KR20240034159A

KR20240034159A - 폴리펩티드 억제제 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20240034159A
Application number: KR1020237036420A
Authority: KR
Inventors: 성재영; 곽호윤; 오시택; 이민혁; 정용우; 하늬; 조은호; 이수현; 이상명; 이예림; 조은비; 이재근; 김한별; 권순구
Original assignee: 주식회사 뉴라클사이언스
Priority date: 2021-07-08
Filing date: 2022-07-08
Publication date: 2024-03-13
Also published as: WO2023281475A1; CN117881687A; EP4367128A1

Abstract

본 발명은 FAM19A5 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고, 이에 의해 LRRC4 단백질 패밀리의 멤버와 FAM19A5 단백질 사이의 상호작용을 억제할 수 있는 폴리펩티드를 제공한다. 일부 측면에서, 상기 폴리펩티드는 LRRC4 단백질 패밀리 멤버의 FAM19A5 결합 도메인을 포함한다. 본 발명은 또한, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드를 투여함으로써 신경돌기 성장(neurite outgrowth)을 촉진하는 방법을 제공한다.

Description

폴리펩티드 억제제 및 이의 용도

본 PCT 출원은 2021년 7월 8일에 출원된 미국 가출원 No.63/219,670의 우선권을 주장하며, 해당 출원의 명세서에 기재된 전체 내용은 본 출원에 참조로 통합된다.

EFS-웹을 통해 전자적으로 제출된 서열 목록에 대한 참조

본 출원에 .XML 파일(이름:3763.018PC01_Seqlisting_ST26.xml, 크기: 159,089바이트; 작성일: 2022년 7월 7일)로 전자 제출된 서열 내용 전체가 참조로 본 출원에 통합된다.

본 발명은 LRRC4 단백질 패밀리의 멤버 및 FAM19A5 단백질 사이의 상호작용을 특이적으로 억제, 감소, 및/또는 해리할 수 있는 폴리펩티드(예컨대, 분리 폴리펩티드)를 제공한다.

포유류 뉴런은 다른 뉴런, 근육, 및 혈관과 시냅스(synapses)를 형성하기 위해 축삭(axon) 및 수상돌기(dendrites)를 포함하는 신경돌기(neurites)를 연속적으로 돌출한다. 동시에, 뉴런은 불필요한 시냅스(예컨대, 연장된 기간동안 사용되지 않았던 것들)를 해체하기 위해 신경돌기를 철회한다. 시냅스의 획득과 손실의 균형은 건강한 중추(central) 및 말초신경계(peripheral nervous systems)에 중요하다.

그러나 다양한 요인(예컨대, 노화(aging), 세포독성 미세환경(cytotoxic microenvironment), 급성손상(acute damages), 유전적 돌연변이(genetic mutations))으로 인한 비정상적 시냅스 손실이 발생할 수 있다. 이러한 시냅스 손실의 증가는 정신지체(mental retardation), 정신분열증(schizophrenia), 자폐스펙트럼 장애(autism spectrum disorder), 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 근위축성측삭경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 다발성경화증(multiple sclerosis), 헌팅턴병(Huntington's disease), 프리온병(prion diseases), 신경병성 통증(neuropathic pain), 척수손상(spinal cord injury), 및 뇌졸중(stroke)을 포함하는 다양한 신경질환과 관련된다(예컨대, Hayashi-Takagi, Neurosci Res 114: 3-8 (Jan. 2017); Wang et al, Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry 84(Pt B): 398-415 (Jun. 2018); Jha et al, J Alzheimer s Dis 57(4): 1017-1039 (2017); Mitoma et al., IntJMolSci 21(14): 4936 (Jul. 2020); 및 Brose et al, Biochem Soc Trans 38(2): 443-4 (Apr. 2010)을 참조).

신경질환의 근본적인 원인이 항상 완전히 이해되는 것은 아니기 때문에, 현재 치료 옵션의 대부분은 장애와 관련된 증상을 치료하는 것에 초점을 맞추고 있다. 그리고, 이용 가능한 치료법이 있는 경우에도, 부작용 및/또는 제한된 효능이 있을 수 있다. 따라서 시냅스의 비정상적 손실과 관련된 것과 같은 신경질환에 더 효과적인 대체 치료 옵션이 현재 필요하다.

본 발명은 서열 유사성 19를 가진 패밀리, 멤버 A5("FAM19A5")에 결합할 수 있는 류신 풍부 반복 함유 4("LRRC4") 단백질 패밀리 멤버의 도메인을 포함하는, 구성되는, 또는 필수적으로 구성되는 분리 폴리펩티드로서, 상기 폴리펩티드는 상응하는 전장(full-length) LRRC4 단백질 패밀리 멤버(서열번호 4; 서열번호 5; 또는 서열번호 6) 보다 짧은 분리된 폴리펩티드를 제공한다.

일부 측면에서, FAM19A5 결합 도메인은 약 10 내지 약 23개의 아미노산 길이이다. 일부 측면에서, 상기 FAM19A5 결합 도메인은 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18, 약 19, 약 20, 약 21, 약 22, 또는 약 23개 아미노산 길이이다. 일부 측면에서, 상기 FAM19A5 결합 도메인은 약 10개의 아미노산 길이이다.

일부 측면에서, 상기 FAM19A5 결합 도메인은 FAM19A5 단백질 및 LRRC4 단백질 패밀리 멤버 사이의 상호작용을 억제, 감소, 및/또는 해리할 수 있다.

일부 측면에서, 상기 FAM19A5 결합 도메인은 하기 화학식을 갖는 아미노산 서열(N-말단에서 C-말단)을 포함한다:

A-(T/S)-B (화학식 Ⅰ):

여기서, (i) A는 X1-(T/S)-(Y/F)-F-X5를 포함하고;

X1은 티로신(Y), 페닐알라닌(F), 발린(V), 류신(L), 또는 이소류신(I)이고;

(T/S)는 트레오닌(T), 또는 세린(S)이고;

(Y/F)는 티로신(Y) 또는 페닐알라닌(F)이고;

X5는 임의의 아미노산이고;

(ii) B는 (V/I)-T-V-(E/V)를 포함하고;

(V/I)는 발린(V) 또는 이소류신(I)이고;

(E/V)는 글루탐산(E) 또는 발린(V)이다.

A-(T/S)-B (화학식 I):

여기서, (i) A는 (Y/W/M)-(T/Y)-(Y/W)-(F/Y/W)-(T/Y)를 포함하고;

(Y/W/M)은 티로신(Y), 트립토판(W), 또는 메티오닌(M)이고;

(T/Y)는 트레오닌(T) 또는 티로신(Y)이고;

(Y/W)는 티로신(Y) 또는 트립토판(W)이고;

(F/Y/W)는 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 또는 트립토판(W)이고;

(ii) B는 X7-(T/S/Y)-X9-X10를 포함하고;

X7은 발린(V), 티로신(Y), 페닐알라닌(F), 류신(L), 트립토판(W), 또는 메티오닌(M)이고;

(T/S/Y)는 트레오닌(T), 세린(S), 또는 티로신(Y)이고;

X9는 발린(V), 이소류신(I), 티로신(Y), 페닐알라닌(F), 류신(L), 트립토판(W), 또는 메티오닌(M)이고;

X10은 글루탐산(E), 아스파르트산(D), 이소류신(I), 티로신(Y), 페닐알라닌(F), 메티오닌(M), 또는 트립토판(W)이다.

본 발명은 또한, 하기 화학식을 갖는 아미노산 서열(N-말단에서 C-말단)을 포함하는 분리 폴리펩티드를 제공한다:

X1-X2-X3-F-X5-T-X7-T-V-X10 (화학식 II):

여기서, X1은 Y, F, V, L, 또는 I이고;

X2는 T 또는 S이고;

X3은 Y 또는 F이고;

X5는 임의의 아미노산이고;

X7은 V 또는 I이고; 및/또는

X1O은 E 또는 V이고,

상기 폴리펩티드는 FAM19A5 단백질에 결합할 수 있고, 이에 의해 FAM19A5 단백질과 LRRC4 단백질 패밀리 멤버 사이의 상호작용을 억제, 감소 및/또는 해리할 수 있다.

본 발명은 하기 화학식의 아미노산 서열(N-말단에서 C-말단)을 포함하는 분리 폴리펩티드를 더 제공한다:

X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10 (화학식 III):

여기서, X1은 Y, F, V, L, I, W, 또는 M이고;

X2는 T, S, 또는 Y이고;

X3은 Y, F, 또는 W이고;

X4는 F, Y, 또는 W이고;

X5는 임의의 아미노산, 예컨대, T, S, 또는 Y이고;

X6는 T, S, 또는 Y이고;

X7은 V, I, Y, F, L, W, 또는 M이고;

X8은 T, S, 또는 Y이고;

X9는 V, I, Y, F, L, W, 또는 M이고; 및/또는

X10은 E, D, V, I, Y, F, M, 또는 W이고,

일부 측면에서, X1은 is Y, F, V, L, 또는 I이다. 일부 측면에서, X2는 T 또는 S이다. 일부 측면에서, X3는 Y 또는 F이다. 일부 측면에서, X4는 F이다. 일부 측면에서, X5는 T 또는 S이다. 일부 측면에서, X6은 T이다. 일부 측면에서, X7은 V 또는 I이다. 일부 측면에서, X8은 T이다. 일부 측면에서, X9는 V이다. 일부 측면에서, X10은 E 또는 V이다.

일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드는 서열번호 29(YTYFTTVTVE)로 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 29(YTYFTTVTVE)로 제시된 아미노산 서열로 구성된다. 일부 측면에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 20(NYSFFTTVTVETTEISPEDTTRK)로 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 20(NYSFFTTVTVETTEISPEDTTRK)로 제시된 아미노산 서열로 구성된다. 일부 측면에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 30(YSFFTTVTVE)으로 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 30(YSFFTTVTVE)으로 제시된 아미노산 서열로 구성된다. 일부 측면에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 21(NFSYFSTVTVETMEPSQDERTTR)로 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 21(NFSYFSTVTVETMEPSQDERTTR)로 제시된 아미노산 서열로 구성된다. 일부 측면에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 31(FSYFSTVTVE)로 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 31(FSYFSTVTVE)로 제시된 아미노산 서열로 구성된다.

일부 측면에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 18(GYTYFTTVTVETLETQPGEE)로 제시된 아미노산을 포함한다. 일부 측면에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 18(GYTYFTTVTVETLETQPGEE)로 제시된 아미노산 서열로 구성된다. 일부 측면에서, 아미노산 잔기 T12 및 L13은 서열번호 18의 상응하는 잔기에 대해 변형된다(예컨대, 치환된다). 일부 측면에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 123-142 중 어느 하나로 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 123-142 중 어느 하나로 제시된 아미노산 서열로 구성된다. 일부 측면에서, 상기 하나 이상의 아미노산 잔기는 D-아미노산형이다.

일부 측면에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 17(GYTYFTTVTVETLETQ)로 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 17(GYTYFTTVTVETLETQ)로 제시된 아미노산 서열로 구성된다. 일부 측면에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 19(GYTYFTTVTVETLETQPGEKEPPGPTTD)로 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 19(GYTYFTTVTVETLETQPGEKEPPGPTTD)로 제시된 아미노산 서열로 구성된다.

일부 측면에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 143(GYTYFTTVTVETLETQPGEEA)로 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 143(GYTYFTTVTVETLETQPGEEA)로 제시된 아미노산 서열로 구성된다. 일부 측면에서, 아미노산 잔기 T12 및 L13은 서열번호 143의 상응하는 잔기에 대해 변형된다(예컨대, 치환된다). 일부 측면에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 123-149 중 어느 하나로 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 123-149 중 어느 하나로 제시된 아미노산 서열로 구성된다.

일부 측면에서, X2에서 아미노산은 인산화(phosphorylated) 또는 O-글리코실화(O-glycosylated)된다.

일부 측면에서, 본 명세서에 제공된 임의의 폴리펩티드는 모이어티(moiety)에 결합된다. 일부 측면에서, 상기 모이어티는 폴리펩티드의 하기 특성들 중 한 개 이상을 증가시킬 수 있다: (1) FAM19A5 단백질에 대한 결합 친화도(binding affinity), (2) 용해도(solubility), (3) 프로테아제 및/또는 펩티다아제로부터의 분해에 대한 저항성, (4) 생체내 투여에 대한 적합성, (5) FAM19A5-LRRC4 단백질 패밀리 멤버 상호작용을 억제하는 능력, 또는 (6) (1) 내지 (5)의 임의의 조합. 일부 측면에서, 상기 모이어티는 LRRC4 단백질 패밀리 멤버의 막곁(juxta-membrane) 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 상기 막곁은 서열번호 151(LDEVMKTTK) 또는 서열번호 152(IDEVMKTTK)로 제시된 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 상기 막곁은 서열번호 151(LDEVMKTTK) 또는 서열번호 152(IDEVMKTTK)로 제시된 서열로 구성된다.

본 발명은 또한, 서열번호 29로 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99% 서열 일치를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 분리 폴리펩티드로서, 상기 아미노산 서열은 FAM19A5 단백질에 결합할 수 있고, 이에 의해 FAM19A5 단백질과 LRRC4 단백질 패밀리 멤버 사이의 상호작용을 억제, 감소, 및/또는 해리할 수 있는 분리 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명은 서열번호 5, 서열번호 4 또는 서열번호 6으로 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 일치하고, 서열번호 5, 서열번호 4 또는 서열번호 6으로 제시된 아미노산 서열에 각각에 대해 적어도 하나의 아미노산 서열 변형을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 분리 폴리펩티드로서, 상기 폴리펩티드는 FAM19A5 단백질에 결합할 수 있고, 이에 의해 FAM19A5 단백질과 LRRC4 단백질 패밀리 멤버 사이의 상호작용을 억제, 감소, 및/또는 해리할 수 있는 분리 폴리펩티드를 제공한다.

일부 측면에서, 상기 적어도 하나의 아미노산 변형은 FAM19A5 단백질에 상기 폴리펩티드의 결합을 증가시킨다. 일부 측면에서, 상기 적어도 하나의 아미노산 변형은 상기 폴리펩티드의 안정성을 증가시킨다. 일부 측면에서, 상기 결합 및/또는 안정성에서 증가는 FAM19A5 단백질과 LRRC4 단백질 패밀리 멤버 사이의 상호작용을 억제, 감소, 및/또는 해리하기 위한 폴리펩티드의 능력을 증가시킨다. 일부 측면에서, FAM19A5 단백질과 LRRC4 단백질 패밀리 사이의 상호작용을 억제, 감소, 및/또는 분리하는 폴리펩티드의 능력은 적어도 하나의 아미노산 변형도 없는 상응하는 폴리펩티드와 비교하여, 적어도 약 0.5배, 적어도 약 1배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 20배, 적어도 약 30배, 적어도 약 40배, 또는 적어도 약 50배 증가시킨다.

일부 측면에서, 서열번호 5의 위치 453(예컨대, 서열번호 29의 위치 5)에서 아미노산 잔기는 T이거나 S 또는 Y로 변형된다. 일부 측면에서, 서열번호 5의 위치 454(예컨대, 서열번호 29의 위치 6)에서 아미노산 잔기는 T이거나 S 또는 Y로 변형된다. 일부 측면에서, 서열번호 5의 위치 449(예컨대, 서열번호 29의 위치 1)에서 아미노산 잔기는 Y이거나 F, V, L, I, W, 또는 M으로 변형된다. 일부 측면에서, 서열번호 5의 위치 450(예컨대, 서열번호 29의 위치 2)에서 아미노산 잔기는 T이거나 S 또는 Y로 변형된다. 일부 측면에서, 서열번호 5의 위치 451(예컨대, 서열번호 29의 위치 3)에서 아미노산 잔기는 Y이거나 F 또는 W로 변형된다. 일부 측면에서, 서열번호 5의 위치 452(예컨대, 서열번호 29의 위치 4)에서 아미노산 잔기는 F이거나 Y 또는 W로 변형된다. 일부 측면에서, 서열번호 5의 위치 455(예컨대, 서열번호 29의 위치 7)에서 아미노산 잔기는 V이거나 I, Y, F, L, W, 또는 M으로 변형된다. 일부 측면에서, 서열번호 5의 위치 456(예컨대, 서열번호 29의 위치 8)에서 아미노산 잔기는 T이거나 S 또는 Y로 변형된다. 일부 측면에서, 서열번호 5의 위치 457(예컨대, 서열번호 29의 위치 9)에서 아미노산 잔기는 V이거나 I, Y, F, L, W, 또는 M으로 변형된다. 일부 측면에서, 서열번호 5의 위치 458(예컨대, 서열번호 29의 위치 10)에서 아미노산 잔기는 E이거나 D, V, I, Y, F, M, 또는 W로 변형된다.

일부 측면에서, 상기 폴리펩티드 중 하나 이상의 아미노산 잔기는 D-형이다. 일부 측면에서, 상기 D-형은 N-말단, C-말단, 또는 둘다이다.

일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(상기 제공된 것과 같은)는 모이어티에 결합된다. 일부 측면에서, 상기 모이어티는 폴리펩티드의 하기 특성들 중 하나 이상 증가시킬 수 있다: (1) FAM19A5 단백질에 대한 결합 친화도, (2) 용해도, (3) 프로테아제 및/또는 펩티다아제로부터의 분해에 대한 저항성, (4) 생체내 투여에 대한 적합성, (5) FAM19A5-LRRC4 단백질 패밀리 멤버 상호작용을 억제하는 능력, 또는 (6) (1) 내지 (5)의 임의의 조합. 일부 측면에서, 상기 모이어티는 LRRC4 단백질 패밀리 멤버의 막곁 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 상기 막곁은 서열번호 151(LDEVMKTTK) 또는 서열번호 152(IDEVMKTTK)로 제시된 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 상기 막곁은 서열번호 151(LDEVMKTTK) 또는 서열번호 152(IDEVMKTTK)로 제시된 서열로 구성된다.

일부 측면에서, 본 발명에 기술된 폴리펩티드는 LRRC4 단백질 패밀리 멤버의 막관통(transmembrane) 영역 및/또는 세포내 영역을 포함하지 않는다. 일부 측면에서, 상기 폴리펩티드는 FAM19A5 단백질에 결합하기 위해 LRRC4 단백질 패밀리의 멤버와 경쟁할 수 있다.

상술된 임의의 폴리펩티드에 대해, 일부 측면에서, LRRC4 단백질 패밀리 멤버는 LRRC4 단백질, LRRC4B 단백질, LRRC4C 단백질 또는 이들의 조합을 포함한다.

또한, 본 발명은 본 명세서에 기술된 임의의 폴리펩티드를 포함하는 분자를 제공한다. 일부 측면에서, 상기 분자는 폴리펩티드의 N-말단, 폴리펩티드의 C-말단, 또는 폴리펩티드의 N-말단과 C-말단 모두에 하나 이상의 추가 아미노산을 더 포함한다. 일부 측면에서, 하나 이상의 추가 아미노산은 친수성 아미노산이다. 일부 측면에서, 하나 이상의 추가 아미노산은 D-아미노산이다.

일부 측면에서, 분자는 본 명세서에 기술된 임의의 폴리펩티드를 포함하고, 상기 폴리펩티드의 N-말단, C-말단, 또는 N-말단과 C-말단 모두는 폴리펩티드의 안정성을 증가시키는 변형을 포함한다. 일부 측면에서, 상기 변형은 Fmoc, PEG화(PEGylation), 아세틸화, 메틸화, 고리화(cyclization) 또는 이들의 조합을 포함한다.

일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드를 포함하는 분자는 융합 단백질이다. 일부 측면에서, 상기 분자는 반감기 연장 모이어티를 더 포함한다. 일부 측면에서, 상기 반감기 연장 모이어티는 Fc, 알부민, 알부민-결합 폴리펩티드, Pro/Ala/Ser(PAS), 인간 융모성(chorionic) 고나도트로핀(gonadotropin)의 β서브유닛의 C-말단 펩티드(CTP), 폴리에틸렌글리콜(PEG), 아미노산의 긴 구조화되지 않은 친수성 서열(XTEN), 히드록시에틸 전분(HES), 알부민-결합 소분자, 또는 이들의 조합을 포함한다.

본 발명은 본 발명의 임의의 폴리펩티드 또는 분자를 인코딩하는 핵산을 제공한다. 일부 측면에서, 상기 핵산은 DNA 또는 RNA이다. 일부 측면에서, 상기 핵산은 mRNA이다. 일부 측면에서, 상기 핵산은 핵산 유사체를 포함한다.

본 발명은 본 명세서에 기술된 임의의 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 본 발명은 본 명세서에 기술된 임의의 벡터를 포함하는 세포를 제공한다. 본 발명은 제제에 연결된, 본 명세서에 기술된 임의의 폴리펩티드를 포함하는 단백질 결합체를 제공한다.

본 발명은 본 명세서에 기술된 임의의 폴리펩티드, 분자, 핵산, 벡터, 세포 또는 단백질 결합체를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 측면에서, 상기 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 더 포함한다.

본 발명은 본 명세서에 기술된 임의의 폴리펩티드, 분자, 핵산, 벡터, 세포 또는 단백질 결합체 및 사용 설명서를 포함하는 키트를 제공한다.

본 발명은 또한 FAM19A5 단백질과 LRRC4 단백질 패밀리 멤버 사이의 상호작용을 억제, 감소 및/또는 해리시킬 수 있는 폴리펩티드의 제조 방법을 제공하고, 상기 방법은 폴리펩티드가 생산되는 적당한 조건하에서, 본 명세서에 기술된 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 일부 측면에서, 상기 방법은 생산된 폴리펩티드를 분리하는 단계를 더 포함한다.

본 발명은 뉴런을 LRRC4 단백질 패밀리 멤버의 엑토도메인(ectodomain) 또는 FAM19A5 단백질에 결합할 수 있는 이의 단편과 접촉시키는 단계를 포함하는, 뉴런에서 신경돌기 성장 및/또는 시냅스 형성을 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 상기 엑토도메인은 서열번호 4, 서열번호 5 또는 서열번호 6에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 상기 이의 단편은 본 명세서에 기술된 임의의 폴리펩티드를 포함한다.

본 발명은 뉴런을 본 명세서에 기술된 임의의 폴리펩티드, 분자, 핵산, 벡터, 세포, 단백질 결합체 또는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 뉴런에서 신경돌기 성장 및/또는 시냅스 형성을 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 상기 접촉 단계는 이를 필요로 하는 대상체의 생체내에서 일어난다. 이러한 측면에서, 상기 방법은 접촉 단계 전에 대상체에게 폴리펩티드를 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 상기 접촉 단계는 생체외에서 일어난다.

일부 측면에서, 상기 접촉은 본 명세서에 기술된 임의의 폴리펩티드, 분자, 핵산, 벡터, 세포, 단백질 결합체 또는 조성물과 접촉되지 않은 상응하는 뉴런에서 신경돌기 성장과 비교하여, 뉴런에서 신경돌기 성장을 적어도 약 0.5배, 적어도 약 1배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 20배, 적어도 약 30배, 적어도 약 40배 또는 적어도 약 50배 증가시킨다. 일부 측면에서, 상기 접촉은 본 명세서에 기술된 폴리펩티드, 분자, 핵산, 벡터, 세포, 단백질 결합체 또는 조성물과 접촉하지 않은 상응하는 뉴런에서 시냅스 형성에 비해, 뉴런에서 시냅스 형성을 적어도 약 0.5배, 적어도 약 1배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 20배, 적어도 약 30배, 적어도 약 40배 또는 적어도 약 50배 증가시킨다.

일부 측면에서, 신경돌기 성장 및/또는 시냅스 형성의 증가는 근위축성측삭경화증(amyotrophic lateral sclerosis, ALS), 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 녹내장(glucoma), 당뇨병성 망막병증(diabetic retinopathy), 신경병성 통증(neuropathic pain), 척수손상(spinal cord injury), 외상성 뇌손상(traumatic brain injury), 뇌졸중(stroke), 파킨슨병(Parkinson's disease) 또는 이들의 조합으로부터 선택된 질환 또는 병태와 관련된 하나 이상의 증상을 감소시킨다.

본 발명은 본 명세서에 기술된 임의의 폴리펩티드, 분자, 핵산, 벡터, 세포, 단백질 결합체, 또는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 FAM19A5 단백질과 LRRC4 단백질 패밀리 멤버 사이의 복합체 형성을 억제하거나 감소시키는 방법을 제공한다.

일부 측면에서, FAM19A5 단백질과 LRRC4 단백질 패밀리 멤버 사이의 복합체 형성은 투여후, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 100% 감소된다. 일부 측면에서, FAM19A5 단백질과 LRRC4 단백질 패밀리 멤버 사이의 복합체 형성의 감소는 대상체에서 LRRC4 단백질 패밀리 멤버의 활성을 증가시킨다. 일부 측면에서, FAM19A5 단백질과 LRRC4 단백질 패밀리 멤버 사이의 복합체 형성의 감소는 근위축성측삭경화증(ALS), 알츠하이머병, 녹내장, 당뇨병성 망막병증, 신경병성 통증, 척수 손상, 외상성 뇌 손상, 뇌졸중, 파킨슨병 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 질병 또는 병태와 관련된 하나 이상의 증상을 감소시킨다.

본 발명은 또한, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드, 분자, 핵산, 벡터, 세포, 단백질 결합체 또는 조성물 중 임의의 것을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 질병 또는 병태를 치료하는 방법으로서, 상기 질병 또는 병태는 근위축성측삭경화증(ALS), 알츠하이머병, 녹내장, 당뇨병성 망막병증, 신경병성 통증, 척수 손상, 외상성 뇌 손상, 뇌졸중, 파킨슨병 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 방법을 제공한다.

도1a, 1b, 1c 및 1d는 공동-면역침전법(co-immunoprecipitation)(도1a 및 1b) 또는 면역형광 분석(immunofluorescence assay)(도1c 및 1d)을 사용하여 측정된 FAM19A5 단백질에 결합하는 LRRC4 단백질 패밀리의 상이한 멤버(즉, LRRC4C, LRRC4, 및 LRRC4B 단백질)의 활성을 나타낸다.
도1a에서, 세포 용해물(FLAG-태그된 LRRC4C, LRRC4 또는 LRRC4B 단백질을 발현하고 재조합 FAM19A5 단백질로 처리된 HEK293 세포로부터 유래)을 항-FLAG 항체로 면역침전시키고, 면역침전된 단백질을 항-FLAG(상단 행) 및 항-FAM19A5(3-2)(하단 행) 항체로 면역블롯팅하였다. 도1b에서, 세포 용해물(FLAG-태그부착된 LRRC4B 단백질을 발현하고 재조합 FAM19A5 단백질로 처리된 HEK293 세포 유래)을 인간 IgG("IgG") 또는 항-FAM19A5(1-65) 항체("1-65")로 면역침전시켰다. 면역침전된 단백질을 항-FLAG(상단 행) 및 항-FAM19A5(3-2)(하단 행) 항체로 면역블로팅하였다. 도1c에서, FLAG-태그된 LRRC4B 단백질을 발현하는 HEK293 세포를 재조합 FAM19A5 단백질로 처리하고 항-FLAG 및 항-FAM19A5(3-2) 항체로 면역염색하였다. 도1d에서, 1차 피질(cortical) 뉴런을 재조합 FAM19A5 단백질로 처리하고 항-FAM19A5(3-2) 및 항-LRRC4B 항체로 면역염색하였다. 도1c 및 1d에서 핵은 Hoechst33342로 염색되었다. 추가로, 도1c 및 도1d의 두번째(FAM19A5 단백질 염색 단독), 세번째(LRRC4B 단백질 염색 단독), 및 네번째(FAM19A5 및 LRRC4B 염색의 오버레이) 열에 제공된 이미지는 첫번째 행에 제공된 이미지에서 박스 영역의 확대도이다. 동국화(Colocalized) 신호는 화살촉으로 표시된다. 스케일 바 = 30μm.
도2a, 2b, 2c 및 2d는 면역형광법(도2a 및 2b) 또는 공동-면역침전 검정(도 2c 및 2d)을 사용하여 측정된 FAM19A5 단백질의 아이소폼(isoform) 1 및 아이소폼 2에 대한 LRRC4B 단백질의 결합을 나타낸다. 도2a는 LRRC4B 단백질과 FAM19A5 아이소폼 1 사이의 상호작용을 나타내는 면역형광 데이터를 제공한다. 도2b는 LRRC4B 단백질과 FAM19A5 아이소폼 2 사이의 상호작용을 나타내는 면역형광 데이터를 제공한다. 도2c에서, 동시 형질감염된 HEK293 세포로부터의 세포 용해물을 항-FLAG 항체로 면역침전시킨 다음, 항-FLAG(상단 행) 및 항-FAM19A5(3-2)(하단 행) 항체로 면역블롯팅하였다. 도2d에서, 공동 형질감염된 HEK293 세포로부터의 세포 용해물을 하기로 면역침전시켰다: (i) 인간 IgG 항체("IgG"); (ii) 항-FAM19A5(1-65) 항체("1-65"); 또는 (iii) 항-FAM19A5(3-2) 항체("3-2"). 면역침전된 단백질을 항-FLAG(상단 행) 및 항-FAM19A5(3-2)(하단 행) 항체로 면역블롯팅하였다.
도3a 및 3b는 FAM19A5 단백질에 대한 상이한 LRRC4B 단백질 결실 구조물의 결합을 나타낸다. 도3a는 LRRC4B 단백질의 상이한 도메인의 개략도를 제공하고, 상이한 결실 구조물에 포함된 도메인을 나타낸다. 표시된 LRRC4B 도메인은 하기를 포함한다: "SP" = 신호 펩티드; "LRR" = 류신-풍부 반복; "IG" = 면역글로불린 유사 C2형; "Thr" = 트레오닌-풍부; "TM" = 막관통; 및 "PB" = PSD95-결합. "결합" 아래의 열은 특정 LRRC4B 단백질 단편이 FAM19A5 단백질에 결합할 수 있었는지 여부를 나타낸다: "O" = 결합; "X" = 결합 안됨; "N.D."= 확인되지 않음. 도3b는 공동-면역침전 검정을 사용하여 측정된 바와 같이 FAM19A5 단백질에 대한 상이한 LRRC4B 단백질 결실 구조물의 결합을 나타낸다.
도4a 및 4b는 ELISA를 사용하여 측정된 LRRC4 단백질 패밀리 멤버의 엑토도메인에 대한 FAM19A5 단백질의 결합을 나타낸다. 도4a는 LRRC4(서열번호 1의 아미노산 39-527; 즉, 서열번호 4)("1"), LRRC4B(서열번호 2의 아미노산 36-527, 즉, 서열번호 5)("2") 및 LRRC4C(서열번호 3의 아미노산 45-527; 즉, 서열번호 6)("3") 단백질의 전장 엑토도메인에 대한 FAM19A5 단백질의 결합을 나타내는 데이터를 제공한다. 도4b는 LRRC4B 단백질의 상이한 단편에 대한 FAM19A5 단백질의 결합을 나타내는 다음의 데이터를 제공한다: (a) 서열번호 2의 아미노산 453-576(즉, 서열번호 7); (b) 서열번호 2의 아미노산 484-576(즉, 서열번호 8); (c) 서열번호 2의 아미노산 482-576(즉, 서열번호 9); (d) 서열번호 2의 아미노산 482-497(즉, 서열번호 10); 및 (e) 서열번호 2의 아미노산 498-576(즉, 서열번호 11).
도5a 및 5b는 LRRC4 단백질 패밀리 멤버의 하기 단백질 단편에 대한 FAM19A5 단백질의 결합을 나타낸다: (1) LRRC4(서열번호 1의 아미노산 451-483)(즉, 서열번호 12); (2) LRRC4C(서열번호 3의 아미노산 451-484)(즉, 서열번호 13); 및 (3) LRRC4B(서열번호 2의 아미노산 484-522)(즉, 서열번호 14). 도5a는 시험된 단백질 단편의 아미노산 서열을 포함하는 LRRC4 단백질 패밀리 멤버 내에 존재하는 상이한 도메인의 개략도를 제공한다. 표시된 도메인은 다음을 포함한다: "SP" = 신호 펩티드; "LRR" = 류신-풍부 반복; "IG" = 면역글로불린 유사 C2형; "Thr" = 트레오닌-풍부; "TM" = 막관통; 및 "PB" = PSD95-결합. "결합" 아래의 열은 특정 LRRC4B 단백질 단편이 FAM19A5 단백질에 결합할 수 있었는지 여부를 나타낸다: "O" = 결합; "X" = 결합안됨; "N.D." = 확인되지 않음. 도5b는 FAM19A5 단백질과 상이한 LRRC4 패밀리 단백질 단편 사이의 상호작용을 나타낸다. 세포 용해물을 항-FLAG 항체로 면역침전시키고, 면역침전된 단백질을 항-FLAG(상단 겔) 및 항-F AMI 9A5(3-2)(하단 겔) 항체로 면역블롯팅하였다.
도6은 FAM19A5 단백질에 결합하는 LRRC4B 단백질의 YTYFTTVTVETLE(서열번호 15) 서열을 포함하는 다음의 3개의 상이한 펩티드 단편의 활성을 나타낸다: (1) "FB-16" = 16개 아미노산 길이(서열번호 17); (2) "FB-20" = 20개 아미노산 길이(서열번호 18); 및 (3) "FB-28" = 28개 아미노산 길이(서열번호 19).
도7은 면역형광 현미경을 사용하여 측정한 HEK293 세포의 FAM19A5(아이소폼 2)와 전장 LRRC4B 단백질간 상호작용의 해리를 유도하는 LRRC4B 펩티드 단편(서열번호 2의 아미노산 453-576)(즉, 서열번호 7)(하단 행)의 활성을 나타낸다. 돌연변이 형태의 LRRC4B 펩티드 단편(서열번호 2의 위치 488 및 489에 알라닌 치환을 포함)(즉, 서열번호 16)("MT")으로 처리된 HEK293 세포를 대조군으로 사용하였다. 상자의 이미지(하단 행, 왼쪽에서 네번째 상자 참조)는 항-hIgG 단독(상단) 및 항-hIgG 및 항-FLAG 항체(하단) 모두 염색된 이미지로 확대되었다. 확대된 이미지의 닫힌 화살촉은 LRRC4B에서 해리된 FAM19A5 신호를 나타낸다. 열린 화살촉은 LRRC4B(453-576)-hFc를 나타내며 LRRC4B가 있는 곳에 있다. 스케일 바 = 30μm.
도8a 및 8b는 LRRC4B 단백질의 전장 엑토도메인(즉, 서열번호 2의 아미노산 36-576)(서열번호 5)에 대한 FAM19A5 단백질의 결합을 억제하는 상이한 LRRC4B 펩티드 단편의 활성을 비교하는 경쟁 억제 분석 데이터를 제공한다. 도8a는 하기 LRRC4B 펩티드 단편에 대한 데이터를 제공한다: (1) LRRC4B(서열번호 2의 아미노산 453-576)(서열번호 7); (2) LRRC4B 돌연변이체(위치 488 및 489에서 AA 돌연변이를 갖는 서열번호 2의 아미노산 453-576)(서열번호 16); (3) LRRC4B(서열번호 2의 아미노산 484-576)(서열번호 8); (4) LRRC4B(서열번호 2의 아미노산 482-576)(서열번호 9); (5) LRRC4B(서열번호 2의 아미노산 482-497)(서열번호 10); 및 (6) LRRC4B(서열번호 1의 아미노산 498-576)(서열번호 11). 도8b는 FAM19A5 단백질의 LRRC4B 단백질의 전장 엑토도메인 결합을 억제하는 (1) FB-28, (2) FB-20, 및 (3) FB-16 펩티드(도6에 기술됨)의 활성을 나타내는 경쟁적 억제 검정 데이터를 제공한다.
도9a, 9b 및 9c는 LRRC4 단백질 패밀리의 상이한 멤버: LRRC4(서열번호 1의 아미노산 잔기 39-572)(즉, 서열번호 4), LRRC4B(서열번호 2의 아미노산 잔기 36-576)(즉, 서열번호 5), 및 LRRC4C(서열번호 3 45-527의 아미노산 잔기)(즉, 서열번호 6) 각각의 전장 엑토도메인에 대한 FAM19A5 단백질의 결합을 억제하는 상이한 LRRC4B 펩티드 단편의 활성을 비교한다. 제시된 상이한 LRRC4B 펩티드 단편은 다음을 포함한다: (1) LRRC4B(서열번호 2의 아미노산 453-576)(서열번호 7); (2) LRRC4B 돌연변이체(위치 488 및 489에서 AA 돌연변이를 갖는 서열번호 2의 아미노산 453-576)(즉, 서열번호 16); 및 (3) FB-20(즉, LRRC4B 단백질의 YTYFTTVTVETLE 서열을 포함하는 20-아미노산 길이의 펩티드 단편; GYTYFTTVTVETLETQPGEE; 서열번호 18).
도10a 및 10b는 LRRC4B 단백질의 전장 엑토도메인(도10a) 또는 LRRC4B 단백질의 트레오닌-풍부 도메인(즉, 서열번호 2의 아미노산 453-576; 즉, 서열번호 7)(도10b)에 FAM19A5 단백질의 결합을 억제하는 FBC4-23 및 FBC4C-23 펩티드 단편의 활성을 비교한다. FBC4C-23 펩티드 단편은 LRRC4C 단백질의 FAM19A5 결합 도메인(굵은 글씨 및 이탤릭체)을 포함하고 다음 서열을 갖는다: N YSFFTTVTVETTE 1 SPEDTTRK(서열번호 20). FBC4C-23 펩티드 단편은 LRRC4C 단백질의 FAM19A5 결합 도메인(굵은 글씨 및 이탤릭체)을 포함하고 다음 서열을 갖는다: N FSYFSTVTVETME PSQDERTTR(서열번호 21). FB-20 펩티드(도6 참조)도 비교 목적으로 사용되었다.
도11a 및 11b는 LRRC4B 단백질의 전장 엑토도메인(도11a) 또는 FAM19A5 결합 도메인을 포함하는 LRRC4B 단백질 단편(즉, 서열번호 2의 아미노산 453-576; 서열번호 7)(도 11b)에 FAM19A5 단백질의 결합을 억제하는 상이한 FB-20 펩티드 단편 변이체의 활성을 나타낸다. 상이한 FB-20 변이체는 다음과 같다: (1) FB-ml ldC, (2) FB-mlOdC, (3) FB-m9dC, (4) FB-m8dC, (5) FB-m7dC, (6) FB-m6dC, (7) FB-mlOdN, (8) FB-m9dN, (9) FB-m8dN 및 (10) FB-m7dN. 실시예 6에 기술된 바와 같이, 각각의 FB-20 변이체는 FAM19A5 단백질에 결합할 수 있는 LRRC4B 단백질 도메인의 C-말단 또는 N-말단에 하나 이상의 아미노산 결실, YTYFTTVTVETLE(서열번호 15)을 포함하였다. FB-20 변이체의 특정 아미노산 서열은 표9에 제공된다.
도12a 및 12b는 LRRC4B 단백질의 전장 엑토도메인(도12a) 또는 FAM19A5 결합 도메인(즉, 서열번호 2의 아미노산 453-576; 서열번호 7)을 포함하는 LRRC4B 단백질 단편(도12b)에 FAM19A5 단백질의 결합을 억제하는 알라닌(A) 또는 아스파라긴(N) 치환을 갖는 상이한 FB-20 펩티드 절단 변이체의 활성을 나타낸다. 실시예 7에 기술된 바와 같이, FAM19A5 단백질에 결합할 수 있는 LRRC4B 단백질 도메인, 즉 YTYFTTVTVETLE(서열번호 15)의 아미노산 잔기 중 하나에서 FB-20 펩티드 단편에 알라닌 또는 아스파라긴 치환이 독립적으로 도입되었다. FB-20 변이체의 특정 아미노산 서열은 표10에 제공된다. 나타낸 각 FB-20 펩티드 변이체(FB-20[12-L] 및 FB-20[13-E] 제외)에 대해, 첫 번째 막대는 알라닌 치환이고 두 번째 막대는 아스파라긴 치환이다. 변이체 FB-20[12-L] 및 FB-20[13-E]의 경우 알라닌 치환만 표시된다.
도13a 및 13b는 마우스 해마(hippocampal) 배양물에서 FAM19A5 패밀리 멤버(도13a) 또는 LRRC4B 및 PTPRF 유전자(도13b)의 전사 수준을 나타낸다. 실시예 8에 기술된 바와 같이, 생후 1일에 마우스 뇌 유래 1차 해마 뉴런을 시험관 내에서 15일 동안 배양하였다. 상이한 유전자의 전사 수준을 초기 배양 후 1, 3, 7, 10 및 15일에 측정하고 RNA-seq 분석을 사용하여 정량화하였다. 도13a에서, 나타낸 각 날에 대해, 첫번째, 두번째 및 세번째 막대(왼쪽에서 오른쪽으로)는 각각 FAM19A1, FAM19A2 및 FAM19A5에 해당한다. FAM19A3 및 FAM19A4 전사체는 검출되지 않았다. 데이터는 3회 평균±SEM이다.
도14a, 14b, 14c 및 14d는 다양한 농도(x축)(0.006-60 nM)에서 시험관 내 마우스 1차 피질 뉴런의 신경돌기 성장을 촉진하는 LRRC4B 펩티드 단편(서열번호 2의 아미노산 잔기 453-576; 서열번호 7)의 활성을 나타낸다. 실시예 8에 기술된 바와 같이, 마우스 1차 피질 뉴런(출생 후 1일)을 초기 배양 후 1일 및 2일에 LRRC4B 단백질 단편으로 처리하고, 다음을 베타-튜불린 III 항체로 면역염색하여 3일에 정량화하였다: (i) 평균 총신경돌기 성장(도14a), (ii) 1차 수상돌기의 수(도14b), (iii) 분기점의 수(도14c), 및 (iv) 2차 신경돌기의 수(도14d). 데이터는 평균 ± SEM로 나타낸다. 일원 분산 분석과 Bonferroni 사후 테스트를 사용하여 통계적 유의성을 평가하였다; a, P<0.01 vs 비히클 대조군.
도15a, 15b 및 15c는 마우스 해마 뉴런에서 시냅토파이신(SYP; 시냅스전 마커) 및 PSD95(시냅스후 마커)의 발현에 대한 LRRC4B 펩티드 단편(서열번호 2의 아미노산 잔기 453-576; 서열번호 7)의 효능을 나타낸다. 도15a 및 15b는 IMARIS 소프트웨어(IMARIS 9.0 Bitplane, Switzerland)를 사용하여 측정된 바와 같이, LRRC4B 펩티드 단편(6 또는 60nM)을 갖는 해마 뉴런의 수상돌기/신경돌기에서 각각 SYN 및 PSD-95에 대한 총 형광 강도를 나타낸다. 도15c는 처리된 해마 뉴런의 수상돌기/신경돌기에서 SYP와 PSD95 신호 사이의 동국화(colocalized) 복셀(voxels)의 수를 나타낸다. 각각의 도15a-15c에서, 비히클("Veh") 및 LRRC4B 펩티드 단편 돌연변이체(MT)(60nM)(즉, 서열번호 2의 위치 488 및 489에서 알라닌 치환을 포함함; 서열번호 16)가 대조군으로 사용되었다. 본 발명의 다른 곳에서 기재된 바와 같이, LRRC4B MT는 FAM19A5 단백질에 결합할 수 없었다. 데이터는 평균±SEM로 나타낸다. 형광 강도의 정량화에 사용된 뉴런의 수는 막대 그래프의 괄호 안에 표시되었다. 일원 분산 분석과 Bonferroni 사후 테스트를 사용하여 통계적 유의성을 평가하였다. a, P<0.05 vs Veh; b, P<0.05 us LRRC4B MT(60nM).
도16a, 16b 및 16c는 APP/PS1 마우스의 해마 CA1에서 LRRC4B 펩티드 단편(서열번호 2의 아미노산 잔기 453-576; "WT")(즉, 서열번호 7)의 시냅스 형성을 촉진하는 능력을 나타낸다. 실시예 8에 또한 기술된 바와 같이, APP/PS1 마우스를 연속 4주 동안 LRRC4B 펩티드 단편(30mg/kg; 정맥내 투여)으로 처리한 후, SYP 및 PSD95에 대한 항체를 사용하여 형광 현미경으로 시냅스 형성을 평가하였다. 대조군 동물은 처리하지 않거나("cont") 돌연변이 LRRC4B 펩티드 단편(60nM)(즉, 서열번호 2의 위치 488 및 489에서 알라닌 치환을 포함함; 서열번호 16)을 처리하였다. 도16a는 대표적인 형광 현미경 사진을 제공한다. 도16b 및 16c는 각각 SYP 및 PSD95 강도를 나타낸다.
도17a, 17b 및 17c는 APP/PS1 마우스의 해마 CA3에서 시냅스 형성을 촉진하는 LRRC4B 펩티드 단편(서열번호 2의 아미노산 잔기 453-576; "WT"; 서열번호 7)의 활성을 나타낸다. 상기 동물을 도16a-16c에 기술된 바와 같이 처리하고 분석하였다. 도17a는 대표적인 형광 현미경 사진을 제공한다. 도17b 및 17c는 각각 SYP 및 PSD95 강도를 나타낸다.
도18a, 18b, 18c, 18d 및 18e는 시험관내에서 FB-16, FB-20 및 FB-28 펩티드로 처리된 마우스 일차 피질 뉴런에서의 신경돌기 성장을 나타낸다(도6에 기술됨). 1차 피질 뉴런을 2일 동안 처리한 후, 3일째에 신경돌기 성장을 항-베타-튜불린 III 항체로 면역염색하여 평가하였다. 도18a는 각각의 처리 그룹으로부터의 대표 현미경 이미지를 제공한다. 도18b, 18c, 18d 및 18e는 각각 (i) 전체 신경돌기 성장의 평균 길이, (ii) 1차 수상돌기의 수, (iii) 분기점의 수 및 (iv) 2차 신경돌기의 수를 나타낸다. 데이터는 평균±SEM로 나타낸다. 일원 분산 분석과 Bonferroni 사후 테스트를 사용하여 통계적 유의성을 평가하였다; a, P<0.01 vs 대조군(CTRL).
도19a, 19b 및 19c는 시험관 내에서 FB-16, FB-20 및 FB-28 펩티드로 처리된 마우스 일차 해마 뉴런에서 시냅토파이신(SYP; 시냅스전 마커) 및 PSD95(시냅스후 마커)의 발현 증가를 나타낸다(도6에 기술됨). 도19a 및 19b는 IMARIS 소프트웨어(IMARIS 9.0 Bitplane, Switzerland)를 사용하여 측정된 해마 뉴런의 수상돌기/신경돌기에서 각각 SYN 및 PSD-95에 대한 총 형광 강도를 나타낸다. 도19c는 처리된 해마 뉴런의 수상돌기/신경돌기에서 SYP와 PSD95 신호 사이의 동국화 복셀의 수를 나타낸다. 데이터는 평균±SEM로 나타낸다. 형광 강도의 정량화에 사용된 뉴런의 수는 막대 그래프의 괄호 안에 표시하였다. 일원 분산 분석과 Bonferroni 사후 테스트를 사용하여 통계적 유의성을 평가하였다; *, P<0.05 vs CTRL; **, P<0.05 vs CTRL.
도20은 상이한 척추동물 종에 걸친 LRRC4 단백질 패밀리 멤버에서 관심 도메인(즉, FAM19A5 단백질에 결합할 수 있음)의 서열 배열을 제공한다.
도21a 및 21b는 슈뢰딩거 플랫폼을 사용하여 FAM19A5-LRRC4 패밀리 복합체의 인실리코(in silico) 잔기 스캐닝을 통해 평가된 바와 같이 LRRC4B 단편의 결합 친화도에 대한 상이한 아미노산 변형의 효과를 제공한다. 도21a는 FB-20 단편(서열번호 18)의 각 아미노산 잔기에서 알라닌 치환 시 깁스(Gibbs) 자유 에너지 변화의 예측값을 제공한다. 도21b는 FAM19A5 단백질에 대한 향상된 친화성을 갖는 상위 20개의 FB-20 이중 돌연변이체(서열번호 18의 잔기 T12 및 L13에서의 아미노산 치환 포함)에 대한 깁스(Gibbs) 자유 에너지 변화의 예측값을 제공한다. 제시된 FB-20 이중 돌연변이에 대한 서열은 실시예 9에 제공된다(표12).
도22a, 22b 및 22c는 FAM19A5 단백질에 결합하는 상이한 FB-21 펩티드 돌연변이체의 활성을 나타낸다. 도22a는 경쟁 억제 검정에 의해 확인된 바와 같이 hFc-융합된 hLRRC4B와 rcFAM19A5 사이의 상호작용에 대한 하기 FB-21 펩티드 단편의 억제 효과의 비교를 제공한다: (1) 야생형 FB-21(서열번호 143), (2) FB-21(P12Y13)(서열번호 144), (3) FB-21(H12F13)(서열번호 145), (4) FB-21(Q12R13)(서열번호 146), (5) FB-21(W12Y13)(서열번호 147), (6) FB-21(M12R13)(서열번호 148), 및 (7) FB-21(I12F13)(서열번호 149). 도22b는 경쟁적 억제 검정에 의해 확인된 바와 같이 HIS0TEV LRRC4B와 rcFAM19A5 단백질 사이의 상호작용에 대한 하기 FB-21 펩티드 단편의 억제 효과의 비교를 나타낸다: (1) FB-21(야생형)(서열번호 143), (2) FB-21(W12Y13)(서열번호 147), (3) FB-21(D12Y13)(서열번호 131), (4) FB-21(F12F13)(서열번호 132), (5) FB-21(H12Y13)(서열번호 133), (6) FB-21(D12F13)(서열번호 135), 및 (7) FB-21(D12I13)(서열번호 136). 도22c는 아미노 및 카르복실 말단에 D-형 아미노산을 함유하고 다른 모든 잔기에는 L-형 아미노산을 포함하는 하기 FB-21 펩티드 단편에 대한 결과를 제공한다: (1) d-형 FB-21("dFB- 21"), (2) 막곁(JM) 서열을 갖는 d-형 FB-21 펩티드("dFB-JM-31"), (3) 각 말단에 BBB 침투 서열을 갖는 d-형 FB-21 펩티드 서열("dFB-BBB-39"), 및 (4) DY 교체 및 추가적인 JM 서열을 갖는 d-형 FB-21 돌연변이 펩티드("dFB-DY-JM31").
도22d는 LRRC4 패밀리의 상이한 멤버(즉, LRRC4, LRRC4B 및 LRRC4C 단백질)의 서열 배열을 제공한다. 하기 도메인은 박스로 표시된다: (1) FAM19A5 결합 도메인("FB"); (2) 막곁 도메인("JM"), 및 (3) 막관통 도메인("TM").
도23a, 23b, 23c 및 23d는 마우스 1차 뉴런에서 아밀로이드 베타-유도된 시냅스 손실에 대한 본 명세서에 기술된 상이한 FB-21 펩티드 단편의 효능을 나타낸다. 도23a는 FB-21, FB-13-JM 또는 FB-BBB-39(모두 6.6 nM; 테스트된 상이한 FB-21 펩티드 단편의 설명에 대해 도22c 참조)로 처리된 해마 뉴런의 PSD95(상단 행), SYP(중간 행) 및 병합(하단 행)에 대한 대표 이미지를 제공한다. 세포의 핵은 Hoechst(파란색)로 염색되었다. 스케일 바= 50μm. 도23b는 FB-21, FB-13-JM, 또는 FB-BBB-39(모두 6.6nM)로 처리된 해마 뉴런의 SYP와 PSD95 신호 수상돌기/신경돌기 사이의 동국화 복셀 수의 비교를 제공한다. 동국화 복셀의 수는 IMARIS 소프트웨어(왼쪽 패널, IMARIS 9.0 Bitplane, 스위스)를 통해 계산되었다. 도23c 및 23d는 IMARIS를 사용하여 측정된 것처럼 FB-21, FB-13-JM 또는 FB-BBB-39(모두 6.6 nM)로 처리된 해마 뉴런의 수상돌기/신경돌기에서 각각 PSD95 및 SYN에 대한 전체 형광 강도의 비교를 제공한다. 데이터는 평균±SEM로 나타낸다. 일원 분산 분석과 Bonferroni 사후 테스트를 사용하여 통계적 유의성을 평가하였다; *, P<0.05 및 *, P<0.01 vs NT.
도24a 및 24b는 본 명세서에 기술된 예시적인 FB-21 펩티드 단편(즉, dFB-dWY-JM31 및 dFB-DY-JM31)이 일차 마우스 척수 운동 뉴런의 신경돌기 성장 촉진에 미치는 효과를 나타낸다. 도24a는 Tau-5 항체로 면역염색된 비처리(NT) 또는 FB-21 펩티드 단편 처리 척수 운동 뉴런의 대표적인 병합 이미지를 제공한다. 신경 세포체는 Hoechst(Blue)에 의해 염색 및 검출되었다. 스케일 바= 100μm. 도24b는 상이한 처리군으로부터의 일차척수 운동뉴런의 평균 총신경돌기 길이의 정량적 비교를 제공한다. 데이터는 평균±SEM로 나타낸다. 일원 분산 분석과 Bonferroni 사후 테스트를 사용하여 통계적 유의성을 평가하였다; *, P<0.01 vs NT.
도25a 및 25b는 LUHMES 세포에서 6-OHDA 유도 세포 사멸에 대한 본 명세서에 기술된 FB-21 펩티드 변이체(dFB-dWY-JM31)의 효능을 나타내다. 도25a는 6-OHDA 처리 유무에 관계없이 FB-21 펩티드 변이체로 처리한 후 발광 발현의 정량적 비교를 제공한다. 도25b는 FB-21 펩티드 변이체를 6-OHDA 처리로 처리한 후 발광 발현의 정량적 비교를 제공한다. 데이터는 평균±SEM로 나타낸다. 일원 분산 분석과 Bonferroni 사후 테스트를 사용하여 통계적 유의성을 평가하였다; *, P<0.01 vs NT.
도26a 및 26b는 만성압박손상(chronic constriction injury, CCI) 래트 모델에서 본 명세서에 기술된 예시적인 FB-21 펩티드 변이체(dFB-dDY-JM31)의 효능을 나타낸다. 도26a는 비히클 대조군(원) 또는 FB-21 펩티드 변이체(사각형)로 처리된 마우스에서 CCI 유도 후 다양한 시점에서 기계적 이질통(alloynia)에 반응하는 발 회피 역치의 비교를 제공한다. 데이터는 평균±SEM로 나타낸다. 도26b는 도26a에 제공된 데이터에 대한 전체 곡선 아래 면적(AUC)의 비교를 제공한다. AUC에 대한 통계적 분석은 단측 unpaired t-test로 수행되었다; *, p < 0.05.
도27은 망막 기능장애(retinal dysfunction) 및 신경진동(neural oscillation)의 조정에 대한 본 명세서에 기술된 FB-21 펩티드 변이체(dFB-dDY-JM31)의 효능을 나타낸다. 망막전도도(electroretinogram, ERG)는 당뇨병성 망막병증 마우스 모델(db/db)을 사용하여 빛의 섬광에 반응하여 망막에서 방출되는 전기 신호를 측정하기 위해 기록되었다. 그룹 간에 측정된 b-파의 ERG 진폭; 이종(heterogenous) 야생형(WT, db/+, 검정), DR 대조군(db/db, 빨강) 및 dFB-dDY-JM31 처리 DR(파랑). 데이터는 평균±SEM로 나타낸다. 일원 분산 분석(one-way ANOVA)으로 통계 분석을 수행한 후 Bonferroni 다중 비교 테스트를 사용하였다; ***, p < 0.001, **, p < 0.01.
도28a 및 28b는 외상성 뇌손상 마우스 모델에서 본 명세서에 기술된 FB-21 펩티드 변이체(dFB-dWY-JM-31)의 효능을 나타낸다. 도28a는 각 그룹의 대표적인 Hoechst 염색을 제공한다. 도28b는 도28a에 제공된 데이터에 기초한 병변 부피의 정량적 비교를 제공한다. 데이터는 평균±SEM로 나타낸다. 통계 분석은 양측 unpaired t-test로 수행되었다; ***, p < 0.001.

본 발명은 FAM19A5 단백질과 LRRC4 단백질 패밀리 멤버 사이의 결합을 억제, 감소 및/또는 해리시킬 수 있는 폴리펩티드(예컨대, 분리 폴리펩티드)를 제공한다. 구체적으로, 본 출원은 FAM19A5 단백질이 LRRC4 단백질 패밀리 멤버에 결합하여 LRRC4 단백질 패밀리 멤버의 활성을 억제할 수 있음을 처음으로 제시한다. 본 발명의 폴리펩티드는 FAM19A5 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 LRRC4 단백질 패밀리 멤버(즉, LRRC4, LRRC4B 또는 LRRC4C)의 도메인을 포함하거나, 구성되거나, 필수적으로 구성된다. FAM19A5와 LRRC4 단백질 패밀리 멤버 사이의 상호작용을 억제, 감소 및/또는 해리함으로써, 본 발명의 폴리펩티드는 내인성 LRRC4 단백질 패밀리 멤버의 활성을 회복시킬 수 있다. 본 발명의 추가적인 측면들은 본 출원 전체에 걸쳐 제공된다.

본 명세서에 개시된 내용의 이해를 용이하게 하기 위해, 다수의 용어 및 구문이 정의된다. 추가적인 정의는 상세한 설명 전반에 걸쳐 제시된다.

I. 정의

본 명세서 전반에 걸쳐, 용어 "한" 또는 "하나의" 개체는 하나 이상의 해당 개체를 의미한다. 예를 들어, "하나의 폴리펩티드"는 하나 이상의 폴리펩티드를 나타내는 것으로 이해된다. 이와 같이, 용어 "한(또는 "하나의")", "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용될 수 있다.

또한, 본 명세서에서 사용되는 "및/또는"은 다른 것이 있거나 없는 2개의 특정 특징 또는 구성요소 각각의 특정 개시로 간주되어야 한다. 따라서, 본 명세서에서 "A 및/또는 B"와 같은 구에서 사용되는 용어 "및/또는"은 "A 및 B", "A 또는 B", "A"(단독) 및 "B(단독)"를 포함하는 것으로 의도된다. 마찬가지로, "A, B 및/또는 C"와 같은 구에서 사용되는 용어 "및/또는"은 다음의 각각의 측면을 포함하도록 의도된다: A, B 및 C; A, B 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A와 C; A와 B; B와 C; A(단독); B(단독); 및 C(단독).

본 명세서에서 "포함하는"이라는 용어로 측면이 설명되는 경우, "구성되는" 및/또는 "필수적으로 구성되는"의 용어로 기술된 유사한 측면 또한 제공되는 것으로 이해된다.

별도로 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명에 관련된 기술 분야의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 예를 들어, 문헌(The Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., Academic Press; 및 Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press)은 당업자에게 본 명세서에서 사용된 많은 용어의 일반 사전을 제공한다.

단위, 접두사 및 기호는 SI(System International de Unites) 허용 형식으로 표시된다. 숫자 범위에는 범위를 정의하는 숫자가 포함된다. 별도로 표시되지 않는 한, 아미노산 서열은 아미노에서 카르복시 방향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 기록된다. 본 명세서에 제공된 제목은 명세서 전체를 참조하여 가질 수 있는 본 발명의 다양한 측면을 제한하는 것이 아니다. 따라서, 하기 정의된 용어들은 본 명세서 전체를 참조함으로써 보다 완전하게 정의된다.

용어 "약"은 본 명세서에서 대략, 대강, 약 또는 영역을 의미하는 것으로 사용된다. "약"이라는 용어가 수치 범위와 함께 사용되는 경우, 이는 명시된 수치 값 위아래로 경계를 확장하여 해당 범위를 수정한다. 일반적으로, "약"이라는 용어는 예를 들어 10%의 변동에 의해 위 또는 아래로(더 높거나 낮음) 명시된 값의 위아래로 수치 값을 수정할 수 있다.

용어 "류신-풍부 반복-함유 4 단백질 패밀리" 또는 "LRRC4 단백질 패밀리(이의 유도체 포함)"은 주요 시냅스 조직자이고, 신경 이동(neuronal migration), 신경돌기 성장(neurite outgrowth), 시냅스 접촉의 형성 및 기능적 조립을 포함하는 신경 회로 형성(neural circuit formation)의 다양한 단계에서 역할을 하는 것으로 기술된 단백질 패밀리을 나타낸다(예를 들어, Woo et al., Mol Cell Neurosci 42(1): 1-10(2009년 9월) 참조). LRRC4 단백질 패밀리은 다음의 3개 멤버를 포함한다: (1) LRRC4, (2) LRRC4B, 및 (3) LRRC4C(전체적으로, 본 명세서에서 "LRRC4 단백질 패밀리 멤버" 또는 "LRRC4 단백질 패밀리의 멤버"(또는 이의 유도체)로 지칭됨. LRRC4 단백질 패밀리 멤버는 일반적으로 LRR N-말단 및 C-말단 측면에 9개의 류신-풍부 반복(LRR) 도메인을 포함한다(도3a 참조). 이러한 LRR 도메인은 시냅스전 수용체 단백질 티로신 포스파타제(RPTP) 단백질의 피브로넥틴 유형 III 도메인과 상호작용하는 것으로 알려져 있다(예를 들어, Won et al., Mol Cells 41(7): 622-630 (Jul. 2018) 참조). LRR 도메인 다음에는 면역글로불린 유사 C2 유형(IG) 및 트레오닌(Thr)이 풍부한 도메인이 뒤따르며, 이들은 함께 LRRC4 단백질 패밀리 멤버의 세포외 부분을 형성한다. 다른 멤버와 달리, LRRC4B 단백질은 IG와 Thr-풍부 도메인 사이에 여분의 글리신(Gly)-풍부 도메인을 갖는다. 세포외 부분에 더하여, LRRC4 단백질 패밀리 멤버는 추가로 단백질의 C-말단에 막관통(TM) 도메인과 시냅스후 밀도-결합(postsynaptic density-binding)(PB) 도메인을 포함한다.

인간에서, LRRC4 단백질을 인코딩하는 유전자는 염색체 7(GenBank Accession Number NC_000007.14의 뉴클레오티드 128,027,071-128,032,107; 마이너스 가닥 배향)에 위치한다. LRRC4 단백질의 동의어는 알려져 있으며 비제한적 예는 하기를 포함한다: "비인두 암종-관련 유전자 14 단백질(Nasopharyngeal Carcinoma-Associated Gene 14 Protein)", "뇌종양-관련 단백질 BAG(Brain Tumor-Associated Protein BAG)", "네트린-G2 리간드(Netrin-G2 Ligand)", "NAG14", "NGL-2", 및 "BAG." LRRC4 단백질의 아미노산 서열은 길이가 653개 아미노산이며 표1(아래)에 제공된다. LRRC4 단백질의 전장 엑토도메인은 서열번호 1의 아미노산 잔기 39-527(즉, 서열번호 4)에 해당한다. 별도로 표시되지 않는 한, 용어 "LRRC4 단백질(이의 동의어 포함)"은 세포에 의해 자연적으로 발현된 LRRC4 단백질의 임의의 변이체 또는 아이소폼을 포함한다.

인간 LRRC4 단백질 (UniProt: Q9HBW1)
(신호펩티드는 볼드체)

MKLLWQVTVHHHTWNAILLPFVYLTAQVWILCAAIAAAASAGPQNCPSVCSCSNQFSKVVCTRRGLSEVPQGIPSNTRYLNLMENNIQMIQADTFRHLHHLEVLQLGRNSIRQIEVGAFNGLASLNTLELFDNWLTVIPSGAFEYLSKLRELWLRNNPIESIPSYAFNRVPSLMRLDLGELKKLEYISEGAFEGLFNLKYLNLGMCNIKDMPNLTPLVGLEELEMSGNHFPEIRPGSFHGLSSLKKLWVMNSQVSLIERNAFDGLASLVELNLAHNNLSSLPHDLFTPLRYLVELHLHHNPWNCDCDILWLAWWLREYIPTNSTCCGRCHAμmHMRGRYLVEVDQASFQCSAPFIMDAPRDLNISEGRMAELKCRTPμmSSVKWLLPNGTVLSHASRHPRISVLNDGTLNFSHVLLSDTGVYTCMVTNVAGNSNASAYLNVSTAELNTSNYSFFTTVTVETTEISPEDTTRKYKPVPTTSTGYQPAYTTSTTVLIQTTRVPKQVAVPATDTTDKMQTSLDEVMKTTKIIIGCFVAVTLLAAAMLIVFYKLRKRHQQRSTVTAARTVEIIQVDEDIPAATSAAATAAPSGVSGEGAVVLPTIHDHINYNTYKPAHGAHWTENSLGNSLHPTVTTISEPYIIQTHTKDKVQETQI (서열번호 1)

인간 LRRC4 엑토도메인 단백질(즉, 서열번호1의 아미노산 39-527)

ASAGPQNCPSVCSCSNQFSKVVCTRRGLSEVPQGIPSNTRYLNLMENNIQMIQADTFRHLHHLEVLQLGRNSIRQIEVGAFNGLASLNTLELFDNWLTVIPSGAFEYLSKLRELWLRNNPIESIPSYAFNRVPSLMRLDLGELKKLEYISEGAFEGLFNLKYLNLGMCNIKDMPNLTPLVGLEELEMSGNHFPEIRPGSFHGLSSLKKLWVMNSQVSLIERNAFDGLASLVELNLAHNNLSSLPHDLFTPLRYLVELHLHHNPWNCDCDILWLAWWLREYIPTNSTCCGRCHAμmHMRGRYLVEVDQASFQCSAPFIMDAPRDLNISEGRMAELKCRTPμmSSVKWLLPNGTVLSHASRHPRISVLNDGTLNFSHVLLSDTGVYTCMVTNVAGNSNASAYLNVSTAELNTSNYSFFTTVTVETTEISPEDTTRKYKPVPTTSTGYQPAYTTSTTVLIQTTRVPKQVAVPATDTTDKMQTSLDEVMKTTK (서열번호 4)

LRRC4 단백질 서열

인간에서, LRRC4B 단백질을 인코딩하는 유전자는 염색체 19(GenBank Accession Number NC_000019.10의 뉴클레오티드 50,516,892-50,568,435; 마이너스 가닥 배향)에 위치한다. LRRC4B 단백질의 동의어는 알려져 있으며 비제한적 예에는 다음을 포함한다: "Netrin-G3 리간드", "LRIG4", "NGL-3", "HSM" 및 "DKFZp761A179". LRRC4B 단백질에 대한 아미노산 서열은 713개 아미노산 길이로 표2(아래)에 제공된다. LRRC4B 단백질의 전장 엑토도메인은 서열번호 2의 아미노산 잔기 36-576(즉, 서열번호 5)에 해당한다. 별도로 나타내지 않는 한, 용어 "LRRC4B 단백질(이의 동의어 포함)"은 세포에 의해 자연적으로 발현되는 LRRC4B 단백질의 임의의 변이체 또는 아이소폼을 포함한다.

인간 LRRC4B 단백질 (UniProt: Q9NT99)
(신호펩티드는 볼드체)

MARARGSPCPPLPPGRMSWPHGALLFLWLFSPPLGAGGGGVAVTSAAGGGSPPATSCPVACSCSNQASRVICTRRDLAEVPASIPVNTRYLNLQENGIQVIRTDTFKHLRHLEILQLSKNLVRKIEVGAFNGLPSLNTLELFDNRLTTVPTQAFEYLSKLRELWLRNNPIESIPSYAFNRVPSLRRLDLGELKRLEYISEAAFEGLVNLRYLNLGMCNLKDIPNLTALVRLEELELSGNRLDLIRPGSFQGLTSLRKLWLMHAQVATIERNAFDDLKSLEELNLSHNNLMSLPHDLFTPLHRLERVHLNHNPWHCNCDVLWLSWWLKETVPSNTTCCARCHAPAGLKGRYIGELDQSHFTCYAPVIVEPPTDLNVTEGMAAELKCRTGTSMTSVNWLTPNGTLMTHGSYRVRISVLHDGTLNFTNVTVQDTGQYTCMVTNSAGNTTASATLNVSAVDPVAAGGTGSGGGGPGGSGGVGGGSGGYTYFTTVTVETLETQPGEEALQPRGTEKEPPGPTTDGVWGGGRPGDAAGPASSSTTAPAPRSSRPTEKAFTVPITDVTENALKDLDDVMKTTKIIIGCFVAITFMAAVMLVAFYKLRKQHQLHKHHGPTRTVEIINVEDELPAASAVSVAAAAAVASGGGVGGDSHLALPALERDHLNHHHYVAAAFKAHYSSNPSGGGCGGKGPPGLNSIHEPLLFKSGSKENVQETQI (서열번호 2)

인간 LRRC4B 엑토도메인 단백질(즉, 서열번호 2의 아미노산 36-576)

AGGGGVAVTSAAGGGSPPATSCPVACSCSNQASRVICTRRDLAEVPASIPVNTRYLNLQENGIQVIRTDTFKHLRHLEILQLSKNLVRKIEVGAFNGLPSLNTLELFDNRLTTVPTQAFEYLSKLRELWLRNNPIESIPSYAFNRVPSLRRLDLGELKRLEYISEAAFEGLVNLRYLNLGMCNLKDIPNLTALVRLEELELSGNRLDLIRPGSFQGLTSLRKLWLMHAQVATIERNAFDDLKSLEELNLSHNNLMSLPHDLFTPLHRLERVHLNHNPWHCNCDVLWLSWWLKETVPSNTTCCARCHAPAGLKGRYIGELDQSHFTCYAPVIVEPPTDLNVTEGMAAELKCRTGTSMTSVNWLTPNGTLMTHGSYRVRISVLHDGTLNFTNVTVQDTGQYTCMVTNSAGNTTASATLNVSAVDPVAAGGTGSGGGGPGGSGGVGGGSGGYTYFTTVTVETLETQPGEEALQPRGTEKEPPGPTTDGVWGGGRPGDAAGPASSSTTAPAPRSSRPTEKAFTVPITDVTENALKDLDDVMKTTK (서열번호 5)

LRRC4B 단백질 서열

인간에서, LRRC4C 단백질을 인코딩하는 유전자는 염색체 11(GenBank Accession Number NC_000011.10의 뉴클레오티드 40,107,066-41,460,419; 마이너스 가닥 배향)에 위치한다. LRRC4C 단백질의 동의어는 알려져 있으며 비제한적 예로 "NGL-1", "Netrin-G1 리간드" 및 "KIAA1580"이 포함된다. LRRC4C 단백질에 대한 아미노산 서열은 길이가 640개 아미노산이고 표3(아래)에 제공된다. LRRC4C 단백질의 전장 엑토도메인은 서열번호 3의 아미노산 45-527(즉, 서열번호 6)에 해당한다. 별도로 표시되지 않는 한, 용어 "LRRC4C 단백질(이의 동의어 포함)"은 세포에 의해 자연적으로 발현되는 LRRC4C 단백질의 임의의 변이체 또는 아이소폼을 포함한다.

인간 LRRC4C 단백질 (UniProt: Q9HCJ2)
(신호펩티드는 볼드체)

MLNKMTLHPQQIMIGPRFNRALFDPLLVVLLALQLLVVAGLVRAQTCPSVCSCSNQFSKVICVRKNLREVPDGISTNTRLLNLHENQIQIIKVNSFKHLRHLEILQLSRNHIRTIEIGAFNGLANLNTLELFDNRLTTIPNGAFVYLSKLKELWLRNNPIESIPSYAFNRIPSLRRLDLGELKRLSYISEGAFEGLSNLRYLNLAMCNLREIPNLTPLIKLDELDLSGNHLSAIRPGSFQGLMHLQKLWMIQSQIQVIERNAFDNLQSLVEINLAHNNLTLLPHDLFTPLHHLERIHLHHNPWNCNCDILWLSWWIKDMAPSNTACCARCNTPPNLKGRYIGELDQNYFTCYAPVIVEPPADLNVTEGMAAELKCRASTSLTSVSWITPNGTVMTHGAYKVRIAVLSDGTLNFTNVTVQDTGMYTCMVSNSVGNTTASATLNVTAATTTPFSYFSTVTVETMEPSQDEARTTDNNVGPTPVVDWETTNVTTSLTPQSTRSTEKTFTIPVTDINSGIPGIDEVMKTTKIIIGCFVAITLMAAVMLVIFYKMRKQHHRQNHHAPTRTVEIINVDDEITGDTμmESHLμmPAIEHEHLNHYNSYKSPFNHTTTVNTINSIHSSVHEPLLIRMNSKDNVQETQI (서열번호 3)

인간 LRRC4C 엑토도메인 단백질(즉, 서열번호 3의 아미노산 45-527)

QTCPSVCSCSNQFSKVICVRKNLREVPDGISTNTRLLNLHENQIQIIKVNSFKHLRHLEILQLSRNHIRTIEIGAFNGLANLNTLELFDNRLTTIPNGAFVYLSKLKELWLRNNPIESIPSYAFNRIPSLRRLDLGELKRLSYISEGAFEGLSNLRYLNLAMCNLREIPNLTPLIKLDELDLSGNHLSAIRPGSFQGLMHLQKLWMIQSQIQVIERNAFDNLQSLVEINLAHNNLTLLPHDLFTPLHHLERIHLHHNPWNCNCDILWLSWWIKDMAPSNTACCARCNTPPNLKGRYIGELDQNYFTCYAPVIVEPPADLNVTEGMAAELKCRASTSLTSVSWITPNGTVMTHGAYKVRIAVLSDGTLNFTNVTVQDTGMYTCMVSNSVGNTTASATLNVTAATTTPFSYFSTVTVETMEPSQDEARTTDNNVGPTPVVDWETTNVTTSLTPQSTRSTEKTFTIPVTDINSGIPGIDEVMKTTK (서열번호 6)

LRRC4C 단백질 서열

본 명세서에서 사용되는 용어 "FAM19A5 결합 도메인"은 FAM19A5 단백질에 결합할 수 있는 LRRC4 단백질 패밀리 멤버의 분절/단편을 의미한다

"서열 유사성 19를 갖는 패밀리, 멤버 A5" 또는 "FAM19A5"라는 용어는 5개의 고도로 상동성인 단백질의 TAFA 패밀리(또한 FAM19 패밀리로 알려짐)에 속하고 주로 뇌 및 척수에서 발현되는 단백질을 의미한다. FAM19A5는 "TAFA5" 또는 "케모카인 유사 단백질 TAFA-5"로도 알려져 있다.

인간에서, FAM19A5를 인코딩하는 유전자는 염색체 22에 위치한다. 선택적 스플라이싱에 의해 생산되는 것으로 여겨지는 다수의 인간 FAM19A5(UniProt: Q7Z5A7) 아이소폼이 있다. 아이소폼 1(UniProt: Q7Z5A7-1)은 132개의 아미노산으로 구성되고, 아이소폼 2(UniProt: Q7Z5A7-2)는 125개의 아미노산으로 구성되고, 아이소폼 3(UniProt: Q7Z5A7-3)은 53개의 아미노산으로 구성된다. 인간 FAM19A5 단백질은 막 결합 및 수용성(분비) 형태로 존재하는 것으로 여겨진다. 아이소폼 1은 하나의 막관통 영역을 가진 막단백질로 여겨진다. 문헌(Tang T. Y. et al., Genomics 83(4):727-34 (2004))에 분비 단백질(수용성)로 보고된 아이소폼 2는 아미노산 위치 1-25에 신호 펩티드를 함유한다. 아이소폼 1은 막단백질로 여겨지며 EST 데이터를 기반으로 예측된다. 표4(아래)는 세 가지 알려진 인간 FAM19A5 아이소폼의 아미노산 서열을 제공한다. 별도로 나타내지 않는 한, "FAM19A5"라는 용어는 세포에 의해 자연적으로 발현되는 FAM19A5 단백질의 임의의 변이체 또는 아이소폼을 포함한다. 따라서, 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4 단백질 패밀리 멤버의 FAM19A5 결합 도메인을 포함함)는 LRRC4 단백질 패밀리 멤버에 대한 FAM19A5 아이소폼 1, 아이소폼 2 및/또는 아이소폼 3의 결합을 억제할 수 있다.

인간 FAM19A5 단백질(아이소폼 1) (UniProt: Q7Z5A7-1, 막관통 단백질): 이 아이소폼은 정식 서열로 선택되었다.	MAPSPRTGSRQDATALPSMSSTFWAFMILASLLIAYCSQLAAGTCEIVTLDRDSSQPRRTIARQTARCACRKGQIAGTTRARPACVDARIIKTKQWCDMLPCLEGEGCDLLINRSGWTCTQPGGRIKTTTVS (서열번호 22)
인간 FAM19A5 단백질(아이소폼2) (UniProt: Q7Z5A7-2, 수용성 단백질)	MQLLKALWALAGAALCCFLVLVIHAQFLKEGQLAAGTCEIVTLDRDSSQPRRTIARQTARCACRKGQIAGTTRARPACVDARIIKTKQWCDMLPCLEGEGCDLLINRSGWTCTQPGGRIKTTTVS (서열번호 23)
인간 FAM19A5 단백질(아이소폼 3)(UniProt: Q7Z5A7-3)	MYHHREWPARIIKTKQWCDMLPCLEGEGCDLLINRSGWTCTQPGGRIKTTTVS (서열번호 24)

FAM19A5 단백질 서열

LRRC4 단백질 패밀리의 멤버를 설명하기 위해 사용되는 용어 "내인성(endogenous)"은 대상체에 자연적으로 존재하는 LRRC4 패밀리 단백질을 의미한다. 본 명세서에 기술된 바와 같이, 본 발명의 폴리펩티드는 내인성 LRRC4 단백질 패밀리 멤버와 (구조적으로 및/또는 기능적으로) 상이하다.

"결합 친화도(binding affinity)"는 일반적으로 분자의 단일 결합 부위(예컨대, FAM19A5 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드)와 그의 결합 파트너(예컨대, FAM19A5 단백질) 사이의 비-공유 상호작용의 합의 강도를 의미한다. 별도로 나타내지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 "결합 친화도"는 결합 쌍의 멤버 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 의미한다. 그의 파트너 Y(예컨대, FAM19A5)에 대한 분자 X(예컨대, LRRC4 단백질 패밀리 멤버의 FAM19A5 결합 도메인을 포함하는 본 명세서에 기술된 폴리펩티드)의 친화도는 일반적으로 해리 상수(K_D)로 나타낼 수 있다. 친화도는 평형 해리 상수(equilibrium dissociation constant)(K_D) 및 평형 결합 상수(equilibrium association constant)(K_A)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 다수의 방식으로 측정 및/또는 표현될 수 있다. K_D는 k_off/k_on의 몫으로 계산되고 몰 농도(M)로 표현되는 반면 K_A는 k_on/k_off의 몫으로 계산된다. k_on은 예컨대, 항원에 대한 항체의 결합 속도 상수를 의미하고, k_off는 예컨대, 항원에 대한 항체의 해리를 의미한다. k_on 및 k_off는 면역분석법(예컨대, 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)), BIACORE　 또는 동역학적 배제 분석법(KinExA)과 같은 당업자에게 공지된 기술에 의해 측정될 수 있다.

본 명세서에 사용된 용어 "특이적으로 결합하다", "특이적으로 인식하다", "특이적 결합", "선택적 결합" 및 "선택적으로 결합하다"는 유사한 용어이며, 항원(예컨대, FAM19A5 단백질)에 분자(예컨대, FAM19A5 결합을 포함하는 폴리펩티드 도메인)가 결합함을 의미하고, 그러한 결합은 당업자에 의해 이해된다. 예를 들어, 항원에 특이적으로 결합하는 분자는 일반적으로 예컨대, 면역분석법, BIACORE　, KinExA 3000 기기(Sapidyne Instruments, Boise, ID) 또는 기타 공지된 분석법에 의해 측정되는 바와 같이 더 낮은 친화도로 다른 펩티드 또는 폴리펩티드에 결합할 수 있다. 일부 측면에서, 항원에 특이적으로 결합하는 분자는 상기 분자가 다른 항원에 결합할때 K_A 보다 적어도 약 2log, 적어도 약 2.5log, 적어도 약 3log, 적어도 약 4log 더 큰 K_A를 갖는 항원에 결합한다.

본 명세서에서 사용되는 "항원"이라는 용어는 단백질, 펩티드 또는 합텐과 같은 임의의 천연 또는 합성 면역원성 물질을 의미한다. 본 발명으로부터 명백한 바와 같이, 항원은 FAM19A5 단백질 또는 이의 단편일 수 있다.

"표적에 결합하기 위해 다른 단백질과 경쟁하는" 폴리펩티드(예컨대, 본 명세서에 기술된 것)는 대상에 다른 단백질(예컨대, LRRC4 단백질 패밀리의 자연적으로 존재하는 멤버)의 결합을 (부분적으로 또는 완전히) 억제하는 폴리펩티드를 의미한다. 2개의 단백질이 표적에 결합하기 위해 서로 경쟁하는지 여부, 즉 본 명세서에 기술된 폴리펩티드가 FAM19A5 단백질에 대한 LRRC4 단백질 패밀리의 자연적으로 존재하는 멤버의 결합을 억제하는지 여부 및 어느 정도 억제하는지 여부는 공지된 경쟁 실험을 사용하여 측정될 수 있다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드는 경쟁하여, FAM19A5 단백질에 대한 LRRC4 단백질 패밀리의 자연적으로 존재하는 멤버의 결합을 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 100%로 억제한다. 경쟁 검정은 본 명세서 또는 예를 들어, 문헌(Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harb Protoc; 2006년; doi: 10.1101/pdb.prot4277 또는 Chapter 11 of "Using Antibodies" by Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA) 에 기술된 바와 같이 수행될 수 있다.

본 발명과 함께 사용될 수 있는 다른 경쟁적 결합 검정은 다음을 포함한다: 고체상 직접 또는 간접 방사면역분석(radioimmunoassay)(RIA), 고체상 직접 또는 간접 효소 면역검정(immunoassay)(EIA), 샌드위치 경쟁 검정(Stahli et al., Methods in Enzymology9:242(1983) 참조); 고체상 직접 비오틴-아비딘(biotin-avidin) EIA(Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614 (1986) 참조); 고체상 직접 표지 분석, 고체상 직접 표지 샌드위치 분석(Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988) 참조); 1-125 표지를 사용하는 고체상 직접 표지 RIA(Morel et al., Mol. Immunol. 25(1):7 (1988) 참조); 고체상 직접 비오틴-아비딘 EIA(Cheung et al., Virology 176:546 (1990) 참조); 및 직접 표지 RIA. (Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77 (1990) 참조).

본 명세서에서 사용된 용어 "자연적으로 발생" 또는 "자연적으로 존재"는 물체(예컨대, 단백질)가 자연에서 발견될 수 있다는 사실을 의미한다. 예를 들어, 자연의 공급원으로부터 분리될 수 있고 실험실에서 사람에 의해 의도적으로 변형되지 않은 유기체(바이러스 포함)에 존재하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 자연 발생적이다. 본 발명의 다른 곳에서 추가로 기재된 바와 같이, 본 발명에 유용한 폴리펩티드는 자연 발생적이지 않다.

"폴리펩티드"는 사슬의 길이에 대한 상한선 없이 적어도 2개의 연속적으로 연결된 아미노산 잔기를 포함하는 사슬을 의미한다. 단백질의 하나 이상의 아미노산 잔기는 글리코실화, 인산화 또는 이황화 결합 형성과 같은 변형을 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. "단백질"은 하나 이상의 폴리펩티드를 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "핵산" 또는 "핵산 분자"는 DNA 분자 및 RNA 분자를 포함하는 것으로 의도된다. 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있으며 cDNA일 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "벡터"는 연결된 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 의미하는 것으로 의도된다. 벡터의 한 유형은 "플라스미드"이며, 이는 추가 DNA 세그먼트가 결찰될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA 루프를 의미한다. 또 다른 유형의 벡터는 추가 DNA 세그먼트가 바이러스 게놈에 결찰될 수 있는 바이러스 벡터이다. 특정 벡터(예컨대, 박테리아 복제 기점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터)는 이들이 도입되는 숙주 세포에서 자율적으로 복제할 수 있다. 다른 벡터(예컨대, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포로의 도입시 숙주 세포의 게놈으로 통합될 수 있고, 이로써 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 특정 벡터는 작동 가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본 명세서에서 "재조합 발현 벡터(또는 간단히 "발현 벡터")"로 나타낸다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드 형태이다. 본 명세서에서 "플라스미드"와 "벡터"는 플라스미드가 가장 일반적으로 사용되는 벡터 형태이므로 혼용하여 사용할 수 있다. 그러나 동등한 기능을 하는 바이러스 벡터(예: 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노 관련 바이러스)와 같은 다른 형태의 발현 벡터도 포함된다.

본 명세서에서 사용되는 "재조합 숙주 세포"(또는 간단히 "숙주 세포")라는 용어는 세포에 자연적으로 존재하지 않는 핵산을 포함하는 세포를 나타내는 것으로 의도되며, 재조합 발현 벡터가 도입된 세포일 수 있다. 이러한 용어는 특정 대상 세포뿐만 아니라 그러한 세포의 자손을 지칭하는 것으로 의도됨을 이해해야 한다. 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 다음 세대에서 특정 변형이 발생할 수 있기 때문에, 이러한 자손은 실제로 부모 세포와 동일할 수 없지만 여전히 여기에서 사용되는 "숙주 세포"라는 용어의 범위 내에 포함된다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "투여하는"은 당업자에게 공지된 임의의 다양한 방법 및 전달 시스템을 사용하여 대상체에게 작용제(예컨대, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드 또는 분자) 또는 작용제를 포함하는 조성물의 물리적 도입을 의미한다. 종래 기술에서. 사용될 수 있는 투여 경로의 비제한적 예는 정맥내(intravenous), 복강내(intraperitoneal), 근육내(intramuscular), 피하(subcutaneous), 척수(spinal) 또는 기타 비경구(parenteral) 투여 경로, 예를 들어 주사 또는 주입을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "비경구 투여"는 일반적으로 주사에 의한 장내(enteral) 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 의미하며, 제한 없이 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내(intraarterial), 척수강내(intracheal), 림프내(intralymphatic), 병변내(intralesional), 피막내(intracapsular), 안와내(intraorbital), 심장내(intracardiac), 피내(intradermal), 기관내(transtracheal), 피하(subcutaneous), 표피하(subcuticular), 관절내(intraarticular), 피막하(subcapsular), 지주막하(subarachnoid), 척수내(intraspinal), 경막외(epidural) 및 흉골내(intrasternal) 주사 및 주입 뿐만 아니라 생체내 전기천공법을 포함한다. 대안적으로, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드 또는 분자는 비경구 경로, 예를 들어 국소, 표피 또는 점막 투여 경로를 통해, 예를 들어 비강내(intranasally), 경구(orally), 질(vaginally), 직장(rectally), 설하(sublingually) 또는 국소(topically) 투여될 수 있다. 투여는 또한 예를 들어 1회, 다수회 및/또는 하나 이상의 연장된 기간에 걸쳐 수행될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "대상체"는 임의의 인간 또는 인간이 아닌 동물을 포함한다. 용어 "비인간 동물"은 모든 척추동물, 예를 들어 포유동물 및 비인간 영장류, 양, 개, 소, 닭, 양서류, 파충류 등과 같은 비포유류를 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 "뉴런"이라는 용어는 전기적 및 화학적 신호를 통해 정보를 처리하고 전달하는 전기적으로 흥분가능한 세포를 포함한다. 뉴런은 CNS의 뇌와 척수, 말초 신경계(PNS)의 신경절의 주요 구성 요소이며 서로 연결되어 신경망을 형성할 수 있다. 전형적인 뉴런은 세포체(cell body)(soma), 수상돌기(dendrites) 및 축삭(axon)으로 구성된다. 뉴런의 소마(세포체)에는 핵이 들어 있다. 뉴런의 수상돌기는 뉴런에 대한 대부분의 입력이 발생하는 많은 가지가 있는 세포 확장이다. 축삭돌기는 세포체에서 연장되는 더 미세한 케이블 모양의 돌기이며 신경 신호를 세포체에서 멀리 전달하고 특정 유형의 정보를 세포체로 다시 전달한다.

본 명세서에 사용된 용어 "치료적 유효량"은 단독으로 또는 다른 치료제와 조합하여 질병 또는 장애를 "치료"하는데 효과적인 물질(예컨대, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드 또는 분자)의 양을 의미한다. 이는 질병 또는 장애(예컨대, 본 명세서에 기술된 신경학적 질병)의 위험, 잠재성, 가능성 또는 발생을 감소시키거나 감소시킨다. "치료적 유효량"은 질병 또는 장애(예컨대, 본 명세서에 기술된 신경학적 질병)를 갖거나 가질 위험이 있는 대상체에게 약간의 개선 또는 이점을 제공하는 물질 또는 치료제의 양을 포함한다. 따라서, "치료적 유효량"은 질병의 위험, 잠재성, 가능성 또는 발생을 감소시키거나, 장애의 경감 또는 일부 경감을 제공하고, 적어도 하나의 지표를 감소시키고, 질병이나 장애의 임상 증상의 적어도 하나를 감소시키는 양이다.

II. 폴리펩티드

본 발명은 FAM19A5 단백질과 LRRC4 단백질 패밀리 멤버 사이의 상호작용을 억제, 감소 및/또는 해리할 수 있는 폴리펩티드(예컨대, 분리 폴리펩티드)를 제공한다. 본 명세서에서 처음으로 입증된 바와 같이(예컨대, 실시예 1 참조), FAM19A5 단백질은 LRRC4 단백질 패밀리의 모든 멤버에 대해 높은 결합 친화성을 나타낸다. 또한, 본 발명은 LRRC4 단백질 패밀리 멤버의 특정 도메인이 FAM19A5 단백질에 대한 결합을 주로 맡고 있음을 추가로 입증한다. 따라서, 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드는 LRRC4 단백질 패밀리 멤버의 도메인을 포함하거나, 이로 구성되거나, 필수적으로 구성되며, 상기 도메인은 FAM19A5 단백질("FAM19A5 결합 도메인"으로도 지칭됨)에 결합할 수 있다. 일부 측면에서, 폴리펩티드는 FAM19A5 결합 도메인을 포함한다. 일부 측면에서, 폴리펩티드는 FAM19A5 결합 도메인으로 구성된다. 일부 측면에서, 폴리펩티드는 FAM19A5 결합 도메인으로 필수적으로 구성된다.

본 발명으로부터 명백한 바와 같이, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드는 하나 이상의 특징을 포함하고, 이는 LRRC4 단백질 패밀리의 자연적으로 존재하는 멤버와 (구조적으로 및/또는 기능적으로) 상이하다. 예를 들어, 일부 측면에서, 폴리펩티드는 FAM19A5 결합 도메인 내에 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 본 발명의 다른 곳에 기재된 바와 같이, 일부 측면에서 이러한 아미노산 치환은 폴리펩티드의 하나 이상의 특성을 개선할 수 있고, 예를 들어 FAM19A5 단백질에 대한 폴리펩티드의 안정성 및/또는 결합 친화도를 증가시킬 수 있다. 일부 측면에서, 본 발명의 폴리펩티드는 FAM19A5 결합 도메인을 포함하지만 LRRC4 단백질 패밀리 멤버의 하나 이상의 다른 도메인이 결여되어 있다. 예를 들어, 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드는 FAM19A5 결합 도메인을 포함하지만, LRRC4 단백질 패밀리 멤버의 막관통 도메인을 포함하지 않는다. 일부 측면에서, 폴리펩티드는 FAM19A5 결합 도메인을 포함하지만, LRRC4 단백질 패밀리 멤버의 세포내 도메인(예컨대, 시냅스후 밀도-결합(PB) 도메인)을 포함하지 않는다. 일부 측면에서, 폴리펩티드는 FAM19A5 결합 도메인을 포함하지만 막관통 도메인 및 세포내 도메인을 모두 포함하지는 않는다. 따라서, 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드는 자연적으로 존재하는 LRRC4 단백질 패밀리 멤버보다 더 짧다. 또한 생물학적 활성을 수행할 때(예컨대, 신경 회로 형성), LRRC4 단백질 계열(LRRC4, LRRC4B 및 LRRC4C)의 멤버는 각각 리간드(netrin-G2, 수용체 티로신 포스파타제 LAR 및 netrin-G1)와 상호 작용한다(예를 들어, Li et al., Mol Cancer 13: 266 (Dec. 2014) 참조). 본 발명의 폴리펩티드가 LRRC4 단백질 패밀리 멤버의 모든 도메인을 포함하지 않기 때문에, 일부 측면에서, 폴리펩티드는 LRRC4 단백질 패밀리 리간드에 결합하지 않고 대신 FAM19A5 단백질을 특이적으로 표적화한다. 따라서, 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드는 내인성 LRRC4 단백질 패밀리 멤버를 대체하지 않는다. 대신에, 일부 측면에서, FAM19A5와 LRRC4 단백질 패밀리의 멤버 사이의 상호작용을 억제, 감소 및/또는 해리함으로써, 본 발명의 폴리펩티드는 내인성 LRRC4 패밀리 단백질을 자유롭게 할 수 있고 이들이 그들의 천연 생물학적 기능을 수행하도록 할 수 있다.

본 명세서에 기술된 바와 같이, 본 발명의 폴리펩티드는 적어도 LRRC4 단백질 패밀리 멤버의 FAM19A5 결합 도메인을 포함한다. 별도로 나타내지 않는 한, FAM19A5 결합 도메인의 전체 길이는 도메인이 FAM19A5 단백질에 결합할 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다. 일부 측면에서, FAM19A5 결합 도메인은 적어도 약 5개 , 적어도 약 6개, 적어도 약 7개, 적어도 약 8개, 적어도 약 9개, 적어도 약 10개, 적어도 약 11개, 적어도 약 12개, 적어도 약 13개, 적어도 약 14개, 적어도 약 15개, 적어도 약 16개, 적어도 약 17개, 적어도 약 18개, 적어도 약 19개, 적어도 약 20개, 적어도 약 21개, 적어도 약 22개, 적어도 약 23개, 적어도 약 24개, 적어도 약 25개, 적어도 약 26개, 적어도 약 27개, 적어도 약 28개, 적어도 약 29개 또는 적어도 약 30개의 아미노산 길이이다. 일부 측면에서, FAM19A5 결합 도메인은 길이가 약 10 내지 약 23개 아미노산이다. 일부 측면에서, FAM19A5 결합 도메인은 약 10개, 약 11개, 약 12개, 약 13개, 약 14개, 약 15개, 약 16개, 약 17개, 약 18개, 약 19개, 약 20개, 약 21개, 약 22개, 또는 약 23개의 아미노산 길이이다. 일부 측면에서, LRRC4 단백질 패밀리 멤버의 FAM19A5 결합 도메인은 약 10개의 아미노산 길이이다.

일부 측면에서, 본 명세서에서 기술된 폴리펩티드의 FAM19A5 결합 도메인은 하기 화학식을 갖는 아미노산 서열(N-말단에서 C-말단)을 포함한다:

A-(T/S)-B (화학식 Ⅰ)(서열번호 25):

여기서, (i) "A"는 X1-(T/S)-(Y/F)-F-X5를 포함하고, (ii) "B"는 (V/I)-T-V-(E/V)를 포함하고;

(T/S)는 트레오닌(T), 또는 세린(S)이고;

(Y/F)는 티로신(Y) 또는 페닐알라닌(F)이고;

X5는 임의의 아미노산이고;

(V/I)는 발린(V) 또는 이소류신(I)이고;

(E/V)는 글루탐산(E) 또는 발린(V)이다.

A-(T/S)-B (화학식 I)(서열번호 26):

여기서, (i) "A"는 (Y/W/M)-(T/Y)-(Y/W)-(F/Y/W)-(T/Y)를 포함하고, (ii) B는 X7-(T/S/Y)-X9-X10를 포함하고,

(Y/W/M)은 티로신(Y), 트립토판(W), 또는 메티오닌(M)이고;

(T/Y)는 트레오닌(T) 또는 티로신(Y)이고;

(Y/W)는 티로신(Y) 또는 트립토판(W)이고;

(F/Y/W)는 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 또는 트립토판(W)이고;

(T/S/Y)는 트레오닌(T), 세린(S), 또는 티로신(Y)이고;

일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4 단백질 패밀리 멤버의 FAM19A5 결합 도메인을 포함함)는 하기 화학식을 갖는 아미노산 서열(N-말단에서 C-말단)을 포함한다:

X1-X2-X3-F-X5-T-X7-T-V-X 10 (화학식 II)(서열번호 27):

여기서, X1은 Y, F, V, L, 또는 I이고;

X2는 T 또는 S이고;

X3은 Y 또는 F이고;

X5는 임의의 아미노산이고;

X7은 V 또는 I이고; 및/또는

XIO은 E 또는 V이고,

일부 측면에서, 본 발명의 폴리펩티드는 하기 화학식의 아미노산 서열(N-말단에서 C-말단)을 포함한다:

X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10 (화학식 III)(서열번호 28):

여기서, XI은 Y, F, V, L, I, W, 또는 M이고;

X2는 T, S, 또는 Y이고;

X3은 Y, F, 또는 W이고;

X4는 F, Y, 또는 W이고;

X5는 임의의 아미노산, 예컨대, T, S, 또는 Y이고;

X6은 T, S, 또는 Y이고;

X7은 V, I, Y, F, L, W, 또는 M이고;

X8은 T, S, 또는 Y이고;

X9는 V, I, Y, F, L, W, 또는 M이고; 및/또는

X10은 E, D, V, I, Y, F, M, 또는 W이고,

임의의 상기 폴리펩티드에 대해, 일부 측면에서, (i) X1은 Y, F, V, L 또는 I이고; (ii) X2는 T 또는 S이고; (iii) X3은 Y 또는 F이고; (iv) X4는 F이고; (v) X5는 T 또는 S이고; (vi) X6은 T이고; (vii) X7은 V 또는 I이고; (viii) X8은 T이고; (ix) X9는 V이고; (x) X10은 E 또는 V이고; (xi) (i)-(x)의 임의의 조합이다. 일부 측면에서, X1은 is Y, F, V, L, 또는 I이다. 일부 측면에서, X2는 T 또는 S이다. 일부 측면에서, X3는 Y 또는 F이다. 일부 측면에서, X4는 F이다. 일부 측면에서, X5는 T 또는 S이다. 일부 측면에서, X6은 T이다. 일부 측면에서, X7은 V 또는 I이다. 일부 측면에서, X8은 T이다. 일부 측면에서, X9는 V이다. 일부 측면에서, X10은 E 또는 V이다. 일부 측면에서, X2 위치에서 아미노산은 인산화된다. 일부 측면에서, X2 위치에서 아미노산은 O-글리코실화된다.

일부 측면에서, 본 발명의 폴리펩티드는 LRRC4 단백질 패밀리 멤버의 FAM19A5 결합 도메인을 포함하고, 상기 FAM19A5 결합 도메인은 아미노산 서열이 상이한(예컨대, 치환된) 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개 아미노산을 갖는 서열번호 29(YTYFTTVTVE)로 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드는 LRRC4 단백질 패밀리 멤버의 FAM19A5 결합 도메인을 포함하고, 상기 FAM19A5 결합 도메인은 아미노산 서열이 상이한(예컨대, 치환된) 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개 아미노산을 갖는 서열번호 29(YTYFTTVTVE)로 제시된 아미노산 서열로 구성된다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드는 LRRC4 단백질 패밀리 멤버의 FAM19A5 결합 도메인을 포함하고, 상기 FAM19A5 결합 도메인은 아미노산 서열이 상이한(예컨대, 치환된) 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개 아미노산을 갖는 서열번호 29(YTYFTTVTVE)로 제시된 아미노산 서열로 필수적으로 구성된다.

일부 측면에서, 본 발명의 폴리펩티드는 FAM19A5 결합 도메인을 포함하고, 이는 서열번호 29(YTYFTTVTVE)로 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, FAM19A5 결합 도메인은 서열번호 29(YTYFTTVTVE)로 제시된 아미노산 서열로 구성된다. 일부 측면에서, FAM19A5 결합 도메인은 서열번호 29(YTYFTTVTVE)로 제시된 아미노산 서열로 필수적으로 구성된다. 본 명세서에서 확인된 바와 같이, 서열번호 29(YTYFTTVTVE)로 제시된 아미노산은 LRRC4B 단백질의 FAM19A5 결합 도메인에 상응한다.

일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드는 FAM19A5 결합 도메인을 포함하고, 이는 서열번호 30(YSFFTTVTVE)로 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, FAM19A5 결합 도메인은 서열번호 30(YSFFTTVTVE)로 제시된 아미노산 서열로 구성된다. 일부 측면에서, FAM19A5 결합 도메인은 서열번호 30(YSFFTTVTVE)로 제시된 아미노산 서열로 필수적으로 구성된다. 본 명세서에서 확인된 바와 같이, 서열번호 30(YSFFTTVTVE)로 제시된 아미노산은 LRRC4 단백질의 FAM19A5 결합 도메인에 상응한다.

일부 측면에서, 본 명세서에 유용한 폴리펩티드는 FAM19A5 결합 도메인을 포함하고, 이는 서열번호 31(FSYFSTVTVE)로 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, FAM19A5 결합 도메인은 서열번호 31(FSYFSTVTVE)로 제시된 아미노산 서열로 구성된다. 일부 측면에서, FAM19A5 결합 도메인은 서열번호 31(FSYFSTVTVE)로 제시된 아미노산 서열로 필수적으로 구성된다. 본 명세서에서 확인된 바와 같이, 서열번호 31(FSYFSTVTVE)로 제시된 아미노산은 LRRC4C 단백질의 FAM19A5 결합 도메인에 상응한다.

본 명세서에 기술된 바와 같이, LRRC4 단백질 패밀리 멤버의 FAM19A5 결합 도메인은 척추동물 중에서 대체로 보존되어 있다(예컨대, 도20 참조). 따라서, 어느 하나의 이론에 얽매이지 않고, 서열번호 29(YTYFTTVTVE), 30(YSFFTTVTVE) 및 31(FSYFSTVTVE) 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 척추동물의 해당 잔기에 아미노산이 존재하는 아미노산으로 치환될 수 있다. 그러한 치환의 예는 본 발명의 다른 곳에서 제공된다(예컨대, 도20 참조).

추가로, 일부 측면에서, 서열 번호 29(YTYFTTVTVE), 30(YSFFTTVTVE) 및 31(FSYFSTVTVE) 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 하나 이상의 아미노산 잔기는 유사한 생화학적 특성을 공유하는 아미노산으로 치환될 수 있다. 예를 들어, 서열번호 29(YTYFTTVTVE)에 제시된 아미노산 서열에서, 위치 1의 Y는 다른 소수성 아미노산(예컨대, F, V, L, I, W, 또는 M)으로 치환될 수 있다. 일부 측면에서, 위치 2의 T는 측쇄에 유사한 히드록실기(OH)를 갖는 다른 아미노산(예컨대, S 또는 Y)으로 치환될 수 있다. 일부 측면에서, 위치 3의 Y는 반 데르 발스 상호작용에 참여할 수 있는 그의 측쇄에 공통 방향족 고리를 갖는 다른 아미노산(예컨대, F 또는 W)으로 치환될 수 있다. 일부 측면에서, 위치 4의 F는 Y 또는 W와 같은 아미노산으로 치환될 수 있다. 일부 측면에서, 위치 5의 T는 S 또는 Y와 같은 아미노산으로 치환될 수 있다. 일부 측면에서, 위치 6의 T는 S 또는 Y와 같은 아미노산으로 치환될 수 있다. 일부 측면에서, 위치 7의 V는 소수성 부피가 큰 측쇄를 갖는 다른 아미노산(예컨대, I, Y, F, L, W, 또는 M)으로 치환될 수 있다. 일부 측면에서, 위치 8의 T는 S 또는 Y와 같은 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 일부 측면에서, 위치 9의 V는 I, Y, F, L, W, 또는 M으로 치환될 수 있다. 일부 측면에서, 위치 10의 E는 산성 측쇄를 갖는 다른 아미노산(예컨대, I, Y, F, M 또는 W)으로 치환될 수 있다.

일부 측면에서, 본 발명의 폴리펩티드는 서열번호 29(YTYFTTVTVE)로 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90% 일치하는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 폴리펩티드는 FAM19A5 단백질에 결합할 수 있다. 일부 측면에서, 상기 폴리펩티드는 FAM19A5 단백질과 LRRC4 단백질 패밀리 사이의 상호작용을 억제, 감소, 및/또는 해리할 수 있다.

일부 측면에서, 본 발명의 폴리펩티드는 서열번호 5로 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 일치하는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 폴리펩티드는 FAM19A5 단백질에 결합할 수 있고, 이에 의해 FAM19A5 단백질과 LRRC4 단백질 패밀리 사이의 상호작용을 억제, 감소, 및/또는 해리할 수 있다. 일부 측면에서, 본 발명의 폴리펩티드는 서열번호 4로 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 일치하는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 폴리펩티드는 FAM19A5 단백질에 결합할 수 있고, 이에 의해 FAM19A5 단백질과 LRRC4 단백질 패밀리 사이의 상호작용을 억제, 감소, 및/또는 해리할 수 있다. 일부 측면에서, 본 발명의 폴리펩티드는 서열번호 6으로 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 일치하는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 폴리펩티드는 FAM19A5 단백질에 결합할 수 있고, 이에 의해 FAM19A5 단백질과 LRRC4 단백질 패밀리 사이의 상호작용을 억제, 감소, 및/또는 해리할 수 있다.

본 발명으로부터 명백한 것처럼, 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4 단백질 패밀리 멤버의 FAM19A5 결합 도메인을 포함함)는 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 일부 측면에서, 하나 이상의 아미노산 변형은 FAM19A5 단백질에 상기 폴리펩티드의 결합 친화도를 증가시킬수 있다. 따라서, 일부 측면에서, FAM19A5 단백질에 본 명세서에 기술된 폴리펩티드의 결합 친화도는 대조군(예컨대, 아미노산 변형이 없거나 또는 자연적으로 존재하는 LRRC4 단백질 패밀리의 멤버에 상응함)에 비교하여 적어도 약 0.5배, 적어도 약 1배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 30배, 적어도 약 35배, 적어도 약 40배, 적어도 약 45배, 또는 적어도 약 50배 증가된다. 일부 측면에서, 하나 이상의 아미노산 변형은 폴리펩티드의 안정성을 증가시킬 수 있다. 따라서, 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드의 안정성은 대조군(예컨대, 아미노산 변형이 없거나 또는 자연적으로 존재하는 LRRC4 단백질 패밀리의 멤버에 해당함)에 비교하여 적어도 약 0.5배, 적어도 약 1배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 30배, 적어도 약 35배, 적어도 약 40배, 적어도 약 45배, 또는 적어도 약 50배 증가된다.

일부 측면에서, 한 개 이상의 아미노산 변형은 FAM19A5 단백질과 LRRC4 단백질 패밀리의 멤버 사이의 상호작용을 억제하는 본 명세서에 기술된 폴리펩티드의 활성을 개선할 수 있다(예컨대, 결합 치환도 및/또는 안정성을 증가시킴으로써). 따라서, 일부 측면에서, FAM19A5 단백질과 LRRC4 단백질 패밀리의 멤버 사이의 상호작용을 억제하는 본 명세서에 기술된 폴리펩티드의 활성은 대조군(예컨대, 아미노산 변형이 없거나 또는 자연적으로 존재하는 LRRC4 단백질 패밀리의 멤버에 해당함)에 비교하여 적어도 약 0.5배, 적어도 약 1배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 30배, 적어도 약 35배, 적어도 약 40배, 적어도 약 45배, 또는 적어도 약 50배 증가된다.

본 발명에 유용한 아미노산 변형의 비제한적 예는 본 발명을 통해 제공된다(예컨대, 본 발명의 섹션 III 참조). 예를 들면, 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드는 LRRC4 단백질 패밀리의 멤버, 즉, YTYFTTVTVE(서열번호 29), YSFFTTVTVE(서열번호 30), 또는 FSYFSTVTVE(서열번호 31)의 FAM19A5 결합 도메인 중 하나 및 폴리펩티드의 N-말단, C-말단, 또는 N-말단과 C-말단 모두에 있는 하나 이상의 아미노산을 포함한다. 일부 측면에서, 본 발명에 유용한 폴리펩티드는 폴리펩티드 N-말단에서 적어도 약 1, 적어도, 약 2, 적어도 약 3, 적어도 약 4, 적어도 약 5, 적어도 약 6, 적어도 약 7, 적어도 약 8, 적어도 약 9, 적어도 약 10, 적어도 약 11, 적어도 약 12, 적어도 약 13, 적어도 약 14, 적어도 약 15, 적어도 약 16, 적어도 약 17, 적어도 약 18, 적어도 약 19 또는 적어도 약 20개의 추가 아미노산을 포함한다. 일부 측면에서, 상기 폴리펩티드는 폴리펩티드 C-말단에서 적어도 약 1, 적어도, 약 2, 적어도 약 3, 적어도 약 4, 적어도 약 5, 적어도 약 6, 적어도 약 7, 적어도 약 8, 적어도 약 9, 적어도 약 10, 적어도 약 11, 적어도 약 12, 적어도 약 13, 적어도 약 14, 적어도 약 15, 적어도 약 16, 적어도 약 17, 적어도 약 18, 적어도 약 19 또는 적어도 약 20개의 추가 아미노산을 포함한다. 일부 측면에서, 상기 폴리펩티드는 (i) 폴리펩티드 N-말단에서 적어도 약 1, 적어도, 약 2, 적어도 약 3, 적어도 약 4, 적어도 약 5, 적어도 약 6, 적어도 약 7, 적어도 약 8, 적어도 약 9, 적어도 약 10, 적어도 약 11, 적어도 약 12, 적어도 약 13, 적어도 약 14, 적어도 약 15, 적어도 약 16, 적어도 약 17, 적어도 약 18, 적어도 약 19 또는 적어도 약 20개의 추가 아미노산; 및 (ii) 폴리펩티드 C-말단에서 적어도 약 1, 적어도, 약 2, 적어도 약 3, 적어도 약 4, 적어도 약 5, 적어도 약 6, 적어도 약 7, 적어도 약 8, 적어도 약 9, 적어도 약 10, 적어도 약 11, 적어도 약 12, 적어도 약 13, 적어도 약 14, 적어도 약 15, 적어도 약 16, 적어도 약 17, 적어도 약 18, 적어도 약 19 또는 적어도 약 20개의 추가 아미노산을 포함한다. 본 명세서에서 확인된 바와 같이(예컨대, 실시예9 참조), 일부 측면에서, 하나 이상의 아미노산은 자연적으로 존재하는 LRRC4 단백질 패밀리 멤버에서 특정 잔기에 존재하는 아미노산과 상이하다.

예를 들어, 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드는 하나 이상의 아미노산 변형(예컨대, 치환)을 갖는 서열번호 18(GYTYFTTVTVETLETQPGEE)에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드는 2개의 아미노산 변형(예컨대, 치환)을 갖는 서열번호 18(GYTYFTTVTVETLETQPGEE)에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 아미노산 변형은 서열번호 18의 잔기 T12 및 L13에 있다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드는 하나 이상의 아미노산 변형(예컨대, 치환)을 갖는 서열번호 18(GYTYFTTVTVETLETQPGEE)에 제시된 아미노산 서열로 구성된다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드는 2개의 아미노산 변형(예컨대, 치환)을 갖는 서열번호 18(GYTYFTTVTVETLETQPGEE)에 제시된 아미노산 서열로 구성된다. 일부 측면에서, 아미노산 변형은 서열번호 18의 잔기 T12 및 L13에 있다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드는 하나 이상의 아미노산 변형(예: 치환)을 갖는 서열번호 18(GYTYFTTVTVETLETQPGEE)에 제시된 아미노산 서열로 필수적으로 구성된다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드는 2개의 아미노산 변형(예컨대, 치환)을 갖는 서열번호 18(GYTYFTTVTVETLETQPGEE)에 제시된 아미노산 서열로 필수적으로 구성된다. 일부 측면에서, 상기 아미노산 변형은 서열번호 18의 잔기 T12 및 L13에 있다.

일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드는 하나 이상의 아미노산 변형(예컨대, 치환)을 갖는 서열번호 17(GYTYFTTVTVETLETQ)에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드는 2개의 아미노산 변형(예컨대, 치환)을 갖는 서열번호 17(GYTYFTTVTVETLETQ)에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 상기 아미노산 변형은 서열번호 17의 잔기 T12 및 L13에 있다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드는 하나 이상의 아미노산 변형(예: 치환)을 갖는 서열번호 17(GYTYFTTVTVETLETQ)에 제시된 아미노산 서열로 구성된다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드는 2개의 아미노산 변형(예컨대, 치환)을 갖는 서열번호 17(GYTYFTTVTVETLETQ)에 제시된 아미노산 서열로 구성된다. 일부 측면에서, 상기 아미노산 변형은 서열번호 17의 잔기 T12 및 L13에 있다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드는 하나 이상의 아미노산 변형(예: 치환)을 갖는 서열번호 17(GYTYFTTVTVETLETQ)에 제시된 아미노산 서열로 필수적으로 구성된다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드는 2개의 아미노산 변형(예컨대, 치환)을 갖는 서열번호 17(GYTYFTTVTVETLETQ)에 제시된 아미노산 서열로 필수적으로 구성된다. 일부 측면에서, 아미노산 변형은 서열번호 17의 잔기 T12 및 L13에 있다.

일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드는 하나 이상의 아미노산 변형(예컨대, 치환)을 갖는 서열번호 19(GYTYFTTVTVETLETQPGEKEPPGPTTD)에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드는 2개의 아미노산 변형(예컨대, 치환)을 갖는 서열번호 19(GYTYFTTVTVETLETQPGEKEPPGPTTD)에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 상기 아미노산 변형은 서열번호 19의 잔기 T12 및 L13에 있다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드는 하나 이상의 아미노산 변형(예컨대, 치환)을 갖는 서열번호 19(GYTYFTTVTVETLETQPGEKEPPGPTTD)에 제시된 아미노산 서열로 구성된다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드는 2개의 아미노산 변형(예컨대, 치환)을 갖는 서열번호 19(GYTYFTTVTVETLETQPGEKEPPGPTTD)에 제시된 아미노산 서열로 구성된다. 일부 측면에서, 상기 아미노산 변형은 서열번호 19의 잔기 T12 및 L13에 있다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드는 하나 이상의 아미노산 변형(예컨대, 치환)을 갖는 서열번호 19(GYTYFTTVTVETLETQPGEKEPPGPTTD)에 제시된 아미노산 서열로 필수적으로 구성된다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드는 2개의 아미노산 변형(예컨대, 치환)을 갖는 서열번호 19(GYTYFTTVTVETLETQPGEKEPPGPTTD)에 제시된 아미노산 서열로 필수적으로 구성된다. 일부 측면에서, 상기 아미노산 변형은 서열번호 19의 잔기 T12 및 L13에 있다.

일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드는 하나 이상의 아미노산 변형(예컨대, 치환)을 갖는 서열번호 143(GYTYFTTVTVETLETQPGEEA)에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드는 2개의 아미노산 변형(예컨대, 치환)을 갖는 서열번호 143(GYTYFTTVTVETLETQPGEEA)에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 상기 아미노산 변형은 서열번호 143의 잔기 T12 및 L13에 있다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드는 하나 이상의 아미노산 변형(예컨대, 치환)을 갖는 서열번호 143(GYTYFTTVTVETLETQPGEEA)에 제시된 아미노산 서열로 구성된다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드는 2개의 아미노산 변형(예컨대, 치환)을 갖는 서열번호 143(GYTYFTTVTVETLETQPGEEA)에 제시된 아미노산 서열로 구성된다. 일부 측면에서, 상기 아미노산 변형은 서열번호 143의 잔기 T12 및 L13에 있다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드는 하나 이상의 아미노산 변형(예컨대, 치환)을 갖는 서열번호 143(GYTYFTTVTVETLETQPGEEA)에 제시된 아미노산 서열로 필수적으로 구성된다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드는 2개의 아미노산 변형(예컨대, 치환)을 갖는 서열번호 143(GYTYFTTVTVETLETQPGEEA)에 제시된 아미노산 서열로 필수적으로 구성된다. 일부 측면에서, 상기 아미노산 변형은 서열번호 143의 잔기 T12 및 L13에 있다.

일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인 포함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVEPYETQPGEE(서열번호 123)를 포함한다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인을 포함함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVEPYETQPGEE(서열번호 123)로 구성된다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인을 포함함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVEPYETQPGEE(서열번호 123)로 필수적으로 구성된다.

일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인 포함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVEMRETQPGEE(서열번호 124)를 포함한다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인 포함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVEMRETQPGEE(서열번호 124)로 구성된다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인 포함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVEMRETQPGEE(서열 번호: 124)로 필수적으로 구성된다.

일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인 포함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVEIFETQPGEE(서열번호 125)를 포함한다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인 포함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVEIFETQPGEE(서열번호 125)로 구성된다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인 포함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVEIFETQPGEE(서열번호 125)로 필수적으로 구성된다.

일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인 포함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVEHFETQPGEE(서열번호 126)를 포함한다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인 포함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVEHFETQPGEE(서열번호 126)로 구성된다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인 포함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVEHFETQPGEE(서열번호 126)로 필수적으로 구성된다.

일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인 포함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVEWYETQPGEE(서열번호 127)를 포함한다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인을 포함함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVEWYETQPGEE(서열번호 127)로 구성된다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인을 포함함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVEWYETQPGEE(서열번호 127)로 필수적으로 구성된다.

일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인 포함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVEQRETQPGEE(서열번호 128)를 포함한다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인 포함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVEQRETQPGEE(서열번호 128)로 구성된다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인을 포함함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVEQRETQPGEE(서열번호 128)로 필수적으로 구성된다.

일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인 포함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVEWFETQPGEE(서열번호 129)를 포함한다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인 포함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVEWFETQPGEE(서열번호 129)로 구성된다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인 포함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVEWFETQPGEE(서열번호 129)로 필수적으로 구성된다.

일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인 포함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVEERETQPGEE(서열번호 130)를 포함한다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인 포함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVEERETQPGEE(서열번호 130)로 구성된다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인 포함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVEERETQPGEE(서열번호 130)로 필수적으로 구성된다.

일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인 포함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVEDYETQPGEE(서열번호 131)를 포함한다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인을 포함함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVEDYETQPGEE(서열번호 131)로 구성된다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인 포함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVEDYETQPGEE(서열번호 131)로 필수적으로 구성된다.

일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인 포함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVEFFETQPGEE(서열번호 132)를 포함한다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인을 포함함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVEFFETQPGEE(서열 번호:132)로 구성된다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인을 포함함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVEFFETQPGEE(서열번호 132)로 필수적으로 구성된다.

일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인 포함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVEHYETQPGEE(서열번호 133)를 포함한다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인 포함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVEHYETQPGEE(서열번호 133)로 구성된다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인 포함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVEHYETQPGEE(서열번호 133)로 필수적으로 구성된다.

일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인 포함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVEMMETQPGEE(서열번호 134)를 포함한다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인을 포함함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVEMMETQPGEE(서열번호 134)로 구성된다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인 포함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVEMMETQPGEE(서열번호 134)로 필수적으로 구성된다.

일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인 포함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVEDFETQPGEE(서열번호 135)를 포함한다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인을 포함함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVEDFETQPGEE(서열번호 135)로 구성된다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인 포함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVEDFETQPGEE(서열번호 135)로 필수적으로 구성된다.

일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인 포함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVEDIETQPGEE(서열번호 136)를 포함한다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인 포함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVEDIETQPGEE(서열번호 136)로 구성된다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인 포함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVEDIETQPGEE(서열번호 136)로 필수적으로 구성된다.

일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인 포함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVELIETQPGEE(서열번호 137)를 포함한다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인 포함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVELIETQPGEE(서열번호 137)로 구성된다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인 포함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVELIETQPGEE(서열번호 137)로 필수적으로 구성된다.

일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인 포함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVEEIETQPGEE(서열번호 138)를 포함한다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인 포함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVEEIETQPGEE(서열번호 138)로 구성된다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인 포함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVEEIETQPGEE(서열번호 138)로 필수적으로 구성된다.

일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인 포함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVEAFETQPGEE(서열번호 139)를 포함한다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인 포함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVEAFETQPGEE(서열번호 139)로 구성된다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인 포함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVEAFETQPGEE(서열번호 139)로 필수적으로 구성된다.

일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인 포함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVEHHETQPGEE(서열번호 140)를 포함한다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인 포함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVEHHETQPGEE(서열번호 140)로 구성된다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인 포함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVEHHETQPGEE(서열번호 140)로 필수적으로 구성된다.

일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인 포함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVEPFETQPGEE(서열번호 141)를 포함한다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인 포함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVEPFETQPGEE(서열번호 141)로 구성된다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인을 포함함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVEPFETQPGEE(서열번호 141)로 필수적으로 구성된다.

일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인 포함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVEDWETQPGEE(서열번호 142)를 포함한다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인 포함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVEDWETQPGEE(서열번호 142)로 구성된다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인 포함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVEDWETQPGEE(서열번호 142)로 필수적으로 구성된다.

일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인 포함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVEPYETQPGEEA(서열번호 144)를 포함한다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인을 포함함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVEPYETQPGEEA(서열번호 144)로 구성된다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인을 포함함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVEPYETQPGEEA(서열번호 144)로 필수적으로 구성된다.

일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인 포함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVEHFETQPGEEA(서열번호 145)를 포함한다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인을 포함함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVEHFETQPGEEA(서열번호 145)로 구성된다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인 포함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVEHFETQPGEEA(서열번호 145)로 필수적으로 구성된다.

일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인을 포함함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVEQRETQPGEEA(서열번호 146)를 포함한다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인 포함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVEQRETQPGEEA(서열번호 146)로 구성된다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인 포함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVEQRETQPGEEA(서열번호 146)로 필수적으로 구성된다.

일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인 포함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVEWYETQPGEEA(서열번호 147)를 포함한다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인 포함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVEWYETQPGEEA(서열번호 147)로 구성된다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인을 포함함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVEWYETQPGEEA(서열번호 147)로 필수적으로 구성된다.

일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인 포함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVEMRETQPGEEA(서열번호 148)를 포함한다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인 포함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVEMRETQPGEEA(서열번호 148)로 구성된다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인을 포함함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVEMRETQPGEEA(서열번호 148)로 필수적으로 구성된다.

일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인 포함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVEIFETQPGEEA(서열번호 149)를 포함한다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인 포함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVEIFETQPGEEA(서열번호 149)로 구성된다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4B의 FAM19A5 결합 도메인 포함)는 아미노산 서열 GYTYFTTVTVEIFETQPGEEA(서열번호 149)로 필수적으로 구성된다.

임의의 하나의 이론에 얽매이지 않고, 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드는 LRRC4 단백질 패밀리의 자연적으로 존재하는 멤버와 경쟁할 수 있다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드는 FAM19A5 단백질에 대한 결합을 위해 LRRC4 단백질 패밀리의 자연적으로 존재하는 멤버를 능가할 수 있도록 하나 이상의 특성(예컨대, 증가된 결합 친화도 및/또는 안정성)을 나타낸다.

III. 분자

또한, 본 명세서에서는 상기 기재된 임의의 폴리펩티드를 포함하는 분자(예컨대, LRRC4 단백질 패밀리 멤버의 FAM19A5 결합 도메인을 포함함)를 제공한다. 본 명세서에서 사용된 용어 "분자"는 분자가 폴리펩티드의 활성을 유지하는 한(예컨대, FAM19A5 단백질과 LRRC4 단백질 패밀리의 멤버 사이의 상호작용을 억제, 감소 및/또는 해리시킴) 특별히 제한되지 않는다. 본 발명에 유용한 분자의 비제한적 예는 항체 (또는 이의 항원 결합 부분), 소분자, 펩티드, 단백질 또는 이의 조합을 포함한다.

일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 분자는 FAM19A5 단백질과 LRRC4 단백질 패밀리의 멤버 사이의 상호작용을 억제하는 폴리펩티드의 능력을 향상시킬 수 있는 하나 이상의 성분을 포함한다. 예를 들어, 일부 측면에서, 분자는 (i) 본 명세서에 기술된 임의의 폴리펩티드 및 (ii) 폴리펩티드의 N-말단, 폴리펩티드의 C-말단 또는 폴리펩티드의 N-말단과 C-말단 모두에 하나 이상의 추가 아미노산 또는 화합물을 포함한다. 일부 측면에서, 본 발명에 유용한 분자는 폴리펩티드의 N-말단에 적어도 약 1, 적어도 약 2, 적어도 약 3, 적어도 약 4, 적어도 약 5, 적어도 약 6, 적어도 약 7, 적어도 약 8, 적어도 약 9, 적어도 약 10, 적어도 약 11, 적어도 약 12, 적어도 약 13, 적어도 약 14, 적어도 약 15, 적어도 약 16, 적어도 약 17, 적어도 약 18, 적어도 약 19 또는 적어도 약 20개의 추가 아미노산을 포함한다. 일부 측면에서, 분자는 폴리펩티드의 C-말단에 적어도 약 1, 적어도 약 2, 적어도 약 3, 적어도 약 4, 적어도 약 5, 적어도 약 6, 적어도 약 7, 적어도 약 8, 적어도 약 9, 적어도 약 10, 적어도 약 11, 적어도 약 12, 적어도 약 13, 적어도 약 14, 적어도 약 15, 적어도 약 16, 적어도 약 17, 적어도 약 18, 적어도 약 19, 또는 적어도 약 20개의 추가 아미노산을 포함한다. 일부 측면에서, 분자는 (i) 폴리펩티드의 N-말단에 적어도 약 1, 적어도 약 2, 적어도 약 3, 적어도 약 4, 적어도 약 5, 적어도 약 6, 적어도 약 7, 적어도 약 8, 적어도 약 9, 적어도 약 10, 적어도 약 11, 적어도 약 12, 적어도 약 13, 적어도 약 14, 적어도 약 15, 적어도 약 16, 적어도 약 17, 적어도 약 18, 적어도 약 19 또는 적어도 약 20개의 추가 아미노산; 및 (ii) 폴리펩티드의 C-말단에 적어도 약 1, 적어도 약 2, 적어도 약 3, 적어도 약 4, 적어도 약 5, 적어도 약 6, 적어도 약 7, 적어도 약 8, 적어도 약 9, 적어도 약 10, 적어도 약 11, 적어도 약 12, 적어도 약 13, 적어도 약 14, 적어도 약 15, 적어도 약 16, 적어도 약 17, 적어도 약 18, 적어도 약 19, 또는 적어도 약 20개의 추가 아미노산을 포함한다.

일부 측면에서, 분자는 (i) 서열번호 29(YTYFTTVTVE)에 제시된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 (ii) 폴리펩티드의 N-말단에 적어도 1개의 추가 아미노산을 포함한다. 일부 측면에서, 분자는 (i) 서열번호 29(YTYFTTVTVE)에 제시된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 (ii) 폴리펩티드의 C-말단에 적어도 1개의 추가 아미노산을 포함한다. 일부 측면에서, 분자는 (i) 서열번호 29(YTYFTTVTVE)에 제시된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 (ii) N-말단 및 C-말단 모두에서 적어도 하나의 추가 아미노산을 포함한다. 일부 측면에서, 본 발명에 유용한 분자는 서열번호 18(GYTYFTTVTVETLETQPGEE)에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 분자는 서열번호 18(GYTYFTTVTVETLETQPGEE)에 제시된 아미노산 서열로 구성된다. 일부 측면에서, 분자는 서열번호 18(GYTYFTTVTVETLETQPGEE)에 제시된 아미노산 서열로 필수적으로 구성된다. 일부 측면에서, 본 발명에 유용한 분자는 서열번호 17(GYTYFTTVTVETLETQ)에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 분자는 서열번호 17(GYTYFTTVTVETLETQ)에 제시된 아미노산 서열로 구성된다. 일부 측면에서, 분자는 서열번호 17(GYTYFTTVTVETLETQ)에 제시된 아미노산 서열로 필수적으로 구성된다. 일부 측면에서, 본 발명에 유용한 분자는 서열번호 19(GYTYFTTVTVETLETQPGEKEPPGPTTD)에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 분자는 서열번호 19(GYTYFTTVTVETLETQPGEKEPPGPTTD)에 제시된 아미노산 서열로 구성된다. 일부 측면에서, 분자는 서열번호 19(GYTYFTTVTVETLETQPGEKEPPGPTTD)에 제시된 아미노산 서열로 필수적으로 구성된다.

일부 측면에서, 본 발명에 유용한 분자는 (i) 서열번호 30에 제시된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드(YSFFTTVTVE) 및 (ii) 폴리펩티드 N-말단에 적어도 하나의 추가 아미노산을 포함한다. 일부 측면에서, 분자는 (i) 서열번호 30(YSFFTTVTVE)에 제시된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 (ii) 폴리펩티드의 C-말단에 적어도 하나의 추가 아미노산을 포함한다. 일부 측면에서, 분자는 (i) 서열번호 30(YSFFTTVTVE)에 제시된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 (ii) N-말단 및 C-말단 모두에 적어도 하나의 추가 아미노산을 포함한다. 일부 측면에서, 본 발명에 유용한 분자는 서열번호 20(NYSFFTTVTVETTEISPEDTTRK)에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 분자는 서열번호 20(NYSFFTTVTVETTEISPEDTTRK)에 제시된 아미노산 서열로 구성된다. 일부 측면에서, 분자는 서열번호 20(NYSFFTTVTVETTEISPEDTTRK)에 제시된 아미노산 서열로 필수적으로 구성된다.

일부 측면에서, 본 발명에 유용한 분자는 (i) 서열번호 31에 제시된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드(FSYFSTVTVE) 및 (ii) 폴리펩티드 N-말단에 적어도 하나의 추가 아미노산을 포함한다. 일부 측면에서, 분자는 (i) 서열번호 31(FSYFSTVTVE)에 제시된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 (ii) 폴리펩티드의 C-말단에 적어도 하나의 추가 아미노산을 포함한다. 일부 측면에서, 분자는 (i) 서열번호 31에 제시된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드(FSYFSTVTVE) 및 (ii) N-말단 및 C-말단 모두에 적어도 하나의 추가 아미노산을 포함한다. 일부 측면에서, 본 발명에 유용한 분자는 서열번호 21(NFSYFSTVTVETMEPSQDERTTR)에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 분자는 서열번호 21(NFSYFSTVTVETMEPSQDERTTR)에 제시된 아미노산 서열로 구성된다. 일부 측면에서, 분자는 서열번호 21(NFSYFSTVTVETMEPSQDERTTR)로 제시된 아미노산 서열로 필수적으로 구성된다.

일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 분자의 폴리펩티드는 서열번호 29(YTYFTTVTVE)에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90% 일치하는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 폴리펩티드는 FAM19A5 단백질에 결합할 수 있고, 상기 아미노산 서열은 N 말단에 하나 이상의 소수성 아미노산을 더 포함한다. 일부 측면에서, 상기 소수성 아미노산은 N-말단에 적어도 2개의 아미노산, 적어도 3개의 아미노산, 적어도 4개의 아미노산, 적어도 5개의 아미노산, 적어도 6개의 아미노산, 적어도 7개의 아미노산, 적어도 8개의 아미노산, 적어도 9개의 아미노산, 적어도 10개의 아미노산, 적어도 15개의 아미노산, 적어도 20개의 아미노산, 적어도 25개의 아미노산, 적어도 30개의 아미노산, 적어도 35개의 아미노산, 적어도 40개의 아미노산, 적어도 45개의 아미노산 또는 적어도 50개의 아미노산을 포함한다.

일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 분자의 폴리펩티드는 서열번호 29(YTYFTTVTVE)에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 폴리펩티드는 FAM19A5 단백질에 결합할 수 있고, 상기 아미노산 서열은 N-말단 및/또는 C-말단에서 하나 이상의 아미노산을 더 포함한다. 일부 측면에서, N-말단 및/또는 C-말단에 연결된 하나 이상의 아미노산은 LRRC4B 단백질로부터 유래된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, N-말단에 연결된 하나 이상의 아미노산은 N-말단에서 적어도 2개의 아미노산, 적어도 3개의 아미노산, 적어도 4개의 아미노산, 적어도 5개의 아미노산, 적어도 6개의 아미노산, 적어도 7개의 아미노산, 적어도 8개의 아미노산, 적어도 10개의 아미노산, 적어도 15개의 아미노산, 적어도 20개의 아미노산, 적어도 25개의 아미노산, 적어도 30개의 아미노산, 적어도 35개의 아미노산, 적어도 40개의 아미노산, 적어도 45개의 아미노산, 또는 적어도 50개의 아미노산을 포함한다. 일부 측면에서, C-말단에 연결된 하나 이상의 아미노산은 C-말단에서 적어도 2개의 아미노산, 적어도 3개의 아미노산, 적어도 4개의 아미노산, 적어도 5개의 아미노산, 적어도 6개의 아미노산, 적어도 7개의 아미노산, 적어도 8개의 아미노산, 적어도 10개의 아미노산, 적어도 15개의 아미노산, 적어도 20개의 아미노산, 적어도 25개의 아미노산, 적어도 30개의 아미노산, 적어도 35개의 아미노산, 적어도 40개의 아미노산, 적어도 45개의 아미노산, 또는 적어도 50개의 아미노산을 포함한다. 일부 측면에서, N-말단 및/또는 C-말단에 연결된 하나 이상의 아미노산은 링커를 통해 연결된다. 일부 측면에서, 상기 링커는 펩티드 링커이다.

일부 측면에서, N-말단 및/또는 C-말단에 추가된 하나 이상의 추가 아미노산은 당업계에 공지된 임의의 적합한 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 하나 이상의 추가 아미노산은 친수성 아미노산이다. 일부 측면에서, 하나 이상의 추가 아미노산은 D-아미노산을 포함할 수 있다. 임의의 하나의 이론에 얽매이지 않고, 일부 측면에서, 폴리펩티드의 N-말단 및/또는 C-말단에 하나 이상의 D-아미노산을 첨가하는 것은 예컨대, 대상체에 투여될 때 분자의 지속성을 향상시킬 수 있다. 예를 들어, D-아미노산의 포함은 대상체의 혈액 내에서 프로테아제 및 펩티다아제 분해로부터 상기 폴리펩티드를 보호할 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 입증된 바와 같이(예컨대, 실시예 10 참조), 일부 측면에서, 본 발명에 유용한 폴리펩티드는 D-아미노산 및 L-아미노산 모두를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드는 N-말단에 D-아미노산을 포함하고 모든 다른 아미노산 잔기에 L-아미노산을 포함한다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드는 C-말단에 D-아미노산을 포함하고 모든 다른 아미노산 잔기에 L-아미노산을 포함한다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드는 N-말단 및 C-말단 모두에 D-아미노산을 포함하고, 모든 다른 아미노산 잔기에 L-아미노산을 포함한다.

추가로, 본 명세서에 기술된 바와 같이, 일부 측면에서, 상술된 분자는 상기 아미노산 서열과 다른(예컨대, 치환된) 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 아미노산을 갖는 서열번호 29(YTYFTTVTVE), 30(YSFFTTVTVE) 및 31(FSYFSTVTVE) 중 어느 하나로 제시된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.

일부 측면에서, 본 발명에 유용한 분자는 폴리펩티드의 N-말단, C-말단, 또는 N-말단과 C-말단 모두에 추가적인 변형을 포함하고, 상기 추가적 변형은 폴리펩티드의 안정성을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 일부 측면에서, 폴리펩티드의 N-말단은 메틸화되어 있다. N-말단 및/또는 C-말단에서 수행될 수 있는 추가적인 변형의 비제한적 예는 Fmoc, PEG화, 아세틸화 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 측면에서, 안정성을 증가시키기 위해 폴리펩티드는 고리화될 수 있다. 당해 분야에 공지된 임의의 적합한 방법을 사용하여 이러한 변형이 가능할 수 있다.

본 발명의 다른 곳에서 또한 기술된 바와 같이, 일부 측면에서, 본 발명에 유용한 분자는 LRRC4족 단백질 멤버의 FAM19A5 결합 도메인 및 추가 모이어티를 포함하며, 이는 상기 분자의 하나 이상의 특성(예컨대, FAM19A5 단백질에 대한 분자의 결합 친화성)을 개선할 수 있다. 본 명세서에서 입증된 바와 같이(예컨대, 실시예 10 참조), 출원인은 LRRC4 단백질 패밀리 멤버의 막곁(juxtra-membrane) 서열의 첨가가 FAM19A5 단백질에 대한 분자의 결합 친화도를 크게 향상시킬 수 있음을 확인하였다. 상기 막곁 서열은 LRRC4 패밀리 멤버 사이에서 고도로 보존되며 서열번호 151(LDEVMKTTK)(LRRC4 및 LRRC4B) 및 서열번호 152(IDEVMKTTK)(LRRC4C)로 제시된다(도22d 참조).

따라서, 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 분자는 LRRC4 단백질의 FAM19A5 결합 도메인(즉, YSFFTTVTVE; 서열번호 30) 및 서열번호 151(LDEVMKTTK)에 제시된 막곁 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 분자는 LRRC4 단백질의 FAM19A5 결합 도메인(즉, YSFFTTVTVE; 서열번호 30) 및 서열번호 152(IDEVMKTTK)에 제시된 막곁 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 분자는 LRRC4B 단백질의 FAM19A5 결합 도메인(즉, YTYFTTVTVE; 서열번호 29) 및 서열번호 151(LDEVMKTTK)에 제시된 막곁 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 분자는 LRRC4 단백질의 FAM19A5 결합 도메인(즉, YTYFTTVTVE; 서열번호 29) 및 서열번호 152(IDEVMKTTK)에 제시된 막곁 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 분자는 LRRC4B 단백질의 FAM19A5 결합 도메인(즉, FSYFSTVTVE; 서열번호 31) 및 서열번호 151(LDEVMKTTK)에 제시된 막곁 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 분자는 LRRC4 단백질의 FAM19A5 결합 도메인(즉, FSYFSTVTVE; 서열번호 31) 및 서열번호 152(IDEVMKTTK)에 제시된 막곁 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 상기 막곁은 분자의 C-말단에 추가된다.

본 발명으로부터 명백한 바와 같이, 분자의 하나 이상의 특성을 개선하기 위한 본 명세서에 기술된 임의의 변형(예컨대, 아미노산 치환, 막곁 서열의 추가, D-아미노산)은 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 측면에서, 본 발명에 유용한 분자(예컨대, 폴리펩티드)는 하기를 포함한다: (i) 잔기 T12 및 L13에서 아미노산 변형을 갖는 서열번호18(GYTYFTTVTVETLETQPGEE)로 제시된 아미노산 서열; 및 (ii) 상기 분자의 C-말단에서 막곁 서열(예컨대, 서열번호 151 또는 서열번호 152). 일부 측면에서, 본 발명에 유용한 분자(예컨대, 폴리펩티드)는 하기를 포함한다:(i) 잔기 T12 및 L13에서 아미노산 변형을 갖는 서열번호 18(GYTYFTTVTVETLETQPGEE)에 제시된 아미노산 서열; (ii) N-말단 및/또는 C-말단의 D-아미노산; 및 (iii) 상기 분자의 C-말단에서 막곁 서열(예컨대, 서열번호 151 또는 서열번호 152). 일부 측면에서, 본 발명에 유용한 분자(예컨대, 폴리펩티드)는 하기를 포함한다:(i) 잔기 T12 및 L13에서 아미노산 변형을 갖는 서열번호 17(GYTYFTTVTVETLETQ)에 제시된 아미노산 서열; 및 (ii) 분자의 C-말단에서 막곁 서열(예컨대, 서열번호 151 또는 서열번호 152). 일부 측면에서, 본 발명에 유용한 분자(예컨대, 폴리펩티드)는 하기를 포함한다: (i) 잔기 T12 및 L13에서 아미노산 변형을 갖는 서열번호 17(GYTYFTTVTVETLETQ)에 제시된 아미노산 서열; (ii) N-말단 및/또는 C-말단의 D-아미노산; 및 (iii) 상기 분자의 C-말단에서 막곁 서열(예컨대, 서열번호 151 또는 서열번호 152). 일부 측면에서, 본 발명에 유용한 분자(예컨대, 폴리펩티드)는 하기를 포함한다: (i) 잔기 T12 및 L13에서 아미노산 변형을 갖는 서열번호 19(GYTYFTTVTVETLETQPGEKEPPGPTTD)에 기재된 아미노산 서열; 및 (ii) 상기 분자의 C-말단에서 막곁 서열(예컨대, 서열번호 151 또는 서열번호 152). 일부 측면에서, 본 발명에 유용한 분자(예컨대, 폴리펩티드)는 하기를 포함한다: (i) 잔기 T12 및 L13에서 아미노산 변형을 갖는 서열번호19(GYTYFTTVTVETLETQPGEKEPPGPTTD)에 기재된 아미노산 서열; (ii) N-말단 및/또는 C-말단의 D-아미노산; 및 (iii) 상기 분자의 C-말단에서 막곁 서열(예컨대, 서열번호 151 또는 서열번호 152). 일부 측면에서, 본 발명에 유용한 분자(예컨대, 폴리펩티드)는 하기를 포함한다: (i) 잔기 T12 및 L13에서 아미노산 변형을 갖는 서열번호 143(GYTYFTTVTVETLETQPGEEA)에 제시된 아미노산 서열; 및 (ii) 상기 분자의 C-말단에서 막곁 서열(예컨대, 서열번호 151 또는 서열번호 152). 일부 측면에서, 본 발명에 유용한 분자(예컨대, 폴리펩티드)는 하기를 포함한다: (i) 잔기 T12 및 L13에서 아미노산 변형을 갖는 서열번호 143(GYTYFTTVTVETLETQPGEEA)에 제시된 아미노산 서열; (ii) N-말단 및/또는 C-말단의 D-아미노산; 및 (iii) 상기 분자의 C-말단에서 막곁 서열(예컨대, 서열번호 151 또는 서열번호 152).

일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 분자(예컨대, LRRC4족 단백질의 멤버의 FAM19A5 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드 포함)는 예컨대, 대상체에게 투여시, 상이한 조직에 특이적으로 표적화되도록 하는 하나 이상의 추가 펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 분자는 분자가 혈액-뇌 장벽(blood-brain barrier)(또한, 본 명세서에서 "BBB 셔틀"이라고도 함)을 가로질러 침투할 수 있게 하는 펩티드를 포함한다. 이러한 BBB 셔틀의 예는 당업계에 공지되어 있다. 비제한적인 예가 표5(아래)에 제공된다(예컨대, Oller-Salvia et al., Chem Soc Rev 45:4690 (2016) 참조).

서열번호	펩티드	서열
32	Angiopep-2	TFFYGGSRGKRNNFKTEEY-OH
33	ApoB (3371-3409)	SSVIDALQYKLEGTTRLTRKRGLKLATALSLSNKFVEGS
34	ApoE (159-167)₂	(LRKLRKRLL)₂
35	Peptide-22	Ac-C(&)MPRLRGC(&)-NH₂
36	THR	THRPμmWSPVWP-NH₂
37	THR retro-enantio	pwvpswmpprht-NH₂
38	CRT	C(&)RTIGPSVC(&)
39	Leptin30	YQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVL
40	RVG29	YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG-OH
41	CDX	GreirtGraerwsekf-OH
42	Apamin	C(&1)NC(&₂)KAPETALC(&₁)-ARRC(&₂)QQH-NH₂
43	MiniAp-4	[Dap](&)KAPETALD(&)
44	서열번호 2의 아미노산 498-576	QPGEEALQPRGTEKEPPGPTTDGVWGGGRPGDAAGPASSSTTAPAPRSSRPTEKAFTVPITDVTENALKDLDDVMKTTK (서열번호 11)
45	G23	HLNILSTLWKYRC
46	g7	GFtGFLS(O-b-Glc)-NH₂
47	TGN	TGNYKALHPHNG
48	TAT (47-57)	YGRKKRRQRRR-NH₂
49	SynB1	RGGRLSYSRRRFSTSTGR
50	Diketopiperazines	&(N-MePhe)-(N-MePhe)Diketopiperazines
51	PhPro	(Phenylproline)4-NH₂

BBB 셔틀

고리형 펩티드(&)에 대한 명명법은 문헌(Spengler et al., J Pept Res 65: 550-555 (2005))에 설명된 3 문자 아미노산 코드에 맞게 조정된다; [Dap]은 디아미노프로피온산을 나타낸다.

일부 측면에서, 본 발명에 유용한 분자는 융합 단백질을 포함한다. 예를 들어, 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 분자는 (i) 본 발명의 임의의 폴리펩티드, 및 (ii) 반감기 연장 모이어티를 포함할 수 있다. 당업계에 공지된 임의의 적합한 반감기 연장 모이어티를 사용하여 본 발명의 융합 단백질을 생성할 수 있다. 이러한 반감기 연장 모이어티의 비제한적 예는 다음을 포함한다: Fc, 알부민, 알부민-결합 폴리펩티드, Pro/Ala/Ser(PAS), 인간융모성고나도트로핀의 β 서브유닛의 C-말단 펩타이드(CTP), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 아미노산의 긴 구조화되지 않은 친수성 서열(XTEN), 히드록시에틸 전분(HES), 알부민-결합 소분자, 또는 이들의 조합.

일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 분자(예컨대, FAM19A5 단백질과 LRRC4 단백질 패밀리 멤버의 상호작용을 억제, 감소 및/또는 해리시킬 수 있는 본 명세서에 기술된 폴리펩티드 중 임의의 것을 포함)는 단백질-약물 결합체(protein-drug conjugate)을 포함한다. 예를 들어, 일부 측면에서, 폴리펩티드는 질병 또는 장애를 치료하는 데 유용한 치료제와 같은 치료제에 결합될 수 있다.

본 명세서에 기술된 단백질-약물 결합체는 당업계에 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 일부 측면에서, 결합 방법은 실질적으로 (또는 거의) 비-면역원성인 연결, 예컨대, 펩티드-(즉, 아미드-), 설파이드-, (입체 장애), 다이설파이드-, 히드라존- 및 에테르 연결을 생성한다. 이들 연결은 거의 비-면역원성이며 혈청 내에서 상당한 안정성을 나타낸다(예컨대, Senter, P.D., Curr. Opin. Chem. Biol. 13 (2009) 235-244; WO 2009/059278; WO 95/17886, 해당 문헌의 전체 내용은 참조로 본 출원에 통합됨).

모이어티 및 폴리펩티드의 생화학적 성질에 따라, 상이한 결합 전략이 사용될 수 있다(예컨대, Hackenberger, C. P. R., and Schwarzer, D., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 47 (2008) 10030-10074 참조). 일부 측면에서, 부위 특이적 반응 및 공유 커플링은 천연 아미노산이 존재하는 다른 작용기의 반응성에 직교하는 반응성을 갖는 아미노산으로 변형시키는 것에 기초한다. 예를 들어, 희귀 서열 맥락 내의 특정 시스테인은 알데히드에서 효소적으로 전환될 수 있다(예컨대, Frese, M.A. 및 Dierks, T., ChemBioChem. 10 (2009) 425-427 참조). 주어진 서열에서 천연 아미노산과 특정 효소의 특정 효소 반응성을 이용함으로써 소정의 아미노산 변형을 얻는 것도 가능하다(예컨대, Taki, M. et al., Prot. Eng. Des. Sel. 17 (2004) 119-126; Gautier, A. et al., Chem. Biol. 15 (2008) 128-136; 및 Protease-catalyzed formation of C-N bond is used by Bordusa, F., Highlights in Bioorganic Chemistry (2004) 389-403 참조).

부위 특이적 반응 및 공유 커플링은 또한 말단 아미노산과 적절한 변형 시약의 선택적 반응에 의해 이루어질 수 있다. N-말단 시스테인과 벤조니트릴의 반응성은 부위-특이적 공유 결합을 이루기 위해 사용될 수 있다(예컨대, Ren, H. et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 48 (2009) 9658-9662 참조). 천연 화학적 결찰은 또한 C-말단 시스테인 잔기에 의존할 수 있다(예컨대, Taylor, E. Vogel; Imperiali, B, Nucleic Acids and Molecular Biology (2009), 22 (Protein Engineering), 65-96 참조).

모이어티는 또한 합성 펩티드 또는 펩티드 모방체일 수 있다. 그러한 경우에, 폴리펩티드는 화학적으로 합성될 수 있고, 직교 화학 반응성을 갖는 아미노산은 그러한 합성 동안 통합될 수 있다(예컨대, de Graaf, A. J. et al., Bioconjug. Chem. 20 (2009) 1281-1295 참조). 단일 표지된 폴리펩타이드를 얻기 위해, 1:1 화학량론을 갖는 결합체는 다른 결합 부산물로부터 크로마토그래피에 의해 분리될 수 있다. 이 절차는 염료 표지된 결합 쌍 멤버와 하전된 링커를 사용하여 촉진될 수 있다. 이러한 종류의 표지되고 고도로 음전하를 띠는 결합 쌍 멤버를 사용함으로써 단일 결합 폴리펩티드는 표지되지 않은 폴리펩티드 및 하나 이상의 링커를 갖는 폴리펩티드로부터 쉽게 분리되는데, 이는 전하 및 분자량의 차이가 분리에 사용될 수 있기 때문이다. 형광 염료는 표지된 1가 결합제와 같이 결합되지 않은 구성 요소로부터 복합체를 정제하는 데 유용할 수 있다.

IV. 약제학적 조성물

본 발명은 또한 생리학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정제(Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA)에서 소정의 순도를 갖는 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(예컨대, LRRC4 단백질 패밀리 멤버의 FAM19A5 결합 도메인을 포함함) (또는 본 명세서에 기재된 분자, 핵산, 벡터, 세포, 단백질 결합체)를 포함하는 조성물을 제공한다. 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정제는 사용된 용량 및 농도에서 수용자에게 무독성이며 인산염, 구연산염 및 기타 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 방부제(옥타데실디메틸벤질암모늄클로라이드; 헥사메토늄클로라이드; 벤잘코늄클로라이드, 벤제토늄클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질알코올; 메틸 또는 프로필파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올 및 m-크레졸 등); 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 고분자; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 포도당, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 수크로즈, 만니톨, 트레할로즈 또는 소르비톨과 같은 당류; 나트륨과 같은 염 형성 반대 이온; 금속복합체(예컨대, Zn-단백질 복합체); 및/또는 TWEEN　, PLURONICS　 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비이온성 계면활성제를 포함한다.

일부 측면에서, 본 발명에 유용한 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체에서 본 명세서에 기술된 임의의 폴리펩티드, 분자, 핵산, 벡터, 세포, 단백질 결합체, 및 선택적으로 하나 이상의 추가 예방제 또는 치료제를 포함한다. 일부 측면에서, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체에 본 명세서에 기술된 임의의 폴리펩티드, 분자, 핵산, 벡터, 세포, 단백질 결합체, 및 선택적으로 치료제의 하나 이상의 추가 예방제를 포함한다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드, 분자, 핵산, 벡터, 세포, 단백질 결합체는 약제학적 조성물에 포함된 유일한 활성 성분이다. 본 명세서에 기술된 약제학적 조성물은 FAM19A5 단백질과 LRRC4 단백질 패밀리 멤버의 상호작용을 억제, 감소 및/또는 해리하는데 유용할 수 있다. 본 발명의 다른 곳에 기재된 바와 같이, FAM19A5 단백질 및 LRRC4 단백질 패밀리 멤버의 상호작용을 억제, 감소 및/또는 해리시키는 것은 신경 회로 형성을 개선할 수 있다(예컨대, 신경돌기 성장 및 시냅스 형성을 촉진함으로써).

비경구 제제에 사용되는 약제학적으로 허용가능한 담체는 수성 비히클(aqueous vehicles), 비수성 비히클(nonaqueous vehicles), 항미생물제(antimicrobial agents), 등장제(isotonic agents), 완충제(buffers), 항산화제(antioxidants), 국소 마취제(local anesthetics), 현탁제 및 분산제(suspending and dispersing agents), 유화제(emulsifying agents), 봉쇄제(sequestering) 또는 킬레이트제(chelating agents) 및 기타 약제학적으로 허용가능한 물질을 포함한다. 수성 비히클의 예는 염화나트륨 주사액, 링거 주사액, 등장 포도당 주사액, 살균수 주사액, 덱스트로스 및 젖산 링거 주사액을 포함한다. 비수성 비경구 비히클은 식물성 고정유, 면실유, 옥수수유, 참기름 및 땅콩유를 포함한다. 정균(bacteriostatic) 또는 정진균(fungistatic) 농도의 항미생물제는 페놀 또는 크레졸, 수은, 벤질알코올, 클로로부탄올, 메틸 및 프로필 p-히드록시벤조산 에스테르, 티메로살, 염화벤잘코늄 및 염화벤제토늄을 포함하는 다중 용량 용기에 포장된 비경구 제제에 첨가될 수 있다. 등장제는 염화나트륨 및 덱스트로스를 포함한다. 완충액에는 인산염과 구연산염이 포함된다. 항산화제에는 중황산나트륨이 포함된다. 국소 마취제는 프로카인 염산염을 포함한다. 현탁제 및 분산제는 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스 및 폴리비닐피롤리돈을 포함한다. 유화제는 폴리소르베이트 80(TWEEN　 80)을 포함한다. 금속 이온의 격리제 또는 킬레이트제는 EDTA를 포함한다. 약제학적 담체는 또한 수혼화성 비히클용 에틸알코올, 폴리에틸렌글리콜 및 프로필렌글리콜; 및 pH 조정을 위한 수산화나트륨(sodium hydroxide), 염산(hydrochloric acid), 구연산(citric acid) 또는 젖산(lactic acid) 을 포함한다.

약제학적 조성물은 대상체에 대한 임의의 투여 경로를 위해 제형화될 수 있다. 투여 경로의 구체적인 예는 비강내(intranasal), 경구(oral), 비경구(parentally), 척수강내(intrathecally), 뇌실내(intra-cerebroventricularly), 폐(pulmonarily), 피하(subcutaneously) 또는 뇌실내(intraventricularly)를 포함한다. 피하, 근육내 또는 정맥내 주사를 특징으로 하는 비경구 투여도 본 명세서에서 고려된다. 주사제는 액체 용액 또는 현탁액, 주사 전에 액체에 용해 또는 현탁액에 적합한 고체 형태 또는 에멀젼과 같은 통상적인 형태로 제조될 수 있다. 주사제, 용액 및 에멀젼은 또한 하나 이상의 부형제를 포함한다. 적합한 부형제는 예를 들어 물, 염수, 덱스트로스, 글리세롤 또는 에탄올이다. 또한, 원하는 경우, 투여될 약제학적 조성물은 또한 습윤제 또는 유화제, pH 완충제, 안정제, 용해도 향상제, 및 나트륨아세테이트, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민올레에이트 및 사이클로덱스트린과 같은 기타 제제와 같은 무독성 보조 물질을 소량 함유할 수 있다.

본 명세서에 기술된 폴리펩티드의 비경구 투여를 위한 제제는 주사용 멸균 용액, 동결건조 분말과 같은 멸균 건조 가용성 제품, 피하 정제를 포함하여 사용 직전에 용매와 조합할 준비가 된 멸균 건조 현탁액, 주사용 멸균 현탁액, 사용 직전에 비히클과 결합할 준비가 된 멸균 건조 불용성 제품 및 멸균 유제을 포함한다. 용액은 수성 또는 비수성일 수 있다.

정맥내 투여시, 적합한 담체는 생리 식염수 또는 인산염 완충 식염수(PBS), 및 글루코스, 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜 및 이들의 혼합물과 같은 증점제 및 가용화제를 함유하는 용액을 포함한다.

본 명세서에 기술된 폴리펩티드를 포함하는 국소 혼합물은 국소 및 전신 투여에 대해 기술된 바와 같이 제조된다. 생성된 혼합물은 용액, 현탁액, 에멀젼 등일 수 있고, 크림, 겔, 연고, 에멀젼, 용액, 엘릭시르(elixirs), 로션, 현탁액, 팅크제(tinctures), 페이스트, 폼, 에어로졸, 이러게이션(irrigations), 스프레이, 좌제(suppositories), 붕대, 피부 패치 또는 국소 투여에 적합한 기타 제형으로 제형화될 수 있다.

약제학적 조성물(예컨대, 본 명세서에 기술된 임의의 폴리펩티드, 분자, 핵산, 벡터, 세포 또는 단백질-결합체를 포함함)은 흡입과 같은 국소 적용을 위한 에어로졸로 제형화될 수 있다(예컨대, 미국 특허 번호 4,044,126, 4,414,209 및 4,364,923 참조). 호흡기관에 투여하기 위한 이러한 제제는 분무기용 에어로졸 또는 용액 형태, 또는 흡입용 미세 분말 형태일 수 있으며, 단독으로 또는 락토스와 같은 불활성 담체와 조합될 수 있다. 그러한 경우에, 제제의 입자는 일부 측면에서 약 50 미크론 미만, 예컨대, 약 10 미크론 미만의 직경을 가질 수 있다.

약제학적 조성물(예컨대, 본 명세서에 기술된 임의의 폴리펩티드, 분자, 핵산, 벡터, 세포 또는 단백질-결합체를 포함함)은 국소 또는 국소 적용, 예컨대 피부 및 점액에 대한 국소 적용을 위해 겔, 크림 및 로션 형태로 눈에 적용하기 위한 또는 수조내 또는 척수내 적용을 위에 제형화될 수 있다. 국소 투여는 경피 전달 및/또한 눈 또는 점막에 대한 투여 또는 흡입 요법을 위해 고려된다. 단독으로 또는 다른 약제학적으로 허용가능한 부형제와 함께 항체의 비강 용액이 또한 투여될 수 있다.

이온영동(iontophoretic) 및 전기영동(electrophoretic) 장치를 포함하는 경피 패치는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 본 명세서에 기술된 임의의 폴리펩티드, 분자, 핵산, 벡터, 세포 또는 단백질-결합체를 투여하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 이러한 패치는 미국 특허 번호 6,267,983, 6,261,595, 6,256,533, 6,167,301, 6,024,975, 6,010715, 5,985,317, 5,983,134, 5,948,433 및 5,860,957에 개시되어 있다.

일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 약제학적 조성물은 용액, 에멀젼 및 기타 혼합물로서 투여를 위해 재구성될 수 있는 동결건조된 분말이다. 또한, 고체 또는 젤로 재구성 및 제형화될 수 있다. 동결건조 분말은 본 명세서에 기술된 임의의 폴리펩티드, 분자, 핵산, 벡터, 세포 또는 단백질-결합체 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 유도체를 적합한 용매에 용해시켜 제조한다. 일부 측면에서, 동결건조된 분말은 멸균 상태이다. 용매는 안정성을 향상시키는 부형제 또는 분말로부터 제조된 분말 또는 재구성 용액의 다른 약리학적 성분을 함유할 수 있다. 사용될 수 있는 부형제는 덱스트로스, 소르비톨, 과당, 옥수수 시럽, 자일리톨, 글리세린, 글루코스, 수크로스 또는 기타 적합한 제제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 용매는 또한 구연산염, 인산나트륨 또는 인산칼륨과 같은 완충제 또는 당업자에게 공지된 다른 완충제를 함유할 수 있다. 일부 측면에서, 완충액은 대략 중성 pH이다. 해당 분야의 기술자에게 공지된 표준 조건 하에서 동결건조에 이은 용액의 후속 멸균 여과는 원하는 제제를 제공한다. 일부 측면에서, 생성된 용액은 동결건조를 위해 바이알에 분류될 수 있다. 각각의 바이알은 단일 투여량 또는 다중 투여량의 화합물(예컨대, 폴리펩티드, 분자, 핵산, 벡터, 세포 또는 단백질 결합체 중 임의의 것)을 함유할 수 있다. 동결건조 분말은 약 4℃ 내지 실온과 같은 적절한 조건 하에 보관될 수 있다.

이 동결건조 분말을 주사용수로 재구성하면 비경구 투여용 제형이 제공된다. 재구성을 위해 동결건조된 분말을 멸균수 또는 기타 적합한 담체에 첨가한다. 정확한 양은 선택한 화합물에 따라 다르다. 그러한 양은 경험적으로 측정될 수 있다.

일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 임의의 폴리펩티드, 분자, 핵산, 벡터, 세포 또는 단백질-결합체를 포함하는 약제학적 조성물은 또한 대상체의 특정 조직, 수용체, 또는 몸의 다른 영역을 표적으로 하도록 제제화될 수 있다(예컨대, 미국 특허 Nos. 6,316,652, 6,274,552, 6,271,359, 6,253,872, 6,139,865, 6,131,570, 6,120,751, 6,071,495, 6,060,082, 6,048,736, 6,039,975, 6,004,534, 5,985,307, 5,972,366, 5,900,252, 5,840,674, 5,759,542, 및 5,709,874을 참조).

생체내 투여에 사용되는 조성물은 멸균될 수 있다. 일부 측면에서, 이는 예컨대, 멸균 여과막을 통하는 여과에 의해 달성될 수 있다.

V. 핵산, 벡터, 숙주 세포

본 명세서에 기술된 추가 측면은 본 명세서에 기술된 폴리펩티드 또는 분자, 예컨대, 융합 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자(본 명세서에서 "핵산" 또는 그의 유도체로도 지칭됨)에 관한 것이다. 핵산은 전체 세포, 세포 용해물 또는 부분적으로 정제된 형태 또는 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수 있다. 일부 측면에서, 핵산은 DNA 서열 및/또는 RNA 서열(예컨대, mRNA)이다. 일부 측면에서, 핵산은 변형된 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 핵산은 다른 세포 성분 또는 다른 오염물질, 예컨대, 다른 세포 핵산(예컨대, 다른 염색체 DNA, 자연적으로 분리된 DNA에 연결된 염색체 DNA) 또는 단백질로부터 정제시 알카라인/SDS 처리, CsCl 밴딩, 컬럼 크로마토그래피, 제한 효소, 아가로스 겔 전기영동 및 당업계에 잘 알려진 기타를 포함하는 표준 기술에 의해 "분리된" 또는 "실질적으로 순수한" 핵산이다(F. Ausubel, et al. , ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York 참조). 일부 측면에서, 핵산 분자는 인트론 서열을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 일부 측면에서, 상기 핵산은 cDNA 분자이다. 본 명세서에 기술된 핵산은 공지의 표준 분자생물학 기술을 사용하여 얻어질 수 있다.

일부 측면에서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 폴리펩티드 또는 분자, 예컨대, 융합 단백질을 인코딩하는 분리된 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다. 본 발명의 적당한 벡터는 발현 벡터, 바이러스 벡터 및 플라스미드 벡터를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 측면에서, 상기 벡터는 바이러스 벡터이다.

본 명세서에서 사용된 용어 "발현 벡터"는 적당한 숙주세포에 도입될때, 삽입된 코딩 서열의 전사 및 번역에 필요한 요소 또는 RNA 바이러스 벡터의 경우 복제 및 번역에 필요한 요소를 포함하는 모든 핵산 구조를 의미한다. 발현 벡터는 플라스미드, 파지미드, 바이러스 및 이들의 유도체를 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 "바이러스 벡터"는 하기 바이러스로부터의 핵산 서열을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 레트로바이러스, 예컨대, 멀로니 쥐 백혈병 바이러스(Moloney murine leukemia virus), 하베이 쥐 육종 바이러스(Harvey murine sarcoma virus), 쥐 유방 종양 바이러스(murine mammary tumor virus) 및 라우스 사코마 바이러스(Rous sarcoma virus); 렌티바이러스(lentivirus); 아데노바이러스; 아데노 관련 바이러스; SV40형 바이러스; 폴리오마바이러스(polyomaviruses); 엡스타인-바 바이러스(Epstein-Barr viruses); 유두종 바이러스(papilloma viruses); 헤르페스 바이러스(herpes virus); 백시니아 바이러스(vaccinia virus); 폴리오 바이러스(polio virus); 및 레트로바이러스와 같은 RNA 바이러스. 특정 바이러스 벡터는 비필수 유전자가 관심 유전자로 대체된 비세포 변성 진핵 바이러스를 기반으로 한다. 비-세포 변성 바이러스는 레트로바이러스를 포함하며, 이의 수명 주기는 게놈 바이러스 RNA의 DNA로의 역전사를 포함하고 후속하는 숙주 세포 DNA로의 프로바이러스 통합을 포함한다.

일부 측면에서, 벡터는 아데노 관련 바이러스로부터 유래된다. 일부 측면에서, 벡터는 렌티바이러스로부터 유래된다. 렌티바이러스 벡터의 예는 WO9931251, W09712622, W09817815, W09817816 및 WO9818934에 개시되어 있으며, 해당 출원 명세서의 전체 내용은 본 명세서에 참조로 통합된다.

다른 벡터는 플라스미드 벡터를 포함한다(예를 들어, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989를 참조). 지난 몇 년 동안, 플라스미드 벡터는 숙주 게놈 내에서 복제하고 통합할 수 없기 때문에 생체 내 세포에 유전자를 전달하는 데 특히 유리한 것으로 밝혀졌다. 그러나, 숙주 세포와 호환되는 프로모터를 갖는 이들 플라스미드는 플라스미드 내에서 작동가능하게 암호화된 유전자로부터 펩티드를 발현할 수 있다. 시판되는 일반적으로 사용되는 일부 플라스미드에는 pBR322, pUC18, pUC19, 다양한 pcDNA 플라스미드, pRC/CMV, 다양한 pCMV 플라스미드, pSV40 및 pBlueScript가 포함된다. 특정 플라스미드의 추가 예는 pcDNA3.1, 카탈로그 번호 V79020; pcDNA3.1/hygro, 카탈로그 번호 V87020; pcDNA4/myc-His, 카탈로그 번호 V86320; 및 pBudCE4.1, 카탈로그 번호 V53220로 모두 Invitrogen(Carlsbad, CA.) 제품이다. 또한, 플라스미드는 DNA의 특정 단편을 제거 및/또는 추가하기 위해 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 맞춤 설계될 수 있다.

본 명세서에 기술된 폴리펩티드 또는 분자, 예를 들어 융합 단백질을 제조하는 방법이 또한 본 발명에 포함된다. 일부 측면에서, 이러한 방법은 본 명세서에 기술된 폴리펩티드 또는 분자를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 세포에서 폴리펩티드 또는 분자, 예를 들어 융합 단백질을 발현시키는 단계를 포함할 수 있다. 이들 뉴클레오티드 서열을 포함하는 숙주 세포는 본 명세서에 포함된다. 사용될 수 있는 숙주 세포의 비제한적 예는 불멸 하이브리도마 세포(immortal hybridoma cell), NS/0 골수종 세포(NS/0 myeloma cell), 293 세포, 차이니즈 햄스터 난소(Chinese hamster ovary, CHO) 세포, HeLa 세포, 인간 양수 유래 세포(human amniotic fluid-derived cell)(CapT 세포), COS 세포, 또는 이들의 조합을 포함한다.

VI. 키트

본 발명은 또한, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드, 분자, 핵산, 벡터, 세포, 단백질 결합체 또는 조성물 중 하나 이상을 포함하는 키트를 제공한다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 약제학적 조성물의 성분 중 하나 이상, 예컨대 본 명세서에 제공된 하나 이상의 폴리펩티드, 선택적 사용 지침으로 채워진 하나 이상의 용기를 포함하는 제약 팩 또는 키트가 본 명세서에 제공된다. 일부 측면에서, 키트는 본 명세서에 기술된 약제학적 조성물 및 본 명세서에 기술된 것과 같은 임의의 예방제 또는 치료제를 함유한다.

VII. 발명의 방법

본 명세서에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 폴리펩티드, 분자, 핵산, 벡터, 세포, 단백질 결합체 또는 조성물은 FAM19A5 단백질과 LRRC4 단백질 패밀리의 멤버 사이의 상호작용을 억제, 감소 및/또는 해리하는데 유용하다. 따라서, 일부 측면에서, 이를 필요로 하는 대상체에서 FAM19A5 단백질과 LRRC4 단백질 패밀리 멤버 사이의 복합체 형성을 억제, 감소 및/또는 해리하는 방법은 대상체에게 본 명세서에 기술된 임의의 폴리펩티드, 분자, 핵산, 벡터, 세포, 단백질 결합체 또는 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 측면에서, 투여 후, 복합체의 형성은 대조군(예컨대, 투여 전 대상체의 해당 값 또는 투여를 받지 않은 해당 대상체의 값)과 비교하여 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 적어도 약 100% 감소된다.

본 발명의 다른 곳에 기술된 바와 같이, FAM19A5 단백질과 LRRC4 단백질 패밀리 멤버의 결합은 LRRC4 단백질 패밀리 멤버의 활성을 억제할 수 있다. 예를 들어, 일부 측면에서 FAM19A5-LRRC4 패밀리 단백질 복합체의 형성은 손상된 신경 회로 형성으로 이어질 수 있으며, 그 결과 시냅스의 동적 이득 및 손실의 불균형을 초래하며, 이는 중추 및 말초 신경계의 뉴런의 건강한 기능에 기본적이다.

따라서, 일부 측면에서, FAM19A5 단백질과 LRRC4 단백질 패밀리 멤버 간의 복합체 형성의 감소는 LRRC4 단백질 패밀리 멤버의 활성을 증가시킬 수 있다. 일부 측면에서, 투여 후, LRRC4 단백질 패밀리 멤버의 활성은 대조군(예컨대, 투여 전 대상체의 상응하는 값 또는 투여를 받지 않은 상응하는 대상체의 값)과 비교하여, 적어도 약 0.5배, 적어도 약 1배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 30배, 적어도 약 35배, 적어도 약 40배, 적어도 약 45배 또는 적어도 약 50배 증가시킨다. 그러한 활성의 비제한적 예는 신경돌기 성장, 신경세포 이동 및 시냅스 접촉의 형성 및 기능적 조립을 포함할 수 있다.

본 발명으로부터 명백한 바와 같이, 일부 측면에서, 본 발명은 뉴런을 본 명세서에 기술된 임의의 폴리펩티드, 분자, 핵산, 벡터, 세포, 단백질 결합체, 또는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는 뉴런에서 신경돌기 성장 및/또는 시냅스 형성을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 일부 측면에서, 상기 접촉은 (예컨대, 이를 필요로 하는 대상체에서) 생체내에서 일어난다. 그러한 측면에서, 상기 방법은 접촉 전에 대상체에게 임의의 폴리펩티드, 분자, 핵산, 벡터, 세포, 단백질 결합체 또는 조성물을 투여하는 단계를 더 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 상기 접촉은 생체외에서 발생한다. 일부 측면에서, 상기 접촉은 뉴런에서 신경돌기 성장을 대조군(예컨대, 본 명세서에 기술된 임의의 폴리펩티드, 분자, 핵산, 벡터, 세포, 단백질 결합체 또는 조성물과 접촉하지 않은 해당하는 뉴런에서의 신경돌기 성장)과 비교하여, 적어도 약 0.5배, 적어도 약 1배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 20배, 적어도 약 30배, 적어도 약 40배 또는 적어도 약 50배 증가시킨다. 일부 측면에서, 상기 접촉은 뉴런에서 시냅스 형성을 대조군(예컨대, 본 명세서에 기술된 임의이 폴리펩티드, 분자, 핵산, 벡터, 세포, 단백질 결합체, 또는 조성물 중 어느 것과도 접촉하지 않은 상응하는 뉴런에서 시냅스 형성)과 비교하여, 적어도 약 0.5배, 적어도 약 1배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 20배, 적어도 약 30배, 적어도 약 40배 또는 적어도 약 50배 증가시킨다.

일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드, 분자, 핵산, 벡터, 세포, 단백질 결합체 또는 조성물의 임의의 치료 효과(예컨대, FAM19A5 단백질과 LRRC4 단백질 패밀리 간의 복합체 형성 감소, 신경 돌기 성장 및/또는 시냅스 형성 증가)는 손상된 신경 회로 형성과 관련된 것과 같은 질병 또는 병태의 하나 이상의 증상을 감소시킬 수 있다.

따라서, 일부 측면에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 대상체에게 본 명세서에서 기술된 임의의 폴리펩티드, 분자, 핵산, 벡터, 세포, 단백질, 결합체 또는 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 질병 또는 상태는 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis, ALS), 알츠하이머병, 녹내장, 당뇨병성 망막병증, 신경병성 통증, 척수 손상, 외상성 뇌 손상, 뇌졸중, 파킨슨병, 또는 이들의 조합으로부터 선택된다. 하기에 추가로 기재된 바와 같이, 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 임의의 폴리펩티드, 분자, 핵산, 벡터, 세포, 단백질 결합체 또는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 근위축성 측삭 경화증(ALS)의 치료 방법이 본 명세서에 제공된다. 일부 측면에서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 임의의 폴리펩티드, 분자, 핵산, 벡터, 세포, 단백질 결합체 또는 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 알츠하이머병을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 임의의 폴리펩티드, 분자, 핵산, 벡터, 세포, 단백질 결합체 또는 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 녹내장을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 본 발명은 대상체에게 본 명세서에 기술된 임의의 폴리펩티드, 분자, 핵산, 벡터, 세포, 단백질 결합체 또는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 당뇨병성 망막병증을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 임의의 폴리펩티드, 분자, 핵산, 벡터, 세포, 단백질 결합체 또는 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 신경병성 통증을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 본 발명은 대상체에게 본 명세서에 기술된 임의의 폴리펩티드, 분자, 핵산, 벡터, 세포, 단백질 결합체 또는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 척수 손상을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 임의의 폴리펩티드, 분자, 핵산, 벡터, 세포, 단백질 결합체 또는 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 외상성 뇌 손상을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 본 발명은 대상체에게 본 명세서에 기술된 임의의 폴리펩티드, 분자, 핵산, 벡터, 세포, 단백질 결합체 또는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 뇌졸중 치료 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 임의의 폴리펩티드, 분자, 핵산, 벡터, 세포, 단백질 결합체 또는 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 파킨슨병을 치료하는 방법을 제공한다.

따라서, 본 발명의 일부 측면은 이를 필요로 하는 대상체에서 ALS를 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 본 명세서에 기술된 임의의 폴리펩티드, 핵산, 벡터, 세포, 단백질 결합체 또는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 측면에서, 본 발명으로 치료될 수 있는 ALS는 산발성(sporadic) ALS, 가족성 ALS 또는 둘 모두를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "산발성" ALS는 ALS 발생이 어떠한 가족력과도 관련되지 않은 ALS를 의미한다. ALS 진단의 약 90% 이상은 산발성 ALS에 대한 것이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "가족성" ALS는 가족 내에서 1회 이상 발생하는 ALS를 의미하며, 이는 질병에 대한 유전적 요소를 암시한다. 일부 측면에서, 본 발명으로 치료될 수 있는 ALS는 원발성 측삭 경화증(PLS)을 포함한다. PLS는 팔과 다리의 상부 운동 뉴런에 영향을 줄 수 있다. 그러나 명백한 PLS를 갖는 사람의 75% 이상이 증상이 시작된지 4년 이내에 하부 운동 신경 징후가 나타나기 때문에 그때까지는 PLS를 확실하게 진단할 수 없다. PLS는 진행 속도가 느리고 기능 저하가 적고 호흡 능력에 영향을 미치지 않으며 심각한 체중 감소를 일으키지 않기 때문에 고전적인 ALS보다 예후가 좋다. 일부 측면에서 ALS는 진행성 근육 위축(progressive muscular atrophy, PMA)을 포함한다. PMA는 팔과 다리의 하부 운동 뉴런에 영향을 줄 수 있다. PMA는 전형적인 ALS보다 평균적으로 더 긴 생존과 관련이 있지만, 시간이 지남에 따라 여전히 다른 척수 영역으로 진행되어 결국 호흡 부전 및 사망으로 이어진다. 상위 운동 뉴런 징후는 PMA 과정 후반에 발생할 수 있으며, 이 경우 진단은 고전적인 ALS로 변경될 수 있다.

일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 임의의 치료제(예컨대, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드, 분자, 핵산, 벡터, 세포, 단백질 결합체, 또는 조성물)의 투여는 ALS와 관련된 하나 이상의 증상을 개선할 수 있다. 이러한 증상의 비제한적인 예는 다음과 같다: 걷기 또는 정상적인 일상 활동 수행의 어려움; 걸려 넘어짐; 사지의 약점; 분명하지 않은 말투; 삼키는 데 어려움; 근육 경련 및 경련; 부적절한 울음, 웃음 또는 하품; 치매(dementia); 인지 및 행동 변화; 및 이들의 조합.

본 발명에서 입증된 바와 같이(예컨대, 실시예 11 참조), 일부 측면에서, 본 발명은 상기 폴리펩티드, 분자, 핵산, 벡터, 세포, 단백질 결합체, 또는 조성물 중 임의의 것을 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 알츠하이머병을 치료하는 방법을 제공한다. 어느 하나의 이론에 얽매이지 않고, 일부 측면에서, 알츠하이머병을 치료하는 것은 대상(예컨대, 알츠하이머병을 앓는)에서 아밀로이드 베타(Aβ) 플라크 부하를 감소시키는 것을 포함한다. 본 명세서에 기술된 "아밀로이드 베타 플라크"는 소수의 아밀로이드 베타 펩티드의 큰 응집체 및 작은 군집들을 포함하는 아밀로이드 베타의 비정상적인 침착의 모든 형태를 말하며, 아밀로이드 베타 펩티드의 임의의 변형을 함유할 수 있다. 아밀로이드 베타(Aβ) 플라크는 예컨대, 시냅스 구성, 시냅스 모양, 시냅스 밀도, 시냅스 전도성 손실, 수상돌기 직경 변화, 수상돌기 길이 변화, 척추 밀도 변화, 척추 면적 변화, 척추 길이의 변화 또는 척추 머리 직경의 변화 같은 신경 변화를 일으키는 것으로 알려져 있다. 일부 측면에서, Aβ 플라크 부하의 증가는 뉴런에서 시냅스 손실을 야기할 수 있다. 따라서, 일부 측면에서, 뉴런을 본 명세서에 기술된 임의의 폴리펩티드, 분자, 핵산, 벡터, 세포, 단백질 결합체 또는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 뉴런에서 시냅스 손실을 감소시키는 방법이 본 발명에 제공된다. 일부 측면에서, 상기 접촉은 생체내에서 일어날 수 있다. 일부 측면에서, 상기 접촉은 생체외에서 일어날 수 있다.

또한, 본 발명에서 입증된 바와 같이(예컨대, 실시예 13 참조), 일부 측면에서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 임의의 폴리펩티드, 분자, 핵산, 벡터, 세포, 단백질 결합체, 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 파킨슨병을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명에서 사용되는 용어 "파킨슨병"(Parkinson's disease, PD)은 운동 및 비운동 징후(즉, 증상)를 유발하고 흑색선조체(nigrostriatal) 시스템에서 도파민성 뉴런의 광범위한 퇴행을 특징으로 하는 신경퇴행성 장애를 의미한다. PD의 운동 및 비운동 징후의 비제한적 예는 본 명세서의 다른 곳에서 제공된다. 단백질병(Proteinopathy)(α-synuclein 비정상적인 응집)은 PD의 특징이다. PD의 다른 예시적인 특징은 도파민성 뉴런 손상, 미토콘드리아 기능장애, 신경염증, 단백질 항상성(예컨대, 손상된 단백질의 자가포식 제거 및 소기관 신경아교세포 기능장애), 및 이들의 조합을 포함한다.

본 명세서에 입증된 바와 같이(예컨대, 실시예 14 참조), 일부 측면에서 본 발명에 제공된 치료제(예컨대, 본 명세서에 기재된 임의의 폴리펩티드, 분자, 핵산, 벡터, 세포, 단백질 결합체 또는 조성물)는 이를 필요로 하는 대상체에서 외부 자극(예: 기계적 및/또는 열적 자극)에 대한 역치 또는 잠복기를 증가시키는 데 유용하다. 따라서, 일부 측면에서, 투여 후, 대상체는 대조군(예컨대, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드를 받지 않은 상응하는 대상체)과 비교하여 외부 자극에 대해 더 높은 역치를 갖는다. 본 발명에서 사용되는 용어 "외부 자극에 대한 역치"는 대상체가 자극에 (예컨대, 멀어짐으로써) 반응하기 전에 (외부 자극으로부터의) 압력의 양을 의미한다.

당업자에게 명백한 바와 같이, 이러한 치료 효과는 신경병성 통증과 관련된 하나 이상의 증상을 치료하는데 유용할 수 있다. 따라서, 일부 측면에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상체에서 신경병성 통증을 치료, 예방, 또는 개선하는 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은 본 발명의 폴리펩티드, 분자, 핵산, 벡터, 세포, 단백질 결합체, 또는 조성물 중 어느 하나를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.

일부 측면에서, 신경병성 통증은 중추 신경병성 통증, 즉 중추 체감각 신경계(central somatosensory nervous system)를 포함하는 CNS의 임의의 수준(예컨대, 뇌 손상 및 척수 손상)에 영향을 미치는 상해 또는 손상으로 인한 통증, 또는 뇌졸중(stoke), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 또는 측방 골수 경색(lateral medullary infarction)과 같은 질병이나 장애와 관련되거나 그 결과로 발생한다. 일부 측면에서, 신경병성 통증은 말초 신경병성 통증, 임의의 수준의 말초 신경계에 영향을 미치는 손상 또는 손상(예컨대, 운동 신경, 감각 신경, 자율 신경 또는 이들의 조합의 손상)으로 인한 통증, 또는 질병이나 장애로 인해 발생하거나 이와 관련된 것이다.

일부 측면에서, 본 발명에 제공된 치료제(예컨대, 본 발명에 기재된 임의의 폴리펩티드, 분자, 핵산, 벡터, 세포, 단백질 결합체 또는 조성물)는 망막병증(retinopathies)을 치료하는데 유용할 수 있다. 일부 측면에서, 본 발명으로 치료될 수 있는 망막병증은 당뇨병성 망막병증을 포함한다. "당뇨병성 망막병증(diabetic retinopathy)"은 비증식성 당뇨병성 망막병증(non-proliferative diabetic retinopathy, NPDR), 증식성 당뇨병성 망막병증(proliferative diabetic retinopathy, PDR), 당뇨병성 황반병증(diabetic maculopathy) 및 당뇨병성 황반 부종(diabetic macular edema)을 포함하나 이에 제한되지 않는 모든 유형의 당뇨병성 망막병증을 포함한다. 임의의 하나의 이론에 얽매이지 않고, 일부 측면에서 망막병증(예컨대, 당뇨병성 망막병증)을 치료하는 것은 이를 필요로 하는 대상체에서 망막 전위를 개선하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 개선된 망막 전위(retinal potential)는 대조군(예컨대, 본원에 기재된 폴리펩티드로 치료되지 않은 상응하는 대상체)과 비교하여 A-파, B-파 및/또는 진동 전위에 대한 값의 증가를 포함한다. 망막병증을 치료하는 것이 황반 변성 및 녹내장(glaucoma)을 포함하나 이에 제한되지 않는 다른 유형의 눈 장애를 치료하는데 유용할 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다.

일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 방법(예컨대, 신경돌기 성장 증가)은 추가 치료제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 추가적인 치료제는 임의의 상술된 적응증과 관련된 하나 이상의 증상을 치료 및/또는 완화하기 위한 임의의 공지된 제제를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 추가적인 치료제는 아세틸콜린에스테라제 억제제를 포함한다. 일부 측면에서, 추가적인 치료제는 도파민 작용제(dopamine agonist)를 포함한다. 일부 측면에서, 추가 치료제는 도파민 수용체 길항제(dopamine receptor antagonist)를 포함한다. 일부 측면에서, 추가적인 치료제는 항정신병제(antipsychotic)를 포함한다. 일부 측면에서, 추가적인 치료제는 모노아민 옥시다제(monoamine oxidase, MAO) 억제제를 포함한다. 일부 측면에서, 추가적인 치료제는 카테콜 O-메틸트랜스퍼라제(catechol O-methyltransferase, COMT) 억제제를 포함한다. 일부 측면에서, 추가적인 치료제는 N-메틸-D-아스파테이트(N-methyl-D-aspartate, NMDA) 수용체 길항제를 포함한다. 일부 측면에서, 추가적인 치료제는 면역조절제(immunomodulatory)를 포함한다. 일부 측면에서, 추가적인 치료제는 면역억제제(immunosuppressant)를 포함한다.

그러한 제제의 비제한적인 예는 다음을 포함한다: 테트라벤자인(Tetrabenazine)(XENAZINE), 항정신병 약물(antipsychotic drugs), 예컨대, 할로페리돌(Haloperidol)(HALDOL), 클로로프로마진(chlorpromazine), 리스페리돈(risperidone)(rRIDPERDAL), 퀘티아핀(quetiapine)(SEROQUEL), 레보다파(levodopa)(카르비도파(Carbidopa)유무에 관계없이)(LODOSYN), 프라미펙솔(pramipexole)과 같은 도파민 작용제(MIRAPEX), 로피니롤(ropinirole)(REQUIP), 및 로티고틴(rotigotine)(NEUPRO), 및 아프로모르핀(apomorphine)(APOKYN), 셀레질린(selegiline)(ELDEPRYL, ZELAPAR), 라사질린(rasagiline)(AZILECT), 엔타카폰(Entacapone)(COMTAN), 벤즈트로핀(benztropine)(COGENTIN), 트리헥시페니딜(Trihexyphenidyl), 아마타딘(amantadine), 도네페질(Donepezil)(ARICEPT), 갈란타민(Galantamine)(RAZADYNE), 리바스티그민(Rivastigmine)(EXELON), 글라티라메르아세테이트(Glatiramer acetate)(COPAXONE), 디메틸푸마레이트(Dimethyl fumarate)(TECFIDERA), 핀골리모드(Fingolimod)(GILENYA), 테리플루오마이드(Teriflunomide)(AUBAGIO), 나탈리주맙(Natalizumab)(TYSABRI), 알렘투주맙(Alemtuzumab)(LEMTRADA), 미톡산트론(Mitoxantrone)(NOVANTRONE), 리루졸(riluzole)(RILUTEK), 피소스티그민살리실레이트(physostigmine salicylate)(ANTILIRIUM), 피소스티그민설페이트(physostigmine sulfate)(ESERINE), 메트리포네이트(metrifonate), 네오소티그민(neostigmine), 간스티그민(ganstigmine), 피리도스티그민(pyridostigmine)(MESTINON), 암베노니움(ambenonium)(MYTELASE), 데마카리움(demarcarium), 데비오(Debio) 9902(ZT-1; 데비오팜라도스티길(Debiopharmladostigil), NP-0361,), 타크린(tacrine)(COGNEX), 톨세린(tolserine), 벨나크린말레이트(velnacrine maleate), 메모퀸(memoquin), 후페르진(huperzine) A (HUP-A; NeuroHitech), 펜세린(phenserine), 엔드로포니움(edrophonium)(ENLON, TENSILON), INM-176, 아포모르핀(apomorphine)(APOKYN), 브로모크립틴(bromocriptine)(PARLODEL), 카베르골린(cabergoline)(DOSTINEX), 디하이드렉시딘(dihydrexidine), 디하이드로에르고트립틴(dihydroergocryptine), 페놀도팜(fenoldopam)(CORLOPAM), 리수리드(lisuride)(DOPERGIN), 테르구리드스페르골리드(terguride spergolide)(PERMAX), 피리베딜(piribedil)(TRIVASTAL, TRASTAL), 퀸피롤(quinpirole), SKF-82958(GlaxoSmithKline), 카리프라진(cariprazine), 파르도프루녹스(pardoprunox), 사리조탄(sarizotan), 클로르프로마진(chlorpromazine), 플루페나진록스지핀(fluphenazine loxzpine), 레스페리돈(resperidone), 티오리다진(thioridazine), 티오티센(thiothixene), 트리플루오페라진(trifluoperazine), 7-히드록시아목사핀(7-hydroxyamoxapine), 드로페리돌(droperidol)(INAPSINE, DRIDOL, DROPLETAN), 돔페리돈(domperidone)(MOTILIUM), L-741742, L-745870, 라클로프라이드(raclopride), SB-277011A, SCH-23390, 에코피팜(ecopipam), SKF-83566, 메토클로프라마이드(metoclopramide)(REGLAN), 루라시돈(lurasidone)(LATUDA, 또한 SM-13496으로도 알려짐; Dainippon Sumitomo), 아리피프라졸(aripiprazole)(ABILIFY), 클로르프로마진(chlorpromazine)(THORAZINE), 일로페리돈(iloperidone)(FANAPTA), 플루펜티솔디카노에이트(flupentixol decanoate)(DEPIXOL, FLUANXOL), 리세리핀(reserpine)(SERPLAN), 피모자이드(pimozide)(ORAP), 플루헤나자인디카노에이트(fluphenazine decanoate), 플루헤나자인히드로클로라이드(fluphenazine hydrochloride), 프로클로페라진(prochlorperazine)(COMPRO), 아세나핀(asenapine)(SAPHRIS), 록사핀(loxapine)(LOXITANE), 몰린돈(molindone)(MOBAN), 페르페나진(perphenazine), 티오리다진(thioridazine), 티오틱사인(thiothixine), 트리플루오페라진(trifluoperazine)(STELAZINE), 라멜테온(ramelteon), 클로자핀(clozapine)(CLOZARIL), 노클로자핀(norclozapine)(ACP-104), 팔리페리돈(paliperidone)(INVEGA), 멜페론(melperone), 올란자핀(olanzapine)(ZYPREXA), 탈네탄트(talnetant), 아미술플라이드(amisulpride), 지프라시돈(ziprasidone)(GEODON), 블로난세린(blonanserin)(LONASEN), ACP-103 (Acadia Pharmaceuticals), 셀레질린히드로클로라이드(selegiline hydrochloride)(I-deprenyl, ELDEPRYL, ZELAPAR), 디메틸셀레질렌(Dimethylselegilene), 브로파로민(brofaromine), 펜넬진(phenelzine)(NARDIL), 트라닐사이프로마인(tranylcypromine)(PARNATE), 몰클로베마이드(moclobemide)(AURORIX, MANERIX), 베플록사톤(befloxatone), 사핀아미드(safinamide), 이소카복사지드(isocarboxazid)(MARPLAN), 니알라마이드(nialamide)(NIAMID), 이프로니아자이드(iproniazide)(MARSILID, IPROZID, IPRONID), CHF-3381(Chiesi Farmaceutici), 이프로클로자이드(iproclozide), 톨록사톤(toloxatone)(HUMORYL, PERENUM), 비페멜레인(bifemelane), 데속시페가닌(desoxypeganine), 하르민(harmine)(텔레파틴(telepathine), 또는 바나스테린(banasterine)), 하말린(harmaline), 리네졸리드(linezolid)(ZYVOX, ZYVOXID), 파질린(pargyline)(EUDATIN, SUPIRDYL), 니테카폰(nitecapone), 톨카폰(tolcapone)(TASMAR), 트로폴론(tropolone), 메만틴(memantine)(NAMENDA, AXURA, EBIXA), 아만타딘(amantadine)(SYMMETREL), 아캄프로세이트(acamprosate)(CAMPRAL), 베손프로딜(besonprodil), 케타민(ketamine)(KETALAR), 델루세민(delucemine), 덱산나비놀(dexanabinol), 덱세파로산(dexefaroxan), 덱스트로메토르판(dextromethorphan), 덱스트로판(dextrorphan), 트락소프로딜(traxoprodil), CP-283097, 히만탄(himantane), 이단타돌(idantadol), 이펜옥사존(ipenoxazone), L-701252(Merck), 란시에민(lancicemine), 레보르판놀(levorphanol)(DROMORAN), LY-233536 및 LY-235959(both Lilly), 메타돈(methadone)(DOLOPHINE), 네라멕산(neramexane), 페르진포텔(perzinfotel), 펜시클리딘(phencyclidine), 티아넵틴(tianeptine)(STABLON), 디조실핀(dizocilpine)(MK-801), EAB-318(Wyeth), 이보가인(ibogaine), 보칸진(voacangine), 틸레타민(tiletamine), 압티가넬(aptiganel)(CERESOTAT), 가베스티넬(gavestinel), 레마시마이드(remacimide), MBP-8298(합성 미엘린 기본 단백질 펩티드), 로퀴니멕스(roquinimex)(LINOMIDE), 라쿠이니모드(laquinimod)(ABR-215062 및 SAIK-MS), ABT-874(인간 항-IL-12항체; Abbott), 리툭시맙(rituximab)(RITUXAN), 레프루노마이드(leflunomide), 시클레소나이드(ciclesonide), 다클리주맙(daclizumab)(ZENAPAX), 메토트렉세이트(methotrexate)(TREXALL, RHEUMATREX), 수플라타스트토실레이트(suplatast tosilate), 마이코페놀레이트모페틸(mycophenolate mofetil)(CELLCEPT), 마이코페놀레이트소듐(mycophenolate sodium)(MYFORTIC), 아자티오프라인(azathioprine)(AZASAN, IMURAN), 머캅토푸린(mercaptopurine)(PURI-NETHOL), 사이클로포스파마이드(cyclophosphamide)(NEOSAR, CYTOXAN), 보클로스포린(voclosporin), PUR-118, AMG 357, AMG 811, BCT197, 클로람부실(chlorambucil)(LEUKERAN), 클라드리바인(cladribine)(LEUSTATIN, MYLINAX), 알파-페토프로테인(alpha-fetoprotein), 에타네르셉트(etanercept)(ENBREL), 레플루노마이드(leflunomide), 시클레소나이드클로로퀸(ciclesonide chloroquine), 히드록시클로로퀸(hydroxychloroquine), 디-페니실라민(d-penicillamine), 아루라노핀(auranofin), 술파살라진(sulfasalazine), 소듐아우로티오말레이트(sodium aurothiomalate), 사이클로스포린(cyclosporine), 크로몰린(cromolyn), 인플릭시맙(infliximab), 아달리무맙(adalimumab), 세르토리주맙(certolizumab) 페골(pegol), 골리무맙(golimumab), 리툭시맙(rituximab), 오크렐리주맙(ocrelizumab), 오파투무맙(ofatumumab), 　4-벤질록시-5-((5-언데실-2H-피롤-2-일리덴)메틸)-2,2'-바이-1H-피롤(4-benzyloxy-5-((5-undecyl-2H-pyrrol-2-ylidene )methyl) -2,2'-bi-1 H-pyrrole)(PNU-156804), 및 이들의 조합.

일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 임의의 폴리펩티드, 분자, 핵산, 벡터, 세포, 단백질 결합체, 또는 조성물은 정맥내(intravenously), 경구(orally), 비경구(parenterally), 경막내(transthecally), 척수강내(intrathecally), 뇌실내(intra-cerebroventricularly), 폐(pulmonarily), 피하(subcutaneously), 표피내(intradermally), 근육내(intramuscularly), or 심실내(intraventricularly)로 투여된다.

하기 실시예는 제한이 아닌 예시를 위해 제공된다.

실시예

실시예 1: FAM19A5와 LRRC4 단백질 패밀리 멤버 간의 상호작용 분석

FAM19A5와 LRRC4 단백질 패밀리 멤버 사이의 상호작용을 더 잘 이해하기 위해, HEK293 세포는 LRRC4 단백질 패밀리의 FLAG-태그된 멤버, 즉, LRRC4C 단백질, LRRC4 단백질, 또는 LRRC4B 단백질을 발현하도록 변형되었다. 그후, HEK293 세포 또는 1차 피질 뉴런을 재조합 FAM19A5 단백질(1μM)로 30분 동안 처리하고, FAM19A5 단백질과 LRRC4 단백질 패밀리의 다른 멤버 사이의 결합을 공동 면역침전 및 면역형광 분석을 모두 사용하여 평가하였다.

공동-면역침전 검정을 위해, 상이한 FAM19A5-처리된 HEK293 세포로부터의 세포 용해물을 수집하고 항-FLAG 항체, 항-FAM19A5(1-65) 항체 또는 인간 IgG 항체(대조군)로 면역침전시켰다. 면역침전된 단백질을 항-FLAG 및 항-FAM19A5(3-2) 항체로 면역블로팅하였다. 면역형광 검정을 위해, 재조합 FAM19A5 단백질로 처리된 HEK293 세포를 항-FAM19A5(3-2)(FAM19A5 단백질 발현을 검출하기 위해) 및 항-FLAG 항체(LRRC4 단백질 패밀리 멤버를 검출하기 위해)로 면역염색하였다. 재조합 FAM19A5 단백질로 처리된 1차 피질 뉴런은 항-FAM19A5(3-2) 및 항-LRRC4B 항체로 면역염색되었다. 핵은 Hoechst33342(파란색)로 염색되었다.

도1a에 도시된 바와 같이, 항-FLAG 항체는 FAM19A5 단백질을 공동-면역침전시킬 수 있었다. 유사하게, 도1b에 도시된 바와 같이. 항-FAM19A5(1-65) 항체는 LRRC4B 단백질을 특이적으로 공동-면역침전시킬 수 있었다. 면역 형광 분석을 사용하여 유사한 결과가 관찰되었다. LRRC4B-발현 HEK293 세포 및 1차 피질 뉴런 모두에서, FAM19A5 단백질은 LRRC4B 단백질이 고도로 발현되는 수상돌기-유사 과정 또는 신경돌기와 대부분 연관되어 있으며(도1c 및 1d 참조), 이는 LRRC4 단백질 패밀리(예: LRRC4B) 및 FAM19A5 단백질 멤버 사이의 상호작용을 의미한다.

다음으로, 상기 결과가 FAM19A5 단백질의 특정 아이소폼에 특이적인지 여부를 평가하기 위해, HEK293 세포를 FLAG-태깅된 LRRC4B 단백질을 인코딩하는 cDNA 및 FAM19A5 단백질의 아이소폼 1 또는 아이소폼 2를 인코딩하는 cDNA로 공동 형질감염시켰다. 그 다음, 결합은 면역형광 및 공동-면역침전 검정을 모두 사용하여 평가하였다.

면역형광 검정을 위해, 동시 형질감염된 HEK293 세포를 항-FAM19A5(1-65) 및 항-FLAG 항체로 면역염색하여 각각 FAM19A5(아이소폼 1 또는 2) 및 LRRC4B 단백질의 세포하 국소화를 확인하였다. 핵은 Hoechst33342(파란색)로 염색되었다. 공동-면역침전 분석을 위해, 공동-형질감염된 HEK293 세포로부터의 세포 용해물을 항-FLAG 항체, 항-FAM19A5(1-65) 항체, 항-FAM19A5(3-2) 항체 또는 인간 IgG 항체(대조군)로 면역침전시켰다. 면역침전된 단백질을 항-FLAG 및 항-FAM19A5(3-2) 항체로 면역블로팅하였다.

이전 결과와 유사하게, 동시 형질감염된 HEK293 세포에서, FAM19A5 단백질의 두 아이소폼은 LRRC4B 단백질, 특히 원형질막 근처의 소포형 반점 및 수상돌기형 과정에서 고도로 동국화된 것으로 나타났다(참조: 도2a 및 2b). 마찬가지로, 항-FLAG 및 항-FAM19A5(1-65) 항체를 사용한 면역침전은 LRRC4B 단백질과 FAM19A5 단백질의 두 아이소폼 사이의 상호작용을 확인하였다. 예를 들어, 항-FLAG 항체는 FAM19A5 단백질의 아이소폼 1 및 2 모두를 공동-면역침전시킬 수 있었다(도2c 참조). 유사하게, 항-FAM19A5(1-65) 항체는 LRRC4B 단백질을 공동-면역침전시킬 수 있었다(도2d 참조). 유사하게, 항-FAM19A5(3-2) 항체는 LRRC4B 단백질을 공동-면역침전시킬 수 없었다. 어느 하나의 이론에 얽매이지 않고, 1-65 및 3-2 항-FAM19A5 항체에서 관찰된 차이는 이들 항체가 FAM19A5 단백질 내의 다른 에피토프에 결합하는 것으로 알려져 있기 때문에 이들의 결합 에피토프 때문일 수 있다(U.S. Publ. 2020/0299373호 참조, 해당 출원 명세서의 전체 내용이 본 명세서에 참조로 통합됨).

종합적으로, 상기 결과는 FAM19A5 단백질과 LRRC4 단백질 패밀리의 다른 멤버(예: LRRC4B) 사이의 상호작용을 확인한다. 본 명세서에 기술된 바와 같이, 본 발명의 폴리펩티드는 이러한 상호작용을 억제, 감소 및/또는 해리함으로써, 일부 측면에서, 이러한 상호작용과 관련된 생물학적 활성을 조절하는데 유용할 수 있다.

실시예2: LRRC4B 단백질의 FAM19A5 단백질 결합 도메인의 확인

FAM19A5 단백질에 대한 결합을 담당하는 LRRC4B 단백질의 특정 모티프 또는 도메인을 확인하기 위해, 다양한 FLAG-태깅된 LRRC4B 결실 구조를 생성하였다(하기 표6 참조). HEK293 세포를 상이한 결실 구조물로 형질감염시킨 후 실시예 1에 기재된 바와 같이 재조합 FAM19A5 단백질로 처리하였다. 이어서, 상이한 HEK293 세포로부터의 세포 용해물을 항-FLAG 항체로 면역침전시켰다. 면역침전된 단백질은 항-FLAG 및 항-FAM19A5(3-2) 항체로 면역블로팅되었다.

구조물 #	설명	아미노산 서열
1"LRRC4B (36-713)"	서열번호 2의 아미노산 36-713	AGGGGVAVTSAAGGGSPPATSCPVACSCSNQASRVICTRRDLAEVPASIPVNTRYLNLQENGIQVIRTDTFKHLRHLEILQLSKNLVRKIEVGAFNGLPSLNTLELFDNRLTTVPTQAFEYLSKLRELWLRNNPIESIPSYAFNRVPSLRRLDLGELKRLEYISEAAFEGLVNLRYLNLGMCNLKDIPNLTALVRLEELELSGNRLDLIRPGSFQGLTSLRKLWLMHAQVATIERNAFDDLKSLEELNLSHNNLMSLPHDLFTPLHRLERVHLNHNPWHCNCDVLWLSWWLKETVPSNTTCCARCHAPAGLKGRYIGELDQSHFTCYAPVIVEPPTDLNVTEGMAAELKCRTGTSMTSVNWLTPNGTLMTHGSYRVRISVLHDGTLNFTNVTVQDTGQYTCMVTNSAGNTTASATLNVSAVDPVAAGGTGSGGGGPGGSGGVGGGSGGYTYFTTVTVETLETQPGEEALQPRGTEKEPPGPTTDGVWGGGRPGDAAGPASSSTTAPAPRSSRPTEKAFTVPITDVTENALKDLDDVMKTTKIIIGCFVAITFMAAVMLVAFYKLRKQHQLHKHHGPTRTVEIINVEDELPAASAVSVAAAAAVASGGGVGGDSHLALPALERDHLNHHHYVAAAFKAHYSSNPSGGGCGGKGPPGLNSIHEPLLFKSGSKENVQETQI (서열번호 52)
2"LRRC4B (157-713)"	서열번호 2의 아미노산 157-713	LSKLRELWLRNNPIESIPSYAFNRVPSLRRLDLGELKRLEYISEAAFEGLVNLRYLNLGMCNLKDIPNLTALVRLEELELSGNRLDLIRPGSFQGLTSLRKLWLMHAQVATIERNAFDDLKSLEELNLSHNNLMSLPHDLFTPLHRLERVHLNHNPWHCNCDVLWLSWWLKETVPSNTTCCARCHAPAGLKGRYIGELDQSHFTCYAPVIVEPPTDLNVTEGMAAELKCRTGTSMTSVNWLTPNGTLMTHGSYRVRISVLHDGTLNFTNVTVQDTGQYTCMVTNSAGNTTASATLNVSAVDPVAAGGTGSGGGGPGGSGGVGGGSGGYTYFTTVTVETLETQPGEEALQPRGTEKEPPGPTTDGVWGGGRPGDAAGPASSSTTAPAPRSSRPTEKAFTVPITDVTENALKDLDDVMKTTKIIIGCFVAITFMAAVMLVAFYKLRKQHQLHKHHGPTRTVEIINVEDELPAASAVSVAAAAAVASGGGVGGDSHLALPALERDHLNHHHYVAAAFKAHYSSNPSGGGCGGKGPPGLNSIHEPLLFKSGSKENVQETQI (서열번호 53)
3"LRRC4B (230-713)"	서열번호 2의 아미노산 230-713	RLEELELSGNRLDLIRPGSFQGLTSLRKLWLMHAQVATIERNAFDDLKSLEELNLSHNNLMSLPHDLFTPLHRLERVHLNHNPWHCNCDVLWLSWWLKETVPSNTTCCARCHAPAGLKGRYIGELDQSHFTCYAPVIVEPPTDLNVTEGMAAELKCRTGTSMTSVNWLTPNGTLMTHGSYRVRISVLHDGTLNFTNVTVQDTGQYTCMVTNSAGNTTASATLNVSAVDPVAAGGTGSGGGGPGGSGGVGGGSGGYTYFTTVTVETLETQPGEEALQPRGTEKEPPGPTTDGVWGGGRPGDAAGPASSSTTAPAPRSSRPTEKAFTVPITDVTENALKDLDDVMKTTKIIIGCFVAITFMAAVMLVAFYKLRKQHQLHKHHGPTRTVEIINVEDELPAASAVSVAAAAAVASGGGVGGDSHLALPALERDHLNHHHYVAAAFKAHYSSNPSGGGCGGKGPPGLNSIHEPLLFKSGSKENVQETQI (서열번호 54)
4"LRRC4B (364-713)"	서열번호 2의 아미노산 364-713	PVIVEPPTDLNVTEGMAAELKCRTGTSMTSVNWLTPNGTLMTHGSYRVRISVLHDGTLNFTNVTVQDTGQYTCMVTNSAGNTTASATLNVSAVDPVAAGGTGSGGGGPGGSGGVGGGSGGYTYFTTVTVETLETQPGEEALQPRGTEKEPPGPTTDGVWGGGRPGDAAGPASSSTTAPAPRSSRPTEKAFTVPITDVTENALKDLDDVMKTTKIIIGCFVAITFMAAVMLVAFYKLRKQHQLHKHHGPTRTVEIINVEDELPAASAVSVAAAAAVASGGGVGGDSHLALPALERDHLNHHHYVAAAFKAHYSSNPSGGGCGGKGPPGLNSIHEPLLFKSGSKENVQETQI (서열번호 55)
5"LRRC4B (453-713)"	서열번호 2의 아미노산 453-713	VSAVDPVAAGGTGSGGGGPGGSGGVGGGSGGYTYFTTVTVETLETQPGEEALQPRGTEKEPPGPTTDGVWGGGRPGDAAGPASSSTTAPAPRSSRPTEKAFTVPITDVTENALKDLDDVMKTTKIIIGCFVAITFMAAVMLVAFYKLRKQHQLHKHHGPTRTVEIINVEDELPAASAVSVAAAAAVASGGGVGGDSHLALPALERDHLNHHHYVAAAFKAHYSSNPSGGGCGGKGPPGLNSIHEPLLFKSGSKENVQETQI (서열번호 56)
6"LRRC4B (577-713)"	서열번호 2의 아미노산 577-713	IIIGCFVAITFMAAVMLVAFYKLRKQHQLHKHHGPTRTVEIINVEDELPAASAVSVAAAAAVASGGGVGGDSHLALPALERDHLNHHHYVAAAFKAHYSSNPSGGGCGGKGPPGLNSIHEPLLFKSGSKENVQETQI (서열번호 57)
7"LRRC4B (36-576)"	서열번호 2의 아미노산 36-576	AGGGGVAVTSAAGGGSPPATSCPVACSCSNQASRVICTRRDLAEVPASIPVNTRYLNLQENGIQVIRTDTFKHLRHLEILQLSKNLVRKIEVGAFNGLPSLNTLELFDNRLTTVPTQAFEYLSKLRELWLRNNPIESIPSYAFNRVPSLRRLDLGELKRLEYISEAAFEGLVNLRYLNLGMCNLKDIPNLTALVRLEELELSGNRLDLIRPGSFQGLTSLRKLWLMHAQVATIERNAFDDLKSLEELNLSHNNLMSLPHDLFTPLHRLERVHLNHNPWHCNCDVLWLSWWLKETVPSNTTCCARCHAPAGLKGRYIGELDQSHFTCYAPVIVEPPTDLNVTEGMAAELKCRTGTSMTSVNWLTPNGTLMTHGSYRVRISVLHDGTLNFTNVTVQDTGQYTCMVTNSAGNTTASATLNVSAVDPVAAGGTGSGGGGPGGSGGVGGGSGGYTYFTTVTVETLETQPGEEALQPRGTEKEPPGPTTDGVWGGGRPGDAAGPASSSTTAPAPRSSRPTEKAFTVPITDVTENALKDLDDVMKTTK (서열번호 58)
8"LRRC4B (36-363)"	서열번호 2의 아미노산 36-363	AGGGGVAVTSAAGGGSPPATSCPVACSCSNQASRVICTRRDLAEVPASIPVNTRYLNLQENGIQVIRTDTFKHLRHLEILQLSKNLVRKIEVGAFNGLPSLNTLELFDNRLTTVPTQAFEYLSKLRELWLRNNPIESIPSYAFNRVPSLRRLDLGELKRLEYISEAAFEGLVNLRYLNLGMCNLKDIPNLTALVRLEELELSGNRLDLIRPGSFQGLTSLRKLWLMHAQVATIERNAFDDLKSLEELNLSHNNLMSLPHDLFTPLHRLERVHLNHNPWHCNCDVLWLSWWLKETVPSNTTCCARCHAPAGLKGRYIGELDQSHFTCYA (서열번호 59)
9"LRRC4B (△364-576)	서열번호 2의 아미노산 △364-576	AGGGGVAVTSAAGGGSPPATSCPVACSCSNQASRVICTRRDLAEVPASIPVNTRYLNLQENGIQVIRTDTFKHLRHLEILQLSKNLVRKIEVGAFNGLPSLNTLELFDNRLTTVPTQAFEYLSKLRELWLRNNPIESIPSYAFNRVPSLRRLDLGELKRLEYISEAAFEGLVNLRYLNLGMCNLKDIPNLTALVRLEELELSGNRLDLIRPGSFQGLTSLRKLWLMHAQVATIERNAFDDLKSLEELNLSHNNLMSLPHDLFTPLHRLERVHLNHNPWHCNCDVLWLSWWLKETVPSNTTCCARCHAPAGLKGRYIGELDQSHFTCYAIIIGCFVAITFMAAVMLVAFYKLRKQHQLHKHHGPTRTVEIINVEDELPAASAVSVAAAAAVASGGGVGGDSHLALPALERDHLNHHHYVAAAFKAHYSSNPSGGGCGGKGPPGLNSIHEPLLFKSGSKENVQETQI (서열번호 60)
10"LRRC4B (364-576)"	서열번호 2의 아미노산 364-576	PVIVEPPTDLNVTEGMAAELKCRTGTSMTSVNWLTPNGTLMTHGSYRVRISVLHDGTLNFTNVTVQDTGQYTCMVTNSAGNTTASATLNVSAVDPVAAGGTGSGGGGPGGSGGVGGGSGGYTYFTTVTVETLETQPGEEALQPRGTEKEPPGPTTDGVWGGGRPGDAAGPASSSTTAPAPRSSRPTEKAFTVPITDVTENALKDLDDVMKTTK (서열번호 61)
11"LRRC4B (453-576)"	서열번호 2의 아미노산 453-576	VSAVDPVAAGGTGSGGGGPGGSGGVGGGSGGYTYFTTVTVETLETQPGEEALQPRGTEKEPPGPTTDGVWGGGRPGDAAGPASSSTTAPAPRSSRPTEKAFTVPITDVTENALKDLDDVMKTTK (서열번호 7)
12"LRRC4B (484-576)"	서열번호 2의 아미노산 484-576	YTYFTTVTVETLETQPGEEALQPRGTEKEPPGPTTDGVWGGGRPGDAAGPASSSTTAPAPRSSRPTEKAFTVPITDVTENALKDLDDVMKTTK (서열번호 8)
13"LRRC4B (498-576)"	서열번호 2의 아미노산 498-576	QPGEEALQPRGTEKEPPGPTTDGVWGGGRPGDAAGPASSSTTAPAPRSSRPTEKAFTVPITDVTENALKDLDDVMKTTK (서열번호 11)

FLAG-태깅된 LRRC4B 결실 구조물

도3a 및 도3b에 도시된 바와 같이, LRRC4B 단백질의 트레오닌-풍부 도메인(도3a에서 "Thr")을 포함하는 모든 결실 구조물은 다양한 수준으로 FAM19A5 단백질에 결합할 수 있었다. 이들 구조물은 다음을 포함한다: LRRC4B(36-713)(즉, 구조물 #1); LRRC4B(157-713)(즉, 구조물 #2); LRRC4B(230-713)(즉, 구조물 #3); LRRC4B(364-713)(즉, 구조물 #4); LRRC4B(453-713)(즉, 구조물 #5); LRRC4B(36-576)(즉, 구조물 #7); LRRC4B(364-576)(즉, 구조물 #10); LRRC4B(453-576)(즉, 구조물 #11); 및 LRRC4B(484-576)(즉, 구조물 #12). 특히, LRRC4B 단백질의 위치 484-497에 있는 아미노산 서열은 아미노산 484-576을 함유하는 결실 구조물(즉, 구조물 #12)이 FAM19A5 단백질에 결합할 수 있기 때문에 결합에 중요한 역할을 하는 것으로 나타난 반면, 아미노산 498-576을 함유하는 결실 구조물(즉, 구조물 #13)은 그렇게 할 수 없었다(도3a 및 3b 참조).

다음으로, 상기 공동-면역침전 결과를 확인하기 위해, ELISA 검정을 사용하여 LRRC4 단백질 패밀리 멤버의 전장 엑토도메인 또는 다양한 LRRC4B 엑토도메인 단백질 단편에 대한 FAM19A5 단백질의 결합을 측정하였다. 구체적으로, ELISA 플레이트를 인간 Fc(100 nM/웰)에 결합된 하기 LRRC4B 엑토도메인 단백질 중 하나로 코팅하였다: (1) LRRC4 단백질의 전장 엑토도메인(서열번호 1의 아미노산 잔기 39-527)(서열번호 4); (2) LRRC4B 단백질의 전장 엑토도메인(서열번호 2의 아미노산 36-576; 즉, 표6의 구조물 #7)(서열번호 5); (3) LRRC4C 단백질의 전장 엑토도메인(서열번호 3의 아미노산 45-527)(서열번호 6); (4) LRRC4B 엑토도메인 단편(서열번호 2의 아미노산 453-576; 즉, 표6의 구조물 #11)(서열번호 7); (5) LRRC4B 엑토도메인 단편(서열번호 2의 아미노산 484-576; 즉, 표6의 구조물 #12)(서열번호 8); (6) LRRC4B 엑토도메인 단편(서열번호 2의 아미노산 482-576)(서열번호 9); (7) LRRC4B 엑토도메인 단편(서열번호 2의 아미노산 482-497)(서열번호 10); 및 (8) LRRC4B 엑토도메인 단편(서열번호 2의 아미노산 498-576; 즉, 표6의 구조물 #13)(서열번호 11). 그 후, 재조합 FAM19A5 단백질(0.005, 0.01, 0.025, 0.05, 0.1, 0.25, 0.5, 1, 2.5, 5 및 10nM)을 관련 웰에 첨가하고 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 이후, HRP가 결합된 항-FAM19A5(1-65) 항체를 이용하여 LRRC4B가 결합된 FAM19A5 단백질의 양을 검출하였다.

도4a에 도시된 바와 같이. LRRC4 단백질 패밀리의 모든 멤버(즉, LRRC4, LRRC4B 및 LRRC4C 단백질)의 전장 엑토도메인은 다양한 수준으로 FAM19A5 단백질을 찾을 수 있었다. LRRC4 및 LRRC4B 단백질의 전장 엑토도메인은 각각 0.48nM 및 0.64nM의 EC50으로 FAM19A5 단백질에 결합하였다. FAM19A5의 10nM 농도에서 전장 LRRC4C 단백질에 대한 결합 포화는 관찰되지 않았다. 그리고, 공동-면역침전 분석과 일치하게, 서열번호 2의 위치 484-497에 있는 서열을 함유하는 LRRC4B 엑토도메인 단백질 단편은 FAM19A5에 상당한 친화도를 갖는 반면, 이 서열이 결여된 엑토도메인 단백질 단편(즉, LRRC4B(498- 576))은 FAM19A5에 결합하는데 실패하였다(도4b 참조).

추가 확인으로서, 서열번호 2의 아미노산 484-497(즉, YTYFTTVTVETLET; 서열번호 65)을 포함하는 다음 3개의 합성 폴리펩티드가 구성되었다: (1) FB-16(GYTYFTTVTVETLETQ; 서열번호 17), (2) FB-20(GYTYFTTVTVETLETQPGEE; 서열번호 18), 및 (3) FB-28(GYTYFTTVTVETLETQPGEKEPPGPTTD; 서열번호 19). 펩티드는 전체 길이가 다르다. 재조합 FAM19A5 단백질에 결합하는 이들 폴리펩티드의 능력은 상술된 바와 같은 ELISA 검정을 사용하여 평가하였다. 도4b에 도시된 바와 같이, FB-16, FB-20 및 FB-28 각각은 서열번호 2의 아미노산 484-497(즉, 서열번호 65)을 포함하는 LRRC4B 엑토도메인 단백질 단편과 유사하게 높은 친화도로 재조합 FAM19A5 단백질에 결합할 수 있었다.

종합적으로, 상기 결과는 FAM19A5 단백질(또한, "FAM19A5 결합 도메인"이라고도 여겨짐)에 대한 결합에서 LRRC4B 단백질(즉, 서열번호 65)의 위치 484-497, 특정 위치 484-493(즉, YTYFTTVTVE;서열번호 29) 내의 아미노산 서열의 중요성을 시사한다. 도20에 도시된 바와 같이, 이 서열은 일반적으로 다른 척추동물 사이에서 LRRC4 단백질 패밀리에서 진화적으로 보존된다.

실시예 3: LRRC4 단백질 패밀리의 다른 멤버의 FAM19A5 단백질 결합 도메인의 확인

실시예 2에 기재된 바와 같이, LRRC4 단백질 패밀리의 모든 멤버는 다양한 수준으로 FAM19A5 단백질에 결합할 수 있었다. 따라서, 결합 도메인을 비교하기 위해 LRRC4B, LRRC4 및 LRRC4C 단백질의 아미노산 서열을 정렬하였다. 도5a에 도시된 바와 같이, LRRC4B의 484-522 위치의 아미노산 서열과 LRRC4 및 LRRC4C 단백질의 상응하는 위치의 아미노산 서열을 비교하면 많은 유사성을 보였다. 따라서, LRRC4 및 LRRC4C의 상응하는 위치가 FAM19A5 단백질에 대한 이들 단백질의 결합에서 중요한지 여부를 평가하기 위해, cDNA 인코딩 (i) LRRC4C 단백질 단편(서열번호 3의 아미노산 354-527; 서열번호 66) 또는 (ii) LRRC4 단백질 단편(서열번호 1의 아미노산 353-527; 서열번호 67)가 조작되었다(표7 참조). HEK293 세포를 형질감염시켜 단백질 단편 중 하나를 발현시킨 다음 실시예 1에 기재된 바와 같이 재조합 FAM19A5 단백질로 처리하였다. 이어서, 상이한 HEK293 세포로부터의 세포 용해물을 항-FLAG 항체로 면역침전시켰다. 상기 면역침전된 단백질을 항-FLAG 및 항-FAM19A5(3-2) 항체로 면역블로팅하였다.

구조물	설명	아미노산 서열
"LRRC4C (354-527)"	서열번호 3의 아미노산 354-527	VIVEPPADLNVTEGMAAELKCRASTSLTSVSWITPNGTVMTHGAYKVRIAVLSDGTLNFTNVTVQDTGMYTCMVSNSVGNTTASATLNVTAATTTPFSYFSTVTVETMEPSQDEARTTDNNVGPTPVVDWETTNVTTSLTPQSTRSTEKTFTIPVTDINSGIPGIDEVMKTTK (서열번호 66)
"LRRC4 (353-527)"	서열번호 1의 아미노산 353-527	PFIMDAPRDLNISEGRMAELKCRTPμmSSVKWLLPNGTVLSHASRHPRISVLNDGTLNFSHVLLSDTGVYTCMVTNVAGNSNASAYLNVSTAELNTSNYSFFTTVTVETTEISPEDTTRKYKPVPTTSTGYQPAYTTSTTVLIQTTRVPKQVAVPATDTTDKMQTSLDEVMKTTK (서열번호 67)

LRRC4C 및 LRRC4 단백질 단편

도5b에 도시된 바와 같이, LRRC4C 및 LRRC4 펩티드 단편 모두 FAM19A5 단백질에 결합할 수 있었다. 이 결과는 LRRC4 패밀리의 서로 다른 멤버의 결합 도메인에서 유사성을 강조한다.

실시예 4: FAM19A5 및 LRRC4B 단백질의 상호작용을 억제하는 FAM19A5 결합 도메인의 역할 분석

실시예 2에 기재된 결합 도메인을 포함하는 LRRC4B 단백질 단편(예컨대, LRRC4B(453-576); 즉, 표6의 구조물 #11)이 높은 친화도로 FAM19A5 단백질에 결합할 수 있었기 때문에, 그러한 단백질 단편은 FAM19A5 단백질에 결합하기 위해 자연적으로 존재하는 LRRC4B 단백질과 경쟁할 수 있고, 따라서 FAM19A5-LRRC4 단백질 패밀리 복합체를 분리할 수 있다. 간단히, FAM19A5 아이소폼 2 및 LRRC4B 단백질 둘 모두를 발현하는 HEK293 세포를 LRRC4B(453-576)-hFc 또는 돌연변이 LRRC4B(453-576)-hFc(서열번호 2의 488 및 489위치에서 알라닌 치환 포함; 서열번호 16) 단백질 단편으로 30분 동안 처리(즉, 시험관내 배양)하였다. 그 후, 세포를 항-FAM19A5(1-65) 및 항-LRRC4B 항체로 면역염색하여 각각 FAM19A5 및 전장 LRRC4B 단백질의 발현을 확인하였다. 항-hIgG 항체를 사용하여 hFc-융합된 LRRC4B 단백질 단편을 확인하였다. 핵은 Hoechst 33342로 염색되었다.

이전에 관찰된 바와 같이(도2a 및 2b 참조), FAM19A5 단백질이 전장 LRRC4B 단백질에 결합되었을 때, 상기 복합체는 특히 원형질막 및 수상돌기-유사 과정에서 고도로 동국화되었다. LRRC4B(453-576)-hFc로 처리된 세포에서 FAM19A5는 전장 LRRC4B 단백질로부터 대부분 분리되었다(도7, 하단 행 참조). 대조적으로, 돌연변이 LRRC4B(453-576)-hFc로 처리된 HEK293 세포에서, FAM19A5 단백질은 전장 LRRC4B 단백질에 대부분 결합된 채로 남아 있었는데, 이는 실시예 2에서 확인된 FAM19A5 패밀리 결합 도메인의 중요성을 의미한다.

다음으로, LRRC4B 단백질의 결합 도메인이 FAM19A5 단백질과 LRRC4 단백질 패밀리 멤버 사이의 상호작용에 대해 갖는 역할을 더 평가하기 위해, 실시예 2로부터의 상이한 LRRC4B 결실 구조물이 LRRC4B 단백질의 전장 엑토도메인(즉, 서열번호 2의 아미노산 36-576; 서열번호 5)에 FAM19A5의 결합을 억제할 수 있는 지를 확인하기 위해 경쟁적 억제 검정이 사용되었다. 간단히, LRRC4B 단백질의 전체 길이 엑토도메인 100nM을 사용하여 플레이트를 코팅한 다음 재조합 FAM19A5 단백질(5ng/mL)을 다음 LRRC4B 결실 구조물(농도 증가)과 조합하여 플레이트에 첨가하였다:(1) LRRC4B(453-576)(즉, 표6의 구조물 #11); (2) LRRC4B(453-576) 돌연변이체(서열번호 2의 위치 488 및 489에서 알라닌 치환을 포함함; 서열번호 16); (3) LRRC4B(484-576)(즉, 표6의 구조물 #12); (4) LRRC4B(482-576); (5) LRRC4B(482-497); 및 (6) LRRC4B(498-576). 상기 플레이트를 37℃에서 배양한 후 코팅된 LRRC4B 엑토도메인 단백질에 결합된 FAM19A5의 양을 HRP-컨쥬게이션된 항-FAM19A5(1-65) 항체를 사용하여 측정하였다.

도8a에 도시된 바와 같이, LRRC4B(453-576)는 FAM19A5 단백질이 코팅된 전장 LRRC4B 엑토도메인 단백질에 결합하는 것을 억제할 수 있었다. 서열번호 2의 아미노산 잔기 484-497(즉, LRRC4B 단백질의 결합 도메인; 서열번호 65)을 포함하는 다른 LRRC4B 단백질 단편은 또한 FAM19A5와 전장 LRRC4B 엑토도메인 단백질(LRRC4B(484-576), LRRC4B(482-576) 및 LRRC4B(482-497) 참조) 사이의 상호작용을 억제할 수 있었다. 유사한 결과가 합성 펩티드 FB-16, FB-20 및 FB-28에서 관찰되었다(도8b 참조). 대조적으로, 서열번호 2의 아미노산 잔기 484-497이 결여된 LRRC4B 단백질 단편은 상호작용을 억제하는 능력이 훨씬 저하되었다 - LRRC4B 돌연변이체 및 LRRC4B(498-576) 참조(도8a 참조).

종합적으로, 상기 결과는 LRRC4B 단백질의 결합 도메인을 함유하는 펩티드 단편(예컨대, 합성)이 FAM19A5-LRRC4B 단백질 복합체의 형성을 억제하는데 유용할 수 있음을 입증한다.

실시예 5: FAM19A5-LRRC4 단백질 패밀리 복합체 형성을 억제하는 LRRC4 단백질 패밀리의 결합 도메인의 역할 분석

실시예 3에 기술된 바와 같이, LRRC4 패밀리의 상이한 멤버의 결합 도메인에서 많은 유사성이 있는 것으로 나타났다. 따라서, LRRC4B 결합 도메인을 포함하는 폴리펩타이드가 LRRC4 단백질 패밀리의 다른 멤버가 FAM19A5 단백질에 결합하는 것을 억제할 수 있는지 여부를 평가하기 위해 ELISA 플레이트를 다음 단백질 중 하나로 코팅하였다(100nM/웰): LRRC4 단백질의 엑토도메인(서열번호 1의 아미노산 잔기 39-527; 서열번호 4); (2) LRRC4B 단백질의 전장 엑토도메인(서열번호 2의 아미노산 36-576; 즉, 표6의 구조물 #7; 서열번호 5); 및 (3) LRRC4C 단백질의 전장 엑토도메인(서열번호 3의 아미노산 45-527; 서열번호 6). 이어서, 재조합 FAM19A5 단백질(5ng/mL)을 다음 중 하나와 함께 첨가하였다: (i) LRRC4B(484-576) 단백질 단편, (ii) LRRC4B(453-576, AA) 단백질 단편, 및 (iii) 합성 FB-20 펩티드. 상기 플레이트를 37℃에서 배양한 후 코팅된 LRRC4, LRRC4B 또는 LRRC4C 단백질에 결합된 FAM19A5 단백질의 양을 항-FAM19A5(1-65) 항체를 사용하여 측정하였다.

도9a, 9b, 및 9c에 도시된 바와 같이, LRRC4B(484-576) 단백질 단편 및 합성 FB-20 펩티드 둘 다 FAM19A5 단백질이 코팅된 LRRC4 및 LRRC4C 단백질에 결합하는 것을 억제할 수 있었다. 그리고, 이전 데이터와 일치하게, 서열번호 2의 위치 488 및 489에서 알라닌 치환을 갖는 LRRC4B 단편, 즉 LRRC4B 돌연변이체(서열번호 16)는 최소한의 효과를 가졌다.

다음으로, LRRC4 또는 LRRC4C 단백질의 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드가 LRRC4B 단백질 결합에 대해 유사한 억제 효과를 가질 수 있는지 여부를 평가하기 위해, 다음 합성 펩티드를 구성하였다: (1) FBC4-23(LRRC4 단백질의 결합 도메인 함유, 즉, YSFFTTVTVETTE); 및 (2) FBC4C-23(LRRC4C 단백질의 결합 도메인, 즉 FSYFSTVTVETME 함유). 이어서, LRRC4 단백질 패밀리 멤버의 FAM19A5 단백질에 대한 결합을 억제하는 펩티드의 능력을 경쟁적 억제 검정을 사용하여 평가하였다. 간단히, 플레이트를 100nM의 LRRC4B 단백질 단편 #1(서열번호 2의 아미노산 36-576; 서열번호 5) 또는 LRRC4B 단백질 단편 #2(서열번호 2의 아미노산 453-576; 서열번호 7)로 코팅하였다. 이어서, 재조합 FAM19A5 단백질(LRRC4B 단편 #1로 코팅된 플레이트의 경우 5ng/mL; LRRC4B 단편 #2로 코팅된 플레이트의 경우 1ng/mL)을 20nM의 FBC4-23, FBC4C-23 및 FB-20 펩티드와 함께 플레이트에 첨가하였다. 상기 플레이트를 37℃에서 배양한 다음 코팅된 LRRC4B 단백질 단편에 결합된 FAM19A5 단백질의 양을 HRP 결합 항-FAM19A5(1-65) 항체를 사용하여 평가하였다.

도10a 및 10b; 및 표8(아래)에 도시된 바와 같이, 3개의 모든 펩티드(즉, FB-20, FBC4-23 및 FBC4C-23)는 FAM19A5 단백질과 코팅된 LRRC4B 단백질 단편 사이의 상호작용을 상당히 감소시켰다.

펩티드	억제율 (%)
펩티드	LRRC4B (아미노산 36-576)-hFc	LRRC4B (아미노산 453-576)-hFc
FB-20	77.0	63.2
FBC4-23	64.1	40.4
FBC4C-23	65.7	40.4

종합적으로, 상기 결과는 LRRC4 단백질 패밀리의 임의의 멤버의 FAM19A5 결합 도메인을 포함하는 펩티드가 FAM19A5와 LRRC4B 단백질 사이의 상호작용을 억제할 수 있고, 따라서 LRRC4 단백질 패밀리의 FAM19A5 결합 도메인의 보존된 특성이 중요함을 입증한다.

실시예 6: FAM19A5 단백질과 LRRC4 단백질 패밀리 멤버 간의 상호작용을 억제하는 데 필요한 최소 FAM19A5 결합 도메인 서열의 확인

다음으로, FAM19A5와 LRRC4 단백질 패밀리 멤버의 상호작용을 억제하는 데 필요한 최소 서열을 확인하기 위해, N-말단 또는 C-말단에서 하나 이상의 아미노산을 연속적으로 삭제하여 10개의 FB-20 펩티드 변이체를 구성하였다(FB-20 펩티드의 표9를 참조). 이어서, FAM19A5와 LRRC4B 단백질 사이의 상호작용을 억제하는 상이한 FB-20 펩티드 변이체의 능력을 평가하기 위해 경쟁적 억제 검정을 사용하였다. 다시, 플레이트를 100nM의 LRRC4B 단백질 단편 #1(서열번호 2의 아미노산 36-576; 서열번호 5) 또는 LRRC4B 단백질 단편 #2(서열번호 2의 아미노산 453-576; 서열번호 7)로 코팅하였다. 이어서, 재조합 FAM19A5 단백질(LRRC4B 단편 #1로 코팅된 플레이트의 경우 5ng/mL; LRRC4B 단편 #2로 코팅된 플레이트의 경우 1ng/mL)을 상술된 상이한 펩티드 20nM과 함께 플레이트에 첨가하였다.

플레이트를 37℃에서 배양한 후 코팅된 LRRC4B 단백질 단편에 결합된 FAM19A5 단백질의 양을 HRP 결합 항-FAM19A5(1-65) 항체를 사용하여 평가하였다.

도11a와 11b; 및 표 9에 나타낸 바와 같이, LRRC4B 단백질 결합 도메인의 처음 10개 아미노산을 포함하는 펩티드 단편(즉, YTYFTTVTVE; 서열번호 29)은 FAM19A5와 코팅된 LRRC4B 단백질 단편 사이의 상호작용을 상당히 억제할 수 있었다("FB-m11dC" 및 "FB-m10dC" 참조). 대조적으로, LRRC4B 단백질 결합 도메인의 위치 1-10에서 하나 이상의 아미노산이 결여된 펩티드 단편은 FAM19A5-LRRC4B 단백질 상호작용을 유의하게 억제하지 못하였다("FB-m10dC", "FB-m9dC", "FB-m8dC" ," "FB-m7dC", "FB-m6dC", "FB-m10dN", "FB-m9dN", "FB-m8dN" 및 "FB-m7dN" 참조).

펩티드	아미노산 서열	억제율 (%)
펩티드		LRRC4B (아미노산 36-576)-hFc	LRRC4B (아미노산 453-576)-hFc
FB-20	GYTYFTTVTVETLETQPGEE (서열번호 18)	84.3	62.0
FB-m11dC	KN YTYFTTVTVET NKETQ (서열번호 68)	65.0	30.4
FB-m10dC	KN YTYFTTVTVE NKETQ (서열번호 69)	62.0	21.9
FB-m9dC	KN YTYFTTVTV NKETQ (서열번호 70)	16.8	2.7
FB-m8dC	KN YTYFTTVT NKETQ (서열번호 71)	5.1	-0.9
FB-m7dC	KN YTYFTTV NKETQ (서열번호 72)	4.4	0.4
FB-m6dC	KN YTYFTT NKETQ (서열번호 73)	14.9	5.5
FB-m10dN	KN TYFTTVTVET NKETQ (서열번호 74)	7.7	0.0
FB-m9dN	KN YFTTVTVET NKETQ (서열번호 75)	2.5	-1.6
FB-m8dN	KN FTTVTVET NKETQ (서열번호 76)	3.3	-1.1
FB-m7dN	KN TTVTVET NKETQ (서열번호 77)	2.0	-1.8

상기 결과는 LRRC4 단백질 패밀리 멤버와 FAM19A5 단백질 사이의 상호작용을 억제, 감소 및/또는 해리시키는 데 있어서 LRRC4 단백질 패밀리 멤버의 FAM19A5 결합 도메인의 적어도 처음 10개 아미노산 잔기의 중요성을 나타낸다.

실시예 7: LRRC4 단백질 패밀리 멤버와 FAM19A5 단백질 간의 상호작용을 억제하기 위한 중요한 FAM19A5 결합 도메인 잔기의 확인

결정적인 아미노산 잔기를 확인하기 위해, 코어 결합 도메인(즉, YTYFTTVTVETLE; 서열번호 15)의 개별 잔기를 알라닌(A) 또는 아스파라긴(N)으로 치환시켜 다중 FB-20 펩티드 돌연변이체를 구성하였다(표10을 참조). 이어서, LRRC4B와 FAM19A5 단백질 사이의 상호작용을 억제하는 이들 FB-20 펩티드 돌연변이체의 능력을 실시예 3 및 4에 기술된 바와 같이 경쟁적 억제 검정을 사용하여 평가하였다.

도12a와 12b; 및 표10에 나타낸 바와 같이, 코어 결합 도메인의 위치 5, 11, 12 및 13에서 알라닌 또는 아스파라긴 치환을 갖는 FB-20 펩티드 돌연변이체는 여전히 FAM19A5 및 LRRC4B 단백질 사이의 상호작용을 유의하게 억제할 수 있었다. 대조적으로, 위치 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9 및 10에서 알라닌 또는 아스파라긴 치환은 LRRC4B 단백질이 FAM19A5에 결합하는 것을 억제하는 펩티드의 능력을 현저하게 감소시켰다. 이는 FAM19A5와 LRRC4 단백질 패밀리 멤버 사이의 상호작용을 억제, 감소 및/또는 해리하는 핵심 결합 도메인 내의 이러한 아미노산 위치의 중요성을 나타낸다.

펩티드	아미노산 서열	억제율(%)
펩티드		LRRC4B (아미노산 36-576)-hFc	LRRC4B (아미노산 453-576)-hFc
FB-20	GYTYFTTVTVETLETQPGEE (서열번호 18)	77.0	63.2
FB-20[A1]	G A TYFTTVTVETLETQPGEE (서열번호 78)	17.2	3.6
FB-20[A2]	GY A YFTTVTVETLETQPGEE (서열번호 79)	1.0	-0.4
FB-20[A3]	GYT A FTTVTVETLETQPGEE (서열번호 80)	5.9	0.0
FB-20[A4]	GYTY A TTVTVETLETQPGEE (서열번호 81)	2.7	1.5
FB-20[A5]	GYTYF A TVTVETLETQPGEE (서열번호 82)	53.4	22.2
FB-20[A6]	GYTYFT A VTVETLETQPGEE (서열번호 83)	17.9	11.0
FB-20[A7]	GYTYFTT A TVETLETQPGEE (서열번호 84)	26.8	7.9
FB-20[A8]	GYTYFTTV A VETLETQPGEE (서열번호 85)	3.9	-0.4
FB-20[A9]	GYTYFTTVT A ETLETQPGEE (서열번호 86)	21.5	3.8
FB-20[A10]	GYTYFTTVTV A TLETQPGEE (서열번호 87)	19.6	6.4
FB-20[A11]	GYTYFTTVTVE A LETQPGEE (서열번호 88)	73.4	50.3
FB-20[A12]	GYTYFTTVTVET A ETQPGEE (서열번호 89)	73.0	56.2
FB-20[A13]	GYTYFTTVTVETL A TQPGEE (서열번호 90)	51.4	27.2
FB-20[N1]	G N TYFTTVTVETLETQPGEE (서열번호 91)	11.9	3.1
FB-20[N2]	GY N YFTTVTVETLETQPGEE (서열번호 92)	-0.7	-2.0
FB-20[N3]	GYT N FTTVTVETLETQPGEE (서열번호 93)	-5.0	4.0
FB-20[N4]	GYTY N TTVTVETLETQPGEE (서열번호 94)	-1.3	2.5
FB-20[N5]	GYTYF N TVTVETLETQPGEE (서열번호 95)	56.1	30.5
FB-20[N6]	GYTYFT N VTVETLETQPGEE (서열번호 96)	-11.4	-0.4
FB-20[N7]	GYTYFTT N TVETLETQPGEE (서열번호 97)	24.5	8.3
FB-20[N8]	GYTYFTTV N VETLETQPGEE (서열번호 98)	2.9	-2.4
FB-20[N9]	GYTYFTTVT N ETLETQPGEE (서열번호 99)	17.5	6.5
FB-20[N10]	GYTYFTTVTV N TLETQPGEE (서열번호 100)	27.0	10.8
FB-20[N11]	GYTYFTTVTVE N LETQPGEE (서열번호 101)	74.1	55.6

실시예 8: LRRC4 단백질 패밀리 멤버의 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드의 치료 효과 분석

본 명세서에 기술된 폴리펩티드의 치료 가능성 평가를 위해, FAM19A5, LRRC4B 및 PTPRF(LRRC4B의 시냅스 후 파트너)의 전사 수준을 RNA 시퀀싱을 사용하여 배양 후 다양한 시간 포인트에 1차 해마 뉴런(생후 1일에 마우스 뇌에서 유래)에서 평가하였다. 도13a에 나타난 바와 같이, 배양 후 1일째에도 FAM19A5 전사체 수준은 FAM19 패밀리의 다른 멤버에 비해 상당히 더 높았고, 배양 후 15일째까지 높게 유지되었다. 유사하게, 도13b에 나타낸 바와 같이, 1차 해마 뉴런은 또한 LRRC4B 및 PTPRF 둘 모두의 높은 전사 수준을 나타냈고, 이는 배양 후 적어도 15일까지 또한 유지되었다. 1차 뉴런에서 이들 유전자의 높은 발현 수준은 이들이 신경 발생의 다양한 측면에서 중요한 역할을 할 수 있음을 의미한다.

다음으로, 1차 피질 뉴런(출생 후 1일)을 다양한 농도(0.006 내지 60nM)의 LRRC4B(453-576) 단백질 단편(즉, 서열번호 2의 아미노산 잔기 453-576; 서열번호 7)과 시험관내 배양하였고, 초기 배양 후 3일째에 항-베타-튜불린 III 항체로 세포를 면역염색하여 신경돌기 성장에 대한 효과를 평가하였다. DMSO("Veh")로 배양된 세포를 대조군으로 사용하였다.

도14a, 14b, 14c 및 14d에 나타낸 바와 같이, LRRC4B(453-576) 단백질 단편을 처리한 1차 피질 뉴런은 용량 의존적으로 신경돌기 성장이 증가된 것으로 나타났다. 예를 들어, 대조군과 비교하여, LRRC4B 단백질 단편 처리된 뉴런은 신경돌기 길이가 증가하였고(도14a), 1차 및 2차 신경돌기의 수가 증가하였고(각각, 도 14b 및 14d), 분기점의 수가 증가하였다(도14c). LRRC4B(453-576) 단백질 단편 대신에 FB-16, FB-20 및 FB-28 펩티드를 사용한 경우에도 증가된 신경돌기 성장이 관찰되었다(도18a, 18b, 18c, 18d 및 18e 참조). FB-16, FB-20 및 FB-28 펩타이드 중에서 이들은 모두 신경돌기 성장에 대해 유사한 긍정적 효과를 갖는 것으로 보인다.

다음으로, 다른 신경돌기에서 자라난 신경돌기는 축삭으로 분화하여 시냅스전을 형성할 수 있다는 것이 일반적으로 알려져있다. 다른 신경돌기는 작은 신경돌기로 남아서 수상돌기로 분화되어 후시냅스를 형성한다. 따라서, LRRC4B(453-576) 단백질 단편이 시냅스 전 형성 및 후 형성에도 영향을 미칠 수 있는지도 평가하였다. 간단히, 마우스 1차 해마 뉴런을 LRRC4B(453-576) 단백질 단편(6 또는 60 nM)과 함께 시험관내에서 배양하였다. 대조군 세포를 DMSO("Veh") 또는 FAM19A5 단백질에 결합할 수 없는 돌연변이 LRRC4B(453-576) 단백질 단편(위치 488 및 489에서 알라닌 치환을 포함함)으로 처리하였다. 이후, 초기 배양 후 3일과 6일에 시냅토파이신(synaptophysin, SYP; presynaptic marker)의 발현 수준을 평가하였다. 초기 배양 후 7일째에, 시냅스후 밀도 95(PSD95; 시냅스후 마커)의 발현 수준을 평가하였다.

도15a 및 15b에 도시된 바와 같이, LRRC4B(453-576) 단백질 단편(두 농도 모두)은 뉴런에서 SYP 및 PSD95 발현을 모두 증가시켰고, 이는 관찰된 신경돌기 성장의 증가가 시냅스 형성을 증가시킬 수 있음을 확인시켜 주었다. 도15c에 나타낸 바와 같이, 펩티드 처리된 마우스 1차 해마 신경세포에서 SYP와 PSD95로 공동표지된 반점의 수가 증가하여 시냅스전과 시냅스후가 융합됨을 알 수 있다. 도19a, 19b 및 19c에서, FB-16, FB-20 및 FB-28 펩티드(각 펩타이드에 대해 60nM)에서 유사한 결과가 관찰되었다.

추가로, 생체내 신경돌기 성장에 대한 상기 효과를 확인하기 위해, APP/PS1 마우스(알츠하이머 마우스 모델)를 사용하였다. APP/PS1 마우스는 출생 후 4개월에 해마의 CA1에서 시냅스 손실을 나타내며 SYP 및 PSD95와 같은 시냅스 전 및 시냅스 후 마커에 대해 공동 표지된 반점에서 50% 감소됨을 확인하였다(Hong et al., Science 352(6286): 712-716 (2016년 5월) 참조). 이러한 시냅스 손실 및 뉴런 손실은 공간 학습 및 기억 능력의 장애와 관련이 있을 가능성이 높다(Yoshiyama et al., Neuron 53: 337-351 (2007) 참조). 해마의 CA1은 EC에서 해마로 가는 입력의 주요 목적지이다. EC의 정보는 두 가지 주요 경로를 통해 CA1에 도달한다. 이 중 한 경로는 EC에서 CA1까지의 직접 천공 경로이고, 다른 경로는 EC에서 이랑(gyrus)(1차 시냅스), CA3(2차 시냅스), CA1(3차 시냅스)까지 삼중결합 회로를 사용하는 간접 경로이다. 따라서, LRRC4B(453-576) 단백질 단편(LRRC4B 단백질의 FAM19A5 결합 도메인 포함)의 투여가 해마, 특히 CA1 및 CA3 영역의 시냅스 연결에 어떠한 영향을 미치는지 조사하였다. 간단히, APP/PS1 마우스를 (i) 야생형 LRRC4B(서열번호 2의 아미노산 잔기 453-576) 단백질 단편(서열번호 7) 또는 (ii) 돌연변이 LRRC4B 단백질 단편(즉, 서열번호 2의 위치 488 및 489에서 알라닌 치환을 포함함)(서열번호 16)으로 처리하였다.

도16a-16c 및 17a-17c에 나타낸 바와 같이, 돌연변이 LRRC4B 단백질 단편으로 처리된 APP/PS1 마우스와 비교하여, 야생형 LRRC4B 단백질 단편으로 처리된 APP/PS1 마우스는 마우스의 CA1 및 CA3에서 증가된 SYP 및 PSD95 면역반응성을 나타내었다. 수준은 처리되지 않은 정상 동물("Cont")에서 관찰된 것과 유사하였다.

종합적으로, 상기 결과는 LRRC4 단백질 패밀리 멤버의 코어 결합 도메인을 포함하는 임의의 펩티드가 FAM19A5에 대한 디코이 수용체 역할을 할 수 있고, 따라서 활성(예컨대, LRRC4 단백질 패밀리 멤버의 신경돌기 생성 및 시냅스 형성)에 대한 FAM19A5 단백질의 억제 효과를 방해한다.

실시예 9: 슈로딩거 플랫폼을 사용한 FAM19A5-LRRC4 패밀리 컴플렉스의 인실리코 잔류물 스캐닝

FAM19A5 단백질과 LRRC4 패밀리 멤버 간의 상호작용에서 역할을 하는 잔기를 더욱 특성화하기 위해, SCHRODINGER BIOLUMINATE　를 사용하여 FAM19A5-LRRC4 패밀리 멤버 복합체의 모든 단일 비알라닌 잔기에서 인실리코(in silico) 알라닌 스캐닝을 수행하였고, Gibbs 자유 에너지의 변화는 각 아미노산 잔기에 대한 결합 친화도를 나타내도록 확인되었다. 구체적으로, FAM19A5 결합 도메인을 포함하는 LRRC4B 단백질의 단편인 FB-20(즉, GYTYFTTVTVETLETQPGEE; 서열번호 18)의 모든 비알라닌 잔기가 알라닌으로 돌연변이되었다. 상이한 FB-20 펩티드 변이체에 대한 서열은 표 11(아래)에 제공된다.

펩티드	아미노산 서열
FB-20 (G1A) (서열번호 103)	AYTYFTTVTVETLETQPGEE
FB-20 (Y2A) (서열번호 78)	GATYFTTVTVETLETQPGEE
FB-20 (T3A) (서열번호 79)	GYAYFTTVTVETLETQPGEE
FB-20 (Y4A) (서열번호 80)	GYTAFTTVTVETLETQPGEE
FB-20 (F5A) (서열번호 81)	GYTYATTVTVETLETQPGEE
FB-20 (T6A) (서열번호 82)	GYTYFATVTVETLETQPGEE
FB-20 (T7A) (서열번호 83)	GYTYFTAVTVETLETQPGEE
FB-20 (V8A) (서열번호 84)	GYTYFTTATVETLETQPGEE
FB-20 (T9A) (서열번호 85)	GYTYFTTVAVETLETQPGEE
FB-20 (V10A) (서열번호 86)	GYTYFTTVTAETLETQPGEE
FB-20 (E11A) (서열번호 87)	GYTYFTTVTVATLETQPGEE
FB-20 (T12A) (서열번호 88)	GYTYFTTVTVEALETQPGEE
FB-20 (L13A) (서열번호 89)	GYTYFTTVTVETAETQPGEE
FB-20 (E14A) (서열번호 90)	GYTYFTTVTVETLATQPGEE
FB-20 (T15A) (서열번호 117)	GYTYFTTVTVETLEAQPGEE
FB-20 (Q16A) (서열번호 118)	GYTYFTTVTVETLETAPGEE
FB-20 (P17A) (서열번호 119)	GYTYFTTVTVETLETQAGEE
FB-20 (G18A) (서열번호 120)	GYTYFTTVTVETLETQPAEE
FB-20 (E19A) (서열번호 121)	GYTYFTTVTVETLETQPGAE
FB-20 (E20A) (서열번호 122)	GYTYFTTVTVETLETQPGEA

FB-20 펩티드 변이체 단백질 서열

도21a(및 이전 데이터와 일치 - 예를 들어, 실시예 7 참조)에 도시된 바와 같이, FB-20 펩티드 단편의 특정 잔기(예컨대, Y2에서 E11 잔기까지)는 FAM19A5 단백질과 LRRC4B 사이의 상호작용에서 중요한 것으로 보였다. 이는 이들 잔기에 알라닌 돌연변이가 도입되면 자유 에너지 변화가 크게 증가하기 때문이다. 유사하게, 특정 잔기(예컨대, T12 및 L13 잔기)는 이러한 잔기의 알라닌 치환이 단백질-펩티드 결합 친화도를 크게 변경하지 않았기 때문에 최소한의 역할을 하는 것으로 보인다.

다음으로, FB-20 펩티드 단편의 결합 친화도가 개선될 수 있는지 여부를 평가하기 위해, T12 및 L13 잔기(FAM19A5 단백질과 LRRC4B 사이의 상호작용에서 최소한의 역할을 하는 것으로 보임)를 다른 모든 가능한 아미노산으로 치환한 후, SCHRODINGER BIOLUMINATE　를 사용하여 결합 친화도를 확인하였다. 히스티딘은 양성자화 상태에서 세 가지 다른 분자 구조(HIP, HID 및 HIE로 약칭됨; HIP: +1 하전, δ- 및 ε-질소 양성자화; HID: 중성, δ-질소 양성자화, HIE: 중성, ε-질소 양성자화)를 가질 수 있기 때문에, 각 잔기는 21개의 다른 아미노산으로 치환될 수 있었다. 따라서, T12 및 L13 모두에 대한 이중 돌연변이는 441개의 돌연변이를 생성하였다. FAM19A5와 LRRC4B 사이의 결합 친화도를 향상시킬 것으로 예상되는 상위 20개의 FB-20 펩티드 이중 돌연변이체(T12 및 L13)에 대한 서열은 표12(아래)에 제공된다.

펩티드	아미노산 서열
FB-20 (T12P & L13Y) (i.e., P12Y13) (서열번호 123)	GYTYFTTVTVEPYETQPGEE
FB-20 (T12M & L13R) (i.e., M12R13) (서열번호 124)	GYTYFTTVTVEMRETQPGEE
FB-20 (T12I & L13F) (i.e., I12F13) (서열번호 125)	GYTYFTTVTVEIFETQPGEE
FB-20 (T12HID & L13F) (i.e., H12F13) (서열번호 126)	GYTYFTTVTVEHFETQPGEE
FB-20 (T12W & L13Y) (i.e., W12Y13) (서열번호 127)	GYTYFTTVTVEWYETQPGEE
FB-20 (T12Q & L13R) (i.e., Q12R13) (서열번호 128)	GYTYFTTVTVEQRETQPGEE
FB-20 (T12W & L13F) (i.e., W12F13) (서열번호 129)	GYTYFTTVTVEWFETQPGEE
FB-20 (T12E & L13R) (i.e., E12R13) (서열번호 130)	GYTYFTTVTVEERETQPGEE
FB-20 (T12D & L13Y) (i.e., D12Y13) (서열번호 131)	GYTYFTTVTVEDYETQPGEE
FB-20 (T12F & L13F) (i.e., F12F13) (서열번호 132)	GYTYFTTVTVEFFETQPGEE
FB-20 (T12HID & L13Y) (i.e., H12Y13) (서열번호 133)	GYTYFTTVTVEHYETQPGEE
FB-20 (T12M & L13M) (i.e., M12M13) (서열번호 134)	GYTYFTTVTVEMMETQPGEE
FB-20 (T12D & L13F) (i.e., D12F13) (서열번호 135)	GYTYFTTVTVEDFETQPGEE
FB-20 (T12D & L13I) (i.e., D12I13) (서열번호 136)	GYTYFTTVTVEDIETQPGEE
FB-20 (T12L & L13I) (i.e., L12I13) (서열번호 137)	GYTYFTTVTVELIETQPGEE
FB-20 (T12E & L13I) (i.e., E12I13) (서열번호 138)	GYTYFTTVTVEEIETQPGEE
FB-20 (T12A & L13F) (i.e., A12F13) (서열번호 139)	GYTYFTTVTVEAFETQPGEE
FB-20 (T12HID & L13HIP) (i.e., H12H13) (서열번호 140)	GYTYFTTVTVEHHETQPGEE
FB-20 (T12P & L13F) (i.e., P12F13) (서열번호 141)	GYTYFTTVTVEPFETQPGEE
FB-20 (T12D & L13W) (i.e., D12W13) (서열번호 142)	GYTYFTTVTVEDWETQPGEE

T12 및/또는 L13 치환을 갖는 예시적인 FB-20 펩티드 단편에 대한 서열

도21b에 도시된 바와 같이, 특정 T12/L13 이중 돌연변이체(예컨대, T12P-L13Y 및 T12I-L13F)를 포함하는 LRRC4B 펩티드 단편은 FAM19A5 단백질에 대해 증가된 결합 친화성을 나타냈다.

상기 결과는 LRRC4B 펩티드 단편의 특정 아미노산 잔기(예컨대, Y2 내지 E11)가 FAM19A5 단백질에 결합하는 데 중요하다는 것을 추가로 확인한다. 상기 결과는 LRRC4B 펩티드 단편의 결합 친화도가 예컨대, 자연적으로 결합에서 중요한 역할을 담당하지 않는 아미노산 잔기를 돌연변이시킴으로써 개선될 수 있고, 이로써 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(LRRC4 단백질 패밀리 멤버의 FAM19A5 결합 도메인 포함) 및 FAM19A5 단백질 사이의 상호작용을 안정화시키는데 도움을 준다는 것을 추가로 입증한다.

실시예 10: 다양한 FB-21 펩티드 돌연변이체의 결합 친화도 분석

실시예 9에 제공된 인 실리코 분석은 특정 T12 및 L13 이중 돌연변이체가 FAM19A5 단백질에 대한 본 발명의 폴리펩티드의 결합 친화도를 개선하는데 중요할 수 있음을 강조하였다. 따라서, 야생형 FB-21 펩티드(FB-21 펩티드가 C-말단에 알라닌을 추가로 함유한다는 점을 제외하고는 본 명세서에 기술된 FB-20 펩티드와 동일함) 및 여러 FB-21 돌연변이체의 능력 hFc-융합 hLRRC4B 및 FAM19A5 복합체 형성에 대한 억제제 효과에 대해 시험하였다. 구체적으로, 시험된 상이한 FB-21 펩티드 단편에 대한 서열은 표13(아래)에 제공된다. 간단히, 플레이트를 100nM의 LRRC4B(453-576, TT/TT)-hFc로 코팅한 다음 1ng/mL의 rFAM19A5를 37℃에서 다양한 FB-21 펩타이드 단편의 농도(0.03, 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30, 100, 300 및 1000nM)를 증가시키면서 배양하였다. LRRC4B-결합된 FAM19A5 농도는 HRP-결합된 1-65 항체를 사용하여 측정되었다.

펩티드	아미노산 서열
FB-21 (야생형) (서열번호 143)	GYTYFTTVTVETLETQPGEEA
FB-21 (P12Y13) (서열번호 144)	GYTYFTTVTVEPYETQPGEEA
FB-21 (H12F13) (서열번호 145)	GYTYFTTVTVEHFETQPGEEA
FB-21 (Q12R13) (서열번호 146)	GYTYFTTVTVEQRETQPGEEA
FB-21 (W12Y13) (서열번호 147)	GYTYFTTVTVEWYETQPGEEA
FB-21 (M12R13) (서열번호 148)	GYTYFTTVTVEMRETQPGEEA
FB-21 (I12F13) (서열번호 149)	GYTYFTTVTVEIFETQPGEEA

예시적인 FB-21 펩티드 단편의 서열

도22a(및 실시예 9에 제공된 데이터와 일치)에 도시된 바와 같이, 시험된 FB-21 펩티드 돌연변이체 중 몇몇은 hFc-융합 hLRRC4B 단백질과 FAM19A5 단백질 사이의 상호작용을 억제할 수 있었다(억제의 IC50에 대해서는 표14 참조). 예를 들어, FB-21(W12Y13) 돌연변이가 LRRC4B-FAM19A5 복합체를 분리하는 능력은 야생형 FB-21과 비교하여 2.9배 증가하였다.

펩티드	IC50 (nM)
FB-21 (야생형) (서열번호 143)	11.9
FB-21 (P12Y13) (서열번호 144)	39
FB-21 (H12F13) (서열번호 145)	9.8
FB-21 (Q12R13) (서열번호 146)	39.9
FB-21 (W12Y13) (서열번호 147)	4.1
FB-21 (M12R13) (서열번호 148)	47.9
FB-21 (I12F13) (서열번호 149)	9.9

인간 LRRC4B 단백질과 재조합 FAM19A5 단백질(1ng/mL) 사이의 복합 제형에 대한 억제(IC50)

FB-21 돌연변이체의 억제 효과를 추가로 평가하기 위해, 실시예 9에 기술된 추가 FB-21 돌연변이체의 능력을 FAM19A5 단백질과 LRRC4B 단백질 사이의 상호작용을 억제하는 능력에 대해 시험하였다. 간단히, 플레이트를 100nM의 His-TEV LRRC4B로 코팅한 다음 1ng/mL의 rFAM19A5를 증가하는 농도(0.3, 1, 3, 10, 30 , 100, 300, 1000, 3000 및 10000nM)의 FB-21 펩티드 단편의 존재하에, 37℃에서 배양하였다. LRRC4B-결합된 FAM19A5 농도는 HRP-결합된 1-65 SS01 항체를 사용하여 측정되었다. 도22b에 나타낸 바와 같이(IC50에 대해서는 표15 참조), FB-21 돌연변이의 대부분(전부는 아님)이 LRRC4B와 재조합 FAM19A5 단백질 간의 상호작용을 억제하는 능력이 개선되었다. 예를 들어, FB-21(D12Y13) 돌연변이는 FB-21 및 FB-21(W12Y13) 각각에 비교하여, LRRC4B-FAM19A5 복합체 형성을 해리하는 데 2.4배 및 7배 더 효과적이었다.

펩티드	IC50 (nM)
FB-21 (야생형) (서열번호 143)	138.1
FB-21 (W12Y13) (서열번호 147)	46.7
FB-21 (D12Y13) (서열번호 131)	19.2
FB-21 (F12F13) (서열번호 132)	31.5
FB-21 (H12Y13) (서열번호 133)	39.6
FB-21 (D12F13) (서열번호 135)	21.2
FB-21 (D12I13) (서열번호 136)	21.8

항-FAM19A5 항체와 재조합 FAM19A5 단백질(1ng/mL) 사이의 복합 제형에 대한 억제(IC50)

다음으로, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드의 다른 특성(예컨대, 용해도, 프로테아제 및 펩티다아제로부터의 분해 방지, 및 생체내 투여)이 개선될 수 있는지 여부를 평가하기 위해, 다음의 추가 FB-21 펩티드 돌연변이체를 구성하고 FAM19A5 단백질과 LRRC4B 간의 상호작용을 억제하는 능력에 대해 시험하였다: (1) d-형 FB-21 펩티드("dFB-21"), (2) 막곁(JM) 서열을 갖는 d-형 FB-21 펩티드("dFB-JM-31"), (3) 서열의 각 말단에 BBB 침투 서열을 갖는 d-형 FB-21 펩티드("dFB-BBB-39"), 및 (4) DY 교체 및 추가 JM 서열을 갖는 d-형 FB-21 돌연변이 펩티드("dFB-DY-JM31"). d-형 FB-21 펩티드에 대한 서열은 서열번호 153(nYTYFTTVTVETLETQPGEEa; 소문자 아미노산은 아미노산의 D-형을 나타내고, 대문자 아미노산은 아미노산의 L-형을 나타냄)에 제시되어 있다. dFB-BBB-39에 대한 서열은 서열번호 154(nYTYFTTVTVETLETQPGEEALRKLRKRLLLRKLRKRLl; 소문자 아미노산은 아미노산의 D-형태를 나타내고, 대문자 아미노산은 아미노산의 L-형태를 나타냄)에 제시되어 있다. dFB-JM-31에 대한 서열은 서열번호 155(nYTYFTTVTVETLETQPGEEALDEVMKTTKa; 소문자 아미노산은 아미노산의 D-형을 나타내고, 대문자 아미노산은 아미노산의 L-형을 나타냄)에 제시되어 있다. dFB-DY-JM31에 대한 서열은 서열번호 156(nYTYFTTVTVEDYETQPGEEALDEVMKTTKa; 소문자 아미노산은 아미노산의 D-형태를 나타내고, 대문자 아미노산은 아미노산의 L-형태를 나타낸다)에 제시되어 있다. dFB-DY-JM31에 대한 서열은 서열번호 156(nYTYFTTVTVEDYETQPGEEALDEVMKTTKa; 소문자 아미노산은 아미노산의 D-형태를 나타내고, 대문자 아미노산은 아미노산의 L-형태를 나타냄)에 제시되어 있다. 전반적인 실험 방법은 위에서 설명한 것과 동일하였다. 도22d에 나타낸 바와 같이, JM 서열은 LRRC4 패밀리 유전자의 막곁 영역에서 보존된 모티프이다. 도22c에 나타난 바와 같이, T12L13에서 D12Y13으로 치환된 돌연변이 펩티드를 포함하는 JM-모티프를 포함하는 FB-21은 야생형 FB-21에 비해 복합체 형성을 4배 더 억제하는 데 효과적이었다.

상기 결과는 본 명세서에 기술된 특정 변형(예컨대, LRRC4 패밀리 멤버의 FAM19A5 결합 도메인의 T12 및 L13 잔기에서의 아미노산 치환; 및 LRRC4 패밀리 멤버의 막곁 모티프의 추가)이 FAM19A5 단백질과 LRRC4 단백질 패밀리 멤버 사이의 상호작용을 억제하는 본 발명의 폴리펩타이드 활성을 향상시킨다.

실시예 11: LRRC4 단백질 패밀리 멤버의 FAM19A5 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드가 아밀로이드 베타-유도된 시냅스 손실에 미치는 영향

알츠하이머병(AD)은 아밀로이드-β(Aβ)의 대사이상증과 밀접한 관련이 있다. 본 명세서에 제공된 폴리펩티드(즉, LRRC4 단백질 패밀리 멤버의 FAM19A5 결합 도메인 포함)가 AD에 대한 임의의 치료 효과를 가질 수 있는지 여부를 평가하기 위해, 독성 Aβ 올리고머에 의해 유도된 시냅스의 변형에 대한 본 명세서에 기술된 다양한 FB-21 펩티드 단편의 효과 및 이후의 구조적 회복을 평가하였다. 구체적으로, 다음의 FB-21 펩티드 단편을 시험하였다: FB-21, FB-JM-31 및 FB-BBB-39(실시예 10 참조).

도23b에 도시된 바와 같이, 독성 Aβ 올리고머와 공동-처리된 경우 PSD95 및 시냅토파이신에 대한 동국화 복셀이 JM 서열을 갖는 유일한 FB 펩티드를 처리 시 유의미하게 중가하는 것을 확인할 수 있다. 하지만, PSD95 및 시냅토파이신 강도에 있어서는 유의한 변화가 관찰되지 않았다(도23c 및 23d 참조). 이들 결과는 독성 Aβ 올리고머에 대한 본 명세서에 제공된 폴리펩티드(즉, LRRC4 단백질 패밀리 멤버의 FAM19A5 결합 도메인 포함)의 구조적 보존 및 신경보호 특성을 강조한다.

실시예 12: 신경돌기 성장에 대한 LRRC4 단백질 패밀리 멤버의 FAM19A5 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드의 효과

척수 손상(spinal cord injury, SCI)은 척수가 담당하는 신체 부위에서 운동 및/또는 감각 및/또는 자율 기능의 일시적 또는 영구적 변화를 유발하는 부상 수준 이하의 척수 손상이다. 대부분의 경우 손상은 낙상, 자동차 사고 또는 스포츠 부상과 같은 신체적 외상으로 인해 발생하지만 감염이나 종양과 같은 비외상적 원인으로 인해 발생할 수도 있다. SCI와 같은 손상 후 운동 뉴런의 재생 능력을 평가하기 위해, 척추 운동 뉴런에 대한 본 명세서에 기술된 폴리펩티드의 치료 효과를 평가하였다. 간단히, 생후 1일에 샘플링된 마우스 척수 운동 뉴런을 1 및 2 DIV에서 10nM의 FB-21 펩티드 단편(dFB-dWY-JM31 및 dFB-DY-JM31)으로 처리하고 3 DIV에서 Tau-5 항체로 면역염색하였다. 비처리 세포("NT")를 대조군으로 사용하였다.

도24a 및 24b에 나타낸 바와 같이, 본 명세서에 기술된 LRRC4B 펩티드 단편으로 처리된 SCI-유도 마우스에서, 척수 운동 뉴런의 전체 신경돌기 길이의 증가가 관찰되었다. 이러한 결과는 SCI의 치료에 대해 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(즉, LRRC4 단백질 패밀리 멤버의 FAM19A5 결합 도메인 포함)의 치료 가능성을 더욱 강조한다.

실시예 13: 6-OHDA 유도 세포 사멸에 대한 LRRC4 단백질 패밀리 멤버의 FAM19A5 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드의 효과

파킨슨병(Parkinson's disease, PD)은 주로 도파민성 뉴런의 변성을 통해 운동 시스템에 영향을 미치는 중추 신경계의 장기 퇴행성 장애이다. PD에 대한 가능한 신경-보호 능력을 평가하기 위해, 도파민성 뉴런(종종 PD에서 보임)의 신경변성 및 세포 사멸에 대한 본 명세서에 기술된 폴리펩티드의 효과를 평가하였다. 간단히, 런드 인간 중뇌(Lund human mesencephalic, LUHMES) 세포를 도파민 작동성 뉴런으로 분화시키고 6-OHDA(도파민 작동성 뉴런의 PD 유사 변성을 유도하는 공지된 신경독소)을 단독 또는 FB-21 펩티드 단편(dFB-dWY-JM31)의 다양한 투여량(10, 30 및 100 nM)과 조합하여 12시간 동안 처리하였다. 일부 LUHMES 세포를 FB-21 펩티드 단편만으로 처리하였다(즉, 6-OHDA 처리 없음). 그 후, CellTiter-Glo assay를 이용하여 발광 발현을 측정하였다.

도25에 나타낸 바와 같이, FB-21 펩티드(dFB-dWY-JM31)와 6-OHDA의 처리는 LUHMES 세포 생존력의 용량-의존적 역전을 나타냈으며, 이는 본 명세서에 기술된 폴리펩티드(즉, LRRC4 단백질 패밀리 멤버의 FAM19A5 결합 도메인을 포함함)의 PD 치료를 위한 새로운 치료제로서의 잠재적 용도를 강조하였다.

실시예 14: 신경병성 통증에 대한 LRRC4 단백질 패밀리 멤버의 FAM19A5 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드의 효과

신경병성 통증은 말초 및 중추 신경계의 신경 손상 또는 부상에 의해 유발되는 난치성 질환이다. 통증은 일반적으로 작열감으로 묘사되며 영향을 받는 부위는 종종 접촉에 민감하다. 신경병증 상태 하에서 본 명세서에 기재된 폴리펩티드의 진통(analgesic) 효과를 평가하기 위해, 만성 압박 손상(chronic constriction injury, CCI) 동물 모델을 사용하였다. 간단히, CCI 유도 후, 동물에게 비히클 또는 50㎍의 FB-21 펩티드 변이체(dFB-dDY-JM31)를 매주 2회, 5회 경막내(intrathecally) 주사하였다. 그 다음, 기계적 이질통(allodymia)을 CCI 유도 후 8, 11, 15 및 18일에 Von Frey test로 측정하였다.

도26a에 나타낸 바와 같이, FB-21 펩티드 단편(dFB-dDY-JM31)으로 처리된 CCI-유도된 래트에서, 비히클 그룹과 비교하여 평가된 모든 시점에서 증가된 발 회피 역치(PWT)가 있었다. 처리된 동물과 대조군 동물 사이의 현저한 차이는 전체 결과가 곡선 아래 면적(AUC)으로 변환되었을 때 훨씬 더 명확하였다(도26b 참조). 이들 결과는 본 명세서에 제공된 폴리펩티드(예컨대, dFB-dDY-JM31)의 투여가 CCI에 의해 유도된 기계적 이질통을 회복시키는데 유용할 수 있음을 입증하며, 이는 진통제로서의 잠재적 용도를 강조한다.

실시예 15: LRRC4 단백질 패밀리 멤버의 FAM19A5 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드의 망막 기능 장애 및 신경 진동의 조절에 미치는 영향

망막 기능 장애(retinal dysfunction)(예컨대, 당뇨병성 망막병증(DR)에 의해 유도됨)에 대한 본 명세서에서 제공된 폴리펩티드(즉, LRRC4 단백질 패밀리 멤버의 FAM19A5 결합 도메인 포함)의 치료 효과를 평가하기 위해, 양극성 세포(bipolar cell) 및 뮬러 세포(Muller cell)-관련 b-파의 진폭이 망막전위도(electroretinogram, ERG) 검사를 통해 형질전환 당뇨병 모델 마우스(db/db)에서 측정되었다. 비히클 또는 10㎍의 dFB-dDY-JM31을 12주에서 18주까지 유리체내(intravitreal, ivt) 주사를 통해 매주 처리하였다.

도27에 나타난 바와 같이, db/db 대조군 동물은 야생형 한배새끼(db/+)에 비해 유의하게 감소된 B파 진폭을 나타내었다. 그러나 db/db 대조군 동물에 FB-21 펩티드 단편(dFB-dWY-JM31)을 처리한 경우 B-파의 진폭이 크게 증가하였다. 이러한 결과는 DR에 의해 유도된 것을 포함하는 망막 기능장애에 대한 본 발명의 폴리펩티드(즉, LRRC4 단백질 패밀리 멤버의 FAM19A5 결합 도메인 포함)의 치료 가능성을 강조한다.

실시예 16: LRRC4 단백질 패밀리 멤버의 FAM19A5 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드가 외상성 뇌 손상으로 인한 뇌 손상에 미치는 영향

본 명세서에 기술된 폴리펩티드의 치료 효과를 추가로 평가하기 위해, 외상성 뇌 손상(traumatic brain injury)(즉, 저온 유발 TBI)의 마우스 모델을 사용하였다. TBI-유도 약 24시간 후, 비히클 대조군 또는 dFB-dWY-JM31 펩티드(100㎍)로 상기 동물을 치료하였다(비강내 투여를 통해). 그 후, 치료 약 투여 24시간 후 뇌 조직을 채취하여 Hoechst로 염색하였다.

도28에 나타낸 바와 같이, TBI-대조군 동물(즉, TBI 유도 후 비히클 대조군으로 처리됨)비교하여, FB-21 펩티드 단편으로 처리된 TBI 동물은 병변 부피가 상당히 감소된 것으로 나타났다. 이들 결과는 본 발명의 폴리펩티드(예컨대, dFB-dWY-JM31)가 TBI에 의해 유도된 뇌 병변 크기를 감소시킬 수 있음을 입증하고, TBI에 대한 치료제로서의 가능성을 나타낸다.

실시예 17: 방법 및 물질

본 명세서에 제공된 예(상기 참조)는 하기 방법 중 하나 이상을 사용한다:

Aβ42 제조

Aβ42(#20276) 펩티드는 AnaSpec(Fremont, USA)에서 구입하였다. Aβ42 펩티드의 동결건조된 분취량(1mg)을 80μl의 1% NH₄OH에 용해한 다음 920μl의 멸균 인산완충식염수(PBS)에 용해하여 농도 1mg/ml의 원액을 얻었다(100μl 분취량으로 -20℃로 보관됨). 작업 Aβ 용액은 Neurobasal 배지(Gibco, Life Technologies, USA)에서 보관 농도를 100nM 최종 Aβ 펩티드 농도로 희석하여 처리 하루 전에 제조하였다. 작업 용액을 4℃에서 24시간 동안 인큐베이션하여 문헌(Zheng et al., Amyloid 20(1): 13-20 (2013), 해당 문헌의 전체 내용이 본 명세서에 참조로 통합됨)에 기술된 바와 같이 올리고머 상태를 얻었다. 사용 당일 작업 용액을 14000g, 4℃, 10분 동안 원심분리하여 피브릴로부터 올리고머 Aβ 분획을 정제하였다.

1차 해마 신경 세포 배양

문헌(Beaudoin et al., Nature protocols 7(9): 1741-1754 (2012), 해당 문헌의 전체 내용이 본 명세서에 참조로 통합됨)에 기술된 바와 같이 C57BL/6(Nara Biotech, Seoul, Korea)의 출생 후 새끼(출생 1일)로부터 1차 해마 뉴런을 준비하였다. 간단히, 피질을 행크 완충염 용액(HBSS)(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에서 해부하고 37℃에서 15분 동안 2.5% 트립신으로 분해하였다. 상등액을 제거하고 조직을 HBSS로 세척하였다. 조직을 부드럽게 분쇄하고, 해리된 세포를 0.5% 포도당, 1mM 피루브산, 1.2mM L-글루타민 및 12% 태아 소 혈청이 보충된 최소 이글 배지(minimum Eagle's medium, MEM)에서 60mm 배양 접시의 폴리-D-라이신이 코팅된 유리 커버슬립에 접시당 8×10⁵개 세포로 시딩하였다. 플레이팅 6시간 후, 배지를 2% B-27 및 0.5mM L-글루타민이 보충된 Neurobasal 배지(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)로 교체하였다. 세포는 5% CO₂-humified 인큐베이터에서 37℃로 유지되었다. Neurobasal 배지는 3-4일마다 절반씩 교체되었다.

1차 척추 운동 뉴런 배양

문헌(Eldeiry et al., JoVE (Journal of Visualized Expeirments) 125: 255856 (2017), 해당 문헌의 전체 내용이 본 명세서에 참조로 통합됨)에 의해 이전에 기술된 바와 같이 C57BL/6(Nara Biotech, Seoul, Korea)의 출생 후 새끼(출생 1일)로부터 1차 척수 운동 뉴런을 준비하였다. 간단히, 척수를 Dulbecco's 인산완충식염수(phosphate-buffered saline, DPBS)(Gibco, Life Technologies, USA)에서 해부하였고, 파파인(papain)(2.5mg/ml)으로 30℃에서 30분 동안 소화시켰다. 상층액을 원심분리하여 제거하고 조직을 2% B-27 및 0.5mM L-글루타민이 보충된 Hibernate A(Gibco, Life Technologies, USA)로 세척하였다. 조직을 부드럽게 분쇄하고, 해리된 세포를 2% B-27 및 0.5mM L-글루타민으로 보충된 Neurobasal 배지(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에서, 12-웰 플레이트에 폴리-D-라이신 및 라미닌(Thermofisher scientific, USA)이 코팅된 유리 커버슬립에 웰당 3×10⁵개 세포로 시딩하였다. 세포는 5% CO₂-humified 인큐베이터에서 37℃로 유지되었다.

면역염색

1차 뉴런은 적절한 DIV에서 4% 파라포름알데히드(PFA)로 고정되었다. 상기 세포를 실온에서 1시간 동안 PBS(phosphate-buffered saline) 중 3% 소 혈청 알부민(BSA) 및 0.1% Triton X-100으로 차단하였다. 그 후, 1차 항체를 4℃에서 밤새 세포에 처리하였다. 본 연구에 사용된 1차 항체는 마우스 항-Tau5(Invitrogen, California, United States), 토끼 항-PSD95(Invitrogen) 및 마우스 항-시냅토파이신(Sigma)이었다. PBS로 여러 번 세척한 후 적당한 형광 결합 2차 항체를 Hoechst 33342(Invitrogen)와 함께 실온에서 30분 동안 처리하였다. 이어서, 공초점 현미경(Leica, Wetzlar, Germany)을 사용하여 세포 이미지를 얻었다.

시냅스생성(Synaptogenesis)의 정량 분석

해마 뉴런을 14, 17 및 20 DIV에서 6.6 nM FB-21, 6.6 nM FB-13-JM 및 6.6 nM FB-13-BBBX2로 처리하여 SYP, 시냅스 전 마커 단백질 및 PSD95, 시냅스 후 마커 단백질을 면역염색하여 21 DIV에서 시냅스 생성 수준을 확인하였다. SYN 및 PSD95의 형광 강도와 SYN 및 PSD95 신호 사이의 동국화 복셀 수를 정량화하기 위해 IMARIS 소프트웨어(IMARIS9.0, Bitplane AG, Zurich, Switzerland)를 사용하여 깊이 3μm의 z-stack 공초점 이미지를 3D 이미지로 변환하였다. IMARIS 소프트웨어의 "서피스 툴(Surface tool)"은 신경 세포체에서 검출된 모든 신호를 제외하기 위해 사용되었고, 신경돌기에서 SYN과 PSD95 신호 사이의 동국화 복셀의 수는 "콜록 툴(Coloc tool)"을 사용하여 계산되었다. 그 후, 신경돌기에서 SYN 및 PSD95에 대한 총 형광 강도를 얻었다.

신경돌기 성장의 정량 분석

마우스 해마 뉴런을 1 및 2 DIV에서 LRRC4B 펩티드로 처리하여 신경돌기 성장을 측정하였다. 총 신경돌기 길이, 1차 및 2차 신경돌기의 수인 3가지 다른 매개변수를 사용하여 측정하였다. 뉴런을 3 DIV에서 베타-튜불린 III로 염색한 후 Fiji(Image J, NIH, Bethesda)를 사용하여 신경돌기 길이와 분기점을 측정하였다. 개별 뉴런을 손으로 선택하고 이러한 매개변수를 단순 신경돌기 트레이서 플러그인(Simple neurite tracer plugin)을 사용하여 계산하였다. 생후 1일에 샘플링된 마우스 척수 운동 뉴런을 1 및 2 DIV에서 10 nM의 NS101 및 LRRC4B-펩티드(dFB-dWY-JM31 및 dFB-DY-JM31)로 처리하고 3 DIV에서 Tau-5 항체로 면역염색하였다. 총 신경돌기 길이와 이미지의 세포체(soma) 수는 Neurphology Image J 플러그인으로 측정하였다.

LUHMES 세포 배양 및 분화

문헌(Harischandra et al., Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Basis of Disease 1866(4): 165533 (2020), 해당 문헌의 전체 내용이 본 명세서에 참조로 통합됨)에 이전에 기술되어 있는 바와 같이, LUHMES 인간 뉴런 전구체 세포는 ATCC(CRL 2927)로부터 얻었다. 간단하게, 플라스틱 배양 플레이트를 50μg/mL 폴리-1-오르니틴(Sigma Aldrich)으로 밤새 미리 코팅하고, 배양이 끝날 때 세포 배양 등급 물(Invitrogen)로 2회 세척한 다음, 밤새 피브로넥틴(Sigma) 1μg/mL로 배양하였다. 세포는 Advanced Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)/F12, N-2 보충제(1x), 2mM L-글루타민 및 40ng/mL 재조합 기본 섬유아세포 성장인자(bFGF)(Sigma)로 구성된 증식 배지를 사용하여 37℃로 유지되는 CO₂ 인큐베이터내에서 증식되었다. 증식 동안, 배지의 절반을 격일로 교체하고 세포를 0.025% 트립신으로 효소적으로 해리하고 배양이 80% 컨플루언시(confluency)에 도달했을 때 계대배양(subculture)하였다. 간단히, 3.5 x 10⁶ 세포를 증식 배지에서 미리 코팅된 T75 플라스크에 시딩하고 24시간 동안 배양하였다. 다음날 새로 준비한 분화 배지로 배지를 교체하고, 48시간 동안 배양하여 분화를 유도하였다. 분화 배지는 Advanced DMEM/F12, N-2 보충제(1x), 2mM L-글루타민, 1mM 디부티릴 cAMP, 1μg/mL 테트라사이클린 및 2ng/mL 재조합 인간 GDNF(R&D Systems)로 구성되었다. 48시간 배양 종료 시, 세포를 0.025% 트립신/EDTA로 분리하고 분화 배지에서 1.5 x 10⁵개 세포/cm²의 세포 밀도로 사전 코팅된 플레이트에 다시 플레이팅하였다. 일단 세포를 재플레이팅한 후 격일로 분화 배지를 교체하였고, 별도의 언급이 없는 한 모든 실험은 분화 5일째에 실시하였다.

세포 생존율의 정량 분석

분화된 LUHMES 세포를 10, 30, 100nM dFB-dWY-JM31로 처리하여 CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay(Promega)로 5μM 6-하이드록시도파민 하이드로브로마이드(Tocris)에 대한 세포 생존력 수준을 측정하였다. 세포 생존력 수준을 측정하기 위해, 각 웰에 존재하는 세포 배양 배지에 CellTiter-Glo 시약을 1:1 비율로 첨가하고 오비탈 쉐이커에서 내용물을 혼합하여 세포 용해를 유도하였다. 플레이트를 실온에서 10분 동안 인큐베이션하여 발광 신호를 안정화시키고 발광 신호를 마이크로플레이트 판독기(Synergy H1, Biotek)에서 판독하였다. 각 실험은 3회 반복 수행된다.

만성 압박 손상(chronic Constriction Injury. CCI)

CCI는 습관화 기간 동안 정상인 건강한 대상체에게 수행되었다. 첫 번째 수술 날짜는 Day 0으로 설정되었다. SD 쥐를 마취실에서 꺼내고 고정하였다. 포비돈(베타딘)과 70% 알코올로 수술 부위를 소독한 후, 왼쪽 하지 피부를 절개(피부 뒤 0.5cm, 대퇴부와 평행하게 약 3-4cm)하였다. 집게로 작은 구멍을 뚫고 그 구멍에 구부러진 바늘 꽂이를 삽입하여 좌골신경(sciatic nerve)과 둔부(dullness)를 분리했다. 현미경으로 관찰하면서 좌골신경 양쪽의 막(근막)을 집게로 잡고 미세가위로 절개하였다. 신경은 4-0 봉합사로 1mm 간격으로 3번 묶었다.

발 회피 역치(Paw Withdrawl Threshold, PWT) 측정

각각의 쥐는 적어도 30분 동안 시험 환경에서 길들여졌다. 50% 발 회피 역치(PWT)를 측정하기 위해, 0.4, 0.6, 1.0, 2.0, 4.0, 6.0, 8.0 및 15.0g의 von-frey 필라멘트를 사용하였다. 2.0g의 von-frey 필라멘트를 CCI 쥐의 뒷다리(hindlimb)에 4-5초 동안 적용하였다. 쥐가 증상(발을 들거나 경련)을 보이면 2.0g의 스케일 다운을 쥐에 적용하였다. 쥐가 어떠한 증상도 보이지 않을 때, 2.0g의 스케일 업을 쥐에 적용하였다. 이러한 방식으로, 결과적으로 0.4g 내지 15.0g의 본-프레이 필라멘트를 적용하였다. 변화된 반응이 발생한 시점(von-frey 필라멘트 2.0g부터 시작하여 반응하기 시작하거나 von-frey 필라멘트 2.0g부터 반응하지 않기 시작하는 시간)에 5배 더 많은 자극을 가하여 PWT를 얻는다.

당뇨망막병증(Diabetic Retinopathy) 마우스 모델에서 망막전위도(Electroretinogram, ERG) 측정(db/db)

당뇨병성 망막 신경변성의 평가를 위해, db/db 및 db/+ 마우스를 사용하였다(예를 들어, 해당 문헌의 전체 내용이 본 명세서에 참조로 통합된 Bogdanov et al., PLoS One 9(5): e97302 (2014)를 참조). ERG는 섬광에 반응하여 망막에서 방출되는 전기 신호를 측정하기 위해 기록되었다. 각 마우스는 International Society for Clinical Electrophysiology of Vision 표준에 따라 ERG를 시험하기 위해 안과 검사를 받았으며 각 마우스는 암실에서 12시간 동안 길들여졌다. 주사 후(6주 및 10주) 암순응 ERG를 시행하였다. b-파의 ERG 진폭을 측정하고 -0.9 log cd·sm^-2의 빛 강도에 의해 유도된 b-파를 그룹간 비교하였다. ERG 분석은 LabScribeERG(iWorx DataAcquisition Software) 프로그램을 사용하여 수행되었다.

콜드(Cold)-유도 외상성 뇌손상(Traumatic Brain Injury, TBI)

이소플루란(isoflurane) 흡입 노출로 마우스를 마취시킨 후, 각각의 마우스를 정위 장치(stereotaxic device)에 안정적으로 배치하였다. 정중선 두피에 3.0mm 절개를 하였다. 콜드-유도 TBI는 액체질소로 냉각(-80℃)된 구리 실린더 막대의 팁(2.5mm)을 오른쪽 정면 두개골에 45초 동안 적용하여 극저온 병변을 생성함으로써 실행되었다(예컨대, 해당 문헌의 전체 내용이 본 명세서에 참조로 통합된 Keskin et al., Neural regeneration research 12(5): 761-764 (2017)를 참조). 외상후 48시간 및 비강내 투여를 통한 비히클 또는 dFB-dWY-JM31 펩티드 주사 후 24시간에, 모든 동물을 심장 관류로 희생시켰다.

TBI 뇌 병변의 정량적 분석

외상을 입은 마우스의 뇌를 제거하고 뇌 전체에 걸쳐 총 8-9개의 연속적인 관상 절편(두께 20μm)으로 뇌 절편을 채취하여 Hoechst(ThermoFisher, Waltham, MA, USA)로 염색하였다. 손상된 및 손상되지 않은 영역의 경계는 Image J 소프트웨어 프로그램(NIH, Bethesda, MD, USA)으로 구분되었다. 손상 부위는 반대측(contralateral side)의 면적에서 병변이 없는 동측 반구(ipsilateral hemisphere)의 면적을 빼서 평가하였다. 부상의 부피는 이러한 병변 부위를 통합하여 계산되었다. 모든 8-9 단면을 개별적으로 측정하고 해당 부피를 계산하였다.

통계 분석

모든 통계 분석은 GraphPad Prism 5(GraphPad Software Inc., California, United States)를 사용하여 수행되었으며, 데이터는 평균±평균의 표준 오차(SEM)로 표시된다. 통계적 유의성은 Bonferroni 사후 테스트와 함께 스튜던트 t-테스트 및/또는 일원 분산 분석(ANOVA)을 사용하여 평가하였다. 0.05 미만의 p-값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.

요약 및 초록 섹션이 아니라 상세한 설명 섹션이 청구범위를 해석하는 데 사용되도록 의도됨을 이해해야 한다. 요약 및 초록 섹션은 발명자(들)에 의해 고려된 본 발명의 모든 예시적 측면이 아닌 하나 이상을 설명할 수 있으며, 따라서 어떤 방식으로든 본 발명 및 첨부된 청구범위를 제한하는 것은 아니다.

본 발명은 특정 기능 및 그 관계의 구현을 예시하는 기능적 빌딩 블록의 도움으로 상술되었다. 이러한 기능적 빌딩 블록의 경계는 설명의 편의를 위해 여기에서 임의로 정의되었다. 지정된 기능과 그 관계가 적절하게 수행되는 한 대체 경계를 정의할 수 있다.

특정 측면에 대한 전술한 설명은 다른 사람들이 과도한 실험 없이 이러한 특정 측면과 같은 다양한 적응을 위해 해당 기술 분야의 지식을 적용하여 쉽게 수정 및/또는 적응할 수 있도록 발명 내용의 일반적인 특성을 완전히 나타낼 것이다. 따라서, 본 발명의 일반적인 개념에서 벗어남이 없이, 그러한 적응 및 수정은 여기에 제시된 설명 및 지침에 기초하여 제시된 측면의 등가물의 의미 및 범위 내에 있는 것으로 의도된다. 본 명세서의 어법(phraseology) 또는 용어(terminology)는 설명을 위한 것이며 제한이 아닌 것으로 이해되어야 하며, 따라서 본 명세서의 어법 또는 용어는 설명 및 지침에 비추어 숙련된 기술자에 의해 해석되어야 한다.

본 발명의 폭과 범위는 전술한 예시적인 측면에 의해 제한되어서는 안 되며, 하기 청구범위 및 그 등가물에 따라서만 정의되어야 한다.

본 발명에 인용된 모든 간행물, 특허, 특허 출원, 인터넷 사이트 및 등록 번호/데이터베이스 서열(폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열 모두 포함)은 각각의 개별 간행물, 특허, 특허 출원, 인터넷 사이트 또는 수탁 번호/데이터베이스 시퀀스가 구체적이고 개별적으로 참조로 통합되도록 표시된 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로 통합된다.

Claims

서열 유사성 19를 가진 패밀리, 멤버 A5("FAM19A5") 단백질에 결합할 수 있는 류신 풍부 반복 함유 4("LRRC4") 단백질 패밀리 멤버의 도메인("FAM19A5 결합 도메인")을 포함하는, 구성되는, 또는 필수적으로 구성되는 분리 폴리펩티드로서, 상기 폴리펩티드는 해당 전장 LRRC4 단백질 패밀리 멤버(서열번호 4, 서열번호 5, 또는 서열번호 6) 보다 짧은 것을 특징으로 하는 분리 폴리펩티드.
제1항에 있어서, 상기 FAM19A5 결합 도메인은 약 10 내지 약 23개의 아미노산 길이인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제2항에 있어서, 상기 FAM19A5 결합 도메인은 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18, 약 19, 약 20, 약 21, 약 22, 또는 약 23개의 아미노산 길이인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제3항에 있어서, 상기 FAM19A5 결합 도메인은 약 10개의 아미노산 길이인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FAM19A5 결합 도메인은 FAM19A5 단백질과 LRRC4 단백질 패밀리 멤버 사이의 상호작용을 억제, 감소, 및/또는 해리할 수 있는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FAM19A5 결합 도메인은 하기 화학식을 갖는 아미노산 서열(N-말단에서 C-말단)을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드:
A-(T/S)-B (화학식 Ⅰ):
여기서, (i) A는 X1-(T/S)-(Y/F)-F-X5를 포함하고;
X1은 티로신(Y), 페닐알라닌(F), 발린(V), 류신(L), 또는 이소류신(I)이고;
(T/S)는 트레오닌(T), 또는 세린(S)이고;
(Y/F)는 티로신(Y) 또는 페닐알라닌(F)이고;
X5는 임의의 아미노산이고;
(ii) B는 (V/I)-T-V-(E/V)를 포함하고;
(V/I)는 발린(V) 또는 이소류신(I)이고;
(E/V)는 글루탐산(E) 또는 발린(V)이다.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FAM19A5 결합 도메인은 하기 화학식을 갖는 아미노산 서열(N-말단에서 C-말단)을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드:
A-(T/S)-B (화학식 I):
여기서, (i) A는 (Y/W/M)-(T/Y)-(Y/W)-(F/Y/W)-(T/Y)를 포함하고;
(Y/W/M)은 티로신(Y), 트립토판(W), 또는 메티오닌(M)이고;
(T/Y)는 트레오닌(T) 또는 티로신(Y)이고;
(Y/W)는 티로신(Y) 또는 트립토판(W)이고;
(F/Y/W)는 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 또는 트립토판(W)이고;
(ii) B는 X7-(T/S/Y)-X9-X10를 포함하고;
X7은 발린(V), 티로신(Y), 페닐알라닌(F), 류신(L), 트립토판(W), 또는 메티오닌(M)이고;
(T/S/Y)는 트레오닌(T), 세린(S), 또는 티로신(Y)이고;
X9는 발린(V), 이소류신(I), 티로신(Y), 페닐알라닌(F), 류신(L), 트립토판(W), 또는 메티오닌(M)이고;
X10은 글루탐산(E), 아스파르트산(D), 이소류신(I), 티로신(Y), 페닐알라닌(F), 메티오닌(M), 또는 트립토판(W)이다.
하기 화학식을 갖는 아미노산 서열(N-말단에서 C-말단)을 포함하는 분리 폴리펩티드로서,
X1-X2-X3-F-X5-T-X7-T-V-X10 (화학식 II):
여기서, X1은 Y, F, V, L, 또는 I이고;
X2는 T 또는 S이고;
X3은 Y 또는 F이고;
X5는 임의의 아미노산이고;
X7은 V 또는 I이고; 및/또는
X1O은 E 또는 V이고,
상기 폴리펩티드는 FAM19A5 단백질에 결합할 수 있고, 이에 의해 FAM19A5 단백질과 LRRC4 단백질 패밀리 멤버 사이의 상호작용을 억제, 감소 및/또는 해리할 수 있는 것을 특징으로 하는 분리 폴리펩티드.
하기 화학식의 아미노산 서열(N-말단에서 C-말단)을 포함하는 분리 폴리펩트드로서,
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10 (화학식 III):
여기서, X1은 Y, F, V, L, I, W, 또는 M이고;
X2는 T, S, 또는 Y이고;
X3은 Y, F, 또는 W이고;
X4는 F, Y, 또는 W이고;
X5는 임의의 아미노산, 예컨대, T, S, 또는 Y이고;
X6은 T, S, 또는 Y이고;
X7은 V, I, Y, F, L, W, 또는 M이고;
X8은 T, S, 또는 Y이고;
X9는 V, I, Y, F, L, W, 또는 M이고; 및/또는
X10은 E, D, V, I, Y, F, M, 또는 W이고,
상기 폴리펩티드는 FAM19A5 단백질에 결합할 수 있고, 이에 의해 FAM19A5 단백질과 LRRC4 단백질 패밀리 멤버 사이의 상호작용을 억제, 감소 및/또는 해리할 수 있는 것을 특징으로 하는 분리 폴리펩티드.
제9항에 있어서, X1은 Y, F, V, L 또는 I인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제9항 또는 제10항에 있어서, X2는 T 또는 S인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, X3는 Y 또는 F인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, X4는 F인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, X5는 T 또는 S인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, X6은 T인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제9항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, X7은 V 또는 I인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제9항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, X8은 T인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제9항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, X9는 V인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제9항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, X10은 E 또는 V인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 29(YTYFTTVTVE)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 29(YTYFTTVTVE)로 제시된 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 20 (NYSFFTTVTVETTEISPEDTTRK)으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 20 (NYSFFTTVTVETTEISPEDTTRK)으로 제시된 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 30(YSFFTTVTVE)으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 30(YSFFTTVTVE)으로 제시된 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 21 (NFSYFSTVTVETMEPSQDERTTR)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 21 (NFSYFSTVTVETMEPSQDERTTR)로 제시된 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 31(FSYFSTVTVE)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 31(FSYFSTVTVE)로 제시된 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 18 (GYTYFTTVTVETLETQPGEE)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 18 (GYTYFTTVTVETLETQPGEE)로 제시된 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제30항 또는 제31항에 있어서, 아미노산 잔기 T12 및 L13은 서열번호 18의 상응하는 잔기에 대해 변형(예컨대, 치환)되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제32항에 있어서, 서열번호 123-142 중 어느 하나로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제32항에 있어서, 서열번호 123-142 중 어느 하나로 제시된 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제30항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 잔기는 D-아미노산형인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 17(GYTYFTTVTVETLETQ)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 17(GYTYFTTVTVETLETQ)로 제시된 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 19 (GYTYFTTVTVETLETQPGEKEPPGPTTD)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 19 (GYTYFTTVTVETLETQPGEKEPPGPTTD)로 제시된 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 143 (GYTYFTTVTVETLETQPGEEA)으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 143 (GYTYFTTVTVETLETQPGEEA)으로 제시된 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제40항 또는 제41항에 있어서, 아미노산 잔기 T12 및 L13은 서열번호 143의 상응하는 잔기에 대해 변형(예컨대, 치환)되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제42항에 있어서, 서열번호 123-149 중 어느 하나로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제42항에 있어서, 서열번호 123-149 중 어느 하나로 제시된 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제8항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, X2에서 아미노산이 인산화 또는 O-글리코실화되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 모이어티(moiety)에 결합되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제46항에 있어서, 상기 모이어티는 하기 폴리펩티드의 특징들 중 하나 이상을 증가시킬 수 있는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드: (1) FAM19A5 단백질에 대한 결합 친화도, (2) 용해도, (3) 프로테아제 및/또는 펩티다아제로부터의 분해에 대한 저항성, (4) 생체내 투여에 대한 적합성, (5) FAM19A5-LRRC4 단백질 패밀리 멤버 상호작용을 억제하는 능력, 또는 (6) (1) 내지 (5)의 임의의 조합.
제46항 또는 제47항에 있어서, 상기 모이어티는 LRRC4 단백질 패밀리 멤버의 막곁(juxtra-membrane) 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제48항에 있어서, 상기 막곁은 서열번호 151(LDEVMKTTK) 또는 서열번호 152 (IDEVMKTTK)로 제시된 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제48항에 있어서, 상기 막곁은 서열번호 151(LDEVMKTTK) 또는 서열번호 152 (IDEVMKTTK)로 제시된 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
서열번호 29로 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99% 서열 일치를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 분리 폴리펩티드로서, 상기 아미노산 서열은 FAM19A5 단백질에 결합할 수 있고, 이에 의해 FAM19A5 단백질과 LRRC4 단백질 패밀리 멤버 사이의 상호작용을 억제, 감소 및/또는 해리할 수 있는 것을 특징으로 하는 분리 폴리펩티드.
서열번호 5, 서열번호 4, 또는 서열번호 6로 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 일치하고, 서열번호 5, 서열번호 4, 또는 서열번호 6에 제시된 아미노산 서열에 각각에 대해 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 분리 폴리펩티드로서, 상기 폴리펩티드는 FAM19A5 단백질에 결합할 수 있고, 이에 의해 FAM19A5 단백질과 LRRC4 단백질 패밀리 멤버 사이의 상호작용을 억제, 감소 및/또는 해리할 수 있는 것을 특징으로 하는 분리 폴리펩티드.
제52항에 있어서, 상기 적어도 하나의 아미노산 변형은 상기 FAM19A5 단백질에 상기 폴리펩티드의 결합을 증가시키는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제52항 또는 제53항에 있어서, 상기 적어도 하나의 아미노산 변형은 상기 폴리펩티드의 안정성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제53항 또는 제54항에 있어서, 결합 및/또는 안정성에서의 증가는 FAM19A5 단백질과 LRRC4 단백질 패밀리의 멤버 사이의 상호작용을 억제, 감소 및/또는 해리하는 폴리펩티드의 능력을 향상시키는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제55항에 있어서, FAM19A5 단백질과 LRRC4 단백질 패밀리의 멤버 사이의 상호작용을 억제, 감소 및/또는 해리하는 상기 폴리펩티드의 능력은 적어도 하나의 아미노산 변형이 없는 상응하는 폴리펩티드와 비교하여 적어도 약 0.5배, 적어도 약 1배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 20배, 적어도 약 30배, 적어도 약 40배, 또는 적어도 약 50배 증가되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제50항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 5의 위치 453에서 아미노산 잔기는 T 이거나 S 또는 Y로 변형되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제50항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 5의 위치 454에서 아미노산 잔기는 T 이거나 S 또는 Y로 변형되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제50항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 5의 위치 449에서 아미노산 잔기는 Y 이거나 F, V, L, I, W 또는 M으로 변형되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제50항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 5의 위치 450에서 아미노산 잔기는 T 이거나 S 또는 Y로 변형되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제50항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 5의 위치 451에서 아미노산 잔기는 Y 이거나 F 또는 W로 변형되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제50항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 5의 위치 452에서 아미노산 잔기는 F 이거나 Y 또는 W로 변형되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제50항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 5의 위치 455에서 아미노산 잔기는 V 이거나 I, Y, F, L, W 또는 M으로 변형되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제50항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 5의 위치 456에서 아미노산 잔기는 T 이거나 S 또는 Y로 변형되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제50항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 5의 위치 457에서 아미노산 잔기는 V 이거나 I, Y, F, L, W 또는 M으로 변형되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제50항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 5의 위치 458에서 아미노산 잔기는 E 이거나 D, V, I, Y, F, M 또는 W로 변형되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제50항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 잔기는 D-형인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제67항에 있어서, 상기 D-형 아미노산은 N-말단, C-말단, 또는 둘다인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제50항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 모이어티에 결합되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제69항에 있어서, 상기 모이어티는 하기 폴리펩티드의 특징들 중 하나 이상을 증가시킬 수 있는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드: (1) FAM19A5 단백질에 대한 결합 친화도, (2) 용해도, (3) 프로테아제 및/또는 펩티다아제로부터의 분해에 대한 저항성, (4) 생체내 투여에 대한 적합성, (5) FAM19A5-LRRC4 단백질 패밀리 멤버 상호작용을 억제하는 능력, 또는 (6) (1) 내지 (5)의 임의의 조합.
제69항 또는 제70항에 있어서, 상기 모이어티는 LRRC4 단백질 패밀리 멤버의 막곁 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제71항에 있어서, 상기 막곁은 서열번호 151(LDEVMKTTK) 또는 서열번호 152 (IDEVMKTTK)로 제시된 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제71항에 있어서, 상기 막곁은 서열번호 151(LDEVMKTTK) 또는 서열번호 152 (IDEVMKTTK)로 제시된 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제1항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LRRC4 단백질 패밀리 멤버의 막관통 도메인 및/또는 세포내 도메인을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제1항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FAM19A5 단백질에 결합하기 위해 LRRC4 단백질 패밀리의 멤버와 경쟁할 수 있는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제5항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LRRC4 단백질 패밀리의 멤버는 LRRC4 단백질, LRRC4B 단백질, LRRC4C 단백질 또는 이들의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제1항 내지 제76항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 포함하는 분자.
제77항에 있어서, 상기 폴리펩티드의 N-말단, 상기 폴리펩티드의 C-말단, 또는 상기 폴리펩티드의 N-말단과 C-말단 모두에서 하나 이상의 추가 아미노산을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 분자.
제78항에 있어서, 상기 하나 이상의 추가 아미노산은 친수성 아미노산인 것을 특징으로 하는 분자.
제78항 또는 제79항에 있어서, 상기 하나 이상의 추가 아미노산은 D-아미노산인 것을 특징으로 하는 분자.
제77항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드의 N-말단, C-말단 또는 N-말단과 C-말단 모두는 상기 폴리펩티드의 안정성을 증가시키는 변형을 포함하는 것을 특징으로 하는 분자.
제81항에 있어서, 상기 변형은 Fmoc, FEG화(PEGylation), 아세틸화(acetylation), 메틸화(methylation), 고리화(cyclization), 또는 이들의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 분자.
제77항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 융합 단백질인 것을 특징으로 하는 분자.
제77항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 반감기 연장 모이어티를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 분자.
제84항에 있어서, 상기 반감기 연장 모이어티는 Fc, 알부민, 알부민-결합 폴리펩티드, Pro/Ala/Ser(PAS), 인간융모성고나도트로핀(human chorionic gonadotropin)β서브유닛의 C-말단 펩티드(CTP), 폴리에틸렌글리콜(PEG), 아미노산의 긴 구조화되지 않은 친수성 서열(XTEN), 히드록시에틸 전분(HES), 알부민-결합 소분자 또는 이들의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 분자.
제77항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 약물 결합체인 것을 특징으로 하는 분자.
제1항 내지 제76항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 또는 제77항 내지 제86항 중 어느 한 항의 분자를 인코딩하는 핵산.
제87항에 있어서, DNA 또는 RNA인 것을 특징으로 하는 핵산.
제88항에 있어서, mRNA인 것을 특징으로 하는 핵산.
제87항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 유사체를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산.
제87항 내지 제90항 중 어느 한 항의 핵산을 포함하는 벡터.
제91항의 벡터를 포함하는 세포.
제제에 결합된 제1항 내지 제76항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 포함하는 단백질 결합체.
제1항 내지 제76항 중 어느 한 항의 폴리펩티드, 제77항 내지 제86항 중 어느 한 항의 분자, 제87항 내지 제90항 중 어느 한 항의 핵산, 제91항의 벡터, 제92항의 세포 또는 제93항의 단백질 결합체를 포함하는 조성물.
제94항에 있어서, 약제학적으로 허용가능한 담체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 내지 제76항 중 어느 한 항의 폴리펩티드, 제77항 내지 제86항 중 어느 한 항의 분자, 제87항 내지 제90항 중 어느 한 항의 핵산, 제91항의 벡터, 제92항의 세포, 제93항의 단백질 결합체, 또는 제94항 또는 제95항의 조성물 및 사용설명서를 포함하는 키트.
상기 폴리펩티드가 제조되는 적합한 조건 하에 제92항의 세포를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 FAM19A5 단백질과 LRRC4 단백질 패밀리 멤버 사이의 상호작용을 억제, 감소, 및/또는 해리할 수 있는 폴리펩티드의 제조 방법.
제97항에 있어서, 제조된 폴리펩티를 분리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
뉴런을 FAM19A5 단백질에 결합할 수 있는 LRRC4 단백질 패밀리 멤버의 엑토도메인 또는 이의 단편과 접촉시키는 단계를 포함하는, 뉴런에서 신경돌기 성장 및/또는 시냅스 형성을 증가시키는 방법.
제99항에 있어서, 상기 엑토도메인은 서열번호 4, 서열번호 5, 또는 서열번호 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제99항 또는 제100항에 있어서, 상기 이의 단편은 제1항 내지 제76항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
뉴런을 제 1항 내지 제 76항 중 어느 한 항의 폴리펩티드, 제 77항 내지 제 86항 중 어느 한 항의 분자, 제87항 내지 제90항의 핵산, 제91항의 벡터, 제92항의 세포, 제93항의 단백질 결합체, 또는 제94항 또는 제95항의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 뉴런에서 신경돌기 성장 및/또는 시냅스 형성 증가시키는 방법.
제102항에 있어서, 상기 접촉 단계는 이를 필요로 하는 대상체의 생체내에서 일어나는 것을 특징으로 하는 방법.
제103항에 있어서, 상기 접촉 단계 전에 상기 대상체에 폴리펩티드를 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제102항에 있어서, 상기 접촉 단계는 생체외에서 일어나는 것을 특징으로 하는 방법.
제102항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접촉 단계는 상기 폴리펩티드, 분자, 핵산, 벡터, 세포, 단백질 결합체, 또는 조성물과 접촉하지 않은 상응하는 뉴런에서 신경돌기 성장과 비교하여 적어도 약 0.5배, 적어도 약 1배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 20배, 적어도 약 30배, 적어도 약 40배, 또는 적어도 약 50배로 뉴런에서 신경돌기 성장을 증가시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제102항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접촉 단계는 상기 폴리펩티드, 분자, 핵산, 벡터, 세포, 단백질 결합체, 또는 조성물과 접촉하지 않은 상응하는 뉴런에서 시냅스 형성과 비교하여 적어도 약 0.5배, 적어도 약 1배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 20배, 적어도 약 30배, 적어도 약 40배, 또는 적어도 약 50배로 뉴런에서 시냅스 형성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제102항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신경돌기 성장 및/또는 시냅스 형성의 증가는 근위축성측삭경화증(amyotrophic lateral sclerosis, ALS), 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 녹내장(glucoma), 당뇨병성 망막병증(diabetic retinopathy), 신경병성 통증(neuropathic pain), 척수손상(spinal cord injury), 외상성 뇌손상(traumatic brain injury), 뇌졸중(stroke), 파킨슨병(Parkinson's disease) 또는 이들의 조합으로부터 선택된 질병 또는 병태와 관련된 하나 이상의 증상을 감소시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제76항 중 어느 한 항의 폴리펩티드, 제77항 내지 제86항 중 어느 한 항의 분자, 제87항 내지 제90항 중 어느 한 항의 핵산, 제91항의 벡터, 제92항의 세포, 제93항의 단백질 결합체, 또는 제94항 또는 제95항의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 FAM19A5 단백질과 LRRC4 단백질 패밀리 멤버 사이의 복합체 형성을 억제 또는 감소시키는 방법.
제109항에 있어서, FAM19A5 단백질과 LRRC4 단백질 패밀리의 멤버 사이의 복합체의 형성은 투여후, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 100% 감소되는 것을 특징으로 하는 방법.
제109항 또는 제110항에 있어서, FAM19A5 단백질과 LRRC4 단백질 패밀리 멤버 사이의 복합체 형성의 감소는 대상체에서 LRRC4 단백질 패밀리 멤버의 활성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제109항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, FAM19A5 단백질과 LRRC4 단백질 패밀리 멤버 사이의 복합체 형성의 감소는 근위축성측삭경화증(amyotrophic lateral sclerosis, ALS), 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 녹내장(glucoma), 당뇨병성 망막병증(diabetic retinopathy), 신경병성 통증(neuropathic pain), 척수손상(spinal cord injury), 외상성 뇌손상(traumatic brain injury), 뇌졸중(stroke), 파킨슨병(Parkinson's disease) 또는 이들의 조합으로부터 선택된 질병 또는 병태와 관련된 하나 이상의 증상을 감소시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제76항 중 어느 한 항의 폴리펩티드, 제77항 내지 제86항 중 어느 한 항의 분자, 제87항 내지 제90항 중 어느 한 항의 핵산, 제91항의 벡터, 제92항의 세포, 제93항의 단백질 결합체, 또는 제94항 또는 제95항의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 이를 필요로 하는 대상체에서 질병 또는 병태를 치료하는 방법으로서, 상기 질병 또는 병태는 근위축성측삭경화증(ALS), 알츠하이머병, 녹내장, 당뇨병성 망막병증, 신경병성 통증, 척수손상, 외상성 뇌 손상, 뇌졸중, 파킨슨병 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.