WO2013122408A1 - 신경교세포 생성 조절에 관여하는 fam19a5의 약제학적 용도 - Google Patents

신경교세포 생성 조절에 관여하는 fam19a5의 약제학적 용도 Download PDF

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황종익
선웅
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Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical use for the diagnosis, prevention or treatment of central nervous system damage, degenerative brain disease or central nervous system disease of FAM19A5 that regulates division and differentiation in neural stem cells of vertebrates.
  • neural tubes are created in the neural plate, and the cavity of the neural tubes forms the ventricles as they go through the process of development.
  • the cell layer located closest to the ventricles is called the ventricular zone, and an additional proliferative cell layer is formed over the ventricular zone during the neurogenesis process, called the subventricular zone.
  • Progenitor cells in the ventricular and subventricular zones are characterized by neural stem cells and are transferred to cortical plates through complex control methods [Dehay and Kennedy, Nat Rev Neurosci 8: 438.
  • Neural stem cells have the ability to continue dividing, or self-renewal, and differentiate into neurons, asthocytes, and oligodendrocytes that make up the central nervous system. Can be. In the embryonic stage, they mainly undergo differentiation into neurons, and after birth they undergo differentiation into glia (Bayer et al., J Comp Neurol 307: 499-516,1991; Miller and Gauthier, Neuron 54: 357-369,2007.
  • Differentiation of neural stem cells into neural cells and glial cells is a phenomenon that is continuously observed in the adult brain as well as the developmental process of the brain.
  • Neurogenesis in the adult brain occurs in two different brain regions: the subventricular zone of the lateral ventricle and the dental gyrus of the hippocampus.
  • the subventricular zone the ventricular cells located closest to the ventricles and the stellate cells distributed along them serve as neural stem cells, and the two types of cells pass through transient amplifying cells to neuroblast cells.
  • Doetsch, Curr Opin Genet Dev 13: 543-550,2003 Doetsch et al., Cell 97: 703-716,1999; Lois and Alvarez-Buylla, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2074-2077,1993; Palmer et al., Mol Cell Neurosci 8: 389-404, 1997; Temple, Nature 414: 112-117, 2001.
  • astrocytes In order to maintain the normal functioning of the brain, the numerical balance of neurons and glial cells is essential. The largest number of astrocytes has been known to control the environment around neurons beyond their role as structural supports, which was previously thought to only protect neurons and help them perform their functions. The secretion of growth factors regulates the function of nerve cells and helps maintain the cellular barrier between blood vessels and the brain.
  • astrocytes The functional significance of astrocytes has been known pathologically through many studies. In case of damage to the brain, astrocytes proliferate actively, become reactive astrocytes, and enlargement is observed. The active proliferation of these glial cells performs beneficial functions such as rapid tissue recovery at the early stage of injury and prevention of propagation from the damaged area.
  • Glial hyperplasia is a common phenomenon in the pathological processes of various central nervous systems. It is caused by the overproliferation and activation of astrocytes due to injury. When the central nervous system is damaged, normal astrocytes become hypertrophic and become reactive astrocytes that increase the production of mesoporous proteins called glial fibrillary acidic protein (GFAP). After injury, various glial cells, including reactive stellate cells, overproliferate to form a rigid cell layer called glia scar, the product of healing.
  • GFAP glial fibrillary acidic protein
  • glial hyperplasias are observed in degenerative brain diseases including Huntington's disease, Parkinson's disease, Alzheimer's disease, and cerebral spinal cord injury, as well as in various pathological phenomena of the central nervous system, including stroke and brain tumors [Faideau et al. , Hum Mol Genet , 2010; Chen et al ., Curr Drug Targets , 2005; Rodriguez et al., Cell Death Differ , 2009; Robel et al., J Neurosci , 2011; Talbott et al., Exp Neurol , 2005; Shimada et al., J Neurosci ; 2012; Sofroniew and Vinters, Acta Neuropathol , 2010].
  • glial hyperplasia In general, the effects of glial hyperplasia vary depending on the situation in which the initial injury occurred or the time elapsed since the injury occurred.
  • reactive astrocytic cells secrete neuronal growth factors such as GDNF and prevent glutamic acid from protecting against apoptosis. It also plays a positive role in restoring the function of the blood-brain barrier and isolating damaged areas to prevent infection of healthy tissues.
  • glia scars are formed by the overproliferated reactive stellate cells, which enclose the damaged area like a net and accumulate inhibitory extracellular matrix.
  • the tight structure of these proteins acts as a barrier to physically and chemically rebuilding neuronal regeneration and connectivity.
  • An object of the present invention is to provide a pharmaceutical use for the diagnosis, prevention, or treatment of central nervous system damage, degenerative brain disease or central nervous system disease by identifying the role of FAM19A5 in the regulation of glial cell production.
  • the present invention provides a composition for regulating division or differentiation of stem cells comprising a FAM19A5 (family with sequence similarity 19, member A5) or an inhibitor thereof as a division or differentiation regulator.
  • the present invention also provides a composition for diagnosing central nervous system injury, degenerative brain disease, or central nervous system disease, including an agent for measuring mRNA or protein level of FAM19A5 (family with sequence similarity 19, member A5) gene.
  • FAM19A5 family with sequence similarity 19, member A5
  • the present invention also provides a composition for treating early traumatic brain injury comprising FAM19A5 (family with sequence similarity 19, member A5).
  • the invention also provides the use of FAM19A5 for the preparation of a pharmaceutical composition for treating early traumatic brain injury.
  • the present invention also provides a method for treating early traumatic brain injury in an animal, comprising administering to the individual a composition for treating initial traumatic brain injury comprising a pharmaceutically effective amount of FAM19A5.
  • the present invention also provides a composition for the prevention or treatment of degenerative brain disease or central nervous system disease, including an FAM19A5 (family with sequence similarity 19, member A5) inhibitor.
  • an FAM19A5 family with sequence similarity 19, member A5
  • the invention also provides the use of a FAM19A5 inhibitor for the manufacture of a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of degenerative brain disease or central nervous system disease.
  • the present invention also provides a method of treating a degenerative brain disease or central nervous system disease in an animal comprising administering to the individual a composition for the prevention or treatment of degenerative brain disease or central nervous system disease comprising a pharmaceutically effective amount of a FAM19A5 inhibitor. do.
  • the invention also relates to a brain disease or central nervous system disease comprising contacting a FAM19A5 (family with sequence similarity 19, member A5) gene with a candidate outside the body and determining whether the candidate promotes or inhibits expression of the gene. It provides a method for screening a medicament for the prophylaxis or treatment.
  • FAM19A5 family with sequence similarity 19, member A5
  • the invention also relates to a brain disease or central comprising contacting a FAM19A5 (family with sequence similarity 19, member A5) protein with a candidate outside the body, and determining whether the candidate enhances or inhibits the function or activity of the protein.
  • a method for screening a medicament for preventing or treating a nervous system disease is provided.
  • FAM19A5 a protein secreted from neural stem cells, regulates the division or differentiation of neural stem cells, and is overexpressed during cerebral spinal cord injury to promote the production of astrocytic cells, thereby recovering early damaged tissues, and specific to FAM19A5 in damaged tissues.
  • FAM19A5 By neutralizing FAM19A5 with an antibody, it is shown to inhibit the production of astrocytes, thereby providing an effect that can be used for the diagnosis, prevention or treatment of central nervous system damage, degenerative brain disease or central nervous system disease.
  • FIG. 1 shows the amino acid sequence (A) and phylogenetic tree (B) of FAM19A5 peptides expressed from the FAM19A5 gene of various vertebrates.
  • Figure 2 shows the mRNA expression of the FAM19A family gene (A) and the mRNA expression of the FAM19A family gene by the time of development (B) in various tissues of mice through reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR).
  • Figure 3 is a result of measuring the expression of FAM19A5 mRNA in the ventricular region and spinal cord of mice by time of occurrence using in situ hybridization (In situ hybridization).
  • Figure 4 shows the result of confirming the binding specificity of His-FAM19A5 specific antibody and FAM19A5 family gene using Western blotting (A) and immunohistochemistry (B).
  • FIG. 6 shows the results of measuring the expression of FAM19A5 peptide in neural stem cells and progenitor cells in the subventricular region of adult mice (A) and the expression level of FAM19A5 peptide in differentiated conditions (B).
  • A the expression of FAM19A5 peptide in neural stem cells and progenitor cells in the subventricular region of adult mice
  • B the expression level of FAM19A5 peptide in differentiated conditions
  • Figure 7 is a result of measuring the expression of FAM19A5 peptide in the neurospheres generated from the neural stem cells of the mouse through the immunocytochemistry (Immunocytochemistry).
  • FIG. 8 is a measure of the expression of FAM19A5 in neurospheres, (A) is obtained through immunocytochemistry, (B) is a result obtained by reverse transcriptase chain reaction (RT-PCR), (C ) Is the result obtained using a microarray.
  • FIG. 10 shows the results of measuring changes in FAM19A5 protein in a traumatic brain injury mouse model.
  • FIG. 11 shows the results of measuring changes in FAM19A5 protein in blood in a traumatic brain injury mouse model using immunohistochemistry and Western blotting (A) and radioimmunoassay (B).
  • FIG. 13 shows the results of measuring changes in FAM19A5 protein in atrophic lateral sclerosis model using immunohistochemistry (A), Western blotting (B) and radioimmunoassay (C).
  • FIG. 14 shows fluorescence signals in brain tissue following FAM19A5 specific antibody treatment after traumatic brain injury.
  • FIG. 15 shows the change of cell markers over time following FAM19A5 specific antibody treatment after traumatic brain injury.
  • FIG. 16 shows changes in neurons following FAM19A5-specific antibody treatment after traumatic brain injury.
  • Figure 17 shows the results of confirming the location of reactive astrocytic cells expressing FAM19A5 protein in a traumatic brain injury mouse model treated with FAM19A5-specific antibody.
  • FIG. 18 measures the change of NG2 glial progenitor cells (A) and oligodendrocytes (B) following FAM19A5-specific antibody treatment after traumatic brain injury.
  • FAM19A5 family with sequence similarity 19, member A5
  • FAM19A5 is a member of the FAM19A family of genes consisting of five highly homologous genes that encode small secreted proteins, which contain a cysteine residue conserved at a fixed position and It is associated with MIP-1 alpha, a member of the chemokine family gene.
  • the protein is mainly expressed specifically in the brain and spinal cord and is known to act as a differentiation regulator that promotes the production of astrocytes while being produced and secreted by neurogenesis and adult neural stem cells.
  • the present inventors have revealed the in vivo presence of FAM19A5 through in situ hybridization, immunohistochemistry, and differentiation from neural stem cells using immunocytochemistry through a bioinformatics approach.
  • the present invention has been completed by elucidating the role of FAM19A5 in the production of isolated cells and revealing the therapeutic use of various diseases related to the production of neurons and glial cells in vertebrates.
  • the present invention provides a composition for regulating division or differentiation of stem cells comprising FAM19A5 (family with sequence similarity 19, member A5) as a division or differentiation regulator.
  • FAM19A5 is specifically expressed in the brain of vertebrates, in particular, it is strongly distributed in the ventricular and spinal cord region, and high expression in the ventricular and subventricular regions even during prenatal pregnancy The expression is weak in the cortical plate where differentiated neurons are located. Therefore, the present invention is the first to express that FAM19A5 gene expression is strongly in two areas of the central nervous system known to be distributed in the cluster of neural stem cells, and that FAM19A5 is important for the formation of the central nervous system and is involved in the production of neurons and glial cells constituting it. Proved.
  • FAM19A5 in neurospheres occurring in neural stem cells showed that the distribution of FAM19A5 in neurospheres was much higher than in other types of family genes of FAM19A. This suggests that FAM19A5 may play an important role in the function of adult neural stem cells and embryonic neural stem cells, or in differentiation into other kinds of cells produced therefrom.
  • FAM19A5 is produced and secreted from neural stem cells and affects the production of differentiated types of cells (ie, neurons or astrocytes). As a result, FAM19A5 promotes the production of astrocytes.
  • FAM19A5 can regulate the number of neurons or astrocytes differentiated from neural stem cells through quantitative changes. That is, the number of astrocytes differentiated through quantitative increase of FAM19A5 increases and the number of neurons differentiated through quantitative decrease of FAM19A5 increases, indicating that FAM19A5 is a differentiation regulator.
  • FAM19A5 by quantitatively increasing the amount of FAM19A5 neural stem cell division is reduced, FAM19A5 by confirming that the division of neural stem cells increases through the quantitative decrease of FAM19A5, stem cell division factor It can be seen that.
  • FAM19A5 or an inhibitor thereof may be used as an agent for controlling division or differentiation of stem cells.
  • the FAM19A5 of the present invention is a secreted protein secreted from neural stem cells, and includes a gene sequence encoding a typical signal peptide at the terminal of an amino group as a signal that can be secreted out of the cell, followed by the amino acid sequence of mature FAM19A5 (FIG. 1). Reference).
  • composition for controlling the division or differentiation of stem cells of the present invention may include natural or recombinant FAM19A5, FAM19A5 protein having physiological activities substantially equivalent thereto, transgenic neural stem cells overexpressing the natural or recombinant FAM19A5, or FAM19A5 inhibitors.
  • Proteins having substantially equivalent physiological activity include native type / recombinant FAM19A5 and its functional equivalents and functional derivatives.
  • the term “functional equivalent” refers to an amino acid sequence variant in which some or all of the amino acids of the native protein are substituted, or a portion of the amino acid is deleted or added, and has substantially the same physiological activity as the native FAM19A5.
  • Functional derivative means a protein that has been modified to increase or decrease the physicochemical properties of the FAM19A5 protein and has a physiological activity substantially equivalent to that of the native type FAM19A5.
  • the FAM19A5 protein of the present invention is a protein derived from a mammal, preferably a human, a mouse, a rat, a goldfish tank, a chicken, a zebradani, a frog, a large bark, etc., for example, GenBank accession no. It refers to a protein having a sequence known as NM_134096, NM_001191991 and the like.
  • FAM19A5 used in the present invention is GenBank accession no. It may be prepared by genetic engineering methods known to those skilled in the art from NM_134096 or NM_001191991 and the like.
  • FAM19A5 by natural recombination method, it is thought that the use of mammalian cell is similar to that of the natural type in terms of protein activity or solubility than that of E. coli or insect cells. .
  • the recombinant FAM19A5 protein can be separated using a conventional column chromatography method.
  • the degree of purification of the protein can be confirmed by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE).
  • the transgenic neural stem cells overexpressing the native or recombinant FAM19A5 may be prepared by introducing a vector expressing the native or recombinant FAM19A5 into neural stem cells through a known method.
  • the FAM19A5 inhibitor may include an antisense-oligonucleotide, siRNA, shRNA, miRNA, or a vector comprising the same; Or it may be any one of antibodies.
  • Division or differentiation regulating composition of the present invention stem cells can be added in vitro (invitro) division or differentiation regulator when cultured neural stem cells from.
  • natural or recombinant FAM19A5 or an inhibitor thereof may be added to control the increase or decrease of stem cell division or the number of neurons or astrocytes through quantitative changes thereof.
  • the astrocytes are increased due to the increase in the amount of FAM19A5 protein secreted from transgenic neural stem cells and FAM19A5 protein secreted from neural stem cells. The number of can be increased.
  • composition for controlling division or differentiation of stem cells of the present invention may further include a known differentiation inducing factor for inducing differentiation of neural stem cells in addition to the FAM19A5.
  • a known differentiation inducing factor for inducing differentiation of neural stem cells in addition to the FAM19A5.
  • ciliary neurotrophic factor CNTF
  • BMPs bone morphogenetic proteins
  • TGF ⁇ transforming growth factor
  • GGF2 neuregulin-1
  • GGF2 glial growth factor-2
  • the present invention also relates to a composition for diagnosing central nervous system injury, degenerative brain disease or central nervous system disease, including an agent for measuring mRNA or protein level of FAM19A5 (family with sequence similarity 19, member A5) gene.
  • FAM19A5 family with sequence similarity 19, member A5
  • Mature stellate cells proliferate actively when the brain is injured, turn into reactive astrocytes and enlarge, resulting in faster tissue recovery and prevention of propagation from the small wound area.
  • the expression of FAM19A5 is significantly increased at the site of injury, and the radioglial cells located at the site of injury express FAM19A5 at the same time as expressing the marker Nestin, which is significantly higher than that of the uninjured control group. Increases.
  • the number of cells expressing FAM19A5 protein increases around the subventricular region where neural stem cell populations are located, and they simultaneously express GFAP, a marker of astrocytes.
  • FAM19A5 can be leaked into the blood in the state where the cerebrovascular barrier collapsed after brain injury, and FAM19A5 protein was detected as a result of the blood test for the expression of FAM19A5. This expression showed a continuous increase in the amount of expression over time after brain injury.
  • FAM19A5 can be used as a biomarker for diagnosing central nervous system damage.
  • FAM19A5-specific antibodies in reactive astrocytic cells caused by traumatic brain injury inhibits the proliferation of astrocytic cells, and the neurons survive, and in the long term, FAM19A5 is capable of objective and quantitative diagnosis of disease progression due to central nervous system damage, as it is expected to promote regeneration of the cells.
  • FAM19A5 can be used as a biomarker for diagnosing degenerative brain disease or central nervous system disease caused by central nervous system damage.
  • central nervous system injury includes any kind of central nervous system injury that causes destruction or degeneration of cerebrospinal cord cells. Examples include, but are not limited to, traumatic brain injury, amyotrophic lateral sclerosis, and the like.
  • degenerative brain disease or central nervous system disease refers to a degenerative brain disease or central nervous system disease due to glial hyperplasia resulting from damage to the central nervous system.
  • diseases include Alzheimer's disease, Huntington's disease, Parkinson's disease, stroke or brain tumors, but are not limited to certain kinds of diseases.
  • diagnosis refers to confirming a pathological condition.
  • diagnosis may be performed by confirming the expression of a central nervous system injury, a degenerative brain disease, or a central nervous system disease diagnostic marker. Or it means to check whether the development of the central nervous system disease, development and alleviation.
  • diagnosis marker refers to a substance that can distinguish the cells of central nervous system damage, degenerative brain disease or central nervous system disease from normal cells, and diagnoses central nervous system damage and degenerative brain disease, compared to normal cells.
  • organic biomolecules such as polypeptides or nucleic acids (eg, mRNA, etc.), lipids, glycolipids, glycoproteins, sugars (monosaccharides, disaccharides, oligosaccharides, etc.) and the like that increase or decrease in cells of central nervous system diseases.
  • the marker for diagnosing central nervous system injury, degenerative brain disease or central nervous system disease provided by the present invention may be a protein expressed from the FAM19A5 gene in which the amount of expression is increased in cells of central nervous system injury, degenerative brain disease or central nervous system disease compared to normal cells. have.
  • composition for diagnosing central nervous system injury, degenerative brain disease or central nervous system disease of the present invention includes an agent for measuring the expression level of the mRNA of the FAM19A5 gene or the amount of the protein expressed from the gene, and the sequence complementary to the FAM19A5 mRNA with such an agent.
  • Oligonucleotides such as primers or nucleic acid probes that specifically bind to FAM19A5 mRNA, or antibodies specific for the FAM19A5 protein.
  • primer By primer is meant a single-stranded oligonucleotide capable of acting as a starting point for template-directed DNA synthesis under suitable conditions and in suitable buffers (ie four different nucleoside triphosphates and polymerases). . Suitable lengths of primers can vary depending on various factors, such as temperature and the use of the primer. In addition, the sequence of the primer need not have a sequence that is completely complementary to some sequences of the template, it is sufficient to have sufficient complementarity within the range that can hybridize with the template to perform the primer-specific action.
  • the primer in the present invention does not need to have a sequence that is perfectly complementary to the nucleotide sequence of the gene that is a template, and it is sufficient to have sufficient complementarity within a range capable of hybridizing to the gene sequence and acting as a primer.
  • the primer according to the present invention may be used for gene amplification reactions.
  • the amplification reaction refers to an amplification reaction of a nucleic acid molecule, and the amplification reactions of such genes are well known in the art, for example, polymerase chain reaction (PCR), reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR), and Liga.
  • PCR polymerase chain reaction
  • RT-PCR reverse transcriptase polymerase chain reaction
  • Liga Liga
  • Aze chain reaction LCR
  • TMA electron mediated amplification
  • NASBA nucleic acid sequence substrate amplification
  • the nucleic acid probe refers to a linear oligomer of natural or modified monomers or linkages, includes deoxyribonucleotides and ribonucleotides, and can specifically hybridize to a target nucleotide sequence, which is either naturally present or artificially synthesized. Say what has been done.
  • the probe according to the invention may be single chain, preferably oligodioxyribonucleotides. Probes of the invention can include natural dNMPs (ie, dAMP, dGMP, dCMP and dTMP), nucleotide analogues or derivatives. In addition, the probes of the present invention may also comprise ribonucleotides.
  • the probes of the present invention can be used for backbone modified nucleotides such as peptide nucleic acids (PNA) (M. Egholm et al., Nature , 365: 566-568 (1993)), phosphorothioate DNA, phosphorodithioate DNA , Phosphoramidate DNA, amide-linked DNA, MMI-linked DNA, 2'-0-methyl RNA, alpha-DNA and methylphosphonate DNA, sugar modified nucleotides such as 2'-0-methyl RNA, 2 '-Fluoro RNA, 2'-amino RNA, 2'-O- alkyl DNA, 2'-O-allyl DNA, 2'-O-alkynyl DNA, hexose DNA, pyranosyl RNA and anhydrohexitol DNA, and nucleotides with base modifications such as C-5 substituted pyrimidines (substituents are fluoro-, bromo-, chloride,
  • polyclonal antibodies As the antibody specific for FAM19A5, polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, human antibodies and humanized antibodies can be used.
  • antibody fragments include Fab, Fab ', F (ab') 2 and Fv fragments; Diabody; Linear antibodies (Zapata et al., Protein Eng. 8 (10): 1057-1062 (1995)); single chain antibody molecules; And multispecific antibodies formed from antibody fragments and the like.
  • Fv is a minimal antibody fragment comprising a complete antigen recognition and binding site. This site consists of a dimer of one heavy chain and one light chain variable region and is tightly coupled non-covalently.
  • Polyclonal antibodies can be prepared by injecting the mammal with one or more immunizing agents, if necessary, with an adjuvant. Typically, the immunizing agent and / or adjuvant is injected into the mammal several times by subcutaneous injection or intraperitoneal injection.
  • the immunizing agent may be a protein of the invention or a fusion protein thereof. Injecting an immunizing agent with a protein known to be immunogenic in the mammal being immunized can be effective.
  • Monoclonal antibodies according to the invention can be prepared by the hybridoma method described in Kohler et al., Nature , 256: 495 (1975), or by recombinant DNA methods (e.g., U.S. Patent 4,816,576). Reference). Monoclonal antibodies are also described, for example, in Clackson et al., Nature , 352: 624-628 (1991) and Marks et al., J. Mol . Biol ., 222: 581-597 (1991). It can be isolated from phage antibody libraries using the techniques described.
  • Monoclonal antibodies in the present invention are specifically those in which a portion of the heavy and / or light chain is identical to the corresponding sequence of an antibody derived from a particular species or an antibody belonging to a particular antibody class or subclass, provided that it exerts the desired activity or Although homologous, the remainder of the chain (s) includes "chimeric" antibodies that are identical or homologous to antibodies from other species or to antibodies belonging to different antibody classes or subclasses or fragments of such antibodies (Morrison et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)).
  • “Humanized” forms of non-human (eg murine) antibodies include chimeric immunoglobulins, immunoglobulin chains or fragments thereof, including minimal sequences derived from non-human immunoglobulins (eg, Fv, Fab, Fab ', F (ab') 2 or other antigen binding sequence of the antibody.
  • humanized antibodies are human immunoglobulins in which residues in the complementarity determining regions (CDRs) of the recipient are replaced by CDR residues of species other than humans (donor antibodies) such as mice, rats or rabbits with the desired specificity, affinity and ability. (Receptor antibody).
  • CDRs complementarity determining regions
  • Humanized antibodies may also include residues that are not found in the recipient antibody or in the CDR or framework sequences to be introduced.
  • humanized antibodies comprise substantially all of one or more, generally two or more variable domains, wherein all or substantially all CDR regions correspond to regions of non-human immunoglobulins, and all or substantially all FR regions Corresponds to the region of human immunoglobulin sequence.
  • Humanized antibodies also include at least a portion of an immunoglobulin constant region (Fc), generally a portion of a human immunoglobulin region (Presta, Curr . Op . Struct . Biol . 2: 593-596 (1992)).
  • composition for diagnosing central nervous system injury, degenerative brain disease or central nervous system disease of the present invention may be included in the form of a kit.
  • the kit may comprise primers, probes or antibodies capable of measuring the expression level or amount of protein of the FAM19A5 gene, the definitions of which are as described above.
  • kits necessary for PCR amplification such as buffers, DNA polymerases (eg, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis , Thermis flavus , Thermococcus literalis or Thermally stable DNA polymerases obtained from Pyrococcus furiosus (Pfu), DNA polymerase cofactors and dNTPs, and when the kits are subjected to an immunoassay, the kits of the invention may optionally contain secondary antibodies and labels It may include a substrate. Furthermore, the kits according to the invention can be produced in a number of separate packaging or compartments comprising the reagent components described above.
  • DNA polymerases eg, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis , Thermis flavus , Thermococcus literalis or Thermally stable DNA polymerases obtained from Pyrococcus furiosus (Pfu), DNA
  • composition for diagnosing central nervous system injury, degenerative brain disease or central nervous system disease of the present invention may be included in the form of a microarray.
  • a primer, probe or antibody capable of measuring the expression level of the FAM19A5 protein or gene encoding the same is used as a hybridizable array element and immobilized on a substrate.
  • Preferred substrates may include suitable rigid or semi-rigid supports, such as membranes, filters, chips, slides, wafers, fibers, magnetic beads or nonmagnetic beads, gels, tubing, plates, polymers, microparticles and capillaries. have.
  • the hybridization array element is arranged and immobilized on the substrate, and such immobilization can be performed by a chemical bonding method or a covalent binding method such as UV.
  • the hybridization array element can be bonded to a glass surface modified to include an epoxy compound or an aldehyde group, and can also be bonded by UV at the polylysine coating surface.
  • the hybridization array element can be coupled to the substrate via a linker (eg, ethylene glycol oligomer and diamine).
  • the sample applied to the microarray of the present invention is a nucleic acid
  • it can be hybridized with the array element on the microarray.
  • Hybridization conditions may vary, and detection and analysis of the degree of hybridization may vary depending on the labeling substance.
  • the present invention provides a method for diagnosing central nervous system damage, degenerative brain disease or central nervous system disease through a method of measuring the expression level of the FAM19A5 gene or its expression protein level, and more specifically, the method (a Measuring the expression level of FAM19A5 gene or the amount of the expressed protein from a biological sample of a suspected central nervous system injury, degenerative brain disease or central nervous system disease; And (b) measuring the expression level of the gene or the amount of the expressed protein thereof from a normal control sample and comparing the result with the measurement result of step (a).
  • the method of measuring the expression level of the gene or the amount of protein in the above may be carried out including a known process for separating mRNA or protein from a biological sample using a known technique.
  • the biological sample refers to a sample obtained from a living body in which the expression level of the gene or the protein level is different from the normal control group according to the central nervous system damage, degenerative brain disease, or the central nervous system disease occurrence or progression, and examples of the sample include, for example, For example, but not limited to, tissue, cells, blood, serum, plasma, saliva and urine and the like can be included.
  • the expression level of the gene is preferably to measure the level of mRNA, the method for measuring the level of mRNA reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), real-time reverse transcription polymerase chain reaction, RNase protection assay, Northern Blots and DNA chips, etc., but is not limited thereto.
  • the protein level can be measured using an antibody, in which case the FAM19A5 protein in the biological sample and the antibody specific to it form a binding, i.e., an antigen-antibody complex, and the amount of antigen-antibody complex formed by the detection label ( Quantitative measurements can be made through the magnitude of the signal in the detection label.
  • the detection label may be selected from the group consisting of enzymes, fluorescent materials, ligands, luminescent materials, microparticles, redox molecules, and radioisotopes, but is not limited thereto.
  • Analytical methods for measuring protein levels include, but are not limited to, Western blot, ELISA, radioimmunoassay, radioimmunoassay, oukteroni immunodiffusion, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, immunoprecipitation assay, Complement fixation assays, FACS, protein chips, and the like.
  • the present invention through the above-described detection method, the amount of mRNA expression or protein of the control group and patients with central nervous system injury, degenerative brain disease or central nervous system disease, or patients with central nervous system injury, degenerative brain disease or central nervous system disease
  • the amount of mRNA expression or amount of protein can be confirmed, and the degree of expression can be compared with a control group to diagnose whether the central nervous system damage, degenerative brain disease or the central nervous system disease, and progression stage.
  • the diagnostic method of the central nervous system damage, degenerative brain disease or central nervous system diseases according to the present invention the central nervous system damage when the expression level of the FAM19A5 gene or the amount of the expressed protein thereof is increased compared to a normal control sample, Degenerative brain disease or central nervous system disease may be caused.
  • the present invention also relates to a composition for treating early traumatic brain injury, comprising FAM19A5 (family with sequence similarity 19, member A5).
  • the invention also provides the use of FAM19A5 for the preparation of a pharmaceutical composition for treating early traumatic brain injury.
  • FAM19A5 produced by neural stem cells is involved in the production of astrocytic cells rather than neural cells, thereby promoting the production of astrocytic cells in the area of brain injury, thereby treating early brain damage, and inhibiting the progression of brain injury diseases.
  • FAM19A5 can be used as a treatment for early traumatic brain injury.
  • the initial traumatic brain injury treatment composition of the present invention is a natural or recombinant FAM19A5 protein, FAM19A5 protein having a substantially equivalent physiological activity, transformed neural stem cells overexpressing the FAM19A5 protein or stellate cells differentiated from the neural stem cells At least one of which is defined as described above.
  • the native or recombinant FAM19A5 protein, or FAM19A5 protein having a physiological activity substantially equivalent thereto promotes the production of astrocytic cells at the site of brain injury, thereby providing an initial traumatic condition.
  • the cells are administered by themselves to secrete the FAM19A5 protein at the site of brain injury, thereby promoting the generation of astrocytes or promoting the differentiation of the transformed neural stem cells into astrocytes.
  • differentiation inducing factors may be administered in parallel to promote differentiation of the transformed neural stem cells. The type of differentiation inducing factor is as described above.
  • astrocytic cells differentiated from the neural stem cells it is possible to treat early traumatic brain injury by administering the cells themselves so that a large amount of astrocytic cells are present at the site of brain injury.
  • the present invention also provides a method for treating an early traumatic brain injury in an animal comprising administering to the individual a composition for treating an initial traumatic brain injury comprising a pharmaceutically effective amount of FAM19A5.
  • the individual who can administer the composition for treating the initial traumatic brain injury includes all animals.
  • it may be an animal except a human such as a dog, a cat, and a mouse.
  • the present invention also relates to a composition for the prophylaxis or treatment of degenerative brain disease or central nervous system disease comprising an FAM19A5 (family with sequence similarity 19, member A5) inhibitor.
  • FAM19A5 family with sequence similarity 19, member A5
  • the invention also provides the use of a FAM19A5 inhibitor for the manufacture of a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of degenerative brain disease or central nervous system disease.
  • FMA19A5 promotes the production of astrocytic cells, a type of glial cells, the number of reactive astrocytes caused by FAM19A5 inhibition by inhibiting the expression of mRNA or protein of FMA19A5 in degenerative brain diseases or central nervous system diseases in which the glial cells are expressed in large quantities. It can be used for the treatment of degenerative brain disease or central nervous system disease by promoting the reduction and proliferation of progenitor cells expressing NG2 (neuron-glial antigen 2) to myelinating the axons of nerve cells around the brain injury site.
  • NG2 neurogen-glial antigen 2
  • composition for preventing or treating degenerative brain disease or central nervous system disease of the present invention may include an agent that reduces the mRNA expression of the FAM19A5 gene or the protein thereof, or decreases the function or activity.
  • the FAM19A5 protein inhibitor may be a peptide or a compound that binds to the FAM19A5 protein and modulates a signal of a neural differentiation pathway.
  • Such inhibitors may be selected through screening methods exemplified below, such as protein structure analysis, and may be designed using methods known in the art.
  • protein inhibitor may be used polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, human antibodies and humanized antibodies to the FAM19A5 protein, the definition of the antibody is as described above.
  • the antibody may be used to prevent or treat degenerative brain diseases or central nervous system diseases by regulating signal transduction of neuronal differentiation pathways of intracellular receptors.
  • the function or activity inhibitor of the FAM19A5 protein of the present invention may be delivered using liposomes, viruses, gene guns, polymers, ultrasound, electric shock, but is not particularly limited thereto.
  • the FAM19A5 gene may be DNA encoding them or mRNA transcribed therefrom.
  • the inhibitor for the gene may be an inhibitor that binds to the gene itself to interfere with transcription or binds to mRNA transcribed from the gene and interferes with the translation of the mRNA.
  • the inhibitor of the FAM19A5 gene includes all inhibitors that inhibit the expression of the FAM19A5 gene.
  • such inhibitor may be a peptide, nucleic acid or compound that binds to the gene.
  • Such inhibitors may be selected through screening methods exemplified below, such as cell based screening, and may be designed using methods known in the art.
  • the inhibitor may be an antisense-oligonucleotide, siRNA, shRNA, miRNA or a vector comprising the FAM19A5 gene.
  • antisense-oligonucleotides, siRNAs, shRNAs, miRNAs or vectors comprising them can be produced using methods known in the art.
  • RNA refers to a double-chain RNA that induces RNA interference through cleavage of mRNA of a target gene, and an RNA strand of a sense sequence having the same sequence as the mRNA of the target gene and an antisense having a complementary sequence thereto. It consists of the RNA strand of the sequence.
  • the siRNA may include a form expressed by inserting the siRNA itself or a base sequence encoding the siRNA synthesized in vitro into the expression vector.
  • the "vector” refers to a gene construct comprising an external DNA inserted into the genome encoding the polypeptide.
  • a vector related to the present invention is a vector in which the nucleic acid sequence that inhibits the gene is inserted into the genome, and examples of the vector include a DNA vector, a plasmid vector, a cosmid vector, a bacteriophage vector, a yeast vector, or a viral vector.
  • the antisense has a sequence complementary to all or part of the mRNA sequence transcribed from the FAM19A5 gene or fragment thereof, and can bind to the mRNA to inhibit the expression of the FAM19A5 gene or fragment.
  • shRNAi short hairpin RNAi
  • shRNAi short hairpin RNAi
  • composition for the prevention or treatment of degenerative brain disease or central nervous system diseases of the present invention may further comprise embryonic neuronal stem cells or adult neuronal stem cells with FAM19A5 inhibitor.
  • FAM19A5 inhibitors can further improve the treatment of degenerative brain diseases or central nervous system diseases by promoting the production of neurons to help tissue recovery by regulating the division or differentiation of neural stem cells used together.
  • the present invention also provides a method of treating a degenerative brain disease or a central nervous system disease in an animal comprising administering to the subject a composition for the prevention or treatment of a degenerative brain disease or a central nervous system disease comprising a pharmaceutically effective amount of a FAM19A5 inhibitor. .
  • the individual who can administer the pharmaceutical composition for preventing or treating the degenerative brain disease or central nervous system disease includes all animals.
  • composition of the present invention may further include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Such pharmaceutically acceptable carriers include carriers and vehicles commonly used in the medical arts, and specifically include ion exchange resins, alumina, aluminum stearate, lecithin, serum proteins (eg, human serum albumin), buffer materials (eg, Phosphates, glycine, sorbic acid, potassium sorbate, partial glyceride mixtures of saturated vegetable fatty acids), water, salts or electrolytes (e.g. Silica, magnesium trisilicate, polyvinylpyrrolidone, cellulose based substrates, polyethylene glycols, sodium carboxymethylcellulose, polyarylates, waxes, polyethylene glycols or wool, and the like.
  • ion exchange resins e.g., ion exchange resins, alumina, aluminum stearate, lecithin, serum proteins (eg, human serum albumin), buffer materials (eg, Phosphates, glycine, sorbic acid, potassium sorbate, partial glyceride mixtures of saturated vegetable fatty acids), water
  • composition of the present invention may further include a lubricant, a humectant, an emulsifier, a suspending agent, or a preservative in addition to the above components.
  • the composition according to the invention may be prepared in an aqueous solution for parenteral administration, preferably a buffered solution such as Hanks' solution, Ringer's solution or physically buffered saline. Can be used.
  • Aqueous injection suspensions can be added with a substrate that can increase the viscosity of the suspension, such as sodium carboxymethylcellulose, sorbitol or dextran.
  • compositions of the present invention may be administered systemically or topically and may be formulated in suitable formulations by known techniques for such administration.
  • oral administration it can be administered by mixing with an inert diluent or an edible carrier, sealed in hard or soft gelatin capsules, or pressed into tablets.
  • the active compounds can be mixed with excipients and used in the form of intake tablets, buccal tablets, troches, capsules, elixirs, suspensions, syrups, wafers and the like.
  • FAM19A5 is well soluble in saline or buffer, so it is stored in a freeze-dried state, and then formulated in solution immediately before administration to saline or buffer in an effective amount of FAM19A5 in a form suitable for intravenous, subcutaneous, intramuscular, intraperitoneal, transdermal administration, etc. It can also be administered.
  • An effective amount of the active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention means an amount required to achieve the effect of preventing, suppressing or alleviating the disease.
  • the type of disease the severity of the disease, the type and amount of the active and other ingredients contained in the composition, the type of formulation and the age, weight, general health, sex and diet, sex and diet, time of administration, route of administration and composition of the patient. It can be adjusted according to various factors including the rate of secretion, the duration of treatment, and the drug used concurrently.
  • the inhibitor of the present invention when administered once or several times a day, is administered once or several times a day, when the compound is 0.1ng / kg to 10g / kg, a polypeptide, In the case of protein or antibody, 0.1ng / kg ⁇ 10g / kg, antisense-oligonucleotide, siRNA, shRNAi, miRNA can be administered at a dose of 0.01ng / kg ⁇ 10g / kg.
  • the invention also relates to a brain disease or central nervous system disease comprising contacting a FAM19A5 (family with sequence similarity 19, member A5) gene with a candidate outside the body and determining whether the candidate promotes or inhibits expression of the gene. It provides a method for screening a medicament for the prophylaxis or treatment.
  • FAM19A5 family with sequence similarity 19, member A5
  • the present invention provides a brain disease comprising contacting the FAM19A5 (family with sequence similarity 19, member A5) protein with a candidate outside the body, and determining whether the candidate enhances or inhibits the function or activity of the protein.
  • a method for screening a medicament for preventing or treating central nervous system diseases comprising contacting the FAM19A5 (family with sequence similarity 19, member A5) protein with a candidate outside the body, and determining whether the candidate enhances or inhibits the function or activity of the protein.
  • a candidate substance to be analyzed may be first contacted with a brain disease or central nervous system disease cell including the gene or protein.
  • the candidate substance is assumed to have a potential as a medicament that promotes or inhibits the function or activity of the FAM19A5 protein or a substance that promotes or inhibits the transcription and translation of the mRNA and the protein in the FAM19A5 gene sequence according to a conventional selection method, or Random nucleic acids, proteins, peptides, other extracts or natural products, compounds, and the like.
  • the expression level of the gene, the amount of the protein or the activity of the protein can be measured in the cells treated with the candidate, and as a result of the increase, the expression amount of the gene, the amount of the protein or the activity of the protein is increased or decreased.
  • the candidate substance may be determined as a substance capable of treating or preventing a brain disease or a central nervous system disease.
  • the method of measuring the expression amount of the gene, the amount of the protein or the activity of the protein in the above may be carried out through a variety of methods known in the art, for example, but not limited to reverse transcriptase polymerase chain reaction (reverse transcriptase-polymerase chain reaction, real time-polymerase chain reaction, western blot, northern blot, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion And immunoprecipitation assays.
  • reverse transcriptase polymerase chain reaction reverse transcriptase-polymerase chain reaction
  • real time-polymerase chain reaction western blot
  • western blot western blot
  • northern blot enzyme linked immunosorbent assay
  • ELISA enzyme linked immunosorbent assay
  • RIA radioimmunoassay
  • radioimmunodiffusion And immunoprecipitation assays radioimmunodiffusion And immunoprecipitation assays
  • Such candidate drugs for treating degenerative brain diseases or central nervous system diseases will act as leading compounds in the development of drugs for treating degenerative brain diseases or central nervous system diseases, and the leading substances will function as the FAM19A5 gene or the protein expressed therefrom.
  • new therapeutic agents for degenerative brain diseases or central nervous system diseases can be developed.
  • FAM19A5 was made possible through a bioinformatics approach model.
  • the present inventors have found an open reading frame of about 50,000 human genomes from Ensemble (http://www.ensembl.org/index.html) and UniprotKB ( http://www.uniprot.org/uniprot ). Download ORF).
  • about 2,000 kinds of secretomes, which are likely to be secreted from cells, were selected using the SignalP3.0 program to identify molecules with potential as bioactive peptides.
  • FAM19A5 is a signal that can be secreted to the outside of a cell and contains a gene sequence encoding a typical signal peptide at the terminal of an amino group, followed by the amino acid sequence of mature FAM19A5.
  • the amino acid sequence of the FAM19A5 protein was very well preserved between species (FIG. 1A).
  • Such comparative genomic analysis is recognized as a reliable experimental model that can verify whether a newly discovered new gene has a substantial function [Robbins, J Comput Biol 3: 465-478,1996].
  • the CC-chemokine gene is expressed in Alzheimer's Disease brain and the mechanism that MIP-1 ⁇ , which is a CC-chemokine family gene, proliferates glial cells to aggravate degenerative brain disease, but the FAM19A family gene is CC. It can be confirmed through the phylogenetic tree to form a unique branch that is radically different from the -chemokine family gene (Fig. 1B) [MengQi Dia et al. , American Journal of Pathology, 1998].
  • mice Six-week old black male mice (C57BL / 6, mouse) were purchased from Daehan Biolink ( http://www.dhbiolink.com ). The mice purchased were housed in rat cages with adequate feed and water, maintained at 20-24 ° C, and 40-70% humidity. The wild-type mice were also stored in a 12/12 Light / Dark cycle with a light initiation of 8:00 am and a light off of 8:00 pm. All experiments were designed to use the fewest number of mice and anesthesia was performed according to experimental animal ethics to minimize the pain of mice used in the experiments, which was proved by the Animal Care and Use Committee of Korea University (Animal Care and Use Committee of the Korea University, KUIACUC-08).
  • RNA distribution of mouse tissue was observed. Primer information used for PCR is listed in Table 1.
  • FAM19A family genes in the cerebral cortex during development, we compared mRNA levels using in situ hybridization. Brains were obtained from the skull by decapitation from the 14 days of gestation (Embryonic day, E14) before birth and 21 days after delivery (Postnatal day, P21). Prenatal rats were used to compare the expression of FAM19A5 genes by time of development, since rats are easier to handle because of their larger body size than other experimental mice.
  • the removed brain was transferred and frozen in isopentane solution kept cold on dry ice.
  • a thin section of frozen brain tissue was sliced to 12 ⁇ m and attached to slide glass coated with TESPA (sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) (phosphate containing 4% paraformaldehyde). It was fixed in phosphate buffered saline (PBS) solution. Then, acetylated with 0.1 M triethanolamine / 0.9% NaCl (pH 8.0) solution containing 0.25% acetic anhydride, and then dehydrated using ethanol and chloroform solution. It was degreased and dried in air. On the other hand, the fragmented tissues were hybridized at 55 ° C.
  • RNAs were extracted from the cerebral cortex of adult mice for the generation of probes, and then c-NA was prepared using a random hexamer as reverse transcriptase and a primer, followed by T-vector ( Cloning to Promega, Madison, WI, USA).
  • the information of the primers used for PCR is listed in Table 2.
  • An in vitro transcription system (Promega, Madison, Wis., USA) was carried out with the cloned T-vector as a template in the presence of [ 35 S] UTP (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA). Antisense riboprobes were purified and used for this heterologous reaction.
  • the segmentation scheme of the mouse brain consists of a total coronal and sagittal plane from the anterior (stretch) with the olfactory bulb to the caudal with the cerebellum. Screened through.
  • FAM19A5 mRNA was strongly distributed in the ventricular zone and the spinal cord during expression of the mRNA of the FAM19A family gene.
  • E14 14th day of pregnancy
  • E16 16th day
  • E18 18th gestation
  • FAM19A5 gene expression in two regions of the central nervous system known as the distribution of neural stem cells, is the first to demonstrate that FAM19A5 protein is important for the formation of the complete central nervous system and is involved in the production of neurons and glial cells that constitute it. It is.
  • Polyclonal antibodies were obtained by inoculating rabbits with short synthetic FAM19A5 to produce antibodies specifically recognizing the FAM19A5 protein.
  • the N-glicosidase F treated 20kDa band, which is a mature protein of FAM19A5 disappeared it was confirmed that the N-glycosylated form (Fig. 4B).
  • Fig. 4C it was observed by immunocytochemistry that each antibody specifically recognized HEK293T cells expressing His-linked FAM19A5
  • Anti-FAM19A5 polyclonal antibody prepared in Example 4 was used as an antibody capable of reacting with FAM19A5 protein in order to confirm the expression site and intensity of FAM19A5 protein in the brain of the mouse.
  • the brain tissues of the stored mice were cut into 40 ⁇ m using a cryostat microtome, and the brain tissue sections were washed in PBS solution for 30 minutes and PBS-T solution containing 10% goat serum (10% TritonX- 100 was contained in a phosphate buffered saline solution) for 1 hour blocking.
  • the ratio of FAM19A5 antibody: blocking solution was 1: 500 in order to avoid surrounding nonspecific antigen-antibody reactions in the fluorescence image and to more accurately distinguish FAM19A5 specific expression sites.
  • the reaction between the FAM19A5 antibody and the antigen was carried out overnight at 4 ° C or at room temperature (25 ° C) for about 3 hours.
  • the brain tissue sections were washed three times for 10 minutes with phosphate-buffered saline, and then diluted with anti-rabbit IgG (Invitrogen, USA) conjugated with FITC at a ratio of 1: 500. Used.
  • the brain tissue sections were washed three times for 10 minutes with phosphate buffered saline, and the tissues were mounted flat on the slide glass.
  • a sample was prepared by covering a cover glass by applying a crystal / mount solution (Biomeda, USA) on the tissue. Fluorescence images of the prepared specimens were obtained by confocal microscopy (Zeiss LSM 510 confocal microscopy).
  • Neural stem cells or neural progenitor cells contain an intermediate filament protein called nestin, which is used as a marker (Lendahl et al., Cell 60: 585-595,1990).
  • nestin an intermediate filament protein
  • neuronal platelets were already expressed before neural tube formation (Woodbury et al., J Neurosci Res 61: 364-370, 2000).
  • the microtubule-binding protein, doublecortin, DCX was present and used as marker.
  • Nestin and DCX were used as a secondary antibody by diluting CY3 conjugated anti-mouse goat goat (Invitrogen, USA) at a ratio of 1: 500.
  • FAM19A5 protein was strongly expressed in the ventricular region at the protein level as in the experimental results using the in situ hybridization method.
  • FAM19A5 peptide was expressed mainly in the ventricular region at 12 days of gestation (E12), the period of predominantly dividing progenitor cells in the ventricular region, and its expression was still high at 14 days (E14) and 18 days (E18). see.
  • the amount of expression in the cortical plate was lower as in the in situ binding method.
  • FAM19A5 protein appeared in the form of a dot in the progenitor cells containing nestin and weak expression in neuroblasts containing DCX.
  • Some genes may have different levels of protein expression and mRNA expression following post-transcriptional or post-translational processes (Wellington et al., Lab Invest 82: 273-283,2002). .
  • Example 5 show the identification, expression location, and expression level or expression level of FAM19A5 protein in the brain tissue during development.FAM19A5 is expressed in neural stem cells that form the central nervous system and generates neurons. And glial cell production.
  • FAM19A5 protein The expression site and intensity of FAM19A5 protein were confirmed by immunohistochemistry in the brains of adult mice as in prenatal mice.
  • mice administered by the above method were subjected to abdominal anesthesia with urethane 0.5cc / 100 g, incised to the left atrium (left cardiac ventricle) by inserting a ringer needle into the 200% 0.9% saline solution.
  • the blood was drained and then fixed by perfusion with 0.9% saline containing 200 mL of 4% paraformaldehyde.
  • the brains of the fixed rats were extracted, and then fixed with phosphate buffered saline containing 4% paraformaldehyde for 24 to 48 hours, and treated with phosphate buffered saline containing 30% sugar for about 24 hours.
  • the brain tissue mold (mold) was then placed in the OCT compound containing 30% of the sugar solution was frozen on dry ice and stored at -80 °C until used.
  • FAM19A5 antibody was used to confirm the expression site and intensity of FAM19A5 protein through immunohistochemistry in the brains of adult mice as in prenatal mice.
  • the ventricular and astrocytes which are adult neural stem cells, contain an intermediate fibrillar protein called glial fibrillary acidic protein (GFAP, Invitrogen, USA).
  • GFAP glial fibrillary acidic protein
  • the expression level of FAM19A5 was high in the subventricular zone (SVZ), in which adult neural stem cell populations were known to be distributed.
  • SVZ subventricular zone
  • FAM19A5 is higher in neural stem cells than in neuroblasts.
  • SVZ neuroblasts migrate to the olfactory bulb (OB) via a rostral migratory stream and eventually differentiate into mature interneurons.
  • FAM19A5 appears to have higher expression in SVZ-RMS than OB, suggesting that the amount of protein decreases during differentiation (FIG. 6B).
  • neural stem cells The technology for continually proliferating neural stem cells has been improved to produce cell masses that arise from neural stem cells called neurospheres. This technique has been made available for a variety of experiments and is being used as a useful experimental model to trace back the characteristics of neural stem cells [Reynolds and Weiss, Science 255: 1707-1710,1992; Reynolds and Weiss, Dev Biol 275: 1-13,1996.
  • Brain matrices were used to extract brains from male mice aged 3 to 8 weeks to obtain adult neural stem cells and to isolate subventricular zones in which adult neural stem cell populations are known.
  • Protease enzymes such as Dispase (Invitrogen, USA) and papain (Worthington, USA) dissociate from tissue into single cells, epidermal growth factor (EGF, Invitrogen) and fibroblast growth factor (basic fibroblast growth factor) Growth factors such as bFGF, Invitrogen) are added to the culture medium to selectively grow cells to form neurospheres.
  • the cerebral cortex can be isolated from the brains of mice on the 12th day of gestation (Embryonic day, E12).
  • Neurospheres consisting of adult neural stem cells and embryonic neural stem cells were fixed to a culture plate using laminin (Invitrogen, USA), a cell adhesion protein, and immunocytochemistry was used to determine the expression of FAM19A5 protein.
  • the solution was fixed with phosphate buffered saline containing 4% paraformaldehyde for 15 minutes and permeabilzated with PBS-T solution (0.5% TritonX-100 in phosphate buffered saline) for 5 minutes. After blocking for 30 minutes, antigen-antibody reactions were performed and dapi staining was used to observe the nuclei.
  • FAM19A5 protein is expressed in most neurospheres, which are secretory proteins and thus stained in the form of dots in the cytoplasm (FIG. 7).
  • neurospheres were co-stained with markers of various neural stem cells.
  • FAM19A5 protein expressing FAM19A5 protein simultaneously expressed nestin (FIG. 8A). This suggests that neurospheres from neural stem cells are a good experimental model for studying a substance called FAM19A5.
  • RNAs were extracted from neurons derived from adult neural stem cells, and cDNA was prepared using reverse transcriptase and random hexamers. Then, PCR was performed using the primers to see the distribution of FAM19A5 mRNA in neurospheres. Information on the primers used for PCR is listed in Table 1.
  • FAM19A5 mRNA in the FAM19A family was significantly more distributed than the rest of the type.
  • FAM19A family genes were compared using reverse transcription polymerase chain reaction followed by microarray method.
  • the heterologous reaction of cDNA and labeled cRNA production with Affymetrix MOE430 v2.0 GeneChip (46k probe-sets) was performed according to the basic protocol provided by Affymetrix (www.affymetrix.com).
  • Affymetrix www.affymetrix.com
  • fluorescent labeling was used for cDNA synthesis and ChipInspector software (Genomatix) was used for statistical analysis of expression levels.
  • FAM19A5 gene was significantly higher than that of other types of genes, similar to the results shown in the reverse transcriptase polymerase chain reaction. Also, normalized levels range from 4 to 14, which suggests that FAM19A5 is a gene with strong expression in neurospheres, given that there are not many gene distributions above 10.
  • FAM19A5 may act as an important substance in the function of adult neural stem cells and embryonic neural stem cells or in differentiation into other kinds of cells produced therefrom.
  • FAM19A5 Specific antibodies to FAM19A5 were used to determine whether FAM19A5 protein is produced and secreted from neural stem cells and affects the generation of differentiated cell types.
  • Neurospheres were dissociated into single cells using Accutase (Innovative Cell Technologies, USA) for differentiation experiments. In order to stabilize and stabilize 50000 cells in each well of a 24-well plate, the cells were placed in a culture medium containing growth factors for one day, and then changed into differentiation cultures containing factors that promote differentiation the next day. Induction of differentiation for 6 days was performed daily with 500ng / mL of FAM19A5 antibody. Immunocytochemistry and western blot were performed using markers that label three types of neuronal cells, neurons, astrocytes, and oligodendrocytes.
  • the experimental group using the antibody that induces neutralization of the FAM19A5 protein had a two-fold increase in the number of neurons labeled with Tuj1 compared to the control group treated with Normal Rb IgG and correspondingly the GFAP.
  • the number of astrocytes labeled with (Glial fibrillary acidic protein) appeared to decrease.
  • the FAM19A5 protein may act as a functional molecule in the process of differentiation from stem cells to other cell types, and in particular, may be involved in promoting the production of astrocytes.
  • FAM19A5 Peptides and specific antibodies against FAM19A5 were used to determine whether FAM19A5 protein is produced and secreted from neural stem cells.
  • Neurospheres were dissociated into single cells for division experiments. 50000 cells were placed in each well of a 24 well plate and the culture medium containing growth factors was treated with peptides or antibodies. Growth factors were used to induce cleavage for 6 days and simultaneously treated with FAM19A5 peptide and specific antibodies at 500 ng / mL. Neurospheres formed on the last day were dissociated into single cells and cell number was measured.
  • the division of neural stem cells was significantly reduced by FAM19A5 peptide compared to the control group, and when the specific antibody was treated, the division was increased.
  • the traumatic brain injury model was used to determine if the amount of FAM19A5 protein changes after brain injury. After fixing the head of 8-week-old mice, the iron rod, which was sufficiently cooled by liquid nitrogen, was placed on the right side of the skull for 1 minute. Through surgery, the skin of the mice was sutured again and maintained for 7 days in the same manner as normal mice (Moon et al., Neuro report 22: 304-308).
  • FIG. 11A it was observed that the cells expressing FAM19A5 protein were significantly increased at the injury site (Penumbra), and the radioglial cells located at the injury site expressed FAM19A5 at the same time as expressing the marker Nestin and were not injured. It can be seen that the number increased significantly compared to the control.
  • the number of cells expressing FAM19A5 protein increased around the subventricular region where neural stem cell populations were located, and they simultaneously expressed GFAP, a marker of astrocytes.
  • the FAM19A5 peptide produced by neural stem cells is more likely to be involved in the generation of astrocytic cells than the production of neural cells.
  • the secretory factor FAM19A5 is likely to leak into the blood after the brain vessels collapsed after brain injury. If so, it is possible to develop a diagnostic marker that can determine the presence, development and mitigation of brain injury disease or brain disease by checking the presence or degree of expression. To determine this, blood was obtained from normal mice and 7-day mice, which are thought to have the highest expression of FAM19A5 after brain injury, and after the coagulation process, only serum was isolated and radioimmunoassay was performed.
  • FAM19A5 protein The quantitative changes of FAM19A5 protein with time after traumatic brain injury were limited to the reactive stellate cells expressing GFAP.
  • mSOD1 G93A Tg mice which are ALS model animals
  • FIG. 13A the spinal cord of mSOD1 G93A mice had a much higher level than mice of the same age. It was observed that the expression of FAM19A5 was increased. This increase in expression was particularly strong in the ventral horn, where the motor neurons that degenerate, mostly in ALS, are distributed. Proliferation of glial cells was observed in the spinal cord of mSOD1 G93A mice during this period. Pathological degeneration was also detected through GFAP double staining. The bottom magnification is a high magnification image of the full size of mSOD1 G93A mice.
  • glial cells labeled with GFAP show high levels of FAM19A5 expression.
  • the cells distributed in the center of the picture are rounded and large in nucleus, and are not regarded as GFAP stains, so they are considered to be degenerative motor neurons. Through Hoechst the nuclei were labeled with blue fluorescence.
  • Radioimmunoassay was performed in the same manner as in Example 10, and the amount of FAM19A5 protein in serum of ALS model mice was detected at least three times higher than that of normal mice (FIG. 13C).
  • the detection of FAM19A5 in the brain injury model including traumatic brain injury and the spinal cord injury disease model including amyotrophic lateral sclerosis may be used as a marker for central nervous system damage.
  • FAM19A5 antibody was injected into the vein of the rat tail the day after the injury was induced. Given the traumatic brain injury, the cerebrovascular barrier around the damaged area would have collapsed and antibodies would enter the surrounding brain tissue.
  • the antibody was injected and changes were observed using various cell markers after 3, 5, and 7 days from the day of induction of the damage.
  • the mouse model injected with the FAM19A5 antibody inhibited the generation of reactive astrocytic cells expressing GFAP in the vicinity of the damaged tissue, compared to the control group injected with Normal rabbit IgG. This phenomenon was more pronounced after five days and remained weak after seven days. Therefore, inhibition of secreted FAM19A5 via antibodies is thought to affect peripheral cells and in particular to delay reactive astrocytic proliferation that appears after injury.
  • Example 10 the reactive astrocytic cells generated at the injury site after the traumatic brain injury were strongly expressed in the FAM19A5 protein. Based on this, the location of reactive astrocytes expressing FAM19A5 protein in mouse model treated with FAM19A5 antibody after traumatic brain injury was investigated.
  • FAM19A5 antibody was stained with markers of various types of glial cells in order to determine whether they affect the production of other types of glial cells.
  • NG2 cells that divide in damaged brain tissues are known to be mature myelin glial cells
  • MBP Myelin basic protein
  • FAM19A5 after brain injury is thought to be involved in the myelinization of peripheral nerve cells by promoting the division of NG2 progenitor cells.
  • FAM19A5 or an inhibitor thereof of the present invention can be used as a stem cell division or differentiation regulator, a diagnostic kit or chip, or therapeutic agent for central nervous system damage, degenerative brain disease or central nervous system disease.

Abstract

본 발명은 신경교세포 생성 조절에 관여하는 FAM19A5의 약제학적 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 척추동물의 신경줄기세포에 분포하면서 신경교세포 생성을 조절하는 FAM19A5를 통해 중추신경계 손상, 퇴행성 뇌질환 또는 중추신경계 질환의 예방, 진단 또는 치료에 사용할 수 있다.

Description

신경교세포 생성 조절에 관여하는 FAM19A5의 약제학적 용도
본 발명은 척추동물의 신경줄기세포에서 분열 및 분화를 조절하는 FAM19A5의 중추신경계 손상, 퇴행성 뇌질환 또는 중추신경계 질환의 진단, 예방 또는 치료를 위한 약제학적 용도에 관한 것이다.
발생 초기 신경판(neural plate)에서 신경관(neural tube)이 만들어지고 신경관의 강(cavity)이 발생 과정을 거치면서 뇌실(ventricle)을 형성한다. 뇌실의 가장 가까이 위치한 세포층을 뇌실 영역(ventricular zone)이라 하고 신경발생 과정을 거치면서 뇌실 영역 위로 추가의 증식 가능한 세포층이 형성되는 데 이를 뇌실하 영역(subventricular zone)이라고 부른다. 뇌실 영역과 뇌실하 영역에 존재하는 전구세포들은 신경줄기세포(neural stem cell)의 특성을 가지고 있으며 복잡한 제어방법을 거쳐 피질판(cortical plate)으로 이동하게 된다[Dehay and Kennedy, Nat Rev Neurosci 8:438-450,2007; Molyneaux et al., Nat Rev Neurosci 8:427-437,2007; Angevine and Sidman, Nature 192:766-768,1961; Caviness and Takahashi, Brain Dev17:159-163,1995].
신경줄기세포(neural stem cell)는 분열을 계속하는 능력 즉 자기재생능력(self-renewal)을 가지며 중추신경계를 구성하는 신경세포(neuron), 성상세포(astrocyte), 희돌기세포(oligodendrocyte)로 분화할 수 있다. 배아기에는 주로 신경세포로의 분화 과정을, 태생 후에는 신경교세포(glia)로의 분화 과정을 겪는다[Bayer et al., J Comp Neurol 307:499-516,1991; Miller and Gauthier,Neuron 54:357-369,2007].
신경줄기세포에서의 신경세포 및 신경교세포로의 분화는 뇌의 발생 과정뿐만 아니라 성체 뇌에서도 지속적으로 관찰되는 현상이다. 성체 뇌에서 신경발생(neurogenesis)은 측뇌실(lateral ventricle)의 뇌실하 영역(subventricular zone)과 해마(hippocampus)의 치아이랑(dentate gyrus), 두 개의 다른 뇌 영역에서 일어난다. 뇌실하 영역에서는 뇌실과 가장 가깝게 위치한 뇌실막세포(ependymal cell)와 이들을 따라 분포하는 성상세포가 신경줄기세포로 역할을 하며 두 가지 종류의 세포는 전이증폭세포(transient amplifying cell)를 거쳐 신경아세포(neuroblast)가 된다[Doetsch, Curr Opin Genet Dev 13:543-550,2003; Doetsch et al., Cell 97:703-716,1999; Lois and Alvarez-Buylla, Proc. Natl. Acad. Sci.USA 90:2074-2077,1993; Palmer et al., Mol Cell Neurosci 8:389-404,1997; Temple, Nature 414:112-117,2001].
뇌의 기능을 정상적으로 유지하기 위해서는 신경세포와 신경교세포의 수적 균형이 필수적이다. 이중 가장 많은 수를 차지하는 성상세포는 신경세포를 보호하며 그 기능을 수행하는데 도움을 줄 뿐이라 생각되었던 예전과는 달리 구조적인 지지물로서의 역할을 넘어 신경세포 주변의 환경을 조정하는 것으로 알려졌다. 즉 성장인자를 분비하여 신경세포의 기능을 조절하며 혈관과 뇌 사이의 세포 장벽을 유지하는데 도움을 주기도 한다. 또한 신경세포간의 시냅스 기능 및 구조 형성을 직접적으로 조절함으로써 보다 능동적인 역할을 하는 것으로 밝혀졌다[Nedergaard et al., Trends Neurosci 26:523-530,2003; Ullian et al., Science 291:657-661,2001; Song et al., Nature 417:39-44,2002; Temple and Davis, Development 120:999-1008,1994; Seri et al., J Neurosci 21:7153-7160,2001; Svendsen, Nature 417:29-32,2002].
성상세포의 기능적인 중요성은 병리학적으로도 많은 연구를 통해 알려져 왔다. 뇌에 손상이 가해진 경우 성상세포는 활발히 증식하여 반응성 성상세포(reactive astrocyte)로 변하고 비대화가 관찰된다. 이러한 신경교세포의 활발한 증식은 손상 초기에는 조직의 회복을 빠르게 하고 손상 지역으로부터의 전파를 방지하는 등 유익한 기능을 수행한다. 하지만 이러한 현상이 반복되면 신경세포의 재생을 억제하고 염증반응을 유발하며 손상을 가하여 퇴행성 뇌질환을 초래하기도 한다[Myer et al., Brain 129:2761-2772,2006; Chen and Swanson, J Cereb Blood Flow Metab 23:137-149,2003; Cunningham et al., Brian 128:1931-1942,2005; Faden, Curr Opin Neurol 15:707-712,2002; Katayama et al., J Neurosurg 73:889-900,1990].
신경교 증식증은 다양한 중추신경계의 병리학적 과정에서 공통적으로 나타나는 현상으로 손상에 따른 성상세포의 과잉증식 및 활성화에 의해 야기된다. 중추신경계에 손상이 가해지면 정상 성상세포는 비대화되고 신경교 섬유질 산성 단백질(Glial fibrillary acidic protein, GFAP)이라는 중간세사 단백질의 생성을 증가시키는 반응성 성상세포가 된다. 손상 후 반응성 성상세포를 포함한 다양한 신경교 세포들이 과다증식되어 치유과정의 산물인 glia scar라는 단단한 세포층을 형성하게 된다. 이러한 신경교 증식증은 헌팅톤병, 파킨슨병, 알츠하이머병을 포함하는 퇴행성 뇌질환과 뇌척수 손상은 물론 뇌졸중 및 뇌종양 등 다양한 중추신경계의 병리학적 현상에서 관찰된다[Faideau et al., Hum Mol Genet, 2010; Chen et al., Curr Drug Targets, 2005; Rodriguez et al., Cell Death Differ, 2009; Robel et al., J Neurosci, 2011; Talbott et al., Exp Neurol, 2005; Shimada et al., J Neurosci; 2012; Sofroniew and Vinters, Acta Neuropathol, 2010].
일반적으로 신경교 증식증의 영향은 최초의 손상이 일어난 상황에 따라 혹은 상처가 생긴 뒤 경과한 시간에 따라 다양하다. 손상 후 초기의 반응성 성상세포는 예정된 세포사멸을 막아주는 GDNF와 같은 신경성장인자를 분비하고 글루탐산을 회수하는 역할을 통해 신경세포를 보호하는 효과를 가진다. 또한 혈관-뇌 장벽의 기능을 회복시키고 손상이 일어난 부위를 격리시켜 건강한 조직의 감염을 막는 긍정적인 역할을 수행한다. 하지만 손상 후 일정 시간이 경과하면 과잉증식된 반응성 성상세포에 의해 glia scar가 형성되어 손상부위를 그물처럼 감싸고 억제성 세포외기질을 축적한다. 이러한 단백질들의 치밀한 구조는 물리적, 화학적으로 신경세포의 재생과 연결을 재구축하는 것을 막는 방벽의 역할을 한다. 또한 염증을 유도하는 물질과 세포독성 사이토카인과 같은 신경독성 물질을 분비하여 신경세포의 세포사멸을 유도하여 기능적인 회복을 방해하고 병리적 증상을 악화시킨다. 기존의 중추신경계질환은 조직병리검사 혹은 컴퓨터촬영(CT)과 자기공명영상(MRI)을 통해 의심할 수 있지만 이러한 방법을 통한 진단은 질병이 어느 정도 진행된 후에나 가능하다. 따라서 중추신경계 질환의 진행 정도를 알아볼 수 있는 신속하고 정확한 진단용 마커의 개발이 필수적이다. 또한 손상 초기에는 신경세포가 생존이 가능하며 후기에는 glia scar의 생성을 최소화하고 신경세포 재생이 촉진될 수 있는 치료법 개발이 현재로서는 최선이다.
본 발명의 목적은 FAM19A5의 신경교세포 생성 조절에서의 역할을 규명함으로써, 중추신경계 손상, 퇴행성 뇌질환 또는 중추신경계 질환에서의 진단, 예방, 또는 치료를 위한 약제학적 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 분열 또는 분화 조절제로, FAM19A5(family with sequence similarity 19, member A5) 또는 이의 저해제를 포함하는 줄기세포의 분열 또는 분화 조절용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 FAM19A5(family with sequence similarity 19, member A5) 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 중추신경계 손상, 퇴행성 뇌질환 또는 중추신경계 질환 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 FAM19A5(family with sequence similarity 19, member A5)를 포함하는 초기 외상성 뇌손상(traumatic brain injury) 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 초기 외상성 뇌손상 치료를 위한 약제학적 조성물의 제조를 위한 FAM19A5의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 약제학적 유효량의 FAM19A5를 포함하는 초기 외상성 뇌손상 치료용 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 동물의 초기 외상성 뇌손상 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 FAM19A5(family with sequence similarity 19, member A5) 저해제를 포함하는 퇴행성 뇌질환 또는 중추신경계 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 퇴행성 뇌질환 또는 중추신경계 질환의 예방 또는 치료를 위한 약제학적 조성물의 제조를 위한 FAM19A5 저해제의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 약제학적 유효량의 FAM19A5 저해제를 포함하는 퇴행성 뇌질환 또는 중추신경계 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 동물의 퇴행성 뇌질환 또는 중추신경계 질환의 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 FAM19A5(family with sequence similarity 19, member A5) 유전자를 후보물질과 인체 외에서 접촉시키고, 상기 후보물질이 상기 유전자의 발현을 촉진하는지 또는 억제하는지를 판단하는 것을 포함하는 뇌질환 또는 중추신경계 질환의 예방 또는 치료용 의약의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 FAM19A5(family with sequence similarity 19, member A5) 단백질을 후보물질과 인체 외에서 접촉시키고, 상기 후보물질이 상기 단백질의 기능 또는 활성을 증진하는지 또는 억제하는지를 판단하는 것을 포함하는 뇌질환 또는 중추신경계 질환의 예방 또는 치료용 의약의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명은 신경줄기세포에서 분비되는 단백질인 FAM19A5가 신경줄기세포의 분열 또는 분화를 조절하며, 뇌척수 손상 시 과발현되어 성상세포의 생성을 촉진함으로써 초기 손상 조직을 회복시키며, 손상이 진행된 조직에서 FAM19A5에 특이적인 항체로 FAM19A5를 중화시킬 경우 성상세포의 생성을 억제함을 규명함으로써, 중추신경계 손상, 퇴행성 뇌질환 또는 중추신경계 질환의 진단, 예방 또는 치료에 사용할 수 있는 효과를 제공한다.
도 1은 다양한 척추동물의 FAM19A5 유전자로부터 발현된 FAM19A5 펩타이드의 아미노산 서열(A) 및 계통수(B)를 나타낸 것이다.
도 2는 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 통해 생쥐의 다양한 조직 내 FAM19A 가족 유전자의 mRNA 발현 양상(A) 및 발생 시기별 FAM19A 가족 유전자의 mRNA 발현 양상(B)을 나타낸 것이다.
도 3은 동소보합결합(In situ hybridization)을 이용하여 발생 시기별로 생쥐의 뇌실 영역과 척수에서 FAM19A5 mRNA의 발현 여부를 측정한 결과이다.
도 4는 웨스턴 블랏팅(A) 및 면역조직화학법(B)을 이용하여 His-FAM19A5 특이 항체와 FAM19A5 가족 유전자의 결합 특이성 확인 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 면역조직화학법을 이용하여 발생 시기 별로 생쥐의 뇌실 영역에 FAM19A5 펩타이드의 발현 여부를 측정한 결과이다.
도 6은 면역조직화학법을 이용하여 성체 생쥐의 뇌실하 영역에 존재하는 신경줄기세포 및 전구세포에서 FAM19A5 펩타이드의 발현 여부(A) 및 분화된 조건에서 FAM19A5 펩타이드의 발현 정도(B)를 측정한 결과이다.
도 7은 면역세포화학법(Immunocytochemistry)을 통해 생쥐의 신경줄기세포에서 발생하는 신경구에 FAM19A5 펩타이드의 발현 여부를 측정한 결과이다.
도 8은 신경구에서 FAM19A5의 발현 여부를 측정한 것으로, (A)는 면역세포화학법을 통해 얻은 결과이고, (B)는 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 통해 얻은 결과이며, (C)는 마이크로어레이를 이용하여 얻은 결과이다.
도 9는 면역조직화학법(A) 및 웨스턴 블랏팅(B)를 이용하여 FAM19A5 및 이의 특이 항체에 의한 신경줄기세포의 분열능에 대한 효과를 측정한 결과이다.
도 10은 외상성 뇌손상 생쥐 모델에서 FAM19A5 단백질의 변화를 측정한 결과이다.
도 11은 면역조직화학법 및 웨스턴 블랏팅(A)과 방사면역검정법(B)을 이용하여 외상성 뇌손상 생쥐 모델에서 혈액 내 FAM19A5 단백질의 변화를 측정한 결과이다.
도 12는 외상성 뇌손상 이후 시간에 따른 FAM19A5 단백질의 변화를 측정한 결과이다.
도 13은 면역조직화학법(A), 웨스턴 블랏팅(B) 및 방사면역검정법(C)을 이용하여 근위축성 측삭 경화증 모델에서 FAM19A5 단백질의 변화를 측정한 결과이다.
도 14는 외상성 뇌손상 이후 FAM19A5 특이 항체 처리에 따른 뇌조직에서의 형광 신호를 나타낸 것이다.
도 15는 외상성 뇌손상 이후 FAM19A5 특이 항체 처리에 따른 시간 별로 세포 표지자의 변화를 나타낸 것이다.
도 16은 외상성 뇌손상 이후 FAM19A5 특이 항체 처리에 따른 신경세포의 변화를 나타낸 것이다.
도 17은 FAM19A5 특이 항체를 처리한 외상성 뇌손상 생쥐 모델에서 FAM19A5 단백질이 발현되는 반응성 성상세포의 위치를 확인한 결과이다.
도 18은 외상성 뇌손상 이후 FAM19A5 특이 항체 처리에 따른 NG2 회돌기교 전구세포(A) 및 회돌기교 세포(B)의 변화를 측정한 것이다.
이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.
FAM19A5(family with sequence similarity 19, member A5)는 작은 분비 단백질을 코딩하는 5개의 매우 상동성을 갖는 유전자로 구성된 FAM19A 가족 유전자의 일원이며, 고정된 위치에서 보존된 시스테인 잔기를 포함하고 있고, CC-케모카인 가족 유전자의 일원인 MIP-1 alpha와 관련되어 있다. 상기 단백질은 주로 뇌와 척수에서 특이적으로 발현되며, 신경 발생과정 및 성체신경줄기세포에서 생성되어 분비되면서 성상세포의 생성을 촉진하는 분화조절인자로 작용하는 것으로 알려져 있다.
본 발명자들은 생물정보학적 접근법을 통해 FAM19A5의 생체 내 존재성을 동소보합결합법(In situ hybridization), 면역조직화학법(Immunohistochemistry)을 통하여 밝히고, 면역세포화학법(Immunocytochemistry)을 이용해 신경줄기세포로부터 분화된 세포를 만드는 과정에서의 FAM19A5의 역할을 규명하고, 척추동물에서 신경세포 및 신경교세포 생성과 관련된 여러 질환의 치료적 용도를 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 분열 또는 분화 조절제로, FAM19A5(family with sequence similarity 19, member A5)를 포함하는 줄기세포의 분열 또는 분화 조절용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, FAM19A5는 척추동물의 뇌에서 특이적으로 발현되는데, 특히, 뇌실 영역과 척수 영역에서 강하게 분포하며, 태생 전 임신기에도 뇌실 영역과 뇌실하 영역에서 높은 발현을 나타내나 분화된 신경세포가 위치한 피질판에서는 발현이 약하게 나타난다. 따라서, 본 발명은 FAM19A5 유전자 발현이 신경줄기세포의 군집이 분포하는 것으로 알려진 중추신경계의 두 영역에서 강하게 나타나 FAM19A5가 완전한 중추신경계 형성에 중요하고 이를 구성하는 신경세포와 신경교세포의 생성에 관여함을 최초로 증명하였다.
이를 기반으로 신경줄기세포에서 발생하는 신경구에서의 FAM19A5의 발현을 살펴본 결과, 신경구에서 FAM19A의 가족 유전자의 다른 유형에 비해 FAM19A5가 월등히 많이 분포함을 확인할 수 있다. 이는 FAM19A5가 성체신경줄기세포와 배아신경줄기세포에서의 기능 또는 그로부터 생성되는 다른 종류의 세포로의 분화과정에서 중요한 물질로 작용할 가능성을 시사하는 것이다.
이러한 사실을 통해 FAM19A5이 신경줄기세포에서 생성되어 분비되면서 그로부터 분화된 종류의 세포(즉, 신경세포 또는 성상세포) 생성에 영향을 주는지 살펴본 결과, FAM19A5는 성상세포의 생성을 촉진함을 확인할 수 있었다.
따라서, FAM19A5는 양적 변화를 통해 신경줄기세포에서 분화되는 신경세포 또는 성상세포의 수를 조절할 수 있다. 즉, FAM19A5의 양적 증가를 통해 분화되는 성상세포의 수가 증가하고, FAM19A5의 양적 감소를 통해 분화되는 신경세포의 수가 증가하므로, FAM19A5는 분화 조절 인자임을 알 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 구체예에 따르면, FAM19A5의 양적 증가를 통해 신경줄기세포의 분열이 감소하고, FAM19A5의 양적 감소를 통해 신경줄기세포의 분열이 증가함을 확인함으로써, FAM19A5는 줄기세포의 분열 조절 인자임을 알 수 있다.
따라서, FAM19A5 또는 이의 저해제는 줄기세포의 분열 또는 분화조절제로 사용할 수 있다.
본 발명의 FAM19A5는 신경줄기세포에서 분비되는 분비 단백질로서, 세포 외부로 분비될 수 있는 신호로서 아미노기 말단의 전형적인 신호 펩타이드를 암호화하는 유전자 서열을 포함하고 있고, 뒤이어 성숙한 FAM19A5의 아미노산 서열을 가진다(도 1 참조).
본 발명의 줄기세포의 분열 또는 분화 조절용 조성물은 천연형 또는 재조합 FAM19A5, 이들과 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖는 FAM19A5 단백질, 상기 천연형 또는 재조합 FAM19A5를 과발현하는 형질전환 신경줄기세포, 또는 FAM19A5 저해제를 포함할 수 있다. 상기 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖는 단백질에는 천연형/재조합 FAM19A5과 그 기능적 동등물(functional equivalent) 및 기능적 유도체(functional derivative)가 포함된다.
상기 "기능적 동등물"에는 천연형 단백질의 아미노산 중 일부 또는 전부가 치환되거나, 아미노산의 일부가 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체로서 천연형 FAM19A5과 실질적으로 동등한 생리활성을 갖는 것을 말한다.
"기능적 유도체"는 상기 FAM19A5 단백질의 물리 화학적 성질을 증가 또는 감소시키기 위한 변형을 가한 단백질로서 천연형 FAM19A5과 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖는 것을 의미한다.
본 발명의 FAM19A5 단백질은 포유동물, 바람직하게는 인간, 생쥐, 랫트, 금화조, 닭, 제브라다니오, 개구리, 큰가시고기 등으로부터 기원하는 단백질이며, 예컨대, 사람 유래의 GenBank accession no. NM_134096, NM_001191991 등으로 공지된 서열을 가진 단백질을 말한다.
일 구체예에 따르면, 본 발명에 사용된 FAM19A5은 GenBank accession no. NM_134096 또는 NM_001191991 등으로부터 당업자에 공지된 유전공학적 방법으로 제조할 수 있다.
천연형의 FAM19A5은 유전자 재조합 방법에 의하여 단백질을 제조하는 경우 대장균(E.coli)이나 곤충 세포를 이용하는 것보다 포유동물 세포를 이용하는 경우가 단백질의 활성도나 용해성 측면에서 천연형의 것과 유사할 것으로 여겨진다.
상기 재조합 FAM19A5 단백질은 통상의 컬럼 크로마토그라피 방법 등을 이용하여 분리할 수 있다. 또한 단백질의 정제 정도는 소듐 도데실 술페이트-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동 (SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE))등으로 확인할 수 있다.
상기 천연형 또는 재조합 FAM19A5를 과발현하는 형질전환 신경줄기세포는 공지의 방법을 통해 천연형 또는 재조합 FAM19A5를 발현하는 벡터를 신경줄기세포에 도입하여 제조된 것일 수 있다.
상기 FAM19A5 저해제는 안티센스-올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA, miRNA 또는 이를 포함하는 벡터; 또는, 항체 중 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 줄기세포의 분열 또는 분화 조절용 조성물은 시험관내(invitro)에서 신경줄기세포 배양 시 분열 또는 분화 조절 인자로 첨가될 수 있다. 예컨대, 신경줄기세포의 분열 또는 분화 유도 배양 시 천연형 또는 재조합 FAM19A5 또는 이의 저해제를 부가하여 이들의 양적 변화를 통해 줄기세포 분열의 증감을 조절하거나, 신경세포 또는 성상세포의 수를 조절할 수 있다.
또한, 천연형 또는 재조합 FAM19A5를 과발현하는 형질전환 신경줄기세포와 신경줄기세포를 공동 배양하면서 분화를 유도할 경우, 형질전환 신경줄기세포에서 분비되는 FAM19A5 단백질과 신경줄기세포에서 분비되는 FAM19A5 단백질 양의 증가로 성상세포의 수가 증가할 수 있다.
본 발명의 줄기세포의 분열 또는 분화 조절용 조성물은 상기 FAM19A5 외에 신경줄기세포의 분화를 유도하는 공지의 분화 유도 인자를 더 포함할 수 있다. 예컨대, ciliary neurotrophic factor(CNTF), bone morphogenetic proteins(BMPs), transforming growth factor(TGFα) 또는 neuregulin-1 (Nrg1)/glial growth factor-2(GGF2) 등을 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 FAM19A5(family with sequence similarity 19, member A5) 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 중추신경계 손상, 퇴행성 뇌질환 또는 중추신경계 질환 진단용 조성물에 관한 것이다.
성숙한 성상세포의 경우 뇌에 손상이 가해진 경우 활발히 증식하여 반응성 성상세포로 변하고 비대화되면서 조직의 회복을 빠르게 하고 소상 지역으로부터의 전파를 방지한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 손상 부위에서 FAM19A5 발현이 현저히 증가하며, 손상 부위에 위치한 방사신경아교세포는 표지자인 네스틴을 발현함과 동시에 FAM19A5를 발현하며 손상을 받지 않은 대조군에 비해 현저히 수적으로 증가한다. 아울러, 뇌실하 영역에서 뇌량을 거쳐 뇌손상 영역으로 이동해가는 신경아세포는 FAM19A5를 거의 발현하지 않는다. 손상 부위 외에도 신경줄기세포 군집이 위치하는 뇌실하 영역 주변부로 FAM19A5 단백질을 발현하는 세포 수가 증가하고, 이들은 성상세포의 표지자인 GFAP를 동시에 발현한다.
또한, FAM19A5는 뇌손상 이후 뇌혈관 장벽이 붕괴된 상태에서 혈액 내로 유출될 수 있어 혈액 검사를 통해 FAM19A5의 발현 여부를 검사한 결과 FAM19A5 단백질이 검출되었다. 이러한 발현은 뇌손상 이후 시간이 지남에 따라 발현양이 지속적으로 증가하는 양상을 나타내었다.
본 발명의 다른 구체예에 따르면, 척수손상질환 모델인 근위축성 측삭 경화증에서 FAM19A5 단백질의 양적 변화를 측정한 결과, 정상모델에 비해 발현양이 증가함을 확인하였다.
따라서, FAM19A5는 중추신경계 손상을 진단하기 위한 바이오마커로 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 구체예에 따르면, 외상성 뇌손상에 의해 생기는 반응성 성상세포에서 FAM19A5 특이 항체를 사용할 경우 성상세포의 과잉 증식이 억제되고, 신경세포는 살아남아 있으며, 이를 통해 장기적으로는 손상 부위의 신겨세포의 재생을 촉진할 것으로 예상되므로 FAM19A5는 중추신경계 손상으로 인한 질환의 진행 상태를 객관적, 정량적 진단이 가능하다.
따라서, FAM19A5는 중추신경계 손상으로 인한 퇴행성 뇌질환 또는 중추신경계 질환을 진단하기 위한 바이오마커로 사용할 수 있다.
본 명세서에서, 용어, "중추신경계 손상"은 뇌척수 세포들의 파괴 또는 퇴화를 일으키는 모든 종류의 중추신경계 손상을 포함한다. 예컨대, 외상성 뇌손상(traumatic brain injury), 근위축성 측삭 경화증 등이 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.
용어, "퇴행성 뇌질환 또는 중추신경계 질환"은 중추신경계에 손상이 가해져 생기는 신경교 증식증으로 인한 퇴행성 뇌질환 또는 중추신경계 질환을 의미한다. 이러한 질환의 예로 알츠하이머 질환, 헌팅톤병, 파킨슨병, 뇌졸중 또는 뇌종양 등이 있으나, 특정 종류의 질환에만 한정되는 것은 아니다.
용어, "진단"은 병리 상태를 확인하는 것을 의미하는 것으로서, 본 발명의 목적상 상기 진단은 중추신경계 손상, 퇴행성 뇌질환 또는 중추신경계 질환 진단 마커의 발현 유무를 확인하여 중추신경계 손상, 퇴행성 뇌질환 또는 중추신경계 질환의 발병 여부, 발전 및 경감 여부를 확인하는 것을 의미한다.
용어, "진단용 마커(diagnosis marker)"란 중추신경계 손상, 퇴행성 뇌질환 또는 중추신경계 질환의 세포를 정상세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질을 의미하며, 정상세포에 비하여 중추신경계 손상, 퇴행성 뇌질환 또는 중추신경계 질환의 세포에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예컨대, mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명에서 제공하는 중추신경계 손상, 퇴행성 뇌질환 또는 중추신경계 질환 진단용 마커는 정상세포에 비해 중추신경계 손상, 퇴행성 뇌질환 또는 중추신경계 질환의 세포에서 발현 양이 증가하는 FAM19A5 유전자로부터 발현된 단백질일 수 있다.
본 발명의 중추신경계 손상, 퇴행성 뇌질환 또는 중추신경계 질환 진단용 조성물은 FAM19A5 유전자의 mRNA의 발현 수준 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질의 양을 측정하는 제제를 포함하고, 이러한 제제로 FAM19A5 mRNA에 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드, 예컨대, FAM19A5 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 핵산 프로브나, FAM19A5 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다.
상기 프라이머는 적합한 온도 및 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있을 수 있다. 또한, 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 또한, 본 발명에 따른 프라이머는 유전자 증폭 반응에 이용될 수 있는 것이 좋다. 상기 증폭 반응은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 말하며, 이러한 유전자의 증폭 반응들에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있고, 예컨대, 중합효소 연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 리가아제 연쇄반응(LCR), 전자 중재 증폭(TMA), 핵산 염기서열 기판 증폭(NASBA) 등이 포함될 수 있다.
상기 핵산 프로브는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타켓 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것을 말한다. 본 발명에 따른 프로브는 단일쇄일 수 있으며, 바람직하게는 올리고디옥시리보뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명의 프로브는 자연 dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 뉴클레오타이드 유사체 또는 유도체를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 프로브는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 프로브는 골격 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대, 펩타이드 핵산 (PNA) (M. Egholm etal.,Nature,365:566-568(1993)),포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O- 알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘(치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.
상기 FAM19A5에 특이적인 항체는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 인간항체 및 인간화 항체를 사용할 수 있다.
상기 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디(diabody); 선형 항체(Zapata et al., Protein Eng.8(10):1057-1062(1995));단일쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이성 항체 등이 포함된다.
항체를 파파인 (papain)으로 분해하면 2개의 동일한 항원 결합 단편, 즉 단일 항원 결합 부위가 있는 각 "Fab" 단편, 및 그 나머지인 "Fc" 단편이 생성된다. 펩신을 처리하면, 2개의 항원 결합 부위가 있으며 여전히 항원에 교차결합할 수 있는 F(ab ')2 단편이 생성된다. Fv는 완전한 항원인식 및 결합 부위를 포함하는 최소한의 항체 단편이다. 이 부위는 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 영역의 이합체로 구성되며 비공유결합으로 단단히 결합되어 있다.
폴리클로날 항체의 제조방법은 당업자에게 공지되어 있다. 폴리클로날 항체는 포유동물에 1회 이상 면역화제를 주입, 필요한 경우 면역보강제와 함께 주입하여 제조할 수 있다. 통상, 면역화제 및(또는) 면역보강제는 포유동물에 피하주사 또는 복강내 주사로 수 회 주입된다. 면역화제는 본 발명의 단백질 또는 이의 융합 단백질일 수 있다. 면역화되는 포유동물에 면역원성이 있는 것으로 공지된 단백질과 함께 면역화제를 주사하는 것이 효과적일 수 있다.
본 발명에 따른 모노클로날 항체는 문헌(Kohler et al., Nature, 256:495 (1975))에 기재된 하이브리도마 방법으로 제조할 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법(예를 들어, 미국특허 제4,816,576호 참조)으로 제조할 수 있다. 모노클로날 항체는 또한 예를 들어, 문헌(Clackson et al., Nature,352:624-628(1991) 및 Marks et al.,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991))에 기재된 기술을 이용하여 파지항체 라이브러리로부터 단리할 수 있다.
본 발명에서의 모노클로날 항체는 구체적으로, 목적하는 활성을 발휘한다면 중쇄 및(또는) 경쇄의 일부분이 특정 종으로부터 유래된 항체 또는 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이 있지만, 쇄(들)의 나머지는 다른 종으로부터 유래된 항체 또는 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체 또는 그러한 항체의 단편과 동일하거나 상동성이 있는 "키메라" 항체를 포함한다(Morrison et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984)).
비-인간(예를 들어, 쥐과 동물) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유도된 최소서열을 포함하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 쇄 또는 그의 단편(예를 들어, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원 결합 서열) 이다. 대부분의 경우 인간화 항체는 수용자의 상보성 결정 영역(CDR)의 잔기를 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 생쥐, 쥐 또는 토끼와 같은 인간 이외의 종(공여자 항체)의 CDR 잔기로 치환시킨 인간 면역글로불린(수용자 항체)을 포함한다. 몇몇 경우에, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 치환된다. 또한, 인간화 항체는 수용 항체, 또는 도입되는 CDR 또는 프레임워크 서열에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 하나 이상, 일반적으로 둘 이상의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함하며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비-인간 면역글로불린의 영역에 대응하며, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 서열의 영역에 해당한다. 또한, 인간화 항체는 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 일반적으로 인간면역글로불린 영역의 일부를 포함한다(Presta, Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)).
본 발명의 중추신경계 손상, 퇴행성 뇌질환 또는 중추신경계 질환 진단용 조성물은 키트의 형태로 포함될 수 있다.
상기 키트는 FAM19A5 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 양을 측정할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 항체를 포함할 수 있고, 이들의 정의는 상술한 바와 같다.
상기 키트가 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합효소 보조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있으며, 상기 키트가 면역 분석에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, 이차항체 및 표지의 기질을 포함할 수 있다. 나아가, 본 발명에 따른 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.
또한, 본 발명의 중추신경계 손상, 퇴행성 뇌질환 또는 중추신경계 질환 진단용 조성물은 마이크로어레이의 형태로 포함될 수 있다.
본 발명의 마이크로어레이에 있어서, 상기 FAM19A5 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 항체는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기질(substrate) 상에 고정화된다. 바람직한 기질은 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함할 수 있다. 상기 혼성화 어레이 요소는 상기 기질 상에 배열되고 고정화되며, 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기질에 결합될 수 있다.
한편, 본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료가 핵산일 경우에는 표지될 수 있고, 마이크로어레이 상의 어레이 요소와 혼성화 될 수 있다. 혼성화 조건은 다양할 수 있으며, 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 FAM19A5 유전자의 발현수준 또는 그 발현 단백질 수준을 측정하는 방법을 통해 중추신경계 손상, 퇴행성 뇌질환 또는 중추신경계 질환을 진단하는 방법을 제공하는데, 보다 구체적으로 상기 방법은, (a) 중추신경계 손상, 퇴행성 뇌질환 또는 중추신경계 질환 의심환자의 생물학적 시료로부터 FAM19A5 유전자의 발현 수준 또는 그 발현 단백질의 양을 측정하는 단계; 및 (b) 정상 대조군 시료로부터 상기 유전자의 발현 수준 또는 그 발현 단백질의 양을 측정하여 상기 (a) 단계의 측정결과와 비교하는 단계를 포함할 수 있다.
상기에서 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 양을 측정하는 방법은 공지의 기술을 이용하여 생물학적 시료로부터 mRNA 또는 단백질을 분리하는 공지의 공정을 포함하여 수행될 수 있다.
상기 생물학적 시료는 중추신경계 손상, 퇴행성 뇌질환 또는 중추신경계 질환 발생 또는 진행 정도에 따른 상기 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 수준이 정상 대조군과는 다른, 생체로부터 채취된 시료를 말하며, 상기 시료로는 예를 들면, 이에 제한되지는 않으나, 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨 등이 포함될 수 있다.
상기 유전자의 발현 수준 측정은 바람직하게는 mRNA의 수준을 측정하는 것이며, mRNA의 수준을 측정하는 방법으로는 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소연쇄반응, RNase 보호 분석법, 노던 블럿 및 DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 단백질 수준의 측정은 항체를 이용할 수 있는데, 이러한 경우, 생물학적 시료 내의 상기 FAM19A5 단백질과 이에 특이적인 항체는 결합물, 즉, 항원-항체 복합체를 형성하며, 항원-항체 복합체의 형성양은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정할 수 있다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물질, 리간드, 발광물질, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 이에 제한되지는 않으나, 웨스턴 블럿, ELISA, 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있다.
따라서 본 발명은 상기와 같은 검출 방법들을 통하여, 대조군의 mRNA 발현 양 또는 단백질의 양과 중추신경계 손상, 퇴행성 뇌질환 또는 중추신경계 질환 환자, 또는 중추신경계 손상, 퇴행성 뇌질환 또는 중추신경계 질환 의심환자에서의 mRNA 발현 양 또는 단백질의 양을 확인할 수 있고, 상기 발현 양의 정도를 대조군과 비교함으로써 중추신경계 손상, 퇴행성 뇌질환 또는 중추신경계 질환의 발병여부, 진행단계 등을 진단할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 상기 중추신경계 손상, 퇴행성 뇌질환 또는 중추신경계 질환의 진단방법은 본 발명에 따른 FAM19A5 유전자의 발현 수준 또는 그 발현 단백질의 양이 정상 대조군 시료에 비해 증가되었을 경우, 중추신경계 손상, 퇴행성 뇌질환 또는 중추신경계 질환이 유발된 것으로 판단할 수 있다.
본 발명은 또한 FAM19A5(family with sequence similarity 19, member A5)를 포함하는 초기 외상성 뇌손상(traumatic brain injury) 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 초기 외상성 뇌손상 치료를 위한 약제학적 조성물의 제조를 위한 FAM19A5의 용도를 제공한다.
외상성 뇌손상에 의해 생성되는 손상 후 초기의 반응성 성상세포는 예정된 세포사멸을 막아주는 GDNF와 같은 신경성장인자를 분비하고, 글루탐산을 회수하는 역할을 통해 신경세포를 보호하는 효과를 가진다. 또한, 혈관-뇌 장벽의 기능을 횝고시키고 손상이 일어난 부위를 격리시켜 건강한 조직의 감염을 막은 긍정적인 역할을 수행한다.
신경줄기세포에서 생성되는 FAM19A5는 신경세포 보다는 성상세포의 생성에 관여하므로 뇌손상 부위에서 성상세포의 생성을 촉진하여 초기 뇌손상을 치료할 수 있고, 뇌손상 질환으로의 진행을 억제할 수 있다.
따라서, FAM19A5는 초기 외상성 뇌손상 치료제로 사용할 수 있다.
본 발명의 초기 외상성 뇌손상 치료용 조성물은 천연형 또는 재조합 FAM19A5 단백질, 이들과 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖는 FAM19A5 단백질, 상기 FAM19A5 단백질을 과발현하는 형질전환 신경줄기세포 또는 상기 신경줄기세포에서 분화된 성상세포를 적어도 하나 포함할 수 있고, 이들의 정의는 상술한 바와 같다.상기 천연형 또는 재조합 FAM19A5 단백질, 또는 이들과 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖는 FAM19A5 단백질은 뇌손상 부위에서 성상세포의 생성을 촉진하여 초기 외상성 뇌손상을 치료할 수 있다.
또한, 상기 FAM19A5 단백질을 과발현하는 형질전환 신경줄기세포의 경우, 세포 자체로 투여되어 뇌손상 부위에서 FAM19A5 단백질을 분비함으로써 성상세포의 생성을 촉진하거나, 상기 형질전환 신경줄기세포의 성상세포로의 분화를 촉진하여 초기 외상성 뇌손상을 치료할 수 있다. 이 경우, 상기 형질전환 신경줄기세포의 분화를 촉진하기 위해 분화 유도 인자를 병행 투여할 수 있다. 상기 분화 유도 인자의 종류는 전술한 바와 같다.
상기 신경줄기세포에서 분화된 성상세포의 경우, 세포 자체로 투여되어 뇌손상 부위에서 다량의 성상세포가 존재하도록 하여 초기 외상성 뇌손상을 치료할 수 있는 것이다.
또한, 본 발명은 약제학적 유효량의 FAM19A5를 포함하는 초기 외상성 뇌손상 치료용 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 동물의 초기 외상성 뇌손상의 치료 방법을 제공한다.
상기 초기 뇌손상의 치료 방법에 사용되는 약학적 조성물 및 투여 방법은 하기에서 후술할 것이므로, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
한편, 상기 초기 외상성 뇌손상 치료용 조성물을 투여할 수 있는 개체는 모든 동물을 포함한다. 예를 들어, 개, 고양이, 생쥐와 같은 인간을 제외한 동물일 수 있다.
본 발명은 또한 FAM19A5(family with sequence similarity 19, member A5) 저해제를 포함하는 퇴행성 뇌질환 또는 중추신경계 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 퇴행성 뇌질환 또는 중추신경계 질환의 예방 또는 치료를 위한 약제학적 조성물의 제조를 위한 FAM19A5 저해제의 용도를 제공한다.
상기 FMA19A5는 신경교세포의 일종인 성상세포의 생성을 촉진하므로, 상기 신경교세포가 다량 발현되는 퇴행성 뇌질환 또는 중추신경계 질환에서 FMA19A5의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현을 억제함으로써 FAM19A5 저해에 의한 반응성 성상세포 수의 감소 및 NG2(neuron-glial antigen 2)를 발현하는 전구세포의 분열을 촉진하여 뇌손상 부위 주변의 신경세포의 축삭을 수초화시킴으로써 퇴행성 뇌질환 또는 중추신경계 질환 치료에 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명의 퇴행성 뇌질환 또는 중추신경계 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 FAM19A5 유전자의 mRNA 발현 또는 이의 단백질의 발현을 감소시키거나, 기능 또는 활성을 감소시키는 제제를 포함할 수 있다.
상기 FAM19A5 단백질 저해제는 FAM19A5 단백질과 결합하여 신경 분화 경로의 신호를 조절하는 펩타이드 또는 화합물 등일 수 있다. 이러한 저해제는 단백질 구조 분석 등의 하기 예시된 스크리닝 방법을 통해 선정될 수 있으며, 당업계에 공지된 방법을 이용하여 설계될 수 있을 것이다.
또한, 상기 단백질 저해제는 FAM19A5 단백질에 대한 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 인간항체 및 인간화 항체를 사용할 수 있고, 상기 항체의 정의는 상술한 바와 같다.
상기 항체를 이용하여 세포 내 수용체의 신경 분화 경로의 신호 전달을 조절함으로써 퇴행성 뇌질환 또는 중추신경계 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.
본 발명의 FAM19A5 단백질의 기능 또는 활성 저해제는 리포솜, 바이러스, 유전자 건(gene gun), 폴리머(polymer), 초음파, 전기충격을 이용해 전달될 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.
상기 FAM19A5 유전자는 이들을 코딩하는 DNA 또는 이로부터 전사되는 mRNA일 수 있다. 따라서, 상기 유전자에 대한 저해제는 유전자 자체에 결합하여 전사를 방해하거나 유전자로부터 전사된 mRNA에 결합하여 mRNA의 해독을 방해하는 저해제일 수 있다.
따라서, 상기 FAM19A5 유전자의 저해제는 FAM19A5 유전자의 발현을 저해하는 저해제를 모두 포함한다. 예컨대, 이러한 저해제는 상기 유전자에 결합하는 펩타이드, 핵산 또는 화합물 등일 수 있다. 이러한 저해제는 세포 기반 스크리닝 등의 하기 예시된 스크리닝 방법을 통해 선정될 수 있으며, 당업계에 공지된 방법을 이용하여 설계될 수 있을 것이다.
한 구체예에서, 상기 저해제는 FAM19A5 유전자에 대한 안티센스-올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA, miRNA 또는 이들을 포함하는 벡터일 수 있다. 이러한 안티센스-올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA, miRNA 또는 이들을 포함하는 벡터는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제작할 수 있다.
본 명세서에서 "siRNA"는 표적 유전자의 mRNA의 절단을 통해 RNA 간섭현상을 유도하는 이중사슬 RNA를 의미하며, 표적 유전자의 mRNA와 같은 서열을 가지는 센스서열의 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 서열의 RNA 가닥으로 구성된다.
상기 siRNA는 시험관내에서 합성한 siRNA 자체 또는 siRNA를 코딩하는 염기서열을 발현벡터에 삽입하여 발현되는 형태를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 "벡터"는 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈 내로 삽입된 외부 DNA를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.
본 발명과 관련된 벡터는 상기 유전자를 저해하는 핵산 서열이 게놈 내로 삽입된 벡터로서, 이들 벡터는 DNA 벡터, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터, 효모 벡터, 또는 바이러스 벡터를 예로 들 수 있다.
또한, 상기 안티센스는 FAM19A5 유전자 또는 그의 단편으로부터 전사되는 mRNA 서열 전체 또는 일부와 상보적인 서열을 지니고, 상기 mRNA와 결합하여 상기 FAM19A5 유전자 또는 단편의 발현을 억제할 수 있다.
또한, 상기 shRNAi(short hairpin RNAi)는 인간 또는 생쥐상의 shRNAi 공통 염기서열 부위를 표적으로 하여 통상의 방법에 따라 제작된 것을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 퇴행성 뇌질환 또는 중추신경계 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 FAM19A5 저해제와 함께 배아신경줄기세포 또는 성체신경줄기세포를 더 포함할 수 있다. FAM19A5 저해제는 함께 사용하는 신경줄기세포의 분열 또는 분화를 조절하여 조직 회복을 돕는 신경세포의 생성을 촉진하므로 퇴행성 뇌질환 또는 중추신경계 질환 치료를 더욱 개선할 수 있다.
본 발명은 또한 약제학적 유효량의 FAM19A5 저해제를 포함하는 퇴행성 뇌질환 또는 중추신경계 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 동물의 퇴행성 뇌질환 또는 중추신경계 질환의 치료 방법을 제공한다.
상기 퇴행성 뇌질환 또는 중추신경계 질환의 치료 방법에 사용되는 약학적 조성물 및 투여 방법은 상기에서 설명하였으므로, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
한편, 상기 퇴행성 뇌질환 또는 중추신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 투여할 수 있는 개체는 모든 동물을 포함한다. 예를 들어, 개, 고양이, 생쥐와 같은 인간을 제외한 동물일 수 있다.
또한, 본 발명의 의약 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다.
상기 약제학적으로 허용 가능한 담체는 의약 분야에서 통상 사용되는 담체 및 비히클을 포함하며, 구체적으로 이온 교환 수지, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질(예, 사람 혈청 알부민), 완충 물질(예, 각종 인산염, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분적인 글리세라이드 혼합물), 물, 염 또는 전해질(예, 프로타민 설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소캄륨, 염화나트륨 및 아연 염), 교질성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈계 기질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌 글리콜 또는 양모지 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 유화제, 현탁제, 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
한 양태로서, 본 발명에 따른 조성물은 비경구 투여를 위한 수용성 용액으로 제조할 수 있으며, 바람직하게는 한스 용액(Hank's solution), 링거 용액(Ringer's solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 완충 용액을 사용할 수 있다. 수용성 주입(injection) 현탁액은 소디움 카르복시메틸셀룰로즈, 솔비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는 기질을 첨가할 수 있다.
본 발명의 조성물은 전신계 또는 국소적으로 투여될 수 있으며, 이러한 투여를 위해 공지의 기술로 적합한 제형으로 제제화될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여 시에는 불활성 희석제 또는 식용 담체와 혼합하거나, 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐에 밀봉되거나 또는 정제로 압형하여 투여할 수 있다. 경구 투여용의 경우, 활성 화합물은 부형제와 혼합되어 섭취형 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다.
주사용, 비경구 투여용 등의 각종 제형은 당해 기술 분야 공지된 기법 또는 통용되는 기법에 따라 제조할 수 있다. FAM19A5는 식염수 또는 완충액에 잘 용해되므로 냉동 건조 상태로 보관한 후, 유효량의 FAM19A5을 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등에 적합한 형태로 식염수 또는 완충액에 투여 직전에 용액으로 제제화하여 투여할 수도 있다.
본 발명의 의약 조성물의 유효성분의 유효량은 질환의 예방, 억제 또는 경감 효과를 이루는데 요구되는 양을 의미한다.
따라서, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 예컨대, 성인의 경우, 1일 1회 내지 수회 투여시, 본 발명의 저해제는 1일 1회 내지 수회 투여시, 화합물일 경우 0.1ng/kg~10g/kg, 폴리펩타이드, 단백질 또는 항체일 경우 0.1ng/kg~10g/kg, 안티센스-올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNAi, miRNA일 경우 0.01ng/kg∼10g/kg의 용량으로 투여할 수 있다.
본 발명은 또한 FAM19A5(family with sequence similarity 19, member A5) 유전자를 후보물질과 인체 외에서 접촉시키고, 상기 후보물질이 상기 유전자의 발현을 촉진하는지 또는 억제하는지를 판단하는 것을 포함하는 뇌질환 또는 중추신경계 질환의 예방 또는 치료용 의약의 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 FAM19A5(family with sequence similarity 19, member A5) 단백질을 후보물질과 인체 외에서 접촉시키고, 상기 후보물질이 상기 단백질의 기능 또는 활성을 증진하는지 또는 억제하는지를 판단하는 것을 포함하는 뇌질환 또는 중추신경계 질환의 예방 또는 치료용 의약의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 스크리닝 방법에 따르면, 먼저 상기 유전자 또는 단백질을 포함하는 뇌질환 또는 중추신경계 질환 세포에 분석하고자 하는 후보물질을 접촉시킬 수 있다.
상기 후보물질은 통상적인 선정방식에 따라 FAM19A5 유전자 염기서열에서 mRNA, 단백질로의 전사, 번역을 촉진하거나 억제하는 물질 또는 FAM19A5 단백질의 기능 또는 활성을 증진하거나 억제하는 의약으로서의 가능성을 지닌 것으로 추정되거나 또는 무작위적으로 선정된 개별적인 핵산, 단백질, 펩타이드, 기타 추출물 또는 천연물, 화합물 등이 될 수 있다.
이후, 후보물질이 처리된 세포에서 상기 유전자의 발현양, 단백질의 양 또는 단백질의 활성을 측정할 수 있으며, 측정 결과, 상기 유전자의 발현양, 단백질의 양 또는 단백질의 활성이 증가 또는 감소되는 것이 측정되면 상기 후보물질은 뇌질환 또는 중추신경계 질환을 치료 또는 예방할 수 있는 물질로 판단할 수 있다.
상기에서 유전자의 발현양, 단백질의 양 또는 단백질의 활성을 측정하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 수행될 수 있는데, 예를 들면, 이에 제한되지는 않으나, 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion) 및 면역침전분석법(immunoprecipitation assay) 등을 이용하여 수행할 수 있다.
본 발명의 스크리닝 방법을 통해 얻은, 유전자 발현을 증진시키거나 단백질의 기능을 증진시키는 활성을 나타내는 후보물질 및 반대로 유전자 발현을 억제시키거나 단백질의 기능을 억제시키는 활성을 나타내는 후보물질은, 전자의 경우, 초기 외상성 뇌손상 치료제 후보물질이 될 수 있고, 후자의 경우는 퇴행성 뇌질환 또는 중추신경계 질환 치료제 후보물질이 될 수 있다.
이와 같은 퇴행성 뇌질환 또는 중추신경계 질환 치료제 후보물질은 이후의 퇴행성 뇌질환 또는 중추신경계 질환 치료제 개발과정에서 선도물질(leading compound)로서 작용하게 되며, 선도물질이 FAM19A5 유전자 또는 그로부터 발현되는 단백질의 기능을 촉진 또는 억제효과를 나타낼 수 있도록 그 구조를 변형시키고 최적화함으로써, 새로운 퇴행성 뇌질환 또는 중추신경계 질환 치료제를 개발할 수 있다.
본 발명에서 유전공학적 기술과 관련된 사항은 샘브룩 등의 문헌(Sambrook, et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001)) 및 프레드릭 등의 문헌(Frederick M. Ausubel et al., Current protocols in molecular biology volume 1, 2, 3, John Wiley & Sons, Inc. (1994))에 개시되어 있는 내용에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
<실시예 1> 생물정보학을 이용한 신규 분비성 FAM19A5 펩타이드의 발견
FAM19A5의 유전자 선별 작업은 생물정보학적 접근 모델을 통하여 가능하였다. 본 발명자들은 Ensemble (http://www.ensembl.org/index.html) 및 UniprotKB (http://www.uniprot.org/uniprot)로부터 인간유전체 유전자 약 50,000여종의 번역 가능 영역(open reading frame, ORF)을 내려 받았다. 이들 중에서 생리활성 펩타이드로서의 가능성을 가진 분자를 식별하기 위해 SignalP3.0 프로그램을 사용하여 세포에서 분비될 가능성을 지닌 유전자(secretome) 약 2,000여종을 선별하였다. UniprotKB에 있는 정보를 바탕으로 선별된 ORF를 분석한 결과 약 600여종의 ORF가 펩타이드를 암호화하고 있는 유전자(peptidome)로 밝혀졌고, 이중에서 560여종은 이미 그 기능을 알고 있는 유전자이나 나머지 40여종은 아직 기능이 알려져 있지 않은 새로운 펩타이드를 암호화하는 유전자로 분리되었다.
이들 중 FAM19A5 유전자는인간을포함한다양한척추동물에서발견되었다. FAM19A5는 세포 외부로 분비될 수 있는 신호로서 아미노기 말단의 전형적인 신호 펩타이드(signal peptide)를 암호화하는 유전자 서열을 포함하고 있으며 그에 이어 성숙한 FAM19A5의 아미노산 서열을 가진다. 특히 FAM19A5 단백질의 아미노산의 서열은 종간 매우 잘 보존되어 있었다(도 1A). 상기와 같은 비교유전체학적 분석법은 새롭게 밝혀진 신규 유전자가 실질적인 기능을 갖는지를 검증할 수 있는 신뢰성 있는 실험적 모델로 인정받고 있다[Robbins, J Comput Biol 3:465-478,1996].한편 선행기술 문헌결과에 따르면 CC-chemokine 유전자가 Alzheimer's Disease 뇌에서 많이 발현되는 것을 확인하고 CC-chemokine 가족 유전자인 MIP-1α가 신경교세포를 증식시켜 퇴행성 뇌질환을 악화시킨다는 메커니즘을 분석한 논문이 있으나 FAM19A 가족 유전자는 CC-chemokine 가족 유전자와는 엄연히 다른 독자적인 branch를 형성하는 것을 계통수(phyrogenetic tree)를 통해 확인할 수 있다(도 1B)[MengQi Dia et al., American Journal of Pathology, 1998].
<실시예 2> 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)법을 통한 다양한 조직 내 FAM19A5 유전자의 발현 검증
6주령의 검은 수컷 생쥐(C57BL/6, mouse)는 대한바이오링크 (http://www.dhbiolink.com)로부터 구입하였다. 구입한 생쥐는 사료와 물이 적절히 주어지고 20-24 ℃로 온도가 유지되며, 40-70%의 습도가 있는 쥐 우리(cage)에서 사육되었다. 또한 이 야생형 생쥐는 빛 개시가 8:00 am이고 빛 꺼짐이 8:00 pm인 12/12 Light/Dark cycle에서 보관되었다. 모든 실험은 가장 적은 수의 생쥐를 사용하도록 설계되었으며 실험동물윤리에 따라 마취법을 실시하여 실험에 사용된 생쥐의 고통을 최소화하였고, 이는 고려대학교의 동물 관리 및 이용 위원회에 의해 증명되었다(Animal Care and Use Committee of the Korea University, KUIACUC-08).
생쥐로부터 각각에 해당하는 조직의 모든 RNA를 추출한 다음 역전사효소(Reverse transcriptase)와 Random hexamer를 사용하여 상보성 DNA(complementary DNA, cDNA)를 만든 후, 해당 프라이머를 이용하여 중합연쇄반응법(PCR)을 수행하여 생쥐 조직의 mRNA 분포를 보았다. PCR에 사용된 프라이머 정보는 표 1에 나열하였다.
도 2에 나타난 바와 같이, FAM19A 가족 유전자 중 FAM19A3 유전자를 제외하고 나머지 유형 모두가 뇌 특이적으로 발현되었다. 또한 발생 초기에서도 FAM19A 가족 유전자의 발현을 관찰하였다.
표 1
Figure PCTKR2013001179-appb-T000001
<실시예 3> 동소보합결합법(In situ hybridization)을 통한 발생 시기별 FAM19A5 유전자의 발현 검증
발생 과정 중 대뇌 피질에서의 FAM19A 가족 유전자의 발현 양상을 알아보고자 동소보합결합법을 이용하여 mRNA의 양을 비교하였다. 상기의 방법과 동일하게 관리된 태생 전 임신 14일(Embryonic day, E14)부터 분만 후 21일 (Postnatal day, P21)의 생쥐(Wistar rat)를 희생시켜(decapitation) 두개골로부터 뇌를 얻었다. 태생 전의 랫트는 다른 종류의 실험 생쥐인 마우스보다 몸 크기가 크기 때문에 실험상의 취급이 용이하므로 발생 시기별 FAM19A5 유전자 발현을 비교하기 위해 사용하였다.
꺼낸 뇌를 드라이 아이스 위에서 차갑게 유지시킨 이소펜탄(isopentane) 용액에 옮겨 얼렸다. 얼린 뇌 조직을 12 ㎛로 얇게 절편화(section)하여 TESPA(sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)가 코팅된 슬라이드 글라스에 붙이고(Thaw-mounted), 4% 파라포름알데하이드가 포함된 인산완충식염수(Phosphate buffered saline, PBS)용액에 고정하였다. 그 후 0.25% 아세트산 무수물(acetic anhydride)이 포함된 0.1M 트리에탄올아민(triethanolamine)/0.9% NaCl(pH8.0) 용액으로 아세틸화(acetylated) 반응을 시키고, 이후 에탄올과 클로로포름 용액을 이용해 탈수화와 탈지화 과정을 거쳐 공기 중에서 건조시켰다. 한편 절편화된 조직들은 35S가 표지된 탐침자(probe)를 이용하여 55℃에서 이종화(hybridized)반응을 시켰고 상온에서 2×SSC 용액으로 씻어내었다. RNA 분해효소(RNase)를 처리한 후, 슬라이드를 1mM 디티오트레이톨(dithiothreitol)이 함유된 2×SSC, 1×SSC, 0.5×SSC, 0.1×SSC 용액으로 상온에서 각각 10분씩 순차적으로 씻어 내었다. 마지막으로 조직절편들을 탈수화 시키고 공기건조를 수행한 후, 뇌 조직절편을 포함하고 있는 슬라이드 글라스를 X-ray film(Biomax MR, Kodak, Rochester, NY, USA)에 감광시켰다.
한편, 탐침자의 생성을 위해 성체 생쥐의 대뇌피질(cerebral cortex)로부터 모든 RNA를 추출한 다음 역전사효소(Reverse transcriptase)와 프라이머로서 랜덤 헥사머(Random hexamer)를 사용하여 cDNA를 만든 후, T-vector(Promega, Madison, WI, USA)로의 클로닝을 실시하였다. PCR에 사용된 프라이머의 정보는 표 2에 나열하였다. 클로닝된 T-vector를 주형으로 하여 [35S]UTP(AmershamPharmaciaBiotech,Piscataway,NJ,USA)가 포함된 상태에서 in vitro transcription system(Promega, Madison, WI, USA)을 수행하였고, 생성된 방사선 표지의 안티센스 리보탐침자(riboprobes)를 순화(purify)하여 본 이종화 반응에 이용하였다.
표 2
Figure PCTKR2013001179-appb-T000002
생쥐 뇌의 절편화 계획은 후각망울(olfactory bulb)이 있는 앞쪽(rostral)부터 소뇌(cerebellum)가 있는 뒤쪽(caudal)까지의 총체적인 관상면절단법(coronal plane)과 시상면절단법(sagital plane)을 통하여 스크리닝 되었다.
도 3에 나타난 바와 같이, FAM19A 가족 유전자의 mRNA의 발현 중 FAM19A5 mRNA만이 뇌실 영역(ventricular zone)과 척수(spinal cord)에 강하게 분포하였다. 태생 전 임신 14일(E14)과 16일(E16)에 FAM19A5는 뇌실 영역에 제한되어 강하게 발현하며 임신 18일(E18)에도 여전히 뇌실 영역 및 뇌실하 영역에서의 발현이 높게 나타나며 분화된 신경세포가 위치한 피질판에서는 그 발현이 훨씬 약하게 나타났다.
FAM19A5 유전자 발현이 신경줄기세포의 군집이 분포하는 것으로 알려진 중추신경계의 두 영역에 강하게 나타나는 것은 FAM19A5 단백질이 완전한 중추신경계의 형성에 중요하며 그를 구성하는 신경세포 생성 및 신경교세포 생성에 관여할 가능성을 최초로 입증한 것이다.
<실시예 4> FAM19A5 특이 항체 제작
FAM19A5 단백질을 특이적으로 인지할 수 있는 항체를 제작하기 위해 짧은 합성 FAM19A5를 토끼에 접종하여 다클론 항체를 얻을 수 있었다. 해당 항체는 HEK293T 세포에 과발현시킨 FAM19A 가족 유전자 중 FAM19A5 만을 특이적으로 인지하였다(도 4A). 또한 N-glicosidase F를 처리 했을 때 FAM19A5의 성숙한 단백질인 20 kDa 밴드가 사라지는 것으로 보아 이는 N-glycosylated 형태임을 확인하였다(도 4B). 또한 His가 연결된 FAM19A5를 발현하는 HEK293T 세포를 각각의 항체가 특이적으로 인지하는 것을 면역세포화학법을 이용해 관찰하였다(도 4C).
<실시예 5> 면역조직화학법(Immunohistochemistry)을 통한 발생 과정 중 FAM19A5 단백질 발현 측정
번역 후 FAM19A5 단백질 발현 양상 역시 유사하게 나타나는지 관찰하기 위해 면역조직화학법을 이용하였다. 상기의 방법으로 관리된 태생 전 임신 12일(Embryonic day, E12)부터 18일(E18)의 생쥐를 희생시켜 두개골로부터 뇌를 얻었다. 4% 파라포름알데하이드가 함유된 인산완충식염수로 24시간에서 48시간 동안 후 고정(post-fixation)하였고, 30%의 수크로우즈가 함유된 인산완충식염수로 24시간 가량 처리하였다. 이후 뇌 조직용 주형(mold)에 놓고 30%의 설탕용액을 포함한 OCT 합성물을 담아 드라이 아이스 위에서 얼리고 이용되기 전까지 -80℃에서 보관하였다.
생쥐의 뇌에서 면역조직화학법을 통한 FAM19A5 단백질의 발현 부위와 강도를 확인하기 위하여 FAM19A5 단백질과 반응할 수 있는 항체는 상기 실시예 4에서 제조한 다클론 항체인 anti-FAM19A5를 사용하였다. 보관된 생쥐의 뇌 조직을 냉동미세절단기(cryostat microtome)을 이용하여 40㎛로 얇게 절단하고 뇌 조직절편을 PBS 용액에서 30분간 씻어내고 10% 염소혈청이 포함된 PBS-T용액(10% TritonX-100이 인산완충식염수에 포함된 용액)으로 1시간 가량 블로킹 하였다. 결과적으로 보여질 형광이미지에서 주변의 비특이적 항원-항체 반응을 지양하고, FAM19A5 특이적 발현부위를 좀 더 정확히 구분하기 위하여 FAM19A5 항체:블로킹 용액의 비율이 1:500이 되도록 하였다. FAM19A5 항체와 항원의 반응은 4℃에서 밤새도록 실시하거나, 상온(25 ℃)에서 3시간 가량 실시하였다. 1차 항체-항원반응이 끝난 후 인산완충식염수로 10분간 세 차례 뇌 조직절편을 씻어낸 후 2차 항체로 FITC가 결합된 anti-rabbit IgG (Invitrogen, USA)를 1:500의 비율로 희석하여 사용하였다. 2차 항체-항원반응이 끝난 후 인산완충식염수로 10분간 세 차례 뇌 조직절편을 씻어낸 후 슬라이드 글라스 위로 조직을 편평하게 봉입시켰다(mounting). 상온에서 약 5분간 건조시킨 후, crystal/mount 용액(Biomeda, USA)을 조직 위에 도포하여 커버 글라스를 덮어 표본을 준비하였다. 준비된 표본의 형광 이미지는 공초점 현미경(Zeiss LSM 510 confocal microscopy)을 이용해 얻었다.
신경줄기세포나 신경전구세포에는 네스틴(nestin)이라는 중간세사(intermediate filament) 단백질이 존재하므로 이를 표지자(marker)로 사용하였다[Lendahl et al., Cell 60:585-595,1990].네스틴은 발생 초기에는 신경관 형성 이전에 이미 신경판에서부터 발현하는 것으로 관찰되었다[Woodbury et al.,J Neurosci Res 61:364-370,2000].신경아세포의 경우는 미세소관결합단백질인 더블코르틴(doublecortin, DCX)이 존재하므로 이를 표지자로 사용하였다. 네스틴과 DCX는 2차 항체로 CY3가 결합된 anti-mouse, goat IgG (Invitrogen, USA)를 1:500의 비율로 희석하여 사용하였다.
도 5에 나타난 바와 같이, 흥미롭게도 동소보합결합법을 이용한 실험결과와 같이 단백질 수준에서도 뇌실 영역에서 FAM19A5 단백질의 발현이 강하게 나타났다. 뇌실 영역에 주로 분열중인 전구세포가 분포하는 시기인 임신 12일(E12)에는 FAM19A5 펩타이드가 주로 뇌실 영역 도처에 발현되고 임신 14일(E14), 18일(E18)에도 여전히 그 발현도가 높게 나타남을 보인다. 피질판에서의 발현양은 동소보합결합법에서의 결과와 마찬가지로 더 낮게 관찰되었다. 네스틴을 포함하는 전구세포에서 FAM19A5 단백질이 점상 형태로 나타나며 DCX를 포함하는 신경아세포에서는 그 발현이 약한 것으로 나타났다. 어떤 유전자의 경우, 전사 후 혹은 번역 후 공정과정 등으로 단백질 발현과 mRNA의 발현 수준이 다를 수 있으나[Wellington et al., Lab Invest 82:273-283,2002]본 실험에서는 상호 동일한 발현양상을 보였다.
실시예 3과 더불어 실시예 5의 결과는 발생 과정중의 뇌 조직에서 FAM19A5 단백질의 동정, 발현 위치, 그리고 발현 수준 혹은 발현 강도를 제시하는 것으로 FAM19A5이 중추신경계를 만드는 신경줄기세포에서 발현되며 신경세포 생성 및 신경교세포 생성에 관여할 것이라 생각된다.
<실시예 6> 면역조직화학법을 통한 성체신경줄기세포에서의 FAM19A5 단백질 발현 측정
태생 전 생쥐와 동일하게 성체 생쥐의 뇌에서 면역조직화학법을 통한 FAM19A5 단백질의 발현 부위와 강도를 확인하였다.
이를 위해, 상기의 방법으로 관리된 4주령의 수컷 생쥐는 우레탄 0.5cc/100 g으로 복강 마취가 실시되었고, 흉부 가죽을 절개하여 좌심방(left cardiac ventricle)에 링거 바늘을 꽂아 0.9% 생리식염수 200mL로 혈액을 빼낸 후, 200mL의 4% 파라포름알데하이드가 함유된 0.9% 생리식염수로 관류하여 고정하였다. 고정된 쥐의 뇌를 적출한 후, 4% 파라포름알데하이드가 함유된 인산완충식염수로 24시간에서 48시간 동안 후 고정하였고, 30%의 설탕이 함유된 인산완충식염수로 24시간 가량 처리하였다. 이후 뇌 조직용 주형(mold)에 놓고 30%의 설탕용액을 포함한 OCT 합성물을 담아 드라이 아이스 위에서 얼리고 이용되기 전까지 -80℃에서 보관하였다. 태생 전 생쥐와 동일하게 성체 생쥐의 뇌에서 면역조직화학법을 통한 FAM19A5 단백질의 발현 부위와 강도를 확인하기 위하여 FAM19A5 항체를 사용하였다. 또한 성체신경줄기세포인 뇌실막세포와 성상세포는 신경교 섬유질 산성 단백질(Glial fibrillary acidic protein, GFAP, Invitrogen, USA)이라는 중간세사단백질이 존재하여 이를 표지자로 사용하였다.
도 6A에 나타난 바와 같이, 발생 시기의 실험결과와 마찬가지로 성체 신경줄기세포 군집이 분포하는 것으로 알려진 뇌실하 영역 (subventricular zone, SVZ)에 FAM19A5의 발현도가 높게 나타났다.
따라서, FAM19A5의 발현은 신경아세포보다는 신경줄기세포에서의 발현이 높게 나타나는 것으로 결론내릴 수 있다.
FAM19A5의 단백질 양이 분화된 조건에서 감소하는 지를 알아보았다. 이를 위해 SVZ-RMS-OB tract에 초점을 맞추어 실험을 진행하였다.
SVZ에서 신경아세포는 RMS(Rostral migratory stream)를 거쳐 후각 신경구(Olfactory bulb, OB)로 이동하고 마침내 성숙한 간재뉴런(interneuron)으로 분화하게 된다. FAM19A5는 OB보다 SVZ-RMS에서 발현이 더 높게 나타나는 것으로 보아 이는 분화과정을 거치면서 단백질 양이 감소하는 것으로 생각된다(도 6B).
<실시예 7> 성체신경줄기세포에서 발생하는 신경구에서의 FAM19A5 발현 측정
신경줄기세포를 계속적으로 증식시키는 기술이 향상되어 신경구(neurosphere)라는 신경줄기세포로부터 발생하는 세포덩어리를 만들 수 있다. 이러한 기술을 다양한 실험에 이용할 수 있게 되었고 신경줄기세포의 특성을 역으로 추적해 나갈 수 있는 유용한 실험 모델로 사용 중이다[Reynolds and Weiss, Science 255:1707-1710,1992; Reynolds and Weiss,Dev Biol 275:1-13,1996].
성체신경줄기세포를 얻기 위해 3주∼8주령의 수컷 생쥐로부터 뇌를 적출하고 성체신경줄기세포 군집이 위치하는 것으로 알려진 뇌실하 영역(subventricular zone)을 분리하기 위해 뇌 주형(brain matrices)을 사용하였다. Dispase(Invitrogen, USA)와 papain(Worthington, USA)과 같은 단백질분해효소로 조직으로부터 단일세포로 해리시키고 표피세포성장인자(epidermal growth factor, EGF, Invitrogen)와 섬유아세포성장인자(basic fibroblast growth factor, bFGF, Invitrogen)등의 성장인자를 배양액에 첨가하여 세포를 선택적으로 증식시켜 신경구를 이룬다. 성체 신경줄기세포와 더불어 태생 전 임신 12일(Embryonic day, E12)의 생쥐의 뇌로부터 대뇌피질을 분리하고 동일한 방법을 이용해 배아신경줄기세포를 선택적으로 배양하여 신경구를 얻을 수 있다.
성체신경줄기세포와 배아신경줄기세포 각각으로 구성된 신경구를 세포부착단백질인 laminin(Invitrogen, USA)을 이용하여 배양용 플레이트에 고정시킨 후 FAM19A5 단백질 발현 유무를 알아 보기 위해 면역세포화학법을 이용하였다. 4% 파라포름알데하이드가 함유된 인산완충식염수로 15분 동안 고정하였고, PBS-T 용액(0.5% TritonX-100이 인산완충식염수에 포함된 용액)으로 5분간 투과화(permeabilzation) 하였다. 30분간 블로킹 후 항원-항체 반응을 실시하였으며 핵을 관찰하기 위해 dapi 염색법을 사용하였다.
대부분의 신경구에서 FAM19A5 단백질이 발현되며, 이는 분비성 단백질이므로 세포질 내에서 점상 형태로 염색된다(도 7).
추가로, FAM19A5 단백질을 발현하는 세포의 특징을 알아보기 위해, 신경구를 다양한 신경줄기세포의 표지자로 동시 염색하였다.
그 결과, FAM19A5 단백질을 발현하는 세포는 동시에 네스틴을 발현하였다(도 8A). 이는 신경줄기세포로부터 얻은 신경구가 FAM19A5라는 물질을 연구하는데 좋은 실험 모델임을 말해준다.
또한, 신경구에서 FAM19A5 유전자 발현이 같은 가족의 다른 유형의 유전자 발현보다 강하게 나타나는지 검증하기 위해 성체신경줄기세포로부터 발생한 신경구로부터 모든 RNA를 추출한 다음 역전사효소와 랜덤 헥사머(Random hexamer)를 사용하여 cDNA를 만든 후, 해당 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 신경구 내 FAM19A5 mRNA 분포를 보았다. PCR에 사용된 프라이머의 정보는 표 1에 나열하였다.
도 8B에 나타난 바와 같이, FAM19A 가족 중 FAM19A5 mRNA가 나머지 유형에 비해 월등히 많이 분포하였다.
역전사 중합효소연쇄반응법에 이어 마이크로어레이법을 이용하여 FAM19A 가족 유전자의 발현 정도를 비교하였다. cDNA 및 표지된 cRNA 생산과 Affymetrix MOE430 v2.0 GeneChip(46k probe-sets)과의 이종화 반응은 Affymetrix사(www.affymetrix.com)에서 제공하는 기본적인 프로토콜에 따라 수행하였다. 분석을 용이하게 하기 위해 cDNA 합성 시 형광물질표지를 이용하고 발현양의 통계적인 분석을 위해서 ChipInspector software(Genomatix)를 사용하였다.
도 8C에 나타난 바와 같이, 역전사 중합효소 연쇄반응에서 보인 결과와 유사하게 다른 유형의 유전자들에 비해 FAM19A5 유전자의 발현 양이 월등히 높게 나타났다. 또한 정규화 수치(normalized level)는 4에서부터 14까지인데 수치 10 이상의 유전자 분포가 그리 많지 않다는 점을 감안했을 때 FAM19A5가 신경구에서 강한 발현을 보이는 유전자임을 말해주는 결과이다.
실시예 6과 실시예 7의 결과는 FAM19A5가 성체신경줄기세포와 배아신경줄기세포에서의 기능 혹은 그로부터 생성되는 다른 종류의 세포로의 분화과정에서 중요한 물질로 작용할 가능성을 강력히 시사한다.
<실시예 8> FAM19A5에 대한 항체의 중화작용 후 신경세포와 신경교세포의 특이적 표지자의 분석에 따른 성상세포 생성의 수적 변화
FAM19A5 단백질이 신경줄기세포에서 생성되어 분비되면서 그로부터 분화된 종류의 세포 생성에 영향을 주는지 알아보고자 FAM19A5에 대한 특이 항체를 이용하였다.
분화 실험을 위해 신경구를 Accutase(Innovative Cell Technologies, USA)를 사용해 단일 세포로 해리시켰다. 24-웰 플레이트의 각 웰에 50000개의 세포를 깔고 안정화 시키기 위해 하루 동안은 성장인자가 포함된 배양액에 두고 그 다음날 분화를 촉진시키는 인자가 포함된 분화 배양액으로 바꾸어 주었다. 6일간 분화를 유도하는 동시에 FAM19A5 항체를 500ng/mL로 매일 처리해 주었다. 세 종류의 신경계통세포인 신경세포(neuron), 성상세포(astrocyte), 희돌기세포(oligodendrocyte)를 표지하는 표지자를 이용한 면역세포화학법과 웨스턴 블랏법을 실시하였다.
도 9에 나타난 바와 같이, 흥미롭게도 FAM19A5 단백질에 대한 중화작용을 유발하는 해당 항체를 사용한 실험군은 Normal Rb IgG를 처리한 대조군에 비해 Tuj1으로 표지되는 신경세포의 수가 2배 가량 증가하였고 그에 상응하여 GFAP(Glial fibrillary acidic protein)로 표지되는 성상세포의 수가 감소하는 것으로 보였다.
결과적으로 FAM19A5 단백질이 줄기세포로부터 다른 종류의 세포로의 분화되는 과정에서 기능적인 분자로 작용할 것이며 특히 성상세포의 생성을 촉진하는 데 관여할 것으로 생각된다.
<실시예 9> FAM19A5 펩타이드와 특이 항체가 신경줄기세포의 분열에 미치는 영향
FAM19A5 단백질이 신경줄기세포에서 생성되어 분비되면서 분열에 영향을 주는지 알아보고자 FAM19A5에 대한 펩타이드와 특이 항체를 이용하였다. 분열 실험을 위해 신경구를 단일 세포로 해리시켰다. 24 웰 플레이트의 각 웰에 50000개의 세포를 깔고 성장인자가 포함된 배양액에 펩타이드 또는 항체를 처리하였다. 성장인자를 이용하여 6일간 분열을 유도하고 동시에 FAM19A5 펩타이드와 특이 항체를 500ng/mL로 매일 처리해 주었다. 마지막 날 형성된 신경구를 단일 세포로 해리시키고 세포수를 측정하였다.
도 10에 나타난 바와 같이, FAM19A5 펩타이드에 의해서 신경줄기세포의 분열이 대조군에 비해 상당히 감소하였으며 특이 항체를 처리한 경우에는 분열이 증가한 것을 관찰하였다.
<실시예 10> 외상성 뇌손상(Traumatic brain injury, TBI) 생쥐 모델에서 FAM19A5 단백질의 양적 변화
뇌 손상 이후에 FAM19A5의 단백질 양의 변화가 나타나는지 알아보고자 외상성 뇌손상 모델을 이용하였다. 8주령 생쥐의 머리를 고정시킨 후 액체 질소에 의해 충분히 차가워진 쇠막대를 두개골의 오른쪽부분에 1분간 올려두었다. 수술을 통해 다시 생쥐의 피부를 봉합하고 7일간 정상 생쥐들과 동일하게 관리하였다[Moon et al., Neuro report 22:304-308].
7일 후 복강 마취를 실시하고, 흉부 가죽을 절개하여 좌심방(left cardiac ventricle)에 링거 바늘을 꽂아 0.9% 생리식염수 200 mL로 혈액을 빼낸 후, 200mL의 4% 파라포름알데하이드가 함유된 0.9% 생리식염수로 관류하여 고정하였다. 고정된 쥐의 뇌를 적출한 후, 4% 파라포름알데하이드가 함유된 인산완충식염수로 24시간에서 48시간 동안 후 고정하였고, 30%의 설탕이 함유된 인산완충식염수로 24시간 가량 처리하였다. 이후 뇌 조직용 주형(mold)에 놓고 30%의 설탕용액을 포함한 OCT 합성물을 담아 드라이 아이스 위에서 얼리고 이용되기 전까지 -80℃에서 보관하였다. 보관된 생쥐의 뇌 조직을 냉동미세절단기(cryostat microtome)을 이용하여 40㎛로 얇게 절단한 후 면역조직화학법을 실시하였다.
성숙한 성상세포의 경우에 외부의 손상을 받게 되면 역분화 과정을 거쳐 방사신경아교세포(radial glial cell)가 되는데 이 종류의 세포들은 네스틴이라는 전구세포 표지자를 발현해 내고 그 위치에서 아교세포(glial cell)를 생성해 낸다.
도 11A에 나타난 바와 같이, 손상 부위(Penumbra)에 FAM19A5 단백질을 발현하는 세포가 현저히 증가한 것을 관찰하였으며 손상 부위에 위치한 방사신경아교세포는 표지자인 네스틴을 발현함과 동시에 FAM19A5를 발현하며 손상을 받지 않은 대조군에 비해 확연히 수적으로 증가한 것을 볼 수 있었다.
또한, 굉장히 적은 비율이기는 하지만 뇌실하 영역에서 뇌량(corpus collosum, CC)을 거쳐 뇌손상 영역으로 이동해 가는 신경아세포(neuroblast)는 FAM19A5 펩타이드를 발현하지 않았다. 손상 부위 외에도 신경줄기세포 군집이 위치하는 뇌실하 영역 주변부로 FAM19A5 단백질을 발현하는 세포 수가 증가하였고 이들은 성상세포의 표지자인 GFAP를 동시에 발현하고 있었다. 결과적으로 신경줄기세포에서 생성되는 FAM19A5 펩타이드가 신경세포의 생성보다는 성상세포의 생성에 관여할 가능성이 더 클 것으로 생각된다.
한편, 분비성 인자인 FAM19A5는 뇌손상 이후 뇌혈관장벽이 붕괴된 상태에서 혈액 내로 유출되어 나올 가능성이 크다. 만약 그렇다면 발현 유무 혹은 발현 정도를 확인하여 뇌손상 질환 또는 뇌질환의 발병 여부, 발전 및 경감 들을 판단할 수 있는 진단용 마커로의 개발이 가능해진다. 이를 알아보기 위해 정상 생쥐와 뇌 손상 이후 FAM19A5의 발현이 가장 높은 것으로 생각되는 7일 생쥐로부터 혈액을 얻고 응고과정을 거친 후 혈청만을 따로 분리하고 방사면역검정법을 실시하였다.
표준곡선을 이용해 혈청내 단백질 양을 측정한 결과 놀랍게도 뇌손상 후 7일이 지난 생쥐의 혈청에서는 정상 생쥐에 비해 7배 이상의 FAM19A5 단백질이 검출되었다(도 11B).
<실시예 11> 외상성 뇌손상(Traumatic brain injury, TBI)이후 시간에 따른 FAM19A5 단백질의 양적 변화
외상성 뇌손상 이후 시간에 따른 FAM19A5 단백질의 양적 변화를 GFAP를 발현하는 반응성 성상세포에 제한하여 살펴보았다.
도 12에 나타난 바와 같이, 손상 후 3일이 지났을 때는 GFAP로 표지되는 성상세포에서의 FAM19A5의 발현은 비교적 낮았고 5일 후에는 발현이 증가하기 시작하며 7일까지는 지속적으로 증가하는 것을 확인했다.
<실시예 12> 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)에 나타나는 FAM19A5 단백질의 양적 증가 측정
ALS 모델 동물인 mSOD1 G93A Tg 생쥐에서 ALS 증상이 발현되는 시기의 조직을 대상으로 면역염색을 시행한 결과, 도 13A에 나타난 바와 같이, mSOD1 G93A 생쥐의 척수에는 동일 연령의 생쥐에 비하여 매우 높은 수준으로 FAM19A5의 발현이 증대되어 있음을 관찰하였다. 이러한 발현의 증대는 특히 ALS에서 주로 퇴행 사멸하는 운동뉴런이 분포하고 있는 전각(ventral horn)에서 강하게 보였다. 이 시기 mSOD1 G93A 생쥐의 척수에서는 교세포의 증식이 관찰되는데 이러한 병적 변성과정 역시 GFAP 이중염색을 통하여 검출되었다. 하단의 확대 사진은 mSOD1 G93A 생쥐의 전각에 대한 고배율 이미지이다. GFAP로 표지된 교세포 대부분이 높은 수준의 FAM19A5 발현을 보이고 있음을 알 수 있다. 한편 사진 중앙에 분포한 세포(화살표 표시)는 핵이 둥글고 크며, GFAP로 염색되지 않은 것으로 보아 퇴행중인 운동뉴런으로 생각되는데, 여기서도 강한 FAM19A5의 발현이 관찰되었다. Hoechst를 통하여 핵은 청색 형광으로 대조표지하였다.
또한, 면역블랏팅(Immunoblotting)을 통해서도 발현 변화를 조사한 결과, 야생형(WT)생쥐에 비하여 ALS 모델 생쥐(TG)의 척수에서는 매우 높은 수준으로 FAM19A5의 발현이 증가되어 있음을 관찰할 수 있었다(도 13B).
실시예 10과 동일하게 방사면역검정법을 실시한 결과 ALS 모델 생쥐의 혈청 내 FAM19A5 단백질 양은 정상 생쥐에 비해 3배 이상 높게 검출되었다(도 13C).
따라서 외상성 뇌손상을 포함하는 뇌손상모델과 근위축성 측삭 경화증을 포함하는 척수손상질환모델에서 FAM19A5의 검출을 통해 중추신경계 손상의 표지물질로의 개발이 가능할 것으로 생각된다.
<실시예 13> 외상성 뇌손상(Traumatic brain injury, TBI) 이후 FAM19A5 항체 처리에 따른 반응성 성상세포 증식증의 지연효과
뇌손상이 유도된 이후 발현이 증가되는 FAM19A5 단백질의 기능을 알아보기 위해 손상을 유도한 다음날 FAM19A5 항체를 쥐꼬리의 정맥에 주입하였다. 외상성 뇌손상이 주어지면 손상지역 주변의 뇌혈관장벽이 붕괴되었을 것이고 그 주변 뇌조직으로 항체가 유입될 것이라는 생각이었다.
FAM19A5의 항체를 주입한 경우에만 이차항체에 따른 형광신호를 관찰할 수 있었다(도 14).
손상 하루 후 항체를 주입하고 손상을 유도한 날을 기준으로 3, 5, 7일이 지난 후 다양한 세포 표지자를 이용하여 변화를 관찰하였다.
도 15에 나타난 바와 같이, 3일이 지난 후 FAM19A5 항체를 주입한 생쥐모델의 경우 Normal rabbit IgG를 주입한 대조군에 비해 손상 조직의 근접부위에서 GFAP를 발현하는 반응성 성상세포 생성이 억제되었다. 이와 같은 현상은 5일이 지난 후에 더 현저히 나타났으며 7일이 지난 후에도 약하게 유지되었다. 따라서 항체를 통한 분비된 FAM19A5의 억제는 주변세포에 영향을 주고 특히 손상 후에 나타나는 반응성 성상세포 증식증을 지연시키는 것으로 생각된다.
한편 손상 후 생성되는 반응성 성상세포는 예정된 세포사멸을 막아주는 GDNF와 같은 신경성장인자를 분비함과 동시에 글루탐산을 회수하는 역할을 하여 신경세포에 미치는 독성을 제거하는 긍정적인 역할을 한다. 따라서 FAM19A5 항체에 따른 반응성 성상세포 증식증의 지연을 통해 신경세포를 보호하는 기능에 부정적인 영향을 미치는지 TUNEL 염색을 통해 알아보았다.
도 16에 나타난 바와 같이, 신경세포의 표지자인 NeuN을 발현하는 세포가 동시에 TUNEL 염색이 되지 않은 것을 보았고 이는 반응성 성상세포의 소실이 신경세포를 사멸시키지 않는 것으로 확인되었다.
실시예 10에 따르면 외상성 뇌손상 이후 손상부위에 생성되는 반응성 성상세포는 FAM19A5 단백질을 강하게 발현하는 것으로 나타났다. 이를 토대로 외상성 뇌손상 후 FAM19A5 항체를 처리한 생쥐 모델에서 FAM19A5 단백질이 발현되는 반응성 성상세포의 위치를 알아보았다.
예측대로 FAM19A5 항체를 주입시킨 손상모델에서는 FAM19A5 단백질을 발현하는 성상세포가 대조군에 비해 손상부위와는 비교적 멀리 떨어져 위치하는 것을 관찰하였다(도 17).
<실시예 14> 외상성 뇌손상(Traumatic brain injury, TBI) 이후 FAM19A5 항체 처리에 따른 NG2 회돌기교 전구세포의 수적 감소
위와 동일한 실험방법을 이용하여 FAM19A5 항체가 다른 종류의 신경교세포의 생성에도 영향을 주는지 알아보기 위해 여러 종류의 신경교세포의 표지자로 염색해 보았다.
뇌 손상 5일 후 손상부위에서 Neuron-glial antigen 2(NG2)를 발현하는 회돌기교 전구세포의 수적 감소가 보였다(도 18A).
한편 손상된 뇌조직에서의 분열하는 NG2 세포는 성숙한 수초를 만드는 회돌기교세포가 되는 것으로 알려져 있기 때문에 Myelin basic protein(MBP)로 표지되는 성숙한 회돌기교세포를 관찰하였는데 이 역시 수적 감소를 보였다(도 18B).
따라서 뇌손상 이후 나타나는 FAM19A5의 재활성화는 NG2 전구세포의 분열을 촉진하여 주변의 신경세포의 축삭을 수초화시키는데 관여할 것으로 생각된다.
본 발명의 FAM19A5 또는 이의 저해제는 줄기세포 분열 또는 분화 조절제, 중추신경계 손상, 퇴행성 뇌질환 또는 중추신경계 질환의 진단 키트 또는 칩, 또는 치료제로 사용할 수 있다.

Claims (14)

  1. 분열 또는 분화 조절제로, FAM19A5(family with sequence similarity 19, member A5) 또는 이의 저해제를 포함하는 줄기세포의 분열 또는 분화 조절용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    줄기세포는 배아신경줄기세포 또는 성체신경줄기세포인 줄기세포의 분열 또는 분화 조절용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    FAM19A5의 저해제는 안티센스-올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA, miRNA 또는 이를 포함하는 벡터; 또는, 항체 중 어느 하나인 줄기세포의 분열 또는 분화 조절용 조성물.
  4. FAM19A5(family with sequence similarity 19, member A5) 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 중추신경계 손상, 퇴행성 뇌질환 또는 중추신경계 질환 진단용 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 유전자의 mRNA를 측정하는 제제는 상기 유전자의 mRNA에 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 중추신경계 손상, 퇴행성 뇌질환 또는 중추신경계 질환 진단용 조성물.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 단백질의 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 중추신경계 손상, 퇴행성 뇌질환 또는 중추신경계 질환 진단용 조성물.
  7. 제4항에 있어서,
    중추신경계 손상, 퇴행성 뇌질환 또는 중추신경계 질환은 외상성 뇌손상(traumatic brain injury), 근위축성 측삭 경화증, 알츠하이머 질환, 헌팅톤병, 파킨슨병, 뇌졸중 또는 뇌종양을 포함하는 중추신경계 손상, 퇴행성 뇌질환 또는 중추신경계 질환 진단용 조성물.
  8. FAM19A5(family with sequence similarity 19, member A5)를 포함하는 초기 외상성 뇌손상(traumatic brain injury) 치료용 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    FAM19A5는 천연 또는 재조합 FAM19A5 단백질, FAM19A5 단백질을 과발현하는 형질전환 신경줄기세포 및 상기 신경줄기세포에서 분화된 성상세포로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 초기 외상성 뇌손상(traumatic brain injury) 치료용 조성물.
  10. FAM19A5(family with sequence similarity 19, member A5) 저해제를 포함하는 퇴행성 뇌질환 또는 중추신경계 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    FAM19A5 저해제는 안티센스-올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA, miRNA 또는 이를 포함하는 벡터; 또는, 항체 중 어느 하나인 퇴행성 뇌질환 또는 중추신경계 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  12. 제10항에 있어서,
    배아신경줄기세포 또는 성체신경줄기세포를 더 포함하는 퇴행성 뇌질환 또는 중추신경계 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  13. FAM19A5(family with sequence similarity 19, member A5) 유전자를 후보물질과 인체 외에서 접촉시키고, 상기 후보물질이 상기 유전자의 발현을 촉진하는지 또는 억제하는지를 판단하는 것을 포함하는 뇌질환 또는 중추신경계 질환의 예방 또는 치료용 의약의 스크리닝 방법.
  14. FAM19A5(family with sequence similarity 19, member A5) 단백질을 후보물질과 인체 외에서 접촉시키고, 상기 후보물질이 상기 단백질의 기능 또는 활성을 증진하는지 또는 억제하는지를 판단하는 것을 포함하는 뇌질환 또는 중추신경계 질환의 예방 또는 치료용 의약의 스크리닝 방법.
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