferably an integer in the range of 0 to 4
  • o is preferably an integer in the range of 1 to 6.
  • small splint bookmark yarn is spirally wound from the center of the spider's web, and is used as a reinforcing material for the web or as a yarn that wraps the captured prey. It is known that the tensile strength is inferior to that of the large splint bookmark yarn, but the stretchability is high. This is because in the small spout bookmark thread, many crystal regions are formed from regions in which glycine and alanine are alternately arranged, so that the crystal region is larger than the large spout bookmark yarn in which the crystal region is formed only with alanine. It is thought that this is because the hydrogen bond of is easily weakened.
  • Examples of the recombinant spider silk protein derived from the above weft protein include a polypeptide comprising an amino acid sequence represented by Formula 3: (Gly-Pro-Gly-Gly-X) n.
  • the units of the amino acid sequence represented by Gly-Pro-Gly-Gly-X may be the same or different.
  • X means any one amino acid, but is preferably one amino acid selected from the group consisting of Ala, Ser, Tyr and Val.
  • N is an integer of 4 or more, preferably an integer of 10 or more, more preferably an integer of 20 or more.
  • Examples of the polypeptide containing the amino acid sequence represented by the above formula 3: (Gly-Pro-Gly-Gly-X) n include a group derived from flagellar silk protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8.
  • An example is a spider silk protein.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 is the repeat portion and motif of the partial sequence of American flagella silk protein obtained from the NCBI database (NCBI Genebank accession number: AAF36090, GI: 7106224).
  • SEQ ID NO: 3 an amino acid sequence consisting of a start codon, a His10 tag and an HRV3C protease recognition site
  • polypeptide containing the amino acid sequence represented by the above formula 3: (Gly-Pro-Gly-Gly-X) n one or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 are substituted or deleted.
  • a polypeptide having an amino acid sequence inserted and / or added, a repeating region consisting of an amorphous region, and a HI of 0 or less may be used.
  • the HI of the polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 (Flag92-short2-UU) is ⁇ 0.482.
  • a great feature of spider silk is that the weft does not have a crystal region but has a repeating region consisting of an amorphous region. It is presumed that the large splint bookmark yarn has both high stress and stretchability because it has a repetitive region consisting of a crystal region and an amorphous region. On the other hand, the weft yarn is inferior in stress to the large splint guide yarn, but has high stretchability. This is considered to be because most of the weft is composed of amorphous regions.
  • the above-mentioned recombinant spider silk protein is preferably a recombinant spider silk protein derived from ADF3, which is one of the two main spider silk proteins of Araneus diadematus.
  • ADF3 recombinant spider silk protein derived from ADF3
  • An advantage of the recombinant spider silk protein derived from ADF3 is that the elongation and toughness are basically high and easy to synthesize.
  • recombinant resilin for example, recombinant resilin derived from natural resilin can be used.
  • recombinant resilin derived from natural resilin there is a polypeptide comprising a plurality of units of the amino acid sequence represented by Formula 4: REP3, preferably 4 or more, more preferably 10 or more, and still more preferably 20 or more. Can be mentioned.
  • the unit of the amino acid sequence represented by REP3 may be the same or different.
  • REP3 means an amino acid sequence composed of (Ser-J-J-Tyr-Gly-U-Pro), and J means any one amino acid, particularly Asp, Ser and Thr. It is preferably one amino acid selected from the group consisting of U represents any one amino acid, and is preferably one amino acid selected from the group consisting of Pro, Ala, Thr and Ser.
  • Examples of the polypeptide containing a plurality of units of the amino acid sequence represented by the above formula 4: REP3 include recombinant resilin having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 was obtained by obtaining a partial sequence of Drosophila melanogaster resilin (NCBI Genebank accession number: Q9V7U0.1, GI: 75026432) from the NCBI web database. This is an amino acid sequence in which an amino acid sequence consisting of a start codon and a His6 tag (SEQ ID NO: 12) is added to the N-terminus of the amino acid sequence corresponding to the portion and motif corresponding to the 19th to 321st residues.
  • the HI of recombinant resilin having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 is -1.229.
  • the polypeptide containing a plurality of units of the amino acid sequence represented by the above formula 4: REP3 has one or more amino acids substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10.
  • a polypeptide having an amino acid sequence and HI of 0 or less may be used.
  • Resilin is a rubber-like protein that exists in specific areas of insect cuticles and is an excellent elastic material.
  • the elasticity of the material is 97%, and only 3% of the stored energy is lost as heat. This elastic performance is thought to be brought about by cross-linking of tyrosine in resilin. Dityrosine cross-linked resilin gives the cuticle an excellent elasticity and plays a major role in insect flight and jumping systems.
  • recombinant collagen for example, recombinant collagen derived from natural collagen can be used.
  • examples of the recombinant collagen derived from natural collagen include a polypeptide comprising 5 or more, preferably 8 or more, more preferably 10 or more consecutive amino acid sequence units represented by Formula 5: REP4.
  • REP4 means an amino acid sequence composed of Gly-XY, and X and Y mean any one amino acid other than Gly.
  • the unit of the amino acid sequence represented by REP4 may be the same or different.
  • Examples of the polypeptide containing 10 or more consecutive amino acid sequence units represented by the above formula 5: REP4 include recombinant collagen having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13 is the repeat part and motif of the partial sequence of human collagen type 4 (NCBI Genebank accession number: CAA56335.1, GI: 3702452) obtained from the NCBI database.
  • An amino acid sequence in which an amino acid sequence consisting of a start codon, His6 tag and Ser-Ser-Gly-Ser-Ser (SEQ ID NO: 15) is added to the N-terminal of the corresponding amino acid sequence from the 301st to 540th residues. is there.
  • the HI of recombinant collagen having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13 is -0.792.
  • a polypeptide containing 10 or more units of the amino acid sequence represented by the above formula 5: REP4 one or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 are substituted, deleted, inserted and / or Alternatively, a polypeptide consisting of an added amino acid sequence may be used.
  • Collagen is one of the proteins constituting the dermis, ligaments, tendons, bones, cartilage, etc., and is the main component of the extracellular matrix of multicellular animals. It has been reported that there are more than 30 types of human collagen, but any collagen has a repeating sequence of the amino acid sequence shown by REP4 called a collagen-like sequence.
  • the above recombinant protein can be produced using a host transformed with an expression vector containing a gene encoding the recombinant protein.
  • the method for producing the gene is not particularly limited, and a gene encoding the recombinant protein is amplified and cloned from the gene-derived cell by polymerase chain reaction (PCR) or chemically synthesized.
  • the method for chemically synthesizing the gene is not particularly limited, for example, an oligonucleotide automatically synthesized with AKTA oligopilot plus 10/100 (manufactured by GE Healthcare Japan) based on the amino acid sequence information of the recombinant protein. Can be synthesized by PCR or the like.
  • a gene encoding a protein consisting of an amino acid sequence in which an amino acid sequence consisting of a His tag is added to the N terminus of the amino acid sequence of the target protein may be synthesized.
  • plasmids, phages, viruses and the like that can express proteins from DNA sequences can be used.
  • the plasmid type expression vector is not particularly limited as long as it expresses the target gene in the host cell and can be amplified by itself.
  • Escherichia coli Rosetta (DE3) is used as a host
  • a pET22b (+) plasmid vector, a pCold plasmid vector, or the like can be used.
  • the host for example, animal cells, plant cells, microorganisms and the like used in protein expression systems can be used, and microorganisms are preferable from the viewpoint of production cost, and from the viewpoint of safety and operability. More preferably, E. coli is used.
  • the recombinant protein preferably has a molecular weight of 500 kDa or less, more preferably 300 kDa or less, and even more preferably 200 kDa when producing recombinant protein using a microorganism such as Escherichia coli as a host. It is as follows.
  • the solution containing the above recombinant protein may be further purified by solvent replacement.
  • Solvent replacement can be performed by dialysis.
  • An aqueous solvent containing water can be used as the dialysis solvent (dialysate).
  • the aqueous solvent include water, a mixed solution of water and a water-miscible organic solvent, a water-soluble buffer solution, an acidic aqueous solution, and a basic aqueous solution.
  • water for example, pure water, distilled water, ultrapure water, or the like can be used.
  • Examples of the acidic aqueous solution include acidic aqueous solutions such as formic acid, acetic acid, and diluted hydrochloric acid
  • examples of the basic aqueous solution include basic aqueous solutions such as a sodium hydroxide aqueous solution and a calcium hydroxide aqueous solution.
  • the water-miscible organic solvent may be any organic solvent that can be mixed with water, and known ones can be used. Specific examples include alcohols such as methanol and ethanol.
  • the aprotic polar solvent is preferably an aprotic polar solvent having no cyclic structure.
  • Recombinant proteins such as recombinant spider silk protein, recombinant resilin, and recombinant collagen can be obtained by using an aprotic polar solvent that does not have a cyclic structure as the solvent for dissolution and replacing the solution containing the recombinant protein with an aqueous solvent. Can be extracted with higher purity.
  • the aprotic polar solvent having no cyclic structure include dimethyl sulfoxide (DMSO), N, N-dimethylformamide (DMF), and N, N-dimethylacetamide (DMA).
  • the solvent-substituted lysate may be further processed by one or more means selected from the group consisting of a column, filtration, centrifugation and the like.
  • a gel filtration column, an ion exchange column, etc. can be used for a column,
  • a filter paper, a filtration membrane, etc. can be used for filtration.
  • ADF3Kai-small-M gene A partial amino acid sequence of ADF3 (NCBI accession number: AAC47010, GI: 1263287) from NCBI's web database ), And an amino acid sequence (SEQ ID NO: 3) consisting of a start codon, His10 tag and HRV3C protease (Human rhinovirus 3C protease) recognition site is added to the N-terminus of the sequence, and 136 to 136 from the first residue of the sequence.
  • a gene encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence up to the residue (SEQ ID NO: 1) was synthesized.
  • the pUC57 vector into which the ADF3Kai-small-M gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 was introduced (the Nde I site immediately upstream of the 5 ′ end and the Xba I site immediately downstream of the 5 ′ end) Acquired. Thereafter, the gene was subjected to restriction enzyme treatment with Nde I and EcoR I, recombined into the pET22b (+) expression vector, and a pET22b (+) vector into which the ADF3Kai-small-M gene was introduced was obtained.
  • Drosophila-Resilin-Kai Gene A partial sequence of Drosophila melanogaster resilin (NCBI Genebank accession number: Q9V7U0.1, GI: 75026432) was obtained from the NCBI web database, and the sequence was repeated. It consists of an amino acid sequence (SEQ ID NO: 10) in which an amino acid sequence consisting of a start codon and a His6 tag (SEQ ID NO: 12) is added to the N-terminus of the amino acid sequence corresponding to the portion and motif corresponding to the 19th to 321st residues. A gene encoding the polypeptide was synthesized.
  • the pUC57 vector into which the Drosophila-Resilin-Kai gene having the base sequence shown in SEQ ID NO: 11 was introduced (the Nde I site immediately upstream of the 5 ′ end and the Xba I site immediately downstream of the 5 ′ end) Acquired. Thereafter, the gene was subjected to restriction enzyme treatment with Nde I and EcoR I, recombined into the pET22b (+) expression vector, and a pET22b (+) vector into which the Drosophila-Resilin-Kai gene was introduced was obtained.
  • the pUC57 vector into which the Collagen-type4-Kai gene having the base sequence shown in SEQ ID NO: 14 was introduced (the Nde I site immediately upstream of the 5 ′ end and the Xba I site immediately downstream of the 5 ′ end) Acquired. Thereafter, the gene was subjected to restriction enzyme treatment with Nde I and EcoR I, recombined into a pET22b (+) expression vector, and a pET22b (+) vector into which the Collagen-type4-Kai gene was introduced was obtained.
  • a culture solution having an OD600 of 3.5 was added to 7 L of 2 ⁇ YT medium containing ampicillin together with 140 mL of 50% glucose, and further cultured until the OD600 reached 4.0. Thereafter, protein expression was induced by adding isopropyl- ⁇ -thiogalactoviranoside (IPTG) to the obtained culture solution having an OD600 of 4.0 so that the final concentration was 0.5 mM.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -thiogalactoviranoside
  • the target protein (ADF3Kai-small-M is about 12.5 kDa, depending on the addition of IPTG, It was confirmed by SDS-PAGE that Drosophila-Resilin-Kai was expressed about 28.5 kDa and Collagen-type4-Kai was about 24.5 kDa).
  • the hydropathic index of the protein of ADF3Kai-small-M is -0.948
  • the hydropathic index of Drosophila-Resilin-Kai is -1.229
  • the hydropathic index of Collagen-type4-Kai is -0. 792.
  • E. coli expressing the ADF3Kai-small-M protein, E. coli expressing the Drosophila-Resilin-Kai protein, and E. coli expressing the Collagen-type4-Kai protein in a freezer ( ⁇ 20 ° C.) saved.
  • Example 1 Protein purification (1) 45 ml of DMSO containing 1 M LiCl was added to about 15 g of Escherichia coli wet cells expressing the ADF3Kai-small-M protein and dissolved at 60 ° C. for 30 minutes. Thereafter, the mixture was centrifuged at 11000 ⁇ g for 10 minutes at 20 ° C. with a centrifuge (“MX-305” manufactured by Tommy Seiko Co., Ltd.), and the supernatant (solution) was collected. (2) The recovered solution was dialyzed to replace the solvent with DMSO and water. The dialysate (water) was changed every 6 hours, and dialysis was performed for a total of 48 hours.
  • the lysate after dialysis was centrifuged at 11000 ⁇ g for 10 minutes at 20 ° C. with a centrifuge (“MX-305” manufactured by Tommy Seiko Co., Ltd.), and the supernatant (lysed solution after solvent replacement) was recovered. . (3) 2 ml of a slurry of 50% by volume of Ni resin (binding to His) was added to 40 ml of the solution after solvent substitution, and the mixture was shaken at room temperature for 1 hour.
  • the Ni resin is recovered, washed 5 times with 10 ml of elution buffer (50 mM Tris, 50 mM NaCl), and then the target protein (ADF3Kai-small-M) is eluted with 300 mM imidazole, and the eluate is recovered. did.
  • SDS-PAGE was performed using the lysate obtained in Example 1, the lysate after solvent replacement, the column eluate, and the ultrasonic disruption liquid obtained in Comparative Example 1. Specifically, in 30 ⁇ L of each sample, 2 ⁇ SDS buffer (4 w / v% SDS, 20 w / v% glycerol, 10 w / v% 2-mercaptoethanol, 0.004 w / v% bromophenol blue, 0.125 M Tris , PH 6.8) 30 ⁇ L was added, heat-treated at 95 ° C. for 10 minutes, and the band was confirmed by polyacrylamide gel electrophoresis using a heat-denatured protein solution cooled at room temperature.
  • the gel was stained with Oriole fluorescent gel stain, and the results are shown in FIG. Moreover, the purity of the target protein (recombinant protein) was calculated
  • FIG. 1 shows the results of SDS-PAGE using the lysate obtained in Example 1, the lysate after solvent replacement and the column eluate, and the ultrasonic disruption liquid obtained in Comparative Example 1.
  • lane M shows a molecular weight marker
  • lane 1 shows a protein contained in the ultrasonic disruption liquid obtained in Comparative Example 1
  • lanes 2, 3, and 4 are obtained in Example 1, respectively.
  • the protein contained in the obtained lysate, lysate after solvent replacement, and column eluate is shown.
  • a protein band corresponding to ADF3Kai-small-M (molecular weight of about 12.5 kDa) is indicated by an arrow.
  • the purity of ADF3Kai-small-M in the lysate obtained by dissolving E. coli with DMSO containing 1M LiCl is as follows. It was confirmed that the target protein (ADF3Kai-small-M) was roughly purified by dissolving E. coli with an aprotic polar solvent and separating insolubles, which was higher than the purity of ADF3Kai-small-M. Further, the purity of the target protein (ADF3Kai-small-M) was increased by substituting the solvent with water. Moreover, the purity of the target protein (ADF3Kai-small-M) was further increased by treating the solution after solvent substitution with a column.
  • Example 2 45 ml of DMSO containing 1M LiCl was added to about 15 g of Escherichia coli wet cells expressing the ADF3Kai-small-M protein and dissolved at 60 ° C. for 30 minutes. Thereafter, the mixture was centrifuged at 11000 ⁇ g for 10 minutes at 20 ° C. with a centrifuge (“MX-305” manufactured by Tommy Seiko Co., Ltd.), and the supernatant (solution) was collected.
  • MX-305 manufactured by Tommy Seiko Co., Ltd.
  • Example 3 The supernatant (solution) was recovered in the same manner as in Example 2 except that DMF containing 1M LiCl was used instead of DMSO containing 1M LiCl.
  • Example 4 The supernatant (lysate) was collected in the same manner as in Example 2 except that DMA containing 1M LiCl was used instead of DMSO containing 1M LiCl.
  • Example 5 The supernatant (lysate) was collected in the same manner as in Example 2 except that NMP containing 1M LiCl was used instead of DMSO containing 1M LiCl.
  • Example 6 The supernatant (lysate) was collected in the same manner as in Example 2 except that DMI containing 1M LiCl was used instead of DMSO containing 1M LiCl.
  • Example 2 The supernatant (solution) was collected in the same manner as in Example 2 except that isopropanol containing 1M LiCl (isopropanol purity: 90%) was used instead of DMSO containing 1M LiCl.
  • lane M indicates a molecular weight marker
  • lanes 1, 2, 3, 4, and 5 correspond to Examples 2, 3, 4, 5, and 6, respectively.
  • an arrow indicates a protein band corresponding to ADF3Kai-small-M (molecular weight of about 12.5 kDa).
  • a hydrophilic recombinant protein having a hydropathic index of 0 or less is obtained by dissolving E. coli expressing a hydrophilic recombinant protein having a hydropathic index of 0 or less in an aprotic polar solvent and separating insolubles. It was found that can be roughly purified.
  • lane M shows a molecular weight marker
  • lane 1 corresponds to Comparative Example 2.
  • the arrow indicates a protein band corresponding to ADF3Kai-small-M (molecular weight of about 12.5 kDa).
  • the purity of the target recombinant spider silk protein roughly purified in the example using an aprotic polar solvent such as DMSO is a comparative example using isopropanol which is a protic polar solvent. It is 2.2 to 3.1 times the purity of the target recombinant spider silk protein roughly purified by using a hydrophilic group with a hydropathic index of 0 or less by using an aprotic polar solvent such as DMSO. The replacement protein could be crudely purified.
  • Example 7 To about 0.3 g of Escherichia coli wet cells expressing Drosophila-Resilin-Kai protein, 1 ml of DMSO containing 1M LiCl was added and allowed to stand at 60 ° C. for 30 minutes for dissolution. Thereafter, the mixture was centrifuged at 11000 ⁇ g for 5 minutes at 20 ° C. with a centrifuge (“MX-305” manufactured by Tommy Seiko Co., Ltd.), and the supernatant (solution) was collected.
  • MX-305 manufactured by Tommy Seiko Co., Ltd.
  • Example 8 1 ml of DMSO containing 1M LiCl was added to about 0.1 g of dry Escherichia coli cells expressing Collagen-type4-Kai protein, and the mixture was allowed to stand at 60 ° C. for 30 minutes for dissolution. Thereafter, the mixture was centrifuged at 11000 ⁇ g for 5 minutes at 20 ° C. with a centrifuge (“MX-305” manufactured by Tommy Seiko Co., Ltd.), and the supernatant (solution) was collected.
  • MX-305 manufactured by Tommy Seiko Co., Ltd.
  • the arrow indicates a protein band corresponding to Collagen-type4-Kai (molecular weight of about 24.5 kDa). Further, when the electrophoretic photograph of the stained protein was image-analyzed using the analysis software ImageLab (Bio-RAD Laboratories, Inc.), the degree of purification of the target protein (Collagen-type4-Kai) was 11.6%. It was.
  • the present invention can be used to roughly purify a hydrophilic recombinant protein from a host expressing a hydrophilic recombinant protein having a hydropathic index of 0 or less.
  • SEQ ID NO: 1 2, 3, 6, 8, 10, 12, 13, 15 amino acid sequence
  • SEQ ID NO: 4 5, 7, 9, 11, 14 nucleotide sequence

Abstract

　本発明は、親水性組換えタンパク質を発現している宿主から親水性組換えタンパク質を粗精製する方法であって、上記親水性組換えタンパク質を発現している宿主に溶解用溶媒を添加し、宿主細胞を溶解し、不溶物を分離して溶解液を得る溶解液取得工程を含み、上記親水性組換えタンパク質はハイドロパシーインデックスが０以下であり、上記溶解用溶媒は非プロトン性極性溶媒である親水性組換えタンパク質の粗精製方法に関する。上記溶解液は水系溶媒で溶媒置換することが好ましい。

Description

親水性組換えタンパク質の粗精製方法
　本発明は、親水性組換えタンパク質の粗精製方法に関し、詳細には、ハイドロパシ―インデックスが０以下の組換えクモ糸タンパク質などの親水性組換えタンパク質を発現している宿主から該親水性組換えタンパク質を粗精製する方法に関する。
　クモ糸繊維は、高い強度とタフネスを有する繊維であり、高張力鋼、ナイロン（登録商標）６繊維などよりも高い強度とタフネスを有することが知られている。このような特性から、クモ糸は新規な素材として注目され、クモ糸の原料となるクモ糸タンパク質を遺伝的組換え技術により大腸菌などの宿主細胞に発現させ、回収することが行われている。例えば、特許文献１には、組換えＤＮＡ技術により、アメリカジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ）大吐糸管（ｍａｊｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ）絹糸（しおり糸）タンパク質、アメリカジョロウグモ小吐糸管（ｍｉｎｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ）絹糸タンパク質などのクモ絹糸タンパク質を製造することが開示されている。
特開平６－９８７７１号公報
　特許文献１では、細胞を溶解させて細胞内に存在する組換えクモ絹糸タンパク質を放出して回収するに際し、細胞残渣は溶解するがクモ絹糸タンパク質は溶解しない溶媒で繰り返し処理することによってクモ絹糸タンパク質を沈澱させている。しかし、組換えクモ絹糸タンパク質が水に不溶性のタンパク質の場合は有効であるが、組換えタンパク質が親水性組換えタンパク質の場合は、有効な手段ではなく、工程の簡便化が望まれている。
　本発明は、上記従来の問題を解決するため、ハイドロパシ―インデックスが０以下の組換えクモ糸タンパク質などの親水性組換えタンパク質を発現している宿主から、簡便かつ効率的に、親水性組換えタンパク質を粗精製することができる親水性組換えタンパク質の粗精製方法を提供する。
　本発明は、親水性組換えタンパク質を発現している宿主から親水性組換えタンパク質を粗精製する方法であって、上記親水性組換えタンパク質を発現している宿主に溶解用溶媒を添加し、宿主細胞を溶解し、不溶物を分離して溶解液を得る溶解液取得工程を含み、上記親水性組換えタンパク質はハイドロパシーインデックスが０以下であり、上記溶解用溶媒は非プロトン性極性溶媒であることを特徴とする親水性組換えタンパク質の粗精製方法に関する。
　本発明の親水性組換えタンパク質の粗精製方法において、上記溶解用溶媒は、双極子モーメントが３．０Ｄ以上であることが好ましく、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、１,３－ジメチル－２－イミダゾリドン、及びＮ－メチル－２－ピロリドンからなる群から選ばれる一種以上の非プロトン性極性溶媒であることがより好ましい。上記溶解用溶媒は、上記非プロトン性極性溶媒に無機塩を添加したものであることが好ましい。上記不溶物の分離は、濾過による分離及び／又は遠心分離により行うことができる。上記溶解用溶媒は、上記宿主の質量に対して、体積（ｍＬ）／質量（ｇ）比として、０．５倍以上添加することが好ましい。上記溶解液を、水系溶媒で溶媒置換することが好ましい。溶媒置換された溶解液を、さらにカラム、濾過、及び遠心分離からなる群から選ばれる一種以上の手段で処理することがより好ましい。上記親水性組換えタンパク質は、組換えクモ糸タンパク質、組換えレシリン、及び組換えコラーゲンからなる群から選ばれる１つのタンパク質であることが好ましい。
　本発明によると、溶解用溶媒として非プロトン性極性溶媒を用い、ハイドロパシーインデックスが０以下の親水性組換えタンパク質を発現している宿主を溶解用溶媒で溶解させ、不溶物を分離し、溶解液を回収することにより、簡便かつ効率的に宿主からハイドロパシーインデックスが０以下の親水性組換えタンパク質を粗精製することができる。
　また、本発明によると、溶解用溶媒として非プロトン性極性溶媒に無機塩を添加したものを用いることで、より高い精製率でハイドロパシーインデックスが０以下の組換えクモ糸タンパク質、組換えレシリン、組換えコラーゲンなどの親水性組換えタンパク質を粗精製することができる。
図１は、実施例１及び比較例１で得られたタンパク質のＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）の結果を示す写真である。 図２は、実施例２～６で得られたタンパク質のＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）の結果を示す写真である。 図３は、比較例２で得られたタンパク質のＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）の結果を示す写真である。 図４は、実施例８で得られたタンパク質のＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）の結果を示す写真である。
　本発明において、タンパク質のハイドロパシーインデックス（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ　ｉｎｄｅｘ）は、以下のように算出したものである。まず、タンパク質中に存在するアミノ酸のハイドロパシーインデックスの総和を求める。次にその総和をタンパク質中のアミノ酸残基数で割ることにより平均値を求め、算出された平均値をタンパク質のハイドロパシーインデックスとする。なお、アミノ酸のハイドロパシーインデックスについては、公知の指標（Ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ　ｉｎｄｅｘ：Kyte, J. & Doolittle, R. F. (1982) A simple method for displaying the hydropathic character of a protein. J. Mol. Biol. 157, 105-132.）を使用する。具体的には、各アミノ酸のハイドロパシーインデックス（以下において、ＨＩとも記す。）は、下記表１に示すとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　本発明者らは、ハイドロパシーインデックス（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ　ｉｎｄｅｘ）が０以下の親水性組換えタンパク質を発現している宿主に非プロトン性極性溶媒を添加して宿主細胞を溶解させて不溶物を分離することで、上記ハイドロパシーインデックスが０以下の親水性組換えタンパク質が上清にて回収され、粗精製されることを見出し、本発明に至った。すなわち、宿主細胞を非プロトン性極性溶媒で溶解させることにより、ハイドロパシーインデックスが０以下の親水性組換えタンパク質が非プロトン性極性溶媒に溶解されることを見出し、本発明に至った。以下において、特に指摘がない場合、親水性タンパク質は、ハイドロパシーインデックスが０以下の親水性タンパク質を意味する。また、以下において、特に指摘がない場合、組換えタンパク質は、ハイドロパシーインデックスが０以下の親水性の組換えタンパク質を意味する。
　上記非プロトン性極性溶媒は、特に限定されないが、夾雑物を低減するという観点から、純度が９０％以上であることが好ましく、９５％以上であることがより好ましい。上記非プロトン性極性溶媒は、双極子モーメントが３．０Ｄ以上であることが好ましい。双極子モーメントは、分子の極性の強さを表す指標として用いられ、双極子モーメントが大きいほど、極性の強さも大きくなる。一般的に双極子モーメントが３．０Ｄ以上の分子は極性が強いとされ、タンパク質等の極性を持った化合物を溶解する場合には極性の大きな溶媒が有効である。下記表２に、講談社サイエンティフィック社が出版している溶剤ハンドブック（２００７年）に基づいた各種有機化合物（有機溶剤）の双極子モーメントを記載する。双極子モーメントが３．０Ｄ以上の非プロトン性極性溶媒としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、１,３－ジメチル－２－イミダゾリドン（ＤＭＩ）、Ｎ－メチル－２－ピロリドン（ＮＭＰ）、アセトニトリルなどが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　上記溶解用溶媒が非プロトン性極性溶媒に無機塩を添加したものである場合、特に限定されないが、組換えタンパク質の純度（精製度）を高める観点から、無機塩の濃度は、０．１Ｍ以上であることが好ましく、より好ましくは０．２５Ｍ以上であり、さらに好ましくは０．５Ｍ以上である。また、上記溶解用溶媒において、無機塩の濃度の上限は特に限定されないが、飽和状態以下であることが好ましく、例えば２．５Ｍ以下にすればよい。
　上記溶解用溶媒の添加量は、上記宿主を溶解できる量であればよく、特に限定されないが、溶解性を高める観点から、上記宿主（細胞）の質量に対して、体積（ｍＬ）／質量（ｇ）比として、０．５倍以上であることが好ましく、より好ましくは０．７５倍以上であり、さらに好ましくは１倍以上である。また、操作の簡便性から、上記溶解用溶媒の添加量は上記宿主の質量に対して、体積（ｍＬ）／質量（ｇ）比として、１０倍以下であることが好ましく、より好ましくは６倍以下であり、さらに好ましくは４倍以下である。上記宿主（細胞）は、乾燥した状態でもよく、湿った状態でもよい。
　上記溶解用溶媒を宿主に添加し、宿主細胞を溶解する工程は、特に限定されないが、組換えタンパク質の溶解性の観点から、２０℃以上で行うことが好ましく、４５℃以上で行うことがより好ましく、５０℃以上で行うことがさらに好ましい。また、組換えタンパク質の分解を抑制するという観点から、上記溶解液取得工程は、１００℃以下で行うことが好ましく、９５℃以下で行うことがより好ましい。また、上記溶解液取得工程は、特に限定されないが、例えば、１０～３００分間行うことが好ましく、より好ましくは３０～１８０分間行うことが好ましい。
　本発明において、不溶物の分離は、沈降物を分離できればよく、特に限定されない。取扱いの簡便性から、濾過による分離及び／又は遠心分離により行うことが好ましい。濾過による分離は、例えば、ろ紙、ろ過膜などを用いて行うことができる。遠心分離の条件は、特に限定されない。例えば、室温（２０±５℃）、８０００×ｇ～１５０００×ｇで５～２０分間行うことができる。上記不溶物の分離は２回以上行ってもよい。
　上記組換えタンパク質は、ハイドロパシーインデックスが０以下の親水性の組換えタンパク質であればよく、特に限定されない。抽出効率が高いという観点から、ハイドロパシーインデックスが－０．１以下であることが好ましく、－０．３以下であることがより好ましい。
　上記組換えタンパク質としては、特に限定されないが、例えば、組換えクモ糸タンパク質、組換えレシリン、及び組換えコラーゲンなどからなる群から選ばれる一つのタンパク質であることが好ましい。
　上記組換えクモ糸タンパク質は、天然型クモ糸タンパク質に由来する組換えクモ糸タンパク質であればよく、特に限定されない。例えば天然型クモ糸タンパク質の変異体、類似体又は誘導体などを含む。上記組換えクモ糸タンパク質は、強靭性に優れるという観点からクモの大瓶状線で産生される大吐糸管しおり糸タンパク質に由来する組換えクモ糸タンパク質であることが好ましい。上記大吐糸管しおり糸タンパク質としては、アメリカジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ）に由来する大瓶状線スピドロインＭａＳｐ１やＭａＳｐ２、二ワオニグモ（Ａｒａｎｅｕｓ　ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ）に由来するＡＤＦ３やＡＤＦ４などが挙げられる。また、上記組換えクモ糸タンパク質は、クモの小瓶状線で産生される小吐糸管しおり糸に由来する組換えクモ糸タンパク質であってもよい。上記小吐糸管しおり糸タンパク質としては、アメリカジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ）に由来する小瓶状線スピドロインＭｉＳｐ１やＭｉＳｐ２が挙げられる。また、上記組換えクモ糸タンパク質は、クモの鞭毛状線（ｆｌａｇｅｌｌｉｆｏｒｍ　ｇｌａｎｄ）で産生される横糸タンパク質に由来する組換えクモ糸タンパク質であってもよい。上記横糸タンパク質としては、例えばアメリカジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ）に由来する鞭毛状絹タンパク質（ｆｌａｇｅｌｌｉｆｏｒｍ　ｓｉｌｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ）などが挙げられる。
　上記大吐糸管しおり糸タンパク質に由来する組換えクモ糸タンパク質としては、式１：ＲＥＰ１－ＲＥＰ２で示されるアミノ酸配列の単位を２以上、好ましくは４以上、より好ましくは６以上含むポリペプチドが挙げられる。なお、上記大吐糸管しおり糸タンパク質に由来する組換えクモ糸タンパク質において、式１：ＲＥＰ１－ＲＥＰ２で示されるアミノ酸配列の単位は、同一であってもよく、異なっていてもよい。
　上記式１において、ＲＥＰ１はポリアラニンを意味している。上記ＲＥＰ１において、連続して並んでいるアラニンは、２残基以上であることが好ましく、より好ましくは３残基以上であり、さらに好ましくは４残基以上であり、特に好ましくは５残基以上である。また、上記ＲＥＰ１において、連続して並んでいるアラニンは、２０残基以下であることが好ましく、より好ましくは１６残基以下であり、さらに好ましくは１４残基以下であり、特に好ましくは１２残基以下である。上記式１において、ＲＥＰ２は１０～２００残基のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、上記アミノ酸配列中に含まれるグリシン、セリン、グルタミン、プロリン及びアラニンの合計残基数がアミノ酸残基数全体に対して４０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上である。
　大吐糸管しおり糸において、上記ＲＥＰ１は繊維内で結晶βシートを形成する結晶領域に該当し、上記ＲＥＰ２は繊維内でより柔軟性があり大部分が規則正しい構造を欠いている無定型領域に該当する。そして、上記［ＲＥＰ１－ＲＥＰ２］は、結晶領域と無定型領域からなる繰り返し領域（反復配列）に該当し、しおり糸タンパク質の特徴的配列である。
　上記式１：ＲＥＰ１－ＲＥＰ２で示されるアミノ酸配列の単位を２以上含むポリペプチドとしては、例えば、配列番号１に示されているアミノ酸配列を有するＡＤＦ３由来の組換えクモ糸タンパク質が挙げられる。配列番号１に示されているアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースから入手したＡＤＦ３の部分的なアミノ酸配列（ＮＣＢＩのＧｅｎｅｂａｎｋのアクセッション番号：ＡＡＣ４７０１０、ＧＩ：１２６３２８７）のアミノ酸配列のＮ末端に、開始コドン、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（Ｈｕｍａｎ　ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ　３Ｃプロテアーゼ）認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号３）を付加したアミノ酸配列の１残基目から１３６残基目までのアミノ酸配列である。配列番号１に示されているアミノ酸配列を有するＡＤＦ３由来の組換えクモ糸タンパク質をコードする遺伝子としては、配列番号４に示されている塩基配列からなる遺伝子を用いることができる。また、上記式１：ＲＥＰ１－ＲＥＰ２で示されるアミノ酸配列の単位を２以上含むポリペプチドとしては、配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、結晶領域と無定型領域からなる繰り返し領域を有し、ＨＩが０以下のポリペプチドを用いてもよい。なお、配列番号１に示されているアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＡＤＦ３Ｋａｉ－ｓｍａｌｌ－Ｍ）のＨＩは、－０．９４８である。
　本発明において、「１若しくは複数個」とは、例えば、１～４０個、１～３５個、１～３０個、１～２５個、１～２０個、１～１５個、１～１０個、又は１若しくは数個を意味する。また、本発明において、「１若しくは数個」は、１～９個、１～８個、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個、１～２個、又は１個を意味する。
　また、上記式１：ＲＥＰ１－ＲＥＰ２で示されるアミノ酸配列の単位を２以上含むポリペプチドとしては、例えば、配列番号２に示されているアミノ酸配列を有するＡＤＦ３由来の組換えクモ糸タンパク質が挙げられる。配列番号２に示されているアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースから入手したＡＤＦ３の部分的なアミノ酸配列（ＮＣＢＩのＧｅｎｅｂａｎｋのアクセッション番号：ＡＡＣ４７０１０、ＧＩ：１２６３２８７）のＮ末端に、開始コドン、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（Ｈｕｍａｎ　ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ　３Ｃプロテアーゼ）認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号３）を付加したアミノ酸配列の１残基目から５４２残基目までのアミノ酸配列である。配列番号２に示されているアミノ酸配列を有するＡＤＦ３由来の組換えクモ糸タンパク質をコードする遺伝子としては、配列番号５に示されている塩基配列からなる遺伝子を用いることができる。また、上記式１：ＲＥＰ１－ＲＥＰ２で示されるアミノ酸配列の単位を２以上含むポリペプチドとしては、配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、結晶領域と無定型領域からなる繰り返し領域を有し、ＨＩが０以下のポリペプチドを用いてもよい。なお、配列番号２に示されているアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＡＤＦ３Ｋａｉ－ＮＮ）のＨＩは、－０．９２である。
　また、上記式１：ＲＥＰ１－ＲＥＰ２で示されるアミノ酸配列の単位を２以上含むポリペプチドとしては、例えば、配列番号６に示されているアミノ酸配列を有するＡＤＦ４由来の組換えクモ糸タンパク質が挙げられる。配列番号６に示されているアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースから入手したＡＤＦ４の部分的なアミノ酸配列（ＮＣＢＩのＧｅｎｅｂａｎｋのアクセッション番号：ＡＡＣ４７０１１、ＧＩ：１２６３２８９）のＮ末端に、開始コドン、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（Ｈｕｍａｎ　ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ　３Ｃプロテアーゼ）認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号３）を付加したアミノ酸配列の１残基から３１８残基目までのアミノ酸配列である。配列番号６に示されているアミノ酸配列を有するＡＤＦ４由来の組換えクモ糸タンパク質をコードする遺伝子としては、配列番号７に示されている塩基配列からなる遺伝子を用いることができる。また、上記式１：ＲＥＰ１－ＲＥＰ２で示されるアミノ酸配列の単位を２以上含むポリペプチドとしては、配列番号６に示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、結晶領域と無定型領域からなる繰り返し領域を有し、ＨＩが０以下のポリペプチドを用いてもよい。なお、配列番号６に示されているアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＡＤＦ４Ｋａｉ－Ｗ）のＨＩは、－０．３５７である。
　上記小吐糸管しおり糸タンパク質に由来する組換えクモ糸タンパク質としては、式２：（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｚ）ｍ（Ｇｌｙ－Ａｌａ）ｌ（Ａｌａ）ｏで示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる。
　上記式２において、Ｚは任意の一つのアミノ酸を意味するが、特にＡｌａ、Ｔｙｒ及びＧｌｎからなる群から選ばれる一つのアミノ酸であることが好ましい。また、ｍは１～４の範囲の整数であることが好ましく、ｌは０～４の範囲の整数であることが好ましく、ｏは１～６の範囲の整数であることが好ましい。
　クモ糸において、小吐糸管しおり糸はクモの巣の中心から螺旋状に巻かれ、巣の補強材として使われたり、捉えた獲物を包む糸として利用されたりする。大吐糸管しおり糸と比べると引っ張り強度は劣るが、伸縮性は高いことが知られている。これは小吐糸管しおり糸において、多くの結晶領域がグリシンとアラニンが交互に連なる領域から形成されているため、アラニンのみで結晶領域が形成されている大吐糸管しおり糸よりも結晶領域の水素結合が弱くなり易いためだと考えられている。
　上記横糸タンパク質に由来する組換えクモ糸タンパク質としては、式３：（Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｘ）ｎで示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる。Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｘで示されるアミノ酸配列の単位は、同一であってもよく、異なっていてもよい。
　上記式３において、Ｘは任意の一つのアミノ酸を意味するが、特にＡｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ及びＶａｌからなる群から選ばれる一つのアミノ酸であることが好ましい。また、ｎは４以上の整数であり、好ましくは１０以上の整数、より好ましくは２０以上の整数である。
　上記式３：（Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｘ）ｎで示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドとしては、例えば、配列番号８に示されているアミノ酸配列を有する鞭毛状絹タンパク質に由来の組換えクモ糸タンパク質が挙げられる。配列番号８に示されているアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースから入手したアメリカジョロウグモの鞭毛状絹タンパク質の部分的な配列（ＮＣＢＩのＧｅｎｅｂａｎｋのアクセッション番号：ＡＡＦ３６０９０、ＧＩ：７１０６２２４）のリピート部分及びモチーフに該当するＮ末端の１２２０残基目から１６５９残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に、開始コドンと、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号３）を付加したアミノ酸配列である。配列番号８に示されているアミノ酸配列を有する鞭毛状絹タンパク質に由来の組換えクモ糸タンパク質をコードする遺伝子としては、配列番号９に示されている塩基配列からなる遺伝子を用いることができる。また、上記式３：（Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｘ）ｎで示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドとしては、配列番号８に示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、無定形領域からなる繰り返し領域を有し、ＨＩが０以下のポリペプチドを用いてもよい。なお、配列番号８に示されているアミノ酸配列を有するポリペプチド（Ｆｌａｇ９２－ｓｈｏｒｔ２－ＵＵ）のＨＩは、－０．４８２である。
　クモ糸において、横糸は結晶領域を持たず、無定形領域からなる繰り返し領域を持つことが大きな特徴である。大吐糸管しおり糸などにおいては結晶領域と無定形領域からなる繰り返し領域を持つため、高い応力と伸縮性を併せ持つと推測される。一方、横糸については、大吐糸管しおり糸に比べると応力は劣るが、高い伸縮性を持つ。これは横糸の大部分が無定形領域によって構成されているためだと考えられている。
　上記組換えクモ糸タンパク質は、ニワオニグモ（Ａｒａｎｅｕｓ　ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ）の２つの主要なしおり糸タンパク質の一つであるＡＤＦ３由来の組換えクモ糸タンパク質であることが好ましい。ＡＤＦ３由来の組換えクモ糸タンパク質は、強伸度及びタフネスが基本的に高く、合成し易いことも利点として挙げられる。
　組換えレシリンとしては、例えば天然のレシリンに由来する組換えレシリンを用いることができる。天然のレシリンに由来する組換えレシリンとしては、式４：ＲＥＰ３で示されるアミノ酸配列の単位を複数個、好ましくは４個以上、より好ましくは１０個以上、さらに好ましくは２０個以上含むポリペプチドが挙げられる。式４において、ＲＥＰ３で示されるアミノ酸配列の単位は同一であってもよく、異なっていてもよい。
　上記式４において、ＲＥＰ３は（Ｓｅｒ－Ｊ－Ｊ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｕ－Ｐｒｏ）から構成されるアミノ酸配列を意味し、Ｊは任意の一つのアミノ酸を意味するが、特にＡｓｐ、Ｓｅｒ及びＴｈｒからなる群から選ばれる一つのアミノ酸であることが好ましい。また、Ｕは任意の一つのアミノ酸を意味するが、特にＰｒｏ、Ａｌａ、Ｔｈｒ及びＳｅｒからなる群から選ばれる一つのアミノ酸であることが好ましい。
　上記式４：ＲＥＰ３で示されるアミノ酸配列の単位を複数個含むポリペプチドとしては、例えば、配列番号１０に示されているアミノ酸配列を有する組換えレシリン等が挙げられる。配列番号１０に示されているアミノ酸配列は、キイロショウジョウバエのレシリンの部分配列（ＮＣＢＩのＧｅｎｅｂａｎｋのアクセッション番号：Ｑ９Ｖ７Ｕ０．１、ＧＩ：７５０２６４３２）をＮＣＢＩのウェブデータベースから入手し、該配列において、リピート部分及びモチーフに該当する１９残基目から３２１残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に、開始コドンとＨｉｓ６タグからなるアミノ酸配列（配列番号１２）を付加したアミノ酸配列である。配列番号１０に示されているアミノ酸配列を有する組換えレシリンのＨＩは、－１．２２９である。また、上記式４：ＲＥＰ３で示されるアミノ酸配列の単位を複数個含むポリペプチドとしては、配列番号１０に示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、ＨＩが０以下のポリペプチドを用いてもよい。
　レシリンは、昆虫のクチクラの特定の領域に存在するゴム様タンパク質であり、優れた弾性材料である。該物質の弾性能は９７％であるとされ、貯蔵エネルギーのわずか３％しか熱として損失しない。この弾性能はレシリン中のチロシン同士が架橋することによってもたらされていると考えられている。ジチロシン架橋されたレシリンはクチクラに優れた弾性を与え、昆虫の飛行システムや跳躍システムに大きな役割を果たしている。
　組換えコラーゲンとしては、例えば天然のコラーゲンに由来する組換えコラーゲンを用いることができる。天然のコラーゲンに由来する組換えコラーゲンとしては、式５：ＲＥＰ４で示されるアミノ酸配列の単位を５以上、好ましくは８以上、より好ましくは１０以上連続して含むポリペプチドが挙げられる。上記式５において、ＲＥＰ４はＧｌｙ－Ｘ－Ｙから構成されるアミノ酸配列を意味し、Ｘ及びＹはＧｌｙ以外の任意の一つのアミノ酸を意味する。式５において、ＲＥＰ４で示されるアミノ酸配列の単位は同一であってもよく、異なっていてもよい。
　上記式５：ＲＥＰ４で示されるアミノ酸配列の単位を１０以上連続して含むポリペプチドとしては、例えば、配列番号１３に示されているアミノ酸配列を有する組換えコラーゲンが挙げられる。配列番号１３に示されているアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースから入手したヒトのコラーゲンタイプ４の部分的な配列（ＮＣＢＩのＧｅｎｅｂａｎｋのアクセッション番号：ＣＡＡ５６３３５．１、ＧＩ：３７０２４５２）のリピート部分及びモチーフに該当する３０１残基目から５４０残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に、開始コドン、Ｈｉｓ６タグ及びＳｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒからなるアミノ酸配列（配列番号１５）を付加したアミノ酸配列である。配列番号１３に示されているアミノ酸配列を有する組換えコラーゲンのＨＩは、－０．７９２である。また、上記式５：ＲＥＰ４で示されるアミノ酸配列の単位を１０以上連続して含むポリペプチドとしては、配列番号１３に示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドを用いてもよい。
　コラーゲンは、真皮、靭帯、腱、骨、軟骨などを構成するタンパク質のひとつであり、多細胞動物の細胞外マトリクスの主成分である。ヒトのコラーゲンは３０種類以上あることが報告されているが、いずれのコラーゲンにおいてもコラーゲン様配列と呼ばれるＲＥＰ４で示されるアミノ酸配列の繰り返し配列を有することがその配列的特徴として挙げられる。
　上記組換えタンパク質は、組換えタンパク質をコードする遺伝子を含有する発現ベクターで形質転換した宿主を用いて製造することができる。遺伝子の製造方法は特に制限されず、組換えタンパク質をコードする遺伝子を遺伝子由来の細胞からポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などで増幅しクローニングするか、若しくは化学的に合成する。遺伝子の化学的な合成方法も特に制限されず、例えば、組換えタンパク質のアミノ酸配列情報をもとに、ＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ　１０／１００（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）などで自動合成したオリゴヌクレオチドをＰＣＲなどで連結して合成することができる。この際に、タンパク質の精製や確認を容易にするため、上記の対象タンパク質のアミノ酸配列のＮ末端にＨｉｓタグからなるアミノ酸配列を付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子を合成してもよい。
　上記発現ベクターとしては、ＤＮＡ配列からタンパク質を発現し得るプラスミド、ファージ、ウイルスなどを用いることができる。上記プラスミド型発現ベクターとしては、宿主細胞内で目的の遺伝子を発現し、かつ自身が増幅することのできるものであればよく、特に限定されない。例えば宿主として大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）を用いる場合は、ｐＥＴ２２ｂ（＋）プラスミドベクター、ｐＣｏｌｄプラスミドベクターなどを用いることができる。中でも、タンパク質の生産性の観点から、ｐＥＴ２２ｂ（＋）プラスミドベクターを用いることが好ましい。上記宿主（細胞）としては、例えば、タンパク質発現系に用いられる動物細胞、植物細胞、微生物などを用いることができ、生産コストの観点から微生物を用いることが好ましく、安全性及び操作性という観点から大腸菌を用いることがより好ましい。
　上記組換えタンパク質は、大腸菌などの微生物を宿主とした組換えタンパク質生産を行う場合、生産性の観点から、分子量が５００ｋＤａ以下であることが好ましく、より好ましくは３００ｋＤａ以下であり、さらに好ましくは２００ｋＤａ以下である。
　上記組換えタンパク質を含む溶解液を、溶媒置換することでさらに精製してもよい。溶媒置換は透析により行うことができる。透析用の溶媒（透析液）は、水を含む水系溶媒を用いることができる。水系溶媒としては、例えば、水、水と水混和性有機溶媒との混合液、水溶性緩衝液、酸性水溶液、塩基性水溶液等が挙げられる。水としては、例えば、純水、蒸留水、超純水等を用いることができる。酸性水溶液としては、ギ酸、酢酸、希塩酸等の酸性水溶液が挙げられ、塩基性水溶液としては、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カルシウム水溶液などの塩基性水溶液が挙げられる。水混和性有機溶媒としては、水と混合できる有機溶媒であればよく、公知のものを用いることができる。具体的には、メタノール、エタノール等のアルコール類が挙げられる。
　上記組換えタンパク質を含む溶解液を水系溶媒で溶媒置換する場合、上記非プロトン性極性溶媒は、環状構造を有しない非プロトン性極性溶媒であることが好ましい。溶解用溶媒として環状構造を有しない非プロトン性極性溶媒を用い、組換えタンパク質を含む溶解液を水系溶媒で溶媒置換すると、組換えクモ糸タンパク質、組換えレシリン、組換えコラーゲン等の組換えタンパク質をより高い純度で抽出できる。環状構造を有しない非プロトン性極性溶媒としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、及びＮ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）等が挙げられる。
　また、溶媒置換された溶解液は、さらにカラム、濾過、遠心分離などからなる群から選ばれる一種以上の手段で処理されてもよい。カラムには、ゲル濾過カラムやイオン交換カラムなどを用いることができ、濾過には濾紙や濾過膜などを用いることができる。上記処理により、目的タンパク質（親水性組換えタンパク質）の精製度（純度）がより高くなる。
　以下、実施例を用いて、本発明をさらに具体的に説明する。なお、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。
　（大腸菌での組換えタンパク質の発現）
　＜遺伝子の合成＞
　（１）ＡＤＦ３Ｋａｉ－ｓｍａｌｌ－Ｍの遺伝子の合成
　ＮＣＢＩのウェブデータベースより、ニワオニグモの２つの主要なしおり糸タンパク質の一つであるＡＤＦ３の部分的なアミノ酸配列（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＡＣ４７０１０、ＧＩ：１２６３２８７）を取得し、同配列のＮ末端に、開始コドン、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（Ｈｕｍａｎ　ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ　３Ｃプロテアーゼ）認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号３）を付加し、該配列の１残基目から１３６残基目までのアミノ酸配列（配列番号１）からなるポリペプチドをコードする遺伝子を合成した。その結果、配列番号４に示す塩基配列からなるＡＤＦ３Ｋａｉ－ｓｍａｌｌ－Ｍの遺伝子が導入されたｐＵＣ５７ベクター（遺伝子の５’末端直上流にＮｄｅ　Ｉサイト、及び５’末端直下流にＸｂａ　Ｉサイト有り）を取得した。その後、同遺伝子をＮｄｅ　Ｉ及びＥｃｏＲ　Ｉで制限酵素処理し、ｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターに組み換え、ＡＤＦ３Ｋａｉ－ｓｍａｌｌ－Ｍの遺伝子が導入されたｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクターを得た。
　（２）Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ－Ｒｅｓｉｌｉｎ－Ｋａｉの遺伝子の合成
　キイロショウジョウバエのレシリンの部分配列（ＮＣＢＩのＧｅｎｅｂａｎｋのアクセッション番号：Ｑ９Ｖ７Ｕ０．１、ＧＩ：７５０２６４３２）をＮＣＢＩのウェブデータベースから入手し、該配列において、リピート部分及びモチーフに該当する１９残基目から３２１残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に、開始コドンとＨｉｓ６タグからなるアミノ酸配列（配列番号１２）を付加したアミノ酸配列（配列番号１０）からなるポリペプチドをコードする遺伝子を合成した。その結果、配列番号１１に示す塩基配列からなるＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ－Ｒｅｓｉｌｉｎ－Ｋａｉの遺伝子が導入されたｐＵＣ５７ベクター（遺伝子の５’末端直上流にＮｄｅ　Ｉサイト、及び５’末端直下流にＸｂａ　Ｉサイト有り）を取得した。その後、同遺伝子をＮｄｅ　Ｉ及びＥｃｏＲ　Ｉで制限酵素処理し、ｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターに組み換え、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ－Ｒｅｓｉｌｉｎ－Ｋａｉの遺伝子が導入されたｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクターを得た。
　（３）Ｃｏｌｌａｇｅｎ－ｔｙｐｅ４－Ｋａｉの遺伝子の合成
　ヒトのコラーゲンタイプ４の部分配列（ＮＣＢＩのＧｅｎｅｂａｎｋのアクセッション番号：ＣＡＡ５６３３５．１、ＧＩ：３７０２４５２）をＮＣＢＩのウェブデータベースから入手し、該配列において、リピート部分及びモチーフに該当する３０１残基目から５４０残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に、開始コドン、Ｈｉｓ６タグ及びＳｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒからなるアミノ酸配列（配列番号１５）を付加したアミノ酸配列（配列番号１３）からなるポリペプチドをコードする遺伝子を合成した。その結果、配列番号１４に示す塩基配列からなるＣｏｌｌａｇｅｎ－ｔｙｐｅ４－Ｋａｉの遺伝子が導入されたｐＵＣ５７ベクター（遺伝子の５’末端直上流にＮｄｅ　Ｉサイト、及び５’末端直下流にＸｂａ　Ｉサイト有り）を取得した。その後、同遺伝子をＮｄｅ　Ｉ及びＥｃｏＲ　Ｉで制限酵素処理し、ｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターに組み換え、Ｃｏｌｌａｇｅｎ－ｔｙｐｅ４－Ｋａｉの遺伝子が導入されたｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクターを得た。
　＜タンパク質の発現＞
　ＡＤＦ３Ｋａｉ－ｓｍａｌｌ－Ｍの遺伝子が導入されたｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクター、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ－Ｒｅｓｉｌｉｎ－Ｋａｉの遺伝子が導入されたｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクター、Ｃｏｌｌａｇｅｎ－ｔｙｐｅ４－Ｋａｉの遺伝子が導入されたｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクターを、それぞれ、大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）に形質転換した。得られたシングルコロニーを、アンピシリンを含む２ｍＬのＬＢ培地で１５時間培養後、同培養液１．４ｍｌを、アンピシリンを含む１４０ｍＬのＬＢ培地に添加し、３７℃、２００ｒｐｍの条件下で、培養液のＯＤ６００が３．５になるまで培養した。次に、ＯＤ６００が３．５の培養液を、アンピシリンを含む７Ｌの２×ＹＴ培地に５０％グルコース１４０ｍＬとともに加え、ＯＤ６００が４．０になるまでさらに培養した。その後、得られたＯＤ６００が４．０の培養液に、終濃度が０．５ｍＭになるようにイソプロピル－β－チオガラクトビラノシド（ＩＰＴＧ）を添加してタンパク質発現を誘導した。ＩＰＴＧ添加後２時間経過した時点で、培養液を遠心分離し、菌体を回収した（湿菌体）。ＩＰＴＧ添加前とＩＰＴＧ添加後の培養液中の菌体から調製したタンパク質溶液を用い、一般的なプロトコールに従い、ＩＰＴＧ添加に依存して目的とするタンパク質（ＡＤＦ３Ｋａｉ－ｓｍａｌｌ－Ｍは約１２．５ｋＤａ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ－Ｒｅｓｉｌｉｎ－Ｋａｉは約２８．５ｋＤａ、Ｃｏｌｌａｇｅｎ－ｔｙｐｅ４－Ｋａｉは約２４．５ｋＤａ）が発現していることをＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認した。ＡＤＦ３Ｋａｉ－ｓｍａｌｌ－Ｍのタンパク質のハイドロパシーインデックスは、－０．９４８であり、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ－Ｒｅｓｉｌｉｎ－Ｋａｉのハイドロパシーインデックスは－１．２２９であり、Ｃｏｌｌａｇｅｎ－ｔｙｐｅ４－Ｋａｉのハイドロパシーインデックスは－０．７９２であった。ＡＤＦ３Ｋａｉ－ｓｍａｌｌ－Ｍのタンパク質を発現している大腸菌と、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ－Ｒｅｓｉｌｉｎ－Ｋａｉのタンパク質を発現している大腸菌、Ｃｏｌｌａｇｅｎ－ｔｙｐｅ４－Ｋａｉのタンパク質を発現している大腸菌を冷凍庫（－２０℃）で保存した。
　（実施例１）
　（タンパク質の精製）
（１）ＡＤＦ３Ｋａｉ－ｓｍａｌｌ－Ｍのタンパク質を発現している大腸菌の湿菌体約１５ｇに、１ＭのＬｉＣｌを含むＤＭＳＯを４５ｍｌ添加し、６０℃で３０分間溶解させた。その後、遠心分離機（トミー精工社製の「ＭＸ－３０５」）にて、２０℃、１１０００×ｇ、１０分間遠心分離し、上清（溶解液）を回収した。
（２）回収した溶解液を透析することにより、ＤＭＳＯと水の溶媒置換を行った。透析液（水）は６時間置きに交換し、トータル４８時間透析を行った。透析後の溶解液を遠心分離機（トミー精工社製の「ＭＸ－３０５」）にて、２０℃、１１０００×ｇ、１０分間遠心分離し、上清（溶媒置換後の溶解液）を回収した。
（３）溶媒置換後の溶解液４０ｍｌに５０体積％のＮｉレジン（Ｈｉｓに結合する）のスラリーを２ｍｌ加え、室温で１時間振とうした。次いで、Ｎｉレジンを回収し、溶出緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ　ＮａＣｌ）１０ｍｌにて５回洗浄した後、３００ｍＭのイミダゾールを用いて目的タンパク質（ＡＤＦ３Ｋａｉ－ｓｍａｌｌ－Ｍ）を溶出させ、溶出液を回収した。
　（比較例１）
　ＡＤＦ３Ｋａｉ－ｓｍａｌｌ－Ｍのタンパク質を発現している大腸菌の湿菌体約０．２ｇに純水５００μｌを入れ、超音波破砕し、超音波破砕液を得た。
　実施例１で得られた溶解液、溶媒置換後の溶解液及びカラム溶出液、並びに比較例１で得られた超音波破砕液を用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。具体的には、各々のサンプル３０μＬに、２ｘＳＤＳ緩衝液（４ｗ／ｖ％　ＳＤＳ、２０ｗ／ｖ％　グリセロール、１０ｗ／ｖ％　２－メルカプトエタノール、０．００４ｗ／ｖ％　ブロモフェノールブルー、０．１２５Ｍ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ６．８）３０μＬを加え、９５℃で１０分間熱処理し、室温で冷却した熱変性したタンパク質溶液を用いて、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によりバンドを確認した。電気泳動後、ゲルをＯｒｉｏｌｅ蛍光ゲルステインで染色し、その結果を図１に示した。また、解析ソフトＩｍａｇｅＬａｂ（Ｂｉｏ－ＲＡＤ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて染色後のタンパク質の電気泳動写真を画像解析することで、目的タンパク質（組換えタンパク質）の純度を求めた。その結果を下記表３に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　図１には、実施例１で得られた溶解液、溶媒置換後の溶解液及びカラム溶出液、並びに比較例１で得られた超音波破砕液を用いたＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示した。図１において、レーンＭは、分子量マーカーを示し、レーン１は、比較例１で得られた超音波破砕液に含まれるタンパク質を示し、レーン２、３、４は、それぞれ、実施例１で得られた溶解液、溶媒置換後の溶解液、カラム溶出液に含まれるタンパク質を示している。図１において、矢印で示しているのがＡＤＦ３Ｋａｉ－ｓｍａｌｌ－Ｍ（分子量約１２．５ｋＤａ）に対応するタンパク質のバンドである。図１及び表３の結果から分かるように、１ＭのＬｉＣｌを含むＤＭＳＯで大腸菌を溶解した溶解液におけるＡＤＦ３Ｋａｉ－ｓｍａｌｌ－Ｍの純度は、大腸菌を超音波破砕して得られた超音波破砕液におけるＡＤＦ３Ｋａｉ－ｓｍａｌｌ－Ｍの純度より高く、非プロトン性極性溶媒で大腸菌を溶解し、不溶物を分離することにより、目的タンパク質（ＡＤＦ３Ｋａｉ－ｓｍａｌｌ－Ｍ）が粗精製されることを確認した。また、溶解液を水で溶媒置換することにより、目的タンパク質（ＡＤＦ３Ｋａｉ－ｓｍａｌｌ－Ｍ）の純度が高くなっていた。また、溶媒置換後の溶解液をカラムで処理することにより、目的タンパク質（ＡＤＦ３Ｋａｉ－ｓｍａｌｌ－Ｍ）の純度がさらに高くなっていた。
　（実施例２）
　ＡＤＦ３Ｋａｉ－ｓｍａｌｌ－Ｍのタンパク質を発現している大腸菌の湿菌体約１５ｇに、１ＭのＬｉＣｌを含むＤＭＳＯを４５ｍｌ添加し、６０℃で３０分間溶解させた。その後、遠心分離機（トミー精工社製の「ＭＸ－３０５」）にて、２０℃、１１０００×ｇ、１０分間遠心分離し、上清（溶解液）を回収した。
　（実施例３）
　１ＭのＬｉＣｌを含むＤＭＳＯの代わりに、１ＭのＬｉＣｌを含むＤＭＦを用いた以外は、実施例２と同様にして、上清（溶解液）を回収した。
　（実施例４）
　１ＭのＬｉＣｌを含むＤＭＳＯの代わりに、１ＭのＬｉＣｌを含むＤＭＡを用いた以外は、実施例２と同様にして、上清（溶解液）を回収した。
　（実施例５）
　１ＭのＬｉＣｌを含むＤＭＳＯの代わりに、１ＭのＬｉＣｌを含むＮＭＰを用いた以外は、実施例２と同様にして、上清（溶解液）を回収した。
　（実施例６）
　１ＭのＬｉＣｌを含むＤＭＳＯの代わりに、１ＭのＬｉＣｌを含むＤＭＩを用いた以外は、実施例２と同様にして、上清（溶解液）を回収した。
　（比較例２）
　１ＭのＬｉＣｌを含むＤＭＳＯの代わりに、１ＭのＬｉＣｌを含むイソプロパノール（イソプロパノールの純度：９０％）を用いた以外は、実施例２と同様にして、上清（溶解液）を回収した。
　実施例２～６、比較例２で得られた上清（溶解液）を用いて、上述したようにＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。電気泳動後、ゲルをＯｒｉｏｌｅ蛍光ゲルステインで染色し、その結果を図２及び図３に示した。また、解析ソフトＩｍａｇｅＬａｂ（Ｂｉｏ－ＲＡＤ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて染色後のタンパク質の電気泳動写真を画像解析することで、目的タンパク質（組換えタンパク質）の精製度を求めた。その結果を下記表４に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　図２において、レーンＭは分子量マーカーを示し、レーン１、２、３、４、５は、それぞれ、実施例２、３、４、５、６に対応する。図２において、矢印で示しているのがＡＤＦ３Ｋａｉ－ｓｍａｌｌ－Ｍ（分子量約１２．５ｋＤａ）に対応するタンパク質のバンドである。図２から、ハイドロパシーインデックスが０以下の親水性組換えタンパク質を発現する大腸菌を非プロトン性極性溶媒で溶解し、不溶物を分離することで、ハイドロパシーインデックスが０以下の親水性組換えタンパク質を粗精製できることが分かった。図３において、レーンＭは分子量マーカーを示し、レーン１は、比較例２に対応する。図３において、矢印で示しているのがＡＤＦ３Ｋａｉ－ｓｍａｌｌ－Ｍ（分子量約１２．５ｋＤａ）に対応するタンパク質のバンドである。
　上記表４の結果から分かるように、ＤＭＳＯ等の非プロトン性極性溶媒を用いた実施例で粗精製した目的の組換えクモ糸タンパク質の純度は、プロトン性極性溶媒であるイソプロパノールを用いた比較例で粗精製した目的の組換えクモ糸タンパク質の純度の２．２～３．１倍になっており、ＤＭＳＯ等の非プロトン性極性溶媒を用いることで、ハイドロパシーインデックスが０以下の親水性組換えタンパク質を粗精製できた。
　（実施例７）
　Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ－Ｒｅｓｉｌｉｎ－Ｋａｉのタンパク質を発現している大腸菌の湿菌体約０．３ｇに、１ＭのＬｉＣｌを含むＤＭＳＯを１ｍｌ添加し、６０℃で３０分間静置して溶解させた。その後、遠心分離機（トミー精工社製の「ＭＸ－３０５」）にて、２０℃、１１０００×ｇ、５分間遠心分離し、上清（溶解液）を回収した。
　（比較例３）
　Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ－Ｒｅｓｉｌｉｎ－Ｋａｉのタンパク質を発現している大腸菌の湿菌体約０．３ｇに、トリス緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ、１００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．０）を１ｍｌ添加し、超音波破砕し、超音波破砕液を得た。
　実施例７で得られた上清（溶解液）及び比較例３で得られた超音波破砕液を用いて、上述したようにＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。電気泳動後、ゲルをＯｒｉｏｌｅ蛍光ゲルステインで染色した。染色後のタンパク質の電気泳動写真を、解析ソフトＩｍａｇｅＬａｂ（Ｂｉｏ－ＲＡＤ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて画像解析して、目的タンパク質（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ－Ｒｅｓｉｌｉｎ－Ｋａｉ）の精製度を求めた。実施例７において目的タンパク質（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ－Ｒｅｓｉｌｉｎ－Ｋａｉ）の精製度は１４．５％であるのに対し、比較例３では目的タンパク質（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ－Ｒｅｓｉｌｉｎ－Ｋａｉ）の精製度が８．０％であった。
　（実施例８）
　Ｃｏｌｌａｇｅｎ－ｔｙｐｅ４－Ｋａｉのタンパク質を発現している大腸菌の乾燥菌体約０．１ｇに、１ＭのＬｉＣｌを含むＤＭＳＯを１ｍｌ添加し、６０℃で３０分間静置して溶解させた。その後、遠心分離機（トミー精工社製の「ＭＸ－３０５」）にて、２０℃、１１０００×ｇ、５分間遠心分離し、上清（溶解液）を回収した。
　実施例８で得られた上清（溶解液）を用いて、上述したようにＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。電気泳動後、ゲルをクーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）で染色し、その結果を図４に示した。
　図４において、矢印で示しているのがＣｏｌｌａｇｅｎ－ｔｙｐｅ４－Ｋａｉ（分子量約２４．５ｋＤａ）に対応するタンパク質のバンドである。また、解析ソフトＩｍａｇｅＬａｂ（Ｂｉｏ－ＲＡＤ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて染色後のタンパク質の電気泳動写真を画像解析したところ、目的タンパク質（Ｃｏｌｌａｇｅｎ－ｔｙｐｅ４－Ｋａｉ）の精製度は１１．６％であった。
　本発明は、ハイドロパシーインデックスが０以下の親水性組換えタンパク質を発現している宿主から、親水性組換えタンパク質を粗精製するのに用いることができる。
　配列番号１、２、３、６、８、１０、１２、１３、１５　アミノ酸配列
　配列番号４、５、７、９、１１、１４　塩基配列

Claims (9)

  1. 　親水性組換えタンパク質を発現している宿主から親水性組換えタンパク質を粗精製する方法であって、
    　前記親水性組換えタンパク質を発現している宿主に溶解用溶媒を添加し、宿主細胞を溶解し、不溶物を分離して溶解液を得る溶解液取得工程を含み、
    　前記親水性組換えタンパク質はハイドロパシーインデックスが０以下であり、前記溶解用溶媒は非プロトン性極性溶媒であることを特徴とする親水性組換えタンパク質の粗精製方法。
  2. 　前記溶解用溶媒は、双極子モーメントが３．０Ｄ以上である請求項１に記載の親水性組換えタンパク質の粗精製方法。
  3. 　前記溶解用溶媒は、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、１,３－ジメチル－２－イミダゾリドン、及びＮ－メチル－２－ピロリドンからなる群から選ばれる一種以上の非プロトン性極性溶媒である請求項１又は２に記載の親水性組換えタンパク質の粗精製方法。
  4. 　前記溶解用溶媒は、前記非プロトン性極性溶媒に無機塩を添加したものである請求項１～３のいずれか１項に記載の親水性組換えタンパク質の粗精製方法。
  5. 　前記不溶物の分離は、濾過による分離及び／又は遠心分離により行う請求項１～４のいずれか１項に記載の親水性組換えタンパク質の粗精製方法。
  6. 　前記溶解用溶媒は、前記宿主の質量に対して、体積（ｍＬ）／質量（ｇ）比として、０．５倍以上添加する請求項１～５のいずれか１項に記載の親水性組換えタンパク質の粗精製方法。
  7. 　前記溶解液を、水系溶媒で溶媒置換する請求項１～６のいずれか１項に記載の親水性組換えタンパク質の粗精製方法。
  8. 　前記溶媒置換された溶解液を、さらにカラム、濾過、遠心分離からなる群から選ばれる一種以上の手段で処理する請求項７に記載の親水性組換えタンパク質の粗精製方法。
  9. 　前記親水性組換えタンパク質は、組換えクモ糸タンパク質、組換えレシリン、及び組換えコラーゲンからなる群から選ばれる１つのタンパク質である請求項１～８のいずれか１項に記載の親水性組換えタンパク質の粗精製方法。
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