JPH0698771A

JPH0698771A - クモ絹糸タンパク質をコードする単離ｄｎａ、複製可能なベクターおよび該単離ｄｎａを含有する形質転換細胞、ならびにその生成物

Info

Publication number: JPH0698771A
Application number: JP3115647A
Authority: JP
Inventors: Randolph V Lewis; ランドルフ・ブイ・ルイス; Ming Xu; ミン・クー; Michael B Hinman; マイケル・ビー・ヒンマン
Original assignee: University of Wyoming
Current assignee: University of Wyoming
Priority date: 1990-04-20
Filing date: 1991-04-18
Publication date: 1994-04-12
Anticipated expiration: 2014-02-03
Also published as: ATE189699T1; EP0452925A2; EP0452925B1; DE69131969D1; JP2852822B2; EP0452925A3; DE69131969T2

Abstract

(57)【要約】（修正有）【目的】組換えＤＮＡ技術によりクモ絹糸タンパク質を
製造する方法の提供。【構成】クモ絹糸タンパク質またはその断片あるいは変
異体をコードする単離ｃＤＮＡ、クモ絹糸タンパク質を
コードし、かつクモ絹糸タンパク質を発現することので
きるｃＤＮＡを含有する複製可能なベクター、クモ絹糸
タンパク質またはその断片あるいは変異体をコードし、
かつクモ絹糸タンパク質を発現することのできるｃＤＮ
Ａを含有する形質転換された細胞または微生物、および
本発明の組換えタンパク質を利用することによって製造
することのできる繊維などの製品に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は組換えＤＮＡ技術による
クモ絹糸タンパク質の製造に関する。

【０００２】

【従来の技術】円網 (orb web)をつくる種類のクモの大
吐糸管 (major ampullate)絹糸（しおり糸（dragline)
）は、高い引張強度とかなりの弾性を合わせ持つとい
う独特の物性を示す［Denny, M. W., J. Exp. Biol., 6
5, 483-506 (1976); Lucas, F. Discovery, 25, 20-26
(1964)］。過去の研究から、クモ絹糸は無定型領域と交
互に積層したβプリーツシート (stack β-pleated she
et) 偽似結晶領域を主構成要素として含有する単一の大
型タンパク質から成ることが示唆されている［Warwicke
r, J. O., J. Mol. Biol., 2, 350-362 (1960); Lucas
e, F. et al., J. Text Inst., 46, T440-T452 (1985);
Hepburn, H. R., et al., Insect Biochem.,9, 69-71
(1979)］。クモ絹糸の弾性の分子機構については今のと
ころ不明であるが、ゴムで見られるようなエントロピー
推進プロセスの関与が示唆されている［Gosline, J.
M., et al., Nature, 309, 551-552 (1984) ］。無定型
領域が繊維の弾性にかなり寄与しているとも考えられて
いる［Hepburn, H. R. et al., Insect Biochem., 9, 6
9-71 (1979) ］。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は組換え
ＤＮＡ技術によってクモ絹糸タンパク質を製造すること
である。

【０００４】本発明のもう一つの目的は、精製された状
態のクモ絹糸タンパク質を初めて提供することである。
すなわち、本発明者らは、Nephila clavipes 由来のク
モ絹糸タンパク質は少なくとも２種類のクモ絹糸タンパ
ク質の混合物として天然に存在することを見いだした。
本発明者らは、これら２種類のタンパク質の遺伝子の一
部をクローン化し、それぞれ絹糸タンパク質１および絹
糸タンパク質２と名付けた。これら２つの遺伝子は別々
にクローン化を行ったので、上記２種類のタンパク質を
組換え技術によって別々に調製することができる。得ら
れた絹糸タンパク質は精製することができる。すなわ
ち、発現系において挟雑物質から分離することによっ
て、精製された均一な絹糸タンパク質１または精製され
た均一な絹糸タンパク質２を得ることができる。したが
って、クモ絹糸タンパク質１はクモ絹糸タンパク質２を
含有せず、クモ絹糸タンパク質２はクモ絹糸タンパク質
１を含有しない。これらのタンパク質は純粋な形で使用
してもよいし、互いに混合して天然クモ絹糸の性質に近
いものを得ることもできる。絹糸タンパク質１と絹糸タ
ンパク質２は１００対１ないし１対１００、好ましくは
１０対１ないし１対２、より好ましくは５対１ないし１
対１の比率で混合することができる。

【０００５】本発明の単離ｃＤＮＡは、好ましくは図１
３〜図１６または図１７〜図２０に示した配列を含有す
るクモ絹糸タンパク質またはその断片あるいはその変異
体をコードする。断片あるいは変異体のアミノ酸組成
は、天然クモ絹糸タンパク質のアミノ酸組成と共通する
ものであってよい。ＦＴＩＲによって構造を調べると、
βシート構造が主として見られる。該断片あるいは変異
体は天然タンパク質同様、ＬｉＳＣＮ、過塩素酸リチウ
ム、ギ酸などの高度カオトロピック溶媒にのみ可溶であ
る。

【０００６】本発明のクモ絹糸タンパク質は、α領域と
β領域の繰り返しと任意の可変領域を有することを特徴
とする。クモ絹糸タンパク質１とクモ絹糸タンパク質２
は、ｃＤＮＡ全体に及ぶクローン化や配列決定は行われ
ていないが、両者はいずれも３０００００ダルトン未
満、おそらくは１０００００〜３０００００ダルトン、
好ましくは１２００００〜３０００００ダルトンの分子
量を有するものと推定される。また、クモ絹糸タンパク
質１とクモ絹糸タンパク質２はそれぞれ９００〜２７０
０個のアミノ酸を有し、２５〜１００反復、好ましくは
３０〜９０反復を伴う。本発明のクモ絹糸タンパク質は
例えば次式によって示すことができる。［（α）（β）］ｐ上記式において、αは伸張時にαらせんを形成し得る無
定型領域を示し、βはβシートを形成し得る（折りたた
み構造の場合）領域を示す。ｐは、断片の場合は１〜１
００、好ましくは１５〜５０、より好ましくは１８〜２
２の整数を示し、全長クモ絹糸タンパク質の場合は２５
〜１００、好ましくは３０〜９０の整数を示す。この配
列は、α領域とβ領域の両方または一方の間に介在する
任意の可変領域を含んでいてもよい。

【０００７】このタンパク質または断片が有用であるた
めには、（１）発現した細胞の内部で不溶であるか、
（２）通常の繊維作成条件下で不溶性繊維の形にするこ
とができるものでなければならない。該タンパク質は条
件（１）および（２）において不溶であることが好まし
い。すなわち、該タンパク質または該断片は水、アルコ
ール（メタノール、エタノールなど）、アセトンおよび
／または有機酸などの溶媒に不溶でなければならない。
該タンパク質または該断片は高い引張強度、例えば０．
５ｘ〜２ｘの引張強度（ここで、ｘは対応する天然絹糸
から形成された繊維または全タンパク質の引張強度を示
す）を有する繊維の形にすることができるものでなけれ
ばならない。また、該タンパク質または該断片は少なく
とも１５％、より好ましくは約２５％の弾性を有する繊
維の形にできるものでなければならない。

【０００８】クモ絹糸タンパク質の変異体は、天然クモ
絹糸や天然タンパク質より大きい引張強度および／また
は弾性を有する繊維の形にしてもよい。弾性は１００％
まで上げることができる。変異体は上記断片の性質を有
していてもよい。

【０００９】断片または変異体は天然クモ絹糸と実質的
に同一の特徴を有していてもよい。天然タンパク質は繊
維形態では特に不溶であり、また大部分の酵素による分
解に対して抵抗性がある。

【００１０】本発明においては、単離ｃＤＮＡは Nephi
la clavipes 大吐糸管絹糸（しおり糸）タンパク質、 N
ephila clavipes 小吐糸管（minor ampullate ）絹糸タ
ンパク質、 Nephila clavipes 繭絹糸タンパク質、 Are
neus gemmoides大吐糸管絹糸タンパク質、 Areneus gem
moides繭絹糸タンパク質などのタンパク質をコードする
ものであってよい。

【００１１】本発明はまた、クモ絹糸タンパク質をコー
ドするとともにクモ絹糸タンパク質を発現し得るｃＤＮ
Ａを含有する複製可能ベクターに関する。

【００１２】本発明はまた、クモ絹糸タンパク質または
その断片あるいは変異体をコードするとともにクモ絹糸
タンパク質を発現し得るｃＤＮＡまたはベクターを含有
する形質転換細胞または微生物に関する。

【００１３】本発明はまた、新規なクモ絹糸タンパク質
に関し、およびクモ絹糸タンパク質の発現を可能ならし
める条件下で上記の形質転換細胞または微生物を培養
し、そのようにして発現されたクモ絹糸タンパク質を任
意に回収し、回収されたクモ絹糸タンパク質を任意に精
製することを特徴とする該タンパク質の製造法に関す
る。このようにして製造されたクモ絹糸タンパク質は、
天然クモ絹糸タンパク質中に存在する他のタンパク質な
どの物質を含まないことがあるという点で天然クモ絹糸
タンパク質と異なっていてもよい。組換え技術によって
製造したクモ絹糸タンパク質はその製造の場となった微
生物、細胞および／または発酵系に由来する汚染物質を
少量含んでいてもよい。したがって、本発明は組換えＤ
ＮＡ技術によって製造されたこれらの新規なまたは単離
タンパク質にも関する。

【００１４】本発明はまた、本発明の組換えタンパク質
を単独でまたは他の物質と組み合わせて含有する繊維な
どの製品にも関する。

【００１５】

【課題を解決するための手段】２つの異なるクモ絹糸タ
ンパク質、即ち、クモ絹糸タンパク質１とクモ絹糸タン
パク質２の遺伝子のクローニングがなされた。絹糸タンパク質１本発明のｃＤＮＡは下記一般式によって示される配列を
有する繰返し単位から成るクモ絹糸タンパク質をコード
する。［（α）（β）］ｐ（Ｉ）式（Ｉ）において、αは伸張時にαらせんを形成し得る
無定型領域を示し、βはβ結晶領域を示す。ｐは断片の
場合は１〜１００、好ましくは１５〜５０、より好まし
くは１８〜２２の整数を示し、全長タンパク質の場合は
２５〜１００、好ましくは３０〜９０の整数を示す。

【００１６】α領域は４〜１０個のＡ、好ましくは５〜
８個のＡ、より好ましくは６個または７個のＡを有する
アラニン含有率の高い領域であるのがよい。α領域は少
なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好
ましくは約７０〜８０％のアラニンを含有し、アミノ酸
の合計数として計算した全タンパク質量の約３５〜５０
％、好ましくは３０〜４０％からなる。α領域はグリシ
ンおよび／またはセリンなど他のアミノ酸を含有してい
てもよい。

【００１７】β領域とはβ結晶構造を形成するかβプリ
ーツシートを形成する配列をいう。β領域は好ましくは
全タンパク質の４０〜７０％、より好ましくは５０〜６
０％からなる。上記百分率（％）はアミノ酸の％をい
う。前記式における各繰返し単位「ｐ」については、α
領域とβ領域は同一であっても異なっていてもよい。

【００１８】本発明のｃＤＮＡは下記一般式によって示
される繰返し単位から成るクモ絹糸タンパク質をコード
する。［（ｖ）（α）（β）］ｐ（II）式（II）において、α、β、ｐは上記と同様の意義を有
し、ｖは可変領域である。また、可変領域（ｖ）が存在
する場合、該可変領域は通常ＡＧＲの配列で始まる０〜
約１２個のアミノ酸を含有する領域である。クモ絹糸タ
ンパク質中の繰返し単位の大部分はこれらの単位を本段
落で定義したように含有していてもよい。この式で示さ
れる配列の代表的なものを表１に示す。

【表１】

【００１９】本発明の単離ｃＤＮＡは下記一般式によっ
て示される配列を有する繰返し単位から成るタンパク質
をコードするものであってよい。 −−［（Ａ）ｍ（Ｘ）ｎ］ｐ−− （III) 式（III)において、ｍは４〜１０、好ましくは５〜８、
より好ましくは６または７を示し、ｎは１０〜２０、好
ましくは１２〜１８、より好ましくは１４〜１６を示
す。ｐは上記と同様の意義を有し、Ｘはそれぞれ同一で
あっても異なっていてもよく、Ｇ、Ａ、Ｑ、ＹおよびＬ
から成る群から選ばれ、Ｘのうち少なくとも５０％はＧ
であり、好ましくはＸのうち少なくとも６０％はＧであ
る。前記式における各繰返し単位「ｐ」については、ｍ
とｎはそれぞれ同一であっても異なっていてもよい。

【００２０】クモ絹糸タンパク質の繰返し単位のうち少
なくとも５０％は、それぞれ式（Ｉ）、式（II）または
式（III)で示すことができ、好ましくは繰返し単位のう
ち少なくとも７０％はそれぞれ式（Ｉ）、式（II）また
は式（III)で示すことができる。

【００２１】本発明の単離ｃＤＮＡは下記配列をコード
する繰返し単位を含有する。 −−［（Ａ）ｍＧＧＡＧＱＧＧＹＧＧＬＧＧＱＧ］−− （IV）式（IV）において、ｍは６または７である。クモ絹糸ま
たはその断片あるいはその変異体は、断片の場合には通
常少なくとも約１６０００ダルトン、好ましくは１６０
００〜１０００００ダルトン、より好ましくは５０００
０〜８００００ダルトンの分子量を有し、全長タンパク
質の場合には１０００００〜３０００００ダルトン、好
ましくは１２００００〜３０００００ダルトンの分子量
を有する。図１３〜図１６と配列番号：２に示したクモ
絹糸タンパク質の分子量は６４４９２ダルトンである。

【００２２】前記式（Ｉ）〜（IV）において、タンパク
質が目的の物性を保持する限り、該タンパク質は更にア
ミノ酸またはアミノ酸配列をその中間部または末端部に
挿入されたかたちで有していてもよい。同様に、タンパ
ク質が目的の物性を保持する限り、該タンパク質からア
ミノ酸またはアミノ酸配列の一部が欠損していてもよ
い。また、タンパク質が目的の物性を保持する限り、該
配列中にアミノ酸置換があってもよい。

【００２３】Nephila clavipesしおり糸絹糸の主構成タ
ンパク質がクローン化されている。その配列はＧｌｙ−
Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｙ−Ｇｌｙ６量体の繰返しから成
る。ここで、ＸとＹはＧｌｎとＡｌａである場合が多い
が、他のアミノ酸であってもよい。この繰返しはＡｌａ
とＳｅｒおよび少量のその他のアミノ酸で構成される様
々な長さのアミノ酸挿入断片によって互いに分離されて
いる。代表的な配列は次の通りである。−［Ｇ−Ｇ−Ｑ
−Ｇ−Ａ−Ｇ］−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−［Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｇ−
Ｑ−Ｇ］−Ｇ−Ｙ−［Ｇ−Ｇ−Ｖ−Ｇ−Ｓ−Ｇ］−Ａ−
Ｓ−Ａ−Ａ−Ｓ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｓ− 本発明のタンパク質は主に、ＡＧＲＧＧＸＧＧＺＧＡＧ
（Ａ）_6-7ＧＧＡＧＱＧＧＹＧＧＬＧＧＱＧの配列の繰
返しから成る。ここで、ＸとＹはＬ、ＹまたはＱである
が、ＸはＺと同一ではない。

【００２４】絹糸タンパク質２本発明のｃＤＮＡは下記一般式によって示される配列を
有する繰返し単位から成るクモ絹糸タンパク質をコード
する。［（β）（α）］ｐ（Ｉ）式（Ｉ）において、αは伸張時にαらせんを形成し得る
無定型領域を示し、βはβシート様構造を形成する結合
βターン領域を示す。ｐは、断片の場合は１〜１００、
好ましくは１５〜５０、より好ましくは１８〜２２の整
数を示し、全長タンパク質の場合は２５〜１００、好ま
しくは３０〜９０の整数を示す。

【００２５】α領域は４〜１０個、好ましくは６〜１０
個のＡを有するアラニンの豊富な領域であることが好ま
しい。また、α領域は少なくとも５０％、好ましくは少
なくとも６０％、より好ましくは約７０〜１００％のア
ラニンを含有し、アミノ酸の合計数でみると全タンパク
質の３５〜５０％程度、好ましくは３０〜４０％程度を
構成する。α領域はセリンとグリシンの両方または一方
などアラニン以外のアミノ酸を含んでいてもよい。この
置換は機能上あまり影響を及ぼさない。

【００２６】β領域は結合βターンを形成する配列であ
る。βターン領域はＧＰＧＱＱＧＰＧＹＹＧＰＧＱＱＧ
ＰＳＧＰＧＳの繰り返しから成り、場合により置換およ
びＧＧＹの挿入が見られる。βターン領域は、絹糸タン
パク質１のβ結晶領域よりはるかに多量のプロリンを含
んでいる。このプロリンがタンパク質のターンや「よじ
れ」を引き起こしていると考えられる。各βターンは１
個、通常は０〜２個のプロリンを含んでいるのが普通で
ある。各β領域は１以上、通常４か５個のβターンを含
んでいるのが普通である。β領域は好ましくは全タンパ
ク質の４０〜７０％、より好ましくは全タンパク質の５
０〜６０％を構成する。上記百分率はアミノ酸の％をい
う。上記式における各繰り返し単位「ｐ］については、
α領域とβ領域は同一であっても異なっていてもよい。

【００２７】本発明のｃＤＮＡは下記一般式によって示
される配列を有する繰返し単位から成るクモ絹糸タンパ
ク質をコードする。［（β）（α）（ｖ）］ｐ（II）式（II）において、α、β、ｐは上記と同様の意義を有
し、ｖは可変領域である。また、可変領域（ｖ）が存在
する場合、該可変領域は０〜約２０個、通常は０〜約１
８個のアミノ酸を有する領域であり、通常はＧＰＧＧＹ
配列とＧＰＧＱＱ配列の両方または一方を有する。クモ
絹糸タンパク質中の繰返し単位の大部分はこれらの単位
を本段落で定義したように含有していてもよい。この式
で示される配列の代表的なものを以下の表２に示す。

【表２】

【００２８】本発明の単離ｃＤＮＡは下記一般式によっ
て示される配列を有する繰返し単位から成るタンパク質
をコードするものであってよい。 −−［（Ａ）ｍ（Ｘ）ｎ］ｐ−− （III) 式（III)において、ｍは４〜１０、好ましくは６〜１０
を示し、ｎは１０〜２０、好ましくは１２〜１８、より
好ましくは１４〜１６を示す。ｐは上記と同様の意義を
有し、Ｘはそれぞれ同一であっても異なっていてもよ
く、Ｐ、Ｇ、Ａ、Ｑ、ＹおよびＬから成る群から選ば
れ、Ｘのうち少なくとも５０％はＧであり、好ましくは
Ｘのうち少なくとも６０％はＧである。前記式における
各繰返し単位「ｐ」については、ｍとｎはそれぞれ同一
であっても異なっていてもよい。

【００２９】クモ絹糸タンパク質の繰返し単位のうち少
なくとも５０％は、それぞれ式（Ｉ）、式（II）または
式（III)で示すことができ、好ましくは繰返し単位のう
ち少なくとも７０％はそれぞれ式（Ｉ）、式（II）また
は式（III)で示すことができる。

【００３０】本発明の単離ｃＤＮＡは下記配列をコード
する繰返し単位を含有していてもよい。 −−［β（Ａ）ｍ］−− （IV）式（IV）において、βは前記と同意義を有し、ｍは６〜
１０である。クモ絹糸またはその断片あるいは変異体は
通常、断片の場合は少なくとも約１６０００ダルトン、
好ましくは１６０００〜１０００００ダルトン、より好
ましくは５００００〜８００００ダルトンの分子量を有
し、全長タンパク質の場合は１０００００〜３００００
０ダルトン、好ましくは１２００００〜３０００００ダ
ルトンの分子量を有する。図１７〜図２０および配列番
号：４に示したクモ絹糸タンパク質２の分子量は５１１
５７ダルトンである。前記式（Ｉ）〜（IV）におい
て、タンパク質が目的の物性を保持する限り、該タンパ
ク質は更にアミノ酸またはアミノ酸配列をその中間部ま
たは末端部に挿入されたかたちで有していてもよい。同
様に、タンパク質が目的の物性を保持する限り、該タン
パク質からアミノ酸またはアミノ酸配列の一部が欠損し
ていてもよい。また、タンパク質が目的の物性を保持す
る限り、該配列中にアミノ酸置換があってもよい。

【００３１】本明細書中で使用するアミノ酸の略号は特
に記載がない限り以下に述べるように従来の定義に従
う。アミノ酸三文字表記一文字表記アラニン Ala Ａアルギニン Arg Ｒアスパラギン Asn Ｎアスパラギン酸 Asp Ｄアスパラギン又はアスパラギン酸 Asx Ｂシステイン Cys Ｃグルタミン Gln Ｑグルタミン酸 Glu Ｅグルタミン又はグルタミン酸 Glx Ｚグリシン Gly Ｇヒスチジン His Ｈロイシン Leu Ｌリシン Lys Ｋメチオニン Met Ｍフェニルアラニン Phe Ｆプロリン Pro Ｐセリン Ser Ｓトレオニン Thr Ｔトリプトファン Trp Ｗチロシン Tyr Ｙバリン Val Ｖ

【００３２】組換えクモ絹糸タンパク質は細胞を溶解さ
せて細胞内に存在するクモ絹糸タンパク質を放出させる
ことによって培養物から回収できる。まず、遠心分離に
よって細胞残渣を分離できる。次いで、残った残渣およ
び上清を細胞残渣は溶解するがクモ絹糸タンパク質は溶
解しない溶媒で繰返し処理することによってクモ絹糸タ
ンパク質を沈澱させる。これらの操作を反復したり、ろ
過、透析および／またはクロマトグラフィーなどの操作
と組み合わせることによって精製品を得ることができ
る。

【００３３】遺伝コードの縮退に従えば、遺伝子の塩基
配列のうち少なくとも１個の塩基を該遺伝子から生成し
たポリペプチドのアミノ酸配列の変化を生起せしめない
で他の種類の塩基で置換することが可能である。したが
って、本発明のＤＮＡは遺伝コードの縮退に従って置換
によって変更されたどのような塩基配列を有していても
よい。例えば、上記置換によって得られた図１３〜図１
６に対応する修飾ＤＮＡによってコードされるアミノ酸
配列は、図１３〜図１６のアミノ酸配列と同一である。

【００３４】ＤＮＡをヌクレオチドの置換、欠失あるい
は挿入によって容易に変性させ、クモ絹糸タンパク質ま
たはその誘導体をコードする新規なＤＮＡ配列を得るこ
とができる。これらの修飾配列は、変異体クモ絹糸タン
パク質の製造やクモ絹糸タンパク質の直接発現に用いら
れる。

【００３５】ＤＮＡ領域が機能的に相互に関連している
場合はこれを人為的に結合させる。例えば、プレ配列ま
たは分泌リーダーに対応するＤＮＡがポリペプチドの分
泌に関与するプレタンパク質として発現される場合は、
これを該ポリペプチドに対応するＤＮＡに人為的に結合
させる。また、プロモーターが配列の転写を制御する場
合は、これを該コード配列に人為的に結合させる。ま
た、リボソーム結合部位が翻訳可能な位置にある場合
は、これをコード配列に人為的に結合させる。一般に、
人為的に結合させた状態とは、隣接している状態、およ
び分泌リーダーの場合は隣接している状態であってかつ
読み取り相にある状態をいう。

【００３６】宿主細胞として適当なものは、原核生物、
酵母、高等真核細胞である。原核生物としては、例えば
大腸菌やバチルスなどのグラム陰性菌あるいはグラム陽
性菌が挙げられる。高等真核細胞としては、以下に述べ
るような昆虫、クモ、あるいは哺乳類由来の樹立細胞系
が挙げられる。

【００３７】クモ絹糸タンパク質の発現には原核生物の
宿主ベクター系が好ましい。様々な微生物ベクターが好
適に利用できる。一般に、微生物ベクターは宿主によっ
て認識される複製開始点、宿主中で機能するプロモータ
ー、および例えば抗生物質抵抗性を与えたり栄養素要求
性をもたらすタンパク質をコードする遺伝子などの発現
型選択遺伝子を含有している。

【００３８】ベクターは宿主生物によって認識されるプ
ロモーターを含有するものでなければならない。このプ
ロモーターは一般に宿主に対して相同のものである。組
換えＤＮＡ構築に最もよく使われるプロモーターとして
は、βラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）−ラクトースプ
ロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター
系およびｔａｃプロモーターが挙げられる。これらが最
もよく使われるのであるが、他の公知の微生物プロモー
ターも用いることができる。これらのプロモーターのヌ
クレオチド配列の詳細については発表されており、技能
者であればそれらをプラスミドベクター中でクモ絹糸タ
ンパク質をコードするＤＮＡやクモ絹糸タンパク質をコ
ードするＤＮＡに人為的に結合させることができる。今
のところ、好ましいベクターはｐＧＥＭ３Ｚである。他
に使用可能な発現ベクターはλＧＴ１１とｐＧＥＭ５Ｚ
ｆｔである。

【００３９】原核生物以外にも、酵母培養物などの真核
微生物もクモ絹糸タンパク質をコードしているベクター
で形質転換することができる。宿主として用いる下等な
真核微生物のなかには入手しやすい菌株が多くあるが、
Saccharomyces cerevisiaeあるいは通常のパン酵母菌
が最もよく使われる。一般に、酵母ベクターは２ミクロ
ンの酵母プラスミド由来の複製開始点または自己複製配
列（ＡＲＳ）、プロモーター、クモ絹糸タンパク質をコ
ードするＤＮＡ配列、ポリアデニル化配列並びに転写終
止配列、および選択遺伝子を含有している。

【００４０】酵母ベクター中の好適なプロモーター配列
としては、メタロチオネインプロモーター並びに３−ホ
スホグリセラートキナーゼなどの解糖酵素のプロモータ
ーが挙げられる。生育条件によって転写を制御できると
いう利点を有するプロモーターもあり、アルコール脱水
素酵素２、イソチトクロームＣ、酸性ホスファターゼ、
窒素代謝に関係する分解酵素、上記メタロチオネインお
よびグリセルアルデヒド−３−ホスフェート脱水素酵
素、並びにマルトースとガラクトースの利用に関与する
酵素に対応するプロモーター領域などが挙げられる。適
当な発現プラスミドの構築に当たっては、これらの遺伝
子と関係する終止配列をクモ絹糸タンパク質をコードす
る配列の発現ベクター３’に結合させ、ｍＲＮＡのポリ
アデニル化と終止を行う。

【００４１】微生物以外にも、多細胞生物由来細胞の培
養物を宿主として用いることもできる。原則として、脊
椎動物と無脊椎動物のいずれを問わずどのような高等真
核細胞培養物でも利用できる。例えば、バクロウイルス
のような昆虫のウイルスは、昆虫の細胞中で絹糸タンパ
ク質を発現させるのに用いることができる。しかしなが
ら、脊椎動物細胞に最大の関心が寄せられており、最近
では培養脊椎動物細胞（組織培養）の増殖が一般化して
いる。有用な宿主細胞系の例としては、ＶＥＲＯおよび
ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）
細胞系およびＷＩ３８，ＢＨＫ、ＣＯＳ−７、ＭＤＣＫ
細胞系などが挙げられる。この様な細胞の発現ベクター
としては、通常（必要であれば）、複製開始点、発現さ
れるべき遺伝子から上流に位置するプロモーター、並び
にリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位（イント
ロン含有ゲノムＤＮＡを用いる場合）、ポリアデニル化
部位および転写終止配列が挙げられる。

【００４２】脊椎動物細胞の形質転換で使用する発現ベ
クター中の転写および翻訳調節配列はウイルス起源のも
のを使用することが多い。例えば、よく使われるプロモ
ーターはポリオーマ、アデノウイルス２およびサルウイ
ルス４０（ＳＶ４０）であり、なかでもＳＶ４０が最も
好ましく用いられている。初期プロモーターおよび後期
プロモーターはいずれもＳＶ４０ウイルス由来の複製開
始点をも含有する断片としてウイルスから容易に得られ
るので、特に有用である。Ｈｉｎｄ III部位からウイル
ス由来の複製開始点に存在するＢｇｌＩ部位に向かって
伸びた約２５０ｂｐの配列が含まれていれば、ＳＶ４０
断片はこれより小さいものでも大きいものでも用いるこ
とができる。

【００４３】複製開始点は、ＳＶ４０やその他のウイル
ス（例えばポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ、ＢＰ
Ｖ）に由来するものなど外来の開始点を含むようにベク
ターを構築することによって得ることもできるし、宿主
細胞の染色体複製機構によって得ることもできる。ベク
ターが宿主細胞染色体中に組み込まれている場合、後者
で十分であることが多い。

【００４４】しおり糸絹糸中の主要タンパク質のタンパ
ク質配列とＤＮＡ配列について以下に説明する。該タン
パク質配列は３つのセグメントに分かれた繰返しパター
ンから成る。第１のセグメントは最大９個のアミノ酸を
含有する。この配列はＡＧＲＧＧＬＧＧＱであるが、該
セグメントは全くアミノ酸を含まないかまたは最初の１
セット３個のアミノ酸と次の１セット３個のアミノ酸の
いずれか一つとを組み合わせて含有することができる。
第２のセグメントはＧＡＧＡＡＡＡＡＡ（Ａ）の配列を
有する９個または１０個のアミノ酸で構成される。この
配列はすべての繰返し中に存在する。最後のセグメント
はＧＧＡＧＱＧＧＹＧＧＬＧＧＱＧの配列を有する１５
個のアミノ酸で構成される。このセグメントの変異は下
線を引いた位置で起こり、その部分はＳ、ＮまたはＡに
なることがある。この第３のセグメントはすべての繰返
し中に見られる。これらのセグメントのいずれにおいて
も、他のアミノ酸の置換が希に起こるが、特定のパター
ンは見られないし、そのような置換は配列を決定した繰
返しの５％以上には存在しない。

【００４５】このタンパク質のＤＮＡ配列は、コドンの
第３位にＡまたはＴが入ることが非常に多く、ランダム
の場合ではＧまたはＣがコドンの最後にくるのは５０％
という数字が予想されるのに対し、全コドンの１０％程
度しかない。これが該ＤＮＡにおける組換えや欠失現象
の発生を防止する安定性因子であると思われる。

【００４６】クモしおり糸絹糸はいくつかの変わった性
質を示す。具体的には、引張強度が鋼や炭素繊維より大
きいこと（２００ｋｓｉ）、弾性が一部のナイロンと同
程度に大きいこと（３５％）、剛性が絹と同程度に低い
こと（０．６ｍｓｉ）、水中で超収縮能力を示すこと
（長さが最大６０％減少する）などが挙げられる。これ
らの性質は他の材料では見られない。本発明の新規材料
は非常に軽量の材料中でこれらの特性を与えるものであ
る。本発明のクローン化タンパク質がこの絹糸の主成分
である。

【００４７】クモ絹糸、特にしおり糸絹糸は２００ｋｓ
ｉを超える引張強度を有し、しかも３５％近い弾性を有
する。この組み合わせによって、しおり糸絹糸を切断す
るためにはケルバーや鋼をはじめとするあらゆる公知繊
維を切断するのに要するエネルギー量と同等のエネルギ
ーが必要である。この組み合わせは生体材料や人工材料
においても特徴を発揮する。クモ絹糸を適当な溶媒に溶
解し、小さな穴を通過させることによって紡糸を行う
と、クモ絹糸には無数の用途が生まれる。例えば、大規
模用途の一つとして布がある。弾性のあるシルクはたと
え高価でも市場で独自の位置を占めるであろう。また、
ロープ、手術用縫合糸、ある種の電気部品用の可撓性止
め具、さらには移植用生理活性材料（例えば人工靭帯や
大動脈バンド）などの高強度用途にも応用できるであろ
う。すなわち、本発明は、ハイテク衣料、ロープ、縫合
糸、医療用カバーなど強度と弾性を様々に組み合わせた
ものが求められる製品に無数の用途がある。タンパク質
配列を変えることで絹糸繊維の性質を変えることもでき
る。

【００４８】該繊維は天然クモ絹糸繊維と同じ用途に用
いることができる。該繊維は種々のプラスチックおよび
／または樹脂と混合して繊維で強化したプラスチックお
よび／または樹脂製品としてもよい。クモ絹糸は１００
℃まで安定であるので、熱により射出されるプラスチッ
クの強化用に用いることができる。

【００４９】本発明は、天然クモ絹糸タンパク質をコー
ドする遺伝子のＤＮＡ配列を決定し、該ＤＮＡ配列の変
異体を作製し、該ＤＮＡ配列の変異体を細胞または微生
物中で発現させることによって天然クモ絹糸タンパク質
の性質と異なる性質を有する変異クモ絹糸タンパク質を
製造することを特徴とする、天然クモ絹糸タンパク質の
変異体の製造法にも関する。天然クモ絹糸タンパク質Ｄ
ＮＡの変異体は、該天然クモ絹糸タンパク質中の無定型
領域に対応する該遺伝子の該ＤＮＡの領域を決定し、該
無定型領域又は該変異体ＤＮＡによって発現されるタン
パク質の弾性特性を変える領域に対応する該ＤＮＡ配列
を変化させることによって、あるいは該天然クモ絹糸タ
ンパク質中のβ結晶領域に対応する該遺伝子の該ＤＮＡ
の領域を決定し、該β結晶領域または該タンパク質の強
度特性を変える領域に対応する該ＤＮＡ配列を変化させ
ることによって製造してもよい。

【００５０】Nephila しおり糸絹糸由来のペプチドのア
ミノ酸配列に基づき、ＤＮＡプローブを用いて絹糸腺ｃ
ＤＮＡライブラリーから数個のクローンを同定する。更
に詳しくは、Nephila しおり糸絹糸タンパク質につい
て、それぞれ２ｋｂ以上のサイズを有する２個のクロー
ンの配列が実施例３に述べた方法によって決定されてい
る。これらのクローンのうち最大のもの（２．５ｋｂ）
の配列が完全に決定されている。その配列はポリＡ部
位、３４０塩基から成る３’非翻訳領域、および残りの
タンパク質コード領域を含有している。タンパク質領域
は３４個のアミノ酸から成る基本繰返し単位を含有して
いる。繰返し単位自体は３個の領域を有する。第１の領
域はＡＧＲ（ＧＧＸ）₂の配列を有する０〜９個のアミ
ノ酸から成る。この領域は保存度が高くないのは明白で
ある。第２の領域はＧＡＧ（Ａ）xの配列を有し、すべ
ての繰返し中で保存度が高く、長さはアミノ酸８〜１０
個である。第３のセグメントは（ＧＧＸ）₅であり、長
さはアミノ酸１５個で、保存度が非常に高い。たいてい
の場合、ＸはＡ、Ｑ、ＹまたはＬである。他の絹糸タン
パク質のクローンも単離され配列が決定されている。ま
た、数種類のクモ絹糸タンパク質のアミノ酸配列が決定
されており、Nephila のしおり糸（ＧＹＧＰＧ、ＧＱＧ
ＡＧ、ＧＡＧＱＧ、ＧＹＧＧＬＧ）と繭（ＳＡＦＱ）お
よびAraneus のしおり糸（ＧＰＹＧＰＧＱＱＧＰ）と繭
（ＦＬＧＧ、ＳＶＧＬＶ−Ｌ／Ｉ −Ａ−Ｙ−Ａ−Ｌ）
などが挙げられる。しおり糸タンパク質配列に基づく１
８ｍｅｒのプローブを用いて、Nephila 絹糸腺ライブラ
リーから１８個以上の陽性クローンが同定されている。

【００５１】本発明によると、組換えタンパク質を細菌
中で作り、必要であれば精製し、紡糸して繊維にするこ
とができる。製造に最適なタンパク質サイズは該タンパ
ク質が重要な物性を保持することができるように決定さ
れる。

【００５２】クモ絹糸タンパク質繰返し単位の配列は様
々に変化させることができ、しかも本発明の範囲内にと
どまる。例えば、配列中のＧｌｎ、ＬｅｕおよびＴｙｒ
を互いに置換してもよい。さらに、ポリ−Ａｌａセグメ
ントを除去すると、弾性の低い絹糸が得られる。更に、
タンパク質配列を更に変化させて、ＧＧＸ中の各対のＧ
ｌｙ中の１個のＧｌｙをＳｅｒと置換してもよい。

【００５３】すなわち、本発明の絹糸タンパク質は用途
に応じて変化せることができる。例えば、弾性を低くし
たい場合は、タンパク質配列のポリ−Ａｌａ伸張を除去
しなければならない。一方、弾性を高くしたいのであれ
ば、ポリ−Ａｌａ伸張の長さを延長しなければならな
い。また、剛性の低い絹糸を得たいのであれば、グリシ
ンをセリンで置換しなければならない。

【００５４】本発明によると、目的の性質を有するタン
パク質を大量に得ることができる。このタンパク質は用
途に応じて繊維の形にすることができる。クローンを配
列決定することによって小吐糸管絹糸、繭絹糸および補
帯絹糸を製造することもできる。繊維混合複合材も独特
の性質があるので興味深い。このような混合複合材は、
そのままでは剛性を示す材料に可撓性を与えるものであ
り、また同時に強度を与える。

【００５５】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説
明する。実施例は当業者に本発明の理解を深めさせるも
のであるが、本発明はこれらの代表的な実施例に限定さ
れるものではない。実施例１クモ Nephila clavipes の大小吐糸管絹糸を文献記載の
方法［Work, R. W., et al., J. Arachnol, 10, 1-10
(1982) ］により採取した後、室温で完全に乾燥させ
る。長さ３〜５ｃｍの絹糸を用いて各ＦＴＩＲ実験を行
う。２ｃｍ^-1の解像度でアナレクトマイクロ−ＸＡＦ
ＴＩＲ顕微鏡を用い、アナレクトＦＸ６２６０ＦＴＩＲ
分光計でスペクトルを得る。１２８回の走査を行って常
法によりインターフェログラムを得、半値重量における
半値幅を１２ｃｍ^-1とし解像度増強係数（Ｋ）を２とし
てガウス成分を用いて、カウピネンらの方法［Kauppine
n, J.K., et al., Appl. Sectrosc. 35, 271-276 (198
6)］によってスペクトルのたたみこみの一部を引き出
す。絹糸の一端を固定し反対側の端を所定サイズの小型
懸垂重りに結び付けて軸引き伸ばし試験を行う。

【００５６】実際の試験に先立ち、繊維を偏光に対して
平行と直角の２通りの状態としてランダムに選んだ数カ
所の部分のＦＴＩＲスペクトルを取って絹糸繊維の均一
性を調べておく。スペクトルは互いにピーク位置が２ｃ
ｍ^-1未満異なっていた（結果は示していない）。したが
って、絹糸繊維はスペクトル的に均一であることがわか
る。

【００５７】タンパク質が軸ひずみに対して応答する際
にクモ Nephila clavipes の大吐糸管絹糸が構造的変化
を示すかどうかを調べるために、赤外線顕微鏡を用いて
個々の絹糸繊維のＦＴＩＲスペクトルを取った。ＩＲ放
射を繊維軸に対して直角に偏光させて得た絹糸繊維の赤
外線スペクトルの当初のものと一部のたたみこみを引き
だしたスペクトルを、繊維にかかった軸張力の関数とし
てそれぞれ図２と図３に示した。アミドＩのバンドに１
６９４、１６３０および１６２０ｃｍ^-1におけるピーク
に対応する強力な直角二色性が見られ、これはＩＲ分光
測定によって他の形の絹糸で検出されているβ構造の高
含有量と一致する［Suzuki, E., Spectrochim. Acta.,
23A, 2303-2308 (1987); Fraser, R. D., et al., Conf
ormationin Fibrous Protein, Academic Press, New Yo
rk and London (1973) ］。１６５７および１６７５ｃ
ｍ^-1における弱いバンドも明確であり、それぞれ無秩序
領域と逆平行βシートに帰属される［Fraser, R. D.
B., et al., Conformation in Fibrous Protein, Acade
mic Press, New York and London (1973); Byler, D.
M., Biopolymers, 25, 469-487 (1986)］。アミドIIの
バンドは１５２０と１５５０ｃｍ^-1の位置に見られ、そ
れぞれβシートと非常に少量のらせん領域を示している
［Fraser, R. D. B., Conformation in Fibrous Protei
n, Academic Press, New York and London (1973); Can
tor, C. R., et al., Biophysical Chemistry, Part I
I, 466-472, Freemnan, San Francisco (1980) ］。絹
糸繊維に張力をかけると、繊維軸に対して直角の放射は
アミドＩ領域に小さな変化をもたらすにすぎない。対照
的に、アミドII領域の１５５０ｃｍ^-1付近のピークは張
力をかけると強度が低下し、１５５７ｃｍ^-1に移動す
る。

【００５８】放射を繊維軸に対して平行にすると著しく
異なる結果が得られる（図１中のＡおよびＢ）。β構造
ピークはすべて明確に残り、その位置は不変であるが、
張力をかけると、１６５１ｃｍ^-1における吸光度が劇的
に増加する。平行二色性を示すこの領域におけるピーク
はαらせん構造の存在を強く示唆するものである［Fras
er, R. D. B., et al., Conformation in Fibrous Prot
ein, Academic Press,New York and London (1973); By
ler D. M., et al., Biopolymers, 25, 469-487 (1986)
］。同様の吸光度の増加は１５５９ｃｍ^-1においてア
ミドIIでも見られ、これもらせん構造の形成を示してい
る。１５１２ｃｍ^-1のバンドも形成され、張力をかける
と１５０８ｃｍ^-1と１５１７ｃｍ^-1で２成分に分かれ
る。タンパク質のこの領域における吸光度は非水素結合
ペプチド基［Cantor, C. R., et al., Biophysical Che
mistry, Part II, 466-472 (1980), Freemnan, San Fra
ncisco］またはチロシン残基［Fraser, R. D. B., et a
l., Conformation in the Fibrous Protein, Academic
Press, New York and London (1973) ］のいずれかに帰
属されるのが普通である。この繊維のチロシン含有率は
３〜４％にすぎないので、後者に帰属される可能性は低
いと思われ、これも高次構造変化が張力によって引き起
こされることを示唆するものである。張力を除くと元の
スペクトルに完全に戻るという事実によっても、観測さ
れた変化はしおり糸絹糸の弾性に関与するものであるこ
とが確認される。弛緩過程で２相が区別できる（図４お
よび図５）。スペクトルが示す第１相（張力除去後０〜
１時間）では、絹糸構造は急速に元の形に戻るが完全に
は戻らない。第２相（張力除去後１〜１２時間）では弛
緩した絹糸は徐々に元の形状を取り戻し、完全に回復す
る。

【００５９】実施例２実施例１に述べたものと同様のやり方で別種のクモ Ara
neus gemmoidesの大吐糸腺から取りだした絹糸を用い、
実施例１の手順を繰り返す。繊維軸を偏光に対して直角
および平行にした状態で取った絹糸繊維のスペクトルを
図６〜図９に示す。すでに述べたように、絹糸繊維が偏
光入射放射に対して平行である場合に張力をかけると出
現するピークが１６５０ｃｍ^-1付近にある。更に、大吐
糸管絹糸の平行スペクトルでは、軸張力をかけると無秩
序構造由来の１６４５ｃｍ^-1付近のピークはαらせん信
号に置き換わる。伸張によってできたαらせん構造が張
力をかける前にすでに存在していたランダム配向αらせ
んに由来し、かけた力はらせんを配向し直して平行配列
にするにすぎないという可能性を調べるために、偏光さ
せない通常光を用いて絹糸繊維のＦＴＩＲスペクトルを
測定する。張力をかけないで数本の絹糸を試料プレート
上にランダムな方向に置き、スペクトルを得る。結果を
図１０に示す。αらせんが弛緩状態ですでに存在してい
れば見られるはずのαらせんの証拠はこれらのスペクト
ルに見られない。

【００６０】この仮説を証明するために、小吐糸腺由来
の絹糸繊維のスペクトルを調べる試験をさらに行う。小
吐糸腺から生成した絹糸はアミノ酸組成、機能および機
械的性質が大吐糸腺由来のものと明らかに異なる［Ande
rson, S. O., Comp. Biochem. Physiol., 35, 705-711
(1970); Work, R. W., et al., J. Arachnol., 15, 65-
80 (1987); Work, R. W., Text. Res. J., 47, 650-662
(1977); Tillinghast, E. K., et al., Ecophysiol. o
f Spiders, 203-210 (1987), Springer, Heideberg］。
特に、この絹糸は大吐糸腺由来絹糸と比べて弾性がかな
り小さく、引張強度も小さい［Work, R. W., J. Text.
Res., 47, 650-662 (1977); Lucase, F., et al., J. T
ext. Res., 46, T440-T452 (1955) ］。そこで、これら
２種類の絹糸繊維の高次構造と張力に対する分子応答を
ＦＴＩＲを用いて比較する。繊維軸を偏光赤外線放射入
射光に対して直角および平行にした状態で取った小吐糸
腺由来絹糸のスペクトルを図１１および図１２に示す。
繊維軸を偏光に対して平行にした状態で取った大小吐糸
腺由来絹糸のスペクトルは大きく異なる。特に興味深い
のは、張力をかけたときに弾性の低い絹糸のスペクトル
中にαらせんの形成を示す証拠が見られないことであ
る。そのかわり、１６６５ｃｍ^-1にピークが出現し、こ
れは非常に限られた伸張が起きると小吐糸腺絹糸のねじ
れ数が増加することを示唆するものである。

【００６１】クモ絹糸の弾性の構造的基盤についても、
部分一次構造の情報を得ることによって調べる。 Nephi
la clavipes と Araneus gemmoidesの両者のしおり糸絹
糸タンパク質を限定酸加水分解によって部分消化し、得
られたペプチドを逆相ＨＰＬＣで単離し、気相エドマン
分解法によって配列決定する［Hewick, R. M., et al.,
J. Biol. Chem., 256, 7990-7997 (1981)］。ＧＱＧＡ
ＧおよびＧＡＧＱＧの配列を有するペプチドが最も一般
的であり、ＧＹＧＧＬＧの配列を有するペプチドが Nep
hila clavipes の場合とほぼ同程度によく見られること
がわかる。Bombyx mori フィブロインとの相同性に基づ
けば、交互グリシン残基を含有するペプチドはβシート
領域を形成すると思われる［Lucas, F., et al., Compr
ehensiveBiochem., 26B, 475-558 (1968)］。Araneus g
emmoides の部分配列決定を行うと、βシートを形成す
る傾向が強いＧｌｙの豊富な繰返しペプチドの存在が明
らかになる。最も興味深いのは、主にアラニン残基を含
有するトリおよびテトラペプチドも両種に見られること
であり、このことから、これらは無定型領域中により不
規則な高次構造で存在している確率が最も高いと思われ
る。

【００６２】ＦＴＩＲとペプチド配列決定を組み合わせ
ると、クモ絹糸の弾性の分子機構が推定できる。ＦＴＩ
Ｒの結果を最も単純に解釈すると、繊維に軸方向の張力
をかけるとらせん（おそらくアルファ型）が形成される
ということがいえる。クモ絹糸ペプチドの配列決定を行
うと、βシート領域中に交互グリシン残基を有する他の
形の絹糸との類似性が判明する。他にも構造的に解明が
進んでいない領域があり、特にクモ絹糸の場合は構造未
解明の領域はアラニンが豊富であると思われる。アラニ
ンの豊富な短鎖ポリペプチドはαらせんを形成する傾向
が強い［Yang,D. S. C., et al., Nature, 333, 232-23
7 (1988) ］。ポリアラニンの繊維を伸張させると規則
的なαらせん構造ができることもわかっている［Bamfor
d, C. H., et al., Nature, 173, 27-31 (1954) ］。最
近、アラニンを主構成要素とする短鎖ペプチドが極めて
安定性の高いαらせん構造を形成する傾向を有すること
がわかり、個々のアラニン残基が高いらせん形成能力を
有すると考えられている［Marqusees, et al., Proc. N
atl. Acad. Sci. USA, 86, 5286-5290 (1989) ］。した
がって、大吐糸腺しおり糸絹糸の無定型領域中のアラニ
ンの豊富なセグメントが、観察された張力誘導αらせん
形成の原因である可能性が最も高い。

【００６３】大吐糸腺クモ絹糸を最も単純に表現する
と、極めて高い強度を繊維に与える積層βシートから成
る半結晶領域であるといえる。繊維軸に沿って力をかけ
ても、これらの領域はほとんど変化しないと思われる。
個々のポリペプチド鎖のβシート部分には、繊維が弛緩
状態にあると無秩序になるアラニンの豊富な短鎖領域が
散在している。張力をかけると、少なくとも一部はかけ
られた物理的力によってらせん形成に必要なエネルギー
が発生し、これらの領域はらせん状になる。この外力誘
導による秩序構造形成はおもしろい知見であり、他の生
化学系と一般的関連を有するかもしれない。このことは
他の絹糸において伸張に伴い見られるαからβへの転換
と明らかな対比を見せている［Ｌｕｃａｓｅ，Ｆ．，
ｅｔａｌ．，ＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅＢｉ
ｏｃｈｅｍ．，２６Ｂ，４７５−５５８（１９６
８）］。張力をゆるめると、秩序構造はエントロピーに
よってより無秩序な状態に復帰し、はじめに観察された
弾性が回復する。

【００６４】実施例３１．絹糸タンパク質の精製と同定本実施例で使用したクモはフロリダ州のマリンスペシメ
ン社から購入したNephila clavipes である。最初に、
単一種の絹糸腺から純粋な絹糸を得る。ワークらが記載
した方法［Ｗｏｒｋ，Ｒ．Ｗ．，ｅｔａｌ．，
Ｊ．Ａｒａｃｈｒｏｌ．，１０，１−１０（１９
８２）］に基づき、クモの出糸突起から絹糸単繊維を引
き出す装置を考案した。得られた絹糸単繊維をスプール
に留める。次いで、変速式電気ドリルを用いて、出糸突
起から０．５〜１ｍｇの純粋絹糸を取り出す。取り出し
た純粋絹糸を室温で５ＭのＬｉＳＣＮを含む１００％Ｔ
ＦＡ（トリフルオロ酢酸）に溶解し、０．４Ｍ酢酸／ピ
リジンを含有する緩衝液Ａ（ｐＨ４．０）、緩衝液Ａに
４０％プロパノールを加えた緩衝液ＢおよびＣ−１８カ
ラムを用いる逆相ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィ
ー）にかける。２つのペプチドのピークを蛍光によって
観察する。

【００６５】２．タンパク質のアミノ酸組成酸化を防止するために、純粋絹糸を真空下、６Ｎの塩酸
中１５５℃で３５分間加水分解する。塩酸を乾燥除去し
た後、Ｃ−１８逆相カラムを用いるＨＰＬＣ並びにＯＰ
Ａ（オルト−フタルアルデヒド）法［Ｊｏｎｅｓ，ｅ
ｔａｌ．，Ｊ．Ｌｉｑ．Ｃｈｒｏｍａｔ．，
４，５６５−５８６（１９８５）］およびＰＩＴＣ
（フェニルイソチオシアネート）法［Ｈｅｉｎｒｉｃｋ
ｓｏｎ，Ｒ．Ｌ．，ｅｔａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．，１３６，６５−７４（１９８
４）］によって試料を分析する。

【００６６】３．タンパク質の分解と断片の精製予備試験の結果から、絹糸タンパク質全体は「でこぼこ
の」アミノ末端を有することがわかる。したがって、絹
糸中のタンパク質は同一の配列を有しないか、そのＮ末
端配列は同一の位置で始まらないかのいずれかになる。
タンパク質の分解と断片の精製を行なって部分配列決定
用の絹糸タンパク質断片を得る。断片は１５５℃の温度
で３分間６Ｍの塩酸で加水分解することによって切断す
る。Ｃ−１８逆相カラムを用いるＨＰＬＣにかけて断片
を精製する。

【００６７】時間Ｂ−緩衝液量記録速度０分０％１０ｃｍ／６０分２０分６．６％４０分１３．２％流量６０分１９．８％０．７５ｍｌ／分８０分３３．３％１００分５０％１２０分６６．６％１４０分１００％

【００６８】４．タンパク質の部分アミノ酸配列決定アプライド・バイオシステムズ社製気相プロテインシー
クエンサー（４７０Ａ）を用いて断片のアミノ酸分析を
行うことによって純粋断片の配列を決定する。これによ
り、断片がＧＱＧＡＧ、ＧＡＧＱＧ、ＧＹＧＧＬＧなど
ＤＮＡプローブに適した配列を示し得るかどうかを決定
する情報が得られる。

【００６９】５．合成ＤＮＡプローブの作成アプライド・バイオシステムズ社製ＤＮＡ自動合成装置
（４３０Ａ）を用いて合成ＤＮＡプローブの合成を行
う。得られたＤＮＡはハイブリダイゼーションプローブ
として利用できる。グリシンとアラニンがタンパク質の
主成分であるので、これらのアミノ酸に対応する第３位
の４種類のコドンを用いることによって、これらの断片
についてのコドンが最も出現頻度の高いコドンと合致す
る可能性が高まる。５’ＣＣｎＣＧｎＣＣｎＧＴ（ＣまたはＴ）ＣＣ３’ ｎ＝ＡＣＧＴ、４種類の塩基。

【００７０】６．絹糸腺ｍＲＮＡからのｃＤＮＡのクロ
ーニング絹糸腺からｍＲＮＡを得るために、クモに強制的に糸を
出させてｍＲＮＡ合成を刺激する［Ｃａｎｃｅｌｅｓ，
Ｇ．Ｃ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｚｏ
ｏ．，２１６，１−６（１９８１）］。クモの腹部
から大吐糸管絹糸腺を切り取り（絹糸腺の解剖学的位置
については、「クモの生物学」Ｆｏｅｌｉｘ，Ｆ．
Ｒ．参照）、直ちに液体窒素に浸漬する。少量の液体窒
素と絹糸腺を乳鉢に加えた後、腺を粉砕して粉末化す
る。ＳＤＳ高温フェノール法によってＲＮＡを抽出する
［Ｔａｙｌｏｒ，Ｄ．Ｗ．，ｅｔａｌ．，Ｍｏ
ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．，１
０，３０５−３１８（１９８４）］。オリゴｄＴカラ
ムを用いて全ＲＮＡからｍＲＮＡを単離する［Ｈａｉｍ
Ａｖｉｖｅｔａｌ．，ＰＮＡＳ，６９，１４
０８−１４１２（１９７２）］。

【００７１】プロメガ社製リボクローンｃＤＮＡ合成装
置を用いてｍＲＮＡからｃＤＮＡへの逆転写を行う（使
用説明書参照）。ｃＤＮＡを作製した後、放射活性標識
ｃＤＮＡをセファロース４Ｂゲルろ過カラムにかけて大
型断片と小型断片を分離する。５００ｂｐより大きいｃ
ＤＮＡをベクターに結合させ、ＸＬ１−ブルー大腸菌に
形質転換を行ってｃＤＮＡライブラリーを構築する［Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ｅｔａｌ．，Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂＭａｎｕａ
ｌ（１９８２）］。

【００７２】ヘルパーファージ刺激存在下で単一ストラ
ンドＤＮＡを生成する機能を有するｐＢｌｕｅｓｃｒｉ
ｐｔＳＫプラスミド（ストラタジーン社のマニュアル参
照）をベクターとして用いてｃＤＮＡをクローン化す
る。ストラタジーン社から入手したｐＢｌｕｅｓｃｒｉ
ｐｔＳＫプラスミドは大量生産されている（トリトン溶
解法を用いる大量生産）［ＦｒｅｄｅｒｉｃｋＭ．
Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔａｌ．，ＣｕｒｒｅｎｔＰ
ｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌ
ｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ１，１９８７］。ライソゾ
ームインキュベーション時間は３７℃で２０分間であ
り、ｖｔｉ８０ローターを２４℃、５４０００ｒｐｍで
一晩用いて超遠心分離機（Ｌ７−５５、ベックマン社
製）中でＣｓＣｌ濃度勾配をつくって精製を行う［Ｆｒ
ｅｄｅｒｉｃｋＭ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔａ
ｌ．，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎ
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ
１，１９８７，ＧｒｅｅｎｅＰｕｂｌｉｓｈｉ
ｎｇＡｓｓｏｃｉａｔｅｓａｎｄＷｉｌｅｙ−Ｉ
ｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ発行］。ＳＤＳ蔗糖濃度勾配に
よってプラスミドのクリーンアップを更に行う［Ｍａｎ
ｉａｔｉｓ，Ｔ．，ｅｔａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂＭａｎｕａｌ
（１９８２），ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ
発行］。

【００７３】ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫプラスミドを
制限酵素Ｓｍａ１で切断し、平滑末端をつくる。プラス
ミドの自己結合率を下げるために、仔ウシ腸由来アルカ
リホスファターゼ（ＣＩＰ）（マンハイムベーリンガー
社製）を用いてプラスミドの５末端のリン酸塩を除去す
る［Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，ｅｔａｌ．，Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂＭａ
ｎｕａｌ（１９８２），ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨ
ａｒｂｏｒ発行］。温度を６８℃とせず７５℃で３０分
間ＣＩＰの不活化を行い、エリューチップｄカラム（Ｓ
ｃｈｌｅｉｃｈｅｒａｎｄＳｃｈｕｅｌｌ，Ｍａ
ｎｕｆａｃｔｕｒｅｒ、ＤＮＡ精製マニュアル参照）を
用いてベクターを精製清浄化した。

【００７４】Ｔ４ＤＮＡリガーゼを４℃で一晩作用させ
て、ｃＤＮＡをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫと結合させ
た後［Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，ｅｔａｌ．，
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂ
Ｍａｎｕａｌ（１９８２），ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ発行］、受容ＸＬ−１ブルーE. coliに形
質転換させる。１ＸＹＴ中で一晩大腸菌に接種し、Ｏ
Ｄ₆₀₀が０．３〜０．６になるまで生育させる。５００
０ｒｐｍで回転するＪＡ２０ローターを用いて５分間遠
心沈澱した後、菌体を元の２分の１の容量の５０ｍＭ
ＣａＣｌ₂＋１０ｍＭトリス（ｐＨ８）中に再び懸濁す
る。この液を２０分間氷冷した後、菌体を前記同様に遠
心沈澱し、元の２０分の１〜５０分の１の容量の５０ｍ
ＭＣａＣｌ₂に再び懸濁する。０．３ｍｌに分取す
る。所定の試験管にＤＮＡを加える。６０分間氷冷し、
４５℃の熱衝撃を３分間与える。プレートに塗布し、３
７℃で一晩インキュベートする。アンピシリン抵抗性マ
ーカーを有するプラスミドを含有する菌体のコロニーが
アンピシリンを加えたＹＴ寒天プレート中で生育する。

【００７５】７．ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニン
グのための合成オリゴデオキシヌクレオチドＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて合成オリゴデオ
キシヌクレオチドプローブをＰ³²で標識する［Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ，Ｔ．，ｅｔａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂＭａｎｕａｌ
（１９８２），ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ
発行］。プレート上に出現した白色コロニーをアンピシ
リンを含有するＹＴ培地を入れた９６穴検定プレートに
移し、再び３７℃で一晩生育させた。次いで、プラスミ
ドを有する大腸菌を３２ピンスタンプを用いてハイボン
ド−Ｎハイブリダイゼーショントランスファー膜（アマ
シャム社製）に移し、アンピシリンプレート中で一晩生
育させる。用いた３２ピンスタンプは９６穴プレートの
穴に合うように発泡スチロールブロックにピンを挿入し
た自家製のスタンプである。次いで、クロラムフェニコ
ールプレート上でプラスミド数を増幅する。水酸化ナト
リウムを用いて菌体を溶解し、膜上のＤＮＡを真空下８
０℃で２時間オーブンで加熱することによって固定した
［Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，ｅｔａｌ．，Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂＭａｎ
ｕａｌ（１９８２），ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａ
ｒｂｏｒ発行］。ＤＮＡ構造が非常に複雑であったの
で、ライブラリーのスクリーニングはウッドとローンの
方法によって放射活性標識オリゴデオキシヌクレオチド
プローブを用いて行った［Ｗｏｏｄ，Ｗ．Ｉ．，ｅ
ｔａｌ．，ＰＮＡＳ，８２，１５８５−１５８８
（１９８５）］。

【００７６】８．サザントランスファーとＤＮＡのハイ
ブリダイゼーションの適用による第１回スクリーニング
で得られた陽性コロニーの確認陽性コロニーを取り出し、ＹＴ培地で生育させ、挿入断
片を有するプラスミドＤＮＡを顕微操作によって抽出す
る［ＰｒｏｍｅｇａＣａｔａｌｏｇａｎｄＦｒｅｄ
ｅｒｉｃｋＭ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔａｌ．，
ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌ
ｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ１，
１９８７］。ＤＮＡをアガロースゲル中で処理した
後、試料をＮ膜上にブロットし［Ｍａｎｉａｔｉｓ，
Ｔ．，ｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏ
ｎｉｎｇ，ＡＬａｂＭａｎｕａｌ（１９８２），
ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ発行］、上記と
同様のプローブを用いて再びハイブリダイズする［Ｗｏ
ｏｄ，Ｗ．Ｉ．，ｅｔａｌ．，ＰＮＡＳ，８
２，１５８５−１５８８（１９８５）］。

【００７７】９．陽性コロニーの制限酵素消化ＤＮＡ複数のコロニーがプローブハイブリダイゼーションで陽
性であったので、ＢａｍＨ１、Ｅｃｏｒ１、Ｐｓｔ１、
Ｈａｅ３、Ａｐａ１、Ｃｌａ１、Ｈｉｎｃ２、Ｈｉｎｄ
３、Ｋｐｎ１、Ｓａｌ１、Ｓａｌ２、Ｘｈｏ１、Ｓｓｐ
１、Ｓｐｈ１などの制限酵素を用いて（各酵素の消化条
件は製造元の指示に従う）、これらの陽性コロニー間の
違いを調べるとともに更にＤＮＡ配列決定を行うための
情報を得た。

【００７８】１０．制限酵素消化断片のサブクローニン
グとプローブによるスクリーニング疑わしいが目的のものではないコロニーの配列を決定す
るという時間の無駄を省くために、大腸菌ＤＮＡポリメ
ラーゼのクレノウ断片［Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，ｅ
ｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，
ＡＬａｂＭａｎｕａｌ（１９８２）］を用い、Ｈａ
ｅIII およびＰｓｔ１による消化断片に４種類のｄＮＴ
ＰＡＣＧＴを挿入し、平滑末端を有する断片をつくっ
た。次いで、クローニングと同じ手順で断片をＭ１３フ
ァージにランダムにサブクローニングした。プローブ
（上記と同じもの）によってプラークを再びスクリーニ
ングした。陽性プラークを再びサザンハイブリダイゼー
ションによってつり上げた〔Ｗｏｏｄ，Ｗ．Ｉ．，
ｅｔａｌ．，ＰＮＡＳ，８２，１５８５−１５
８８（１９８５）］。

【００７９】１１．陽性サブクローン断片の配列決定挿入断片を有するＭ１３ファージの陽性プラークをＢＳ
Ｊ７２大腸菌とともに３７℃で一晩培養し、ＤＮＡ配列
決定用単一ストランドＤＮＡをつくった。単一ストラン
ドＤＮＡの精製のために、１ｍｌのファージ含有上清を
０．２５ｍｌのＲＮＡアーゼ／ＰＥＧ（ＰＥＧ１０％、
ＮａＣｌ２．５Ｍ、ＥＤＴＡ０．０１５Ｍ）と混合し、
室温で２〜３時間静置する。マイクロフュージ中で５分
間回転させて、ファージをペレット化する。溶液をでき
るだけ除去する。ペレットを０．０７ｍｌのプロテイナ
ーゼ溶液（ｐＨ８の０．０１Ｍトリス、ｐＨ８の０．０
０１ＭＥＤＴＡ、０．２％サルコシル、０．０７ｍｇ
／ｍｌプロテイナーゼＫ）に溶解し、５５℃で２０分イ
ンキュベートし、０．０５ｍｌの０．２５ＭＮａＣｌ
を加える。０．１５ｍｌの水飽和フェノールで抽出す
る。さらに、０．１３０ｍｌのフェノール／ＣＨＣｌ／
イソアミルアルコール（５０／４５／５％）で抽出し、
次いで、０．１２０ｍｌのＣＨＣｌで抽出する。０．２
ｍｌのＥｔＯＨを用い−８０℃で２０分以上、または−
２０℃で１時間以上沈澱させる。１５分間遠心沈澱さ
せ、次いで、ペレットを７０％ＥｔＯＨで洗浄し、ペレ
ットを乾燥させ、４０ｍｌの水に再び懸濁する。単一ス
トランドＤＮＡを精製した後、Ｍ１３ファージ用ユニバ
ーサルプライマーを用いて鋳型をハイブリダイズし、サ
ンガーらの方法［Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．，ｅｔａ
ｌ．，ＰＮＡＳ，７４，５４６３−５４６７（１９
７７）］に基づきＤＮＡの配列を決定した。配列決定時
の露光像の標識としてＳ³⁵−ｄＡＴＰを用いた。配列決
定ゲル電気泳動装置［Ｓ２型、ベセスダリサーチラ
ボラトリーズライフテクノロジー（ＢＲＬ）社製］は
製造元の指示に従って操作する。

【００８０】操作条件：７０ワット、３〜７時間大きい方のゲルプレートを珪素化する。次いで、ガラス
が新しいものであるかＮａＯＨで洗浄を行う場合に限
り、ガラスを９０℃で４時間加熱する。大型プレートは
使用前にその都度、無加熱で珪素化した。小さい方のプ
レートは使用前にその都度、３−メタクリルオキシプロ
ピル−トリメトキシシラン（シグマ社製）を溶解した２
％エタノール溶液で処理する。大小両方のプレートを洗
剤と蒸留水でよく洗った。珪素化、３−メタクリルオキ
シプロピル−トリメトキシシラン処理およびゲル充填に
先立ち、９０％エタノールを用いて最終洗浄を行った。
７％アクリルアミド／ビス、８Ｍ尿素ゲルを常に用い
た。

【００８１】５００ｍｌのアクリルアミド原液の調製アクリルアミド３３．２ｇビスアクリルアミド１．７５ｇ尿素２４０ｇ溶液は、溶液５００ｍｌに対して２５ｇのアンバーライ
トＭＢ−３モノベッド樹脂（シグマ社製）によって脱イ
オン化しておかねばならない。

【００８２】１リットルの１０ｘ配列決定緩衝液ＴＢＥ
の調製トリス塩基１６０ｇほう酸３８ｇＥＤＴＡ二ナトリウム９ｇ１ｘＴＢＥ緩衝液を７％のアクリルアミド／ビス／尿素
溶液と混合したものが操作条件である。１５％過硫酸ア
ンモニウム（０．２０ｍｌ）とＴＥＭＥＤ（０．０５ｍ
ｌ）を触媒として用いて全体で６０ｍｌのゲルを重合さ
せた。

【００８３】１２．プローブとハイブリダイズする配列
を有するコロニーの配列決定サンガーらの方法［Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．，ｅｔａ
ｌ．，ＰＮＡＳ，７４，５４６３−５４６７（１９
７７）］を用いて３個のコロニーの配列を決定する。配
列決定時の露光像の標識としてＳ³⁵−ｄＡＴＰを用い
た。これらのコロニーは、サイズが８００ｂｐ〜２．４
ｋｂｐの範囲で異なっていたので、各配列決定反応で明
確な読み取りができたのは３００〜３５０ｂｐだけであ
った。ＤＮＡの全配列を読み取るために、プロメガ社製
部分欠損ＤＮＡ検出キット「エラーゼ−ａ−ベースシス
テム」を用いて様々なサイズの配列決定用ＤＮＡを作成
した（プロメガ社製「エラーゼ−ａ−ベースシステム」
の使用説明書参照）。

【００８４】１３．クモ絹糸タンパク質の２．４ｋｂＤ
ＮＡの配列決定２．４ｋｂＤＮＡの部分配列決定の結果から、断片に欠
失と再結合を起こさせ得る反復配列と高ＧＣ含有率の複
雑な構造の存在が判明した。正確な配列情報を得るため
に、制限酵素ＨａｅIII を用いて２．４ｋｂ断片を切断
し、１５０〜９００ｂｐの小断片を得た。これらのＨａ
ｅIII 断片を１％低融点アガロース（ベセスダリサー
チラボラトリーズ社製）を用いて分離し、次いで、高
温フェノール［Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，ｅｔａ
ｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，Ａ
ＬａｂＭａｎｕａｌ（１９８２）］とエリューチップ
−ｄを用いて精製した。サイズの異なる純粋断片をｐＢ
ｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ（＋／−）プラスミドと配列
決定用Ｍ１３ファージのｍｐ１８とｍｐ１９（ストラタ
ジーン社製）のそれぞれにサブクローン化した（クロー
ニングと同様の方法）。

【００８５】１４．ノザンブロッティングとハイブリダ
イゼーションによる絹糸タンパク質ｍＲＮＡのサイズ決
定全ＲＮＡをオリゴｄＴアフィニティーカラム（上記と同
様のもの）にかけ、変性ホルムアルデヒドアガロースゲ
ル［ＦｒｅｄｅｒｉｃｋＭ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅ
ｔａｌ．，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ
ｕｍｅ１，４．９．５−４．９．８（１９８７）］
中を通過させることによってｍＲＮＡを精製する。この
ｍＲＮＡをゼータプローブ膜上にブロットした［Ｍａｎ
ｉａｔｉｓ，Ｔ．，ｅｔａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂＭａｎｕａｌ
（１９８２）］。ＨａｅIII 消化断片をアガロースゲル
電気泳動によって分離した（上記と同様の手順）。ニッ
クトランスレーションキット（ニックトランスレーショ
ン試薬キット、ベセスダリサーチラボラトリーズ社
製）を用い、９００ｂｐの断片を鋳型として放射活性標
識プローブを作製した。ｍＲＮＡを含む膜を７５℃の温
度でプローブによってハイブリダイズし、絹糸タンパク
質のｍＲＮＡのサイズを決定した［バイオラド社使用説
明書４．３ゼータプローブブロッッティング膜参照］。
絹糸タンパク質のＤＮＡ配列および対応するアミノ酸配
列を図１３〜図１６に示す。

【００８６】実施例４ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋／−プラスミド中のクモ
絹糸ＤＮＡ（２．０ｋｂ）（図１３〜図１６参照）のク
ローンを選択する。ＳｍａＩ部位に挿入断片を挿入す
る。実施例３の＃６と同様の方法でpBluescriptSK+ベク
ターを制限酵素ＳｍａＩで消化する。ＢａｍＨＩ部位と
ＥｃｏＲＩ部位でｐＢＳから挿入断片を切り出す［ニュ
ーイングランドバイオラボ社「ＮＥＢ」］。ＥｃｏＲＩ
部位にクレノウ断片を挿入し（断片とプロトコールはプ
ロメガ社から提供を受けた）、ＥｃｏＲＩ部位に平滑末
端を付与する。ＢａｍＨＩのオーバーハングは残して、
挿入断片が新しいｐＧＥＭ３Ｚベクター中で正しい方向
を向くようにした。このｐＧＥＭ３Ｚベクターは、Ｂａ
ｍＨＩで消化することによって作成し［ＢａｍＨＩ消化
はＢＲＬ反応緩衝液（ベセスダリサーチラボラトリ
ーズ社製）を用いて３７℃で３０分間行う）、オーバー
ハングとＨｉｎｃＩＩ（ＮＥＢ社製）平滑末端が残る。
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いてこの２個のプラスミドを結
合する。Ｔ４ＤＮＡ結合は、１０ｘ結合緩衝液を用いて
４℃で一晩反応させることによって行う［Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ，Ｔ．，ｅｔａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂＭａｎｕａｌ（１９８
２）］。

【化１】

【００８７】結合させたＤＮＡをあらかじめ作成してお
いた受容細胞に加えることでＤＮＡの形質転換を行う。
菌体とＤＮＡを０℃で２時間インキュベーションした
後、０．８５％の生理食塩水軟寒天（３ｍｌの軟寒天）
と混合し、４０μｇ／ｍｌのＸ−ガル、５０μｇ／ｍｌ
のアンピシリンおよび４０μｇ／ｍｌのＩＰＴＧ（イソ
プロピル−β−Ｄ−トリスガラクトピラノシド）を添加
したＬＢ寒天プレートに注ぐ。Ｘ−ガル（５−ブロモ−
４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノ
シド）、アンピシリンおよびＩＰＴＧは形質転換体の正
常な生育に必要であると判定された生長調節物質である
（ストラタジーン社製、ＢＲＬ社製）。使用した３種類
の宿主細胞系はＪＭ１０９（ストラタジーン社製）、Ｄ
Ｈ５αＦ（ベセスダリサーチラボラトリーズ社製）
およびＳＵＲＥ（ストラタジーン社製）である。３７
℃で培養中に生育培地にＩＰＴＧ（ベセスダリサーチ
ラボラトリーズ社製）を添加することによってクモ絹
糸タンパク質の発現を誘導する。抽出したタンパク質
（５０μｌ）をＰＡＧＥ／ＳＤＳファストゲル（ファル
マシア社製）によって調べる。少量のタンパク質しか生
成しないので、プラスミド中のリーディングフレームの
シフトを誘導する。

【００８８】リーディングフレームシフトは、プラスミ
ドを１単位のＳｐｈＩで消化し［ＳｐｈＩ消化はプロメ
ガＳｐｈＩ１０ｘ緩衝液（プロメガ社製）を用いて３７
℃で３０分間行う］、次いで、１単位のＴ４ＤＮＡポリ
メラーゼ（プロメガ社製）を用いて４塩基分の３’オー
バーハングを切り取ることによって行う。３’オーバー
ハングは、１単位のＴ４ＤＮＡポリメラーゼを室温で１
０分間加えることによって除去する。除去される塩基は
ＣＧＴＡである。５０μｌの容量で４℃で一晩自己結合
を起こさせる。次いで、このプラスミドを１単位のＴ４
ＤＮＡリガーゼ（ニューイングランドバイオラボ社製）
と自己結合させ、プラスミドｐＬＭ−４を構築し、前述
のプラスミド（ストラタジーン社製、ＢＲＬ社製）の代
わりに前述のようにして宿主細胞ＳＵＲＥ大腸菌（スト
ラタジーン社製）に形質転換させる。この大腸菌はアメ
リカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックビ
ル、メリーランド、Ｕ．Ｓ．Ａ．に、ブダペスト条約の
条件に従って１９９１年３月２７日に寄託され、寄託番
号６８５６７が与えられた。

【００８９】４０μｇ／ｍｌのイソプロピルチオガラク
トシド（ＩＰＴＧ）（ＢＲＬ社製）を生育培地に添加す
ることによって２０〜３０ｍｇ／ｌのクモ絹糸タンパク
質の発現を誘導する。タンパク質はＰＡＧＥ／ＳＤＳ
（ファルマシア社製）によって検出する。このタンパク
質は図１３〜図１６に示した配列を有する。タンパク
質は、菌体を６００ｘｇで１５分間遠心分離し、１Ｍの
酢酸に懸濁して破砕した後、３０００ｘｇで２０分間遠
心分離することによって精製することができる。ペレッ
トを５％ＳＤＳ（容量比１：１０）に溶解し、遠心分離
を繰返した。次いで、ペレットをＲＮａｓｅとＤＮＡａ
ｓｅ（０．０１ｍｇ／ｇ）で処理し、遠心分離を繰返し
た。ペレットを５Ｍの過塩素酸リチウムに溶解し、水
（容量比１：１００）に対して透析する。透析中、水を
４回交換する。透析懸濁液を１５０００ｘｇで３０分間
遠心分離する。過塩素酸リチウム中への溶解、透析、遠
心分離を３回繰り返す。

【００９０】実施例５実施例１、２または４（予想）のいずれかのタンパク質
絹糸を１０〜２０ｍｇ採取する。絹糸を５ＭのＬｉＳＣ
Ｎまたは過塩素酸リチウムに飽和点まで溶解する。溶解
した絹糸を含有する溶液を長い小ゲージニードル（サイ
ズ２４以下）を通過させ、１Ｍの酢酸溶液に流し込む。
ニードルから出るのに伴い繊維が形成され始める。

【００９１】実施例６下記の方法でクモ絹糸タンパク質２をクローン化した。
既存の Nephila clavipes 大吐糸管ｃＤＮＡライブラリ
ーから複製ニトロセルロースフィルターを作成した。フ
ィルター上のコロニーを固定し［Ｍａｎｉａｔｉｓ，
Ｔ．ｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎ
ｉｎｇ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２）］、５量体ペプチドＧ
−Ｙ−Ｇ−Ｐ−Ｇを基本とするＣＣＮＧＧＮＣＣＡＴＡ
ＮＣＣの配列を有する１４個のヌクレオチドから成るＭ
ｉｎｇ１と名付けられたキナーゼ処理［Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ，Ｔ．ｅｔａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂＭａｎｕａｌ，Ｃｏ
ｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ（１９８２）］した変性プローブとハイブリダイズ
させた。ウッドらの方法［ＰＮＡＳＵＳＡ，８
２，１５８５（１９８５）］を実施した後、塩化テト
ラメチルアンモニウムを用いるハイブリダイゼーション
を行った。フィルターのオートラジオグラムを取り、得
られた１２個の最も暗色のコロニーを用いてアルカリ性
迅速標品をつくり、これをＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消
化した。臭化エチジウム染色後、ゲルの写真を取り、ゼ
ータプローブ（バイオラド社製）に真空ブロットした。
キナーゼ処理したＭｉｎｇ１をプローブとして用い、
サザンブロットにハイブリダイズさせた。約２ｋｂとい
う最大の明確な挿入断片を有するクローン番号６を以後
のすべての実験に使用した。実施例４と同様の方法で発
現ベクターを構築し、プラスミドｐＭＢ−２を得る。
ＢａｍＨＩおよびＳａｃ１制限エンドヌクレアーゼを用
いて絹糸タンパク質２のオリジナルクローン（ｐ６Ｂ）
を切り取り、３５℃で３０秒間エクソヌクレアーゼIII
消化を行った。このＤＮＡをＳ１ヌクレアーゼとクレノ
ウ断片で処理することにより平滑末端を有するＤＮＡを
得た。このＤＮＡを自己結合させて（Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼ）、オリジナルクローン（ｐ６Ｂ）より１７３ｂｐ短
いクモ絹糸２の挿入断片を有するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ
ｔＳＫ＋プラスミドを得た。このプラスミドｐＭＢ２は
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＳａｃ１部位で始まり、配列
番号：３のヌクレオチド番号１７２（ＣＣＣ）に続くＤ
ＮＡ配列を有している。

【００９２】このプラスミド（ｐＭＢ−２）を含む大腸
菌ＳＵＲＥ細胞は、１９９１年３月２７日にアメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックビル、メ
リーランド、Ｕ．Ｓ．Ａ．に寄託番号６８５６８として
寄託されている。実施例４と同様の方法でＩＰＴＧを添
加することによって融合タンパク質（ｌａｃ遺伝子＋ク
モ絹糸タンパク質）の発現を誘導することができる。実
施例４と同様の方法でこのタンパク質を精製し、実施例
５と同様の方法で繊維にすることができる。

【００９３】実施例７（予想例）細菌中でのクモ大吐糸管絹糸の発現を効率良く行うた
め、３種類の発現ベクターを用いる。これらはいずれ
も、詳しい取扱いマニュアルと併せてニューイングラン
ドバイオラボ社から入手できる。これらのベクターは、
アンピシリンを用いるスクリーニング用のベータラクタ
マーゼ遺伝子、ポリリンカー部位の上流にマルトース結
合タンパク質（ｍａｌＥ）の一部によって構築された
クローニング用ポリリンカー部位、並びにポリリンカー
部位の下流にベータガラクトシダーゼのアルファサブユ
ニット供与体を有する。ＩＰＴＧによって制御されたｔ
ａｃプロモーターで転写を行う。ラクトースオペロンの
レプレッサー遺伝子もすべてのベクターに付いている。
したがって、プラスミドＤＮＡのコピー数を多くしても
細胞中のプラスミドＤＮＡの数に比例する競合ｔａｃプ
ロモーター領域が提供されることにより、レプレッサー
が大腸菌菌体中のサイトゾル中で希釈されることはな
い。クモ絹糸タンパク質１をコードするプラスミドｐＬ
Ｍ４をＥｃｏＲＩで消化した後、アガロースゲル上で精
製する。ベクターｐＭＡＬ−ｃＲＩ（ＮＥＢ社製）もＥ
ｃｏＲＩで消化し、ＣＩＰ（仔ウシ腸由来アルカリホス
ファターゼ、ベーリンガーマンハイム社製）で処理した
後、アガロースゲル上で精製する。分離した２個の断片
を５％のＰＥＧ８０００（ポリエチレングリコール８０
００、シグマ社製）の存在下でＴ４リガーゼ（プロメガ
社製）を用いて３７℃で１時間結合させる。取扱いマニ
ュアルに従い結合物をＳＵＲＥ受容細胞（ストラタジー
ン社製）に形質転換させた後、アンピシリン、Ｘ−ｇａ
ｌおよびＩＰＴＧを含有するＬＢプレートにのせる。制
限酵素消化またはＤＮＡ配列決定のいずれかによって方
向の正しいクローンをスクリーニングする。クモ絹糸タ
ンパク質２をコードするプラスミドｐＭＨ２をＢａｍＨ
ＩとＸｂａＩの両方によって消化してｃＤＮＡを切り出
し、５’末端オーバーハングに大腸菌ポリメラーゼＩ
（ＵＳＢ社製）のクレノウ断片を挿入した後、上記のよ
うにしてアガロースゲル上で精製する。発現ベクターｐ
ＭＡＬ−ｃまたはｐＭＡＬ−ｐをＳｔｕＩで消化して平
滑末端をつくり、ＣＩＰ処理とアガロースゲル精製を行
う。２個の精製断片をＴ４リガーゼを用いて結合させ、
ＳＵＲＥ受容細胞に形質転換させる。制限酵素消化また
はＤＮＡ配列決定のいずれかを行って挿入断片の方向を
決定する。ｐＭＡＬ−ｃＲＩまたはｐＭＡＬ−ｃベクタ
ーのいずれかを含有する大腸菌菌体はサイトゾル中でク
モ絹糸を生成するが、ｐＭＡＬ−ｐベクターを含有する
大腸菌菌体はペリプラズマ中にクモ絹糸を分泌する。前
者の生成物は実施例４と同様の方法で精製するが、後者
は菌体を氷上で３０分間０．１ｍｇ／ｍｌ濃度のリゾチ
ームで処理した後、遠心分離を行って上清を分離するこ
とによって回収する。回収したタンパク質はマルトース
結合タンパク質の一部との融合タンパク質である。ベク
ターとともにＮＥＢ社から提供されているアフィニティ
ーカラムで、マルトース結合タンパク質を用いて、融合
タンパク質を精製する。マルトース結合タンパク質とク
モ絹糸タンパク質を認識して切断するＸａ因子で融合タ
ンパク質を消化することによって過剰なマルトース結合
タンパク質を除去する。Ｘａ因子もＮＥＢ社から入手で
きる。

【００９４】実施例８：真核生物細胞中のクモ絹糸の発
現（予想例）バキュロウイルス系は高等真核生物細胞中に見られるタ
ンパク質変性、プロセシング系及び輸送系の多くを利用
している。組換え生成物の大部分は機能的にも免疫学的
にも真性タンパク質と変わらないものと思われる。全バ
キュロウイルス系をインビトロジェン社から購入する。
ｐＡｃ３６０融合ベクターをＢａｍＨＩで消化した後、
５’末端オーバーハングに大腸菌ポリメラーゼＩのクレ
ノウ断片を挿入する。クモ絹糸タンパク質１をコードす
るプラスミドｐＬＭ４をＥｃｏＲＶとＳｍａＩの両方に
よって消化してｃＤＮＡを切り出す。アガロースゲル上
で断片を精製した後、両方の断片を５％のＰＥＧ８００
０の存在下、３７℃でＴ４リガーゼを用いて１時間結合
させる。結合物をＳＵＲＥ受容細胞に形質転換させ、常
法により回収する。適当な組換えＤＮＡを精製した後、
取扱いマニュアルに従い、ヨトウムシSpodoptera frugi
perda Sf９細胞系に移入を行う。相同組換えがイン・ビ
ボで起き、雑種ＤＮＡの置換とクモ絹糸ｃＤＮＡの発現
が起こる。この組換えバキュロウイルスは外来クモ絹糸
ｃＤＮＡに結合した活性多核体遺伝子プロモーターを有
するので、ウイルス閉塞は起きない。解剖顕微鏡視野下
でスクリーニングを行い、生じたプラーク中に閉塞がな
いことを目視により確認することによって組換えプラー
クを探す。スクリーニングの手順の詳細は取扱いマニュ
アルに述べられている。組換えが起きたと思われるプラ
ークを回収し、32Ｐ標識プローブによるハイブリダイゼ
ーションによって確認し、組換えタンパク質の製造に使
用する。

【００９５】本願で引用した米国特許をはじめとする刊
行物はいずれも文献としてここに挙げたものである。し
たがって、本発明は様々な形で変更できることが明白で
ある。この様な変更は本発明の精神と範囲を逸脱しない
ものとする。また、当該技術に熟練せる者にとって自明
である変更はいずれも本願の請求の範囲に含まれるもの
とする。

【００９６】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：２３３８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡハイポセティカル配列：Ｎｏ起源：生物名：ネフィリアクラヴィペス (Nephila clavipe
s) 配列の特徴：特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置：１．．２１５４他の情報：生成物はネフィリアクラヴィペスのしおり
糸絹糸タンパク質配列 CAA GGG GCA GGT GCA GCA GCA GCA GCA GCT GGA GGT GCC GGA CAA GGA 48 Gln Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gln Gly 1 5 10 15 GGA TAT GGA GGT CTT GGT GGA CAA GGA GCT GGT CAA GGT GGA TAT GGA 96 Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Gly Gln Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly 20 25 30 GGT CTT GGT GGA CAA GGT GCC GGA CAA GGA GCT GGT GCA GCC GCC GCA 144 Gly Leu Gly Gly Gln Gly Ala Gly Gln Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala 35 40 45 GCA GCA GCT GGT GGT GCC GGA CAA GGA GGA TAT GGA GGT CTT GGA AGC 192 Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Ser 50 55 60 CAA GGT GCT GGA CGA GGT GGA CAA GGA GCT GGA GCA GCC GCT GCA GCT 240 Gln Gly Ala Gly Arg Gly Gly Gln Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala 65 70 75 80 GCG GGT GGT GCC GGA CAA GGA GGT TAT GGA GGT CTT GGA AGT CAA GGT 288 Ala Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Ser Gln Gly 85 90 95 GCA GGA CGA GGT GGA TTA GGT GGA CAA GGG GCA GGT GCA GCA GCC GCT 336 Ala Gly Arg Gly Gly Leu Gly Gly Gln Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala 100 105 110 GCA GCA GCT GGA GGT GCC GGA CAA GGA GGA TAT GGA GGC CTT GGA AAC 384 Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Asn 115 120 125 CAA GGT GCT GGA CGA GGT GGA CAA GGT GCA GCA GCA GCA GCA GCT GGA 432 Gln Gly Ala Gly Arg Gly Gly Gln Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly 130 135 140 GGT GCT GGA CAA GGA GGA TAT GGA GGT CTT GGA AGC CAA GGT GCA GGA 480 Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Ser Gln Gly Ala Gly 145 150 155 160 CGA GGT GGA TTA GGT GGA CAA GGT GCA GGT GCA GCA GCA GCA GCA GCC 528 Arg Gly Gly Leu Gly Gly Gln Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala 165 170 175 GGA GGT GCT GGA CAA GGC GGA TAC GGT GGT CTT GGT GGA CAA GGT GCC 576 Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Gly Gln Gly Ala 180 185 190 GGA CAA GGA GGC TAT GGA GGA CTT GGA AGC CAA GGT GCT GGA CGA GGA 624 Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Ser Gln Gly Ala Gly Arg Gly 195 200 205 GGA TTA GGT GGA CAA GGT GCA GGT GCA GCA GCA GCA GCA GCA GCT GGA 672 Gly Leu Gly Gly Gln Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly 210 215 220 GGT GCC GGA CAA GGA GGA CTA GGT GGA CAA GGT GCT GGA CAA GGA GCT 720 Gly Ala Gly Gln Gly Gly Leu Gly Gly Gln Gly Ala Gly Gln Gly Ala 225 230 235 240 GGA GCA TCC GCT GCA GCA GCT GGT GGT GCC GGA CAA GGA GGA TAT GGA 768 Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly 245 250 255 GGT CTT GGA AGC CAA GGT GCT GGA CGA GGT GGA GAA GGT GCA GGC GCA 816 Gly Leu Gly Ser Gln Gly Ala Gly Arg Gly Gly Glu Gly Ala Gly Ala 260 265 270 GCC GCA GCA GCA GCC GGA GGT GCT GGA CAA GGA GGA TAC GGT GGT CTT 864 Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu 275 280 285 GGT GGA CAA GGT GCC GGA CAA GGA GGC TAT GGA GGA CTT GGA AGC CAA 912 Gly Gly Gln Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Ser Gln 290 295 300 GGT GCT GGA CGA GGA GGA TTA GGT GGA CAA GGT GCA GGT GCA GCA GCA 960 Gly Ala Gly Arg Gly Gly Leu Gly Gly Gln Gly Ala Gly Ala Ala Ala 305 310 315 320 GCT GGA GGT GCC GGG CAA GGA GGA CTA GGT GGA CAA GGT GCT GGA CAA 1008 Ala Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Leu Gly Gly Gln Gly Ala Gly Gln 325 330 335 GGA GCT GGA GCA GCC GCT GCA GCA GCT GGT GGT GCC GGA CAA GGA GGA 1056 Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly 340 345 350 TAT GGA GGT CTT GGA AGC CAA GGT GCA GGA CGA GGT GGA TTA GGT GGA 1104 Tyr Gly Gly Leu Gly Ser Gln Gly Ala Gly Arg Gly Gly Leu Gly Gly 355 360 365 CAA GGG GCA GGT GCA GTA GCC GCT GCA GCA GCT GGA GGT GCC GGA CAA 1152 Gln Gly Ala Gly Ala Val Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gln 370 375 380 GGA GGA TAT GGA GGT CTT GGA AGC CAA GGT GCT GGA CGA GGT GGA CAA 1200 Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Ser Gln Gly Ala Gly Arg Gly Gly Gln 385 390 395 400 GGA GCT GGA GCA GCC GCT GCA GCA GCT GGT GGT GCC GGA CAA AGA GGT 1248 Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gln Arg Gly 405 410 415 TAT GGA GGT CTT GGA AAT CAA GGT GCA GGA CGA GGT GGA TTA GGT GGA 1296 Tyr Gly Gly Leu Gly Asn Gln Gly Ala Gly Arg Gly Gly Leu Gly Gly 420 425 430 CAA GGG GCA GGT GCA GCA GCC GCT GCA GCA GCT GGA GGT GCC GGA CAA 1344 Gln Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gln 435 440 445 GGA GGA TAT GGA GGC CTT GGA AAC CAA GGT GCT GGA CGA GGT GGA CAA 1392 Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Asn Gln Gly Ala Gly Arg Gly Gly Gln 450 455 460 GGT GCA GCA GCA GCA GCT GGA GGT GCC GGA CAA GGA GGA TAT GGA GGT 1440 Gly Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly 465 470 475 480 CTT GGA AGC CAA GGT GCT GGA CGA GGT GGA CAA GGT GCA GGC GCA GCC 1488 Leu Gly Ser Gln Gly Ala Gly Arg Gly Gly Gln Gly Ala Gly Ala Ala 485 490 495 GCA GCA GCA GCC GTA GGT GCT GGA CAA GAA GGA ATA CGT GGA CAA GGT 1536 Ala Ala Ala Ala Val Gly Ala Gly Gln Glu Gly Ile Arg Gly Gln Gly 500 505 510 GCC GGA CAA GGA GGC TAT GGA GGA CTT GGA AGC CAA GGT TCT GGT CGA 1584 Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Ser Gln Gly Ser Gly Arg 515 520 525 GGA GGA TTA GGT GGA CAA GGT GCA GGT GCA GCA GCA GCA GCA GCT GGA 1632 Gly Gly Leu Gly Gly Gln Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly 530 535 540 GGT GCT GGA CAA GGA GGA TTA GGT GGA CAA GGT GCT GGA CAA GGA GCT 1680 Gly Ala Gly Gln Gly Gly Leu Gly Gly Gln Gly Ala Gly Gln Gly Ala 545 550 555 560 GGA GCA GCC GCT GCA GCA GCT GGT GGT GTT AGA CAA GGA GGA TAT GGA 1728 Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Val Arg Gln Gly Gly Tyr Gly 565 570 575 GGT CTT GGA AGC CAA GGT GCT GGA CGA GGT GGA CAA GGT GCA GGC GCA 1776 Gly Leu Gly Ser Gln Gly Ala Gly Arg Gly Gly Gln Gly Ala Gly Ala 580 585 590 GCC GCA GCA GCA GCC GGA GGT GCT GGA CAA GGA GGA TAT GGT GGT CTT 1824 Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu 595 600 605 GGT GGA CAA GGT GTT GGC CGA GGT GGA TTA GGT GGA CAG GGT GCA GGC 1872 Gly Gly Gln Gly Val Gly Arg Gly Gly Leu Gly Gly Gln Gly Ala Gly 610 615 620 GCA GCG GCA GCT GGT GGT GCT GGA CAA GGA GGA TAT GGT GGT GTT GGT 1920 Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Val Gly 625 630 635 640 TCT GGG GCG TCT GCT GCC TCT GCA GCT GCA TCC CGG TTG TCT TCT CCT 1968 Ser Gly Ala Ser Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ser Arg Leu Ser Ser Pro 645 650 655 CAA GCT AGT TCA AGA GTT TCA TCA GCT GTT TCC AAC TTG GTT GCA AGT 2016 Gln Ala Ser Ser Arg Val Ser Ser Ala Val Ser Asn Leu Val Ala Ser 660 665 670 GGT CCT ACT AAT TCT GCG GCC TTG TCA AGT ACA ATC AGT AAC GTG GTT 2064 Gly Pro Thr Asn Ser Ala Ala Leu Ser Ser Thr Ile Ser Asn Val Val 675 680 685 TCA CAA ATT GGC GCC AGC ATC CTG GTC TTT CTG GAT GTG ATG TCC TCA 2112 Ser Gln Ile Gly Ala Ser Ile Leu Val Phe Leu Asp Val Met Ser Ser 690 695 700 TTC AAG CTC TTC TCG AGG TTG TTT CTG CTC TTA TCC AGA TCT 2154 Phe Lys Leu Phe Ser Arg Leu Phe Leu Leu Leu Ser Arg Ser 705 710 715 TAGGTTCTTC CAGCATCGGC CAAGTTAACT ATGGTTCCGC TGGACAAGCC ACTCAGATCG 2214 TTGGTCAATC AGTTTATCAA GCCCTAGGTT AAATGTAAAA TCAAGAGTTG CTAAAACTTA 2274 ATGAACTCGG GCTGTTTATT TGTGTTAGGT TTTAAAATAT TTTCAATAAA TATTATGCAT 2334 ATAA 2338

【００９７】配列番号：２配列の長さ：７１８配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：蛋白質配列 Gln Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gln Gly 1 5 10 15 Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Gly Gln Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly 20 25 30 Gly Leu Gly Gly Gln Gly Ala Gly Gln Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala 35 40 45 Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Ser 50 55 60 Gln Gly Ala Gly Arg Gly Gly Gln Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala 65 70 75 80 Ala Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Ser Gln Gly 85 90 95 Ala Gly Arg Gly Gly Leu Gly Gly Gln Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala 100 105 110 Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Asn 115 120 125 Gln Gly Ala Gly Arg Gly Gly Gln Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly 130 135 140 Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Ser Gln Gly Ala Gly 145 150 155 160 Arg Gly Gly Leu Gly Gly Gln Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala 165 170 175 Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Gly Gln Gly Ala 180 185 190 Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Ser Gln Gly Ala Gly Arg Gly 195 200 205 Gly Leu Gly Gly Gln Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly 210 215 220 Gly Ala Gly Gln Gly Gly Leu Gly Gly Gln Gly Ala Gly Gln Gly Ala 225 230 235 240 Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly 245 250 255 Gly Leu Gly Ser Gln Gly Ala Gly Arg Gly Gly Glu Gly Ala Gly Ala 260 265 270 Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu 275 280 285 Gly Gly Gln Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Ser Gln 290 295 300 Gly Ala Gly Arg Gly Gly Leu Gly Gly Gln Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Leu Gly Gly Gln Gly Ala Gly Gln 325 330 335 Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly 340 345 350 Tyr Gly Gly Leu Gly Ser Gln Gly Ala Gly Arg Gly Gly Leu Gly Gly 355 360 365 Gln Gly Ala Gly Ala Val Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gln 370 375 380 Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Ser Gln Gly Ala Gly Arg Gly Gly Gln 385 390 395 400 Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gln Arg Gly 405 410 415 Tyr Gly Gly Leu Gly Asn Gln Gly Ala Gly Arg Gly Gly Leu Gly Gly 420 425 430 Gln Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gln 435 440 445 Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Asn Gln Gly Ala Gly Arg Gly Gly Gln 450 455 460 Gly Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly 465 470 475 480 Leu Gly Ser Gln Gly Ala Gly Arg Gly Gly Gln Gly Ala Gly Ala Ala 485 490 495 Ala Ala Ala Ala Val Gly Ala Gly Gln Glu Gly Ile Arg Gly Gln Gly 500 505 510 Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Ser Gln Gly Ser Gly Arg 515 520 525 Gly Gly Leu Gly Gly Gln Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly 530 535 540 Gly Ala Gly Gln Gly Gly Leu Gly Gly Gln Gly Ala Gly Gln Gly Ala 545 550 555 560 Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Val Arg Gln Gly Gly Tyr Gly 565 570 575 Gly Leu Gly Ser Gln Gly Ala Gly Arg Gly Gly Gln Gly Ala Gly Ala 580 585 590 Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu 595 600 605 Gly Gly Gln Gly Val Gly Arg Gly Gly Leu Gly Gly Gln Gly Ala Gly 610 615 620 Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Val Gly 625 630 635 640 Ser Gly Ala Ser Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ser Arg Leu Ser Ser Pro 645 650 655 Gln Ala Ser Ser Arg Val Ser Ser Ala Val Ser Asn Leu Val Ala Ser 660 665 670 Gly Pro Thr Asn Ser Ala Ala Leu Ser Ser Thr Ile Ser Asn Val Val 675 680 685 Ser Gln Ile Gly Ala Ser Ile Leu Val Phe Leu Asp Val Met Ser Ser 690 695 700 Phe Lys Leu Phe Ser Arg Leu Phe Leu Leu Leu Ser Arg Ser 705 710 715

【００９８】配列番号：３配列の長さ：１９９５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡハイポセティカル配列：Ｎｏ直接の起源：クローン名：ｐ６Ｂ配列の特徴：特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置：１．．１７８５配列 CCT GGA GGA TAT GGA CCA GGA CAA CAA GGC CCA GGA GGA TAT GGC CCT 48 Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro 1 5 10 15 GGA CAA CAA GGA CCA TCT GGA CCT GGC AGT GCC GCT GCA GCA GCA GCA 96 Gly Gln Gln Gly Pro Ser Gly Pro Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala 20 25 30 GCC GCC GCA GCA GGA CCT GGA GGA TAT GGC CCT GGA CAA CAA GGA CCC 144 Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro 35 40 45 GGA GGA TAT GGA CCA GGA CAA CAA GGA CCC GGA AGA TAT GGA CCA GGA 192 Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Arg Tyr Gly Pro Gly 50 55 60 CAA CAA GGA CCA TCT GGA CCT GGC AGT GCC GCT GCA GCC GCA GCA GGA 240 Gln Gln Gly Pro Ser Gly Pro Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly 65 70 75 80 TCT GGA CAA CAA GGC CCA GGA GGA TAT GGA CCA CGT CAA CAA GGT CCA 288 Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Arg Gln Gln Gly Pro 85 90 95 GGA GGT TAT GGA CAA GGA CAA CAA GGA CCA TCT GGA CCA GGC AGT GCA 336 Gly Gly Tyr Gly Gln Gly Gln Gln Gly Pro Ser Gly Pro Gly Ser Ala 100 105 110 GCC GCA GCC TCA GCC GCA GCC TCA GCA GAA TCT GGA CAA CAA GGC CCA 384 Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ser Ala Glu Ser Gly Gln Gln Gly Pro 115 120 125 GGA GGT TAT GGA CCA GGT CAA CAA GGC CCA GGA GGT TAT GGA CCA GGT 432 Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly 130 135 140 CAA CAA GGT CCT GGA GGA TAT GGA CCA GGA CAA CAA GGA CCA TCT GGA 480 Gln Gln Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Ser Gly 145 150 155 160 CCA GGT AGT GCC GCT GCA GCA GCC GCC GCC GCA TCA GGA CCT GGA CAA 528 Pro Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ser Gly Pro Gly Gln 165 170 175 CAA GGA CCA GGA GGA TAT GGA CCA GGT CAA CAA GGT CCT GGA GGA TAT 576 Gln Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Tyr 180 185 190 GGA CCA GGA CAA CAA GGA CCA TCT GGA CCA GGT AGT GCC GCT GCA GCC 624 Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Ser Gly Pro Gly Ser Ala Ala Ala Ala 195 200 205 GCC GCC GCC GCA TCA GGA CCT GGA CAA CAA GGA CCA GGA GGA TAT GGA 672 Ala Ala Ala Ala Ser Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Tyr Gly 210 215 220 CCA GGT CAA CAA GGT CCA GGA GGT TAT GGA CCA GGA CAA CAA GGA CTA 720 Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Leu 225 230 235 240 TCT GGA CCA GGC AGT GCA GCT GCA GCA GCC GCA GCA GGA CCT GGA CAA 768 Ser Gly Pro Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Gln 245 250 255 CAA GGA CCC GGA GGA TAT GGA CCA GGA CAA CAA GGA CCA TCT GGA CCC 816 Gln Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Ser Gly Pro 260 265 270 GGT AGT GCC GCT GCA GCA GCA GCC GCC GCA GCA GGA CCT GGA GGA TAT 864 Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Gly Tyr 275 280 285 GGC CCT GGA CAA CAA GGA CCC GGA GGA TAT GGA CCA GGA CAA CAA GGA 912 Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly 290 295 300 CCA TCT GGA GCA GGC AGT GCA GCA GCA GCA GCC GCA GCA GGA CCT GGA 960 Pro Ser Gly Ala Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly 305 310 315 320 CAA CAA GGA TTA GGA GGT TAT GGA CCA GGA CAA CAA GGT CCA GGA GGA 1008 Gln Gln Gly Leu Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly 325 330 335 TAT GGA CCA GGA CAA CAA GGT CCA GGA GGA TAT GGA CCA GGT AGT GCA 1056 Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Ala 340 345 350 TCT GCA GCA GCA GCC GCA GCA GGA CCT GGA CAA CAA GGA CCA GGA GGA 1104 Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly 355 360 365 TAT GGA CCT GGA CAA CAA GGA CCA TCT GGA CCA GGC AGT GCA TCT GCA 1152 Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Ser Gly Pro Gly Ser Ala Ser Ala 370 375 380 GCA GCA GCC GCA GCC GCA GCA GGA CCA GGA GGA TAT GGA CCA GGA CAA 1200 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln 385 390 395 400 CAA GGT CCA GGA GGA TAT GCA CCA GGA CAA CAA GGA CCA TCT GGA CCA 1248 Gln Gly Pro Gly Gly Tyr Ala Pro Gly Gln Gln Gly Pro Ser Gly Pro 405 410 415 GGC AGT GCA TCT GCA GCA GCA GCC GCA GCC GCA GCA GGA CCA GGA GGA 1296 Gly Ser Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Gly 420 425 430 TAT GGA CCA GGA CAA CAA GGT CCA GGA GGA TAT GCA CCA GGA CAA CAA 1344 Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Tyr Ala Pro Gly Gln Gln 435 440 445 GGA CCA TCT GGA CCA GGC AGT GCA GCA GCA GCA GCA GCT GCC AGT GCA 1392 Gly Pro Ser Gly Pro Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ser Ala 450 455 460 GGA CCT GGT GGA TAT GGA CCA GCG CAA CAG GGA CCA TCT GGT CCT GGA 1440 Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Ala Gln Gln Gly Pro Ser Gly Pro Gly 465 470 475 480 ATC GCA GCT TCA GCT GCT TCA GCA GGA CCT GGA GGT TAT GGA CCA GCA 1488 Ile Ala Ala Ser Ala Ala Ser Ala Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Ala 485 490 495 CAA CAA GGA CCA GCT GGA TAT GGG CCT GGA AGC GCA GTA GCA GCC TCT 1536 Gln Gln Gly Pro Ala Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Ala Val Ala Ala Ser 500 505 510 GCC GGT GCA GGA TCT GCA GGT TAT GGG CCA GGT TCT CAA GCT TCC GCT 1584 Ala Gly Ala Gly Ser Ala Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gln Ala Ser Ala 515 520 525 GCA GCT TCT CGT CTG GCT TCT CCA GAT TCA GGC GCT AGA GTT GCA TCA 1632 Ala Ala Ser Arg Leu Ala Ser Pro Asp Ser Gly Ala Arg Val Ala Ser 530 535 540 GCT GTT TCT AAC TTG GTA TCC AGT GGC CCA ACT AGC TCT GCT GCC TTA 1680 Ala Val Ser Asn Leu Val Ser Ser Gly Pro Thr Ser Ser Ala Ala Leu 545 550 555 560 TCA AGT GTT ATC AGT AAC GCT GTG TCT CAA ATT GGC GCA AGT AAT CCT 1728 Ser Ser Val Ile Ser Asn Ala Val Ser Gln Ile Gly Ala Ser Asn Pro 565 570 575 GGT CTC TCT GGT TGC GAT GTC CTC ATT CAA GCT CTC TGG AAA TCG TTT 1776 Gly Leu Ser Gly Cys Asp Val Leu Ile Gln Ala Leu Trp Lys Ser Phe 580 585 590 CTG CTT GTG TAA CCA TCC TTT CTT CAT CCA GCA TTG GTC AAG TTA ATT 1824 Leu Leu Val 595 ATG GAG CGG CTT CTC AGT TCG CCC AAG TTG TCG GCC AAT CTG TTT TGA 1872 GTG CAT TTT AAT TGA AAA ATT TAT TAA AAT ATG CAT GGA TTT TCT AGC 1920 CTG GGC AAC TAA TTG CTC GTA CTA TGT AAT TTT TTT TTA AAT AAA TTC 1968 TTT GCA ACT TCT AAA AAA AAA AAA AAA 1995

【００９９】配列番号：４配列の長さ：５９６配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：蛋白質配列 Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro 1 5 10 15 Gly Gln Gln Gly Pro Ser Gly Pro Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala 20 25 30 Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro 35 40 45 Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Arg Tyr Gly Pro Gly 50 55 60 Gln Gln Gly Pro Ser Gly Pro Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly 65 70 75 80 Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Arg Gln Gln Gly Pro 85 90 95 Gly Gly Tyr Gly Gln Gly Gln Gln Gly Pro Ser Gly Pro Gly Ser Ala 100 105 110 Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ser Ala Glu Ser Gly Gln Gln Gly Pro 115 120 125 Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly 130 135 140 Gln Gln Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Ser Gly 145 150 155 160 Pro Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ser Gly Pro Gly Gln 165 170 175 Gln Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Tyr 180 185 190 Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Ser Gly Pro Gly Ser Ala Ala Ala Ala 195 200 205 Ala Ala Ala Ala Ser Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Tyr Gly 210 215 220 Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Leu 225 230 235 240 Ser Gly Pro Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Gln 245 250 255 Gln Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Ser Gly Pro 260 265 270 Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Gly Tyr 275 280 285 Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly 290 295 300 Pro Ser Gly Ala Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly 305 310 315 320 Gln Gln Gly Leu Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly 325 330 335 Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Ala 340 345 350 Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly 355 360 365 Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Ser Gly Pro Gly Ser Ala Ser Ala 370 375 380 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln 385 390 395 400 Gln Gly Pro Gly Gly Tyr Ala Pro Gly Gln Gln Gly Pro Ser Gly Pro 405 410 415 Gly Ser Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Gly 420 425 430 Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Tyr Ala Pro Gly Gln Gln 435 440 445 Gly Pro Ser Gly Pro Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ser Ala 450 455 460 Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Ala Gln Gln Gly Pro Ser Gly Pro Gly 465 470 475 480 Ile Ala Ala Ser Ala Ala Ser Ala Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Ala 485 490 495 Gln Gln Gly Pro Ala Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Ala Val Ala Ala Ser 500 505 510 Ala Gly Ala Gly Ser Ala Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gln Ala Ser Ala 515 520 525 Ala Ala Ser Arg Leu Ala Ser Pro Asp Ser Gly Ala Arg Val Ala Ser 530 535 540 Ala Val Ser Asn Leu Val Ser Ser Gly Pro Thr Ser Ser Ala Ala Leu 545 550 555 560 Ser Ser Val Ile Ser Asn Ala Val Ser Gln Ile Gly Ala Ser Asn Pro 565 570 575 Gly Leu Ser Gly Cys Asp Val Leu Ile Gln Ala Leu Trp Lys Ser Phe 580 585 590 Leu Leu Val 595

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、繊維軸を偏光放射に対して平行（Ａと
Ｂ）にした状態で Nephila clavipes 大吐糸腺由来しお
り糸絹糸繊維のＦＴＩＲスペクトルを取り、繊維にかけ
た力との関係を示したものである。Ａは元のスペクトル
を示し、ＢはＡのたたみこみの一部を引き出したスペク
トルである。

【図２】図２は、繊維軸を偏光放射に対して直角にした
状態で Nephila clavipes 大吐糸腺由来しおり糸絹糸繊
維のＦＴＩＲスペクトルを取り、繊維にかけた力との関
係を示したものであり、元のスペクトルを示す。

【図３】図３は、繊維軸を偏光放射に対して直角にした
状態で Nephila clavipes 大吐糸腺由来しおり糸絹糸繊
維のＦＴＩＲスペクトルを取り、繊維にかけた力との関
係を示したものであり、たたみこみの一部を引き出した
スペクトルである。

【図４】図４は、繊維軸を偏光放射に対して平行にした
状態で取った Nephila clavipes 大吐糸腺由来しおり糸
絹糸繊維のＦＴＩＲスペクトルである。（ｉ）軸張力０
グラム。（ii）軸張力２．０グラム。（iii)軸張力除去
２９分後。（iv）軸張力除去１２時間後。

【図５】図５は、繊維軸を偏光放射に対して直角にした
状態で取った Nephila clavipes 大吐糸腺由来しおり糸
絹糸繊維のＦＴＩＲスペクトルである。（ｉ）軸張力０
グラム。（ii）軸張力２．０グラム。（iii)軸張力除去
２９分後。（iv）軸張力除去１２時間後。

【図６】図６は、繊維軸を偏光放射に対して平行にした
状態でAraneus gemmoides 大吐糸腺由来しおり糸絹糸繊
維のＦＴＩＲスペクトルを取り、繊維にかけた力との関
係を示したものであり、元のスペクトルを示す。

【図７】図７は、繊維軸を偏光放射に対して平行にした
状態でAraneus gemmoides 大吐糸腺由来しおり糸絹糸繊
維のＦＴＩＲスペクトルを取り、繊維にかけた力との関
係を示したものであり、たたみこみの一部を引き出した
スペクトルである。

【図８】図８は、繊維軸を偏光放射に対して直角にした
状態でAraneus gemmoides 大吐糸腺由来しおり糸絹糸繊
維のＦＴＩＲスペクトルを取り、繊維にかけた力との関
係を示したものであり、元のスペクトルを示す。

【図９】図９は、繊維軸を偏光放射に対して直角にした
状態でAraneus gemmoides 大吐糸腺由来しおり糸絹糸繊
維のＦＴＩＲスペクトルを取り、繊維にかけた力との関
係を示したものであり、たたみこみの一部を引き出した
スペクトルである。

【図１０】図１０は、 Nephila clavipes 大吐糸腺由来
しおり糸絹糸３本を試料プレートにランダムな方向に置
き、偏光板を使わないで検出したＦＴＩＲスペクトルで
ある。実線は元のスペクトルを示し、破線はたたみこみ
の一部を引き出したスペクトルを示す。

【図１１】図１１は、 Nephila clavipes 小吐糸腺由来
絹糸繊維のＦＴＩＲスペクトルのたたみこみの一部を引
き出したものであり、繊維軸を偏光入射放射に対して直
角にした状態で取ったスペクトルである。

【図１２】図１２は、 Nephila clavipes 小吐糸腺由来
絹糸繊維のＦＴＩＲスペクトルのたたみこみの一部を引
き出したものであり、繊維軸を偏光入射放射に対して平
行にした状態で取ったスペクトルである。

【図１３】図１３は、図１４、図１５および図１６と共
に Nephila clavipes 大吐糸腺由来クモ絹糸タンパク質
１の全ｃＤＮＡ配列およびそれに対応するアミノ酸配列
を示す。該クモ絹糸タンパク質は２１５４位までのＤＮ
Ａによってコードされているので、２１５２−２１５４
位にあるＳｅｒ（アミノ酸７１８）が最後のアミノ酸と
なっている。ｃＤＮＡ配列およびそれに対応するアミノ
酸配列は、配列番号：１に示されている。２１５５−２
１５７位の終止コドンＴＡＧは翻訳されないし、残りの
コドンも翻訳されない。

【図１４】図１４は、図１３、図１５および図１６と共
に Nephila clavipes 大吐糸腺由来クモ絹糸タンパク質
１の全ｃＤＮＡ配列およびそれに対応するアミノ酸配列
を示す。

【図１５】図１５は、図１３、図１４および図１６と共
に Nephila clavipes 大吐糸腺由来クモ絹糸タンパク質
１の全ｃＤＮＡ配列およびそれに対応するアミノ酸配列
を示す。

【図１６】図１６は、図１３、図１４および図１５と共
に Nephila clavipes 大吐糸腺由来クモ絹糸タンパク質
１の全ｃＤＮＡ配列およびそれに対応するアミノ酸配列
を示す。

【図１７】図１７は、図１８、図１９および図２０と共
に Nephila clavipes 大吐糸腺由来クモ絹糸タンパク質
２の全ｃＤＮＡ配列およびそれに対応するアミノ酸配列
を示す。該クモ絹糸タンパク質は１７８５位までのＤＮ
Ａによってコードされている。ｃＤＮＡ配列およびそれ
に対応するアミノ酸配列は、配列番号：３に示されてい
る。

【図１８】図１８は、図１７、図１９および図２０と共
に Nephila clavipes 大吐糸腺由来クモ絹糸タンパク質
２の全ｃＤＮＡ配列およびそれに対応するアミノ酸配列
を示す。

【図１９】図１９は、図１７、図１８および図２０と共
に Nephila clavipes 大吐糸腺由来クモ絹糸タンパク質
２の全ｃＤＮＡ配列およびそれに対応するアミノ酸配列
を示す。

【図２０】図２０は、図１７、図１８および図１９と共
に Nephila clavipes 大吐糸腺由来クモ絹糸タンパク質
２の全ｃＤＮＡ配列およびそれに対応するアミノ酸配列
を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者ミン・クーカナダ国ティ２エヌ３ワイティ、アルバータカルガリー、エヌダブリューホスピタルドライブ 3330、ユニバーシティーオブカルガリーメディカルフィジオロジー／メディカルバイオケミストリーデパートメント内 (72)発明者マイケル・ビー・ヒンマンアメリカ合衆国ワイオミング 82070 ララミー、フェッターマンストリート 308 １／２

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】クモ絹糸タンパク質またはその断片あるい
は変異体をコードする単離ＤＮＡ。
【請求項２】αは伸張時にαらせんを形成し得る無定型
領域であり、βはβシートを形成し得る領域である、α
およびβの繰り返し領域を有するタンパク質をコードす
る請求項１記載の単離ＤＮＡ。
【請求項３】さらに可変領域を含む請求項２記載の単離
ＤＮＡ。
【請求項４】図１３、図１４、図１５および図１６に示
されるアミノ酸配列を有するクモ絹糸タンパク質をコー
ドする請求項３記載のＤＮＡ。
【請求項５】図１７、図１８、図１９および図２０に示
されるアミノ酸配列を有するクモ絹糸タンパク質をコー
ドする請求項３記載のＤＮＡ。
【請求項６】クモ絹糸タンパク質またはその断片あるい
は変異体をコードするｃＤＮＡを含有するベクターであ
って、かつ適当な宿主に導入した場合にクモ絹糸タンパ
ク質またはその断片あるいは変異体を発現することがで
きる複製可能なベクター。
【請求項７】図１３、図１４、図１５および図１６に示
されるｃＤＮＡ配列を有する請求項６記載のベクター。
【請求項８】図１７、図１８、図１９および図２０に示
されるｃＤＮＡ配列を有する請求項６記載のベクター。
【請求項９】請求項６記載のベクターを含有する生きた
細胞または微生物。
【請求項１０】細菌であって該ベクターがプラスミドで
ある請求項９記載の生きた細胞または微生物。
【請求項１１】クモ絹糸タンパク質またはその断片ある
いは変異体をコードし、クモ絹糸タンパク質を発現する
ことができるＤＮＡを含有する形質転換細胞または微生
物。
【請求項１２】請求項１１記載の形質転換細胞または微
生物によって産生された組換えクモ絹糸タンパク質。
【請求項１３】精製クモ絹糸タンパク質。
【請求項１４】αは伸張時にαらせんを形成し得る無定
型領域であり、βはβシートを形成し得る領域である、
αおよびβの繰り返し単位を有する請求項１３記載の精
製クモ絹糸タンパク質。
【請求項１５】図１３、図１４、図１５および図１６に
示されるアミノ酸配列を有する請求項１４記載の精製ク
モ絹糸タンパク質。
【請求項１６】図１７、図１８、図１９および図２０に
示されるアミノ酸配列を有する請求項１４記載の精製ク
モ絹糸タンパク質。
【請求項１７】請求項１２または請求項１３記載のタン
パク質から製造された、または両タンパク質の混合物か
ら形成された繊維。
【請求項１８】天然クモ絹糸タンパク質の断片または変
異体、またはそれから形成された繊維。
【請求項１９】請求項１１記載の形質転換細胞または微
生物を培養する工程を有する組換えクモ絹糸タンパク質
の製造方法。
【請求項２０】天然クモ絹糸タンパク質をコードする遺
伝子のＤＮＡ配列を決定し、該ＤＮＡ配列の変異体を調
製し、および該ＤＮＡ配列の該変異体を細胞または微生
物中で発現することによって、天然クモ絹糸の性質と異
なる性質を有するクモ絹糸タンパク質変異体を製造する
工程を有する天然クモ絹糸タンパク質変異体の調製方
法。