WO2013162021A1 - 肝疾患の予防または治療剤 - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to an agent for preventing or treating liver diseases.
  • Metabolic syndrome is a modern disease that has rapidly surfaced along with changes in the living environment in recent years, and various difficult-to-control disease groups such as type 2 diabetes and arteriosclerotic diseases are developed in a domino manner.
  • fatty liver is one that becomes prominent from the beginning with obesity.
  • NASH non-alcoholic steatohepatitis
  • the liver parenchyma is extensively fibrotic in an alcohol-independent manner, and cirrhosis and hepatocellular carcinoma often develop.
  • insulin resistance improving drugs, antioxidants, liver protectants, antihyperlipidemic drugs, antihypertensive drugs, etc. are used, but there is no established treatment method, and development of effective therapeutic drugs Is desired.
  • NASH animal models include mice loaded with MCD (methionine-choline diet) and carbon tetrachloride, both of which are mainly fibrotic after hepatic necrosis due to hepatic failure and have lost weight. However, it does not accurately reflect liver fibrosis resulting from obesity and fatty liver due to overnutrition seen in patients with human metabolic syndrome. If an NASH animal model capable of reproducing human pathology can be prepared, it becomes possible to screen for and evaluate NASH therapeutic agents.
  • MCD methionine-choline diet
  • carbon tetrachloride both of which are mainly fibrotic after hepatic necrosis due to hepatic failure and have lost weight.
  • MCD methionine-choline diet
  • carbon tetrachloride both of which are mainly fibrotic after hepatic necrosis due to hepatic failure and have lost weight.
  • Metabolic syndrome is based on the acquisition of insulin resistance associated with obesity, but in recent years, it has become clear that chronic inflammation in adipose tissue is important. As a result of the persistent inflammation of adipose tissue associated with obesity throughout the body, systemic insulin resistance is induced.
  • Non-Patent Documents 1-4 AIM (Apoptosis Inhibitor of Macrophage) as described below.
  • AIM is specifically produced by macrophages and is present in the blood, but the blood concentration increases with obesity, and it is taken up by adipocytes by endocytosis via CD36 and decomposes the accumulated neutral fat ( lipolysis) is induced to release free fatty acids from fat cells (Non-patent Document 5). The released fatty acid induces and maintains chronic inflammation in the adipose tissue through stimulation of toll-like receptors (Non-patent Document 6).
  • An object of the present invention is to provide a preventive or therapeutic agent for liver disease. Another object of the present invention is to provide a method for evaluating or screening a preventive or therapeutic drug for liver disease using a new model mouse for liver disease. Still another object of the present invention is to provide a method for diagnosing liver disease.
  • the present inventor examined the pathological condition of AIM knockout mice loaded with a high fat diet and made obese, and found that (1) obesity, (2) preceding fatty liver, (3) fibrosis of the liver parenchyma, and (4) We have obtained a very interesting finding that a pathological condition similar to that of human NASH, which is a high frequency of carcinogenesis, occurs in a state where chronic inflammation and insulin resistance throughout the body including the liver are suppressed. . From this, supplementation with AIM was considered to be prevention or treatment of a series of liver diseases such as fatty liver, NASH, and liver cancer. As a result of further research based on these findings, the present inventor has completed the present invention.
  • a prophylactic / therapeutic agent for liver diseases comprising a nucleic acid comprising AIM or a partial peptide thereof or a base sequence encoding them;
  • a prophylactic / therapeutic agent for liver disease comprising an agent that induces expression of AIM or an agent that stabilizes AIM;
  • the prophylactic / therapeutic agent according to [1] or [2], wherein the liver disease is fatty liver, nonalcoholic steatohepatitis, cirrhosis or liver cancer;
  • the screening method according to [4] comprising the following steps: (1) a step of administering a test substance to a non-human mammal deficient in AIM expression under high-fat diet load conditions; (2) A step of observing at least one of the following characteristics of a non-human mam
  • liver disease is fatty liver, nonalcoholic steatohepatitis, cirrhosis or liver cancer
  • a method for preventing / treating liver disease comprising administering an effective amount of a nucleic acid comprising AIM or a partial peptide thereof or a base sequence encoding them to a subject
  • a method for preventing and treating liver disease comprising administering an effective amount of an agent that induces expression of AIM or an agent that stabilizes AIM to a subject
  • the prevention / treatment method according to [12] or [13] wherein the liver disease is fatty liver, non-alcoholic steatohepatitis, cirrhosis or liver cancer
  • the present invention can provide a prophylactic / therapeutic agent for liver disease containing AIM as an active ingredient.
  • a substance effective for the prevention and treatment of liver disease can be searched.
  • the effect of a known preventive / therapeutic agent for liver disease can be evaluated using the liver disease model mouse of the present invention.
  • this invention can provide the diagnostic method of a liver disease by measuring the AIM density
  • A is a graph showing the liver weight of AIM KO mice and WT mice loaded with a high fat diet, the ratio of liver weight to body weight, and the weight of neutral fat in the liver. mean ⁇ SEM, ***; P ⁇ 0.001.
  • B Hematoxylin and eosin (HE) stained images of liver tissue pieces of AIM KO mice and WT mice loaded with a high fat diet.
  • A Sirius red-stained images of liver tissue pieces of AIM KO mice and WT mice 20 weeks after loading with a high fat diet.
  • B A graph showing the rate of fibrosis in liver tissue pieces of AIM KO mice and WT mice loaded with a high fat diet for 0, 6, 12, 20, 45, 55 weeks.
  • C A graph showing the relative mRNA expression levels of TGF ⁇ 1 and ⁇ SMA in the livers of AIM KO mice and WT mice loaded with a high fat diet.
  • A Photographs of livers extracted from AIM KO mice and WT mice loaded with a high fat diet for 52 weeks.
  • B Hematoxylin-eosin stained image of liver tissue piece of AIM KO mice loaded with high fat diet for 52 weeks.
  • C Graph showing the incidence of well-differentiated hepatocellular carcinoma (HCC) in liver tissue pieces of AIM KO mice and WT mice loaded with a high fat diet for 0, 6, 12, 20, 45, 52 weeks .
  • HCC well-differentiated hepatocellular carcinoma
  • FIG. 2 is a graph showing anti-AFP antibody-stained images of liver tissue pieces of AIM KO mice and WT mice loaded with a high fat diet and the relative expression level of AFP in the liver.
  • 2 is a graph showing the relative expression levels of F4 / 80 (macrophages), TNF ⁇ , IL-6, and IL-1 ⁇ in the livers of AIM KO mice and WT mice loaded with a high fat diet. mean ⁇ SEM, *; P ⁇ 0.05, **; P ⁇ 0.01, ***; P ⁇ 0.001.
  • FIG. 2 is a graph showing an oil red O-stained image of primary mouse hepatocytes cultured in the presence or absence of AIM after pre-culture with oleic acid and the relative expression level of FSP27 in the cells.
  • FIG. 3 is a graph showing the adipocyte differentiation inhibitory effect of AIM or SRCR domain protein on 3T3-L1 preadipocytes. It is a graph which shows the AIM density
  • A It is a graph which shows the weight change of the rAIM administration group and PBS administration group of the AIM KO mouse loaded with the high fat diet.
  • B Macroscopic image of liver in rAIM administration group and PBS administration group of AIM KO mice loaded with high fat diet, hematoxylin-eosin stained image of liver tissue section (cancerous part, non-cancerous part), graph showing cancer incidence It is a graph which shows the amount of neutral fat in a liver.
  • AIM in the present invention is a protein comprising an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • AIM is isolated and purified from macrophages that are immune cells of warm-blooded animals (eg, humans, mice, rats, rabbits, sheep, pigs, cows, horses, cats, dogs, monkeys, chimpanzees, birds, etc.). It may be a protein. Further, it may be a protein synthesized chemically or by a cell-free translation system, or a recombinant produced from a transformant introduced with a nucleic acid containing a base sequence encoding the amino acid sequence. It may be a protein.
  • the amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is about 60% or more, preferably about 70% or more, more preferably about 80%, with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the amino acid sequences having homology of about 90% or more, most preferably about 95% or more are particularly preferable.
  • “homology” refers to an optimal alignment when two amino acid sequences are aligned using a mathematical algorithm known in the art (preferably the algorithm uses a sequence of sequences for optimal alignment). The percentage of identical and similar amino acid residues relative to all overlapping amino acid residues in which one or both of the gaps can be considered).
  • Similar amino acids mean amino acids that are similar in physicochemical properties, such as aromatic amino acids (Phe, Trp, Tyr), aliphatic amino acids (Ala, Leu, Ile, Val), polar amino acids (Gln, Asn). ), Basic amino acids (Lys, Arg, His), acidic amino acids (Glu, Asp), amino acids having hydroxyl groups (Ser, Thr), amino acids with small side chains (Gly, Ala, Ser, Thr, Met), etc. Examples include amino acids classified into groups. It is expected that substitution with such similar amino acids will not change the phenotype of the protein (ie, is a conservative amino acid substitution).
  • the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is about 60% or more, preferably about 70% or more, more preferably the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. Is an amino acid sequence having about 80% or more, particularly preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more identity.
  • Examples of the protein containing an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 include, for example, an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, A protein having substantially the same activity as the protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is preferred.
  • the term “activity” refers to, for example, atherosclerotic lesion macrophage apoptosis inhibitory activity, arteriosclerosis maintenance / promoting activity, adipocyte differentiation inhibiting activity, adipocyte lipid droplet thawing activity, adipocyte shrinking activity, CD36 binding activity, It refers to endocytic activity on fat cells, FAS binding activity, FAS function inhibitory activity, anti-obesity activity, and the like. “Substantially homogeneous” indicates that their activities are qualitatively (eg, physiologically or pharmacologically) the same.
  • the activities are preferably equivalent, but quantitative factors such as the degree of these activities (eg, about 0.1 to about 10 times, preferably about 0.5 to about 2 times) and the molecular weight of the protein. May be different.
  • the activity can be measured according to a method known per se.
  • amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 2 preferably about 1 to 100, preferably about 1 to 50, Preferably about 1 to 10, particularly preferably 1 to several (2, 3, 4 or 5) amino acid sequences deleted.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 preferably about 1 to 100, preferably about 1 to 50, more preferably about 1 to 10, particularly preferably 1 to several (2, 3, 4 or 5) amino acids.
  • Added amino acid sequence, (3) 1 or 2 or more preferably about 1-50, preferably about 1-10, more preferably 1-number (2) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 preferably about 1 to 50, preferably about 1 to 10, more preferably Also included are amino acid sequences in which 1 to several (2, 3, 4 or 5) amino acids are substituted with other amino acids, or (5) proteins containing amino acid sequences combining them.
  • amino acid sequence is inserted, deleted or substituted as described above, the position of the insertion, deletion or substitution is not particularly limited as long as the activity of the protein is maintained.
  • the AIM of the present invention is preferably a human AIM protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (GenBank accession number: AAD01446), or a homolog thereof in other mammals [for example, GenBank accession number, respectively. : Mouse homologue registered as AAD01445].
  • proteins and peptides are described with the N-terminus (amino terminus) at the left end and the C-terminus (carboxyl terminus) at the right end according to the convention of peptide designation.
  • the AIM of the present invention including the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 has a C-terminal carboxyl group (—COOH), carboxylate (—COO ⁇ ), amide (—CONH 2 ) or Any of esters (—COOR) may be used.
  • R in the ester for example, a C 1-6 alkyl group such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl; for example, a C 3-8 cycloalkyl group such as cyclopentyl, cyclohexyl; C 6-12 aryl groups such as ⁇ -naphthyl; phenyl-C 1-2 alkyl groups such as benzyl and phenethyl; C 7- such as ⁇ -naphthyl-C 1-2 alkyl groups such as ⁇ -naphthylmethyl; 14 aralkyl group; pivaloyloxymethyl group and the like are used.
  • a C 1-6 alkyl group such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl
  • a C 3-8 cycloalkyl group such as cyclopentyl, cyclohex
  • the AIM of the present invention has a carboxyl group (or carboxylate) in addition to the C-terminus, those in which the carboxyl group is amidated or esterified are also included in the protein of the present invention.
  • the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester or the like is used.
  • the amino group of the N-terminal amino acid residue is protected with a protecting group (for example, a C 1-6 acyl group such as C 1-6 alkanoyl such as formyl group, acetyl group, etc.).
  • N-terminal glutamine residue that can be cleaved in vivo is pyroglutamine oxidized, a substituent on the side chain of an amino acid in the molecule (for example, —OH, —SH, amino group, imidazole group, An indole group, a guanidino group, etc.) protected with an appropriate protecting group (for example, a C 1-6 acyl group such as a C 1-6 alkanoyl group such as a formyl group or an acetyl group), or a sugar chain Also included are complex proteins such as so-called glycoproteins.
  • an amino acid in the molecule for example, —OH, —SH, amino group, imidazole group, An indole group, a guanidino group, etc.
  • an appropriate protecting group for example, a C 1-6 acyl group such as a C 1-6 alkanoyl group such as a formyl group or an acetyl group
  • complex proteins such as
  • a partial peptide of AIM is a peptide having the above-described partial amino acid sequence of AIM and has substantially the same quality of activity as AIM. Any one may be used.
  • substantially the same quality of activity has the same meaning as described above.
  • substantially the same quality of activity can be measured in the same manner as in the case of AIM. Since AIM includes three SRCR (scavenger-receptor cysteine-rich) domains that are rich in cysteine, each SRCR domain can be used as a partial peptide of the present invention.
  • SRCR1 domain amino acid numbers 24-125 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2
  • SRCR2 domain amino acid numbers 138 to 239
  • SRCR3 domain amino acid numbers 244 to 346 among the amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 2
  • the size of the partial peptide of the present invention is not particularly limited as long as it includes the functional domain described above, but preferably includes 50 or more partial amino acid sequences, more preferably 100 or more partial amino acid sequences. More preferably, those containing 200 or more partial amino acid sequences are included.
  • the partial amino acid sequence may be one continuous partial amino acid sequence, or may be a concatenation of a plurality of discontinuous partial amino acid sequences.
  • the C-terminus may be any of a carboxyl group (—COOH), a carboxylate (—COO ⁇ ), an amide (—CONH 2 ), or an ester (—COOR).
  • R in the ester include the same as those described above for AIM.
  • the partial peptide of the present invention has a carboxyl group (or carboxylate) in addition to the C-terminus, those in which the carboxyl group is amidated or esterified are also included in the partial peptide of the present invention.
  • the ester in this case, for example, the same ester as the C-terminal ester is used.
  • the amino group of the N-terminal amino acid residue is protected with a protecting group
  • the N-terminal glutamine residue is pyroglutamine oxidized
  • Examples include those in which a substituent on the side chain of the amino acid is protected with an appropriate protecting group, or a complex peptide such as a so-called glycopeptide to which a sugar chain is bound.
  • the AIM or its partial peptide used in the present invention may be in the form of a salt.
  • a salt with a physiologically acceptable acid eg, inorganic acid, organic acid
  • a base eg, alkali metal salt
  • a physiologically acceptable acid addition salt is particularly preferable.
  • Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid). Acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, succinic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) and the like.
  • inorganic acids eg hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic
  • AIM can be produced from the above-described mammalian macrophages by a known protein purification method. Specifically, after homogenizing mammalian macrophages and removing cell debris by low-speed centrifugation, the supernatant is centrifuged at high speed to precipitate a cell membrane-containing fraction, and the supernatant is subjected to reverse phase chromatography and ion exchange chromatography. AIM or a salt thereof can be prepared by subjecting to chromatography such as affinity chromatography.
  • AIM or a partial peptide thereof can also be produced according to a known peptide synthesis method (hereinafter, in the description of these chemical syntheses, the full-length AIM and its partial peptide are simply referred to as AIM unless otherwise specified. ).
  • the peptide synthesis method may be, for example, either a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method.
  • the target protein can be produced by removing the protecting group.
  • the condensation and the removal of the protecting group are carried out according to a method known per se, for example, the method described in the following (1) and (2). (1) M.M. Bodanszky and M.M. A. Ondetti, Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966) (2) Schroeder and Luebke, The Peptide, Academic Press, New York (1965)
  • the AIM thus obtained can be purified and isolated by a known purification method.
  • the purification method include solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, recrystallization, and combinations thereof.
  • AIM can also be produced by culturing a transformant containing a nucleic acid encoding it and separating and purifying AIM from the resulting culture.
  • the nucleic acid encoding AIM or a partial peptide thereof may be DNA or RNA, or may be a DNA / RNA chimera.
  • DNA is used.
  • the nucleic acid may be double-stranded or single-stranded. In the case of a double strand, it may be a double-stranded DNA, a double-stranded RNA or a DNA: RNA hybrid.
  • DNA encoding AIM or a partial peptide thereof include genomic DNA, warm-blooded animals (eg, human, cow, monkey, horse, pig, sheep, goat, dog, cat, guinea pig, rat, mouse, rabbit, hamster, bird). Macrophage-derived cDNA, synthetic DNA and the like.
  • Any genomic DNA encoding AIM or a partial peptide thereof may be any cell of the animal [for example, hepatocytes, spleen cells, nerve cells, glial cells, pancreatic ⁇ cells, bone marrow cells, mesangial cells, Langerhans cells, epidermal cells, Epithelial cells, goblet cells, endothelial cells, smooth muscle cells, fibroblasts, fibrocytes, muscle cells, fat cells, immune cells (eg, macrophages, T cells, B cells, natural killer cells, mast cells, neutrophils, Basophils, eosinophils, monocytes), megakaryocytes, synoviocytes, chondrocytes, bone cells, osteoblasts, osteoclasts, mammary cells, hepatocytes or stromal cells, or precursor cells of these cells, Stem cells or cancer cells] or any tissue in which those cells exist [eg, brain, brain regions (eg, olfactory bulb, amygdala, bas
  • genomic DNA and cDNA encoding AIM or a partial peptide thereof can be obtained from a genomic DNA library and cDNA library prepared by inserting the above genomic DNA and a fragment of total RNA or mRNA into an appropriate vector. Alternatively, they can be cloned by plaque hybridization method or PCR method, respectively.
  • the vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like.
  • Examples of the DNA encoding AIM include DNA containing the same or substantially the same base sequence as the base sequence represented by base numbers 64 to 1107 of SEQ ID NO: 1.
  • Examples of DNA containing a base sequence substantially the same as the base sequence represented by base numbers 64 to 1107 of SEQ ID NO: 1 include the base sequence represented by base numbers 64 to 1107 of SEQ ID NO: 1 and about A protein having a base sequence having a homology of 60% or more, preferably about 70% or more, more preferably about 80% or more, particularly preferably about 90% or more, and having substantially the same activity as AIM described above
  • DNA that encodes is used.
  • NCBI BLAST National Center for Biotechnology Information Basic Alignment Search Tool
  • the above-mentioned algorithm for calculating homology of amino acid sequences is also preferably exemplified.
  • the DNA encoding AIM is preferably a DNA (GenBank accession number: AF011429) containing a base sequence encoding a human AIM protein represented by the base sequence represented by base numbers 64 to 1107 of SEQ ID NO: 1, or other Homologues in mammals [for example, mouse homologues registered with GenBank as accession number: AF011428, respectively].
  • the DNA encoding the partial peptide of the present invention is any DNA as long as it contains a base sequence encoding a peptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as part of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. It may be.
  • examples of the DNA encoding the partial peptide of the present invention include (1) DNA containing a partial base sequence of the base sequence represented by base numbers 64 to 1107 of SEQ ID NO: 1, or (2) About 60% or more, preferably about 70% or more, more preferably about 80% or more, particularly preferably about 90%, with DNA containing a partial base sequence of the base sequence represented by base numbers 64 to 1107 of SEQ ID NO: 1
  • a DNA encoding a protein containing a base sequence having the above homology and having substantially the same quality of activity as AIM described above is used.
  • a DNA encoding AIM or a partial peptide thereof is amplified by a PCR method using a synthetic DNA primer having a part of a base sequence encoding the AIM or a partial peptide thereof, or is incorporated into a suitable expression vector, Cloning can be performed by hybridization with a DNA fragment encoding a part or the entire region of AIM or a labeled synthetic DNA. Hybridization is carried out according to a method known per se or a method analogous thereto, for example, the method described in Molecular Cloning, 2nd edition (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). Can do. When a commercially available library is used, hybridization can be performed according to the method described in the attached instruction manual.
  • Hybridization can be preferably performed according to stringent conditions.
  • a hybridization reaction at 45 ° C. in 6 ⁇ SSC (sodium chloride / sodium citrate), followed by one or more times at 65 ° C. in 0.2 ⁇ SSC / 0.1% SDS Cleaning.
  • a person skilled in the art may appropriately change the salt concentration of the hybridization solution, the temperature of the hybridization reaction, the probe concentration, the length of the probe, the number of mismatches, the time of the hybridization reaction, the salt concentration of the washing solution, the washing temperature, etc.
  • the desired stringency can be easily adjusted.
  • hybridization can be performed according to the method described in the instruction manual attached to the library.
  • An expression vector containing DNA encoding AIM or a partial peptide thereof is produced, for example, by excising a target DNA fragment from DNA encoding AIM and ligating the DNA fragment downstream of a promoter in an appropriate expression vector.
  • an expression vector plasmids derived from E. coli (eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13); animal cell expression plasmids (eg, pA1-11, pXT1, pRc / CMV, pRc / RSV, pcDNAI / Neo); retrovirus, Animal virus vectors such as vaccinia virus and adenovirus are used.
  • the promoter may be any promoter as long as it is appropriate for the host used for gene expression.
  • the SR ⁇ promoter when the host is an animal cell, the SR ⁇ promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV (cytomegalovirus) promoter, RSV (Rous sarcoma virus) promoter, MoMuLV (Moloney murine leukemia virus) LTR, HSV-TK (herpes simplex) Virus thymidine kinase) promoter and the like are used.
  • CMV promoter, SR ⁇ promoter and the like are preferable.
  • the host is a bacterium of the genus Escherichia, trp promoter, lac promoter, recA promoter, .lambda.P L promoter, lpp promoter, T7 promoter and the like are preferable.
  • an expression vector containing an enhancer, a splicing signal, a poly A addition signal, a selection marker, an SV40 origin of replication (hereinafter sometimes abbreviated as SV40 ori), etc. is used as desired.
  • the selection marker include a dihydrofolate reductase gene (hereinafter abbreviated as dhfr, methotrexate (MTX) resistance), an ampicillin resistance gene (hereinafter abbreviated as amp r ), a neomycin resistance gene ( hereinafter sometimes abbreviated as neo r, include G418 resistance) and the like.
  • the target gene can be selected using a medium not containing thymidine.
  • a base sequence (signal codon) encoding a signal sequence suitable for the host is added (or replaced with a native signal codon) to the 5 ′ end of DNA encoding AIM or a partial peptide thereof. May be.
  • the host is Escherichia, PhoA signal sequence, OmpA signal sequence, etc .; if the host is an animal cell, insulin signal sequence, ⁇ -interferon signal sequence, antibody molecule / signal sequence, etc. Each is used.
  • AIM or a partial peptide thereof can be produced by transforming a host with an expression vector containing DNA encoding the above-mentioned AIM or a partial peptide thereof and culturing the resulting transformant.
  • the host for example, Escherichia bacteria, animal cells and the like are used.
  • the genus Escherichia include, for example, Escherichia coli K12 • DH1 [Procedures of the National Academy of Sciences of the USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA).
  • animal cells examples include monkey COS-7 cells, monkey Vero cells, Chinese hamster ovary cells (hereinafter abbreviated as CHO cells), dhfr gene-deficient CHO cells (hereinafter abbreviated as CHO (dhfr ⁇ ) cells), mouse L Cells, mouse AtT-20 cells, mouse myeloma cells, rat GH3 cells, human FL cells and the like are used.
  • Transformation can be performed according to a known method depending on the type of host.
  • Escherichia bacteria include Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 69, 2110 (1972) and Gene (Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA). Gene), Vol. 17, 107 (1982), and the like.
  • Animal cells should be transformed, for example, according to the method described in Cell Engineering Supplement 8 New Cell Engineering Experimental Protocol, 263-267 (1995) (published by Shujunsha), Virology, Vol. 52, 456 (1973). Can do.
  • the culture of the transformant can be performed according to a known method depending on the type of the host.
  • a medium for culturing a transformant whose host is an Escherichia bacterium for example, an M9 medium containing glucose and casamino acid [Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics ( Journal of Experiments in Molecular Genetics), 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972].
  • a drug such as 3 ⁇ -indolylacrylic acid may be added to the medium in order to make the promoter work efficiently.
  • the transformant whose host is Escherichia is usually cultured at about 15 to about 43 ° C. for about 3 to about 24 hours. If necessary, aeration or agitation may be performed.
  • a minimal essential medium containing about 5 to about 20% fetal bovine serum [Science, Vol. 122, 501 (1952) ], Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) [Virology, Vol. 8, 396 (1959)], RPMI 1640 Medium [The Journal of the American Medical Association, 1 Vol., 519 (1967)], 199 medium [Proceeding of the Society for the Biological Medicine (Proceeding of the Society for the Biological Medicine) l Medicine), 73 vol., and 1 (1950)] is used.
  • the pH of the medium is preferably about 6 to about 8.
  • the culture is usually performed at about 30 ° C. to about 40 ° C. for about 15 to about 60 hours. You may perform ventilation
  • AIM can be produced inside or outside the transformant.
  • AIM or a partial peptide thereof can be separated and purified from a culture obtained by culturing the transformant according to a method known per se.
  • a method known per se For example, when AIM or a partial peptide thereof is extracted from cultured cells or cell cytoplasm, the cells or cells collected from the culture by a known method are suspended in an appropriate buffer, and are subjected to ultrasound, lysozyme and / or freezing.
  • ultrasound, lysozyme and / or freezing For example, a method of obtaining a crude extract of soluble protein by centrifugation or filtration after disrupting cells or cells by thawing or the like is appropriately used.
  • the buffer solution may contain a protein denaturant such as urea or guanidine hydrochloride and a surfactant such as Triton X-100 TM .
  • AIM or a partial peptide thereof is secreted outside the cells (cells)
  • a method of separating the culture supernatant from the culture by centrifugation or filtration is used. Isolation and purification of AIM or its partial peptide contained in the thus obtained soluble fraction and culture supernatant can be carried out according to a method known per se. Examples of such methods include the use of solubilities such as salting out and solvent precipitation; mainly the differences in molecular weight such as dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
  • a method utilizing a difference in charge such as ion exchange chromatography; a method utilizing a specific affinity such as affinity chromatography; a method utilizing a difference in hydrophobicity such as reverse phase high performance liquid chromatography; A method using a difference in isoelectric point, such as point electrophoresis, is used. These methods can be combined as appropriate.
  • AIM AIM or a partial peptide thereof thus obtained can be confirmed by enzyme immunoassay or Western blotting using an antibody against AIM.
  • AIM obtained as described above or a partial peptide thereof or a salt thereof, or a nucleic acid containing a base sequence encoding AIM or a partial peptide thereof prevents the onset of liver disease.
  • -It can be provided as a therapeutic agent.
  • the present invention can also use an agent that induces the expression of AIM or an agent that stabilizes AIM, instead of AIMs.
  • agents that induce AIM expression include compounds having an AIM transcription activity, and examples of the compounds include transcription factors that can bind to the promoter region of the AIM gene.
  • the inventor has also found that AIM is expressed in macrophages. Therefore, a macrophage differentiation inducer is mentioned as an agent which induces the expression of AIM.
  • the macrophage differentiation inducer is not particularly limited as long as it can induce differentiation of macrophages from progenitor cells such as granulocyte macrophage colony forming cells (CFU-GM) and macrophage colony forming cells (CFU-M).
  • a sphere macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), a macrophage colony-stimulating factor (M-CSF), or the like can be used.
  • Transcription factors, GM-CSF, and M-CSF may be proteins isolated and purified from mammalian tissues and cells by the above-mentioned known means, or may be biochemically synthesized by chemical synthesis or cell-free translation systems. It may be a synthesized protein. Alternatively, it may be a recombinant protein produced from a transformant introduced with a nucleic acid containing a base sequence encoding the protein.
  • Examples of drugs that stabilize AIM include compounds that inhibit AIM degradation, or compounds that inhibit urinary excretion.
  • Examples of the compound that inhibits degradation include protease inhibitors and proteasome inhibitors.
  • protease inhibitors include serine protease inhibitors (4- (2-aminoethyl) benzenesulfonyl hydrochloride (AEBSGF), aprotinin, trypsin inhibitor, etc.), cysteine protease inhibitors (E-64, leupeptin, etc.) Etc.
  • Examples of proteasome inhibitors include lactacystin, MG-115, MG-132, proteasome inhibitor I and the like.
  • Examples of compounds that inhibit urinary excretion include compounds that impart to AIM a molecular weight that cannot pass through the glomerular basement membrane. Since it was confirmed that IgM binds to AIM as in Examples described later, IgM can be mentioned as a compound that inhibits urinary excretion. However, when IgM itself is administered, there are concerns about side effects of the immune system, so the Fc part of IgM, which is a binding site for AIM, and a protein with a molecular weight that is filtered through tubules and not excreted in urine were fused.
  • a fusion protein is preferably used.
  • the protein to be fused is not limited, but is preferably a protein with less side effects, such as albumin.
  • the connection may be directly connected, or may be connected using a hinge portion.
  • An example of the hinge portion is a FLAG tag arranged in parallel.
  • Such molecules can be produced in a conventional manner as a single recombinant protein by linking the genes encoding them.
  • AIM knockout mice were promoted to develop liver diseases under high-fat diet loading conditions as compared to wild-type (WT) mice.
  • WT wild-type mice.
  • the liver disease approximates the pathology of non-alcoholic steatohepatitis (NASH) and the progression to liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma, which are the characteristics of the disease, was also reproduced.
  • AIMs drugs that induce the expression of AIM, drugs that stabilize AIM, or compounds that can replace the function of AIM that can be explored by the screening methods described below, are associated with the onset and progression of liver disease. It is suggested that can be prevented and treated.
  • liver diseases to which the pharmaceutical composition containing the AIMs of the present invention, a drug that induces expression of AIM, or a drug that stabilizes AIM are applied include fatty liver, NASH, cirrhosis, and liver cancer.
  • the liver disease to which the pharmaceutical composition containing the AIMs of the present invention, an agent that induces the expression of AIM, or an agent that stabilizes AIM is applied involves activation of hepatic stellate cells. It may be liver disease.
  • ⁇ SMA ⁇ -smooth muscle actin
  • the liver disease may be a liver disease in which ⁇ SMA mRNA is significantly expressed as compared with normal liver tissue. Furthermore, in another aspect, the liver disease may be a liver disease in which TGF ⁇ 1 or Collagen4A1 is significantly expressed as compared with normal liver tissue.
  • the pharmaceutical composition containing the AIMs of the present invention an agent that induces the expression of AIM or an agent that stabilizes AIM has low toxicity and is used as a liquid or as a pharmaceutical composition of an appropriate dosage form as human or other Orally or parenterally (eg, intravascular administration, subcutaneous administration, etc.) to warm-blooded animals (eg, mice, rats, rabbits, sheep, pigs, cattle, cats, dogs, monkeys, birds, etc.) can do.
  • warm-blooded animals eg, mice, rats, rabbits, sheep, pigs, cattle, cats, dogs, monkeys, birds, etc.
  • injections are dosage forms such as intravenous injections, subcutaneous injections, intradermal injections, intramuscular injections, infusions, and the like. May be included.
  • Such an injection can be prepared according to a known method.
  • a method for preparing an injection for example, the AIMs of the present invention, a drug that induces the expression of AIM, or a drug that stabilizes AIM is dissolved in a sterile aqueous liquid or oily liquid that is usually used for injection. It can be prepared by turbidity or emulsification.
  • an aqueous solution for injection for example, an isotonic solution containing physiological saline, glucose and other adjuvants, and the like are used, and suitable solubilizers such as alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, Propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants (eg, polysorbate 80, HCO-50 (polyoxyethylene (50 mol) additive of hydrogenated castor oil)) and the like may be used in combination.
  • the oily liquid for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and benzyl benzoate, benzyl alcohol and the like may be used in combination as a solubilizing agent.
  • the prepared injection solution is preferably filled in a suitable ampoule.
  • a suppository used for rectal administration may be prepared by mixing the above AIMs, an agent that induces expression of AIM, or an agent that stabilizes AIM into an ordinary suppository base.
  • compositions for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including dragees and film-coated tablets), pills, granules, powders, capsules (including soft capsules), syrups Agents, emulsions, suspensions and the like.
  • Such a composition is produced by a known method and may contain a carrier, a diluent or an excipient usually used in the pharmaceutical field.
  • a carrier and excipient for tablets for example, lactose, starch, sucrose, and magnesium stearate are used.
  • the above parenteral or oral pharmaceutical composition is conveniently prepared in a dosage unit form suitable for the dose of the active ingredient.
  • dosage form of such a dosage unit include tablets, pills, capsules, injections (ampoules), and suppositories.
  • the AIMs of the present invention, an agent that induces expression of AIM or an agent that stabilizes AIM is, for example, usually 5 to 500 mg per dosage unit form, especially 5 to 100 mg for injections, and 10 to 250 mg for other dosage forms. It is preferably contained.
  • the dose of the AIMs of the present invention, the agent for inducing the expression of AIM or the agent for stabilizing AIM varies depending on the administration subject, target disease, symptom, administration route, etc.
  • the AIMs of the present invention are used as a single dose, usually about 0.01 to 20 mg / kg body weight, preferably 0.1 to 10 mg / kg body weight. It is convenient to administer about 0.1 to 5 mg / kg body weight by intravenous injection about 1 to 5 times a day, preferably about 1 to 3 times a day. In the case of other parenteral administration and oral administration, an equivalent amount can be administered. If symptoms are particularly severe, the dose may be increased according to the symptoms.
  • compositions may contain other active ingredients as long as an undesirable interaction is not caused by the combination with the AIMs of the present invention, a drug that induces expression of AIM, or a drug that stabilizes AIM. Good.
  • agents that induce the expression of AIM are other agents useful for the treatment of liver diseases, such as insulin sensitizers (eg, rosiglitazone, pioglitazone, etc.) Thiazolidine derivatives, etc., biguanides such as metformin, buformin); antioxidants (eg, vitamin E, vitamin C, betaine, EPL (Polyenephosphatidylcholine), etc.); liver protectants (eg, ursodeoxycholic acid (UDCA), etc.) Antihyperlipidemic drugs (eg, fibrate drugs, probucol, statin drugs, etc.); antihypertensive drugs (eg, angiotensin II receptor antagonist, etc.); glycyrrhizin preparations; You may use together with anticancer agents.
  • the AIMs of the present invention, an agent that induces expression of AIM or an agent that stabilizes AIM, and the agent may be administered to a patient at
  • AIM knockout mice frequently develop liver disease similar to the pathology of non-alcoholic steatohepatitis (NASH) under high-fat diet loading conditions, compared to wild-type mice, It was confirmed to progress to cirrhosis and hepatocellular carcinoma. This suggests that AIM knockout mice placed under high-fat diet loading conditions can be provided as new model mice for liver disease. Therefore, the present invention provides a screening method for a prophylactic / therapeutic agent for liver disease using an animal obtained by loading a non-human mammal deficient in AIM expression with a high-fat diet.
  • NASH non-alcoholic steatohepatitis
  • AIM expression deficient non-human mammal means a non-human mammal in which the expression of endogenous AIM is inactivated.
  • AIM KO animals produced from ES cells in which AIM is knocked out (KO)
  • KD knockdown animals in which the expression of AIM is inactivated by antisense or RNAi technology.
  • knockout (KO) means that complete mRNA cannot be produced by destroying or removing an endogenous gene
  • knockdown (KD)” By inhibiting the translation from mRNA to protein, it means inactivating the expression of the endogenous gene as a result.
  • the AIM KO / KD animal of the present invention may be simply referred to as “KO / KD animal of the present invention”.
  • Examples of the AIM KO animal of the present invention include Miyazaki T. et al. et al. (J. Exp. Med., 189, 413-422, 1999).
  • non-human mammal that can be the subject of the present invention is not particularly limited as long as it is a mammal other than a human in which a transgenic system has been established.
  • a mouse, rat, cow, monkey, pig, sheep, goat Examples include rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, and mice.
  • Rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters and the like are preferred, and rodents with relatively short ontogeny and biological cycle and easy breeding are more preferable from the viewpoint of producing disease model animals, especially mice (for example, C57BL / 6 line, BALB / c line, DBA2 line, etc.
  • rats for example, Wistar, SD, etc.
  • mammals birds such as chickens can be used for the same purpose as the “non-human mammal” targeted in the present invention.
  • destroying the function of the exon or promoter by inserting another DNA fragment (for example, drug resistance gene or reporter gene) into the exon part or promoter region, or (2) Cre -Using the loxP system or Flp-frt system, excise all or part of the AIM and delete the gene, or (3) insert a stop codon into the protein coding region to disable complete protein translation Or (4) inserting a DNA sequence (for example, a polyA addition signal) that terminates gene transcription into the transcription region
  • a DNA sequence for example, a polyA addition signal
  • the resulting DNA strand having a DNA sequence constructed so as to inactivate the gene (hereinafter abbreviated as a targeting vector) is transformed into the target non-human mammal by homologous recombination.
  • a method of incorporating into the AIM locus can be preferably used.
  • the homologous recombinant can be obtained, for example, by introducing the above targeting vector into embryonic stem cells (ES cells).
  • ES cells are cells derived from the inner cell mass (ICM) of fertilized eggs at the blastocyst stage, and can be cultured and maintained in an undifferentiated state in vitro.
  • ICM cells are cells that will form the embryo body in the future, and are stem cells that form the basis of all tissues including germ cells.
  • an established cell line may be used, or a newly established cell line may be used according to the method of Evans and Kaufman (Nature 292, 154, 1981).
  • ES cells derived from 129 mice are generally used.
  • C57BL / 6 mice and BDF 1 mice in which the number of eggs collected from C57BL / 6 is improved by crossing with DBA / 2 (C57BL / 6 and DBA / ES cells established from F 1 ) with 2 can also be used favorably.
  • the BDF 1 mouse has a large number of eggs and has the advantage that the egg is strong, and has a C57BL / 6 mouse in the background. Therefore, when an ES cell derived therefrom is used as a disease model mouse, the C57BL / 6 mouse is used.
  • ES cells can be differentiated into various types of cells such as parietal muscle, visceral muscle, and myocardium by monolayer culture to high density or suspension culture until a cell conglomerate is formed under appropriate conditions.
  • ES cells can be differentiated into various types of cells such as parietal muscle, visceral muscle, and myocardium by monolayer culture to high density or suspension culture until a cell conglomerate is formed under appropriate conditions.
  • the vector when the targeting vector is designed to destroy the function of the exon or promoter by inserting other DNA fragments into the exon part or promoter region of AIM, the vector may be, for example, Such a configuration can be adopted.
  • the targeting vector is homologous to the target site 5 ′ upstream and 3 ′ downstream of the other DNA fragment, respectively. It is necessary to include the sequences (5 ′ arm and 3 ′ arm).
  • DNA fragments to be inserted are not particularly limited, but when a drug resistance gene or a reporter gene is used, ES cells in which a targeting vector is incorporated into a chromosome can be selected using drug resistance or reporter activity as an index.
  • drug resistance genes include neomycin phosphotransferase II (nptII) gene and hygromycin phosphotransferase (hpt) gene
  • reporter genes include, for example, ⁇ -galactosidase (lacZ) gene, chloramphenicol acetyl. Examples thereof include, but are not limited to, transferase (cat) genes.
  • the drug resistance or reporter gene is preferably under the control of any promoter that can function in mammalian cells.
  • any promoter that can function in mammalian cells.
  • CMV cytomegalovirus
  • LTR cytomegalovirus
  • RSV rous sarcoma virus
  • MoMuLV murine leukemia virus
  • AdV adenovirus
  • Examples thereof include promoters of mammalian constituent protein genes such as ⁇ -actin gene promoter, PGK gene promoter, and transferrin gene promoter.
  • a promoter that controls transcription of the gene in the targeting vector is not required.
  • the targeting vector preferably has a sequence (also called a polyadenylation (polyA) signal or terminator) that terminates transcription of mRNA from the drug resistance or reporter gene, for example, Terminator sequences derived from viral genes or from various mammalian or avian genes can be used. Preferably, an SV40 terminator or the like is used.
  • gene recombination in mammals is mostly non-homologous, and the introduced DNA is randomly inserted at an arbitrary position on the chromosome. Therefore, depending on selection (positive selection) such as detection of drug resistance and reporter gene expression, only clones targeted to the endogenous AIM targeted by homologous recombination cannot be efficiently selected. It is necessary to confirm the integration site by Southern hybridization or PCR for all clones.
  • HSV-tk herpes simplex virus-derived thymidine kinase
  • the electroporation method is selected from the viewpoint that a large number of cells can be treated.
  • the conditions used for gene transfer into normal animal cells may be used as they are.
  • 10 6 After ES cells in the logarithmic growth phase are treated with trypsin and dispersed into single cells, 10 6 It can be carried out by suspending in a medium so as to be ⁇ 10 8 cells / ml, transferring to a cuvette, adding 10 to 100 ⁇ g of the targeting vector, and applying an electric pulse of 200 to 600 V / cm.
  • ES cells incorporating a targeting vector can also be assayed by screening chromosomal DNA isolated from colonies obtained by culturing single cells on feeder cells by Southern hybridization or PCR, When drug resistance genes and reporter genes are used as other DNA fragments, transformants can be selected at the cell stage using their expression as an index. For example, when a vector containing the nptII gene is used as a marker gene for positive selection, ES cells after the gene introduction treatment are cultured in a medium containing a neomycin antibiotic such as G418, and the appeared resistant colonies are transformed. Select as a candidate.
  • the vector When a vector containing the HSV-tk gene is used as a negative selection marker gene, the vector is cultured in a medium containing ganciclovir, and the appeared resistant colonies are selected as homologous recombinant candidates. Each of the obtained colonies is transferred to a culture plate, and after trypsin treatment and medium exchange are repeated, a part is left for culture, and the rest is subjected to PCR or Southern hybridization to confirm the presence of the introduced DNA.
  • ES cell in which the integration of the introduced DNA is confirmed is returned into an embryo derived from the same kind of non-human mammal, it is incorporated into the ICM of the host embryo to form a chimeric embryo.
  • a chimeric KO animal can be obtained by transplanting this to a temporary parent (female for embryo transfer) and further allowing development. If ES cells contributed to the formation of primordial germ cells that differentiate into eggs and sperm in the future in a chimeric animal, germline chimeras will be obtained, and mating this will genetically fix AIM expression deficiency KO animals can be made.
  • the chimera embryos are prepared by adhering the early embryos up to the morula stage (aggregate chimera method) and by microinjecting cells into the blastocyst division (injection chimera method) There is.
  • aggregate chimera method In the production of chimeric embryos using ES cells, the latter has been widely used.
  • a method for producing an aggregate chimera by injecting ES cells into the zona pellucida of an 8-cell embryo or a micromanipulator is not required.
  • a method of producing an aggregate chimera by co-culturing and aggregating an ES cell mass and an 8-cell embryo from which the zona pellucida has been removed is also performed.
  • the host embryo can be collected in the same manner from a non-human mammal that can be used as an egg-collecting female in gene transfer into a fertilized egg, which will be described later. It is preferable to collect a host embryo from a mouse having a different color from the strain from which the ES cells are derived so that the ES cell contribution rate can be determined by the coat color. For example, if ES cells are derived from 129 mice (hair color: Agouti), C57BL / 6 mice (hair color: black) or ICR mice (hair color: albino) are used as the female for egg collection, and ES cells are C57BL / 6 or DBF.
  • mice hair color: black
  • TT2 cells derived from C57BL / 6 and CBA F 1 (hair color: Agouti)
  • ICR mice and BALB / c mice hair color: albino are used as eggs for egg collection. be able to.
  • the germline chimera-forming ability largely depends on the combination of ES cells and host embryos, it is more preferable to select a combination having a high germline chimera-forming ability.
  • a host embryo derived from the C57BL / 6 strain for ES cells derived from the 129 strain, and a host embryo derived from the BALB / c strain for ES cells derived from the C57BL / 6 strain. Etc. are preferred.
  • the female mouse for egg collection is preferably about 4 to about 6 weeks of age, and the male mouse for mating is preferably of the same strain of about 2 to about 8 months of age.
  • the mating may be natural mating, but is preferably performed after gonad stimulating hormone (follicle stimulating hormone and then luteinizing hormone) is administered to induce superovulation.
  • a blastocyst stage embryo (for example, in the case of a mouse, about 3.5 days after mating) is collected from the uterus of a female for egg collection (or an early embryo before the morula stage is taken from the oviduct).
  • ES cells into which the targeting vector has been introduced into the dividing space of the blastocyst using a micromanipulator may be cultured to the blastocyst stage in an embryo culture medium (described later)) (about 10 to After injection, about 15) are transplanted into the uterus of a female non-human mammal for pseudoembryo pregnancy.
  • a non-human mammal that can be used as a female for embryo transfer in gene transfer into a fertilized egg can be similarly used.
  • 8-cell stage embryos and morulas are collected from the oviduct and uterus of the female egg collection (or the initial stage before the 8-cell stage).
  • the embryo After the embryo is collected from the fallopian tube, it may be cultured in the embryo culture medium (described later) to the 8-cell stage or morula stage.
  • the obtained morula or blastocyst is transplanted into the uterus of a female non-human mammal for embryo reception in the same manner as described above.
  • a chimeric non-human mammal can be obtained by natural delivery or caesarean section. It is only necessary to continue suckling for naturally delivered embryos, and if a baby is delivered by caesarean section, the offspring are fed by a separately prepared nursing female (a female non-human mammal that is normally mated and delivered). be able to.
  • a chimeric mouse having the same gender as that of ES cells is selected (usually male ES cells are used, so male chimeric mice are selected.
  • a chimeric mouse (for example, 50% or more) having a high ES cell contribution rate is selected from the phenotype such as hair color.
  • a male mouse having a high proportion of agouti's coat color is selected. preferable.
  • a germline chimeric non-human mammal (founder) into which the targeting vector obtained as described above is introduced is usually obtained as a heterozygote in which only one AIM of a homologous chromosome is KO.
  • Phase to AIM both homologous chromosomes obtain a homozygote is KO may be crossed siblings heterozygous out of the F 1 animal obtained as described above. Selection of heterozygotes can be assayed by screening for example F 1 animals separated extracted chromosomal DNA from the tail by Southern hybridization or PCR method. 1/4 of the obtained F 2 animals would be homozygotes.
  • a virus when used as a targeting vector, a virus comprising a positive selection marker gene inserted between the 5 ′ and 3 ′ arms and a DNA containing the negative selection marker gene outside the arm.
  • a method for infecting ES cells of a non-human mammal for example, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 99, Proceedings of National Academy of Sciences USA). No. 4, pages 2140-2145, 2002.
  • retrovirus or lentivirus when retrovirus or lentivirus is used, the cells are seeded in a suitable incubator such as a dish, and a viral vector is added to the culture solution (polybrene may coexist if desired). After culturing for 1 to 2 days, As described above, the selective agent is added and the culture is continued to select cells into which the vector has been incorporated.
  • DNA encoding AIM antisense RNA or siRNA is introduced using a known per se transgenic production technique, and is then introduced into the target non-human mammalian cell.
  • shRNA shRNA
  • DNA containing a base sequence complementary to the target region of the target polynucleotide that is, DNA capable of hybridizing with the target polynucleotide is "antisense" to the target polynucleotide.
  • An antisense DNA having a base sequence complementary to or substantially complementary to the base sequence of the polynucleotide encoding AIM or a part thereof is complementary or substantially complementary to the base sequence of the polynucleotide encoding AIM.
  • Any antisense DNA may be used as long as it contains a complementary base sequence or a part thereof and has an action capable of suppressing the expression of the polynucleotide.
  • the base sequence substantially complementary to the polynucleotide encoding AIM is, for example, about 70% or more, preferably about 80% or more, with respect to the region overlapping with the base sequence of the complementary strand of the polynucleotide.
  • the nucleotide sequence has a homology of about 90% or more, most preferably about 95% or more.
  • the base sequence of the portion encoding the N-terminal site of AIM for example, the start codon
  • each of the antisense DNAs having a homology of about 95% or more is suitable.
  • Antisense DNA containing a base sequence complementary or substantially complementary to a base sequence registered as AF011428 or a part thereof preferably an anti-sense DNA containing a base sequence complementary to the base sequence or a part thereof Examples include sense DNA.
  • an antisense DNA having a base sequence complementary to or substantially complementary to the base sequence of a polynucleotide encoding AIM or a part thereof was cloned, Alternatively, it can be designed and synthesized based on the determined base sequence information of DNA encoding AIM.
  • Such antisense DNA can inhibit AIM replication or expression. That is, the antisense DNA of the present invention can hybridize with RNA (mRNA or initial transcription product) transcribed from AIM, and inhibits mRNA synthesis (processing) or function (translation into protein). it can.
  • the length of the target region of the antisense DNA of the present invention is not particularly limited as long as the antisense DNA hybridizes, and as a result, the translation into AIM is inhibited.
  • the mRNA encoding the protein is not particularly limited.
  • the short sequence may be about 10 bases, and the long sequence may be the entire sequence of mRNA or initial transcription product.
  • the 3 ′ end palindromic region or the 3 ′ end hairpin loop or the like can be selected as a preferred target region of the antisense DNA, but any region within the AIM can be selected as a target.
  • the intron portion of the gene can be used as the target region.
  • the antisense DNA of the present invention not only hybridizes with AIM mRNA or initial transcription product to inhibit translation into protein, but also binds to AIM, which is a double-stranded DNA, to form a triplex. May be formed so that RNA transcription can be inhibited.
  • a DNA: RNA hybrid may be formed to induce degradation by RNase H.
  • the most versatile ribozyme is self-splicing RNA found in infectious RNA such as viroid and virusoid, and the hammerhead type and hairpin type are known.
  • the hammerhead type exhibits enzyme activity at about 40 bases, and a few bases at both ends adjacent to the part having the hammerhead structure (about 10 bases in total) are made into a sequence complementary to the desired cleavage site of mRNA.
  • ribozyme has the additional advantage of not attacking genomic DNA since it only uses RNA as a substrate.
  • AIM mRNA itself has a double-stranded structure
  • the target sequence can be made single-stranded by using a hybrid ribozyme linked to an RNA motif derived from a viral nucleic acid that can specifically bind to an RNA helicase. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98 (10): 5572-5777 (2001)].
  • a hybrid ribozyme in which a sequence in which tRNA is modified is further linked can be used [Nucleic Acids Res. , 29 (13): 2780-2788 (2001)].
  • RNA interference in which siRNA is introduced into a cell and mRNA homologous to the RNA is degraded, so-called RNA interference (RNAi) has been known for a long time in nematodes, insects and plants.
  • siRNA can be appropriately designed using commercially available software (eg, RNAi Designer; Invitrogen) based on the base sequence information of the target mRNA.
  • the antisense oligo DNA and ribozyme of the present invention determine the target sequence of mRNA or initial transcript based on the cDNA sequence or genomic DNA sequence of AIM, and are commercially available DNA / RNA automatic synthesizers (Applied Biosystems, Beckman). Etc.) can be prepared by synthesizing a complementary sequence thereto.
  • the synthesized antisense oligo DNA or ribozyme is inserted downstream of the promoter of the expression vector through an appropriate linker (adapter) sequence, if necessary, so that a DNA expression vector encoding the antisense oligo RNA or ribozyme can be obtained.
  • Expression vectors that can be used here include plasmids derived from E.
  • plasmids derived from Bacillus subtilis, plasmids derived from yeast, bacteriophages such as ⁇ phage, retroviruses such as Moloney leukemia virus, lentiviruses, adeno-associated viruses, and vaccinia viruses. Or animals such as baculoviruses or insect viruses are used.
  • plasmids preferably E. coli-derived, Bacillus subtilis-derived or yeast-derived, especially E. coli-derived plasmids
  • animal viruses preferably retroviruses, lentiviruses
  • promoters examples include SV40-derived early promoter, cytomegalovirus (CMV) long terminal repeat (LTR), Rous sarcoma virus (RSV) LTR, murine leukemia virus (MoMuLV) LTR, adenovirus (AdV) -derived early promoter.
  • CMV cytomegalovirus
  • RSV Rous sarcoma virus
  • MoMuLV murine leukemia virus
  • AdV adenovirus
  • promoters of mammalian constituent protein genes such as ⁇ -actin gene promoter, PGK gene promoter, transferrin gene promoter, and the like.
  • a DNA expression vector encoding a longer antisense RNA (for example, the full length of the complementary strand of AIM mRNA, etc.) can be obtained by using an AIM cDNA cloned by a conventional method, if necessary, via an appropriate linker (adapter) sequence. It can be prepared by inserting in the reverse direction downstream.
  • DNA encoding siRNA can be prepared by separately synthesizing as DNA encoding sense strand or antisense strand and inserting each into a suitable expression vector.
  • siRNA expression vector one having a Pol III promoter such as U6 or H1 can be used.
  • siRNA is formed by transcription and annealing of the sense strand and the antisense strand in the animal cell introduced with the vector.
  • shRNA can be prepared by inserting a unit in which a length (for example, about 15 to 25 bases) between which a sense strand and an antisense strand can form an appropriate loop structure is inserted into an appropriate expression vector.
  • a Pol III promoter such as U6 or H1 can be used as an shRNA expression vector.
  • the shRNA transcribed in the animal cell introduced with the expression vector forms a loop by itself, and then is processed by an endogenous enzyme dicer or the like to form a mature siRNA.
  • knockdown can be achieved by RNAi by expressing a microRNA (miRNA) containing a target siRNA sequence with a Pol II promoter.
  • miRNA microRNA
  • a tissue-specific knockdown is also possible by a promoter exhibiting tissue-specific expression.
  • a method of introducing an expression vector containing DNA encoding AIM antisense RNA, siRNA, shRNA, or miRNA into a cell a method known per se is appropriately used depending on the target cell.
  • a microinjection method is used for introduction into an early embryo such as a fertilized egg.
  • calcium phosphate coprecipitation method, electroporation method, lipofection method, retrovirus infection method, aggregation method, microinjection method, particle gun method, DEAE-dextran method and the like can be used.
  • the gene is easily introduced by adding the virus to an early embryo or ES cell, culturing for 1 to 2 days, and infecting the cell with the virus. May be achievable. Individual regeneration (establishment of founders), passage (preparation of homozygote), and the like from ES cells can be performed by the same method as described above in the KO animal of the present invention.
  • an expression vector comprising DNA encoding AIM antisense RNA, siRNA, shRNA, or miRNA is introduced into an early embryo (fertilized egg) of a target non-human mammal by a microinjection method.
  • Microinjection of DNA into a fertilized egg can be performed according to a conventional method using a known apparatus such as a micromanipulator. Briefly, a fertilized egg placed in a microdrop of embryo culture medium is aspirated and fixed with a holding pipette, and the DNA solution is directly injected into the male or female pronucleus, preferably into the male pronucleus, using an injection pipette. inject.
  • the introduced DNA is preferably highly purified by CsCl density gradient ultracentrifugation or an anion exchange resin column.
  • the introduced DNA is preferably linearized by cleaving the vector portion using a restriction enzyme.
  • the fertilized egg after introduction of DNA is cultured from the 1 cell stage to the blastocyst stage in 5% carbon dioxide gas / 95% air in the embryo culture medium by the microdrop culture method, and then pseudopregnant female. Transplanted into the fallopian tube or uterus of a non-human mammal.
  • the female non-human mammal for embryo transfer may be the same species as the animal from which the early embryo to be transplanted is derived. For example, when transplanting a mouse early embryo, an ICR female mouse (preferably about 8 to about 10 weeks old) is preferably used.
  • Examples of a method for putting a female non-human mammal for embryo transfer into a pseudopregnant state include, for example, the same type of vasectomized (ligated) male non-human mammal (for example, in the case of a mouse, an ICR male mouse (preferably about 2). There is known a method of selecting those in which the presence of vaginal plugs has been confirmed by mating with those a month old or older)).
  • Embryonic females may be naturally ovulated or administered luteinizing hormone-releasing hormone (generally abbreviated as LHRH) or its analog prior to mating with vasectomized (ligated) males. Alternatively, fertility induced may be used.
  • LHRH analogs include [3,5-DiI-Tyr 5 ] -LH-RH, [Gln 8 ] -LH-RH, [D-Ala 6 ] -LH-RH, [des-Gly 10 ]- And LH-RH, [D-His (Bzl) 6 ] -LH-RH, and their ethylamide.
  • the dose of LHRH or an analog thereof, and the timing of mating with a male non-human mammal after the administration differ depending on the type of non-human mammal.
  • the non-human mammal is a mouse (preferably an ICR mouse, etc.)
  • the dose of the analog is usually about 10-60 ⁇ g / individual, preferably about 40 ⁇ g / individual.
  • the embryo is transplanted to the female uterus for embryo transfer, and if earlier (for example, 1 cell stage to 8 cell stage embryo), it is transferred to the fallopian tube.
  • a female for embryo transfer a female whose a certain number of days has passed since pseudopregnancy is appropriately used depending on the stage of development of the transplanted embryo. For example, in the case of mice, female mice about 0.5 days after pseudopregnancy are preferable for transplanting 2-cell stage embryos, and female mice about 2.5 days after pseudopregnancy are preferable for transplanting blastocyst stage embryos. .
  • the ovaries are extracted by incision, and the initial embryos (about 5 to about 10) suspended in the embryo culture medium are pipetted for embryo transfer Inject into the fallopian tube or near the fallopian junction at the uterine horn.
  • the offspring is a separately provided female female (for example, in the case of a mouse, a female mouse normally mated and delivered) Can be fed to ICR female mice))).
  • AIM antisense RNA, siRNA, shRNA, or miRNA at the fertilized egg cell stage is ensured so that the introduced DNA is present in all germ line cells and somatic cells of the subject non-human mammal. Whether or not the introduced DNA is incorporated into the chromosomal DNA can be assayed, for example, by screening chromosomal DNA separated and extracted from the tail of the litter by Southern hybridization or PCR. The presence of the expression vector in the germ line cells of the offspring non-human mammal (F 0 ) obtained as described above indicates that all of the progeny (F 1 ) animals have their germ line cells and somatic cells in all. It means that an expression vector exists.
  • F 0 animals are obtained as heterozygotes having the introduced DNA only in one of the homologous chromosomes. Individual F 0 individuals are randomly inserted on different chromosomes unless homologous recombination is used. Phase in order to obtain a homozygote having the expression vector into both the chromosomes, to produce F 1 animals crossed with an F 0 animal and a non-transgenic animal, heterojunction having the transferred DNA in only one of the homologous chromosomes You only have to cross your brothers and sisters. If only introduced DNA is integrated into a locus, 1/4 of the obtained F 2 animals would be homozygotes.
  • a virus containing DNA encoding an antisense RNA, siRNA, shRNA, or miRNA of AIM is used.
  • a method of infecting early embryos or ES cells can be mentioned.
  • a fertilized egg it is preferable to remove the zona pellucida prior to infection.
  • the selective agent is added as described above, and the culture is continued to select cells into which the vector has been incorporated.
  • the AIM-deficient non-human mammal of the present invention can respond under high fat diet load conditions. Compared to wild-type animals, the following characteristics: (1) liver weight increases, (2) Fatty liver is increased, (3) develop liver cancer, and / or (4) the inflammatory response is suppressed in the liver, Have
  • the non-human mammal deficient in AIM expression of the present invention has a feature that liver fibrosis is enhanced under a high-fat diet load condition, like a wild-type animal. These phenotypes have not been reported at least in conventionally known AIM KO mice. In particular, it is a new discovery that the transition to fatty liver, liver fibrosis, and liver cancer is similar to the pathology of NASH.
  • liver weight means that liver weight and / or liver weight / body weight (%) is increased by loading a non-human mammal with AIM expression deficiency of the present invention with a high-fat diet compared to a wild-type animal. It means that a significant difference is recognized. In Examples described later, AIM knockout mice showed a significant difference compared to wild-type mice from the 6th week of high fat diet load.
  • the enhancement of fatty liver means that accumulation of fat in the liver is recognized at an early stage as compared with a wild-type animal by loading a non-human mammal with AIM expression deficiency of the present invention with a high fat diet. .
  • Accumulation of fat in the liver can be confirmed by, for example, oil red O staining of a liver tissue piece. Alternatively, it can be confirmed by measuring the amount of neutral fat in the liver tissue. In Examples described later, AIM knockout mice showed a significant difference compared to wild-type mice from the 6th week of high fat diet load.
  • “Developing liver cancer” means that the onset of liver cancer is observed when a non-human mammal with AIM expression deficiency of the present invention is loaded with a high fat diet. Liver cancer can be confirmed, for example, by staining a piece of liver tissue with anti-AFP ( ⁇ -fetoprotein), measuring the AFP expression level in the liver tissue, or measuring the blood AFP concentration.
  • liver cancer is hardly confirmed even after 1 year of high fat diet load in wild type mice, but liver cancer was observed in all mice after 1 year of high fat diet load in AIM knockout mice. .
  • the suppression of the inflammatory response in the liver means that the inflammatory response is suppressed in the liver as compared with the wild-type animal even when the AIM-deficient non-human mammal of the present invention is loaded with a high-fat diet.
  • the inflammatory response can be confirmed by, for example, expression of F4 / 80 (a macrophage marker), TNF ⁇ , IL-6, and IL-1 ⁇ .
  • liver fibrosis is enhanced when liver fibrosis is observed as in a wild-type animal by loading a high-fat diet on a non-human mammal with AIM expression deficiency of the present invention.
  • Liver fibrosis can be confirmed, for example, by staining a liver tissue piece with Sirius red.
  • hepatic fibrosis involves collagen synthesis by hepatic stellate cells, but it can also be confirmed by the expression of ⁇ SMA, which is a marker for hepatic stellate cells.
  • liver fibrosis was observed in the wild type mouse and the AIM knockout mouse from the 20th week after loading with a high fat diet.
  • high expression of ⁇ SMA was observed from the 20th week of high fat diet loading.
  • the expression level of TGF ⁇ 1 tended to increase in proportion to the length of the high fat diet loading period.
  • no significant difference was observed between the wild-type mouse and the AIM knockout mouse regarding the degree of fibrosis and the expression levels of ⁇ SMA and TGF ⁇ 1.
  • the screening method of the present invention includes the following steps.
  • a step of administering a test substance to a non-human mammal deficient in AIM expression under a high-fat diet load condition (2) A step of observing at least one of the following characteristics of a non-human mammal deficient in AIM expression administered with a test substance: (I) liver weight, (Ii) liver fat mass, (Iii) liver fibers, (Iv) liver cancer, (V) an inflammatory response in the liver, (3) A step of selecting a test substance whose characteristics are improved as compared with the case where the test substance is not administered.
  • the high fat diet loaded on the non-human mammal deficient in AIM expression is not particularly limited as long as it has a high lipid content, but usually the lipid content is 20% or more, preferably 30%. More preferably, 40% or more is mentioned.
  • a period during which a high fat diet is loaded is carried out until at least the above-mentioned characteristics can be confirmed.
  • the loading period is 6 weeks or longer, more preferably 12 weeks or longer, more preferably 20 weeks or longer.
  • test substances to be administered to non-human mammals deficient in AIM expression include proteins, peptides, antibodies, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, plasma, etc. May be used.
  • the test substance may be administered before or at the start of the high-fat diet load, or when the non-human mammal deficient in AIM expression is loaded with a high-fat diet, May be observed.
  • the administration method may be oral or parenteral. Oral administration can be mixed with feed or drinking water. Examples of parenteral administration include intraperitoneal administration, intravenous injection, subcutaneous injection, intradermal injection, intramuscular injection, drip injection, etc., rectal administration with a suppository, and the like.
  • the administration may be a single administration or multiple administrations.
  • the characteristics of a non-human mammal with AIM expression deficiency administered with a test substance are usually observed after 4 weeks, preferably after 6 weeks after administration of the test substance.
  • the liver weight can be observed by measuring the liver weight and / or liver weight / body weight (%) extracted from the mammal.
  • Liver fat can be observed by staining the excised liver tissue piece of the liver with oil red O and quantifying the degree of staining, or measuring the amount of neutral fat in the liver tissue.
  • Liver fibers can be observed by staining the excised liver tissue piece of the liver with sirius red and quantifying the degree of staining.
  • liver fibers can be confirmed by quantifying the expression level of ⁇ SMA ( ⁇ -smooth muscle actin), TGF ⁇ 1 or Collagen4A1 in the excised liver.
  • ⁇ SMA smooth muscle actin
  • TGF ⁇ 1 TGF ⁇ 1
  • Collagen4A1 Collagen4A1
  • anti-AFP ⁇ -fetoprotein staining of the excised liver liver tissue fragment and quantifying the degree of staining, quantifying the expression level of AFP in the excised liver, or blood It can be observed by measuring the medium AFP concentration.
  • the inflammatory reaction in the liver can be confirmed by quantifying the expression level of F4 / 80, TNF ⁇ , IL-6 or IL-1 ⁇ in the excised liver.
  • the observation results of the characteristics obtained as described above are compared with the case of non-test substance administration.
  • a correlation diagram between the characteristics and the presence or absence of liver disease may be prepared in advance, and the obtained observation result of the characteristics may be compared with the correlation diagram.
  • the comparison is preferably performed based on the presence or absence of a significant difference.
  • the test substance can be selected as a prophylactic / therapeutic agent for liver disease.
  • improvement means that (i) the liver weight is lower than that in the case where the test substance is not administered, and (ii) the amount of liver fat (degree of oil red O staining or the amount of neutral fat) is tested.
  • the degree of liver fibrosis (degree of Sirius red staining, expression of ⁇ SMA, TGF ⁇ 1, Collagen4A1) is lower than that in the case where no test substance is administered, (iv) ) AFP expression is lower than that when the test substance is not administered, (v) F4 / 80, TNF ⁇ , IL-6, IL-1 ⁇ expression is higher than when the test substance is not administered .
  • the selected test substance When used as a prophylactic / therapeutic agent for liver disease, it can be formulated in the same manner as the AIMs of the present invention and administered by the same administration route / dose. The same applies to the liver disease that is the target of the prophylactic / therapeutic agent.
  • the present invention also provides a method for evaluating the prophylactic / therapeutic effect of a prophylactic / therapeutic agent for liver disease using an animal obtained by loading a non-human mammal deficient in AIM expression with a high-fat diet. Specifically, the evaluation method of the present invention includes the following steps.
  • a step of administering a prophylactic / therapeutic agent for liver disease to a non-human mammal deficient in AIM expression under a high fat diet load condition (2) A step of observing any one or more of the following characteristics of a non-human mammal with AIM expression deficiency administered with an agent for preventing or treating liver disease: (I) liver weight, (Ii) liver fat mass, (Iii) liver fibers, (Iv) liver cancer, (V) an inflammatory response in the liver, (3) A step of evaluating the effect of the preventive / therapeutic agent for liver disease by comparing the above characteristics with the case of no administration of the preventive / therapeutic agent for liver disease.
  • the preventive / therapeutic agent for hepatic disease administered to a non-human mammal deficient in AIM expression may be a known prophylactic / therapeutic agent for hepatic disease, such as an insulin sensitizer (eg, Thiguanidine derivatives such as rosiglitazone and pioglitazone, biguanides such as metformin and buformin); antioxidants (eg, vitamin E, vitamin C, betaine, EPL (Polyenephosphatylylcholine), etc.); liver protectants (eg, ursodeoxycholic acid) (UDCA), etc.); antihyperlipidemic drugs (eg, fibrate drugs, probucol, statin drugs, etc.); antihypertensive drugs (eg, angiotensin II receptor antagonists, etc.), glycyrrhizin preparations, Chinese medicines (eg, small purple) And so on) and anticancer agents, but are not limited thereto.
  • an insulin sensitizer eg, Thiguan
  • the method for observing the characteristics observed by the evaluation method of the present invention may be performed according to the description of the screening method.
  • the improvement here may be the same as described above.
  • the diagnostic method of the present invention includes the following steps.
  • the subject to which the diagnostic method of the present invention can be applied is not particularly limited, and examples thereof include a subject who has a risk of developing or suspected of developing liver disease.
  • examples of such subjects include, but are not limited to, subjects having symptoms such as obesity, diabetes, hypertension, arteriosclerosis, and hyperlipidemia.
  • healthy individuals include those who have not been clinically diagnosed as having liver disease, such as those who do not have the above symptoms.
  • a sample collected from the above-mentioned subject and containing an AIM gene product eg, RNA, protein, its degradation product, etc.
  • an AIM gene product eg, RNA, protein, its degradation product, etc.
  • body fluids such as blood, plasma, serum, lymph, urine, sweat, saliva, joint fluid, or fractions thereof, or cells contained therein, particularly macrophages.
  • the measurement of AIM concentration in a sample collected from a subject can be examined by preparing an RNA (eg, total RNA, mRNA) fraction from macrophages and measuring the transcript of the AIM gene contained in the fraction.
  • the RNA fraction can be prepared using a known method such as guanidine-CsCl ultracentrifugation or AGPC, but using a commercially available RNA extraction kit (eg, RNeasy Mini Kit; manufactured by QIAGEN, etc.) High-purity total RNA can be prepared quickly and easily from a small amount of macrophages.
  • RNA fraction As a means for detecting the transcript of the AIM gene in the RNA fraction, for example, a method using hybridization (Northern blot, dot blot, DNA chip analysis, etc.) or PCR (RT-PCR, competitive PCR, real-time PCR, etc.) ) And the like. Quantitative PCR methods such as competitive PCR and real-time PCR are preferred in that changes in the expression of the AIM gene can be detected quickly and easily in a quantitative manner from a small amount of macrophages.
  • measurement of the transcription product of the AIM gene can be performed using a nucleic acid (probe) that can hybridize with the transcription product of the gene.
  • a nucleic acid probe
  • Examples of such a nucleic acid include a nucleic acid capable of hybridizing under high stringency conditions with a nucleic acid containing the base sequence shown in the transcription product of the AIM gene (for example, the base sequence shown in SEQ ID NO: 1).
  • Examples of the highly stringent conditions include the aforementioned conditions.
  • the nucleic acid used as the probe may be double-stranded or single-stranded. In the case of a double strand, it may be a double-stranded DNA, a double-stranded RNA or a DNA: RNA hybrid. In the case of a single strand, an antisense strand can be used.
  • the length of the nucleic acid is not particularly limited as long as it can specifically hybridize with the target nucleic acid, and is, for example, about 15 bases or more, preferably about 30 bases or more.
  • the nucleic acid is preferably labeled with a labeling agent in order to enable detection and quantification of the target nucleic acid.
  • a radioisotope for example, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance, or the like is used.
  • the radioisotope for example, [ 32 P], [ 3 H], [ 14 C] and the like are used.
  • the enzyme those which are stable and have high specific activity are preferable.
  • ⁇ -galactosidase, ⁇ -glucosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase and the like are used.
  • the fluorescent substance for example, fluorescamine, fluorescein isothiocyanate and the like are used.
  • luminescent substance for example, luminol, luminol derivatives, luciferin, lucigenin and the like are used.
  • biotin- (strept) avidin can also be used for binding between the probe and the labeling agent.
  • the RNA fraction prepared as described above is separated by gel electrophoresis, then transferred to a membrane such as nitrocellulose, nylon, polyvinylidene difluoride, and prepared as described above.
  • the amount of AIM gene expressed is determined by measuring the amount of label bound to the membrane for each band using an appropriate method after hybridization under the above high stringency conditions. Can be measured.
  • the expression level of the AIM gene can be measured by subjecting the membrane spotted with the RNA fraction to a hybridization reaction in the same manner and measuring the amount of the label on the spot.
  • a quantitative PCR method is used as a method for measuring the AIM concentration.
  • quantitative PCR include competitive PCR and real-time PCR.
  • DNA that can hybridize specifically with the sense strand (coding strand) and antisense strand (non-coding strand) of the AIM gene transcription product and is sandwiched between them
  • the fragment is not particularly limited as long as it can amplify a fragment.
  • each fragment has a length of about 15 to about 100 bases, preferably about 15 to about 50 bases, and amplifies a DNA fragment of about 100 bp to 1 kbp.
  • the set of oligonucleotides used as a primer includes a nucleic acid that can hybridize with a nucleic acid (sense strand) containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 under highly stringent conditions
  • the aforementioned Examples include a nucleic acid that can hybridize with a nucleic acid (antisense strand) containing a base sequence complementary to the base sequence under highly stringent conditions.
  • highly stringent conditions have the same meaning as described above.
  • RT-PCR is a method in which a known amount of another template nucleic acid that can be amplified by a set of primers that can amplify a target DNA is allowed to coexist in a reaction solution as a competitor to cause an amplification reaction competitively.
  • a known amount of competitor nucleic acid is used (different sizes, different migration patterns of restriction enzyme-treated fragments, etc.).
  • the competitor nucleic acid may be DNA or RNA.
  • cDNA may be synthesized by reverse transcription reaction from the RNA fraction prepared as described above, and then PCR may be performed in the presence of the primer set and the competator.
  • the competor is added to the RNA fraction. May be added to perform reverse transcription reaction, and the primer set may be further added to perform PCR. In the latter case, since the efficiency of the reverse transcription reaction is taken into consideration, the absolute amount of the original mRNA can be estimated.
  • real-time PCR is a method for monitoring the amount of amplification in real time using a fluorescent reagent, and requires an apparatus in which a thermal cycler and a spectrofluorometer are integrated.
  • a thermal cycler and a spectrofluorometer are integrated.
  • Such devices are commercially available.
  • a reagent that emits fluorescence by binding to the above primer set and double-stranded DNA such as SYBR Green I, ethidium bromide ( Intercalator), a nucleic acid that can be used as the probe (however, the nucleic acid hybridizes to the target nucleic acid in the amplification region) and a fluorescent substance (eg, FAM, HEX, TET, FITC, etc.) and a quencher (Example: TAMRA, DABCYL, etc.)
  • a fluorescent reagent (probe) such as a modified one (TaqMan TM probe or Molecular Beacon probe) is added to the PCR reaction system.
  • the intercalator binds to the synthesized double-stranded DNA and emits fluorescence when irradiated with excitation light, the amount of amplification product generated can be monitored by measuring the fluorescence intensity, thereby increasing the amount of original template cDNA. Can be estimated.
  • the TaqMan TM probe is an oligonucleotide that can be hybridized to the target nucleic acid amplification region with both ends modified with a fluorescent substance and a quenching substance, and hybridizes to the target nucleic acid during annealing, but does not emit fluorescence due to the presence of the quenching substance
  • fluorescence is emitted by being decomposed by the exonuclease activity of DNA polymerase and releasing a fluorescent substance. Therefore, the amount of amplification product produced can be monitored by measuring the fluorescence intensity, thereby estimating the amount of the original template cDNA.
  • the Molecular Beacon probe is an oligonucleotide that can be hybridized to the target nucleic acid amplification region with both ends modified with a fluorescent substance and a quenching substance, and can take a hairpin secondary structure, and is quenched when it has a hairpin structure. Fluorescence is not emitted due to the presence of the substance, but is emitted when the distance between the fluorescent substance and the quenching substance is increased by hybridization to the target nucleic acid during annealing. Therefore, the amount of amplification product produced can be monitored by measuring the fluorescence intensity, thereby estimating the amount of the original template cDNA. Since real-time RT-PCR can monitor the amount of PCR amplification in real time, electrophoresis is not required and the expression of the AIM gene can be analyzed more rapidly.
  • the measurement of AIM concentration in a sample collected from a subject can be examined by preparing a protein fraction from the sample and detecting AIM contained in the fraction. Detection of AIM can be performed by an immunological assay (eg, ELISA, FIA, RIA, Western blot, etc.) using an antibody against AIM. Alternatively, detection of AIM can also be performed using mass spectrometry such as MALDI-TOFMS.
  • the antibody against AIM is a polyclonal antibody or monoclonal antibody usually used by using a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence or partial amino acid sequence as the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 as a sensitizing antigen. Can be acquired according to technology.
  • the blood concentration of the AIM of the present invention decreases in patients with liver diseases. Therefore, as a result of measuring the AIM concentration as described above, when it is lower than that of a healthy person, it can be determined that the subject has developed or is highly likely to develop liver disease.
  • a correlation diagram between the presence or absence of liver disease and AIM concentration may be prepared in advance, and the obtained measurement results may be compared with the correlation diagram. The comparison is preferably performed based on the presence or absence of a significant difference.
  • sequence numbers in the sequence listing in the present specification indicate the following sequences.
  • [SEQ ID NO: 1] The base sequence of human AIM is shown.
  • [SEQ ID NO: 2] The amino acid sequence of human AIM is shown.
  • [SEQ ID NO: 3] The base sequence of the sense primer for F4 / 80 is shown.
  • [SEQ ID NO: 4] The base sequence of the antisense primer for F4 / 80 is shown.
  • SEQ ID NO: 5 The base sequence of the sense primer for TNF ⁇ is shown.
  • [SEQ ID NO: 6] The base sequence of the antisense primer for TNF ⁇ is shown.
  • [SEQ ID NO: 7] The nucleotide sequence of the sense primer for IL-6 is shown.
  • [SEQ ID NO: 12] The base sequence of the antisense primer for ⁇ SMA is shown.
  • [SEQ ID NO: 13] The base sequence of the sense primer for TGF ⁇ 1 is shown.
  • [SEQ ID NO: 16] The base sequence of the antisense primer for AFP is shown.
  • [SEQ ID NO: 17] The base sequence of the sense primer for GAPDH is shown.
  • [SEQ ID NO: 18] The base sequence of the antisense primer for GAPDH is shown.
  • Example 1 Enhancement of fatty liver by loading AIM knockout mice with high fat diet (HFD)
  • HFD high fat diet
  • AIM knockout mice and WT mice By loading high fat diet (HFD) with AIM knockout mice and WT mice, liver weight and liver weight Weight, neutral fat weight in the liver, and hepatic fat accumulation by hematoxylin and eosin tissue staining were examined.
  • HFD high fat diet
  • liver weight / body weight did not show a clear change until week 20, but by adding HFD to AIM knockout mice, it was compared with WT from 6 weeks.
  • a significant increase in liver weight / body weight was observed (FIG. 1A).
  • FIG. 1B shows that from the result of the weight of neutral fat in the liver, by adding HFD to AIM knockout mice, fat accumulation in the liver was observed from the 6th week, and fatty liver was increased compared with WT. It became clear (FIG. 1B).
  • Example 2 Progression of liver fibrosis (cirrhosis) by loading AIM knockout mice with a high fat diet (HFD) Wild type mice (male, 10 mice, 12 weeks old) and AIM knockout mice (male, 10 mice, 12 weeks old) was loaded with a high fat diet (HFD), 0, 6, 12, 20, 45, 55 weeks later, the liver was fixed in formalin, the sections were stained with Sirius red, and the stained fibrosis part ( FIG. 2A) was quantified by NIH-J image. Each mouse was analyzed on 3 non-consecutive sections, and the average value (ratio of fibrosis in the entire section) is shown (FIG. 2B).
  • HFD high fat diet
  • ⁇ SMA and TGF ⁇ are representative genes involved in liver fibrosis, by quantitative RT-PCR (FIG. 2C).
  • FFD high-fat diet
  • ⁇ SMA and TGF ⁇ mRNA expression levels increased with HFD loading, but there was no significant difference between the two.
  • Example 3 Onset of hepatocellular carcinoma by loading AIM knockout mice with high-fat diet (HFD) Although hepatic carcinoma is seen even when WT mice are loaded with HFD for 52 weeks, hepatocellular carcinoma is almost developed. In contrast, hepatocellular carcinoma was observed in all AIM knockout mice, and most of the observed tumors were well-differentiated hepatocellular carcinoma (HCC) (FIGS. 3A, B, and C). Hepatocellular carcinoma was confirmed in the liver of AIM knockout mice by Hoechst / AFP staining (FIG. 4), and increased expression of AFP in the liver was also confirmed.
  • HFD high-fat diet
  • Example 4 Inflammatory Response of AIM Knockout Mice to High Fat Diet (HFD) Loading
  • HFD high fat diet
  • FIG. 5 When HFD was added to WT mice, enhanced inflammatory responses such as accumulation of macrophages in the liver and increased expression of TNF ⁇ , IL-6, and IL-1 ⁇ were observed at 12-20 weeks. On the other hand, these inflammatory responses were suppressed in AIM knockout mice compared to WT (FIG. 5).
  • Example 5 Stabilization of blood AIM with IgM AIM in serum of RAG (Recombination-activating gene) KO mice lacking IgM in blood due to lack of B lymphocytes was analyzed by Western blot. Compared with WT, the amount of AIM in serum was extremely low in RAG KO mice, and no AIM-IgM complex was detected (FIG. 6A). Therefore, when the binding between AIM and IgM was examined in vitro, the binding between AIM and IgM was confirmed (FIG. 6A). Furthermore, when 200 ⁇ g of IgM was intravenously administered to RAG KO mice, AIM in the blood increased (FIG. 6B).
  • Example 6 Inhibitory effect of AIM on fatty liver in vitro The effect of AIM on hepatocytes in vitro was examined. After AIM was allowed to act on mouse primary cultured hepatocytes for 5 hours, the cells were stained with an anti-AIM antibody and Western blotted, confirming that the cells had taken up AIM (FIG. 8). Further, 800 ⁇ M oleic acid (OA) was added to primary mouse cultured hepatocytes, and the mixture was cultured for 24 hours for fatty liver formation, and then cultured for 24 hours with or without AIM. Fatty liver formation was measured from oil red O staining and mRNA expression level of FSP27 (Fat-Specific protein 27).
  • FSP27 Frat-Specific protein 27
  • Example 7 Suppression of differentiation from preadipocytes to adipocytes by SRCR domain
  • Recombinant human SRCR domain (SRCR1, SRCR2, SRCR3) proteins were prepared using HEK293T cells, each of which was added with an HA (hemagglutinin) tag.
  • HA hemagglutinin
  • 3T3-L1 adipose precursor cells are induced to differentiate into adipocytes by culturing them in the presence of 1 ⁇ g / mL insulin, 1 ⁇ M dexamethasone (DEX), 0.5 mM isobutylmethylxanthine (IBMX) for SRCR domain
  • DEX dexamethasone
  • IBMX isobutylmethylxanthine
  • hAIM human full-length AIM
  • SRCR domain proteins were used at 20 ⁇ g / ml. Differentiation into adipocytes was quantified assuming that the degree of oil red O staining was not added as 100%. The same adipocyte differentiation inhibitory effect as AIM was observed in all SRCR domains (FIG. 10).
  • Example 8 Measurement of serum AIM concentration in NASH patients The serum AIM concentration was measured in 3 NASH patients (2 progressing to hepatocellular carcinoma) and 3 non-NASH patients. The measurement was performed by Western blot using an anti-AIM antibody, and the intensity of the signal was quantified. Compared to non-NASH patients, serum AIM concentrations were reduced in NASH patients (FIG. 11). Moreover, in the NASH patients progressing to hepatocellular carcinoma, the serum AIM concentration was further decreased (FIG. 11).
  • AIM or vehicle is administered daily from the 6th to 8th week of HFD loading in which accumulation of fat in the liver is observed.
  • the liver is stained with oil red O 4 to 8 weeks after administration, the accumulation of fat increases in the vehicle administration group compared to before administration, whereas the accumulation of fat decreases in the AIM administration group compared to before administration. Therefore, it can be seen that AIM is useful for improving or treating fatty liver. Similar results can be obtained by using an agent capable of agonistically adjusting the function of AIM (including a partial peptide of AIM having AIM activity) or an agent that induces the expression of AIM instead of AIM. Similarly, by administering AIM according to the time of onset of liver fibrosis and liver cancer, AIM prevention, improvement or therapeutic effect on cirrhosis and liver cancer can also be confirmed.
  • Example 9 Effect of AIM administration on AIM knockout mice loaded with a high fat diet (HFD)
  • AIM knockout mice (10 males, 12 weeks old) were loaded with a high fat diet (HFD) for 43 weeks, at 30 weeks From week 1 to week 43, recombinant AIM (rAIM) (20 mg / Kg (body weight); 5 animals) or PBS (5 animals) was administered by intraperitoneal injection once a week.
  • rAIM recombinant AIM
  • Mice were sacrificed at 43 weeks of HFD, and the excised liver was fixed with formalin, and then a liver tissue section was prepared. The obtained liver tissue sections were stained with hematoxylin and eosin to analyze the status of cancer and fatty liver.
  • Liver tissue sections were prepared as 10 non-continuous sections for each mouse and analyzed for the presence, size, and number of cancers.
  • a part of the liver (non-cancerous part) was excised before fixation and the content of neutral fat was measured.
  • the body weight of the rAIM administration group was significantly reduced.
  • the body weight of the PBS administration group increased (FIG. 12A).
  • no obvious cancerous part was observed in the rAIM administration group.
  • multiple cancer nodules were observed in all mice. Histologically, multiple liver cancers were observed.
  • a macroscopic photograph and a hematoxylin-eosin stained image are shown (FIG. 12B).
  • fatty liver Furthermore, with regard to fatty liver, a clear histological improvement was observed in the rAIM administration group. In addition, the triglyceride content in the liver (non-cancerous part) was also significantly reduced as compared to the PBS administration group (FIG. 12B).
  • the present invention can provide a prophylactic / therapeutic agent for liver diseases containing AIM as an active ingredient.
  • the liver disease model mouse of the present invention contributes to elucidation of the onset mechanism of liver disease, and further, according to the screening method using the model mouse, it is possible to search for a substance effective for prevention / treatment of liver disease. it can.
  • the effect of a known preventive / therapeutic agent for liver disease can be evaluated using the liver disease model mouse of the present invention.
  • the present invention can provide a method for diagnosing liver disease. This application is based on Japanese Patent Application No. 2012-103958 filed in Japan (filing date: April 27, 2012), the contents of which are incorporated in full herein.

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Abstract

　本発明は、ＡＩＭもしくはその部分ペプチドまたはそれらをコードする塩基配列を含む核酸を含有してなる、肝疾患の予防・治療剤、またはＡＩＭ発現不全非ヒト哺乳動物に高脂肪食負荷することによって得られる動物を用いた、肝疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法などを提供する。

Description

肝疾患の予防または治療剤
　本発明は、肝疾患の予防または治療剤などに関する。
　メタボリックシンドロームは、近年の生活環境の変化に伴い急速に表面化した現代病であり、２型糖尿病や動脈硬化性疾患など様々な制御困難な疾患群がドミノ倒し的に発症する。一連の疾患の中で、肥満とともに初期から著明になってくるものとして脂肪肝があげられる。最近、脂肪肝を持つ患者の数十％が、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ：ｎｏｎ－ａｌｃｏｈｏｌｉｃ　ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ）と呼ばれる疾患へと進行することが明らかになった。ＮＡＳＨではアルコール非依存性に肝実質が広範に線維化し、更に肝硬変や肝細胞癌を発症する場合も多い。ＮＡＳＨの治療には、インスリン抵抗性改善薬、抗酸化剤、肝庇護剤、抗高脂血症薬、降圧薬などが使用されているが、確立した治療法はなく、有効な治療薬の開発が望まれている。
　ＮＡＳＨの正確な発症機序は依然として不明である。脂肪肝の存在下に、炎症とインスリン抵抗性が加わるとＮＡＳＨに進行するという、２ヒット・セオリーが提唱されているが、実験的な確証はない。また、ＮＡＳＨの動物モデルとして、ＭＣＤ（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ－ｃｈｏｌｉｎｅ　ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ　ｄｉｅｔ）や四塩化炭素を負荷したマウスがあげられるが、いずれも肝不全による肝壊死後の線維化が主体であり、体重は減少しており、ヒトのメタボリックシンドロームの患者に見られる過剰栄養による肥満・脂肪肝から生ずる肝線維化を正確に反映していない。ヒトの病態を再現できるＮＡＳＨの動物モデルを作製できれば、ＮＡＳＨの治療薬のスクリーニングや評価を行うことが可能になる。
　メタボリックシンドロームは肥満に伴うインスリン抵抗性獲得がその基盤となるが、近年、脂肪組織における慢性炎症が重要であることが明らかとなった。肥満に伴う脂肪組織の持続的な炎症が全身に波及する結果、全身性のインスリン抵抗性が惹起される。
　本発明者は、この病態の鍵となるのが、ＡＩＭ（Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｏｆ　Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）であることを、近年、以下に述べるように明らかにした（非特許文献１－４）。ＡＩＭはマクロファージが特異的に産生し血中に存在するが、肥満に伴い血中濃度が上昇し、ＣＤ３６を介したエンドサイトーシスにより脂肪細胞に取り込まれ、蓄積している中性脂肪の分解（ｌｉｐｏｌｙｓｉｓ）を誘導し、脂肪細胞から遊離脂肪酸を放出させる（非特許文献５）。放出された脂肪酸が、ｔｏｌｌ様受容体の刺激を介して脂肪組織に慢性炎症を惹起・維持する（非特許文献６）。実際に、ＡＩＭノックアウト（ＫＯ）マウスでは、肥満しても、脂肪組織や肝臓を含め全身で慢性炎症が生じず、インスリン抵抗性に陥らないため、糖尿病・動脈硬化発症も著しく抑制される（非特許文献４、６）。しかし、ＡＩＭが肝疾患、特にＮＡＳＨの発症、進行に関与することはこれまでに知られていない。
Ｊ　Ｅｘｐ　Ｍｅｄ　１８９：４１３－４２２，１９９９ Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　２７６：２２９１０－２２９１４，２００１ Ａｍ　Ｊ　Ｐａｔｈｏｌ　１６２：８３７－８４７，２００３ Ｃｅｌｌ　Ｍｅｔａｂ　１：２０１－２１３，２００５ Ｃｅｌｌ　Ｍｅｔａｂ　１１：４７９－４９２，２０１０ ＰＮＡＳ　１０８：１２０７２－１２０７７，２０１１
　本発明の目的は、肝疾患の予防又は治療薬を提供することである。また、新たな肝疾患のモデルマウスを用いた肝疾患の予防又は治療薬の評価方法及びスクリーニング方法などを提供することである。さらに本発明の別の目的は、肝疾患の診断方法を提供することである。
　本発明者は、高脂肪食を負荷し、肥満させたＡＩＭノックアウトマウスについて病態の検討を行ったところ、（１）肥満、（２）先行する脂肪肝、（３）肝実質の線維化、及び（４）高頻度の発癌、というヒトＮＡＳＨの病態に近似している病態が、肝臓を含む全身での慢性炎症もインスリン抵抗性も抑制されている状態で生じるという、非常に興味深い知見を得た。このことから、ＡＩＭを補充することは、脂肪肝、ＮＡＳＨ、肝癌といった一連の肝疾患の予防又は治療になると考えられた。
　本発明者は、これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、
［１］ＡＩＭもしくはその部分ペプチドまたはそれらをコードする塩基配列を含む核酸を含有してなる、肝疾患の予防・治療剤；
［２］ＡＩＭの発現を誘導する薬剤またはＡＩＭを安定化させる薬剤を含有してなる、肝疾患の予防・治療剤；
［３］肝疾患が脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝炎、肝硬変または肝臓癌である［１］または［２］に記載の予防・治療剤；
［４］ＡＩＭ発現不全非ヒト哺乳動物に高脂肪食負荷することによって得られる動物を用いる、肝疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法；
［５］以下の工程を含むことを特徴とする、［４］に記載のスクリーニング方法
（１）高脂肪食負荷条件下、ＡＩＭ発現不全非ヒト哺乳動物に被検物質を投与する工程、
（２）被検物質を投与されたＡＩＭ発現不全非ヒト哺乳動物の下記特性のいずれか一項目以上を観察する工程：
（ｉ）肝臓重量、
（ｉｉ）肝脂肪量、
（ｉｉｉ）肝線維、
（ｉｖ）肝臓癌、
（ｖ）肝臓における炎症反応、
（３）被検物質非投与の場合と比較して、前記特性が改善される被検物質を選択する工程；
［６］肝疾患が脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝炎、肝硬変または肝臓癌である［４］または［５］に記載のスクリーニング方法；
［７］ＡＩＭ発現不全非ヒト哺乳動物に高脂肪食負荷することによって得られる動物を用いる、肝疾患予防・治療剤の予防治療効果の評価方法；
［８］以下の工程を含むことを特徴とする、［７］に記載の評価方法
（１）高脂肪食負荷条件下、ＡＩＭ発現不全非ヒト哺乳動物に肝疾患予防・治療剤を投与する工程、
（２）肝疾患予防・治療剤を投与されたＡＩＭ発現不全非ヒト哺乳動物の下記特性のいずれか一項目以上を観察する工程：
（ｉ）肝臓重量、
（ｉｉ）肝脂肪量、
（ｉｉｉ）肝線維、
（ｉｖ）肝臓癌、
（ｖ）肝臓における炎症反応、
（３）前記特性を肝疾患予防・治療剤非投与の場合と比較して、肝疾患予防・治療剤の効果を評価する工程；
［９］肝疾患が脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝炎、肝硬変または肝臓癌である［７］または［８］に記載の評価方法；
［１０］以下の工程を含むことを特徴とする、肝疾患の診断方法
（１）被検者の試料中のＡＩＭ濃度を測定する工程、
（２）前記被検者の試料中のＡＩＭ濃度と健常者の試料中のＡＩＭ濃度とを比較する工程、
（３）前記被検者の試料中のＡＩＭ濃度が健常者の試料中のＡＩＭ濃度に比べて低値である場合、被験者が肝疾患である、または肝疾患になる可能性が高いと判断する工程；
［１１］肝疾患が脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝炎、肝硬変または肝臓癌である［１０］に記載の診断方法；
［１２］ＡＩＭもしくはその部分ペプチドまたはそれらをコードする塩基配列を含む核酸を対象に有効量投与することを含む、肝疾患の予防・治療方法；
［１３］ＡＩＭの発現を誘導する薬剤またはＡＩＭを安定化させる薬剤を対象に有効量投与することを含む、肝疾患の予防・治療方法；
［１４］肝疾患が脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝炎、肝硬変または肝臓癌である、［１２］または［１３］に記載の予防・治療方法；
［１５］肝疾患の予防・治療に用いるための、ＡＩＭもしくはその部分ペプチドまたはそれらをコードする塩基配列を含む核酸；
［１６］肝疾患が脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝炎、肝硬変または肝臓癌である、［１５］に記載のＡＩＭもしくはその部分ペプチドまたはそれらをコードする塩基配列を含む核酸；
［１７］肝疾患の予防・治療に用いるための、ＡＩＭの発現を誘導する薬剤またはＡＩＭを安定化させる薬剤；
［１８］肝疾患が脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝炎、肝硬変または肝臓癌である、［１７］に記載の薬剤；
を提供する。
　本発明は、有効成分としてＡＩＭ等を含む、肝疾患の予防・治療剤を提供することができる。また、本発明の肝疾患モデルマウスを用いたスクリーニング方法によれば、肝疾患に対する予防・治療に有効な物質を探索することができる。また本発明の肝疾患モデルマウスを用いて、肝疾患の公知の予防・治療剤の効果を評価することができる。さらに、本発明は、被験者の試料中のＡＩＭ濃度を測定することで、肝疾患の診断方法を提供することができる。
Ａ：高脂肪食を負荷したＡＩＭ　ＫＯマウスおよびＷＴマウスの肝臓重量、体重に対する肝臓重量の割合、および肝臓中の中性脂肪重量を示すグラフである。ｍｅａｎ±ＳＥＭ，＊＊＊；Ｐ＜０．００１。Ｂ：高脂肪食を負荷したＡＩＭ　ＫＯマウスおよびＷＴマウスの肝組織片のヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色像である。 Ａ：高脂肪食を負荷後２０週目におけるＡＩＭ　ＫＯマウスおよびＷＴマウスの肝組織片のシリウスレッド染色像である。Ｂ：高脂肪食を０、６、１２、２０、４５、５５週間負荷したＡＩＭ　ＫＯマウスおよびＷＴマウスの肝組織片における線維化の割合を示すグラフである。Ｃ：高脂肪食を負荷したＡＩＭ　ＫＯマウスおよびＷＴマウスの肝臓におけるＴＧＦβ１およびαＳＭＡの相対的ｍＲＮＡ発現量を示すグラフである。 Ａ：高脂肪食を５２週間負荷したＡＩＭ　ＫＯマウスおよびＷＴマウスから摘出した肝臓の写真像である。Ｂ：高脂肪食を５２週間負荷したＡＩＭ　ＫＯマウスの肝組織片のヘマトキシリン・エオジン染色像である。Ｃ：高脂肪食を０、６、１２、２０、４５、５２週間負荷したＡＩＭ　ＫＯマウスおよびにＷＴマウスの肝組織片における、高分化型肝細胞癌（ＨＣＣ）の発症頻度を示すグラフである。 高脂肪食を負荷したＡＩＭ　ＫＯマウスおよびＷＴマウスの肝組織片の抗ＡＦＰ抗体染色像および肝臓におけるＡＦＰの相対的発現量を示すグラフである。 高脂肪食を負荷したＡＩＭ　ＫＯマウスおよびＷＴマウスの肝臓におけるＦ４／８０（マクロファージ）、ＴＮＦα、ＩＬ－６、ＩＬ－１βの相対的発現量を示すグラフである。ｍｅａｎ±ＳＥＭ，＊；Ｐ＜０．０５，＊＊；Ｐ＜０．０１，＊＊＊；Ｐ＜０．００１。 Ａ：ＡＩＭ　ＫＯマウス、ＷＴマウスおよびＲＡＧ　ＫＯマウスの血清中に存在するＡＩＭのウエスタンブロット像、およびモノクローナルＩｇＭまたはポリクローナルＩｇＭとｉｎ　ｖｉｔｒｏ結合させたＡＩＭのウエスタンブロット像である。Ｂ：ＩｇＭを静脈注射されたＲＡＧ　ＫＯマウスの血清中に存在するＡＩＭのウエスタンブロット像である。 マウスおよびヒト血清中のＡＩＭ濃度とＩｇＭ濃度の相関関係を示すグラフである。 ＡＩＭ存在下で培養したマウス初代培養肝細胞の抗ＡＩＭ抗体染色像及びウエスタンブロット像である。 オレイン酸で前培養後、ＡＩＭ存在下またはＡＩＭ非存在下で培養したマウス初代培養肝細胞のオイルレッドＯ染色像及び該細胞におけるＦＳＰ２７の相対的発現量を示すグラフである。 ３Ｔ３－Ｌ１脂肪前駆細胞に対するＡＩＭまたはＳＲＣＲドメイン蛋白質の脂肪細胞分化抑制効果を示すグラフである。 ＮＡＳＨ患者および非ＮＡＳＨ患者における、血清中のＡＩＭ濃度を示すグラフである。 Ａ：高脂肪食を負荷したＡＩＭ　ＫＯマウスのｒＡＩＭ投与群とＰＢＳ投与群の体重変化を示すグラフである。Ｂ：高脂肪食を負荷したＡＩＭ　ＫＯマウスのｒＡＩＭ投与群とＰＢＳ投与群の肝臓の巨視的像、肝組織切片のヘマトキシリン・エオジン染色像（癌部、非癌部）、癌発症率を示すグラフ、肝内中性脂肪量を示すグラフである。
　本発明におけるＡＩＭは、配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質である。
　ＡＩＭは、例えば、温血動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー、トリなど）の免疫細胞であるマクロファージから単離・精製される蛋白質であってよい。また、化学合成もしくは無細胞翻訳系で生化学的に合成された蛋白質であってもよいし、あるいは上記アミノ酸配列をコードする塩基配列を含む核酸を導入された形質転換体から産生される組換え蛋白質であってもよい。
　配列番号：２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：２で表されるアミノ酸配列と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。ここで「相同性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つのアミノ酸配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである）における、オーバーラップする全アミノ酸残基に対する同一アミノ酸および類似アミノ酸残基の割合（％）を意味する。「類似アミノ酸」とは物理化学的性質において類似したアミノ酸を意味し、例えば、芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ）、脂肪族アミノ酸（Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ）、極性アミノ酸（Ｇｌｎ、Ａｓｎ）、塩基性アミノ酸（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）、酸性アミノ酸（Ｇｌｕ、Ａｓｐ）、水酸基を有するアミノ酸（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ）、側鎖の小さいアミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ）などの同じグループに分類されるアミノ酸が挙げられる。このような類似アミノ酸による置換は蛋白質の表現型に変化をもたらさない（即ち、保存的アミノ酸置換である）ことが予測される。保存的アミノ酸置換の具体例は当該技術分野で周知であり、種々の文献に記載されている（例えば、Ｂｏｗｉｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７：１３０６－１３１０（１９９０）を参照）。
　本明細書におけるアミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ　ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　Ｂａｓｉｃ　Ｌｏｃａｌ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　Ｓｅａｒｃｈ　Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；フィルタリング＝ＯＦＦ）にて計算することができる。アミノ酸配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、例えば、Ｋａｒｌｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５８７３－５８７７（１９９３）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ　２．０）に組み込まれている（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，２５：３３８９－３４０２（１９９７））］、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４４－４５３（１９７０）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムに組み込まれている］、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ，ＣＡＢＩＯＳ，４：１１－１７（１９８８）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＣＧＣ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ２．０）に組み込まれている］、Ｐｅａｒｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：２４４４－２４４８（１９８８）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＦＡＳＴＡプログラムに組み込まれている］等が挙げられ、それらも同様に好ましく用いられ得る。
　より好ましくは、配列番号：２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とは、配列番号：２で表されるアミノ酸配列と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列である。
　配列番号：２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質としては、例えば、前記の配列番号：２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含み、配列番号：２で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ましい。ここで「活性」とは、例えば、動脈硬化巣マクロファージのアポトーシス抑制活性、動脈硬化の維持・促進活性、脂肪細胞分化抑制活性、脂肪細胞の脂肪滴融解活性、脂肪細胞縮小活性、ＣＤ３６結合活性、脂肪細胞へのエンドサイトーシス活性、ＦＡＳ結合活性、ＦＡＳ機能抑制活性、抗肥満活性などをいう。「実質的に同質」とは、それらの活性が定性的（例えば、生理学的または薬理学的）に同じであることを示す。したがって、前記活性は同等であることが好ましいが、これらの活性の程度（例えば、約０．１～約１０倍、好ましくは約０．５～約２倍）や蛋白質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
　前記活性の測定は、自体公知の方法に準じて行なうことができる。
　また、本発明のＡＩＭには、例えば、（１）配列番号：２で表されるアミノ酸配列のうち１または２個以上（好ましくは、１～１００個程度、好ましくは１～５０個程度、さらに好ましくは１～１０個程度、特に好ましくは１～数（２、３、４もしくは５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（２）配列番号：２で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１～１００個程度、好ましくは１～５０個程度、さらに好ましくは１～１０個程度、特に好ましくは１～数（２、３、４もしくは５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（３）配列番号：２で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１～５０個程度、好ましくは１～１０個程度、さらに好ましくは１～数（２、３、４もしくは５）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（４）配列番号：２で表されるアミノ酸配列のうち１または２個以上（好ましくは、１～５０個程度、好ましくは１～１０個程度、さらに好ましくは１～数（２、３、４もしくは５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（５）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有する蛋白質なども含まれる。
　上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿入、欠失または置換の位置は、蛋白質の活性が保持される限り特に限定されない。
　本発明のＡＩＭは、好ましくは、配列番号：２で表されるアミノ酸配列を有するヒトＡＩＭ蛋白質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＡＤ０１４４６）、あるいは他の哺乳動物におけるそのホモログ［例えば、ＧｅｎＢａｎｋにそれぞれアクセッション番号：ＡＡＤ０１４４５として登録されているマウスホモログ等］である。
　本明細書において、蛋白質およびペプチドは、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）で記載される。配列番号：２で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質をはじめとする、本発明のＡＩＭは、Ｃ末端がカルボキシル基（－ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（－ＣＯＯ－）、アミド（－ＣＯＮＨ２）またはエステル（－ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。
　ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチルなどのＣ１－６アルキル基；例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３－８シクロアルキル基；例えば、フェニル、α－ナフチルなどのＣ６－１２アリール基；例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル－Ｃ１－２アルキル基；α－ナフチルメチルなどのα－ナフチル－Ｃ１－２アルキル基などのＣ７－１４アラルキル基；ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
　本発明のＡＩＭがＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明の蛋白質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
　さらに、本発明のＡＩＭには、Ｎ末端のアミノ酸残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１－６アルカノイルなどのＣ１－６アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成し得るＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば－ＯＨ、－ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１－６アルカノイル基などのＣ１－６アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども含まれる。
　ＡＩＭの部分ペプチド（以下、単に「本発明の部分ペプチド」と略称する場合もある）は、上記したＡＩＭの部分アミノ酸配列を有するペプチドであり、且つＡＩＭと実質的に同質の活性を有する限り、何れのものであってもよい。ここで「実質的に同質の活性」とは上記と同意義を示す。また、「実質的に同質の活性」の測定はＡＩＭの場合と同様に行なうことができる。
　ＡＩＭは、システインを多く含む３つのＳＲＣＲ（Ｓｃａｖｅｎｇｅｒ－Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　Ｃｙｓｔｅｉｎｅ－Ｒｉｃｈ）ドメインを含んでいることから、それぞれのＳＲＣＲドメインを本発明の部分ペプチドとして使用できる。具体的には、例えば、配列番号：２で表されるアミノ酸配列のうち、ＳＲＣＲ１ドメイン（配列番号：２で表されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号２４～１２５）、ＳＲＣＲ２ドメイン（配列番号：２で表されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号１３８～２３９）、ＳＲＣＲ３ドメイン（配列番号：２で表されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号２４４～３４６）をそれぞれ含む部分アミノ酸配列やＳＲＣＲドメインの任意の組合せを含む部分アミノ酸配列を有するものなどが用いられる。本発明の部分ペプチドは、上記の機能ドメインを含む限りそのサイズに特に制限はないが、好ましくは５０個以上の部分アミノ酸配列を含むもの、より好ましくは１００個以上の部分アミノ酸配列を含むもの、さらに好ましくは２００個以上の部分アミノ酸配列を含むものが挙げられる。該部分アミノ酸配列は一個の連続した部分アミノ酸配列であってもよく、あるいは不連続な複数の部分アミノ酸配列が連結されたものであってもよい。
　また、本発明の部分ペプチドはＣ末端がカルボキシル基（－ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（－ＣＯＯ－）、アミド（－ＣＯＮＨ２）またはエステル（－ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。ここでエステルにおけるＲとしては、ＡＩＭについて前記したものと同様のものが挙げられる。本発明の部分ペプチドがＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明の部分ペプチドに含まれる。この場合のエステルとしては、例えば、Ｃ末端のエステルと同様のものなどが用いられる。
　さらに、本発明の部分ペプチドには、上記したＡＩＭと同様に、Ｎ末端のアミノ酸残基のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
　本発明で用いられるＡＩＭまたはその部分ペプチドは塩の形態であってもよい。例えば、生理学的に許容される酸（例：無機酸、有機酸）や塩基（例：アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
　ＡＩＭは、前述した哺乳動物のマクロファージから自体公知の蛋白質の精製方法によって製造することができる。具体的には、哺乳動物のマクロファージをホモジナイズし、低速遠心により細胞デブリスを除去した後、上清を高速遠心して細胞膜含有画分を沈澱させ、該上清を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー等に付すことによりＡＩＭまたはその塩を調製することができる。
　ＡＩＭまたはその部分ペプチドは、公知のペプチド合成法に従って製造することもできる（以下、これらの化学合成の説明においては、特にことわらない限り、全長ＡＩＭおよびその部分ペプチドを包括して、単にＡＩＭという）。
　ペプチド合成法は、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれであってもよい。ＡＩＭを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合し、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的とする蛋白質を製造することができる。
　ここで、縮合や保護基の脱離は、自体公知の方法、例えば、以下の（１）および（２）に記載された方法に従って行われる。
（１）Ｍ．ＢｏｄａｎｓｚｋｙおよびＭ．Ａ．Ｏｎｄｅｔｔｉ，Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９６６年）
（２）ＳｃｈｒｏｅｄｅｒおよびＬｕｅｂｋｅ，Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９６５年）
　このようにして得られたＡＩＭは、公知の精製法により精製単離することができる。ここで、精製法としては、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶、これらの組み合わせなどが挙げられる。
　上記方法で得られるＡＩＭが遊離体である場合には、該遊離体を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆にＡＩＭが塩として得られた場合には、該塩を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
　さらに、ＡＩＭは、それをコードする核酸を含有する形質転換体を培養し、得られる培養物からＡＩＭを分離精製することによって製造することもできる。ＡＩＭまたはその部分ペプチドをコードする核酸はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよい。好ましくはＤＮＡが挙げられる。また、該核酸は二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドでもよい。一本鎖の場合は、センス鎖（即ち、コード鎖）であっても、アンチセンス鎖（即ち、非コード鎖）であってもよい。
　ＡＩＭまたはその部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、温血動物（例えば、ヒト、ウシ、サル、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、モルモット、ラット、マウス、ウサギ、ハムスター、トリなど）のマクロファージ由来のｃＤＮＡ、合成ＤＮＡなどが挙げられる。ＡＩＭまたはその部分ペプチドをコードするゲノムＤＮＡであれば、前記動物のあらゆる細胞［例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、線維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞など］もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織［例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆嚢、骨髄、副腎、皮膚、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、脂肪組織（例、褐色脂肪組織、白色脂肪組織）、骨格筋など］より調製したゲノムＤＮＡ画分を鋳型として用い、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、「ＰＣＲ法」と略称する）によって直接増幅することができ、ＡＩＭまたはその部分ペプチドをコードするｃＤＮＡであれば、マクロファージより調製した全ＲＮＡもしくはｍＲＮＡ画分をそれぞれ鋳型として用い、ＰＣＲ法およびＲｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ－ＰＣＲ（以下、「ＲＴ－ＰＣＲ法」と略称する）によって直接増幅することもできる。あるいは、ＡＩＭまたはその部分ペプチドをコードするゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡは、上記したゲノムＤＮＡおよび全ＲＮＡもしくはｍＲＮＡの断片を適当なベクター中に挿入して調製されるゲノムＤＮＡライブラリーおよびｃＤＮＡライブラリーから、コロニーもしくはプラークハイブリダイゼーション法またはＰＣＲ法などにより、それぞれクローニングすることもできる。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。
　ＡＩＭをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１の塩基番号６４から１１０７で表される塩基配列と同一または実質的に同一な塩基配列を含むＤＮＡなどが挙げられる。
　配列番号：１の塩基番号６４から１１０７で表される塩基配列と実質的に同一な塩基配列を含むＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１の塩基番号６４から１１０７で表される塩基配列と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上の相同性を有する塩基配列を含有し、前記したＡＩＭと実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡなどが用いられる。
　本明細書における塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ　ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　Ｂａｓｉｃ　Ｌｏｃａｌ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　Ｓｅａｒｃｈ　Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；フィルタリング＝ＯＮ；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝－３）にて計算することができる。塩基配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、上記したアミノ酸配列の相同性計算アルゴリズムが同様に好ましく例示される。
　ＡＩＭをコードするＤＮＡは、好ましくは配列番号：１の塩基番号６４から１１０７で表される塩基配列で示されるヒトＡＩＭ蛋白質をコードする塩基配列を含むＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＦ０１１４２９）、あるいは他の哺乳動物におけるそのホモログ［例えば、ＧｅｎＢａｎｋにそれぞれアクセッション番号：ＡＦ０１１４２８として登録されているマウスホモログ等］である。
　本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡは、配列番号：２で表されるアミノ酸配列の一部と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むペプチドをコードする塩基配列を含むものであればいかなるものであってもよい。具体的には、本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、（１）配列番号：１の塩基番号６４から１１０７で表される塩基配列の部分塩基配列を含むＤＮＡ、または（２）配列番号：１の塩基番号６４から１１０７で表される塩基配列の部分塩基配列を含むＤＮＡと約６０％以上、好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上の相同性を有する塩基配列を含み、前記したＡＩＭと実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡなどが用いられる。
　ＡＩＭまたはその部分ペプチドをコードするＤＮＡは、該ＡＩＭまたはその部分ペプチドをコードする塩基配列の一部分を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当な発現ベクターに組み込んだＤＮＡを、ＡＩＭの一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを標識したものとハイブリダイゼーションすることによってクローニングすることができる。ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）第２版（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、ハイブリダイゼーションは、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。ハイブリダイゼーションは、好ましくは、ストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
　ハイストリンジェントな条件としては、例えば、６×ＳＳＣ（ｓｏｄｉｕｍ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ／ｓｏｄｉｕｍ　ｃｉｔｒａｔｅ）中４５℃でのハイブリダイゼーション反応の後、０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中６５℃での一回以上の洗浄などが挙げられる。当業者は、ハイブリダイゼーション溶液の塩濃度、ハイブリダゼーション反応の温度、プローブ濃度、プローブの長さ、ミスマッチの数、ハイブリダイゼーション反応の時間、洗浄液の塩濃度、洗浄の温度等を適宜変更することにより、所望のストリンジェンシーに容易に調節することができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、ハイブリダイゼーションは、該ライブラリーに添付された使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
　ＡＩＭまたはその部分ペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターは、例えば、ＡＩＭをコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
　発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）；動物細胞発現プラスミド（例：ｐＡ１－１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏ）；レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルスなどの動物ウイルスベクターなどが用いられる。
　プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。
　例えば、宿主が動物細胞である場合、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス）ＬＴＲ、ＨＳＶ－ＴＫ（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーターなどが用いられる。なかでも、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーターなどが好ましい。
　宿主がエシェリヒア属菌である場合、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが好ましい。
　発現ベクターとしては、上記の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製起点（以下、ＳＶ４０　ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある、メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性）、アンピシリン耐性遺伝子（以下、ａｍｐｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、ｎｅｏｒと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用い、ｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、チミジンを含まない培地によって目的遺伝子を選択することもできる。
　また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列をコードする塩基配列（シグナルコドン）を、ＡＩＭまたはその部分ペプチドをコードするＤＮＡの５’末端側に付加（またはネイティブなシグナルコドンと置換）してもよい。例えば、宿主がエシェリヒア属菌である場合、ＰｈｏＡ・シグナル配列、ＯｍｐＡ・シグナル配列などが；宿主が動物細胞である場合、インスリン・シグナル配列、α－インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ用いられる。
　上記したＡＩＭまたはその部分ペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターで宿主を形質転換し、得られる形質転換体を培養することによって、ＡＩＭまたはその部分ペプチドを製造することができる。
　宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、動物細胞などが用いられる。
　エシェリヒア属菌としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）Ｋ１２・ＤＨ１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），６０巻，１６０（１９６８）〕，エシェリヒア・コリＪＭ１０３〔ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ），９巻，３０９（１９８１）〕，エシェリヒア・コリＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ），１２０巻，５１７（１９７８）〕，エシェリヒア・コリＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４１巻，４５９（１９６９）〕，エシェリヒア・コリＣ６００〔ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），３９巻，４４０（１９５４）〕などが用いられる。
　動物細胞としては、例えば、サルＣＯＳ－７細胞、サルＶｅｒｏ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（以下、ＣＨＯ細胞と略記）、ｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ－）細胞と略記）、マウスＬ細胞、マウスＡｔＴ－２０細胞、マウスミエローマ細胞、ラットＧＨ３細胞、ヒトＦＬ細胞などが用いられる。
　形質転換は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができる。
　エシェリヒア属菌は、例えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），６９巻，２１１０（１９７２）やジーン（Ｇｅｎｅ），１７巻，１０７（１９８２）などに記載の方法に従って形質転換することができる。
　動物細胞は、例えば、細胞工学別冊８　新細胞工学実験プロトコール，２６３－２６７（１９９５）（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），５２巻，４５６（１９７３）に記載の方法に従って形質転換することができる。
　形質転換体の培養は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができる。
　宿主がエシェリヒア属菌である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ），ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），４３１－４３３，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　１９７２〕が好ましい。必要により、プロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β－インドリルアクリル酸のような薬剤を培地に添加してもよい。
　宿主がエシェリヒア属菌である形質転換体の培養は、通常約１５～約４３℃で、約３～約２４時間行なわれる。必要により、通気や撹拌を行ってもよい。
　宿主が動物細胞である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば、約５～約２０％の胎児ウシ血清を含む最小必須培地（ＭＥＭ）〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），１２２巻，５０１（１９５２）〕，ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）〔ヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），８巻，３９６（１９５９）〕，ＲＰＭＩ１６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ），１９９巻，５１９（１９６７）〕，１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），７３巻，１（１９５０）〕などが用いられる。培地のｐＨは、好ましくは約６～約８である。培養は、通常約３０℃～約４０℃で、約１５～約６０時間行なわれる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
　以上のようにして、形質転換体の細胞内または細胞外にＡＩＭを製造せしめることができる。
　前記形質転換体を培養して得られる培養物からＡＩＭまたはその部分ペプチドを自体公知の方法に従って分離精製することができる。
　例えば、ＡＩＭまたはその部分ペプチドを培養菌体あるいは細胞の細胞質から抽出する場合、培養物から公知の方法で集めた菌体あるいは細胞を適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊した後、遠心分離やろ過により可溶性蛋白質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。該緩衝液は、尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤や、トリトンＸ－１００ＴＭなどの界面活性剤を含んでいてもよい。また、ＡＩＭまたはその部分ペプチドが菌体（細胞）外に分泌される場合には、培養物から遠心分離またはろ過等により培養上清を分取するなどの方法が用いられる。
　このようにして得られた可溶性画分、培養上清中に含まれるＡＩＭまたはその部分ペプチドの単離精製は、自体公知の方法に従って行うことができる。このような方法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法；透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法；イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法；アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法；逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法；等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法；などが用いられる。これらの方法は、適宜組み合わせることもできる。
　かくして得られるＡＩＭまたはその部分ペプチドの存在は、ＡＩＭに対する抗体を用いたエンザイムイムノアッセイやウエスタンブロッティングなどにより確認することができる。
　以上の通りにして得られるＡＩＭもしくはその部分ペプチドまたはその塩あるいはＡＩＭもしくはその部分ペプチドをコードする塩基配列を含む核酸（ここでは、ＡＩＭ類と表現することもある）は、肝疾患の発症の予防・治療剤として提供することができる。
　本発明はまた、ＡＩＭ類に替えて、ＡＩＭの発現を誘導する薬剤やＡＩＭを安定化させる薬剤も使用することができる。
　ＡＩＭの発現を誘導する薬剤としては、例えば、ＡＩＭ転写活性作用を持つ化合物などが挙げられ、該化合物としては、ＡＩＭ遺伝子のプロモーター領域に結合できる転写因子等が挙げられる。また、本発明者は、ＡＩＭがマクロファージにおいて発現することを見出している。従って、ＡＩＭの発現を誘導する薬剤として、マクロファージ分化誘導剤が挙げられる。マクロファージ分化誘導剤としては、顆粒球マクロファージコロニー形成細胞（ＣＦＵ－ＧＭ）やマクロファージコロニー形成細胞（ＣＦＵ－Ｍ）などの前駆細胞からマクロファージを分化誘導できるものであれば特に制限されないが、例えば、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ－ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ　ｃｏｌｏｎｙ　ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ：ＧＭ－ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ　ｃｏｌｏｎｙ　ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ：Ｍ－ＣＳＦ）などを用いることができる。転写因子、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｍ－ＣＳＦは、前記の公知手段によって、哺乳動物の組織・細胞から単離・精製される蛋白質であってよいし、化学合成もしくは無細胞翻訳系で生化学的に合成された蛋白質であってもよい。あるいは、上記蛋白質をコードする塩基配列を含む核酸を導入された形質転換体から産生される組換え蛋白質であってもよい。
　ＡＩＭを安定化させる薬剤としては、ＡＩＭ分解を阻害する化合物、または尿中への排泄を阻害する化合物などが挙げられる。分解を阻害する化合物としては、プロテアーゼ阻害剤、プロテアソーム阻害剤などが挙げられる。プロテアーゼ阻害剤としては、例えば、セリンプロテアーゼ阻害剤（フッ化４－（２－アミノエチル）ベンゼンスルホニル塩酸塩（ＡＥＢＳＧＦ）、アプロチニン、トリプシンインヒビターなど）、システインプロテアーゼ阻害剤（Ｅ－６４、ロイペプチンなど）などが挙げられる。プロテアソーム阻害剤としては、ラクタシスチン、ＭＧ－１１５、ＭＧ－１３２、プロテアソームインヒビターＩなどが挙げられる。尿中への排泄を阻害する化合物としては、例えば、糸球体の基底膜を通過できない分子量をＡＩＭに付与する化合物が挙げられる。後述する実施例の通り、ＩｇＭはＡＩＭと結合することが確認できたことから、尿中への排泄を阻害する化合物として、ＩｇＭが挙げられる。しかし、ＩｇＭ自体を投与すると免疫系の副作用が懸念されることから、ＡＩＭとの結合部位であるＩｇＭのＦｃ部分と尿細管でろ過され尿中に排出されない程度の分子量の蛋白質とを融合させた融合蛋白質が好ましく用いられる。融合させる蛋白質は限定されないが、副作用の懸念が少ない蛋白質が好ましく、例えばアルブミンが使用できる。結合は直接つなげても構わないし、ヒンジ部分を用いてつなげても構わない。ヒンジ部分としてはＦＬＡＧ　ｔａｇを並列したものが例示される。このような分子は、それぞれをコードする遺伝子をつなぎ、ひとつの組換えタンパクとして常法により製造することができる。
　本発明の後述する実施例においては、ＡＩＭのノックアウトマウスは野生型（ＷＴ）マウスと比較して、高脂肪食負荷条件下、肝疾患の発症が促された。特に該肝疾患は非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の病態に近似し、該疾患の特徴である肝硬変、肝細胞癌への進行も再現することが確認できた。以上のことから、ＡＩＭ類、ＡＩＭの発現を誘導する薬剤またはＡＩＭを安定化させる薬剤、或いは、後述するスクリーニング方法で探索することができるＡＩＭの機能を代替できる化合物は、肝疾患の発症、進行を予防・治療できることが示唆される。
　本発明のＡＩＭ類、ＡＩＭの発現を誘導する薬剤またはＡＩＭを安定化させる薬剤を含有する医薬組成物の適用対象となる肝疾患は、例えば、脂肪肝、ＮＡＳＨ、肝硬変、肝臓癌があげられる。また、別の側面では、本発明のＡＩＭ類、ＡＩＭの発現を誘導する薬剤またはＡＩＭを安定化させる薬剤を含有する医薬組成物の適用対象となる肝疾患は、肝星細胞の活性化を伴う肝疾患であってよい。肝星細胞の活性化の指標として、αＳＭＡ（α－ｓｍｏｏｔｈ　ｍｕｓｃｌｅ　ａｃｔｉｎ）ｍＲＮＡの発現が挙げられる。従って、該肝疾患としては、正常な肝組織と比較してαＳＭＡｍＲＮＡが有意に高発現する肝疾患であってもよい。さらに、別の側面では、該肝疾患は、正常な肝組織と比較してＴＧＦβ１またはＣｏｌｌａｇｅｎ４Ａ１が有意に高発現する肝疾患であってもよい。
　本発明のＡＩＭ類、ＡＩＭの発現を誘導する薬剤またはＡＩＭを安定化させる薬剤を含有する医薬組成物は低毒性であり、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは他の温血動物（例、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル、トリなど）に対して経口的または非経口的（例、血管内投与、皮下投与など）に投与することができる。
　非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を包含しても良い。このような注射剤は、公知の方法に従って調製できる。注射剤の調製方法としては、例えば、上記本発明のＡＩＭ類、ＡＩＭの発現を誘導する薬剤またはＡＩＭを安定化させる薬剤を通常注射剤に用いられる無菌の水性液、または油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製できる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ－５０（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（５０ｍｏｌ）ａｄｄｕｃｔ　ｏｆ　ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ　ｃａｓｔｏｒ　ｏｉｌ）〕等と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等を併用してもよい。調製された注射液は、適当なアンプルに充填されることが好ましい。直腸投与に用いられる坐剤は、上記ＡＩＭ類、ＡＩＭの発現を誘導する薬剤またはＡＩＭを安定化させる薬剤を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製されてもよい。
　経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等が挙げられる。このような組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有していても良い。錠剤用の担体、賦形剤としては、例えば、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムが用いられる。
　上記の非経口用または経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。このような投薬単位の剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤が挙げられる。本発明のＡＩＭ類、ＡＩＭの発現を誘導する薬剤またはＡＩＭを安定化させる薬剤は、例えば、投薬単位剤形当たり通常５～５００ｍｇ、とりわけ注射剤では５～１００ｍｇ、その他の剤形では１０～２５０ｍｇ含有されていることが好ましい。
　本発明のＡＩＭ類、ＡＩＭの発現を誘導する薬剤またはＡＩＭを安定化させる薬剤を含有する上記予防・治療剤の投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、成人の肝疾患の治療・予防のために使用する場合には、本発明のＡＩＭ類を１回量として、通常０．０１～２０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは０．１～１０ｍｇ／ｋｇ体重程度、さらに好ましくは０．１～５ｍｇ／ｋｇ体重程度を、１日１～５回程度、好ましくは１日１～３回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。
　なお、前記した各組成物は、本発明のＡＩＭ類、ＡＩＭの発現を誘導する薬剤またはＡＩＭを安定化させる薬剤との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
　さらに、本発明のＡＩＭ類、ＡＩＭの発現を誘導する薬剤またはＡＩＭを安定化させる薬剤は、肝疾患の治療に有用な他の薬剤、例えば、インスリン抵抗性改善薬（例、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン等のチアゾリジン誘導体等、メトホルミン、ブホルミン等のビグアナイド剤）；抗酸化剤（例、ビタミンＥ、ビタミンＣ、ベタイン、ＥＰＬ（Ｐｏｌｙｅｎｅｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）等）；肝庇護剤（例、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）等）；抗高脂血症薬（例、フィブラート系薬剤、プロブコール、スタチン系薬剤等）；降圧薬（例、アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬等）；グリチルリチン製剤；漢方薬（例、小紫胡湯等）；抗がん剤などと併用してもよい。本発明のＡＩＭ類、ＡＩＭの発現を誘導する薬剤またはＡＩＭを安定化させる薬剤および上記薬剤は、同時または異なった時間に患者に投与すればよい。
　また、前記の通り、ＡＩＭのノックアウトマウスは野生型マウスと比較して、高脂肪食負荷条件下、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の病態に近似した肝疾患を高頻度に発症し、更に肝硬変、肝細胞癌へ進行することを確認した。このことは、高脂肪食負荷条件下に置かれたＡＩＭのノックアウトマウスは、肝疾患の新たなモデルマウスとして提供できることを示唆する。従って、本発明は、ＡＩＭ発現不全非ヒト哺乳動物に高脂肪食負荷することによって得られる動物を用いた、肝疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法を提供する。
　ＡＩＭ発現不全非ヒト哺乳動物とは、内在性ＡＩＭの発現が不活性化された非ヒト哺乳動物を意味し、ＡＩＭがノックアウト（ＫＯ）されたＥＳ細胞から、作製されるＡＩＭ　ＫＯ動物の他、アンチセンスもしくはＲＮＡｉ技術によりＡＩＭの発現が不活性化されたノックダウン（ＫＤ）動物なども含まれる。ここで「ノックアウト（ＫＯ）」とは、内在性遺伝子を破壊したり、除去したりすることにより完全なｍＲＮＡを産生不能にすることを意味し、他方、「ノックダウン（ＫＤ）」とは、ｍＲＮＡから蛋白質への翻訳を阻害することにより、結果的に内在性遺伝子の発現を不活性化することを意味する。以下、本発明のＡＩＭ　ＫＯ／ＫＤ動物を、単に「本発明のＫＯ／ＫＤ動物」という場合がある。本発明のＡＩＭ　ＫＯ動物としては、例えば、Ｍｉｙａｚａｋｉ　Ｔ．ｅｔ　ａｌ．（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８９，４１３－４２２，１９９９）に開示されている。
　本発明で対象とし得る「非ヒト哺乳動物」は、トランスジェニック系が確立されたヒト以外の哺乳動物であれば特に制限はなく、例えば、マウス、ラット、ウシ、サル、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなどが挙げられる。好ましくは、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター等であり、なかでも疾患モデル動物作製の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、繁殖が容易な齧歯動物がより好ましく、とりわけマウス（例えば、純系としてＣ５７ＢＬ／６系統、ＢＡＬＢ／ｃ系統、ＤＢＡ２系統など、交雑系としてＢ６Ｃ３Ｆ１系統、ＢＤＦ１系統、Ｂ６Ｄ２Ｆ１系統、ＩＣＲ系統など）およびラット（例えば、Ｗｉｓｔａｒ、ＳＤなど）が好ましい。
　また、哺乳動物以外にもニワトリなどの鳥類を本発明で対象とする「非ヒト哺乳動物」と同様の目的に用いることができる。
　ＡＩＭをノックアウトする具体的な手段としては、前記のＭｉｙａｚａｋｉ　Ｔ．ｅｔ　ａｌ．（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８９，４１３－４２２，１９９９）にも開示されているが、その他の公知の一般的な手法としては、対象非ヒト哺乳動物由来のＡＩＭ（ゲノムＤＮＡ）を常法に従って単離し、例えば、（１）そのエキソン部分やプロモーター領域に他のＤＮＡ断片（例えば、薬剤耐性遺伝子やレポーター遺伝子等）を挿入することによりエキソンもしくはプロモーターの機能を破壊するか、（２）Ｃｒｅ－ｌｏｘＰ系やＦｌｐ－ｆｒｔ系を用いてＡＩＭの全部または一部を切り出して該遺伝子を欠失させるか、（３）蛋白質コード領域内へ終止コドンを挿入して完全な蛋白質の翻訳を不能にするか、あるいは（４）転写領域内部へ遺伝子の転写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、ｐｏｌｙＡ付加シグナルなど）を挿入して、完全なｍＲＮＡの合成を不能にすることによって、結果的に遺伝子を不活性化するように構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖（以下、ターゲッティングベクターと略記する）を、相同組換えにより対象非ヒト哺乳動物のＡＩＭ遺伝子座に組み込ませる方法などが好ましく用いられ得る。
　該相同組換え体は、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）への上記ターゲッティングベクターの導入により取得することができる。
　ＥＳ細胞は胚盤胞期の受精卵の内部細胞塊（ＩＣＭ）に由来し、インビトロで未分化状態を保ったまま培養維持できる細胞をいう。ＩＣＭの細胞は将来、胚本体を形成する細胞であり、生殖細胞を含むすべての組織の基になる幹細胞である。ＥＳ細胞としては、既に樹立された細胞株を用いてもよく、また、ＥｖａｎｓとＫａｕｆｍａｎの方法（ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）第２９２巻、１５４頁、１９８１年）に準じて新しく樹立したものでもよい。例えば、マウスＥＳ細胞の場合、現在、一般的には１２９系マウス由来のＥＳ細胞が使用されているが、免疫学的背景がはっきりしていないので、これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明らかなＥＳ細胞を取得するなどの目的で、例えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスやＣ５７ＢＬ／６の採卵数の少なさをＤＢＡ／２との交雑により改善したＢＤＦ１マウス（Ｃ５７ＢＬ／６とＤＢＡ／２とのＦ１）から樹立されるＥＳ細胞なども良好に用いることができる。ＢＤＦ１マウスは、採卵数が多く、かつ卵が丈夫であるという利点に加えて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを背景に持つので、これ由来のＥＳ細胞は疾患モデルマウスを作製したとき、Ｃ５７ＢＬ／６マウスと戻し交雑することでその遺伝的背景をＣ５７ＢＬ／６マウスに代えることが可能である点で有利に用い得る。ＥＳ細胞は、適当な条件により、高密度に至るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔Ｍ．Ｊ．Ｅｖａｎｓ及びＭ．Ｈ．Ｋａｕｆｍａｎ，ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）第２９２巻、１５４頁、１９８１年；Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｔｉｎ，プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）第７８巻、７６３４頁、１９８１年；Ｔ．Ｃ．Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら，ジャーナル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクスペリメンタル・モルフォロジー、第８７巻、２７頁、１９８５年〕、本発明のターゲッティングベクターを導入されたＥＳ細胞を分化させて得られるＡＩＭ発現不全非ヒト哺乳動物細胞は、インビトロにおけるＡＩＭの細胞生物学的検討において有用である。
　例えば、ターゲッティングベクターが、ＡＩＭのエキソン部分やプロモーター領域に他のＤＮＡ断片を挿入することにより、該エキソンもしくはプロモーターの機能を破壊すべく設計されたものである場合、当該ベクターは、例えば、以下のような構成をとることができる。
　まず、相同組換えにより、ＡＩＭのエキソンもしくはプロモーター部分に他のＤＮＡ断片が挿入されるために、ターゲッティングベクターは、当該他のＤＮＡ断片の５’上流および３’下流に、それぞれ標的部位と相同な配列（５’アームおよび３’アーム）を含む必要がある。
　挿入される他のＤＮＡ断片は特に制限はないが、薬剤耐性遺伝子やレポーター遺伝子を用いると、ターゲッティングベクターが染色体へ組み込まれたＥＳ細胞を、薬剤耐性もしくはレポーター活性を指標として選択することができる。ここで薬剤耐性遺伝子としては、例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｔ）遺伝子などが、レポーター遺伝子としては、例えば、β－ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ｃａｔ）遺伝子などがそれぞれ挙げられるが、それらに限定されない。
　薬剤耐性もしくはレポーター遺伝子は、哺乳動物細胞内で機能し得る任意のプロモーターの制御下にあることが好ましい。例えば、ＳＶ４０由来初期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ロングターミナルリピート（ＬＴＲ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲ、マウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）ＬＴＲ、アデノウイルス（ＡｄＶ）由来初期プロモーター等のウイルスプロモーター、並びにβ－アクチン遺伝子プロモーター、ＰＧＫ遺伝子プロモーター、トランスフェリン遺伝子プロモーター等の哺乳動物の構成蛋白質遺伝子のプロモーターなどが挙げられる。しかしながら、薬剤耐性もしくはレポーター遺伝子がＡＩＭの内在性プロモーターの制御下におかれるようにＡＩＭ内に挿入される場合は、ターゲッティングベクター中に該遺伝子の転写を制御するプロモーターは必要でない。
　また、ターゲッティングベクターは、薬剤耐性もしくはレポーター遺伝子の下流に、該遺伝子からのｍＲＮＡの転写を終結させる配列（ポリアデニレーション（ｐｏｌｙＡ）シグナル、ターミネーターとも呼ばれる）を有していることが好ましく、例えば、ウイルス遺伝子由来、あるいは各種哺乳動物または鳥類の遺伝子由来のターミネーター配列を用いることができる。好ましくは、ＳＶ４０由来のターミネーターなどが用いられる。
　通常、哺乳動物における遺伝子組換えは大部分が非相同的であり、導入されたＤＮＡは染色体の任意の位置にランダムに挿入される。したがって、薬剤耐性やレポーター遺伝子の発現を検出するなどの選択（ポジティブ選択）によっては相同組換えにより標的となる内在性ＡＩＭにターゲッティングされたクローンのみを効率よく選択することができず、選択されたすべてのクローンについてサザンハイブリダイゼーション法もしくはＰＣＲ法による組込み部位の確認が必要となる。そこで、ターゲッティングベクターの標的配列に相同な領域の外側に、例えば、ガンシクロビル感受性を付与する単純ヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）遺伝子を連結しておけば、該ベクターがランダムに挿入された細胞はＨＳＶ－ｔｋ遺伝子を有するため、ガンシクロビル含有培地では生育できないが、相同組換えにより内在性ＡＩＭ遺伝子座にターゲッティングされた細胞はＨＳＶ－ｔｋ遺伝子を有しないので、ガンシクロビル耐性となり選択される（ネガティブ選択）。あるいは、ＨＳＶ－ｔｋ遺伝子の代わりに、例えばジフテリア毒素遺伝子を連結すれば、該ベクターがランダムに挿入された細胞は自身の産生する該毒素によって死滅するので、薬剤非存在下で相同組換え体を選択することもできる。
　ＥＳ細胞へのターゲッティングベクターの導入には、リン酸カルシウム共沈殿法、電気穿孔（エレクトロポレーション）法、リポフェクション法、レトロウイルス感染法、凝集法、顕微注入（マイクロインジェクション）法、遺伝子銃（パーティクルガン）法、ＤＥＡＥ－デキストラン法などのいずれも用いることができるが、上述のように、哺乳動物における遺伝子組換えは大部分が非相同的であり、相同組換え体が得られる頻度は低いので、簡便に多数の細胞を処理できること等の点からエレクトロポレーション法が一般的に選択される。エレクトロポレーションには通常の動物細胞への遺伝子導入に使用されている条件をそのまま用いればよく、例えば、対数増殖期にあるＥＳ細胞をトリプシン処理して単一細胞に分散させた後、１０６～１０８細胞／ｍｌとなるように培地に懸濁してキュベットに移し、ターゲッティングベクターを１０～１００μｇ添加し、２００～６００Ｖ／ｃｍの電気パルスを印加することにより行なうことができる。
　ターゲッティングベクターが組み込まれたＥＳ細胞は、単一細胞をフィーダー細胞上で培養して得られるコロニーから分離抽出した染色体ＤＮＡをサザンハイブリダイゼーションまたはＰＣＲ法によりスクリーニングすることによっても検定することができるが、他のＤＮＡ断片として薬剤耐性遺伝子やレポーター遺伝子を使用した場合は、それらの発現を指標として細胞段階で形質転換体を選択することができる。例えば、ポジティブ選択用マーカー遺伝子としてｎｐｔＩＩ遺伝子を含むベクターを用いた場合、遺伝子導入処理後のＥＳ細胞をＧ４１８などのネオマイシン系抗生物質を含有する培地中で培養し、出現した耐性コロニーをトランスフォーマントの候補として選択する。また、ネガティブ選択用マーカー遺伝子として、ＨＳＶ－ｔｋ遺伝子を含むベクターを用いた場合、ガンシクロビルを含有する培地中で培養し、出現した耐性コロニーを相同組換え体の候補として選択する。得られたコロニーをそれぞれ培養プレートに移してトリプシン処理、培地交換を繰り返した後、一部を培養用として残し、残りをＰＣＲもしくはサザンハイブリダイゼーションにかけて導入ＤＮＡの存在を確認する。
　導入ＤＮＡの組込みが確認されたＥＳ細胞を同種の非ヒト哺乳動物由来の胚内に戻すと、宿主胚のＩＣＭに組み込まれてキメラ胚が形成される。これを仮親（受胚用雌）に移植してさらに発生を続けさせることにより、キメラＫＯ動物が得られる。キメラ動物の中でＥＳ細胞が将来卵や精子に分化する始原生殖細胞の形成に寄与した場合には、生殖系列キメラが得られることとなり、これを交配することによりＡＩＭ発現不全が遺伝的に固定されたＫＯ動物を作製することができる。
　キメラ胚の作製方法としては、桑実胚期までの初期胚同士を接着させて集合させる方法（集合キメラ法）と、胚盤胞の割腔内に細胞を顕微注入する方法（注入キメラ法）とがある。ＥＳ細胞によるキメラ胚の作製においては従来より後者が広く行なわれているが、最近では、８細胞期胚の透明帯内へのＥＳ細胞の注入により集合キメラを作る方法や、マイクロマニピュレーターが不要で操作が容易な方法として、ＥＳ細胞塊と透明帯を除去した８細胞期胚とを共培養して凝集させることによって集合キメラを作製する方法も行われている。
　いずれの場合も、宿主胚は、後述する受精卵への遺伝子導入において、採卵用雌として使用され得る非ヒト哺乳動物から同様にして採取することができるが、例えばマウスの場合、キメラマウス形成へのＥＳ細胞の寄与率を毛色（コートカラー）で判定し得るように、ＥＳ細胞の由来する系統とは毛色の異なる系統のマウスから宿主胚を採取することが好ましい。例えば、ＥＳ細胞が１２９系マウス（毛色：アグーチ）由来であれば、採卵用雌としてＣ５７ＢＬ／６マウス（毛色：ブラック）やＩＣＲマウス（毛色：アルビノ）を用い、ＥＳ細胞がＣ５７ＢＬ／６もしくはＤＢＦ１マウス（毛色：ブラック）由来やＴＴ２細胞（Ｃ５７ＢＬ／６とＣＢＡとのＦ１（毛色：アグーチ）由来）であれば、採卵用雌としてＩＣＲマウスやＢＡＬＢ／ｃマウス（毛色：アルビノ）を用いることができる。
　また、生殖系列キメラ形成能はＥＳ細胞と宿主胚との組み合わせに大きく依存するので、生殖系列キメラ形成能の高い組み合わせを選択することがより好ましい。例えばマウスの場合、１２９系統由来のＥＳ細胞に対してはＣ５７ＢＬ／６系統由来の宿主胚等を用いることが好ましく、Ｃ５７ＢＬ／６系統由来のＥＳ細胞に対してはＢＡＬＢ／ｃ系統由来の宿主胚等が好ましい。
　採卵用雌マウスは約４～約６週齢程度が好ましく、交配用の雄マウスとしては約２～約８ヶ月齢程度の同系統のものが好ましい。交配は自然交配によってもよいが、好ましくは性腺刺激ホルモン（卵胞刺激ホルモン、次いで黄体形成ホルモン）を投与して過剰排卵を誘起した後に行なわれる。
　胚盤注入法による場合は、胚盤胞期胚（例えばマウスの場合、交配後約３．５日）を採卵用雌の子宮から採取し（あるいは桑実胚期以前の初期胚を卵管から採取した後、胚培養用培地（後述）中で胚盤胞期まで培養してもよい）、マイクロマニピュレーターを用いて胚盤胞の割腔内にターゲッティングベクターが導入されたＥＳ細胞（約１０～約１５個）を注入した後、偽妊娠させた受胚用雌非ヒト哺乳動物の子宮内に移植する。受胚用雌非ヒト哺乳動物は受精卵への遺伝子導入における受胚用雌として使用され得る非ヒト哺乳動物を同様に用いることができる。
　共培養法による場合は、８細胞期胚および桑実胚（例えばマウスの場合、交配後約２．５日）を採卵用雌の卵管および子宮から採取して（あるいは８細胞期以前の初期胚を卵管から採取した後、胚培養用培地（後述）中で８細胞期または桑実胚期まで培養してもよい）酸性タイロード液中で透明帯を溶解した後、ミネラルオイルを重層した胚培養用培地の微小滴中にターゲッティングベクターが導入されたＥＳ細胞塊（細胞数約１０～約１５個）を入れ、さらに上記８細胞期胚または桑実胚（好ましくは２個）を入れて一晩共培養する。得られた桑実胚または胚盤胞を上記と同様にして受胚用雌非ヒト哺乳動物の子宮内に移植する。
　移植胚が首尾よく着床し受胚雌が妊娠すれば、自然分娩もしくは帝王切開によりキメラ非ヒト哺乳動物が得られる。自然分娩した受胚雌にはそのまま哺乳を継続させればよく、帝王切開により出産した場合は、産仔は別途用意した哺乳用雌（通常に交配・分娩した雌非ヒト哺乳動物）に哺乳させることができる。
　生殖系列キメラの選択は、まずＥＳ細胞の雌雄が予め判別されている場合はＥＳ細胞と同じ性別のキメラマウスを選択し（通常は雄性ＥＳ細胞が使用されるので、雄キメラマウスが選択される）、次いで毛色等の表現型からＥＳ細胞の寄与率が高いキメラマウス（例えば、５０％以上）を選択する。例えば、１２９系マウス由来の雄性ＥＳ細胞であるＤ３細胞とＣ５７ＢＬ／６マウス由来の宿主胚とのキメラ胚から得られるキメラマウスの場合、アグーチの毛色の占める割合の高い雄マウスを選択するのが好ましい。選択されたキメラ非ヒト哺乳動物が生殖系列キメラであるか否かの確認は、適当な系統の同種動物との交雑により得られるＦ１動物の表現型に基づいて行なうことができる。例えば、上記キメラマウスの場合、アグーチはブラックに対して優性であるので、雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスと交雑すると、選択された雄マウスが生殖系列キメラであれば得られるＦ１の毛色はアグーチとなる。
　上記のようにして得られるターゲッティングベクターが導入された生殖系列キメラ非ヒト哺乳動物（ファウンダー）は、通常、相同染色体の一方のＡＩＭのみがＫＯされたヘテロ接合体として得られる。相同染色体の両方のＡＩＭがＫＯされたホモ接合体を得るためには、上記のようにして得られるＦ１動物のうちヘテロ接合体の兄妹同士を交雑すればよい。ヘテロ接合体の選択は、例えばＦ１動物の尾部より分離抽出した染色体ＤＮＡをサザンハイブリダイゼーションまたはＰＣＲ法によりスクリーニングすることにより検定することができる。得られるＦ２動物の１／４がホモ接合体となる。
　ターゲッティングベクターとしてウイルスを用いる場合の別の好ましい一実施態様として、ポジティブ選択用マーカー遺伝子が５’および３’アームの間に挿入され、該アームの外側にネガティブ選択用マーカー遺伝子を含むＤＮＡを含むウイルスで、非ヒト哺乳動物のＥＳ細胞を感染させる方法が挙げられる（例えば、プロシーディングズ・オヴ・ナショナル・アカデミー・オヴ・サイエンシーズ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）第９９巻，第４号，第２１４０－２１４５頁，２００２年参照）。例えば、レトロウイルスやレンチウイルスを用いる場合、ディッシュなどの適当な培養器に細胞を播き、培養液にウイルスベクターを加えて（所望によりポリブレンを共存させてもよい）、１～２日間培養後、上述のように選択薬剤を添加して培養を続け、ベクターが組み込まれた細胞を選択する。
　ＡＩＭをノックダウンする具体的な手段としては、ＡＩＭのアンチセンスＲＮＡもしくはｓｉＲＮＡ（ｓｈＲＮＡを含む）をコードするＤＮＡを、自体公知のトランスジェニック作製技術を用いて導入し、対象非ヒト哺乳動物細胞内で発現させる方法などが挙げられる。
　目的のポリヌクレオチドの標的領域と相補的な塩基配列を含むＤＮＡ、即ち、目的のポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるＤＮＡは、該目的のポリヌクレオチドに対して「アンチセンス」であるということができる。
　ＡＩＭをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に、相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有するアンチセンスＤＮＡとしては、ＡＩＭをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有し、該ポリヌクレオチドの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、いずれのアンチセンスＤＮＡであってもよい。
　ＡＩＭをコードするポリヌクレオチドに実質的に相補的な塩基配列とは、例えば、該ポリヌクレオチドの相補鎖の塩基配列と、オーバーラップする領域に関して、約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列である。本明細書における塩基配列の相同性は、例えば、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ　ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　Ｂａｓｉｃ　Ｌｏｃａｌ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　Ｓｅａｒｃｈ　Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；フィルタリング＝ＯＮ；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝－３）にて計算することができる。
　特に、ＡＩＭをコードするポリヌクレオチドの相補鎖の全塩基配列のうち、（ａ）翻訳阻害を指向したアンチセンスＤＮＡの場合は、ＡＩＭのＮ末端部位をコードする部分の塩基配列（例えば、開始コドン付近の塩基配列など）の相補鎖と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアンチセンスＤＮＡが、（ｂ）ＲＮａｓｅＨによるＲＮＡ分解を指向するアンチセンスＤＮＡの場合は、イントロンを含むＡＩＭをコードするポリヌクレオチドの全塩基配列の相補鎖と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアンチセンスＤＮＡがそれぞれ好適である。
　具体的には、対象非ヒト哺乳動物がマウスの場合、ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＦ０１１４２８として登録されている塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列、またはその一部を含むアンチセンスＤＮＡ、好ましくは、該塩基配列に相補的な塩基配列またはその一部を含むアンチセンスＤＮＡなどが挙げられる。
　ＡＩＭをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有するアンチセンスＤＮＡ（以下、「本発明のアンチセンスＤＮＡ」ともいう）は、クローン化した、あるいは決定されたＡＩＭをコードするＤＮＡの塩基配列情報に基づき設計し、合成しうる。かかるアンチセンスＤＮＡは、ＡＩＭの複製または発現を阻害することができる。即ち、本発明のアンチセンスＤＮＡは、ＡＩＭから転写されるＲＮＡ（ｍＲＮＡまたは初期転写産物）とハイブリダイズすることができ、ｍＲＮＡの合成（プロセッシング）または機能（蛋白質への翻訳）を阻害することができる。
　本発明のアンチセンスＤＮＡの標的領域は、アンチセンスＤＮＡがハイブリダイズすることにより、結果としてＡＩＭへの翻訳が阻害されるものであればその長さに特に制限はなく、該蛋白質をコードするｍＲＮＡの全配列であっても部分配列であってもよく、短いもので約１０塩基程度、長いものでｍＲＮＡまたは初期転写産物の全配列が挙げられる。具体的には、ＡＩＭの５’端ヘアピンループ、５’端６－ベースペア・リピート、５’端非翻訳領域、翻訳開始コドン、蛋白質コード領域、ＯＲＦ翻訳終止コドン、３’端非翻訳領域、３’端パリンドローム領域または３’端ヘアピンループなどが、アンチセンスＤＮＡの好ましい標的領域として選択しうるが、ＡＩＭ内の如何なる領域も対象として選択しうる。例えば、該遺伝子のイントロン部分を標的領域とすることもできる。
　さらに、本発明のアンチセンスＤＮＡは、ＡＩＭのｍＲＮＡもしくは初期転写産物とハイブリダイズして蛋白質への翻訳を阻害するだけでなく、二本鎖ＤＮＡであるＡＩＭと結合して三重鎖（トリプレックス）を形成し、ＲＮＡの転写を阻害し得るものであってもよい。あるいはＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを形成してＲＮａｓｅＨによる分解を誘導するものであってもよい。
　ＡＩＭをコードするｍＲＮＡもしくは初期転写産物を、コード領域の内部（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）で特異的に切断し得るリボザイムをコードするＤＮＡもまた、本発明のアンチセンスＤＮＡに包含され得る。リボザイムとして最も汎用性の高いものとしては、ウイロイドやウイルソイド等の感染性ＲＮＡに見られるセルフスプライシングＲＮＡがあり、ハンマーヘッド型やヘアピン型等が知られている。ハンマーヘッド型は約４０塩基程度で酵素活性を発揮し、ハンマーヘッド構造をとる部分に隣接する両端の数塩基ずつ（合わせて約１０塩基程度）をｍＲＮＡの所望の切断部位と相補的な配列にすることにより、標的ｍＲＮＡのみを特異的に切断することが可能である。このタイプのリボザイムは、ＲＮＡのみを基質とするので、ゲノムＤＮＡを攻撃することがないというさらなる利点を有する。ＡＩＭｍＲＮＡが自身で二本鎖構造をとる場合には、ＲＮＡヘリカーゼと特異的に結合し得るウイルス核酸由来のＲＮＡモチーフを連結したハイブリッドリボザイムを用いることにより、標的配列を一本鎖にすることができる［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９８（１０）：５５７２－５５７７（２００１）］。さらに、転写産物の細胞質への移行を促進するために、ｔＲＮＡを改変した配列をさらに連結したハイブリッドリボザイムとすることもできる［Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，２９（１３）：２７８０－２７８８（２００１）］。
　本明細書においては、ＡＩＭのｍＲＮＡもしくは初期転写産物のコード領域内の部分配列（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）に相同なオリゴＲＮＡとその相補鎖とからなる二本鎖ＲＮＡ、いわゆる単鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）もまた、本発明のＫＤ動物作製のために用いることができる。ｓｉＲＮＡを細胞内に導入するとそのＲＮＡに相同なｍＲＮＡが分解される、いわゆるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれる現象は、以前から線虫、昆虫、植物等で知られていたが、この現象が動物細胞でも広く起こることが確認されて以来［Ｎａｔｕｒｅ，４１１（６８３６）：４９４－４９８（２００１）］、リボザイムの代替技術として汎用されている。ｓｉＲＮＡは標的となるｍＲＮＡの塩基配列情報に基づいて、市販のソフトウェア（例：ＲＮＡｉ　Ｄｅｓｉｇｎｅｒ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて適宜設計することができる。
　本発明のアンチセンスオリゴＤＮＡ及びリボザイムは、ＡＩＭのｃＤＮＡ配列もしくはゲノミックＤＮＡ配列に基づいてｍＲＮＡもしくは初期転写産物の標的配列を決定し、市販のＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機（アプライド・バイオシステムズ社、ベックマン社等）を用いて、これに相補的な配列を合成することにより調製することができる。合成されたアンチセンスオリゴＤＮＡまたはリボザイムは、必要に応じて適当なリンカー（アダプター）配列を介して発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、アンチセンスオリゴＲＮＡまたはリボザイムをコードするＤＮＡ発現ベクターを調製することができる。ここで用いられ得る発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、モロニー白血病ウイルスなどのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルスまたはバキュロウイルスなどの動物もしくは昆虫ウイルスなどが用いられる。なかでも、プラスミド（好ましくは大腸菌由来、枯草菌由来または酵母由来、特に大腸菌由来のプラスミド）や、動物ウイルス（好ましくはレトロウイルス、レンチウイルス）が好ましく例示される。また、プロモーターとしては、例えば、ＳＶ４０由来初期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ロングターミナルリピート（ＬＴＲ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲ、マウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）ＬＴＲ、アデノウイルス（ＡｄＶ）由来初期プロモーター等のウイルスプロモーター、並びにβ－アクチン遺伝子プロモーター、ＰＧＫ遺伝子プロモーター、トランスフェリン遺伝子プロモーター等の哺乳動物の構成蛋白質遺伝子のプロモーターなどが挙げられる。
　より長いアンチセンスＲＮＡ（例えば、ＡＩＭｍＲＮＡの相補鎖全長など）をコードするＤＮＡ発現ベクターは、常法によりクローニングしたＡＩＭｃＤＮＡを、必要に応じて適当なリンカー（アダプター）配列を介して発現ベクターのプロモーターの下流に逆方向に挿入することにより調製することができる。
　一方、ｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡは、センス鎖またはアンチセンス鎖をコードするＤＮＡとして別個に合成し、それぞれを適当な発現ベクター中に挿入することにより調製することができる。ｓｉＲＮＡの発現ベクターとしては、Ｕ６やＨ１などのＰｏｌ　ＩＩＩ系プロモーターを有するものが用いられ得る。この場合、該ベクターが導入された動物細胞内で、センス鎖とアンチセンス鎖がそれぞれ転写されてアニーリングすることにより、ｓｉＲＮＡが形成される。ｓｈＲＮＡはセンス鎖およびアンチセンス鎖を適当なループ構造を形成しうる長さ（例えば１５から２５塩基程度）を間に挿入したユニットを適当な発現ベクター中に挿入することにより調製することができる。ｓｈＲＮＡの発現ベクターとしてはＵ６やＨ１などのＰｏｌ　ＩＩＩ系プロモーターを有するものが用いられ得る。この場合、該発現ベクターを導入された動物細胞内で転写されたｓｈＲＮＡは、自身でループを形成した後に、内在の酵素ダイサー（ｄｉｃｅｒ）などによってプロセシングされることにより成熟ｓｉＲＮＡが形成される。あるいは、Ｐｏｌ　ＩＩ系プロモーターで、ターゲットのｓｉＲＮＡ配列を含むマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を発現させてＲＮＡｉによりノックダウンを達成することも可能である。この場合には組織特異的発現を示すプロモーターにより、組織特異的ノックダウンも可能となる。
　ＡＩＭのアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、もしくはｍｉＲＮＡをコードするＤＮＡを含む発現ベクターを細胞に導入する方法としては、標的細胞に応じて自体公知の方法が適宜用いられる。例えば、受精卵などの初期胚への導入については、マイクロインジェクション法が用いられる。また、ＥＳ細胞への導入については、リン酸カルシウム共沈殿法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、レトロウイルス感染法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ－デキストラン法などが用いられ得る。あるいは、ベクターとしてレトロウイルスやレンチウイルスなどを用いる場合には、初期胚やＥＳ細胞にウイルスを添加して１～２日培養し、該細胞を該ウイルスに感染させることにより、簡便に遺伝子導入を達成し得る場合がある。ＥＳ細胞からの個体再生（ファウンダーの樹立）、継代（ホモ接合体の作製）等は、本発明のＫＯ動物において上記したと同様の方法により行うことができる。
　好ましい一実施態様においては、ＡＩＭのアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、もしくはｍｉＲＮＡをコードするＤＮＡを含む発現ベクターは、マイクロインジェクション法により対象となる非ヒト哺乳動物の初期胚（受精卵）に導入される。
　受精卵へのＤＮＡの顕微注入は、マイクロマニピュレーター等の公知の装置を用いて常法に従って実施することができる。簡潔に言えば、胚培養用培地の微小滴中に入れた受精卵をホールディングピペットで吸引して固定し、インジェクションピペットを用いてＤＮＡ溶液を雄性もしくは雌性前核、好ましくは雄性前核内に直接注入する。導入ＤＮＡはＣｓＣｌ密度勾配超遠心または陰イオン交換樹脂カラム等で高度に精製したものを用いることが好ましい。また、導入ＤＮＡは制限酵素を用いてベクター部分を切断し、直鎖状にしておくことが好ましい。
　ＤＮＡ導入後の受精卵は胚培養用培地中で微小滴培養法等により５％炭酸ガス／９５％大気下で１細胞期～胚盤胞期まで培養した後、偽妊娠させた受胚用雌非ヒト哺乳動物の卵管または子宮内に移植される。受胚用雌非ヒト哺乳動物は移植される初期胚が由来する動物と同種のものであればよく、例えば、マウス初期胚を移植する場合は、ＩＣＲ系の雌マウス（好ましくは約８～約１０週齢）などが好ましく用いられる。受胚用雌非ヒト哺乳動物を偽妊娠状態にする方法としては、例えば、同種の精管切除（結紮）雄非ヒト哺乳動物（例えば、マウスの場合、ＩＣＲ系の雄マウス（好ましくは約２ヶ月齢以上））と交配させて、膣栓の存在が確認されたものを選択する方法が知られている。
　受胚用雌は自然排卵のものを用いてもよいし、あるいは精管切除（結紮）雄との交配に先立って、黄体形成ホルモン放出ホルモン（一般にＬＨＲＨと略する）もしくはその類縁体を投与し、受精能を誘起させたものを用いてもよい。ＬＨＲＨ類縁体としては、例えば、［３，５－ＤｉＩ－Ｔｙｒ５］－ＬＨ－ＲＨ、［Ｇｌｎ８］－ＬＨ－ＲＨ、［Ｄ－Ａｌａ６］－ＬＨ－ＲＨ、［ｄｅｓ－Ｇｌｙ１０］－ＬＨ－ＲＨ、［Ｄ－Ｈｉｓ（Ｂｚｌ）６］－ＬＨ－ＲＨおよびそれらのＥｔｈｙｌａｍｉｄｅなどが挙げられる。ＬＨＲＨもしくはその類縁体の投与量、ならびにその投与後に雄非ヒト哺乳動物と交配させる時期は、非ヒト哺乳動物の種類によりそれぞれ異なる。例えば、非ヒト哺乳動物がマウス（好ましくはＩＣＲ系のマウスなど）の場合には、通常、ＬＨＲＨもしくはその類縁体を投与した後、約４日目に雄マウスと交配させることが好ましく、ＬＨＲＨあるいはその類縁体の投与量は、通常、約１０～６０μｇ／個体、好ましくは約４０μｇ／個体である。
　通常、移植される初期胚が桑実胚期以後の場合は受胚用雌の子宮に、それより前（例えば、１細胞期～８細胞期胚）であれば卵管に胚移植される。受胚用雌は、移植胚の発生段階に応じて偽妊娠からある日数が経過したものが適宜使用される。例えばマウスの場合、２細胞期胚を移植するには偽妊娠後約０．５日の雌マウスが、胚盤胞期胚を移植するには偽妊娠後約２．５日の雌マウスが好ましい。受胚用雌を麻酔（好ましくはＡｖｅｒｔｉｎ、ネンブタール等が使用される）後、切開して卵巣を引き出し、胚培養用培地に懸濁した初期胚（約５～約１０個）を胚移植用ピペットを用いて、卵管腹腔口もしくは子宮角の卵管接合部付近に注入する。
　移植胚が首尾よく着床し受胚雌が妊娠すれば、自然分娩もしくは帝王切開により仔非ヒト哺乳動物が得られる。自然分娩した受胚雌にはそのまま哺乳を継続させればよく、帝王切開により出産した場合は、産仔は別途用意した哺乳用雌（例えばマウスの場合、通常に交配・分娩した雌マウス（好ましくはＩＣＲ系の雌マウス等））に哺乳させることができる。
　受精卵細胞段階におけるＡＩＭのアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、もしくはｍｉＲＮＡをコードするＤＮＡの導入は、導入ＤＮＡが対象非ヒト哺乳動物の生殖系列細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。導入ＤＮＡが染色体ＤＮＡに組み込まれているか否かは、例えば、産仔の尾部より分離抽出した染色体ＤＮＡをサザンハイブリダイゼーションまたはＰＣＲ法によりスクリーニングすることにより検定することができる。上記のようにして得られる仔非ヒト哺乳動物（Ｆ０）の生殖系列細胞において発現ベクターが存在することは、その後代（Ｆ１）の動物全てが、その生殖系列細胞および体細胞のすべてに発現ベクターが存在することを意味する。
　通常、Ｆ０動物は相同染色体の一方にのみ導入ＤＮＡを有するヘテロ接合体として得られる。また、個々のＦ０個体は相同組換えによらない限り異なる染色体上にランダムに挿入される。相同染色体の両方に発現ベクターを有するホモ接合体を得るためには、Ｆ０動物と非トランスジェニック動物とを交雑してＦ１動物を作製し、相同染色体の一方にのみ導入ＤＮＡを有するヘテロ接合体の兄妹同士を交雑すればよい。１遺伝子座にのみ導入ＤＮＡが組み込まれていれば、得られるＦ２動物の１／４がホモ接合体となる。
　ベクターとしてウイルスを用いる場合の別の好ましい一実施態様として、上記ＫＯ動物の場合と同様に、ＡＩＭのアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、もしくはｍｉＲＮＡをコードするＤＮＡを含むウイルスで、非ヒト哺乳動物の初期胚もしくはＥＳ細胞を感染させる方法が挙げられる。細胞として受精卵を用いる場合は、感染に先立って透明帯を除いておくことが好ましい。ウイルスベクターを感染させて１～２日間培養後、初期胚であれば、上述のように偽妊娠させた受胚用雌非ヒト哺乳動物の卵管または子宮内に移植し、ＥＳ細胞であれば、上述のように選択薬剤を添加して培養を続け、ベクターが組み込まれた細胞を選択する。
　さらに、プロシーディングズ・オヴ・ナショナル・アカデミー・オヴ・サイエンシーズ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）第９８巻，第１３０９０－１３０９５頁，２００１年に記載されるように、雄非ヒト哺乳動物から採取した精原細胞をＳＴＯフィーダー細胞と共培養する間にウイルスベクターに感染させた後、雄性不妊非ヒト哺乳動物の精細管に注入して雌非ヒト哺乳動物と交配させることにより、効率よくＡＩＭのアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、もしくはｍｉＲＮＡをコードするＤＮＡのへテロＴｇ（＋／－）産仔を得ることができる。
　Ｍｉｙａｚａｋｉ　Ｔ．ｅｔ　ａｌ．（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８９，４１３－４２２，１９９９）に記載された、あるいは上記の手法によって取得されうる本発明のＡＩＭ発現不全非ヒト哺乳動物は、高脂肪食負荷条件下において、対応する野生型動物と比較して、以下の特性： 
（１）肝臓重量が増大する、
（２）脂肪肝が亢進する、
（３）肝臓癌を発症する、および／または
（４）肝臓において炎症反応が抑制される、
を有する。また、本発明のＡＩＭ発現不全非ヒト哺乳動物は、野生型動物と同様に、高脂肪食負荷条件下において肝線維化が亢進する特徴を有する。これらの表現型は、従来公知のＡＩＭ　ＫＯマウスにおいては、少なくとも報告されていない。特に、脂肪肝、肝線維化、肝臓癌への変遷が、ＮＡＳＨの病態と近似したものであることは新たな発見である。
　（１）肝臓重量が増大するとは、本発明のＡＩＭ発現不全非ヒト哺乳動物に高脂肪食負荷することによって、野生型動物と比較して、肝臓重量および／または肝臓重量／体重（％）の有意な差が認められることをいう。後述する実施例においては、ＡＩＭノックアウトマウスでは、高脂肪食負荷６週目から野生型マウスと比べて有意な差が認められた。
　（２）脂肪肝が亢進するとは、本発明のＡＩＭ発現不全非ヒト哺乳動物に高脂肪食負荷することによって、野生型動物と比較して、早期に肝臓に脂肪の蓄積が認められることをいう。肝臓における脂肪の蓄積は、例えば、肝組織片をオイルレッドＯ染色することによって確認することができる。あるいは、肝臓組織中の中性脂肪量を測定することによっても確認できる。後述する実施例においては、ＡＩＭノックアウトマウスでは、高脂肪食負荷６週目から野生型マウスと比べて有意な差が認められた。
　（３）肝臓癌を発症するとは、本発明のＡＩＭ発現不全非ヒト哺乳動物に高脂肪食負荷することによって、肝臓癌の発症が認められることをいう。肝臓癌は、例えば、肝組織片を抗ＡＦＰ（α－ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）染色すること、肝組織中のＡＦＰ発現量を測定すること、または血中ＡＦＰ濃度を測定することによって確認することができる。後述する実施例においては、野生型マウスでは高脂肪食負荷１年後も肝臓癌はほぼ確認できないが、ＡＩＭノックアウトマウスでは、高脂肪食負荷１年後には全てのマウスに肝臓癌が認められた。
　（４）肝臓において炎症反応が抑制されるとは、本発明のＡＩＭ発現不全非ヒト哺乳動物に高脂肪食負荷しても、野生型動物と比較して、肝臓において炎症反応が抑制されることをいう。炎症反応は、例えば、Ｆ４／８０（マクロファージのマーカー）、ＴＮＦα、ＩＬ－６、ＩＬ－１βの発現によって確認することができる。後述する実施例においては、ＡＩＭノックアウトマウスでは、高脂肪食負荷１２週目から野生型マウスに比較して肝臓における炎症が有意に抑制されていた。
　また、肝線維化が亢進するとは、本発明のＡＩＭ発現不全非ヒト哺乳動物に高脂肪食負荷することによって、野生型動物と同様に、肝線維化が認められることをいう。肝線維化は、例えば、肝組織片をシリウスレッド染色することによって確認することができる。あるいは、肝線維化には、肝星細胞によるコラーゲン合成が関与していることが知られているが、肝星細胞のマーカーであるαＳＭＡの発現によっても確認することができる。また、肝臓におけるＴＧＦβ１、Ｃｏｌｌａｇｅｎ４Ａ１の発現によっても確認することができる。後述する実施例においては、野生型マウスおよびＡＩＭノックアウトマウスでは、高脂肪食負荷２０週目から肝線維化が認められた。また、野生型マウスおよびＡＩＭノックアウトマウスでは、高脂肪食負荷２０週目からαＳＭＡの高発現が認められた。ＴＧＦβ１は、高脂肪食負荷期間の長さに比例して、発現量が増加する傾向があった。しかしながら、野生型マウスとＡＩＭノックアウトマウスの間に、線維化の程度、αＳＭＡやＴＧＦβ１の発現量について有意な差は認められなかった。
　これらの知見は、ＡＩＭ発現不全非ヒト哺乳動物を高脂肪食負荷条件下に置くことで、肝疾患のモデル動物として有用であることを示し、さらに肝疾患の予防・治療薬のスクリーニングに用いることができることを示す。具体的には、本発明のスクリーニング方法は、以下の工程を含む。
（１）高脂肪食負荷条件下、ＡＩＭ発現不全非ヒト哺乳動物に被検物質を投与する工程、
（２）被検物質を投与されたＡＩＭ発現不全非ヒト哺乳動物の下記特性のいずれか一項目以上を観察する工程：
（ｉ）肝臓重量、
（ｉｉ）肝脂肪量、
（ｉｉｉ）肝線維、
（ｉｖ）肝臓癌、
（ｖ）肝臓における炎症反応、
（３）被検物質非投与の場合と比較して、前記特性が改善される被検物質を選択する工程。
　本発明のスクリーニング方法で、ＡＩＭ発現不全非ヒト哺乳動物に負荷される高脂肪食としては、脂質含量が高いものであれば特に制限されないが、通常、脂質含量が２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは４０％以上のものが挙げられる。また、ＡＩＭ発現不全非ヒト哺乳動物に対して、高脂肪食を負荷する期間は、少なくとも前記の特性が確認できるまで実施する。負荷期間としては、６週間以上、より好ましくは１２週間以上、より好ましくは２０週間以上である。
　ＡＩＭ発現不全非ヒト哺乳動物に投与される被験物質としては、蛋白質、ペプチド、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などが用いられてよい。被検物質を投与する時期は、高脂肪食負荷の開始前であっても、開始と同時であってもよいし、あるいはＡＩＭ発現不全非ヒト哺乳動物が高脂肪食負荷されて、前記した特性が観察されるようになってからでもよい。投与の方法としては、経口的であっても非経口的であってもよい。経口的投与としては飼料や飲料水に混ぜて投与することができる。非経口的投与としては、腹腔内投与、静脈注射、皮下注射、皮内注射、筋肉注射、点滴注射等による投与、坐剤による直腸投与などが挙げられる。また、投与は単回投与であっても複数回投与であってもよい。
　被検物質を投与されたＡＩＭ発現不全非ヒト哺乳動物の特性は、被検物質の投与後、通常４週間以降、好ましくは６週間以降に観察する。肝臓重量については、前記哺乳動物から摘出した肝臓重量および／または肝臓重量／体重（％）を計測することで観察することができる。肝脂肪については、前記摘出した肝臓の肝組織片をオイルレッドＯ染色し、その染色程度を数値化すること、あるいは肝組織中の中性脂肪量を測定することで観察することができる。肝線維については、前記摘出した肝臓の肝組織片をシリウスレッド染色し、その染色程度を数値化することで観察することができる。あるいは、肝線維については、前記摘出した肝臓におけるαＳＭＡ（α－ｓｍｏｏｔｈ　ｍｕｓｃｌｅ　ａｃｔｉｎ）、ＴＧＦβ１またはＣｏｌｌａｇｅｎ４Ａ１の発現程度を数値化することによっても確認することができる。肝臓癌については、前記摘出した肝臓の肝組織片を抗ＡＦＰ（α－ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）染色し、その染色程度を数値化すること、前記摘出した肝臓におけるＡＦＰの発現程度を数値化すること、または血中ＡＦＰ濃度を測定することによって観察することができる。肝臓における炎症反応については、前記摘出した肝臓におけるＦ４／８０、ＴＮＦα、ＩＬ－６またはＩＬ－１βの発現程度を数値化することで確認することができる。
　上記のようにして得られた前記特性の観察結果について、被検物質非投与の場合と比較する。あるいは、前記特性について肝疾患の有無との相関図をあらかじめ作成しておき、得られた前記特性の観察結果をその相関図と比較してもよい。比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行われる。
　そして、得られた前記特性の観察結果が、被検物質非投与の場合に比べて改善される場合には、該被検物質を肝疾患の予防・治療剤として選択することができる。ここで改善されるとは、（ｉ）肝臓重量が被検物質非投与の場合に比べて低いこと、（ｉｉ）肝脂肪量（オイルレッドＯ染色の程度、又は中性脂肪量）が被検物質非投与の場合に比べて低いこと、（ｉｉｉ）肝線維化の程度（シリウスレッド染色の程度、αＳＭＡ、ＴＧＦβ１、Ｃｏｌｌａｇｅｎ４Ａ１の発現）が被検物質非投与の場合に比べて低いこと、（ｉｖ）ＡＦＰ発現が被検物質非投与の場合に比べて低いこと、（ｖ）Ｆ４／８０、ＴＮＦα、ＩＬ－６、ＩＬ－１βの発現が被検物質非投与の場合に比べて高いことをいう。
　前記選択された被検物質を肝疾患の予防・治療剤として用いる場合、本発明のＡＩＭ類と同様に製剤化され、同様の投与経路・用量で投与することができる。該予防・治療剤の対象となる肝疾患についても、前記と同様でありうる。
　また、ＡＩＭ発現不全非ヒト哺乳動物は高脂肪食負荷条件下、肝疾患のモデル動物として有用であることから、該哺乳動物は、肝疾患の予防・治療薬の評価方法に用いることができる。従って、本発明はまた、ＡＩＭ発現不全非ヒト哺乳動物に高脂肪食負荷することによって得られる動物を用いる、肝疾患予防・治療剤の予防治療効果の評価方法を提供する。具体的には、本発明の評価方法は、以下の工程を含む。
（１）高脂肪食負荷条件下、ＡＩＭ発現不全非ヒト哺乳動物に肝疾患予防・治療剤を投与する工程、
（２）肝疾患予防・治療剤を投与されたＡＩＭ発現不全非ヒト哺乳動物の下記特性のいずれか一項目以上を観察する工程：
（ｉ）肝臓重量、
（ｉｉ）肝脂肪量、
（ｉｉｉ）肝線維、
（ｉｖ）肝臓癌、
（ｖ）肝臓における炎症反応、
（３）前記特性を肝疾患予防・治療剤非投与の場合と比較して、肝疾患予防・治療剤の効果を評価する工程。
　本発明の評価方法で、ＡＩＭ発現不全非ヒト哺乳動物に投与される肝疾患予防・治療剤としては、公知の肝疾患予防・治療剤であってよく、たとえば、インスリン抵抗性改善薬（例、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン等のチアゾリジン誘導体等、メトホルミン、ブホルミン等のビグアナイド剤）；抗酸化剤（例、ビタミンＥ、ビタミンＣ、ベタイン、ＥＰＬ（Ｐｏｌｙｅｎｅｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）等）；肝庇護剤（例、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）等）；抗高脂血症薬（例、フィブラート系薬剤、プロブコール、スタチン系薬剤等）；降圧薬（例、アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬等）、グリチルリチン製剤、漢方薬（例、小紫胡湯等）、抗がん剤等が挙げられるが、それらに制限されない。肝疾患予防・治療剤の投与時期、投与方法、投与回数などは前記のスクリーニング方法と同様であってよい。
　本発明の評価方法で観察される特性の観察方法は、前記スクリーニング方法の記載に従って実施してよい。また、その評価方法について、得られた前記特性の観察結果が、肝疾患予防・治療剤非投与の場合に比べて改善される程度が大きい程、該被検物質を肝疾患の予防・治療剤として予防・治療効果が高いと評価することができる。ここで改善されるとは前記と同様であってよい。
　また、本発明の後述する実施例において、ＮＡＳＨ患者の血清中ＡＩＭ濃度は非ＮＡＳＨ患者と比較して低いことが確認された。特に、肝臓癌に進行したＮＡＳＨ患者における血清中ＡＩＭ濃度は、肝臓癌まで進行していないＮＡＳＨ患者に比べてもさらに低いことが確認できた。以上のことから、被験者の血中ＡＩＭ濃度を測定することによって、肝疾患を診断できることが示唆される。具体的には、本発明の診断方法は、以下の工程を含む。
（１）被検者の試料中のＡＩＭ濃度を測定する工程、
（２）前記被検者の試料中のＡＩＭ濃度と健常者の試料中のＡＩＭ濃度とを比較する工程、
（３）前記被検者の試料中のＡＩＭ濃度が健常者の試料中のＡＩＭ濃度に比べて低値である場合、被験者が肝疾患である、または肝疾患になる可能性が高いと判断する工程。
　本発明の診断方法が適用できる被験者は特に制限されないが、例えば、肝疾患を発症するおそれがあるか、もしくは発症していることが疑われる被験者が挙げられる。そのような被験者としては、限定されるものではないが、例えば、肥満、糖尿病、高血圧症、動脈硬化症、高脂血症などの症状を有する被験者が挙げられる。また、健常者とは、臨床的に肝疾患であるとは診断されていない者、例えば、前記の症状を有しない者が挙げられる。
　本発明の診断方法に用いられる試料としては、上記被験者から採取されるものであって、測定対象であるＡＩＭ遺伝子産物（例、ＲＮＡ、蛋白質、その分解産物など）を含有するものであれば特に制限されない。例えば、血液、血漿、血清、リンパ液、尿、汗、唾液、関節液等の体液もしくはそのフラクション、あるいはそれらに含まれる細胞、特にマクロファージなどが挙げられる。
　被験者から採取した試料におけるＡＩＭ濃度の測定は、マクロファージからＲＮＡ（例：全ＲＮＡ、ｍＲＮＡ）画分を調製し、該画分中に含まれるＡＩＭ遺伝子の転写産物を測定することにより調べることができる。ＲＮＡ画分の調製は、グアニジン－ＣｓＣｌ超遠心法、ＡＧＰＣ法など公知の手法を用いて行うことができるが、市販のＲＮＡ抽出用キット（例：ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ；ＱＩＡＧＥＮ製等）を用いて、微量のマクロファージから迅速且つ簡便に高純度の全ＲＮＡを調製することができる。ＲＮＡ画分中のＡＩＭ遺伝子の転写産物を検出する手段としては、例えば、ハイブリダイゼーション（ノーザンブロット、ドットブロット、ＤＮＡチップ解析等）を用いる方法、あるいはＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ、競合ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ等）を用いる方法などが挙げられる。微量のマクロファージから迅速且つ簡便に定量性よくＡＩＭ遺伝子の発現変動を検出できる点で競合ＰＣＲやリアルタイムＰＣＲなどの定量的ＰＣＲ法が好ましい。
　ノーザンブロットまたはドットブロットハイブリダイゼーションによる場合、ＡＩＭ遺伝子の転写産物の測定は、該遺伝子の転写産物とハイブリダイズし得る核酸（プローブ）を用いて行うことができる。そのような核酸としては、ＡＩＭ遺伝子の転写産物に示される塩基配列（例えば、配列番号：１に示される塩基配列）を含む核酸とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸が挙げられる。ハイストリンジェントな条件とは、前記した条件などが挙げられる。
　プローブとして用いられる核酸は、二本鎖であっても一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドでもよい。一本鎖の場合は、アンチセンス鎖を用いることができる。該核酸の長さは標的核酸と特異的にハイブリダイズし得る限り特に制限はなく、例えば約１５塩基以上、好ましくは約３０塩基以上である。該核酸は、標的核酸の検出・定量を可能とするために、標識剤により標識されていることが好ましい。標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔３２Ｐ〕、〔３Ｈ〕、〔１４Ｃ〕などが用いられる。酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β－ガラクトシダーゼ、β－グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、プローブと標識剤との結合にビオチン－（ストレプト）アビジンを用いることもできる。
　ノーザンハイブリダイゼーションによる場合は、上記のようにして調製したＲＮＡ画分をゲル電気泳動にて分離した後、ニトロセルロース、ナイロン、ポリビニリデンジフロリド等のメンブレンに転写し、上記のようにして調製された標識プローブを含むハイブリダイゼーション緩衝液中、上記ハイストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションさせた後、適当な方法でメンブレンに結合した標識量をバンド毎に測定することにより、ＡＩＭ遺伝子の発現量を測定することができる。ドットブロットの場合も、ＲＮＡ画分をスポットしたメンブレンを同様にハイブリダイゼーション反応に付し、スポットの標識量を測定することにより、ＡＩＭ遺伝子の発現量を測定することができる。
　別の好ましい実施態様によれば、ＡＩＭ濃度を測定する方法として定量的ＰＣＲ法が用いられる。定量的ＰＣＲとしては、例えば、競合ＰＣＲやリアルタイムＰＣＲなどがある。
　ＰＣＲにおいてプライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドのセットとしては、ＡＩＭ遺伝子転写産物のセンス鎖（コード鎖）およびアンチセンス鎖（非コード鎖）とそれぞれ特異的にハイブリダイズすることができ、それらに挟まれるＤＮＡ断片を増幅し得るものであれば特に制限はなく、例えば、各々約１５～約１００塩基、好ましくは各々約１５～約５０塩基の長さを有し、約１００ｂｐ～１ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅するようにデザインされたオリゴＤＮＡのセットが挙げられる。より具体的には、プライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドのセットとしては、配列番号：１に示される塩基配列を含む核酸（センス鎖）とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸、及び前記の塩基配列に相補的な塩基配列を含む核酸（アンチセンス鎖）とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸が挙げられる。ここでハイストリンジェントな条件とは前記と同義である。
　競合ＲＴ－ＰＣＲとは、目的のＤＮＡを増幅し得るプライマーのセットにより増幅され得る既知量の他の鋳型核酸をｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒとして反応液中に共存させて競合的に増幅反応を起こさせ、増幅産物の量を比較することにより、目的ＤＮＡの量を算出する方法をいう。したがって、競合ＲＴ－ＰＣＲによる場合、上記したプライマーセットに加えて、該プライマーセットで増幅でき、増幅後に標的核酸（すなわち、ＡＩＭ遺伝子の転写産物）の増幅産物と区別することができる（例えば、増幅サイズが異なる、制限酵素処理断片の泳動パターンが異なるなど）既知量のｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ核酸が用いられる。標的核酸とｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ核酸とはプライマーを奪い合って増幅が競合的に起こるので、増幅産物の量比が元の鋳型の量比を反映することになる。ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ核酸はＤＮＡでもＲＮＡでもよい。ＤＮＡの場合、上記のようにして調製されるＲＮＡ画分から逆転写反応によりｃＤＮＡを合成した後に、上記プライマーセットおよびｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒの共存下でＰＣＲを行えばよく、ＲＮＡの場合は、ＲＮＡ画分にｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒを添加して逆転写反応を行い、さらに上記プライマーセットを添加してＰＣＲを実施すればよい。後者の場合、逆転写反応の効率も考慮に入れているので、元のｍＲＮＡの絶対量を推定することができる。
　一方、リアルタイムＰＣＲは、蛍光試薬を用いて増幅量をリアルタイムでモニタリングする方法であり、サーマルサイクラーと分光蛍光光度計を一体化した装置を必要とする。このような装置は市販されている。用いる蛍光試薬によりいくつかの方法があり、例えば、インターカレンター法、ＴａｑＭａｎＴＭプローブ法、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｅａｃｏｎ法等が挙げられる。いずれも、上記のようにして調製されるＲＮＡ画分から逆転写反応によりｃＤＮＡを合成した後に、上記プライマーセットとＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ、エチジウムブロマイド等の二本鎖ＤＮＡに結合することにより蛍光を発する試薬（インターカレーター）、上記プローブとして用いることができる核酸（但し、該核酸は増幅領域内で標的核酸にハイブリダイズする）の両端をそれぞれ蛍光物質（例：ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＦＩＴＣ等）および消光物質（例：ＴＡＭＲＡ、ＤＡＢＣＹＬ等）で修飾したもの（ＴａｑＭａｎＴＭプローブまたはＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｅａｃｏｎプローブ）などの蛍光試薬（プローブ）とを、それぞれＰＣＲ反応系に添加するというものである。インターカレーターは合成された二本鎖ＤＮＡに結合して励起光の照射により蛍光を発するので、蛍光強度を測定することにより増幅産物の生成量をモニタリングすることができ、それによって元の鋳型ｃＤＮＡ量を推定することができる。ＴａｑＭａｎＴＭプローブは両端を蛍光物質と消光物質をそれぞれで修飾した、標的核酸の増幅領域にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドであり、アニーリング時に標的核酸にハイブリダイズするが消光物質の存在により蛍光を発せず、伸長反応時にＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性により分解されて蛍光物質が遊離することにより蛍光を発する。従って、蛍光強度を測定することにより増幅産物の生成量をモニタリングすることができ、それによって元の鋳型ｃＤＮＡ量を推定することができる。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｅａｃｏｎプローブは両端を蛍光物質と消光物質をそれぞれで修飾した、標的核酸の増幅領域にハイブリダイズし得るとともにヘアピン型二次構造をとり得るオリゴヌクレオチドであり、ヘアピン構造をとっている時は消光物質の存在により蛍光を発せず、アニーリング時に標的核酸にハイブリダイズして蛍光物質と消光物質との距離が広がることにより蛍光を発する。従って、蛍光強度を測定することにより増幅産物の生成量をモニタリングすることができ、それによって元の鋳型ｃＤＮＡ量を推定することができる。リアルタイムＲＴ－ＰＣＲは、ＰＣＲの増幅量をリアルタイムでモニタリングできるので、電気泳動が不要で、より迅速にＡＩＭ遺伝子の発現を解析可能である。
　別の態様では、被験者から採取した試料におけるＡＩＭ濃度の測定は、該試料から蛋白質画分を調製し、該画分中に含まれるＡＩＭを検出することにより調べることができる。ＡＩＭの検出は、ＡＩＭに対する抗体を用いて、免疫学的測定法（例：ＥＬＩＳＡ、ＦＩＡ、ＲＩＡ、ウエスタンブロット等）によって行うことができる。あるいはまた、ＡＩＭの検出は、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳ等の質量分析法を用いても行うことができる。
　尚、ＡＩＭに対する抗体は、配列番号：２に示されるアミノ酸配列と、同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列もしくは部分アミノ酸配列を含む蛋白質を感作抗原として、通常使用されるポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体作製技術に従って取得することができる。
　個々の免疫学的測定法を本発明の診断方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えてＡＩＭの測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。例えば、入江寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ」Ｖｏｌ．７０（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ａ））、同書Ｖｏｌ．７３（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ｂ））、同書Ｖｏｌ．７４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ｃ））、同書Ｖｏｌ．８４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ｄ：Ｓｅｌｅｃｔｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ））、同書Ｖｏｌ．９２（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ｅ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　Ｍｅｔｈｏｄｓ））、同書Ｖｏｌ．１２１（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ｉ：Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ））（以上、アカデミックプレス社発行）などを参照することができる。
　前述のとおり、本発明のＡＩＭは、肝疾患患者において血中濃度が低下する。したがって、上記のようにして、ＡＩＭ濃度を測定した結果、健常者と比べて低下していた場合、被験者は肝疾患を発症しているか、発症する可能性が高いと判定することができる。あるいは、肝疾患の有無とＡＩＭ濃度との相関図をあらかじめ作成しておき、得られた測定結果をその相関図と比較してもよい。比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行われる。
　本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号：１〕
ヒトＡＩＭの塩基配列を示す。
〔配列番号：２〕
ヒトＡＩＭのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：３〕
Ｆ４／８０に対するセンスプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：４〕
Ｆ４／８０に対するアンチセンスプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：５〕
ＴＮＦαに対するセンスプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：６〕
ＴＮＦαに対するアンチセンスプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：７〕
ＩＬ－６に対するセンスプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：８〕
ＩＬ－６に対するアンチセンスプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：９〕
ＩＬ－１βに対するセンスプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１０〕
ＩＬ－１βに対するアンチセンスプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１１〕
αＳＭＡに対するセンスプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１２〕
αＳＭＡに対するアンチセンスプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１３〕
ＴＧＦβ１に対するセンスプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１４〕
ＴＧＦβ１に対するアンチセンスプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１５〕
ＡＦＰに対するセンスプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１６〕
ＡＦＰに対するアンチセンスプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１７〕
ＧＡＰＤＨに対するセンスプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１８〕
ＧＡＰＤＨに対するアンチセンスプライマーの塩基配列を示す。
　以下において、実施例および参考例により本発明をより具体的にするが、この発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１：ＡＩＭノックアウトマウスに高脂肪食（ＨＦＤ）を負荷することによる脂肪肝の亢進
　ＡＩＭノックアウトマウスおよびにＷＴマウスに高脂肪食（ＨＦＤ）を負荷することにより、肝臓重量、体重に対する肝臓の重量、肝臓中の中性脂肪重量、およびヘマトキシリン・エオジン組織染色による肝脂肪の蓄積について検討した。その結果、ＷＴマウスにＨＦＤを付加しても、２０週目まで肝臓重量／体重は明確な変化は示さなかったが、ＡＩＭノックアウトマウスにＨＦＤを付加することにより、６週目からＷＴに比較し有意な肝臓重量／体重の増加が認められた（図１Ａ）。また、肝臓中の中性脂肪重量の結果から、ＡＩＭノックアウトマウスにＨＦＤを付加することにより、６週目から肝臓での脂肪の蓄積が認められ、ＷＴと比較して脂肪肝が亢進していることが明らかとなった（図１Ｂ）。
実施例２：ＡＩＭノックアウトマウスに高脂肪食（ＨＦＤ）を負荷することによる肝線維化（肝硬変）の進行
　野生型マウス（オス、１０匹、１２週齢）とＡＩＭノックアウトマウス（オス、１０匹、１２週齢）に高脂肪食（ＨＦＤ）を負荷し、０、６、１２、２０、４５、５５週間後に肝臓をフォルマリン固定し、切片をシリウスレッドで染色し、染色された線維化部分（図２Ａ）をＮＩＨ－Ｊ　ｉｍａｇｅにて定量化した。各マウスにつき３枚の非連続切片で解析し、その平均値（切片全体における線維化の割合）を示している（図２Ｂ）。その結果、線維化領域はＨＦＤ負荷期間が長いほど増加するが、野生型マウスとＡＩＭノックアウトマウスで有意な差は認められなかった。また、固定前に一部の肝組織からＲＮＡを抽出し、量的ＲＴ－ＰＣＲによって、肝線維化に関与する代表的な遺伝子であるαＳＭＡとＴＧＦβについてｍＲＮＡ発現量を解析した（図２Ｃ）。高脂肪食（ＨＦＤ）負荷後４５、５５週のＡＩＭノックアウトマウスでは、癌が多発し、正常肝部での正確な発現量が解析できにくいため、ＲＮＡ解析は、０、６、１２、２０週間負荷したマウスのみで行った。その結果、αＳＭＡとＴＧＦβのｍＲＮＡ発現量は、ＨＦＤ負荷と共に上昇したが、両者に有意な差はなかった。
実施例３：ＡＩＭノックアウトマウスに高脂肪食（ＨＦＤ）を負荷することによる肝細胞癌の発症
　ＷＴマウスにＨＦＤを５２週間負荷しても、脂肪肝は見られるものの、肝細胞癌はほぼ発症しなかったのに対し、ＡＩＭノックアウトマウスでは全例に肝細胞癌が観察され、観察された腫瘍のほとんどが、高分化型肝細胞癌（ＨＣＣ）であった（図３Ａ、Ｂ、Ｃ）。肝細胞癌はＨｏｅｃｈｓｔ／ＡＦＰ染色でＡＩＭノックアウトマウスの肝臓に確認され（図４）、肝臓でのＡＦＰの発現亢進も確認できた。
実施例４：高脂肪食（ＨＦＤ）の負荷に対するＡＩＭノックアウトマウスの炎症反応
　ＡＩＭノックアウトマウスに高脂肪食（ＨＦＤ）を負荷することにより肝臓での炎症反応は抑制されていた（図５）。ＷＴマウスにＨＦＤを付加すると、１２－２０週目で肝臓でのマクロファージの集積、ＴＮＦα、ＩＬ－６、ＩＬ－１βの発現亢進といった炎症反応の亢進が見られた。一方、ＡＩＭノックアウトマウスではＷＴと比較してこれらの炎症反応は抑制されていた（図５）。
実施例５：血中ＡＩＭのＩｇＭによる安定化
　Ｂリンパ球が欠損しているため血中にＩｇＭが存在しないＲＡＧ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ　ｇｅｎｅ）ＫＯマウスの血清中ＡＩＭをウエスタンブロットにより解析した。ＷＴに比べ、ＲＡＧ　ＫＯマウスでは血清中ＡＩＭ量が極めて少なく、またＡＩＭ－ＩｇＭ複合体は検出されなかった（図６Ａ）。そこでｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて、ＡＩＭとＩｇＭの結合を調べたところ、ＡＩＭとＩｇＭの結合が確認された（図６Ａ）。さらにＲＡＧ　ＫＯマウスに２００μｇのＩｇＭを静脈内投与したところ、血中のＡＩＭが増加した（図６Ｂ）。さらに、マウスおよびヒト血清中のＡＩＭ濃度とＩｇＭ濃度をＥＬＩＳＡ法により測定したところ、ヒトにおいても血中のＡＩＭ濃度とＩｇＭ濃度は、マウスと同様に相関していることが判明した（図７）。以上より、ＡＩＭは血中でＩｇＭと複合体を形成し、安定化していることが示唆された。
実施例６：ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおけるＡＩＭの脂肪肝抑制効果
　ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおけるＡＩＭの肝細胞に対する作用を検討した。マウス初代培養肝細胞にＡＩＭを５時間作用した後、細胞を抗ＡＩＭ抗体で染色及びウエスタンブロットしたところ、細胞がＡＩＭを取り込んでいることが確認された（図８）。さらにマウス初代培養肝細胞に８００μＭオレイン酸（ＯＡ）を添加し、２４時間培養することにより脂肪肝化させた後、ＡＩＭ添加またはＡＩＭ非添加で２４時間培養した。オイルレッドＯ染色およびＦＳＰ２７（Ｆａｔ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ　２７）のｍＲＮＡ発現量から脂肪肝化を測定した。ＡＩＭ非添加（ＯＡ→ＤＭＥＭ）では、ＯＡ非添加に比べオイルレッドＯ染色の程度およびｆｓｐ２７発現量が増加し、脂肪肝化が確認された（図９）。一方、ＡＩＭ添加（ＯＡ→ＡＩＭ）では、オイルレッドＯ染色の程度およびｆｓｐ２７発現量の増加は見られず（図９）、ＡＩＭの脂肪肝改善効果が確認された。
実施例７：ＳＲＣＲドメインによる脂肪前駆細胞から脂肪細胞への分化抑制
　組換えヒトＳＲＣＲドメイン（ＳＲＣＲ１、ＳＲＣＲ２、ＳＲＣＲ３）タンパクは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いて、それぞれＨＡ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）タグを付加したヒトＳＲＣＲドメインを発現させ、抗ＨＡ抗体カラムにより精製することにより得た。３Ｔ３－Ｌ１脂肪前駆細胞を、１μｇ／ｍＬインスリン、１μＭデキサメタゾン（ＤＥＸ）、０．５ｍＭイソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）存在下で４８時間培養することにより脂肪細胞への分化を誘導し、それに対するＳＲＣＲドメインおよびＡＩＭの分化抑制作用を検討した。添加したＡＩＭとしては、ヒト全長ＡＩＭ（ｈＡＩＭ）、前記の３種のＳＲＣＲドメイン蛋白質を２０μｇ／ｍｌで用いた。脂肪細胞への分化は、オイルレッドＯ染色の程度を無添加の場合を１００％として定量化した。すべてのＳＲＣＲドメインにＡＩＭと同じ脂肪細胞分化抑制作用が見られた（図１０）。
実施例８：ＮＡＳＨ患者における血清中ＡＩＭ濃度の測定
　ＮＡＳＨ患者３例（うち２例は肝細胞癌に進行）および非ＮＡＳＨ患者3例の血清中ＡＩＭ濃度を測定した。測定は、抗ＡＩＭ抗体を用いたウエスタンブロットで行い、シグナルの強さを定量化した。非ＮＡＳＨ患者に比べ、ＮＡＳＨ患者では血清中のＡＩＭ濃度が低下していた（図１１）。また、肝細胞癌に進行しているＮＡＳＨ患者では、血清中ＡＩＭ濃度がより低下していた（図１１）。
参考例：高脂肪食（ＨＦＤ）を負荷されたＡＩＭノックアウトマウスに対するＡＩＭ投与の効果
　８週齢のＡＩＭ　ＫＯマウスに高脂肪食（ＨＦＤ）を負荷して飼育する。肝臓への脂肪の蓄積が見られる前のＨＦＤ負荷２～３週目よりＡＩＭまたはｖｅｈｉｃｌｅを連日投与する。投与４～６週後に肝臓をオイルレッドＯ染色すると、ｖｅｈｉｃｌｅ投与群では脂肪の蓄積が見られるのに対し、ＡＩＭ投与群では脂肪の蓄積が見られない。従って、ＡＩＭが脂肪肝の予防に有用であることがわかる。また、８週齢のＡＩＭ　ＫＯマウスに高脂肪食（ＨＦＤ）を負荷して飼育する。肝臓への脂肪の蓄積が見られるＨＦＤ負荷６～８週目よりＡＩＭまたはｖｅｈｉｃｌｅを連日投与する。投与４～８週後に肝臓をオイルレッドＯ染色すると、ｖｅｈｉｃｌｅ投与群では投与前に比べ脂肪の蓄積が増加するのに対し、ＡＩＭ投与群では投与前に比べ脂肪の蓄積が減少する。従って、ＡＩＭが脂肪肝の改善又は治療に有用であることがわかる。また、ＡＩＭの代わりに、ＡＩＭの機能をアゴニスティックに調節できる薬剤（ＡＩＭ活性を有するＡＩＭの部分ペプチドを含む）やＡＩＭの発現を誘導する薬剤を使用しても同様の結果が得られる。同様にして、肝線維化および肝癌の発症時期に合わせてＡＩＭを投与することにより、肝硬変および肝癌に対するＡＩＭの予防、改善又は治療効果も確認できる。
実施例９：高脂肪食（ＨＦＤ）を負荷されたＡＩＭノックアウトマウスに対するＡＩＭ投与の効果
　ＡＩＭノックアウトマウス（オス１０匹、１２週齢）に高脂肪食（ＨＦＤ）を４３週間負荷し、３０週目から４３週目まで組換えＡＩＭ（ｒＡＩＭ）（２０ｍｇ／Ｋｇ（体重）；５匹）またはＰＢＳ（５匹）を週一回腹腔内注射にて投与した。ＨＦＤ４３週目にマウスを屠殺し、摘出した肝臓をフォルマリン固定した後、肝組織切片を作製した。得られた肝組織切片をヘマトキシリン・エオジン染色し、癌の状況と脂肪肝の状況について解析した。肝組織切片は各マウスにつき１０枚非連続切片で作製し、癌の有無、大きさ、個数について解析した。また、肝臓（非癌部）の一部は固定前に切除し中性脂肪の含有量を測定した。その結果、ｒＡＩＭ投与群の体重は有意に減少した。一方ＰＢＳ投与群の体重は増加した（図１２Ａ）。また、ｒＡＩＭ投与群には明らかな癌部は認められなかった。一方、ＰＢＳ投与群では、全てのマウスに複数個の癌結節が見られた。組織学的にも多発性の肝癌が認められた。巨視的な写真とヘマトキシリン・エオジン染色像を示す（図１２Ｂ）。さらに、脂肪肝についてはｒＡＩＭ投与群では組織学的に明らかな改善が認められた。また肝（非癌部）の中性脂肪含有量も、ＰＢＳ投与群に比して有意に減少した（図１２Ｂ）。
　本発明は、有効成分としてＡＩＭを含む、肝疾患の予防・治療剤を提供することができる。また、本発明の肝疾患モデルマウスは、肝疾患の発症メカニズムを解明に寄与し、さらに該モデルマウスを用いたスクリーニング方法によれば、肝疾患に対する予防・治療に有効な物質を探索することができる。また本発明の肝疾患モデルマウスを用いて、肝疾患の公知の予防・治療剤の効果を評価することができる。さらに本発明は、肝疾患の診断方法を提供することができる。
　本出願は、日本で出願された特願２０１２－１０３９５８（出願日：平成２４年４月２７日）を基礎としており、その内容はすべて本明細書に包含されるものとする。

Claims (18)

  1. 　ＡＩＭもしくはその部分ペプチドまたはそれらをコードする塩基配列を含む核酸を含有してなる、肝疾患の予防・治療剤。
  2. 　ＡＩＭの発現を誘導する薬剤またはＡＩＭを安定化させる薬剤を含有してなる、肝疾患の予防・治療剤。
  3. 　肝疾患が脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝炎、肝硬変または肝臓癌である請求項１または２に記載の予防・治療剤。
  4. 　ＡＩＭ発現不全非ヒト哺乳動物に高脂肪食負荷することによって得られる動物を用いる、肝疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法。
  5. 　以下の工程を含むことを特徴とする、請求項４記載のスクリーニング方法
    （１）高脂肪食負荷条件下、ＡＩＭ発現不全非ヒト哺乳動物に被検物質を投与する工程、
    （２）被検物質を投与されたＡＩＭ発現不全非ヒト哺乳動物の下記特性のいずれか一項目以上を観察する工程：
    （ｉ）肝臓重量、
    （ｉｉ）肝脂肪量、
    （ｉｉｉ）肝線維、
    （ｉｖ）肝臓癌、
    （ｖ）肝臓における炎症反応
    （３）被検物質非投与の場合と比較して、前記特性が改善される被検物質を選択する工程。
  6. 　肝疾患が脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝炎、肝硬変または肝臓癌である請求項４または５に記載のスクリーニング方法。
  7. 　ＡＩＭ発現不全非ヒト哺乳動物に高脂肪食負荷することによって得られる動物を用いる、肝疾患予防・治療剤の予防治療効果の評価方法。
  8. 　以下の工程を含むことを特徴とする、請求項７記載の評価方法
    （１）高脂肪食負荷条件下、ＡＩＭ発現不全非ヒト哺乳動物に肝疾患予防・治療剤を投与する工程、
    （２）肝疾患予防・治療剤を投与されたＡＩＭ発現不全非ヒト哺乳動物の下記特性のいずれか一項目以上を観察する工程：
    （ｉ）肝臓重量、
    （ｉｉ）肝脂肪量、
    （ｉｉｉ）肝線維、
    （ｉｖ）肝臓癌、
    （ｖ）肝臓における炎症反応、
    （３）前記特性を肝疾患予防・治療剤非投与の場合と比較して、肝疾患予防・治療剤の効果を評価する工程。
  9. 　肝疾患が脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝炎、肝硬変または肝臓癌である請求項７または８に記載の評価方法。
  10. 　以下の工程を含むことを特徴とする、肝疾患の診断方法
    （１）被検者の試料中のＡＩＭ濃度を測定する工程、
    （２）前記被検者の試料中のＡＩＭ濃度と健常者の試料中のＡＩＭ濃度とを比較する工程、
    （３）前記被検者の試料中のＡＩＭ濃度が健常者の試料中のＡＩＭ濃度に比べて低値である場合、被験者が肝疾患である、または肝疾患になる可能性が高いと判断する工程。
  11. 　肝疾患が脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝炎、肝硬変または肝臓癌である請求項１０に記載の診断方法。
  12. 　ＡＩＭもしくはその部分ペプチドまたはそれらをコードする塩基配列を含む核酸を対象に有効量投与することを含む、肝疾患の予防・治療方法。
  13. 　ＡＩＭの発現を誘導する薬剤またはＡＩＭを安定化させる薬剤を対象に有効量投与することを含む、肝疾患の予防・治療方法。
  14. 　肝疾患が脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝炎、肝硬変または肝臓癌である、請求項１２または１３に記載の予防・治療方法。
  15. 　肝疾患の予防・治療に用いるための、ＡＩＭもしくはその部分ペプチドまたはそれらをコードする塩基配列を含む核酸。
  16. 　肝疾患が脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝炎、肝硬変または肝臓癌である、請求項１５に記載のＡＩＭもしくはその部分ペプチドまたはそれらをコードする塩基配列を含む核酸。
  17. 　肝疾患の予防・治療に用いるための、ＡＩＭの発現を誘導する薬剤またはＡＩＭを安定化させる薬剤。
  18. 　肝疾患が脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝炎、肝硬変または肝臓癌である、請求項１７に記載の薬剤。
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Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015119253A1 (ja) * 2014-02-07 2015-08-13 宮崎　徹 腎疾患の予防または治療剤
WO2016190387A1 (ja) * 2015-05-28 2016-12-01 国立大学法人東京大学 腫瘍の治療剤及びその使用
JP2016540218A (ja) * 2013-12-10 2016-12-22 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 肝疾患の鑑別診断
JPWO2017022315A1 (ja) * 2015-08-06 2018-06-21 積水メディカル株式会社 腎疾患の検査方法
WO2019097898A1 (ja) 2017-11-16 2019-05-23 宮崎　徹 変異型ａｉｍ
JP2020510001A (ja) * 2017-03-14 2020-04-02 エスジェーティー モレキュラー リサーチ，エスエル 非アルコール性脂肪性肝疾患と非アルコール性脂肪性肝炎の予防および／または処置に使用するための化合物
WO2020071318A1 (ja) 2018-10-01 2020-04-09 宮崎　徹 神経変性疾患治療剤
WO2020096043A1 (ja) * 2018-11-09 2020-05-14 積水メディカル株式会社 ウィルス性肝癌の検出方法
WO2020158858A1 (ja) * 2019-01-31 2020-08-06 積水メディカル株式会社 生物学的試料中の遊離ａｉｍの免疫学的分析方法及び対象におけるｎａｓｈの検出方法
WO2020158857A1 (ja) * 2019-01-31 2020-08-06 積水メディカル株式会社 生物学的試料中の遊離ａｉｍの免疫学的分析方法及び測定キット
JP2020158437A (ja) * 2019-03-26 2020-10-01 宮崎　徹 血中フリー体ａｉｍ増加用組成物

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI704228B (zh) * 2015-09-10 2020-09-11 日商積水醫療股份有限公司 肝癌的檢查方法
US11946937B2 (en) * 2017-09-13 2024-04-02 Mayo Foundation For Medical Education And Research Identification and monitoring of apoptosis inhibitor of macrophage
CN108535492B (zh) * 2018-03-27 2019-02-12 重庆医科大学 Aim作为生物标志物在诊断、预后或监测脓毒症中的用途
CN112116860B (zh) * 2020-10-23 2022-06-10 北京博医时代教育科技有限公司 用于上腹部手术训练的模型及其制作方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011145723A1 (ja) * 2010-05-20 2011-11-24 Miyazaki Toru メタボリックシンドロームの予防又は治療方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100331244A1 (en) 2009-06-01 2010-12-30 The University Of Tokyo Pharmaceutical composition, food or drink, and methods related thereto

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011145723A1 (ja) * 2010-05-20 2011-11-24 Miyazaki Toru メタボリックシンドロームの予防又は治療方法

Non-Patent Citations (54)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"METHODS IN ENZYMOLOGY", vol. 121, ACADEMIC PRESS
"Methods in ENZYMOLOGY", vol. 70, ACADEMIC PRESS
"METHODS IN ENZYMOLOGY", vol. 73, ACADEMIC PRESS
"METHODS IN ENZYMOLOGY", vol. 74, ACADEMIC PRESS
"METHODS IN ENZYMOLOGY", vol. 84, ACADEMIC PRESS
"METHODS IN ENZYMOLOGY", vol. 92, ACADEMIC PRESS
"Shin Saibo Kogaku Jikken Protocol (New Cell Engineering Experimental Protocol)", vol. 8, 1995, SHUJUNSHA, article "Saibo Kogaku (Cell Engineering)", pages: 263 - 267
ALTSCHUL ET AL., NUCLEIC ACIDS RES., vol. 25, 1997, pages 3389 - 3402
AM J PATHOL, vol. 162, 2003, pages 837 - 847
BOWIE ET AL., SCIENCE, vol. 247, 1990, pages 1306 - 1310
CELL METAB, vol. 1, 2005, pages 201 - 213
CELL METAB, vol. 11, 2010, pages 479 - 492
EIJI ISHIKAWA ET AL.: "Enzyme Immunoassay", 1978, IGAKUSHOIN
EIJI ISHIKAWA ET AL.: "Enzyme Immunoassay", 1987, IGAKUSHOIN
EIJI ISHIKAWA ET AL.: "Enzyme Immunoassay, 2nd ed.", 1982, IGAKUSHOIN
EVANS; KAUFMAN, NATURE, vol. 292, 1981, pages 154
G.R. MARTIN, PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, USA, vol. 78, 1981, pages 7634
GENE, vol. 17, 1982, pages 107
GENETICS, vol. 39, 1954, pages 440
HIROSHI IRIE: "Radioimmunoassay", 1974, KODANSHA LTD.
HIROSHI IRIE: "Sequel to the Radioimmunoassay", 1979, KODANSHA LTD.
J BIOL CHEM, vol. 276, 2001, pages 22910 - 22914
J EXP MED, vol. 189, 1999, pages 413 - 422
J. SAMBROOK ET AL.: "Molecular Cloning, 2nd ed.", 1989, COLD SPRING HARBOR LAB. PRESS
JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY, vol. 120, 1978, pages 517
JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY, vol. 41, 1969, pages 459
KARLIN ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 90, 1993, pages 5873 - 5877
LU Y. ET AL.: "Peroxiredoxin 2: a potential biomarker for early diagnosis of hepatitis B virus related liver fibrosis identified by proteomic analysis of the plasma", BMC GASTROENTEROL., vol. 10, 2010, pages 115, XP021074039 *
M. BODANSZKY; M.A. ONDETTI: "Peptide Synthesis", 1966, INTERSCIENCE PUBLISHERS
M.J. EVANS; M.H. KAUFMAN, NATURE, vol. 292, 1981, pages 154
MILLER: "Journal of Experiments in Molecular Genetics", 1972, COLD SPRING HARBOR LABORATORY, pages: 431 - 433
MIYAZAKI T. ET AL., J. EXP. MED., vol. 189, 1999, pages 413 - 422
MIYAZAKI T. ET AL.: "Increased susceptibility of thymocytes to apoptosis in mice lacking AIM, a novel murine macrophage-derived soluble factor belonging to the scavenger receptor cysteine-rich domain superfamily", J.EXP.MED., vol. 189, 1999, pages 413 - 422, XP008149323 *
MYERS; MILLER, CABIOS, vol. 4, 1988, pages 11 - 17
NATURE, vol. 411, no. 6836, 2001, pages 494 - 498
NEEDLEMAN ET AL., J. MOL. BIOL., vol. 48, 1970, pages 444 - 453
NUCLEIC ACIDS RES., vol. 29, no. 13, 2001, pages 2780 - 2788
NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 9, 1981, pages 309
PEARSON ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 85, 1988, pages 2444 - 2448
PNAS, vol. 108, 2011, pages 12072 - 12077
PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 60, 1968, pages 160
PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 69, 1972, pages 2110
PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 98, 2001, pages 13090 - 13095
PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 98, no. 10, 2001, pages 5572 - 5577
PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 99, no. 4, 2002, pages 2140 - 2145
PROCEEDING OF THE SOCIETY FOR THE BIOLOGICAL MEDICINE, vol. 73, 1950, pages 1
SCHROEDER; LUEBKE: "The Peptide", 1965, ACADEMIC PRESS
SCIENCE, vol. 122, 1952, pages 501
STEPANOVA M. ET AL.: "Protein pathway biomarker signature associated with superimposed non-alcoholic steatohepatitis(NASH) and advanced fibrosis in patients with chronic hapatitis C", J.HEPATOL., vol. 52, no. SUPPL., 2010, pages S157, XP026998281 *
T. C. DOETSCHMAN ET AL., JOURNAL OF EMBRYOLOGY AND EXPERIMENTAL MORPHOLOGY, vol. 87, 1985, pages 27
THE JOURNAL OF THE AMERICAN MEDICAL ASSOCIATION, vol. 199, 1967, pages 519
TORU MIYAZAKI: "Apoptosis Yokusei Inshi AIM no Kino Seigyo ni yoru Domyaku Koka no Atarashii Chiryoho Kaihatsu o Mezashite", THER.RES., vol. 29, 2008, pages 144 - 151, XP008167256 *
VIROLOGY, vol. 52, 1973, pages 456
VIROLOGY, vol. 8, 1959, pages 396

Cited By (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016540218A (ja) * 2013-12-10 2016-12-22 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 肝疾患の鑑別診断
US10349640B2 (en) 2014-02-07 2019-07-16 Toru Miyazaki Preventive or therapeutic agent for kidney disease
KR20160110538A (ko) 2014-02-07 2016-09-21 토루 미야자키 신질환의 예방 또는 치료제
US11253571B2 (en) 2014-02-07 2022-02-22 Toru Miyazaki Preventive or therapeutic agent for kidney disease
KR101870246B1 (ko) * 2014-02-07 2018-06-22 토루 미야자키 신질환의 예방 또는 치료제
WO2015119253A1 (ja) * 2014-02-07 2015-08-13 宮崎　徹 腎疾患の予防または治療剤
WO2016190387A1 (ja) * 2015-05-28 2016-12-01 国立大学法人東京大学 腫瘍の治療剤及びその使用
JPWO2017022315A1 (ja) * 2015-08-06 2018-06-21 積水メディカル株式会社 腎疾患の検査方法
JP2020510001A (ja) * 2017-03-14 2020-04-02 エスジェーティー モレキュラー リサーチ，エスエル 非アルコール性脂肪性肝疾患と非アルコール性脂肪性肝炎の予防および／または処置に使用するための化合物
JP7343902B2 (ja) 2017-03-14 2023-09-13 エスジェーティー モレキュラー リサーチ，エスエル 非アルコール性脂肪性肝疾患と非アルコール性脂肪性肝炎の予防および／または処置に使用するための化合物
US11866471B2 (en) 2017-11-16 2024-01-09 Toro Miyazaki Variant AIM
WO2019097898A1 (ja) 2017-11-16 2019-05-23 宮崎　徹 変異型ａｉｍ
WO2020071318A1 (ja) 2018-10-01 2020-04-09 宮崎　徹 神経変性疾患治療剤
JPWO2020071318A1 (ja) * 2018-10-01 2021-09-02 宮崎　徹 神経変性疾患治療剤
JP7289033B2 (ja) 2018-10-01 2023-06-09 徹 宮崎 神経変性疾患治療剤
WO2020096043A1 (ja) * 2018-11-09 2020-05-14 積水メディカル株式会社 ウィルス性肝癌の検出方法
CN113196057A (zh) * 2018-11-09 2021-07-30 积水医疗株式会社 病毒性肝癌的检测方法
JPWO2020096043A1 (ja) * 2018-11-09 2021-09-24 積水メディカル株式会社 ウィルス性肝癌の検出方法
JP7315965B2 (ja) 2018-11-09 2023-07-27 積水メディカル株式会社 ウィルス性肝癌の検出方法
WO2020158857A1 (ja) * 2019-01-31 2020-08-06 積水メディカル株式会社 生物学的試料中の遊離ａｉｍの免疫学的分析方法及び測定キット
JPWO2020158857A1 (ja) * 2019-01-31 2021-12-23 積水メディカル株式会社 生物学的試料中の遊離ａｉｍの免疫学的分析方法及び測定キット
JP7315968B2 (ja) 2019-01-31 2023-07-27 積水メディカル株式会社 生物学的試料中の遊離ａｉｍの免疫学的分析方法及び対象におけるｎａｓｈの検出方法
JPWO2020158858A1 (ja) * 2019-01-31 2021-12-23 積水メディカル株式会社 生物学的試料中の遊離ａｉｍの免疫学的分析方法及び対象におけるｎａｓｈの検出方法
JP7315967B2 (ja) 2019-01-31 2023-07-27 積水メディカル株式会社 生物学的試料中の遊離ａｉｍの免疫学的分析方法及び測定キット
WO2020158858A1 (ja) * 2019-01-31 2020-08-06 積水メディカル株式会社 生物学的試料中の遊離ａｉｍの免疫学的分析方法及び対象におけるｎａｓｈの検出方法
JP7159093B2 (ja) 2019-03-26 2022-10-24 徹 宮崎 血中フリー体ａｉｍ増加用組成物
JP2020158437A (ja) * 2019-03-26 2020-10-01 宮崎　徹 血中フリー体ａｉｍ増加用組成物

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