WO2013038925A1 - 細菌または真菌の抗菌薬感受性の検査方法およびそれに用いるシステム - Google Patents

細菌または真菌の抗菌薬感受性の検査方法およびそれに用いるシステム Download PDF

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WO2013038925A1
WO2013038925A1 PCT/JP2012/072181 JP2012072181W WO2013038925A1 WO 2013038925 A1 WO2013038925 A1 WO 2013038925A1 JP 2012072181 W JP2012072181 W JP 2012072181W WO 2013038925 A1 WO2013038925 A1 WO 2013038925A1
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WO
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microdevice
bacteria
test
flow path
solution
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PCT/JP2012/072181
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English (en)
French (fr)
Inventor
佳巳 松本
浩平 葉山
昇一 榊原
邦彦 西野
明人 山口
博行 野地
亮太 飯野
Original Assignee
国立大学法人大阪大学
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/18—Testing for antimicrobial activity of a material

Definitions

  • the present invention relates to a method for testing antimicrobial susceptibility of bacteria or fungi and a system used therefor.
  • Non-Patent Document 1 For the susceptibility test of bacteria and fungi, a device for the purpose of speeding up is put on the market (Non-Patent Document 1). However, these large devices are expensive. Moreover, in order to perform turbidity determination, the apparatus must grow bacteria to a turbidity that can be determined. For example, in the case of a slow-growing bacterium such as Pseudomonas aeruginosa, it takes at least 8 hours. In addition, as a method that does not require the equipment, generally, the MIC (minimum growth inhibitory concentration) is determined from the inhibition circle formed on the agar medium by a micro liquid dilution method and a disk with a concentration gradient. And a disk method based on the Kirby-Bauer method (KB method) (Non-patent Document 2). However, these methods also require, for example, about 18 hours from the start of the test to the determination of sensitivity, and therefore further speedup is required.
  • KB method Kirby-B
  • an object of the present invention is to provide a new method capable of testing the susceptibility of bacteria or fungi to an antibacterial drug simply and quickly, and a test system used therefor.
  • the test method of the present invention is a test method for bacterial or fungal antimicrobial susceptibility, using a microdevice having a channel, and in the channel of the microdevice, the antibacterial agent And a detection step of detecting bacteria or fungi derived from the test bacterial solution in the observation area of the flow path of the microdevice.
  • the inspection system of the present invention is an inspection system for inspecting the antimicrobial susceptibility of bacteria or fungi by the above-described inspection method of the present invention, and has a flow path into which a mixed liquid of a test bacteria solution and an antibacterial drug is introduced.
  • Incubation means for incubating the microdevice having, image acquisition means for acquiring an image of the observation area of the flow path of the microdevice, information acquisition means for acquiring information on at least one of the number and form of bacteria or fungi in the image, And based on the said information, it has a determination means which determines the antibacterial drug sensitivity of the bacterium or fungus derived from the said test liquid.
  • a mixed solution of an antibacterial drug and a test bacterium solution is incubated, and an observation area in the flow path is observed by, for example, a microscope or the like.
  • the susceptibility of fungi to antibacterial drugs can be confirmed easily and quickly.
  • the inspection method of the present invention can be easily performed. For this reason, the present invention is extremely useful in clinical examinations, environmental tests and the like.
  • the test method of the present invention is a test method for the susceptibility of bacteria or fungi to antibacterial agents, using a microdevice having a flow channel, and the antibacterial drug and the test subject in the flow channel of the microdevice.
  • the test of bacterial or fungal antimicrobial susceptibility includes, for example, the meaning of a test of bacterial or fungal antimicrobial resistance.
  • the types of bacteria and fungi to be inspected are not particularly limited. Specific examples include, for example, Staphylococcus aureus, enterococci, Escherichia coli and other enteric bacteria, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter and other sugar non-fermenting bacteria, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Legionella bacteria, Campylobacter bacteria, Examples include tuberculosis bacteria.
  • the type of test liquid to be tested is not particularly limited.
  • the test bacterial solution can be prepared, for example, from a colony separated and cultured from a clinical specimen or the like.
  • the test bacterial solution is not limited to this, and for example, a clinical sample may be used as it is.
  • the clinical specimen is preferably, for example, a specimen having a low possibility of contamination, and a specimen capable of securing a sufficient bacterial density.
  • the structure of the microdevice is not limited at all, and may be provided with a flow channel into which the test bacteria solution can be introduced.
  • An example of the micro device will be described later.
  • the order of introducing the antibacterial agent and the test bacteria solution into the microdevice is not particularly limited. Introduction can be paraphrased as, for example, inoculation or supply.
  • a mixed solution of the antibacterial drug and the test bacteria solution may be introduced into the flow path of the microdevice.
  • the antibacterial drug is disposed in advance in the flow path of the microdevice, and the test bacteria solution is placed in the flow path of the microdevice before the incubation step or in the incubation step. It may be introduced.
  • the amount of the test bacterial solution introduced into the microdevice and the number of bacteria in the test bacterial solution are not particularly limited.
  • the amount and the number of bacteria can be appropriately set according to the size of the microdevice, the size of the flow path, and the like.
  • the amount of the antibacterial agent to be used is not particularly limited, and can be appropriately set according to, for example, the amount of the test bacterial solution and the estimated clinical effective concentration (breakpoint).
  • the conditions for the incubation step are not particularly limited.
  • the incubation conditions can be appropriately selected according to, for example, the optimal growth conditions of the target bacteria or fungi.
  • the incubation temperature is not particularly limited, and is, for example, 30 to 37 ° C.
  • general bacteria such as Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa are, for example, 37 ° C.
  • Incubation time is not particularly limited, and fast-growing bacteria such as Escherichia coli is, for example, 2-3 hours, and Pseudomonas aeruginosa and other non-sugar-fermenting bacteria are, for example, 3-4 hours.
  • the incubation time is not limited to this, and may be terminated when, for example, the growth (control) of the test bacterium in the absence of the antibacterial agent reaches a level sufficient for determination.
  • this incubation time is a factor that substantially determines the total time required for the inspection. For this reason, according to the inspection method of the present invention, since the incubation step can be performed in a short time, it can be said that the inspection can be performed in a very short time comprehensively.
  • the incubation step it is preferable to incubate the microdevice under a condition of maintaining humidity because the microdevice can sufficiently prevent the concentration of the antibacterial agent from changing due to, for example, drying in the flow path by heating. .
  • a condition of maintaining humidity because the microdevice can sufficiently prevent the concentration of the antibacterial agent from changing due to, for example, drying in the flow path by heating.
  • the humidity is, for example, 95 to 100%, preferably 97 to 100%.
  • the detection step for example, it is preferable to observe at least one of increase / decrease in number and morphological change in the observation area for bacteria or fungi derived from the test bacteria solution.
  • the detection step for example, only one of the number and the form may be observed, or both may be observed.
  • the coarse density of bacteria or fungi may be observed.
  • changes before and after the incubation step or changes with time may be observed.
  • bacteria or fungi are sensitive to the antibacterial agent, for example, even if incubation is performed, there are signs that the number of bacteria does not increase, the number decreases due to death, or the form changes. Thus, for example, by observing an increase or decrease in number and / or morphological change, the antimicrobial susceptibility of bacteria or fungi can be determined.
  • the determination of sensitivity may be determined, for example, as the presence or absence of sensitivity, or may be determined as MIC.
  • a method for detecting bacteria or fungi derived from the test bacteria solution is not particularly limited, and examples include detection with a microscope. Among them, it is preferable to detect bacteria or fungi derived from the test bacterial solution with the microscope in the detection step because more accurate inspection can be performed.
  • the kind of the microscope is not particularly limited, and examples thereof include an optical microscope and a fluorescence microscope, and an optical microscope is preferable.
  • the microscope is preferably a miniaturized microscope, for example.
  • the microscope preferably includes, for example, a CCD (Charge Coupled Device).
  • CCD Charge Coupled Device
  • the detection by the microscope includes the meaning of detection by an image output from the microscope, for example.
  • the microscope is preferably connected to output means in order to obtain an image in the field of view.
  • the output means include a monitor and a printer.
  • the detection step is preferably performed, for example, before or after the incubation step, and particularly preferably before or after the incubation step. That is, it is preferable to detect bacteria or fungi derived from the test bacterial solution in the observation area of the flow channel both before and after incubation of the microdevice. Thereby, for example, the number before incubation and the number after incubation, or the form before incubation and the form after incubation can be compared.
  • the microdevice is not limited as described above.
  • the micro device will be exemplified, but the present invention is not limited thereto.
  • the flow path only needs to be capable of moving a liquid inside.
  • the mechanism by which the liquid flows in the flow path is not limited at all.
  • the liquid may be moved, for example, by utilizing the capillary phenomenon of the flow path, or may be moved by pressurization or decompression.
  • the channel is preferably, for example, a micro channel.
  • the channel may be provided in a bent state.
  • the corner of the flow path is preferably a curved shape, a round shape, or the like.
  • one end of the flow path is open.
  • the one open end serves as, for example, an introduction port for the test bacteria solution and is also referred to as a supply port or an inoculation port.
  • the said flow path is also opening the other edge part, for example.
  • the other opening end is, for example, an air opening.
  • the other opening end may be, for example, a lead-out port through which the test microbial solution introduced from the introduction port and passed through the flow path is led out.
  • the outlet can also be referred to as, for example, an outlet from which the test bacteria solution is discharged from the flow path.
  • the direction in which the test bacteria solution flows from the introduction port is referred to as “flow direction”.
  • the introduction port side is the upstream side and the air port side is the downstream side.
  • the observation area is set, for example, downstream from the introduction port, and the observation area is set, for example, between the introduction port and the air port.
  • the flow path may further include an exhaust part, for example.
  • the exhaust unit is preferably located on the downstream side of the observation area in the flow channel, and specifically, for example, at the end of the flow channel.
  • the exhaust part is, for example, an air port.
  • you may have a drainage part in the terminal of the said flow path as an area which can store the said test microbe liquid which passed the said observation area, for example.
  • the flow path may have both the exhaust part (air port) and the drainage part at the downstream end.
  • the upstream side of the observation area is also referred to as an “introduction flow path” and the downstream side of the observation area is also referred to as a “discharge flow path”.
  • the lengths of the introduction channel and the discharge channel may be the same or different, for example. In the latter case, the discharge channel is preferably shorter than the introduction channel. By doing so, for example, the supply of air from the air port (exhaust port) becomes smoother, and it becomes easier to grow bacteria or fungi derived from the test bacterial solution.
  • the size of the observation area (for example, channel width) and the size of the introduction channel and the discharge channel (for example, channel width) may be the same or different, for example.
  • the size of the observation area is, for example, the introduction flow so that a plurality of channels can be easily observed with a microscope. It is preferable that the size of the channel and the discharge channel is smaller.
  • the flow path is provided, for example, on a substrate (also referred to as a base material).
  • the substrate is preferably a transparent substrate because it can be observed with a microscope or the like.
  • the raw material for the transparent substrate is not particularly limited, and examples thereof include polymers such as polydimethylsiloxane and glass.
  • the substrate is preferably a breathable substrate, for example.
  • the substrate is preferably a laminate of an upper substrate and a lower substrate.
  • the upper substrate preferably has, for example, a concave portion to be the flow path formed on the surface laminated with the lower substrate, and has a through hole at a position corresponding to one end or both ends of the flow path. It is preferable. If the upper substrate and the lower substrate are stacked, in the stacked body, for example, a cavity formed by a concave portion of the upper substrate becomes the flow path, and one through hole of the upper substrate becomes the flow path.
  • the other through-hole is an air port (outlet port) of the flow path.
  • a desired site can be set in the observation area.
  • the micro device When a liquid is supplied to the laminate from the inlet of the upper substrate, the liquid is introduced into the channel through the inlet, passes through the channel, and the other end of the channel. To reach.
  • the micro device further includes the exhaust part.
  • a recess serving as the exhaust portion is formed on the laminated surface and further on the downstream end of the flow path.
  • substrate has a through-hole used as the said air port in the location applicable to the said exhaust part, for example.
  • the microdevice is not limited to such a form, and for example, the lower substrate may have a recess as described above.
  • an antibacterial drug may be arranged in advance in the flow path.
  • the part where the antibacterial drug is arranged or the part where the antibacterial drug is arranged in the channel is also referred to as a reagent part.
  • an antibacterial drug may be arranged in advance, or at the time of use, the antibacterial drug may be arranged before introducing the test bacteria solution.
  • the test bacteria solution and the antibacterial drug can be mixed in the flow path by supplying the test bacteria solution to the microdevice.
  • the arrangement method of the antibacterial agent in the reagent part is not particularly limited, and for example, the antibacterial agent solution containing the antibacterial agent can be arranged by supplying it to a desired portion of the flow path and drying it. Further, the antibacterial liquid may be passed through the flow path from the introduction port, for example, and the antibacterial drug may be disposed in the flow path, or the liquid flow from the outlet port into the flow path. And you may arrange
  • the microdevice When an antibacterial drug is arranged in advance on the microdevice, the microdevice is preferably stored in a dry state until use, for example.
  • the micro device may not have the reagent part, for example.
  • the test bacteria solution and the antibacterial drug may be mixed outside the microdevice, and the mixed solution may be introduced into the microdevice.
  • the number of flow paths having the observation area is not particularly limited.
  • the number of the flow paths can be appropriately set according to, for example, the number of test bacteria solutions to be supplied, the number of antibacterial drugs, the number of antibacterial drugs, the number of controls, and the like.
  • the number of flow paths having the observation area is, for example, a plurality, and two or more, for example, 2 to 25.
  • the number of the flow paths is preferably a number that can be arranged so as to facilitate microscopic observation according to the purpose.
  • the microdevice having a plurality of the flow paths for example, a plurality of types of antibacterial drugs, a plurality of types of antibacterial drugs, and / or a plurality of types of test bacteria can be determined by one microdevice.
  • the number of the flow paths can be increased, for example, by enlarging a micro device.
  • the lengths of the respective flow paths may be the same or different, for example. From the viewpoint of aligning the growth rate of bacteria or fungi derived from the test bacterial solution, the former is preferable.
  • the microdevice has a plurality of flow paths
  • bacteria or fungi derived from the test bacteria solution are detected in the observation area of each flow path.
  • the observation areas of the plurality of flow paths are preferably close to each other in parallel, for example, and can be said to be arranged in parallel.
  • all the observation areas are converged in the microdevice so that the entire observation area is within the field of view of the microscope. It is preferable that they are arranged.
  • the channels may be independent or partially connected.
  • the former microdevice will be exemplified below as a first embodiment, and the latter microdevice as a second embodiment and a third embodiment. In the present invention, the microdevice is not limited to these examples.
  • the micro device of the first form is, for example, a form in which the plurality of flow paths have different introduction ports and different observation areas, respectively.
  • the introduction port and the observation area are independent from each other, so that different test liquids, different antibacterial drugs and / or different antibacterial drugs are different in the observation area of each flow path.
  • a concentration test can be performed.
  • FIG. 1 shows an example of the micro device.
  • 1A is a perspective view showing the microdevice 1 in a state where the upper substrate 10 and the lower substrate 20 constituting the microdevice 1 are separated from each other
  • FIG. 1B is a top view of the microdevice 1
  • FIG. FIG. 3 is a bottom view of the substrate 10, that is, a view of a laminated surface of the upper substrate 10 and the lower substrate 20.
  • the upper substrate 10 includes through holes 11a ′ to 11d ′, 21a ′ to 21d ′, 31a ′ to 31d ′, 41a ′ to 41d ′, 51a ′, which serve as introduction ports, and air ports.
  • Through-holes 15a ′ to 15d ′, 25a ′ to 25d ′, 35a ′ to 35d ′, 45a ′ to 45d ′, and 55a ′ are provided.
  • FIG. 1A only the inlet port 11a 'and the air port 15a' are shown three-dimensionally, but the same applies to the other through holes.
  • FIG. 1C reference numerals for observation areas other than the observation areas 13a, 23a, 33a, and 43a are omitted, but regions parallel to the observation area 13a are observation areas 13b to 13d in order from the observation area 13a side.
  • the areas parallel to the observation area 23a are the observation areas 23b to 23d in order from the observation area 23a side, and the areas parallel to the observation area 33a are the observation areas 33b to 33d in order from the observation area 33a side.
  • the areas parallel to the observation area 43a are the observation areas 43b to 43d in order from the observation area 43a side, and the central area in the flow path between the inlet 51a and the exhaust part 55a is the observation area 53a.
  • the observation area other than 53a is bent at two places, but it is preferable to observe a portion parallel to 53a.
  • the introduction port, the introduction unit, the introduction channel, the observation area, the discharge channel, the exhaust unit, and the cavity connected to the air port are referred to as “lanes”, respectively. It is represented by the sign of the inlet. That is, for example, a cavity in which the introduction port 11a ', the introduction portion 11a, the introduction flow channel 12a, the observation area 13a, the discharge flow channel 14a, the exhaust portion 15a, and the air port 15a' are connected is referred to as a lane 11a '.
  • the size of the microdevice 1 is not particularly limited, and can be exemplified as follows, for example.
  • Overall size Width (length in the direction of arrow X in FIG. 1A): For example, 30 to 40 mm Length (length in the arrow Y direction in FIG. 1A): for example, 30 to 40 mm Thickness (length in the direction of arrow Z in FIG.
  • 1A eg 1 to 3 mm Upper substrate 10, Thickness: for example, 0.8 to 2.8 mm Depth of recess: 10-25 ⁇ m, for example Diameter of the introduction port: for example, 0.75 to 1.5 mm, preferably 0.75 mm
  • the introduction channel length for example, 10 to 15 mm
  • the observation area length for example, 1 to 5 mm
  • the discharge channel length for example, 10 to 15 mm
  • Diameter of exhaust section for example, 0.75 to 1.5 mm
  • the microdevice may or may not have a reagent part, for example.
  • the part of the reagent part preferably includes, for example, at least the observation area, more preferably includes the observation area from the introduction port, and more preferably from the introduction port to the air port. Range, that is, the entire flow path including the introduction flow path and the discharge flow path.
  • the antibacterial drug solution is introduced (filled) into the flow path from either the introduction port or the air port, and then the microdevice is dried.
  • the antibacterial agent can be arranged.
  • the amount of the antibacterial solution introduced into each lane is not particularly limited, and is, for example, 0.2 to 3 ⁇ L per lane.
  • the preparation of the antibacterial drug solution is not particularly limited, and for example, the solvent, concentration, etc. can be appropriately determined according to the type of antibacterial drug.
  • the solvent is not particularly limited, and examples thereof include ethanol, water, and a buffer solution.
  • the amount of the test bacterial solution introduced into each lane is not particularly limited.
  • the amount of the test bacterial solution introduced into each lane is not particularly limited, and the turbidity of the test bacterial solution is preferably adjusted to, for example, McFarland 0.5.
  • the amount of bacteria in the test bacterial solution can be modified, for example, according to the bacterial species and the purpose of the test.
  • the flow path of the micro device has a different inlet.
  • the sensitivity with respect to a several antimicrobial agent can be confirmed about a specific test microbe by introduce
  • the same antibacterial drug is filled in each flow path at different concentrations, and the same microbial solution is introduced into each introduction port, so that the MIC ( Minimum growth inhibitory concentration) can be determined.
  • the same antibacterial drug is disposed in each reagent part, and different test liquids are introduced into each introduction port, whereby each test bacteria for a specific antibacterial drug is provided. The sensitivity of the liquid can be confirmed.
  • the microdevice 1 includes, for example, a group of lanes 11a ′ to 11d ′, a group of lanes 21a ′ to 21d ′, a group of lanes 31a ′ to 31d ′, and a group of lanes 41a ′ to 41d ′.
  • Different antibacterial drugs are arranged, the same antibacterial drug is arranged at different concentrations in each lane in each group, and the lane 51a ′ is used as a control in which no antibacterial drug is arranged.
  • the sensitivity and resistance to four types of antibacterial agents can be confirmed for one type of test bacterial solution, and furthermore, in each group, each lane is provided with different concentrations of antibacterial agents. Therefore, it is possible to determine the MIC.
  • a method for inspecting the antimicrobial susceptibility of the test liquid using the microdevice 1 in which the flow path is filled with the antimicrobial is exemplified below.
  • test bacteria solution is supplied to the introduction ports in the microdevice 1.
  • the test bacteria solution supplied to each introduction port moves from the introduction port to the channel and is mixed with the antibacterial drug filled in the channel.
  • the microdevice 1 is incubated. Incubation conditions are as described above, for example. Then, the observation area of the microdevice 1 is observed with a microscope, and the increase or decrease in the number of bacteria or fungi and the change in morphology of bacteria or fungi are confirmed. This makes it possible to test the sensitivity to antibacterial drugs.
  • the micro device of the second form is, for example, a form in which a plurality of flow paths have the same introduction port and have different observation areas.
  • the description of the first embodiment can be used for the microdevice unless otherwise specified.
  • a plurality of flow paths have the same introduction port, and therefore, in the observation area of each flow path, for example, for the same test bacterium liquid, testing for different antibacterial drugs and / or the same antibacterial drugs Can be tested for different concentrations.
  • FIG. 2 shows an example of the micro device.
  • 2A is a perspective view showing the microdevice 2 in a state where the upper substrate 60 and the lower substrate 70 constituting the microdevice 2 are separated from each other
  • FIG. 2B is a top view of the microdevice 2
  • FIG. 2D is a bottom view of the substrate 60, that is, a view of a laminated surface of the upper substrate 60 with the lower substrate 70
  • FIG. 2D is a cross-sectional view in the II direction of FIG. 2B.
  • the upper substrate 60 is provided with a through hole 61 'serving as an introduction port and through holes 65a' to 65d 'serving as air ports.
  • the introduction portion 61 corresponding to the introduction port 61 ′, the first introduction passage 66, and the second introduction passage branched from the downstream end of the first introduction passage 66.
  • 62a to 62d, observation areas 63a to 63d, discharge passages 64a to 64d, and exhaust portions 65a to 65d are connected to each other to form a recess.
  • each lane is represented by the symbol of the second introduction flow path. That is, for example, the cavity where the inlet 61 ′, the inlet 61, the first inlet channel 66, the second inlet channel 62a, the observation area 63a, the outlet channel 64a, the exhaust part 65a, and the air port 65a ′ are connected, This is referred to as lane 62a.
  • the size of the microdevice 2 is not particularly limited, and can be exemplified as follows, for example.
  • Overall size Width (length in the direction of arrow X in FIG. 2A): For example, 30 to 40 mm Length (length in the arrow Y direction in FIG. 2A): for example, 30 to 40 mm Thickness (length in the direction of arrow Z in FIG.
  • 2A For example, 1 to 3 mm Upper substrate 60 Thickness: for example, 0.8 to 2.8 mm Depth of recess: For example, 17 ⁇ m Diameter of the introduction port: for example, 0.75 mm
  • the introduction channel length for example, 50 mm
  • Said 1st introduction flow path For example, 2 mm Second introduction flow path: For example, 3 to 5 cm
  • the observation area length for example, 8 mm
  • the discharge channel length for example, 2 to 5 mm
  • the exhaust part diameter for example, 1.5 mm
  • the microdevice 2 has a reagent part, for example.
  • the part of the reagent part is not particularly limited.
  • the reagent part preferably includes, for example, at least the observation area, and more preferably is a range including the exhaust part from the downstream side of the first introduction channel (for example, the middle of the second introduction channel). .
  • the amount of the antibacterial solution introduced into each flow path is not particularly limited, but is, for example, 0.25 to 1 ⁇ L per lane.
  • the amount of the test bacterial solution to be introduced is not particularly limited, and is, for example, 9 to 10 ⁇ L. In the microdevice 2, the amount of the test bacterial solution to be introduced is not particularly limited.
  • the flow paths of the microdevice 2 each have the same introduction port and a different observation area. For this reason, the microdevice 2 arrange
  • the same antibacterial drug is arranged at different concentrations in each flow path, and the same test microbial solution is introduced into the introduction port, so that the MIC ( Minimum growth inhibitory concentration) can be determined.
  • the microdevice 2 is configured such that a different antibacterial drug is disposed in any three of the lanes 62a to 62d, and the remaining one lane is used as a control in which the antibacterial drug is not disposed. It is done. According to this form, for example, the sensitivity to three types of antibacterial drugs can be confirmed for one type of test bacterial solution.
  • the method for testing the antimicrobial susceptibility of the test bacterial solution using the microdevice 2 is not particularly limited, and is described above except that the test bacterial solution is introduced into the microdevice 2 from the inlet 61 ′.
  • the illustration in FIG. 1 can be used.
  • the microdevice of the third mode is a mode in which, for example, a plurality of flow paths have the same introduction port and have different observation areas, as in the second mode. Unless otherwise indicated, the description of the first embodiment and the second embodiment can be used for the microdevice.
  • a plurality of flow paths have the same introduction port, and therefore, in the observation area of each flow path, for example, for the same test bacterium liquid, testing for different antibacterial drugs and / or the same antibacterial drugs Can be tested for different concentrations.
  • FIG. 10 shows an example of the micro device.
  • 10A is a perspective view showing the micro device 3 in a state where the upper substrate 90 and the lower substrate 100 constituting the micro device 3 are separated from each other
  • FIG. 10B is a top view of the micro device 3
  • FIG. 10D is a bottom view of the substrate 90, that is, a view of a laminated surface of the upper substrate 90 with the lower substrate 100
  • FIG. 10D is a sectional view in the II-II direction of FIG. 10B.
  • the upper substrate 90 is provided with a through hole 91 'serving as an introduction port and through holes 95a' to 95f 'serving as air ports.
  • the introduction portion 91 corresponding to the introduction port 91 ′, the first introduction passage 96, and the second introduction passage branched from the downstream end of the first introduction passage 96.
  • 92a to 92f, observation areas 93a to 93f, discharge passages 94a to 94f, and exhaust parts 95a to 95f are connected to each other to form a recess.
  • each lane is represented by the symbol of the second introduction flow path. That is, for example, the cavity where the inlet 91 ′, the inlet 91, the first inlet channel 96, the second inlet channel 92a, the observation area 93a, the outlet channel 94a, the exhaust part 95a, and the air port 95a ′ are connected, This is referred to as lane 92a.
  • the corners of the second introduction channels 92a to 92f are rounded.
  • the flow path widths of the observation areas 93a to 93f are narrower than the flow path widths of the second introduction flow paths 92a to 92f and the discharge flow paths 92a to 92f.
  • the length of the flow path from the observation areas 93a to 93f to the exhaust parts 95a to 95f is the same.
  • the size of the microdevice 3 is not particularly limited, and can be exemplified as follows, for example.
  • Overall size Width (length in the direction of arrow X in FIG. 10A): For example, 30 to 40 mm Length (length in the arrow Y direction in FIG. 10A): For example, 30 to 40 mm Thickness (length in the direction of arrow Z in FIG.
  • the introduction channel length for example, 25 to 35 mm
  • the first introduction channel length for example, 2 mm
  • the second introduction channel length for example, 23 to 33 cm Width: For example, 200 ⁇ m
  • the micro device 3 has a reagent part, for example.
  • the reagent part is the same as in the second embodiment described above, for example.
  • the amount of the antibacterial solution introduced into each flow path is not particularly limited, but is, for example, 0.2 to 0.4 ⁇ L per lane.
  • the amount of the test bacteria solution to be introduced is not particularly limited, and is, for example, 15 to 25 ⁇ L. In the microdevice 3, the amount of the test bacterial solution to be introduced is not particularly limited.
  • the flow paths of the microdevice 3 each have the same inlet and a different observation area. For this reason, the microdevice 3 can confirm the susceptibility to a plurality of antibacterial agents for a specific test bacterium, for example, in the same manner as in the second embodiment described above, or MIC (minimum growth inhibition for a specific antibacterial agent) Concentration) can be determined.
  • the micro device 3 is configured such that different antibacterial drugs are arranged in any five of the lanes 92a to 92f, and the remaining one lane is used as a control in which no antibacterial drug is arranged. It is done. According to this form, for example, the sensitivity to five types of antibacterial drugs can be confirmed for one type of test bacterial solution.
  • the method for testing the antimicrobial susceptibility of the test bacterial solution using the microdevice 3 is not particularly limited, and is described above except that the test bacterial solution is introduced into the microdevice 3 from the inlet 91 ′.
  • the illustration in FIG. 1 can be used.
  • the test system of the present invention is a test system for testing the antimicrobial susceptibility of bacteria or fungi by the test method of the present invention, which is a mixture of a test bacterial solution and an antibacterial drug.
  • Incubation means for incubating a microdevice having a channel into which a liquid has been introduced, image acquisition means for acquiring an image of an observation area of the channel in the microdevice, the number of bacteria or fungi in the image, the coarse density, and the form
  • Information acquisition means for acquiring at least one of the information, and determination means for determining antimicrobial susceptibility of bacteria or fungi derived from the test bacterial solution based on the information.
  • the inspection system of the present invention includes, for example, an inspection apparatus constructed by a computer system.
  • the hardware structure of the system is not limited.
  • a storage device, an input device such as a keyboard and a mouse are connected to a CPU that is a control unit, and further, for example, a result output device, input data, and a result A display device (display) or the like may be connected.
  • each means should just be a functional block implement
  • the inspection system of the present invention further includes, for example, fixing means for setting the micro device.
  • the micro device may be disposable, for example, or may be replaced every time a sample is measured / detected.
  • the inspection system may include, for example, an introduction port for introducing a specimen into the set micro device, and the introduction port may be the same as the introduction port of the micro device.
  • the inspection system includes means for automatically incubating a specimen introduced into the microdevice by temperature control or the like, for example.
  • the inspection system includes, for example, means for automatically acquiring an image of the observation area of the microdevice intermittently or continuously.
  • FIG. 9 is a schematic diagram, and the size, shape, and the like are not limited at all.
  • FIG. 9 is an example, and the present invention is not limited to this.
  • the inspection system includes a measurement unit 7 and an image processing unit 8.
  • the measurement unit 7 includes a microscope 700.
  • the microscope 700 includes a CCD camera 701, and includes a placement unit 702 for setting the micro device 71 and a temperature control unit 703 for controlling the temperature of the placement unit 702.
  • the microscope 700 includes a general configuration provided in the microscope, such as a light source.
  • the image processing unit 8 includes a CPU 80, a storage unit 81, and an output unit 82. Examples of the storage unit 81 include ROM, HDD, and HD. Examples of the output unit 82 include a monitor and a printer.
  • the inspection method of the present invention can be executed as follows.
  • the micro device 71 is set on the placement unit 702 of the microscope 700 in the measurement unit 7.
  • the micro device 71 may be, for example, a micro device into which a mixed liquid of the test bacteria solution and the antibacterial drug is introduced in advance or a micro device into which only an antibacterial agent is introduced in advance.
  • the test bacteria solution may be introduced.
  • the temperature control unit 703 controls the temperature of the placement unit 702 to incubate the micro device 71 set in the placement unit 702.
  • the CCD camera 701 of the microscope 700 captures an image of the observation area of the micro device 71 and outputs it as a signal. Imaging can be performed, for example, intermittently or continuously.
  • the measurement unit 7 further includes a control unit that controls image capturing.
  • An example of the control unit is a CPU.
  • the output signal is input to the CPU 80 of the image processing unit 8.
  • the data after the calculation is output to the output unit 82, and the data after the calculation is stored in the storage unit 81.
  • the CPU 80 performs arithmetic processing on the signal output from the measurement unit 7 to calculate, for example, data indicating the number of bacteria or fungi, coarse density, and / or change in morphology, and is further set in advance as calculated data. Comparison with a reference value may be made to determine antimicrobial susceptibility.
  • Example 1 Microdevice The microdevice 1 shown in FIG. 1 was produced as follows.
  • the upper substrate 10 of the microdevice 1 was made of PDMS, and the lower substrate 20 was made of glass.
  • the size of the microdevice 1 was as follows.
  • PDMS flow path molding 1) Polydimethylsiloxane (PDMS) (trade name Silpot 184, Dow Corning Toray Co., Ltd.) and a polymerization catalyst were mixed at a weight ratio of 10: 1, and 30 Minute deaeration. 2) Dip into the mold and bake and harden at 100 ° C for 30 minutes.
  • PDMS Polydimethylsiloxane
  • Silpot 184 trade name Silpot 184, Dow Corning Toray Co., Ltd.
  • the antibacterial solution of (2) and the culture solution of (3) were mixed at a volume ratio of 1: 9, and 1 ⁇ L of the mixed solution was injected into each inlet of the microdevice 1.
  • sterilized water and the culture solution were mixed at a volume ratio of 1: 9, and 1 ⁇ L of the mixed solution was injected into the introduction port of the microdevice 1.
  • the microdevice 1 was put into the petri dish, and also the petri dish was put into the airtight container.
  • the petri dish and the sealed container were each filled with water-containing Kim wipes.
  • the sealed container was placed in a 37 ° C. incubator and incubated for 3 hours. The relative humidity in the sealed container and the petri dish was 97%.
  • the microdevice 1 was taken out from the sealed container, and the increase / decrease and the morphological change of the amount of bacteria relative to the control were confirmed for the observation area with a microscope, and the MIC (minimum growth inhibitory concentration) was determined.
  • FIG. 3 A micrograph of Pseudomonas aeruginosa # 2 strain after incubation is shown in FIG.
  • the numbers in the AMK, CPFX and IPM photographs indicate the final concentration ( ⁇ g / mL) of each antibacterial drug, “+” indicates that it is growing more than the control 0 hr, and “ ⁇ ” indicates , Comparable to control 0 hr, indicating that growth is suppressed.
  • the MIC of AMK is 32 ⁇ g / mL or more and the MIC of CPFX is 4 ⁇ g / mL or more with respect to Pseudomonas aeruginosa # 2 strain.
  • the IPM MIC was found to be 16 ⁇ g / mL.
  • the MIC of AMK was 64 ⁇ g / mL
  • the MIC of CPFX was 32 ⁇ g / mL
  • the MIC of IPM was 32 ⁇ g / mL.
  • the MIC of the microdevice method and the IPM of the standard method showed MICs that differed by a factor of two, but they all matched in the determination of resistance (R) when the breakpoint of CLSI was used as an index.
  • FIG. 4 A micrograph of P. aeruginosa S1 strain after incubation is shown in FIG.
  • the numbers in the AMK, CPFX and IPM photographs indicate the final concentration ( ⁇ g / mL) of each antimicrobial agent.
  • no growth as in control 3 hr was observed at any concentration of each antibacterial drug, confirming that any antibacterial drug was sensitive.
  • FIG. 5 A micrograph of Pseudomonas aeruginosa # 5 strain (MDRP) after incubation is shown in FIG.
  • the numbers in the AMK, CPFX and IPM photographs indicate the final concentration ( ⁇ g / mL) of each antimicrobial agent.
  • each antibacterial drug was resistant to any antibacterial drug because it was proliferating more than control 0 hr at any concentration of each antibacterial drug.
  • Example 2 (1) Microdevice The microdevice shown in FIG. 2 was produced in the same manner as in Example 1.
  • the upper substrate of the microdevice was made of PDMS, and the lower substrate was made of glass.
  • the size of the microdevice 2 was as follows.
  • Amikacin Amikacin (trade name AMK, Sigma), Ciprofloxacin Ciprofloxacin (trade name CPFX, Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) and Imipenem Imipenem / Cilastatin (trade name IPM, Sakai Pharmaceutical Co., Ltd.) 2 It was dissolved in PBS to a concentration of ⁇ 4 mg / mL, and further diluted with 100% ethanol to prepare antibacterial drug solutions with predetermined concentrations (AMK 160 ⁇ g / mL, CPFX 20 ⁇ g / mL, IPM 80 ⁇ g / mL). And after inject
  • Example 2 (2) Determination Incubation and determination were performed in the same manner as in Example 1 except that about 10 ⁇ L of the test bacterial solution prepared in the same manner as in Example 1 was injected into the common inlet.
  • FIG. 7 shows a micrograph of the Pseudomonas aeruginosa S1 strain (sensitive strain) after incubation.
  • the growth of Pseudomonas aeruginosa S1 was confirmed according to the incubation time in the flow path without the addition of the antibacterial drug (control), but the antibacterial drug was added. In some cases, no growth was observed in any of the channels.
  • FIG. 8 A micrograph of Pseudomonas aeruginosa # 5 strain (MDRP) after incubation is shown in FIG. As shown in FIG. 8, according to the method using the microdevice 2, the growth of Pseudomonas aeruginosa strain # 5 was confirmed according to the incubation time even when the antibacterial agent was added, as in the case where the antibacterial agent was not added (control). It was done.
  • Example 3 65 types of Pseudomonas aeruginosa strains were treated with AMK, CPFX and IPM in the same manner as in Example 2 above, multidrug resistance (3 drug resistance), 2 drug resistance, 1 drug resistance and sensitivity (3 drug sensitivity) Classification was performed. Further, the same 65 types of Pseudomonas aeruginosa strains were similarly classified into resistance and sensitivity by the standard method described in Example 1 above. These results are shown in FIG. FIG. 6 is a graph showing the number of resistant and sensitive strains among 65 types of Pseudomonas aeruginosa strains. As shown in FIG. 6, the classification result similar to that of the standard method was obtained by the micro device method of this example. From this result, it was found that according to the microdevice method of the present invention, resistance and sensitivity can be judged in a much shorter time (3 hours) than the standard method requiring a long time.
  • the liquid mixture of the antibacterial drug and the test bacteria solution is incubated in the flow path of the microdevice, and the observation area in the flow path is observed with a microscope, for example.
  • a microscope for example.
  • the inspection method of the present invention can be easily performed. For this reason, the present invention is extremely useful in clinical examinations, environmental tests and the like.

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Abstract

　簡便且つ迅速に、抗菌薬に対する細菌または真菌の感受性を検査できる新たな方法およびそれに用いる検査システムを提供する。　本発明の検査方法は、細菌または真菌の抗菌薬感受性の検査方法であり、流路を有するマイクロデバイスを使用し、前記マイクロデバイスの前記流路内で、抗菌薬と被検菌液との混合液をインキュベートする工程、および、前記マイクロデバイスの前記流路の観察エリアにおける、前記被検菌液由来の細菌または真菌を検出する検出工程を含むことを特徴とする。前記検出工程は、例えば、前記観察エリアにおける、前記被検菌液由来の細菌または真菌の増減や形態変化を、顕微鏡等により検出することにより行える。

Description

細菌または真菌の抗菌薬感受性の検査方法およびそれに用いるシステム
　本発明は、細菌または真菌の抗菌薬感受性の検査方法およびそれに用いるシステムに関する。
　近年、薬剤耐性菌が増加していることから、有効な抗菌薬を選択するために、細菌または真菌の抗菌薬に対する感受性を確認することは、極めて重要となっている。
　細菌および真菌の感受性検査のため、簡易迅速化を目的とした機器が発売されている（非特許文献１）。しかしながら、これらの大型機器は高価である。また、前記機器は、濁度判定を行うために、判定可能な濁度にまで菌を増殖させなければならない。例えば、緑膿菌のように増殖の遅い菌の場合、最短でも８時間以上を要する。また、前記機器を必要としない方法として、一般的に、微量液体希釈法、濃度勾配をつけたディスクにより、寒天培地に形成される培養後の阻止円からＭＩＣ（最少発育阻止濃度）を決定する方法、Ｋｉｒｂｙ－Ｂａｕｅｒ法（Ｋ－Ｂ法）に基づくディスク法等があげられる（非特許文献２）。しかしながら、これらの方法についても、検査開始から感受性の判定まで、例えば、１８時間程度を要するため、さらなる迅速化が求められている。
Ｋａｎｅｍｉｔｓｕら、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００５，　ｐ．５８０８－５８１０ 石井ら、日本化学療法学会雑誌、２００２、ｐ．２５９－２６５
　そこで、本発明は、簡便且つ迅速に、抗菌薬に対する細菌または真菌の感受性を検査できる新たな方法およびそれに用いる検査システムを提供することを目的とする。
　前記目的を達成するために、本発明の検査方法は、細菌または真菌の抗菌薬感受性の検査方法であり、流路を有するマイクロデバイスを使用し、前記マイクロデバイスの前記流路内で、抗菌薬と被検菌液との混合液をインキュベートする工程、および、前記マイクロデバイスの前記流路の観察エリアにおける、前記被検菌液由来の細菌または真菌を検出する検出工程を含むことを特徴とする。
　本発明の検査システムは、前記本発明の検査方法により細菌または真菌の抗菌薬感受性を検査するための検査システムであって、被検菌液と抗菌薬との混合液が導入された流路を有するマイクロデバイスをインキュベートするインキュベート手段、前記マイクロデバイスの前記流路の観察エリアの画像を取得する画像取得手段、前記画像における細菌または真菌の数および形態の少なくとも一方の情報を取得する情報取得手段、および、前記情報に基づいて、前記被検菌液由来の細菌または真菌の抗菌薬感受性を決定する決定手段を有することを特徴とする。
　本発明によれば、前記マイクロデバイスの流路内で、抗菌薬と被検菌液との混合液をインキュベートし、前記流路における観察エリアを、例えば、顕微鏡等で観察することによって、細菌または真菌の抗菌薬に対する感受性を、簡便かつ迅速に確認できる。また、本発明の検査システムによれば、前記本発明の検査方法を簡便に行うことができる。このため、本発明は、臨床検査、環境試験等において、極めて有用である。特に、臨床検査においては、例えば、対象となる細菌および真菌について、適切な抗菌薬の選択が早期に可能となるため、救命率の向上、不要な薬剤使用量の減少等の効果が期待でき、長期的に見れば、耐性菌の増加を抑制できる可能性がある。
マイクロデバイスの一例を示す斜視図である。 マイクロデバイスの一例を示す上面図である。 マイクロデバイスにおける上基板の一例を示す下面図である。 マイクロデバイスの一例を示す斜視図である。 マイクロデバイスの一例を示す上面図である。 マイクロデバイスにおける上基板の一例を示す下面図である。 マイクロデバイスの一例を示す断面図である。 本発明の実施例における緑膿菌の顕微鏡写真である。 本発明の実施例における緑膿菌の顕微鏡写真である。 本発明の実施例における緑膿菌の顕微鏡写真である。 本発明の実施例における６５種類の緑膿菌株の分類を示すグラフである。 本発明の実施例における緑膿菌の顕微鏡写真である。 本発明の実施例における緑膿菌の顕微鏡写真である。 本発明の検査システムの一例を示すブロック図である。 マイクロデバイスの一例を示す斜視図である。 マイクロデバイスの一例を示す上面図である。 マイクロデバイスにおける上基板の一例を示す下面図である。 マイクロデバイスの一例を示す断面図である。
　本発明の検査方法は、前述のように、細菌または真菌の抗菌薬感受性の検査方法であり、流路を有するマイクロデバイスを使用し、前記マイクロデバイスの前記流路内で、抗菌薬と被検菌液との混合液をインキュベートする工程、および、前記マイクロデバイスの前記流路の観察エリアにおける前記被検菌液由来の細菌または真菌を検出する検出工程を含むことを特徴とする。
　本発明において、細菌または真菌の抗菌薬感受性の検査とは、例えば、細菌または真菌の抗菌薬耐性の検査の意味も含む。
　本発明の検査方法において、検査対象となる細菌および真菌の種類は、特に制限されない。具体例としては、例えば、黄色ブドウ球菌、腸球菌、大腸菌およびその他腸内菌、緑膿菌、アシネトバクター属およびその他糖非発酵菌、肺炎球菌、インフルエンザ菌、レジオネラ属細菌、キャンピロバクター属細菌、結核菌等があげられる。
　本発明の検査方法において、検査対象となる被検菌液の種類は、特に制限されない。前記被検菌液は、例えば、臨床検体等から分離培養したコロニーから調製できる。前記被検菌液は、これには制限されず、例えば、臨床検体をそのまま使用してもよい。この場合、前記臨床検体は、例えば、コンタミネーションの可能性が低い検体が好ましく、また、十分な菌の密度が確保できる検体が好ましい。また、前記臨床検体を使用する場合、例えば、前記臨床検体からの菌の回収と、培地への再懸濁を行うことが好ましい。
　本発明の検査方法において、前記マイクロデバイスの構造は、何ら制限されず、前記被検菌液が導入可能な流路を備えていればよい。前記マイクロデバイスについては、例を後述する。
　本発明の検査方法において、前記マイクロデバイスに対する、前記抗菌薬および前記被検菌液の導入順序は、特に制限されない。導入は、例えば、接種または供給と言い換えできる。前記インキュベート工程において、例えば、前記マイクロデバイスの前記流路に、前記抗菌薬と前記被検菌液との混合液を導入してもよい。また、例えば、前記マイクロデバイスの前記流路に、予め、前記抗菌薬を配置し、前記インキュベート工程前において、または、前記インキュベート工程において、前記マイクロデバイスの前記流路に、前記被検菌液を導入してもよい。
　本発明の検査方法において、前記マイクロデバイスに導入する前記被検菌液の量および前記被検菌液中の菌数は、特に制限されない。前記量および菌数は、例えば、前記マイクロデバイスの大きさ、前記流路の大きさ等に応じて、適宜設定できる。本発明の検査方法において、使用する抗菌薬の量は、特に制限されず、例えば、前記被検菌液の量および推定臨床有効濃度（ブレイクポイント）等に応じて、適宜設定できる。
　本発明の検査方法において、前記インキュベート工程の条件は、特に制限されない。前記インキュベート条件は、例えば、対象となる細菌または真菌の至適生育条件に応じて、適宜選択できる。インキュベート温度は、特に制限されず、例えば、３０～３７℃であり、具体例として、大腸菌および緑膿菌等の一般細菌は、例えば、３７℃である。インキュベート時間は、特に制限されず、大腸菌等の増殖の速い菌は、例えば、２～３時間であり、緑膿菌およびその他の糖非発酵菌は、例えば、３～４時間である。インキュベート時間は、これには制限されず、例えば、前記抗菌薬が非存在下での前記被検菌の増殖（コントロール）が、判定に十分なレベルに達した時点で終了してもよい。
　本発明の検査方法は、例えば、このインキュベート時間が、実質的に、検査に要するトータルの時間を決定づける要因となる。このため、本発明の検査方法によれば、前記インキュベート工程を短時間で行うことができるため、総合的に、非常に短時間での検査が可能といえる。
　前記インキュベート工程において、前記マイクロデバイスは、例えば、加温による流路内の乾燥で、前記抗菌薬の濃度が変化することを十分に防止できることから、湿度を維持した条件下でインキュベートすることが好ましい。具体例としては、例えば、水を含ませたティッシュ等を入れた密閉容器内で、前記マイクロデバイスをインキュベートすることが好ましい。前記湿度は、例えば、９５～１００％であり、９７～１００％が好ましい。
　前記検出工程において、例えば、前記被検菌液由来の細菌または真菌について、前記観察エリアにおける、数の増減および形態変化の少なくとも一方を観察することが好ましい。前記検出工程において、例えば、数および形態のいずれか一方のみを観察してもよいし、両方を観察してもよい。前記検出工程において、例えば、細菌または真菌の粗密度合を観察してもよい。前記検出工程において、例えば、細菌もしくは真菌の数、形態変化および／または粗密度合について、インキュベート工程の前後における変化または経時的な変化を観察してもよい。細菌または真菌が前記抗菌薬に耐性を示す場合、例えば、前記インキュベートを行うと、増殖により菌数が増加する。他方、細菌または真菌が前記抗菌薬に感受性を示す場合、例えば、インキュベートを行っても、菌数が増加しない、死滅により数が減少する、または形態が変化する等の徴候が見られる。したがって、例えば、数の増減および／または形態変化を観察することによって、細菌または真菌の抗菌薬感受性を判断できる。前記感受性の判断は、例えば、感受性の有無として判断してもよいし、ＭＩＣとして判断してもよい。
　前記検出工程において、前記被検菌液由来の細菌または真菌の検出方法は、特に制限されず、例えば、顕微鏡による検出があげられる。中でも、より正確な検査が行えることから、前記検出工程において、前記顕微鏡により、前記被検菌液由来の細菌または真菌を検出することが好ましい。前記顕微鏡の種類は、特に制限されず、例えば、光学顕微鏡、蛍光顕微鏡等があげられ、光学顕微鏡が好ましい。また、前記顕微鏡は、例えば、小型化顕微鏡が好ましい。前記顕微鏡は、例えば、ＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ　Ｃｏｕｐｌｅｄ　Ｄｅｖｉｃｅ）を備えることが好ましい。本発明の検査方法は、例えば、前記マイクロデバイスと前記顕微鏡とを使用することにより、例えば、高額な機器を使用する必要がなく、また、機器によって場所をとることも回避できる。このため、例えば、容易に既存の検査室および研究室に導入可能であり、非常に容易な実施が可能になる。また、前記顕微鏡による検出は、例えば、前記顕微鏡から出力した画像による検出の意味も含む。前記顕微鏡は、例えば、その視野における画像を得るために、出力手段に連結していることが好ましい。前記出力手段は、例えば、モニタ、プリンタ等があげられる。
　本発明の検出方法において、前記検出工程は、例えば、前記インキュベート工程の前または後に行われ、特に、前記インキュベート工程の前後に行うことが好ましい。つまり、前記流路の観察エリアにおける前記被検菌液由来の細菌または真菌の検出を、前記マイクロデバイスのインキュベート前およびインキュベート後の両方で行うことが好ましい。これによって、例えば、インキュベート前の数とインキュベート後の数、または、インキュベート前の形態とインキュベート後の形態とを比較できる。
　本発明の検出方法において、前記マイクロデバイスは、前述のように、何ら制限されない。以下に、前記マイクロデバイスを例示するが、本発明は、これには制限されない。
　前記マイクロデバイスにおいて、前記流路は、内部を液体が移動可能であればよい。前記流路内に液体が流れるメカニズムは、何ら制限されない。具体例として、前記液体は、例えば、前記流路の毛細管現象を利用して移動させてもよいし、加圧または減圧によって移動させてもよい。前記流路は、例えば、マイクロ流路であることが好ましい。例えば、前記流路の流路長を確保する等のために、前記流路は、曲げられた状態で設けられてもよい。この場合、例えば、前記流路を通過する前記液体に対する抵抗を低くする観点から、前記流路の角部は、湾曲した形状、丸い形状等であることが好ましい。
　前記マイクロデバイスにおいて、前記流路は、例えば、一方の端部が開口している。前記一方の開口端部は、例えば、前記被検菌液の導入口となり、供給口または接種口ともいう。また、前記流路は、例えば、さらに、他方の端部も開口していることが好ましい。前記他方の開口端部は、例えば、空気口となる。また、前記他方の開口端部は、例えば、前記導入口から導入されて前記流路を通過した被検菌液が導出する導出口となってもよい。前記導出口は、例えば、前記被検菌液が前記流路から排出される排出口ということもできる。前記流路において、前記導入口から前記被検菌液が流れる方向を、「流れ方向」といい、前記流れ方向において、例えば、前記導入口側が上流側であり、前記空気口側が下流側となる。前記流路において、前記観察エリアは、例えば、前記導入口より下流側に設定され、また、前記観察エリアは、例えば、前記導入口と前記空気口との間に設定される。
　前記流路は、例えば、さらに、排気部を有してもよい。前記排気部は、例えば、前記流路において、前記観察エリアより下流側に位置することが好ましく、具体的には、例えば、前記流路の末端に位置する。前記排気部は、例えば、空気口である。また、前記流路の末端には、例えば、前記観察エリアを通過した前記被検菌液を貯留可能なエリアとして、排液部を有してもよい。前記流路は、前記下流側の端部において、前記排気部（空気口）と前記排液部の両方を有してもよい。
　前記流路について、以下、前記観察エリアより上流側を「導入流路」、前記観察エリアよりも下流側を「排出流路」ともいう。前記導入流路と前記排出流路の長さは、例えば、同じでもよいし、異なっていてもよい。後者の場合、前記排出流路は、前記導入流路より短いのが好ましい。このようにすることで、例えば、前記空気口（排気口）からの空気の供給がよりスムーズになり、前記被検菌液由来の細菌または真菌を増殖させやすくなる。前記観察エリアの大きさ（例えば、流路幅）と、前記導入流路および前記排出流路の大きさ（例えば、流路幅）は、例えば、同じでもよいし、異なっていてもよい。後者の場合、前記液体の抵抗を低くする観点から前後の流路幅を広くしたとしても、前記観察エリアの大きさは、複数の流路を同時に顕微鏡観察し易いように、例えば、前記導入流路および前記排出流路の大きさより小さいのが好ましい。
　前記マイクロデバイスにおいて、前記流路は、例えば、基板（基材ともいう）に設けられている。前記基板は、例えば、顕微鏡等により観察可能であることから、透明基材が好ましい。前記透明基材の原料は、特に制限されず、例えば、ポリジメチルシロキサン等のポリマー、ガラス等があげられる。検出対象の細菌または真菌が好気性の場合、前記基板は、例えば、通気性基板が好ましい。
　前記マイクロデバイスは、例えば、前記基板が、上基板と下基板との積層体であることが好ましい。前記上基板は、例えば、前記下基板との積層表面に、前記流路となる凹部が形成されていることが好ましく、前記流路の一方の末端または両端に該当する箇所に、貫通孔を有することが好ましい。前記上基板と前記下基板とを積層すれば、前記積層体において、例えば、前記上基板の凹部により形成される空洞が、前記流路となり、前記上基板の一方の貫通孔が、前記流路の導入口となり、他方の貫通孔が、前記流路の空気口（導出口）となる。前記流路において、所望の部位を前記観察エリアに設定できる。前記積層体に対して、前記上基板の前記導入口から液体を供給すると、前記液体は、前記導入口を経て前記流路に導入され、前記流路を通過し、前記流路の他方の末端に到達する。前記マイクロデバイスが、さらに前記排気部を備える場合も、同様である。前記上基板または前記下基板は、例えば、前記積層表面に、さらに、前記流路の下流側の末端に前記排気部となる凹部が形成されていることが好ましい。また、前記上基板は、例えば、前記排気部に該当する箇所に、前記空気口となる貫通孔を有することが好ましい。前記マイクロデバイスは、このような形態には制限されず、例えば、下基板が前述のような凹部を有してもよい。
　前記マイクロデバイスは、例えば、前記流路に、予め、抗菌薬を配置してもよい。以下、前記流路において、前記抗菌薬が配置される部位または前記抗菌薬を配置した部位を、試薬部ともいう。前記試薬部は、例えば、予め、抗菌薬が配置されてもよいし、使用時、前記被検菌液の導入前に、前記抗菌薬が配置されてもよい。この場合、例えば、前記マイクロデバイスに前記被検菌液を供給することで、前記流路内で、前記被検菌液と前記抗菌薬とを混合できる。
　前記試薬部への前記抗菌薬の配置方法は、特に制限されず、例えば、前記抗菌薬を含む抗菌薬液を前記流路の所望の部位に供給し、乾燥することによって配置できる。また、前記抗菌薬液を、例えば、前記導入口から前記流路内に通液して、前記流路内に前記抗菌薬を配置してもよいし、前記導出口から前記流路内に通液して、前記流路内に前記抗菌薬を配置してもよい。前記マイクロデバイスに前記抗菌薬液を導入した後、例えば、前記マイクロデバイスを乾燥することが好ましい。
　前記マイクロデバイスに予め抗菌薬を配置した場合、前記マイクロデバイスは、例えば、使用時まで乾燥状態で保存しておくことが好ましい。
　また、前記マイクロデバイスは、例えば、前記試薬部を有していなくてもよい。この場合、例えば、前記被検菌液と前記抗菌薬とを、前記マイクロデバイスの外部で混合し、この混合液を、前記マイクロデバイスに導入してもよい。
　前記マイクロデバイスにおいて、前記観察エリアを有する流路の数は、特に制限されない。前記流路の数は、例えば、供給する被検菌液の数、抗菌薬の数、抗菌薬の濃度の数、コントロールの数等に応じて適宜設定できる。前記観察エリアを有する流路の数は、例えば、複数であり、２つ以上、例えば、２～２５である。前記流路の数は、例えば、目的に応じて、顕微鏡観察がし易いように、配置可能な数にするのが好ましい。このように、複数の前記流路を有する前記マイクロデバイスによれば、例えば、複数種の抗菌薬、複数種の抗菌薬濃度および／または複数種の被検菌液を、一つのマイクロデバイスで判定可能である。前記流路は、例えば、マイクロデバイスを大きくすること等により、数を増やすことが可能である。前記流路が複数の場合、前記各流路の長さは、例えば、同じでもよいし、異なっていてもよい。前記被検菌液由来の細菌または真菌の増殖速度を揃える観点から、前者が好ましい。
　前記マイクロデバイスが、例えば、複数の流路を有する場合、前記検出工程において、各流路の観察エリアについて、前記被検菌液由来の細菌または真菌を検出することが好ましい。また、前記マイクロデバイスにおいて、前記複数の流路の観察エリアは、例えば、それぞれ平行して近接していることが好ましく、並列に配置されているともいえる。また、前記検出工程において顕微鏡を使用する場合、例えば、全ての観察エリアを一回で観察できることから、顕微鏡の視野内に全観察エリアが収まるように、前記マイクロデバイスにおいて全観察エリアが収束して配置されていることが好ましい。
　前記マイクロデバイスが、前記観察エリアを有する複数の流路を備える場合、前記各流路は、それぞれ独立してもよいし、部分的に連結してもよい。前者のマイクロデバイスを第１の形態、後者のマイクロデバイスを第２の形態および第３の形態として、以下に例示する。なお、本発明において、前記マイクロデバイスは、これらの例示に制限されない。
（第１の形態）
　第１の形態のマイクロデバイスは、例えば、前記複数の流路が、それぞれ、異なる前記導入口および異なる前記観察エリアを有する形態である。
　前記マイクロデバイスは、例えば、それぞれ、前記導入口と前記観察エリアとが独立していることから、各流路の観察エリアにおいて、異なる被検菌液、異なる抗菌薬および／または同じ抗菌薬の異なる濃度に関する検査を行うことができる。
　図１に、前記マイクロデバイスの一例を示す。図１Ａは、マイクロデバイス１について、これを構成する上基板１０と下基板２０とを分離した状態で示す斜視図であり、図１Ｂは、マイクロデバイス１の上面図であり、図１Ｃは、上基板１０の下面図、つまり、上基板１０において、下基板２０との積層面の図である。
　図１Ａおよび図１Ｂに示すように、上基板１０は、導入口となる貫通孔１１ａ’～１１ｄ’、２１ａ’～２１ｄ’、３１ａ’～３１ｄ’、４１ａ’～４１ｄ’、５１ａ’、空気口となる貫通孔１５ａ’～１５ｄ’、２５ａ’～２５ｄ’、３５ａ’～３５ｄ’、４５ａ’～４５ｄ’、５５ａ’が設けられている。図１Ａにおいては、導入口１１ａ’および空気口１５ａ’のみを立体的に示したが、他の貫通孔も同様である。
　図１Ｃに示すように、上基板１０の下面には、導入口１１ａ’～１１ｄ’、２１ａ’～２１ｄ’、３１ａ’～３１ｄ’、４１ａ’～４１ｄ’、５１ａ’に対応する導入部１１ａ～１１ｄ、２１ａ～２１ｄ、３１ａ～３１ｄ、４１ａ～４１ｄ、５１ａ、導入流路１２ａ～１２ｄ、２２ａ～２２ｄ、３２ａ～３２ｄ、４２ａ～４２ｄ、５２ａ、観察エリア１３ａ～１３ｄ、２３ａ～２３ｄ、３３ａ～３３ｄ、４３ａ～４３ｄ、５３ａ、排出流路１４ａ～１４ｄ、２４ａ～２４ｄ、３４ａ～３４ｄ、４４ａ～４４ｄ、５４ａ、および、空気口１５ａ’～１５ｄ’、２５ａ’～２５ｄ’、３５ａ’～３５ｄ’、４５ａ’～４５ｄ’、５５ａ’と対応する排気部１５ａ～１５ｄ、２５ａ～２５ｄ、３５ａ～３５ｄ、４５ａ～４５ｄ、５５ａが、それぞれ連結して、凹部として形成されている。なお、図１Ｃにおいて、観察エリア１３ａ、２３ａ、３３ａ、４３ａ以外の観察エリアは、符号を省略するが、観察エリア１３ａに平行する領域が、観察エリア１３ａ側から、順に、観察エリア１３ｂ～１３ｄであり、観察エリア２３ａに平行する領域が、観察エリア２３ａ側から、順に、観察エリア２３ｂ～２３ｄであり、観察エリア３３ａに平行する領域が、観察エリア３３ａ側から、順に、観察エリア３３ｂ～３３ｄであり、観察エリア４３ａに平行する領域が、観察エリア４３ａ側から、順に、観察エリア４３ｂ～４３ｄであり、導入口５１ａと排気部５５ａとの間の流路における中心領域が、観察エリア５３ａとなる。５３ａ以外の観察エリアは、２ヶ所で折れ曲がっているが、５３ａと並行する部位を観察するのが好ましい。
　以下、前記導入口、前記導入部、前記導入流路、前記観察エリア、前記排出流路、前記排気部および前記空気口が連結した空洞を、それぞれ「レーン」といい、各レーンの名称は、前記導入口の符号で表わす。つまり、例えば、導入口１１ａ’、導入部１１ａ、導入流路１２ａ、観察エリア１３ａ、排出流路１４ａ、排気部１５ａおよび空気口１５ａ’が連結した空洞を、レーン１１ａ’という。
　マイクロデバイス１の大きさは、特に制限されず、例えば、以下のように例示できる。
全体の大きさ
　　幅（図１Ａにおいて矢印Ｘ方向の長さ）：例えば、３０～４０ｍｍ
　　長さ（図１Ａにおいて矢印Ｙ方向の長さ）：例えば、３０～４０ｍｍ
　　厚み（図１Ａにおいて矢印Ｚ方向の長さ）：例えば、１～３ｍｍ
上基板１０、
　　厚み：例えば、０．８～２．８ｍｍ
　　凹部の深さ：例えば、１０～２５μｍ
前記導入口
　　直径：例えば、０．７５～１．５ｍｍで、好ましくは、０．７５ｍｍ
前記導入流路
　　長さ：例えば、１０～１５ｍｍ
前記観察エリア
　　長さ：例えば、１～５ｍｍ
前記排出流路
　　長さ：例えば、１０～１５ｍｍ
前記排気部
　　直径：例えば、０．７５～１．５ｍｍ
下基板２０
　　厚み：例えば、０．１２～０．１７ｍｍ
　前記マイクロデバイスは、例えば、試薬部を有しても、有していなくてもよい。前者の場合、前記試薬部の部位は、例えば、少なくとも前記観察エリアを含むことが好ましく、より好ましくは、前記導入口から前記観察エリアを含み、さらに好ましくは、前記導入口から前記空気口までの範囲、すなわち、前記導入流路と前記排出流路を含む流路全体である。
　前記マイクロデバイスに、予め前記抗菌薬を配置する場合、例えば、前記抗菌薬液を、前記導入口および前記空気口のいずれかから、前記流路に導入（充填）し、その後、前記マイクロデバイスを乾燥させることで、前記抗菌薬を配置できる。
　前記マイクロデバイスにおいて、各レーンに導入する前記抗菌薬液の液量は、特に制限されないが、例えば、レーンあたり０．２～３μＬである。前記抗菌薬液の調製は、特に制限されず、抗菌薬の種類に応じて、例えば、溶媒、濃度等を適宜決定できる。前記溶媒は、特に制限されず、例えば、エタノール、水、緩衝液等があげられる。
　前記マイクロデバイスにおいて、各レーンに導入する被検菌液の液量は、特に制限されない。前記マイクロデバイスにおいて、各レーンに導入する前記被検菌液の菌量は、特に制限されず、前記被検菌液の濁度を、例えば、ＭｃＦａｒｌａｎｄ　０．５に調製するのが望ましい。前記被検菌液の菌量は、例えば、菌種や検査の目的に応じて改変可能である。
　前記マイクロデバイスの流路は、それぞれ、異なる導入口を有する。このため、前記マイクロデバイスによれば、例えば、各流路に、異なる抗菌薬を混合した被検菌液を導入することで、特定の被検菌について、複数の抗菌薬に対する感受性を確認できる。また、前記マイクロデバイスによれば、例えば、各流路に、同じ抗菌薬を異なる濃度で充填して、各導入口に、同じ被検菌液を導入することで、特定の抗菌薬に対するＭＩＣ（最少発育阻止濃度）を決定できる。また、前記マイクロデバイスによれば、例えば、各試薬部に、同じ抗菌薬を配置して、各導入口に、異なる被検菌液を導入することで、特定の抗菌薬に対する、各被検菌液の感受性を確認できる。
　具体例として、マイクロデバイス１は、例えば、レーン１１ａ’～１１ｄ’のグループ、レーン２１ａ’～２１ｄ’のグループ、レーン３１ａ’～３１ｄ’のグループ、レーン４１ａ’～４１ｄ’のグループには、それぞれ、異なる抗菌薬を配置し、各グループ内の各レーンには、同じ抗菌薬を異なる濃度で配置し、レーン５１ａ’は、抗菌薬を配置しないコントロールとして使用する形態があげられる。この形態によれば、例えば、１種類の被検菌液について、４種類の抗菌薬に対する感受性および耐性を確認でき、さらに、各グループにおいて、各レーンは、異なる濃度の抗菌薬が配置されていることから、ＭＩＣを決定することも可能である。
　前記流路に抗菌薬を充填したマイクロデバイス１を使用して、被検菌液の抗菌薬感受性を検査する方法を、以下に例示する。
　まず、前記被検菌液を、マイクロデバイス１内の前記各導入口に供給する。前記各導入口に供給された前記被検菌液は、前記導入口から前記流路に移動し、前記流路に充填された前記抗菌薬と混合される。
　つぎに、マイクロデバイス１をインキュベートする。インキュベート条件は、例えば、前述の通りである。そして、マイクロデバイス１の観察エリアを、顕微鏡で観察し、細菌数または真菌数の増減および細菌または真菌の形態変化を確認する。これによって、抗菌薬に対する感受性を検査できる。
（第２の形態）
　第２の形態のマイクロデバイスは、例えば、複数の流路が、同一の前記導入口を有し、それぞれ異なる観察エリアを有する形態である。前記マイクロデバイスは、特に示さない限り、前記第１の形態の説明を援用できる。
　前記マイクロデバイスは、例えば、複数の流路が同一の導入口を有することから、各流路の観察エリアにおいて、例えば、同一の被検菌液について、異なる抗菌薬に関する検査および／または同じ抗菌薬の異なる濃度に対する検査を行うことができる。
　図２に、前記マイクロデバイスの一例を示す。図２Ａは、マイクロデバイス２について、これを構成する上基板６０と下基板７０とを分離した状態で示す斜視図であり、図２Ｂは、マイクロデバイス２の上面図であり、図２Ｃは、上基板６０の下面図、つまり、上基板６０において、下基板７０との積層面の図であり、図２Ｄは、図２ＢのＩ－Ｉ方向断面図である。
　図２Ａおよび図２Ｂに示すように、上基板６０は、導入口となる貫通孔６１’、空気口となる貫通孔６５ａ’～６５ｄ’が設けられている。図２Ｃに示すように、上基板６０の下面には、導入口６１’に対応する導入部６１、第１導入流路６６、第１導入流路６６の下流末端から分岐する第２導入流路６２ａ～６２ｄ、観察エリア６３ａ～６３ｄ、排出流路６４ａ～６４ｄおよび排気部６５ａ～６５ｄが、それぞれ連結して、凹部として形成されている。
　以下、前記導入口、前記導入部、前記第１導入流路、前記第２導入流路、前記観察エリア、前記排出流路、前記排気部および前記空気口が連結した空洞を、それぞれ「レーン」といい、各レーンの名称は、前記第２導入流路の符号で表わす。つまり、例えば、導入口６１’、導入部６１、第１導入流路６６、第２導入流路６２ａ、観察エリア６３ａ、排出流路６４ａ、排気部６５ａおよび空気口６５ａ’が連結した空洞を、レーン６２ａという。
　マイクロデバイス２の大きさは、特に制限されず、例えば、以下のように例示できる。
全体の大きさ
　　幅（図２Ａにおいて矢印Ｘ方向の長さ）：例えば、３０～４０ｍｍ
　　長さ（図２Ａにおいて矢印Ｙ方向の長さ）：例えば、３０～４０ｍｍ
　　厚み（図２Ａにおいて矢印Ｚ方向の長さ）：例えば、１～３ｍｍ
上基板６０
　　厚み：例えば、０．８～２．８ｍｍ
　　凹部の深さ：例えば、１７μｍ
前記導入口
　　直径：例えば、０．７５ｍｍ
前記導入流路
　　長さ：例えば、５０ｍｍ
前記第１導入流路：例えば、２ｍｍ
前記第２導入流路：例えば、３～５ｃｍ
前記観察エリア
　　長さ：例えば、８ｍｍ
前記排出流路
　　長さ：例えば、２～５ｍｍ
前記排気部
　　直径：例えば、１．５ｍｍ
　マイクロデバイス２は、例えば、試薬部を有する。前記試薬部の部位は、特に制限されない。前記試薬部は、例えば、少なくとも前記観察エリアを含むことが好ましく、より好ましくは、前記第１導入流路より下流（例えば、前記第２導入流路の半ば）から前記排気部を含む範囲である。
　マイクロデバイス２において、前記各流路に導入する前記抗菌薬液の液量は、特に制限されないが、例えば、レーンあたり０．２５～１μＬである。
　マイクロデバイス２において、導入する被検菌液の液量は、特に制限されず、例えば、９～１０μＬである。マイクロデバイス２において、導入する被検菌液の菌量は、特に制限されない。
　マイクロデバイス２の流路は、それぞれ、同一の導入口と異なる観察エリアを有する。このため、マイクロデバイス２は、例えば、各流路に異なる抗菌薬を配置して、前記導入口から各流路に同じ被検菌液を導入することで、特定の被検菌について、複数の抗菌薬に対する感受性を確認できる。また、マイクロデバイス２によれば、例えば、各流路に、同じ抗菌薬を異なる濃度で配置して、前記導入口に、同じ被検菌液を導入することで、特定の抗菌薬に対するＭＩＣ（最少発育阻止濃度）を決定できる。
　具体例として、マイクロデバイス２は、例えば、レーン６２ａ～６２ｄのいずれか３つに、それぞれ、異なる抗菌薬を配置し、残りの１つのレーンは、抗菌薬を配置しないコントロールとして使用する形態があげられる。この形態によれば、例えば、１種類の被検菌液について、３種類の抗菌薬に対する感受性を確認できる。
　マイクロデバイス２を使用して、被検菌液の抗菌薬感受性を検査する方法は、特に制限されず、前記被検菌液を、導入口６１’からマイクロデバイス２に導入する以外は、前述した図１における例示を援用できる。
（第３の形態）
　第３の形態のマイクロデバイスは、前述の第２の形態と同様に、例えば、複数の流路が、同一の前記導入口を有し、それぞれ異なる観察エリアを有する形態である。前記マイクロデバイスは、特に示さない限り、前記第１の形態および前記第２の形態の説明を援用できる。
　前記マイクロデバイスは、例えば、複数の流路が同一の導入口を有することから、各流路の観察エリアにおいて、例えば、同一の被検菌液について、異なる抗菌薬に関する検査および／または同じ抗菌薬の異なる濃度に対する検査を行うことができる。
　図１０に、前記マイクロデバイスの一例を示す。図１０Ａは、マイクロデバイス３について、これを構成する上基板９０と下基板１００とを分離した状態で示す斜視図であり、図１０Ｂは、マイクロデバイス３の上面図であり、図１０Ｃは、上基板９０の下面図、つまり、上基板９０において、下基板１００との積層面の図であり、図１０Ｄは、図１０ＢのＩＩ－ＩＩ方向断面図である。
　図１０Ａおよび図１０Ｂに示すように、上基板９０は、導入口となる貫通孔９１’、空気口となる貫通孔９５ａ’～９５ｆ’が設けられている。図１０Ｃに示すように、上基板９０の下面には、導入口９１’に対応する導入部９１、第１導入流路９６、第１導入流路９６の下流末端から分岐する第２導入流路９２ａ～９２ｆ、観察エリア９３ａ～９３ｆ、排出流路９４ａ～９４ｆおよび排気部９５ａ～９５ｆが、それぞれ連結して、凹部として形成されている。
　以下、前記導入口、前記導入部、前記第１導入流路、前記第２導入流路、前記観察エリア、前記排出流路、前記排気部および前記空気口が連結した空洞を、それぞれ「レーン」といい、各レーンの名称は、前記第２導入流路の符号で表わす。つまり、例えば、導入口９１’、導入部９１、第１導入流路９６、第２導入流路９２ａ、観察エリア９３ａ、排出流路９４ａ、排気部９５ａおよび空気口９５ａ’が連結した空洞を、レーン９２ａという。
　マイクロデバイス３の各レーンにおいて、第２導入流路９２ａ～９２ｆの角部には、丸みがつけられている。観察エリア９３ａ～９３ｆの流路幅は、第２導入流路９２ａ～９２ｆの流路幅および排出流路９２ａ～９２ｆの流路幅より狭くなっている。また、各レーンについて、観察エリア９３ａ～９３ｆから排気部９５ａ～９５ｆまでの流路の長さは、同じである。
　マイクロデバイス３の大きさは、特に制限されず、例えば、以下のように例示できる。
全体の大きさ
　　幅（図１０Ａにおいて矢印Ｘ方向の長さ）：例えば、３０～４０ｍｍ
　　長さ（図１０Ａにおいて矢印Ｙ方向の長さ）：例えば、３０～４０ｍｍ
　　厚み（図１０Ａにおいて矢印Ｚ方向の長さ）：例えば、１～４ｍｍ
上基板６０
　　厚み：例えば、０．８～３ｍｍ
　　凹部の深さ：例えば、５０μｍ（導入口部分：例えば、３００μｍ）
前記導入口
　　直径：例えば、１ｍｍ
前記導入流路
　　長さ：例えば、２５～３５ｍｍ
前記第１導入流路
　　長さ：例えば、２ｍｍ
前記第２導入流路
　　長さ：例えば、２３～３３ｃｍ
　　幅　：例えば、２００μｍ
前記観察エリア
　　長さ：例えば、４ｍｍ
　　幅　：例えば、１００μｍ
前記排出流路
　　長さ：例えば、２～３ｍｍ
　　幅　：例えば、５００μｍ
前記排気部
　　直径：例えば、１．５ｍｍ
　マイクロデバイス３は、例えば、試薬部を有する。前記試薬部は、例えば、前述の第２の形態と同様である。
　マイクロデバイス３において、前記各流路に導入する前記抗菌薬液の液量は、特に制限されないが、例えば、レーンあたり０．２～０．４μＬである。
　マイクロデバイス３において、導入する被検菌液の液量は、特に制限されず、例えば、１５～２５μＬである。マイクロデバイス３において、導入する被検菌液の菌量は、特に制限されない。
　マイクロデバイス３の流路は、それぞれ、同一の導入口と異なる観察エリアを有する。このため、マイクロデバイス３は、例えば、前述の第２の形態と同様にして、特定の被検菌について、複数の抗菌薬に対する感受性を確認でき、または、特定の抗菌薬に対するＭＩＣ（最少発育阻止濃度）を決定できる。
　具体例として、マイクロデバイス３は、例えば、レーン９２ａ～９２ｆのいずれか５つに、それぞれ、異なる抗菌薬を配置し、残りの１つのレーンは、抗菌薬を配置しないコントロールとして使用する形態があげられる。この形態によれば、例えば、１種類の被検菌液について、５種類の抗菌薬に対する感受性を確認できる。
　マイクロデバイス３を使用して、被検菌液の抗菌薬感受性を検査する方法は、特に制限されず、前記被検菌液を、導入口９１’からマイクロデバイス３に導入する以外は、前述した図１における例示を援用できる。
　つぎに、本発明の検査システムは、前述のように、前記本発明の検査方法により細菌または真菌の抗菌薬感受性を検査するための検査システムであって、被検菌液と抗菌薬との混合液が導入された流路を有するマイクロデバイスをインキュベートするインキュベート手段、前記マイクロデバイスにおける前記流路の観察エリアの画像を取得する画像取得手段、前記画像における細菌または真菌の数、粗密度合および形態の少なくとも一方の情報を取得する情報取得手段、および、前記情報に基づいて、前記被検菌液由来の細菌または真菌の抗菌薬感受性を決定する決定手段を有することを特徴とする。
　本発明の検査システムは、例えば、コンピュータシステムによって構築された検査装置があげられる。前記システムのハードウェア構造は、制限されず、例えば、制御部であるＣＰＵに、記憶装置、キーボードやマウス等の入力装置が接続されており、さらに、例えば、結果の出力装置、入力データや結果を表示する表示装置（ディスプレイ）等が接続されてもよい。また、各手段は、例えば、コンピュータのＣＰＵが所定のプログラムを実行することによって実現される機能的ブロックであればよい。このため、例えば、各構成手段が、ハードウェアとして実装されてなくともよく、ネットワークシステムでもよい。
　本発明の検査システムは、例えば、さらに、前記マイクロデバイスをセットする固定手段を有する。前記マイクロデバイスは、例えば、ディスポーザブルでもよく、検体を測定・検出する毎に交換してもよい。前記検査システムは、例えば、前記セットされたマイクロデバイスに検体を導入するための導入口を有し、前記導入口は、前記マイクロデバイスの導入口と同一でもよい。前記検査システムは、例えば、前記マイクロデバイス内に導入された検体を、温度制御等により自動的にインキュベートする手段を有する。前記検査システムは、例えば、前記マイクロデバイスの観察エリアの画像を、間欠的あるいは連続的に、自動的に取得する手段を有する。また、例えば、各画像データから検体の細菌または真菌の数、粗密度合または形態、あるいはそれらの変化のデータを取得し、それらデータと基準値を比較する手段を有する。
　本発明の検査システムの構成について、一例を、図９のブロック図に示す。図９は、模式図であって、その大きさおよび形状等は、何ら制限されない。図９は、一例であって、本発明は、これには制限されない。
　図９に示すように、前記検査システムは、測定部７と画像処理部８とを備える。測定部７は、顕微鏡７００を備える。顕微鏡７００は、ＣＣＤカメラ７０１を内蔵し、マイクロデバイス７１をセットする配置部７０２、および配置部７０２の温度を制御する温度制御部７０３を備える。顕微鏡７００は、図示していないが、例えば、その他に、光源等、顕微鏡が備える一般的な構成を含む。画像処理部８は、ＣＰＵ８０、記憶部８１、出力部８２を備える。記憶部８１は、例えば、ＲＯＭ、ＨＤＤおよびＨＤ等があげられる。出力部８２は、例えば、モニタ、プリンタ等があげられる。
　前記検査システムによれば、例えば、以下のようにして本発明の検査方法を実行できる。まず、マイクロデバイス７１を、測定部７における顕微鏡７００の配置部７０２にセットする。マイクロデバイス７１は、例えば、前記被検菌液と前記抗菌薬との混合液が予め導入されたマイクロデバイスでもよいし、抗菌薬のみが予め導入されたマイクロデバイスのいずれでもよい。前記抗菌薬のみが導入されたマイクロデバイスの場合、マイクロデバイスを配置部７０２にセットした後、前記被検菌液を導入すればよい。そして、温度制御部７０３で配置部７０２の温度を制御することによって、配置部７０２にセットされたマイクロデバイス７１をインキュベートする。
　顕微鏡７００のＣＣＤカメラ７０１により、マイクロデバイス７１の観察エリアの画像を撮像し、これを信号として出力する。撮像は、例えば、間欠的あるいは連続的に行うことができる。この際、測定部７は、画像の撮像を制御する制御部をさらに備えることが好ましい。前記制御部は、例えば、ＣＰＵがあげられる。そして、出力された信号は、画像処理部８のＣＰＵ８０に入力される。前記信号がＣＰＵ８０で演算処理されると、演算後のデータが出力部８２に出力され、演算後のデータは、記憶部８１に記憶される。
　測定部７から出力された信号を、ＣＰＵ８０で演算処理することによって、例えば、細菌もしくは真菌の数、粗密度合および／または形態の変化を示すデータを算出し、さらに、算出データと予め設定された基準値との比較を行い、抗菌薬感受性が判断されてもよい。
　つぎに、本発明の実施例について説明する。なお、本発明は、下記の実施例により制限されない。
［実施例１］
（１）マイクロデバイス
　図１に示すマイクロデバイス１を以下に示すようにして作製した。マイクロデバイス１の上基板１０は、ＰＤＭＳ製、下基板２０は、ガラス製とした。マイクロデバイス１の大きさは、以下の通りとした。
全体長さ（Ｙ方向）：３０ｍｍ
全体幅（Ｘ方向）：４０ｍｍ
全体厚み（Ｚ方向）：２～３ｍｍ
上基板の凹部の深さ：１７μｍ
導入口の直径：０．７５ｍｍ
導入流路の長さ：１０～１５ｍｍ
導入流路の幅：０．１ｍｍ
観察エリアの長さ：２～５ｍｍ
観察エリアの各流路の幅：０．１ｍｍ
排出流路の長さ：１０～１３ｍｍ
排出流路の幅：０．１ｍｍ
排気部の直径：１ｍｍ
上基板の貫通孔の直径：０．７５ｍｍ
（１－１）鋳型の作製
１）　４０ｍｍ×５０ｍｍのカバーガラス（Ｎｏ．５、厚み１ｍｍ、Ｍａｔｓｕｎａｍｉ　Ｇｌａｓｓ　Ｉｎｄ．，　Ｌｔｄ．，）、または、シリコンウェハー（３ｉｎｃｈ、Ｆｅｒｒｏｔｅｃ　Ｃｏ．，）に、コーティング剤（商品名オムニコート、ＭｉｃｒｏＣｈｅｍ）を、４０００ｒｐｍ、１０秒でスピンコートし、１８０℃で１分焼成。
２）　フォトレジスト（ＳＵ８－２５、ＭｉｃｒｏＣｈｅｍ）を、２０００ｒｐｍ、３０秒でスピンコート。膜厚は、１６～１７μｍ。
３）　６５℃、３分および９５℃、７分でプリベーク。
４）　マスクアライナー（商品名、ＥＳ２０、Ｎａｎｏｍｅｒｉｃ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｃ．，）で、１１秒間、マイクロパターンを露光。
５）　露光後、６５℃、１分および９５℃、３分で、ベーク。
６）　ＳＵ８－Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ（商品名、マイクケム社）で、２分現像。
７）　固く焼き付けるため、１８０℃、３０分でハードベーク。
８）　後述するＰＤＭＳが剥がれやすいように、０．８４ｗｔ％のＣｙｔｏｐ８０９ＭＥ（商品名、Ａｓａｈｉ　Ｇｌａｓｓ　Ｃｏ．，　Ｌｔｄ．，）を、４０００ｒｐｍでスピンコートし、１８０℃で１時間処理。
（１－２）ＰＤＭＳ流路の成型
１）　ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）（商品名Ｓｉｌｐｏｔ　１８４、Ｄｏｗ　Ｃｏｒｎｉｎｇ　Ｔｏｒａｙ　Ｃｏ．，　Ｌｔｄ．，）と重合触媒とを、重量比１０：１で混合し、３０分脱気。
２）　モールドにディップし、１００℃、３０分で焼き固める。
（１－３）ガラス基板とＰＤＭＳの張り合わせ
１）　固めたＰＤＭＳ基材を剥がす。予めエタノールで洗浄したカバーガラス（Ｎｏ．１、厚み０．１２～０．１７ｍｍ、Ｍａｔｓｕｎａｍｉ　Ｇｌａｓｓ　Ｉｎｄ．，　Ｌｔｄ．，）とともに、前記ＰＤＭＳを、リアクティブイオンエッチング装置（商品名ＲＩＥ－１０ＮＲ、Ｓａｍｃｏ）に入れる。
２）　前記カバーガラスと前記ＰＤＭＳ基材を、酸素流量１００ｓｔａｎｄａｒｄ　ｃｕｂｉｃ／分（ｓｃｃｍ）、圧力５０Ｐａ、ＲＦ　ｐｏｗｅｒ　３０Ｗの条件の酸素プラズマに、２０秒さらす。
３）　前記カバーガラスと前記ＰＤＭＳ基材とを、プラズマ処理した面で張り合わせ、ボンディングを行う。
４）　前記ボンディングした積層体に、パンチャー（商品名ＢＰ－１５Ｆ、Ｋａｉ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ　Ｃｏ．，　Ｌｔｄ．，）で、導入口および空気口となる貫通孔をあける。
（２）抗菌薬液の調製
　以下に示す３種類の抗菌薬を、下記濃度となるようにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．２－７．４）に混合し、抗菌薬液を調製した。
アミカシンＡｍｉｋａｃｉｎ（商品名ＡＭＫ、Ｓｉｇｍａ）
　　６４０、３２０、１６０、８０μｇ／ｍＬ
シプロフロキサシンＣｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ（商品名ＣＰＦＸ、東京化成工業株式会社）
　　８０、４０、２０、１０μｇ／ｍＬ
イミペネムＩｍｉｐｅｎｅｍ／シラスタチンｃｉｌａｓｔａｔｉｎ（商品名ＩＰＭ、萬有製薬株式会社）
　　３２０、１６０、８０、４０μｇ／ｍＬ（ＩＰＭ濃度）
（３）被検菌液の調製
　Ｍｕｅｌｌｅｒ－Ｈｉｎｔｏｎ　Ａｇａｒ　（Ｂｅｃｔｏｎ，　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ）プレートを用いて、緑膿菌を、３７℃で２４時間、前培養した。コロニーを、Ｍｕｅｌｌｅｒ－Ｈｉｎｔｏｎ　ｂｒｏｔｈに懸濁し、ＭａｃＦａｒｌａｎｄ＝０．５（ＯＤ６００＝０．１３２）に調製した。緑膿菌は、多剤耐性株＃２株および＃５株（ＢＭＬより入手）、Ｓ１株（感受性株、ＢＭＬより入手）を、それぞれ使用した。
（４）インキュベート
　前記（２）の抗菌薬液と前記（３）の培養液とを、体積比１：９で混合し、混合液１μＬを、それぞれ、マイクロデバイス１の各導入口に注入した。また、コントロールとして、前記抗菌薬液に代えて、滅菌水と前記培養液とを、体積比１：９で混合し、混合液１μＬを、マイクロデバイス１の導入口に注入した。そして、シャーレにマイクロデバイス１を入れ、さらに、密閉容器に前記シャーレを入れた。なお、前記シャーレおよび前記密閉容器には、それぞれ、水を含ませたキムワイプを入れた。前記密閉容器を３７℃のインキュベーターに入れ、３時間インキュベートした。前記密閉容器および前記シャーレ内の相対湿度は、９７％であった。
（５）判定
　前記密閉容器からマイクロデバイス１を取り出し、顕微鏡により、観察エリアについて、コントロールに対する菌量の増減および形態変化を確認し、ＭＩＣ（最少発育阻止濃度）を決定した。
　他方、同じ緑膿菌について、標準法ＣＬＳＩ基準に則った微量液体希釈法により、ＡＭＫ、ＣＰＦＸおよびＩＰＭのＭＩＣを測定した。
　インキュベート後の緑膿菌＃２株の顕微鏡写真を図３に示す。図３において、ＡＭＫ、ＣＰＦＸおよびＩＰＭの写真の数字は、各抗菌薬の最終濃度（μｇ／ｍＬ）を示し、「＋」は、コントロール０ｈｒよりも増殖していることを示し、「－」は、コントロール０ｈｒと同程度であり、増殖が抑制されていることを示す。図３に示すように、前記マイクロデバイスを用いた方法によると、緑膿菌＃２株に対し、ＡＭＫのＭＩＣが、３２μｇ／ｍＬ以上であり、ＣＰＦＸのＭＩＣが、４μｇ／ｍＬ以上であり、ＩＰＭのＭＩＣが、１６μｇ／ｍＬであることがわかった。一方、標準法では、ＡＭＫのＭＩＣが、６４μｇ／ｍＬであり、ＣＰＦＸのＭＩＣが、３２μｇ／ｍＬであり、ＩＰＭのＭＩＣが、３２μｇ／ｍＬであった。前記マイクロデバイス法のＩＰＭと、標準法とのＩＰＭとでは、２倍異なるＭＩＣを示したが、いずれもＣＬＳＩのブレイクポイントを指標にすると、耐性（Ｒ）の判定で一致していた。
　インキュベート後の緑膿菌Ｓ１株の顕微鏡写真を図４に示す。図４において、ＡＭＫ、ＣＰＦＸおよびＩＰＭの写真の数字は、各抗菌薬の最終濃度（μｇ／ｍＬ）を示す。図４に示すように、各抗菌薬のいずれの濃度においても、コントロール３ｈｒのような増殖は見られないことから、いずれの抗菌薬にも感受性を示すことが確認できた。
　インキュベート後の緑膿菌＃５株（ＭＤＲＰ）の顕微鏡写真を図５に示す。図５において、ＡＭＫ、ＣＰＦＸおよびＩＰＭの写真の数字は、各抗菌薬の最終濃度（μｇ／ｍＬ）を示す。図５に示すように、各抗菌薬のいずれの濃度においても、コントロール０ｈｒよりも増殖していることから、いずれの抗菌薬にも耐性を示すことが確認できた。
［実施例２］
（１）マイクロデバイス
　図２に示すマイクロデバイスを、前記実施例１と同様にして作製した。マイクロデバイスの上基板は、ＰＤＭＳ製、下基板は、ガラス製とした。マイクロデバイス２の大きさは、以下の通りとした。
全体長さ（Ｙ方向）：４０ｍｍ
全体幅（Ｘ方向）：３０ｍｍ
全体厚み（Ｚ方向）：２ｍｍ
上基板６０の凹部の深さ：１７μｍ
導入口の直径：０．７５ｍｍ
導入部の直径：３ｍｍ
導入流路の長さ：３０～４０ｍｍ
第１導入流路：１～２ｍｍ
第２導入流路：２８～３９ｍｍ
導入流路の幅：０．３～０．５ｍｍ
観察エリアの長さ：８ｍｍ
観察エリアの幅：０．５ｍｍ
排出流路の長さ：２～４ｍｍ
排出流路の幅：０．５ｍｍ
排気部の直径：１．５ｍｍ
　つぎに、アミカシンＡｍｉｋａｃｉｎ（商品名ＡＭＫ、Ｓｉｇｍａ）、シプロフロキサシンＣｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ（商品名ＣＰＦＸ、東京化成工業株式会社）およびイミペネムＩｍｉｐｅｎｅｍ／シラスタチンｃｉｌａｓｔａｔｉｎ（商品名ＩＰＭ、萬有製薬株式会社）を、それぞれ２～４ｍｇ／ｍＬの濃度となるようにＰＢＳに溶解し、さらに、１００％エタノールで希釈し、所定濃度の抗菌薬液を調製した（ＡＭＫ　１６０μｇ／ｍＬ、ＣＰＦＸ　２０μｇ／ｍＬ、ＩＰＭ　８０μｇ／ｍＬ）。そして、マイクロデバイス２の各導入口に、前記各抗菌薬液０．２５μＬを注入した後、マイクロデバイス２を室温で約１５分乾燥させた。
（２）判定
　前記実施例１と同様にして調製した被検菌液約１０μＬを、共通の導入口に注入した以外は、前記実施例１と同様にして、インキュベートおよび判定を行った。
　インキュベート後の緑膿菌Ｓ１株（感受性株）の顕微鏡写真を図７に示す。図７に示すように、マイクロデバイス２を用いた方法によると、緑膿菌Ｓ１は、抗菌薬未添加（コントロール）の流路では、インキュベート時間に従って増殖が確認されたが、抗菌薬を添加した場合、いずれの流路においても増殖は確認されなかった。
　インキュベート後の緑膿菌＃５株（ＭＤＲＰ）の顕微鏡写真を図８に示す。図８に示すように、マイクロデバイス２を用いた方法によると、緑膿菌＃５株は、抗菌薬を添加した場合も、抗菌薬未添加（コントロール）と同様に、インキュベート時間に従って増殖が確認された。
［実施例３］
　６５種類の緑膿菌株について、前記実施例２と同様にして、ＡＭＫ、ＣＰＦＸおよびＩＰＭで処理を行い、多剤耐性（３剤耐性）、２剤耐性、１剤耐性および感受性（３剤感受性）の分類を行った。また、同じ６５種類の緑膿菌株について、前記実施例１に記載した標準法により、同様に耐性および感受性の分類を行った。これらの結果を、図６に示す。図６は、６５種類の緑膿菌株のうち、耐性および感受性の株数を示すグラフである。図６に示すように、本実施例のマイクロデバイス法により、標準法と同様の分類結果が得られた。この結果から、本発明のマイクロデバイス法によれば、長時間を要する標準法と比較して格段に短い時間（３時間）で、耐性および感受性の判断を行えることがわかった。
　以上のように、本発明によれば、前記マイクロデバイスの流路内で、抗菌薬と被検菌液との混合液をインキュベートし、前記流路における観察エリアを、例えば、顕微鏡で観察することによって、細菌または真菌の抗菌薬に対する感受性を、簡便かつ迅速に確認できる。また、本発明の検査システムによれば、前記本発明の検査方法を簡便に行うことができる。このため、本発明は、臨床検査、環境試験等において、極めて有用である。特に、臨床検査においては、例えば、対象となる細菌および真菌について、適切な抗菌薬の選択が早期に可能となるため、救命率の向上、不要な薬剤使用量の減少等の効果が期待でき、長期的に見れば、耐性菌の増加を抑制できる可能性がある。
１、２、３　　　マイクロデバイス
１０、６０、９０　上基板
２０、７０、１００　下基板
１１’、２１’、３１’、４１’、５１’、６１’、９１’　導入口
１１、２１、３１、４１、５１、６１、９１　　　　導入部
１２、２２、３２、４２、５２、６２、９２　　　　導入流路
１３、２３、３３、４３、５３、６３、９３　　　　観察エリア
１４、２４、３４、４４、５４、６４、９４　　　　排出流路
１５、２５、３５、４５、５５、６５、９５　　　　排気部
１５’、２５’、３５’、４５’、５５’、６５’、９５’　　空気口
７　　　測定部
７００　顕微鏡
７０１　ＣＣＤカメラ
７０２　配置部
７０３　温度制御部
７１　　マイクロデバイス
８　　　画像処理部
８０　　ＣＰＵ
８１　　記憶部
８２　　出力部

Claims (9)

  1. 流路を有するマイクロデバイスを使用し、
    前記マイクロデバイスの前記流路内で、抗菌薬と被検菌液との混合液をインキュベートする工程、および、
    前記マイクロデバイスの前記流路の観察エリアにおける、前記被検菌液由来の細菌または真菌を検出する検出工程を含むことを特徴とする、細菌または真菌の抗菌薬感受性の検査方法。
  2. 前記検出工程において、前記被検菌液由来の細菌または真菌について、前記観察エリアにおける、数および形態の少なくとも一方を観察する、請求項１記載の検査方法。
  3. 前記検出工程において、顕微鏡により、前記被検菌液由来の細菌または真菌を検出する、請求項１または２記載の検査方法。
  4. 前記インキュベート工程において、前記マイクロデバイスの前記流路に、前記抗菌薬と前記被検菌液との混合液を導入する、請求項１から３のいずれか一項に記載の検査方法。
  5. 前記マイクロデバイスの前記流路に、予め、前記抗菌薬を配置し、
    前記インキュベート工程において、前記マイクロデバイスの前記流路に、前記被検菌液を導入する、請求項１から３のいずれか一項に記載の検査方法。
  6. 前記インキュベート工程の前後に、前記検出工程を行う、請求項１から５のいずれか一項に記載の検査方法。
  7. 前記マイクロデバイスが、２以上の流路を有するデバイスであり、
    前記検出工程において、各流路の観察エリアにおける前記被検菌液由来の細菌または真菌を検出する、請求項１から６のいずれか一項に記載の検査方法。
  8. 前記マイクロデバイスにおいて、前記２以上の流路の観察エリアが、並列に配置されている、請求項７記載の検査方法。
  9. 請求項１から８のいずれか一項に記載の検査方法により細菌または真菌の抗菌薬感受性を検査するための検査システムであって、
    被検菌液と抗菌薬との混合液が導入された流路を有するマイクロデバイスをインキュベートするインキュベート手段、
    前記マイクロデバイスの前記流路の観察エリアの画像を取得する画像取得手段、
    前記画像における細菌または真菌の数および形態の少なくとも一方の情報を取得する情報取得手段、および、
    前記情報に基づいて、前記被検菌液由来の細菌または真菌の抗菌薬感受性を決定する決定手段を有することを特徴とする、検査システム。
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