WO2014054865A1 - 식물에서 셀룰로오즈와 셀룰로오즈 결합 도메인을 사용하여 단백질을 분리정제하는 방법 - Google Patents

식물에서 셀룰로오즈와 셀룰로오즈 결합 도메인을 사용하여 단백질을 분리정제하는 방법 Download PDF

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protein
binding domain
amorphous
separating
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박수홍
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손은주
민경민
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    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses

Definitions

  • the present invention relates to methods for separating proteins comprising cellulose binding domains using various forms of cellulose and / or variants thereof.
  • Cellulose is a basic component of the cell membrane and wood of the plant is a kind of organic compound that occupies about 30% or more of the plant. It belongs to a polysaccharide, and the chemical structure of D-glucose (glucose) is a beta-1,4 glucoside (beta-1,4 glucoside) is a plurality of polymerization, the molecular weight of the natural state reaches tens of thousands to hundreds of thousands.
  • Cellulose is an odorless white solid that is insoluble in water, ethanol and ether and has a very strong resistance to alkali.
  • cellulose is hydrolyzed in acid or cuprammonium solution and is an intermediate product. Is produced in large quantities, and is finally converted to glucose. Since cellulose is one of the most abundant natural resources in the natural world, many studies are underway to use it.
  • the cellulase that breaks down cellulose has a cellulose binding domain (CBD), and specifically binds to cellulose to effectively break down cellulose.
  • CBD cellulose binding domain
  • Attempts have been made to produce recombinant proteins that specifically bind to cellulose by binding to the target proteins requiring such cellulose binding domains (Korean Patent No. 10-0618563).
  • this approach is limited to methods for producing recombinant proteins using microorganisms, and examples using plants are not yet known.
  • the present invention has been made to solve the above-mentioned problems in the prior art, in order to quickly and simply separate the protein expressed in the plant in large quantities, cellulose binding using various forms of cellulose and / or its modifications. It is an object of the present invention to provide a method for separating a protein including a domain.
  • the present invention (a) protein binding step of mixing a plant extract and cellulose (cellulose) comprising a protein (binding step);
  • (C) it provides a method for separating a protein comprising a cellulose binding domain (Cellulose binding domain) comprising the step of eluting the protein bound to the cellulose.
  • the cellulose may be microcrystalline cellulose or amorphous cellulose.
  • the microcrystalline cellulose may be used at a dose of 0.5 to 2 times the dose of the plant extract.
  • the amorphous cellulose may be used at a dose of 0.1 to 0.5 times the dose of the plant extract.
  • the amorphous cellulose is (a) 40 to 75% of the phosphoric acid (phosphoric acid) by adding microcrystalline cellulose and stirring to prepare the amorphous cellulose;
  • (b) 500 mM to 1.5M of sodium carbonate (Na 2 CO 3 ) may be prepared by the method comprising adding to the amorphous cellulose.
  • the protein comprising the cellulose binding domain may be an amino acid sequence of the cellulose binding domain consisting of SEQ ID NO: 2.
  • the bonding step comprises 10 to 60 mM of sodium acetate, 10 to 200 mM of sodium chloride, and 0.1 to 3 mM of calcium chloride. It may be to use a buffer containing
  • the washing step is 10 to 60 mM sodium acetate, 10 to 200 mM sodium chloride, 0.1 to 3 mM calcium chloride, and It may be to use a buffer containing 0.05 to 0.2% of Triton X-100 (Triton X-100).
  • eluting the protein comprises 10 to 60 mM Tris-HCl buffer solution at pH 7.5 to 10, sodium chloride at 10 to 200 mM, and It may be to use a buffer containing 0.1 to 3 mM of calcium chloride (calcium chloride) and 1 to 20% of Cellobiose (Cellobiose).
  • the method of separating proteins including cellulose binding domains of the present invention uses cellulose as an affinity matrix, it is possible to prepare at a significantly lower cost than conventional affinity substrates and to separate them according to the type of cellulose.
  • the capacity of the reagents used in the process can also be reduced, which significantly reduces the cost of protein separation, allowing for large protein separations.
  • a cellulose binding domain having a high affinity for cellulose non-specific proteins can be prevented from binding, so that proteins can be quickly separated from the total extract of plants containing various proteins in high purity. It is possible to isolate even low concentration of protein.
  • Fig. 1 shows the results of efficient amorphous cellulose preparation for use in protein separation and purification from plant extracts.
  • Figure 2 is a view showing the result confirmed by Western blotting protein separated using microcrystalline cellulose.
  • Figure 3 is a view showing the result confirmed by Western blotting protein isolated using amorphous cellulose.
  • FIG. 4 is a diagram showing the result of confirming the protein separated using amorphous cellulose by Kumaji-blo staining on SDS-page.
  • the present invention is characterized by providing a method for separating a protein comprising a cellulose binding domain (Cellulose binding domain) comprising the following steps.
  • the present inventors have completed the present invention as a result of a method for rapidly and inexpensively separating high-purity recombinant protein from plants in large quantities. That is, in one embodiment of the present invention, the 3 'end of the gene encoding the target protein A recombinant vector is prepared by binding a cellulose binding domain (CBD) consisting of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 to a transformed product to produce a target protein using the recombinant vector. After preparing the plant, it was confirmed that the target protein can be separated using microcrystalline cellulose (MCC) and / or amorphous cellulose (AMC) (see Examples 1 to 3).
  • MCC microcrystalline cellulose
  • AMC amorphous cellulose
  • the inventors found out that the target protein can be easily eluted from the plant in which the target protein including the cellulose binding domain is expressed using cellulose.
  • the present invention can provide a method for separating a protein including a cellulose binding domain.
  • the cellulose may be used as microcrystalline cellulose or amorphous cellulose.
  • the microcrystalline cellulose may be preferably used at a dose of 0.5 to 2 times the plant extract dose, more preferably at the same dose as the plant extract, and the amorphous cellulose is preferably 0.1 to 0.5 of the plant extract dose. It may be used as a fold dose, but is not limited to the above dose, and may be adjusted according to conditions such as the expression level of the target protein.
  • the amorphous cellulose is prepared by adding microcrystalline cellulose to 40 to 75% of phosphoric acid (phosphoric acid) and stirring to prepare amorphous cellulose, and then added 500mM to 1.5M sodium carbonate (Na 2 CO 3 ) to the amorphous cellulose It may be prepared by, but is not limited thereto.
  • the target protein including the cellulose binding domain may be a recombinant protein including an amino acid sequence of the cellulose binding domain consisting of SEQ ID NO: 2 or a sequence showing substantially homogeneous activity thereof.
  • substantially homogeneous activity refers to activity of the cellulose binding domain, and may include amino acid sequence variants that are functionally identical, for example, some of the amino acid sequences are substituted, deleted, or added.
  • the binding step is 10 to 60 mM sodium acetate (NaOAC), 10 to 200 mM sodium chloride (NaCl), and 0.1 to A buffer containing 3 mM calcium chloride (CaCl 2 ) may be used, most preferably a buffer containing 50 mM sodium acetate, 50 mM sodium chloride, and 1 mM calcium chloride. It may be to use a solution.
  • the washing step is 10 to 60 mM sodium acetate (NaOAC), 10 to 200 mM sodium chloride (NaCl), 0.1 to 3 mM calcium chloride (CaCl 2 ), and 0.05
  • a buffer containing from 0.2% of Triton X-100 most preferably 50 mM sodium acetate, 50 mM sodium chloride, 1 mM calcium chloride, and It may be to use a buffer solution containing 0.1% of Triton X-100.
  • the step of eluting the protein is 10 to 60 mM Tris-HCl buffer solution of pH 7.5 to 10, 10 to 200 mM sodium chloride (NaCl), and 0.1 to 3 mM calcium chloride (calcium chloride: CaCl 2 ) and a buffer containing 1 to 20% of Cellobiose (Cellobiose) can be made, most preferably 50 mM tris-hydrogen buffer, pH 8.8, 50 mM It may be to use a buffer containing sodium chloride, and 1 mM of calcium chloride and 1% of Cellobiose (Cellobiose).
  • target protein refers to a protein to be produced by the genetic engineering method according to the invention, it is not particularly limited to any one. Proteins, which are preferably used for commercial purposes and need to be produced in large quantities, may be included.
  • a cellulose bond consisting of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 at the 3 'end of the gene encoding the protein of interest (pork cholera virus glycoprotein gp55)
  • a recombinant vector was prepared by incorporating a cellulose binding domain (CBD) into pCAMBIA 1300, a plant expression vector, and transfecting the vector into the Agrobacterium tumefaciens LBA-4404 strain. Transformed. And using the Agrobacterium strain to transform the Arabidopsis thaliana ecotype Col-1 to produce a transgenic plant to produce a target protein, a transformation to stably produce a target protein combined with a cellulose binding domain Plants were selected.
  • CBD cellulose binding domain
  • microcrystalline cellulose In order to separate proteins using microcrystalline cellulose (MCC), 2.5 g of microcrystalline cellulose was added to distilled water to hydrate, and the column was filled with hydrated microcrystalline cellulose. Moisture was removed. And after planting the transformed plant prepared by the method of Example 1 in the soil for about 3 weeks to obtain a plant except the root portion, the same amount as the microcrystalline cellulose plants in a mortar containing 2.5g of liquid nitrogen Powdered using. Transfer the powdered plant to a new tube and add and mix the extraction buffer to 5 mL per g of plant, add 0.5X protease inhibitor and vortexing. Mixed.
  • MCC microcrystalline cellulose
  • washing buffer 50 mM NaOAC (pH 5.2), 50 mM NaCl, 1 mM CaCl 2
  • Triton X-100 0.1% Triton X-100 was poured at a rate of 1 mL / min, and washed once. Wash twice using 100 wash buffer without addition.
  • the elution buffer elution buffer: 50mM Tris-HCl (pH 8.8), 50mM NaCl, 1mM CaCl 2 , 1% Cellobiose
  • the isolated protein was identified by western blotting using coomassie-blue staining and an antibody binding to the cellulose binding domain. The results are shown in FIG.
  • microcrystalline cellulose was treated with phosphoric acid (phosphoric acid) at 4 ° C. to change the cellulose form into crystals.
  • phosphoric acid phosphoric acid
  • amorphous cellulose was prepared by reacting 5%, 10%, 40%, and 80% phosphoric acid with microcrystalline cellulose for 30 minutes, and the prepared amorphous cellulose was observed under a microscope. The results are shown in FIG.
  • amorphous cellulose prepared by the method of Example 3-1 In order to separate proteins using amorphous cellulose prepared by the method of Example 3-1, 0.5 g (50 mL) of amorphous cellulose was charged to a column. And the plant shredding liquid prepared in the same manner as in Example 2 was added to the column filled with amorphous cellulose was mixed well, and then the plant shredding liquid was flowed at a rate of 100uL / min.
  • Triton X-100 was added to wash 4 times with a washing buffer (washing buffer: 50 mM NaOAC (pH 5.2), 50 mM NaCl, 1 mM CaCl 2 ) at a rate of 1 mL / min, and Triton X- Wash twice using 100 wash buffer without addition.
  • Elution buffer elution buffer: 50mM Tris-HCl (pH 8.8), 50mM NaCl, 1mM CaCl 2 1% Cellobiose
  • the isolated protein was confirmed by western blotting using an antibody that binds to the cellulose binding domain. The results are shown in FIG. In addition, the pattern of the isolated protein was confirmed through coomassie blue staining (coomassie-blue staining) on the SDS-page. The results are shown in FIG.
  • the protein separation method using cellulose of the present invention not only can separate almost the same amount of protein using not only microcrystalline cellulose but also amorphous cellulose, and less than 1/5 volume of amorphous cellulose.
  • the protein separation method of the present invention is expected to be applicable to a variety of industrial fields because it is possible to efficiently separate a large amount of recombinant protein from plants quickly and inexpensively and efficiently.

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Abstract

본 발명은 셀룰로오스의 다양한 형태물 및/또는 그 변형체를 이용하여 식물로부터 셀룰로오스 결합 도메인을 포함하는 단백질을 분리하는 방법 등에 관한 것으로, 본 발명의 단백질 분리 방법은 친화도가 높은 셀룰로오스 결합 도메인을 사용함으로써 고순도의 단백질을 신속하고 용이하게, 저렴한 비용으로 대량 분리가 가능하므로, 산업적으로 다양한 분야에 응용이 가능할 것으로 기대된다.

Description

식물에서 셀룰로오즈와 셀룰로오즈 결합 도메인을 사용하여 단백질을 분리정제하는 방법
본 발명은 셀룰로오스의 다양한 형태물 및/또는 그 변형체를 이용하여 셀룰로오스 결합 도메인을 포함하는 단백질을 분리하는 방법 등에 관한 것이다.
셀룰로오스(Cellulose)는 식물의 세포막 및 목질부를 구성하는 기본성분으로 식물체의 약 30% 이상을 차지하는 유기화합물의 일종이다. 다당류에 속하며, 화학구조는 D-글루코스(glucose)가 베타-1,4 글루코시드(beta-1,4 glucoside) 결합으로 다수 중합되어, 천연상태의 분자량이 수만 내지 수십만에 이른다. 셀룰로오스는 무취의 흰색 고체로 물, 에탄올, 및 에테르에는 녹지 않으며 알칼리에 상당히 강한 내성을 가지고 있으나, 산(acid)이나 구리암모니아용액(cuprammonium solution) 내에서는 가수분해 되어 중간산물로 셀로비오스(cellobiose)를 다량 생성하고, 최종적으로는 글루코스(glucose)로 변환된다. 셀룰로오스는 자연계에서 가장 풍부한 천연자원의 한 종류인 만큼 이를 이용하고자 하는 많은 연구들이 진행 중이다.
한편, 셀룰로오스를 분해하는 셀룰라아제(cellulase)는 셀룰로오스 결합 도메인(cellulose binding domain, CBD)을 가지고 있어, 셀룰로오스에 특이적으로 결합하여 셀룰로오스를 효과적으로 분해한다. 상기와 같은 셀룰로오스 결합 도메인을 필요로 하는 목적 단백질에 결합시켜 셀룰로오스에 특이적으로 결합하는 재조합 단백질을 제조하고자 하는 시도들이 활발히 이루어지고 있다(대한민국 등록특허 제10-0618563호). 그러나 이러한 시도는 미생물을 이용하여 재조합 단백질을 제조하는 방법들에 국한되어 있으며, 식물을 이용한 예는 아직 알려진 바 없다.
그러나 최근 식물 유래 재조합 단백질, 백신 등의 생산과 관련하여 관심이 집중되고 있는 만큼, 식물체를 이용하여 대량의 재조합 단백질을 생산하고, 고순도의 재조합 단백질을 대량으로 신속하고 저렴하게 분리하는 방법에 대한 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 식물체 내에서 발현된 단백질을 대량으로 신속하고 간단하게 분리하기 위하여, 셀룰로오스의 다양한 형태물 및/또는 그 변형체를 이용하여 셀룰로오스 결합 도메인을 포함하는 단백질을 분리하는 방법 등을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 (a) 단백질을 포함하는 식물 추출물 및 셀룰로오스(cellulose)를 혼합하는 단백질 결합 단계(binding step);
(b) 결합되지 않은 단백질을 제거하는 세척 단계(washing step); 및
(c) 상기 셀룰로오스에 결합된 단백질을 용출(elusion)하는 단계를 포함하는 셀룰로오스 결합 도메인(Cellulose binding domain)을 포함하는 단백질의 분리 방법을 제공한다.
본 발명의 일구현예에 있어서, 상기 셀룰로오스(cellulose)는 미세결정셀룰로오스(microcrystalline cellulose) 또는 비결정셀룰로오스(amorphous cellulose)일 수 있다.
본 발명의 다른 일구현예에 있어서, 상기 미세결정셀룰로오스는 식물 추출물 용량의 0.5 내지 2배 용량으로 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 일구현예에 있어서, 상기 비결정셀룰로오스는 식물 추출물 용량의 0.1 내지 0.5배 용량으로 사용될 수있다.
본 발명의 또 다른 일구현예에 있어서, 상기 비결정셀룰로오스는 (a) 40 내지 75%의 인산(phosphoric acid)에 미세결정셀룰로오스를 첨가하고 교반하여 비결정셀룰로오스를 제조하는 단계; 및
(b) 상기 비결정셀룰로오스에 500mM 내지 1.5M의 탄산나트륨(Na2CO3)을 첨가하는 단계를 포함하는 방법으로 제조되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일구현예에 있어서, 상기 셀룰로오스 결합 도메인을 포함하는 단백질은 서열번호 2로 구성되는 셀룰로오스 결합 도메인의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일구현예에 있어서, 상기 결합 단계는 10 내지 60 mM의 아세트산나트륨(sodium acetate), 10 내지 200 mM의 염화나트륨(sodium chloride), 및 0.1 내지 3 mM의 염화칼슘(calcium chloride)을 포함하는 완충용액(buffer)을 사용하는 것일 수 있다
본 발명의 또 다른 일구현예에 있어서, 상기 세척 단계는 10 내지 60 mM의 아세트산나트륨(sodium acetate), 10 내지 200 mM의 염화나트륨(sodium chloride), 0.1 내지 3 mM의 염화칼슘(calcium chloride), 및 0.05 내지 0.2 %의 트리톤 X-100(Triton X-100)을 포함하는 완충용액(buffer)을 사용하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일구현예에 있어서, 상기 단백질을 용출하는 단계는 pH 7.5 내지 10의 10 내지 60 mM 트리스-염화수소(Tris-HCl) 완충용액, 10 내지 200 mM의 염화나트륨(sodium chloride), 및 0.1 내지 3 mM의 염화칼슘(calcium chloride) 및 1 내지 20 %의 셀로비오스(Cellobiose)를 포함하는 완충용액(buffer)을 사용하는 것일 수 있다.
본 발명의 셀룰로오스 결합 도메인을 포함하는 단백질의 분리 방법은 셀룰로오스를 친화성 기질(affinity matrix)로 사용하기 때문에 기존의 친화성 기질에 비하여 현저히 저렴한 비용으로도 준비가 가능할 뿐만 아니라 셀룰로오스의 종류에 따라 분리 과정에서 사용되는 시약의 용량도 감소시킬 수 있으므로 단백질 분리에 소요되는 비용을 현저히 감소시켜 대량의 단백질 분리가 가능하게 한다. 또한 셀룰로오스에 대한 높은 친화도를 가지는 셀룰로오스 결합 도메인을 사용함으로써, 비특이적인 단백질들이 결합하는 것을 방지하여 다양한 단백질이 혼합되어 있는 식물체의 총 추출물(total extract)로부터도 단백질을 고순도로 신속하게 분리할 수 있으며, 낮은 농도의 단백질이라도 분리가 가능하다.
도 1은 식물 추출물로부터 단백질 분리 정제에 사용할 효율적 비결정셀룰로오스 제작에 관한 결과를 나타내는 도면이다.
도 2는 미세결정셀룰로오스를 이용하여 분리된 단백질을 웨스턴 블로팅으로 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 3 은 비결정셀룰로오스를 이용하여 분리된 단백질을 웨스턴 블로팅으로 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 4 는 비결정셀룰로오스를 이용하여 분리된 단백질을 SDS-page 상에서 쿠마지-블로 염색법으로 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
본 발명은 하기 단계를 포함하는 셀룰로오스 결합 도메인(Cellulose binding domain)을 포함하는 단백질의 분리 방법을 제공함에 그 특징이 있다.
(a) 단백질을 포함하는 식물 추출물 및 셀룰로오스(cellulose)를 혼합하는 단백질 결합 단계(binding step);
(b) 결합되지 않은 단백질을 제거하는 세척 단계(washing step); 및
(c) 상기 셀룰로오스에 결합된 단백질을 용출(elusion)하는 단계.
본 발명자들은 고순도의 재조합 단백질을 식물체로부터 대량으로 신속하고 저렴하게 분리하는 방법에 대하여 연구한 결과 본 발명을 완성하게 되었는데, 즉, 본 발명의 일실시예에서는 목적 단백질을 코딩하는 유전자의 3' 말단에 서열번호 1의 염기서열 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되는 셀룰로오스 결합 도메인(cellulose binding domain, CBD)을 결합시켜 재조합 벡터를 제작하고, 상기 재조합 벡터를 이용하여 목적 단백질을 생산하는 형질전환된 식물체를 제조한 뒤, 미세결정셀룰로오스(Microcrystalline cellulose, MCC) 및/또는 비결정셀룰로오스(Amorphous cellulose, AMC)를 이용하여 목적 단백질을 분리할 수 있음을 확인하였다(실시예 1 내지 3 참조).
상기로부터 본 발명자들은 셀룰로오스 결합 도메인을 포함하는 목적 단백질이 발현된 식물체로부터 셀룰로오스를 이용하여 용이하게 목적 단백질을 용출시킬 수 있다는 사실을 알 수 있었다.
따라서 본 발명은 셀룰로오스 결합 도메인(Cellulose binding domain)을 포함하는 단백질의 분리 방법을 제공할 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명에서 상기 셀룰로오스(cellulose)는 미세결정셀룰로오스(microcrystalline cellulose) 또는 비결정셀룰로오스(amorphous cellulose) 등을 사용할 수 있다. 이때, 미세결정셀룰로오스는 바람직하게는 식물 추출물 용량의 0.5 내지 2배 용량으로 사용될 수 있고, 더욱 바람직하게는 식물 추출물과 동일한 용량으로 사용될 수 있으며, 비결정셀룰로오스는 바람직하게는 식물 추출물 용량의 0.1 내지 0.5배 용량으로 사용될 수 있으나, 상기 용량에 한정되는 것은 아니며, 목적 단백질의 발현 정도 등의 조건에 따라 조절될 수 있다.
또한, 상기 비결정셀룰로오스는 40 내지 75%의 인산(phosphoric acid)에 미세결정셀룰로오스를 첨가하고 교반하여 비결정셀룰로오스를 제조한 다음, 상기 비결정셀룰로오스에 500mM 내지 1.5M의 탄산나트륨(Na2CO3)을 첨가함으로써 제조될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 셀룰로오스 결합 도메인을 포함하는 목적 단백질은 서열번호 2로 구성되는 셀룰로오스 결합 도메인의 아미노산 서열 또는 이와 실질적으로 동질의 활성을 나타내는 서열을 포함하는 재조합 단백질일 수 있다.
여기서, ‘실질적으로 동질의 활성’이란 셀룰로오스 결합 도메인의 활성을 의미하는 것으로, 기능적으로 동일한, 예를 들어, 아미노산 서열 중 일부가 치환되거나, 결실, 또는 부가된 아미노산 서열 변형체를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 셀룰로오스 결합 도메인을 포함하는 단백질의 분리 방법에서, 상기 결합 단계는 10 내지 60 mM의 아세트산나트륨(sodium acetate: NaOAC), 10 내지 200 mM의 염화나트륨(sodium chloride: NaCl), 및 0.1 내지 3 mM의 염화칼슘(calcium chloride: CaCl2)을 포함하는 완충용액(buffer)을 사용하여 이루어질 수 있으며, 가장 바람직하게는 50 mM의 아세트산나트륨, 50 mM의 염화나트륨, 및 1 mM의 염화칼슘을 포함하는 완충용액을 사용하는 것일 수 있다.
또한, 상기에서 세척 단계는 10 내지 60 mM의 아세트산나트륨(sodium acetate: NaOAC), 10 내지 200 mM의 염화나트륨(sodium chloride: NaCl), 0.1 내지 3 mM의 염화칼슘(calcium chloride: CaCl2), 및 0.05 내지 0.2 %의 트리톤 X-100(Triton X-100)을 포함하는 완충용액(buffer)을 사용하여 이루어질 수 있으며, 가장 바람직하게는 50 mM의 아세트산나트륨, 50 mM의 염화나트륨, 1 mM의 염화칼슘, 및 0.1 %의 트리톤 X-100을 포함하는 완충용액을 사용하는 것일 수 있다.
또한, 상기에서 단백질을 용출하는 단계는 pH 7.5 내지 10의 10 내지 60 mM 트리스-염화수소(Tris-HCl) 완충용액, 10 내지 200 mM의 염화나트륨(sodium chloride: NaCl), 및 0.1 내지 3 mM의 염화칼슘(calcium chloride: CaCl2) 및 1 내지 20 %의 셀로비오스(Cellobiose)를 포함하는 완충용액(buffer)을 사용하여 이루어질 수 있으며, 가장 바람직하게는 pH 8.8의 50 mM 트리스-염화수소 완충용액, 50 mM의 염화나트륨, 및 1 mM의 염화칼슘 및 1 %의 셀로비오스(Cellobiose)를 포함하는 완충용액을 사용하는 것일 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "목적 단백질(또는 단백질)"은 본 발명에 따른 유전공학적 방법으로 생산하고자 하는 단백질을 말하는 것으로, 특별히 어느 하나에 제한되지 않는다. 바람직하게는 상업적 용도로 이용되고 있어 다량으로 생산될 필요가 있는 단백질들이 포함될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 형질전환 식물체의 제조
목적 단백질을 발현하는 형질전환 식물체를 제조하기 위하여, 목적 단백질(돼지 콜레라 바이러스 당단백질 gp55)을 코딩하는 유전자의 3' 말단에 서열번호 1의 염기서열 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되는 셀룰로오스 결합 도메인(cellulose binding domain, CBD)을 결합시켜 식물발현용 벡터(vector)인 pCAMBIA 1300에 삽입하여 재조합 벡터를 제조하고, 상기 벡터를 아그로박테리움 튜머페시언스(Agrobacterium tumefaciens) LBA-4404 균주에 형질전환(transformation)시켰다. 그리고 상기 아그로박테리움 균주를 이용하여 애기장대(Arabidopsis thaliana ecotype Col-1)를 형질전환시켜 목적 단백질을 생산하는 형질전환 식물체를 제조하고, 안정적으로 셀룰로오스 결합 도메인이 결합된 목적 단백질을 생산하는 형질전환 식물체를 선별하였다.
실시예 2. 미세결정셀룰로오스를 이용한 단백질의 분리
미세결정셀룰로오스(Microcrystalline cellulose, MCC)를 이용하여 단백질을 분리하기 위하여, 미세결정셀룰로오스 2.5g을 증류수(distilled water)에 첨가하여 수화(hydration)시키고, 컬럼(column)에 수화된 미세결정셀룰로오스를 채우고 수분을 제거하였다. 그리고 상기 실시예 1의 방법으로 제조된 형질전환 식물체를 토양에 심어 약 3주간 배양한 후에 뿌리부분을 제외한 식물체를 수득하고, 상기 미세결정셀룰로오스와 동량인 2.5g의 식물체를 막자사발에 담고 액체질소를 이용하여 분말화시켰다. 상기 분말화된 식물체를 새로운 튜브(tube)에 옮겨 담고 추출 완충용액(extraction buffer)을 식물체 g당 5mL이 되도록 첨가 및 혼합한 후에, 0.5X 단백질가수분해효소 억제제(protease inhibitor)를 첨가하고 vortexing으로 혼합하였다. 그리고 10분간 초음파 처리(sonication)하여 식물체를 파쇄하고, miracloth를 이용하여 파쇄물이 제거된 식물 파쇄액을 수득하였다. 수득된 식물 파쇄액은 상기 미세결정셀룰로오스가 채워진 컬럼에 채워준 후에, 미세결정셀룰로오스와 식물 파쇄액이 잘 혼합시켜 셀룰로오스 결합 도메인이 미세결정셀룰로오스에 결합시킨 후에 컬럼에 담긴 식물 파쇄액을 100uL/min의 속도로 흘려주었다. 이후 0.1% Triton X-100이 첨가된 세척용 완충용액(washing buffer: 50mM NaOAC(pH 5.2), 50mM NaCl, 1mM CaCl2) 15mL을 1mL/min의 속도로 흘려주어 1회 세척하고, Triton X-100이 첨가되지 않은 세척용 완충용액을 이용하여 2회 세척하였다. 그리고 용출용 완충용액(elution buffer: 50mM Tris-HCl(pH 8.8), 50mM NaCl, 1mM CaCl2, 1% Cellobiose)을 200uL/min으로 흘려주어 단백질을 분리하였다. 단백질을 분리하는 과정에서 미세결정셀룰로오스가 마르지 않도록 주의하였다. 분리된 단백질은 쿠마지-블루 염색(coomassie-blue staining)과 셀룰로오스 결합 도메인에 결합하는 항체(antibody)를 이용하여 웨스턴 블로팅(western blotting)으로 확인하였다. 그 결과는 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, 목적 단백질의 크기인 66kDa에서 셀룰로오스 결합 도메인이 결합되어 있는 단백질이 분리된 것을 확인할 수 있었다. 또한 세척 단계(W1 내지 W3)에서는 셀룰로오스에 결합되어 있는 단백질들이 거의 용출되지 않았으며, 용출 단계(E1 내지 E3)에서는 3회까지도 단백질들이 분리되고 있다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3. 비결정셀룰로오스를 이용한 단백질의 분리
<3-1> 비결정셀룰로오스의 제조
비결정셀룰로오스(Amorphous cellulose, AMC)를 이용하여 단백질을 분리하기 위하여, 미세결정셀룰로오스에 4℃에서 인산(phosphoric acid)을 처리하여 셀룰로오스 형태를 결정체로 변화시키는 방법을 이용하였다. 먼저 미세결정셀룰로오스에 5%, 10%, 40%, 80% 인산을 각각 30분 반응시켜 비결정셀룰로오스를 제작하고, 상기 제조된 비결정셀룰로오스를 현미경으로 관찰하였다. 그 결과는 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타난 바와 같이, 80% 인산을 처리하여 제조한 비결정셀룰로오스의 경우에는 인산을 처리하자마자 결정구조가 사라지는 것을 확인할 수 있었으며, 또한 컬럼에 채워 증류수를 흘리면 증류수가 상기 비결정셀룰로오스를 통과하지 못한다는 것을 확인할 수 있었다. 또한 40% 인산을 30분 동안 처리한 비결정셀룰로오스의 경우에는 크리스탈 구조가 사라지는 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과를 통하여 인산의 농도를 40% 이상, 80% 이하로 처리한 경우에 적절한 비결정셀룰로오스가 제조되어, 단백질의 분리에 사용가능하다는 것을 확인하였다. 이를 바탕으로, 하기 실시예에서는 최종 인산의 농도를 60%로 하여 비결정셀룰로오스를 제조하였다.
증류수 6mL에 미세결정셀룰로오스 2g을 첨가하고 약 2~3분간 교반한 후에 최종 농도가 60%가 되도록 인산을 조금씩 첨가하며 교반하고, 완전히 혼합된 후에 30분간 추가로 교반하였다. 교반된 용액을 2개의 튜브에 나누어 담고, 증류수를 20mL 첨가하여 혼합한 후에 원심분리(14,000rpm, 4℃, 10분)하여 상층액을 제거하였다. 결정화된 셀룰로오스에 1M의 Na2CO3 2mL을 첨가하고, vortexing으로 혼합하고, 다시 원심분리(14,000rpm, 4℃, 10분)하여 상층액을 제거하는 과정을 2회 수행하여 상층액을 깨끗이 제거한 후에 1M의 Na2CO3 1mL 및 20mL의 증류수를 셀룰로오스에 첨가하고 vortexing으로 혼합하였다. 그리고 다시 증류수를 첨가하여 최종 부피를 200mL이 되도록 조정한 다음 4℃에 보관하였다. 상기의 방법으로 제조된 비결정셀룰로오스는 안정된 pH인 6~9를 유지하는 것을 확인하였다.
<3-2> 비결정셀룰로오스를 이용한 단백질의 분리
실시예 3-1의 방법으로 제조된 비결정셀룰로오스(amorphous cellulose, AMC)를 이용하여 단백질을 분리하기 위하여, 비결정셀룰로오스 0.5g(50mL)을 컬럼(column)에 채웠다. 그리고 실시예 2와 동일한 방법으로 준비한 식물 파쇄액을 비결정셀룰로오스가 채워져 있는 컬럼에 첨가하여 잘 혼합시켜준 다음, 식물 파쇄액을 100uL/min의 속도로 흘려주었다. 이후 0.1% Triton X-100이 첨가된 세척용 완충용액(washing buffer: 50mM NaOAC(pH 5.2), 50mM NaCl, 1mM CaCl2) 4mL을 1mL/min의 속도로 흘려주어 1회 세척하고, Triton X-100이 첨가되지 않은 세척용 완충용액을 이용하여 2회 세척하였다. 그리고 용출용 완충용액(elution buffer: 50mM Tris-HCl(pH 8.8), 50mM NaCl, 1mM CaCl2 1% Cellobiose)을 200uL/min으로 흘려주어 단백질을 분리하였다. 단백질을 분리하는 과정에서 비결정셀룰로오스가 마르지 않도록 주의하였다. 분리된 단백질은 셀룰로오스 결합 도메인에 결합하는 항체(antibody)를 이용하여 웨스턴 블로팅(western blotting)으로 확인하였다. 그 결과는 도 3에 나타내었다. 또한 SDS-page 상에서 쿠마지블루 염색(coomassie-blue staining)을 통하여 분리된 단백질의 패턴을 확인하였다. 그 결과는 도 4에 나타내었다.
도 3 및 4에 나타난 바와 같이, 미세결정셀룰로오스를 이용하여 분리한 결과와 동일하게 목적 단백질의 크기인 66kDa에서 셀룰로오스 결합 도메인이 결합되어 있는 단백질이 분리된 것을 확인할 수 있었다. 또한 세척 단계(W1 내지 W3)에서는 셀룰로오스에 결합되어 있는 단백질들이 거의 용출되지 않았으며, 용출 단계(E1 및 E2)에서는 첫 번째 용출 때 많은 단백질이 분리되고, 2회에서부터는 용출되는 단백질의 양이 감소되었다. 상기 결과를 통하여, 비결정셀룰로오스를 사용하는 경우 용출 시간을 감소시킬 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과들을 통하여, 본 발명의 셀룰로오스를 이용한 단백질 분리방법은 미세결정셀룰로오스 뿐만 아니라 비결정셀룰로오스를 이용하여서도 거의 동일한 양의 단백질을 분리할 수 있을 뿐만 아니라, 약 1/5 정도 적은 볼륨의 비결정셀룰로오스를 사용함으로써 세척용 완충용액 및 용출용 완충용액의 양을 1/5로 감소시킬 수 있었으며, 이를 통하여 최종적으로는 단백질 분리에 소요되는 시간을 1/5로 감소시킬 수 있었다. 이는 대량의 단백질을 분리할 경우에는 사용되는 시료의 감소 및 소요시간 단축으로 인하여 작업효율을 극대화할 수 있다는 것을 의미한다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.
본 발명의 단백질 분리 방법은 식물체로부터 대량의 재조합 단백질을 고순도로 신속하고 저렴하게 효율적으로 분리 가능하게 하기 때문에, 산업적으로 다양한 분야에 응용이 가능할 것으로 기대된다.
<210> 1
<211> 426
<212> DNA
<213> Clostridium stercorarium - CBD base seq.
<400> 1
cgaagttcac cagtgcctgc acctggtgat aacacaagag acgcatattc tatcattcag 60
gccgaggatt atgacagcag ttatggtccc aaccttcaaa tctttagctt accaggtggt 120
ggcagcgcca ttggctatat tgaaaatggt tattccacta cctataaaaa tattgatttt 180
ggtgacggcg caacgtccgt aacagcaaga gtagctaccc agaatgctac taccattcag 240
gtaagattgg gaagtccatc gggtacatta cttggaacaa tttacgtggg gtccacagga 300
agctttgata cttataggga tgtatccgct accattagta atactgcggg tgtaaaagat 360
attgttcttg tattctcagg tcctgttaat gttgactggt ttgtattctc aaaatcagga 420
acttct 426
<210> 2
<211> 142
<212> PRT
<213> Clostridium stercorarium - CBD amino acid seq.
<400> 2
Arg Ser Ser Pro Val Pro Ala Pro Gly Asp Asn Thr Arg Asp Ala Tyr
Ser Ile Ile Gln Ala Glu Asp Tyr Asp Ser Ser Tyr Gly Pro Asn Leu
Gln Ile Phe Ser Leu Pro Gly Gly Gly Ser Ala Ile Gly Tyr Ile Glu
Asn Gly Tyr Ser Thr Thr Tyr Lys Asn Ile Asp Phe Gly Asp Gly Ala
Thr Ser Val Thr Ala Arg Val Ala Thr Gln Asn Ala Thr Thr Ile Gln
Val Arg Leu Gly Ser Pro Ser Gly Thr Leu Leu Gly Thr Ile Tyr Val
Gly Ser Thr Gly Ser Phe Asp Thr Tyr Arg Asp Val Ser Ala Thr Ile
Ser Asn Thr Ala Gly Val Lys Asp Ile Val Leu Val Phe Ser Gly Pro
Val Asn Val Asp Trp Phe Val Phe Ser Lys Ser Gly Thr Ser

Claims (9)

  1. (a) 단백질을 포함하는 식물 추출물 및 셀룰로오스(cellulose)를 혼합하는 단백질 결합 단계(binding step);
    (b) 결합되지 않은 단백질을 제거하는 세척 단계(washing step); 및
    (c) 상기 셀룰로오스에 결합된 단백질을 용출(elusion)하는 단계를 포함하는 셀룰로오스 결합 도메인(Cellulose binding domain)을 포함하는 단백질의 분리 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 셀룰로오스(cellulose)는 미세결정셀룰로오스(microcrystalline cellulose) 또는 비결정셀룰로오스(amorphous cellulose)인 것을 특징으로 하는, 단백질의 분리 방법.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 미세결정셀룰로오스는 식물 추출물 용량의 0.5 내지 2배 용량으로 사용되는 것을 특징으로 하는, 단백질의 분리 방법.
  4. 제 2 항에 있어서,
    상기 비결정셀룰로오스는 식물 추출물 용량의 0.1 내지 0.5배 용량으로 사용되는 것을 특징으로 하는, 단백질의 분리 방법.
  5. 제 2 항에 있어서,
    상기 비결정셀룰로오스는
    (a) 40 내지 75%의 인산(phosphoric acid)에 미세결정셀룰로오스를 첨가하고 교반하여 비결정셀룰로오스를 제조하는 단계; 및
    (b) 상기 비결정셀룰로오스에 500mM 내지 1.5M의 탄산나트륨(Na2CO3)을 첨가하는 단계를 포함하는 방법으로 제조되는 것을 특징으로 하는, 단백질의 분리 방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 셀룰로오스 결합 도메인을 포함하는 단백질은 서열번호 2로 구성되는 셀룰로오스 결합 도메인의 아미노산 서열을 포함하는 재조합 단백질인 것을 특징으로 하는, 단백질의 분리 방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 결합 단계는 10 내지 60 mM의 아세트산나트륨(sodium acetate), 10 내지 200 mM의 염화나트륨(sodium chloride), 및 0.1 내지 3 mM의 염화칼슘(calcium chloride)을 포함하는 완충용액(buffer)을 사용하는 것을 특징으로 하는, 단백질의 분리 방법.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 세척 단계는 10 내지 60 mM의 아세트산나트륨(sodium acetate), 10 내지 200 mM의 염화나트륨(sodium chloride), 0.1 내지 3 mM의 염화칼슘(calcium chloride), 및 0.05 내지 0.2 %의 트리톤 X-100(Triton X-100)을 포함하는 완충용액(buffer)을 사용하는 것을 특징으로 하는, 단백질의 분리 방법.
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 단백질을 용출하는 단계는 pH 7.5 내지 10의 10 내지 60 mM 트리스-염화수소(Tris-HCl) 완충용액, 10 내지 200 mM의 염화나트륨(sodium chloride), 및 0.1 내지 3 mM의 염화칼슘(calcium chloride) 및 1 내지 20 %의 셀로비오스(Cellobiose)를 포함하는 완충용액(buffer)을 사용하는 것을 특징으로 하는, 단백질의 분리 방법.
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