KR20100020445A - 인간 신경줄기세포 및 이를 이용한 중추 또는 말초 신경계 질환 및 손상 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간 신경줄기세포 및 이를 이용한 신경계 질환 및 손상 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 신경계 질환 및 손상의 치료에 효과적인 인간 종뇌 유래 인간 신경줄기세포 및 이를 이용한 신경계 질환 및 손상 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 인간 신경줄기세포는 신경계 질환 및 손상, 특히 현재 특별한 치료법이 없으며 영구적 신경학적 후유증을 남기는 중증 척수 손상 환자, 허혈성 뇌손상, 간질 및 알쯔하이머병의 치료에 유효한 효과를 가진다. 따라서, 본 발명의 인간 신경줄기세포를 포함하는 약학적 조성물은 신경계 손상의 치료를 위한 새로운 방법을 제공하는 효과가 있다.

신경줄기세포, 척수 손상, 허혈성 뇌손상, 간질, 알츠하이머병, 이식, 세포치료제

Description

인간 신경줄기세포 및 이를 이용한 중추 또는 말초 신경계 질환 및 손상 치료용 약학적 조성물{Human neural stem cell and pharmaceutical composition for treating disorder and injury of central or peripheral nervous system using the same}

본 발명은 인간 신경줄기세포 및 이를 이용한 신경계 질환 및 손상 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 신경계 손상의 치료에 효과적인 인간 종뇌 유래 인간 신경줄기세포 및 이를 이용한 신경계 질환 및 손상 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

신경줄기세포란 주로 신경계에 존재하는 미성숙 (immature) 세포로서 미분화 (undifferentiated) 된 상태로 계속 증식하는 자가 갱신(self-renew)을 보이고, 신경원세포(neuron) 및 신경교세포(glia)로 분화하는 분화의 다능성(multipotency)을 보이는 세포로 정의된다. 신경줄기세포는 인간을 포함한 포유동물의 태아 신경계 전반에 걸쳐 다양한 해부학적 부위에서 존재하고, 최근에는 태아뿐만 아니라 성체 신경계의 특정 부위에서도 신경줄기세포가 존재하며, 일생을 통하여 신경줄기세포는 뇌의 특정 부위에서 계속 증식하면서 새로운 신경세포를 생성한다. 이외에도 신 경줄기세포는 보다 미성숙한 세포인 배아줄기세포에서 분화될 수도 있고, 신경계가 아닌 몸의 다른 부위 즉, 골수, 피부, 양막 (amniotic membrane), 제대혈 (umbilical cord blood) 세포 등에서도 분화될 수 있다고 보고되고 있으나 이러한 조직에서 나오는 신경줄기세포 및 신경세포는 극히 드물며 진정한 기능성 신경세포로 분화되는지는 아직 확실하지 않다. 그러나 신경계에 존재하는 신경줄기세포는 확실히 기능성 신경세포로 분화하므로 최근에 이러한 신경줄기세포를 이용한 줄기세포의 증식과 분화기전 및 신경계 발달에 관한 기초연구뿐만 아니라, 한번 손상되면 재생되지 않는다고 알려져 있는 선천성 및 후천성 난치성 신경계질환에서 신경줄기세포의 생물학적 특성을 이용하여 새로운 세포 및 유전자 치료의 가능성에 대한 관심이 증대하고 있다.

현재 신경계질환에 대한 수많은 새로운 치료약물, 단백질 및 신경영양인자들이 검색되고, 생체 내외에서 치료 효과와 신경보호 작용의 평가 등을 통하여 다양한 치료법이 활발히 개발되고 있으나 아직 가시화된 성과는 별로 없다. 실제 임상적으로 손상된 신경조직을 보호하고 재생시키는 특별한 치료법은 없는 실정이다. 한편 난치성 신경계 질환의 치료를 위해서는 치료약물, 신경영양인자 및 화합물질과 같은 '소분자 (small molecules)'의 개발만으로는 충분하지 않고, 이미 사멸하였거나 기능부전을 보이는 신경세포를 대체하여 신경재생을 유도하는 세포치료가 필수적이다. 따라서 최근에 줄기세포학이 발전하면서 기존 유전자 치료의 안전성과 효율성의 문제점, 그리고 1차 태아조직 또는 세포 사용의 한계점을 극복하고 인체 에 대한 새로운 세포 및 줄기세포 이용 유전자 치료를 가능케 하는 최상의 대안으로 인간 신경줄기세포에 대한 연구와 치료적 적용이 부각되고 있다.

그러나 현재 인간 신경줄기세포의 치료적 적용을 위해서는 많은 기초적인 연구가 필요하고 실제 임상시술을 위해서는 여러 가지 임상적용에 관련된 문제들이 해결되어야 한다. 즉, 인간 신경줄기세포의 대량증식 및 분화의 제어조절, 생체 내 이식 시 종양발생 억제 등의 장기적 안전성, 신경계 이식 시 공여 줄기세포의 생착, 이주, 분화, 숙주 신경계로의 통합기전 및 신경기능 개선효과 검정 및 기전, 난치성 신경계질환의 병태생리 규명을 통한 줄기세포 이식치료 목표 설정, 동물실험 결과의 임상시험 적용 시 차이점과 주의할 점, 줄기세포의 항염증 및 면역제어조절 기전, 줄기세포와 다른 다양한 치료법과의 혼합치료법 추구 등에 관한 많은 연구가 필요하다 (Alvarez-Buylla, et al. Nat Rev Neurosci 2:287, 2001; Flax, et al., Nat Biotech 16:1033, 1998; Gage, Science 287:1433, 2000; Lindvall, Nature 441:1094, 2006).

척수손상은 산업의 고도화와 인간 활동량의 증가에 따라 사고 등으로 인하여 발생 빈도가 증가하고 있는데, 미국의 경우 기존의 척수손상 환자가 100만 명 정도이고 연간 인구 100만 명당 50명의 척수손상 발생빈도를 보여 매년 12000 명의 새로운 환자가 발생하고 있으며, 특히 환자의 대부분이 30세 이하의 청장년기여서 환자의 평균 생존 기간이 증가하고 있고 대략 일 년에 약 97억 달러의 의료비가 소요 되는 것으로 추산된다. 국내의 경우 약 7만 명이 척수장애인으로 등록되어 있는데 특히 국내 실정에서 볼 때 교통사고의 증가는 필연적으로 척수손상 환자의 증가로 이어지고 있다. 이러한 척수손상 환자들은 심각한 운동, 감각 및 자율신경계 장애로 인하여 병원에서의 장기 입원 및 재활치료를 필요로 하고, 일상의 생활을 위하여 타인을 도움을 절대적으로 필요로 하여 사회적 및 개인적으로 심각한 경제적 부담과 인적 자원의 손실, 개인의 존엄성 및 독립성 유지에 큰 장애를 초래하고 있다. 그러나 국내에서는 아직 이러한 척수손상 장애인의 사회적 활동과 갱생 및 독립성 유지를 위한 사회적 복지 제공이 극히 미비하며, 손상된 척수신경의 재생을 위한 생물학적, 의학적 연구는 이제 막 시작하는 단계에 있다.

일반적으로 중추신경계 질환인 척수손상은 비가역적인 것으로 손상 후 재생은 매우 어려운 것으로 알려져 있으며, 최근에 척수손상에 대한 치료 및 재활요법의 괄목할 발전에도 불구하고 손상의 근본 원인이 되는 신경 조직의 재생이 이루어지지 않아 근본치료는 불가능한 상태이다. 따라서 최근까지 임상에서 주로 사용되는 치료법은 손상된 척수에 대한 근본 치료보다는 이차적인 척수손상을 막기 위한 수술치료와 약물치료 등이 이용되고 있는 실정이다. 급성 척수손상인 경우 메틸프레드니솔론(methylprednisolone)을 정주하면 효과가 있다고 하나 약효가 확실하지 않고 합병증이 많이 발생하여 많은 나라에서는 사용하고 있지 않으며, 그 외 실험적으로 신경손상에 효과를 보이는 약제 (monosialoganglioside sodium [GM-1 ganglioside], naloxone, and tirilazad) 등이 임상시험으로 사용되었으나 결과가 보고되지 않았거나 효과가 불분명하여 현재까지 미국 FDA에서 임상사용이 허가된 신경보호 약제는 없는 실정이다 (Ducker et al., Spine 19:2281, 1994; Hurlbert, J Neurosurg 93:1, 2000; Short, et al., Spinal Cord 38:273, 2000; McDonald, et al., Lancet 359:417, 2002).

그러나 최근에 척수손상 치료법 개발을 위하여 재생 의학적 연구가 크게 부각되고 있는데, 척수손상 시 조직 환경에 다양한 수초관련물질 (myelin associated molecules) 및 신경교세포 반흔 관련 세포외기질 단백질 (glial scar-asociated extracellular matrix protein) 등의 작용으로 손상된 신경축삭돌기 (axon)의 재생이 일어나지 않으므로 이러한 물질들에 대한 작용 억제제를 사용하거나, 다양한 조직 혹은 세포를 이식하여 끊어진 척수신경 축삭돌기의 성장과 재생을 촉진시키는 동물 및 임상시험이 보고되고 있다 (Bradbury et al., Nature 416:636, 2002; Bregman et al., Nature 378:498, 1995; GrandPre, et al., Nature 417:547, 2002; Bunge, Neuroscientist 7:325, 2001; Cheng et al., Science 273:510, 1996; Coumans et al., J Neurosci 21:9334, 2001; Keyvan_Fouladi et al., J Neurosci 23:9428, 2003; Rossignol et al., J Neurosci 27:11782, 2007).

한편, 최근 줄기세포학 연구가 크게 발전하고 활성화되면서 척수손상 부위에 줄기세포를 이식하여 손상된 신경세포로의 분화유도, 신경축삭돌기의 재생유도 및 축삭돌기의 재수초화 (remyelination) 등을 보이는 동물실험이 많이 보고되고 있는 데, 마우스 및 인간 배아줄기세포로부터 다양한 신경세포로 분화 유도하여 이식하는 경우 신경기능의 호전은 보이나 아직 종양발생 가능성에 따른 안전성과 배아줄기세포 사용에 따른 윤리성 문제 등이 해결되어야 할 과제이고 (McDonald et al., Nat Med 5:1410, 1999; Keirstead et al., J Neurosci 25:4694, 2005), 골수줄기세포 (bone marrow stromal stem cells) 사용은 자가 세포 사용으로 면역거부반응 및 윤리성 문제는 피할 수 있으나 골수줄기세포의 기능성 신경세포로의 교차분화 여부가 확실하지 않으며 (Terada, et al., Nature 416:542, 2002; Ying et al., Nature 416:545, 2002; Alvarez-Dolado et al., Nature 425:968, 2003), 실제 척수손상 부위에 이식 시 신경세포로의 분화는 잘 발생하지 않는다고 하나 (Hofstetter, et al., PNAS 99:2199, 2002) 공여세포에 의한 손상된 척수신경 축삭돌기의 재생유발 가능성이 보고되었다 (Ankeny et al., Exp Neurol 190:17, 2004). 설치류 및 인간의 중추신경계에서 유래된 신경줄기세포는 이식 후 척수손상 부위에서 기능성 신경세포로 분화할 수 있고 종양 형성할 가능성이 별로 없어 동물실험에서 신경기능 호전이 보고되었고 (Cummings et al., PNAS 102:14069, 2005; Hofstetter et al., Nat Neurosci 8:346, 2005; Iwanami et al., J Neurosci Res 80:182, 2005; Karimi-Abdolrezaee et al., J Neurosci 26:3377, 2006; Ogawa et al., J Neurosci Res 69:925, 2002; Teng et al., PNAS 99:3024, 2002; Yan et al., PLos Medicine 4:e39, 2007), 최근에는 척수손상 시 실제 회백질의 신경원세포 손상보다는 백질의 신경교세포 손상에 의한 신경기능 손상이 중요함이 밝혀져 줄기세포 유래 신경교세포 전구세포 (glial-restricted progenitor cells; GRPs) 혹은 희소돌기아교세포 전구세포 (oligodendrocyte precursor cells; OPCs) 등을 이식하는 동물실험도 보고되었다 (Bambakidis et al., Spine J 4:16, 2004; Cao et al., J Neurosci 25:6947, 2005; Han et al., Glia 45:1, 2004; Herrera et al., Exp Neurol 171:11, 2001; Hill et al., Exp Neurol 190:289, 2004; Mitsui et al., J Neurosci 25:9624, 2005). 이상으로 다양한 종류의 줄기세포를 척수손상 부위에 이식할 경우 동물실험에서 신경기능의 호전을 보고하고 있으나 줄기세포 이식의 임상적용을 위해서는 어떤 종류의 줄기/전구세포가 가장 이상적인 공여세포인지 아직 확실하지 않으며, 보다 나은 치료효과를 얻기 위해서는 척수손상의 병태생리 연구를 통한 다양한 치료목표 및 단계의 설정과 줄기/전구세포 이식과 다른 치료법의 혼합을 통한 복합적 접근법이 요구되고 있다.

뇌졸중의 경우, 대한민국 국민의 사망원인 제 2위, 단일 질환으로는 제 1위에 해당하는 대단히 중요한 국민보건 문제 중 하나인데, 성인의 경우 매년 약 15만 명 이상의 새로운 환자가 발생하고 있고, 태아 및 신생아에서 주산기 가사에 의한 저산소성 허혈성 뇌 병증의 발생 빈도는 만삭아에서는 1,000명 생존 출생아 중 2-4명에서 발생하고 (매년 2000명의 새로운 환아 발생), 극소저출생체중 미숙아에서는 출생아의 약 60%에서 발생한다고 보고되고 있으며 (매년 3000-4000명의 새로운 환아 발생), 저산소성 허혈성 뇌 병증 환아의 약 10-60%가 신생아기에 사망하여 높은 사망률을 보이고, 생존아의 25%에서는 뇌성마비, 지능발달 지연, 학습장애 및 간질 등의 영구적인 중증의 신경발달학적 후유증을 남겨 성인의 뇌졸중과 더불어 본 질환은 국민 보건 복지적인 측면에서 뿐만 아니라 사회 경제적인 측면에서도 심각한 문제를 야기 시키는 주요 신경계 질환이다. 그러나 실제 임상적으로 저산소성 허혈성 뇌 병증을 호전시키는 특별한 치료 방법은 없는 실정이며, 현재 보전적인 치료에 국한되어 있으나 이러한 치료법이 현재 진행하고 있는 뇌손상을 중단시키거나 예방하지는 못한다 (Rogers MC, Nichols DG (Eds). Rogers’' Textbook of Pediatric Intensive Care. 4th Edition. Philadelphia, Lippincott Williams & Wilkins, 2008, pp 810-825; Roach et al., Stroke 39:2644, 2008; van Bel and Groenendaal, 2008 Neonatology 94:203).

간질 (epilepsy)은 가장 흔한 신경계질환중 하나인데, 인구의 약 3-5%가 생애 한번 정도라도 경련 증상을 보이는 것으로 알려져 있고, 인구의 약 0.5-1%는 반복되는 발작을 보이는 간질 환자이다. 대부분의 환자는 항 경련제 투약으로 치료가 되나 일차전신간질 (primary generalized epilepsy) 환자의 약 20%, 부분간질 (partial epilepsy) 환자의 약 35%는 약물치료에 잘 반응하지 않는 난치성간질 (refractory epilepsy) 인데, 항 경련제로 치료가 되지 않는 경우는 뇌의 일부분을 절제하는 수술적 치료 방법을 고려할 수 있으나 이러한 경우에도 환자의 약 50% (수술 적응증을 보이는 환자를 엄격히 선택한 경우는 환자의 약 2/3) 에서만 수술 후 간질이 완전히 없어지고, 대부분의 경우 간질의 빈도가 줄거나 정도가 약하게 되는 효과만 있다. 그리고 많은 환자에서 수술로 인하여 심각한 뇌기능 상실의 위험성으로 인하여 수술적 치료를 받지 못하는 경우도 많으며, 파국성간질증후군 (catastrophic epilepsy syndrome)을 보이는 유 소아 환아 에서는 뇌파에 미만성, 양측성 혹은 다초점 간질을 보여 수술적 치료에 적응 대상이 되지 못하는 경우도 있고, 수술이 가능한 경우라도 multilobar resection 또는 대뇌반구절제술등을 시행하여 뇌조직의 손상이 많아 수술에 따른 신경학적 결손이 남는 경우가 많다. 따라서 현재까지 간질에 대한 많은 치료법이 개발되어 왔으나 난치성간질 환자 수는 모든 종류의 뇌종양, 다발성경화증, 근이영양증 (muscular dystrophy), 척수운동신경질환, Guillain-Barre syndrome과 같은 대표적인 난치성 신경계질환 환자 전체보다 많으며, 이러한 이유로 난치성간질에 대한 새로운 치료법의 개발은 공중보건학적 차원에서 아주 중요한 문제이다. 그러므로 이러한 난치성간질 환자에서 간질유발부위, 발작시작부위 및 기능저하부위에 신경줄기세포를 이식하여 손상된 혹은 기능 저하된 신경세포를 대체하고, 신경회로를 재구성하며, 신경세포의 전기생리학적 과흥분 상태를 조절하여 간질 발작을 억제하고 신경기능의 향상을 유도하는 치료법의 개발은 간질 치료에 대한 획기적이고도 근본적인 시도가 될 수 있다 (Rakhade and Jensen, Nat Rev Neurol 5:380, 2009; Marson et al., Clin Evid pil:1201, 2009; Banerjee et al., Epilepsy Res 85:31, 2009; Jacobs et al., Epielepsy Behav 14:438, 2009).

알츠하이머병은 노인에서 흔히 관찰되는 진행성 퇴행성 뇌질환으로 치매를 유발하는 가장 중요한 원인질환 가운데 하나로서 전체 노인성치매 환자의 약 절반 이상을 차지한다 (원인으로 혈관성 치매가 30-40%, 대사성 치매가 10-20%, 원인불명 치매가 50% 정도 됨). 발병률과 유병률은 나이에 따라 증가하여 60세 이후에 매 5년마다 두 배씩 증가한다. 60-64세의 알츠하이머병의 유병률은 약 1%이고, 65-69세는 2%, 70-74세는 4%, 75-79세는 8%, 80-84세는 16%, 85세 이상은 약 35-40%에 달하며, 대략 65세 이상 노인의 10%가 알츠하이머병을 앓고 있다. 발병률은 75-79세 사이에 2.3%이고 80-84세 사이는 4.6%, 85-89세에서는 8.5%에 달한다. 우리나라는 2000년에 65세 이상 노인 인구가 7%인 고령사회가 되었고, 2022년에는 65세 이상 노인 인구가 14% 이상인 고령사회가 될 것으로 예상하고 있어 향후 알츠하이머병 환자들이 급증하리라 예상된다. 실제 2007년 우리나라의 치매 노인은 전체 노인 481만 명중 8.3%에 해당하는 39만 9000명으로, 2000년 28만 2000명에서 7년 새 11만 7000명 (41.4%)이 늘었음. 따라서 국내 치매환자 비율은 일본 (3.8%), 영국 (2.2%), 미국 (1.6%), 스페인 (1.0%) 등과 비교하였을 때 최고 수준인데, 고령화 속도가 그 어느 나라보다 빠른 탓에 앞으로도 증가세가 가파를 것으로 보여, 2010년 46만 1000명 (전체 노인의 8.6%), 2015년 58만 명 (9.0%)으로 늘 것으로 보인다. 따라서 치매로 인한 경제적 손실도 엄청나서 지난해 우리나라에서 치매환자 직접 진료비는 3268억 원이나, 간접비용을 포함할 경우 연간 3조 4000억-7조 3000억 원에 이를 것으로 추정된다. 미국의 경우 이미 520만 명의 알츠하이머병 환자가 있으며, 65세 이하의 환자도 50만 명이나 되고, 특히 베이비부머 세대에서 향후 18%에서 알츠하이머병이 발생할 가능성이 있어 향후 약 140만 명이 알츠하이머병에 걸릴 것으로 예상된다. 현재 미국의 경우에서도 환자의 70%는 가정에서 가족이 돌보고 있는데, 지난 한 해 동안 알츠하이머병에 걸린 가족이나 친지를 간호한 사람은 약 1000만 명, 시간으로 따지면 총 84억 시간, 금액으로 환산하면 890억 달러에 해당한다고 한다. 최근 알츠하이머병의 증상 개선ㆍ진행을 늦추는 약물들이 일부 개발되어 사용되고 있으나 근본적인 치료는 되지 못하고 향후 고령 인구의 증가로 본 질환의 직접적 치료 및 간호에 소요되는 보건 의학적 경비는 막대할 것으로 예상된다. 따라서 알츠하이머질환에서 신경줄기세포를 이용한 새로운 치료법의 개발은 난치성 퇴행성 신경계질환 치료의 획기적인 시도가 될 수 있다 (Minati et al., Am J Alzheimers Dis Other Demen 24:95, 2009; Ziegler-Graham et al., Alzheimers Dement 4:316, 2008; Kalaria et al., Lancet Neurol 7:812, 2008).

이에 본 발명자들은 척수 손상 등 신경계 질환 및 손상을 효과적으로 치료할 수 있는 방법을 개발하기 위하여 연구를 거듭한 결과, 인간 종뇌에서 채취되어 배양된 새로운 인간 신경줄기세포가 안전하고 유효하게 신경계 질환 및 손상을 치료할 수 있음을 알아내어 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 기탁번호 KCTC11370BP를 가지는 인간 신경줄기세포 및 이를 포함하는 신경계 질환 및 손상 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 기탁번호 KCTC11370BP를 가지는 인간 신경줄기세포를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 인간 신경줄기세포를 포함하는 신경계 질환 및 손상 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

이하 본 발명의 내용을 보다 상세히 설명하기로 한다.

본 발명의 인간 신경줄기세포는 합법적 유산으로 이미 사망한 재태연령 (gestational age) 13주 (13 weeks)의 인간 태아 중추신경계의 종뇌 (telencephalon) 신경조직에서 채취되어 특정 성장인자를 사용하여 유전자 변형 없는 일차 신경줄기세포로 배양되었고, 생체 외에서 줄기세포로서의 세포특성이 확인된 것이다. 본 발명의 인간 신경줄기세포는 임상에 적용하기 앞서, 척수손상 동물모델에 이식되어 세포치료제로서의 안전성 및 유효성이 확인되었으며, 2008년 7월 24일 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁번호 KCTC11370BP로 기탁되었다.

본 발명에서 사용된 용어 '줄기세포'는 조직 및 기관의 특수화된 세포를 형성하도록 비제한적으로 재생할 수 있는 마스터 세포를 지칭한다. 줄기세포는 발달가능한 만능성 또는 다능성 세포이다. 줄기세포는 2개의 딸줄기세포, 또는 하나의 딸줄기세포와 하나의 유래('전이(transit)') 세포로 분열될 수 있으며, 이후에 조직이 성숙하고 완전한 형태의 세포로 증식된다.

본 발명에서 사용된 용어 '다능성 세포'는 포유류 신체의 약 260개 세포 유형의 임의의 하위세트로의 성장능력을 갖는 세포를 지칭한다. 만능성 세포와 달리, 다능성 세포는 모든 세포 유형을 형성하려는 능력을 갖지는 않는다.

본 발명에서 사용된 용어 "분화(differentiation)"는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화하는 현상, 즉 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 것을 말한다. 일반적으로 비교적 단순한 계(系)가 둘 이상의 질적으로 다른 부분계(部分系)로 분리되 는 현상이다. 예를 들면, 개체발생에서 처음에 동질적이었던 알 부분 사이에 머리나 몸통 등의 구별이 생기거나 세포에도 근세포라든가 신경세포 등의 구별이 생기는 것과 같이 처음에 거의 동질이었던 어떤 생물계의 부분 사이에 질적인 차이가 생기는 것, 또는 그 결과로서 질적으로 구별할 수 있는 부역 또는 부분계로 나누어져 있는 상태를 분화라고 한다.

본 발명에서 사용된 용어 '세포치료제'는 사람으로부터 분리, 배양 및 특수한 저작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방 의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종세포를 체외에서 증식, 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 지칭한다. 세포치료제는 세포의 분화정도에 따라 크게 체세포치료제, 줄기세포치료제로 분류되며 본 발명은 특히 줄기세포치료제에 관한 것이다.

본 발명의 신경줄기세포는 인간 태아의 종뇌로부터 유래한 것일 수 있다. 바람직하게는 인간 태아의 뇌 조직으로부터 얻은 세포를 신경줄기세포 성장인자가 첨가된 배지에서 배양하여 제조할 수 있다(실시예 1 참조). 상기 신경줄기세포 성장인자는 bFGF(fibroblast growth factor-basic), LIF(leukemia inhibitory factor) 및 헤파린(heparin)을 사용할 수 있다. 바람직하게는 20 ng/㎖ bFGF, 10 ng/㎖ LIF 및 8 ㎍/㎖ 헤파린을 사용할 수 있다.

본 발명의 인간 신경줄기세포는 당업계에 공지된 방법에 따라 증식 및 배양될 수 있다. 본 발명의 신경줄기세포는 목적 세포 타입의 생존 또는 증식을 뒷받침하는 배양액 내에서 배양된다. 종종 혈청 대신 자유 아미노산으로 영양을 공급하는 배양액을 사용하는 것이 바람직하다. 신경세포의 지속적인 배양을 위해 개발된 첨가제를 배양액에 보충하는 것이 바람직하다. 예컨대, Gibco 사에서 시판되는 N2 및 B27 첨가제가 있다. 배양시 배지와 세포의 상태를 관찰하면서 배지를 교환해 주는 것이 바람직하다. 또한 신경줄기세포가 계속 증식하여 서로 뭉쳐서 신경구(neurospheres)를 형성하면 계대배양을 실시하는 것이 바람직하다. 계대배양은 약 7-8일 마다 실시할 수 있다.

본 발명에 따른 신경줄기세포의 바람직한 배양 방법은 다음과 같다: 배양액의 조성이 알려져 있는 특정 배지(예: DMEM/F-12 또는 Neurobasal 배지 등)에 N2 또는 B27 첨가제(Gibco), 신경줄기세포 증식유발 사이토카인(예: bFGF, EGF, LIF 등)과 헤파린을 첨가한다. 일반적으로 혈청은 첨가하지 않는다. 상기 배지에서 신경줄기세포를 신경구 형태로 증식 배양한다. 3-4일에 한번씩 배지의 반 정도를 새로운 배지로 갈아준다. 세포수가 늘어나면 7-8일마다 기계적 방법 또는 트립신(0.05% trypsin/EDTA)을 이용하여 세포를 해리시킨다. 이후, 세포 부유액을 새로운 플레이트에 플레이팅하고 상기 조성의 배지에서 계속하여 증식 배양시킨다(Gage et al . PNAS , 92(11):879, 1995; McKay. Science , 276:66, 1997; Gage., Science , 287:1433, 2000; Snyder et al. Nature , 374:367, 1995; Weiss et al. Trends Neurosci., 19:387, 1996).

또한 본 발명의 신경줄기세포는 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 각종 신경세포로 분화될 수 있다. 일반적으로 분화는 세포배지에 신경줄기세포 증식유발 사이토카인은 첨가하지 않고 적절한 기질 또는 분화 시약이 첨가되는 영양 배양액을 함유하는 배양 환경에서 실행한다. 적절한 기질은, 양전하로 코팅된 고체 표면, 예를 들면 폴리-L-라이신 및 폴리오르니틴이 적합하다. 기질은 세포외 매트릭스 성분, 일례로 피브로넥틴 및 라미닌으로 코팅 가능하다. 기타 허용되는 세포외 매트릭스는 매트리겔(Matrigel)을 포함한다. 기타 적절한 것은, 폴리-L-라이신을 피브로넥틴, 라미닌, 또는 이들의 혼합물과 혼합한 조합 기질이다.

적당한 분화 시약은 다양한 종류의 성장 인자, 예를 들면, 표피 성장 인자(EGF), 전환성장인자 α(TGF-α), 임의의 형태의 섬유아세포 성장인자(FGF-4, FGF-8 및 bFGF), 혈소판 유래 성장인자(PDGF), 인슐린 유사 성장인자(IGF-1 등), 고농도의 인슐린, 골형성 단백질(특히, BMP-2 및 BMP-4), 레틴산(RA) 및 gp130과 복합하는 수용체에 대한 리간드(예: LIF, CNTF 및 IL-6)이 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한 본 발명의 신경줄기세포는 장기간 보관을 위하여 당업계에 공지된 방법에 따라 동결보관할 수 있다. 일반적인 동결보관은 계대배양을 계속하여 충분한 숫자의 신경줄기세포를 획득하면 기계적 방법 또는 트립신을 이용하여 신경구를 잘게 부수어 단일 세포 현탁액을 만든다. 이후, 20-50% 태아우혈청(fetal bovine serum), 10-15% DMSO 및 세포 배지로 이루어진 동결 보관액에 상기 세포 현탁액을 혼합하여 동결 유리병(freezing vial)에 분주한다. 동결 보관액에 혼합한 세포는 즉시 4℃에 보관한 상태에서 -70℃의 냉동고로 옮기고, 최소 24시간 후에 액체질소탱크로 옮겨 장기 보관한다(Gage et al . PNAS, 92(11):879, 1995; McKay. Science , 276:66, 1997; Gage., Science , 287:1433, 2000; Snyder et al. Nature , 374:367, 1995; Weiss et al. Trends Neurosci., 19:387, 1996).

아울러 동결보관된 본 발명의 신경줄기세포는 당업계에 공지된 방법에 따라 해동할 수 있다. 동결 보관된 세포를 녹일 때는 동결 유리병을 37℃ 항온 수조에 담가 천천히 흔든다. 동결 유리병에 있는 세포가 절반정도 녹았을 때 미리 37℃로 데워져 있는, 신경줄기세포 배지가 들어있는 코니컬 튜브에 상기 세포 현탁액을 옮기기 시작한다. 세포 현탁액을 모두 옮기고 원심 분리하여 상층액을 제거한다. 침전되어 있는 세포 펠렛을 신경줄기세포 배지로 조심스럽게 부유시킨다. 세포 현탁액을 60 mm 세포 배양 플레이트에 옮긴다. 이후, 신경줄기세포 증식유발 사이토카인을 배지에 첨가하고 계속하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양한다.

한편, 본 발명은 본 발명의 인간 신경줄기세포를 포함하는 신경계 질환 및 손상 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기에서 '치료(treatment)'는 증상의 완화, 질환(또는 손상, 이하 동일) 정도의 감소, 악화되지 않는 질환의 유지, 질환진행의 지연, 질환 상태의 개선 또는 완화(palliation), (일부 또는 완전한) 완화(remission)를 포함한다. 또한 치료는 치료를 받지 않은 경우 예상되는 질환의 상태와 비교하여 호전된 상태를 의미할 수 있다. 치료는 치료적 수단 이외에 예방적 수단을 동시에 포함한다. 치료가 필요한 경우는 질환을 이미 가지고 있는 경우와 질환이 예방되어야 하는 경우를 포함한다. 질병의 완화는 치료받지 않는 상황과 비교하여 원하지 않는 질병의 임상양상의 호전이나 질병의 추이가 지연되거나 연장되는 경우이다. 전형적으로 치료는 손상된 신경계의 재생을 위해 본 발명의 신경줄기세포를 투여하는 경우를 포함한다. 이 때, 본 발명에서의 신경계는 뇌, 중추 또는 말초 신경계일 수 있다.

본 발명의 인간 신경줄기세포는 원하는 조직 부위로 직접 이식하거나 이동하는 방식으로 투여되어, 손상된 신경계가 재생되거나 기능적으로 회복되도록 한다. 예컨대, 치료될 질환에 따라 본 발명의 신경줄기세포를 손상된 신경 부위로 직접 이식한다. 이식은 단세포 현탁액 또는 ㎕ 당 1× 10⁵-1.5× 10⁵ 세포 밀도의 작은 집합체를 이용하여 수행한다(미국특허 제5,968,829호 참조).

본 발명의 인간 신경줄기세포는 인간 내로의 투여를 위해 약학적 조성물의 형태로 공급될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에는 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기 '약학적으로 허용되는'이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 것을 말한다. 상기 담체는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제, 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등 당업계에 공지된 것이라면 제한없이 사용할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 각종 제형의 형태로 통용되는 기법에 따라 제조될 수 있다. 예컨대, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 포함제 형태로 제조할 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 의약 제형의 일반적인 원리에 대해서는 하기의 문헌을 참고할 수 있다: Cell Therapy; Stem Cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, G. Morstyn amp; W. Sheridan 편저, Cambridge University Press, 1996; 및 Hematopoietic Stem Cell Therapy, E. D. Ball, J. Lister amp; P. Law, Churchill Livingstone, 2000. 본 발명의 약학적 조성물은 원하는 목적, 예를 들면 손상된 신경계의 재생을 위해 표기된 지시에 따라 적당한 용기 내에 포장될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물이 적용될 수 있는 신경계 질환 및 손상은 척수 손상, 파킨슨병, 뇌졸중, 근위축성 척수측색경화증, 운동신경손상, 외상에 의한 말초 신경손상, 허혈성 뇌손상, 신생아 저산소성 허혈성 뇌손상, 뇌성마비, 간질, 난치성 간질, 알쯔하이머병, 선천성 대사성 신경계질환 또는 외상성 뇌손상 (traumatic brain injury)을 포함하며, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에서는 합법적 유산으로 사망한 태아의 종뇌에서 채취한 신경세포를 성장인자를 이용하여 신경줄기세포로 배양하였다.

본 발명의 다른 실시예에서는 상기 제조된 신경줄기세포를 척수 손상 동물모델에 이식하여 안전성 및 효능을 확인하였다. 그 결과, 별다른 독성을 보이지 않고, 척수 손상이 치료되어 본 발명의 신경줄기세포가 안전성 및 유효성을 지니고 있음을 알 수 있었다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는 본 발명의 신경줄기세포를 척수 손상 환자에 이식하고, 기존의 척수손상 환자들에게 시행하는 물리치료와 작업치료를 시행하면서 경과를 확인하였다. 그 결과, 총 17례의 임상에서 ASIA-A 환자 15례 중 1례는 ASIA-B로, 2례는 ASIA-C로 변화하고, ASIA-B 환자 2례 중 2례 모두 ASIA-D로 변화하여 운동 완전 척수손상 환자 중 29%에서 ASIA 등급변화를 나타낼 정도의 임상적 호전을 보임을 알 수 있었다. 특히 실제 ASIA-A 환자 중 3례에서는 줄기세포 이식만으로는 임상적 호전을 기대하기 어려울 정도의 수술 소견이 있는 중증의 환자이어서 이를 제외할 경우, ASIA-A 환자 중 신경줄기세포 이식 후 25%에서 호전을 보 였고, 운동 완전손상 환자 전체 중에서는 신경줄기세포 이식 후 36%에서 호전을 보임을 알 수 있었다. 아울러, 전체 ASIA-A 환자 중 75%에서, 전체 운동 완전 척수손상 환자 중 82% 이상(17례 중 14례)에서 운동기능의 호전을 보임을 알 수 있었다.

본 발명의 다른 실시예에서는 상기 제조된 신경줄기세포를 신생아 저산소성 허혈성 뇌손상 동물모델에 이식하여 안전성 및 효능을 확인하였다. 그 결과, 별다른 독성을 보이지 않고, 저산소성 허혈성 뇌손상이 치료되어 본 발명의 신경줄기세포가 안전성 및 유효성을 지니고 있음을 알 수 있었다.

본 발명의 다른 실시예에서는 상기 제조된 신경줄기세포를 난치성 간질 동물모델에 이식하여 안전성 및 효능을 확인하였다. 그 결과, 별다른 독성을 보이지 않고, 난치성 간질이 치료되어 본 발명의 신경줄기세포가 안전성 및 유효성을 지니고 있음을 알 수 있었다.

본 발명의 다른 실시예에서는 상기 제조된 신경줄기세포를 알쯔하이머병 동물모델에 이식하여 안전성 및 효능을 확인하였다. 그 결과, 별다른 독성을 보이지 않고, 알쯔하이머병이 치료되어 본 발명의 신경줄기세포가 안전성 및 유효성을 지니고 있음을 알 수 있었다.

따라서, 본 발명의 인간 신경줄기세포는 신경계 질환 및 손상, 특히 현재 특 별한 치료법이 없으며 영구적 신경학적 후유증을 남기는 척수 손상, 파킨슨병, 뇌졸중, 근위축성 척수측색경화증, 운동신경손상, 외상에 의한 말초신경손상, 허혈성 뇌손상, 신생아 저산소성 허혈성 뇌손상, 뇌성마비, 간질, 난치성 간질, 알츠하이머병, 선천성 대사성 신경계질환, 외상성 뇌손상 (traumatic brain injury) 등의 치료에 유효한 효과를 가지며, 본 발명의 인간 신경줄기세포를 포함하는 약학적 조성물은 신경계 손상의 치료를 위한 새로운 방법을 제공하는 효과가 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

인간 신경줄기세포의 분리 및 배양

<1-1> 뇌조직의 분리

세브란스병원 IRB(Institution Review Board)의 승낙을 받은 후, 보건복지가족부의 생명윤리법안과 교육과학기술부 세포응용연구사업단 윤리위원회의 연구지침 및 신촌 세브란스 병원의 인체조직 연구관리 지침을 따라 임신 13주에 자연 유산되어 사망한 태아의 사체를 사전에 보호자의 동의서를 받고 획득하였다. 태아 사체를 멸균된 차가운 H-H 완충용액(Hanks' balanced salt solution, 1× [GIBCO]+HEPES, 10 mM [GIBCO] in ddH₂O, pH 7.4)으로 세척하고, 현미경 하에서 중추신경계만 해부하였다. 이후, 뇌척수막과 혈관을 모두 제거하고 종뇌(telencephalon) 부위의 조직을 따로 분리하였다.

분리된 뇌 조직을 패트리 디쉬(petri dish)에 담고, 약 1× 1 mm 크기로 잘랐다. 950 rpm에서 3분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 조직을 다시 H-H 완충용액으로 세척하고, 상기 원심분리를 3회 반복 수행하였다. 마지막 원심분리를 수행한 후 상층액을 모두 제거하고, 남은 조직에 0.1% 트립신(Gibco) 5 ㎖과 DNase I(Roche, 1 ㎎/㎗)을 첨가하여 잘 혼합하였다. 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 30분간 반응시켰다. 30분 후 트립신 저해제 (T/I, Soybean, Sigma, 1 ㎎/㎖) 함유되어 있는 H-H 완충액 5 ㎖ 첨가하였다. 혈청 피펫(serologic pipette, Falcon)으로 천천히 조직을 잘게 부수기 시작하여 단일세포 수준까지 해리시켰다. 이후, 원심분리를 하여 상층액을 제거한 후, 세포 펠렛(pellet)을 H-H 완충용액으로 세척하였다. 그리고 다시 원심분리를 한 후, 상층액을 제거하였다.

<1-2> 신경줄기세포로의 증식

상기 실시예 <1-1>을 통해 얻어진 뇌조직의 세포 펠렛에 N2 배지(D-MEM/F-12 [98% volume(v)/volume(v)]+N2 supplement [1% v/v]+Penicillin/Streptomycin [1% v/v]; 모두 GIBCO 제품) 10 ㎖을 첨가하여 천천히 혼합하였다. 약 4× 10⁶-6× 10⁶개의 세포를 조직배양 처리 100 mm 플레이트(tissue culture treated 100 mm plate, Corning)에 옮겼다. 신경줄기세포 성장인자로 20 ng/㎖ bFGF(recombinant human fibroblast growth factor-basic, R & D), 10 ng/㎖ LIF(recombinant human leukemia inhibitory factor, Sigma) 및 8 ㎍/㎖ 헤파린(Sigma)을 각각 첨가하여 좌우앞뒤로 잘 흔든 후, 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 24시간 후, 5 ㎖의 배지를 버리고, 새로운 N2 배지 5 ㎖를 첨가하였다. 동시에 20 ng/㎖ bFGF, 10 ng/㎖ LIF 및 8 ㎍/㎖ 헤파린을 첨가하고, 계속하여 배양하였다. 배지 교환은 배지와 세포의 상태를 관찰하면서 3-4일마다 수행하였다. 이 때 약 절반 정도의 배지만을 새 배지로 교환하고 성장인자를 함께 첨가하였다.

<1-3> 계대배양

상기 실시예 <1-2>를 통해 미분화된 신경줄기세포가 계속 증식하여 서로 뭉쳐져 세포덩어리, 즉 신경구(neurospheres)를 형성하면서 자라기 시작하면(도 1), 보통 7-8일마다 계대배양을 실시하였다. 계대배양은 다음과 같은 방법으로 실시하였다: 세포 배양 플레이트에서 배지를 모두 제거하였다. 세포에 0.05% 트립신/EDTA(T/E, Gibco) 2 ㎖를 처리하고, 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 2분 30초간 반응시켰다. 이후, 트립신의 작용을 중단시키기 위하여 트립신 저해제(T/I, Soybean, Sigma, 1 ㎎/㎖) 2.5 ㎖를 첨가하여 잘 혼합하였다. 세포 현탁액을 15 ㎖ 코니컬 튜브(cornical tube, Falcon)에 옮겼다. 원심분리를 하여 상층액을 제거하였다. 세포를 N2 배지 3 ㎖로 재부유시킨 다음, 신경구가 단일세포로 해리될 때까지 혈청 피펫으로 잘게 부쉈다. 세포수를 측정한 후, 약 4× 10⁶ ~ 6× 10⁶개의 세포를 포함하고 있는 세포 현탁액을 기존의 배지가 일부 포함되어 있는 새로운 세포 배양 플레이트에 옮기고, 부족한 N2 배지를 첨가하여 총 10 ㎖의 배지가 되게 하였다. 그리고 20 ng/㎖ bFGF, 10 ng/㎖ LIF 및 8 ㎍/㎖ 헤파린을 첨가한 후, 계속하여 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다.

<1-4> 동결보관( cryopreservation )

상기 실시예 <1-3>에 기재된 방법에 따라 계대배양을 계속하여 충분한 수의 신경줄기세포를 획득하면 일부 세포는 동결보관하였다. 동결보관은 다음과 같은 방법으로 수행하였다: 세포 계대배양시와 같이 0.05% 트립신/EDTA와 트립신 저해제를 차례대로 처리한 신경구를 잘게 부수어 15 ㎖ 튜브에 모두 옮겼다. H-H 완충용액 8 ㎖를 첨가하여 세포를 세척하였다. 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 세포 펠렛에 미리 준비한 4℃ 동결보관 용액(N2 배지[40% v/v]+FBS [50% v/v]+DMSO[10% v/v, Sigma])을 첨가하여 부드럽게 세포를 재부유시켰다. 세포 현탁액을 1개의 동결 유리병(freezing vial, NUNC)에 1.8 ㎖씩 분주하였다. 보통 10 mm 세포 배양 플레이트 1개에 들어있는 세포를 3-4개의 동결 유리병으로 분주하였다. 이후, 아이스 버킷(ice bucket)에 보관한 상태에서 -70℃의 냉동고로 옮겼으며, 최소 24시간 후에 다시 액체질소탱크로 옮겨 장기 보관하였다.

<1-5> 동결보관된 세포의 해동

동결보관된 세포를 해동시킬 때는 동결 유리병을 37℃ 항온수조에 담가 천천히 흔들었다. 세포가 절반정도 해동되었을 때 세포 현탁액을 미리 37℃로 데워진 N2 배지 10 ㎖가 담겨져 있는 코니컬 튜브에 옮겼다. 원심분리를 하여 상층액을 제거하였다. 세포 펠렛을 N2 배지 5 ㎖ 로 조심스럽게 부유시켜 60 mm 세포배양 플레이트에 옮겼다. 이후, 플레이트에 20 ng/㎖ bFGF, 10 ng/㎖ LIF 및 8 ㎍/㎖ 헤파린을 첨가한 후, 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 세포가 신경구를 형성하면서 자라면 다시 상기 실시예 <1-3>에 기재된 방법에 따라 계대배양을 하였다. 대개 10일 정도 지나면 10 mm 세포 배양 플레이트에 옮길 수 있을 만큼 자라게 된다.

< 실시예 2>

인간 신경줄기세포의 마우스 이식 및 효과 확인

본 발명의 인간 신경줄기세포가 척수 손상에 대해서 재생효과를 지니는지 확인하기 위하여 척수손상 동물모델에 이식한 후 그 결과를 확인하였다. 척수손상은 NYU (New York University) 임팩트(impact) 모델을 사용하였는데, 스프라그-돌리(Sprague-Dawley) 성체 쥐 (체중 300-350 gm)를 마취하고 제 9-10 번 흉수 (thoracic spine)부위에 추궁절제술 (laminectomy)를 시행한 후, 척수의 배면 (dorsal part)에 직경 2 mm, 무게 10 그람(gm)의 무게추를 25 mm 높이에서 떨어뜨 려 중등도 좌상성 척수손상 (moderate contussive spinal cord injury)을 유발하였다 (Basso et al., J Neurotrauma 1995;12:1, Liu et al., J Neurosci 1997;17:5395). 척수손상 유발 7-8일 후 손상부위에 상기 확립된 인간 신경줄기세포 10μl (4 x 10⁴ cells/μl)를 글라스 마이크로파이펫(glass micropipette)을 이용하여 이식하였고, 면역거부반응을 피하기 위하여 세포 이식군 및 H-H 완충액을 주사한 대조군 모두에서 세포이식 하루 전부터 세포이식 후 12주일까지 면역억제제인 싸이클로스포린(cyclosporine, 10 mg/kg)을 매일 복강 내 주사하였다.

세포이식 2, 4, 6, 12주일 후 각각 쥐의 척수조직을 분석하였는데, 도 1에서 보듯이, 세포 이식 후 12주일이 경과하여도 human-specific nuclei antigen (hNuc; Chemicon, Temecula, CA) 면역염색 양성인 빨간색의 많은 인간 신경줄기세포가 이식된 척수손상 부위뿐만 아니라 주위 척수 부위까지 광범위하게 이주하여 생착됨을 보이고, 생착된 공여세포 부위를 따라 Neurofilament (NF; Sternberger, USA) 면역염색 양성인 녹색의 손상된 숙주 척수신경돌기가 길게 신전되어 있는 것으로 보아 공여세포는 세포이식 부위 및 주위의 상하 척추 1-2 segment 부위까지 광범위하게 이주하여 생착함을 보였고, 생착된 공여세포를 따라 손상 혹은 절단된 숙주 척수신경세포의 축삭돌기가 크게 신전되어 있어 이식한 공여세포가 손상된 숙주 신경세포돌기의 재생을 촉진시킴을 확인할 수 있었다.

아울러, 도 2에서 보듯이, human-specific nuclei antigen (hNuc; Chemicon, Temecula, CA) 면역염색 양성인 빨간색의 이식된 인간 신경줄기세포가 척수손상 부위에서 각각 신경원세포(neurons)(도 2A), 성상세포(astrocytes)(도 2B), 희소돌기아교세포(oligodendrocytes)(도 2C)로 분화하였으며, 일부 세포는 인간 미분화 신경줄기세포의 표지인자인 hNestin을 표현하는 미분화된 상태를 유지함을 알 수 있었다.

또한, 척수손상 유발 1주일 후부터 척수손상 부위에 인간 신경줄기세포를 이식한 이식군 (쥐 20마리)과 H-H 완충용액만 주사한 대조군 (쥐 15마리)에서 뒷발의 운동기능을 평가하기 위하여 BBB (Basso-Beattie-Bresnahan) locomotor rating scale (Basso, et al., J Neurotrauma 1995;12:1) 을 이용한 BBB 점수를 1주일 간격으로 3개월간 측정하였는데, 3개월 후 인간 신경줄기세포 이식군의 평균 BBB 점수는 왼쪽 발은 11.8±0.4점 (평균값±표준오차), 오른쪽 발은 12.2±0.6점 이었고, 대조군의 왼쪽 발은 9.0±0.4점, 오른쪽 발은 8.6±0.2점으로 신경줄기세포 이식 군에서 대조군에 비해 운동기능이 통계적으로 의의있게 향상됨을 보였다 (p<0.05).

세포이식 12주 후 세포 이식 군과 대조군에서 운동 및 감각기능을 객관적으로 평가하기 위하여 운동유발전위검사 (motor evoked potential; MEP)와 체성감각유발전위검사 (somatosensory evoked potential; SSEP) 등의 전기생리학적 검사를 실시하였다 (Fehlings et al., Electroencephalogr Clin Neurophysiol 1988;69:65). 체성감각유발전위검사상 대조군 (3마리) 에서 N1파와 P1파의 평균 잠복시간 (latency)은 각각 46.7 msec, 68.6 msec 였고, 진폭 (amplitude)은 각각 4.3 μv, 6.2 μv였다. 이식 군 (3 마리)에서 N1파와 P1파의 평균 잠복시간은 각각 36.6 msec, 61.8 msec 였고, 진폭은 각각 18.9 μv, 33.1 μv였다. 따라서 대조군에 비해 이식군에서 체성감각유발전위검사 파의 잠복시간은 짧아졌고, 진폭은 증가하여 부분적인 감각기능의 호전을 보였다. 운동유발전위검사상 대조군 (3마리) 에서 N1파와 P1파의 평균 잠복시간은 각각 58.7 msec, 81.5 msec 였고 진폭은 각각 1.0 μv, 0.4 μv였으나, 이식 군 (3 마리)에서 N1파와 P1파의 평균 잠복시간은 각각 49.0 msec, 73.8 msec 였고 진폭은 각각 1.5 μv, 2.9 μv였다. 따라서 대조군에 비해 이식군에서 운동유발전위검사 파의 잠복시간은 짧아졌고, 진폭은 증가하여 운동기능의 부분적인 호전을 보였다.

인간 신경줄기세포의 척수이식 후 약 12주간 동물을 관찰한 결과, 모든 실험군에서 비정상적인 행동 및 신경학적 소견을 보이거나 종양 형성을 관찰 할 수 없었으며, 세포조직학적 분석을 시행한 모든 동물에서도 척수손상 부위 및 그 주변 부위에서 종양, 출혈 및 이상 면역반응의 발생이 관찰되지 않았다.

< 실시예 3>

인간 신경줄기세포의 이식 및 효과 확인

<3-1> 이식 대상 환자

본 발명의 신경줄기세포가 이식된 환자는 외상으로 인하여 경수 부위 (cervical spine)에 척수손상을 받아 사지마비를 보이는 환자로서, 15 내지 60세 사이의 성인이고, 척수손상에 대한 다른 세포치료 받은 경력이 없으며, 척수손상 외에 하지에 골절 혹은 기타 연관손상 (associated injury)이 없고, 줄기세포 이식술 및 신경기능 평가에 영향을 줄 수 있는 중증의 내외과적 질환이 없으며, 종양성 척수질환이나 척수손상으로 인한 상하지 관절 및 근육의 위축이 없고, 다른 진행성/비진행성 중주 및 말초신경계 질환, 약물중독 혹은 기타 정신과적 질환이 동반되지 않은 환자이다. 아울러, 대상 환자는 기계적 척수신경 압박이 있어 이차 감압수술이 필요하거나, 다발성 부위에 척수손상, 기타 주치의 판단 하에 이식술에 부적합한 요인 등이 동반된 경우는 제외하였다.

<3-2> 이식전 검사

줄기세포 이식술 전 기본적 혈액 및 화학 스크리닝(screening) 진단검사 (CBC, urinalysis, BUN/creatinin, liver function test 등), 이학적 검사, ASIA (American Spinal Injury Association) 2002 점수평가와 감각 및 운동신경의 선택 요소(optional elements)를 포함한 신경학적 검사 (Reference manual for the international standards for neurological classification of spinal cord injury; Braddom RL, Physical medicine & rehabilitation, 3rd edition, Saunders Elesevier, Philadelphia, 2007, pp1295, 1297-1299; Delisa JA, Phisical medicine & rehabilitation, 4th edition, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, 2005, pp1719-1721), 호흡능력평가 (Kang SW, et al., J Korean Acad Rehab Med 2007;31:346), 척수 자기공명영상 (spine MRI), 세계통증연구학회 (IASP) 분류법 기준에 따른 환자 통증 평가 (VAS 점수)(Ohnhaus EE, et al., Pain 1975;1:379; Wewers ME, et al., Res Nurs Health 1990;13:227), 경직정도 평가 (modified Ashworth scale)(Ashworth B, Preliminary trial of carisoprodol in multiple sclerosis, Practitioner 1964;192:540; Braddom RL. Physical medicine & rehabilitation, 3rd edition. Saunders Elesevier, Philadelphia, 2007, pp652), 전기진단검사 (양측 상하지에 근전도검사 [EMG;electromyography])(Liveson JA, Ma DM, Laboratory reference for clinical neurophysiology, F. A. Davis company, Philadelphia, 1992, pp82-85, 98-100, 133-137, 147-149, 195-200, 204-207, 219-221; Dumitru D, Amato AA, Zwarts M, Electrodiagnostic medicine, 2nd edition, Hanley & Belfus, Philadelphia, 2002, pp200-204, 211-213)와 운동유발전위검사 (MEP; motor evoked potential)(Chen R, et al., Clinical Neurophysiology 2008;119:504; Liveson JA, Ma DM, Laboratory reference for clinical neurophysiology. F. A. Davis company, Philadelphia, 1992, pp357-362; Dumitru D, Amato AA, Zwarts M, Electrodiagnostic medicine, 2nd edition, Hanley & Belfus, Philadelphia, 2002, pp419-420), 양측 정중신경 (median nerve), 척골신경 (ulnar nerve), 경골신경 (tibial nerve), 비골신경 (peroneal nerve)과 음부신경 (pudendal nerve)에 체성감각유발전위검사 (SSEP; somatosensory evoked potential)(Liveson JA, Ma DM, Laboratory reference for clinical neurophysiology. F. A. Davis company, Philadelphia, 1992, pp278-297, 301-304; Dumitru D, Amato AA, Zwarts M, Electrodiagnostic medicine, 2nd edition, Hanley & Belfus, Philadelphia, 2002, pp384-395, 400) 를 모두 실시하였다.

ASIA 2002 점수평가 시 반드시 전기진단검사를 함께 실시하여 말초신경 손상은 동반되지 않아야 하며, 척수분절 (spinal segment) 천수 (sacrum) 부위 (S4-5)에 감각 및 운동기능이 없으면서 SSEP 검사 상에서도 반응이 없는 경우를 완전 척수손상 (complete spinal cord injury; ASIA-A)이라 정의하고, 신경학적 검사와 ASIA 2002 점수 상 완전 척수손상으로 평가되나 SSEP 검사 상 잠시 전자파의 지연 (latency)을 보이더라도 전자파가 관찰되는 경우에는 불완전 척수손상 (ASIA-B)이라 정의하였는데, 운동 완전손상 (motor complete injury; ASIA-A; 15명, ASIA-B; 2명) 환자 17례를 확인하였다(표 1 참조).

<3-3> 인간 신경줄기세포의 이식

본 환자들을 대상으로 척수손상 후 2-8주일 사이 (아급성 척수손상; 11례) 및 8주일 이후 (만성 척수손상; 6례)에 모두 전신마취하고 추궁절제술 (laminectomy)을 시행한 후 척수 경막 (dura)을 열었다. 수술현미경 하에서 척수 MRI 소견 상 확인된 척수손상 중앙부위 (epicenter)의 정중앙 (midline)에 23G needle을 접근시켜 척수 배면 (dorsal part) 표면에서 직각으로 5 mm 삽입한 후 미리 확립된 동종 인간 신경줄기세포 부유액 0.5 ml (1.0 x 10⁵/μl)를 3분에 걸쳐 천천히 주사하고 2분간 기다린 후 바늘을 빼고, 또 척수손상 중앙부위의 정중앙에서 5 mm 근위 부 (proximal part)와 원위 부 (distal part)에 각각 상기와 동일한 방법으로 인간 신경전구세포 부유액 0.25 ml (1.0 x 10⁵/μl) 씩을 3분에 걸쳐 천천히 주사하였다.

면역억제제인 싸이클로스포린(cyclosporine)은 줄기세포 이식 3일 전부터 투여 (3 mg/kg/day, #2, po)하기 시작하여 이식 후 2주까지는 같은 용량으로 투여하였고, 그 후 2 mg/kg/day로 감량하여 4주간 투여하였으며, 그 후 2주간 1 mg/kg/day 로 감량하여 투여한 후 투약 중단하였다.

<3-4> 이식 경과 및 치료 효과 확인

줄기세포 이식 후 상기 실시예 <3-2>에서와 같이 다음과 같은 검사를 수행하였다: 3일, 1주, 2주, 4주, 6주, 2개월, 3개월, 6개월에 혈액 및 화학검사를 실시하고, 이식 후 1주부터 6주까지는 매주, 이 후 2개월, 3개월, 6개월, 9개월, 12개월에 이학적 검사, 신경학적 검사, ASIA 2002 점수평가, 통증 및 경직정도 평가를 실시하였으며, 척수 MRI 검사는 이식 후 1주, 8주, 6개월 및 12개월에 실시하고, EMG, SSEP 및 MEP 검사는 이식 후 2개월, 6개월 및 12개월에 시행하였다.

대상 환자 모두에서 동일하게 기존의 척수손상 환자들에게 시행하는 물리치료와 작업치료를 시행하여 중추신경계발달 치료 (neurodevelopmental treatment) 및 기립기 (standing flame), 유산소운동을 위한 전동자전거 운동 등을 시행하였고, 환자의 마비 정도에 따라 앉는 자세에서의 균형 연습 및 일상생활동작 수행 연습 (ADL training) 등을 시행하였다. 환자가 이식 후 운동 수준 (motor level)의 호전이 보이면, 운동 수준 (motor level)의 호전 정도에 따라 근전도검사를 사용한 생체되먹임치료 (biofeedback)를 통해 신경근골격 재교육 (neuromuscular reeducation)을 시행하였고, 하지의 central pattern generator를 자극하기 위해 수치료 (pool therapy)를 시행하였다.

줄기세포 이식 후 평균 11개월 이상 (12개월 이상; 13례, 10개월; 1례, 7개월; 3례, 4개월; 1례) 동안 관찰한 결과, 표 1에서 보듯이, ASIA-A 환자 15례 중 1례는 ASIA-B로, 2례는 ASIA-C로 변화하고 (ASIA-A 환자 중 20%에서 ASIA 등급변화가 일어남, 등급변화가 일어난 환자는 모두 아급성 척수손상 환자, 기준이 다양하지만 문헌보고(Bedbrook GM, et al., Paraplegia 1982;20:321; Frankel HL, et al., Paraplegia 1969;7:17992; Marino RJ, et al., Paraplegia 1995;33:510; Maynard FM, et al., J Neurosurg 1979;50:611; Stover SL, et al. J Urol 1986;135:78; Wu L, et al. Arch Phys Med Rehabil 1992;73:40)에 의하면 0-11%에 서 자연재생에 의하여 ASIA 등급변화가 일어남), ASIA-B 환자 2례 중 2례 모두 ASIA-D로 변화 (100% ASIA 등급변화, 등급변화가 일어난 환자는 모두 아급성 척수손상 환자, 문헌보고(Waters RL, et al., Arch Phys Med Rehabil 1994;75:306; Crozier KS, et al., Arch Phys Med Rehabil 1991;72:119; Folman Y, et al., Injury 1989;20:92; Foo D, et al., Surg Neurol 1981;15:389; Katoh S, et al., Paraplegia 1995;33:506)에 의하면 11-14%에서 66-89%까지 다양하게 자연재생이 일어남) 하여 운동 완전 척수손상 환자 중 29%에서 ASIA 등급변화를 나타낼 정도의 임상적 호전을 보였다.

그러나 실제 ASIA-A 환자 중 3례(표 1의 04_김00, 05_박00 및 10_곽00)에서는 수술 소견 상 중증의 척수 위축을 보여 거의 손상 부위가 잘려진 상태여서 줄기세포 주사시 세포액이 척수 바깥으로 새는 수준이었다. 따라서 이러한 환자는 실제 중증 척수위축 부위에 줄기세포 이식만으로는 임상적 호전을 기대하기 어려운 실정이어서 3례의 환자를 제외할 경우, ASIA-A 환자 중 신경줄기세포 이식 후 25%에서 호전을 보였고, 운동 완전손상 환자 전체 중에서는 신경줄기세포 이식 후 36%에서 호전을 보였다.

그리고 줄기세포 이식 후 ASIA 2002 평가 상 등급 변화가 없었던 ASIA-A 환자 12례 중 (아급성 척수손상 6례, 만성 척수손상 6례), 3례 (모두 만성 척수손상)를 제외하고는 모두 운동지표점수 (AMS; ASIA motor score)가 이식 전에 비하여 5% 이상 호전을 보여 전체 ASIA-A 환자 중 75%에서, 전체 운동 완전 척수손상 환자 중 82% 이상(17례 중 14례)에서 운동기능의 호전을 보였다. ASIA-A 환자 중 수술 소견 상 중증의 척수 위축을 보여 거의 손상 부위가 잘려진 상태여서 줄기세포 주사시 세포액이 척수 바깥으로 새는 수준이어서 실제 줄기세포 이식 후에 임상적 호전을 기대하기 어려운 실정인 상기 3례 (04_김00, 05_박00, 10_곽00)의 환자에서도 1례 (10_곽00 환자)를 제외하고는 줄기세포 이식 후 운동지표점수가 5% 이상 호전을 보였다. 그리고 대상 환자 전체에서 줄기세포 이식 관련 부작용 (출혈, 종양, 동통, 경직, 감염증, 이상 면역반응, 신경학적 이상 소견, 척수 MRI 검사 상 이상 소견) 발생을 관찰할 수 없었다.

척수손상 환자명단	ASIA 등급 ( 이식전 )	ASIA 등급 ( 이식후 )	척수손상-세포이식 소요기간	운동점수 ( AMS ) ( 이식전 )	운동점수 ( AMS ) ( 이식후 )	운동점수 ( AMS ) 호전율	감각점수-가 벼운촉감 ( ASS -L) ( 이식전 )	감각점수-가 벼운촉감 ( ASS -L) ( 이식후 )	감각점수-가 벼운촉감 ( ASS -L) 호전율	감각점수-핀 촉감 ( ASS -P) ( 이식전 )	감각점수-핀 촉감 ( ASS -P) ( 이식후 )	감각점수-핀 촉감 ( ASS -P) 호전율
ASIA 점수 무 변화 환자 (A → A)
01_신00	A	A	38일	0	6	6%	10	12	2%	12	12	0%
02_김00	A	A	46일	0	8	8%	11	13	2%	11	11	0%
03_권00	A	A	82일	29	38	12.7%	25	25	0%	25	25	0%
04_김00	A	A	53일	12	24	13.6%	13	19	6.1%	13	14	1%
05_박00	A	A	141일	13	18	5.7%	17	18	1.1%	16	18	2.1%
06_임00	A	A	75일	2	3	1%	12	14	2%	12	14	2%
07_임00	A	A	123일	6	6	0%	12	12	0%	9	12	2.9%
08_김00	A	A	28일	0	5	5%	8	15	6.7%	8	14	5.8%
09_박00	A	A	59일	26	36	13.5%	21	31	11%	22	24	2.2%
10_곽00	A	A	7개월	1	1	0%	11	12	1%	10	12	2%
11_황00	A	A	16일	10	26	17.8%	19	19	0%	16	18	2.1%
12_임00	A	A	33일	9	18	9.9%	19	29	10.8%	16	18	2.1%
ASIA 점수 변화한 환자 (A → B, C)
13_최00	A	C	21일	15	29	16.5%	13	16	3%	13	22	9.1%
14_임00	A	B	48일	18	24	7.3%	22	76	60%	19	24	5.4%
15_김00	A	C	18일	9	19	11%	10	15	4.9%	12	26	14%
ASIA 점수 변화한 환자 (B → D)
16_전00	B	D	25일	28	76	66.7%	68	70	4.6%	31	46	18.5%
17_김00	B	D	22일	50	72	44%	65	94	61.7%	38	70	43.2%

< 실시예 4>

인간 신경줄기세포의 저산소성 허혈성 뇌손상 마우스 이식 및 효과 확인

본 발명의 인간 신경줄기세포가 신생아의 저산소성 허혈성 뇌손상에 대해서 재생효과를 가지는지 확인하기 위하여 신생아 저산소성-허혈성 뇌손상 동물모델에 이식한 후 그 결과를 확인하였다. 동물모델은 생후 7일의 ICR 마우스에서 우측 경동맥(common carotid artery)를 노출시키고 영구적으로 결찰 하여 허혈성 뇌손상을 유발하였다. 2시간의 회복시간 후 온도 조절장치와 산소 측정기가 장착된 챔버(chamber)내에서 37℃, 산소 8%의 환경에서 1시간 30분 동안 유지하였다 (Park KI et al., Nat Biotech 2002; 20:1111). 뇌손상을 유발한지 1주일 후 동물모델을 케타민(ketamine; 50㎎/㎏)과 롬펀(Rompun; 10㎎/㎏)으로 마취시키고, 머리의 피부를 70% 알코올로 소독하고 절개한 후, 글라스 마이크로파이펫 (glass micropipette)을 이용하여 인간 신경줄기세포 12㎕(1×10⁵cells/㎕)를 쥐의 뇌경색 부위에 주사하였고 일부는 대조군 실험을 위해서 H-H 버퍼(buffer) 12㎕를 쥐의 뇌경색 부위에 주사하였다. 수술부위는 요오드 연고로 소독하고 봉합하였으며, 마취가 깰 때까지 37℃ 웜패드(warm pad)에서 안정화시키고, 이식된 인간 신경줄기세포에 대한 면역거부반응을 막기 위해서 이식 하루 전부터 실험동물이 사망할 때까지 매일 싸이클로스포린(cyclosporine; 10mg/kg/day)을 복강 내 주사하였다. 인간 신경줄기세포 이식이 실험동물에 미치는 영향을 평가하기 위하여 세포이식 후 3주부터 11주까지 2주 간격으로 동물모델의 신경학적 행동검사를 실시하였고 11주에는 공간지각 학습 및 기억능력을 평가하기 위한 행동검사를 실시하였다. 세포이식 후 12주에 실험쥐들의 뇌조직을 얻어 분석하였다.

세포이식 후 12주일에 실험쥐들의 뇌조직을 분석하였는데, 도 3에서 보듯이hNuMA(human specific nuclear matrix; Calbiochem, Germany) 면역염색 양성인 빨간색의 많은 인간 신경줄기세포가 이식된 뇌경색증 주변부로부터 대뇌피질 (cerebral cortex), 해마 (hippocampus), 뇌량 (corpus callosum), 뇌백질 신경로 (white matter tract), 측 내실 (lateral ventricle) 주변까지 광범위하게 이주하여 생착됨을 알 수 있었다. 생착된 공여세포가 뉴로필라멘트(Neurofilament, NF; sternberger, USA) 면역염색 양성인 녹색임을 통해서 신경원세포로 분화되었음을 알았고, 미엘린 염기성 단백질(Myelin basic protein; MBP; DAKO, Carpinteria, CA) 면역염색 양성인 녹색임을 통해서 희소돌기아교세포로 분화되었음을 알았으며, GFAP(Glial fibrillary acidic protein ; DAKO, Carpinteria, CA) 면역염색 양성인 녹색임을 통해서 성상세포로 분화되었음을 관찰하였다. 면역염색 빨간색과 녹색 모두 양성인 경우 노랑색으로 관찰되었다.

이식된 인간 신경줄기세포가 신경원세포로 분화된 경우 어떤 신경전달물질(neurotransmitter)를 분비하는지 알아보기 위해 면역염색을 실시하였다. 도 4에서 보듯이 hNuMA 면역염색 양성인 빨간색의 인간 신경줄기세포가 글루타메이트(Glutamate; Glut; Sigma, Saint Louis, MO) 면역염색 양성인 녹색을 나타내 글루타매터직 뉴런(glutamatergic neuron)으로 분화했음을 알 수 있었고, GABA (γ-Aminobutyric acid; Sigma, Saint Louis, MO) 면역염색 양성인 녹색을 나타내 가바어직 뉴런(GABAergic neuron)으로 분화했음을 알 수 있으며, 콜린아세틸전이효소(Choline acetyl transferase; Chat; Chemicon, Temecula, CA) 면역염색 양성인 녹색을 나타내 콜리너직 뉴런(cholinergic neuron)으로 분화했음을 알 수 있었다. 또 hNuMA 면역염색 양성인 빨간색의 인간 신경줄기세포가 시냅신 I(Synapsin I; Syn-1; Chemicon, Temecula, CA) 면역염색 양성인 녹색을 나타내 뉴런으로 분화된 인간 신경줄기세포가 시냅스를 형성했음이 관찰되었다. 면역염색 빨간색과 녹색 모두 양성인 경우 노랑색으로 관찰되었다.

세포이식 후 3주부터 11주까지 2주 간격으로 동물모델의 신경학적 행동검사에서는 꼬리걸기(tail suspension), 앞다리굴절(forelimb flexion), 몸비틀기(torso twisting), 우측반향(right reflection), 환경반응(placing reaction), 발가락늘이기(toe spreading)의 6가지 항목을 평가하는데 (Brooks and Dunnett, Nat Rev Neurosci 10:519, 2009), 정상적인 움직임을 보일 경우는 0점이고 비정상적 움직임을 보일경우 1점을 부여하게 된다. 도 5에서 보듯이 실험동물에 인간 신경줄기세포를 이식한 경우 (hNSC;29마리) 이식 3주후 신경학검사 점수는 1.14±1.1 (평균±표준오차), 5주후 0.86±0.99, 7주후 0.83±0.85, 9주후 0.76±0.91, 11주후 0.62±0.73이었고, H-H 버퍼를 이식한 대조군의 경우(vehicle;33마리) 신경학검사 점수는 3주후 1.39±1.20, 5주후 1.45±1.03, 7주후 1.39±1.00, 9주후 1.42±1.03, 11주후 1.58±1.12이었다.

따라서 인간 신경줄기세포를 이식한 경우 점차적으로 신경학적 행동검사에서 병적증상이 호전되는 것이 관찰되었고, H-H 버퍼를 이식한 대조군과 경우와 비교해서 이식 5주차부터 통계적으로 유의하게 좋아짐이 관찰되었다. (p<0.05)

인간 신경줄기세포 이식 후 11주에 실시된 공간지각 학습 및 기억능력 행동검사 (Morris water maze test)를 실시하였다 (Gerlai, Behav Brain Res 125:269, 2001). 대상 쥐을 6일 동안 매일 수조에서 특정 위치를 교육시킨 후 7일째에 그 위치가 속하는 사분면에 머무는 시간(goal quadrant spent time)을 평가하였다. 6일 동안 대상 쥐에서 특정위치를 학습하는데 있어서 인간 신경줄기세포 이식군 (hNSC)과 H-H 버퍼 이식군 간에 차이는 나타나지 않았으나, 도 6에서 보듯이 7일째 욕조의 특정위치가 속하는 사분면 (quadrant)에 머무는 시간은 인간 신경줄기세포를 이식받은 경우 (hNSC;20마리)는 20.28±7.83초, H-H 버퍼를 이식받은 경우(vehicle;28마리)는 16.69±5.24초였다. 따라서 신경줄기세포를 이식받을 경우가 공간 기억 능력이 향상되어 대조군에 비하여 학습된 특정위치가 속한 사분면을 기억하여 머무는 시간이 긴 것을 보였고 두 군 간에 통계적으로 유의한 차이를 보였다 (p<0.05).

<실시예 5>

인간 신경줄기세포의 난치성 간질 모델 ( 킨들링 모델) 이식 및 효과 확인

본 발명의 인간 신경줄기세포가 간질에서 발작 억제 효과를 지니는 지 확인하기 위해서 간질 동물모델에 이식한 후 그 결과를 확인하였다. 간질모델은 측두엽 간질의 가장 널리 쓰이는 모델은 킨들링(Kindling) 모델과 간질 중첩증(Status epilepticus; SE)이며 본 실험에서는 킨들링 모델을 사용하였다 (Morimoto K, et al., Prog Neurobiol 2004;73:1). 스프라그-돌리(Sprague-Dawley) 성체 쥐(체중 300gm)를 마취하고 오른쪽 해마(hippocampus) 등 쪽 CA3에 양극 전극(bipolar electode)을 삽입하고 일주일간 회복시킨 후 매일 두 번씩 전기 자극(2msec, 50Hz, biphasic rectangular, constant current stimulation, 1 sec duration)을 주면서 비디오와 뇌파도(electroencephalogram, EEG) 저장 장치로 행동과 EEG의 변화를 관찰하였다. 자극의 세기는 EEG에서 후방전 (afterdischarge, AD)의 발생이 나타나는 최소의 값을 AD 역치값으로 정하고 실험과정에서 일정하게 유지하였다. 초기에 AD 역치값의 자극은 외관상 발작을 일으키지 못하나 자극이 계속됨에 따라 발작의 정도를 나타내는 Racine 등급 1부터 6까지 순차적으로 발작이 심화되고, Racine 등급 5 이상을 연속적으로 5번 하면 킨들링 모델이 되었다고 정의한다(Racine RJ, Electroenchepalogr Clin Neurophysiol 1972;32:281, Pinel JP, et al., Exp Neurol 1978;58:335, T. Nishimura, et al., Neuroscience 2005;134:691, McIntyre DC, et al., Epilepsy Res 1993;14:49, Mirnajafi-Zadeh, et al., Brain Res 2000;858:48, Vezzani, et al., Neurosci Lett 1988;87:63). 킨들링 모델 확립 일주일 후 자극 부위에 상기 확립된 인간 신경줄기세포 4μl (1 x 10⁵ cells/μl)를 이식하였고, 면역거부반응을 피하기 위하여 세포 이식군 및 H-H 완충액을 주사한 대조군 모두에서 세포 이식 하루 전부터 세포이식 후 8주일까지 면역억제제인 싸이클로스포린(cyclosporine, 10mg/kg)을 매일 복강 내 주사하였다.

세포이식 2, 4, 8주일 후 각각 쥐의 뇌 조직을 분석하였는데, 도 7에서 보듯이 세포이식 후 8주일 경과하여도 세포이식 전 신경줄기세포에 표지한 BrdU (5-Bromo-2-deoxyuridine; Roche, USA) 면역염색 양성인 녹색을 띠는 많은 공여세포가 세포 이식된 등 쪽 해마의 CA3 뿐만 아니라 경련발작의 형성에 관여하는 뇌 구조인 해마의 치아이랑(dentate gyrus)과 해마술 (fimbriae)까지 이주하여 생착됨을 보이고, 생착된 공여세포 대부분에서 Tuj1 (β-tubulin Ⅲ; Covance, Berkeley, CA) 면역염색 양성인 빨간색을 발현하고 있어 신경원세포로의 분화를 확인하였다. 또 BrdU 면역 염색 양성인 녹색의 이식된 인간 신경줄기세포 중 다수가 억제성 신경전달물질인 GABA(γ-aminobutyrate; Sigma, USA) 면역염색 양성인 빨간색(도 8A)을 발현하고 있어 발작 발생에 관여하는 흥분성 신경세포를 억제할 수 있음을 확인하였다. 공여세포의 일부는 희소돌기아교세포(oligdendrocytes)(도 8B)로 분화하였다. 간질 모델에서는 일반적으로 경련발작의 생성과 유지에 관여한다고 알려져 있는 중증의 아교세포증식(astrogliosis)을 보이는데 이식된 신경줄기세포는 성상아교세포(astrocytes)로는 전혀 분화하지 않고(도 8C), 오히려 대조군에 비해 이식군에서 숙주동물의 아교세포증식이 감소함을 확인하였다.

난치성 간질 모델에서 인간 신경줄기세포 이식이 간질발작에 미치는 영향을 연구하기 위하여, 신경줄기세포를 이식한 이식군 (쥐 15마리)과 H-H 완충용액만을 주사한 대조군 (쥐 15마리)에서 이식 후에 1주일 간격으로 자극을 주어 8주일간 Racine 등급에 따른 발작 정도 (도 9A)와 뇌파검사 (EEG) 상 (도 9B)의 발작 지속 시간을 관찰하였다. 줄기세포 이식군의 발작 정도는 이식 후에 점차 감소하다가 이식 2, 3주일 후에 통계적으로 유의하게 대조군에 비해 감소함을 보였고 (도 9A)(p<0.05), 발작 지속 시간은 대조군에 비해 이식군에서 세포 이식 4주일 후에 통계적으로 의미있게 감소하는 것을 확인하였다 (도 9B)(p<0.05).

<실시예 6>

인간 신경줄기세포의 알쯔하이머병 모델에 이식 및 효과 확인

본 발명의 인간 신경줄기세포가 노인성 치매의 일종인 알츠하이머병 모델에서 치료적 유용성이 있는지 확인하기 위하여 알츠하이머병 동물모델에 이식한 후 결과를 확인하였다. 알쯔하이머병 동물 모델은 인간 아밀로이드 전구단백질 (amyloid precursor protein, APP) 695 아이소폼(isoform) 유전자의 스웨디쉬(swedish) 돌연변이(KM595/596NL)를 가진 쥐로서 뉴론특이 엔로아제(neuron specific enloase; NSE) 프로모터에 의해서 APP가 발현되는 형질전환 쥐이다 (Hwang DY et al., Exp Neurol 2004;186:20). B57BL/6 계통 쥐와 교배시켜 출생 후 3주 뒤에 한배에서 나온 새끼들의 유전자형을 확정하여 인간 APPsw(AAP의 스웨디쉬 돌연변이)를 가지고 있는 이형접합체(heterozygote) 유전자형 쥐를 실험군, 가지고 있지 않은 정상 쥐를 대조군으로 사용하였다. 생후 13개월 된 APPsw 형질전환 쥐와 정상 대조군 쥐를 자일라진(Xylazine; 0.1mg/10g of mouse)과 케타민(Ketamine; 0.5mg/10g of mouse)으로 마취시키고, 머리의 피부를 70% 알코올로 소독하고 절개한 후, 스테레오택식 장치(stereotaxic apparatus)에 고정된 상태에서 양쪽 측뇌실 (lateral ventricle) 부위(Bregma로부터 뒤로 0.1mm, 옆으로 0.9mm)에 1mm 드릴바(drill bar)로 두개골(skull bone)에 구멍을 뚫었다. 10㎕ 헤밀턴 주사기(Hemilton syringe)에 준비된 인간 신경줄기세포 또는 H-H 버퍼를 담아 스테레오택식 장치에 고정시키고, 뇌경막(dura mater)로부터 깊이 2mm에 마이크로인젝션 펌프(micro injection pump)로 1 ㎕/분의 속도로 천천히 각 측내실에 5㎕ (1×10⁵cells/㎕ 또는 H-H 버퍼)씩 이식하였다. 이식이 끝난 후 2분간 안정화 한 후 다시 3분에 걸쳐 천천히 주사기 바늘을 꺼냈다. 수술부위는 요오드 연고로 소독하고 봉합하였으며, 마취가 깰 때까지 37℃ 웜패드(warm pad)에서 안정화시키고, 이식된 인간 신경줄기세포의 면역거부반응을 막기 위해서 이식 하루 전부터 실험동물을 분석할 때까지 6주 동안 매일 싸이클로스포린 (10mg/kg/day)을 실험군과 대조군 모든 쥐의 복강 내 주사하였다. 세포이식 후 5주에 인간 신경줄기세포 이식이 실험동물 개체의 공간지각 학습 및 기억능력에 미치는 행동학적 변화를 측정하였고 6주차에 실험쥐들로부터 뇌 조직을 얻어 분석하였다.

세포이식 6주일 후 분석한 뇌 조직을 보면, 도 10에서 보듯이 인간 신경줄기세포 이식 후 6주일이 경과하였을 때 hNuMA (Calbiochem, Germany), hHsp27 (human specific heat shock protein 27; Stressgen, Ann Arbor, MI) 면역염색 양성인 빨간색의 많은 인간 신경줄기세포가 이식된 측내실 주변부위로부터 대뇌피질(cortex), 해마(hippocampus), 뇌량(corpus callosum)까지 광범위하게 이주하여 생착됨을 관찰할 수 있었다.

알츠하이머병의 병태생리기전에서 중요한 역할을 하는 염증반응과 관련하여 APPsw 형질전환 쥐에 인간신경 줄기세포를 이식한 군(APP-hNSC)과 H-H 버퍼를 이식한 군(APP-vehicle)에서 미세아교세포의 분포와 세포수를 비교 분석하였는데, 이식군과 대조군의 해마 치아이랑(DG;dentate gyrus)에서 미세아교세포 표식인자인 CD11b(AbD Serotec, UK)와 F4/80(AbD Serotec, UK)를 이용한 면역염색검사를 실시하였다 (도 11). 신경 줄기세포를 이식한 이식군에서 CD11b 양성인 녹색의 미세아교세포 숫자는 48.25±15.08 (평균±표준오차) (n=5)이었고, 대조군에서 CD11b 양성인 세포수는 94.25±24.51 (n=6) 이었다. 따라서 이식군에서 대조군에 비해 해마 치아이랑 부위에서 미세아교세포 숫자가 통계적으로 유의하게 줄어들어 (p<0.05) 알츠하이머병 모델에서 인간 신경줄기세포 이식할 경우 뇌에서 염증반응을 감소시켰다.

APPsw 형질전환 쥐와 대조군 정상 쥐에서 인간 신경줄기세포와 H-H 버퍼를 이식한 후 5주일에 공간지각 학습 및 기억능력 행동검사를 실시하였다. APPsw 형질전환 쥐에 인간 신경줄기세포를 이식한 군 (APP-hNSC : 32마리), APPsw 형질전환 쥐에 H-H 버퍼를 이식한 군 (APP-vehicle : 24마리), 정상 쥐에 인간 신경줄기세포를 이식한 군 (Wild-hNSC : 25마리), 정상 쥐에 H-H 버퍼를 이식한 군 (Wild-vehicle : 30마리)을 서로 비교분석하였다. 검사 6일 동안 수조에서 특정 위치를 교육시킨 후 검사 7일째에 그 위치를 찾아가는 시간을 평가하였다. 6일 동안 특정위치를 학습하는데 있어서는 상기 4군에 차이가 나타나지 않았으나 (도 12A), 7일째 특정위치를 찾아가는 기억능력에 있어서는 차이를 보였다 (도 12 B). 7일째 평가된 시간 (escape latency)은 APP-hNSC군은 10.98±6.49초 (평균±표준오차), APP-vehicle군은 18.19±12.96초, Wild-hNSC군은 9.83±5.24초, Wild-vehicle군은 10.28±6.26초였다. 따라서 인간 신경줄기세포를 이식한 APPsw 형질전환 쥐의 기억능력이 H-H 버퍼를 이식한 APPsw 형질전환 쥐에 비해 통계적으로 유의하게 향상되었음을 알 수 있었고 (p<0.05), 또 APP-vehicle군과 Wild-vehicle군에서 기억능력이 통계적으로 유의하게 차이나는 것을 (p<0.01) 보아 APPsw 형질전환 쥐가 정상 쥐에 비해서 기억능력이 유의하게 떨어지는 것이 확인 되었으며, 정상 쥐에서는 신경줄기세포를 이식한다고 하여 기억능력이 증가함을 보이지 않았다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 인간 신경줄기세포는 신경계 질환 및 손상, 특히 현재 특별한 치료법이 없으며 영구적 신경학적 후유증을 남기는 척수 손상, 파킨슨병, 뇌졸중, 근위축성 척수측색경화증, 운동신경손상, 외상에 의한 말초신경손상, 허혈성 뇌손상, 신생아 저산소성 허혈성 뇌손상, 뇌성마비, 간질, 난치성 간질, 알츠하이머병, 선천성 대사성 신경계질환, 외상성 뇌손상 (traumatic brain injury) 등의 치료에 유효한 효과를 가지며, 본 발명의 인간 신경줄기세포를 포함하는 약학적 조성물은 신경계 손상의 치료를 위한 새로운 방법을 제공하는 효과가 있다.

도 1은 이식된 인간 신경줄기세포가 척수 손상 부위 및 그 주변 부위로 이주하여 생착함을 나타낸 것이다.(적색 : human-specific nuclei antigen (hNuc; Chemicon, Temecula, CA) 면역염색 양성인 인간 신경줄기세포 생착 부위, 녹색 : Neurofilament (NF; Sternberger, USA) 면역염색 양성인 손상된 숙주 척수신경돌기)

도 2는 본 발명의 신경줄기세포가 신경원세포 (neurons), 성상세포 (astrocytes), 희소돌기아교세포 (oligodendrocytes)로 분화하거나 또는 미분화된 상태로 남아있는 것을 확인한 것이다.(A; 초기 신경원세포 표지인자인 TUJ1(β-tubulin III, Covance)의 발현 확인(화살표), B; 성상세포의 표지인자인 GFAP (glial fibrillary acidic protein, DAKO)의 발현 확인(화살표), C; 희소돌기아의교세포의 표지인자인 CNPase (2,3-cyclic nucleotide-3-phosphohydrolase, Chemicon)의 발현 확인(화살표), D; 인간 미분화 신경줄기세포의 표지인자인 hNestin (human nestin, Chemicon)의 발현 확인(화살표))

도 3은 이식된 인간 신경줄기세포가 뇌경색증 주변부위로 이주하여 생착함을 나타낸 것이다. (적색 : human specific nuclear matrix (hNuMA; Calbiochem, Germany) 면역염색 양성인 인간 신경줄기세포 생착 부위) 또 이식된 신경줄기세포는 신경원세포, 성상세포, 희소돌기아교세포로 분화했음을 보여준다. (녹색 : 신경원세포 표식인자인 Neurofilament (NF; sternberger, USA)의 발현 확인, 희소돌기아교세포 표식인자인 Myelin Basic Protein (MBP; DAKO, Carpinteria, CA)의 발현 확인, 성상세포 표식인자인 Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP; DAKO, Carpinteria, CA)의 발현 확인). 적색과 녹색의 동시발현은 노랑색으로 관찰된다.

도 4는 이식된 인간 신경줄기세포가 신경원세포로 분화했을 때 어떤 신경전달 물질을 분비하는지 나타낸 것이다. (적색 : human specific nuclear matrix (hNuMA; Calbiochem, Germany) 면역염색 양성인 인간 신경줄기세포, 녹색 : glutamatergic neuron의 표식인자인 Glutamate(Glut; Sigma, Saint Louis, MO)의 발현 확인, GABAnergic neuron의 표식인자인 γ-Aminobutyric acid(GABA; Sigma, Saint Louis, MO)의 발현 확인, cholinergic neuron의 표식인자인 Choline acetyl transferase(Chat; Chemicon, Temecula, CA)의 발현 확인, 시냅스 형성과 관련된 표식인자인 SynapsinⅠ(Syn-1; Chemicon, Temecula, CA)의 발현 확인)

도 5는 저산소성-허혈성 뇌손상 동물모델에 인간 신경줄기세포를 이식한 군(hNSC)과 H-H 버퍼를 이식한 군(vehicle)간에 신경학적 행동검사를 보여주는 것이다. 이식 후 3주부터 2주 간격으로 11주까지 측정하였다.

도 6은 저산소성-허혈성 뇌손상 동물모델에 인간 신경줄기세포를 이식한 군(hNSC)과 H-H 버퍼를 이식한 군(vehicle)간에 공간지각 학습 및 기억능력 행동검사 결과로 6일 동안 특정위치 학습 후 7일째에 특정위치를 속해 있는 사분면에 머문 시간 (goal quadrant spent time)을 나타낸 것이다.

도 7은 이식된 인간 신경줄기세포가 이식 부위 및 그 주변 부위로 이주하여 생착함을 나타낸 것이다 (녹색 : BrdU 면역염색 양성인 인간 신경줄기세포, 적색 : Tuj1 면역염색 양성인 신경원세포, 녹색과 적색이 겹쳐진 세포는 노랑 혹은 주황색 임).

도 8는 이식된 인간 신경줄기세포가 GABA 발현 신경원세포 혹은 희소돌기아교세포로 분화하나 성상아교세포로는 분화하지 않음을 보인 것이다 (A; BrdU 양성인 녹색의 공여세포가 적색의 GABA를 발현함. 녹색과 적색이 겹쳐진 세포는 노랑 혹은 주황색임, B; BrdU 양성인 녹색의 공여세포가 적색의 희소돌기아교세포의 표지인자 APC-CC1 [adenomatous polyposis coli clone CC1, Abcam, UK]의 발현 확인, 녹색과 적색이 겹쳐진 세포는 노랑 혹은 주황색임, C; BrdU 양성인 녹색의 공여세포가 적색의 성상아교세포의 표지인자인 GFAP [glial fibriilary acidic protein, DAKO]을 발현하지 않음을 확인).

도 9는 인간 신경줄기세포를 난치성 간질 모델인 킨들링 동물모델에 이식한 후 경련 발작 억제효과를 비디오 (도 9A)와 EEG 저장 장치 (도 9B)로 분석한 것임. Racine 등급 (1단계; facial movements only, 2단계; facial movements and head nodding, 3단계; facial movements, head nodding, and forelimb clonus, 4단계; facial movements, head nodding, forelimb clonus, and rearing, 5단계; facial movements, head nodding, forelimb clonus, rearing, and falling, 6단계; facial movements, head nodding, forelimb clonus, and a multiple sequence of rearing and falling)에 따라 발작정도를 등급으로 나타냈으며, EEG 상에서는 1Hz 이상 빈도로 발생하는 극파(spike)를 발작을 나타내는 뇌파로 정의하고 지속시간을 나타내었다 (Y Kitano, et al., Epilepsia 2005;46:1561, LW, et al., Eur J Phamacol.1989;163;1). 그림에서 별표는 통계적으로 유의한 (p<0.05) 구간을 나타 낸다.

도 10은 APPsw 형질전환 쥐의 뇌에 이식된 인간 신경줄기세포가 측내실 주변부로부터 대뇌피질, 해마, 뇌량으로 이주하여 생착함을 나타낸 것이다 (면역현광염색 상 적색 : human specific nuclear matrix (hNuMA; Calbiochem, Germany), human specific heat shock protein 27 (hHsp27; Stressgen, Ann Arbor, MI).

도 11은 APPsw 형질전환 쥐에 인간 신경줄기세포를 이식한 군(APP-hNSC)과 APPsw 형질전환 쥐에 H-H 버퍼를 이식한 군 (APP-vehicle)에서 해마 치아회랑 부위에서 미세아교세포 표식인자 (녹색 : CD11b [AbD Serotec, UK]와 F4/80 [AbD Serotec, UK])를 사용해 면역현광염색을 시행하여 미세아교세포의 숫자와 분포를 비교한 것이다. 신경줄기세포를 이식한 군이 H-H 버퍼를 이식한 군에 비교하여 유의하게 미세아교세포 표지인자를 발현하는 녹색 세포 수가 감소함을 보였다.

도 12는 APPsw 형질전환 쥐에 인간 신경줄기세포를 이식한 군 (APP-hNSC), APPsw 형질전환 쥐에 H-H 버퍼를 이식한 군 (APP-vehicle), 정상 쥐에 인간 신경줄기세포를 이식한 군 (Wild-hNSC), 정상 쥐에 H-H 버퍼를 이식한 군(Wild-vehicle)에서 공간지각 학습 및 기억능력 행동검사를 비교한 것이다. 상기 4군 모두에서 검사 6일 동안 매일 특정위치를 찾는데 걸린 시간 (latency to find hidden platform)은 특별한 차이가 없었고 (도 12A), 검사 7일째에 특정한 위치를 찾아가는 시간 (escape latency)을 비교한 결과 (도 12 B), 인간 신경줄기세포를 이식한 APPsw 형질전환 쥐의 기억능력이 H-H 버퍼를 이식한 APPsw 형질전환 쥐에 비해 통계적으로 유의하게 향상됨을 보였다.

Claims (3)

1. KCTC11370BP의 기탁번호를 가지는 인간 신경줄기세포.
2. 제1항의 인간 신경줄기세포를 포함하는 신경계 질환 및 손상 치료용 약학적 조성물.
3. 제2항에 있어서, 상기 신경계 질환 및 손상은 척수 손상, 파킨슨병, 뇌졸중, 근위축성 척수측색경화증, 운동신경손상, 외상에 의한 말초신경손상, 허혈성 뇌손상, 신생아 저산소성 허혈성 뇌손상, 뇌성마비, 간질, 난치성 간질, 알쯔하이머병, 선천성 대사성 신경계질환 및 외상성 뇌손상 (traumatic brain injury)으로 이루어진 군에서 선택된 질환 및 손상인 것을 특징으로 하는 조성물.

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