WO2012114978A1 - 変異体および該変異体の培養方法 - Google Patents

変異体および該変異体の培養方法 Download PDF

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WO2012114978A1
WO2012114978A1 PCT/JP2012/053706 JP2012053706W WO2012114978A1 WO 2012114978 A1 WO2012114978 A1 WO 2012114978A1 JP 2012053706 W JP2012053706 W JP 2012053706W WO 2012114978 A1 WO2012114978 A1 WO 2012114978A1
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WO
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gene
gsf2
pombe
mutant
pvg1
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PCT/JP2012/053706
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English (en)
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薫 竹川
太志 原
英毅 東田
博道 熊谷
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旭硝子株式会社
国立大学法人九州大学
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C07K14/39—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor

Definitions

  • the present invention relates to a Schizosaccharomyces pombe mutant having non-sexual aggregation even under acidic conditions, and a method for culturing the Schizosaccharomyces pombe mutant.
  • yeast having non-sexual aggregating property can easily separate the agglomerated yeast cells and the culture solution from the culture solution after completion of the culture. It is preferable to use a yeast having an aggregative property as a host.
  • a FLO mutant strain is known in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces cerevisiae).
  • Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae
  • a mutant strain having non-sexual aggregation properties has also been reported in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe (hereinafter also referred to as S. pombe) (Patent Document 1).
  • S. Pombe is a phylogenetically very different yeast from budding yeast, and has similar properties to animal cells with complex properties such as cell growth mechanism, chromosome structure, RNA splicing mechanism, and addition of galactose residues to glycoprotein sugar chains. There are benefits to you. Therefore, it has been attracting attention in recent years as a good host for the expression system.
  • the pH of the culture solution may shift to acidic.
  • the pH of the culture solution at the end of the culture often becomes 2 to 4 acidic.
  • the pH is neutral after the end of the culture in order to aggregate the yeast. It is necessary to carry out neutralization treatment to adjust the vicinity.
  • Patent Document 1 The yeast described in Patent Document 1 is S. cerevisiae having non-sexual aggregation. It is a pombe mutant and is considered suitable as a host for the expression system. However, the S.P. Although the pombe mutant has been confirmed to aggregate non-sexually in YPD medium (usually pH 5.6 to 6.0), whether or not it has sufficient aggregability even under acidic conditions, It is unknown.
  • YPD medium usually pH 5.6 to 6.0
  • An object is to provide a method for culturing pombe mutants.
  • the Pombe mutant is characterized in that Gsf activity is increased and the enzyme activity of pyruvate transferase Pvg1 is reduced or inactivated.
  • the expression level of the gsf2 gene is preferably increased.
  • an exogenous gsf2 gene is preferably incorporated, and the exogenous gsf2 gene is preferably the gsf2 gene originally possessed by Schizosaccharomyces pombe.
  • the foreign gsf2 gene is preferably integrated into the host chromosome by a genetic engineering method.
  • S. of the present invention S. of the present invention.
  • the Pombe mutant is preferably deficient in the gene encoding pyruvate transferase Pvg1, or introduced with a mutation that reduces or deactivates the enzyme activity of Pvg1.
  • S. of the present invention S. of the present invention.
  • the pombe mutant is non-sexually dependent on one or more cations selected from the group consisting of calcium ions, lithium ions, manganese ions, copper ions, and zinc ions at a pH of 2.0 to 4.0. It preferably has an aggregating property.
  • S. of the present invention is preferably deficient in the gene encoding pyruvate transferase Pvg1, or introduced with a mutation that reduces or deactivates the enzyme activity of Pvg1.
  • S. of the present invention S. of the present invention.
  • Pombe mutant has the property of aggregating non-sexually in a calcium ion-containing lactic acid buffer (80 mM lactic acid, 100 mM calcium chloride, pH 2.0), and when the concentration of dry cells is 3.6 g / L.
  • the sedimentation rate in the calcium ion-containing lactic acid buffer is preferably 2.0 m / h or more.
  • the sedimentation speed is preferably 6.0 m / h or more.
  • the method for producing a mutant having a non-aggregating property uses a Schizosaccharomyces pombe as a host, incorporates an exogenous gsf2 gene by a genetic engineering method, and uses pyruvic acid. It is characterized in that a gene encoding the transferase Pvg1 is deleted or a mutation that reduces or inactivates the enzyme activity of Pvg1 is introduced into the gene.
  • the method for culturing the Schizo Saccharomyces pombe mutant of the present invention is the S. cerevisiae of the present invention.
  • the pombe mutant is cultured at a pH of 5 or less.
  • the pombe mutant has sufficient asexual aggregation even under acidic conditions of pH 2-4. For this reason, the S.P. Even when the pH of the culture solution at the end of the culture is 5 or less by the culture method of the present invention using the pombe mutant, neutralization with an alkali is not required, and aggregation between yeasts is utilized. The yeast cells and the culture solution can be easily separated.
  • Example 1 it is a photograph figure which shows the presence or absence of aggregation of the variant under each pH condition.
  • non-sexual cohesiveness means “S. The property which has a cohesiveness different from the property (sexual cohesiveness) which Pombe originally has sexual aggregation is said. However, this does not mean that the inherent sexual aggregation is lost.
  • Constutive aggregation refers to the same property as nonsexual aggregation, but particularly refers to the property of aggregating simultaneously (non-sexually) during growth.
  • Gsf activity means S. cerevisiae. It means non-sexual cohesiveness exhibited at the pH at which pombe is normally cultured (eg, pH 5-6).
  • a gene associated with Gsf activity is referred to as an agglutinin gene.
  • the gsf2 gene is S. cerevisiae. In Pombe, it is an agglutinin gene.
  • S. The official name of the pombe gsf2 gene is SPCC1742.01.
  • Pvg1 is pyruvate transferase.
  • the official name of the pvg1 gene encoding Pombe Pvg1 is SPAC8F11.10c.
  • Pombe mutants are S. cerevisiae. As a result of modification of at least a part of the pombe gene, the mutant has increased Gsf activity and reduced or inactivated enzyme activity of pyruvate transferase Pvg1. S. In Pombe, when Gsf activity increases and Pvg1 enzyme activity decreases or inactivates, a trait that aggregates non-sexually at pH 2-4 is obtained. Hereinafter, “the property of aggregating non-sexually at pH 2 to 4” is also referred to as acid resistance non-aggregation. That is, S. of the present invention.
  • the pombe mutant is a mutant that has acquired acid-resistant non-sexual aggregation.
  • S. Pombe has sexual aggregation induced by pheromone. For example, sexual aggregation tends to occur when nutritional deficiencies occur during the growth process. However, in artificial large-scale culture such as tank culture, sexual aggregation is less likely to occur than when culture is usually performed in a culture solution having a sufficient amount of nutrients. On the other hand, S. of the present invention. Since the pombe mutant has non-sexual aggregability, even if it is cultured in a culture medium having a sufficient amount of nutrients, it will aggregate (constitutive aggregation) with growth.
  • the Pombe Gsf activity is increased, for example, by increasing the expression level of the gsf2 gene.
  • the enzyme activity of Pvg1 in Pombe can be reduced or inactivated by deleting the pvg1 gene encoding Pvg1 or by introducing a mutation that reduces or inactivates the enzyme activity of Pvg1 into the gene. For this reason, the S.P.
  • the pombe mutant strain is a non-acid-resistant non-agglutinating strain such as a wild-type strain by genetic engineering.
  • the expression level of the gsf2 gene can be increased by incorporating a foreign gsf2 gene by a genetic engineering method.
  • the expression level of the gsf2 gene can be increased by overexpressing the mbx2 gene.
  • the Mbx2 gene also known as pvg4 gene
  • pvg4 gene is considered to be a transcriptional activator that controls the transcription of other genes, and the expression of the gsf2 gene is thought to be controlled by this transcriptional activator. It is preferable to introduce a new gsf2 gene into the host, and the introduced gsf2 gene may be the same as the endogenous gsf2 gene of the host or a gsf2 gene derived from a different organism.
  • the gsf2 gene to be incorporated is also referred to as a foreign gsf2 gene in the present invention.
  • a method for introducing the gsf2 gene into a host by a genetic engineering method a known method can be used.
  • S. Examples of methods for introducing a foreign structural gene into pombe as a host include, for example, JP-A-5-15380, WO95 / 09914, JP-A-10-234375, and JP-A-2000-262284.
  • the methods described in JP-A-2005-198612, WO 2010/087344 and the like can be used.
  • the gsf2 gene is S. It is preferably introduced into the pombe chromosome. By introducing the gsf2 gene into the chromosome, a transformant having excellent passage stability can be obtained. A plurality of gsf2 genes can also be introduced into the chromosome. By introducing a plurality of gsf2 genes, the expression efficiency of the gsf2 gene can be increased. S. of the present invention. In the pombe mutant, the number of gsf2 genes integrated in the chromosome is preferably 1 to 20, and more preferably 1 to 8.
  • a method for introducing the gsf2 gene into the chromosome a known method can be used.
  • a plurality of gsf2 genes can be introduced into the chromosome by the method described in JP-A-2000-262284.
  • one gsf2 gene can be introduced into the chromosome by this method.
  • one or a plurality of gsf2 genes can be introduced into a plurality of locations on the chromosome.
  • the gsf2 gene was transformed into S. cerevisiae.
  • a method for introduction into the pombe chromosome a method of introduction by homologous recombination using a vector having an expression cassette having the gsf2 gene and a recombination site is preferred.
  • the vector has an expression cassette with the gsf2 gene and a recombination site.
  • the expression cassette is a combination of DNAs necessary for expressing Gsf2, and includes the gsf2 gene and S. cerevisiae.
  • a promoter that functions in Pombe Includes a terminator that functions within the pombe. Further, any one or more of 5′-untranslated region and 3′-untranslated region may be included.
  • the auxotrophic complementary marker may be included.
  • a preferred expression cassette is an expression cassette comprising a gsf2 gene, a promoter, a terminator, a 5′-untranslated region, a 3′-untranslated region, and an auxotrophic complementary marker.
  • a plurality of gsf2 genes may be present in the expression cassette. The number of gsf2 genes in the expression cassette is preferably 1-8, more preferably 1-5.
  • the promoter and terminator that function in the pombe may be any promoter and terminator that can function in the mutant obtained by transformation and maintain the expression of Gsf2 even under acidic conditions of pH 2-4.
  • Examples of promoters that function in pombe include S. cerevisiae. Pombe's inherent promoter (preferably having high transcription initiation activity) or S.
  • a promoter eg, a virus-derived promoter
  • Two or more promoters may be present in the vector.
  • promoters inherent in Pombe include alcohol dehydrogenase gene promoter, nmt1 gene promoter involved in thiamine metabolism, fructose-1, 6-bisphosphatase gene promoter involved in glucose metabolism, and invertase gene involved in catabolite repression. Examples include promoters (see International Publication No. 99/23223) and heat shock protein gene promoters (see International Publication No. 2007/26617). S. Examples of promoters that are not inherently possessed by pombe include promoters derived from animal cell viruses described in JP-A-5-15380, JP-A-7-163373, and JP-A-10-234375. Among these promoters, the nmt1 gene promoter with good expression efficiency and its modified promoters (eg, nmt1 + , nmt41), hCMV promoter, and SV40 promoter are preferable.
  • a terminator that Pombe does not have can be used.
  • Two or more terminators may be present in the vector. Examples of the terminator include human terminators described in JP-A-5-15380, JP-A-7-163373, and JP-A-10-234375, and human lipocortin I terminator is preferable. .
  • the recombination site of the vector is This is a site having a base sequence that allows homologous recombination to be performed on a target site for homologous recombination in the pombe chromosome.
  • the target site is S. pneumoniae. This is a target site for integrating the expression cassette in the pombe chromosome.
  • the target site can be freely set by setting the recombination site of the vector to a base sequence that allows homologous recombination to be performed on the target site.
  • the homology between the base sequence of the recombination site and the base sequence of the target site needs to be 70% or more.
  • the homology between the base sequence of the recombination site and the base sequence of the target site is preferably 90% or more, and more preferably 95% or more from the viewpoint that homologous recombination is likely to occur.
  • the expression cassette is incorporated into the target site by homologous recombination.
  • the length (number of bases) of the recombination site is preferably 20 to 2000 bp. If the length of the recombination site is 20 bp or more, homologous recombination is likely to occur.
  • the length of the recombination site is 2000 bp or less, it is easy to prevent the vector from becoming too long and causing homologous recombination to hardly occur.
  • the length of the recombination site is more preferably 100 bp or more, and further preferably 200 bp or more. Further, the length of the recombination site is more preferably 800 bp or less, and further preferably 400 bp or less.
  • the vector may have other DNA regions in addition to the expression cassette and the recombination site.
  • a replication initiation region called “ori” necessary for replication in E. coli, an antibiotic resistance gene (neomycin resistance gene, etc.) and the like can be mentioned. These are genes usually required when constructing a vector using Escherichia coli.
  • the replication initiation region is preferably removed when the vector is integrated into the host chromosome as described later.
  • the vector is a vector having a circular DNA structure or a linear DNA structure. When introducing into a pombe cell, it is preferable to introduce it in a linear DNA structure. That is, in the case of a vector having a circular DNA structure such as a commonly used plasmid DNA, S.
  • the position for opening the vector having a circular DNA structure is within the recombination site.
  • the recombination sites partially exist at both ends of the opened vector, and the entire vector is integrated into the target site of the chromosome by homologous recombination.
  • the vector may be constructed by a method other than the method of cutting a vector having a circular DNA structure, as long as it can have a linear DNA structure in which a part of the recombination site exists at each end.
  • the vector for example, plasmids derived from E. coli such as pBR322, pBR325, pUC118, pUC119, pUC18, and pUC19 can be preferably used.
  • the plasmid vector used for homologous recombination preferably has a replication initiation region called “ori” that is necessary for replication in E. coli.
  • ori replication initiation region
  • the method for constructing the vector from which the replication initiation region has been removed is not particularly limited, but the method described in JP-A-2000-262284 is preferably used.
  • a method is preferred in which a precursor vector in which a replication initiation region is inserted at the cleavage site in the recombination site is constructed so that the replication initiation region is excised at the same time as the linear DNA structure as described above. Thereby, a vector from which the replication initiation region has been easily removed can be obtained.
  • expression vectors described in JP-A-5-15380, JP-A-7-163373, WO96 / 23890, JP-A-10-234375, and the like are applied to express them.
  • a method may be used in which a precursor vector having a cassette and a recombination site is constructed, and a vector used for homologous recombination is obtained by further removing the replication initiation region from the precursor vector by an ordinary genetic engineering technique.
  • the target site to incorporate the vector is S. It may be present only at one location in the pombe chromosome, or may be present at two or more locations. When two or more target sites exist, S.P. Two or more vectors can be integrated into the pombe chromosome. When a plurality of gsf2 genes in the expression or set are used, a plurality of gsf2 genes can be incorporated into one target site. Furthermore, an expression cassette can be incorporated into two or more target sites using two or more vectors having recombination sites corresponding to the respective target sites. In this manner, S. A plurality of gsf2 genes can be incorporated into the pombe chromosome, thereby increasing the expression level of lactate dehydrogenase and improving the lactate productivity.
  • the target site described in the method described in JP-A No. 2000-262284 can be used.
  • Two or more types of vectors having different integration sites can be used to integrate the vectors at different target sites.
  • this method is complicated when the vector is integrated into two or more locations of the chromosome.
  • Base sequences that are substantially identical to each other means that the homology of the base sequences is 90% or more.
  • the homology between the target sites is preferably 95% or more.
  • the length of the base sequences that are substantially identical to each other is a length that includes the recombination site of the vector, and is preferably 1000 bp or more.
  • the gsf2 gene is distributed and integrated into multiple target sites.
  • the gsf2 gene is less likely to be dropped from the chromosome at a time, and the maintenance stability in the passage of the transformant is improved.
  • a transposon gene Tf2 is preferable as a target site present in a plurality of locations in a chromosome.
  • Tf2 is the S.T.
  • a vector can be incorporated into only one location of Tf2 present in 13 locations on a chromosome.
  • a transformant having two or more gsf2 genes can be obtained by incorporating a vector having two or more gsf2 genes.
  • the transformant which has a 2 or more gsf2 gene can be obtained by integrating a vector in two or more places of Tf2.
  • a transformant having more gsf2 genes can be obtained by incorporating a vector having two or more gsf2 genes. If the vector is incorporated at all 13 positions of Tf2, the burden on the survival and growth of the transformant may be too great.
  • the vector is preferably incorporated at 8 or less of 13 Tf2, and more preferably the vector is incorporated at 5 or less.
  • the S. cerevisiae of the present invention is obtained by a genetic engineering method.
  • S. cerevisiae used as a host when producing a pombe mutant. It is preferable to use a pombe having a marker for selecting a transformant.
  • a pombe having a marker for selecting a transformant.
  • auxotrophic complementary marker By incorporating this missing gene (auxotrophic complementary marker) into the vector, the transformant loses the auxotrophy of the host. Due to the difference in auxotrophy between the host and the transformant, the transformant can be obtained by distinguishing both.
  • an orotidine phosphate decarboxylase gene ura4 gene
  • ura4 gene has been deleted or inactivated and has become uracil-requiring.
  • a transformant incorporating the vector can be obtained by selecting those that have lost uracil requirement.
  • the gene that becomes auxotrophic due to deletion in the host is not limited to the ura4 gene as long as it is used for selection of transformants, and may be an isopropylmalate dehydrogenase gene (leu1 gene) or the like.
  • the obtained transformant is selected.
  • the selection method include the following methods. Screening is performed with a medium capable of selecting transformants using the auxotrophic marker, and a plurality of colonies obtained are selected. Next, after separately culturing them in liquid, the expression level of the gsf2 gene per cell is examined, and a mutant with a higher expression level is selected.
  • the number of vectors integrated in the chromosome and the number of expression cassettes can be examined by performing genome analysis by pulse field gel electrophoresis on the selected mutants. The number of vectors integrated into the chromosome can be adjusted to some extent by adjusting the integration conditions and the like, but it is considered that the integration efficiency and the number of integrations also change depending on the size (number of bases) and structure of the vector.
  • S. cerevisiae which is the host, can be obtained by deleting the pvg1 gene by a genetic engineering method or introducing a mutation that reduces or inactivates the enzyme activity of Pvg1 into the pvg1 gene.
  • the enzyme activity of Pombe Pvg1 can be reduced or inactivated. Since the enzyme activity of Pvg1 can be surely inactivated, it is preferable to delete the pvg1 gene itself from the chromosome.
  • Deletion or inactivation of the pvg1 gene can be performed by a known method.
  • the pvg1 gene can be deleted by using the Latour method (described in Nucleic Acids Res, 2006, 34, e11, International Publication No. 2007/063919).
  • the pvg1 gene can be inactivated by causing deletion, insertion, substitution, or addition to a part of the base sequence of the pvg1 gene. Mutation due to deletion, insertion, substitution, or addition of the gene may cause only one of them or two or more.
  • a known method can be used as a method for introducing the mutation into a part of the pvg1 gene. For example, mutation isolation method using a mutation agent (Yeast Molecular Genetics Experimental Method, 1996, Society Press Center), random mutation method using PCR (PC Methods Appl.), 1992 , Volume 2, p.28-33.).
  • Pombe mutants are, for example, normal S. cerevisiae that does not have non-sexual aggregation. It can also be obtained from Pombe by artificial mutation means. That is, S. cerevisiae having no non-sexual cohesiveness.
  • the pombe was mutated and treated with S. cerevisiae. From Pombe, a bacterium having an increased Gsf activity as compared to the wild strain and having a decreased or inactivated Pvg1 enzyme activity is selected from the selected bacterium, and an increased Gsf activity, a decreased Pvg1 enzyme activity, or the like Can be produced by selecting those having a dominant mutation.
  • the mutagenesis treatment for pombe may use a mutagen such as EMS (ethyl methanesulfonate) or may irradiate light with a short wavelength such as ultraviolet rays.
  • EMS ethyl methanesulfonate
  • the selection of bacteria having acid resistance and non-aggregation properties from pombe may be performed in the presence of a cation such as calcium ion.
  • the Pombe Gsf activity can be evaluated using the sedimentation rate as an index. For this reason, mutation-treated S.
  • pombe is cultured on a solid medium and the formed colonies are put into an appropriate solvent, if they settle significantly faster than the wild-type colonies (the sedimentation rate is faster), the colonies are formed.
  • Bacteria can be evaluated as having increased Gsf activity as compared to the wild type. Wild colonies and mutated bacterial colonies may be poured into the solvent almost simultaneously, and the speed of sedimentation may be compared, and the results obtained by measuring the sedimentation speed of wild strains under specific conditions in advance And the sedimentation rate of the mutated fungal colony may be compared.
  • the solvent used for the colony sedimentation test is not particularly limited as long as it is a solution in which yeast can survive, but is selected from the group consisting of calcium ions, lithium ions, manganese ions, copper ions, and zinc ions.
  • a buffer containing cations of more than one species is preferable. For example, when the concentration of dry cells is 3.6 g / L, bacteria having a sedimentation rate of 1.0 m / h or more in a calcium ion-containing lactic acid buffer (80 mM lactic acid, 100 mM calcium chloride, pH 6.0) , And can be selected as a mutant strain with increased Gsf activity.
  • an acid-resistant non-aggregated strain can be obtained by the following operation. First, S.M. After mutagenesis with EMS on pombe, they are isolated and cultured. Thereafter, the supernatant collected by removing the supernatant was suspended in a lactic acid-sodium hydroxide buffer solution (80 mM lactic acid, 100 mM calcium chloride, pH 2.0) so that the concentration of the dried cells was 3.6 g / L. The turbidity is measured and the sedimentation rate is measured, and a strain having a sedimentation rate exceeding 2.0 m / h is selected as an acid-resistant non-sexual agglutinating strain.
  • S.M After mutagenesis with EMS on pombe, they are isolated and cultured. Thereafter, the supernatant collected by removing the supernatant was suspended in a lactic acid-sodium hydroxide buffer solution (80 mM lactic acid, 100 mM calcium chloride, pH 2.0) so that the concentration of the dried cells was
  • Mutants with increased Gsf activity can also be selected using the expression level of the gsf2 gene as an index.
  • the expression level of the gsf2 gene is S. cerevisiae.
  • the expression level of the pombe gsf2 gene can be measured by a measurement method usually used for gene expression analysis such as RT-PCR or Northern blotting using a labeled probe.
  • the enzyme activity of Pvg1 in pombe can be evaluated using the abundance of cell surface pyruvic acid as an index. That is, S. From Pombe, bacteria lacking cell surface pyruvate can be selected as a mutant in which the enzyme activity of Pvg1 is reduced or inactivated.
  • the deletion mutant of the cell surface pyruvate can be prepared with reference to the method of Andreishcheva et al. (The Journal of Biological Chemistry 2004, Aug 20: 279 (34): 35644-55). First, mutations are induced on the pombe using EMS and then cultured in an appropriate liquid medium for 48 hours. Thereafter, the adsorbed cells are removed from the culture using Q-sepharose having a positive charge, and the cells remaining in the supernatant are recovered. After repeating the selection with Q-Sepharose several times, the obtained culture supernatant is applied to a plate and isolated and cultured to obtain a deletion mutant of cell surface pyruvic acid.
  • a mutant in which the enzyme activity of Pvg1 is reduced or inactivated can also be selected by measuring the enzyme activity of Pvg1 of each mutated bacterium.
  • the enzyme activity of Pombe Pvg1 can be measured by a measurement method usually used for measuring the enzyme activity of other transferases, such as a measurement method using a labeled substrate.
  • the pombe mutant may be produced by a combination of a genetic engineering method and a mutation treatment.
  • a mutation treatment for a mutant strain in which the expression level of the gsf2 gene is increased by the mutation treatment, the enzyme activity of Pvg1 may be reduced or inactivated by a genetic engineering method.
  • the expression level of the gsf2 gene may be increased by a genetic engineering method.
  • Mutants in which the Pvg1 enzyme activity has been reduced or inactivated by genetic engineering may be mutated to select mutants having an increased expression level of the gsf2 gene.
  • the Pombe mutant may have mutations in other genes as long as it can maintain acid resistance and non-aggregation, and a foreign structural gene may be introduced into or outside the chromosome. .
  • the acid-resistant non-sexual agglutination property of the pombe mutant is not affected by the type of acid in the culture solution. That is, whether the acid that brings the pH of the culture solution to 2 to 4 is an organic acid such as lactic acid, citric acid, acetic acid, succinic acid, fumaric acid, malic acid, or a mineral acid such as hydrochloric acid and sulfuric acid, S. of the present invention. Pombe mutants aggregate non-sexually.
  • the strength of nonsexual agglutination provided by the pombe mutant can be determined, for example, by the sedimentation rate.
  • the yeast sedimentation rate can be determined by suspending the yeast cells dispensed in a transparent container such as a test tube after the suspension treatment and starting sedimentation, and then starting the sedimentation from the liquid surface to the solid-liquid interface (the sedimented yeast cells). Is obtained by dividing the distance to the interface with the supernatant by the elapsed time from the start of sedimentation.
  • the unit m / h of sedimentation speed in this specification means the distance expressed in meters per hour.
  • the pombe mutant has the property of aggregating non-sexually in a calcium ion-containing lactic acid buffer (80 mM lactic acid, 100 mM calcium chloride, pH 2.0). S. of the present invention.
  • the sedimentation rate of the Pombe mutant in the calcium ion-containing lactic acid buffer is preferably 2.0 m / h or more, preferably 4.0 m / h or more, when the concentration of dry cells is 3.6 g / L. More preferably, it is 6.0 m / h or more.
  • the pombe mutant has a non-aggregating property in a calcium ion-containing lactic acid buffer (80 mM lactic acid, 100 mM calcium chloride, pH 4.0).
  • the sedimentation rate of the Pombe mutant in the calcium ion-containing lactic acid buffer is preferably 2.0 m / h or more, preferably 4.0 m / h or more, when the concentration of dry cells is 3.6 g / L. More preferably, it is more preferably 8.0 m / h or more. When the sedimentation rate at pH 4.0 is 8.0 m / h or more, sufficient cohesion is exhibited even at a pH lower than pH 4.
  • the acid-resistant non-sexual aggregability provided in the pombe mutant may depend on one or more cations selected from the group consisting of calcium ions, lithium ions, manganese ions, copper ions, and zinc ions.
  • a chelating agent such as EDTA is added to the culture solution, thereby allowing the S. cerevisiae of the present invention. It can inhibit aggregation of Pombe mutants.
  • the acid-resistant non-sexual agglutination property of the pombe mutant may be a property that is inhibited by galactose.
  • S. of the present invention is added by adding galactose to the final concentration of 5 mM or more in the culture solution. It can inhibit aggregation of Pombe mutants.
  • S. of the present invention Pombe mutants show strong asexual aggregation under acidic (eg pH 2-4) conditions. For this reason, the S.P.
  • the pombe mutant is particularly suitable as an expression system host for synthesizing acidic proteins, organic acids and the like.
  • S. of the present invention Introduction of an exogenous structural gene into a pombe mutant can be performed in the same manner as the introduction of the gsf2 gene.
  • S. of the present invention When a transformant for mass production of acidic proteins, organic acids and the like is prepared using a pombe mutant as a host, and the transformant is cultured in tank culture or the like, the pH of the culture solution is 2 to 4 at the end of the culture. Even in such a case, the bacterial cells can be aggregated without performing solid-liquid separation treatment such as centrifugation and filtration, or a neutralization reaction, whereby the bacterial cells and the culture solution can be easily separated.
  • the pombe mutant may be able to aggregate non-sexually not only under acidic conditions but also under weakly acidic to alkaline (eg, pH 5 to 10) conditions.
  • the pombe mutant and its transformant can be cultured by a known yeast culture method, for example, shake culture, stirring culture or the like. Further, the culture may be batch culture or continuous culture. The culture temperature is preferably 23 to 37 ° C. The culture time can be determined as appropriate.
  • a medium usually used for culturing yeast such as MA medium, EMM medium, MM medium, YES medium, YPD medium, SD medium, or a modified medium thereof can be used.
  • Example 1 ⁇ Preparation of gsf2 + strain (gsf2 gene expression increased strain)> According to the method of Bahler et al. (Yeast magazine, 1998, Vol. 14, pp. 943-951). A gene fragment containing the nmt41 promoter was introduced into Pombe's uracil auxotrophic strain (ARC010, genotype: h - leu1-32 ura4-D18, provided by Professor Yuichi Iino, University of Tokyo graduate School of Science) Transformed. The mutant obtained after the transformation was cultured, and genome analysis by pulse field gel electrophoresis was performed to confirm that the gsf2 gene was integrated. Information on the nmt41 promoter can be obtained from the National BioResource Project website (address: http://yeast.lab.nig.ac.jp/nig/index.html).
  • a gene fragment containing the nmt41 promoter was prepared as follows. First, the gene fragment was amplified by PCR using as a template a sequence containing a gsf2 promoter sequence and Ura4 sequence at the 5'-end side of the nmt41 promoter and a gsf2-ORF at the 3'-end side.
  • ⁇ Preparation of ⁇ pvg1gsf2 + strain (pvg1 gene deletion + gsf2 gene expression augmented strain)>
  • the gsf2 + strain was transformed according to the Latour method (Nucleic Acids Res., 2006, 34, e11, described in International Publication No. 2007/063919) to prepare a ⁇ pvg1gsf2 + strain in which the pvg1 gene was deleted.
  • the obtained mutant was cultured, and genome analysis by pulse field gel electrophoresis was performed to confirm that the pvg1 gene was deleted.
  • ⁇ Culture test> Each obtained mutant was inoculated into a leucine-containing MA liquid medium and cultured for 20 hours under the conditions of a temperature of 30 ° C. and a shaking speed of 100 rpm.
  • the cultured cells were washed with EDTA (10 mM) and further washed with sterilized water.
  • the washed cells were dispensed in equal amounts into 20 wells of a 96 well plate.
  • citrate buffer 100 mM at pH 2.0 to 6.0
  • MOPS buffer 100 mM at pH 6.5 to 8.0
  • citrate buffer containing EDTA at pH 5.0 or 6.0
  • 100 mM EDTA 100 mM EDTA
  • pH 8.5-12.5 glycine buffer 100 mM
  • Example 2 ⁇ Measurement of sedimentation velocity> Gsf2 + strain obtained in Example 1 and Derutapvg1gsf2 + strain, S. Pombe ARC032 strain (wild strain) and S. Pombe ARC028 strain (a non-aggregating mutant) in pH 2.0, 4.0, 6.0, and 9.5 buffer, water, galactose solution, acetic acid solution, and L-lactic acid solution The sedimentation rate in each was measured.
  • pH 2.0 lactic acid-sodium hydroxide buffer 80 mM lactic acid, 100 mM calcium chloride
  • pH 4.0 lactic acid-sodium hydroxide buffer 80 mM lactic acid, 100 mM calcium chloride
  • pH 6.0 Citric acid-sodium hydroxide buffer (80 mM citric acid, 100 mM calcium chloride), pH 9.5 glycine-sodium hydroxide buffer (80 mM glycine, 100 mM calcium chloride), aqueous calcium chloride solution (100 mM calcium chloride), galactose solution ( 100 mM galactose, 100 mM calcium chloride), acetic acid solution (800 mM acetic acid, 100 mM calcium chloride) and L-lactic acid solution (1 M L-lactic acid, 100 mM calcium chloride) were used.
  • the ARC032 and ARC028 strains were cultured in a YES solid medium for 72 hours, then the colonies were inoculated into 5 mL of YES liquid medium and precultured for 24 hours, and the resulting preculture was inoculated into 100 mL of YES liquid medium. Then, what was cultured for 24 hours was used for measuring the sedimentation rate.
  • the gsf2 + strain and ⁇ pvg1gsf2 + strain were cultured in a leucine-containing MA solid medium for 72 hours, colonies were inoculated into 5 mL of EMM liquid medium and pre-cultured for 24 hours, and the resulting preculture was used as 100 mL of EMM liquid.
  • Table 2 shows relative values of sedimentation rates at pH 2.0, 4.0, and 9.5 with respect to the sedimentation rate at pH 6.0.
  • the ARC028 strain had a sedimentation rate of 8 m / h or more at pH 9.5 and 6.0 and showed very strong aggregation, but at pH 2.0, it was about 1 m / h and the aggregation was small. In the lactic acid solution, it was only 0.07 m / h and hardly aggregated.
  • all of the gsf2 + strains were about 2.5 m / h at pH 4.0 to 9.5, indicating weak aggregation.
  • the relative sedimentation rate relative to the sedimentation rate at pH 6.0 was 70% or more at pH 2 to 9.5, and the influence of pH was not observed so much. However, in pH 2.0 and acetate buffer, it was less than 0.5 and hardly aggregated. On the other hand, ⁇ pvg1gsf2 + strains were all 6.0 m / h or more at pH 2.0 to 9.5, and showed sufficient aggregation under acidic conditions. Further, it was 4.5 m / h or more in the acetic acid solution and the L-lactic acid solution, and had sufficient cohesiveness.

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Abstract

　ｐＨ２～４の酸性条件下でも充分な凝集性を有するＳ．ポンベ変異体、および該Ｓ．ポンベ変異体の培養方法の提供を目的とする。　Ｇｓｆ活性が増大しており、かつピルビン酸転移酵素Ｐｖｇ１の酵素活性が低下または失活していることを特徴とするシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）変異体、シゾサッカロミセス・ポンベを宿主とし、遺伝子工学的方法により、外来のｇｓｆ２遺伝子を組み込み、かつピルビン酸転移酵素Ｐｖｇ１をコードする遺伝子を欠失する、若しくは該遺伝子にＰｖｇ１の酵素活性が低下若しくは失活する変異を導入することを特徴とする非性的に凝集する性質を有する変異体の製造方法、並びに前記シゾサッカロミセス・ポンベ変異体の培養方法。

Description

変異体および該変異体の培養方法
　本発明は、酸性条件下でも非性的凝集性を有するシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）変異体、および該シゾサッカロミセス・ポンベ変異体の培養方法に関する。
　酵母を宿主とした発現系を利用して、タンパク質および有機酸等の有用成分を製造する技術が開発されている。該発現系において酵母によって製造された有用成分を精製するためには、一般的に、遠心分離法等の固液分離処理によって酵母と培養液を分離する工程を要する。非性的凝集性（非性的に凝集する性質）を有する酵母は、培養終了後の培養液から凝集した酵母菌体と培養液とを容易に分離できるため、前記発現系においては、非性的凝集性を有する酵母を宿主とすることが好ましい。
　非性的凝集性を有する酵母としては、出芽酵母サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）においてＦＬＯ変異株が知られている。また、分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベ（以下、Ｓ．ポンベともいう）でも、非性的凝集性を有する変異株も報告されている（特許文献１）。
　Ｓ．ポンベは、出芽酵母とは系統進化的にきわめて異なる酵母であり、細胞増殖機構、染色体構造、ＲＮＡスプライシング機構、糖蛋白質糖鎖へのガラクトース残基の付加等の諸性質が複雑で動物細胞と類似している利点がある。そのため、前記発現系の良き宿主として近年注目されてきている。
特開２０００－１０６８６７号公報
　酵母の培養中に、培養液のｐＨが酸性にシフトしてしまうことがある。特に、前記発現系において、有機酸または分泌性の酸性蛋白質を大量に合成させた場合には、培養終了時の培養液のｐＨが２～４の酸性となる場合が多い。このため、たとえばｐＨ５以上の比較的ｐＨの高い培養液中では凝集性を有するが、ｐＨ２～４の酸性条件下では凝集しない場合には、酵母を凝集させるために、培養終了後にｐＨを中性付近に調整する中和処理を行わなくてはならない。
　特許文献１に記載の酵母は、非性的凝集性を有するＳ．ポンベ変異株であり、前記発現系の宿主として好適と考えられる。しかし、該Ｓ．ポンベ変異株は、ＹＰＤ培地（通常、ｐＨ５．６～６．０）中で非性的に凝集することが確認されているものの、酸性条件下でも充分な凝集性を有しているか否か、不明である。
　そこで本発明では、ｐＨ２～４の酸性条件下でも充分な凝集性を有するＳ．ポンベ変異体、および該Ｓ．ポンベ変異体の培養方法の提供を目的とする。
　本発明のＳ．ポンベ変異体は、Ｇｓｆ活性が増大しており、かつピルビン酸転移酵素Ｐｖｇ１の酵素活性が低下または失活していることを特徴とする。
　本発明のＳ．ポンベ変異体においては、ｇｓｆ２遺伝子の発現量が増大していることが好ましい。また、外来のｇｓｆ２遺伝子が組み込まれていることが好ましく、前記外来のｇｓｆ２遺伝子は、シゾサッカロミセス・ポンベが本来有するｇｓｆ２遺伝子であることが好ましい。また、外来のｇｓｆ２遺伝子は、遺伝子工学的方法により宿主の染色体に組み込まれていることが好ましい。
　また、本発明のＳ．ポンベ変異体は、ピルビン酸転移酵素Ｐｖｇ１をコードする遺伝子が欠損している、または該遺伝子にＰｖｇ１の酵素活性が低下または失活する変異が導入されていることが好ましい。
　また、本発明のＳ．ポンベ変異体は、ｐＨ２．０～４．０において、カルシウムイオン、リチウムイオン、マンガンイオン、銅イオン、および亜鉛イオンからなる群より選択される１種以上の陽イオンに依存して非性的に凝集する性質を有することが好ましい。 
　さらに、本発明のＳ．ポンベ変異体は、カルシウムイオン含有乳酸緩衝液（８０ｍＭ　乳酸、１００ｍＭ　塩化カルシウム、ｐＨ２．０）中で非性的に凝集する性質を有し、乾燥菌体の濃度が３．６ｇ／Ｌの場合に、該カルシウムイオン含有乳酸緩衝液中における沈降速度が２．０ｍ／ｈ以上であることが好ましい。前記沈降速度は、６．０ｍ／ｈ以上であることが好ましい。
　また、本発明の非性的に凝集する性質を有する変異体の製造方法は、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）を宿主とし、遺伝子工学的方法により、外来のｇｓｆ２遺伝子を組み込み、かつピルビン酸転移酵素Ｐｖｇ１をコードする遺伝子を欠失する、若しくは該遺伝子にＰｖｇ１の酵素活性が低下若しくは失活する変異を導入することを特徴とする。
　さらに、本発明のシゾサッカロミセス・ポンベ変異体の培養方法は、本発明のＳ．ポンベ変異体を、ｐＨ５以下で培養することを特徴とする。
　本発明のＳ．ポンベ変異体は、ｐＨ２～４の酸性条件下でも充分な非性的凝集性を有している。このため、該Ｓ．ポンベ変異体を用いた本発明の培養方法により、培養終了時の培養液のｐＨが５以下になる場合であっても、アルカリによる中和を必要とせずに、酵母同士の凝集を利用して容易に酵母菌体と培養液とを分離できる。
例１において、各ｐＨ条件下の変異体の凝集の有無を示す写真図である。
　本発明において、「非性的凝集性」とは、Ｓ．ポンベが本来有する性的に凝集する性質（性的凝集性）とは異なる凝集性を有する性質をいう。しかし、本来有する性的凝集性が失われていることを意味するものではない。また、「構成的凝集性」とは非性的凝集性と同一の性質をいうが、特に増殖過程において増殖と同時に（非性的に）凝集する性質を指していう。
　本発明において、「Ｇｓｆ活性」とは、Ｓ．ポンベが通常培養されるｐＨ（例えば、ｐＨ５～６）において示される非性的凝集性を意味する。また、Ｇｓｆ活性に関連する遺伝子を凝集素遺伝子という。
　ｇｓｆ２遺伝子は、Ｓ．ポンベにおいては凝集素遺伝子である。Ｓ．ポンベのｇｓｆ２遺伝子の正式名称はＳＰＣＣ１７４２．０１である。
　Ｐｖｇ１は、ピルビン酸転移酵素である。Ｓ．ポンベのＰｖｇ１をコードするｐｖｇ１遺伝子の正式名称はＳＰＡＣ８Ｆ１１．１０ｃである。
　なお、Ｓ．ポンベの染色体の全塩基配列は、サンガー研究所のデータベース「ＧｅｎｅＤＢ」に「Schizosaccharomyces pombe Gene DB（http://www.genedb.org/genedb/pombe/）」として、収録され、公開されている。本明細書記載のＳ．ポンベの遺伝子の配列データは上記データベースから遺伝子名または系統名で検索して、入手できる。
　本発明のＳ．ポンベ変異体は、Ｓ．ポンベの遺伝子の少なくとも一部が改変された結果、Ｇｓｆ活性が増大しており、かつピルビン酸転移酵素Ｐｖｇ１の酵素活性が低下または失活している変異体である。Ｓ．ポンベにおいて、Ｇｓｆ活性が増大し、かつＰｖｇ１の酵素活性が低下または失活すると、ｐＨ２～４において非性的に凝集する形質が獲得される。以下、「ｐＨ２～４において非性的に凝集する性質」を、耐酸性非性的凝集性ともいう。すなわち、本発明のＳ．ポンベ変異体は、耐酸性非性的凝集性を獲得した変異体である。
　Ｓ．ポンベは本来フェロモンで誘導される性的凝集性を有する。たとえば、増殖過程において栄養不足をきたすと性的凝集を生じやすい。しかし、タンク培養等による人工的大量培養においては通常充分な量の栄養を有する培養液中で培養が行われることより性的凝集を起こすことは少ない。一方、本発明のＳ．ポンベ変異株は非性的凝集性を有すため、充分な量の栄養を有する培養液中で培養が行われても、増殖とともに凝集（構成的凝集）を起こす。
　Ｓ．ポンベのＧｓｆ活性は、例えば、ｇｓｆ２遺伝子の発現量を増大させることにより、増大させられる。また、Ｓ．ポンベのＰｖｇ１の酵素活性は、Ｐｖｇ１をコードするｐｖｇ１遺伝子を欠失する、若しくは該遺伝子にＰｖｇ１の酵素活性が低下若しくは失活する変異を導入することにより、低下または失活させられる。このため、本発明のＳ．ポンベ変異株は、遺伝子工学的方法により、野生株等の耐酸性非性的凝集性を有さないＳ．ポンベを宿主とし、遺伝子工学的方法により、外来のｇｓｆ２遺伝子を組み込み、かつＰｖｇ１をコードする遺伝子を欠失する、若しくは該遺伝子にＰｖｇ１の酵素活性が低下若しくは失活する変異を導入することで製造できる。
　ｇｓｆ２遺伝子の発現量は、遺伝子工学的方法で外来のｇｓｆ２遺伝子を組み込むことにより、増大させられる。また、ｍｂｘ２遺伝子を過剰発現させることよりｇｓｆ２遺伝子の発現量を増大させることもできる。Ｍｂｘ２遺伝子（ｐｖｇ４遺伝子の別名）は他の遺伝子の転写を制御する転写活性化因子と考えられ、ｇｓｆ２遺伝子はこの転写活性化因子によりその発現が制御さていると考えられる。
　宿主にｇｓｆ２遺伝子を新たに導入することが好ましく、導入されるｇｓｆ２遺伝子は、宿主の内在性のｇｓｆ２遺伝子と同種であってもよく、異種生物由来のｇｓｆ２遺伝子であってもよい。なお、宿主に内在するｇｓｆ２遺伝子と同一のｇｓｆ２遺伝子を遺伝子工学的方法で宿主に組み込む場合、組み込む当該ｇｓｆ２遺伝子も本発明においては外来のｇｓｆ２遺伝子という。
　遺伝子工学的方法で宿主にｇｓｆ２遺伝子を導入する方法としては公知の方法を使用できる。Ｓ．ポンベを宿主としてこれに外来の構造遺伝子を導入する方法としては、たとえば、特開平５－１５３８０号公報、国際公開第９５／０９９１４号、特開平１０－２３４３７５号公報、特開２０００－２６２２８４号公報、特開２００５－１９８６１２号公報、国際公開第２０１０／０８７３４４号等に記載の方法を使用できる。
　ｇｓｆ２遺伝子はＳ．ポンベの染色体に導入することが好ましい。染色体にｇｓｆ２遺伝子を導入することにより継代の維持安定性に優れた形質転換体が得られる。また、ｇｓｆ２遺伝子は染色体に複数導入することもできる。ｇｓｆ２遺伝子を複数導入することにより、ｇｓｆ２遺伝子の発現効率を高めることができる。本発明のＳ．ポンベ変異体において、染色体に組み込まれたｇｓｆ２遺伝子の数は１～２０が好ましく、特に１～８が好ましい。
　染色体にｇｓｆ２遺伝子を導入する方法としては公知の方法を使用できる。たとえば、前記特開２０００－２６２２８４号公報に記載の方法で染色体にｇｓｆ２遺伝子を複数導入できる。また、この方法で染色体にｇｓｆ２遺伝子を１個導入することもできる。また、後述のように、染色体の複数の箇所に１個または複数のｇｓｆ２遺伝子を導入することもできる。
　ｇｓｆ２遺伝子をＳ．ポンベの染色体に導入する方法としては、ｇｓｆ２遺伝子を有する発現カセットと組換え部位とを有するベクターを用い、相同組換え法により導入する方法が好ましい。
　ベクターは、ｇｓｆ２遺伝子を有する発現カセットと組換え部位を有する。
　発現カセットとは、Ｇｓｆ２を発現するために必要なＤＮＡの組み合わせであり、ｇｓｆ２遺伝子とＳ．ポンベ内で機能するプロモーターとＳ．ポンベ内で機能するターミネーターを含む。さらに、５’－非翻訳領域、３’－非翻訳領域のいずれか１つ以上が含まれていてもよい。さらに、前記栄養要求性相補マーカーが含まれていてもよい。好ましい発現カセットは、ｇｓｆ２遺伝子、プロモーター、ターミネーター、５’－非翻訳領域、３’－非翻訳領域、栄養要求性相補マーカーを含む発現カセットである。発現カセットには複数のｇｓｆ２遺伝子が存在していてもよい。発現カセット中のｇｓｆ２遺伝子の数は１～８が好ましく、１～５がより好ましい。
　Ｓ．ポンベ内で機能するプロモーターとターミネーターは、ｐＨ２～４の酸性条件下においても形質転換により得られる変異体内で機能してＧｓｆ２の発現を維持できるものであればよい。Ｓ．ポンベ内で機能するプロモーターとしては、Ｓ．ポンベが本来有するプロモーター（転写開始活性が高いものが好ましい）またはＳ．ポンベが本来有しないプロモーター（ウイルス由来のプロモーター等）を使用できる。プロモーターはベクター内に２種以上存在していてもよい。
　Ｓ．ポンベが本来有するプロモーターとしては、たとえば、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター、チアミンの代謝に関与するｎｍｔ１遺伝子プロモーター、グルコースの代謝に関与するフルクトース－１、６－ビスホスファターゼ遺伝子プロモーター、カタボライト抑制に関与するインベルターゼ遺伝子のプロモーター（国際公開第９９／２３２２３号参照）、熱ショック蛋白質遺伝子プロモーター（国際公開第２００７／２６６１７号参照）等が挙げられる。Ｓ．ポンベが本来有しないプロモーターとしては、たとえば、特開平５－１５３８０号公報、特開平７－１６３３７３号公報、特開平１０－２３４３７５号公報に記載されている動物細胞ウイルス由来のプロモーター等が挙げられる。該プロモーターのうち、発現効率が良好なｎｍｔ１遺伝子プロモーターおよびその改変プロモーター（たとえば、ｎｍｔ１＋、ｎｍｔ４１）、ｈＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーターが好ましい。
　Ｓ．ポンベ内で機能するターミネーターとしては、Ｓ．ポンベが本来有するターミネーターまたはＳ．ポンベが本来有しないターミネーターを使用できる。ターミネーターはベクター内に２種以上存在していてもよい。
　ターミネーターとしては、たとえば、特開平５－１５３８０号公報、特開平７－１６３３７３号公報、特開平１０－２３４３７５号公報に記載されているヒト由来のターミネーターが挙げられ、ヒトリポコルチンＩのターミネーターが好ましい。
　ベクターの組換え部位は、Ｓ．ポンベの染色体における相同組換えの標的部位に対して相同組換えを行わせることのできる塩基配列を有する部位である。また、標的部位は、Ｓ．ポンベの染色体内で発現カセットを組み込む標的となる部位である。標的部位は、ベクターの組換え部位を該標的部位に対して相同組換えを行わせる塩基配列とすることにより自由に設定できる。
　前記組換え部位の塩基配列と標的部位の塩基配列との相同性は７０％以上とすることが必要である。また、組換え部位の塩基配列と標的部位の塩基配列との相同性は、相同組換えが起きやすくなる点から、９０％以上とすることが好ましく、９５％以上であることがより好ましい。このような組換え部位を有するベクターを用いることにより、発現カセットが相同組換えにより標的部位に組み込まれる。
　組換え部位の長さ（塩基数）は、２０～２０００ｂｐであることが好ましい。組換え部位の長さが２０ｂｐ以上であれば、相同組換えが起きやすくなる。また、組換え部位の長さが２０００ｂｐ以下であれば、ベクターが長くなりすぎて相同組換えが起き難くなることを防ぎやすい。組換え部位の長さは１００ｂｐ以上であることがより好ましく、２００ｂｐ以上であることがさらに好ましい。また、組換え部位の長さは８００ｂｐ以下であることがより好ましく、４００ｂｐ以下であることがさらに好ましい。
　ベクターは、前記発現カセットと組換え部位以外に他のＤＮＡ領域を有していてもよい。たとえば、大腸菌内での複製のために必要な「ｏｒｉ」と呼ばれる複製開始領域、抗生物質耐性遺伝子（ネオマイシン耐性遺伝子等）等が挙げられる。これらは大腸菌を使用してベクターを構築する場合に通常必要とされる遺伝子である。ただし、上記複製開始領域は後述のようにベクターを宿主の染色体に組み込む際には除去されることが好ましい。
　ベクターは、環状ＤＮＡ構造または線状ＤＮＡ構造を有するベクターであり、Ｓ．ポンベの細胞に導入する際には線状ＤＮＡ構造で導入することが好ましい。すなわち、通常用いられるプラスミドＤＮＡ等の環状ＤＮＡ構造を有するベクターである場合には、制限酵素でベクターを線状に切り開いた後にＳ．ポンベの細胞に導入することが好ましい。
　この場合、環状ＤＮＡ構造を有するベクターを切り開く位置は、組換え部位内とする。これにより、切り開かれたベクターの両端にそれぞれ組換え部位が部分的に存在することとなり、相同組換えによりベクター全体が染色体の標的部位に組み込まれる。
　ベクターは、両端それぞれに組換え部位の一部が存在するような線状ＤＮＡ構造とすることができれば、環状ＤＮＡ構造を有するベクターを切り開く方法以外の方法で構築してもよい。
　ベクターとしては、たとえば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等の大腸菌由来のプラスミドを好適に用いることができる。
　この場合、相同組換えに用いる際のプラスミドベクターは、大腸菌内での複製のために必要な「ｏｒｉ」と呼ばれる複製開始領域が除去されていることが好ましい。これにより、上述したベクターを染色体に組み込む際に、その組み込み効率を向上させることができる。
　複製開始領域が除去されたベクターの構築方法は特に限定されないが、特開２０００－２６２２８４号公報に記載されている方法を用いることが好ましい。すなわち、組換え部位内の切断箇所に複製開始領域が挿入された前駆体ベクターを構築しておき、前述のように線状ＤＮＡ構造とすると同時に複製開始領域が切り出されるようにする方法が好ましい。これにより、簡便に複製開始領域が除去されたベクターを得ることができる。
　また、特開平５－１５３８０号公報、特開平７－１６３３７３号公報、国際公開第９６／２３８９０号、特開平１０－２３４３７５号公報等に記載された発現ベクターおよびその構築方法を適用して、発現カセットおよび組換え部位を有する前駆体ベクターを構築し、さらに通常の遺伝子工学的手法で該前駆体ベクターから複製開始領域を除去して相同組換えに用いるベクターを得る方法であってもよい。
　ベクターを組み込む標的部位は、Ｓ．ポンベの染色体中の１箇所のみに存在していてもよく、２箇所以上に存在していてもよい。標的部位が２箇所以上存在している場合、Ｓ．ポンベの染色体に組み込まれるベクターを２箇所以上にできる。また、発現かセット中のｇｓｆ２遺伝子を複数とした場合には、標的部位の１箇所に複数のｇｓｆ２遺伝子を組み込むことができる。さらに、２種以上の標的部位に、それぞれの標的部位に対応する組換え部位を有する２種以上のベクターを用いて、発現カセットを組み込むこともできる。該方法で、Ｓ．ポンベの染色体に複数のｇｓｆ２遺伝子を組み込むことができ、これにより乳酸脱水素酵素の発現量を増大させ、乳酸の生産性を向上させることができる。
　１箇所の標的部位に発現カセットを組み込む場合、たとえば特開２０００－２６２２８４号公報に記載の方法記載の標的部位を使用できる。異なる組込み部位を有する２種以上のベクターを用いて、異なる標的部位にそれぞれベクターを組み込むことができる。しかし、染色体の２箇所以上にベクターを組み込む場合、この方法は煩雑である。
　染色体中に複数箇所存在する互いに実質的に同一の塩基配列部分を標的部位として、この複数箇所の標的部位にそれぞれベクターを組み込むことができれば、１種類のベクターを使用して染色体の２箇所以上にベクターを組み込むことができる。互いに実質的に同一の塩基配列とは、塩基配列の相同性が９０％以上であることを意味する。標的部位同士の相同性は９５％以上であることが好ましい。また、互いに実質的に同一である塩基配列の長さは、前記ベクターの組換え部位を包含する長さであり、１０００ｂｐ以上であることが好ましい。１箇所の標的部位に複数のｇｓｆ２遺伝子が組み込まれている場合に比較して、ｇｓｆ２遺伝子の組み込み数が同一であっても、複数存在する標的部位にｇｓｆ２遺伝子が分散して組み込まれている場合には、形質転換体が増殖する際にｇｓｆ２遺伝子が染色体から１度に脱落することが少なくなり、形質転換体の継代における維持安定性が向上する。
　染色体中に複数箇所存在する標的部位としては、トランスポゾン遺伝子Ｔｆ２が好ましい。Ｔｆ２は、Ｓ．ポンベの３本（一倍体）の染色体それぞれに合計１３箇所存在するトランスポゾン遺伝子であり、長さ（塩基数）は約４９００ｂｐであり、それらの遺伝子間における塩基配列相同性は９９．７％であることが知られている（下記文献参照）。
　Nathan J. Bowen et al, “Retrotransposons and Their Recognition of pol II Promoters: A Comprehensive Survey of the Transposable Elements From the Complete Genome Sequence of Schizosaccharomyces pombe”, Genome Res. 2003 13: 1984-1997
　染色体に１３箇所存在するＴｆ２の１箇所のみにベクターを組み込むことができる。この場合、２個以上のｇｓｆ２遺伝子を有するベクターを組み込むことにより、２個以上のｇｓｆ２遺伝子を有する形質転換体を得ることができる。また、Ｔｆ２の２箇所以上にベクターを組み込むことにより、２個以上のｇｓｆ２遺伝子を有する形質転換体を得ることができる。この場合、２個以上のｇｓｆ２遺伝子を有するベクターを組み込むことにより、さらに多くのｇｓｆ２遺伝子を有する形質転換体を得ることができる。Ｔｆ２の１３箇所すべてにベクターが組み込まれると、形質転換体の生存や増殖に対する負荷が大きくなりすぎるおそれがある。１３箇所のＴｆ２の８箇所以下にベクターが組み込まれることが好ましく、５箇所以下にベクターが組み込まれることがより好ましい。
　遺伝子工学的方法により本発明のＳ．ポンベ変異株を製造する場合に宿主として使用するＳ．ポンベには、形質転換体を選択するためのマーカーを有するものを用いることが好ましい。たとえば、ある遺伝子が欠落していることにより特定の栄養成分が生育に必須である宿主を使用することが好ましい。ベクターにこの欠落している遺伝子（栄養要求性相補マーカー）を組み込んでおくことにより、形質転換体は宿主の栄養要求性が消失する。この宿主と形質転換体の栄養要求性の相違により、両者を区別して形質転換体を得ることができる。
　たとえば、オロチジンリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｕｒａ４遺伝子）が欠失または失活してウラシル要求性となっているＳ．ポンベを宿主とし、ｕｒａ４遺伝子（栄養要求性相補マーカー）を有するベクターにより形質転換した後、ウラシル要求性が消失したものを選択することにより、ベクターが組み込まれた形質転換体を得ることができる。宿主において欠落により栄養要求性となる遺伝子は、形質転換体の選択に用いられるものであればｕｒａ４遺伝子には限定されず、イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｌｅｕ１遺伝子）等であってもよい。
　通常、相同組換えを行った後、得られた形質転換体を選択する。選択する方法としては、たとえば、以下に示す方法が挙げられる。前記栄養要求性マーカーにより形質転換体を選択できる培地によりスクリーニングし、得られたコロニーから複数を選択する。次に、それらを別々に液体培養した後、それぞれの菌体当たりのｇｓｆ２遺伝子の発現量を調べ、該発現量がより多い変異体を選択する。また、それら選択した変異体に対してパルスフィールドゲル電気泳動法によるゲノム解析を行うことにより、染色体に組み込まれたベクターの数および発現カセットの数を調べることができる。
　染色体に組み込まれるベクターの数は組み込み条件等を調整することによりある程度は調整できるが、ベクターの大きさ（塩基数）および構造により、組み込み効率および組み込み数も変化すると考えられる。
　遺伝子工学的方法でｐｖｇ１遺伝子を欠損させる、またはｐｖｇ１遺伝子にＰｖｇ１の酵素活性が低下または失活する変異を導入することにより、宿主であるＳ．ポンベのＰｖｇ１の酵素活性を低下または失活できる。確実にＰｖｇ１の酵素活性を失活できるため、ｐｖｇ１遺伝子自身を染色体から欠損させることが好ましい。
　ｐｖｇ１遺伝子の欠失または失活は、公知の方法で行うことができる。たとえば、Ｌａｔｏｕｒ法（Ｎｕｃｒｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ誌、２００６年、３４巻、ｅ１１頁、国際公開第２００７／０６３９１９号等に記載）を用いることによりｐｖｇ１遺伝子を欠失させることができる。
　また、ｐｖｇ１遺伝子の塩基配列の一部に欠失、挿入、置換、付加を起こすことにより、該ｐｖｇ１遺伝子を失活させることもできる。該遺伝子の欠失、挿入、置換、付加による変異は、それらのいずれか１つのみを起こしてもよく、２つ以上を起こしてもよい。
　ｐｖｇ１遺伝子の一部に前記変異を導入する方法は、公知の方法を用いることができる。たとえば、変異剤を用いた突然変異分離法（酵母分子遺伝学実験法、１９９６年、学会出版センター）、ＰＣＲを利用したランダム変異法（ピーシーアール・メソッズ・アプリケーション（ＰＣＲ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ａｐｐｌ．）、１９９２年、第２巻、ｐ．２８－３３．）等が挙げられる。
　本発明のＳ．ポンベ変異株は、たとえば非性的凝集性を有しない通常のＳ．ポンベから人工的突然変異手段によっても取得できる。すなわち、非性的凝集性を有しないＳ．ポンベを突然変異処理し、処理されたＳ．ポンベから、野生株よりもＧｓｆ活性が増大しており、かつＰｖｇ１の酵素活性が低下または失活している菌を選択し、さらに選択された菌からＧｓｆ活性増大やＰｖｇ１の酵素活性の低下等が優性変異であるものを選択することにより作製できる。
　Ｓ．ポンベに対する突然変異処理は、ＥＭＳ（メタンスルホン酸エチル）等の突然変異誘発物質を用いてもよく、紫外線等の短波長の光を照射してもよい。また、突然変異処理後のＳ．ポンベからの耐酸性非性的凝集性を有する菌の選抜は、カルシウムイオン等の陽イオンの存在下で行ってもよい。
　Ｓ．ポンベのＧｓｆ活性は、沈降速度を指標として評価することができる。このため、突然変異処理されたＳ．ポンベを固体培地上で培養し、形成されたコロニーを適当な溶媒中に投入した場合に、野生株のコロニーよりも有意に早く沈降した（沈降速度が速い）場合には、該コロニーを形成する菌は、野生株よりもＧｓｆ活性が増大していると評価できる。野生株のコロニーと突然変異処理された菌のコロニーをほぼ同時に溶媒へ投入し、沈降の速さを比較してもよく、特定の条件における野生株の沈降速度を予め測定し、得られた結果から決定された閾値と、突然変異処理された菌のコロニーの沈降速度とを比較してもよい。コロニーの沈降試験に用いる溶媒は、酵母が生存可能な溶液であれば特に限定されるものではないが、カルシウムイオン、リチウムイオン、マンガンイオン、銅イオン、および亜鉛イオンからなる群より選択される１種以上の陽イオンを含むバッファーであることが好ましい。例えば、乾燥菌体の濃度が３．６ｇ／Ｌの場合に、カルシウムイオン含有乳酸緩衝液（８０ｍＭ　乳酸、１００ｍＭ　塩化カルシウム、ｐＨ６．０）中における沈降速度が１．０ｍ／ｈ以上である菌を、Ｇｓｆ活性が増大した変異株として選抜できる。
　たとえば、以下の操作により耐酸性非性的凝集株を得る事が出来る。まず、Ｓ．ポンベに対してＥＭＳを用いて突然変異を誘発した後、それらを単離し培養する。その後、上清を除去して回収された菌体を、乳酸－水酸化ナトリウム緩衝液（８０ｍＭ　乳酸、１００ｍＭ　塩化カルシウム、ｐＨ２．０）に乾燥菌体の濃度が３．６ｇ／Ｌとなるよう懸濁させ、沈降速度を測り、沈降速度が２．０ｍ／ｈを超える菌株を、耐酸性非性的凝集株として選択する。
　Ｇｓｆ活性が増大した変異体は、ｇｓｆ２遺伝子の発現量を指標として選抜することもできる。ｇｓｆ２遺伝子の発現量は、Ｓ．ポンベのｇｓｆ２遺伝子の発現量は、ＲＴ－ＰＣＲ、標識済みプローブを用いたノザンブロッティング等の遺伝子発現解析に通常用いられる測定方法により測定できる。
　Ｐｖｇ１の酵素活性が低下または失活すると、細胞表層のピルビン酸の存在量が有意に低下する傾向がある。このため、Ｓ．ポンベのＰｖｇ１の酵素活性は、細胞表層ピルビン酸の存在量を指標として評価できる。すなわち、突然変異処理されたＳ．ポンベから、細胞表層ピルビン酸が欠失している菌を、Ｐｖｇ１の酵素活性が低下または失活している変異体として選抜できる。
　細胞表層ピルビン酸の欠失変異体は、Andreishchevaらの方法（The Journal of biological chemistry　2004 Aug 20;279(34):35644-55）を参考にして作製できる。まず、ポンベに対してＥＭＳを用いて突然変異を誘発した後、それらを適切な液体培地で４８時間培養する。その後、培養物から陽電荷を帯びたＱ－セファロースを用いて吸着する菌体を取り除き、上清に残った菌体を回収する。該Ｑ－セファロースによる選別を何度か繰返した後、得られた培養液上清をプレートに塗布し、単離培養する事で、細胞表層ピルビン酸の欠失変異体が得られる。
　Ｐｖｇ１の酵素活性が低下または失活している変異体は、突然変異処理された各菌のＰｖｇ１の酵素活性を測定することによっても選抜できる。Ｓ．ポンベのＰｖｇ１の酵素活性は、標識した基質を用いた測定方法等、他の転移酵素の酵素活性の測定に通常用いられる測定方法により測定できる。
　本発明のＳ．ポンベ変異株は、遺伝子工学的方法と突然変異処理とを組み合わせて製造してもよい。例えば、突然変異処理によりｇｓｆ２遺伝子の発現量が増大した変異株に対して、遺伝子工学的方法によりＰｖｇ１の酵素活性を低下または失活させてもよく、突然変異処理によりＰｖｇ１の酵素活性が低下または失活した変異株に対して、遺伝子工学的方法によりｇｓｆ２遺伝子の発現量を増大させてもよい。遺伝子工学的方法によりＰｖｇ１の酵素活性を低下または失活させた変異体に対して突然変異処理を行い、ｇｓｆ２遺伝子の発現量が増大した変異株を選抜してもよい。
　本発明のＳ．ポンベ変異株は、耐酸性非性的凝集性を維持し得る限り、その他の遺伝子に変異を有していてもよく、さらに、染色体中または染色体外に外来の構造遺伝子が導入されていてもよい。
　本発明のＳ．ポンベ変異株が備える耐酸性非性的凝集性は、培養液中の酸の種類には影響されない。すなわち、培養液のｐＨを２～４にたらしめている酸が乳酸、クエン酸、酢酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸等の有機酸であろうと、塩酸および硫酸等の鉱酸であろうと、本発明のＳ．ポンベ変異株は非性的に凝集する。
　本発明のＳ．ポンベ変異株が備える非性的凝集性の強さは、たとえば、沈降速度を指標にできる。酵母の沈降速度は、たとえば、試験管等の透明な容器に分注した酵母菌体を懸濁処理後に静置して沈降を開始させた後、液表面から固液界面（沈降した酵母菌体と上清との界面）までの距離を沈降開始からの経過時間で除することにより、求められる。本明細書における沈降速度の単位ｍ／ｈは、１時間あたりのメートルで表わした距離をいう。
　本発明のＳ．ポンベ変異株は、カルシウムイオン含有乳酸緩衝液（８０ｍＭ　乳酸、１００ｍＭ　塩化カルシウム、ｐＨ２．０）中で非性的に凝集する性質を有する。本発明のＳ．ポンベ変異株の該カルシウムイオン含有乳酸緩衝液中における沈降速度は、乾燥菌体の濃度が３．６ｇ／Ｌの場合に、２．０ｍ／ｈ以上であることが好ましく、４．０ｍ／ｈ以上であることがより好ましく、６．０ｍ／ｈ以上であることがさらに好ましい。
　また、本発明のＳ．ポンベ変異株は、カルシウムイオン含有乳酸緩衝液（８０ｍＭ　乳酸、１００ｍＭ　塩化カルシウム、ｐＨ４．０）中で非性的に凝集する性質を有する。本発明のＳ．ポンベ変異株の該カルシウムイオン含有乳酸緩衝液中における沈降速度は、乾燥菌体の濃度が３．６ｇ／Ｌの場合に、２．０ｍ／ｈ以上であることが好ましく、４．０ｍ／ｈ以上であることがより好ましく、８．０ｍ／ｈ以上であることがさらに好ましい。ｐＨ４．０における沈降速度が８．０ｍ／ｈ以上であることにより、ｐＨ４よりもさらに低いｐＨにおいても、充分な凝集性が示される。
　本発明のＳ．ポンベ変異株が備える耐酸性非性的凝集性は、カルシウムイオン、リチウムイオン、マンガンイオン、銅イオン、および亜鉛イオンからなる群より選択される１種以上の陽イオンに依存していてもよい。耐酸性非性的凝集性がカルシウムイオン等に依存する場合には、ＥＤＴＡ等のキレート剤を培養液に添加することにより、本発明のＳ．ポンベ変異株の凝集を阻害できる。
　本発明のＳ．ポンベ変異株が備える耐酸性非性的凝集性は、ガラクトースにより阻害される性質であってもよい。耐酸性非性的凝集性がガラクトースにより阻害される場合には、培養液中に最終濃度が５ｍＭ以上となるようにガラクトースを添加することにより、本発明のＳ．ポンベ変異株の凝集を阻害できる。
　本発明のＳ．ポンベ変異株は、酸性（たとえば、ｐＨ２～４）条件下で強力な非性的凝集性を示す。このため、本発明のＳ．ポンベ変異株は、特に、酸性蛋白質および有機酸等を合成するための発現系の宿主として好適である。本発明のＳ．ポンベ変異株への外来の構造遺伝子の導入は、ｇｓｆ２遺伝子の導入と同様にして行える。
　本発明のＳ．ポンベ変異株を宿主として酸性蛋白質および有機酸等を大量製造するための形質転換体を作製し、該形質転換体をタンク培養等で培養した場合に、培養終了時に培養液のｐＨが２～４となった場合でも、遠心分離、濾過等の固液分離処理や中和反応等を行うことなく、菌体を凝集させることができ、それにより菌体と培養液を容易に分離できる。なお、本発明のＳ．ポンベ変異株は、酸性条件下のみならず、弱酸性～アルカリ性（たとえば、ｐＨ５～１０）条件下でも非性的に凝集可能であってもよい。
　本発明のＳ．ポンベ変異株およびその形質転換体は、公知の酵母培養方法によって培養でき、たとえば振とう培養、攪拌培養等により行うことができる。また、培養は、回分培養であってもよく、連続培養であってもよい。培養温度は、２３～３７℃であることが好ましい。培養時間は適宜決定できる。培養培地は、ＭＡ培地、ＥＭＭ培地、ＭＭ培地、ＹＥＳ培地、ＹＰＤ培地、ＳＤ培地等の酵母の培養に通常用いられる培地またはそれらの改変培地を使用できる。
　以下、実施例および比較例を示して本発明を詳細に説明する。ただし、本発明は以下の記載によっては限定されない。
［例１］　
＜ｇｓｆ２＋株（ｇｓｆ２遺伝子発現増大株）の作製＞
　Ｂａｈｌｅｒらの方法（Ｙｅａｓｔ誌、１９９８年、１４巻、９４３－９５１頁）に従い、Ｓ．ポンベのウラシル要求性株（ＡＲＣ０１０、遺伝子型：ｈ－　ｌｅｕ１－３２　ｕｒａ４－Ｄ１８、東京大学大学院理学系研究科附属遺伝子実験施設・飯野雄一教授より供与）にｎｍｔ４１プロモーターを含む遺伝子断片を導入し、形質転換した。形質転換後に得られた変異体を培養し、パルスフィールドゲル電気泳動法によるゲノム解析を行い、ｇｓｆ２遺伝子が組み込まれたことを確認した。ｎｍｔ４１プロモーターの情報はナショナルバイオリソースプロジェクトのホームページ（アドレス：http://yeast.lab.nig.ac. jp/nig/index.html）より入手できる。
　ｎｍｔ４１プロモーターを含む遺伝子断片は、以下の様に作製した。まず、ｎｍｔ４１プロモーターの５’－末端側にｇｓｆ２プロモーター配列とＵｒａ４配列とを含み、３’－末端側にｇｓｆ２－ＯＲＦを含む配列を鋳型とし、上記遺伝子断片をＰＣＲによって増幅した。
＜Δｐｖｇ１ｇｓｆ２＋株（ｐｖｇ１遺伝子欠損＋ｇｓｆ２遺伝子発現増大株）の作製＞
　ｇｓｆ２＋株をＬａｔｏｕｒ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．誌、２００６年、３４巻、ｅ１１頁、国際公開第２００７／０６３９１９号に記載）に従って形質転換し、ｐｖｇ１遺伝子を削除したΔｐｖｇ１ｇｓｆ２＋株を作製した。得られた変異体を培養し、パルスフィールドゲル電気泳動法によるゲノム解析を行い、ｐｖｇ１遺伝子が欠損したことを確認した。
　削除断片の作製には、Ｓ．ポンベの野生株であるＡＲＣ０３２株（遺伝子型：ｈ－、東京大学大学院理学系研究科附属遺伝子実験施設・飯野雄一教授より供与）よりＤＮｅａｓｙ（キアゲン社製）によって調製した全ゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲ法により行った。より具体的には、削除断片をＵＰ領域、ＯＬ領域、およびＤＮ領域に分け、各領域のＤＮＡ断片をそれぞれＫＯＤ－Ｄａｓｈ（東洋紡社製）を用いたＰＣＲ法によって作製したのち、さらにそれらを鋳型として、同様のＰＣＲ法によって全長の削除断片を作製した。
＜培養試験＞
　得られた各変異体をロイシン含有ＭＡ液体培地に植菌して、温度３０℃、振盪速度１００ｒｐｍの条件下で２０時間培養した。培養後の菌体をＥＤＴＡ（１０ｍＭ）で洗浄した後、滅菌水でさらに洗浄した。洗浄後の菌体を９６ウェルプレートの２０ウェルに等量ずつ分注した。各ウェルに、ｐＨ２．０～６．０のクエン酸バッファー（１００ｍＭ）、ｐＨ６．５～８．０のＭＯＰＳバッファー（１００ｍＭ）、ｐＨ５．０または６．０のＥＤＴＡ含有クエン酸バッファー（１００ｍＭ　クエン酸、１００ｍＭ　ＥＤＴＡ）、ｐＨ８．５～１２．５のグリシンバッファー（１００ｍＭ）のいずれかを分注した。その後、全てのウェルに、最終濃度が１００ｍＭとなるように塩化カルシウムを添加し、菌体の凝集の有無を観察した。
　図１に、各ウェルの写真を示す。この結果、ｐＨ２．０～５．０では、Δｐｖｇ１ｇｓｆ２＋株は酵母の凝集塊がウェルの底に沈殿しているのが観察されたのに対して、ｇｓｆ２＋株はほとんど凝集が観察されなかった。ｐＨ５．５～１２．５では、両株とも凝集が観察されたが、Δｐｖｇ１ｇｓｆ２＋株のほうがｇｓｆ２＋株よりもより凝集性が強かった。また、ＥＤＴＡ（１００ｍＭ）を含有させたバッファーでは、両株とも凝集は観察されず、両株の非性的凝集性がカルシウムイオン依存性であることが確認された。
［例２］
＜沈降速度の測定＞
　例１で得られたｇｓｆ２＋株およびΔｐｖｇ１ｇｓｆ２＋株、Ｓ．ポンベＡＲＣ０３２株（野生株）、並びに特許文献１に記載のＳ．ポンベＡＲＣ０２８株（非性的凝集性を有する変異株）について、ｐＨ２．０、４．０、６．０、および９．５の緩衝液、水、ガラクトース溶液、酢酸溶液、並びにＬ－乳酸溶液中における沈降速度をそれぞれ測定した。測定用溶液としては、ｐＨ２．０の乳酸－水酸化ナトリウム緩衝液（８０ｍＭ　乳酸、１００ｍＭ　塩化カルシウム）、ｐＨ４．０の乳酸－水酸化ナトリウム緩衝液（８０ｍＭ　乳酸、１００ｍＭ　塩化カルシウム）、ｐＨ６．０のクエン酸－水酸化ナトリウム緩衝液（８０ｍＭ　クエン酸、１００ｍＭ　塩化カルシウム）、ｐＨ９．５のグリシン－水酸化ナトリウム緩衝液（８０ｍＭ　グリシン、１００ｍＭ　塩化カルシウム）、塩化カルシウム水溶液（１００ｍＭ　塩化カルシウム）、ガラクトース溶液（１００ｍＭ　ガラクトース、１００ｍＭ　塩化カルシウム）、酢酸溶液（８００ｍＭ　酢酸、１００ｍＭ　塩化カルシウム）およびＬ－乳酸溶液（１Ｍ　Ｌ－乳酸、１００ｍＭ　塩化カルシウム）を用いた。
　ＡＲＣ０３２株およびＡＲＣ０２８株は、ＹＥＳ固体培地で７２時間培養後、コロニーを５ｍＬのＹＥＳ液体培地に植菌して２４時間前培養した後、得られた前培養液を１００ｍＬのＹＥＳ液体培地に植菌して２４時間培養したものを、沈降速度の測定に用いた。
　ｇｓｆ２＋株およびΔｐｖｇ１ｇｓｆ２＋株は、ロイシン含有ＭＡ固体培地で７２時間培養後、コロニーを５ｍＬのＥＭＭ液体培地に植菌して２４時間前培養した後、得られた前培養液を１００ｍＬのＥＭＭ液体培地に植菌して２４時間培養したものを、沈降速度の測定に用いた。
　各株の培養物をＥＤＴＡ溶液（１００ｍＭ）で洗浄した後、乾燥菌体重量を測定した。菌体を水で洗浄した後、２倍希釈したときに乾燥菌体の濃度が３．６ｇ／Ｌとなるように、透明な試験管に高さ２５ｍｍまで分注した。その後、沈降速度の測定用溶液の２倍濃縮液をそれぞれ添加した。各試験管を充分に懸濁させた後静置して沈降を開始させた後、液表面から固液界面（沈降した酵母菌体と上清との界面）までの領域を９５％沈降済み領域とし、液表面から固液界面までの距離を沈降開始からの経過時間で除することにより沈降速度（ｍ／ｈ）を算出した。
　沈降速度の測定結果を表１に示す。また、表２に、ｐＨ６．０の時の沈降速度に対する、ｐＨ２．０、４．０、９．５における沈降速度の相対値を示す。この結果、ＡＲＣ０２８株は、ｐＨ９．５および６．０では沈降速度が８ｍ／ｈ以上であり、非常に強い凝集性を示したが、ｐＨ２．０では１ｍ／ｈ程度であり、凝集性が小さく、乳酸溶液では０．０７ｍ／ｈしかなく、ほとんど凝集しなかった。一方でｇｓｆ２＋株は、ｐＨ４．０～９．５ではいずれも２．５ｍ／ｈ程度であり、弱い凝集性を示した。また、ｐＨ６．０の沈降速度に対する相対沈降速度はｐＨ２～９．５においていずれも７０％以上であり、ｐＨによる影響はあまり観察されなかった。しかし、ｐＨ２．０および酢酸バッファー中では、０．５未満でしかなく、ほとんど凝集しなかった。これに対してΔｐｖｇ１ｇｓｆ２＋株では、ｐＨ２．０～９．５ではいずれも６．０ｍ／ｈ以上であり、酸性条件下で充分な凝集性を示した。また、酢酸溶液およびＬ－乳酸溶液中でも４．５ｍ／ｈ以上であり、充分な凝集性を有していた。但し、ガラクトース溶液中では、ｇｓｆ２＋株およびΔｐｖｇ１ｇｓｆ２＋株はいずれも凝集が阻害されており、両株の非性的凝集性はガラクトースにより阻害されることが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　本発明のＳ．ポンベ変異体および該Ｓ．ポンベ変異体の培養方法は、酸性条件下でも強い凝集性を有するため、特に、酵母を利用した発現系の宿主として好適に用いることができる。
　なお、２０１１年２月２１日に出願された日本特許出願２０１１－０３４９６４号の明細書、特許請求の範囲、図面および要約書の全内容をここに引用し、本発明の明細書の開示として、取り入れるものである。

Claims (11)

  1. 　Ｇｓｆ活性が増大しており、かつピルビン酸転移酵素Ｐｖｇ１の酵素活性が低下または失活していることを特徴とするシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）変異体。
  2. 　ｇｓｆ２遺伝子の発現量が増大している、請求項１に記載のシゾサッカロミセス・ポンベ変異体。 
  3. 　外来のｇｓｆ２遺伝子が組み込まれている、請求項１または２に記載のシゾサッカロミセス・ポンベ変異体。 
  4. 　前記外来のｇｓｆ２遺伝子が、シゾサッカロミセス・ポンベが本来有するｇｓｆ２遺伝子である、請求項３に記載のシゾサッカロミセス・ポンベ変異体。
  5. 　前記外来のｇｓｆ２遺伝子が、遺伝子工学的方法により宿主の染色体に組み込まれている、請求項３または４に記載のシゾサッカロミセス・ポンベ変異体。
  6. 　ピルビン酸転移酵素Ｐｖｇ１をコードする遺伝子が欠損している、または該遺伝子にＰｖｇ１の酵素活性が低下または失活する変異が導入されている請求項１～５のいずれか一項に記載のシゾサッカロミセス・ポンベ変異体。
  7. 　ｐＨ２．０～４．０において、カルシウムイオン、リチウムイオン、マンガンイオン、銅イオン、および亜鉛イオンからなる群より選択される１種以上の陽イオンに依存して非性的に凝集する性質を有する、請求項１～６のいずれか一項に記載のシゾサッカロミセス・ポンベ変異体。 
  8. 　カルシウムイオン含有乳酸緩衝液（８０ｍＭ　乳酸、１００ｍＭ　塩化カルシウム、ｐＨ２．０）中で非性的に凝集する性質を有し、乾燥菌体の濃度が３．６ｇ／Ｌの場合に、該カルシウムイオン含有乳酸緩衝液中における沈降速度が２．０ｍ／ｈ以上である、請求項１～７のいずれか一項に記載のシゾサッカロミセス・ポンベ変異体。
  9. 　乾燥菌体の濃度が３．６ｇ／Ｌの場合に、前記カルシウムイオン含有乳酸緩衝液における沈降速度が６．０ｍ／ｈ以上である、請求項８に記載のシゾサッカロミセス・ポンベ変異体。
  10. 　シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）を宿主とし、遺伝子工学的方法により、外来のｇｓｆ２遺伝子を組み込み、かつピルビン酸転移酵素Ｐｖｇ１をコードする遺伝子を欠失する、若しくは該遺伝子にＰｖｇ１の酵素活性が低下若しくは失活する変異を導入することを特徴とする非性的に凝集する性質を有する変異体の製造方法。
  11. 　請求項１～９のいずれか一項に記載のシゾサッカロミセス・ポンベ変異体を、ｐＨ５以下で培養することを特徴とするシゾサッカロミセス・ポンベ変異体の培養方法。
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