WO2014079367A1 - 适于生物样品的分子印迹聚合物纳米颗粒及其制备方法 - Google Patents

适于生物样品的分子印迹聚合物纳米颗粒及其制备方法 Download PDF

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WO2014079367A1
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poly
acid
molecularly imprinted
chain transfer
imprinted polymer
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张会旗
马悦
张莹
潘国庆
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南开大学
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    • C08F2438/03—Use of a di- or tri-thiocarbonylthio compound, e.g. di- or tri-thioester, di- or tri-thiocarbamate, or a xanthate as chain transfer agent, e.g . Reversible Addition Fragmentation chain Transfer [RAFT] or Macromolecular Design via Interchange of Xanthates [MADIX]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2600/00—Assays involving molecular imprinted polymers/polymers created around a molecular template

Definitions

  • the present invention relates to a molecularly imprinted polymer nanoparticle and a method of preparing the same, and more particularly to a molecularly imprinted polymer nanoparticle having excellent recognition function for small organic molecules in biological samples, particularly pure biological samples, and
  • the preparation method relates specifically to a molecularly imprinted polymer nanoparticle having a hydrophilic polymer brush on its surface and a preparation method thereof.
  • Molecular imprinting is a simple and efficient method for preparing polymer acceptors with specific recognition sites (H. Zhang, L. Ye, K. Mosbach, J. Mol. Recognit. 2006, 19, 248-259 ).
  • MIPs Molecularly Imprinted Polymers obtained from them have attracted extensive attention due to their advantages of high selectivity, simple preparation process, heat resistance and chemical stability.
  • molecular imprinting technology has developed into a direct and efficient method for obtaining biomimetic synthetic receptors. Its greatest feature is its versatility, which means that molecularly imprinted polymers of various template molecules can be obtained without significantly changing the synthetic formulation.
  • the molecularly imprinted polymers produced by the above methods are micron-sized, and although they are suitable for ordinary aqueous solutions, they are not suitable for analysis of biological samples because molecules such as proteins in biological samples are rapidly adsorbed to the surface of the particles. Therefore, on the basis of the above work, the present inventors succeeded in realizing the preparation of a surface suitable for biological samples, particularly pure biological samples, by introducing a suitable hydrophilic macromolecular chain transfer agent into the RAFT precipitation polymerization system. The purpose of molecularly imprinted polymer nanoparticles with a hydrophilic polymer brush.
  • the present invention is directed to providing a molecularly imprinted polymer nanoparticle suitable for biological samples, particularly pure biological samples, and a preparation method thereof, to compensate for the deficiencies of the prior art, and ultimately to replace the natural molecularly imprinted polymer.
  • the receptor is laid and laid the foundation for practical use.
  • the technical idea of the present invention is to prepare a molecularly imprinted polymer nanoparticle having a hydrophilic polymer brush on the surface by introducing a suitable hydrophilic macromolecular chain transfer agent into a RAFT precipitation polymerization system, thereby obtaining a suitable biological organism.
  • Molecularly imprinted polymer of the sample is as follows: (1) The template molecule, functional monomer, and cross-linking agent are dosed in a suitable reaction solvent at a molar ratio of 1:1 to 10:4 to 80. The volume fraction of the functional monomer and the crosslinking agent in the system is 0.5 ⁇ 10%.
  • the chain transfer agent is composed of a small molecular chain transfer agent and a hydrophilic macromolecular chain transfer agent, wherein the small molecular chain transfer agent accounts for 0 to 95% by mole.
  • the reactor was sealed and placed in a 25-100 ° C oil bath for 1 to 100 hours, ultrasonically dispersed for 5 to 30 minutes, and centrifuged at high speed to obtain polymer nanoparticles containing template molecules.
  • the polymer nanoparticles containing the template molecule are firstly methanol/acetic acid (volume ratio is
  • the mixture of 10/0.1 ⁇ 10/10 was washed for 12 to 72 hours, and then washed with methanol for 12 to 48 hours until no template molecules were washed out. Then, it is dried under vacuum at 20 to 60 ° C to a constant weight to obtain molecularly imprinted polymer nanoparticles having a hydrophilic polymer brush on the surface.
  • the functional monomers used are: 4-vinylpyridine, 2-vinylpyridine, 4-vinylbenzoic acid, (meth)acrylic acid, trifluoromethylacrylic acid, 2-hydroxyethyl methacrylate, dimethyl methacrylate Aminoethyl ester, (methyl:) acrylamide, 2-acrylamido-2-methyl-1-propanesulfonic acid, 4-vinylimidazole, itaconic acid or N-vinylpyrrolidone.
  • the crosslinking agents used are: ethylene glycol dimethacrylate, trimethylolpropyl trimethacrylate, pentaerythritol triacrylate, divinylbenzene, N,N'-methylenebisacrylamide, N, N'-ethylbisacrylamide, N,N'-1,4-phenylbisacrylamide or 1,4-diacryloylpiperazine.
  • the initiator used is: an azo radical initiator, a peroxide radical initiator, or a redox initiator.
  • the small molecular chain transfer agent used is: a dithioester or a trithioester organic compound.
  • the macromolecular chain transfer agent used is: various hydrophilic polymers having a dithioester or a trithioester end group (including polyethylene glycol, poly N-isopropyl acrylamide, polymethacrylic acid 2- Hydroxyethyl ester, poly(:methyl:)acrylamide, poly N,N-dimethylacrylamide, polydimethylaminoethyl methacrylate, etc. :).
  • various hydrophilic polymers having a dithioester or a trithioester end group including polyethylene glycol, poly N-isopropyl acrylamide, polymethacrylic acid 2- Hydroxyethyl ester, poly(:methyl:)acrylamide, poly N,N-dimethylacrylamide, polydimethylaminoethyl methacrylate, etc. :).
  • the solvents used were: acetonitrile, acetonitrile / toluene, acetonitrile / tetrahydrofuran, acetonitrile / methanol, acetonitrile / B Alcohol, acetonitrile/propanol, acetonitrile/butanol, acetonitrile/pentanol, methanol, ethanol, propanol, butanol, pentanol, water, methanol/water, ethanol/water, propanol/water, butanol/water, Pentanol/water, butanone or paraffin oil.
  • the template molecules used are: propranolol, valproate, pentamidine, theophylline, caffeine, morphine, atenolol, paracetamol, ibuprofen, naproxen, salimidine, pentamidine, vitamins Latami, tramadol, dopamine, methyl salmeteridine, barbiturate, alfuzosin, zidovudine, statvadine, bupivacaine, mepivacaine, ro Picocaine, thalidomide, namontin, monosulfuron, nicotine, paclitaxel, vitamin B, vitamin B2, ephedrine, phenylalanine aniline, phenytoin, diazepam, dichlorhydrinamine, bromine Dichlorohydrinamine, bisphenol A, p-tert-butylphenol, p-nitrophenol, p-chlorophenol, benzopyrene, diphenyl phosphate, metsulfuron
  • the present invention provides a molecularly imprinted polymer nanoparticle having a hydrophilic polymer brush on the surface, characterized by a crosslinking degree of >50%, a particle diameter of 10 to 500 nm, preferably 10 to 300 nm. More preferably, it is 10 to 250 nm, and the nanoparticles are capable of recognizing biological samples, particularly pure biological samples.
  • RAFT Reversible addition-fragmentation chain transfer
  • the present invention provides a molecularly imprinted polymer nanoparticle having a hydrophilic polymeric brush on its surface, characterized in that the nanoparticle has a core portion formed by a network of crosslinked polymers and on the surface of the core portion a hydrophilic polymer brush having a cross-linking degree of >50%, a particle diameter of 10 to 500 nm, preferably 10 300 nm, more preferably 10 250 nm, and the core portion of the nanoparticle has A molecularly imprinted pore that identifies a template molecule in a biological sample, particularly a pure biological sample.
  • the nanoparticle has a narrow particle size distribution, and preferably the nanoparticle has a particle size distribution index measured by dynamic light scattering according to ISO 13321 of less than or equal to 0.6, preferably less than or equal to 0.5. It is preferably less than or equal to 0.4, preferably less than or equal to 0.3, preferably less than or equal to 0.2, preferably less than or equal to 0.1.
  • the reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT) precipitation polymerization for preparing the molecularly imprinted polymer nanoparticles of the present invention is in a hydrophilic macromolecular chain transfer agent and a small molecular chain transfer agent. Under the common induction.
  • the template molecule is selected from the group consisting of an amino acid, a biological receptor, a nucleic acid, a class, an immunosuppressive agent, a hormone, a heparin, an antibiotic, a vitamin, a pathological or disease state, a biomarker small molecule, a toxin, a killer Insecticides, herbicides, explosives, neurotoxic agents, endocrine disrupting compounds, nucleotides, nucleosides, oligonucleotides, metabolites, secondary metabolites, drug metabolites, drugs or pharmaceutical intermediates or small organic drugs
  • Molecules in particular the template molecules are selected from the group consisting of: propranolol, valproate, pentamidine, theophylline, caffeine, morphine, atenolol, paracetamol, ibuprofen, naproxen, salimidine, squirt He ⁇ , verapamil, tramadol, do
  • the monoolefin functional monomer is selected from the group consisting of ⁇ 2 - ⁇ 8 monoolefins, vinyl aromatic compounds, vinyl heteroaromatic compounds, monoethylenically unsaturated carboxylic acids and salts thereof , esters and amides, vinyl alcohols and their esters, allyl alcohols and their esters, vinyl ethers, vinyl lactams, vinyl halides, vinylidene halides, (methyl:) acrylic acid and its esters, salts , amide, vinyl pyridine compound and combinations thereof, preferably 4-vinylpyridine, 2-vinylpyridine, 4-vinylbenzoic acid, (methyl:)acrylic acid, trifluoromethylacrylic acid, 2-hydroxyethyl methacrylate Ester, dimethylaminoethyl methacrylate, (meth)acrylamide, 2-acrylamido-2-methyl-1-propanesulfonic acid, 4-vinylimidazole, itaconic acid or N-
  • the crosslinking agent is a monomer having two or more non-conjugated ethylenically unsaturated double bonds, preferably selected from the group consisting of: at least diol acrylates, methacrylic acid Ester, allyl ether or vinyl ether; vinyl ester of unsaturated monohydric alcohol or unsaturated monohydric alcohol and olefinic An ester of a saturated c 3 -c 6 carboxylic acid; an ester of an unsaturated carboxylic acid with a polyhydric alcohol; a linear or branched, linear or cyclic, aliphatic or aromatic hydrocarbon having at least two double bonds, in an aliphatic hydrocarbon In the case where the double bond is not conjugated; at least a bifunctional amine of acrylamide, methacrylamide and N-allylamine; and combinations thereof, more preferably ethylene glycol dimethacrylate, trimethyl Trimethylolpropyl acrylate, pentaerythritol triacrylate,
  • the hydrophilic macromolecular chain transfer agent is a hydrophilic polymer having a dithioester or a trithioester end group
  • the hydrophilic polymer is preferably selected from the group consisting of: polyalcohol , poly(lactam:), polyurethane, poly(methyl:)acrylic acid, polyacrylamide, polyvinyl alcohol, polyvinyl ether, polyester, polyvinylamine, polyethyleneimine, polyepoxyquinone, poly(carboxylate) Acid:), polyamide, polyanhydride, polyphosphazene, cellulose, heparin, dextran, peptides, fibrin and elastin, polysaccharides, hyaluronic acid, alginate, gelatin and chitin, albumin, Oligopeptides, short-chain peptides and oligonucleotides and copolymers obtained from monomers which give the above polymers, more preferably polyethylene glycol, poly-N
  • the chain transfer agent is preferably selected from the group consisting of: a dithioester or a trithioester organic compound, a thiocarbonylthio compound, for example: 1-pyrroledithiocarboxylic acid 2-cyanopropan-2-yl-ester, 1-pyrrole II 2-cyanobutan-2-yl thio
  • the template The molar ratio of the functional monomer to the crosslinking agent is 1:1 ⁇ 10:4 ⁇ 80, preferably 1:1 ⁇ 9:4 ⁇ 70, more preferably 1:1 ⁇ 8:4 ⁇ 50 Still more preferably from 1:1 to 6:4 to 10, still more preferably from 1:1 to 4:4 to 10.
  • the total amount of the monoolefin functional monomer and the crosslinking agent is The molar ratio of the chain transfer agent (including the optional small molecule chain transfer agent to the hydrophilic macromolecular chain transfer agent:) is from 500:1 to 10:1, preferably from 200:1 to 10:1, preferably 150:1. To 50:1, more preferably 120:1 to 80: 1.
  • small chain transfer in a chain transfer agent composed of a small molecular chain transfer agent and a hydrophilic macromolecular chain transfer agent
  • the molar percentage of the agent is 0-95%, preferably 1-85%, It is more preferably 10 to 75%, still more preferably 15 to 70%, still more preferably 20 to 60%.
  • the hydrophilic polymeric brush is formed from the macromolecular chain transfer agent.
  • the hydrophilic macromolecular chain transfer agent has a number average molecular weight of from 500 to 50,000, preferably from 1,000 to 30,000, more preferably from 1,500 to 8,000, still more preferably from 2,000 to 5,000.
  • the present invention provides a method of preparing a molecularly imprinted polymer nanoparticle having a hydrophilic polymeric brush on a surface according to the present invention, comprising the following steps:
  • the present invention provides a method of preparing a molecularly imprinted polymer nanoparticle having a hydrophilic polymeric brush on a surface according to the present invention, characterized by comprising the following steps:
  • the polymer nanoparticles containing the template molecules are first washed with a mixture of methanol/acetic acid (10/0.1 to 10/10 by volume) for 12 to 72 hours, and then washed with methanol for 12 to 48 hours until no template molecules are present. After washing out, it is dried under vacuum at 20 to 60 ° C to a constant weight to obtain molecularly imprinted polymer nanoparticles having a hydrophilic polymer brush on the surface.
  • preparation process by varying functional monomers, crosslinkers, initiators, small molecule chain transfer agents, macromolecular chain transfer agents, template molecules and solvent species Class and amount, preparing a series of molecularly imprinted polymer nanoparticles having molecular recognition function for different template molecules and having a hydrophilic polymer brush on the surface.
  • the initiator is an azo radical initiator, a peroxide radical initiator or a redox initiator, the azo radical
  • the initiator is preferably selected from the group consisting of: 2,2'-azobis(isobutyronitrile), 2,2'-azobis(isoheptonitrile), 2,2'-azobis(2-cyano-2- Ding), dimethyl 2,2'-azobis(methyl isobutyrate), 4,4'-azobis(4-cyanovaleric acid), 4,4'-azobis ( 4-cyano-pentan-1-ol), hydrazine, hydrazine-azobis(cyclohexanecarbonitrile), 2-(tert-butylazo)-2-cyanopropionide, 2,2'-azo double [2-Methyl-N-(l,l)-bis(hydroxymethyl)-2-hydroxyethyl]propanamide, 2,2'-azobis[2-methyl-N-hydroxyethyl] ]
  • the solvent used for the polymerization is acetonitrile, acetonitrile/toluene, acetonitrile/tetrahydrofuran, acetonitrile/methanol, acetonitrile/ethanol, acetonitrile/propanol, acetonitrile/butanol, acetonitrile/pentyl Alcohol, methanol, ethanol, propanol, butanol, pentanol, water, methanol/water, ethanol/water, Propyl alcohol/water, butanol/water, pentanol/water, toluene, tetrahydrofuran, N,N-dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, butanone or paraffin oil.
  • the reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT) precipitation polymerization is carried out under the mutual induction of a hydrophilic macromolecular chain transfer agent and a small molecular chain transfer agent.
  • the solvent, template molecule, monoolefin functional monomer, crosslinking agent, initiator, optional small molecule chain transfer agent, and hydrophilic macromolecule is as follows:
  • the molar ratio of the template molecule, the monoolefin functional monomer to the crosslinking agent is from 1:1 to 10:4 to 80, preferably from 1:1 to 9:4 to 70, more preferably from 1:1 to 8: 4 ⁇ 50, still more preferably 1:1 ⁇ 6:4 ⁇ 10, still more preferably
  • the volume fraction of the monoolefin functional monomer and the crosslinking agent in the system is 0.5 to 10%;
  • the initiator dose is 0.5-10% of the total amount of the monoolefin functional monomer and the crosslinking agent, and the initiator and the chain transfer agent (including the optional small molecular chain transfer agent and the hydrophilic macromolecular chain transfer agent: a molar ratio of 1: 1-20; and 3) in a chain transfer agent composed of a small molecular chain transfer agent and a hydrophilic macromolecular chain transfer agent, the small molecular chain transfer agent accounts for 0 to 95% by mole. It is preferably from 1 to 85%, more preferably from 10 to 75%, still more preferably from 15 to 70%, still more preferably from 20 to 60%.
  • the present invention provides molecularly imprinted polymer nanoparticles having a hydrophilic polymer brush on the surface prepared according to the present invention or prepared by the method according to the present invention, in biological sample analysis, medical clinical immunoassay, food and environment Use in monitoring and/or biomimetic sensor manufacturing.
  • the invention provides a kit comprising molecularly imprinted polymer nanoparticles having a hydrophilic polymeric brush in accordance with the invention or prepared by the method according to the invention.
  • the invention provides a sensor for a biological sample comprising molecularly imprinted polymer nanoparticles according to the invention or having a hydrophilic polymeric brush having a surface prepared by the method according to the invention.
  • MIP Molecularly imprinted polymer
  • M N , NMR 4800
  • CP Selective Adsorption of Non-imprinted Polymer
  • D and POAc concentrations of D and POAc were both 0.02 mM
  • concentrations of MIP and CP were both 12 mg/mL; Figure 8.
  • Molecularly imprinted polymer nanoparticles (propranol-MIP-2, solid symbol:) and its non-imprinted polymer nanoparticles (propranol-CP-2, open symbols) in pure milk (squares) with pure bovine serum (diamonds) :)
  • Adsorption performance of propranolol (adsorption temperature is 25 °C, propranolol concentration is 0.05 mM:).
  • a "pure biological sample” refers to a sample (such as serum, milk, urine, etc.) rich in a biological matrix such as protein.
  • biological sample includes a plurality of sample types obtained from a subject and useful in the present invention.
  • Biological samples can include, but are not limited to, solid tissue samples, liquid tissue samples, biological fluids, aspirate, cells, and cell fragments.
  • Specific examples of biological samples include, but are not limited to, solid tissue samples obtained by surgical removal, pathological samples, archived samples, or biopsy samples, tissue cultures or cells obtained therefrom, and progeny of the cells, and from these sources Any of the prepared sections or smears.
  • Non-limiting examples of biological samples include samples obtained from breast tissue, lymph nodes, and breast tumors.
  • Biological samples also include any material obtained from the vertebrate body, including but not limited to: blood, cerebrospinal fluid, serum, plasma, urine, nipple aspirate, fine needle aspirate, tissue lavage fluid such as ductal lavage, Saliva, sputum, ascites fluid, liver, kidney, breast, bone, bone marrow, testis, brain, ovary, skin, lung, prostate, thyroid, pancreas, cervix, stomach, intestine, colorectal, brain, bladder, colon, nostrils, Liquid samples of uterus, semen, lymph, vaginal mixture, synovial fluid, spinal fluid, head and neck, nasopharyngeal tumor, amniotic fluid, breast milk, pulmonary sputum or pulmonary surfactant, urine, feces and other biological origins.
  • molecularly imprinted polymer nanoparticles refers to a polymer having a particle size on the order of ten to several hundred nanometers comprising a hole (or gap:) corresponding at least partially to one or more template molecules. Wherein the template molecule has been incorporated into the monomer matrix comprising the crosslinking monomer prior to polymerization. Polymerized product The polymer includes a plurality of voids corresponding to the shape of the template molecule.
  • RAFT reversible addition-cleavage chain transfer
  • precipitation polymerization as used in the present invention is one of "active" I controlled radical polymerization (CRP).
  • a dithioester or a trithioester derivative is usually added as a chain transfer reagent.
  • it forms a dormant intermediate with the growing chain free radicals, which limits the irreversible double-base termination side reaction between the growing chain radicals, so that the polymerization reaction can be effectively controlled.
  • This dormant intermediate can be cleaved by itself, releasing new active free radicals from the corresponding sulfur atom, forming a growing chain in combination with the monomer, and the rate of addition or cleavage is much faster than the rate of chain growth.
  • the ester or trithioester derivative rapidly shifts between the living radical and the dormant radical, narrowing the molecular weight distribution, thereby allowing the polymerization to exhibit a controllable/"active" character.
  • particle size distribution refers to the proportion of particles of different particle sizes in a certain particle group, which is also referred to as the degree of dispersion of the particles.
  • degree of crosslinking as used in the present invention means the ratio of the amount of crosslinking agent typed in the polymer to the total amount of the crosslinking agent and the functional monomer.
  • the degree of crosslinking of the molecularly imprinted polymer nanoparticles having a hydrophilic polymer brush on the surface according to the present invention is measured in accordance with ASTM D 2765.
  • the molecularly imprinted polymer according to the present invention has a degree of crosslinking greater than 50%, preferably greater than 60%, more preferably greater than 70%, still more preferably greater than 80%.
  • the following examples are merely illustrative of the embodiments of the invention and are not to be construed as limiting the invention in any way.
  • the molecularly imprinted polymer nanoparticles have a particle size of 11 nm (DLS, methanol solvent, the same below) and a degree of crosslinking of 75%.
  • Example 2 0.83 mmol of 2,4-D was placed in a 100 mL round bottom flask containing 60 mL of methanol/water (4:1, volume/volume), and the magnetron was stirred to completely dissolve, then 0.83 mmol of 4 was added.
  • - vinylpyridine 0.83 mmol of 2,4-D was placed in a 100 mL round bottom flask containing 60 mL of methanol/water (4:1, volume/volume), and the magnetron was stirred to completely dissolve, then 0.83 mmol of 4
  • the molecularly imprinted polymerization had a particle size of 147 nm and a degree of crosslinking of 75%.
  • reaction system After deaeration for 30 min with argon gas, the reaction system was sealed, placed in a 60 ° C constant temperature oil bath, reacted for 24 h, and centrifuged at high speed to obtain the reaction product.
  • the reaction product was washed with methanol/acetic acid (9:1, vol/vol:) with methanol until no template molecules were eluted. After drying, it was vacuum dried at 40 °C for 48 h to obtain molecularly imprinted polymer nanoparticles with hydrophilic poly(2-hydroxyethyl methacrylate) polymer brush on the surface (ie, the molecularly imprinted by propranolol-MIP-1).
  • the polymer nanoparticles have a particle size of 220 nm and a cross-linking degree of 75%.
  • Non-imprinted polymer nanoparticles with a hydrophilic poly(2-hydroxyethyl methacrylate) polymer brush on the surface ie, the propranolol-CP-1
  • the preparation was the same as above except that no template molecule was added.
  • Example 4 0.83 mmol of propranol was added to a 100 mL round bottom flask containing 60 mL of acetonitrile/methanol (2:1, volume/volume), magneto Stir it to dissolve completely, then add 0.83 mmol of methacrylic acid.
  • Example 5 0.83 mmol of 2,4-D was added to a 100 mL round bottom flask containing 60 mL of methanol/water (4:1, volume/volume), and the magnetron was stirred to completely dissolve, and then 0.83 mmol of 4 was added.
  • the reaction system was sealed after argon gas removal for 30 min, and placed in a constant temperature oil bath at 60 ° C. 10 h, high speed centrifugation to obtain the reaction product.
  • the molecularly imprinted polymer nanoparticles have a particle size of 180 nm and a degree of crosslinking of 80%.
  • Example 6 Molecularly imprinted polymer nanoparticles having a hydrophilic polymer brush on the surface according to the present invention were prepared in the same manner as in Example 5 except that the molar ratio of the template molecule to the functional monomer was 1:10. The molecularly imprinted polymer nanoparticles have a particle size of 215 nm and a degree of crosslinking of 80%.
  • Example 7 Molecularly imprinted polymer nanoparticles having a hydrophilic polymer brush on the surface according to the present invention were prepared in the same manner as in Example 5 except that the molar ratio of the template molecule to the functional monomer was 1:5.
  • the molecularly imprinted polymer nanoparticles have a particle size of 195 nm and a degree of crosslinking of 80%.
  • Example 8 Molecularly imprinted polymer nanoparticles having a hydrophilic polymer brush on the surface according to the present invention were prepared in the same manner as in Example 5 except that the molar ratio of the functional monomer to the crosslinking agent was 1:80. .
  • the molecularly imprinted polymer nanoparticles have a particle size of 850 nm and a degree of crosslinking of -9.88%.
  • Example 9 Molecularly imprinted polymer nanoparticles having a hydrophilic polymer brush on the surface according to the present invention were prepared in the same manner as in Example 5 except that the molar ratio of the functional monomer to the crosslinking agent was 1:40. .
  • the molecularly imprinted polymer nanoparticles had a particle size of 480 nm and a degree of crosslinking of 97.6%.
  • Example 10 The surface of the present invention having a hydrophilic polymer brush was prepared in the same manner as in Example 5.
  • Molecularly imprinted polymer nanoparticles differ only in that the molar ratio of functional monomer to crosslinker is 1:20.
  • the molecularly imprinted polymer nanoparticles have a particle size of 384 nm and a degree of crosslinking of 95.2%.
  • Example 11 Molecularly imprinted polymer nanoparticles having a hydrophilic polymer brush on the surface according to the present invention were prepared in the same manner as in Example 5 except that the molar ratio of the functional monomer to the crosslinking agent was 1:60. .
  • the molecularly imprinted polymer nanoparticles had a particle size of 620 nm and a degree of crosslinking of 98.4%.
  • Example 12 Molecularly imprinted polymer nanoparticles having a hydrophilic polymer brush on the surface according to the present invention were prepared in the same manner as in Example 5 except that the molar ratio of the initiator to the functional monomer and the crosslinking agent was 0.5: 100.
  • the molecularly imprinted polymer nanoparticles have a particle size of 240 nm and a degree of crosslinking of 80%.
  • Example 13 Molecularly imprinted polymer nanoparticles having a hydrophilic polymer brush on the surface according to the present invention were prepared in the same manner as in Example 5 except that the molar ratio of the initiator to the functional monomer and the crosslinking agent was 5: 100.
  • the molecularly imprinted polymer nanoparticles have a particle size of 130 nm and a degree of crosslinking of 80%.
  • Example 14 Molecularly imprinted polymer nanoparticles having a hydrophilic polymer brush on the surface according to the present invention were prepared in the same manner as in Example 5 except that the molar ratio of the initiator to the functional monomer and the crosslinking agent was 10: 100. The molecularly imprinted polymer nanoparticles have a particle size of 100 nm and a degree of crosslinking of 80%.
  • Example 15 Molecularly imprinted polymer nanoparticles having a hydrophilic polymer brush on the surface according to the present invention were prepared in the same manner as in Example 5 except that the reaction system contained only hydrophilic macromolecular chains. Transfer agent. The molecularly imprinted polymer nanoparticles have a particle size of 106 nm and a degree of crosslinking of 80%.
  • Example 16 Molecularly imprinted polymer nanoparticles having a hydrophilic polymer brush on the surface according to the present invention were prepared in the same manner as in Example 5 except that the molar ratio of the initiator to the chain transfer agent was 1:1. The molecularly imprinted polymer nanoparticles have a particle size of 220 nm and a degree of crosslinking of 80%.
  • Example 17 Molecularly imprinted polymer nanoparticles having a hydrophilic polymer brush on the surface according to the present invention were prepared in the same manner as in Example 5 except that the molar ratio of the initiator to the chain transfer agent was 1:20. The molecularly imprinted polymer nanoparticles have a particle size of 137 nm and a degree of crosslinking of 80%.
  • Example 18 Molecularly imprinted polymer nanoparticles having a hydrophilic polymer brush on the surface according to the present invention were prepared in the same manner as in Example 5 except that the molar ratio of the hair to the chain transfer agent was 1: 10. The molecularly imprinted polymer nanoparticles have a particle size of 145 nm and a degree of crosslinking of 80%.
  • Example 19 Molecularly imprinted polymer nanoparticles having a hydrophilic polymer brush on the surface according to the present invention were prepared in the same manner as in Example 5 except that the molar ratio of the initiator to the chain transfer agent was 1:1. The molecularly imprinted polymer nanoparticles have a particle size of 150 nm and a degree of crosslinking of 80%.
  • Example 20 Molecularly imprinted polymer nanoparticles having a hydrophilic polymer brush on the surface according to the present invention were prepared in the same manner as in Example 5 except that the small molecular chain transfer agent accounted for 95% of the total amount of the chain transfer agent.
  • the molecularly imprinted polymer nanoparticles have a particle size of 450 nm and a degree of crosslinking of 80%.
  • Molecularly imprinted polymer nanoparticles having a hydrophilic polymer brush on the surface according to the present invention were prepared in the same manner as in Example 5 except that the small molecular chain transfer agent accounted for 50% of the total amount of the chain transfer agent.
  • the imprinted polymer nanoparticles had a particle size of 104 nm and a degree of crosslinking of 80%.
  • Example 22 Molecularly imprinted polymer nanoparticles having a hydrophilic polymer brush on the surface according to the present invention were prepared in the same manner as in Example 5 except that the template molecule was paraquat.
  • the molecularly imprinted polymer nanoparticles have a particle size of 169 nm and a degree of crosslinking of 80%.
  • Example 23 Molecularly imprinted polymer nanoparticles having a hydrophilic polymer brush on the surface according to the present invention were prepared in the same manner as in Example 5 except that the functional monomer was itaconic acid. The molecularly imprinted polymer nanoparticles have a particle size of 180 nm and a degree of crosslinking of 80%.
  • Example 24 Molecularly imprinted polymer nanoparticles having a hydrophilic polymer brush on the surface according to the present invention were prepared in the same manner as in Example 5 except that the functional monomer was N-vinylpyrrolidone.
  • the molecularly imprinted polymer nanoparticles have a particle size of 120 nm and a degree of crosslinking of 80%.
  • Example 25 Molecularly imprinted polymer nanoparticles having a hydrophilic polymer brush on the surface according to the present invention were prepared in the same manner as in Example 5 except that the crosslinking agent was trimethylolpropyl trimethacrylate. .
  • the molecularly imprinted polymer nanoparticles have a particle size of 208 nm and a degree of crosslinking of 80%.
  • Example 26 Molecularly imprinted polymer nanoparticles having a hydrophilic polymer brush on the surface according to the present invention were prepared in the same manner as in Example 5 except that the crosslinking agent was divinylbenzene.
  • the molecularly imprinted polymer nanoparticles have a particle size of 174 nm and a degree of crosslinking of 80%.
  • Example 27 Molecularly imprinted polymer nanoparticles having a hydrophilic polymer brush on the surface according to the present invention were prepared in the same manner as in Example 5 except that the hydrophilic macromolecular chain transfer agent was polyethylene glycol and The solvent was a mixture of N,N-dimethylformamide and acetonitrile 4:1, volume/volume. The molecularly imprinted polymer nanoparticles have a particle size of 370 nm and a degree of crosslinking of 80%.
  • Example 28 Molecularly imprinted polymer nanoparticles having a hydrophilic polymer brush on the surface according to the present invention were prepared in the same manner as in Example 5 except that the hydrophilic macromolecular chain transfer agent was poly N-isopropyl Acrylamide and the solvent is a mixture of N,N-dimethylformamide and acetonitrile (4:1, volume/volume:).
  • the molecularly imprinted polymer nanoparticles have a particle size of 480 nm and a degree of crosslinking of 80%.
  • Example 29 Molecularly imprinted polymer nanoparticles having a hydrophilic polymer brush on the surface according to the present invention were prepared in the same manner as in Example 5 except that the small molecular chain transfer agent was x-ethyl sulphate 0-ethyl S. -(2-ethoxycarbonylpropan-2-yl ester:). The molecularly imprinted polymer nanoparticles have a particle size of 500 nm and a degree of crosslinking of 80%.
  • Example 30 Molecularly imprinted polymer nanoparticles having a hydrophilic polymer brush on the surface according to the present invention were prepared in the same manner as in Example 5 except that the solvent was methyl ethyl ketone.
  • the molecularly imprinted polymer nanoparticles have a particle size of 450 nm and a degree of crosslinking of 80%. As shown in Figures 2, 4 and 5, molecularly imprinted polymer nanoparticles having a hydrophilic polymeric brush on their surface were obtained by the method of the present invention.
  • the inventors believe that since the macromolecular chain transfer agent of the present invention exists at the beginning of the reaction, after the initiation of the active RAFT polymerization, the active initiation center is immediately transferred to the macromolecular chain transfer agent, and then in a specific Under the reaction system conditions, the active centers of the plurality of chain transfer agents initiate active cross-linking polymerization of the monoolefin functional monomer and the cross-linking agent to obtain nano-microspheres, and the end of the macro-initiator is located in the core portion of the nano-spheres. External A hydrophilic polymer brush is formed.
  • the RAFT polymerization is living polymerization, the size of the obtained nanoparticles is uniform, as shown in Figs.
  • the solid particles were removed by centrifugation, 400 ⁇ l of the upper emulsion portion was taken, 600 ⁇ l of acetonitrile was added, sonicated for 5 minutes, and after centrifugation, the whole liquid was made up to 1 mL with acetonitrile/water (3/2, volume/volume).
  • concentration of 2,4-D and POAc in the solution was then determined by HPLC.
  • HPLC test conditions After mixing methanol and 0.5% acetic acid in water (volume ratio 3/2) as a mobile phase, the flow rate was 1 mL per minute, and the detection wavelength was 272 nm.
  • HPLC test conditions After mixing an aqueous solution of acetonitrile and 0.4% triethylamine (volume ratio 7/3) as a mobile phase, the flow rate was 1 mL per minute, and the detection wavelength was 293 nm.
  • the solid particles were removed by centrifugation, 400 ⁇ l of the upper emulsion portion was taken, 600 ⁇ l of acetonitrile was added, sonicated for 5 minutes, and after centrifugation, the whole liquid was made up to 1 mL with acetonitrile/water (3/2, volume/volume). The concentration of the solution center and atenolol was then determined by HPLC.
  • the nanoparticle of the present invention has almost the same ability to recognize a template molecule in an aqueous sample as well as a biological sample, particularly a pure biological sample, and its ability to recognize in an organic solvent (taking into account Test error avoided:).
  • nanoparticles of the present invention can be effectively used for aqueous purposes.
  • Specific template molecules are specifically identified in the sample as well as in the biological sample, particularly the pure biological sample.
  • the nanoparticles of the present invention can easily identify antibiotics and pesticide residues in milk, which has great applications in the fields of food safety and the like.
  • the nanoparticles of the present invention can be applied in biological sample analysis, medical clinical immunoassay, food and environmental monitoring, and/or biomimetic sensor manufacturing.
  • the nanoparticles of the present invention can be used to prepare a sensor or the like for a biological sample.

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Abstract

一种适于生物样品、特别是纯生物样品的分子印迹聚合物纳米颗粒及其制备方法，所述分子印迹聚合物纳米颗粒交联度在50%以上，粒径为10〜500纳米，且其表面具有亲水性高分子刷，是采用亲水性大分子链转移剂诱导的可逆加成-裂解链转移（RAFT）沉淀聚合技术一步法合成的，具有合成方法简单、适用范围广、产品纯净等优点。所得亲水性分子印迹聚合物纳米颗粒在生物样品分析、医学临床免疫分析、食品与环境监测、仿生传感器等众多领域具有广阔的应用前景。

Description

适于生物样品的分子印迹聚合物纳米颗粒及其制备方法 本申请要求于 2012 年 11 月 20 日提交中国专利局、 申请号为 201210470277. 1发明名称为 "适于纯生物样品的分子印迹聚合物纳米颗粒及 其制备方法" 的中国专利申请的优先权， 其全部内容通过引用结合在本申请 中。
技术领域 本发明涉及一种分子印迹聚合物纳米颗粒及其制备方法， 尤其是涉及一 种在生物样品、 特别是纯生物样品中对有机小分子具有优异识别功能的分子 印迹聚合物纳米颗粒及其制备方法， 具体地说就是涉及一种表面具有亲水性 高分子刷的分子印迹聚合物纳米颗粒及其一歩法制备方法。 背景技术 在自然界中， 基于生物受体 (如酶、 抗体等:)的分子识别在大多数生物过程 (：如免疫反应、 配体 -受体作用及酶催化等：)中起着决定作用。 如何开发拥有与 生物受体亲和性与选择性相近的合成受体是当代化学家面临的一项重大挑 战。 目前人们已合成了许多有机小分子型受体 (F. Hof, S. L. Craig, C. Nuckolls, J. Rebek Jr., Angew. Chem. Int. Ed. 2002, 41, 1488-1508; D. M. Vriezema, M. C. Aragones, J. A. A. W. Elemans, J. J. L. M. Cornelissen, A. E. Rowan, R. J. M. Nolte, Chem. Rev. 2005, 105, 1445-1490),不过它们通常均需要多歩有机合成过 程， 这大大限制了其广泛的实际应用。 因此发展更易合成的人工受体成为近 年来研究的热点。 分子印迹技术是一种制备具有特异性识别位点的聚合物受体的简便高效 的新方法 (H. Zhang, L. Ye, K. Mosbach, J. Mol. Recognit. 2006, 19, 248-259)。 由 其得到的分子印迹聚合物 (Molecularly Imprinted Polymers, 简称 MIPs)由于具 有选择识别性能高、 制备过程简单、 耐热性与化学稳定性好等优点而受到广 泛关注。 目前， 分子印迹技术已经发展成为了一种直接、 高效地获得仿生合 成受体的方法。 其最大的特点是它具有通用性， 即可以在不明显改变合成配 方的基础上得到各种模板分子的分子印迹聚合物。 目前分子印迹聚合物的应 用研究已经扩展到色谱固定相、 固相提取、 免疫分析、 仿生传感器、 人工酶、 有机合成与药物传递等众多方面， 并在食品与环境安全检测等领域显示出巨 大的应用前景。 分子印迹研究的最终目标是制备可与生物受体相媲美的分子 印迹聚合物并最终在实际应用中取代生物受体。 尽管分子印迹研究已经取得了巨大进展， 在某些应用领域 (如固相提取:) 甚至已进入了商品化阶段， 但是此研究领域中仍然存在一些关键性的难题与 挑战， 大大限制了分子印迹聚合物材料更广泛的应用。 其中之一即是如何制 备在水溶液中对有机小分子 (大多数环境污染物、 药物、 抗生素、 农药、 除草 剂等均为有机小分子：)具有优异分子识别性能的分子印迹聚合物。 迄今发展起 来的以有机小分子为模板的分子印迹聚合物通常只有在有机溶液体系中才能 显示出优异的分子识别性能， 而真正能适用于水溶液体系的以有机小分子为 模板的分子印迹聚合物则非常有限。 然而从经济上、 生态上以及环境保护等 各方面考虑， 以水来代替有机溶剂都是非常必要的； 从其潜在的在生物技术 领域中的应用考虑， 以水为溶剂则是必须的； 而就其在环境与食品安全检测 及临床医学等领域中的实际应用来讲， 使用在水溶液中具有优异分子识别性 能的分子印迹聚合物则可达到直接快速检测的目的。 尽管目前人们通过利用 特殊设计的功能单体法 (G. Wulff, R. Schonfeld, Adv. Mater. 1998, 10, 957-959; H. Asanuma, T. Hishiya, M. Komiyama, Adv. Mater. 2000, 12, 1019-1030; P. Manesiotis, A. J. Hall, J. Courtois, K. Irgum, B. Sellergren, Angew. Chem. Int. Ed. 2005, 44, 3902-3906; J. L. Urraca, A. J. Hall, M. C. Moreno-Bondi, B. Sellergren, Angew. Chem. Int. Ed. 2006, 45, 5158-5161)、 或采用常规分子印迹方法 (L. I. Anderson, R. Muller, G. Vlatakis, K. Mosbach, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1995 92, 4788-4792; J. G. Karlsson, L. I. Andersson, I. A. Nicholls, Anal. Chim. Acta 2001, 435, 57-64), 或通过在分子印迹聚合体系中加入亲水性共聚单体的方法 (B. Dirion, Z. Cobb, E. Schillinger, L. I. Andersson, B. Sellergren, J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 15101-15109)在此方面获得了一些研究进展， 但是目前能够适 用于纯生物样品的分子印迹聚合物的制备仍然是分子印迹领域具有挑战性的 难题。 众所周知， 生物样品、 特别是纯生物样品成分复杂 (如牛奶与血清等样品 内部含有大量的蛋白质等成分：)， 这给分子印迹聚合物在实际生物样品中的分 子识别带来了极大的困难。 这里应该指出的是， 虽然也有大量将分子印迹聚 合物作为固相萃取材料应用于生物样品中特定分子分离的报道 (B. Sellergren, Anal. Chem. 1994, 66, 1578-1582; E. Caro, R. M. Marce, F. Borrull, P. A. G. Cormack, D. C. Sherrington, Trend. Anal. Chem. 2006, 25, 143-154; B. Tse Sum Bui, K. Haupt, Anal. Bioanal. Chem. 2010, 398, 2481-2492; E. Turiel, A. Martin-Esteban, Anal. Chim. Acta 2010, 668, 87-99), 但是在固相萃取过程中分 子印迹聚合物的选择性主要由使用的淋洗溶剂来决定， 这比直接将分子印迹 聚合物用于生物样品中进行分子识别要容易得多。 因为后者主要是由分子印 迹聚合物材料本身的性质决定的 (V. Pichon, F. Chapuis-Hugon, Anal. Chim. Acta 2008, 622, 48-61)。 最近， 本发明人报道了通过将亲水性大分子链转移剂引入到可逆加成-裂 解链转移 (RAFT)沉淀聚合体系中的方法， 实现了一歩法制备适于纯水溶液体 系的表面具有亲水性高分子刷的分子印迹聚合物微球的目的 (G. Pan, Y. Zhang, Y. Ma, C. Li, H. Zhang, Angew. Chem. Int. Ed. 2011, 50, 11731-11734)。 然而， 通 过上述方法制得的分子印迹聚合物是微米级的， 虽然它们适于普通水溶液体 系， 但是由于生物样品中的蛋白等分子会急剧吸附到颗粒表面所以其不适合 于生物样品的分析。 因此， 本发明人在上述工作的基础上， 通过将合适的亲 水性大分子链转移剂引入到 RAFT沉淀聚合体系中， 成功实现了一歩法制备 适于生物样品、 特别是纯生物样品的表面具有亲水性高分子刷的分子印迹聚 合物纳米颗粒的目的。 其纳米尺度的体积赋予亲水性的分子印迹聚合物纳米 颗粒以优异的水相悬浮性能， 这亦为其在环境监测、 食品安全、 及临床医学 等方面的应用提供了极大地便利。 发明内容 本发明旨在提供一种简便地制备适于生物样品、 特别是纯生物样品的分 子印迹聚合物纳米颗粒及其制备方法， 以弥补现有技术的不足， 为分子印迹 聚合物最终取代天然受体并得到实用化奠定基础。 本发明的技术构思是通过将合适的亲水性大分子链转移剂引入到 RAFT 沉淀聚合体系中， 一歩法制备表面具有亲水性高分子刷的分子印迹聚合物纳 米颗粒， 得到适于纯生物样品的分子印迹聚合物。 本发明的具体方法如下: (1) 将模板分子、 功能单体、 交联剂按摩尔比 1 :1~10:4~80投料于适当的 反应溶剂中， 功能单体与交联剂在体系中的体积分数为 0.5~10%。
(2) 加入功能单体与交联剂总量约 0.5~10%的引发剂与适量的链转移剂， 其中引发剂与链转移剂的摩尔比为 1 :1~20。 (3) 链转移剂由小分子链转移剂与亲水性大分子链转移剂组成，其中小分 子链转移剂所占摩尔百分数为 0~95%。
(4) 将上述混合物完全溶解后， 通氩气或氮气 5~60分钟除去氧气。 将反 应器密封后置于 25~100°C油浴中反应 1~100小时，超声分散 5~30分钟，高速 离心得到含有模板分子的聚合物纳米颗粒。 (5) 将含有模板分子的聚合物纳米颗粒先用甲醇 /乙酸（体积比为
10/0.1~10/10)的混合液清洗 12~72小时， 再用甲醇清洗 12 48小时， 直至没有 模板分子洗出为止。然后于 20~60 °C真空干燥至恒重， 即得到表面具有亲水性 高分子刷的分子印迹聚合物纳米颗粒。 所用的功能单体为： 4-乙烯吡啶、 2-乙烯吡啶、 4-乙烯基苯甲酸、 （甲基) 丙烯酸、 三氟甲基丙烯酸、 甲基丙烯酸 2-羟基乙酯、 甲基丙烯酸二甲氨基乙 酯、 （甲基：)丙烯酰胺、 2-丙烯酰胺基 -2-甲基 -1-丙磺酸、 4-乙烯基咪唑、 衣康酸 或 N-乙烯基吡咯垸酮。 所用的交联剂为： 双甲基丙烯酸乙二醇酯、 三甲基丙烯酸三羟甲基丙酯、 季戊四醇三丙烯酸酯、 二乙烯苯、 N,N'-亚甲基双丙烯酰胺、 N,N'-乙基双丙烯 酰胺、 N，N'-1,4-苯基双丙烯酰胺或 1,4-二丙烯酰哌嗪。 所用引发剂为： 偶氮类自由基引发剂、 过氧化物类自由基引发剂、 或氧 化还原类引发剂。 所用小分子链转移剂为： 双硫酯或三硫酯有机化合物。 所用的大分子链转移剂为： 具有双硫酯或三硫酯端基的各种亲水性聚合 物 (：包括聚乙二醇、 聚 N-异丙基丙烯酰胺、 聚甲基丙烯酸 2-羟基乙酯、 聚 (：甲 基：)丙烯酰胺、 聚 N,N-二甲基丙烯酰胺、 聚甲基丙烯酸二甲胺基乙酯等：)。 所用的溶剂为： 乙腈、 乙腈 /甲苯、 乙腈 /四氢呋喃、 乙腈 /甲醇、 乙腈 /乙 醇、 乙腈 /丙醇、 乙腈 /丁醇、 乙腈 /戊醇、 甲醇、 乙醇、 丙醇、 丁醇、 戊醇、 水、 甲醇 /水、 乙醇 /水、 丙醇 /水、 丁醇 /水、 戊醇 /水、 丁酮或石蜡油。 所采用的模板分子为： 心得安、 戊脉安、 戊垸脒、 茶碱、 咖啡因、 吗啡、 阿替洛尔、 扑热息痛、 布洛芬、 萘普生、 沙美利定、 喷他脒、 维拉拍米、 反 胺苯环醇、 多巴胺、 甲基沙美利定、 异戊巴比妥、 阿夫唑嗪、 齐多呋定、 司 他呋定、 布比卡因、 甲哌卡因、 罗哌卡因、 酞胺哌啶酮、 那蒙特金、 单嘧磺 隆、 尼古丁、 紫杉醇、 维生素 B、 维生素 B2、 麻黄素、 苯丙氨酸苯胺、 苯妥 英、 地西潘、 双氯醇胺、 溴代双氯醇胺、 双酚 A、 对叔丁基苯酚、 对硝基苯 酚、 对氯酚、 苯并芘、 磷酸二苯酯、 甲磺隆、 单嘧磺隆、 瘦肉精、 9-乙基腺嘌 呤、 三聚氰胺、 槲皮素、 芦丁、 青霉素、 红霉素、 四环素、 土霉素、 氯霉素、 赭曲霉毒素 A、 四环素、 氟哌酸、 氟喹诺酮、 头孢氨苄、 环丙沙星、 恩诺沙 星、 恩佛沙星、 氧氟沙星、 头孢硫脒、 阿莫西林、 卡马西平、 奥卡西平、 三 甲氧苄二氨嘧啶、 磷酸酯、 一硫代磷酸酯、 二硫代磷酸酯、 焦磷酸酯、 磷酰 胺、 硫代磷酰胺、 N-甲基氨基甲酸酯、 二甲基氨基甲酸酯、 三嗪、 脒类、 沙 蚕毒类、 脲类、 二硫代氨基甲酸盐、 氨基磺酸类、 硫代磺酸酯类、 三氯甲硫 基类、 抗蚜威、 吡虫啉、 莠去津、 莠灭净、 甲草胺、 乙草胺、 丁草胺、 异丙 甲草胺、 扑草净、 二甲戊灵、 百草枯、 精喹禾灵、 咪唑乙烟酸、 氟磺胺草醚、 异恶草松、 草除灵、 双甲脒、 二嗪磷、 乙酰甲胺磷、 溴氰菊酯、 异丙隆、 非 草隆、 利谷隆、 甲氧隆、 绿麦隆、 秀谷隆、 戊唑醇、 2-甲基 -4-氯苯氧乙酸、 2,4-二氯苯氧乙酸 (2,4-D)、 2,4,5-三氯苯氧乙酸、 西玛津、 扑灭津、 特丁津、 雌 二醇、 乙炔基雌二醇、 17- 雌二醇、 睾丸酮、 葡糖苷酸睾酮、 醋酸皮质酮、 皮炎平、 皮康霜、 恩肤霜、 复方酮康唑霜、 复方酮纳乐霜、 去炎松软膏、 乐 肤液、 皮康王、 艾洛松、 优卓尔、 适确得、 复方适确得、 特美肤、 索康、 喜 乐、 地塞米松磷酸钠、 可的松、 氢化可的松、 醋酸氢化可的松、 丁酸氢化可 的松、 地塞米松、 醋酸地塞米松、 强的松、 双丙酸倍氯米松、 糠酸莫米松、 氟轻松、 丙酸倍他米松、 卤美他松、 倍氯美松、 双醋氟美松的确当、 百力特、 点必舒、 艾氟龙、 曲安西龙、 哈西奈德或丙酸氯倍他索。 在第一方面， 本发明提供一种表面具有亲水性高分子刷的分子印迹聚合 物纳米颗粒， 其特征是交联度>50%，粒径为 10~500纳米，优选为 10~300纳米， 更优选为 10~250纳米， 所述纳米颗粒能够识别生物样品、 特别是纯生物样品 中的模板分子， 所述分子印迹聚合物纳米颗粒是在模板分子存在下， 由单烯 类功能单体与交联剂在亲水性大分子链转移剂和任选的小分子链转移剂诱导 下进行可逆加成 -裂解链转移 (RAFT)沉淀聚合得到的。 在第二方面， 本发明提供一种表面具有亲水性高分子刷的分子印迹聚合 物纳米颗粒， 其特征是所述纳米颗粒具有由交联聚合物网络形成的核部分以 及在核部分表面上的亲水性高分子刷， 所述核部分的交联度 >50%， 粒径为 10~500纳米， 优选为 10 300纳米， 更优选为 10 250纳米， 所述纳米颗粒的核 部分具有能够识别生物样品、 特别是纯生物样品中的模板分子的分子印迹孔 穴。 在一个优选实施方案中， 所述纳米颗粒的粒径分布窄， 优选地所述纳米 颗粒根据 ISO 13321采用动态光散射法测得的粒径分布指数小于或等于 0.6，优 选地小于或等于 0.5， 优选地小于或等于 0.4， 优选地小于或等于 0.3， 优选地小 于或等于 0.2， 优选地小于或等于 0.1。 在另一个优选实施方案中， 用于制备本发明的分子印迹聚合物纳米颗粒 的可逆加成 -裂解链转移 (RAFT)沉淀聚合是在亲水性大分子链转移剂与小分 子链转移剂的共同诱导下进行的。 在又一个优选实施方案中， 所述的模板分子选自氨基酸、 生物受体、 核 酸、 类、 免疫抑制剂、 激素、 肝素、 抗生素、 维生素、 病理或疾病状态的 生物标记小分子、 毒素、 杀虫剂、 除草剂、 炸药、 神经毒剂、 内分泌干扰化 合物、 核苷酸、 核苷、 低聚核苷酸、 代谢物、 次级代谢产物、 药物代谢物、 药物或药物中间体或药物的有机小分子， 特别地所述模板分子选自： 心得安、 戊脉安、 戊烷脒、 茶碱、 咖啡因、 吗啡、 阿替洛尔、 扑热息痛、 布洛芬、 萘 普生、 沙美利定、 喷他脒、 维拉拍米、 反胺苯环醇、 多巴胺、 甲基沙美利定、 异戊巴比妥、 阿夫唑嗪、 齐多呋定、 司他呋定、 布比卡因、 甲哌卡因、 罗哌 卡因、 酞胺哌啶酮、 那蒙特金、 单嘧磺隆、 尼古丁、 紫杉醇、 维生素 B、 维生 素 B2、 麻黄素、 苯丙氨酸苯胺、 苯妥英、 地西潘、 双氯醇胺、 溴代双氯醇胺、 双酚 A、对叔丁基苯酚、对硝基苯酚、对氯酚、苯并芘、磷酸二苯酯、 甲磺隆、 单嘧磺隆、 瘦肉精、 9-乙基腺嘌呤、 三聚氰胺、 槲皮素、 芦丁、 青霉素、 红霉 素、 四环素、 土霉素、 氯霉素、 赭曲霉毒素 A、 四环素、 氟哌酸、 氟喹诺酮、 头孢氨苄、 环丙沙星、 恩诺沙星、 恩佛沙星、 氧氟沙星、 头孢硫脒、 阿莫西 林、 卡马西平、 奥卡西平、 三甲氧苄二氨嘧啶、 磷酸酯、 一硫代磷酸酯、 二 硫代磷酸酯、 焦磷酸酯、 磷酰胺、 硫代磷酰胺、 N-甲基氨基甲酸酯、 二甲基 氨基甲酸酯、 三嗪、 脒类、 沙蚕毒类、 脲类、 二硫代氨基甲酸盐、 氨基磺酸 类、 硫代磺酸酯类、 三氯甲硫基类、 抗蚜威、 吡虫啉、 莠去津、 莠灭净、 甲 草胺、 乙草胺、 丁草胺、 异丙甲草胺、 扑草净、 二甲戊灵、 百草枯、 精喹禾 灵、 咪唑乙烟酸、 氟磺胺草醚、 异恶草松、 草除灵、 双甲脒、 二嗪磷、 乙酰 甲胺磷、 溴氰菊酯、 异丙隆、 非草隆、 利谷隆、 甲氧隆、 绿麦隆、 秀谷隆、 戊唑醇、 2-甲基 -4-氯苯氧乙酸、 2,4-二氯苯氧乙酸 (2,4-D)、 2,4,5-三氯苯氧乙酸、 西玛津、 扑灭津、 特丁津、 雌二醇、 乙炔基雌二醇、 17-β-雌二醇、 睾丸酮、 葡糖苷酸睾酮、 醋酸皮质酮、 皮炎平、 皮康霜、 恩肤霜、 复方酮康唑霜、 复 方酮纳乐霜、 去炎松软膏、 乐肤液、 皮康王、 艾洛松、 优卓尔、 适确得、 复 方适确得、 特美肤、 索康、 喜乐、 地塞米松磷酸钠、 可的松、 氢化可的松、 醋酸氢化可的松、 丁酸氢化可的松、 地塞米松、 醋酸地塞米松、 强的松、 双 丙酸倍氯米松、 糠酸莫米松、 氟轻松、 丙酸倍他米松、 卤美他松、 倍氯美松、 双醋氟美松的确当、 百力特、 点必舒、 艾氟龙、 曲安西龙、 哈西奈德或丙酸 氯倍他索， 优选为心得安、 茶碱、 咖啡因、双酚 Α、 青霉素、 红霉素、 四环素、 氟哌酸、双甲脒、 二嗪磷、 乙酰甲胺磷、 溴氰菊酯、 2,4-二氯苯氧乙酸 (2,4-D)、 雌二醇或睾丸酮， 更优选为心得安或 2,4-二氯苯氧乙酸 (2,4-D：)。 在再一个优选实施方案中， 所述的单烯类功能单体选自〇2-〇8单烯烃、 乙 烯基芳香族化合物、 乙烯基杂芳族化合物， 单烯属不饱和羧酸及其盐、 酯和 酰胺， 乙烯基醇及其酯、 烯丙基醇及其酯、 乙烯基醚、 乙烯基内酰胺、 乙烯 基卤化物、 偏二卤乙烯， （甲基：)丙烯酸及其酯、 盐、 酰胺、 乙烯基吡啶化合物 及其组合， 优选为 4-乙烯吡啶、 2-乙烯吡啶、 4-乙烯基苯甲酸、 （甲基：)丙烯酸、 三氟甲基丙烯酸、 甲基丙烯酸 2-羟基乙酯、 甲基丙烯酸二甲氨基乙酯、 （甲基) 丙烯酰胺、 2-丙烯酰胺基 -2-甲基 -1-丙磺酸、 4-乙烯基咪唑、 衣康酸或 N-乙烯 基吡咯垸酮或其混合物， 更优选为 4-乙烯吡啶或甲基丙烯酸。 在另一个优选实施方案中， 所述的交联剂是具有两个或更多个非共轭烯 属不饱和双键的单体， 优选选自： 至少二元醇的丙烯酸酯、 甲基丙烯酸酯、 烯丙基醚或乙烯基醚； 不饱和一元醇的乙烯基酯或者不饱和一元醇与烯属不 饱和 c3-c6羧酸的酯； 不饱和羧酸与多元醇的酯； 具有至少两个双键的直链或 支化、 线性或环状、 脂肪族或芳香族烃， 在脂族烃的情况下， 所述双键不应 共轭； 至少双官能胺的丙烯酰胺、 甲基丙烯酰胺和 N-烯丙胺； 及其组合， 更 优选为双甲基丙烯酸乙二醇酯、 三甲基丙烯酸三羟甲基丙酯、 季戊四醇三丙 烯酸酯、二乙烯苯、 N，N'-亚甲基双丙烯酰胺、 N，N'-乙基双丙烯酰胺、 Ν,Ν'Λ,Α- 苯基双丙烯酰胺或 1,4-二丙烯酰哌嗪或其混合物， 还更优选为双甲基丙烯酸乙 二醇酯。 在又一个优选实施方案中， 所述的亲水性大分子链转移剂为具有双硫酯 或三硫酯端基的亲水性聚合物， 所述亲水性聚合物优选选自： 聚醇、 聚 (内酰 胺：)、 聚氨酯、 聚 (甲基：)丙烯酸、 聚丙烯酰胺、 聚乙烯醇、 聚乙烯醚、 聚酯、 聚乙烯胺、 聚乙烯亚胺、 聚环氧垸、 聚 (羧酸：)， 聚酰胺、 聚酐、 聚磷腈、 纤维 素、 肝素、 葡聚糖、 多肽、 纤维蛋白和弹性蛋白、 多糖、 透明质酸、 藻酸盐、 明胶和几丁质、 白蛋白、 寡肽、 短链肽和寡核苷酸及由得到上述聚合物的单 体获得的共聚物， 更优选为聚乙二醇、 聚 N-异丙基丙烯酰胺、 聚甲基丙烯酸 2-羟基乙酯、 聚 (：甲基：)丙烯酰胺、 聚 N，N-二甲基丙烯酰胺、 聚 N，N-二甲基氨基 乙基甲基丙烯酸酯、 聚甲基丙烯酸二甲胺基乙酯、 聚 ([2- (甲基丙烯酰氧基:)乙 基]二甲基 -(3-磺丙基：)氢氧化铵:)、聚3-2-N-甲基丙烯酰氧乙基 -N，N-二甲基磺酸 丙基胺：)、 聚 (2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱：)、 （氧 磺酰基丙基三甲基-缩 水甘油基：)十一垸基酯硫代甲基：)乙烯 -氧基 (正十二垸基硫代甲基：)乙烯：)共聚 物、聚 (丙烯酰胺基 -2-甲基 -1-丙磺酸：)、聚 (甲基丙烯酰乙基磺基甜菜碱：)、聚 (甲 基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵：)、 聚 (3-甲基丙烯酸磺丙酯钾盐：)、 聚4- [二甲基 (2'-甲基丙烯酰氧基乙基：)铵]丁酸酯：)、 聚 (甲基丙烯酸 3-磺酸丙酯钾盐：)、 聚 (：甲 基丙烯酸甲酯磺基甜菜碱：)、聚 (甲基丙烯酰胺磺基甜菜碱：)、聚 (苯乙烯磺酸盐：)、 聚 (苯乙烯磺酸：)、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯氨酸钠、 甲氧基三 (乙 二醇：)甲基丙烯酸酯-甲基丙烯酸共聚物、 聚 (乙二醇：)、 聚 (乙二醇：)甲基醚甲基 丙烯酸酯、 聚环氧垸、 聚环氧乙垸、 聚 (低聚 (乙二醇：)甲基醚甲基丙烯酸酯：)、 聚 (甲基丙烯酸氧乙二醇酯：)、聚 (N-甲基甘氨酸：)、聚 (L-谷氨酸：)、聚 (L-赖氨酸：)、 聚 (N-异丙基甲基丙烯酰胺：)、 聚 (N-羟甲基丙烯酰胺：)、 聚 (N-[ 2,2-二甲基 -1,3- 二氧戊环：)甲基：)丙烯酰胺：)、 聚 (N-(2-羟丙基：)甲基丙烯酰胺：)、 聚 (：丙烯酸 2-羟乙 酯：)、 聚 (：2,3-二羟基丙基甲基丙烯酸酯：)、 聚 (：醚胺：)、 聚 (N-乙烯基吡咯垸酮：)、 聚 (N-乙烯基己内酰胺：)、 聚2-噁唑啉：)及其衍生物、 聚2- (二乙基氨基：)乙基丙 烯酸酯)、 聚 (2-(二甲基氨基)乙基甲基丙烯酸酯)、 聚 (2-(二乙基氨基)乙基甲基 丙烯酸酯：)、 聚 (2-乙烯基吡啶：)、 聚 1-乙烯基咪唑：)、 聚 丙烯酰吗啉：)、 聚 (：磷 酸乙基乙二醇酯：)及由得到上述聚合物的单体获得的共聚物。 在再一个优选实施方案中， 所述小分子链转移剂具有以下结构：
Figure imgf000011_0001
其中： R=垸基、 链烯 (炔)基、 芳基、 芳垸基、 取代垸基、 取代芳基、 碳 环或杂环、 垸氧基或二垸基氨基；
Z=垸基、 芳基、 芳垸基、 取代垸基、 取代芳基、 碳环或杂环、 垸硫基、 芳硫基、 垸氧羰基、 芳氧羰基、 酰氧基、 氨基甲酰基、 氰基、 垸基芳基二取 代氨基、 垸氧基、 芳氧基、 二垸基 -或二芳基膦酸基， 或二垸基-或二芳基-次 膦酸基， 所述小分子链转移剂优选选自： 双硫酯或三硫酯有机化合物、 硫代羰基 硫代化合物， 例如： 1-吡咯二硫代羧酸 2-氰基丙 -2-基 -酯、 1-吡咯二硫代羧酸 2-氰基丁 -2-基酯、 1-咪唑二硫代羧酸苄基酯、 二硫代苯甲酸异丙苯酯、 二硫代 氰基异丙酯、 二硫代苯甲酸异丁酸酯、 十二垸基 -S'-(o，o"-二甲基 -ex"-乙酸:)三 硫代碳酸酯、 十二垸基 -V-异丙酸-三硫代碳酸酯， 黄原酸酯衍生物， 例如： 黄原酸 (9-乙基 苯乙基:)酯、 黄原酸 0-乙基 S-(2-乙氧基羰基丙 -2-基酯:)和黄 原酸 (9-乙基 (2-氰基异丙基:)酯。 在另一个优选实施方案中， 模板分子、 单烯类功能单体与交联剂的摩尔 比为 1:1~10:4~80， 优选为 1:1~9:4~70， 更优选为 1:1~8:4~50， 还更优选为 1:1-6:4-10, 仍更优选为 1:1~4:4~10。 在又一个优选实施方案中， 单烯类功能单体和交联剂总量与链转移剂 (包 括任选的小分子链转移剂与亲水性大分子链转移剂:)的摩尔比为 500:1~10:1， 优选为 200:1 10:1， 优选为 150:1到 50:1， 更优选为 120:1到 80:1。 在另一个优选实施方案中， 在小分子链转移剂与亲水性大分子链转移剂 组成的链转移剂中，小分子链转移剂所占摩尔百分数为 0~95%，优选为 1~85%， 更优选为 10~75%， 还更优选为 15~70%， 仍更优选为 20~60%。 在又一个优选实施方案中， 所述亲水性高分子刷由所述大分子链转移剂 形成。 在再一个优选实施方案中， 所述亲水性大分子链转移剂的数均分子量为 500到 50000， 优选为 1000到 30000， 更优选为 1500到 8000， 更优选为 2000到 5000。 在第三方面， 本发明提供一种制备根据本发明的表面具有亲水性高分子 刷的分子印迹聚合物纳米颗粒的方法， 包括以下歩骤：
1)将模板分子、 单烯类功能单体、 交联剂、 溶剂、 自由基引发剂与亲水性 大分子链转移剂和任选的小分子链转移剂混匀， 除氧后， 在 25~100°C、 优选
30~90°C、更优选 40~80°C、还更优选 50~70°C反应 1~500小时，优选 2~200小时， 更优选 3~100小时， 得到含有模板分子的聚合物纳米颗粒； 和
2)采用适当的溶剂对含有模板分子的聚合物纳米颗粒进行清洗直至没有 模板分子洗出为止， 得到表面具有亲水性高分子刷的分子印迹聚合物纳米颗 粒。 在第四方面， 本发明提供一种制备根据本发明的表面具有亲水性高分子 刷的分子印迹聚合物纳米颗粒的方法， 其特征在于包括以下歩骤：
1)将模板分子、 单烯类功能单体、 交联剂、 溶剂、 自由基引发剂与亲水性 大分子链转移剂和任选的小分子链转移剂混匀， 通氩气或氮气 5~60分钟除氧 后， 将反应器置于 25~100°C油浴中反应 1~100小时， 超声分散 5~30分钟， 高速 离心得到含有模板分子的聚合物纳米颗粒； 和
2)将含有模板分子的聚合物纳米颗粒先用甲醇 /乙酸（体积比为 10/0.1~10/10)的混合液清洗 12~72小时， 再用甲醇清洗 12~48小时， 直至没有模 板分子洗出为止， 然后于 20~60°C真空干燥至恒重， 即得到表面具有亲水性高 分子刷的分子印迹聚合物纳米颗粒。 在根据本发明制备方法的一个优选实施方案中， 通过改变功能单体、 交 联剂、 引发剂、 小分子链转移剂、 大分子链转移剂、 模板分子以及溶剂的种 类和用量， 制备一系列对不同模板分子具有分子识别功能、 且表面具有亲水 性高分子刷的分子印迹聚合物纳米颗粒。 在根据本发明制备方法的另一个优选实施方案中， 所述的引发剂为偶氮 类自由基引发剂、 过氧化物类自由基引发剂或氧化还原类引发剂， 所述偶氮 类自由基引发剂优选选自： 2,2'-偶氮二 (异丁腈)、 2,2'-偶氮二 (异庚腈)、 2,2'- 偶氮双 (2-氰基 -2-丁垸)、 二甲基 2,2'-偶氮双 (甲基异丁酸酯)、 4,4'-偶氮双 (4-氰 基戊酸)、 4,4'-偶氮双 (4-氰基-戊 -1-醇)、 Ι,Γ-偶氮双 (环己腈)、 2- (叔丁基偶氮 )-2- 氰基丙垸、 2,2'-偶氮双 [2-甲基 -N-(l,l)-双 (羟甲基) -2-羟基乙基]丙酰胺、 2,2'-偶 氮双 [2-甲基 -N-羟基乙基]] -丙酰胺、二盐酸 2,2'-偶氮双 (N，N'_二亚甲基异丁咪：)、 二盐酸 2,2'-偶氮双 (2-脒基丙垸：)、 2,2'-偶氮双 _(N，N'-二亚甲基异丁胺：)、 2,2'-偶 氮双 (2-甲基 -N-[l,l-双- (羟基甲基: )-2-羟基乙基： I丙酰胺：)、 2,2'-偶氮双 (2-甲基 -N-[l,l-双 (羟基甲基)乙基]丙酰胺)、 2,2'-偶氮双 [2-甲基 -N-(2-羟基乙基)丙酰 胺： |、 二水合 2,2'-偶氮双 (异丁酰胺：)、 2,2'-偶氮双 (2,2,4-三甲基戊垸：)、 2,2'-偶氮 双 (2-甲基丙垸: 所述过氧化物类自由基引发剂优选选自： 过氧乙酸叔丁酯、 过氧苯甲酸叔丁酯、 过氧辛酸叔丁酯、 过氧新癸酸叔丁酯、 过氧异丁酸叔丁 酯、 过氧新戊酸叔戊酯、 过氧新戊酸叔丁酯、 过氧二碳酸二异丙酯、 过氧二 碳酸二环己酯、 过氧化二异丙苯、 过氧化二苯甲酰、 过氧化十二垸酰、 过二 硫酸钾、 过二硫酸铵、 连二次硝酸二叔丁酯、 过氧化二叔丁基或连二次硝酸 二异丙苯酯、 异丙苯过氧化氢、 叔丁基过氧化氢； 对于所述氧化还原类引发 剂来说， 氧化剂包括有机 (垸基-、 芳基-、 或酰基：)氢过氧化物、 过硫酸盐、 过 磷酸盐、 或有机过氧化物， 优选的氧化剂包括过硫酸盐和有机氢过氧化物， 最优选的氧化剂包括铵、 钠、 或钾的过硫酸盐， 和叔丁基过氧化氢， 还原剂 包括甲醛合次硫酸氢钠、 亚硫酸钠、 焦亚硫酸钠、 连二亚硫酸钠、 抗坏血酸、 异抗坏血酸、 肼、 羟基胺或羟基胺盐、 还原糖、 硫醇、 以及亚磺酸衍生物、 三乙基铝、 三乙基硼、 叔胺， 优选的还原剂包括甲醛合次硫酸氢钠、 焦亚硫 酸钠、 异抗坏血酸、 连二亚硫酸钠、 硫代硫酸钠、 亚硫酸钠， 最优选的还原 剂包括连二亚硫酸钠。 在根据本发明制备方法的又一个优选实施方案中， 聚合所用的溶剂为乙 腈、 乙腈 /甲苯、 乙腈 /四氢呋喃、 乙腈 /甲醇、 乙腈 /乙醇、 乙腈 /丙醇、 乙腈 / 丁醇、 乙腈 /戊醇、 甲醇、 乙醇、 丙醇、 丁醇、 戊醇、 水、 甲醇 /水、 乙醇 /水、 丙醇 /水、 丁醇 /水、 戊醇 /水、 甲苯、 四氢呋喃、 N，N-二甲基甲酰胺、 二甲基亚 砜、 丁酮或石蜡油。 在根据本发明制备方法的再一个优选实施方案中， 所述可逆加成-裂解链 转移 (RAFT)沉淀聚合是在亲水性大分子链转移剂与小分子链转移剂的共同诱 导下进行的。 在根据本发明制备方法的又一个优选实施方案中， 所述的溶剂、 模板分 子、 单烯类功能单体、 交联剂、 引发剂、 任选的小分子链转移剂及亲水性大 分子链转移剂的用量如下：
1)模板分子、 单烯类功能单体与交联剂的摩尔比为 1 :1~10:4~80， 优选为 1 : 1-9:4-70 , 更优选为 1 : 1~8:4~50， 还更优选为 1 :1~6:4~10， 仍更优选为
1 : 1-4:4-10 , 单烯类功能单体与交联剂在体系中的体积分数为 0.5~10%；
2)引发剂量为单烯类功能单体与交联剂总量的 0.5~10%， 且引发剂与链转 移剂 (包括任选的小分子链转移剂与亲水性大分子链转移剂:)的摩尔比为 1 : 1-20； 和 3)在小分子链转移剂与亲水性大分子链转移剂组成的链转移剂中，小分子 链转移剂所占摩尔百分数为 0~95%， 优选为 1~85%， 更优选为 10~75%， 还更 优选为 15~70%， 仍更优选为 20~60%。 在第五方面， 本发明提供根据本发明的或者由根据本发明的方法制得的 表面具有亲水性高分子刷的分子印迹聚合物纳米颗粒在生物样品分析、 医学 临床免疫分析、 食品与环境监测和 /或仿生传感器制造中的用途。 在第六方面， 本发明提供一种试剂盒， 其包含根据本发明的或者由根据 本发明的方法制得的表面具有亲水性高分子刷的分子印迹聚合物纳米颗粒。 在第七方面， 本发明提供一种用于生物样品的传感器， 其包含根据本发 明的或者由根据本发明的方法制得的表面具有亲水性高分子刷的分子印迹聚 合物纳米颗粒。 附图说明： 为了进一歩阐明本发明的上述和其它优点与特征， 将参照在附图中描述 的本发明的具体实施方案对本发明进行更详细的描述。 应认识到， 这些图仅 仅描述本发明的说明性实施方案， 因此不应认为限制其范围。 将使用以下附 图更为具体和详细地描述和解释本发明， 其中： 图 1. 利用亲水性大分子链转移剂诱导的 RAFT沉淀聚合法制备表面具有 亲水性高分子刷的分子印迹聚合物纳米颗粒的过程示意图。 图 2. 利用亲水性大分子链转移剂诱导的 RAFT沉淀聚合法制备的表面具 有亲水性聚甲基丙烯酸 2-羟基乙酯高分子刷 (Λ^,ΝΜΚ = 4800；)的分子印迹聚合 物纳米颗粒 (以 2,4-D为模板分子)的扫描电子显微镜照片。 图 3. 利用亲水性大分子链转移剂诱导的 RAFT沉淀聚合法制备的表面具 有亲水性聚甲基丙烯酸 2-羟基乙酯高分子刷 (Λ^,ΝΜΚ = 4800；)的非印迹聚合物 纳米颗粒 (对应于图 2中的分子印迹聚合物)的扫描电子显微镜照片。 图 4. 利用亲水性大分子链转移剂诱导的 RAFT沉淀聚合法制备的表面具 有亲水性聚甲基丙烯酸 2-羟基乙酯高分子刷 (Λ^,ΝΜΚ = 4800；)的分子印迹聚合 物纳米颗粒 (以心得安为模板分子：心得安 -ΜΙΡ-2)的扫描电子显微镜照片。 图 5. 利用亲水性大分子链转移剂诱导的 RAFT沉淀聚合法制备的表面具 有亲水性聚甲基丙烯酸 2-羟基乙酯高分子刷 (Λ^,ΝΜΚ = 4800；)的非印迹聚合物 纳米颗粒 (对应于图 4 中的分子印迹聚合物 心得安 -CP-2)的扫描电子显微镜 照片。 图 6. 表面具有亲水性聚甲基丙烯酸 2-羟基乙酯高分子刷 (MN,NMR = 4800) 的分子印迹聚合物纳米颗粒 (以 2,4-D为模板分子， 实心符号)及其非印迹聚合 物纳米颗粒 (：空心符号：)在纯牛奶 (方块：)与纯牛血清 (菱形：)中对 2,4-D 的吸附性 能 (吸附温度为 25 °C, 2,4-D的浓度为 0.02 mM：)。 图 7. 表面具有亲水性聚甲基丙烯酸 2-羟基乙酯高分子刷 (MN,NMR = 4800) 的分子印迹聚合物 (MIP)纳米颗粒 (以 2,4-D为模板分子)及其非印迹聚合物 (CP) 纳米颗粒在纯牛奶与纯牛血清中对 2,4-D及其类似物苯氧乙酸POAc)的选择 性吸附性能 (吸附温度为 25 °C, 2,4-D与 POAc的浓度均为 0.02 mM， MIP与 CP的浓度均为 12 mg/mL；)。 图 8. 表面具有亲水性聚甲基丙烯酸 2-羟基乙酯高分子刷 (MN,NMR = 4800) 的分子印迹聚合物纳米颗粒 (心得安 -MIP-2， 实心符号：)及其非印迹聚合物纳米 颗粒 (心得安 -CP-2, 空心符号)在纯牛奶 (方块)与纯牛血清 (菱形：)中对心得安的 吸附性能 (吸附温度为 25 °C， 心得安的浓度为 0.05 mM：)。 图 9. 表面具有亲水性聚甲基丙烯酸 2-羟基乙酯高分子刷 (Mn,NMR = 4800；)的分子印迹聚合物MIP)纳米颗粒 (：心得安 -ΜΙΡ-2;)及其非印迹聚合物 (CP) 纳米颗粒 (：心得安 -CP-2;)在纯牛奶与纯牛血清中对心得安 (Propranolol;)与阿替 洛尔 (Atenolol)的选择性吸附性能 (吸附温度为 25 °C，心得安与阿替洛尔的浓度 均为 0.05 mM， 心得安 -MIP-2与心得安 -CP-2的浓度均为 2 mg/mL) o 具体实施方式 定义 本发明所用的术语"纯生物样品"是指富含蛋白质等生物基体的样品 (如血 清、 牛奶和尿液等 )。 术语"生物样品"包括从受试对象获得的并且在本发明中有用的多种样品 类型。 生物样品可以包括但不限于固体组织样品、 液体组织样品、 生物流体、 抽吸物、 细胞和细胞片段。 生物样品的具体实例包括但不限于通过手术移除 获得的固体组织样品、 病理学样本、 存档样品、 或活检样本、 组织培养物或 自其获取的细胞及该细胞的子代、 以 及由这些来源的任何一种制备的切片或 涂片。 生物样品的非限制性实例包括从乳房组织、 淋巴结和乳房肿瘤获得的 样品。 生物样品还包括从脊椎动物身体获取的任何材料， 包括但不限于： 血 液、 脑脊液、 血清、 血浆、 尿、 乳头抽吸物、 细针抽吸物、 组织灌洗液诸如 乳管灌洗液、 唾液、 痰、 腹水液、 肝、 肾、 乳房、 骨、 骨髓、 睾丸、 脑、 卵 巢、 皮肤、 肺、 前列 腺、 甲状腺、 胰、 宫颈、 胃、 肠、 结肠直肠、 脑、 膀胱、 结肠、 鼻孔、 子宫、 精液、 淋巴、 阴道混合物、 滑液、 脊髓液、 头和颈、 鼻 咽肿瘤、 羊膜液、 母乳、 肺痰或肺表面活性物、 尿、 粪便和其他生物起源的 液体样品。 本发明所用的术语"分子印迹聚合物纳米颗粒"是指粒径在十到几百纳米 级别的一种包含至少部分与一种或多种模板分子对应的空穴 (或间隙:)的聚合 物， 其中模板分子在聚合前已并入包括交联单体的单体基质中。 聚合后的产 物聚合物包括大量与模板分子形状对应的空穴。 本发明所用的术语"可逆加成 -裂解链转移 (RAFT)沉淀聚合"是 "活性" I 可控自由基聚合 (CRP)的一种。在 RAFT反应中， 通常加入双硫酯或三硫酯衍 生物作为链转移试剂。 聚合中它与增长链自由基形成休眠的中间体， 限制了 增长链自由基之间的不可逆双基终止副反应， 使聚合反应得以有效控制。 这 种休眠的中间体可自身裂解， 从对应的硫原子上再释放出新的活性自由基， 结合单体形成增长链， 加成或断裂的速率要比链增长的速率快得多， 双硫酯 或三硫酯衍生物在活性自由基与休眠自由基之间迅速转移， 使分子量分布变 窄， 从而使聚合体现可控 /"活性"特征。 本发明所用的术语"粒径分布"是指某一粒子群中，不同粒径的粒子所占比 例， 亦称为粒子的分散度。 本发明所用的术语"交联度 "是指聚合物中键入的交联剂量占键入的交联 剂与功能单体总量的比值。 根据本发明的表面具有亲水性高分子刷的分子印 迹聚合物纳米颗粒的交联度是根据 ASTM D 2765测量的。 根据本发明的分子 印迹聚合物的交联度大于 50%， 优选大于 60%， 更优选大于 70%， 还更优选 大于 80%。 实施例 下面的实施例仅用于举例说明本发明的实施方案， 不应被解释为以任何 方式限制本发明。 制备实施例 实施例 1 将 0.83 mmol 2,4-D加入装有 60 mL甲醇 /水 (4:1, 体积 /体积)的 100 mL圆 底烧瓶中， 磁子搅拌使其完全溶解， 然后加入 0.83 mmol的 4-乙烯吡啶。 充 分混合半小时后， 再分别加入 2.50 mmol双甲基丙烯酸乙二醇酯、 0.055 mmol 小分子链转移剂二硫代苯甲酸异丙苯酯 （CDB：)、 0.034 mmol聚甲基丙烯酸 2- 羟基乙酯大分子链转移剂 (Mn,NMR = 4800)和 0.028 mmol 偶氮二异丁腈 AIBN：)。 通氩气除氧 30 min后将反应体系密封， 置于 60°C恒温油浴中， 反应 10 h， 高速离心得反应产物。 先后用甲醇 /乙酸 (9: 1 , 体积 /体积)与甲醇清洗反应产物， 直到无模板分子 洗出为止。 晾干后于 40 °C下真空干燥 48 h， 得到表面具有亲水性聚甲基丙烯 酸
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= 4800；)的分子印迹聚合物纳米颗粒。所述分子 印迹聚合物纳米颗粒的粒径为 l l lnm(DLS， 甲醇溶剂，下同)，交联度为 75%。 表面具亲水性聚甲基丙烯酸 2-羟基乙酯高分子刷 (MN,NMR = 4800；)的非印 迹聚合物纳米颗粒的制备中除不加模板分子外， 其他过程同上。 实施例 2 将 0.83 mmol 2,4-D加入装有 60 mL甲醇 /水 (4: 1 , 体积 /体积)的 100 mL圆 底烧瓶中， 磁子搅拌使其完全溶解， 然后加入 0.83 mmol的 4-乙烯吡啶。 充 分混合半小时后， 再分别加入 2.50 mmol双甲基丙烯酸乙二醇酯、 0.055 mmol 小分子链转移剂二硫代苯甲酸异丙苯酯 (CDB：)、 0.034 mmol聚甲基丙烯酸 2- 羟基乙酯大分子链转移剂 (MN,NMR = 3250)和 0.028 mmol 偶氮二异丁腈 AIBN：)。 通氩气除氧 30 min后将反应体系密封， 置于 60 °C恒温油浴中， 反应 10 h， 高速离心得反应产物。 先后用甲醇 /乙酸 (9: 1 , 体积 /体积)与甲醇清洗反应产物， 直到无模板分子 洗出为止。 晾干后于 40 °C下真空干燥 48 h， 得到表面具有亲水性聚甲基丙烯 酸
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=3250；)的分子印迹聚合物纳米颗粒。 所述分子 印迹聚合的粒径为 147 nm， 交联度为 75 %。 表面具有亲水性聚甲基丙烯酸 2-羟基乙酯高分子刷 (MN,NMR = 3250)的非 印迹聚合物纳米颗粒的制备中除不加模板分子外， 其他过程同上。 实施例 3 将 0.83 mmol心得安加入装有 60 mL乙腈 /甲醇 (1 : 1 , 体积 /体积)的 100 mL 圆底烧瓶中， 磁子搅拌使其完全溶解， 然后加入 0.83 mmol的甲基丙烯酸。 充 分混合半小时后， 再分别加入 2.50 mmol双甲基丙烯酸乙二醇酯、 0.055 mmol 小分子链转移剂二硫代苯甲酸异丙苯酯 （CDB：)、 0.034 mmol聚甲基丙烯酸 2- 羟基乙酯大分子链转移剂 (Λ ,ΝΜΚ = 4800；)和 0.028 mmol偶氮二异丁腈 (AIBN：)。 通氩气除氧 30 min后将反应体系密封， 置于 60 °C恒温油浴中， 反应 24 h， 高 速离心得反应产物。 先后用甲醇 /乙酸 (9: 1 , 体积 /体积：)与甲醇清洗反应产物， 直至无模板分子 洗出为止。 晾干后于 40 °C下真空干燥 48 h， 得到表面具有亲水性聚甲基丙烯 酸 2-羟基乙酯高分子刷的分子印迹聚合物纳米颗粒 (即心得安 -MIP-1 所述分 子印迹聚合物纳米颗粒的粒径为 220 nm， 交联度为 75 %。 表面具有亲水性聚甲基丙烯酸 2-羟基乙酯高分子刷的非印迹聚合物纳米 颗粒 (即心得安 -CP-1)的制备中除不加模板分子外， 其他过程同上。 实施例 4 将 0.83 mmol心得安加入装有 60 mL乙腈 /甲醇 (2: 1 , 体积 /体积)的 100 mL 圆底烧瓶中， 磁子搅拌使其完全溶解， 然后加入 0.83 mmol的甲基丙烯酸。 充 分混合半小时后， 再分别加入 2.50 mmol双甲基丙烯酸乙二醇酯、 0.055 mmol 小分子链转移剂二硫代苯甲酸异丙苯酯 （CDB：)、 0.034 mmol聚甲基丙烯酸 2- 羟基乙酯大分子链转移剂 (Λ ,ΝΜΚ = 4800；)和 0.028 mmol偶氮二异丁腈 (AIBN：)。 通氩气除氧 30 min后将反应体系密封， 置于 60 °C恒温油浴中， 反应 16 h， 高 速离心得反应产物。 先后用甲醇 /乙酸 (9: 1 , 体积 /体积：)与甲醇清洗反应产物， 直至无模板分子 洗出为止。 晾干后于 40 °C下真空干燥 48 h， 得到表面具有亲水性聚甲基丙烯 酸 2-羟基乙酯高分子刷的分子印迹聚合物纳米颗粒 (即心得安 -MIP-2 所述分 子印迹聚合物纳米颗粒的粒径为 182 nm， 交联度为 75 %。 表面具有亲水性聚甲基丙烯酸 2-羟基乙酯高分子刷的非印迹聚合物纳米 颗粒 (心得安 -CP-2)的制备中除不加模板分子外， 其他过程同上。 实施例 5 将 0.83 mmol 2,4-D加入装有 60 mL甲醇 /水 (4: 1 , 体积 /体积)的 100 mL圆 底烧瓶中， 磁子搅拌使其完全溶解， 然后加入 0.83 mmol的 4-乙烯吡啶。 充 分混合半小时后， 再分别加入 3.32 mmol双甲基丙烯酸乙二醇酯、 0.055 mmol 小分子链转移剂二硫代苯甲酸异丙苯酯 （CDB：)、 0.034 mmol聚甲基丙烯酸 2- 羟基乙酯大分子链转移剂 = 4800)和 0.028 mmol 偶氮二异丁腈 AIBN：)。 通氩气除氧 30 min后将反应体系密封， 置于 60 °C恒温油浴中， 反应 10 h， 高速离心得反应产物。 先后用甲醇 /乙酸 (9: 1, 体积 /体积)与甲醇清洗反应产物， 直到无模板分子 洗出为止。 晾干后于 40°C下真空干燥 48 h， 得到表面具有亲水性聚甲基丙烯 酸 2-羟基乙酯高分子刷 = 4800)的分子印迹聚合物纳米颗粒。所述分子 印迹聚合物纳米颗粒的粒径为 180纳米， 交联度为 80 %。 实施例 6 以与实施例 5相同的方式制备根据本发明的表面具有亲水性高分子刷的 分子印迹聚合物纳米颗粒， 区别仅在于： 模板分子与功能单体的摩尔比为 1 : 10。 所述分子印迹聚合物纳米颗粒的粒径为 215纳米， 交联度为 80 %。 实施例 7 以与实施例 5相同的方式制备根据本发明的表面具有亲水性高分子刷的 分子印迹聚合物纳米颗粒， 区别仅在于： 模板分子与功能单体的摩尔比为 1 : 5。 所述分子印迹聚合物纳米颗粒的粒径为 195纳米， 交联度为 80 %。 实施例 8 以与实施例 5相同的方式制备根据本发明的表面具有亲水性高分子刷的 分子印迹聚合物纳米颗粒，区别仅在于：功能单体与交联剂的摩尔比为 1 : 80。 所述分子印迹聚合物纳米颗粒的粒径为 850纳米， 交联度为—— 98.8 %。 实施例 9 以与实施例 5相同的方式制备根据本发明的表面具有亲水性高分子刷的 分子印迹聚合物纳米颗粒，区别仅在于：功能单体与交联剂的摩尔比为 1 : 40。 所述分子印迹聚合物纳米颗粒的粒径为 480纳米， 交联度为 97.6%。 实施例 10 以与实施例 5相同的方式制备根据本发明的表面具有亲水性高分子刷的 分子印迹聚合物纳米颗粒，区别仅在于：功能单体与交联剂的摩尔比为 1 : 20。 所述分子印迹聚合物纳米颗粒的粒径为 384纳米， 交联度为 95.2 %。 实施例 11 以与实施例 5相同的方式制备根据本发明的表面具有亲水性高分子刷的 分子印迹聚合物纳米颗粒，区别仅在于：功能单体与交联剂的摩尔比为 1 : 60。 所述分子印迹聚合物纳米颗粒的粒径为 620纳米， 交联度为 98.4 %。 实施例 12 以与实施例 5相同的方式制备根据本发明的表面具有亲水性高分子刷的 分子印迹聚合物纳米颗粒， 区别仅在于： 引发剂与功能单体和交联剂的摩尔 比为 0.5: 100。 所述分子印迹聚合物纳米颗粒的粒径为 240纳米， 交联度为 80%。 实施例 13 以与实施例 5相同的方式制备根据本发明的表面具有亲水性高分子刷的 分子印迹聚合物纳米颗粒， 区别仅在于： 引发剂与功能单体和交联剂的摩尔 比为 5: 100。所述分子印迹聚合物纳米颗粒的粒径为 130纳米，交联度为 80 %。 实施例 14 以与实施例 5相同的方式制备根据本发明的表面具有亲水性高分子刷的 分子印迹聚合物纳米颗粒， 区别仅在于： 引发剂与功能单体和交联剂的摩尔 比为 10: 100。 所述分子印迹聚合物纳米颗粒的粒径为 100 纳米， 交联度为 80 %。 实施例 15 以与实施例 5相同的方式制备根据本发明的表面具有亲水性高分子刷的 分子印迹聚合物纳米颗粒， 区别仅在于： 反应体系中仅包含亲水性大分子链 转移剂。 所述分子印迹聚合物纳米颗粒的粒径为 106 纳米， 交联度为 80 %。 实施例 16 以与实施例 5相同的方式制备根据本发明的表面具有亲水性高分子刷的 分子印迹聚合物纳米颗粒， 区别仅在于： 引发剂与链转移剂的摩尔比为 1 : 1。 所述分子印迹聚合物纳米颗粒的粒径为 220纳米， 交联度为 80 %。 实施例 17 以与实施例 5相同的方式制备根据本发明的表面具有亲水性高分子刷的 分子印迹聚合物纳米颗粒，区别仅在于：引发剂与链转移剂的摩尔比为 1 : 20。 所述分子印迹聚合物纳米颗粒的粒径为 137纳米， 交联度为 80%。 实施例 18 以与实施例 5相同的方式制备根据本发明的表面具有亲水性高分子刷的 分子印迹聚合物纳米颗粒，区别仅在于：弓 1发剂与链转移剂的摩尔比为 1 : 10。 所述分子印迹聚合物纳米颗粒的粒径为 145纳米， 交联度为 80 %。 实施例 19 以与实施例 5相同的方式制备根据本发明的表面具有亲水性高分子刷的 分子印迹聚合物纳米颗粒， 区别仅在于： 引发剂与链转移剂的摩尔比为 1 : 1。 所述分子印迹聚合物纳米颗粒的粒径为 150纳米， 交联度为 80 %。 实施例 20 以与实施例 5相同的方式制备根据本发明的表面具有亲水性高分子刷的 分子印迹聚合物纳米颗粒， 区别仅在于： 小分子链转移剂占链转移剂总量 95%。 所述分子印迹聚合物纳米颗粒的粒径为 450纳米， 交联度为 80 %。 以与实施例 5相同的方式制备根据本发明的表面具有亲水性高分子刷的 分子印迹聚合物纳米颗粒， 区别仅在于： 小分子链转移剂占链转移剂总量 50% o所述分子印迹聚合物纳米颗粒的粒径为 104纳米，交联度为 80 %。 实施例 22 以与实施例 5相同的方式制备根据本发明的表面具有亲水性高分子刷的 分子印迹聚合物纳米颗粒， 区别仅在于： 模板分子为百草枯。 所述分子印迹 聚合物纳米颗粒的粒径为 169纳米， 交联度为 80 %。 实施例 23 以与实施例 5相同的方式制备根据本发明的表面具有亲水性高分子刷的 分子印迹聚合物纳米颗粒， 区别仅在于： 功能单体是衣康酸。 所述分子印迹 聚合物纳米颗粒的粒径为 180纳米， 交联度为 80 %。 实施例 24 以与实施例 5相同的方式制备根据本发明的表面具有亲水性高分子刷的 分子印迹聚合物纳米颗粒， 区别仅在于： 功能单体是 N-乙烯基吡咯垸酮。 所 述分子印迹聚合物纳米颗粒粒径为 120纳米， 交联度为 80 %。 实施例 25 以与实施例 5相同的方式制备根据本发明的表面具有亲水性高分子刷的 分子印迹聚合物纳米颗粒， 区别仅在于： 交联剂是三甲基丙烯酸三羟甲基丙 酯。 所述分子印迹聚合物纳米颗粒的粒径为 208纳米， 交联度为 80 %。 实施例 26 以与实施例 5相同的方式制备根据本发明的表面具有亲水性高分子刷的 分子印迹聚合物纳米颗粒， 区别仅在于： 交联剂是二乙烯苯。 所述分子印迹 聚合物纳米颗粒的粒径为 174纳米， 交联度为 80 %。 实施例 27 以与实施例 5相同的方式制备根据本发明的表面具有亲水性高分子刷的 分子印迹聚合物纳米颗粒， 区别仅在于： 亲水性大分子链转移剂是聚乙二醇 且溶剂是 N，N-二甲基甲酰胺和乙腈混合物4:l, 体积 /体积)。 所述分子印迹聚 合物纳米颗粒的粒径为 370纳米， 交联度为 80 %。 实施例 28 以与实施例 5相同的方式制备根据本发明的表面具有亲水性高分子刷的 分子印迹聚合物纳米颗粒， 区别仅在于： 亲水性大分子链转移剂是聚 N-异丙 基丙烯酰胺且溶剂是 N，N-二甲基甲酰胺和乙腈混合物 (4:1, 体积 /体积：)。 所述 分子印迹聚合物纳米颗粒的粒径为 480 纳米， 交联度为 80 %。 实施例 29 以与实施例 5相同的方式制备根据本发明的表面具有亲水性高分子刷的 分子印迹聚合物纳米颗粒，区别仅在于：小分子链转移剂是黄原酸 0-乙基 S-(2- 乙氧基羰基丙 -2-基酯：)。 所述分子印迹聚合物纳米颗粒的粒径为 500纳米， 交 联度为 80 %。 实施例 30 以与实施例 5相同的方式制备根据本发明的表面具有亲水性高分子刷的 分子印迹聚合物纳米颗粒， 区别仅在于： 溶剂为丁酮。 所述分子印迹聚合物 纳米颗粒的粒径为 450纳米， 交联度为 80 %。 如附图 2， 4和 5中所示出的， 通过本发明的方法获得了表面具有亲水性 高分子刷的分子印迹聚合物纳米颗粒。 不局限于理论， 发明人认为由于本发 明中的大分子链转移剂在反应初始就存在， 所以在活性的 RAFT聚合引发后， 活性引发中心即刻转移到大分子链转移剂上， 然后在特定的反应体系条件下， 多个链转移剂的活性中心引发单烯类功能单体和交联剂进行活性交联聚合， 从而获得纳米微球， 并且大分子引发剂的末端位于纳米微球的核部分的外部 形成亲水性高分子刷。 另外， 由于 RAFT聚合是活性聚合， 因此所得纳米颗 粒的尺寸是均匀的， 如图 2， 4和 5中所示的， gp， 粒径分布窄。 在洗脱模板 分子之后， 在纳米颗粒的核部分中留下模板分子的印迹空穴， 因此本发明的 纳米微球能够对样品中存在的模板分子进行特异性的吸附， 即吸附的选择性 高， 如以下的测试实施例所证实的。 测试实施例 图 6， 将不同质量的表面具有亲水性聚甲基丙烯酸 2-羟基乙酯高分子刷 ( NJNMR = 4800；)的分子印迹聚合物纳米颗粒及其非印迹聚合物纳米颗粒浸入 2,4-D的纯牛奶和纯血清溶液中 (2,4-D的浓度为 0.02 mM),室温震摇 16小时。 离心除去固体颗粒， 取 400微升上层乳液部分， 加入 600微升乙腈， 超声处 理 5分钟， 离心后将全部液体用乙腈 /水 (3/2， 体积 /体积：)定容到 lmL。 之后用 HPLC检测溶液中 2,4-D的浓度。可以计算得到表面具有亲水性聚甲基丙烯酸 2-羟基乙酯高分子刷 (Λ^,ΝΜΚ = 4800；)的分子印迹聚合物纳米颗及其非印迹聚合 物纳米颗粒吸附样品中模板分子 2,4-D的比例。 HPLC测试条件： 甲醇和 0.5%乙酸的水溶液混合后 (测试牛奶样品体积比
3/1， 测试血清样品体积比 4/1)作为流动相， 流速为每分钟 lmL， 检测波长为 284纳米。 图 7 将一定质量的表面具有亲水性聚甲基丙烯酸 2-羟基乙酯高分子刷 ( NJNMR = 4800；)的分子印迹聚合物纳米颗粒及其非印迹聚合物纳米颗粒浸入 2,4-D和 POAc的纯牛奶和纯血清溶液中 (2,4-D和 POAc的浓度均为 0.02 mM), 室温震摇 16小时。 离心除去固体颗粒， 取 400微升上层乳液部分， 加入 600 微升乙腈， 超声处理 5分钟， 离心后将全部液体用乙腈 /水 (3/2， 体积 /体积)定 容到 lmL。 之后用 HPLC检测溶液中 2,4-D和 POAc的浓度。 可以计算得到 表面具有亲水性聚甲基丙烯酸 2-羟基乙酯高分子刷 (MN,NMR = 4800；)的分子印 迹聚合物纳米颗及其非印迹聚合物纳米颗粒吸附样品中模板分子 2,4-D 和类 似物 POAc的比例。
HPLC测试条件： 甲醇和 0.5%乙酸的水溶液混合后 (体积比 3/2)作为流动 相， 流速为每分钟 lmL， 检测波长为 272纳米。 图 8. 将不同质量的表面具有亲水性聚甲基丙烯酸 2-羟基乙酯高分子刷 ( njNMR = 4800；)的分子印迹聚合物 (：心得安 -ΜΙΡ-2;)纳米颗粒及其非印迹聚合物 (CP)纳米颗粒浸入心得安的纯牛奶和纯血清溶液中（心得安的浓度为 0.05 mM) , 室温震摇 16小时。 离心除去固体颗粒， 取 400微升上层乳液部分， 加 入 600微升乙腈， 超声处理 5分钟， 离心后将全部液体用乙腈 /水 (3/2， 体积 / 体积)定容到 lmL。 之后用 HPLC检测溶液中心得安的浓度。 可以计算得到表 面具有亲水性聚甲基丙烯酸
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= 4800；)的分子印迹 聚合物 (心得安 -MIP-2)纳米颗及其非印迹聚合物 (CP)纳米颗粒吸附样品中模 板分子心得安的比例。 HPLC测试条件： 乙腈和 0.4%三乙胺的水溶液混合后 (体积比 7/3)作为流 动相， 流速为每分钟 lmL， 检测波长为 293纳米。 图 9. 将一定质量的表面具有亲水性聚甲基丙烯酸 2-羟基乙酯高分子刷 ( njNMR = 4800；)的分子印迹聚合物 (：心得安 -ΜΙΡ-2;)纳米颗粒及其非印迹聚合物 (CP)纳米颗粒浸入心得安和阿替洛尔的纯牛奶和纯血清溶液中 (心得安和阿替 洛尔的浓度均为 0.05 mM) , 室温震摇 16小时。 离心除去固体颗粒， 取 400微 升上层乳液部分， 加入 600微升乙腈， 超声处理 5分钟， 离心后将全部液体 用乙腈 /水 (3/2， 体积 /体积)定容到 lmL。之后用 HPLC检测溶液中心得安和阿 替洛尔的浓度。 可以计算得到表面具有亲水性聚甲基丙烯酸 2-羟基乙酯高分 子刷 (Λ ,ΝΜΚ = 4800；)的分子印迹聚合物 (：心得安 -ΜΙΡ-2;)纳米颗及其非印迹聚合 物 (CP)纳米颗粒吸附样品中模板分子心得安和类似物阿替洛尔的比例。
HPLC测试条件： 乙腈和 0.4%三乙胺的水溶液混合后 (体积比 7/3)作为流 动相， 流速为每分钟 lmL， 检测波长为 275纳米。 如以上的测试实施例中所证明的， 本发明的纳米颗粒在水性样品以及生 物样品、 特别是纯生物样品中对于模板分子的识别能力与其在有机溶剂中的 识别能力几乎完全相同 (考虑到不可避免的试验误差：)。不局限于理论， 申请人 认为这是由于本申请的方法获得了具有特定结构和性质的纳米颗粒， 该纳米 颗粒能够有效地识别水性样品以及生物样品、 特别是纯生物样品中的模板分 子， 并且不受例如生物样品中的蛋白质等高含量成分的干扰。 这在本发明之 前是未知的并且不可预期的。 因此， 本发明的纳米颗粒能够有效地用于水性 样品以及生物样品、 特别是纯生物样品中特异性地识别特定的模板分子。 例 如， 通过本发明的纳米颗粒能够方便地识别牛奶中的抗生素和农药残余， 这 在食品安全等领域具有巨大的应用。 由于以上特性， 本发明的纳米颗粒能够应用在生物样品分析、 医学临床 免疫分析、 食品与环境监测和 /或仿生传感器制造中。 例如， 本发明的纳米颗 粒能够用于制备用于生物样品的传感器等。 虽然针对特定实施方案描述了本发明， 但是许多其它变化和修正以及其 它应用对于本领域技术人员来说将变得明显。 因此， 优选本发明不受说明书 的具体公开内容限制， 而仅受所附权利要求限制。

Claims

权 利 要 求
1. 一种表面具有亲水性高分子刷的分子印迹聚合物纳米颗粒， 其特征是 交联度 >50%，粒径为 10 500纳米，优选为 10 300纳米，更优选为 10 250纳米， 所述纳米颗粒能够识别生物样品、 特别是纯生物样品中的模板分子， 所述分子印迹聚合物纳米颗粒是在模板分子存在下， 由单烯类功能单体 与交联剂在亲水性大分子链转移剂和任选的小分子链转移剂诱导下进行可逆 加成 -裂解链转移 (RAFT)沉淀聚合得到的。
2. —种表面具有亲水性高分子刷的分子印迹聚合物纳米颗粒， 其特征是 所述纳米颗粒具有由交联聚合物网络形成的核部分以及在核部分表面上的亲 水性高分子刷，
所述核部分的交联度 >50%， 粒径为 10~500纳米， 优选为 10~300纳米， 更 优选为 10~250纳米， 所述纳米颗粒的核部分具有能够识别生物样品、 特别是 纯生物样品中的模板分子的分子印迹孔穴。
3. 根据之前权利要求任一项所述的分子印迹聚合物纳米颗粒， 其特征是 所述纳米颗粒的粒径分布窄， 优选地所述纳米颗粒根据 ISO 13321采用动态光 散射法测得的粒径分布指数小于或等于 0.6， 优选地小于或等于 0.5， 优选地小 于或等于 0.4， 优选地小于或等于 0.3， 优选地小于或等于 0.2， 优选地小于或等 于 0.1。
4. 根据权利要求 1所述的分子印迹聚合物纳米颗粒， 其特征是所述可逆 加成 -裂解链转移 (RAFT)沉淀聚合是在亲水性大分子链转移剂与小分子链转 移剂的共同诱导下进行的。
5. 根据之前权利要求任一项所述的分子印迹聚合物纳米颗粒， 其特征在 于所述的模板分子选自氨基酸、 生物受体、 核酸、 类、 免疫抑制剂、 激素、 肝素、 抗生素、 维生素、 病理或疾病状态的生物标记小分子、 毒素、 杀虫剂、 除草剂、 炸药、 神经毒剂、 内分泌干扰化合物、 核苷酸、 核苷、 低聚核苷酸、 代谢物、 次级代谢产物、 药物代谢物、 药物或药物中间体或药物的有机小分 子， 特别地所述模板分子选自： 心得安、 戊脉安、 戊垸脒、 茶碱、 咖啡因、 吗啡、 阿替洛尔、 扑热息痛、 布洛芬、 萘普生、 沙美利定、 喷他脒、 维拉拍 米、 反胺苯环醇、 多巴胺、 甲基沙美利定、 异戊巴比妥、 阿夫唑嗪、 齐多呋 定、 司他呋定、 布比卡因、 甲哌卡因、 罗哌卡因、 酞胺哌啶酮、 那蒙特金、 单嘧磺隆、 尼古丁、 紫杉醇、 维生素 B、 维生素 B2、 麻黄素、 苯丙氨酸苯胺、 苯妥英、 地西潘、 双氯醇胺、 溴代双氯醇胺、 双酚 A、 对叔丁基苯酚、 对硝基 苯酚、 对氯酚、 苯并芘、 磷酸二苯酯、 甲磺隆、 单嘧磺隆、 瘦肉精、 9-乙基腺 嘌呤、 三聚氰胺、 槲皮素、 芦丁、 青霉素、 红霉素、 四环素、 土霉素、 氯霉 素、 赭曲霉毒素 A、 四环素、 氟哌酸、 氟喹诺酮、 头孢氨苄、 环丙沙星、 恩诺 沙星、 恩佛沙星、 氧氟沙星、 头孢硫脒、 阿莫西林、 卡马西平、 奥卡西平、 三甲氧苄二氨嘧啶、 磷酸酯、 一硫代磷酸酯、 二硫代磷酸酯、 焦磷酸酯、 磷 酰胺、 硫代磷酰胺、 N-甲基氨基甲酸酯、 二甲基氨基甲酸酯、 三嗪、 脒类、 沙蚕毒类、 脲类、 二硫代氨基甲酸盐、 氨基磺酸类、 硫代磺酸酯类、 三氯甲 硫基类、 抗蚜威、 吡虫啉、 莠去津、 莠灭净、 甲草胺、 乙草胺、 丁草胺、 异 丙甲草胺、 扑草净、 二甲戊灵、 百草枯、 精喹禾灵、 咪唑乙烟酸、 氟磺胺草 醚、 异恶草松、 草除灵、 双甲脒、 二嗪磷、 乙酰甲胺磷、 溴氰菊酯、 异丙隆、 非草隆、 利谷隆、 甲氧隆、 绿麦隆、 秀谷隆、 戊唑醇、 2-甲基 -4-氯苯氧乙酸、 2,4-二氯苯氧乙酸 (2,4-D)、 2,4,5-三氯苯氧乙酸、 西玛津、 扑灭津、 特丁津、 雌 二醇、 乙炔基雌二醇、 17-β-雌二醇、 睾丸酮、 葡糖苷酸睾酮、 醋酸皮质酮、 皮炎平、 皮康霜、 恩肤霜、 复方酮康唑霜、 复方酮纳乐霜、 去炎松软膏、 乐 肤液、 皮康王、 艾洛松、 优卓尔、 适确得、 复方适确得、 特美肤、 索康、 喜 乐、 地塞米松磷酸钠、 可的松、 氢化可的松、 醋酸氢化可的松、 丁酸氢化可 的松、 地塞米松、 醋酸地塞米松、 强的松、 双丙酸倍氯米松、 糠酸莫米松、 氟轻松、 丙酸倍他米松、 卤美他松、 倍氯美松、 双醋氟美松的确当、 百力特、 点必舒、 艾氟龙、 曲安西龙、 哈西奈德或丙酸氯倍他索， 优选为心得安、 茶 碱、 咖啡因、 双酚 Α、 青霉素、 红霉素、 四环素、 氟哌酸、 双甲脒、 二嗪磷、 乙酰甲胺磷、 溴氰菊酯、 2,4-二氯苯氧乙酸 (2,4-D)、 雌二醇或睾丸酮， 更优选 为心得安或 2,4-二氯苯氧乙酸 (2,4-D)。
6. 根据之前权利要求任一项所述的分子印迹聚合物纳米颗粒， 其特征在 于所述的单烯类功能单体选自 C2-C8单烯烃、 乙烯基芳香族化合物、 乙烯基杂 芳族化合物， 单烯属不饱和羧酸及其盐、 酯和酰胺， 乙烯基醇及其酯、 烯丙 基醇及其酯、 乙烯基醚、 乙烯基内酰胺、 乙烯基卤化物、 偏二卤乙烯， （甲基:) 丙烯酸及其酯、 盐、 酰胺、 乙烯基吡啶化合物及其组合， 优选为 4-乙烯吡啶、 2-乙烯吡啶、 4-乙烯基苯甲酸、 （甲基:)丙烯酸、 三氟甲基丙烯酸、 甲基丙烯酸 2-羟基乙酯、 甲基丙烯酸二甲氨基乙酯、 （甲基：)丙烯酰胺、 2-丙烯酰胺基 -2-甲 基 -1-丙磺酸、 4-乙烯基咪唑、 衣康酸或 N-乙烯基吡咯烷酮或其混合物， 更优 选为 4-乙烯吡啶或甲基丙烯酸。
7. 根据之前权利要求任一项所述的分子印迹聚合物纳米颗粒， 其特征在 于所述的交联剂是具有两个或更多个非共轭烯属不饱和双键的单体， 优选选 自： 至少二元醇的丙烯酸酯、 甲基丙烯酸酯、 烯丙基醚或乙烯基醚； 不饱和 一元醇的乙烯基酯或者不饱和一元醇与烯属不饱和 C3-C6羧酸的酯； 不饱和羧 酸与多元醇的酯； 具有至少两个双键的直链或支化、 线性或环状、 脂肪族或 芳香族烃， 在脂族烃的情况下， 所述双键不应共轭； 至少双官能胺的丙烯酰 胺、 甲基丙烯酰胺和 N-烯丙胺； 及其组合， 更优选为双甲基丙烯酸乙二醇酯、 三甲基丙烯酸三羟甲基丙酯、 季戊四醇三丙烯酸酯、 二乙烯苯、 N，N'-亚甲基 双丙烯酰胺、 N，N'-乙基双丙烯酰胺、 N，N'-1,4-苯基双丙烯酰胺或 1,4-二丙烯酰 哌嗪或其混合物， 还更优选为双甲基丙烯酸乙二醇酯。
8. 根据之前权利要求任一项所述的分子印迹聚合物纳米颗粒， 其特征在 于所述的亲水性大分子链转移剂为具有双硫酯或三硫酯端基的亲水性聚合 物， 所述亲水性聚合物优选选自： 聚醇、 聚 (内酰胺：)、 聚氨酯、 聚 (甲基：)丙烯 酸、 聚丙烯酰胺、 聚乙烯醇、 聚乙烯醚、 聚酯、 聚乙烯胺、 聚乙烯亚胺、 聚 环氧烷、 聚 (羧酸：)， 聚酰胺、 聚酐、 聚磷腈、 纤维素、 肝素、 葡聚糖、 多肽、 纤维蛋白和弹性蛋白、 多糖、 透明质酸、 藻酸盐、 明胶和几丁质、 白蛋白、 寡肽、 短链肽和寡核苷酸及由得到上述聚合物的单体获得的共聚物， 更优选 为聚乙二醇、 聚 N-异丙基丙烯酰胺、 聚甲基丙烯酸 2-羟基乙酯、 聚 (：甲基：)丙烯 酰胺、聚 N，N-二甲基丙烯酰胺、聚 N，N-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯、 聚甲基 丙烯酸二甲胺基乙酯、 聚 ([2- (甲基丙烯酰氧基：)乙基]二甲基 磺丙基：)氢氧化 铵：)、 聚 (3-2-N-甲基丙烯酰氧乙基 -N，N-二甲基磺酸丙基胺：)、 聚2-甲基丙烯酰 氧乙基磷酸胆碱：)、 （氧 磺酰基丙基三甲基-缩水甘油基：)十一垸基酯硫代 甲基：)乙烯 -氧基 (正十二垸基硫代甲基：)乙烯：)共聚物、 聚 (丙烯酰胺基 -2-甲基 -1- 丙磺酸：)、 聚 (甲基丙烯酰乙基磺基甜菜碱：)、 聚 (甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化 铵：)、 聚 (3-甲基丙烯酸磺丙酯钾盐：)、 聚 (4- [二甲基 (2'-甲基丙烯酰氧基乙基：)铵] 丁酸酯：)、 聚 (甲基丙烯酸 3-磺酸丙酯钾盐：)、 聚 (甲基丙烯酸甲酯磺基甜菜碱：)、 聚 (甲基丙烯酰胺磺基甜菜碱 )、 聚 (苯乙烯磺酸盐 )、 聚 (苯乙烯磺酸：)、 聚丙烯 酸、 聚甲基丙烯酸、 聚甲基丙烯氨酸钠、 甲氧基三 (乙二醇：)甲基丙烯酸酯-甲 基丙烯酸共聚物、 聚 (乙二醇：)、 聚 (乙二醇：)甲基醚甲基丙烯酸酯、 聚环氧垸、 聚环氧乙烷、聚 (：低聚 (乙二醇：)甲基醚甲基丙烯酸酯：)、聚 (甲基丙烯酸氧乙二醇 酯：)、 聚 (N-甲基甘氨酸：)、 聚 (L-谷氨酸：)、 聚 (L-赖氨酸：)、 聚 (N-异丙基甲基丙烯 酰胺)、 聚 (N-羟甲基丙烯酰胺)、 聚 (N-[(2,2-二甲基 -1,3-二氧戊环)甲基)丙烯酰 胺：)、 聚 (N- 2-羟丙基：)甲基丙烯酰胺：)、 聚 (：丙烯酸 2-羟乙酯：)、 聚 (2,3-二羟基丙 基甲基丙烯酸酯：)、聚 (：醚胺：)、聚 (N-乙烯基吡咯烷酮：)、聚 (N-乙烯基己内酰胺：)、 聚2-噁唑啉：)及其衍生物、 聚 (2- (二乙基氨基：)乙基丙烯酸酯：)、 聚 (2- (二甲基氨 基)乙基甲基丙烯酸酯)、 聚2- (二乙基氨基：)乙基甲基丙烯酸酯：)、 聚2-乙烯基 吡啶：)、 聚 1-乙烯基咪唑：)、 聚 (N-丙烯酰吗啉：)、 聚 (：磷酸乙基乙二醇酯：)及由得 到上述聚合物的单体获得的共聚物。
9. 根据权利要求 1或 3-8任一项所述的分子印迹聚合物纳米颗粒， 其特征 在于所述小分子链转移剂具有以下结构：
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其中： R=垸基、 链烯 (炔)基、 芳基、 芳垸基、 取代垸基、 取代芳基、 碳 环或杂环、 垸氧基或二垸基氨基；
Z=垸基、 芳基、 芳垸基、 取代垸基、 取代芳基、 碳环或杂环、 垸硫基、 芳硫基、 垸氧羰基、 芳氧羰基、 酰氧基、 氨基甲酰基、 氰基、 垸基芳基二取 代氨基、 垸氧基、 芳氧基、 二垸基 -或二芳基膦酸基， 或二垸基-或二芳基-次 膦酸基， 所述小分子链转移剂优选选自： 双硫酯或三硫酯有机化合物、 硫代羰基 硫代化合物， 例如： 1-吡咯二硫代羧酸 2-氰基丙 -2-基 -酯、 1-吡咯二硫代羧酸 2-氰基丁 -2-基酯、 1-咪唑二硫代羧酸苄基酯、 二硫代苯甲酸异丙苯酯、 二硫代 氰基异丙酯、 二硫代苯甲酸异丁酸酯、 十二垸基 -S'-(o，o "-二甲基 -O "-乙酸:)三 硫代碳酸酯、 十二垸基 -V-异丙酸-三硫代碳酸酯， 黄原酸酯衍生物， 例如： 黄原酸 (9-乙基 苯乙基:)酯、 黄原酸 0-乙基 S-(2-乙氧基羰基丙 -2-基酯:)和黄 原酸 (9-乙基 (2-氰基异丙基：)酯。
10. 根据之前权利要求任一项所述的分子印迹聚合物纳米颗粒，其特征在 于模板分子、 单烯类功能单体与交联剂的摩尔比为 1 : 1~10:4~80。
11. 根据之前权利要求任一项所述的分子印迹聚合物纳米颗粒，其特征在 于单烯类功能单体和交联剂总量与链转移剂 (包括任选的小分子链转移剂与亲 水性大分子链转移剂:)的摩尔比为 500: 1~10:1， 优选为 200: 1~10:1， 更优选为 150:1到 50:1， 还更优选为 120: 1到 80: 1。
12. 根据之前权利要求任一项所述的分子印迹聚合物纳米颗粒，其特征在 于在小分子链转移剂与亲水性大分子链转移剂组成的链转移剂中， 小分子链 转移剂所占摩尔百分数为 0~95%， 优选为 1~85%， 更优选为 10~75%， 还更优 选为 15~70%。
13. 根据之前权利要求任一项所述的分子印迹聚合物纳米颗粒，其特征在 于所述亲水性高分子刷由所述大分子链转移剂形成。
14. 根据之前权利要求任一项所述的分子印迹聚合物纳米颗粒，其特征在 于所述亲水性大分子链转移剂的数均分子量为 500到 50000， 优选为 1000到 30000， 更优选为 1500到 8000， 更优选为 2000到 5000。
15. 一种制备根据权利要求 1-14任一项所述的表面具有亲水性高分子刷 的分子印迹聚合物纳米颗粒的方法， 包括以下歩骤： 1)将模板分子、 单烯类功能单体、 交联剂、 溶剂、 自由基引发剂与亲水性 大分子链转移剂和任选的小分子链转移剂混匀， 除氧后， 在 25~100°C反应 1~500小时、 优选为 1~100小时， 得到含有模板分子的聚合物纳米颗粒； 和
2)采用适当的溶剂对含有模板分子的聚合物纳米颗粒进行清洗直至没有 模板分子洗出为止， 得到表面具有亲水性高分子刷的分子印迹聚合物纳米颗 粒。
16.—种制备根据权利要求 1-14任一项所述的表面具有亲水性高分子刷的 分子印迹聚合物纳米颗粒的方法， 其特征在于包括以下歩骤：
1)将模板分子、 单烯类功能单体、 交联剂、 溶剂、 自由基引发剂与亲水性 大分子链转移剂和任选的小分子链转移剂混匀， 通氩气或氮气 5~60分钟除氧 后，将反应器置于 25~100°C油浴中反应 1~100小时，超声分散 5~30分钟，高 (超：) 速离心得到含有模板分子的聚合物纳米颗粒； 和
2)将含有模板分子的聚合物纳米颗粒先用甲醇 /乙酸（体积比为 10/0.1~10/10)的混合液清洗 12~72小时， 再用甲醇清洗 12~48小时， 直至没有模 板分子洗出为止， 然后于 20~60°C真空干燥至恒重， 即得到表面具有亲水性高 分子刷的分子印迹聚合物纳米颗粒。
17. 根据权利要求 15或 16所述的表面具有亲水性高分子刷的分子印迹聚 合物纳米颗粒的制备方法， 其特征是通过改变功能单体、 交联剂、 引发剂、 小分子链转移剂、 大分子链转移剂、 模板分子以及溶剂的种类和用量， 制备 一系列对不同模板分子具有分子识别功能、 且表面具有亲水性高分子刷的分 子印迹聚合物纳米颗粒。
18. 根据权利要求 15-17任一项所述的表面具有亲水性高分子刷的分子 印迹聚合物纳米颗粒的制备方法， 其特征是所述的引发剂为偶氮类自由基引 发剂、 过氧化物类自由基引发剂或氧化还原类引发剂， 所述偶氮类自由基引 发剂优选选自： 2,2'-偶氮二 (异丁腈)、 2,2'-偶氮二 (异庚腈)、 2,2'-偶氮双 (2-氰基 -2-丁垸：)、 二甲基 2,2'-偶氮双 (甲基异丁酸酯：)、 4,4'-偶氮双 (4-氰基戊酸：)、 4,4'- 偶氮双 (4-氰基-戊 -1-醇)、 Ι,Γ-偶氮双 (环己腈)、 2- (叔丁基偶氮 )-2-氰基丙垸、 2,2'-偶氮双 [2-甲基 -N-(l,l)-双 (羟甲基) -2-羟基乙基]丙酰胺、2,2'-偶氮双 [2-甲基 -N-羟基乙基: Π-丙酰胺、二盐酸 2,2'-偶氮双 (N，N'_二亚甲基异丁咪：)、二盐酸 2,2'- 偶氮双 (2-脒基丙垸：)、 2,2'-偶氮双 _(N，N'-二亚甲基异丁胺：)、 2,2'-偶氮双 (2-甲基 -N-[l,l-双- (羟基甲基: )-2-羟基乙基： I丙酰胺：)、 2,2'-偶氮双 (2-甲基 -N-[l,l-双 (羟基 甲基：)乙基]丙酰胺：)、 2,2'-偶氮双 [2-甲基 羟基乙基：)丙酰胺]、 二水合 2,2'- 偶氮双 (异丁酰胺 )、 2,2'-偶氮双 (2,2,4-三甲基戊垸：)、 2,2'-偶氮双 (2-甲基丙垸: 所述过氧化物类自由基引发剂优选选自： 过氧乙酸叔丁酯、 过氧苯甲酸叔丁 酯、 过氧辛酸叔丁酯、 过氧新癸酸叔丁酯、 过氧异丁酸叔丁酯、 过氧新戊酸 叔戊酯、 过氧新戊酸叔丁酯、 过氧二碳酸二异丙酯、 过氧二碳酸二环己酯、 过氧化二异丙苯、 过氧化二苯甲酰、 过氧化十二垸酰、 过二硫酸钾、 过二硫 酸铵、 连二次硝酸二叔丁酯、 过氧化二叔丁基或连二次硝酸二异丙苯酯、 异 丙苯过氧化氢、 叔丁基过氧化氢； 对于所述氧化还原类引发剂来说， 氧化剂 包括有机 (垸基-、 芳基-、 或酰基：)氢过氧化物、 过硫酸盐、 过磷酸盐、 或有机 过氧化物， 优选的氧化剂包括过硫酸盐和有机氢过氧化物， 最优选的氧化剂 包括铵、 钠、 或钾的过硫酸盐， 和叔丁基过氧化氢， 还原剂包括甲醛合次硫 酸氢钠、 亚硫酸钠、 焦亚硫酸钠、 连二亚硫酸钠、 抗坏血酸、 异抗坏血酸、 肼、 羟基胺或羟基胺盐、 还原糖、 硫醇、 以及亚磺酸衍生物、 三乙基铝、 三 乙基硼、 叔胺， 优选的还原剂包括甲醛合次硫酸氢钠、 焦亚硫酸钠、 异抗坏 血酸、 连二亚硫酸钠、 硫代硫酸钠、 亚硫酸钠， 最优选的还原剂包括连二亚 硫酸钠。
19. 根据权利要求 15-18任一项所述的表面具有亲水性高分子刷的分子 印迹聚合物纳米颗粒的制备方法， 其特征是聚合所用的溶剂为乙腈、 乙腈 /甲 苯、 乙腈 /四氢呋喃、 乙腈 /甲醇、 乙腈 /乙醇、 乙腈 /丙醇、 乙腈 /丁醇、 乙腈 / 戊醇、 甲醇、 乙醇、 丙醇、 丁醇、 戊醇、 水、 甲醇 /水、 乙醇 /水、 丙醇 /水、 丁 醇 /水、 戊醇 /水、 甲苯、 四氢呋喃、 N，N-二甲基甲酰胺、 二甲基亚砜、 丁酮或 石蜡油。
20. 根据权利要求 15-19任一项所述的表面具有亲水性高分子刷的分子印 迹聚合物纳米颗粒的制备方法， 其特征是所述可逆加成 -裂解链转移 (RAFT)沉 淀聚合是在亲水性大分子链转移剂与小分子链转移剂的共同诱导下进行的。
21. 根据权利要求 15-20任一项所述的表面具有亲水性高分子刷的分子印 迹聚合物纳米颗粒的制备方法， 其特征在于所述的模板分子选自氨基酸、 生 物受体、 核酸、 类、 免疫抑制剂、 激素、 肝素、 抗生素、 维生素、 病理或 疾病状态的生物标记小分子、 毒素、 杀虫剂、 除草剂、 炸药、 神经毒剂、 内 分泌干扰化合物、 核苷酸、 核苷、 低聚核苷酸、 代谢物、 次级代谢产物、 药 物代谢物、 药物或药物中间体或药物的有机小分子， 特别地所述模板分子选 自： 心得安、 戊脉安、 戊垸脒、 茶碱、 咖啡因、 吗啡、 阿替洛尔、 扑热息痛、 布洛芬、 萘普生、 沙美利定、 喷他脒、 维拉拍米、 反胺苯环醇、 多巴胺、 甲 基沙美利定、 异戊巴比妥、 阿夫唑嗪、 齐多呋定、 司他呋定、 布比卡因、 甲 哌卡因、 罗哌卡因、 酞胺哌啶酮、 那蒙特金、 单嘧磺隆、 尼古丁、 紫杉醇、 维生素 B、 维生素 B2、 麻黄素、 苯丙氨酸苯胺、 苯妥英、 地西潘、 双氯醇胺、 溴代双氯醇胺、 双酚 A、 对叔丁基苯酚、 对硝基苯酚、 对氯酚、 苯并芘、 磷酸 二苯酯、 甲磺隆、 单嘧磺隆、 瘦肉精、 9-乙基腺嘌呤、 三聚氰胺、 槲皮素、 芦 丁、 青霉素、 红霉素、 四环素、 土霉素、 氯霉素、 赭曲霉毒素 A、 四环素、 氟 哌酸、 氟喹诺酮、 头孢氨苄、 环丙沙星、 恩诺沙星、 恩佛沙星、 氧氟沙星、 头孢硫脒、 阿莫西林、 卡马西平、 奥卡西平、 三甲氧苄二氨嘧啶、 磷酸酯、 一硫代磷酸酯、 二硫代磷酸酯、 焦磷酸酯、 磷酰胺、 硫代磷酰胺、 N-甲基氨 基甲酸酯、 二甲基氨基甲酸酯、 三嗪、 脒类、 沙蚕毒类、 脲类、 二硫代氨基 甲酸盐、 氨基磺酸类、 硫代磺酸酯类、 三氯甲硫基类、 抗蚜威、 吡虫啉、 莠 去津、 莠灭净、 甲草胺、 乙草胺、 丁草胺、 异丙甲草胺、 扑草净、 二甲戊灵、 百草枯、 精喹禾灵、 咪唑乙烟酸、 氟磺胺草醚、 异恶草松、 草除灵、 双甲脒、 二嗪磷、 乙酰甲胺磷、 溴氰菊酯、 异丙隆、 非草隆、 利谷隆、 甲氧隆、 绿麦 隆、 秀谷隆、 戊唑醇、 2-甲基 -4-氯苯氧乙酸、 2,4-二氯苯氧乙酸 (2,4-D)、 2,4,5- 三氯苯氧乙酸、 西玛津、 扑灭津、 特丁津、 雌二醇、 乙炔基雌二醇、 17-β-雌 二醇、 睾丸酮、 葡糖苷酸睾酮、 醋酸皮质酮、 皮炎平、 皮康霜、 恩肤霜、 复 方酮康唑霜、 复方酮纳乐霜、 去炎松软膏、 乐肤液、 皮康王、 艾洛松、 优卓 尔、 适确得、 复方适确得、 特美肤、 索康、 喜乐、 地塞米松磷酸钠、 可的松、 氢化可的松、 醋酸氢化可的松、 丁酸氢化可的松、 地塞米松、 醋酸地塞米松、 强的松、 双丙酸倍氯米松、 糠酸莫米松、 氟轻松、 丙酸倍他米松、 卤美他松、 倍氯美松、 双醋氟美松的确当、 百力特、 点必舒、 艾氟龙、 曲安西龙、 哈西 奈德或丙酸氯倍他索， 优选为心得安、 茶碱、 咖啡因、 双酚 Α、 青霉素、 红霉 素、 四环素、 氟哌酸、 双甲脒、 二嗪磷、 乙酰甲胺磷、 溴氰菊酯、 2,4-二氯苯 氧乙酸 (2,4-D：)、雌二醇或睾丸酮，更优选为心得安或 2,4-二氯苯氧乙酸 (2,4-D：)。
22. 根据权利要求 15-21任一项所述的表面具有亲水性高分子刷的分子印 迹聚合物纳米颗粒的制备方法， 其特征在于所述的单烯类功能单体选自 C2-C8 单烯烃、 乙烯基芳香族化合物、 乙烯基杂芳族化合物， 单烯属不饱和羧酸及 其盐、 酯和酰胺， 乙烯基醇及其酯、 烯丙基醇及其酯、 乙烯基醚、 乙烯基内 酰胺、 乙烯基卤化物、 偏二卤乙烯， （甲基：)丙烯酸及其酯、 盐、 酰胺、 乙烯基 吡啶化合物及其组合， 优选为 4-乙烯吡啶、 2-乙烯吡啶、 4-乙烯基苯甲酸、 （甲 基：)丙烯酸、 三氟甲基丙烯酸、 甲基丙烯酸 2-羟基乙酯、 甲基丙烯酸二甲氨基 乙酯、 （甲基：)丙烯酰胺、 2-丙烯酰胺基 -2-甲基 -1-丙磺酸、 4-乙烯基咪唑、 衣康 酸或 N-乙烯基吡咯垸酮或其混合物， 更优选为 4-乙烯吡啶或甲基丙烯酸。
23. 根据权利要求 15-22任一项所述的表面具有亲水性高分子刷的分子印 迹聚合物纳米颗粒的制备方法， 其特征在于所述的交联剂是具有两个或更多 个非共轭烯属不饱和双键的单体， 优选选自： 至少二元醇的丙烯酸酯、 甲基 丙烯酸酯、 烯丙基醚或乙烯基醚； 不饱和一元醇的乙烯基酯或者不饱和一元 醇与烯属不饱和 C3-C6羧酸的酯； 不饱和羧酸与多元醇的酯； 具有至少两个双 键的直链或支化、 线性或环状、 脂肪族或芳香族烃， 在脂族烃的情况下， 所 述双键不应共轭； 至少双官能胺的丙烯酰胺、 甲基丙烯酰胺和 N-烯丙胺； 及 其组合， 更优选为双甲基丙烯酸乙二醇酯、 三甲基丙烯酸三羟甲基丙酯、 季 戊四醇三丙烯酸酯、 二乙烯苯、 N，N'-亚甲基双丙烯酰胺、 N，N'-乙基双丙烯酰 胺、 N，N'-1,4-苯基双丙烯酰胺或 1,4-二丙烯酰哌嗪或其混合物， 还更优选为双 甲基丙烯酸乙二醇酯。
24. 根据权利要求 15-23任一项所述的表面具有亲水性高分子刷的分子印 迹聚合物纳米颗粒的制备方法， 其特征在于所述的亲水性大分子链转移剂为 具有双硫酯或三硫酯端基的亲水性聚合物， 所述亲水性聚合物优选选自： 聚 醇、 聚 (内酰胺：)、 聚氨酯、 聚 (甲基：)丙烯酸、 聚丙烯酰胺、 聚乙烯醇、 聚乙烯 醚、 聚酯、 聚乙烯胺、 聚乙烯亚胺、 聚环氧垸、 聚 (羧酸：)， 聚酰胺、 聚酐、 聚 磷腈、 纤维素、 肝素、 葡聚糖、 多肽、 纤维蛋白和弹性蛋白、 多糖、 透明质 酸、 藻酸盐、 明胶和几丁质、 白蛋白、 寡肽、 短链肽和寡核苷酸及由得到上 述聚合物的单体获得的共聚物， 更优选为聚乙二醇、 聚 N-异丙基丙烯酰胺、 聚甲基丙烯酸 2-羟基乙酯、 聚 (甲基：)丙烯酰胺、 聚 N，N-二甲基丙烯酰胺、 聚甲 基丙烯酸二甲胺基乙酯、 聚 ([2- (甲基丙烯酰氧基：)乙基]二甲基 磺丙基：)氢氧 化铵：)、 聚 (3-2-N-甲基丙烯酰氧乙基 -N，N-二甲基磺酸丙基胺：)、 聚 (2-甲基丙烯 酰氧乙基磷酸胆碱：)、 （氧 (11-(3-磺酰基丙基三甲基-缩水甘油基：)十一垸基酯硫 代甲基：)乙烯 -氧基 (正十二垸基硫代甲基：)乙烯：)共聚物、 聚 (丙烯酰胺基 -2-甲基 -1-丙磺酸：)、 聚 (甲基丙烯酰乙基磺基甜菜碱：)、 聚 (甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯 化铵：)、 聚 (3-甲基丙烯酸磺丙酯钾盐：)、 聚 (4- [二甲基 (2'-甲基丙烯酰氧基乙基:) 铵]丁酸酯)、聚 (甲基丙烯酸 3-磺酸丙酯钾盐)、聚 (甲基丙烯酸甲酯磺基甜菜碱)、 聚 (甲基丙烯酰胺磺基甜菜碱)、 聚 (苯乙烯磺酸盐)、 聚 (苯乙烯磺酸)、 聚丙烯 酸、 聚甲基丙烯酸、 聚甲基丙烯氨酸钠、 甲氧基三 (乙二醇；)甲基丙烯酸酯-甲 基丙烯酸共聚物、 聚 (乙二醇：)、 聚 (乙二醇：)甲基醚甲基丙烯酸酯、 聚环氧垸、 聚环氧乙垸、聚 (低聚 (乙二醇：)甲基醚甲基丙烯酸酯：)、聚 (甲基丙烯酸氧乙二醇 酯：)、 聚 (N-甲基甘氨酸：)、 聚 (L-谷氨酸：)、 聚 (L-赖氨酸 )、、 聚 (N-异丙基甲基丙 烯酰胺)聚 (N-羟甲基丙烯酰胺)、 聚 (N-[(2,2-二甲基 -1,3-二氧戊环)甲基)丙烯酰 胺：)、 聚 (N-(2-羟丙基：)甲基丙烯酰胺：)、 聚 (：丙烯酸 2-羟乙酯：)、 聚 (2,3-二羟基丙 基甲基丙烯酸酯：)、聚 (醚胺：)、聚 (N-乙烯基吡咯垸酮：)、聚 (N-乙烯基己内酰胺：)、 聚2-噁唑啉：)及其衍生物、 聚 (2- (二乙基氨基：)乙基丙烯酸酯：)、 聚 (2- (二甲基氨 基)乙基甲基丙烯酸酯)、 聚2- (二乙基氨基：)乙基甲基丙烯酸酯：)、 聚2-乙烯基 吡啶：)、 聚 1-乙烯基咪唑：)、 聚 丙烯酰吗啉：)、 聚 (：磷酸乙基乙二醇酯：)及由得 到上述聚合物的单体获得的共聚物。
25. 根据权利要求 15-24任一项所述的表面具有亲水性高分子刷的分子印 迹聚合物纳米颗粒的制备方法， 其特征在于所述小分子链转移剂具有以下结 构：
Figure imgf000037_0001
其中： R=垸基、 链烯 (炔)基、 芳基、 芳垸基、 取代垸基、 取代芳基、 碳 环或杂环、 垸氧基或二垸基氨基；
Z=垸基、 芳基、 芳垸基、 取代垸基、 取代芳基、 碳环或杂环、 垸硫基、 芳硫基、 垸氧羰基、 芳氧羰基、 酰氧基、 氨基甲酰基、 氰基、 垸基芳基二取 代氨基、 垸氧基、 芳氧基、 二垸基 -或二芳基膦酸基， 或二垸基-或二芳基-次 膦酸基， 所述小分子链转移剂优选选自： 双硫酯或三硫酯有机化合物、 硫代羰基 硫代化合物， 例如 1-吡咯二硫代羧酸 2-氰基丙 -2-基 -酯、 1-吡咯二硫代羧酸 2- 氰基丁 -2-基酯、 1-咪唑二硫代羧酸苄基酯、 二硫代苯甲酸异丙苯酯、 二硫代 氰基异丙酯、 二硫代苯甲酸异丁酸酯、 十二垸基 -S'-(o，o "-二甲基 -O "-乙酸:)三 硫代碳酸酯、 十二垸基 -V-异丙酸-三硫代碳酸酯， 黄原酸酯衍生物， 例如： 黄原酸 (9-乙基 苯乙基:)酯、 黄原酸 0-乙基 S-(2-乙氧基羰基丙 -2-基酯:)和黄 原酸 (9-乙基 (2-氰基异丙基:)酯。
26. 根据权利要求 15-25任一项所述的表面具有亲水性高分子刷的分子印 迹聚合物纳米颗粒的制备方法， 其特征在于所述亲水性高分子刷由所述大分 子链转移剂形成。
27. 根据权利要求 15-26任一项所述的表面具有亲水性高分子刷的分子印 迹聚合物纳米颗粒的制备方法， 其特征在于所述亲水性大分子链转移剂的数 均分子量为 500到 50000， 优选为 1000到 30000， 更优选为 1500到 8000， 更优选 为 2000到 5000。
28. 根据权利要求 15-27任一项所述的表面具有亲水性高分子刷的分子 印迹聚合物纳米颗粒的制备方法， 其特征是所述的溶剂、 模板分子、 单烯类 功能单体、 交联剂、 引发剂、 任选的小分子链转移剂及亲水性大分子链转移 剂的用量如下：
1)模板分子、 单烯类功能单体与交联剂的摩尔比为 1 :1~10:4~80， 单烯类 功能单体与交联剂在体系中的体积分数为 0.5~10%; 2)引发剂量为单烯类功能单体与交联剂总量的 0.5~10%， 且引发剂与链转 移剂 (包括任选的小分子链转移剂与亲水性大分子链转移剂:)的摩尔比为 1 : 1-20； 和
3)在小分子链转移剂与亲水性大分子链转移剂组成的链转移剂中，小分子 链转移剂所占摩尔百分数为 0~95%。
29. 根据权利要求 1-14任一项所述的或者由权利要求 15-28任一项所述的 方法制得的表面具有亲水性高分子刷的分子印迹聚合物纳米颗粒在生物样品 分析、 医学临床免疫分析、 食品与环境监测和 /或仿生传感器制造中的用途。
30. 一种试剂盒， 其包含根据权利要求 1-14任一项所述的或者由权利要求 15-28任一项所述的方法制得的表面具有亲水性高分子刷的分子印迹聚合物纳 米颗粒。
31. 一种用于生物样品的传感器， 其包含根据权利要求 1-14任一项所述的 或者由权利要求 15-28任一项所述的方法制得的表面具有亲水性高分子刷的分 子印迹聚合物纳米颗粒。
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