WO2014098210A1 - アポトーシス誘導剤 - Google Patents

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WO2014098210A1
WO2014098210A1 PCT/JP2013/084225 JP2013084225W WO2014098210A1 WO 2014098210 A1 WO2014098210 A1 WO 2014098210A1 JP 2013084225 W JP2013084225 W JP 2013084225W WO 2014098210 A1 WO2014098210 A1 WO 2014098210A1
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drug
akt
suppresses
apoptosis
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PCT/JP2013/084225
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新津洋司郎
西夛裕樹
田中洋行
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日東電工株式会社
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    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.

Definitions

  • the present invention relates to a novel apoptosis inducer, cell growth inhibitor, autophagy inhibitor, pharmaceutical composition comprising the apoptosis inducer, cell growth inhibitor or autophagy inhibitor, and abnormality of apoptosis, cell proliferation or autophagy
  • the present invention relates to a novel treatment method for diseases associated with the disease.
  • Cancer is one of the most important and troublesome diseases faced by centuries, and great research efforts are being made to treat it. Cancer is a disease in which cells grow uncontrolled due to gene mutation or epigenetic abnormality. Many gene abnormalities in cancer have already been reported (for example, Non-Patent Document 1 etc.), and many of them are considered to have some relationship with signal transduction related to cell proliferation, differentiation, and survival. It has been. In addition, such gene abnormalities cause abnormal signal transduction in cells composed of normal molecules, which leads to activation and inactivation of specific signal cascades, ultimately causing abnormal cell growth. It may be a factor. Early cancer treatments focused on the suppression of cell growth itself, but such treatments also suppressed the growth of physiologically normal cells, leading to hair loss, digestive disorders, and bone marrow suppression. It was accompanied by side effects such as. Therefore, in order to suppress such side effects, development of cancer therapeutic drugs based on new ideas such as molecular target drugs targeting cancer-specific gene abnormalities and signal transduction abnormalities is underway.
  • GST- ⁇ also called glutathioneathS-transferase pi, GSTP1
  • GSTP1 glutathioneathS-transferase pi
  • Non-patent document 5 a recent report reports that when an androgen-independent prostate cancer cell line overexpressing GST- ⁇ is allowed to act on siRNA for GST- ⁇ , its growth is suppressed and apoptosis is increased.
  • Non-patent document 6 it has been reported that when siRNA against GST- ⁇ is allowed to act on cancer cell lines having mutations in KRAS, Akt activation is suppressed and autophagy is increased, but apoptosis is moderately induced.
  • An object of the present invention is to provide a composition for effectively inducing apoptosis and / or growth inhibition in cells and a method using the same.
  • the present invention relates to the following.
  • An agent for inducing apoptosis comprising a drug that suppresses GST- ⁇ and a drug that suppresses Akt as active ingredients.
  • An agent for inhibiting cell proliferation comprising a drug that suppresses GST- ⁇ and a drug that suppresses Akt as active ingredients.
  • An agent for suppressing autophagy in a cell in which GST- ⁇ is suppressed comprising as an active ingredient a drug that suppresses Akt.
  • An agent for enhancing apoptosis induction and / or cell growth inhibition by a drug that suppresses GST- ⁇ comprising an agent that suppresses Akt as an active ingredient.
  • a pharmaceutical composition comprising the agent according to any one of (1) to (5).
  • the pharmaceutical composition according to (6) which is for cancer treatment.
  • the apoptosis-inducing agent of the present invention is extremely useful as a pharmaceutical composition because it can induce apoptosis more effectively than conventional ones and suppress cell proliferation.
  • cancer cells can be killed by apoptosis, so that not only the progression of cancer can be prevented, but also the effect of regression of cancer can be expected.
  • FIG. 1 is a graph showing the cell growth inhibitory effect of GST- ⁇ or Akt knockdown in PANC-1 cells.
  • FIG. 2 is a graph showing the effect of suppressing cell proliferation by knockdown of GST- ⁇ or Akt in A549 cells.
  • FIG. 3 is a graph showing the cell growth inhibitory effect of GST- ⁇ and Akt double knockdown in PANC-1 cells.
  • FIG. 4 is a graph showing the cell growth inhibitory effect by double knockdown of GST- ⁇ and Akt in A549 cells.
  • FIG. 5 is a graph showing the cell growth inhibitory effect of the combined use of GST- ⁇ siRNA and an Akt inhibitor. * P ⁇ 0.05, ** P ⁇ 0.01.
  • FIG. 6 is a graph showing the effect of suppressing autophagy by double knockdown of GST- ⁇ and Akt.
  • the present invention relates to an agent or composition for suppressing cell growth (hereinafter referred to as “cell growth inhibitor” or “cell growth inhibitor”) comprising, as active ingredients, a drug that suppresses GST- ⁇ and a drug that suppresses Akt. And an agent or composition for inducing apoptosis (hereinafter also referred to as “apoptosis-inducing agent” or “apoptosis-inducing composition”).
  • apoptosis-inducing agent hereinafter also referred to as “apoptosis-inducing agent” or “apoptosis-inducing composition”.
  • GST- ⁇ refers to an enzyme that catalyzes glutathione conjugation encoded by the GSTP1 gene.
  • GST- ⁇ exists in various animals including humans, and its sequence information is also known (for example, human: NP_000843 (NM_000852), rat: NP_036709 (NM_012577), mouse: NP_038569 (NM_013541), etc.)
  • the numbers are NCBI databases. The accession number is shown, the amino acid sequence outside the parentheses, and the base sequence number inside the parentheses).
  • Akt refers to a serine / threonine kinase having a PH domain encoded by the Akt gene.
  • Akt has three types of isotopes known as Akt1 to Akt3, but since Akt1 is associated with the PI3K / AKT / mTOR pathway, Akt refers to Akt1 unless otherwise specified in this specification.
  • Shall. Akt exists in various animals including humans, and its sequence information is also known (for example, human: NP_005154 (NM_005163) etc. The number indicates the accession number of the NCBI database. It is the number of the base sequence).
  • the GST- ⁇ or GSTP1 gene, or the Akt or Akt gene in the present invention is a It is not limited to proteins and nucleic acids having the same sequence, but one or more, typically one or several, for example 1, 2, 3, 4, 5 for the same sequence , 6, 7, 8, 9 or 10 amino acids or bases, but may have a function equivalent to that of the known GST- ⁇ or Akt described above. Specific functions of GST- ⁇ and Akt are as described later.
  • the “drug that suppresses GST- ⁇ ” used in the present specification is not limited, but includes, for example, a drug that suppresses production and / or activity of GST- ⁇ , and degradation and / or inactivation of GST- ⁇ .
  • Drugs that promote Examples of drugs that suppress GST- ⁇ production include, but are not limited to, RNAi molecules, ribozymes, antisense nucleic acids, DNA / RNA chimeric polynucleotides for DNA encoding GST- ⁇ , and these. A vector etc. are mentioned.
  • drugs that suppress GST- ⁇ activity include, but are not limited to, for example, substances that bind to GST- ⁇ , such as glutathione, glutathione analogs (eg, WO 95/08563, WO 96/40205, WO 99/54346, as described in Non-Patent Document 4, etc.), ketoprofen (Non-Patent Document 2), indomethacin (Hall et al., Cancer Res. 1989; 49 (22): 6265-8), ethacrynic acid, pyroprost (Tew et al., Cancer Res. 1988; 48 (13): 3622-5), anti-GST- ⁇ antibodies, dominant negative mutants of GST- ⁇ , and the like. These drugs are commercially available or can be appropriately produced based on known techniques.
  • substances that bind to GST- ⁇ such as glutathione, glutathione analogs (eg, WO 95/08563, WO 96/40205, WO 99/54346, as described in Non-Patent
  • Drugs that suppress GST- ⁇ production or activity include RNAi molecules, ribozymes, antisense nucleic acids, DNA / RNA chimeras for DNA encoding GST- ⁇ due to its high specificity and low possibility of side effects. Polynucleotides and vectors expressing them are preferred.
  • the inhibition of GST- ⁇ can be determined by the fact that the expression and activity of GST- ⁇ are suppressed in the cells as compared with the case where no GST- ⁇ inhibitor was allowed to act.
  • the expression of GST- ⁇ is not limited to any known method, for example, immunoprecipitation using an anti-GST- ⁇ antibody, EIA, ELISA, IRA, IRMA, Western blotting, immunohistochemistry, immunization Cytochemistry, flow cytometry, various nucleic acids using nucleic acids that specifically hybridize to a nucleic acid encoding GST- ⁇ or a unique fragment thereof or a transcription product (eg, mRNA) or splicing product of the nucleic acid. It can be evaluated by a hybridization method, Northern blot method, Southern blot method, various PCR methods and the like.
  • the activity of GST- ⁇ is not limited to the known activity of GST- ⁇ .
  • it binds to proteins such as Raf-1 (particularly phosphorylated Raf-1) and EGFR (particularly phosphorylated EGFR).
  • the sex and the like can be evaluated by analyzing by any known method such as immunoprecipitation, Western blotting, mass spectrometry, pull-down, surface plasmon resonance (SPR), and the like.
  • a drug that suppresses Akt is not limited and includes, for example, a drug that suppresses production and / or activity of Akt, a drug that promotes degradation and / or inactivation of Akt, and the like. included.
  • examples of drugs that suppress Akt production include, but are not limited to, RNAi molecules, ribozymes, antisense nucleic acids, DNA / RNA chimera polynucleotides, and vectors expressing them, for Akt-encoding DNA. It is done.
  • Examples of the drug that suppresses the activity of Akt include, but are not limited to, a substance that binds to Akt, such as Akt Inhibitor (Akt Inhibitor, Akt Inhibitor II to XIII) of Merck Millipore, MK-2206, Perifosine, GSK690693, AT7867, CCT128930, PHT-427, Palomid 529, PF-04691502, Tricibin, Triciribine phosphate (NSC-280594), A-674563, sc-221226, anti-Akt antibody, dominant negative mutant of Akt, etc. Can be mentioned. These drugs are commercially available or can be appropriately produced based on known techniques.
  • Akt Inhibitor Akt Inhibitor, Akt Inhibitor II to XIII
  • Merck Millipore MK-2206
  • Perifosine GSK690693
  • AT7867 CCT128930
  • PHT-427 Palomid 529
  • Drugs that suppress Akt production or activity include RNAi molecules, ribozymes, antisense nucleic acids, DNA / RNA chimeric polynucleotides and DNA / RNA chimeric polynucleotides for Akt-encoding DNA because of their high specificity and low possibility of side effects.
  • a vector that expresses is preferred.
  • the suppression of Akt can be determined by the fact that the expression and activity of Akt are suppressed in the cells compared to the case where no Akt inhibitor was allowed to act.
  • the expression of Akt is not limited to any known method, for example, immunoprecipitation using an anti-Akt antibody, EIA, ELISA, IRA, IRMA, Western blotting, immunohistochemistry, immunocytochemistry, Various hybridization methods, Northern blotting methods using nucleic acids that specifically hybridize to nucleic acids that specifically encode Akt-encoding nucleic acids or unique fragments, or transcription products (eg, mRNA) or splicing products of the nucleic acids , Southern blotting, various PCR methods and the like.
  • the activity of Akt is not limited to the known activity of Akt.
  • the binding activity to a protein such as mTOR can be determined by any known method such as immunoprecipitation, western blotting, and mass spectrometry. It can be evaluated by analyzing by a pull-down method, surface plasmon resonance (SPR) method or the like.
  • an RNAi molecule refers to any molecule that causes RNA interference, including, but not limited to, siRNA (small interfering RNA), miRNA (micro RNA), shRNA (short hairpin RNA), ddRNA (DNA- directed RNA), piRNA (Piwi-interacting RNA), rasiRNA (repeat associated siRNA) and the like, and variants thereof.
  • siRNA small interfering RNA
  • miRNA miRNA
  • shRNA short hairpin RNA
  • ddRNA DNA- directed RNA
  • piRNA piRNA
  • rasiRNA replicaat associated siRNA
  • antisense nucleic acid includes RNA, DNA, PNA, or a complex thereof.
  • a DNA / RNA chimeric polynucleotide is not limited, for example, a double-stranded polynucleotide comprising DNA and RNA that inhibits expression of a target gene described in JP-A-2003-219893. Including.
  • the drug that suppresses GST- ⁇ and the drug that suppresses Akt may be included in a single preparation, or may be included separately in two or more preparations. In the latter case, each preparation may be administered at the same time or may be administered at intervals. When administered at a time interval, a preparation containing a drug that suppresses GST- ⁇ may be administered before or after a preparation containing a drug that suppresses Akt.
  • the present invention also provides an agent or composition (hereinafter referred to as “apoptosis induction enhancement”) for enhancing apoptosis induction and / or cell growth inhibition by a drug that inhibits GST- ⁇ , which contains an agent that inhibits Akt as an active ingredient.
  • the compounding amount of the active ingredient in the agent or composition of the present invention may be an amount that induces apoptosis and / or suppresses cell proliferation when the agent or composition is administered. In addition, an amount that does not cause adverse effects exceeding the benefits of administration is preferred. Such an amount is known or can be appropriately determined by an in vitro test using cultured cells, or a test in a model animal such as a mouse, rat, dog or pig. Such a test method is well known to those skilled in the art. Are known.
  • Induction of apoptosis is evaluated by various known techniques such as DNA fragmentation, annexin V binding to the cell membrane, changes in mitochondrial membrane potential, caspase activation, and other phenomena peculiar to apoptosis, and TUNEL staining. can do.
  • suppression of cell proliferation can be performed by various known methods such as counting the number of living cells over time, measuring tumor size, volume or weight, measuring DNA synthesis, WST-1 method, BrdU (bromodeoxy). (Uridine) method, 3 H thymidine incorporation method, and the like.
  • the amount of the active ingredient may vary depending on the dosage form of the agent or the composition.
  • the amount of the active ingredient blended in one unit of the composition may be a plurality of the amount of the active ingredient necessary for one administration. it can. Those skilled in the art can appropriately adjust the blending amount.
  • the present invention also provides a method for producing an agent or a composition for inducing apoptosis or suppressing cell proliferation, comprising combining a drug that suppresses GST- ⁇ and a drug that suppresses Akt as active ingredients , Use of a drug that suppresses GST- ⁇ and a drug that suppresses Akt in the production of an agent or composition for inducing apoptosis or suppressing cell proliferation, GST used for inducing apoptosis or suppressing cell proliferation, A combination of a drug that inhibits - ⁇ and a drug that inhibits Akt, as well as administering an effective amount of a drug that inhibits GST- ⁇ and a drug that inhibits Akt, or induces apoptosis or inhibits cell proliferation On how to do.
  • the present invention also produces an agent or composition for enhancing apoptosis induction and / or cell growth inhibition by a GST- ⁇ -inhibiting drug, which comprises incorporating an Akt-inhibiting drug as an active ingredient Method, use of a drug that suppresses Akt, in the production of an agent or a composition for enhancing apoptosis induction and / or suppression of cell proliferation by a drug that suppresses GST- ⁇ , by a drug that suppresses GST- ⁇ Induction of apoptosis by a drug that inhibits GST- ⁇ , comprising administering an agent that inhibits Akt used to enhance apoptosis induction and / or inhibition of cell proliferation, and an effective amount of an agent that inhibits Akt And / or to a method of enhancing inhibition of cell proliferation.
  • each drug can be performed according to any known technique. Any of the above-described methods for inducing apoptosis or suppressing cell growth may be an in vitro method or an in vivo method. Further, the drug in the method is as described above, and the effective amount of the drug may be an amount that induces apoptosis or suppresses cell proliferation in the administered cell. In addition, an amount that does not cause adverse effects exceeding the benefits of administration is preferred. Such an amount is known or can be appropriately determined by an in vitro test using cultured cells or the like, and such a test method is well known to those skilled in the art.
  • the effective amount need not necessarily result in apoptosis or growth inhibition in all cells of the cell population when the drug is administered to the cell population.
  • the effective amount is 1% or more, 2% or more, 3% or more, 4% or more, 5% or more, 6% or more, 8% or more, 10% or more, 12% or more, 15% of the cells in the cell population.
  • the amount may bring about apoptosis or growth inhibition to 20% or more, further 25% or more.
  • the agent for inducing apoptosis and inhibiting cell growth of the present invention can effectively induce apoptosis or growth inhibition even in cells having abnormal cell proliferation, and is effective as a component of a pharmaceutical composition.
  • one aspect of the present invention includes a pharmaceutical composition comprising the apoptosis-inducing agent or cytostatic agent of the present invention.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is particularly effective for treating diseases having abnormalities in apoptosis. Therefore, one embodiment of the present invention relates to a pharmaceutical composition for treating a disease having an abnormality in apoptosis, comprising the apoptosis inducer.
  • a disease having an abnormality in apoptosis is not limited thereto. For example, a disease caused by abnormal cell proliferation, a disease caused by KRAS mutation, or an overexpression of GST- ⁇ . Disease to be included.
  • Diseases resulting from abnormal cell proliferation include, but are not limited to, for example, benign or malignant tumors, hyperplasia, keloids, Cushing syndrome, primary aldosteronism, erythema, polycythemia vera, leukoplakia, hyperplasia. Includes formed scars, lichen planus and melanosis.
  • KRAS mutation examples include, but are not limited to, benign or malignant tumor (also referred to as cancer or malignant neoplasm).
  • GST- ⁇ Diseases resulting from overexpression of GST- ⁇ include, but are not limited to, for example, benign or malignant tumors, particularly drug resistance (eg, alkylating agents such as melphalan and cyclophosphamide, anthracyclines such as adriamycin Antitumor antibiotics, platinum complexes such as cisplatin, and malignant tumors resistant to etoposide).
  • drug resistance eg, alkylating agents such as melphalan and cyclophosphamide, anthracyclines such as adriamycin Antitumor antibiotics, platinum complexes such as cisplatin, and malignant tumors resistant to etoposide.
  • the disease having an abnormality in apoptosis is cancer.
  • the cancer in the present invention is not limited, for example, fibrosarcoma, malignant fibrous histiocytoma, liposarcoma, rhabdomyosarcoma, leiomyosarcoma, angiosarcoma, Kaposi sarcoma, lymphangiosarcoma, synovial sarcoma , Sarcomas such as chondrosarcoma, osteosarcoma, brain tumor, head and neck cancer, breast cancer, lung cancer, esophageal cancer, stomach cancer, duodenal cancer, appendix cancer, colon cancer, rectal cancer, liver cancer, pancreatic cancer, gallbladder cancer, bile duct cancer, anal cancer, Examples include renal cancer, ureteral cancer, bladder cancer, prostate cancer, penile cancer, testicular cancer, uterine cancer, ovarian cancer, vulvar cancer, vaginal cancer, skin cancer and other carcinomas, as well as leukemia and malignant lymphoma.
  • cancer includes epithelial malignant tumors and non-epithelial malignant tumors.
  • the cancer in the present invention may be any part of the body, for example, brain, head and neck, chest, limbs, lung, heart, thymus, esophagus, stomach, small intestine (duodenum, jejunum, ileum), large intestine (colon, cecum, appendix).
  • liver pancreas, gallbladder, anus, kidney, ureter, bladder, prostate, penis, testis, uterus, ovary, vulva, vagina, skin, striated muscle, smooth muscle, synovium, cartilage, bone, thyroid , Adrenal glands, peritoneum, mesentery, bone marrow, blood, vascular system, lymph nodes such as lymph nodes, lymph fluid, etc.
  • the cancer includes cancer cells having the mutant KRAS defined above.
  • the cancer comprises cancer cells that exhibit hormone or growth factor independent proliferation.
  • the cancer comprises cancer cells that exhibit GST- ⁇ overexpression.
  • the cancer is drug resistant.
  • the cancer is selected from the group consisting of alkylating agents such as melphalan and cyclophosphamide, anthracycline antitumor antibiotics such as adriamycin, platinum complexes such as cisplatin, and etoposide. Resistant to drugs.
  • the cancer is resistant to a drug selected from the group consisting of melphalan, cyclophosphamide, adriamycin, cisplatin, etoposide.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for treating a disease having an abnormality in apoptosis, comprising a drug that suppresses GST- ⁇ and a drug that suppresses Akt as an active ingredient, a drug that suppresses GST- ⁇ , and an inhibitor that suppresses Akt
  • a method for producing a pharmaceutical composition for treating a disease having an abnormality in apoptosis comprising combining a drug to be treated as an active ingredient, a disease having an abnormality in apoptosis of a drug that suppresses GST- ⁇ and a drug that suppresses Akt , A combination of a drug that suppresses GST- ⁇ and a drug that suppresses Akt, and an effective amount of the pharmaceutical composition used for the manufacture of a pharmaceutical composition that treats
  • For treating a disease having an abnormality in apoptosis comprising administering to a subject in need thereof.
  • the apoptosis inducer, cell growth inhibitor and composition containing the same of the present invention may be used in combination with other active ingredients.
  • the combined use includes, for example, administering other active ingredients as separate preparations, and administering the other active ingredients as a combination with at least one other drug.
  • preparations containing other active ingredients may be administered before other preparations, simultaneously with other preparations, or after other preparations.
  • Such other active ingredients include those that are effective in treating the target disease.
  • an anticancer agent can be used in combination.
  • anticancer agents include, for example, alkylating agents such as ifosfamide, nimustine hydrochloride, cyclophosphamide, dacarbazine, melphalan, ranimustine, gemcitabine hydrochloride, enocitabine, cytarabine ocphosphat, cytarabine formulation, tegafur uracil, tegafur Gimeracil / oteracil potassium combination drug (eg TS-1), antimetabolite such as doxyfluridine, hydroxycarbamide, fluorouracil, methotrexate, mercaptopurine, idarubicin hydrochloride, epirubicin hydrochloride, daunorubicin hydrochloride, daunorubicin citrate, doxorubicin hydrochloride,
  • platinum complexes such as carboplatin, cisplatin (CDDP) and nedaplatin
  • angiogenesis inhibitors such as thalidomide, neobasstat and bevacizumab, and L-asparaginase.
  • autophagy can include macroautophagy, microautophagy, chaperone-mediated autophagy, etc., but typically means macroautophagy. Accordingly, the term “autophagy” in the present invention refers to “macroautophagy” unless otherwise specified.
  • Autophagy is one of intracellular protein degradation mechanisms called “autophagy” and is responsible for the degradation and recycling of proteins in cells. Autophagy is found in a wide range of species, including yeast and mammals, and is generally (a) formation of PAS (phagophore assembly site), (b) extension and expansion of a phagophore (isolation membrane) surrounding the protein to be degraded. This involves a series of processes including the formation of autophagosomes encapsulating the protein to be degraded, (c) the formation of autolysosomes by fusion of autophagosomes and lysosomes, and (d) the degradation of proteins within the autolysosomes. .
  • Examples of autophagy-related factors involved in the core molecular mechanism of autophagy in mammals include VMP1, TP53INP2, mAtg9, ULK complex (consisting of ULK1, ULK2, mAtg13, and FIP200) involved in the formation of PAS, PI3K complex Body (Atg14L complex composed of Beclin1, hVps34, p150, Ambra1, Atg14L, and UVRAG complex composed of Beclin1, hVps34, p150, Bif-1, UVRAG), LC3-II involved in phagophore elongation , Atg12-Atg5-Atg16L complex, and the like.
  • the drugs that suppress autophagy are not limited, and include, for example, autophagy-related factors including those described above (in the case where the related factor is a complex, not only the complex itself but also the individual composing the complex). And the like, and drugs that promote the degradation and / or inactivation of autophagy-related factors.
  • drugs that suppress the production of autophagy-related factors include RNAi molecules, ribozymes, antisense nucleic acids, DNA / RNA chimeric polynucleotides, and vectors that express these, against DNA encoding autophagy-related factors.
  • drugs that suppress the activity of autophagy-related factors include, but are not limited to, for example, inhibitors of PI3K (eg, wortmannin), particularly inhibitors of class III PI3K (eg, 3-MA (3- Methyl adenine)), substances that inhibit autophagosome-lysosome fusion (eg, bafilomycin A1), substances that inhibit proteolysis in autolysosomes (eg, chloroquine, leupeptin, etc.), autophagy-related factors Examples include substances that bind (for example, antibodies to autophagy-related factors), dominant negative mutants of autophagy-related factors, and the like. These drugs are commercially available or can be appropriately produced based on known techniques.
  • inhibitors of PI3K eg, wortmannin
  • class III PI3K eg, 3-MA (3- Methyl adenine
  • substances that inhibit autophagosome-lysosome fusion eg, bafilomycin A1
  • RNAi molecules As a drug that suppresses autophagy, RNAi molecules, ribozymes, antisense nucleic acids, DNA / RNA chimera polynucleotides for DNA encoding autophagy-related factors and these are expressed because of their high specificity and low side effects.
  • Vectors are preferred.
  • the suppression of autophagy can be determined by the suppression of autophagy in the cells compared to the case where the autophagy inhibitor of the present invention is not allowed to act.
  • Suppression of autophagy is not limited to any known method, for example, detection of autophagosomes by electron microscopy, detection of autophagy markers (eg, Atg5, Atg12, LC3, especially LC3-II, etc.), etc. Can be evaluated on the basis.
  • LC3-II is not limited, and may be detected with, for example, a specific antibody against LC3-II, or LC3-II separated into a band different from LC3-I after separation of the sample by electrophoresis or the like.
  • LC3-II can also be detected by Western blotting using an antibody that reacts with LC3-II or both LC3-I and LC3-II.
  • LC3-I is scattered in the cytoplasm
  • LC3-II is localized in a structure unique to autophagy such as an isolating membrane, autophagosome, autolysosome, and the like.
  • the presence or number of punctate signals showing these structures which are manifested by immunostaining with an antibody that reacts with both LC3-II) or the like, may be used as an index of autophagy.
  • the present invention also provides an agent or composition for suppressing autophagy in a GST- ⁇ -suppressed cell (“autophagy inhibitor” or “autophagy inhibitory composition”, comprising a drug that suppresses Akt as an active ingredient) ").
  • autophagy inhibitor or “autophagy inhibitory composition”, comprising a drug that suppresses Akt as an active ingredient”
  • the suppression of autophagy can be determined by the suppression of autophagy in cells compared to the case where the agent or composition of the present invention is not allowed to act.
  • the autophagy evaluation method is as described above.
  • “GST- ⁇ is suppressed” includes, for example, a state where GST- ⁇ is suppressed in a cell in which GST- ⁇ is expressed.
  • Such a state examples include a state in which a GST- ⁇ -expressing drug (for example, those described above) is administered to cells expressing GST- ⁇ . Whether or not GST- ⁇ is expressed in a certain cell is known in the literature or can be determined by actually detecting the expression of GST- ⁇ in the cell. The expression of GST- ⁇ can be detected using any known technique, including those already described above.
  • the present invention further includes a method for producing an agent or a composition for suppressing autophagy in a cell in which GST- ⁇ is suppressed, and a method for preparing GST- Use in the manufacture of an agent or composition for suppressing autophagy in cells in which ⁇ is suppressed, a drug for suppressing Akt used for suppressing autophagy in cells in which GST- ⁇ is suppressed, and an effective amount of Akt
  • the present invention also relates to a method for suppressing autophagy in cells in which GST- ⁇ is suppressed, comprising administering a drug that suppresses GST- ⁇ .
  • the agent or composition for suppressing autophagy according to the present invention is useful for treatment of a condition associated with the enhancement of autophagy in a situation where GST- ⁇ is suppressed.
  • a state include, but are not limited to, a state in which the expression and activity of GST- ⁇ are reduced, and a state in which a drug that suppresses the expression and activity of GST- ⁇ is administered.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for treating a condition associated with enhanced autophagy in a situation where GST- ⁇ is suppressed, comprising a drug that suppresses Akt as an active ingredient, and a drug that suppresses Akt.
  • a method for producing a pharmaceutical composition for treating a state associated with enhancement of autophagy in a situation where GST- ⁇ is suppressed including a step of blending, a situation where GST- ⁇ of a drug that suppresses Akt is suppressed
  • administering an effective amount of a drug that suppresses Akt to a subject in need thereof under conditions where GST- ⁇ is suppressed It also relates to a method of treating a condition associated with increased fuzzy.
  • the compounding amount of the active ingredient in the agent or composition of the present invention relating to suppression of autophagy may be an amount that achieves suppression of autophagy when the agent or composition is administered. In addition, an amount that does not cause adverse effects exceeding the benefits of administration is preferred. Such an amount is known or can be appropriately determined by an in vitro test using cultured cells, or a test in a model animal such as a mouse, rat, dog or pig. Such a test method is well known to those skilled in the art. Are known.
  • the suppression of autophagy can be evaluated by various known techniques, including those described above.
  • the amount of the active ingredient may vary depending on the dosage form of the agent or the composition.
  • the amount of the active ingredient blended in one unit of the composition may be a plurality of the amount of the active ingredient necessary for one administration. it can. Those skilled in the art can appropriately adjust the blending amount.
  • the drug and the compounding amount thereof in the production method or use of the above-mentioned agent or composition relating to suppression of autophagy are as described above.
  • Formulation of each drug can be performed according to any known technique.
  • any of the above methods for suppressing autophagy may be an in-vitro method or an in-vivo method.
  • the effective amount of the drug in the above method may be an amount that achieves a desired effect (that is, suppression of autophagy) in the administered cells.
  • a desired effect that is, suppression of autophagy
  • an amount that does not cause adverse effects exceeding the benefits of administration is preferred.
  • Such an amount is known or can be appropriately determined by an in vitro test using cultured cells or the like, and such a test method is well known to those skilled in the art. Achievement of the desired effect can be assessed by various known techniques including those described above.
  • the effective amount does not necessarily induce a desired effect on all cells of the cell population when the drug is administered to the cell population.
  • the effective amount is 1% or more, 2% or more, 3% or more, 4% or more, 5% or more, 6% or more, 8% or more, 10% or more, 12% or more, 15% of the cells in the cell population.
  • the amount may induce a desired effect to 20% or more, further 25% or more.
  • the active ingredient in the various agents, compositions, treatment methods, etc. of the present invention described in the present specification is a nucleic acid such as an RNAi molecule, a ribozyme, an antisense nucleic acid, a DNA / RNA chimeric polynucleotide, etc.
  • a nucleic acid such as an RNAi molecule, a ribozyme, an antisense nucleic acid, a DNA / RNA chimeric polynucleotide, etc.
  • the vector any known vector such as a plasmid vector, a phage vector, a phagemid vector, a cosmid vector, or a virus vector can be used.
  • the vector preferably includes at least a promoter that enhances the expression of the nucleic acid carried, and in this case, the nucleic acid is preferably operably linked to such a promoter.
  • Nucleic acid operably linked to a promoter means that the nucleic acid and the promoter are arranged so that the protein encoded by the nucleic acid is appropriately produced by the action of the promoter.
  • the vector may or may not be replicable in the host cell, and transcription of the gene may be performed outside or inside the nucleus of the host cell. In the latter case, the nucleic acid may be integrated into the genome of the host cell.
  • the active ingredient can also be supported on various non-viral lipids or protein carriers.
  • examples of such carriers include, but are not limited to, cholesterol, liposomes, antibody protomers, cyclodextrin nanoparticles, fusion peptides, aptamers, biodegradable polylactic acid copolymers, polymers, and the like, and increase the efficiency of incorporation into cells.
  • cationic liposomes and polymers for example, polyethyleneimine
  • polymers useful as such carriers include those described in US ⁇ ⁇ ⁇ 2008/0207553, US 2008/0312174, and the like.
  • the active ingredient may be combined with other optional ingredients as long as the effect of the active ingredient is not hindered.
  • optional components include other chemotherapeutic agents, pharmacologically acceptable carriers, excipients, diluents and the like.
  • the composition may be coated with an appropriate material such as an enteric coating or a time-disintegrating material. It may be incorporated.
  • compositions of the present invention described herein can be produced by various routes including both oral and parenteral, such as, without limitation, oral, intravenous, Intramuscular, subcutaneous, local, intratumoral, rectal, intraarterial, intraportal, intraventricular, transmucosal, transdermal, intranasal, intraperitoneal, intrapulmonary, intrauterine, etc. It may be formulated into a dosage form suitable for the administration route. Any known dosage form and formulation method can be adopted as appropriate (see, for example, Standard Pharmaceutical Sciences, Yoshiaki Watanabe, Nankodo, 2003, etc.).
  • dosage forms suitable for oral administration include, but are not limited to, powders, granules, tablets, capsules, solutions, suspensions, emulsions, gels, syrups, etc.
  • Suitable dosage forms include injections such as solution injections, suspension injections, emulsion injections, and injections prepared at the time of use.
  • Formulations for parenteral administration can be in the form of aqueous or non-aqueous isotonic sterile solutions or suspensions.
  • the various agents or compositions (including various pharmaceutical compositions) of the present invention described in the present specification may be targeted to specific tissues or cells. Targeting can be accomplished by any known technique. When intended for delivery to cancer, it is not limited, for example, passive by making the formulation 50 to 200 ⁇ m in diameter suitable for the expression of EPR (enhanced permeability and retention) effect, particularly 75 to 150 ⁇ m. Targeting, CD19, HER2, transferrin receptor, folate receptor, VIP receptor, EGFR (Torchilin, AAPS J.
  • RAAG10 (Special Table 2005-532050), PIPA (Special Table 2006-506071), ligands such as KID3 (special table 2007-529197), peptides having RGD motif or NGR motif, F3, LyP-1 (Ruoslahti et al., J Cell Biol. 2010; 188 (6): 759-68) can be used as a targeting agent.
  • ligands such as KID3 (special table 2007-529197), peptides having RGD motif or NGR motif, F3, LyP-1 (Ruoslahti et al., J Cell Biol. 2010; 188 (6): 759-68) can be used as a targeting agent.
  • carriers containing retinoids as targeting agents can also be used. In addition to the above-mentioned documents, such carriers are described in WO 2009/036368, WO ⁇ ⁇ 2010/014117, WO ⁇ ⁇ 2012/170952, and the like.
  • compositions of the present invention may be supplied in any form, but from the viewpoint of storage stability, for example, a form that can be prepared at the time of use, for example, Alternatively, it may be provided in a form that can be prepared by a doctor and / or pharmacist, nurse, or other paramedical at or near a medical site. Such a form is particularly useful when the agent or composition of the present invention contains components that are difficult to stably store, such as lipids, proteins, and nucleic acids.
  • the agent or composition of the present invention is provided as one or more containers containing at least one of the essential components thereof and is used before use, for example within 24 hours, preferably 3 Prepared within an hour and more preferably immediately before use.
  • reagents, solvents, dispensing devices and the like that are usually available at the place of preparation can be appropriately used.
  • the present invention provides a preparation kit for a composition
  • a preparation kit for a composition comprising one or more containers containing active ingredients that can be contained in the various agents or compositions of the present invention alone or in combination, and such a kit.
  • the necessary components of various agents or compositions provided in the form of may contain instructions describing how to prepare and administer the various agents or compositions of the present invention, such as instructions and electronic recording media such as CDs and DVDs. Good.
  • the kit of this invention may contain all the components for completing the various agents or compositions of this invention, it does not necessarily need to contain all the components. Therefore, the kit of the present invention may not contain reagents and solvents that are usually available at medical sites, experimental facilities, etc., such as sterile water, physiological saline, and glucose solution.
  • the effective amount in the various treatment methods of the present invention described in the present specification is, for example, an amount that reduces the symptoms of the disease, delays or stops the progression of the disease, and preferably suppresses the disease, or The amount to heal.
  • an amount that does not cause adverse effects exceeding the benefits of administration is preferred.
  • Such an amount can be appropriately determined by an in vitro test using cultured cells or the like and a test in a model animal such as a mouse, rat, dog or pig, and such a test method is well known to those skilled in the art. .
  • the dose of the drug used in the treatment method of the present invention is known to those skilled in the art, or can be appropriately determined by the above-described test or the like.
  • Administration routes include various routes including both oral and parenteral, such as oral, intravenous, intramuscular, subcutaneous, topical, intratumoral, rectal, intraarterial, intraportal, intraventricular, transmucosal, Routes such as transdermal, intranasal, intraperitoneal, intrapulmonary and intrauterine are included.
  • the frequency of administration varies depending on the properties of the agent and composition used and the conditions of the subject including the above, but for example, many times a day (ie, 2, 3, 4 or 5 times a day), 1 day a day Times, every few days (ie every 2, 3, 4, 5, 6, 7 days, etc.), every week, every few weeks (ie every 2, 3, 4 weeks, etc.).
  • the term “subject” means any living individual, preferably an animal, more preferably a mammal, more preferably a human individual.
  • a subject may be healthy or suffer from some disease, but when treatment of a specific disease is intended, typically the subject is suffering from such disease.
  • treatment as used herein also encompasses all types of medically acceptable prophylactic and / or therapeutic interventions intended to cure, temporarily ameliorate, or prevent disease. Shall.
  • the term “treatment” encompasses medically acceptable interventions for various purposes, including delaying or stopping the progression of a disease, regression or disappearance of a lesion, prevention of onset or prevention of recurrence, and the like.
  • Example 1 GST- ⁇ and Akt knockdown by siRNA 1 ⁇ 10 6 PANC-1 cells were seeded in a 10 cm dish, and 10% fetal bovine serum (FBS) and 5% L-glutamine were added. And cultured at Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640, Sigma) for 18 hours. Culture conditions were 37 ° C. and 5% CO 2 unless otherwise specified. Further, 1 ⁇ 10 6 A549 cells were seeded in a 10 cm petri dish and cultured for 18 hours in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, Sigma) supplemented with 10% FBS and 10% L-glutamine. Each medium was changed, and 2 hours later, 20-30% confluent PANC-1 or A549 cells were transfected with GST- ⁇ siRNA and / or Akt siRNA using Lipofectamine RNAiMAX (Life Technologies).
  • FBS fetal bovine serum
  • RPMI 1640 Roswell Park Memorial Institute 1640
  • a Lipofectamine / siRNA mixed solution for transfection was prepared as follows. First, a Lipofectamine solution in which 35 ⁇ L of Lipofectamine RNAiMAX and 965 ⁇ L of OPTI-MEM (Sigma) were mixed was prepared. Next, prepare a siRNA solution in which a predetermined amount of 10 ⁇ M siRNA is made up to 1 mL with OPTI-MEM (for example, when preparing a siRNA solution to be used at a final concentration of 30 nM, 36 ⁇ L of 10 ⁇ M siRNA and 964 ⁇ L of OPTI-MEM are used. This was mixed with the above lipofectamine solution and allowed to stand at room temperature for 15 minutes. The following siRNA was used.
  • Akt siRNA Akt siRNA I (Cell Signaling Technology, # 6211)
  • Control siRNA AllStars Neg. Control siRNA 1027281 (QIAGEN)
  • siRNA To optimize the concentration of siRNA, add GST- ⁇ siRNA or Akt siRNA at a final concentration of 10-50 nM to a petri dish containing PANC-1 cells or A549 cells substituted with 10 mL OPTI-MEM and at room temperature for 5 After time culture, the medium was replaced (PANC-1 cells were RPMI 1640 with 5% FBS, and A549 cells were DMEM with 10% FBS) and cultured for 2 hours. As a control, a control siRNA added at a final concentration of 30 nM was used. These cells were detached from a 10 cm petri dish by trypsin treatment, collected, and seeded at 1 ⁇ 10 5 cells in a 6 cm petri dish.
  • a Lipofectamine / siRNA mixed solution in which GST- ⁇ siRNA and Akt siRNA were mixed was added to each cell in the same manner as described above. Counted the number.
  • a control siRNA added at a final concentration of 30 nM was used.
  • the above Lipofectamine / siRNA mixed solution was prepared by mixing 36 ⁇ L of 10 ⁇ M GST- ⁇ siRNA, 36 ⁇ L of 10 ⁇ M Akt siRNA and 928 ⁇ L of OPTI-MEM as the siRNA solution. It was made with. From the results shown in FIGS. 3 and 4, it can be seen that when GST- ⁇ and Akt are both knocked down, the cell growth inhibitory effect is greater than when only one of them is knocked down.
  • Example 2 Concomitant use of GST- ⁇ siRNA and an Akt inhibitor Similar results can be obtained using a substance other than siRNA as an Akt inhibitor.
  • Akt Inhibitor VIII (Merck # 124018, 1, 3 -Dihydro-1- (1-((4- (6-phenyl-1H-imidazo [4,5-g] quinoxalin-7-yl) phenyl) methyl) -4-piperidinyl) -2H-benzimidazol-2-one ). It is known that Akt Inhibitor VIII binds to the Pleckstrin homology (PH) region of Akt to cause allosteric inhibition and does not inhibit Akt3 but selectively blocks phosphorylation and activation of Akt1 and Akt2.
  • Pleckstrin homology PH
  • PANC-1 cells were seeded in a 10 cm dish and cultured in RPMI 1640 supplemented with 10% FBS and 5% L-glutamine for 24 hours.
  • the medium was replaced with 10 mL of OPTI-MEM, and GST- ⁇ siRNA prepared in the same manner as in Example 1 was added to the petri dish at a final concentration of 50 nM.
  • the medium was replaced with RPMI 1640 supplemented with 5% FBS. And cultured for 2 hours.
  • Scramble siRNA added at the same concentration was used. Scramble siRNA having the following sequence was used (Hokkaido System Science).
  • Sense strand CGAUUCCGCUAGACCGGCUUCAUUGCAG (SEQ ID NO: 3)
  • Antisense strand GCAAUGAAGCCCGGUCUAGCGAAUCGAU (SEQ ID NO: 4)
  • Example 3 Suppression of autophagy by double knockdown of GST- ⁇ and Akt It was examined how autophagy is affected by double knockdown of GST- ⁇ and Akt.
  • 1 ⁇ 10 6 PANC-1 cells were seeded in a 10 cm dish and cultured in RPMI 1640 supplemented with 10% FBS and 5% L-glutamine for 24 hours.
  • the medium was replaced with 10 mL of OPTI-MEM, and GST- ⁇ siRNA, Akt siRNA, or a mixed solution of GST- ⁇ siRNA and Akt siRNA prepared in the same manner as in Example 1 was used so that each siRNA had a final concentration of 10 nM.
  • the culture medium was replaced with RPMI 1640 supplemented with 5% FBS and cultured for 3 days.
  • Lysis buffer is NP-40 Alternative, PROTEIN GRADE ® Detergent, 10% Solution, Sterile-Filtered (CALBIOCHEM) 100 ⁇ L, 1 M Tris-HCl (pH 7.5) 500 ⁇ L, 5 M NaCl 300 ⁇ L, 0.5 M EDTA 20 ⁇ L, sterile water 9 .08 ⁇ L was prepared by mixing.
  • the cell lysate was collected with a cell scraper and cooled on ice for 30 minutes. During this time, the mixture was mixed by inversion every 10 minutes.
  • the obtained solution was centrifuged at 15000 rpm at 4 ° C. for 15 minutes, and the supernatant was collected to obtain a cell extract.
  • This cell extract was subjected to Western blot analysis.
  • An anti-LC3B antibody (Sigma) was used as a primary antibody and reacted with the transfer membrane at 4 ° C. for 16 hours.
  • the LC3 molecule was detected using a chemiluminescent reagent after reacting with an HRP-labeled secondary antibody. Whether autophagy was induced was evaluated by shifting LC3 to type I (18 kDa) and type II (16 kDa). From the results shown in FIG. 6, it can be seen that autophagy induced by GST- ⁇ knockdown was suppressed almost completely by simultaneously knocking down Akt.

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Abstract

　本発明は、細胞において効果的にアポトーシスおよび／または増殖阻害を誘導するための組成物およびそれを用いる方法を提供することを目的とする。　本発明は、ＧＳＴ－πを抑制する薬物と、Ａｋｔを抑制する薬物とを活性成分として含む、アポトーシスを誘導するための剤、これを含む医薬組成物、これを用いたアポトーシスの異常に伴う疾患の処置方法等に関する。

Description

アポトーシス誘導剤
　本発明は、新規なアポトーシス誘導剤、細胞増殖抑制剤、オートファジー抑制剤、該アポトーシス誘導剤、細胞増殖抑制剤またはオートファジー抑制剤を含む医薬組成物、およびアポトーシス、細胞増殖またはオートファジーの異常に伴う疾患の新規な治療方法等に関する。
　がんは人類が直面している最も重要かつ厄介な疾患の１つであり、その治療のために多大な研究努力がなされている。がんは、遺伝子の突然変異やエピジェネティックな異常などにより、細胞が無制御に増殖する疾患である。がんにおける遺伝子異常としてはすでに数多くのものが報告されており（例えば、非特許文献１など）、その多くが、細胞の増殖、分化、生存に関するシグナル伝達に何らかの関連を有していると考えられている。また、かかる遺伝子異常により、正常な分子で構成される細胞内のシグナル伝達が異常を来し、これが特定のシグナルカスケードの活性化や不活性化をもたらし、最終的に細胞の異常増殖を引き起す一因となることもある。初期のがん治療は、細胞増殖自体の抑制に主眼がおかれていたが、かかる治療は生理的に正常に増殖する細胞の増殖をも抑制してしまうため、脱毛、消化器障害、骨髄抑制などの副作用を伴っていた。そこで、かかる副作用を抑えるため、がん特有の遺伝子異常や、シグナル伝達の異常を標的とした分子標的薬などの新たな発想に基づくがん治療薬の開発が進められている。
　グルタチオン包含を触媒する酵素の１つであるグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、特にＧＳＴ－π（glutathione S-transferase pi、ＧＳＴＰ１ともいう）の発現が、種々のがん細胞において増大しており、これが一部の抗がん剤に対する耐性の一因となっている可能性が指摘されている。実際、ＧＳＴ－πを過剰発現しており、薬物耐性を示すがん細胞系に、ＧＳＴ－πに対するアンチセンスＤＮＡやＧＳＴ－π阻害剤を作用させると、薬剤耐性が抑制されることが知られている（非特許文献２～４）。さらに、最近の報告では、ＧＳＴ－πを過剰発現するアンドロゲン非依存性前立腺がん細胞系にＧＳＴ－πに対するｓｉＲＮＡを作用させるとその増殖が抑制され、アポトーシスが増大することが報告されている（非特許文献５）。また、ＫＲＡＳに変異を有するがん細胞系にＧＳＴ－πに対するｓｉＲＮＡを作用させると、Ａｋｔの活性化が抑制され、オートファジーが増大するが、アポトーシスの誘導は中程度となることが報告されている（非特許文献６）。
　しかしながら、ＧＳＴ－πと細胞増殖やアポトーシスとの関係、ＧＳＴ－πの分子機構、種々の細胞内シグナル伝達におけるＧＳＴ－πの役割などについては未だ殆ど明らかにされていない。細胞内のシグナル伝達は極めて複雑であり、１つの分子が複数の分子の作用に影響を与えたり、逆に１つの分子が複数の分子から影響を受けたりすることがあるうえ、ある分子の作用を抑えても、他のシグナルカスケードが活性化され、期待どおりの効果が得られないことがままある。したがって、より優れた分子標的薬の開発には、複雑に絡み合った細胞のシグナル伝達機構の解明が必要だが、長年の研究によってもそのごく一部が解明されているに過ぎず、さらなる研究努力が求められている。
Futreal et al., Nat Rev Cancer. 2004;4(3):177-83 Takahashi and Niitsu, Gan To Kagaku Ryoho. 1994;21(7):945-51 Ban et al., Cancer Res. 1996;56(15):3577-82 Nakajima et al., J Pharmacol Exp Ther. 2003;306(3):861-9 Hokaiwado et al., Carcinogenesis. 2008;29(6):1134-8 Nishita et al., AACR 102nd Annual Meeting, Abstact No. 1065
　本発明は、細胞において効果的にアポトーシスおよび／または増殖阻害を誘導するための組成物およびそれを用いる方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、ＧＳＴ－πの分子機構を解明すべく鋭意研究を続ける中で、ＧＳＴ－πとＡｋｔの発現を同時に阻害すると、両者のいずれか一方のみの発現を阻害したときに比べ、細胞増殖がより強力に抑制され、細胞死もより強く誘導されることを見出すとともに、ＧＳＴ－πの発現阻害により誘導されたオートファジーが、Ａｋｔの発現を同時に阻害することにより顕著に抑制されることをさらに見出し、本発明を完成させるに至った。
　すなわち本発明は、以下に関する。
（１）ＧＳＴ－πを抑制する薬物と、Ａｋｔを抑制する薬物とを活性成分として含む、アポトーシスを誘導するための剤。
（２）ＧＳＴ－πを抑制する薬物と、Ａｋｔを抑制する薬物とを活性成分として含む、細胞増殖を抑制するための剤。
（３）Ａｋｔを抑制する薬物とを活性成分として含む、ＧＳＴ－πが抑制された細胞においてオートファジーを抑制するための剤。
（４）Ａｋｔを抑制する薬物とを活性成分として含む、ＧＳＴ－πを抑制する薬物によるアポトーシスの誘導および／または細胞増殖の抑制を増強するための剤。
（５）活性成分が、ＲＮＡｉ分子、リボザイム、アンチセンス核酸、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラポリヌクレオチドおよびこれらを発現するベクターからなる群から選択される、（１）～（４）のいずれかに記載の剤。
（６）（１）～（５）のいずれかに記載の剤を含む、医薬組成物。
（７）細胞の異常増殖に起因する疾患の治療用である、（６）に記載の医薬組成物。
（８）がんの治療用である、（６）に記載の医薬組成物。
　本発明のアポトーシス誘導剤は、従来のものと比較してより効果的にアポトーシスを誘導し、細胞増殖を抑制することができるため、医薬組成物として極めて有用である。特にがんの治療においては、がん細胞をアポトーシスにより死滅させることができるため、がんの進行を阻止するばかりでなく、がんを退縮させる効果も期待できる。
図１は、ＰＡＮＣ－１細胞におけるＧＳＴ－πまたはＡｋｔのノックダウンによる細胞増殖抑制効果を示したグラフである。 図２は、Ａ５４９細胞におけるＧＳＴ－πまたはＡｋｔのノックダウンによる細胞増殖抑制効果を示したグラフである。 図３は、ＰＡＮＣ－１細胞におけるＧＳＴ－πおよびＡｋｔのダブルノックダウンによる細胞増殖抑制効果を示したグラフである。 図４は、Ａ５４９細胞におけるＧＳＴ－πおよびＡｋｔのダブルノックダウンによる細胞増殖抑制効果を示したグラフである。 図５は、ＧＳＴ－π　ｓｉＲＮＡとＡｋｔ阻害剤との併用による細胞増殖抑制効果を示したグラフである。*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１。 図６は、ＧＳＴ－πおよびＡｋｔのダブルノックダウンによるオートファジーの抑制効果を示したグラフである。
　本発明は、ＧＳＴ－πを抑制する薬物と、Ａｋｔを抑制する薬物とを活性成分として含む、細胞増殖を抑制するための剤または組成物（以下、「細胞増殖抑制剤」または「細胞増殖抑制用組成物」ともいう）および、アポトーシスを誘導するための剤または組成物（以下、「アポトーシス誘導剤」または「アポトーシス誘導組成物」ともいう）に関する。
　本明細書で用いる場合、ＧＳＴ－πは、ＧＳＴＰ１遺伝子によりコードされる、グルタチオン抱合を触媒する酵素を指す。ＧＳＴ－πはヒトを含む種々の動物に存在し、その配列情報も公知である（例えば、ヒト：NP_000843（NM_000852）、ラット：NP_036709（NM_012577）、マウス：NP_038569（NM_013541）など。番号はＮＣＢＩデータベースのアクセッション番号を示し、括弧外はアミノ酸配列、括弧内は塩基配列の番号である）。
　本明細書で用いる場合、Ａｋｔは、Ａｋｔ遺伝子によりコードされる、ＰＨドメインを有するセリン／スレオニンキナーゼを指す。ＡｋｔにはＡｋｔ１～３の３種類のアイソタプが知られているが、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路に関連しているのはＡｋｔ１であるため、本明細書では、特に別記しない限りＡｋｔはＡｋｔ１を指すものとする。Ａｋｔはヒトを含む種々の動物に存在し、その配列情報も公知である（例えば、ヒト：NP_005154（NM_005163）など。番号はＮＣＢＩデータベースのアクセッション番号を示し、括弧外はアミノ酸配列、括弧内は塩基配列の番号である）。
　生物個体間には、タンパク質の生理学的機能を損なわない遺伝子配列やアミノ酸配列の変異が生じる可能性があるため、本発明におけるＧＳＴ－πもしくはＧＳＴＰ１遺伝子、または、ＡｋｔもしくはＡｋｔ遺伝子は、既知配列と同一の配列を有するタンパク質や核酸に限定されず、同配列に対し１個または２個以上、典型的には１個または数個、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個のアミノ酸または塩基が相違する配列を有するが、なお上記の公知のＧＳＴ－πまたはＡｋｔと同等の機能を有するものを含み得る。ＧＳＴ－πおよびＡｋｔの具体的機能については、後述のとおりである。
　なお、本明細書において、「本明細書で用いる場合」、「本明細書で用いる」、「本明細書において」、「本明細書に記載される」等の句は、特に別記しない限り、これに引続く記載が本明細書に記載された全ての発明に適用されることを意味するものとする。また、他に定義されない限り、本明細書で用いる全ての技術用語および科学用語は、当業者が通常理解しているものと同じ意味を有する。本明細書中で参照する全ての特許、公報および他の出版物は、その全体を本明細書に援用する。
　本明細書で用いる「ＧＳＴ－πを抑制する薬物」には、限定されずに、例えば、ＧＳＴ－πの産生および／または活性を抑制する薬物や、ＧＳＴ－πの分解および／または不活性化を促進する薬物などが含まれる。ＧＳＴ－πの産生を抑制する薬物としては、これに限定するものではないが、例えばＧＳＴ－πをコードするＤＮＡに対するＲＮＡｉ分子、リボザイム、アンチセンス核酸、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラポリヌクレオチドおよびこれらを発現するベクター等が挙げられる。
　ＧＳＴ－πの活性を抑制する薬物としては、これに限定するものではないが、例えば、ＧＳＴ－πに結合する物質、例えば、グルタチオン、グルタチオンアナログ（例えば、WO 95/08563、WO 96/40205、WO 99/54346、非特許文献４等に記載のもの）、ケトプロフェン（非特許文献２）、インドメタシン（Hall et al., Cancer Res. 1989;49(22):6265-8）、エタクリン酸、ピロプロスト（Tew et al., Cancer Res. 1988;48(13):3622-5）、抗ＧＳＴ－π抗体、ＧＳＴ－πのドミナントネガティブ変異体等が挙げられる。これらの薬物は市販されているか、公知の技術に基づいて適宜製造することができる。
　ＧＳＴ－πの産生または活性を抑制する薬物としては、特異性の高さや、副作用の可能性の低さから、ＧＳＴ－πをコードするＤＮＡに対するＲＮＡｉ分子、リボザイム、アンチセンス核酸、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラポリヌクレオチドおよびこれらを発現するベクターが好ましい。
　ＧＳＴ－πの抑制は、ＧＳＴ－π抑制剤を作用させなかった場合に比べ、細胞においてＧＳＴ－πの発現や活性が抑制されていることにより決定することができる。ＧＳＴ－πの発現は、既知の任意の手法、限定されずに、例えば、抗ＧＳＴ－π抗体を利用した免疫沈降法、ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ＩＲＡ、ＩＲＭＡ、ウェスタンブロッティング法、免疫組織化学法、免疫細胞化学法、フローサイトメトリー法、ＧＳＴ－πをコードする核酸もしくはそのユニークな断片または該核酸の転写産物（例えば、ｍＲＮＡ）もしくはスプライシング産物に特異的にハイブリダイズする核酸を利用した、種々のハイブリダイゼーション法、ノーザンブロット法、サザンブロット法、種々のＰＣＲ法などにより評価することができる。
　また、ＧＳＴ－πの活性は、ＧＳＴ－πの既知の活性、限定されずに、例えば、Ｒａｆ－１（特にリン酸化Ｒａｆ－１）や、ＥＧＦＲ（特にリン酸化ＥＧＦＲ）などのタンパク質との結合性などを、既知の任意の方法、例えば、免疫沈降法、ウェスタンブロッティング法、質量分析法、プルダウン法、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法などにより解析することによって評価することができる。
　本明細書で用いる「Ａｋｔを抑制する薬物」には、限定されずに、例えば、Ａｋｔの産生および／または活性を抑制する薬物や、Ａｋｔの分解および／または不活性化を促進する薬物などが含まれる。Ａｋｔの産生を抑制する薬物としては、これに限定するものではないが、例えばＡｋｔをコードするＤＮＡに対するＲＮＡｉ分子、リボザイム、アンチセンス核酸、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラポリヌクレオチドおよびこれらを発現するベクター等が挙げられる。
　Ａｋｔの活性を抑制する薬物としては、これに限定するものではないが、例えば、Ａｋｔに結合する物質、例えば、Merck Millipore社のAkt Inhibitor（Akt Inhibitor、Akt Inhibitor II～XIII）、MK-2206、Perifosine、GSK690693、AT7867、CCT128930、PHT-427、Palomid 529、PF-04691502、トリシビン、リン酸トリシリビン（NSC-280594）、A-674563、sc-221226、抗Ａｋｔ抗体、Ａｋｔのドミナントネガティブ変異体等が挙げられる。これらの薬物は市販されているか、公知の技術に基づいて適宜製造することができる。
　Ａｋｔの産生または活性を抑制する薬物としては、特異性の高さや、副作用の可能性の低さから、ＡｋｔをコードするＤＮＡに対するＲＮＡｉ分子、リボザイム、アンチセンス核酸、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラポリヌクレオチドおよびこれらを発現するベクターが好ましい。
　Ａｋｔの抑制は、Ａｋｔ抑制剤を作用させなかった場合に比べ、細胞においてＡｋｔの発現や活性が抑制されていることにより決定することができる。Ａｋｔの発現は、既知の任意の手法、限定されずに、例えば、抗Ａｋｔ抗体を利用した免疫沈降法、ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ＩＲＡ、ＩＲＭＡ、ウェスタンブロッティング法、免疫組織化学法、免疫細胞化学法、フローサイトメトリー法、Ａｋｔをコードする核酸もしくはそのユニークな断片または該核酸の転写産物（例えば、ｍＲＮＡ）もしくはスプライシング産物に特異的にハイブリダイズする核酸を利用した、種々のハイブリダイゼーション法、ノーザンブロット法、サザンブロット法、種々のＰＣＲ法などにより評価することができる。
　また、Ａｋｔの活性は、Ａｋｔの既知の活性、限定されずに、例えば、ｍＴＯＲなどのタンパク質との結合性などを、既知の任意の方法、例えば、免疫沈降法、ウェスタンブロッティング法、質量分析法、プルダウン法、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法などにより解析することによって評価することができる。
　本明細書で用いる場合、ＲＮＡｉ分子は、ＲＮＡ干渉をもたらす任意の分子を指し、限定されずに、ｓｉＲＮＡ（small interfering RNA）、ｍｉＲＮＡ（micro RNA)、ｓｈＲＮＡ（short hairpin RNA）、ｄｄＲＮＡ（DNA-directed RNA）、ｐｉＲＮＡ（Piwi-interacting RNA）、ｒａｓｉＲＮＡ（repeat associated siRNA）などの二重鎖ＲＮＡおよびこれらの改変体などを含む。これらのＲＮＡｉ分子は市販されているか、公知の配列情報などに基づいて設計、作製することが可能である。
　また、本明細書で用いる場合、アンチセンス核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ、またはこれらの複合物を含む。
　本明細書で用いる場合、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラポリヌクレオチドは、限定されずに、例えば、特開2003-219893に記載の、標的遺伝子の発現を阻害するＤＮＡとＲＮＡとからなる２本鎖ポリヌクレオチドを含む。
　ＧＳＴ－πを抑制する薬物とＡｋｔを抑制する薬物とは、単一の製剤に含まれていてもよいし、２個以上の製剤に別々に含まれていてもよい。後者の場合、各製剤は同時に投与されてもよいし、時間間隔をあけて投与されてもよい。時間間隔をあけて投与される場合、ＧＳＴ－πを抑制する薬物を含む製剤を、Ａｋｔを抑制する薬物を含む製剤の前に投与してもよいし、後に投与してもよい。
　本発明はまた、Ａｋｔを抑制する薬物を活性成分として含む、ＧＳＴ－πを抑制する薬物によるアポトーシスの誘導および／または細胞増殖の抑制を増強するための剤または組成物（以下、「アポトーシス誘導増強剤」、「細胞増殖抑制増強」、「アポトーシス誘導増強用組成物」または「細胞増殖抑制増強用組成物」ともいう）に関する。
　本発明の剤または組成物における活性成分の配合量は、剤または組成物が投与された場合に、アポトーシスが誘導および／または細胞増殖が抑制される量であってもよい。また、投与による利益を超える悪影響が生じない量が好ましい。かかる量は公知であるか、培養細胞などを用いたin vitro試験や、マウス、ラット、イヌまたはブタなどのモデル動物における試験により適宜決定することができ、このような試験法は当業者によく知られている。アポトーシスの誘導は、種々の既知の手法、例えば、ＤＮＡ断片化、アネキシンＶの細胞膜への結合、ミトコンドリア膜電位の変化、カスパーゼの活性化などのアポトーシス特有の現象の検出や、ＴＵＮＥＬ染色などにより評価することができる。また、細胞増殖の抑制は、種々の既知の手法、例えば、経時的な生細胞数の計数、腫瘍のサイズ、体積または重量の測定、ＤＮＡ合成量の測定、ＷＳＴ－１法、ＢｒｄＵ（ブロモデオキシウリジン）法、３Ｈチミジン取込み法、などにより評価することができる。活性成分の配合量は、剤や組成物の投薬態様によって変化し得る。例えば、１回の投与に複数の単位の組成物を用いる場合、組成物１単位に配合する有効成分の量は、１回の投与に必要な有効成分の量の複数分の１とすることができる。かかる配合量の調整は当業者が適宜行うことができる。
　本発明はまた、ＧＳＴ－πを抑制する薬物と、Ａｋｔを抑制する薬物とを活性成分として配合することを含む、アポトーシスを誘導するもしくは細胞増殖を抑制するための剤または組成物を製造する方法、ＧＳＴ－πを抑制する薬物およびＡｋｔを抑制する薬物の、アポトーシスを誘導するもしくは細胞増殖を抑制するための剤または組成物の製造への使用、アポトーシスの誘導もしくは細胞増殖の抑制に用いる、ＧＳＴ－πを抑制する薬物およびＡｋｔを抑制する薬物の組合わせ、ならびに、有効量のＧＳＴ－πを抑制する薬物およびＡｋｔを抑制する薬物を投与することを含む、アポトーシスを誘導するもしくは細胞増殖を抑制する方法に関する。
　本発明はまた、Ａｋｔを抑制する薬物を活性成分として配合することを含む、ＧＳＴ－πを抑制する薬物によるアポトーシスの誘導および／または細胞増殖の抑制を増強するための剤または組成物を製造する方法、Ａｋｔを抑制する薬物の、ＧＳＴ－πを抑制する薬物によるアポトーシスの誘導および／または細胞増殖の抑制を増強するための剤または組成物の製造への使用、ＧＳＴ－πを抑制する薬物によるアポトーシスの誘導および／または細胞増殖の抑制を増強するために用いるＡｋｔを抑制する薬物、ならびに、有効量のＡｋｔを抑制する薬物を投与することを含む、ＧＳＴ－πを抑制する薬物によるアポトーシスの誘導および／または細胞増殖の抑制を増強する方法に関する。
　上記製造方法または使用における薬物やその配合量については、既に上述したとおりである。各薬物の配合は、既知の任意の手法に従って行うことができる。
　上記アポトーシス誘導または細胞増殖抑制方法はいずれも、in vitroの方法であっても、in vivoの方法であってもよい。また、当該方法における薬物については既に上述したとおりであり、薬物の有効量は、投与した細胞においてアポトーシスが誘導される、または細胞増殖が抑制される量であってもよい。また、投与による利益を超える悪影響が生じない量が好ましい。かかる量は公知であるか、培養細胞などを用いたin vitro試験などにより適宜決定することができ、このような試験法は当業者によく知られている。アポトーシスの誘導または細胞増殖の抑制は、上述のものを含む種々の既知の手法により評価することができる。上記有効量は、薬物をある細胞集団に投与した場合に、必ずしも同細胞集団の全ての細胞にアポトーシスまたは増殖抑制をもたらすものでなくともよい。例えば、上記有効量は、細胞集団における細胞の１％以上、２％以上、３％以上、４％以上、５％以上、６％以上、８％以上、１０％以上、１２％以上、１５％以上、２０％以上、さらには２５％以上などにアポトーシスまたは増殖抑制をもたらす量であってよい。
　本発明のアポトーシス誘導および細胞増殖抑制剤は、細胞増殖に異常がある細胞などにおいても効果的にアポトーシスまたは増殖抑制を誘導できるものであり、医薬組成物の成分として有効である。したがって本発明の一側面には、本発明のアポトーシス誘導剤または細胞増殖抑制剤を含む医薬組成物が含まれる。
　本発明の医薬組成物は、特にアポトーシスに異常を有する疾患を処置するのに有効である。したがって、本発明の一態様は、上記アポトーシス誘導剤を含む、アポトーシスに異常を有する疾患を処置するための医薬組成物に関する。本明細書で用いる場合、アポトーシスに異常を有する疾患は、これに限定するものではないが、例えば細胞の異常増殖に起因する疾患、ＫＲＡＳの変異に起因する疾患、ＧＳＴ－πの過剰発現に起因する疾患などが含まれる。細胞の異常増殖に起因する疾患としては、限定されずに、例えば、良性または悪性腫瘍、過形成症、ケロイド、クッシング症候群、原発性アルドステロン症、紅板症、真性多血症、白板症、過形成瘢痕、扁平苔癬および黒子症などを含む。ＫＲＡＳの変異に起因する疾患としては、限定されずに、例えば、良性または悪性腫瘍（がん、悪性新生物ともいう）などを含む。ＧＳＴ－πの過剰発現に起因する疾患としては、限定されずに、例えば、良性または悪性腫瘍、特に薬剤耐性（例えば、メルファラン、シクロホスファミドなどのアルキル化剤、アドリアマイシンなどのアントラサイクリン系抗腫瘍性抗生物質、シスプラチンなどの白金錯体、エトポシドなどに対して耐性）の悪性腫瘍などを含む。本発明の一態様において、アポトーシスに異常を有する疾患はがんである。
　本発明におけるがんとしては、限定されずに、例えば、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、脂肪肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、血管肉腫、カポジ肉腫、リンパ管肉腫、滑膜肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫などの肉腫、脳腫瘍、頭頚部癌、乳癌、肺癌、食道癌、胃癌、十二指腸癌、虫垂癌、大腸癌、直腸癌、肝癌、膵癌、胆嚢癌、胆管癌、肛門癌、腎癌、尿管癌、膀胱癌、前立腺癌、陰茎癌、精巣癌、子宮癌、卵巣癌、外陰癌、膣癌、皮膚癌などの癌腫、さらには白血病や悪性リンパ腫などが挙げられる。なお、本発明では、「がん」は、上皮性悪性腫瘍および非上皮性悪性腫瘍を含む。本発明におけるがんは、身体の任意の部位、例えば、脳、頭頚部、胸部、四肢、肺、心臓、胸腺、食道、胃、小腸（十二指腸、空腸、回腸）、大腸（結腸、盲腸、虫垂、直腸）、肝臓、膵臓、胆嚢、肛門、腎、尿管、膀胱、前立腺、陰茎、精巣、子宮、卵巣、外陰、膣、皮膚、横紋筋、平滑筋、滑膜、軟骨、骨、甲状腺、副腎、腹膜、腸間膜、骨髄、血液、血管系、リンパ節等のリンパ系、リンパ液などに存在し得る。
　本発明の一態様において、がんは、上記で定義した変異型ＫＲＡＳを有するがん細胞を含む。本発明の一態様において、がんは、ホルモンまたは成長因子非依存性の増殖を示すがん細胞を含む。本発明の一態様において、がんは、ＧＳＴ－πの過剰発現を示すがん細胞を含む。本発明の一態様において、がんは、薬剤耐性である。本発明の一態様において、がんは、メルファラン、シクロホスファミドなどのアルキル化剤、アドリアマイシンなどのアントラサイクリン系抗腫瘍性抗生物質、シスプラチンなどの白金錯体、エトポシドからなる群から選択される薬剤に対して耐性を有する。本発明の一態様において、がんは、メルファラン、シクロホスファミド、アドリアマイシン、シスプラチン、エトポシドからなる群から選択される薬剤に対して耐性を有する。
　本発明はまた、ＧＳＴ－πを抑制する薬物およびＡｋｔを抑制する薬物とを活性成分としてを含む、アポトーシスに異常を有する疾患を処置する医薬組成物、ＧＳＴ－πを抑制する薬物およびＡｋｔを抑制する薬物とを活性成分として配合することを含む、アポトーシスに異常を有する疾患を処置する医薬組成物の製造方法、ＧＳＴ－πを抑制する薬物およびＡｋｔを抑制する薬物の、アポトーシスに異常を有する疾患を処置する医薬組成物を製造するための使用、アポトーシスに異常を有する疾患の処置に用いる、ＧＳＴ－πを抑制する薬物とＡｋｔを抑制する薬物との組合せ、ならびに、前記医薬組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、アポトーシスに異常を有する疾患を処置するための方法に関する。
　上記製造方法または使用における薬物や配合量、アポトーシスに異常を有する疾患については、既に上述したとおりである。また、各薬物の配合は、既知の任意の手法に従って行うことができる。
　本発明のアポトーシス誘導剤、細胞増殖阻害剤およびこれを含む組成物は、他の有効成分と併用してもよい。ここで、併用するとは、例えば、他の有効成分を別々の製剤として投与すること、および、他の有効成分を、少なくとも１種の他の薬剤との合剤として投与することなどを含む。別々の製剤として投与する場合には、他の有効成分を含む製剤を、他の製剤より前、他の製剤と同時、または、他の製剤より後に投与してもよい。
　かかる他の有効成分としては、対象となる疾患の処置に有効なものが挙げられる。例えば、処置する疾患ががんである場合は、抗がん剤を併用することができる。抗がん剤の例としては、例えば、イホスファミド、塩酸ニムスチン、シクロホスファミド、ダカルバジン、メルファラン、ラニムスチン等のアルキル化剤、塩酸ゲムシタビン、エノシタビン、シタラビン・オクホスファート、シタラビン製剤、テガフール・ウラシル、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤（例えば、ＴＳ－１）、ドキシフルリジン、ヒドロキシカルバミド、フルオロウラシル、メトトレキサート、メルカプトプリン等の代謝拮抗剤、塩酸イダルビシン、塩酸エピルビシン、塩酸ダウノルビシン、クエン酸ダウノルビシン、塩酸ドキソルビシン、塩酸ピラルビシン、塩酸ブレオマイシン、硫酸ペプロマイシン、塩酸ミトキサントロン、マイトマイシンＣ等の抗腫瘍性抗生物質、エトポシド、塩酸イリノテカン、酒石酸ビノレルビン、ドセタキセル水和物、パクリタキセル、硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンデシン、硫酸ビンブラスチン等のアルカロイド、アナストロゾール、クエン酸タモキシフェン、クエン酸トレミフェン、ビカルタミド、フルタミド、リン酸エストラムスチン等のホルモン療法剤、カルボプラチン、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、ネダプラチン等の白金錯体、サリドマイド、ネオバスタット、ベバシズマブ等の血管新生阻害剤、Ｌ－アスパラギナーゼなどを挙げることができる。
　他の有効成分の別の例としては、オートファジーを抑制する薬物が挙げられる。本明細書で用いる場合、オートファジーは、マクロオートファジー、ミクロオートファジー、シャペロン介在性オートファジー等を含み得るが、典型的にはマクロオートファジーを意味する。したがって、本発明における「オートファジー」なる用語は、特に別記しない限り「マクロオートファジー」を指すものとする。
　オートファジーは「自食」とも呼ばれる細胞内タンパク質分解機構の一つであり、細胞内におけるタンパク質の分解、リサイクルを担っている。オートファジーは、酵母や哺乳動物を含む広範な生物種でみられ、概ね（ａ）ＰＡＳ（phagophore assembly site）の形成、（ｂ）分解すべきタンパク質を取り囲むファゴフォア（隔離膜）の伸長および拡大と、これによる、分解すべきタンパク質を内包するオートファゴソームの形成、（ｃ）オートファゴソームとリソソームとの融合によるオートリソソームの形成、（ｄ）オートリソソーム内でのタンパク質の分解を含む一連のプロセスを伴う。
　上記（ａ）～（ｃ）のプロセスには特有のオートファジー関連因子が関与している。オートファジー関連因子は、当初酵母において研究がなされ、これまでにＡｔｇ１～２７を始め数多くのものが同定されているが（Klionsky et al., Dev Cell. 2003;5(4):539-45）、哺乳動物における研究も進み、ホモログが複数同定され、オートファジーのコア分子機構も明らかになりつつある（Yang and Klionsky, Curr Opin Cell Biol. 2010;22(2):124-31）。
　哺乳動物におけるオートファジーのコア分子機構に関与するオートファジー関連因子としては、例えば、ＰＡＳの形成に関与するＶＭＰ１、ＴＰ５３ＩＮＰ２、ｍＡｔｇ９、ＵＬＫ複合体（ＵＬＫ１、ＵＬＫ２、ｍＡｔｇ１３、ＦＩＰ２００から構成）、ＰＩ３Ｋ複合体（Ｂｅｃｌｉｎ１、ｈＶｐｓ３４、ｐ１５０、Ａｍｂｒａ１、Ａｔｇ１４Ｌから構成されるＡｔｇ１４Ｌ複合体、および、Ｂｅｃｌｉｎ１、ｈＶｐｓ３４、ｐ１５０、Ｂｉｆ－１、ＵＶＲＡＧから構成されるＵＶＲＡＧ複合体）、ファゴフォアの伸長に関与するＬＣ３－ＩＩ、Ａｔｇ１２－Ａｔｇ５－Ａｔｇ１６Ｌ複合体などが挙げられる。
　したがって、オートファジーを抑制する薬物としては、限定されずに、例えば、上記のものを含むオートファジー関連因子（関連因子が複合体の場合は、同複合体自体のみならず、これを構成する個々の成分を含む）の産生および／または活性を抑制する薬物や、オートファジー関連因子の分解および／または不活性化を促進する薬物等が挙げられる。オートファジー関連因子の産生を抑制する薬物としては、オートファジー関連因子をコードするＤＮＡに対するＲＮＡｉ分子、リボザイム、アンチセンス核酸、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラポリヌクレオチドおよびこれらを発現するベクター等が挙げられる。
　オートファジー関連因子の活性を抑制する薬物としては、これに限定するものではないが、例えば、ＰＩ３Ｋの阻害剤（例えば、ワートマニン等）、特にクラスＩＩＩＰＩ３Ｋの阻害剤（例えば、３－ＭＡ（３－メチルアデニン）等）、オートファゴソームとリソソームとの融合を阻害する物質（例えば、バフィロマイシンＡ１等）、オートリソソームにおけるタンパク質分解を阻害する物質（例えば、クロロキン、ロイペプチン等）、オートファジー関連因子に結合する物質（例えば、オートファジー関連因子に対する抗体など）、オートファジー関連因子のドミナントネガティブ変異体などが挙げられる。これらの薬物は市販されているか、公知の技術に基づいて適宜製造することができる。
　オートファジーを抑制する薬物としては、特異性の高さや、副作用の低さから、オートファジー関連因子をコードするＤＮＡに対するＲＮＡｉ分子、リボザイム、アンチセンス核酸、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラポリヌクレオチドおよびこれらを発現するベクターが好ましい。
　オートファジーの抑制は、本発明のオートファジー抑制剤を作用させなかった場合に比べ、細胞においてオートファジーが抑制されていることにより決定することができる。オートファジーの抑制は、既知の任意の手法、限定されずに、例えば、電子顕微鏡法によるオートファゴソームの検出、オートファジーマーカー（例えば、Ａｔｇ５、Ａｔｇ１２、ＬＣ３、特にＬＣ３－ＩＩなど）の検出などに基づいて評価することができる。ＬＣ３－ＩＩは、限定されずに、例えば、ＬＣ３－ＩＩに対する特異的抗体で検出してもよいし、試料を電気泳動などで分離した後、ＬＣ３－Ｉとは異なるバンドに分れたＬＣ３－ＩＩを、ＬＣ３－ＩＩまたはＬＣ３－ＩとＬＣ３－ＩＩの両方に反応する抗体を用いてウェスタンブロット法などにより検出することもできる。また、ＬＣ３－Ｉは細胞質内に散在する一方、ＬＣ３－ＩＩは隔離膜、オートファゴソーム、オートリソソームなどのオートファジー特有の構造に局在するため、ＬＣ３－ＩＩに反応する抗体（ＬＣ３－ＩとＬＣ３－ＩＩの両方に反応する抗体を含む）による免疫染色等で顕在化する、これらの構造を示す点状シグナルの存在や数をオートファジーの指標としてもよい。
　本発明はまた、Ａｋｔを抑制する薬物を活性成分として含む、ＧＳＴ－πが抑制された細胞においてオートファジーを抑制するための剤または組成物（「オートファジー抑制剤」または「オートファジー抑制組成物」ともいう）に関する。
　本発明において、オートファジーの抑制は、本発明の剤または組成物を作用させなかった場合に比べ、細胞においてオートファジーが抑制されていることにより決定することができる。オートファジーの評価手法については、上述のとおりである。
　本明細書で用いる場合、「ＧＳＴ－πが抑制された」とは、例えば、ＧＳＴ－πが発現している細胞において、ＧＳＴ－πが抑制されている状態を含む。かかる状態としては、例えば、ＧＳＴ－πが発現している細胞に、ＧＳＴ－πを抑制する薬物（例えば、上述のものなど）を投与した状態などが挙げられる。
　ある細胞においてＧＳＴ－πが発現しているか否かは、文献学的に知られているか、または、細胞におけるＧＳＴ－πの発現を実際に検出することにより決定することができる。ＧＳＴ－πの発現は、既に上述したものを含む、既知の任意の手法を用いて検出することができる。
　本発明はさらに、Ａｋｔを抑制する薬物を配合する工程を含む、ＧＳＴ－πが抑制された細胞においてオートファジーを抑制するための剤または組成物の製造方法、Ａｋｔを抑制する薬物の、ＧＳＴ－πが抑制された細胞においてオートファジーを抑制するための剤または組成物の製造への使用、ＧＳＴ－πが抑制された細胞におけるオートファジー抑制に用いるＡｋｔを抑制する薬物、ならびに、有効量のＡｋｔを抑制する薬物を投与することを含む、ＧＳＴ－πが抑制された細胞においてオートファジーを抑制する方法にも関する。
　本発明のオートファジーを抑制するための剤または組成物は、ＧＳＴ－πが抑制された状況下におけるオートファジーの亢進に伴う状態などの処置に有用である。かかる状態としては、限定されずに、例えば、ＧＳＴ－πの発現や活性が低下した状態、ＧＳＴ－πの発現や活性を抑制する薬物が投与された状態等が挙げられる。
　したがって、本発明はまた、Ａｋｔを抑制する薬物を活性成分として含む、ＧＳＴ－πが抑制された状況下におけるオートファジーの亢進に伴う状態を処置するための医薬組成物、Ａｋｔを抑制する薬物を配合する工程を含む、ＧＳＴ－πが抑制された状況下におけるオートファジーの亢進に伴う状態を処置するための医薬組成物の製造方法、Ａｋｔを抑制する薬物の、ＧＳＴ－πが抑制された状況下におけるオートファジーの亢進に伴う状態を処置するための医薬組成物の製造への使用、ＧＳＴ－πが抑制された状況下におけるオートファジーの亢進に伴う状態の処置に用いるＡｋｔを抑制する薬物、ならびに、有効量のＡｋｔを抑制する薬物を、それを必要とする対象に投与することを含む、ＧＳＴ－πが抑制された状況下におけるオートファジーの亢進に伴う状態を処置する方法にも関する。
　オートファジーの抑制に係る本発明の上記剤または組成物における活性成分の配合量は、当該剤または組成物が投与された場合に、オートファジーの抑制を達成する量であってもよい。また、投与による利益を超える悪影響が生じない量が好ましい。かかる量は公知であるか、培養細胞などを用いたin vitro試験や、マウス、ラット、イヌまたはブタなどのモデル動物における試験により適宜決定することができ、このような試験法は当業者によく知られている。オートファジーの抑制は、上述のものを含む、種々の既知の手法により評価することができる。活性成分の配合量は、剤や組成物の投薬態様によって変化し得る。例えば、１回の投与に複数の単位の組成物を用いる場合、組成物１単位に配合する有効成分の量は、１回の投与に必要な有効成分の量の複数分の１とすることができる。かかる配合量の調整は当業者が適宜行うことができる。
　オートファジーの抑制に係る上記剤または組成物の製造方法または使用における薬物やその配合量については、既に上述したとおりである。各薬物の配合は、既知の任意の手法に従って行うことができる。
　オートファジーの抑制に係る上記方法はいずれも、in vitroの方法であっても、in vivoの方法であってもよい。また、上記方法における薬物の有効量は、投与した細胞において所望の効果（すなわち、オートファジーの抑制）が達成される量であってもよい。また、投与による利益を超える悪影響が生じない量が好ましい。かかる量は公知であるか、培養細胞などを用いたin vitro試験などにより適宜決定することができ、このような試験法は当業者によく知られている。所望の効果の達成は、上述のものを含む種々の既知の手法により評価することができる。上記有効量は、薬物をある細胞集団に投与した場合に、必ずしも同細胞集団の全ての細胞に所望の効果を誘導するものでなくともよい。例えば、上記有効量は、細胞集団における細胞の１％以上、２％以上、３％以上、４％以上、５％以上、６％以上、８％以上、１０％以上、１２％以上、１５％以上、２０％以上、さらには２５％以上などに所望の効果を誘導する量であってよい。
　本明細書に記載される本発明の各種の剤や組成物、処置方法等における活性成分が核酸、例えば、ＲＮＡｉ分子、リボザイム、アンチセンス核酸、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラポリヌクレオチドなどである場合、これらは、裸の核酸としてそのまま利用することもできるが、種々のベクターに担持させることもできる。ベクターとしては、プラスミドベクター、ファージベクター、ファージミドベクター、コスミドベクター、ウイルスベクター等の公知の任意のものを利用することができる。ベクターは、担持する核酸の発現を増強するプロモーターを少なくとも含んでいることが好ましく、この場合、該核酸は、かかるプロモーターと作動可能に連結されていることが好ましい。核酸がプロモーターに作動可能に連結されているとは、プロモーターの作用により、該核酸のコードするタンパク質が適切に産生されるように、該核酸とプロモーターとが配置されていることを意味する。ベクターは、宿主細胞内で複製可能であってもなくてもよく、また、遺伝子の転写は宿主細胞の核外で行われても、核内で行われてもよい。後者の場合、核酸は宿主細胞のゲノムに組み込まれてもよい。
　また、有効成分は、種々の非ウイルス性脂質またはタンパク質担体に担持させることもできる。かかる担体としては、限定されずに、例えば、コレステロール、リポソーム、抗体プロトマー、シクロデキストリンナノ粒子、融合ペプチド、アプタマー、生分解性ポリ乳酸コポリマー、ポリマーなどが挙げられ、細胞内への取込み効率を高めることができる（例えば、Pirollo and Chang, Cancer Res. 2008;68(5):1247-50などを参照）。特に、カチオン性リポソームやポリマー（例えば、ポリエチレンイミンなど）が有用である。かかる担体として有用なポリマーのさらなる例としては、例えば、US 2008/0207553、US 2008/0312174等に記載のものなどが挙げられる。
　本明細書に記載される本発明の各種医薬組成物においては、活性成分の効果を妨げない限り、活性成分を他の任意成分と組み合わせてもよい。そのような任意成分としては、例えば、他の化学治療剤、薬理学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤等が挙げられる。また、投与経路や薬物放出様式などに応じて、上記組成物を、適切な材料、例えば、腸溶性のコーティングや、時限崩壊性の材料で被覆してもよく、また、適切な薬物放出システムに組み込んでもよい。
　本明細書に記載される本発明の各種剤および組成物（各種医薬組成物を含む）は、経口および非経口の両方を包含する種々の経路、例えば、限定することなく、経口、静脈内、筋肉内、皮下、局所、腫瘍内、直腸、動脈内、門脈内、心室内、経粘膜、経皮、鼻内、腹腔内、肺内および子宮内等の経路で投与してもよく、各投与経路に適した剤形に製剤してもよい。かかる剤形および製剤方法は任意の公知のものを適宜採用することができる（例えば、標準薬剤学、渡辺喜照ら編、南江堂、２００３年などを参照）。
　例えば、経口投与に適した剤形としては、限定することなく、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤、ゲル剤、シロップ剤などが挙げられ、また非経口投与に適した剤形としては、溶液性注射剤、懸濁性注射剤、乳濁性注射剤、用時調製型注射剤などの注射剤が挙げられる。非経口投与用製剤は、水性または非水性の等張性無菌溶液または懸濁液の形態であることができる。
　本明細書に記載される本発明の各種剤または組成物（各種医薬組成物を含む）は、特定の組織や細胞に標的化されていてもよい。標的化は、既知の任意の手法により達成することができる。がんへの送達を企図する場合は、限定されずに、例えば、製剤をＥＰＲ（enhanced permeability and retention）効果の発現に好適な直径５０～２００μｍ、特に７５～１５０μｍなどのサイズにすることによるパッシブターゲティングや、ＣＤ１９、ＨＥＲ２、トランスフェリン受容体、葉酸受容体、ＶＩＰ受容体、ＥＧＦＲ（Torchilin, AAPS J. 2007;9(2):E128-47）、ＲＡＡＧ１０（特表２００５－５３２０５０）、ＰＩＰＡ（特表２００６－５０６０７１）、ＫＩＤ３（特表２００７－５２９１９７）などのリガンドや、ＲＧＤモチーフやＮＧＲモチーフを有するペプチド、Ｆ３、ＬｙＰ－１（Ruoslahti et al., J Cell Biol. 2010;188(6):759-68）などを標的化剤として利用するアクティブターゲティングなどの手法を用いることができる。また、レチノイドまたはその誘導体ががん細胞への標的化剤として有用であることも知られているため（WO 2008/120815）、レチノイドを標的化剤として含む担体を利用することもできる。かかる担体は、上記文献のほか、WO 2009/036368、WO 2010/014117、WO 2012/170952などに記載されている。
　本明細書に記載される本発明の各種剤または組成物（各種医薬組成物を含む）はいずれの形態で供給されてもよいが、保存安定性の観点から、用時調製可能な形態、例えば、医療の現場あるいはその近傍において、医師および／または薬剤師、看護士、もしくはその他のパラメディカルなどによって調製され得る形態で提供してもよい。かかる形態は、本発明の剤または組成物が、脂質やタンパク質、核酸などの安定した保存が難しい成分を含むときに特に有用である。この場合、本発明の剤または組成物は、これらに必須の構成要素の少なくとも１つを含む１個または２個以上の容器として提供され、使用の前、例えば、２４時間前以内、好ましくは３時間前以内、そしてより好ましくは使用の直前に調製される。調製に際しては、調製する場所において通常入手可能な試薬、溶媒、調剤器具などを適宜使用することができる。
　したがって、本発明は、本発明の各種剤または組成物に含まれ得る活性成分を、単独でもしくは組み合わせて含む１個または２個以上の容器を含む組成物の調製キット、ならびに、そのようなキットの形で提供される各種剤または組成物の必要構成要素にも関する。本発明のキットは、上記のほか、本発明の各種剤または組成物の調製方法や投与方法などが記載された指示、例えば説明書や、ＣＤ、ＤＶＤ等の電子記録媒体等を含んでいてもよい。また、本発明のキットは、本発明の各種剤または組成物を完成するための構成要素の全てを含んでいてもよいが、必ずしも全ての構成要素を含んでいなくてもよい。したがって、本発明のキットは、医療現場や、実験施設などで通常入手可能な試薬や溶媒、例えば、無菌水や、生理食塩水、ブドウ糖溶液などを含んでいなくてもよい。
　本明細書に記載される本発明の各種処置方法における有効量とは、例えば、疾患の症状を低減し、または疾患の進行を遅延もしくは停止する量であり、好ましくは、疾患を抑制し、または治癒する量である。また、投与による利益を超える悪影響が生じない量が好ましい。かかる量は、培養細胞などを用いたin vitro試験や、マウス、ラット、イヌまたはブタなどのモデル動物における試験により適宜決定することができ、このような試験法は当業者によく知られている。また、本発明の処置方法に用いる薬物の用量は当業者に公知であるか、または、上記の試験等により適宜決定することができる。
　本明細書に記載される本発明の処置方法において投与する活性成分の具体的な用量は、処置を要する対象に関する種々の条件、例えば、症状の重篤度、対象の一般健康状態、年齢、体重、対象の性別、食事、投与の時期および頻度、併用している医薬、治療への反応性、剤形、および治療に対するコンプライアンスなどを考慮して決定され得る。
　投与経路としては、経口および非経口の両方を包含する種々の経路、例えば、経口、静脈内、筋肉内、皮下、局所、腫瘍内、直腸、動脈内、門脈内、心室内、経粘膜、経皮、鼻内、腹腔内、肺内および子宮内等の経路が含まれる。
　投与頻度は、用いる剤や組成物の性状や、上記のものを含む対象の条件によって異なるが、例えば、１日多数回（すなわち１日２、３、４回または５回以上）、１日１回、数日毎（すなわち２、３、４、５、６、７日毎など）、１週間毎、数週間毎（すなわち２、３、４週間毎など）であってもよい。
　本明細書で用いる場合、用語「対象」は、任意の生物個体を意味し、好ましくは動物、さらに好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒトの個体である。本発明において、対象は健常であっても、何らかの疾患に罹患していてもよいものとするが、特定の疾患の処置が企図される場合には、典型的にはかかる疾患に罹患しているか、罹患するリスクを有する対象を意味する。
　また、用語「処置」は、本明細書で用いる場合、疾患の治癒、一時的寛解または予防などを目的とする医学的に許容される全ての種類の予防的および／または治療的介入を包含するものとする。例えば、「処置」の用語は、疾患の進行の遅延または停止、病変の退縮または消失、発症の予防または再発の防止などを含む、種々の目的の医学的に許容される介入を包含する。
　本発明を以下の例でさらに詳細に説明するが、これらは例示に過ぎず、本発明を決して限定するものではない。
例１：ｓｉＲＮＡによるＧＳＴ－πおよびＡｋｔのノックダウン
　１×１０６個のＰＡＮＣ－１細胞を１０ｃｍシャーレに播種し、１０％ウシ胎児血清（Fetal bovine serum、FBS）と５％Ｌ－グルタミンを添加したRoswell Park Memorial Institute 1640（RPMI 1640、Sigma社）で１８時間培養した。培養条件は、特に別記しない限り３７℃、５％ＣＯ２で行った。また、１×１０６個のＡ５４９細胞を１０ｃｍシャーレに播種し、１０％ＦＢＳと１０％Ｌ－グルタミンを添加したDulbecco’s modified Eagle’s medium（DMEM、Sigma社）で１８時間培養した。培地をそれぞれ交換し、２時間後、２０～３０％コンフルエントになったＰＡＮＣ－１またはＡ５４９細胞にLipofectamine RNAiMAX（Life Technologies社）を用いて、ＧＳＴ－π　ｓｉＲＮＡおよび／またはＡｋｔ　ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした。
　トランスフェクション用のLipofectamine／ｓｉＲＮＡ混合溶液は以下のように作製した。まず、３５μＬのLipofectamine RNAiMAXと９６５μＬのOPTI-MEM（Sigma社）とを混合したLipofectamine溶液を調製した。次に、所定量の１０μＭ　ｓｉＲＮＡをOPTI-MEMで１ｍＬにメスアップしたｓｉＲＮＡ溶液を調製し（例えば、終濃度３０ｎＭの使用するｓｉＲＮＡ溶液を作製する場合、３６μＬの１０μＭ　ｓｉＲＮＡと９６４μＬのOPTI-MEMを混合した）、これを上記のlipofectamine溶液と混合し、１５分間室温で静置した。なお、ｓｉＲＮＡは以下のものを使用した。
ＧＳＴ－π　ｓｉＲＮＡ：
センス鎖：GGGAGGCAAGACCUUCAUUtt（配列番号１）
アンチセンス鎖：AAUGAAGGUCUUGCCUCCCtg（配列番号２）
（なお大文字はＲＮＡ、小文字はＤＮＡをそれぞれ意味する）
Ａｋｔ　ｓｉＲＮＡ：Akt siRNA I（Cell Signaling Technology社、#6211）
Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｓｉＲＮＡ：AllStars Neg. Control siRNA　1027281（QIAGEN社）
　ｓｉＲＮＡの濃度を最適化するため、ＧＳＴ－π　ｓｉＲＮＡまたはＡｋｔ　ｓｉＲＮＡを１０～５０ｎＭの終濃度で、１０ｍＬのＯＰＴＩ－ＭＥＭで置換したＰＡＮＣ－１細胞またはＡ５４９細胞を含むシャーレに添加し、室温で５時間培養後、培地を置換し（ＰＡＮＣ－１細胞は５％ＦＢＳ加ＲＰＭＩ　１６４０、Ａ５４９細胞は１０％ＦＢＳ加ＤＭＥＭ）、２時間培養した。コントロールとして、Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｓｉＲＮＡを３０ｎＭの終濃度で添加したものを使用した。これらの細胞をトリプシン処理で１０ｃｍシャーレから剥離、採取し、６ｃｍシャーレに１×１０５個ずつ播種し直した。その後、２４時間毎に、細胞をトリプシン処理でシャーレから剥離、採取し、細胞数をカウントした。トランスフェクションから４日後の結果を図１および２に示す。これらの結果から、各ｓｉＲＮＡによる細胞増殖阻害効果が３０ｎＭの終濃度でほぼプラトーに達することが分かる。
　ＧＳＴ－π　ｓｉＲＮＡおよびＡｋｔ　ｓｉＲＮＡを同時に作用させた場合の効果を検証するために、各細胞にＧＳＴ－π　ｓｉＲＮＡとＡｋｔ　ｓｉＲＮＡとを混合したLipofectamine／ｓｉＲＮＡ混合溶液を、上記と同様に添加し、細胞数をカウントした。コントロールとして、Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｓｉＲＮＡを３０ｎＭの終濃度で添加したものを使用した。なお、上記Lipofectamine／ｓｉＲＮＡ混合溶液は、ｓｉＲＮＡ溶液として、３６μＬの１０μＭ　ＧＳＴ－π　ｓｉＲＮＡと、３６μＬの１０μＭ　Ａｋｔ　ｓｉＲＮＡと、９２８μＬのOPTI-MEMとを混合したものを使用して、上記と同様の手法で作製した。図３および４に示す結果から、ＧＳＴ－πとＡｋｔを両方ともノックダウンすると、いずれか一方のみをノックダウンしたときよりも細胞増殖抑制効果は大きくなることがわかる。
　また、細胞の形態を観察すると、ＧＳＴ－πをノックダウンしたときには、肥大化して増殖しない細胞が２０～３０％程度みられた。特に、ＰＡＮＣ－１では、肥大化に加え、浮いている細胞（死細胞）も多く認められた。Ａｋｔをノックダウンしたときには、死細胞が多く認められた。ＧＳＴ－πとＡｋｔの両方をノックダウンすると、ＰＡＮＣ－１、Ａ５４９共に、いずれか一方をノックダウンしたときに比べ、死細胞数が増加した。これらの所見から、ＧＳＴ－πまたはＡｋｔのノックダウンによりアポトーシスが誘導され、両者をノックダウンすると、アポトーシスがより強く誘導されることが示唆された。
例２：ＧＳＴ－π　ｓｉＲＮＡとＡｋｔ阻害剤との併用
　Ａｋｔ阻害剤としてｓｉＲＮＡ以外の物質を用いても同様の結果が得られることを、小分子であるAkt Inhibitor VIII（Merck #124018、1,3-Dihydro-1-(1-((4-(6-phenyl-1H-imidazo[4,5-g]quinoxalin-7-yl)phenyl)methyl)-4-piperidinyl)-2H-benzimidazol-2-one）を使用して検討した。なお、Akt Inhibitor VIIIは、ＡｋｔのPleckstrin homology（ＰＨ）領域に結合してアロステリック阻害をもらたし、Ａｋｔ３は阻害しないが、Ａｋｔ１およびＡｋｔ２のリン酸化と活性化を選択的にブロックすることが知られている（Barnett, S.F., et al. 2005. Biochem. J. 385: 399-408、Lindsley, C.W., et al. 2005. Bioorg. Med. Chem. Lett. 15: 761-764、Zhao, Z., et al. 2005. Bioorg. Med. Chem. Lett. 15: 905-909）。
　１×１０６個のＰＡＮＣ－１細胞を１０ｃｍシャーレに播種し、１０％ＦＢＳと５％Ｌ－グルタミンを添加したＲＰＭＩ　１６４０で２４時間培養した。培地を１０ｍＬのＯＰＴＩ－ＭＥＭに置換し、例１と同様に調製したＧＳＴ－π　ｓｉＲＮＡを５０ｎＭの終濃度でシャーレに添加し、室温で５時間培養後、培地を５％ＦＢＳ加ＲＰＭＩ　１６４０に置換し、２時間培養した。コントロールとして、Ｓｃｒａｍｂｌｅ　ｓｉＲＮＡを同濃度で添加したものを使用した。Ｓｃｒａｍｂｌｅ　ｓｉＲＮＡは、以下の配列のものを使用した（北海道システムサイエンス社）。
センス鎖：ＣＧＡＵＵＣＧＣＵＡＧＡＣＣＧＧＣＵＵＣＡＵＵＧＣＡＧ（配列番号３）
アンチセンス鎖：ＧＣＡＡＵＧＡＡＧＣＣＧＧＵＣＵＡＧＣＧＡＡＵＣＧＡＵ（配列番号４）
これらの細胞をトリプシン処理で１０ｃｍシャーレから剥離、採取し、６ｃｍシャーレに１×１０５個ずつ播種し直し、Akt Inhibitor VIIIを１μＭの終濃度で添加した。その後、２４時間毎に、細胞をトリプシン処理でシャーレから剥離、採取し、細胞数をカウントした。検定にはBonferroni/Dunn法を用いた。結果を図５に示す。この結果から、Ａｋｔ阻害剤としてｓｉＲＮＡ以外の物質を用いても、ＧＳＴ－πとＡｋｔの両方の阻害により、ＧＳＴ－πおよびＡｋｔのいずれか一方を阻害した場合に比べ、細胞増殖抑制効果が増大することが分かる。
例３：ＧＳＴ－πおよびＡｋｔのダブルノックダウンによるオートファジーの抑制
　ＧＳＴ－πおよびＡｋｔのダブルノックダウンによりオートファジーがどのような影響を受けるかを検討した。
　１×１０６個のＰＡＮＣ－１細胞を１０ｃｍシャーレに播種し、１０％ＦＢＳと５％Ｌ－グルタミンを添加したＲＰＭＩ　１６４０で２４時間培養した。培地を１０ｍＬのＯＰＴＩ－ＭＥＭに置換し、例１と同様に調製したＧＳＴ－π　ｓｉＲＮＡ、Ａｋｔ　ｓｉＲＮＡ、またはＧＳＴ－π　ｓｉＲＮＡとＡｋｔ　ｓｉＲＮＡとの混合溶液を、各ｓｉＲＮＡが１０ｎＭの終濃度となるようにシャーレに添加し、室温で５時間培養後、培地を５％ＦＢＳ加ＲＰＭＩ　１６４０に置換し、３日間培養した。シャーレの細胞を氷冷ＰＢＳで洗った後、氷冷Lysis bufferを加え、細胞を破砕した。Lysis bufferはNP-40 Alternative, PROTEIN GRADE(R) Detergent, 10% Solution, Sterile-Filtered（CALBIOCHEM社）１００μＬ、１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）５００μＬ、５Ｍ　ＮａＣｌ３００μＬ、０．５Ｍ　ＥＤＴＡ２０μＬ、滅菌水９．０８μＬを混和して調製した。細胞破砕液をセルスクレイパーで集め、３０分氷冷した。この間１０分おきに転倒混和した。得られた溶液を１５０００ｒｐｍ、４℃で１５分遠心し、上清を採取し、細胞抽出液とした。この細胞抽出液をウェスタンブロット解析に供した。一次抗体として、抗ＬＣ３Ｂ抗体（Sigma社）を用いて、転写膜と４℃、１６時間反応させた。ＬＣ３分子の検出は、ＨＲＰ標識二次抗体と反応させた後、化学発光試薬を用いて行った。オートファジーが誘導されているかどうかは、ＬＣ３のＩ型（１８ｋＤａ）とＩＩ型（１６ｋＤａ）への移行で評価した。
　図６に示す結果から、ＧＳＴ－πのノックダウンにより誘導されたオートファジーが、Ａｋｔを同時にノックダウンすることによりほぼ完全に抑制されたことが分かる。

Claims (8)

  1. 　ＧＳＴ－πを抑制する薬物と、Ａｋｔを抑制する薬物とを活性成分として含む、アポトーシスを誘導するための剤。
  2. 　ＧＳＴ－πを抑制する薬物と、Ａｋｔを抑制する薬物とを活性成分として含む、細胞増殖を抑制するための剤。
  3. 　Ａｋｔを抑制する薬物とを活性成分として含む、ＧＳＴ－πが抑制された細胞においてオートファジーを抑制するための剤。
  4. 　Ａｋｔを抑制する薬物とを活性成分として含む、ＧＳＴ－πを抑制する薬物によるアポトーシスの誘導および／または細胞増殖の抑制を増強するための剤。
  5. 　活性成分が、ＲＮＡｉ分子、リボザイム、アンチセンス核酸、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラポリヌクレオチドおよびこれらを発現するベクターからなる群から選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載の剤。
  6. 　請求項１～５のいずれかに記載の剤を含む、医薬組成物。
  7. 　細胞の異常増殖に起因する疾患の治療用である、請求項６に記載の医薬組成物。
  8. 　がんの治療用である、請求項６に記載の医薬組成物。
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