WO2012043633A1 - 優性変異遺伝子発現抑制剤 - Google Patents

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WO2012043633A1
WO2012043633A1 PCT/JP2011/072187 JP2011072187W WO2012043633A1 WO 2012043633 A1 WO2012043633 A1 WO 2012043633A1 JP 2011072187 W JP2011072187 W JP 2011072187W WO 2012043633 A1 WO2012043633 A1 WO 2012043633A1
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mutant
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浩彦 北條
理貴 高橋
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独立行政法人国立精神・神経医療研究センター
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Definitions

  • the present invention relates to a dominant mutant gene expression inhibitor comprising an RNAi molecule capable of selectively and effectively suppressing the expression of a dominant mutant gene, a pharmaceutical composition comprising the expression inhibitor, and the design of the RNAi molecule Regarding the method.
  • Functional nucleic acids include siRNA (small interfering RNA), shRNA (short hairpin miRNA), miRNA (micro ⁇ ⁇ ⁇ RNA) and miRNA (micro RNA) that suppress the expression of target genes after transcription by gene silencing via RNAi (RNA interference) Decoy sequences such as nucleic acid aptamers that specifically bind to target substances such as transcription factors and suppress their functions, antisense nucleic acids that bind to target mRNAs and suppress their translation, and transcription factor binding domains Decoy DNA that suppresses gene expression by its transcription factor by capturing the target substance, specifically destabilizes the polyadenylation in the mRNA precursor of the target gene, then leads to degradation U1 adapter etc. are known. Both are expected as next-generation pharmaceuticals or diagnostic agents, but RNAi by siRNA or shRNA can suppress the desired gene expression because of its target specificity, wide applicability, and certainty of action and effect. It is in the limelight as a powerful gene expression control tool.
  • RNAi Allele-specific RNAi (ASP-RNAi), an application of RNAi that can specifically suppress the expression of a desired allele, causes disease without affecting the expression of wild-type genes Since it can specifically suppress the expression of the target dominant mutation gene, it is considered to be extremely useful in the treatment of diseases.
  • ASP-RNAi Allele-specific RNAi
  • refractory progressive ossifying fibrodysplasia (Fibrodysplasia Ossificans Progressiva: FOP), known as one of the autosomal dominant genetic diseases, is ALK2 (Activin-like kinase 2: Activin-like kinase 2) ) It is caused by a point mutation in which 617th G (guanine) on the gene is replaced with A (adenine) or a point mutation in which the 1067th G is replaced with A. Since a mutant gene having any of these point mutations is dominant, FOP develops even in a heterozygote having a wild-type ALK2 gene (Non-Patent Documents 1 to 3).
  • ASP-RNAi can suppress only the expression of the dominant mutant gene and allow the expression of the wild type gene, it can suppress the onset of autosomal dominant genetic diseases such as FOP. If the patient has already developed symptoms, the progression can be prevented.
  • ASP-RNAi is particularly useful as a pharmaceutical or diagnostic agent among RNAi.
  • RNAi based on the conventional general design method
  • the molecule has low specificity for the mutated gene and suppresses the expression of the wild type gene.
  • RNAi designed by the conventional method Molecules are not necessarily highly specific for mutant genes, and often can suppress the expression of wild-type genes.
  • the design region is necessarily limited because the surrounding base sequence including the mutation site (substitution site, deletion site, insertion site, etc.) must be the target region. The Therefore, there is a problem that even if a known effective siRNA target sequence selection method is applied, it is not always possible to design a highly specific and effective siRNA.
  • the present invention allows the expression of a wild-type gene or a desired dominant mutant gene, and can selectively and effectively suppress only the expression of a specific target dominant mutant gene that produces a discontinuous junction on the transcript.
  • An object of the present invention is to develop an RNAi molecule and provide a dominant mutant gene expression inhibitor containing the molecule as an active ingredient and a method for designing the RNAi molecule.
  • An object of the present invention is to provide a therapeutic agent for treating a hereditary disease caused by expression of a dominant mutant gene.
  • RNAi molecules set so that the base length from the 3 ′ side of the sense strand region adjacent to the discontinuous junction to the 3 ′ end thereof is a predetermined length, selectively expresses the dominant mutant gene, And while suppressing effectively, it became clear that the suppression effect was hardly shown or reduced with respect to the expression of a wild-type gene.
  • the present invention has been completed based on the above findings and provides the following.
  • RNAi molecule is siRNA
  • RNAi molecule is shRNA
  • the mutation in the dominant mutation gene is selected from the group consisting of base deletion, base insertion, base replacement capable of destroying the splice site, gene duplication, gene translocation, and chromosomal inversion, (1)
  • the inhibitor according to any one of (5) is selected from the group consisting of base deletion, base insertion, base replacement capable of destroying the splice site, gene duplication, gene translocation, and chromosomal inversion, (1)
  • the inhibitor according to any one of (5).
  • the malignant neoplasm is non-small cell lung cancer and the dominant mutant gene targeted is a mutant EGFR gene, or the malignant neoplasm is colon cancer and the dominant mutant gene targeted is mutated.
  • Type CTNNB1 gene malignant neoplasm is gastric cancer and the dominant mutant gene targeted is mutant CDH1 gene, or malignant neoplasm is breast cancer and the dominant mutant gene targeted is mutated Is a type BRCA1 gene or a mutant BRCA2 gene, or the malignant neoplasm is multigland autoimmune endocrine insufficiency type I, and the dominant mutant gene that is the target is a mutant AIRE gene, or a malignant neoplasm Is an autoimmune lymphoproliferative syndrome and the dominant mutant gene targeted is a mutant TNFRSF6 / APT1 / FAS gene, or the malignant neoplasm is chronic myeloid leukemia or acute lymphocytic leukemia and the target The dominant mutant gene is a B
  • the sense strand region of the RNAi molecule is SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 47, 49, 53, 55, 59, 61, 63, 65, 67, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143 or 145, the suppression according to (11) Agent.
  • the human autosomal dominant mutation is congenital night blindness, and the dominant mutation gene that is the target is the RHO gene, or the human autosomal dominant mutation is the deafness gene region DFNA2, and the target
  • the dominant mutation gene is KCNQ4 gene or GJB gene, the human autosomal dominant mutation disease is Wardenburg syndrome, and the target dominant mutation gene is MITF gene, or the human autosomal dominant mutation disease is not Symptomatic hearing loss and the target dominant mutant gene is DIAPH1 / DFNA1 gene or POU4F3 gene, or human autosomal dominant mutation is hypertrophic cardiomyopathy, and the target dominant mutant gene is TNNT2
  • the human autosomal dominant mutation is familial hypertrophic cardiomyopathy and the dominant mutation gene targeted by it is the MYBPC3 gene
  • the autosomal dominant mutation is apical hypertrophic cardiomyopathy
  • the target dominant mutation is the TNNI3 gene
  • the human autosomal dominant mutation is Charcot-Marie-Tooth disease type 1A and its target
  • the disease is myotonic dystrophy and the dominant mutant gene targeted is DMPK gene, or the disease is spinal muscular atrophy and the dominant mutant gene targeted is SMN1 gene Or the disease is congenital myasthenia syndrome and the dominant mutant gene targeted is the CHRNE gene, or the disease is frontotemporal dementia and the dominant mutant gene targeted is the MAPT gene Or the suppressor according to (8), wherein the disease is growth hormone-only deficiency type II and the dominant mutant gene targeted by the disease is the GH1 gene.
  • a pharmaceutical composition comprising at least one inhibitor according to any one of (1) to (17) as an active ingredient.
  • RNAi molecule having a sense strand region consisting of nucleotides represented by SEQ ID NO: 83 or 85, and / or an expression vector operably linked to a DNA encoding the RNAi molecule, and / or a sense strand region Further comprising, as an active ingredient, an RNAi molecule consisting of the nucleotide shown in SEQ ID NO: 89 and / or an expression vector operably linked to DNA encoding the RNAi molecule, depending on (11) or (12) The pharmaceutical composition according to (18).
  • RNAi molecule consisting of the nucleotide represented by SEQ ID NO: 89 and / or an expression vector operably linked to DNA encoding the RNAi molecule Inhibitor.
  • RNAi molecule that selectively suppresses the expression of a dominant mutant gene having a discontinuous junction on a transcript, comprising: (a) 5 ′ adjacent to the discontinuous junction on the transcript (B) the 4th to 15th bases from the base corresponding to the second reference base to the downstream side in the transcript, (C) a base sequence comprising 16 to 30 consecutive bases including the first and second reference bases of the transcript in the dominant mutant gene And (d) setting the base sequence containing a base sequence complementary to the base sequence of the set RNAi sense strand region as the RNAi antisense strand region.
  • the ASP method is the design method, wherein the ASP score is calculated from the following formula.
  • ASP score [(Relative ratio of normalized expression level of normal gene treated with RNAi molecule to standardized expression level of normal gene treated with control RNAi molecule) ⁇ (Standardization of mutant gene treated with control RNAi molecule) Relative ratio of the standardized expression level of the mutant gene treated with the RNAi molecule to the expressed level]] ⁇ (1-standardization of the mutant gene treated with the RNAi molecule relative to the standardized expression level of the mutant gene treated with the control RNAi molecule Relative ratio of expression level) (In the formula, the control RNAi molecule is an RNAi molecule that does not affect the expression of the normal gene and the mutant gene) (23) The design method according to (21) or (22), wherein TT or UU is further added to the 3 ′ ends of the RNAi sense strand region and the RNAi antisense strand region.
  • the expression of the target dominant mutant gene is selectively and effectively suppressed without greatly affecting the expression of the wild type gene or the dominant mutant gene other than the target. It becomes possible.
  • RNAi molecule which is an active ingredient of the dominant mutant gene expression inhibitor of the present invention, it is possible to design for a dominant sudden dominant mutant gene having discontinuous junctions on any transcript that causes disease. It is possible to provide a design method with high applicability.
  • the disease in a hereditary disease, can be cured by selectively suppressing the expression of the target dominant mutation gene causing the disease while maintaining the expression of the wild-type gene. Is possible.
  • the solid open box (0102, 0103) indicates the coding region (0102) or all or part of the exon (0103) of the gene (0101), and the solid hatched box (0104, 0105) indicates the non-coding region of the gene (5 'Non-coding region: 0104; 3' non-coding region: 0105) and solid lines (0106, 0107) sandwiched between boxes indicate all (0106) or part (0107) of the intron.
  • the region indicated by the broken line is the deletion region (0108, 0109, 0110, 0111), and the dashed white box (0108, 0112) is the deletion region (0108) or deletion exon (0112) of the coding region within the exon of the gene
  • the dashed lines (0113, 0114) between the boxes indicate all (0113) or part (0114) of the deleted intron.
  • An arrow (0115) indicates the transcription start point.
  • A shows the wild type gene
  • a ' shows the transcript of the wild type gene
  • B shows the mutant gene
  • B' shows the transcript of the mutant gene.
  • C shows the deletion region (b region) with a broken line when mutant gene B is compared with wild-type gene A.
  • the junction (J) between the region a and the region c on B ′ is a discontinuous junction.
  • A shows the wild type gene
  • a ' shows the transcript of the wild type gene
  • B shows the mutant gene
  • B' shows the transcript of the mutant gene.
  • Solid open boxes (0301, 0302) indicate exons
  • solid lines (0303, 0304) between boxes indicate all (0303) or part (0304) of introns
  • asterisks (0305) indicate 5 'splice sites.
  • a region (0306) indicated by a broken line is a deletion region in the mutated gene.
  • the junction (J1) between the region derived from part (0307) of the first exon (0301) and the region derived from part of intron (0304), and the intron Two junction points (J2) between the region derived from part (0304) and the region derived from the second exon (0302) are discontinuous junction points.
  • A shows the wild type gene
  • a ' shows the transcript of the wild type gene
  • B shows the mutant gene
  • B' shows the transcript of the mutant gene
  • C shows a deletion region (0406) indicated by a broken line when mutant gene B is compared with wild-type gene A.
  • the junction (J) between the first exon (0401) and the third exon (0403) is a discontinuous junction in the transcript B ′ of the mutant gene.
  • A shows the wild type gene
  • a ' shows the transcript of the wild type gene
  • B shows the mutant gene
  • B' shows the transcript of the mutant gene.
  • white boxes in the a region and b region indicate coding regions in exons
  • hatched boxes indicate non-coding regions in exons
  • c regions (shaded boxes) indicate insertion portions in mutant genes. .
  • junction points (J1, J2) of the region derived from the wild-type exon a region and the region derived from the insertion part that is the c region in the transcript B ′ of the mutant gene are discontinuous junction points.
  • the conceptual diagram of the structure of RNAi molecule is shown.
  • the case of (A) a double-stranded RNAi molecule (siRNA) and the case of (2) a single-stranded RNAi molecule (shRNA) are shown.
  • numerator of Embodiment 1 is shown.
  • A A diagram showing a comparison of the base sequence and amino acid sequence around the deletion site in the wild-type EGFR gene and the deletion mutant EGFR gene del (E764-A750).
  • the region surrounded by a black frame is the deletion region of this mutant EGFR gene.
  • the position corresponding to the discontinuous junction in the transcript of this mutant gene is indicated by an arrowhead.
  • B The EGFR-siRNA expression inhibitory effect on wild-type non-target EGFR gene and deletion mutant EGFR gene del (E764-A750) was calculated as a relative value when the luciferase activity of each siControl was 1.0.
  • RNAi The luciferase activity is corrected by the expression level of ⁇ -galactosidase, which is an exogenous control that is not subject to expression suppression by RNAi.
  • C ASP score values of EGFR-siRNA against wild-type non-target EGFR gene and deletion mutant EGFR gene del (E764-A750). The boundary line of the ASP score value 0.4 is indicated by a broken line.
  • A A diagram showing a comparison of the base sequence and amino acid sequence around the deletion site in the wild-type EGFR gene and the deletion mutant EGFR gene del (L747-T751) -L747S.
  • EGFR-siRNA expression suppression effect on wild-type non-target EGFR gene and deletion mutant EGFR gene del (L747-T751) -L747S is calculated as a relative value when the luciferase activity of each siControl is 1.0 did.
  • the luciferase activity of each sample is corrected by the expression level of ⁇ -galactosidase, which is an exogenous control that is not subject to expression suppression by RNAi.
  • C EGFR-siRNA ASP score values for wild-type non-target EGFR gene and deletion mutant EGFR gene del (L747-T751) -L747S.
  • the boundary line of the ASP score value 0.4 is indicated by a broken line.
  • A It is the figure which showed the comparison of the base sequence and amino acid sequence around a deletion site
  • the region surrounded by a black frame is the deletion region of the mutant EGFR gene, and the base shown in bold in the mutant EGFR gene is the insertion base.
  • C ASP score values of EGFR-siRNA against wild-type non-target EGFR gene and deletion / insertion mutant EGFR gene del (L747-E749) -A750P (G).
  • the boundary line of the ASP score value 0.4 is indicated by a broken line.
  • A It is the figure which showed the comparison of the base sequence and amino acid sequence around a deletion site
  • the region surrounded by a black frame is the deletion region of the mutant EGFR gene, and the base shown in bold in the mutant EGFR gene is the insertion base.
  • the position corresponding to the discontinuous junction in the transcript of this mutant gene is indicated by an arrowhead.
  • this deletion / insertion variant there are two discontinuous junctions.
  • B Inhibition of EGFR-siRNA expression against wild-type non-target EGFR gene and deletion / insertion mutant EGFR gene del (L747-E749) -A750P (A), with luciferase activity of each siControl as 1.0 Was calculated as a relative value.
  • RNAi The luciferase activity of each sample is corrected by the expression level of ⁇ -galactosidase, which is an exogenous control that is not subject to expression suppression by RNAi.
  • C ASP score values of EGFR-siRNA against wild-type non-target EGFR gene and deletion / insertion mutant EGFR gene del (L747-E749) -A750P (A). The boundary line of the ASP score value 0.4 is indicated by a broken line.
  • BCR-ABL chimeric gene and wild expressed from the Philadelphia chromosome (reciprocal translocation between the ABL gene located on the long arm of chromosome 9 (9q34) and the BCR gene located on the long arm of chromosome 22 (22q11))
  • the region surrounded by the black frame is the translocated region
  • the region surrounded by the black frame is the region of the ABL gene linked to the BCR gene by translocation. It is.
  • a position corresponding to a discontinuous junction in the transcript of the chimeric gene is indicated by an arrowhead.
  • B The suppression effect of BCR-ABL-siRNA expression on wild-type non-target ABL gene and BCR-ABL chimeric gene was calculated as a relative value when the luciferase activity of each siControl was 1.0. The luciferase activity is corrected by the expression level of ⁇ -galactosidase, which is an exogenous control that is not subject to expression suppression by RNAi.
  • C ASP score value of BCR-ABL-siRNA against wild-type non-target ABL gene and BCR-ABL chimeric gene. The boundary line of the ASP score value 0.4 is indicated by a broken line.
  • BCR-ABL chimeric gene and wild type generated from the Philadelphia chromosome (reciprocal translocation between the ABL gene located on the long arm of chromosome 9 (9q34) and the BCR gene located on the long arm of chromosome 22 (22q11)) It is the figure which showed the contrast of the base sequence and amino acid sequence of a translocation site periphery sequence in a BCR gene.
  • the region surrounded by a black frame is the translocated region
  • the region surrounded by the black frame is the region of the BCR gene linked to the ABL gene by translocation. It is.
  • a position corresponding to a discontinuous junction in the transcript of the chimeric gene is indicated by an arrowhead.
  • B The expression suppression effect of BCR-ABL-siRNA against wild-type non-target BCR gene and BCR-ABL chimeric gene was calculated as a relative value when the luciferase activity of each siControl was 1.0. The luciferase activity is corrected by the expression level of ⁇ -galactosidase, which is an exogenous control that is not subject to expression suppression by RNAi.
  • C ASP score value of BCR-ABL-siRNA against wild-type non-target BCR gene and BCR-ABL chimeric gene. The boundary line of the ASP score value 0.4 is indicated by a broken line.
  • FIG. It is an electrophoretic diagram which shows the mutated gene-specific RNAi effect when EGFR-siRNA (si747 / 49 (A) -8D19) is introduced into PC3 cells. It is the figure which showed the cell growth inhibitory effect when EGFR-siRNA (si747 / 49-3D19) was introduce
  • the base sequence of the mutant EGFR gene In the base sequence of the mutant EGFR gene, the base shown in bold is the replacement site for the mutant EGFR gene.
  • B The EGFR-siRNA expression inhibitory effect on the wild-type non-target EGFR gene and substitution mutant EGFR gene T790M was calculated as a relative value when the luciferase activity of each siControl was 1.0. The luciferase activity is corrected by the expression level of ⁇ -galactosidase, which is an exogenous control that is not subject to expression suppression by RNAi.
  • PC3 cell a human non-small cell lung cancer-derived cell line with mutant EGFR del (L747-E749) -A750P
  • PC9 a human non-small cell lung cancer cell line with mutant EGFR del (E746-A750)
  • A shows PC3 cells
  • B shows PC9 cells
  • C shows HeLa cells. The values in each figure are shown as relative values when the cell viability in untreated cells is 100%.
  • A shows results when PC3 cells are treated with B, PC9 cells are treated with C, and HeLa cells are treated with siRNA. The values in each figure are shown as relative values when the cell viability in untreated cells is 100%.
  • B From an individual group not administered with siRNA (a1 to a3), an individual group administered with siControl (b1 to b3), and an individual group administered with EGFR-siRNA (si747 / 49-3D19) (c1 to c3) , Shows a tumor derived from PC3 cells extracted 3 weeks (9 weeks of age) after administration of siRNA and the like. It is the figure which showed the time course of the tumor volume when EGFR-siRNA (si747 / 49-3D19) was administered with respect to PC3 cell transplanted subcutaneously to the nude mouse.
  • ⁇ indicates that there is a significant difference (p ⁇ 0.05) compared to the tumor volume of individuals not receiving siRNA, and # indicates that there is a significant difference compared to the tumor volume of individuals receiving siControl. It shows that there is a difference (p ⁇ 0.05). It is the figure which showed the tumor wet weight when EGFR-siRNA (si747 / 49-3D19) was administered with respect to the PC3 cell transplanted subcutaneously to the nude mouse. ⁇ indicates that there is a significant difference (p ⁇ 0.05) compared to the tumor volume of individuals not receiving siRNA, and # indicates that there is a significant difference compared to the tumor volume of individuals receiving siControl. It shows that there is a difference (p ⁇ 0.05).
  • A A nude mouse 3 weeks (9 weeks old) after administration of siRNA or the like to a tumor (arrow) derived from subcutaneously transplanted PC3 cells is shown.
  • B PC3 cell-derived tumor extracted from each individual group (5 mice per group) at 3 weeks (9 weeks of age) after administration of siRNA or the like. It is the figure which showed the time course of the tumor volume when EGFR-siRNA (si747 / 49 (A) -8D19) was administered with respect to PC3 cell transplanted subcutaneously to the nude mouse.
  • ⁇ indicates that there is a significant difference (p ⁇ 0.05) compared to the tumor volume of individuals not receiving siRNA
  • # indicates that there is a significant difference compared to the tumor volume of individuals receiving siControl.
  • A is the total amount of bilirubin in plasma
  • B is the amount of direct bilirubin in plasma
  • C is the amount of indirect bilirubin in plasma
  • D is the amount of alkaline phosphatase in plasma.
  • siEgfr is an EGFR-siRNA having a conventional siRNA configuration.
  • the 1st Embodiment of this invention is a dominant mutant gene expression inhibitor.
  • the inhibitor of the present invention contains an RNAi molecule and / or an expression vector encoding it as an active ingredient, and is characterized by selectively suppressing the expression of a dominant mutant gene.
  • RNAi molecule refers to the expression of a gene through the degradation of the target dominant mutant gene transcript by inducing RNA interference in vivo. Molecules that can be silenced after transcription and before translation. As long as it is a molecule that can suppress gene expression via the RNAi mechanism, it may be either a single-stranded molecule or a double-stranded molecule. Examples thereof include a double-stranded molecule such as siRNA (small interfering RNA), and a single-stranded molecule such as shRNA (short hairpin RNA) or miRNA (micro RNA).
  • siRNA small interfering RNA
  • shRNA short hairpin RNA
  • miRNA miRNA
  • RNA interference For RNA interference, see, for example, Bass BL, 2000, Cell, 101, 235-238; Sharp PA, 2001, Genes Dev., 15, 485-490; Zamore PD, 2002, Science, 296, 1265-1269; Dernburg, See AF & Karpen, GH, 2002, Cell, 111,159-162.
  • gene silencing after transcription via the RNAi mechanism is hereinafter referred to as “gene expression suppression”.
  • RNAi molecule is composed of a nucleic acid.
  • nucleic acid refers to a natural nucleic acid, a non-natural nucleic acid, and / or a nucleic acid analog.
  • natural nucleic acid refers to a biological macromolecule existing in nature in which nucleotides are structural units and they are linked by phosphodiester bonds. Usually, it corresponds to RNA in which ribonucleotides having any base of adenine, guanine, cytosine and uracil are linked and / or DNA in which deoxyribonucleotides having any base of adenine, guanine, cytosine and thymine are linked. In the RNAi molecule of the present invention, it is particularly preferred that RNA is the main constituent.
  • non-natural nucleic acid refers to a nucleic acid containing or consisting of a non-natural nucleotide.
  • non-natural nucleotide refers to an artificially constructed or artificially chemically modified nucleotide that does not exist in nature and has similar properties and / or structures to the naturally occurring nucleotide. It refers to nucleotides or nucleotides containing nucleosides or bases having properties and / or structures similar to naturally occurring nucleosides or bases.
  • Examples include abasic nucleosides, arabino nucleosides, 2′-deoxyuridines, ⁇ -deoxyribonucleosides, ⁇ -L-deoxyribonucleosides, and other nucleosides with sugar modifications. Furthermore, substituted pentasaccharide (2'-O-methylribose, 2'-deoxy-2'-fluororibose, 3'-O-methylribose, 1 ', 2'-deoxyribose), arabinose, substituted arabinose sugar; Nucleosides with substituted hexasaccharides and alpha-anomeric sugar modifications are included.
  • Non-natural nucleotides also include nucleotides that include artificially constructed base analogs or artificially chemically modified bases (modified bases).
  • Base analog includes, for example, 2-oxo (1H) -pyridin-3-yl group, 5-substituted-2-oxo (1H) -pyridin-3-yl group, 2-amino-6- (2 -Thiazolyl) purin-9-yl group, 2-amino-6- (2-thiazolyl) purin-9-yl group, 2-amino-6- (2-oxazolyl) purin-9-yl group and the like.
  • Modified bases include, for example, modified pyrimidines (eg, 5-hydroxycytosine, 5-fluorouracil, 4-thiouracil), modified purines (eg, 6-methyladenine, 6-thioguanosine) and other heterocyclic rings. Examples include bases. Chemically modified nucleic acids and nucleic acid analogues such as methylphosphonate DNA / RNA, phosphorothioate DNA / RNA, phosphoramidate DNA / RNA, 2′-O-methyl DNA / RNA can also be included.
  • nucleic acid analog refers to an artificially constructed compound having a structure and / or property similar to that of a natural nucleic acid. Examples include peptide nucleic acids (PNA: Peptide Nucleic Acid), peptide nucleic acids having a phosphate group (PHONA), cross-linked nucleic acids (BNA / LNA: Bridged Nucleic Acid / Locked Nucleic Acid), morpholino nucleic acids, and the like.
  • PNA Peptide Nucleic Acid
  • PONA peptide nucleic acids having a phosphate group
  • BNA / LNA Bridged Nucleic Acid / Locked Nucleic Acid
  • morpholino nucleic acids and the like.
  • a phosphate group, a sugar and / or a base may be labeled with a nucleic acid labeling substance, if necessary.
  • a nucleic acid labeling substance any substance known in the art can be used as the nucleic acid labeling substance.
  • radioisotopes eg, 32 P, 3 H, 14 C
  • DIG diatomaceous iotide
  • biotin e.g, FITC, Texas, cy3, cy5, cy7, FAM, HEX, VIC, JOE, Rox, TET, Bodipy493 , NBD, TAMRA
  • a luminescent substance for example, acridinium ester
  • mutation is a physical or structural variation of a base sequence that occurs on a gene or chromosome. There are gene mutations that occur on the gene and chromosomal mutations that occur on the chromosome. In this specification, any mutation that causes the discontinuous junction point described below on the transcript of the target dominant mutation gene is used. Also good. In addition to mutations that occur in nature, mutations are artificially induced by using mutagenic agents such as ethyl methanesulfonate (EMS) and N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine. Also included are induced mutations and mutations introduced using molecular genetic techniques.
  • EMS ethyl methanesulfonate
  • N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine also included are induced mutations and mutations introduced using molecular genetic techniques.
  • mutation types include mutations based on base deletions, insertions or substitutions in genes, gene duplications or translocations, or chromosomal inversions.
  • “Deletion” refers to a mutation in which a part of the base sequence of the wild-type gene is lost.
  • wild-type gene is a gene that exists in nature most in an allele group of homologous genes, and a protein or functional nucleic acid encoded by the gene has an original function.
  • “Functional nucleic acid” is also referred to as non-coding RNA, and is RNA having various functions by itself without encoding a protein. For example, transfer RNA (tRNA), ribosomal RNA (rRNA), small nuclear RNA (snRNA), small nucleolar RNA (snoRNA), microRNA (miRNA) and the like are applicable.
  • the number of deletion bases and the position are not particularly limited as long as the deletion site in one gene is a site that causes a discontinuous junction on the transcript of the deletion gene.
  • Deletions of about 1 to 50 bases, 1 to 40 bases, 1 to 30 bases, or 1 to 20 bases are common, but the transcription product resulting from the deletion results in a dominant mutation in the individual carrying the mutant gene.
  • 70% or more, 80% or more, or 90% or more of the base sequence of the wild-type gene may be deleted.
  • the deletion site in one gene as shown in FIG.
  • the gene containing one or more introns as shown in FIG. 1B lacks the region (0109) containing the entire region (0112) of one or more exons that does not contain the transcription start point (0115).
  • Lost may include one or more introns and / or partial regions; in FIG. 1B, the deletion site is located on both sides of one exon in addition to the entire region (0112) A part of two introns (0114), in a gene containing one or more introns, as shown in FIG.
  • a part of two exons containing the entire region (0113) of at least one intron ie, Part of the 3 'side of the upstream exon
  • the region (0110) between the exon and the 5 ′ part of the downstream exon is deleted, the 3 ′ part of the upstream exon and the 5 ′ of the intron located downstream of the exon as shown in FIG. 1D
  • a region including a part of the side may include the entire region of one or more other exons and introns in between; in FIG. 1D, the entire region of one exon (0112) and its The entire region (0113) of one intron located on both sides and the partial region (0114) of the other intron).
  • deletion of a partial region of an intron that does not include a splice site or deletion of the entire region of one or more introns does not correspond to the deletion of the present invention because no discontinuous junction is formed on the transcript.
  • “Insertion” refers to a mutation in which one or more bases are inserted into the base sequence of a wild-type gene.
  • the position of insertion of a base in a gene is not particularly limited as long as it is within an exon.
  • the intron when inserted into an intron, the intron is usually removed by splicing after gene expression and does not produce a discontinuous junction on the transcript. Therefore, in principle, the insertion of a base into an intron is not included in the insertion of the present invention. However, even in the insertion of an intron, if the splice site described later is destroyed by the insertion, the intron is not removed normally by splicing due to the large number of inserted bases, or inserted.
  • a discontinuous junction is formed on the transcript. It shall be included in the insertion.
  • the number of inserted bases is not particularly limited. For example, it may be a single base insertion as described above, or may be an insertion of several hundred bases or more like a transposon.
  • substitution refers to a mutation in which the base of the wild-type gene is replaced with another base.
  • substitution mutation normally, when the wild type gene and the mutant gene are compared, there is no gap between the base sequences of both genes and their transcription products. Therefore, except for substitutions that can destroy the splice site, it is usually not possible to produce discontinuous junctions on the transcript of the gene.
  • substitution can destroy the splice site, removal of the intron under the control of the splice site by splicing is inhibited, resulting in a discontinuous junction on the transcript, that is, as described later.
  • a gap is generated between the nucleotide sequences of the transcription product of the wild type gene and the mutant gene.
  • the substitution in the present invention covers only substitution that can destroy the splice site.
  • the splice site here refers to a site necessary for normal splicing in the gene sequence.
  • a 5 'splice site located around the 5' end of the intron
  • a 3 'splice site located around the 3' end of the intron
  • the intron A general part located at a predetermined position in the intron, such as a branch point located at, corresponds.
  • other bases in introns required for splicing and bases located in exons are also included.
  • a base essential for formation of a higher-order structure in an RNA sequence necessary for splicing corresponds.
  • the number of bases to be substituted is not particularly limited as long as the splice site can be destroyed.
  • it may be a single base substitution point mutation.
  • “Duplicate” refers to a mutation in which multiple identical genes exist in a chromosome. Usually, gene duplication occurs with duplication of a partial region of a chromosome containing the gene. In the present invention, only a part of the gene is duplicated, and on the basis of this, the duplication that generates a gene in which a discontinuous junction is generated on the transcript is targeted.
  • Translocation refers to a mutation in which part of a gene or chromosome changes its position on the same or different chromosome.
  • a gene in which a discontinuous junction is generated on a transcript containing a part of the translocated gene as a result of the translocation of a part of the gene to a different position is targeted.
  • the transcript is compared with any transcript of each gene that is the basis of the fusion.
  • it will have discontinuous junctions.
  • “Inversion” refers to a mutation in which the direction of a part of the chromosome is reversed.
  • the one in which the direction of a part of a gene is reversed due to inversion and a discontinuous junction is generated on a transcript containing a part of the reversed gene is targeted.
  • “Mutant gene” refers to a gene containing a base different from the base sequence of the wild-type gene.
  • the mutated gene includes not only those inherently present on the chromosome but also those acquired afterward.
  • the mutated gene does not need to be present in all cells constituting the individual, and may be present only in some cells, tissues, or organs. For example, in one individual, a mutant gene that does not exist in normal cells but exists only in cancer cells can be mentioned.
  • mutant mutant gene refers to a mutant gene in which a trait based on the mutation is manifested as a phenotype in an individual. As a result, as long as it is a mutant gene that dominates an individual with an abnormal phenotype, it does not matter whether the protein or functional RNA encoded by the mutant gene is active.
  • gain-of-function mutation gain ⁇ ⁇ of function mutation
  • loss-of-function mutation loss of function mutation
  • a gain-of-function mutation is a hypermorphic mutation that causes a trait that exhibits a quantitative increase (overexpression) or increased activity (constitutive active or hyperactive) in a protein.
  • neomorph mutations that cause traits exhibiting functional activity
  • antimorph mutations that antagonize or suppress wild-type gene-derived proteins and suppress wild-type gene expression
  • loss-of-function mutation examples include an amorph mutation in which the gene has completely lost the ability to express the phenotype and a hypomorph mutation that causes a reduction in the ability to express the gene.
  • loss-of-function mutations many of them are usually recessive, but in this specification, only those whose effects are dominant are considered. A gain-of-function dominant mutation is preferred.
  • discontinuous junction refers to a gap of at least one base when the base sequence of a transcription product in a mutant gene is compared with the base sequence of a transcription product of a wild-type gene (this gap is a transcription product). Base sequence on the mutant gene transcript, which disrupts the continuity of the corresponding base between the mutant gene transcript and the wild-type gene transcript. This is the joint part. One or more discontinuous junctions may be present in the transcript of one mutant gene.
  • This discontinuity is based on the mutation of the mutated gene.
  • the mutation is a deletion of a base in one exon
  • the base sequences in the regions indicated by a and c correspond, but the 3 ′ end base of the a region and the 5 ′ end of the c region in the transcript of the wild type gene.
  • the continuity is lost between bases.
  • the junction (J) between the 3 'terminal base of the a region and the 5' terminal base of the c region in the mutant gene transcript B ' is a discontinuous junction.
  • the deletion in mutant gene B (see C where the deletion site is indicated by a broken line) is caused by a partial base at the 3 ′ end side of the first exon (0301) and the first intron.
  • the region (0306) consisting of a part of the base on the 5 ′ end side of (0303)
  • a transcript B ′ containing a part of the base (0304) on the 3 ′ end side of the first intron (0303) is generated.
  • the 5 'side is the base at the 3' deletion end of the first exon (0301) and the 3 'side is the first.
  • the base at the 5 ′ end of 2 exons (0302) disrupts its continuity. Therefore, in this case, the base at the 3 ′ deletion end of the first exon (0301) and the base at the 5 ′ deletion end of the first intron (0304) in which a part of the 5 ′ end is truncated.
  • Two discontinuous junctions are formed at the junction (J2) of the base (J1) and the base at the 3 ′ end of the first intron (0304) and the base at the 5 ′ end of the second exon (0302).
  • the deletion in mutant gene B (see C where the deletion site is indicated by a broken line) is caused by a partial base on the 3 ′ end side of the first intron (0404) and the second exon ( 0402), the deletion of the 3 'splice site (0407) of the first intron of mutant gene B causes a deletion of the second exon (0402). ) Part of the 3 'terminal side (0408) is removed by splicing, and the transcript B' may be in a state where the first exon (0401) and the third exon (0403) are linked. is there.
  • the junction (J) between the base at the 3 'end of the first exon (0401) and the base at the 5' end of the third exon (0403) is a discontinuous junction.
  • transcript B ′ of mutant gene B containing the inserted c region and the wild type
  • transcript B ′ When comparing the base sequence of the gene A with the transcript A ′, the 3 ′ end of the a region and the 5 ′ end of the c region and the 3 ′ end of the c region and the 5 ′ end of the b region in the transcript B ′
  • the continuity is lost.
  • junction (J1) of the 3 ′ end base of the a region and the 5 ′ end base of the c region and the 3 ′ end base of the c region and the 5 ′ end of the b region in the transcript B ′ of the mutant gene Two locations of the terminal base junction (J2) are discontinuous junctions.
  • the type of target gene and the biological species from which the gene is derived are not particularly limited.
  • a gene encoding any protein or functional nucleic acid can be the target of the inhibitor of this embodiment.
  • the biological species may be any of animals and plants, and includes all kinds thereof. If it is an animal, it is preferably a vertebrate, more preferably a fish, a bird or a mammal. More preferably among fish species, fish species for fishery resources (for example, salmonaceae, perch, cod, herring, flounder, flatfish, horse mackerel, sandfish, Thai, and rockfish) .
  • edible species for example, chickens, geese, ducks, ducks, ducks, turkeys, quails, ostriches, etc.
  • edible species for example, chickens, geese, ducks, ducks, ducks, turkeys, quails, ostriches, etc.
  • domestic animals pigs, cattle, sheep, goats, horses
  • laboratory animals rodents, rabbits, dogs, monkeys
  • competing horses pet animals (dogs, cats, rabbits, monkeys) Rodents) or humans.
  • a more preferred species is human.
  • a seed plant more preferably an angiosperm, and even more preferably an edible plant species (eg, Gramineae (eg, rice, wheat, barley, rye, corn, goryan, millet), legume ( For example, soybean, azuki bean, green pea), eggplant family (for example, tomato, eggplant, potato, pepper, pepper), convolvulaceae family (for example, sweet potato), rose family (for example, strawberry, almond, peach, plum, plum, rose) , Sakura), Brassicaceae (for example, Japanese radish, turnip, Brassica), Rabbitaceae (for example, spinach, sugar beet), Apiaceae, Tadeidae, Cucurbitaceae, Asteraceae, Lilyaceae, Araceae, Grapeaceae, Citrus, Edible plant species belonging to the family Beech, Palmaceae, etc.), plant species for textile resources (eg cotton, a plant species, eg, a seed plant, more
  • the trait involving the mutation is not particularly limited, but is preferably a trait whose expression is to be suppressed.
  • mutations involved in the onset of diseases, mutations involved in abnormal forms, and the like can be mentioned.
  • the diseases referred to here include, for example, diseases caused by mutations acquired in genomic DNA in specific cells and autosomal dominant mutation diseases.
  • neoplasms tumors
  • malignant neoplasms malignant tumors, so-called cancers, including leukemia
  • EGFR epidermal growth factor receptor
  • NSCLC Small cell lung cancer
  • CTNNB1 colorectal cancer caused by mutations in the CTNNB1 gene
  • gastric cancer caused by mutations in the CDH1 gene gastric cancer caused by mutations in the CDH1 gene
  • breast cancer caused by mutations in the BRCA1 or BRCA2 genes and many causes caused by mutations in the AIRE gene
  • examples include glandular autoimmune endocrine insufficiency type I, autoimmune lymphoproliferative syndrome caused by mutations in the TNFRSF6 / APT1 / FAS gene.
  • a more specific example of a malignant neoplasm caused by a mutation of a gene with a translocation that is acquired in the genomic DNA in a specific cell is caused by a chimeric gene of the BCR gene and the ABL gene.
  • CML Chronic myeloid leukemia
  • ALL acute lymphoblastic leukemia
  • Burkitt lymphoma caused by a chimeric gene of c-myc gene and IgH gene, undifferentiated type caused by a chimeric gene of NPM gene and ALK gene
  • the disease involves splicing abnormalities, myotonic dystrophy caused by mutations in the DMPK gene, spinal muscular atrophy caused by mutations in the SMN1 gene, congenital myasthenia caused by mutations in the CHRNE gene Syndrome, frontotemporal lobe dementia caused by mutation of MAPT gene, growth hormone single deficiency type II caused by mutation of GH1 gene, and the like.
  • RNAi molecule contained in the inhibitor of the present embodiment comprises an RNAi sense strand region containing at least one discontinuous junction generated on the transcription product of the target dominant mutant gene, and a base sequence complementary thereto
  • An RNAi antisense strand region comprising
  • RNAi molecules include double-stranded molecules (FIG. 6A) or single-stranded molecules (FIG. 6B).
  • RNAi sense strand region and a circular molecule for example, a dumbbell nucleic acid
  • a dumbbell nucleic acid for example, a dumbbell nucleic acid
  • RNAi molecules contained in the inhibitor of the present embodiment has an RNAi sense strand region (0601), an RNAi antisense strand region (0602), and a discontinuous junction (0603) as essential components. Include as. Hereinafter, components common to RNAi molecules will be described.
  • the “RNAi sense strand region” (0601) is composed of a base sequence that matches the base sequence of the transcription product of the target dominant mutant gene, and a discontinuous junction (0603) that occurs on the transcription product (sense in FIG. 6).
  • the chain region (0601) includes at least one of the hatched region and the white region.
  • the base length of the sense strand region (0601) is 16 to 30 bases, 18 to 25 bases, or 19 to 23 bases of the transcript.
  • the 3 ′ base (0604) adjacent to the discontinuous junction (0603) is used as a reference (corresponding to a second reference base described later), and 3 to 16 from the reference base toward the downstream side.
  • the 3rd base preferably 4th to 15th base (0605), more preferably 4th to 13th base constitutes the 3 ′ terminal base of the RNAi sense strand region.
  • the 3 ′ base adjacent to any one of the discontinuous junctions may be used as the reference base.
  • the “RNAi antisense strand region” (0602) is composed of a base sequence that is completely complementary to the RNAi sense strand region (0601). Therefore, the base sequence includes a base (0607) complementary to the reference base, that is, the 3 'base adjacent to the discontinuous junction (0603).
  • the RNAi molecule of this embodiment is a double-stranded molecule (FIG. 6A)
  • the RNAi antisense strand region is contained in the other polynucleotide strand different from the polynucleotide strand containing the RNAi sense strand region.
  • FIG. 6B double-stranded molecule it is contained in the reverse direction in the same polynucleotide chain as the RNAi sense strand region.
  • RNAi molecule of this embodiment is characterized by having an ASP score value of 0.4 or more.
  • ASP score Allele-SPecificity score
  • ASP score value is a quantification of allele discrimination ability, which is an important element in ASP-RNAi, and further suppresses non-specific expression of RNAi molecules against normal genes. It can also be considered that the effect of RNAi molecules, that is, the side effects of RNAi molecules on normal genes are quantified.
  • the ASP score value is derived by the following formula.
  • ASP score [(Relative ratio of normalized expression level of normal gene treated with RNAi molecule to standardized expression level of normal gene treated with control RNAi molecule) ⁇ (Standardization of mutant gene treated with control RNAi molecule) Relative ratio of the standardized expression level of the mutant gene treated with the RNAi molecule to the expressed level]] ⁇ (1-standardization of the mutant gene treated with the RNAi molecule relative to the standardized expression level of the mutant gene treated with the control RNAi molecule Relative ratio of expression level)
  • the control RNAi molecule is an RNAi molecule that is a negative control of the siRNA molecule that is the active ingredient of the present embodiment, and is an RNAi molecule that does not affect the expression of the normal gene and the mutant gene.
  • the expression level of the normalized gene treated with the control RNAi molecule is considered as 100%.
  • an RNAi molecule containing an arbitrary base sequence that does not have a target gene is applicable.
  • the relative ratio of the expression level after standardization exceeds “1.0”, it is considered that there is no expression suppression effect, and the relative ratio is calculated as “1.0”.
  • the ASP score can reflect both “specificity” and “suppression effect” for mutant genes. For example, if an RNAi molecule has a low ASP score, even if the RNAi molecule can strongly suppress the expression of the mutant gene, it also strongly suppresses the expression of the wild-type gene at the same time because of its low specificity. Meaning that there are strong side effects on wild-type genes. If the ASP score value is 0.4 or more, the RNAi molecule functions as ASP-RNAi because it suppresses the expression of the mutated gene and has no or a relatively weak effect on the wild-type gene. obtain.
  • any method known in the art may be used as long as each expression level is measured by the same method. Not limited. Standardization may be performed based on the expression level of an internal or exogenous control gene that is not subject to expression suppression by RNAi molecules. Preferably, using a reporter gene expression plasmid developed by Ohnishi Y. et al. (2006, Journal of RNAi and Gene Silencing, Vol.
  • Example 2 Based on the expression of a reporter gene such as Renilla luciferase and the expression of a ⁇ -galactosidase gene that is not subject to expression suppression by RNAi molecules as a control, the expression levels of the wild type gene and the mutant gene are measured.
  • a reporter gene such as Renilla luciferase
  • a ⁇ -galactosidase gene that is not subject to expression suppression by RNAi molecules
  • RNAi molecules contained in the inhibitor of this embodiment is a double-stranded molecule such as siRNA, as shown in FIG. 6A
  • the RNAi sense strand region (0601), RNAi antisense, which is a common component of the RNAi molecule is used.
  • it may optionally further comprise a 3 ′ terminal added base (0606) at the 3 ′ end of each polypeptide chain.
  • the “3 ′ terminal addition base” (0606) is composed of two bases of TT (thymine-thymine) or UU (uracil-uracil).
  • RNAi molecules to which this base has been added can increase RNAi suppression efficiency (Tuschl T et al., 1999, Genes Dev, 13 (24): 3191-7).
  • RNAi molecule contained in the inhibitor of this embodiment is a single-stranded molecule such as shRNA, as shown in FIG. 6B, the RNAi sense strand region (0601), which is a common component of the RNAi molecule, and RNAi antisense In addition to the strand region (0602) and the discontinuous junction (0603), a short spacer sequence (0608) linking the RNAi sense strand region (0601) and the opposite RNAi antisense strand region (0602). including.
  • the spacer sequence can be any base sequence usually comprising 3 to 24 bases, preferably 4 to 15 bases.
  • the whole molecule consists of 35 bases (16 ⁇ 2 + 3) to 84 bases (30 ⁇ 2 + 24).
  • the RNAi sense strand region and the RNAi antisense strand region are base paired with each other, and the spacer sequence located between them forms a loop structure, so that the entire molecule can have a hairpin-type stem-loop structure. .
  • RNAi molecule having the above structure When a single-stranded RNAi molecule having the above structure is introduced into a cell, it is processed into a double-stranded siRNA by the action of an endonuclease called Dicer in the cytoplasm, of which the RNAi antisense strand region is RNA-induced silencing. complex) and then incorporated into the complex, the post-transcriptional pre-translational expression of the target gene can be suppressed by the RNAi mechanism similar to the double-stranded RNAi molecule described above.
  • RNAi sense strand region (0601) and RNAi antisense strand region (0602) in a single-stranded molecule may contain a 3 'terminal added base at the 3' end of each region, as in the case of the double-stranded RNAi molecule. it can. Arbitrary sequences can be added to the 5 ′ end and / or the 3 ′ end of the single-stranded molecule. For example, a base sequence capable of forming a stem loop structure can be added to the 5 ′ end and / or the 3 ′ end.
  • an “expression vector” is an active ingredient contained in the inhibitor of the present embodiment, and is inserted into an expression vector so that the DNA encoding the RNAi molecule can be expressed. It is a vector.
  • RNAi molecule when the RNAi molecule is a double-stranded molecule such as siRNA, DNA fragments encoding each of the RNAi sense strand region and the RNAi antisense strand region are inserted into two different expression vectors. It may also be inserted as a DNA fragment whose expression is independently controlled in one expression vector.
  • RNAi molecule when the RNAi molecule is a single-stranded molecule such as shRNA, a DNA fragment encoding the single-stranded RNA molecule may be inserted at a predetermined position in the expression vector.
  • the “expression vector” refers to the backbone part of the expression vector of this embodiment, that is, the part other than the DNA fragment encoding the RNAi molecule of Embodiment 1 in the expression vector of this embodiment.
  • the type of expression vector is not particularly limited, but a plasmid or virus is preferred. These may be appropriately selected according to the host to be introduced. For example, when the host to be introduced is a human, a known expression vector such as a virus based on adenovirus, retrovirus, lentivirus, Sendai virus, adeno-associated virus, or non-viral vector is used. be able to.
  • plasmids such as pBI or pRI binary vectors, cauliflower mosaic virus (CaMV), kidney bean golden mosaic virus (BGMV), and tobacco mosaic virus (TMV). can do.
  • CaMV cauliflower mosaic virus
  • BGMV kidney bean golden mosaic virus
  • TMV tobacco mosaic virus
  • plasmids such as pBI, pPZP, pSMA, pUC, pBR, and pBluescript (Stratagene) can be used.
  • various expression vectors for various hosts that are commercially available from various life science manufacturers may be used.
  • the expression vector may include a regulatory region such as a promoter, enhancer, or terminator, or a labeling region such as a selectable marker gene. Each type is not particularly limited. What is known in the art may be appropriately selected according to the host into which the expression vector is introduced.
  • promoters operable in E. coli include lac, trp or tac promoters or phage-derived T7, T3, SP6, PR or PL promoters.
  • promoters operable in yeast include promoters derived from yeast glycolytic genes, alcohol dehydrogenase gene promoters, TPI1, and ADH2-4c promoters.
  • promoters operable in plant cells include cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter, nopaline synthase gene promoter (Pnos), corn-derived ubiquitin promoter, rice-derived actin promoter, tobacco-derived PR protein promoter, and the like. Can be mentioned.
  • promoters operable in insect cells include polyhedrin promoter, P10 promoter, autographa calicornica polyhedrossis basic protein promoter, baculovirus immediate early gene 1 promoter, baculovirus 39K delayed early gene promoter, etc. Can be mentioned.
  • a promoter operable in animal cells such as humans an RNA polymerase II (Pol II) promoter and an RNA polymerase III (Pol III) promoter are preferably used.
  • Pol III promoters are preferable, and promoters such as U6 and H1 are particularly preferable.
  • a site-specific promoter that induces expression only at a specific site in the living body can also be used.
  • the promoters are the same so that each RNA strand is expressed in the same amount. It is preferable to use a promoter or a different promoter having the same level of expression activity.
  • the present design method includes a reference base setting step (0701), a 3 ′ terminal base setting step (0702), an RNAi sense strand region setting step (0703), and an RNAi antisense strand region setting step (0704). )including.
  • a reference base setting step (0701)
  • a 3 ′ terminal base setting step (0702)
  • an RNAi sense strand region setting step (0703)
  • an RNAi antisense strand region setting step (0704).
  • the “reference base setting step” (0701) means that the 5 ′ and 3 ′ bases adjacent to the discontinuous junction on the transcript in the target dominant mutant gene are the first and second reference bases, respectively. It is the process of setting as. When there are two or more discontinuous junctions in the transcript of the dominant mutant gene, one of the discontinuous junctions is selected. In that case, the 5'-side and 3'-side bases adjacent to the selected discontinuous junction are the first and second reference bases, respectively.
  • the “3 ′ terminal base setting step” (0702) is the 4th to 15th base, preferably the 4th to 14th base, or the 4th to 13th base from the base corresponding to the second reference base toward the downstream side. Is a step of setting so as to correspond to the 3 ′ terminal base of the RNAi sense strand region.
  • RNAi sense strand region setting step is a step of setting 16 to 30 bases including the first and second reference bases as RNAi sense strand regions in the base sequence of the transcription product of the dominant mutant gene. is there. Since the 3 ′ terminal base is determined by the 3 ′ terminal base setting step, the first of the bases of the transcription product is counted upstream from the base corresponding to the 3 ′ terminal base. In addition, 16 to 30 bases may be set as the RNAi sense strand region so as to include the second reference base. This process determines the target region for the dominant mutant gene of the RNAi molecule.
  • RNAi antisense strand region setting step is a step of setting a base sequence containing a base sequence complementary to the base sequence of the set RNAi sense strand region as the RNAi antisense strand region.
  • RNAi molecule contained in the inhibitor of the present embodiment (for example, a single-stranded RNAi molecule, a double-stranded RNAi molecule, or a circular RNAi molecule).
  • a 3 'end addition step is characterized by adding TT (thymine-thymine) or UU (uracil-uracil) to each 3 ′ end of the RNAi sense strand region and the RNAi antisense strand region designed above. To do. Since this step is an optional step, it may be added as necessary.
  • the “spacer linking step” is a unique and essential step for single-stranded RNAi molecules or circular RNAi molecules. This step is performed at the 3 ′ end of the RNAi sense strand region designed above (if the RNAi sense strand region has undergone a 3 ′ end addition step prior to this step, it is added to the 3 ′ end of the RNAi sense strand region. TT or UU 3 ′ end) and the 5 ′ end of the RNAi antisense strand region (ie, in the opposite direction to the RNAi sense strand region), respectively, are linked to the 3 ′ end and 5 ′ end of the spacer sequence, respectively. This is a step of making a double-stranded molecule or a circular RNAi molecule.
  • the spacer sequence may be any base sequence consisting of 3 to 24 bases, preferably 4 to 15 bases. Preferably, the base sequence does not form base pairing in the spacer sequence.
  • the “ASP score selection step” is a step of selecting only RNAi molecules having an ASP score value of 0.4 or more from the RNAi molecules prepared by the above steps.
  • the ASP score may be calculated from the above formula.
  • the RNAi molecule of this embodiment can be synthesized by a chemical synthesis method based on the base sequence designed by the aforementioned method.
  • each life science manufacturer for example, Sigma-Aldrich, Bex, Takara Bio, Invitrogen, etc.
  • the RNAi molecule of the present embodiment is obtained by converting the nucleotide sequence designed by the above method into a DNA sequence, cloning a chemically synthesized DNA based on the sequence, and then in vitro known in the art.
  • RNA can be prepared by RNA transcription. For example, Sambrook, J. et.
  • a method for preparing an expression vector contained in the inhibitor of the present embodiment is basically a method known in the art, for example, Sambrook, J. et. Al., (1989) Molecular Cloning: a It can be prepared according to the method described in Laboratory Manual Second Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.
  • the base sequence of the RNAi molecule is determined according to the method described in the above section “1-5. Design and production of RNAi molecule”. Subsequently, based on the corresponding DNA sequence, sense strand DNA and antisense strand DNA are respectively synthesized by a chemical synthesis method or the like. At this time, it is preferable that an appropriate restriction site is added to both ends of each chain, or an appropriate cohesive end is formed after annealing of each chain. As for DNA synthesis, manufacturers of life science related companies offer contract synthesis services, which can also be used. After synthesis, both strands are mixed and annealed to prepare a double-stranded DNA fragment.
  • a restriction site is added to the end, it is cleaved with the restriction enzyme as necessary. Further, the 5 'end of each chain is phosphorylated with T4 polynucleotide kinase or the like as necessary. Subsequently, the prepared double-stranded DNA fragment is ligated to the corresponding restriction site downstream of the promoter of the expression vector.
  • the DNA fragment may be once ligated to an appropriate cloning vector and cloned, and then the DNA fragment may be ligated to an expression vector.
  • TT is inserted in advance at each 3' end of the RNAi sense strand region and the RNAi antisense strand region. Since this step is an optional step, it may be added as necessary.
  • Mutant EGFR gene expression inhibitor As an example of the dominant mutant gene expression inhibitor of this embodiment, an RNAi molecule (EGFR-RNAi molecule) that specifically suppresses the expression of the mutant EGFR (epidermal growth factor receptor) gene is effective.
  • a mutant EGFR gene expression inhibitor used as a component may be mentioned.
  • the mutated EGFR gene referred to here is a dominant mutated gene that is acquired and is a gene that causes non-small cell lung cancer (NSCLC).
  • NSCLC non-small cell lung cancer
  • a ligand such as epidermal growth factor (EGF) binds to the extracellular domain of EGFR, it usually activates the tyrosine kinase in the intracellular domain and activates autophosphorylation.
  • EGF epidermal growth factor
  • substitution, deletion, or insertion occurs in a specific base of the EGFR gene, and it is thought that it occurs when the downstream intracellular signal transduction pathway is constitutively activated. (Paez GJ et al., Science, 2004, 304; 1497-1500).
  • the mutant EGFR gene expression inhibitor of the present embodiment can specifically suppress gene expression based on mutations such as deletion and insertion other than substitution in such mutant EGFR gene.
  • mutant EGFR gene expression inhibitor of the present embodiment include a part of the human EGFR gene as shown in FIGS. 8-1, 9-1, 10-1, and 11-1.
  • EGFR-RNAi for each of the del (E746-A750) and del (L747-T751) -L747S mutations with deleted bases, and the del (L747-E749) -A750P mutation with deleted and inserted partial bases Examples include mutant EGFR gene expression inhibitors containing molecules as active ingredients.
  • the del (L747-E749) -A750P mutation as will be described later, even if the encoded amino acid sequence is the same, the difference in G and A between the bases due to the deletion and insertion of the base sequence is different.
  • del (L747-E749) -A750P mutation when it is necessary to distinguish the difference between these mutations, the mutation having G is hereinafter referred to as del (L747-E749) -A750P ( G) mutation (FIG. 10-1A), and mutation with A is del (L747-E749) -A750P (A) mutation (FIG. 11-1A).
  • the sense strand region has SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 , 19 or 21 single stranded or double stranded RNAi molecule, or an expression vector operably linked to DNA encoding the RNAi molecule.
  • the sense strand region is represented by SEQ ID NO: 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47 or 49.
  • the sense strand region is a single strand or a double strand represented by SEQ ID NO: 53, 55, 59, 61, 63, 65 or 67.
  • the sense strand region is represented by SEQ ID NO: 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143 or 145.
  • An expression vector in which a single-stranded or double-stranded RNAi molecule or a DNA encoding the RNAi molecule is operably linked.
  • BCR-ABL chimeric gene expression inhibitor As an example of the dominant mutant gene expression inhibitor of this embodiment, an RNAi molecule (BCR-) that specifically suppresses the expression of a BCR-ABL chimeric gene caused by a translocation mutation in the Philadelphia chromosome.
  • the BCR-ABL chimera gene here is an acquired dominant mutation gene, which is regarded as a causative gene of chronic myeloid leukemia (CML) or acute lymphocytic leukemia (ALL).
  • CML chronic myeloid leukemia
  • ALL acute lymphocytic leukemia
  • the Philadelphia chromosome (Ph chromosome) is found in more than 90% of cases of chronic myelogenous leukemia (CML) and about 20% of acute lymphocytic leukemia (ALL). It is a tumor-specific chromosome with a translocated structure. As a result of this translocation, the ABL gene located on the long arm of chromosome 9 (9q34) and the BCR gene located on the long arm of chromosome 22 (22q11) reciprocally translocate to form a BCR-ABL chimeric gene. A p210 or p190 protein with enhanced tyrosine kinase activity is produced.
  • the BCR-ABL chimeric gene expression inhibitor of this embodiment can specifically suppress the expression of such a BCR-ABL chimeric gene.
  • a BCR-ABL-RNAi molecule for the BCR-ABL chimeric gene is used as an active ingredient.
  • a BCR-ABL chimeric gene expression inhibitor More specifically, for example, the sense strand region is a single-stranded or double-stranded RNAi molecule represented by SEQ ID NO: 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111 or 113, or an RNAi molecule thereof Is an expression vector operably linked to DNA encoding.
  • the RNAi molecule as an active ingredient selectively and efficiently suppresses the expression of the target gene with little effect on the expression of the non-target gene. can do.
  • the inhibitor of the present embodiment when an RNAi molecule is used as an active ingredient when introduced into a cell, the RNAi molecule is left as it is, and when an expression vector is used as an active ingredient, the expression vector is added to the expression vector. After the RNAi molecule encoded by the contained DNA is expressed, it can act on the target dominant mutant gene and suppress its expression by the RNAi silencing mechanism. Therefore, when the inhibitor contains RNAi molecules, the administered effect can be imparted to the administered cells in a relatively short time. On the other hand, when the inhibitor contains an expression vector, the above effect can be continuously imparted as long as the expression vector is maintained in the cell after administration. Therefore, the combined use of these can effectively suppress the expression of the dominant mutant gene.
  • composition The second embodiment of the present invention is a pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition of the present invention contains the dominant mutant gene expression inhibitor of Embodiment 1 as an active ingredient.
  • the dominant mutant gene expression inhibitor may contain an RNAi molecule for the target dominant mutant gene or an expression vector operably linked to the DNA encoding the RNAi molecule, or target the same gene. And / or an expression vector in which DNAs encoding one or more different RNAi molecules and / or one or more different RNAi molecules are operably linked.
  • the active ingredient of the pharmaceutical composition of the present embodiment is a mutant EGFR gene expression inhibitor, and the inhibitor contains two or more different EGFR-RNAi molecules
  • the del (E746-A750) mutation EGFR-RNAi molecule targeting the gene for example, the sense strand region comprises a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 or 21
  • del (L747- EGFR-RNAi molecule targeting the T751) -L747S mutant gene for example, the nucleotide sequence of which the sense strand region is represented by SEQ ID NO: 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47 or 49
  • EGFR-RNAi molecule targeting the del (L747-E749) -A750P (G) mutant gene for example, the base whose sense strand region is represented by SEQ ID NO: 53, 55, 59, 61, 63, 65 or 67
  • a mutant EGFR gene expression inhibitor is an EGFR-RNAi molecule and an EGFR-RNAi molecule expression vector (for example, operably linked DNA encoding the EGFR-RNAi molecule and / or a different EGFR-RNAi molecule) ) Can also be included.
  • the pharmaceutical composition of the embodiment has other active ingredients within a pharmaceutically acceptable range and within a range in which the RNAi molecule and / or expression vector in the dominant mutant gene expression inhibitor of the first embodiment is not inactivated. So-called composite preparations that can contain
  • the other active ingredients mentioned here target the same gene as the dominant mutant gene expression inhibitor of the first embodiment, but have an RNAi molecule having a configuration different from that of the active ingredient of the first embodiment and / or its RNAi.
  • An expression inhibitor comprising an expression vector operably linked to DNA encoding a molecule can be used.
  • an EGFR-RNAi molecule having the configuration described in Embodiment 1 and / or an expression vector in which DNA encoding the RNAi molecule is operably linked is included.
  • the sense strand region includes an RNAi molecule represented by SEQ ID NO: 83 or 85 and / or an expression vector operably linked to the DNA encoding the RNAi molecule.
  • the dominant allele expression inhibitor is mentioned.
  • a dominant mutant gene expression inhibitor different from the above-described dominant allele expression inhibitor, wherein the sense strand region described in Example 4 to be described later is an RNAi molecule represented by SEQ ID NO: 89 and / or its RNAi molecule
  • An inhibitor containing an expression vector operably linked to the encoding DNA as an active ingredient can also be contained.
  • Such a combined preparation using as an active ingredient an inhibitor that suppresses the expression of a gene based on each mutation targeting different mutation sites of the same gene is useful when the mutation site of the target gene is not clear. Since the RNAi molecule, which is an active ingredient of the inhibitor, has high specificity for the target mutation gene, side effects that suppress the expression of other genes even when mixed and RNAi molecules and / or expression vectors are inactivated. It has the advantage that there is almost no possibility.
  • the other active ingredient may be a drug having a pharmacological action different from that of the dominant mutant gene expression inhibitor of the first embodiment.
  • antibiotics etc. are mentioned.
  • the pharmaceutical composition of the present invention contains an RNAi molecule as an active ingredient and / or a medium for an expression vector.
  • the medium includes, for example, solvents such as water, ethanol, propylene glycol, ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxylated isostearyl alcohol and polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters.
  • solvents such as water, ethanol, propylene glycol, ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxylated isostearyl alcohol and polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters.
  • Such a medium is desirably sterilized and is preferably adjusted to be isotonic with blood as necessary.
  • the content of the RNAi molecule and / or expression vector as an active ingredient in the pharmaceutical composition is the type of the causative gene of the disease to be treated, the onset action mechanism of the gene, the RNAi molecule
  • the effect varies depending on various conditions such as the action effect and stability, the expression level of the expression vector, the dosage form of the pharmaceutical composition, the type of carrier used, the administration method, the condition of the subject to be administered and the like. These may be appropriately selected based on known techniques in the field.
  • Specific examples of the content of the RNAi molecule or the expression vector of the present invention are as follows.
  • nucleic acid When administered by injection to a human adult male (body weight 60 kg) that does not require the use of other pharmaceuticals, It may be contained at 0.01% (w / v) to about 20% (w / v), preferably about 0.1% (w / v) to about 10% (w / v). Specifically, for example, 1 ⁇ g to 200 ⁇ g of siRNA is usually contained in 1 mL injection at a time.
  • the nucleic acid can be divided into several times to reduce the burden on the subject.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can further contain a pharmaceutically acceptable carrier as necessary.
  • a pharmaceutically acceptable carrier refers to an additive usually used in the field of pharmaceutical technology.
  • an excipient, a binder, a disintegrant, a filler, an emulsifier, a fluid addition regulator, a lubricant and the like can be mentioned.
  • Excipients include sugars such as monosaccharides, disaccharides, cyclodextrins and polysaccharides (more specifically, but not limited to glucose, sucrose, lactose, raffinose, mannitol, sorbitol, inositol, dextrin, malto Dextrin, starch and cellulose), metal salts (eg sodium chloride, sodium phosphate or calcium phosphate, calcium sulfate, magnesium sulfate, calcium carbonate), citric acid, tartaric acid, glycine, low, medium and high molecular weight polyethylene glycols ( PEG), pluronic, kaolin, silicic acid, or combinations thereof.
  • sugars such as monosaccharides, disaccharides, cyclodextrins and polysaccharides (more specifically, but not limited to glucose, sucrose, lactose, raffinose, mannitol, sorbitol, inos
  • binders include starch paste using corn, wheat, rice, or potato starch, simple syrup, glucose solution, gelatin, tragacanth, methylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, shellac and / or polyvinylpyrrolidone. As mentioned.
  • Disintegrants include the starch, lactose, carboxymethyl starch, cross-linked polyvinyl pyrrolidone, agar, laminaran powder, sodium bicarbonate, calcium carbonate, alginic acid or sodium alginate, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, sodium lauryl sulfate, stearic acid monoglyceride Or their salts are mentioned as examples.
  • the filler examples include the sugar and / or calcium phosphate (for example, tricalcium phosphate or calcium hydrogen phosphate).
  • emulsifiers examples include sorbitan fatty acid esters, glycerin fatty acid esters, sucrose fatty acid esters, and propylene glycol fatty acid esters.
  • Examples of the flow addition regulator and lubricant include silicate, talc, stearate or polyethylene glycol.
  • Such a carrier mainly facilitates the formation of the dosage form and maintains the dosage form and drug effect.
  • the RNAi molecule which is an active ingredient of the dominant mutant gene expression inhibitor, is subject to degradation by nucleolytic enzymes in vivo. It is used to make it difficult, and may be used as needed.
  • flavoring agents, solubilizers, suspending agents, diluents, surfactants, stabilizers, absorption promoters, extenders, moisturizers, humectants, adsorbents, if necessary Disintegration inhibitors, coating agents, coloring agents, preservatives, antioxidants, fragrances, flavoring agents, sweetening agents, buffering agents and the like can also be included.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can also contain other drugs as long as the pharmacological effect of the RNAi molecule is not lost.
  • a predetermined amount of antibiotics may be contained.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition of the present embodiment is not particularly limited as long as it does not inactivate RNAi molecules or expression vectors, which are active ingredients in the inhibitor, and other additional active ingredients. Since RNA is generally unstable, a dosage form that is difficult to degrade in vivo when an RNAi molecule is administered is preferred. For example, any of liquid, solid, or semi-solid may be sufficient. Specific dosage forms include, for example, parenteral dosage forms such as injections, suspensions, emulsions, eye drops, nasal drops, creams, ointments, plasters, shipping agents and suppositories, or liquids and powders. Oral dosage forms such as granules, tablets, capsules, sublinguals, lozenges and the like. In the case of the pharmaceutical composition of this embodiment containing an inhibitor comprising an RNAi molecule or an expression vector as an active ingredient, the dosage form is preferably an injection.
  • the pharmaceutical composition of the present embodiment or the dominant mutant gene expression inhibitor of the first embodiment is applied to nanoparticles (for example, target nanoparticle transmission described in Davis ME, et al., Nature, 2010, 464: 1067-1070).
  • nanoparticles for example, target nanoparticle transmission described in Davis ME, et al., Nature, 2010, 464: 1067-1070.
  • liposomes eg, membrane-permeable peptide-bound liposomes, including SNALPs
  • cholesterol conjugates eg, cholesterol conjugates.
  • the RNAi transmission system described in Castanotto D. & Rossi JJ., Nature, 2009, 457, 426-433 can also be used.
  • the pharmaceutical composition of the present embodiment can be administered to a living body in a pharmaceutically effective amount for the treatment of the target disease.
  • the living body to be administered is a vertebrate, preferably a mammal, more preferably a human.
  • the “pharmaceutically effective amount” means that the RNAi molecule and / or expression vector, which is an active ingredient of the inhibitor contained in the pharmaceutical composition of the present invention, treats the target disease or reduces the symptoms.
  • Necessary dose specifically, a dose capable of suppressing the expression of the dominant mutation gene causing the disease
  • harmful side effects to the administered organism eg, wild type gene
  • the specific amount varies depending on the type of the target gene, the phenotypic effect of the dominant mutant gene, the dosage form to be used, information on the subject (subject in the case of a human) and the administration route.
  • the pharmaceutically effective amount range and suitable route of administration is generally based on data obtained from cell culture assays and animal studies.
  • the final dose is determined and adjusted according to the judgment of the doctor according to the individual subject.
  • the information of the subject to be considered includes the degree or severity of the disease, the general health condition, age, weight, sex, diet, drug sensitivity, resistance to treatment, and the like.
  • the RNAi molecule of the present invention may be administered systemically or locally. It can select suitably according to the kind of disease, onset location, or a progression degree. If the onset site is a local disease, local administration directly administered to and around the onset site by injection or the like is preferable. This is because a sufficient amount of the RNAi molecule of the present invention can be administered to a site (tissue or organ) to be treated and it is difficult to affect other tissues. On the other hand, when the treatment site cannot be specified as in metastatic cancer or when the onset is a systemic disease, systemic administration by intravenous injection or the like is preferable, although there is no limitation. This is because by spreading the RNAi molecule of the present invention throughout the body through the bloodstream, it can be administered even to a lesion that cannot be detected by diagnosis.
  • RNAi molecule of the present invention can be administered by any suitable method that does not deactivate the active ingredient contained therein.
  • it may be parenteral (for example, injection, aerosol, application, eye drop, nose drop) or oral.
  • parenteral for example, injection, aerosol, application, eye drop, nose drop
  • oral Preferably, it is an injection.
  • the injection site is not particularly limited. Any site may be used as long as the RNAi molecule produced from the RNAi molecule of the present invention or the expression vector exhibits its function with respect to the target molecule and can achieve the purpose of the pharmaceutical composition. Examples include intravenous, intraarterial, intrahepatic, intramuscular, intraarticular, intramedullary, intrathecal, intraventricular, percutaneous, subcutaneous, intradermal, intraperitoneal, intranasal, intestinal, or sublingual. . Intravenous injection such as intravenous injection or intraarterial injection is preferable. This is because the pharmaceutical composition of the present invention can be distributed throughout the body through the blood stream as described above, and is less invasive. For example, RNAi molecules may be administered systemically by intravascular injection using the aforementioned target nanoparticle delivery system of Davis et al.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is used for the treatment of diseases.
  • a disease caused by the expression of a dominant mutant gene such as an autosomal dominant genetic disease
  • the wild-type gene encoding a gene protein that selectively suppresses the expression of the mutant gene and simultaneously has a normal function. Since the phenotype of the type gene can be revealed, it can be used for improvement of varieties of animals and plants, in addition to the treatment of genetic diseases and cancer that have been difficult to treat. Therefore, the disease targeted by the pharmaceutical composition of the present embodiment is a disease based on the dominant trait of the dominant mutant gene targeted by the RNAi molecule contained in the inhibitor or the RNAi molecule expressed from the expression vector.
  • the pharmaceutical composition of the present embodiment can be used in various ways by using, as an active ingredient, an RNAi molecule for a dominant mutation gene that is a causative gene or an expression vector containing a DNA encoding the gene depending on the disease to be treated. Applicable to various diseases.
  • EGFR-siRNA Designed siRNA (EGFR-siRNA) that specifically suppresses the expression of mutant EGFR (epidermal growth factor receptor) gene, and suppresses the expression of mutant gene (cancer-causing gene), namely ASP-RNAi (allele-specific gene) Silencing: Allele-specific RNAi) effect was verified.
  • EGFR-siRNA Designed siRNA (EGFR-siRNA) that specifically suppresses the expression of mutant EGFR (epidermal growth factor receptor) gene, and suppresses the expression of mutant gene (cancer-causing gene), namely ASP-RNAi (allele-specific gene) Silencing: Allele-specific RNAi) effect was verified.
  • the gain-of-function mutant EGFR gene is a causative gene of non-small cell lung cancer (NSCLC). Therefore, if the EGFR-siRNA of the present invention has an ASP-RNAi effect that specifically suppresses only the expression of such a gain-of-function mutant EGFR gene, effective treatment for non-small cell lung cancer Can be an agent.
  • NSCLC non-small cell lung cancer
  • mutant EGFR gene In non-small cell lung cancer patients, various mutations (gain-of-function mutations) related to the disease have been found in the EGFR gene (Accession No. NM_005228). For example, as shown in FIG. 8-1A, a “del (E746-A750) mutation” in which the nucleotide sequence from 2235th to 2249th (start codon A is the first, the same applies hereinafter) deleted (the gene Along with the deletion mutation, a mutant protein in which the alanine from the 746th glutamic acid to the 750th is deleted when the starting methionine is the first is generated), from 2240th to 2251st as shown in FIG.
  • a “del (E746-A750) mutation” in which the nucleotide sequence from 2235th to 2249th (start codon A is the first, the same applies hereinafter) deleted (the gene Along with the deletion mutation, a mutant protein in which the alanine from the 746th gluta
  • A750P (G) mutation (with the deletion / insertion mutation of the gene, The glutamic acid from syn to 749th is deleted, resulting in a mutant protein in which the 750th alanine is replaced with proline), and the base corresponding to the start codon A to 2238 as shown in FIG. 11-1A,
  • the third base of the codon encoding E746 (GAG) is not "G” (Pao et al., 2005, PloS Medicine, Vol. 2, Issue 3: e73) but “A” (Paez et al., 2004, Science, vol. 304, 1497-1500) and “del (L747-E749) -A750P (A) mutation”.
  • point mutations are also included.
  • the transcript of the del (E746-A750) mutant gene has two discontinuous junctions and only one base (in the case of L747-E749) -A750P (A)) or two bases (L747- E749) -A750P (G)).
  • the bases on the 5 ′ side and the 3 ′ side adjacent to the discontinuous junction located formally on the 3 ′ side are used as the first and second reference bases, respectively.
  • the number of bases from the base corresponding to the second reference base to the 3 ′ end was shifted one by one to set the 3 ′ end base of the RNAi sense strand region (3 ′ end base setting step).
  • a base sequence containing 19 consecutive bases including the first and second reference bases of the transcript was set as an RNAi sense strand region (RNAi sense strand region setting step).
  • a base sequence containing a base sequence complementary to the base sequence of the set RNAi sense strand region was defined as an RNAi antisense strand region (RNAi antisense strand region setting step).
  • Table 1 shows the del (E746-A750) mutant gene
  • Table 2 shows the del (L747-T751) -L747S mutant gene
  • Table 3 shows the del (L747-E749) -A750P (G) mutation.
  • Table 4 shows the nucleotide sequences of the sense strand region (ss) and antisense strand region (as) of siRNA designed for the del (L747-E749) -A750P (A) mutant gene, respectively.
  • the base sequences shown in each table exclude the 3 'terminal added base consisting of UU at the 3' end of the sense strand region and the antisense strand region.
  • corresponds to the number of a sequence table.
  • RNAi sense strand region is an siRNA consisting of 19 bases. That is, in “si746 / 50” of “si746 / 50-3D19”, “si” is siRNA, “746/50” is del (E746-A750) mutation 746 to 750, and “3D19” “D” is a deletion mutation, “3” is 3 bases from the second reference base to the 3 ′ end, and “19” is 19 bases in the RNAi sense strand region.
  • siRNA name for the del (L747-E749) -A750P (A) mutant gene shown in Table 4 is distinguished from the siRNA for the del (L747-E749) -A750P (G) mutant gene shown in Table 3.
  • “del (L747-E749) -A750P (G) mutation is added to“ si747 / 49-3D19 ”by adding“ (A) ”like“ si747 / 49 (A) -3D19 ”. Differentiated from siRNA for genes.
  • ⁇ in the sense strand region (ss) in each table indicates a discontinuous junction
  • ⁇ in the antisense strand region (as) corresponds to a discontinuous junction in the sense strand region. Indicates the position to perform.
  • the underlined base indicates the second reference base.
  • the inserted base (2 bases) in the del (L747-E749) -A750P (G) mutation is shown in bold.
  • each siRNA was outsourced to Sigma-Aldrich.
  • the synthesized siRNA was subjected to annealing treatment of the sense strand region and the antisense strand region, which was directly used for the experiment.
  • reporter gene expression plasmid For selection of evaluation of RNAi effect of EGFR-siRNA prepared in (1) above, pGL3-TK (Ohnishi Y., et al.) Expressing the firefly luciferase gene al., 2006, Journal of RNAi and Gene Silencing, Vol. 2: 154-160) and the phRL-TK plasmid (Promega) expressing Renilla luciferase gene to target siRNA Construction of reporter gene expression plasmids of dominant mutant gene and non-targeted wild type gene was performed.
  • the design of the synthetic oligo DNA including the mutation site, insertion into the reporter gene expression plasmid, and selection method were in accordance with Ohnishi Y., et al., 2008, PloS One, Vol. 3, Issue 5: e2248. Specifically, deletion or deletion of each gene of del (E746-A750), del (L747-T751) -L747S, or del (L747-E749) -A750P in the pathogenesis of non-small cell lung cancer Oligo DNA sense strand regions and antisense strand regions each containing an insertion mutation site were synthesized (consigned to Sigma-Aldrich).
  • the linker sequence is underlined, the discontinuous junction in the EGFR gene is “ ⁇ ”, the second reference base in the sense strand region (ss) of each table is black and white inverted characters, and in Table 5, del (L747 The insertion base (2 bases) in the -E749) -A750P (G) mutant gene and the insertion base (1 base) in the del (L747-E749) -A750P (A) mutant gene are shown in bold in Table 6.
  • EGFR (T790T) and EGFR (T790M) are synthetic oligo DNAs for point mutation of EGFR, and a base expressed in lower case indicates a point mutation site.
  • annealing treatment of each synthesized strand oligo DNA was performed. Specifically, single strand oligo DNA (final concentration: 1 ⁇ M each), 10 ⁇ annealing buffer (Invitrogen, final concentration: 1 ⁇ ) and a sense strand region and an antisense strand region so that the final volume is 10 ⁇ L Sterile water was mixed, heat-treated at 80 ° C. for 5 minutes, and then allowed to stand at room temperature for 30 minutes to form double strands.
  • the double-stranded oligo DNA was inserted into the two kinds of plasmids treated with restriction enzymes.
  • the normal allele is the pGL3-TK plasmid
  • the dominant mutant gene is the reporter gene in the phRL-TK plasmid.
  • the wild type EGFR reporter gene expression plasmid and the dominant mutant EGFR reporter gene expression plasmid were constructed by inserting into the 3 ′ untranslated region (3′UTR).
  • reporter gene expression plasmids in which the reporter gene was replaced with normal and dominant mutant genes were constructed in the same manner.
  • HeLa cells were dispersed by trypsin digestion, adjusted to a cell density of 1 ⁇ 10 5 cells / cm 2 and seeded in a 96-well culture plate, and the HeLa cells contained no antibiotics. Culturing was performed with the DMEM culture medium.
  • plasmids After 24 hours, three types of plasmids were used: (a) pGL3-TK backbone plasmid (60 ng / well) which is a wild type EGFR reporter gene expression plasmid, (b) phRL which is a reporter gene expression plasmid of each mutant EGFR gene -TK backbone plasmid (20 ng / well) and (c) pSV- ⁇ -galactosidase control plasmid (Promega) (10 ng / well) which is a ⁇ -galactosidase gene expression plasmid not subject to RNAi expression suppression as an exogenous control
  • pG-siRNAs final concentration 20 nM
  • siRNA that does not induce RNAi at a final concentration of 20 nM (siControl; QIAGEN) was used.
  • Lipofectamine 2000 (Invitrogen) was used for introduction of these nucleic acids. The transfection method followed the attached protocol. 24 hours after introduction of the nucleic acid, prepare a cell extract using the (Dual-Luciferase reporter assay system) cell lysis buffer attached to the Dual-Luciferase reporter assay system (Promega) kit.
  • each of the expressed reporter genes (and two luciferases) and the control ⁇ -galactosidase was measured using a Dual-Luciferase reporter assay system (Promega) and a Beta-Glo assay system (Promega), respectively. Fusion Universal Microplate Analyzer (Perkin Elmer) was used for the measurement. Furthermore, regarding the reporter, in order to eliminate the possibility of measurement differences due to differences in the activity of the two luciferases used, each mutant gene del (E746-A750), del (L747-T751) -L747S, del (L747-E749) -An experiment was also conducted in which the reporter gene was replaced with the A750P gene.
  • FIG. 8-1B shows the results of each EGFR-siRNA against the del (E746-A750) mutant gene
  • FIG. 9-1B shows the results of each EGFR-siRNA against the del (L747-T751) -L747S mutant gene.
  • the results of each EGFR-siRNA against the del (L747-E749) -A750P (G) and del (L747-E749) -A750P (A) mutant genes are shown in FIGS. 10-1B and 11-1B, respectively.
  • the luciferase activities of the non-target wild-type EGFR gene and the target mutant EGFR gene were calculated as relative values when the luciferase activity of each siControl was 1.0.
  • the luciferase activity of each sample is corrected by the expression level of ⁇ -galactosidase, which is an exogenous control that is not subject to expression suppression by RNAi.
  • the base length of the entire RNAi sense strand region is maintained at 19 bases by introducing the 3 ′ end base of the RNAi sense strand region one by one from the second reference base toward the downstream side, the base length of the entire RNAi sense strand region is maintained as shown in FIG. As shown in FIG. -1B and FIG. 9-1B, when the 4th to 15th bases are set as the 3 ′ terminal bases of the RNAi sense strand region (indicated by ⁇ 4D19 to ⁇ 15D19), the expression of the control (siControl) It was revealed that the expression of the mutant EGFR gene was strongly suppressed as compared with the control, but the expression of the wild-type EGFR gene was not significantly suppressed or almost the same as the control. That is, this means that it is a useful siRNA with a high ASP-RNAi effect.
  • FIG. 10-1B when the 2nd to 9th bases are set to the 3 ′ terminal base of the RNAi sense strand region, the expression of the mutant EGFR gene is strongly suppressed compared to the control (siControl) expression.
  • the expression of the wild-type EGFR gene was not significantly suppressed or hardly changed from the control.
  • This result is slightly different from the result of the del (E746-A750) mutation or the del (L747-T751) -L747S mutation.
  • FIGS. 10-1A and 11-1A there are two discontinuous junctions in del (L747-E749) -A750P (G), (A), and 2 bases and 1 base respectively.
  • -9D19 and si747 / 49 (A) -3D19 to -11D19 were prepared, with the 5 ′ and 3 ′ bases adjacent to the 5 ′ discontinuous junction being the first and second reference, respectively.
  • si747 / 49-4D19 to -11D19 and si747 / 49 (A) -4D19 to -12D19, del (E746-A750) mutation or del (L747-T751) -L747S Consistent with mutation results.
  • an RNAi molecule that targets a transcript containing a discontinuous junction can be arbitrarily sequenced as long as it contains two bases (first and second reference bases) sandwiching the discontinuous junction. It is not necessarily set, and it has been shown that the desired ASP-RNAi effect cannot be obtained unless the first and second reference bases are located at predetermined positions in the RNAi sense strand region. Although this tendency is somewhat fluctuated, as shown in Example 5 and FIGS. 12 and 13 to be described later, this phenomenon is recognized regardless of the difference in the base sequence of the target region in the same gene or the difference in the target gene. It became clear that.
  • Example 2 EGFR-siRNA deletion (or deletion / insertion) mutant gene-specific RNAi effect on human non-small cell lung cancer-derived cell lines>
  • siRNA whether or not they show a specific expression suppression effect (ASP-RNAi effect) also against endogenous mutant EGFR was examined.
  • PC3 cells derived from human lung cancer having EGFR del (L747-E749) -A750P were used as an example.
  • the EGFR-siRNA was endogenous using si747 / 49-3D19 and si747 / 49 (A) -8D19, which had a particularly suppressive effect on the del (L747-E749) -A750P mutation in Example 1. Mutant EGFR RNAi knockdown was performed.
  • the three groups of cells were cultured in a 6-well culture plate using the culture solution of (1), and collected after 24 hours.
  • PCR temperature and time conditions include initial denaturation (95 ° C, 10 minutes), denaturation (94 ° C, 30 seconds), annealing (55 ° C, 30 seconds), and extension reaction (72 ° C, 30 seconds). The condition was repeated 26 times. Thereafter, the PCR amplification product was analyzed by electrophoresis (7% polyacrylamide gel, 100 mA, 1 hour). The primer sequences used are shown in Table 7.
  • Example 3 Evaluation of effects of EGFR-siRNA on cell death and cell proliferation ability on human non-small cell lung cancer-derived cell lines> Specific and effect of endogenous mutant EGFR (del (L747-E749) -A750P) using EGFR-siRNA (si747 / 49-3D19 and si747 / 49 (A) -8D19) shown in Example 2 Whether or not the expression suppression can affect cell proliferation and cell death was examined with respect to the total cell number, cytotoxicity, cell proliferation / survival activity, and cell death (apoptosis).
  • Cell culture (cell density: about 3 ⁇ 10 4 cells / well) was performed in a 96-well culture plate using the culture solution of (1) above, and subjected to each evaluation experiment after 1 day and 4 days.
  • si747 / 49-3D19 was subjected to the same evaluation experiment after 2 days and 6 days together with the control.
  • FIG. 16 shows the result. This figure shows the relative value (%) of the LDH amount when the LDH amount of “no siRNA” on the first day, which is regarded as the total number of cells, is defined as 100%.
  • EGFR-siRNA significantly reduced its total number of PC3 cells both “no siRNA” and “siControl”. That is, this result means that si747 / 49-3D19 suppressed the cell proliferation of PC3 cells.
  • si747 / 49-3D19 is specific and effective against PC3 endogenous dominant mutant EGFR gene (del (L747-E749) -A750P), which promotes cell proliferation activity through constitutive activation. It shows that expression was suppressed.
  • Cytotoxicity evaluation In order to evaluate cytotoxicity in PC3 cells after introduction of si747 / 49-3D19, the amount of LDH released extracellularly due to cytotoxicity and present in the culture solution was determined using CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay (Promega). It was measured. The experimental operation was performed according to the attached protocol, and the absorbance was measured using BenchMark Plus (BIO-RAD). The negative controls used were the same two controls (no siRNA and siControl) used when measuring the cell proliferation ability.
  • FIG. 17 shows the result.
  • the relative value (%) when the LDH amount (sample added with a cell lysis buffer as in the cell proliferation ability evaluation experiment) contained in all cells on the first day of “no siRNA” is 100%.
  • si747 / 49-3D19 does not induce cytotoxicity or cell death due to suppression of endogenous mutant EGFR expression equivalent to or higher than “no siRNA” or “siControl”.
  • Cell proliferation and survival activity evaluation (1) [Method] In order to evaluate cell proliferation and survival activity in PC3 cells after si747 / 49-3D19 introduction, CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (Promega) was used, and NADH (nicotinamide adenine dinucleotide; MTS reduction action by nicotinamide adenine dinucleotide) was measured. The experimental operation was performed according to the attached protocol, and the absorbance was measured using BenchMark Plus (BIO-RAD). The negative controls used were the same two controls (no siRNA and siControl) used when measuring the cell proliferation ability.
  • Cell proliferation and survival activity evaluation (2) [Method] In order to evaluate cell proliferation and survival activity in PC3 cells after si747 / 49-3D19 introduction, the relative amount of ATP in the cells was measured using CellTiter-Glo Assay (Promega). The experimental procedure was performed according to the attached protocol, and the luminescence level was measured using Fusion Universal Microplate Analyzer (Perkin Elmer). The negative controls used were the same two controls (no siRNA and siControl) used when measuring the cell proliferation ability.
  • cell proliferation and survival activity show the relative values on the first day and the fourth day when the relative ATP amount on the first day of culture without “siRNA” is 100%.
  • si747 / 49-3D19 significantly suppressed the growth rate or decreased the survival rate for both “no siRNA” and “siControl” on the 4th day of culture. .
  • the results are shown in FIG.
  • the caspase 3/7 activity indicates a relative value on the first day and the fourth day when the activity on the first day of culture without “siRNA” is defined as 100%.
  • si747 / 49-3D19 did not show a significant change in caspase 3/7 activity when compared with either “no siRNA” or “siControl” on the 4th day of culture. This indicates that suppression of mutant EGFR-specific expression by si747 / 49-3D19 does not induce apoptosis.
  • Example 4 Point mutation gene-specific RNAi effect of EGFR-siRNA on human non-small cell lung cancer-derived cell line> (1) Examination of ASP-RNAi effect of EGFR-siRNA on EGFR gene [Method] As described in Example 1, in non-small cell lung cancer patients, point mutations are also known as gain-of-function mutations associated with disease in the EGFR gene (Paez GJ et al., Science, 2004, 304). ; 1497-1500). For example, as shown in FIG.
  • T790M mutation in which the 2369th base C is substituted with T (a point mutation in which the 790th tryptophan is amino acid changed to methionine (T790M) following the point mutation of the gene).
  • T790M methionine
  • Embodiment 1 If there is an expression vector operably linked to other siRNA having a different structure from the inhibitor and / or DNA encoding the siRNA, it should be used in combination with the EGFR-siRNA described in Example 1 above. Therefore, a higher suppression effect is expected.
  • siRNA that specifically suppresses the expression of the point mutation type EGFR (epidermal growth factor receptor) gene was designed, and the expression suppression effect on the mutant gene (cancer causing gene) was verified.
  • Table 8 shows the base sequences of the sense strand region (ss) and the antisense strand region (as) of siRNA designed for the T790M mutation. In the base sequence, the base shown in bold letters corresponds to the point mutation site. In the base sequences shown in each table, the 3 ′ terminal added base consisting of UU at the 3 ′ end of the sense strand and the antisense strand is excluded for convenience of description. Moreover, the sequence number in a table
  • EGFR-siRNA name in each table for example, “si790-9C / U18” in Table 8 has 9 bases from the point mutation site of T790M mutation to the 5 ′ terminal base of the sense strand region. It indicates that the base C on the wild-type EGFR gene has been replaced with U (T) by point mutation, and that the number of bases in the sense strand region and the antisense strand region are both 18 bases. .
  • reporter gene expression plasmid and reporter assay For selection of evaluation of RNAi effect of EGFR-siRNA prepared in 1 above, reporter gene expression of dominant mutant gene targeted by siRNA and non-target wild type gene Plasmid construction, cell culture, transfection and reporter assays were performed. The basic operation procedure was in accordance with the method described in Example 1.
  • si790-9C / U18 was not a preferred siRNA because it has a relatively strong suppression effect on wild-type EGFR gene expression compared to siControl, but si790-10C / U18 It was revealed that si790-11C / U18 has almost no expression suppressing effect on the wild-type EGFR gene, while it has an effective suppressing action on the mutant EGFR gene.
  • si790-10C / U18 and si790-11C / U18 were shown to be suitable EGFR-siRNAs.
  • Example 5 Transient mutation gene-specific RNAi effect of BCR-ABL-siRNA on BCR-ABL chimeric gene>
  • the siRNA (BCR-ABL-siRNA) having the constitution of the present embodiment 1 targeting the BCR-ABL chimeric gene generated by the translocation mutation in the Philadelphia chromosome is designed, and the BCR-ABL chimeric gene, which is a leukemia causative gene, is designed. The expression suppression effect was verified.
  • the BCR-ABL chimeric gene is considered as a causative gene for CML and ALL found in patients with the Philadelphia chromosome, and the BCR-ABL-siRNA of the present invention is a hyperfunctional BCR-ABL gene. If only the expression of can be specifically suppressed, it can be an effective prophylactic or therapeutic agent for CML and ALL in patients with the Philadelphia chromosome.
  • BCR-ABL chimeric genes It is known that the breakpoints of the BCR gene in the Ph translocation are concentrated at two locations, Major-BCR (downstream: M-BCR) and minor-BCR (upstream: m-BCR). In neutrophil leukemia / essential thrombocythemia, further downstream ⁇ -BCR (p230) involvement has been reported.
  • P210BCR / ABL M-BCR breakpoint
  • p190BCR / ABL m-BCR breakpoint
  • p230BCR / ABL ⁇ -BCR breakpoint
  • BCR-ABL-siRNA was designed and designed according to the RNAi molecule design method described in Embodiment 1 for the BCR-ABL chimeric gene having M-BCR as the breakpoint most frequently found in the disease. It was prepared and verified whether or not the expression of these translocation mutant genes could be specifically suppressed.
  • BCR-ABL-siRNA For the BCR-ABL chimeric gene with M-BCR as the breakpoint, the wild-type ABL gene and the wild-type BCL gene are expressed on the mutant gene product (mutant mRNA).
  • BCR-ABL-siRNA was designed and prepared in the same manner as in Example 1, using the 5 ′ and 3 ′ bases adjacent to this discontinuous junction as the first and second reference bases, respectively.
  • Table 9 shows specific base sequences of BCR-ABL-siRNA designed and used in this example.
  • Table 9 shows the base sequences of the sense strand region (ss) and the antisense strand region (as) of siRNA designed for the BCR-ABL chimeric gene having M-BCR as a breakpoint.
  • the base sequences shown in each table exclude the 3 ′ terminal added base consisting of UU at the 3 ′ end of the sense strand region and the antisense strand region for convenience of description.
  • corresponds to the number of a sequence table.
  • each siRNA was outsourced to Sigma-Aldrich.
  • the synthesized siRNA was subjected to annealing treatment of the sense strand region and the antisense strand region, which was directly used for the experiment.
  • reporter gene expression plasmid For construction of reporter gene expression plasmid, design of synthetic oligo DNA containing mutation site, insertion into reporter gene expression plasmid, and selection method, refer to “(3) Reporter gene expression in Example 1. According to the method described in “Construction of Plasmid”. Table 10 shows the specific base sequence of the synthetic oligo DNA used.
  • each BCR-ABL-siRNA against the BCR-ABL chimeric gene results of each BCR-ABL-siRNA against the BCR-ABL chimeric gene are shown in FIGS. 12-1B and 13-1B.
  • the target gene-specific expression suppression effect of each BCR-ABL-siRNA was shown to be BCR-ABL chimeric gene and wild type ABL gene (FIG. 12-1B), and BCR-ABL chimeric gene and wild type BCR gene (FIG. 13-1B). ).
  • the luciferase activity of the non-target wild-type ABL or BCR gene and the target BCR-ABL chimeric gene was calculated as a relative value when the luciferase activity of each siControl was 1.0. .
  • the luciferase activity of each sample is corrected by the expression level of ⁇ -galactosidase, which is an exogenous control that is not subject to expression suppression by RNAi.
  • FIG. 13-1B When the base length of the entire RNAi sense strand region is maintained at 19 bases by introducing the 3 ′ base of the siRNA sense strand region by shifting one by one starting from the second reference base toward the downstream side, FIG. As shown in -1B and FIG. 13-1B, when the 4th to 13th bases are set to the 3 ′ terminal base of the RNAi sense strand region (indicated by ⁇ 4D19 to ⁇ 13D19), the expression of the control (siControl) As compared with, the expression of the BCR-ABL chimeric gene was strongly suppressed, but the expression of the wild-type ABL or BCR gene was not significantly suppressed or almost the same as the control. That is, this shows that it is a useful siRNA with a high ASP-RNAi effect.
  • Example 6 Influence on cell survival activity of EGFR-siRNA and anticancer drug gefitinib against human non-small cell lung cancer-derived cell line>
  • del L747-E749
  • PC3 and PC9 cells which are human non-small cell lung cancer cell lines having del (L747-E749) -A750P mutation and del (E746-A750) mutation of EGFR, and control We used human HeLa cells with wild-type EGFR.
  • PC3 cells were cultured in the same manner as in the above “Example 2: (1)”, and HeLa cells were cultured in the same manner as in the above “Example 1: (4)”.
  • PC9 cells were cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 using RPMI-1640 culture medium (Wako) containing 10% fetal bovine serum (FBS; Invitrogen).
  • EGFR-siRNA introduction of EGFR-siRNA into PC3 cells by electroporation
  • the EGFR-siRNA was introduced into cells in the same manner as in “Example 2: (2)”. Specifically, PC3 cells cultured in the culture medium of (1) above were dispersed by trypsin digestion, and then collected by centrifugation (120 G, 5 minutes), and about 1 ⁇ 10 6 cells were obtained at a final concentration of 100. , 50, 25, 10, 5, 1 and 0 nM EGFR-siRNA (si747 / 49-3D19) or 100 ⁇ L of electroporation buffer (Amaxa Cell Line Nucleofector Solution V containing siRNA that does not induce RNAi (siControl; QIAGEN)) And Amaxa).
  • Electroporation (program: U-005, gene transfer system Nucleofector, Amaxa) was performed according to the attached protocol, and the siRNA was introduced into the cells. The cells were cultured in the medium described in “Example 2: (1)”, and the cell viability was measured after 3 days.
  • EGFR-siRNA introduction of EGFR-siRNA into PC9 cells by lipofection method
  • Cell culture cell density: about 1 ⁇ 10 5 cells / cm 2
  • EGFR-siRNA si746 / 50-4D19
  • a final concentration of 100, 50, 25, 10, 5, 1 and 0 nM and siRNA that does not induce RNAi were used with PC9 using Lipofectamine 2000 (Invitrogen) Introduced into cells.
  • the transfection method followed the attached protocol. Cell viability was measured after 3 days of culture.
  • FIGS. 23A and 23B show the results of PC9 cells having the del (E746-A750) mutation
  • FIG. 23C shows the results of HeLa cells. Each figure shows a relative value when the cell survival activity in an untreated cell is 100%.
  • PC9 cells showed significant cell growth inhibition and decreased survival activity at gefitinib concentrations of 10 -2 ⁇ M or higher, whereas PC3 cells and HeLa cells both had concentration-dependent cell growth suppression and survival at 1 ⁇ M or higher. The activity decreased.
  • PC9 cells are gefitinib-sensitive cells that can suppress their proliferation even when administered with a small amount of gefitinib, whereas PC3 cells are also affected by HeLa cells, that is, even cells with wild-type EGFR are suppressed. It was suggested that the cells are gefitinib-resistant cells that do not exhibit the effect of suppressing their cell proliferation and survival activity unless such high concentrations of gefitinib are administered.
  • gefitinib can be an effective anticancer agent for non-small cell lung cancer with gefitinib-sensitive EGFR mutation such as del (E746-A750) mutation, but has del (L747-E749) -A750P mutation.
  • non-small cell lung cancer that has acquired resistance to gefitinib has been shown to have no effect unless administered with a high concentration of gefitinib that can cause harmful side effects to the individual.
  • FIG. 24A shows EGFR-siRNA (si747 / 49-3D19) against PC3 cells having the del (L747-E749) -A750P mutation
  • FIG. 24B shows PC9 cell EGFR-siRNA (si746 / D750) having the del (E746-A750) mutation
  • FIG. 24C shows the results of EGFR-siRNA (si747 / 49-3D19) against HeLa cells. Each figure shows a relative value when the cell survival activity in an untreated cell is 100%.
  • EGFR-siRNA (si746 / 50-4D19 and si747 / 49-3D19) markedly suppresses cell proliferation and decreases survival activity against both PC3 and PC9 cells with mutations in EGFR.
  • EGFR-siRNAs showed an inhibitory effect on cell proliferation and survival activity against HeLa cells having wild-type EGFR.
  • the EGFR-siRNA of the present invention has little effect on the expression of wild-type EGFR (that is, there is no side effect or it is infinitely small), and gefitinib resistant or sensitive EGFR It was proved that even mutations can induce highly specific cell growth suppression and reduced survival activity at lower concentrations than gefitinib.
  • Example 7 Production of a model mouse by heterogeneous transplantation of human non-small cell lung cancer-derived cell lines and the effect of EGFR-siRNA on it> The effect of EGFR-siRNA verified at the cell level was verified at the individual level.
  • PC3 cells were transplanted subcutaneously into nude mice, a mouse subcutaneous tumor model was created, and the tumor growth inhibitory effect of EGFR-siRNA administration was verified using the model mouse.
  • Tumor volume was calculated from the tumor diameter one week after transplantation of PC3 cells (6 weeks of age), and for the tumor reaching about 50 mm 3 , the three prepared above Samples, ie, siRNA-free atelocollagen solution, siControl and 20 ⁇ g / 200 ⁇ L solution of EGFR-siRNA, were each administered directly to the tumor at 1.0 mg / kg body weight. Tumor volume was calculated using the following formula:
  • FIG. 26 The time course of tumor volume by administration of EGFR-siRNA is shown in FIG. 26 (si747 / 49-3D19 administration) and FIG. 29 (si747 / 49 (A) -8D19 administration), and the wet weight of the excised tumor is shown in FIG. 27 (si747 / 49-3D19 administration) and FIG. 30 (si747 / 49 (A) -8D19 administration), respectively.
  • the population administered with EGFR-siRNA (si747 / 49-3D19 or si747 / 49 (A) -8D19) significantly suppressed the enlargement of subcutaneous tumors compared to the individual administered with atelocollagen solution alone and siControl Was shown to be. Furthermore, the wet weight of the tumor was also significantly reduced compared to them.
  • the EGFR-siRNA of the present invention is effective in suppressing cancer cell proliferation not only at the cellular level but also at the individual level.
  • the EGFR-siRNA of the present invention has great side effects in the administration of gefitinib, and suppresses the proliferation and survival activity of cancer cells extremely effectively and safely against the EGFR mutation resistant to gefitinib that could not be used so far It was proven that
  • a cancer cell of a non-small cell lung cancer patient has a mutated EGFR gene can be examined by a highly sensitive detection method such as LNA-PNA-PCR clamp method (Patent No. 4216266). If the patient's EGFR gene has a gefitinib-sensitive mutation such as the del (E746-A750) mutation, gefitinib can be a very effective therapeutic agent. However, in the case of cancer cells that have acquired gefitinib resistance even though they have mutations such as del (L747-E749) -A750P, no effective and side-effect drug has been known to date.
  • the EGFR-siRNA of the present invention can be a very effective anticancer agent even for non-small cell lung cancer patients having gefitinib-resistant EGFR gene mutation for which such an effective treatment method has not been established. It was done.
  • Example 8 Verification of side effects due to suppression of endogenous wild-type EGFR gene expression>
  • the EGFR-siRNA of the present invention specifically suppresses only the mutant EGFR gene, whereas the conventional siRNA distinguishes between the wild-type and mutant EGFR genes. Both strongly suppress expression. Then, it verified about the presence or absence of the side effect at the time of administering EGFR-siRNA of this invention and the conventional siRNA to a mouse
  • siRNAs were administered intraperitoneally to ICR mice (male, 10 weeks old).
  • the experimental group consists of only atelocollagen solution without siRNA administration (no siRNA), siRNA that does not induce RNAi (siControl; QIAGEN), si747 / 49-3D19 that specifically suppresses expression of mutant EGFR gene, and mouse
  • siEgfr that suppresses the expression of endogenous wild-type EGFR gene expressed in vivo. These were prepared in the same manner as in Example 7 and administered intraperitoneally to mice.
  • specific base sequences of siEgfr designed and used in this example are shown in Table 11.
  • FIG. 31 shows the result. Endogenous wild-type EGFR gene is expressed in total bilirubin (A), direct bilirubin (B), indirect bilirubin (C), and alkaline phosphatase (D) in plasma compared to no siRNA group and siControl group A significant increase was observed in the suppressive siEgfr administration group. On the other hand, no significant change was observed in the EGFR-siRNA (si747 / 49-3D19) administration group of the present invention. This significant increase in blood parameters was attributed to the suppression of endogenous wild-type EGFR expression by administration of siEgfr, suggesting that hepatobiliary disorders were induced from the blood parameter data changed. It was done.

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Abstract

　野生型又は所望の変異遺伝子の発現を許容し、特定の優性変異遺伝子の発現のみを選択的かつ効果的に抑制することのできるRNAi分子を開発し、その設計方法及び当該RNAi分子を有効成分として含む優性変異遺伝子発現抑制剤の提供を目的とする。　転写産物上に不連続接合点を生じる優性変異遺伝子において、不連続接合点に隣接するセンス鎖領域の3'側の塩基から3'末端までの塩基長を所定の長さとなるように設定したRNAi分子を含む優性変異遺伝子発現抑制剤を提供する。

Description

優性変異遺伝子発現抑制剤
　本発明は、優性変異遺伝子の発現を選択的に、かつ効果的に抑制することのできるRNAi分子を含む優性変異遺伝子発現抑制剤、該発現抑制剤を含む医薬組成物、及び前記RNAi分子の設計方法に関する。
　近年、化合物及び抗体と並ぶ新たな医薬又は診断薬として、生体内で特定の遺伝子の発現を制御する機能性核酸が注目され、その医療応用に向けての様々な研究及び開発が世界各国で進められている。
　機能性核酸には、RNAi（RNA interference: RNA干渉）を介した遺伝子サイレンシングによって標的遺伝子の発現を転写後に抑制するsiRNA（small interfering RNA）、shRNA（short hairpin RNA）及びmiRNA（micro RNA)や、転写因子等の標的物質と特異的に結合して、その機能を抑制する核酸アプタマー、標的mRNAに結合してその翻訳を抑制するアンチセンス核酸、転写因子結合ドメイン等の調節領域をデコイ配列として包含し、標的物質を捕捉することによりその転写因子による遺伝子発現を抑制するデコイDNA、標的遺伝子のmRNA前駆体におけるポリアデニル化を特異的に阻害して不安定化させた後、それを分解に導くU1アダプター等が知られている。いずれも次世代の医薬又は診断薬として期待されているが、中でもsiRNAやshRNAによるRNAiは、その標的特異性、応用性の広さ、及び作用効果の確実性から、所望の遺伝子発現を抑制できる強力な遺伝子発現制御ツールとして脚光を浴びている。
　RNAiの応用であり、所望のアレルの発現を特異的に抑制できるアレル特異的遺伝子サイレンシング（allele-specific RNAi: ASP-RNAi）は、野生型遺伝子の発現に影響を及ぼすことなく、疾患を引き起こす標的優性変異遺伝子の発現を特異的に抑制できることから、疾患治療法上極めて有用と考えられている。例えば、常染色体優性遺伝疾患の一つとして知られる難治性の進行性骨化性線維異形成症（Fibrodysplasia Ossificans Progressiva:FOP）は、原因遺伝子であるALK2（Activin-like kinase 2:アクチビン様キナーゼ２）遺伝子上の６１７番目のG（グアニン）がA（アデニン）に置換した点突然変異又は１０６７番目のGがAに置換した点突然変異によってもたらされる。これらの点突然変異のいずれかを有する変異遺伝子は、優性であるため、野生型ALK2遺伝子を持つヘテロ接合体であってもFOPを発症してしまう（非特許文献１～３）。しかし、FOPの発症や進行を抑制する有効な方法は、現在のところまだ知られていない。ここで、ASP-RNAiにより、優性変異遺伝子の発現のみを抑制し、野生型遺伝子の発現を許容することができれば、FOPをはじめとする常染色体優性遺伝疾患の発症を抑制することができ、また既に発症している患者であれば、その進行を阻止することが可能となる。このように、ASP-RNAiは、RNAiの中でも特に医薬又は診断薬としての有用性が高い。
　ところが、上記のような点突然変異による塩基置換の変異遺伝子と野生型遺伝子とでは、その遺伝子間の塩基配列は、わずか１～数塩基しか相違しないため、従来の一般的な設計法に基づくRNAi分子では、変異遺伝子に対する特異性が低く、野生型遺伝子の発現まで抑制してしまう。また、不連続接合点を含む転写産物を生じる優性変異遺伝子のように、変異遺伝子と野生型遺伝子の塩基配列の間に明瞭な相違が存在する場合であっても、従来法によって設計されたRNAi分子では、必ずしも変異遺伝子に対する特異性が高いとはいえず、しばしば野生型遺伝子の発現も抑制し得る。このようにASP-RNAiを実現させるためには、極めて変異遺伝子に対する特異性の高いsiRNA又はshRNAの開発が不可欠となってくる。その一方で、siRNA等の設計においては、突然変異部位（置換部位、欠失部位、挿入部位等）を含む周辺の塩基配列を標的領域としなければならないことから、設計領域が必然的に制限される。それ故、公知の有効なsiRNAの標的配列選択方法を適用しても、特異性が高く、かつ効果的なsiRNA等を必ずしも設計できないという問題があった。
Shore EM., et al., 2006, Nature Genetics, Vol. 38: 525-527 Nakajima M., et al., 2007, Journal of Human Genetics, Vol.52: 473-475 Furuya H., et al., 2008, American Journal of Medical Genetics Part A, Vol. 146A: 459-463
　本発明は、野生型遺伝子又は所望の優性変異遺伝子の発現を許容し、転写産物上に不連続接合点を生じる特定の標的優性変異遺伝子の発現のみを選択的かつ効果的に抑制することのできるRNAi分子を開発し、当該分子を有効成分として含有する優性変異遺伝子発現抑制剤及び当該RNAi分子の設計方法の提供を目的とする。
　本発明は、優性変異遺伝子の発現により発症する遺伝性疾患を治療する治療剤の提供を目的とする。
　本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、転写産物上に不連続接合点を生じる優性変異遺伝子の発現を選択的に、かつ効果的に抑制することができるsiRNA等のRNAi分子の構造的一般法則性を見出した。すなわち、不連続接合点に隣接するセンス鎖領域の3’側の塩基からその3’末端までの塩基長を所定の長さとなるように設定したRNAi分子は、優性変異遺伝子の発現を選択的、かつ効果的に抑制する一方で、野生型遺伝子の発現に対しては、抑制効果をほとんど示さないか又は低減することが明らかとなった。本発明は、上記知見に基づいて完成されたものであり、以下を提供する。
　（１）ASPスコア値が０．４以上であるRNAi分子を有効成分として含む、優性変異遺伝子の発現抑制剤であって、前記ASPスコアは、以下の式から算出され、
　　ASPスコア＝[（対照RNAi分子で処理した正常型遺伝子の標準化した発現量に対する前記RNAi分子で処理した正常型遺伝子の標準化した発現量の相対比）－（対照RNAi分子で処理した変異遺伝子の標準化した発現量に対する前記RNAi分子で処理した変異遺伝子の標準化した発現量の相対比）]×（１－対照RNAi分子で処理した変異遺伝子の標準化した発現量に対する前記RNAi分子で処理した変異遺伝子の標準化した発現量の相対比）
　（式中、対照RNAi分子は、前記正常型遺伝子及び変異遺伝子の発現に影響を及ぼさないRNAi分子である）
　前記RNAi分子が標的である優性変異遺伝子の転写産物上に生じる少なくとも一つの不連続接合点、及び該転写産物の連続する１６～３０塩基の配列に一致する塩基配列を含むRNAiセンス鎖領域、並びにそれに相補的な塩基配列を含むRNAiアンチセンス鎖領域を含み、かつ前記RNAiセンス鎖領域上のいずれか一の不連続接合点に隣接する3’側の塩基から下流側に向かって４～１５番目のいずれか一の塩基が該RNAiセンス鎖領域の3’末端塩基を構成する、前記遺伝子発現抑制剤。
　（２）ASPスコア値が０．４以上であるRNAi分子をコードするDNAを動作可能なように連結した発現ベクターを有効成分として含む、優性変異遺伝子の発現抑制剤であって、前記ASPスコアは、以下の式から算出され、
　　ASPスコア＝[（対照RNAi分子で処理した正常型遺伝子の標準化した発現量に対する前記RNAi分子で処理した正常型遺伝子の標準化した発現量の相対比）－（対照RNAi分子で処理した変異遺伝子の標準化した発現量に対する前記RNAi分子で処理した変異遺伝子の標準化した発現量の相対比）]×（１－対照RNAi分子で処理した変異遺伝子の標準化した発現量に対する前記RNAi分子で処理した変異遺伝子の標準化した発現量の相対比）
　（式中、対照RNAi分子は、前記正常型遺伝子及び変異遺伝子の発現に影響を及ぼさないRNAi分子である）
　前記RNAi分子が標的である優性変異遺伝子の転写産物上に生じる少なくとも一つの不連続接合点、及び該転写産物の連続する１６～３０塩基の配列に一致する塩基配列を含むRNAiセンス鎖領域、並びにそれに相補的な塩基配列を含むRNAiアンチセンス鎖領域を含み、かつ前記RNAiセンス鎖領域上のいずれか一の不連続接合点に隣接する3’側の塩基から下流側に向かって４～１５番目のいずれか一の塩基が該RNAiセンス鎖領域の3’末端塩基を構成する、前記遺伝子発現抑制剤。
　（３）RNAiセンス鎖領域及びRNAiアンチセンス鎖領域の3’末端にさらにTT又はUUを付加する、（１）又は（２）に記載の抑制剤。
　（４）RNAi分子がsiRNAである、（１）～（３）のいずれかに記載の抑制剤。
　（５）RNAi分子がshRNAである、（１）～（３）のいずれかに記載の抑制剤。
　（６）優性変異遺伝子における変異が塩基の欠失、塩基の挿入、スプライス部位を破壊し得る塩基の置換、遺伝子の重複、遺伝子の転座、及び染色体の逆位からなる一群から選択される、（１）～（５）のいずれかに記載の抑制剤。
　（７）優性変異遺伝子が機能獲得型である、（１）～（６）のいずれかに記載の抑制剤。
　（８）優性変異遺伝子が疾患の発症に関与する、（１）～（７）のいずれかに記載の抑制剤。
　（９）疾患が悪性新生物である、（８）に記載の抑制剤。
　（１０）悪性新生物が非小細胞肺癌で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子が変異型EGFR遺伝子であるか、悪性新生物が大腸癌で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子が変異型CTNNB1遺伝子であるか、悪性新生物が胃癌で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子が変異型CDH1遺伝子であるか、悪性新生物が乳癌で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子が変異型BRCA1遺伝子若しくは変異型BRCA2遺伝子であるか、悪性新生物が多腺性自己免疫性内分泌不全症I型で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子が変異型AIRE遺伝子であるか、悪性新生物が自己免疫性リンパ増殖症候群で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子が変異型TNFRSF6/APT1/FAS遺伝子であるか、悪性新生物が慢性骨髄性白血病又は急性リンパ性白血病で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がBCR-ABLキメラ遺伝子であるか、悪性新生物がバーキットリンパ腫で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がc-myc-IgH-キメラ遺伝子、悪性新生物が未分化型大細胞リンパ腫で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がNPM-ALK-キメラ遺伝子であるか、悪性新生物が肺癌で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がEML4-ALK-キメラ遺伝子であるか、悪性新生物が隆起性皮膚線維肉腫で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がPDGFB-COL1A1キメラ遺伝子であるか、悪性新生物が先天性線維肉腫で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がETV6-NTRK3キメラ遺伝子であるか、悪性新生物が低悪性線維粘液肉腫で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がFUS-CREB3L2キメラ遺伝子であるか、悪性新生物が骨外性粘液型軟骨肉腫で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がEWS-CHNキメラ遺伝子であるか、悪性新生物がユーイング肉腫若しくは線維形成性小細胞腫瘍で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がEWSR1遺伝子を転座パートナーとするキメラ遺伝子であるか、悪性新生物が胞巣型横紋筋肉腫で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がSYT遺伝子若しくはSSX遺伝子を転座パートナーとするキメラ遺伝子であるか、悪性新生物が炎症性筋線維芽細胞性腫瘍で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がALK遺伝子を転座パートナーとするキメラ遺伝子であるか、悪性新生物が脂肪肉腫で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がCHOP遺伝子を転座パートナーとするキメラ遺伝子であるか、又は悪性新生物が軟部明細胞肉腫若しくは悪性線維性組織球腫で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がATF1遺伝子を転座パートナーとするキメラ遺伝子である、（９）に記載の抑制剤。
　（１１）悪性新生物が非小細胞肺癌で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子が変異型EGFR遺伝子である、（１０）に記載の抑制剤。
　（１２）RNAi分子のセンス鎖領域が、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５３、５５、５９、６１、６３、６５、６７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３又は１４５で示されるヌクレオチドからなる、（１１）に記載の抑制剤。
　（１３）悪性新生物が慢性骨髄性白血病又は急性リンパ性白血病で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がBCR-ABLキメラ遺伝子である、（１０）に記載の抑制剤。
　（１４）RNAi分子のセンス鎖領域が、配列番号９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１又は１１３で示されるヌクレオチドからなる、（１３）に記載の抑制剤。
　（１５）疾患がヒト常染色体優性変異疾患である、（８）に記載の抑制剤。
　（１６）ヒト常染色体優性変異疾患が先天性夜盲症で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がRHO遺伝子であるか、ヒト常染色体優性変異疾患が難聴遺伝子領域DFNA2で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がKCNQ4遺伝子若しくはGJB遺伝子であるか、ヒト常染色体優性変異疾患がワールデンブルグ症候群で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がMITF遺伝子であるか、ヒト常染色体優性変異疾患が非症候性難聴で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がDIAPH1/DFNA1遺伝子若しくはPOU4F3遺伝子であるか、ヒト常染色体優性変異疾患が肥大型心筋症で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がTNNT2遺伝子であるか、ヒト常染色体優性変異疾患が家族性肥大型心筋症で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がMYBPC3遺伝子であるか、ヒト常染色体優性変異疾患が心尖部肥大型心筋症で、その標的となる前記優性変異遺伝子がTNNI3遺伝子であるか、ヒト常染色体優性変異疾患がシャルコー・マリー・トゥース病1A型で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がPMP22遺伝子であるか、ヒト常染色体優性変異疾患がシャルコー・マリー・トゥース病1B型で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がMPZ遺伝子であるか、ヒト常染色体優性変異疾患がQT延長症候群で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がKCNQ1遺伝子若しくはKCNH2遺伝子若しくはSCN5A遺伝子若しくはANK2遺伝子若しくはKCNE1遺伝子若しくはKCNE2遺伝子若しくはKCNJ2遺伝子若しくはCAV3遺伝子若しくはSCN48遺伝子若しくはAKAP9遺伝子若しくはANTA1遺伝子であるか、ヒト常染色体優性変異疾患がQT短縮症候群で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がKCNH2遺伝子若しくはKCNJ2遺伝子であるか、ヒト常染色体優性変異疾患がブルガタ症候群で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がSCN5A遺伝子若しくはGPD1L遺伝子若しくはCACNA1C遺伝子若しくはCACNB2B遺伝子若しくはSCN1B遺伝子であるか、ヒト常染色体優性変異疾患がカテコラミン誘発性多形性心室頻拍で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がRYR2遺伝子であるか、ヒト常染色体優性変異疾患が心伝導障害で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がSCN5A遺伝子若しくはSCN1B遺伝子であるか、ヒト常染色体優性変異疾患が筋萎縮性側索硬化症で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がTDP43遺伝子であるか、ヒト常染色体優性変異疾患がヌーナン症候群で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がPTPN11遺伝子であるか、又はヒト常染色体優性変異疾患が低カルシウム血症で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がCaR遺伝子である（１５）に記載の抑制剤。
　（１７）疾患が筋硬直性ジストロフィーで、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がDMPK遺伝子であるか、疾患が脊髄性筋萎縮症で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がSMN1遺伝子であるか、疾患が先天性筋無力症候群で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がCHRNE遺伝子であるか、疾患が前頭側頭葉型痴呆症で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がMAPT遺伝子であるか、又は疾患が成長ホルモン単独欠損症II型で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がGH1遺伝子である、（８）に記載の抑制剤。
　（１８）（１）～（１７）のいずれかに記載の抑制剤を有効成分として少なくとも一つ含有する医薬組成物。
　（１９）センス鎖領域が、配列番号８３又は８５で示されるヌクレオチドからなるRNAi分子、及び／又はそのRNAi分子をコードするDNAを動作可能なように連結した発現ベクター、並びに／あるいはセンス鎖領域が、配列番号８９で示されるヌクレオチドからなるRNAi分子、及び／又はそのRNAi分子をコードするDNAを動作可能なように連結した発現ベクターを有効成分としてさらに含有する、（１１）又は（１２）に従属する（１８）に記載の医薬組成物。
　（２０）センス鎖領域が、配列番号８９で示されるヌクレオチドからなるRNAi分子、及び／又はそのRNAi分子をコードするDNAを動作可能なように連結した発現ベクターを含む、点突然変異型EGFR遺伝子発現抑制剤。
　（２１）転写産物上に不連続接合点を有する優性変異遺伝子の発現を選択的に抑制するRNAi分子の設計方法であって、（ａ）該転写産物上の不連続接合点に隣接する5’側及び3’側の塩基をそれぞれ第１及び第２基準塩基として設定する工程、（ｂ）前記転写産物において、前記第２基準塩基に対応する塩基から下流側に向かって４～１５番目の塩基がRNAiセンス鎖の3’末端塩基に対応するように設定する工程、（ｃ）前記優性変異遺伝子において、その転写産物の第１及び第２基準塩基を含む連続する１６～３０塩基を含む塩基配列をRNAiセンス鎖領域として設定する工程、（ｄ）設定されたRNAiセンス鎖領域の塩基配列に相補的な塩基配列を含む塩基配列をRNAiアンチセンス鎖領域として設定する工程
を含む、前記設計方法。
　（２２）（ｅ）ASPスコア値が０．４以上あるRNAi分子を選別する工程をさらに含む、(２１)に記載の設計方法であって、
　ASPスコアは、以下の式から算出される、前記設計方法。
　　ASPスコア＝[（対照RNAi分子で処理した正常型遺伝子の標準化した発現量に対する前記RNAi分子で処理した正常型遺伝子の標準化した発現量の相対比）－（対照RNAi分子で処理した変異遺伝子の標準化した発現量に対する前記RNAi分子で処理した変異遺伝子の標準化した発現量の相対比）]×（１－対照RNAi分子で処理した変異遺伝子の標準化した発現量に対する前記RNAi分子で処理した変異遺伝子の標準化した発現量の相対比）
　（式中、対照RNAi分子は、前記正常型遺伝子及び変異遺伝子の発現に影響を及ぼさないRNAi分子である）
　（２３）RNAiセンス鎖領域及びRNAiアンチセンス鎖領域の3’末端にさらにTT又はUUを付加する、（２１）又は（２２）に記載の設計方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2010-222847号、2011-044347号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
　本発明の優性変異遺伝子発現抑制剤によれば、野生型遺伝子や標的以外の優性変異遺伝子の発現に大きな影響を及ぼすことなく、標的優性変異遺伝子の発現を選択的に、また効果的に抑制することが可能となる。
　本発明の優性変異遺伝子発現抑制剤の有効成分であるRNAi分子の設計方法によれば、疾患の原因となる、あらゆる転写産物上に不連続接合点を有する優性突然優性変異遺伝子に対して設計が可能であり、応用性の高い設計方法を提供できる。
　本発明の医薬組成物によれば、遺伝性疾患において、野生型遺伝子の発現を維持しながら、疾患原因となる標的優性変異遺伝子の発現を選択的に抑制することにより、その疾患を治癒することが可能となる。
欠失変異の種類を説明する概念図である。実線白抜きボックス（0102、0103）は遺伝子（0101）のエクソン内コード領域（0102）又はエクソンの全部又は一部（0103）を、実線斜線ボックス（0104、0105）は遺伝子の非コード領域（5’非コード領域：0104；3’非コード領域：0105）を、ボックスに挟まれた実線（0106、0107）はイントロンの全部（0106）又は一部（0107）を示す。破線で示す領域は、欠失領域（0108、0109、0110、0111）で、破線白抜きボックス（0108、0112）は遺伝子のエクソン内コード領域の欠失領域（0108）又は欠失エクソン（0112）を、ボックス間の破線（0113、0114）は欠失イントロンの全部（0113）又は一部（0114）を示す。そして矢印（0115）は転写開始点を示す。 欠失変異における不連続接合点を説明する概念図（１）である。Aは野生型遺伝子を、A’はその野生型遺伝子の転写産物を、Bは変異遺伝子を、そしてB’はその変異遺伝子の転写産物を、それぞれ示す。また、Cは、変異遺伝子Bを野生型遺伝子Aと対比させたときの欠失領域（b領域）を破線で示したものである。この図では、B’上のa領域とｃ領域の接合点（J）が、不連続接合点となる。 欠失変異における不連続接合点を説明する概念図（２）である。Aは野生型遺伝子を、A’はその野生型遺伝子の転写産物を、Bは変異遺伝子を、そしてB’はその変異遺伝子の転写産物を、それぞれ示す。実線白抜きボックス（0301、0302）はエクソンを、ボックス間の実線（0303、0304）はイントロンの全部（0303）又は一部（0304）を、星印（0305）は5’スプライス部位を示す。破線で示す領域(0306)は、変異遺伝子における欠失領域である。この図では、変異遺伝子の転写産物B’において、第１エクソン（0301）の一部（0307）由来の領域とイントロンの一部（0304）由来の領域との接合点（J1）、及びイントロンの一部（0304）由来の領域と第２エクソン（0302）由来の領域との接合点（J2）の二箇所が、不連続接合点となる。 欠失変異における不連続接合点を説明する概念図（３）である。Aは野生型遺伝子を、A’はその野生型遺伝子の転写産物を、Bは変異遺伝子を、そしてB’はその変異遺伝子の転写産物を、それぞれ示す。また、Cは、変異遺伝子Bを野生型遺伝子Aと対比させたときの欠失領域（0406）を破線で示したものである。この図では、変異遺伝子の転写産物B’において、第１エクソン（0401）と第３エクソン（0403）との接合点（J）が、不連続接合点となる。 挿入変異における不連続接合点を説明する概念図である。Aは野生型遺伝子を、A’はその野生型遺伝子の転写産物を、Bは変異遺伝子を、そしてB’はその変異遺伝子の転写産物を、それぞれ示す。図中のａ領域及びｂ領域における白抜きボックスはエクソン内のコード領域を、斜線ボックスはエクソン内の非コード領域を、またｃ領域（網掛けボックス）は、変異遺伝子における挿入部分を、それぞれ示す。この図では、変異遺伝子の転写産物B’における野生型エクソンａ領域由来の領域とｃ領域である挿入部分由来の領域との二箇所の接合点（J1、J2）が不連続接合点となる。 RNAi分子の構造の概念図を示す。（A）二本鎖RNAi分子（siRNA）の場合及び（２）一本鎖RNAi分子（shRNA）の場合をそれぞれ示す。 実施形態１のRNAi分子の設計方法フローを示す。 A:野生型EGFR遺伝子と欠失変異型EGFR遺伝子del(E764-A750)における欠失部位周辺の塩基配列及びアミノ酸配列の対比を示した図である。野生型EGFR遺伝子の塩基配列において、黒枠で囲んだ領域がこの変異型EGFR遺伝子の欠失領域である。この変異遺伝子の転写産物における不連続接合点に相当する位置を矢頭で示す。B: 野生型の非標的EGFR遺伝子と欠失変異型EGFR遺伝子del(E764-A750)に対するEGFR-siRNAの発現抑制効果を、それぞれのsiControlのルシフェラーゼ活性を1.0としたときの相対値として算出した。ルシフェラーゼ活性は、RNAiによる発現抑制を受けない外来性コントロールであるβ-ガラクトシダーゼの発現量で補正している。 C: 野生型の非標的EGFR遺伝子と欠失変異型EGFR遺伝子del(E764-A750)に対するEGFR-siRNAのASPスコア値を示す。ASPスコア値０．４の境界線を破線で示す。 A:野生型EGFR遺伝子と欠失変異型EGFR遺伝子del(L747-T751)-L747Sにおける欠失部位周辺の塩基配列及びアミノ酸配列の対比を示した図である。野生型EGFR遺伝子の塩基配列において、黒枠で囲んだ領域がこの変異型EGFR遺伝子の欠失領域である。この変異遺伝子の転写産物における不連続接合点に相当する位置を矢頭で示す。B: 野生型の非標的EGFR遺伝子と欠失変異型EGFR遺伝子del(L747-T751)-L747Sに対するEGFR-siRNAの発現抑制効果を、それぞれのsiControlのルシフェラーゼ活性を1.0としたときの相対値として算出した。各サンプルのルシフェラーゼ活性は、RNAiによる発現抑制を受けない外来性コントロールであるβ-ガラクトシダーゼの発現量で補正している。 C: 野生型の非標的EGFR遺伝子と欠失変異型EGFR遺伝子del(L747-T751)-L747Sに対するEGFR-siRNAのASPスコア値を示す。ASPスコア値０．４の境界線を破線で示す。 A:野生型EGFR遺伝子と欠失／挿入変異型EGFR遺伝子del(L747-E749)-A750P(G)における欠失部位周辺の塩基配列及びアミノ酸配列の対比を示した図である。野生型EGFR遺伝子の塩基配列において、黒枠で囲んだ領域がこの変異型EGFR遺伝子の欠失領域であり、また変異型EGFR遺伝子において太字で示した塩基が挿入塩基である。この変異遺伝子の転写産物における不連続接合点に相当する位置を矢頭で示す。この欠失／挿入変異型では、不連続接合点が二箇所存在する。B: 野生型の非標的EGFR遺伝子と欠失／挿入変異型EGFR遺伝子del(L747-E749)-A750P(G)に対するEGFR-siRNAの発現抑制効果を、それぞれのsiControlのルシフェラーゼ活性を1.0としたときの相対値として算出した。各サンプルのルシフェラーゼ活性は、RNAiによる発現抑制を受けない外来性コントロールであるβ-ガラクトシダーゼの発現量で補正している。 C: 野生型の非標的EGFR遺伝子と欠失／挿入変異型EGFR遺伝子del(L747-E749)-A750P(G)に対するEGFR-siRNAのASPスコア値を示す。ASPスコア値０．４の境界線を破線で示す。 Ａ:野生型EGFR遺伝子と欠失／挿入変異型EGFR遺伝子del(L747-E749)-A750P(A)における欠失部位周辺の塩基配列及びアミノ酸配列の対比を示した図である。野生型EGFR遺伝子の塩基配列において、黒枠で囲んだ領域がこの変異型EGFR遺伝子の欠失領域であり、また変異型EGFR遺伝子において太字で示した塩基が挿入塩基である。この変異遺伝子の転写産物における不連続接合点に相当する位置を矢頭で示す。この欠失／挿入変異型では、不連続接合点が二箇所存在する。B: 野生型の非標的EGFR遺伝子と欠失／挿入変異型EGFR遺伝子del(L747-E749)-A750P(A)に対するEGFR-siRNAの発現抑制効果を、それぞれのsiControlのルシフェラーゼ活性を1.0としたときの相対値として算出した。各サンプルのルシフェラーゼ活性は、RNAiによる発現抑制を受けない外来性コントロールであるβ-ガラクトシダーゼの発現量で補正している。 C: 野生型の非標的EGFR遺伝子と欠失／挿入変異型EGFR遺伝子del(L747-E749)-A750P(A)に対するEGFR-siRNAのASPスコア値を示す。ASPスコア値0.4の境界線を破線で示す。 A: フィラデルフィア染色体（９番染色体長腕(9q34)に座位するABL遺伝子と、２２番染色体長腕(22q11)に座位するBCR遺伝子との相互転座）から発現するBCR-ABLキメラ遺伝子と野生型ABL遺伝子における転座部位周辺配列の塩基配列及びアミノ酸配列の対比を示した図である。野生型ABL遺伝子の塩基配列において、黒枠で囲んだ領域が転座した領域であり、BCR－ABLキメラ遺伝子の塩基配列において、黒枠で囲んだ領域が転座によってBCR遺伝子と連結したABL遺伝子の領域である。このキメラ遺伝子の転写産物における不連続接合点に相当する位置を矢頭で示す。B: 野生型の非標的ABL遺伝子とBCR-ABLキメラ遺伝子に対するBCR-ABL-siRNAの発現抑制効果を、それぞれのsiControlのルシフェラーゼ活性を1.0としたときの相対値として算出した。ルシフェラーゼ活性は、RNAiによる発現抑制を受けない外来性コントロールであるβ-ガラクトシダーゼの発現量で補正している。 C: 野生型の非標的ABL遺伝子とBCR-ABLキメラ遺伝子に対するBCR-ABL-siRNAのASPスコア値を示す。ASPスコア値０．４の境界線を破線で示す。 A: フィラデルフィア染色体（9番染色体長腕(9q34)に座位するABL遺伝子と、２２番染色体長腕(22q11)に座位するBCR遺伝子との相互転座）から生じるBCR-ABLキメラ遺伝子と野生型BCR遺伝子における転座部位周辺配列の塩基配列及びアミノ酸配列の対比を示した図である。野生型BCR遺伝子の塩基配列において、黒枠で囲んだ領域が転座した領域であり、BCR－ABLキメラ遺伝子の塩基配列において、黒枠で囲んだ領域が転座によってABL遺伝子と連結したBCR遺伝子の領域である。このキメラ遺伝子の転写産物における不連続接合点に相当する位置を矢頭で示す。B:野生型の非標的BCR遺伝子とBCR-ABLキメラ遺伝子に対するBCR-ABL-siRNAの発現抑制効果を、それぞれのsiControlのルシフェラーゼ活性を1.0としたときの相対値として算出した。ルシフェラーゼ活性は、RNAiによる発現抑制を受けない外来性コントロールであるβ-ガラクトシダーゼの発現量で補正している。 C: 野生型の非標的BCR遺伝子とBCR-ABLキメラ遺伝子に対するBCR-ABL-siRNAのASPスコア値を示す。ASPスコア値０．４の境界線を破線で示す。 ヒト非小細胞肺癌由来株化細胞（PC3細胞）のEGFR del(L747-E749)-A750P変異に対するEGFR-siRNA（si747/49-3D19）を導入したときの、変異遺伝子特異的RNAi効果を示す電気泳動図である。 PC3細胞に対するEGFR-siRNA（si747/49(A)-8D19）を導入したときの変異遺伝子特異的RNAi効果を示す電気泳動図である。 PC3細胞にEGFR-siRNA（si747/49-3D19）を導入したときの、その細胞増殖抑制作用をPC3細胞の全細胞数によって示した図である。 PC3細胞にEGFR-siRNA（si747/49-3D19）を導入したときの、siRNAにおける細胞毒性作用を示した図である。 PC3細胞にEGFR-siRNA（si747/49-3D19）を導入したときの、PC3細胞における細胞増殖及び生存活性を示した図（１）である。 PC3細胞にEGFR-siRNA（si747/49(A)-8D19）を導入したときの、その細胞増殖抑制作用をPC3細胞の全細胞数によって示した図である。 PC3細胞にEGFR-siRNA（si747/49-3D19）を導入したときの、PC3細胞における細胞増殖及び生存活性を示した図（２）である。 PC3細胞にEGFR-siRNA（si747/49-3D19）を導入したときの、PC3細胞の細胞死（アポトーシス）を示した図である。 A:野生型EGFR遺伝子と点突然変異型（置換変異型）EGFR遺伝子T790M変異に対して設計したsiRNAのセンス鎖領域における置換部位周辺の塩基配列及びアミノ酸配列の対比を示した図である。変異型EGFR遺伝子の塩基配列において、太字で示した塩基がこの変異型EGFR遺伝子の置換部位である。B: 野生型の非標的EGFR遺伝子と置換変異型EGFR遺伝子T790Mに対するEGFR-siRNAの発現抑制効果を、それぞれのsiControlのルシフェラーゼ活性を1.0としたときの相対値として算出した。ルシフェラーゼ活性は、RNAiによる発現抑制を受けない外来性コントロールであるβ-ガラクトシダーゼの発現量で補正している。 変異型EGFR del(L747-E749)-A750Pを有するヒト非小細胞肺癌由来株化細胞であるPC3細胞、変異型EGFR del(E746-A750)を有するヒト非小細胞肺癌由来株化細胞であるPC9細胞、及び野生型EGFRを有するヒト子宮頸癌由来株化細胞であるHeLa細胞に様々な濃度の抗癌剤ゲフィチニブで曝露したときの各細胞おける細胞増殖及び生存活性を示した図である。ＡはPC3細胞を、ＢはPC9細胞を、ＣはHeLa細胞を示す。各図の値は、それぞれ無処置の細胞における細胞生存活性を100%としたときの相対値で示している。 PC3細胞、PC9細胞、及びHeLa細胞に様々な濃度のEGFR-siRNAを投与したときの各細胞おける細胞増殖及び生存活性を示した図である。ＡはPC3細胞を、ＢはPC9細胞を、ＣはHeLa細胞をsiRNAで処理したときの結果を示す。各図の値は、それぞれ無処置の細胞における細胞生存活性を100%としたときの相対値で示している。 Ａ：皮下移植したPC3細胞由来の腫瘍（矢印）にsiRNA等を投与後３週（９週齢）目のヌードマウスを示す。ａはsiRNAを投与していない個体を、ｂはsiControlを投与した個体を、ｃはEGFR-siRNA（si747/49-3D19）を投与した個体を、示す。Ｂ：siRNAを投与していない個体群（ａ１～ａ３）、siControlを投与した個体群（ｂ１～ｂ３）、及びEGFR-siRNA（si747/49-3D19）を投与した個体群（ｃ１～ｃ３）から、siRNA等を投与後３週（９週齢）目に摘出したPC3細胞由来の腫瘍を示す。 ヌードマウスに皮下移植したPC3細胞に対してEGFR-siRNA（si747/49-3D19）を投与したときの、腫瘍体積の時間経過を示した図である。★印は、siRNAを投与していない個体の腫瘍体積と比較して有意な差（p＜0.05）があることを、また＃印は、siControlを投与した個体の腫瘍体積と比較して有意な差（p＜0.05）があることを、示している。 ヌードマウスに皮下移植したPC3細胞に対してEGFR-siRNA（si747/49-3D19）を投与したときの、腫瘍湿重量を示した図である。★印は、siRNAを投与していない個体の腫瘍体積と比較して有意な差（p＜0.05）があることを、また＃印は、siControlを投与した個体の腫瘍体積と比較して有意な差（p＜0.05）があることを、示している。 Ａ：皮下移植したPC3細胞由来の腫瘍（矢印）にsiRNA等を投与後３週（９週齢）目のヌードマウスを示す。Ｂ：各個体群(１群５匹)から、siRNA等を投与後３週（９週齢）目に摘出したPC3細胞由来の腫瘍を示す。 ヌードマウスに皮下移植したPC3細胞に対してEGFR-siRNA（si747/49(A)-8D19）を投与したときの、腫瘍体積の時間経過を示した図である。★印は、siRNAを投与していない個体の腫瘍体積と比較して有意な差（p＜0.05）があることを、また＃印は、siControlを投与した個体の腫瘍体積と比較して有意な差（p＜0.05）があることを、示している。 ヌードマウスに皮下移植したPC3細胞に対してEGFR-siRNA（si747/49(A)-8D19）を投与したときの、腫瘍湿重量を示した図である。★印は、siRNAを投与していない個体の腫瘍体積と比較して有意な差（p＜0.05）があることを、また＃印は、siControlを投与した個体の腫瘍体積と比較して有意な差（p＜0.05）があることを、示している。 EGFR-siRNAのマウス個体に対する副作用の影響を示す。Aは血漿中の全ビリルビン量、Bは血漿中の直接ビリルビン量、Cは血漿中の間接ビリルビン量を、及びDは血漿中のアルカリホスファターゼの量を示す。siEgfrは、従来のsiRNAの構成を有するEGFR-siRNAである。
１．優性変異遺伝子発現抑制剤
１－１．概要
　本発明の第１の実施形態は、優性変異遺伝子発現抑制剤である。本発明の抑制剤は、RNAi分子及び／又はそれをコードする発現ベクターを有効成分として含み、優性変異遺伝子の発現を選択的に抑制することを特徴とする。
１－２．RNAi分子の構成と定義
　本明細書において、「RNAi分子」とは、生体内においてRNA干渉（RNA interference）を誘導し、標的とする優性変異遺伝子の転写産物の分解を介してその遺伝子の発現を転写後翻訳前に抑制（サイレンシング）することができる分子をいう。RNAi機構を介して遺伝子の発現を抑制できる分子であれば、一本鎖分子又は二本鎖分子のいずれであってもよい。例えば、siRNA（small interfering RNA）のような二本鎖分子、shRNA（short hairpin RNA）又はmiRNA（micro RNA)のような一本鎖分子が挙げられる。RNA干渉については、例えば、Bass B.L., 2000, Cell, 101, 235-238；Sharp P.A., 2001, Genes Dev., 15 ,485-490；Zamore P.D., 2002, Science, 296, 1265-1269；Dernburg ,A.F. & Karpen, G.H., 2002, Cell, 111,159-162を参照されたい。なお、本明細書では、RNAi機構を介した転写後の遺伝子サイレンシングを、以下、「遺伝子の発現抑制」として表す。
　本明細書において、RNAi分子は、核酸からなる。ここでいう「核酸」とは、天然型核酸、非天然型核酸及び／又は核酸類似体をいう。
　本明細書において、「天然型核酸」とは、ヌクレオチドを構成単位とし、それらがホスホジエステル結合によって連結した自然界に存在する生体高分子をいう。通常は、アデニン、グアニン、シトシン及びウラシルのいずれかの塩基を有するリボヌクレオチドが連結したRNA及び／又はアデニン、グアニン、シトシン及びチミンのいずれかの塩基を有するデオキシリボヌクレオチドが連結したDNAが該当する。本発明のRNAi分子では、特に、RNAが主な構成成分であることが好ましい。
　本明細書において、「非天然型核酸」とは、非天然型ヌクレオチドを含む又はそれからなる核酸をいう。ここで「非天然型ヌクレオチド」とは、人工的に構築された又は人工的に化学修飾された自然界に存在しないヌクレオチドであって、前記天然に存在するヌクレオチドに類似の性質及び／又は構造を有するヌクレオチド、又は天然に存在するヌクレオシド若しくは塩基に類似の性質及び／又は構造を有するヌクレオシド若しくは塩基を含むヌクレオチドをいう。例えば、脱塩基ヌクレオシド、アラビノヌクレオシド、2'-デオキシウリジン、α－デオキシリボヌクレオシド、β-L-デオキシリボヌクレオシド、その他の糖修飾を有するヌクレオシドが挙げられる。さらに、置換五単糖（2'-O-メチルリボース、2'-デオキシ-2'-フルオロリボース、3'-O-メチルリボース、1'，2'-デオキシリボース）、アラビノース、置換アラビノース糖；置換六単糖及びアルファ－アノマーの糖修飾を有するヌクレオシドが含まれる。また、非天然型ヌクレオチドは、人工的に構築された塩基類似体又は人工的に化学修飾された塩基（修飾塩基）を包含するヌクレオチドも含む。「塩基類似体」には、例えば、2-オキソ（1H）-ピリジン-3-イル基、5位置換-2-オキソ（1H）-ピリジン-3-イル基、2-アミノ-6-（2-チアゾリル）プリン-9-イル基、2-アミノ-6-（2-チアゾリル）プリン-9-イル基、2-アミノ-6-（2-オキサゾリル）プリン-9-イル基等が挙げられる。「修飾塩基」には、例えば、修飾化ピリミジン（例えば、5-ヒドロキシシトシン、5-フルオロウラシル、4-チオウラシル）、修飾化プリン（例えば、6-メチルアデニン、6-チオグアノシン）及び他の複素環塩基等が挙げられる。メチルホスホネート型DNA/RNA、ホスホロチオエート型DNA/RNA、ホスホルアミデート型DNA/RNA、2'-O-メチル型DNA/RNA等の化学修飾核酸や核酸類似体も含むこともできる。
　本明細書において「核酸類似体」とは、天然型核酸に類似の構造及び／又は性質を有する人工的に構築された化合物をいう。例えば、ペプチド核酸（PNA：Peptide Nucleic Acid）、ホスフェート基を有するペプチド核酸（PHONA）、架橋化核酸（BNA/LNA：Bridged Nucleic Acid/Locked Nucleic Acid）、モルホリノ核酸等が挙げられる。
　また、本発明のRNAi分子を構成する核酸は、必要に応じて、リン酸基、糖及び／又は塩基が核酸用標識物質で標識されていてもよい。核酸用標識物質は、当該分野で公知のあらゆる物質を利用することができる。例えば、放射性同位元素（例えば、32P、3H、14C）、DIG、ビオチン、蛍光色素（例えば、FITC、Texas、cy3、cy5、cy7、FAM、HEX、VIC、JOE、Rox、TET、Bodipy493、NBD、TAMRA）、又は発光物質（例えば、アクリジニウムエスター）が挙げられる。
　本明細書において「変異」とは、遺伝子上又は染色体上に生じる塩基配列の物理的又は構造的変異である。遺伝子上に生じる遺伝子変異と、染色体上に生じる染色体変異があるが、本明細書においては、標的優性変異遺伝子の転写産物上に後述する不連続接合点を生じる変異であれば、いずれであってもよい。また、変異は、自然界において生じた突然変異だけでなく、メタンスルホン酸エチル（EMS）やN-メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジンのような突然変異誘発剤等を用いて人為的に誘発された変異及び分子遺伝学的手法を用いて導入された変異も包含する。
　変異の種類には、例えば、遺伝子における塩基の欠失、挿入若しくは置換、遺伝子の重複若しくは転座、又は染色体の逆位に基づく変異が挙げられる。
　「欠失」とは、野生型遺伝子の塩基配列の一部が失われた変異をいう。ここで、「野生型遺伝子」とは、同種遺伝子のアレル集団内において自然界に最も多く存在し、かつそれがコードするタンパク質又は機能性核酸が本来の機能を有するものである。「機能性核酸」とは、ノンコーディングRNAとも呼ばれ、タンパク質をコードせずにそれ自身で様々な機能を有するRNAである。例えば、転移RNA（tRNA）、リボソームRNA（rRNA）、核内低分子RNA（snRNA）、核小体低分子RNA（snoRNA）、及びマイクロRNA（miRNA）等が該当する。本発明において、一遺伝子における欠失部位は、その欠失遺伝子の転写産物上に不連続接合点をもたらす部位であれば、その欠失塩基数や位置は特に限定はしない。１～５０塩基、１～４０塩基、１～３０塩基、又は１～２０塩基程度の欠失が一般的ではあるが、欠失によって生じる転写産物が結果的にその変異遺伝子を有する個体に優性変異をもたらす範囲であれば、例えば、野生型遺伝子の塩基配列の70％以上、80％以上、又は90％以上が欠失していても構わない。一遺伝子における欠失部位の例としては、図１Aで示すような、１つのエクソン（0101）のコード領域（0102）において、転写開始点（0115）を含まない破線で示した一部領域（0108）が欠失した場合、図１Bで示すような、一以上のイントロンを含む遺伝子において、転写開始点（0115）を含まない一以上のエクソンの全領域（0112）を含む領域（0109）が欠失した場合（一以上のイントロンの全領域及び／又は一部領域を含んでいてもよい；図１Bでは、欠失部位が１つのエクソンの全領域（0112）に加えて、その両側に位置する２つのイントロンの一部（0114）を含む）、図１Cで示すような、一以上のイントロンを含む遺伝子において、少なくとも１つのイントロンの全領域（0113）を含む２つのエクソンの一部（すなわち、上流エクソンの3’側の一部と下流エクソンの5’側の一部）間の領域（0110）が欠失した場合、図１Dで示すような、上流エクソンの3’側の一部とそのエクソンの下流に位置するイントロンの5’側の一部を含む領域が欠失した場合（その間に位置する一以上の他のエクソン及びイントロンの全領域を含んでいてもよい；図１Dでは、１つのエクソンの全領域（0112）及びその両側に位置する一方のイントロンの全領域（0113）と他方のイントロンの一部領域（0114）を含む）が挙げられる。一方、スプライス部位を含まないイントロンの一部領域の欠失や一以上のイントロンの全部領域の欠失は、転写産物上に不連続接合点を生じないため本発明の欠失には該当しない。
　「挿入」とは、野生型遺伝子の塩基配列中に一以上の塩基が挿入された変異をいう。本発明において、遺伝子内における塩基の挿入の位置は、エクソン内であれば特に限定はしない。一方、イントロン内に挿入された場合には、通常、遺伝子発現後にそのイントロンはスプライシングによって除かれ、転写産物上に不連続接合点を生じない。それ故、原則として、イントロン内への塩基の挿入は、本発明の挿入には含まないものとする。ただし、イントロン内の挿入であっても、挿入によって後述するスプライス部位が破壊された場合、挿入された塩基の数が膨大であることによって、そのイントロンがスプライシングにより正常に除去されない場合、又は挿入された塩基の中にエクソンに相当する配列が含まれた結果、スプライシング後の転写産物上に新たなエクソンが挿入される場合のように、転写産物上に不連続接合点を生じるときには、本発明の挿入に含むものとする。挿入される塩基数は、特に限定はされない。例えば、前述のように一塩基挿入であってもよいし、トランスポゾンのように数百塩基以上の挿入であってもよい。
　「置換」とは、野生型遺伝子の塩基が他の塩基と置き換わった変異をいう。置換変異では、通常、野生型遺伝子と変異遺伝子を対比させた場合において、双方の遺伝子及びその転写産物の塩基配列にギャップは生じない。それ故、スプライス部位を破壊し得る置換以外では、通常、その遺伝子の転写産物上に不連続接合点を生じ得ない。一方、スプライス部位を破壊し得る置換であれば、転写産物において、そのスプライス部位の支配下にあるイントロンのスプライシングによる除去が阻害される結果、転写産物上に不連続接合点、すなわち後述するように、野生型遺伝子と変異遺伝子の転写産物の塩基配列間にギャップを生じる。したがって、本発明における置換は、スプライス部位を破壊し得る置換のみを対象とする。ここでいうスプライス部位とは、遺伝子配列において正常なスプライシングを行なう上で必要な部位をいう。例えば、pre-mRNAスプライシングの場合であれば、イントロンの5’末端周辺に位置する5’スプライス部位（ドナー部位）、イントロンの3’末端周辺に位置する3’スプライス部位（アクセプター部位）及びイントロン内に位置するブランチポイント等のイントロン内の所定の位置する一般的な部位が該当する。この他、スプライシングに必要なイントロン内の他の塩基やエクソン内に位置する塩基も包含する。また、tRNAスプライシングやセルフスプライシングの場合であれば、スプライシングに必要なRNA配列内の高次構造の形成に必須の塩基が該当する。置換される塩基数は、スプライス部位を破壊することができれば、特に限定しない。例えば、上記5’スプライス部位におけるG（グアニン）のように、pre-mRNAスプライシングに必須の塩基であれば、一塩基置換の点突然変異であってよい。
　「重複」とは、染色体中に同一の遺伝子が複数個存在する変異をいう。通常、遺伝子の重複は、その遺伝子を含む染色体の一部領域の重複に伴い発生する。本発明においては、遺伝子の一部のみが重複し、それに基づき、その転写産物上に不連続接合点が生じる遺伝子を生じさせる重複が対象となる。
　「転座」とは、遺伝子又は染色体の一部が同一又は異なる染色体上にその位置を変えた変異をいう。本発明においては、転座によって遺伝子の一部が異なる位置に移動した結果、その転座した遺伝子の一部を含む転写産物上に不連続接合点がを生じるものが対象となる。例えば、転座の結果生じたキメラ遺伝子、すなわち異なる二以上の遺伝子が部分的に融合した遺伝子であれば、その転写産物は、その融合の基となった各遺伝子のいずれの転写産物と対比しても不連続接合点を有することとなる。
　「逆位」とは、染色体の一部の方向が逆になった変異をいう。本発明においては、逆位によって遺伝子の一部の方向が逆になった結果、その逆になった遺伝子の一部を含む転写産物上に不連続接合点が生じるものを対象とする。
　「変異遺伝子」とは、野生型遺伝子の塩基配列と異なる塩基を含む遺伝子をいう。本発明において、変異遺伝子は、染色体上に先天的に存在するものの他、後天的に獲得されたものも含む。変異遺伝子は、個体を構成する全ての細胞中に存在する必要はなく、一部の細胞、組織又は器官にのみ存在するものであってもよい。例えば、一の個体において、正常細胞中には存在せず、癌細胞中にのみ存在する変異遺伝子が挙げられる。
　本明細書において「優性変異遺伝子」とは、個体においてその変異に基づく形質が表現型として顕在化する変異遺伝子をいう。結果としてその個体に異常な表現型を優性でもたらす変異遺伝子であれば、その変異遺伝子がコードしているタンパク質又は機能性RNAの活性の有無は問わない。例えば、機能獲得型変異（gain of function mutation）又は機能喪失型変異（loss of function mutation）のいずれであってもよい。機能獲得型変異は、タンパク質に量的上昇（過剰発現：overexpression）又は活性上昇（構成的活性化：constitutive active又は機能亢進型：hyper active）を示す形質をもたらすハイパーモルフ変異（hypermorph mutation）、新規機能活性を示す形質をもたらすネオモルフ変異（neomorph mutation）、及び野生型遺伝子由来のタンパク質と拮抗又はそれを抑制し、野生型遺伝子の形質発現を抑制するアンチモルフ変異（antimorph mutation: dominant negative）を含む。また、機能喪失型変異は、遺伝子が形質発現能を完全に失ったアモルフ変異（amorph mutation）及び遺伝子の形質発現能の低下をもたらすハイポモルフ変異（hypomorph mutation）が挙げられる。機能喪失型変異の場合、通常は劣性となるものが多いが、本明細書においては、その効果が優性となるもののみを対象とする。好ましくは機能獲得型の優性突然変異である。
　本明細書において「不連続接合点」とは、変異遺伝子における転写産物の塩基配列を野生型遺伝子の転写産物の塩基配列と対比したときに、少なくとも１塩基以上のギャップ（このギャップは、転写産物の塩基配列端部に位置していてもよい）の存在により、変異遺伝子の転写産物と野生型遺伝子の転写産物との間で対応する塩基の連続性が途絶える、変異遺伝子の転写産物上の塩基の接合部をいう。不連続接合点は、一の変異遺伝子の転写産物中に一箇所以上あってもよい。
　この不連続性は、変異遺伝子の変異に基づくものである。例えば、図２で示すように、変異が一エクソン内の塩基の欠失である場合、野生型遺伝子Aにおいてｂで示す領域が欠失した変異遺伝子Bの転写産物B’では、野生型遺伝子の転写産物A’との塩基配列を対比したとき、a及びｃで示す領域の塩基配列は対応するが、野生型遺伝子の転写産物におけるa領域の3’末端の塩基とｃ領域の5’末端の塩基間で、その連続性が途絶える。この場合、変異遺伝子の転写産物B’におけるa領域の3’末端の塩基とc領域の5’末端の塩基の接合部（J）が不連続接合点となる。
　また、図３で示すように、変異遺伝子Bにおける欠失（欠失部位を破線で示したCを参照）が、第１エクソン(0301)の3’末端側の一部の塩基と第１イントロン(0303)の5’末端側の一部の塩基からなる領域(0306)である場合、変異遺伝子Bの5’スプライス部位(0305)の欠失により、pre-mRNAスプライシングのよる第１イントロンの除去が阻害され、結果として第１イントロン(0303)の3’末端側の一部の塩基(0304)を含む転写産物B’が生じる。この転写産物B’と野生型遺伝子Aの転写産物A’との塩基配列を対比したときには、5’側では第１エクソン(0301)の3’欠失末端の塩基で、また3’側では第２エクソン(0302)の5’末端の塩基で、その連続性が途絶える。したがって、この場合には、第１エクソン(0301)の3’欠失末端の塩基と5’末端側の一部がトランケ―トした第１イントロン(0304)の5’欠失末端の塩基の接合部（J1）、及び第１イントロン(0304)の3’末端の塩基と第２エクソン(0302)の5’末端の塩基の接合部（J2）の二箇所が不連続接合点となる。
　さらに、図４で示すように、変異遺伝子Bにおける欠失（欠失部位を破線で示したCを参照）が第１イントロン（0404）の3’末端側の一部の塩基と第２エクソン（0402）の5’ 末端側の一部の塩基からなる領域(0406)の欠失である場合、変異遺伝子Bの第１イントロンの3’スプライス部位(0407)の欠失により、第２エクソン（0402）の3’末端側の一部の領域（0408）は、スプライシングによって除去され、その転写産物B’は、第１エクソン（0401）と第３エクソン（0403）が連結された状態となる場合がある。この転写産物B’と野生型遺伝子Aの転写産物A’との塩基配列を対比したとき、第１エクソン（0401）の3’末端の塩基と第３エクソン（0403）の5’末端の塩基間で、その連続性が途絶える。したがって、この場合には、その第１エクソン（0401）の3’末端の塩基と第３エクソン（0403）の5’末端の塩基の接合部（J）が不連続接合点となる。
　また、例えば、図５で示すように、変異遺伝子Bにおける変異が１つのエクソン内への塩基の挿入である場合には、挿入されたc領域を含む変異遺伝子Bの転写産物B’と野生型遺伝子Aの転写産物A’との塩基配列を対比させると、転写産物B’におけるa領域の3’末端とc領域の5’末端、及びc領域の3’末端とb領域の5’末端で、その連続性が途絶える。この場合、変異遺伝子の転写産物B’におけるa領域の3’末端の塩基とc領域の5’末端の塩基の接合部（J1）、及びc領域の3’末端の塩基とb領域の5’末端の塩基の接合部（J2）の２箇所が不連続接合点となる。
　本実施形態において、標的となる遺伝子の種類、及びその遺伝子が由来する生物種は、特に限定はしない。あらゆるタンパク質又は機能性核酸をコードする遺伝子が本実施形態の抑制剤の標的となり得る。また、生物種は、動物、植物のいずれであってもよく、それらのあらゆる種類を包含する。動物であれば、好ましくは脊椎動物、より好ましくは魚類、鳥類又は哺乳動物である。魚類の中でさらに好ましくは水産資源用魚種（例えば、サケ科、スズキ科、タラ科、ニシン科、ヒラメ科、カレイ科、アジ科、イカナゴ科、タイ科及びメバル科の魚種）である。鳥類の中でさらに好ましくは食用種（例えば、ニワトリ、ガチョウ、アヒル、カモ、合鴨、七面鳥、ウズラ、ダチョウ等）である。哺乳動物の中でさらに好ましくは家畜（ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ）、実験用動物（げっ歯類、ウサギ、イヌ、サル）、競争馬、愛玩動物（イヌ、ネコ、ウサギ、サル、げっ歯類）又はヒトである。一層好ましい生物種は、ヒトである。一方、植物であれば、好ましくは種子植物、より好ましくは被子植物、さらに好ましくは食用植物種（例えば、イネ科（例えば、イネ、コムギ、オオムギ、ライムギ、トウモロコシ、コーリャン、アワ）、マメ科（例えば、ダイズ、アズキ、グリーンピース）、ナス科（例えば、トマト、ナス、ジャガイモ、トウガラシ、ピーマン）、ヒルガオ科（例えば、サツマイモ）、バラ科（例えば、イチゴ、アーモンド、モモ、プラム、ウメ、バラ、サクラ）、アブラナ科（例えば、ダイコン、カブ、アブラナ）、アカザ科（例えば、ホウレンソウ、テンサイ）、セリ科、タデ科、ウリ科、キク科、ユリ科、サトイモ科、ブドウ科、ミカン科、ブナ科、ヤシ科等に属する食用の植物種）、繊維資源用植物種（例えば、ワタ、アサ等）、木材資源用植物種（例えば、スギ、ヒノキ、モミ、ツガ、マツ、イチイ、サクラ、カエデ、カシ、ナラ、ブナ、ニレ、ケヤキ、クルミ、ホウ、カツラ、チーク、ラワン、黒檀、マホガニー、ポプラ、ユーカリ等）である。
　前記変異が関与する形質も、特に限定はしないが、好ましくはその発現を抑制したい形質である。例えば、疾患の発症に関与する変異、異常形態に関与する変異等が挙げられる。ここでいう疾患は、例えば、後天的に特定の細胞内のゲノムDNA中に生じた突然変異による疾患や常染色体優性変異疾患を含む。
　後天的に特定の細胞内のゲノムDNA中に生じた突然変異による疾患には、例えば、新生物（腫瘍）、特に悪性新生物（悪性腫瘍、いわゆる癌であって、白血病を含む）が挙げられる。後天的に特定の細胞内のゲノムDNAに生じた塩基配列の挿入又は欠失によって発生する悪性新生物の具体的な例としては、上皮成長因子受容体（EGFR）遺伝子の変異を原因とする非小細胞肺癌（NSCLC）、CTNNB1遺伝子の変異を原因とする大腸癌、CDH1遺伝子の変異を原因とする胃癌、BRCA1遺伝子又はBRCA2遺伝子の変異を原因とする乳癌、AIRE遺伝子の変異を原因とする多腺性自己免疫性内分泌不全症I型、TNFRSF6/APT1/FAS遺伝子の変異を原因とする自己免疫性リンパ増殖症候群等が挙げられる。また、後天的に特定の細胞内のゲノムDNA中に生じた転座を伴う遺伝子の突然変異によって生じる悪性新生物の、より具体的な例としては、BCR遺伝子とABL遺伝子のキメラ遺伝子を原因とする慢性骨髄性白血病(CML)及び急性リンパ性白血病(ALL)、c-myc遺伝子とIgH遺伝子のキメラ遺伝子を原因とするバーキットリンパ腫、NPM遺伝子とALK遺伝子のキメラ遺伝子を原因とする未分化型大細胞リンパ腫、EML4遺伝子とALK遺伝子のキメラ遺伝子を原因とする肺癌、PDGFB遺伝子とCOL1A1遺伝子のキメラ遺伝子を原因とする隆起性皮膚線維肉腫、ETV6遺伝子とNTRK3遺伝子のキメラ遺伝子を原因とする先天性線維肉腫、FUS遺伝子とCREB3L2遺伝子のキメラ遺伝子を原因とする低悪性線維粘液肉腫、EWS遺伝子とCHN遺伝子のキメラ遺伝子を原因とする骨外性粘液型軟骨肉腫、EWS1遺伝子を転座パートナーとするキメラ遺伝子を原因とするユーイング肉腫、SYT遺伝子若しくはSSX遺伝子を転座パートナーとするキメラ遺伝子を原因とする胞巣型横紋筋肉腫、ALK遺伝子を転座パートナーとするキメラ遺伝子を原因とする炎症性筋線維芽細胞性腫瘍、CHOP遺伝子を転座パートナーとするキメラ遺伝子を原因とする脂肪肉腫、ATF1遺伝子を転座パートナーとするキメラ遺伝子を原因とする軟部明細胞肉腫若しくは悪性線維性組織球腫等が挙げられる。
　また、スプライシング異常を伴う疾患であれば、DMPK遺伝子の変異を原因とする筋硬直性ジストロフィー、SMN1遺伝子の変異を原因とする脊髄性筋萎縮症、CHRNE遺伝子の変異を原因とする先天性筋無力症候群、MAPT遺伝子の変異を原因とする前頭側頭葉型痴呆症、GH1遺伝子の変異を原因とする成長ホルモン単独欠損症II型等が挙げられる。
　また、ヒト常染色体優性変異疾患であれば、RHO遺伝子の変異を原因とする先天性夜盲症、KCNQ4遺伝子若しくはGJB遺伝子の変異を原因とする難聴遺伝子領域DFNA2、MITF遺伝子の変異を原因とするワールデンブルグ症候群、DIAPH1/DFNA1遺伝子若しくはPOU4F3遺伝子の変異を原因とする非症候性難聴、TNNT2遺伝子の変異を原因とする肥大型心筋症、MYBPC3遺伝子の変異を原因とする家族性肥大型心筋症、TNNI3遺伝子の変異を原因とする心尖部肥大型心筋症、MPZ遺伝子の変異を原因とするシャルコー・マリー・トゥース病1B型、PMP22遺伝子の変異を原因とするシャルコー・マリー・トゥース病1A型、KCNQ1遺伝子若しくはKCNH2遺伝子若しくはSCN5A遺伝子若しくはANK2遺伝子若しくはKCNE1遺伝子若しくはKCNE2遺伝子若しくはKCNJ2遺伝子若しくはCAV3遺伝子若しくはSCN48遺伝子若しくはAKAP9遺伝子若しくはANTA1遺伝子の変異を原因とするQT延長症候群、KCNH2遺伝子若しくはKCNJ2遺伝子の変異を原因とするQT短縮症候群、SCN5A遺伝子若しくはGPD1L遺伝子若しくはCACNA1C遺伝子若しくはCACNB2B遺伝子若しくはSCN1B遺伝子の変異を原因とするブルガタ症候群、RYR2遺伝子の変異を原因とするカテコラミン誘発性多形性心室頻拍、SCN5A若しくはSCN1B遺伝子の変異を原因とする心伝導障害、TDP43遺伝子の変異を原因とする筋萎縮性側索硬化症、PTPN11遺伝子の変異を原因とするヌーナン症候群、又はCaR遺伝子の変異を原因とする低カルシウム血症等が挙げられる。
１－３．RNAi分子の構造
　本実施形態の抑制剤に含まれるRNAi分子は、標的である優性変異遺伝子の転写産物上に生じる少なくとも一つの不連続接合点を含むRNAiセンス鎖領域、及びそれに相補的な塩基配列を含むRNAiアンチセンス鎖領域を含む。
　一例として、本実施形態の抑制剤に含まれるRNAi分子の構造における概念図を図６に示す。この図で示すように、RNAi分子は、二本鎖分子（図６A）又は一本鎖分子（図６B）を包含する。この他、前記RNAiセンス鎖領域及びそれに相補的な塩基配列を含むRNAiアンチセンス鎖領域を含む環状分子(例えば、ダンベル型核酸)を含み得る。
（各RNAi分子に共通する構成要素）
　本実施形態の抑制剤に含まれるRNAi分子は、いずれの形態の場合にも、RNAiセンス鎖領域（0601）、RNAiアンチセンス鎖領域（0602）及び不連続接合点（0603）を必須の構成要素として含む。以下、RNAi分子に共通する構成要素について説明をする。
　「RNAiセンス鎖領域」（0601）とは、標的優性変異遺伝子の転写産物の塩基配列に一致する塩基配列で構成され、その転写産物上に生じる不連続接合点（0603）（図６において、センス鎖領域（0601）では斜線領域と白抜き領域の接合部として表す）を少なくとも一つ含む。また、センス鎖領域（0601）の塩基長は、その転写産物の連続する１６～３０塩基、１８～２５塩基又は１９～２３塩基である。さらに、前記不連続接合点（0603）に隣接する3’側の塩基（0604）を基準（後述する第２基準塩基に相当する）とし、その基準塩基から数えて下流側に向かって３～１６番目の塩基、好ましくは４～１５番目の塩基（0605）、より好ましくは４～１３番目の塩基が該RNAiセンス鎖領域の3’末端塩基を構成する。不連続接合点（0603）が一の転写産物中に複数存在する場合には、いずれか一の不連続接合点に隣接する3’側の塩基を基準塩基とすればよい。
　「RNAiアンチセンス鎖領域」（0602）とは、前記RNAiセンス鎖領域（0601）に完全に相補する塩基配列で構成される。したがって、その塩基配列中には、前記基準塩基、すなわち不連続接合点（0603）に隣接する3’側の塩基に相補的な塩基（0607）を含む。RNAiアンチセンス鎖領域は、本実施形態のRNAi分子が二本鎖分子（図６A）の場合には、RNAiセンス鎖領域を含むポリヌクレオチド鎖とは異なる他方のポリヌクレオチド鎖に含まれるが、一本鎖分子（図６B）の場合には、RNAiセンス鎖領域と同一のポリヌクレオチド鎖に逆方向で含まれる。
　「不連続接合点」(0603)については、既に詳述したことから、ここではその説明を省略する。
　本実施形態のRNAi分子は、ASPスコア値が０．４以上であることを特徴とする。「ASPスコア」（Allele-SPecificity score）とは、ASP-RNAiにおいて重要な要素である対立遺伝子識別能力を数値化したものであり、さらには、正常型遺伝子に対するRNAi分子の非特異的な発現抑制の影響、すなわち、RNAi分子が正常型遺伝子に与える副作用を数値化したものと見なすこともできる。ASPスコア値は、下記式によって導き出される。
　　ASPスコア＝[（対照RNAi分子で処理した正常型遺伝子の標準化した発現量に対する前記RNAi分子で処理した正常型遺伝子の標準化した発現量の相対比）－（対照RNAi分子で処理した変異遺伝子の標準化した発現量に対する前記RNAi分子で処理した変異遺伝子の標準化した発現量の相対比）]×（１－対照RNAi分子で処理した変異遺伝子の標準化した発現量に対する前記RNAi分子で処理した変異遺伝子の標準化した発現量の相対比）
　式中、対照RNAi分子は、本実施形態の有効成分であるsiRNA分子のネガティブコントロールとなるRNAi分子で、前記正常型遺伝子及び変異遺伝子の発現に影響を及ぼさないRNAi分子であり、それ故、上記式では、対照RNAi分子で処理した標準化した遺伝子の発現量を１００％とみなす。例えば、標的となる遺伝子が存在しない任意の塩基配列を含むRNAi分子が該当する。上記式において、標準化後の発現量の相対比が「１．０」を超えた場合、それは発現抑制効果が無いものとみなし、その相対比を「１．０」として算出する。
　ASPスコアによれば、変異遺伝子に対する「特異性」と「抑制効果」の両者を反映できる。例えば、あるRNAi分子のASPスコア値が低い場合には、そのRNAi分子が、たとえ変異遺伝子の発現を強く抑制できる場合であっても、特異性が低いゆえに同時に野生型遺伝子の発現までも強く抑制してしまうこと、すなわち野生型遺伝子に対する副作用が強いことを意味する。ASPスコア値が０．４以上であれば、そのRNAi分子は、変異遺伝子の発現を抑制し、かつ野生型遺伝子に対する副作用がないか又は比較的弱い効果を有することから、ASP-RNAiとして機能し得る。
　ASPスコアの算出のための正常型遺伝子と変異遺伝子の発現量の測定については、各発現量を同一の方法によって測定するのであれば、当該分野で公知のいずれの方法を用いてもよく、特に限定しない。また、標準化は、RNAi分子による発現抑制を受けない内部または外来性コントロール遺伝子の発現量に基づいて行なえばよい。好ましくは、Ohnishi Y.ら（2006, Journal of RNAi and Gene Silencing, Vol. 2: 154-160）によって開発されたレポーター遺伝子発現プラスミドを用いて、後述する実施例１に記載の条件で、ホタルとウミシイタケのルシフェラーゼ等のレポーター遺伝子の発現と、コントロールとしてRNAi分子による発現抑制を受けないβ-ガラクトシダーゼ遺伝子の発現に基づいて、野生型遺伝子と変異遺伝子の発現量を測定することである。
（二本鎖RNAi分子の構成要素）
　本実施形態の抑制剤に含まれるRNAi分子がsiRNAのような二本鎖分子の場合、前記図６Aに示すように、上記RNAi分子共通構成要素であるRNAiセンス鎖領域（0601）、RNAiアンチセンス鎖領域（0602）及び不連続接合点（0603）に加えて、任意でさらにそれぞれのポリペプチド鎖の3’末端に3’末端付加塩基（0606）を含むことができる。「3’末端付加塩基」（0606）は、TT（チミン‐チミン）又はUU（ウラシル‐ウラシル）の２塩基で構成される。この塩基を付加したRNAi分子は、RNAi抑制効率を高めることができる（Tuschl T et al., 1999, Genes Dev, 13(24):3191-7）。
（一本鎖RNAi分子の構成要素）
　本実施形態の抑制剤に含まれるRNAi分子がshRNAのような一本鎖分子の場合、前記図６Bに示すように、上記RNAi分子共通構成要素であるRNAiセンス鎖領域（0601）、RNAiアンチセンス鎖領域（0602）及び不連続接合点（0603）に加えて、さらにRNAiセンス鎖領域（0601）と、それとは逆向きのRNAiアンチセンス鎖領域（0602）とを連結する短いスペーサー配列（0608）を含む。スペーサー配列は、通常３～２４塩基、好ましくは、４～１５塩基からなる任意の塩基配列とすることができる。したがって、RNAi分子が一本鎖の場合、分子全体として、３５塩基（１６×２＋３）～８４塩基（３０×２＋２４）からなる。RNAi分子内では、RNAiセンス鎖領域とRNAiアンチセンス鎖領域が互いに塩基対合し、その間に位置するスペーサー配列がループ構造を形成することによって、分子全体がヘアピン型のステム－ループ構造をなし得る。前記構造を有する一本鎖RNAi分子が細胞内に導入されると、細胞質内でDicerと呼ばれるエンドヌクレアーゼの働きによって二本鎖siRNAに加工され、そのうちRNAiアンチセンス鎖領域がRISC（RNA-induced silencing complex）複合体に取り込まれた後、前述の二本鎖RNAi分子と同様のRNAi機構によって標的遺伝子の転写後翻訳前発現を抑制することができる。一本鎖分子におけるRNAiセンス鎖領域（0601）とRNAiアンチセンス鎖領域（0602）は、前記二本鎖RNAi分子と同様に、それぞれの領域の3’末端に3’末端付加塩基を含むこともできる。一本鎖分子における5’末端、及び／又は3’末端には、任意の配列を付加することもできる。例えば、5’末端及び／又は3’末端にステムループ構造を形成し得る塩基配列を付加することもできる。
１－４．発現ベクターの構成
　本明細書において「発現ベクター」とは、本実施形態の阻害剤に含まれる有効成分であって、前記RNAi分子をコードするDNAを発現可能なように発現用ベクター内に挿入したベクターである。
　本実施形態の発現ベクターは、RNAi分子がsiRNAのような二本鎖分子の場合、RNAiセンス鎖領域及びRNAiアンチセンス鎖領域のそれぞれをコードするDNA断片を、異なる二つの発現用ベクターに挿入していてもよく、また一つの発現用ベクター内に独立に発現制御されるDNA断片として挿入していてもよい。一方、RNAi分子がshRNAのような一本鎖分子の場合、当該一本鎖RNA分子をコードするDNA断片が発現用ベクター内の所定の位置に挿入されていればよい。
　本明細書において、「発現用ベクター」とは、本実施形態の発現ベクターにおける骨格部分、すなわち、本実施形態の発現ベクターにおいて実施形態１のRNAi分子をコードするDNA断片以外の部分をいう。発現用ベクターの種類は、特に限定はしないが、プラスミド又はウイルスが好ましい。これらは、導入する宿主に応じて適宜選択すればよい。例えば、導入する宿主がヒトの場合には、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、センダイウイルス、アデノ随伴ウイルス等のウイルス、あるいは非ウイルスベクターを基礎とするベクターのような公知の発現ベクターを使用することができる。また、導入する宿主が植物の場合には、pBI系若しくはpRI系のバイナリーベクター等のプラスミドやカリフラワーモザイクウイルス（CaMV）、インゲンマメゴールデンモザイクウイルス（BGMV）、タバコモザイクウイルス（TMV）等のウイルスを利用することができる。さらに、導入する宿主が大腸菌の場合には、例えば、pBI系、pPZP系、pSMA系、pUC系、pBR系、pBluescript系（stratagene社）等のプラスミドを利用することができる。この他、各ライフサイエンスメーカーから市販されている様々な各種宿主用発現ベクターを利用してもよい。
　前記発現用ベクターは、プロモーター、エンハンサー、若しくはターミネーターのような調節領域、又は選抜マーカー遺伝子のような標識領域を含むことができる。それぞれの種類は、特に限定されない。発現ベクターを導入する宿主に応じて当該分野で公知のものを適宜選択すればよい。
　大腸菌中で動作可能なプロモーターとしては、例えば、lac、trp若しくはtacプロモーター又はファージ由来のT7、T3、SP6、PR若しくはPLプロモーター等が挙げられる。酵母で動作可能なプロモーターとしては、例えば、酵母解糖系遺伝子由来のプロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター、TPI1、ADH2-4cプロモーター等が挙げられる。植物細胞で動作可能なプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）の35Sプロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター（Pnos）、トウモロコシ由来ユビキチンプロモーター、イネ由来のアクチンプロモーター、タバコ由来PRタンパク質プロモーター等が挙げられる。昆虫細胞で動作可能なプロモーターとしては、例えば、ポリヘドリンプロモーター、P10プロモーター、オートグラファ・カリホルニカ・ポリヘドロシス塩基性タンパクプロモーター、バキュロウイルス即時型初期遺伝子１プロモーター、バキュロウイルス39K遅延型初期遺伝子プロモーター等が挙げられる。そして、ヒトをはじめとする動物細胞内で動作可能なプロモーターとしては、RNAポリメラーゼII(PolII)系のプロモーターやRNAポリメラーゼIII(Pol III)系のプロモーターが好適に用いられる。好ましくは、Pol III系のプロモーター、特に好ましくはU6及びH1等のプロモーターである。また、いずれの宿主の場合にも、生体内の特定の部位でのみ発現を誘導する部位特異的プロモーターを使用することもできる。なお、異なる二つの発現用ベクターのそれぞれにRNAiセンス鎖領域及びRNAiアンチセンス鎖領域をコードするDNA断片を挿入した場合、各RNA鎖が同程度の量で発現するように、プロモーターは、同一のプロモーター又は同程度の発現活性を有する異なるプロモーターを用いることが好ましい。
１－５．RNAi分子の設計と製造
　本実施形態の抑制剤に含まれるRNAi分子の設計方法について説明をする。本設計方法は、図７で示すように、基準塩基設定工程（0701）、3’末端塩基設定工程（0702）、RNAiセンス鎖領域設定工程（0703）、及びRNAiアンチセンス鎖領域設定工程（0704）を含む。以下、それぞれの工程について説明をする。
　「基準塩基設定工程」（0701）とは、標的とする優性変異遺伝子において、その転写産物上の不連続接合点に隣接する5’側及び3’側の塩基をそれぞれ第１及び第２基準塩基として設定する工程である。優性変異遺伝子の転写産物中に不連続接合点が二箇所以上存在する場合には、いずれか一の不連続接合点を選択する。その場合、選択された不連続接合点に隣接する5’側及び3’側の塩基がそれぞれ第１及び第２基準塩基となる。
　「3’末端塩基設定工程」（0702）とは、前記第２基準塩基に対応する塩基を起点に、下流側に向かって４～１５番目、好ましくは４～１４番目又は４～１３番目の塩基がRNAiセンス鎖領域の3’末端塩基に対応するように設定する工程である。
　「RNAiセンス鎖領域設定工程」（0703）とは、優性変異遺伝子の転写産物の塩基配列において、第１及び第２基準塩基を含む連続する１６～３０塩基をRNAiセンス鎖領域として設定する工程である。前記3’末端塩基設定工程により3’末端の塩基が決定していることから、転写産物の塩基配列上において、その3’末端の塩基に対応する塩基から数えて、上流に向かって、第１及び第２基準塩基を含むようにして、１６～３０塩基をRNAiセンス鎖領域として設定すればよい。本工程によってRNAi分子の優性変異遺伝子に対する標的領域が定まる。
　「RNAiアンチセンス鎖領域設定工程」（0704）とは、設定されたRNAiセンス鎖領域の塩基配列に相補的な塩基配列を含む塩基配列をRNAiアンチセンス鎖領域として設定する工程である。
　以上の工程は、本実施形態の抑制剤に含まれるRNAi分子の形態 (例えば、一本鎖RNAi分子、二本鎖RNAi分子又は環状型RNAi分子等)にかかわらず共通する工程である。次に、3’末端付加工程及びスペーサー連結工程、ASPスコア選抜工程を説明する。　「3’末端付加工程」は、前記で設計したRNAiセンス鎖領域及びRNAiアンチセンス鎖領域のそれぞれの3’末端にTT（チミン‐チミン）又はUU（ウラシル‐ウラシル）を付加することを特徴とする。本工程は、任意工程であるため、必要に応じて追加すればよい。
　「スペーサー連結工程」は、一本鎖RNAi分子又は環状型RNAi分子に特有で、かつ必須の工程である。本工程は、前記で設計したRNAiセンス鎖領域の3’末端（本工程に先立ち、RNAiセンス鎖領域が3’末端付加工程を経た場合であれば、RNAiセンス鎖領域の3’末端に付加されたTT又はUUの3’末端）とRNAiアンチセンス鎖領域の5’末端を（すなわち、RNAiセンス鎖領域とは逆方向で）それぞれスペーサー配列の3’末端と5’末端に連結して、一本鎖分子又は環状型RNAi分子にする工程である。スペーサー配列は、３～２４塩基、好ましくは４～１５塩基からなる任意の塩基配列でよい。好ましくは、スペーサー配列内で塩基対合を形成しない塩基配列である。
　「ASPスコア選別工程」は、上記工程によって調製されたRNAi分子のうち、ASPスコア値が０．４以上あるRNAi分子のみを選別する工程である。
　ASPスコアは、上記式から算出すればよい。
　本実施形態のRNAi分子は、前述の方法によって設計された塩基配列に基づいて、化学的合成法によって合成することができる。RNAi分子の化学合成は、各ライフサイエンスメーカー（例えば、シグマアルドリッチ社、ベックス社、タカラバイオ社、インビトロジェン社等）が受託製造サービスを行っており、それらを利用することもできる。また、本実施形態のRNAi分子は、前述の方法によって設計された塩基配列を一旦DNA配列に変換し、その配列に基づいてDNAを化学合成したものをクローニングした後に、当該分野で公知のin vitro RNA転写法によってRNAとして調製することができる。in vitro RNA転写法は、例えば、Sambrook, J. et. al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual Second Ed., Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New Yorkを参照すればよい。また、Ui-Teiらの方法（Nucleic Acids Res., 32:936-948, 2004）、Reynoldsらの方法（Nat. Biotechnol., 22:326-330, 2004）、Amarzguiouiらの方法（Biochem. Biophys. Res. Commun., 316: 1050-1058, 2004）を参考にすることができる。
１－６．発現ベクターの調製
　本実施形態の抑制剤に含まれる発現ベクターの調製方法は、基本的には、当該分野で公知の方法、例えば、Sambrook, J. et. al., (1989) Molecular Cloning: a Laboratory Manual Second Ed., Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New Yorkに記載の方法に従って調製することができる。
　具体的な例を挙げると、まず、前述の「１－５．RNAi分子の設計と製造」の項で説明した方法に従い、RNAi分子の塩基配列を決定する。続いて、それに対応するDNA配列に基づき、センス鎖DNA及びアンチセンス鎖DNAを化学合成法等によってそれぞれ合成する。このとき各鎖の両末端に適当な制限部位を付加するか、各鎖のアニーリング後に適当なコヘシブ末端が形成されるようにしておくことが好ましい。DNA合成は、ライフサイエンス関連メーカー各社が受託合成サービスを行っており、それを利用することもできる。合成後の両鎖を混合してアニーリングさせ、二本鎖DNA断片を調製した後、末端に制限部位を付加していた場合には、必要に応じてその制限酵素で切断する。さらに、各鎖の5’末端を必要に応じてT4ポリヌクレオチドキナーゼ等でリン酸化する。続いて、発現用ベクターのプロモーター下流の対応する制限部位に前記調製した二本鎖DNA断片を連結する。DNA断片は、一旦適当なクローニングベクターに連結してクローン化した後、それから切り出したものを発現用ベクターに連結してもよい。
　また、3’末端付加塩基を有するRNAi分子を発現させるためには、予めRNAiセンス鎖領域及びRNAiアンチセンス鎖領域のそれぞれの3’末端にTTを挿入しておくことに留意する。本工程は、任意工程であるため、必要に応じて追加すればよい。
１－７．変異型EGFR遺伝子発現抑制剤
　本実施形態の優性変異遺伝子発現抑制剤の一例として、変異型EGFR（上皮成長因子受容体）遺伝子の発現を特異的に抑制するRNAi分子（EGFR-RNAi分子）を有効成分とする変異型EGFR遺伝子発現抑制剤が挙げられる。ここでいう変異型EGFR遺伝子とは、後天的に発生する優性変異遺伝子で、非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer；NSCLC）の原因となる遺伝子である。EGFRの細胞外ドメインに上皮成長因子（EGF）等のリガンドが結合すると、通常は細胞内ドメインのチロシンキナーゼ活性化され、自己リン酸化作用が作動する。変異型EGFR遺伝子では、EGFR遺伝子の特定の塩基に置換、欠失、挿入が生じ、下流の細胞内シグナル伝達経路が構成的に活性化状態にある機能獲得型となることによって発生すると考えられている（Paez G.J. et al., Science, 2004, 304；1497-1500）。
　本実施形態の変異型EGFR遺伝子発現抑制剤は、このような変異型EGFR遺伝子において、置換以外の欠失及び挿入等の変異に基づく遺伝子の発現を特異的に抑制することができる。
　本実施形態の変異型EGFR遺伝子発現抑制剤の具体的な例としては、図８－１、９－１、１０－１、及び１１－１の各Aで示すように、ヒトEGFR遺伝子の一部塩基が欠失したdel(E746-A750）変異及びdel(L747-T751)-L747S変異、また一部塩基の欠失と挿入が生じたdel(L747-E749)-A750P変異のそれぞれに対するEGFR-RNAi分子を有効成分とする変異型EGFR遺伝子発現抑制剤が挙げられる。なお、del(L747-E749)-A750P変異については、後述するように、コードするアミノ酸配列が同一であっても、塩基配列の欠失と挿入の相違によって、GとAの一塩基の違いを有する2種類の変異が存在する。本明細書では、del(L747-E749)-A750P変異において、それらの変異の違いを区別する必要がある場合には、以降、便宜的にGを有する変異をdel(L747-E749)-A750P(G)変異（図１０－１A）とし、またAを有する変異をdel(L747-E749)-A750P(A)変異（図１１－１A）とする。より具体的な変異型EGFR遺伝子発現抑制剤としては、例えば、del(E746-A750）の発現抑制剤として、センス鎖領域が、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９又は２１で示される一本鎖若しくは二本鎖のRNAi分子、又はそのRNAi分子をコードするDNAを動作可能なように連結した発現ベクターが挙げられる。また、del(L747-T751)-L747Sの発現抑制剤としては、例えば、センス鎖領域域が、配列番号２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７又は４９で示される一本鎖若しくは二本鎖のRNAi分子、又はそのRNAi分子をコードするDNAを動作可能なように連結した発現ベクターが挙げられる。さらに、del(L747-E749)-A750P(G)の発現抑制剤としては、例えば、センス鎖領域が、配列番号５３、５５、５９、６１、６３、６５又は６７で示される一本鎖若しくは二本鎖のRNAi分子、又はそのRNAi分子をコードするDNAを動作可能なように連結した発現ベクターである。あるいは、del(L747-E749)-A750P(A)の発現抑制剤としては、例えば、センス鎖領域が、配列番号１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３又は１４５で示される一本鎖若しくは二本鎖のRNAi分子、又はそのRNAi分子をコードするDNAを動作可能なように連結した発現ベクターである。
１－８．BCR-ABLキメラ遺伝子発現抑制剤
　本実施形態の優性変異遺伝子発現抑制剤の一例として、フィラデルフィア染色体における転座変異によって生じたBCR-ABLキメラ遺伝子の発現を特異的に抑制するRNAi分子（BCR-ABL-RNAi分子）を有効成分とするBCR-ABLキメラ遺伝子発現抑制剤が挙げられる。ここでいうBCR-ABLキメラ遺伝子とは、後天的に発生する優性変異遺伝子で、慢性骨髄性白血病(CML)又は急性リンパ性白血病(ALL)の原因遺伝子とみなされている。
　フィラデルフィア染色体(Ph染色体)は、慢性骨髄性白血病(CML)の90%以上、及び急性リンパ性白血病(ALL)の約20%の症例で見出され、９番染色の一部が２２番染色に転座した構造を有する腫瘍特異的な染色体である。この転座によって、９番染色体長腕(9q34)に座位するABL遺伝子と２２番染色体長腕(22q11)に座位するBCR遺伝子とが相互転座してBCR-ABLキメラ遺伝子が形成される結果、チロシンキナーゼ活性の亢進したp210又はp190タンパク質が生産される。本実施形態のBCR-ABLキメラ遺伝子発現抑制剤は、このようなBCR-ABLキメラ遺伝子の発現を特異的に抑制することができる。
　本実施形態のBCR-ABLキメラ遺伝子発現抑制剤の具体的な例としては、図１２－１及び１３－１のAで示すように、BCR-ABLキメラ遺伝子に対するBCR-ABL-RNAi分子を有効成分とするBCR-ABLキメラ遺伝子発現抑制剤が挙げられる。より具体的には、例えば、センス鎖領域が、配列番号９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１又は１１３で示される一本鎖若しくは二本鎖のRNAi分子、又はそのRNAi分子をコードするDNAを動作可能なように連結した発現ベクターである。
１－９．効果
　本実施形態の遺伝子発現抑制剤によれば、有効成分のRNAi分子は、非標的遺伝子の発現に対しては、ほとんど影響を及ぼすことなく、標的遺伝子の発現を選択的、かつ効率的に抑制することができる。
　本実施形態の抑制剤によれば、細胞内に導入する際に、RNAi分子を有効成分とする場合にはそのRNAi分子がそのままで、また発現ベクターを有効成分とする場合にはその発現ベクターに含まれるDNAにコードされたRNAi分子が発現した後に、標的とする優性変異遺伝子に作用して、RNAiサイレンシング機構によってその発現を抑制することができる。したがって、抑制剤がRNAi分子を含む場合には、投与した細胞等に比較的短時間でそのRNAiによる抑制効果を付与することができる。一方、抑制剤が発現ベクターを含む場合には、投与後の細胞内で発現ベクターが維持されている限り前記効果を継続的に付与し続けることができる。したがって、これらを併用することで、効果的に優性変異遺伝子の発現を抑制することができる。
　本実施形態の抑制剤を用いれば、後述する医薬組成物に加えることで、様々な疾患を治療又は軽減することができる。
２．医薬組成物
　本発明の第２の実施形態は、医薬組成物である。
２－１．構成
　本発明の医薬組成物は、有効成分として前記実施形態１の優性変異遺伝子発現抑制剤を含有する。優性変異遺伝子発現抑制剤は、標的とする優性変異遺伝子に対するRNAi分子又はそのRNAi分子をコードするDNAを動作可能なように連結した発現ベクターを、単独で含んでいても良いし、同一遺伝子を標的とする一以上の異なるRNAi分子及び／又は一以上の異なるRNAi分子をコードするDNAを動作可能なように連結した発現ベクターを含んでいてもよい。
　例えば、本実施形態の医薬組成物の有効成分が変異型EGFR遺伝子発現抑制剤であって、その抑制剤が二以上の異なるEGFR-RNAi分子を含む場合には、前記del(E746-A750）変異遺伝子を標的とするEGFR-RNAi分子（例えば、センス鎖領域が配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９又は２１で示される塩基配列を含む）、del(L747-T751)-L747S変異遺伝子を標的とするEGFR-RNAi分子（例えば、センス鎖領域が配列番号２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７又は４９で示される塩基配列を含む）、del(L747-E749)-A750P(G)変異遺伝子を標的とするEGFR-RNAi分子（例えば、センス鎖領域が配列番号５３、５５、５９、６１、６３、６５又は６７で示される塩基配列を含む）及びdel(L747-E749)-A750P(A)変異遺伝子を標的とするEGFR-RNAi分子（例えば、センス鎖領域が配列番号、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３又は１４５で示される塩基配列を含む）からなる群より選択される二以上のRNAi分子を含むことができる。
　また、変異型EGFR遺伝子発現抑制剤がEGFR-RNAi分子とEGFR-RNAi分子発現ベクター（例えば、そのEGFR-RNAi分子及び／又は異なるEGFR-RNAi分子をコードするDNAを動作可能なように連結したもの）を含むこともできる。
　さらに、実施形態の医薬組成物は、製薬上許容可能な範囲内で、かつ前記実施形態１の優性変異遺伝子発現抑制剤中のRNAi分子及び／又は発現ベクターを失活させない範囲において他の有効成分を包含することのできる、いわゆる複合製剤であってもよい。
　ここでいう他の有効成分は、前記実施形態１の優性変異遺伝子発現抑制剤と同一の遺伝子を標的とするが、前記実施形態１の有効成分とは異なる構成を有するRNAi分子及び／又はそのRNAi分子をコードするDNAを動作可能なように連結した発現ベクターを含む発現抑制剤とすることができる。一例として、変異型EGFR遺伝子を標的遺伝子とする場合、前記実施形態１に記載の構成を有するEGFR-RNAi分子及び／又はそのRNAi分子をコードするDNAを動作可能なように連結した発現ベクターを含む優性変異遺伝子発現抑制剤に加えて、例えば、センス鎖領域が、配列番号８３又は８５で示されるRNAi分子、及び／又はそのRNAi分子をコードするDNAを動作可能なように連結した発現ベクターを含む優性アレル発現抑制剤が挙げられる。この他、前記の優性アレル発現抑制剤とは異なる優性変異遺伝子発現抑制剤であって、後述の実施例４で説明するセンス鎖領域が配列番号８９で示されるRNAi分子及び／又はそのRNAi分子をコードするDNAを動作可能なように連結した発現ベクターを有効成分として含む抑制剤を含有することもできる。このような、同一遺伝子の異なる変異部位を標的として、それぞれの変異に基づく遺伝子の発現を抑制する抑制剤を有効成分とする複合製剤は、標的遺伝子の変異部位が明らかでない場合に有用である。前記抑制剤の有効成分であるRNAi分子は、標的変異遺伝子に対する特異性が高いことから、混合しても他の遺伝子の発現を抑制するような副作用やRNAi分子及び／又は発現ベクターを失活させる可能性がほとんどないという利点を有する。
　また、他の有効成分は、前記実施形態１の優性変異遺伝子発現抑制剤と異なる薬理作用を有する薬剤であってもよい。例えば、抗生物質等が挙げられる。
　本発明の医薬組成物は、有効成分であるRNAi分子及び／又は発現ベクターの媒体を含む。媒体には、例えば、水、エタノール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアレルアルコール、ポリオキシ化イソステアレルアルコール及びポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類のような溶媒が挙げられる。このような媒体は、殺菌されていることが望ましく、必要に応じて血液と等張に調整されていることが好ましい。
　本発明の医薬組成物において、医薬組成物中の有効成分であるRNAi分子及び／又は発現ベクターの含有量は、治療対象となる疾患の原因遺伝子の種類、その遺伝子の発症作用機序、RNAi分子の作用効果及び安定性、発現ベクターの発現量、医薬組成物の剤形、使用する担体の種類、及び投与方法、投与する被検体の状態等の様々な条件によって異なる。これらは、当該分野の公知技術に基づいて適宜選択すればよい。本発明のRNAi分子又は発現ベクターの含有量の具体例は、他の医薬の併用を必要としないヒト成人男子（体重60 kg）に対して注射液によって投与する場合、注射液一投与単位あたり約0．01％(w/v)～約20％(w/v)、好ましくは約0.1％(w/v)～約10％(w/v)で含まれていればよい。具体的には、例えば、１回1mLの注射剤中にはsiRNAが通常1μg～200μg含まれていればよい。また、本発明の医薬組成物の薬理効果を得る上で、本発明の核酸の大量投与が必要な場合、被検体に対する負担軽減のために数回に分割して投与することもできる。
　本発明の医薬組成物は、必要に応じてさらに製薬上許容可能な担体を含むことができる。「製薬上許容可能な担体」とは、製剤技術分野において通常使用する添加剤をいう。例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、充填剤、乳化剤、流動添加調節剤、滑沢剤等が挙げられる。
　賦形剤としては、単糖、二糖類、シクロデキストリン及び多糖類のような糖（より具体的には、限定はしないが、グルコース、スクロース、ラクトース、ラフィノース、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、デキストリン、マルトデキストリン、デンプン及びセルロースを含む）、金属塩（例えば、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム若しくはリン酸カルシウム、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム）、クエン酸、酒石酸、グリシン、低、中、高分子量のポリエチレングリコール（PEG）、プルロニック、カオリン、ケイ酸、あるいはそれらの組み合わせが例として挙げられる。
　結合剤としては、トウモロコシ、コムギ、コメ、若しくはジャガイモのデンプンを用いたデンプン糊、単シロップ、グルコース液、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、セラック及び／又はポリビニルピロリドン等が例として挙げられる。
　崩壊剤としては、前記デンプンや、乳糖、カルボキシメチルデンプン、架橋ポリビニルピロリドン、アガー、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、アルギン酸若しくはアルギン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド又はそれらの塩が例として挙げられる。
　充填剤としては、前記糖及び／又はリン酸カルシウム（例えば、リン酸三カルシウム、若しくはリン酸水素カルシウム）が例として挙げられる。
　乳化剤としては、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステルが例として挙げられる。
　流動添加調節剤及び滑沢剤としては、ケイ酸塩、タルク、ステアリン酸塩又はポリエチレングリコールが例として挙げられる。
　このような担体は、主として前記剤形形成を容易にし、また剤形及び薬剤効果を維持する他、優性変異遺伝子発現抑制剤の有効成分であるRNAi分子が生体内の核酸分解酵素による分解を受け難くするために用いられるものであり、必要に応じて適宜使用すればよい。上記の添加剤の他、必要であれば矯味矯臭剤、可溶化剤、懸濁剤、希釈剤、界面活性剤、安定剤、吸収促進剤、増量剤、付湿剤、保湿剤、吸着剤、崩壊抑制剤、コーティング剤、着色剤、保存剤、抗酸化剤、香料、風味剤、甘味剤、緩衝剤等を含むこともできる。
　本発明の医薬組成物は、前記RNAi分子が有する薬理効果を失わない範囲において、他の薬剤を含有することもできる。例えば、注射剤の場合であれば、抗生物質を所定量含有していても良い。
　本実施形態の医薬組成物の剤形は、抑制剤中の有効成分であるRNAi分子又は発現ベクター、さらには他の付加的な有効成分を不活化させない形態であれば特に限定しない。RNAは、一般に不安定であることから、RNAi分子を投与する場合には生体内で分解され難い剤形が好ましい。例えば、液体、固体又は半固体のいずれであってもよい。具体的な剤形としては、例えば、注射剤、懸濁剤、乳剤、点眼剤、点鼻剤、クリーム剤、軟膏剤、硬膏剤、シップ剤及び座剤等の非経口剤形又は液剤、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、舌下剤、トローチ剤等の経口剤形が挙げられる。RNAi分子又は発現ベクターを有効成分とする抑制剤を含む本実施形態の医薬組成物の場合、剤形は注射剤であることが好ましい。
　また、本実施形態の医薬組成物又は前記実施形態１の優性変異遺伝子発現抑制剤をナノ粒子(例えば、Davis ME， et al.，Nature， 2010, 464:1067-1070に記載の標的ナノ粒子伝達システムを含む)、リポソーム（例えば、膜透過ペプチド結合リポソーム、SNALPsを含む）、コレステロール結合体の形態に調製してもよい。Castanotto D. & Rossi JJ.， Nature，2009， 457, 426－433に記載のRNAi伝達システムを利用することもできる。
２－２．投与方法
　本実施形態の医薬組成物は、目的とする疾患の治療のために製薬上有効な量を生体に投与することができる。投与する対象となる生体は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。
　本明細書において「製薬上有効な量」とは、本発明の医薬組成物に含まれる抑制剤の有効成分であるRNAi分子及び／又は発現ベクターが、対象とする疾患を治療する又は症状を軽減する上で必要な用量（具体的には疾患原因である優性変異遺伝子の形質発現を抑制することができる用量）であって、かつ投与する生体に対して有害な副作用（例えば、野生型遺伝子等の発現抑制等）がほとんどないか又は全くない用量をいう。その具体的な量は、標的とする遺伝子の種類、優性変異遺伝子の形質発現効果、使用する剤形、被検体（ヒトの場合には被験者）の情報及び投与経路によって異なる。ヒトに投与する場合には、製薬上有効な量の範囲及び好適な投与経路は、一般に細胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデータに基づいて策定される。最終的な投与量は、個々の被験者に応じて医師の判断により決定され、調整される。その際に、勘案される被験者の情報には、病気の進行度若しくは重症度、全身の健康状態、年齢、体重、性別、食生活、薬剤感受性及び治療に対する耐性等が含まれる。
　本発明のRNAi分子は、全身投与又は局所的投与のいずれであってもよい。疾患の種類、発症箇所又は進行度等に応じて適宜選択することができる。発症箇所が局部的な疾患であれば、注射などにより発症箇所及びその周辺に直接投与する局所的投与が好ましい。治療すべき箇所（組織又は器官）に本発明のRNAi分子を十分量投与することができ、また他の組織に影響を及ぼしにくいからである。一方、転移性癌のように治療箇所を特定できない場合や発症が全身性の疾患の場合には、限定はしないが、静脈注射等による全身投与が好ましい。血流を介して本発明のRNAi分子を全身に行き渡らせることで、診断で発見できない病変部にも投与が可能となるからである。
　本発明のRNAi分子は、含有される有効成分が失活しないあらゆる適当な方法で投与することができる。例えば、非経口（例えば、注射、エアロゾル、塗布、点眼、点鼻）又は経口のいずれであってもよい。好ましくは、注射である。
　注射による投与の場合、注入部位は、特に限定しない。標的分子に対して本発明のRNAi分子又は発現ベクターから生産されるRNAi分子がその機能を発揮し、医薬組成物の目的を達し得ればいずれの部位であってもよい。例えば、静脈内、動脈内、肝臓内、筋肉内、関節内、骨髄内、髄腔内、心室内、経皮、皮下、皮内、腹腔内、鼻腔内、腸内又は舌下等が挙げられる。好ましくは、静脈内注射又は動脈内注射等の血管内への注射である。前述のように血流を介して本発明の医薬組成物を全身に行き渡らせることが可能であり、また侵襲性も比較的低いからである。例えば、前述のDavisらの標的ナノ粒子伝達システム等を用いて、血管内注射によりRNAi分子を全身に投与してもよい。
２－３．用法
　本発明の医薬組成物は、疾患の治療用として使用される。例えば、常染色体優性遺伝疾患のような優性変異遺伝子の発現を原因とする疾患において適用することで、その変異遺伝子の発現を選択的に抑制し、同時に正常な機能を有する遺伝子タンパク質をコードする野生型遺伝子の形質を顕在化できることから、従来その治療が困難であった遺伝病や癌等の治療の他、動植物の品種改良等に利用することができる。したがって、本実施形態の医薬組成物の対象となる疾患は、抑制剤に含まれるRNAi分子又は発現ベクターから発現されるRNAi分子が、標的とする優性変異遺伝子の優性形質に基づく疾患である。このような疾患の具体例としては、例えば、後天的に特定の細胞内のゲノムDNA中に生じた突然変異による疾患や常染色体優性変異疾患を含む。これらの疾患の具体的な例については、前述の通りである。したがって、本実施形態の医薬組成物は、治療対象となる疾患に応じて、その原因遺伝子である優性変異遺伝子に対するRNAi分子又はそれをコードするDNAを含む発現ベクターを有効成分として用いることで、様々な疾患に対して適用できる。
＜実施例1：EGFR遺伝子に対するsiRNAのASP-RNAi効果の検討＞
　変異型EGFR（上皮成長因子受容体）遺伝子の発現を特異的に抑制するsiRNA（EGFR-siRNA）を設計し、変異遺伝子（癌原因遺伝子）に対する発現抑制効果、すなわちASP-RNAi(アレル特異的遺伝子サイレンシング:allele-specific RNAi)効果について検証した。
　機能獲得型の変異型EGFR遺伝子は、非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer；NSCLC）の原因遺伝子である。それ故、本発明のEGFR-siRNAがそのような機能獲得型の変異型EGFR遺伝子の発現のみを特異的に抑制するASP-RNAi効果を有していれば、非小細胞肺癌に対する効果的な治療剤となり得る。
（１）変異型EGFR遺伝子の種類 
　非小細胞肺癌患者では、EGFR遺伝子（アクセッションNo.NM_005228）内に疾患と関連する様々な変異（機能獲得型変異）が見つかっている。例えば、図８－１Aで示すような2235番目から2249番目（開始コドンのAを１番目とする。以下、同じ）の塩基配列が欠失した「del(E746-A750）変異」（前記遺伝子の欠失変異に伴い、開始メチオニンを１番目としたときに746番目のグルタミン酸から750番目までのアラニンが欠失した変異タンパク質を生じる）、図９－１Aで示すような2240番目から2251番目までの塩基配列が欠失した「del(L747-T751)-L747S変異」（前記遺伝子の欠失変異に伴い、747番目のロイシンから751番目のトレオニンが欠失し、また747番目のロイシンがセリンに置換された変異タンパク質を生じる）、図１０－１Aで示すような2238番目から2248番目の塩基配列が欠失し、その欠失部位に新たに２塩基が挿入された「del(L747-E749)-A750P(G)変異」（前記遺伝子の欠失／挿入変異に伴い、747番目のロイシンから749番目までのグルタミン酸が欠失し、750番目のアラニンがプロリンに置換された変異タンパク質を生じる）、さらに図１１－１Aで示すような開始コドンのAから2238番目に相当する塩基、すなわちE746をコードするコドン（GAG）の三番目の塩基が「G」（Pao et al., 2005, PloS Medicine, Vol. 2, Issue 3: e73）ではなく「A」（Paez et al.,2004、 Science, vol.304, 1497-1500）である「del(L747-E749)-A750P（A）変異」等がある。そして、その他、点突然変異も挙げられる。
　そこで、実施形態１に記載のRNAi分子の設計方法に準じて設計し、調製したEGFR-siRNAが、これらの変異遺伝子の発現を特異的に抑制することができるか否かについて検証した。
（２）EGFR-siRNAの設計と調製
　上記del(E746-A750）変異、del(L747-T751)-L747S変異及びdel(L747-E749)-A750P変異については、その変異遺伝子産物（変異mRNA）上で、それぞれ図８－１A、９－１A, 10－１A及び11-１Aにおいて矢頭で示した位置に相当する箇所が本明細書に記載の不連続接合点に相当する。すなわち、del(E746-A750）変異遺伝子及びdel(L747-T751)-L747S変異遺伝子の転写産物では不連続接合点がそれぞれ一箇所、またdel(L747-E749)-A750P変異遺伝子の転写産物では二箇所存在することとなる。そこで、この不連続接合点に隣接する5’側及び3’側の塩基をそれぞれ第１及び第２基準塩基とした（基準塩基設定工程）。del(L747-E749)-A750P変異遺伝子の転写産物は、２つの不連続接合点を有し、かつそれらが僅か１塩基（L747-E749)-A750P(A)の場合）又は２塩基（L747-E749)-A750P(G)の場合）を挟んで近接している。それ故、ここでは、形式的に3’側に位置する不連続接合点に隣接する5’側及び3’側の塩基をそれぞれ第１及び第２基準塩基とした。次に、第２基準塩基に対応する塩基から3’末端までの塩基数を一つずつずらして、RNAiセンス鎖領域の3’末端塩基を設定した（3’末端塩基設定工程）。続いて、各変異遺伝子において、その転写産物の第１及び第２基準塩基を含む連続する１９塩基を含む塩基配列をRNAiセンス鎖領域として設定した（RNAiセンス鎖領域設定工程）。また、設定されたRNAiセンス鎖領域の塩基配列に相補的な塩基配列を含む塩基配列をRNAiアンチセンス鎖領域とした（RNAiアンチセンス鎖領域設定工程）。
　本実施例で設計し、使用したEGFR-siRNAの具体的な塩基配列を表１～４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表１にはdel(E746-A750)変異遺伝子に対して、表２にはdel(L747-T751)-L747S変異遺伝子に対して、表３にはdel(L747-E749)-A750P(G)変異遺伝子、そして表４にはdel(L747-E749)-A750P(A)変異遺伝子に対して、それぞれ設計したsiRNAのセンス鎖領域（ss）及びアンチセンス鎖領域（as）の塩基配列を示している。各表で示す塩基配列は、記載便宜上、センス鎖領域及びアンチセンス鎖領域の3’末端におけるUUからなる3’末端付加塩基を除いている。また、表中の配列番号は、配列表の番号に対応する。
　各表のEGFR-siRNA名については、例えば、表１の「si746/50-3D19」は、del(E746-A750)変異の第２基準塩基を起点として3’末端までの塩基数が３つであり、RNAiセンス鎖領域が１９塩基からなるsiRNAであること表している。すなわち、「si746/50-3D19」の「si746/50」において、「si」はsiRNAを、「746/50」はdel(E746-A750)変異の746～750を、及び「3D19」において、「D」は欠失変異であることを、「3」は第２基準塩基を起点として3’末端までの塩基数が３つであることを、そして、「19」はRNAiセンス鎖領域が１９塩基からなることを、それぞれ表す。ただし、表４に示したdel(L747-E749)-A750P(A)変異遺伝子に対するsiRNA名については、表３に示したdel(L747-E749)-A750P(G)変異遺伝子に対するsiRNAと区別するために、上記基準において「si747/49-3D19」に対しては「si747/49(A) -3D19」のように「(A)」を加えて、del(L747-E749)-A750P(G)変異遺伝子に対するsiRNAと区別するようにした。また、各表のセンス鎖領域（ss）における「＾」は、不連続接合点を示し、また、アンチセンス鎖領域（as）における「＾」は、センス鎖領域内の不連続接合点に対応する位置を示す。各表のセンス鎖領域（ss）において、下線を付した塩基は、第２基準塩基を示している。また、del(L747-E749)-A750P(G)変異における挿入塩基（２塩基）を太字で示している。
　各siRNAの合成は、シグマアルドリッチ社に委託した。合成されたsiRNAは、センス鎖領域及びアンチセンス鎖領域のアニーリング処理が施されており、それを直接実験に使用した。
（３）レポーター遺伝子発現プラスミドの構築
　前記（１）で調製したEGFR-siRNAのRNAi効果の評価の選定のために、ホタル・ルシフェラーゼ（Photinus luciferase）遺伝子を発現するpGL3-TK （Ohnishi Y., et al., 2006, Journal of RNAi and Gene Silencing, Vol. 2: 154-160）と及びウミシイタケ・ルシフェラーゼ（Renilla luciferase）遺伝子を発現するphRL-TK プラスミド（Promega社）を用いて、siRNAの標的となる優性変異遺伝子と非標的の野生型遺伝子のレポーター遺伝子発現プラスミドの構築を行った。
　変異部位を含む合成オリゴDNAの設計、レポーター遺伝子発現プラスミドへの挿入、選定方法については、Ohnishi Y., et al., 2008, PloS One, Vol. 3, Issue 5: e2248に従った。具体的には、非小細胞肺癌の病因となるEGFR遺伝子のdel(E746-A750)、del(L747-T751)-L747S、又はdel(L747-E749)-A750Pの各遺伝子の欠失又は欠失挿入変異部位をそれぞれ含むオリゴDNAのセンス鎖領域及びアンチセンス鎖領域をそれぞれ合成した（シグマアルドリッチ社に委託）。なお、DNA合成の際には、表１～４における各センス鎖領域及びアンチセンス鎖領域のU(ウラシル)をT（チミン）に変換した。変異を持たない野生型遺伝子についても同様に、オリゴDNA合成した。それぞれの具体的な塩基配列を表５及び６に示す。これらのセンス鎖領域及びアンチセンス鎖領域は、EGFR遺伝子断片のセンス鎖領域及びアンチセンス鎖領域の両端に制限酵素切断部位を構成するリンカー配列を含んでいる。表中、リンカー配列を下線で示し、EGFR遺伝子における不連続接合点を「＾」で、各表のセンス鎖領域（ss）における第２基準塩基を黒白反転文字で、そして表５においてdel(L747-E749)-A750P(G)変異遺伝子における挿入塩基（２塩基）と、表６においてdel(L747-E749)-A750P(A)変異遺伝子における挿入塩基（１塩基）を太字で示している。なお、EGFR(T790T)及びEGFR(T790M)は、EGFRの点突然変異用合成オリゴDNAであり、小文字表記した塩基が点突然変異部位を示す。　　
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　次に、合成した各鎖オリゴDNAのアニーリング処理を行った。具体的には、最終容量10μLとなるように、センス鎖領域及びアンチセンス鎖領域の一本鎖オリゴDNA（最終濃度：それぞれ１μM）、10×アニーリングバッファ（インビトロジェン社、最終濃度：1×）及び滅菌水を混合し、80℃で５分間熱処理をした後、室温に３０分間放置し、二本鎖を形成させた。
　続いて、二本鎖オリゴDNAを制限酵素処理した前記２種のプラスミドに挿入した。具体的には、pGL3-TK プラスミドとphRL-TK プラスミドを制限酵素XbaI及びNotIで処理した後、正常型アレルはｐGL3－TKプラスミドにおける、また優性変異遺伝子は、phRL-TKプラスミドにおける、各レポーター遺伝子の3’非翻訳領域（3’UTR）内に挿入して、野生型EGFRレポーター遺伝子発現プラスミド及び優性変異型EGFRレポーター遺伝子発現プラスミドを構築した。また、正常型及び優性変異遺伝子に対してレポーター遺伝子を入れ替えたレポーター遺伝子発現プラスミドも同様に構築した。
（４）細胞培養
　ヒト由来株化細胞であるHeLa細胞を10%ウシ胎仔血清（FBS；Invitrogen社）及び抗生物質（100ユニット/mL ペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン；Wako社）含有のDMEM培養液（Wako社）を用いて、5% CO2下で37℃にて培養した。
（５）トランスフェクション及びレポーターアッセイ
　前記レポーター遺伝子発現プラスミドを用いたレポーターアッセイによって様々なEGFR-siRNAのRNAi効果及びRNAi誘導に好適なRNAi分子の構造的一般法則性について検討した。
　遺伝子導入の前日に、HeLa細胞をトリプシン消化により分散させた後、細胞密度1×105cells/cm2となるように調整して９６ウェル培養プレートに播種し、前記HeLa細胞に抗生物質不含のDMEM培養液で培養を行った。２４時間後、３種類のプラスミド、すなわち、（a）野生型EGFRレポーター遺伝子発現プラスミドであるpGL3-TKバックボーンプラスミド（60ng/ウェル）、（ｂ）変異型EGFR遺伝子の各レポーター遺伝子発現プラスミドであるphRL-TKバックボーンプラスミド（20ng/ウェル）及び（c）外来性コントロールとしてRNAiによる発現抑制を受けないβ-ガラクトシダーゼ遺伝子発現プラスミドであるpSV-β-ガラクトシダーゼ対照用プラスミド（Promega社）（10ng/ウェル）を、EGFR優性変異遺伝子を標的として設計した表１～４で示す様々なEGFR-siRNA（終濃度20nM）と共に導入した。ネガティブコントロールとしては、終濃度20nMのRNAiを誘導しないsiRNA（siControl; QIAGEN社）を用いた。これらの核酸の導入には、リポフェクタミン2000（Invitrogen社）を用いた。トランスフェクション法は、添付されたプロトコールに従った。核酸を導入して２４時間後、Dual-Luciferase reporter assay system （Promega社）のキットに添付された（Dual-Luciferase reporter assay system）細胞溶解バッファ（Passive lysis buffer）を用いて細胞抽出液を調製し、発現したそれぞれのレポーター遺伝子（及び２種のルシフェラーゼ）とコントロールのβ-ガラクトシダーゼの活性をDual-Luciferase reporter assay system（Promega社）及びBeta-Glo assay system（Promega社）を用いてそれぞれ測定した。測定にはFusion Universal Microplate Analyzer（Perkin Elmer社）を用いた。さらに、レポーターに関して、使用した２種のルシフェラーゼ活性の違いによる測定差異の可能性を排除するため、各変異遺伝子del(E746-A750)、del(L747-T751)-L747S、del(L747-E749)-A750P遺伝子に対して、レポーター遺伝子を入れ替えた実験も行った。
（６）結果
　del(E746-A750)変異遺伝子に対する各EGFR-siRNAの結果を図８－１Bに、del(L747-T751)-L747S変異遺伝子に対する各EGFR-siRNAの結果を図９－１Bに、そしてdel(L747-E749)-A750P(G)、及びdel(L747-E749)-A750P(A)変異遺伝子に対する各EGFR-siRNAの結果をそれぞれ図１０－１B、及び図１１－１Bに、示す。各図において、非標的の野生型EGFR遺伝子と、標的の変異型EGFR遺伝子のルシフェラーゼ活性を、それぞれのsiControlのルシフェラーゼ活性を1.0としたときの相対値として算出した。各サンプルのルシフェラーゼ活性は、RNAiによる発現抑制を受けない外来性コントロールであるβ-ガラクトシダーゼの発現量で補正している。
　第２基準塩基を起点に下流側に向かってRNAiセンス鎖領域の3’末端塩基を一つずつずらしながら導入して、全体のRNAiセンス鎖領域の塩基長を１９塩基に保持した場合、図８－１B及び図９－１Bで示すように、４～１５番目の塩基をRNAiセンス鎖領域の3’末端塩基に設定したとき（-4D19～-15D19で示される）に、コントロール（siControl）の発現と比較して、変異型EGFR遺伝子の発現は強く抑制するが、野生型EGFR遺伝子の発現はあまり抑制しないか、コントロールとほとんど変わらないことが明らかとなった。すなわち、これは、ASP-RNAi効果の高い有用なsiRNAであることを意味している。
　一方、図１０－１Bでは、２～９番目の塩基をRNAiセンス鎖領域の3’末端塩基に設定したときに、コントロール（siControl）の発現と比較して、変異型EGFR遺伝子の発現は強く抑制するが、野生型EGFR遺伝子の発現はあまり抑制しないか、又はコントロールとほとんど変わらないことが明らかとなった。この結果は、上記のdel(E746-A750)変異又はdel(L747-T751)-L747S変異の結果と若干のずれがある。しかし、図１０－１A、図１１－１Aで示すように、del(L747-E749)-A750P（G）、(A)には二箇所の不連続接合点が存在し、それぞれ２塩基と１塩基を挟んで双方が近接している。したがって、上述のように本実施例では、形式的に3’側の不連続接合点に隣接する5’側及び3’側の塩基をそれぞれ第１及び第２基準塩基としてsi747/49-2D19～-9D19そしてsi747/49(A)-3D19～-11D19を調製したが、これは、5’側の不連続接合点に隣接する5’側及び3’側の塩基をそれぞれ第１及び第２基準塩基とみなすことも可能であり、その場合、si747/49-4D19～-11D19とsi747/49(A)-4D19～-12D19となり、del(E746-A750)変異又はdel(L747-T751)-L747S変異の結果と一致する。
　したがって、第２基準塩基を起点としてその下流の４～１５番目の塩基をRNAiセンス鎖領域の3’末端塩基に設定することがASP-RNAi効果の高い有用なEGFR-siRNAを設計する上で好適であることが示唆された。
　このように、不連続接合点を含む転写産物を標的とするRNAi分子は、不連続接合点を挟む２塩基（第１及び第２基準塩基）を含みさえすれば、他は任意にその配列を設定してもよいわけではなく、第１及び第２基準塩基がRNAiセンス鎖領域の所定の位置になければ、望ましいASP-RNAi効果が得られないことが示された。この傾向は、多少の振れはみられるものの、後述する実施例５及び図１２及び１３でも示すように、同一遺伝子内の標的領域の塩基配列の差異、又は標的遺伝子の差異にかかわらず認められる現象であることが明らかとなった。
＜実施例２：ヒト非小細胞肺癌由来株化細胞に対するEGFR-siRNAの欠失（又は欠失／挿入）変異遺伝子特異的なRNAi効果＞
　前記実施例１で、変異型EGFR、すなわち、del(E746-A750)、del(L747-T751)-L747S、del(L747-E749)-A750Pに対して効果的な発現抑制効果を示したEGFR－siRNAについて、それらが内在性の変異型EGFRに対しても特異的な発現抑制効果（ASP-RNAi効果）を示すか否かを検討した。本実験にはEGFR del(L747-E749)-A750Pを有するヒト肺癌由来のPC3細胞を例として使用した。EGFR－siRNAには、実施例１においてdel(L747-E749)-A750P変異に対して、特に発現抑制効果のあったsi747/49-3D19、及びsi747/49(A)-8D19を用いて内在性変異型EGFRのRNAiノックダウンを行った。
［方法］
（１）細胞培養
　ヒト非小細胞肺癌由来株化細胞であるPC3細胞を10%ウシ胎仔血清（FBS；Invitrogen社）含有のEMEM培養液（Wako社）を用いて、5% CO2下で37℃にて培養した。
（２）エレクトロポレーション法によるEGFR-siRNAの導入
　前記（１）で培養した細胞をトリプシン消化によって分散させた後、遠心（120G、５分間）によって回収し、約1×106個の細胞をEGFR-siRNA（終濃度5μM）を含む100μLのエレクトロポレーションバッファ（Amaxa Cell Line Nucleofector Solution V、Amaxa社）にて懸濁した。前記エレクトロポレーション用サンプルを３つ調製し、添付されたプロトコールに従ってエレクトロポレーション（プログラム：U-005, 遺伝子導入システムNucleofector, Amaxa社）によって核酸の導入（１つは核酸を入れない対照実験群）を行なった。導入した核酸は、si747/49-3D19、si747/49(A)-8D19と RNAiを誘導しないコントロールsiRNA（QIAGEN社）である。
　前記３群の細胞を前記（１）の培養液を用いて、６ウェル培養プレートにて培養を行い、２４時間後に回収した。
（３）cDNA合成
　前記（２）で回収した細胞をTRIzol reagent (Invitrogen社)を用いて、添付されたプロトコールに従って全RNAを回収した。その後、SuperScript III Reverse Transcriptase (Invitrogen社)及びOligo(dT)15 (Promega社)を用いて逆転写酵素反応によってcDNAを合成し、その後RNaseH (Invitrogen社)処理を行った。前記操作は全て添付されたプロトコールに従い行った。
（４）PCR解析
　前記（３）で得たcDNAをAmpliTaq Gold DNA Polymerase (アプライドバイオシステム社)とEGFR変異部位周辺配列を特異的に増幅するプライマーを用いてPCR解析を行った。PCRの温度・時間条件は、初期変性（95℃、１０分）後、変性(94℃、３０秒)、アニール(55℃、３０秒)、伸長反応(72℃、３０秒)の3段階を２６回繰返す条件とした。その後、PCR増幅産物を電気泳動法（7%ポリアクリルアミドゲル、100mA、１時間）にて解析した。使用したプライマー配列は、表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
［結果］
　si747/49-3D19での結果を図１４に、si747/49(A)-8D19での結果を図１５にそれぞれ示す。どちらのEGFR-siRNAも、野生型EGFR遺伝子の発現を抑制することなく、内在性変異型EGFR遺伝子の発現を特異的、かつ強力に抑制することが実証された。
＜実施例３：ヒト非小細胞肺癌由来株化細胞に対するEGFR-siRNAの細胞死及び細胞増殖能における影響評価＞
　実施例２で示した、EGFR-siRNA（si747/49-3D19、及びsi747/49(A)-8D19）を用いた内在性変異型EGFR（del(L747-E749)-A750P）の特異的かつ効果的な発現抑制が細胞増殖や細胞死に対して影響を与え得るか否かを、全細胞数、細胞毒性、細胞増殖・生存活性、細胞死（アポトーシス）に関して、それぞれ検討した。
（１）細胞培養
　前記「実施例２（１）」と同様にPC3細胞の培養を行った。
（２）エレクトロポレーション法によるEGFR-siRNAの導入
　前記「実施例２（２）」と同様に、エレクトロポレーションを行った。
　前記（１）の培養液を用いて、９６ウェル培養プレートにて細胞培養(細胞密度:約3×104個/ウェル)を行い、１日、４日後に各評価実験に供した。si747/49-3D19については、コントロールと共に、２日後、及び６日後についても、同様の評価実験に供した。
１．細胞増殖能（全細胞数）の測定
［方法］
　si747/49-3D19導入後のPC3細胞における経時的な細胞数の変化（細胞増殖能）を調べるため、細胞内LDH（Lactate Dehydrogena;乳酸脱水素酵素）量をCytoTox 96（R) Non-Radioactive Cytotoxicity Assay (Promega社)を用いて測定した。実験は、添付されたプロトコールに従って行った。簡潔には、前記アッセイキットに添付された細胞溶解バッファ（Lysis Solution (10x)）を全サンプル群の培養液に加え、４５分間37℃でインキュベートすることによって全細胞に含有される全てのLDHが放出される。このLDH量を測定することで全細胞数を間接的に算出した。吸光度の測定はBenchMark Plus (BIO-RAD社)を用いた。ネガティブコントロールには、siRNAを加えないサンプル（siRNAなし）とRNAiを誘導しないsiRNA（siControl; QIAGEN社）を添加したサンプルを用いた。
［結果］
　図１６に結果を示す。この図では、全細胞数とみなす１日目の「siRNAなし」のLDH量を100％としたときのLDH量の相対値（％）で示した。EGFR-siRNA（si747/49-3D19）は、「siRNAなし」に対しても、また「siControl」に対しても有意にPC3細胞のその全細胞数を減少させた。すなわち、この結果はsi747/49-3D19がPC3細胞の細胞増殖を抑制したことを意味する。また、同時に、構成的活性化により細胞増殖活性を促進するPC3内在性優性変異型EGFR（del(L747-E749)-A750P）遺伝子に対してsi747/49-3D19が特異的かつ効果的に、その発現を抑制したことを示している。
２．細胞毒性評価
［方法］
　si747/49-3D19導入後のPC3細胞における細胞毒性を評価するため、細胞毒性によって細胞外に放出され、培養液中に存在するLDH量をCytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay (Promega社)を用いて測定した。実験操作は、添付されたプロトコールに従って行い、吸光度の測定は、BenchMark Plus (BIO-RAD社)を用いた。また、使用したネガティブコントロールは、前記細胞増殖能の測定時に使用したものと同じ２つのコントロール（siRNAなし及びsiControl）を用いた。
［結果］
　図１７に結果を示す。この図では、１日目の「siRNAなし」の全細胞が含有するLDH量（前記細胞増殖能評価実験と同様に細胞溶解バッファを添加したサンプル）を100％としたときの相対値（％）で示している。si747/49-3D19は、「siRNAなし」や「siControl」と同等又はそれ以上に細胞毒性、又は内在性変異型EGFRの発現抑制による細胞死を誘導しないことが明らかとなった。
３．細胞増殖及び生存活性評価（１）
［方法］
　si747/49-3D19導入後のPC3細胞における細胞増殖及び生存活性を評価するために、CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (Promega社)を用いて、生細胞に含まれるNADH（nicotinamide adenine dinucleotide；ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）によるMTS還元作用を測定した。実験操作は、添付されたプロトコールに従って行い、吸光度の測定はBenchMark Plus (BIO-RAD社)を用いた。また、使用したネガティブコントロールは、前記細胞増殖能の測定時に使用したものと同じ２つのコントロール（siRNAなし及びsiControl）を用いた。
［結果］
　si747/49-3D19の結果を図１８、si747/49(A)-8D19の結果を図１９にそれぞれ示す。この図では、細胞増殖及び生存活性（細胞生存率）を「siRNAなし」の１日目のNADH活性を100％としたときの相対値として示している。si747/49-3D19、及びsi747/49(A)-8D19は、「siRNAなし」及び「siControl」のいずれに対しても有意にその増殖率を抑制し、又は生存率を低下させた。
４．細胞増殖及び生存活性評価(２)
［方法］
　si747/49-3D19導入後のPC3細胞における細胞増殖及び生存活性を評価するため、CellTiter-Glo Assay (Promega社)を用いて、細胞の相対的ATP量を測定した。実験操作は添付されたプロトコールに従って行い、発光量の測定はFusion Universal Microplate Analyzer（Perkin Elmer社）を用いた。また、使用したネガティブコントロールは、前記細胞増殖能の測定時に使用したものと同じ２つのコントロール（siRNAなし及びsiControl）を用いた。
［結果］
　図２０に結果を示す。細胞増殖及び生存活性（細胞生存率）は、「siRNAなし」の培養１日目の相対的ATP量を100％としたときの、１日目と４日目の相対値を示している。この図が示すように、si747/49-3D19は、培養４日目には「siRNAなし」及び「siControl」のいずれに対しても有意にその増殖率を抑制し、又は生存率を低下させた。
５．細胞死評価
［方法］
　si747/49-3D19導入後のPC3細胞おける細胞死（アポトーシス）評価のため、Caspase-Glo 3/7 Assay (Promega社)を用いてcaspase3/7の活性を測定した。実験操作は、添付されたプロトコールに従って行い、発光量の測定は、Fusion Universal Microplate Analyzer （Perkin Elmer社）を用いた。また、使用したネガティブコントロールは、前記細胞増殖能の測定時に使用したものと同じ２つのコントロール（siRNAなし及びsiControl）を用いた。
［結果］
　図２１に結果を示す。caspase3/7活性は、「siRNAなし」の培養１日目の活性を100％としたときの、１日目と４日目の相対値を示している。この図が示すように、si747/49-3D19は、培養４日目の「siRNAなし」及び「siControl」のいずれと比較してもcaspase3/7活性に有意な変化を示さなかった。これは、si747/49-3D19による変異型EGFR特異的発現抑制がアポトーシスを誘導しないことを示している。
＜実施例４：ヒト非小細胞肺癌由来株化細胞に対するEGFR-siRNAの点変異遺伝子特異的RNAi効果＞
（１）EGFR遺伝子に対するEGFR－siRNAのASP-RNAi効果の検討
［方法］
　実施例１で記載したように、非小細胞肺癌患者では、EGFR遺伝子内に疾患と関連する機能獲得型変異として、点突然変異も知られている（Paez G.J. et al., Science, 2004, 304；1497-1500）。例えば、図２２Aで示すような2369番目の塩基CがTに置換した「T790M変異」（前記遺伝子の点突然変異に伴い、790番目のトリプトファンがメチオニンにアミノ酸変化（T790M）する点突然変異が挙げられる。このような点突然変異による置換変異を有する変異遺伝子は、その転写産物が不連続接合点を有さないことから、本願実施例１の優性変異遺伝子発現抑制剤の対象とはならない。
　しかし、野生型のEGFR遺伝子発現に影響を及ぼさず、このような点突然変異による置換変異を有する変異型EGFR遺伝子の発現を特異的に抑制することができ、かつ実施形態１の優性変異遺伝子発現抑制剤とは異なる構成を有する他のsiRNA及び／又はそのsiRNAをコードするDNAを動作可能なように連結した発現ベクターがあれば、それを前記実施例１に記載のEGFR－siRNAと併用することで、より高い抑制効果が期待される。
　そこで、点突然変異型EGFR（上皮成長因子受容体）遺伝子の発現を特異的に抑制するsiRNA（EGFR-siRNA）を設計し、変異遺伝子（癌原因遺伝子）に対する発現抑制効果について検証した。表８にはT790M変異に対して設計したsiRNAのセンス鎖領域（ss）及びアンチセンス鎖領域（as）の塩基配列を示している。塩基配列中、太字で示した塩基が点突然変異部位に相当する。なお、各表で示す塩基配列は、センス鎖及びアンチセンス鎖の3’末端におけるUUからなる3’末端付加塩基を記載便宜上、除いている。また、表中の配列番号は、配列表の番号に対応する。各表のEGFR-siRNA名については、例えば、表８の「si790-9C/U18」は、T790M変異の点突然変異部位を起点にセンス鎖領域の5’末端塩基までの塩基数が９塩基であること、点突然変異によって野生型EGFR遺伝子上の塩基CがU（T）に置換されていること、そしてセンス鎖領域及びアンチセンス鎖領域の塩基数が共に１８塩基であることを示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
（２）レポーター遺伝子発現プラスミドの構築とレポーターアッセイ
　前記１で調製したEGFR-siRNAのRNAi効果の評価の選定のために、siRNAの標的となる優性変異遺伝子と非標的の野生型遺伝子のレポーター遺伝子発現プラスミドの構築、細胞培養、トランスフェクション及びレポーターアッセイを行なった。基本的な操作手順は、実施例１に記載の方法に準じた。
［結果］
　結果を図２２Bに示す。この図が示すように、si790-9C/U18は、siControlと比較して野生型EGFR遺伝子の発現にも比較的強い抑制効果があることからあまり好ましいsiRNAではなかったが、si790-10C/U18とsi790-11C/U18は、野生型EGFR遺伝子に対する発現抑制効果がほとんどなく、一方、変異型EGFR遺伝子に対しては効果的な抑制作用を有することが明らかとなった。
　したがって、si790-10C/U18とsi790-11C/U18は、好適なEGFR-siRNAであることが示された。
＜実施例５：BCR-ABLキメラ遺伝子に対するBCR-ABL-siRNAの転座変異遺伝子特異的RNAi効果＞
　フィラデルフィア染色体における転座変異によって生じたBCR-ABLキメラ遺伝子を標的とする本実施形態１の構成を有するsiRNA（BCR-ABL-siRNA）を設計し、白血病原因遺伝子であるBCR-ABLキメラ遺伝子に対する発現抑制効果について検証した。
［方法］
　前述のように、BCR-ABLキメラ遺伝子は、フィラデルフィア染色体を有する患者で見出されるCMLやALLの原因遺伝子とみなされており、本発明のBCR-ABL-siRNAが機能亢進型のBCR-ABL遺伝子の発現のみを特異的に抑制することができれば、フィラデルフィア染色体を有する患者でCMLやALLに対する効果的な予防剤又は治療剤となり得る。
（１）BCR-ABLキメラ遺伝子の種類 
　Ph転座におけるBCR遺伝子の切断点は、Major-BCR(下流:M-BCR)とminor-BCR(上流:m-BCR)の二箇所に集中していることが知られているが、慢性好中球性白血病／本態性血小板血症では、さらに下流のμ-BCR(p230)の関与が報告されている。それぞれp210BCR/ABL（M-BCR切断点）、p190BCR/ABL（ｍ－BCR切断点）、p230BCR/ABL（μ-BCR切断点）の蛋白が生じ、このうちp210BCR/ABLはCMLのほぼ全例及びPh陽性ALLに、p190BCR/ABLはPh陽性ALLの残り半数の患者に認められる。
　そこで、該疾患において最も高頻度にみられるM-BCRを切断点とするBCR－ABLキメラ遺伝子に対して、実施形態１に記載のRNAi分子の設計方法に準じてBCR-ABL-siRNAを設計及び調製し、これらの転座変異遺伝子の発現を特異的に抑制することができるか否かについて検証した。
（２）BCR-ABL-siRNAの設計と調製
　上記M-BCRを切断点とするBCR－ABLキメラ遺伝子については、その変異遺伝子産物（変異mRNA）上で、野生型ABL遺伝子と野生型BCL遺伝子のそれぞれに対して図１２－１A、及び１３－１Aにおいて矢頭で示した位置に相当する箇所が本明細書に記載の不連続接合点に相当する。この不連続接合点に隣接する5’側及び3’側の塩基をそれぞれ第１及び第２基準塩基として、実施例１と同様の方法によりBCR-ABL-siRNAの設計し、調製した。
　本実施例で設計し、使用したBCR－ABL-siRNAの具体的な塩基配列を表９に示す。表９にM-BCRを切断点とするBCR－ABLキメラ遺伝子に対して設計したsiRNAのセンス鎖領域（ss）及びアンチセンス鎖領域（as）の塩基配列を示している。ただし、各表で示す塩基配列は、記載便宜上、センス鎖領域及びアンチセンス鎖領域の3’末端におけるUUからなる3’末端付加塩基を除いている。また、表中の配列番号は、配列表の番号に対応する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　各siRNAの合成は、シグマアルドリッチ社に委託した。合成されたsiRNAは、センス鎖領域及びアンチセンス鎖領域のアニーリング処理が施されており、それを直接実験に使用した。
（３）レポーター遺伝子発現プラスミドの構築
　レポーター遺伝子発現プラスミドの構築、変異部位を含む合成オリゴDNAの設計、レポーター遺伝子発現プラスミドへの挿入、選定方法については、実施例１の「（３）レポーター遺伝子発現プラスミドの構築」に記載の方法に準じた。使用した合成オリゴDNAの具体的な塩基配列を表１０に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
（４）細胞培養
　実施例１の「（４）細胞培養」に記載の方法に準じた。
（５）トランスフェクション及びレポーターアッセイ
　実施例１の「（５）トランスフェクション及びレポーターアッセイ」に記載の方法に準じた。
［結果］
　BCR-ABLキメラ遺伝子に対する各BCR-ABL-siRNAの結果を図１２－１B及び図１３－１Bに示す。各BCR-ABL-siRNAの該遺伝子に対する特異的発現抑制効果を評価するためには、BCR-ABLキメラ遺伝子と二つの野生型遺伝子（ABL遺伝子とBCR遺伝子）に対して評価しなければならない。そのため、各BCR-ABL-siRNAの標的遺伝子特異的発現抑制効果をBCR-ABLキメラ遺伝子と野生型ABL遺伝子（図１２－１B）、そしてBCR-ABLキメラ遺伝子と野生型BCR遺伝子（図１３－１B）の組み合わせで評価した。また前記と同様に、各図において、非標的の野生型ABL又はBCR遺伝子と、標的のBCR-ABLキメラ遺伝子のルシフェラーゼ活性を、それぞれのsiControlのルシフェラーゼ活性を1.0としたときの相対値として算出した。各サンプルのルシフェラーゼ活性は、RNAiによる発現抑制を受けない外来性コントロールであるβ-ガラクトシダーゼの発現量で補正している。
　第２基準塩基を起点に下流側に向かってsiRNAセンス鎖領域の3’末端塩基を一つずつずらしながら導入して、全体のRNAiセンス鎖領域の塩基長を１９塩基に保持した場合、図１２－１B及び図１３－１Bで示すように、４～１３番目の塩基をRNAiセンス鎖領域の3’末端塩基に設定したとき（-4D19～－13D19で示される）に、コントロール（siControl）の発現と比較して、BCR-ABLキメラ遺伝子の発現は強く抑制するが、野生型ABL又はBCR遺伝子の発現はあまり抑制しないか、コントロールとほとんど変わらないことが明らかとなった。すなわち、これは、ASP-RNAi効果の高い有用なsiRNAであることを示している。
　したがって、前述の「実施例１」と同様に、第２基準塩基を起点としてその下流の４～１５番目の範囲の塩基をRNAiセンス鎖領域の3’末端塩基に設定することが、ASP-RNAi効果の高い、有用なBCR-ABL-siRNAを設計する上で好適であることが示された。
＜実施例６：ヒト非小細胞肺癌由来株化細胞に対するEGFR-siRNA及び抗癌剤ゲフィチニブの細胞生存活性への影響＞
　前記実施例１でEGFRのdel(L747-E749)-A750P変異又はdel(E746-A750)変異に対してそれぞれ特異的な発現抑制を示したEGFR－siRNA、及び変異型EGFRを発現する非小細胞肺癌に対して有効とされる抗癌剤ゲフィチニブを用いて、それぞれの細胞増殖及び細胞生存活性に対する影響について検証した。
［方法］
（１）細胞培養
　解析には、EGFRのdel(L747-E749)-A750P変異及びdel(E746-A750)変異を有するヒト非小細胞肺癌由来株化細胞であるPC3細胞及びPC9細胞、及び対照用に野生型EGFRを有するヒトHeLa細胞を用いた。PC3細胞の培養は、前記「実施例２：（１）」と、またHeLa細胞の培養は、前記「実施例１：（４）」と同様に行った。PC9細胞は、10%ウシ胎仔血清（FBS；Invitrogen社）含有のRPMI-1640培養液（Wako社）を用いて、5% CO2下で37℃にて培養した。
（２）ゲフィチニブ処理
　培養したPC3細胞、PC9細胞及びHeLa細胞を、トリプシン消化によって分散させた後、遠心（120G、５分間）によって回収し、９６ウェル培養プレートにて細胞培養(細胞密度:約1×105個/cm2)を行った。２４時間後、終濃度0、10-3、10-2、10-1、100及び101μMのゲフィチニブ（商品名：イレッサ；アストラゼネカ社）に曝露し、３日後に細胞生存活性を測定した。
（３）エレクトロポレーション法によるPC3細胞へのEGFR-siRNAの導入
　前記「実施例２：（２）」と同様の方法で、EGFR-siRNAの細胞導入を行った。具体的には、前記（１）の培養液で培養したPC3細胞をトリプシン消化によって分散させた後、遠心（120G、５分間）によって回収し、約1×106個の細胞を、終濃度100、50、25、10、5、1及び0nMのEGFR-siRNA(si747/49-3D19)又はRNAiを誘導しないsiRNA（siControl; QIAGEN社）を含む100μLのエレクトロポレーションバッファ（Amaxa Cell Line Nucleofector Solution V、Amaxa社）にて懸濁した。添付されたプロトコールに従ってエレクトロポレーション（プログラム：U-005, 遺伝子導入システムNucleofector, Amaxa社）を行い、前記siRNAを細胞に導入した。「実施例２：（１）」に記載の培地で培養し、３日後に細胞生存活性を測定した。
（４）リポフェクション法によるPC9細胞へのEGFR-siRNAの導入
　前記（１）９６ウェル培養プレートにて細胞培養(細胞密度:約1×105個/cm2)を行った。終濃度100、50、25、10、5、1及び0nMのEGFR-siRNA (si746/50-4D19)及びRNAiを誘導しないsiRNA（siControl; QIAGEN社）を、リポフェクタミン2000（Invitrogen社）を用いてPC9細胞に導入した。トランスフェクション法は、添付されたプロトコールに従った。培養３日後に細胞生存活性を測定した。
（５）細胞増殖及び生存活性の評価
　前記「実施例３；３．細胞増殖及び生存活性評価（１）」と同様の方法で評価した。
［結果］
（１）細胞増殖及び生存活性に対するゲフィチニブの影響
　ゲフィチニブによる各細胞の細胞増殖及び生存活性の結果を図２３Ａ～Ｃに示す。図２３Ａは、del(L747-E749)-A750P変異を有するPC3細胞の、図２３Ｂは、del(E746-A750)変異を有するPC9細胞の、図２３ＣはHeLa細胞の結果である。各図は、それぞれ無処置の細胞における細胞生存活性を100%としたときの相対値を示している。
　PC9細胞が10-2μM以上のゲフィチニブ濃度で顕著な細胞増殖抑制及び生存活性低下を示したのに対して、PC3細胞とHeLa細胞は、いずれも1μM以上で濃度依存的な細胞増殖抑制及び生存活性低下を示した。この結果から、PC9細胞が少量のゲフィチニブ投与でもその増殖を抑制できるゲフィチニブ感受性の細胞であるのに対して、PC3細胞は、HeLa細胞も影響を受ける、すなわち野生型EGFRを有する細胞でも抑制されるような高濃度のゲフィチニブを投与しなければその細胞増殖及び生存活性の抑制効果が見られないゲフィチニブ耐性細胞であることが示唆された。
　以上より、ゲフィチニブは、del(E746-A750)変異のようなゲフィチニブ感受性のEGFR変異を有する非小細胞肺癌に対しては有効な抗癌剤となり得るが、del(L747-E749)-A750P変異を有し、かつゲフィチニブ耐性を獲得した非小細胞肺癌に対しては、投与個体に有害な副作用を与え得る高濃度のゲフィチニブを投与しなければ効果が得らないことが示された。
　実際、ゲフィチニブの有効性とEGFRの遺伝子変異には密接な関係が存在することが報告されており（Paez G.J. et al. Science, 2004, 304；1497－1500、Lynch T.J. et al. N　Engl J Med, 2004,350； 2129－2139）、ゲフィチニブ感受性EGFR変異を有する患者は、ゲフィチニブの投与によって劇的な治療効果が得られるが、ゲフィチニブ耐性EGFR変異を有する患者では、ゲフィチニブの投与が間質性肺炎や急性肺障害等の副作用をもたらし得ることが知られており、本実施例の結果も、それを支持している。
（２）細胞増殖及び生存活性に対するEGFR-siRNAの影響
　EGFR-siRNAによる各細胞の細胞増殖及び生存活性結果を図２４Ａ～Ｃに示す。
図２４Ａは、del(L747-E749)-A750P変異を有するPC3細胞に対するEGFR-siRNA（si747/49-3D19）の、図２４Ｂは、del(E746-A750)変異を有するPC9細胞EGFR-siRNA（si746/50-4D19）の、図２４ＣはHeLa細胞に対するEGFR-siRNA（si747/49-3D19）の結果である。各図は、それぞれ無処置の細胞における細胞生存活性を100%としたときの相対値を示している。
　この図で示すように、EGFRに変異を有するPC3細胞及びPC9細胞の両者に対して、EGFR-siRNA（si746/50-4D19及びsi747/49-3D19）の顕著な細胞増殖抑制及び生存活性の低下が観察された。一方、いずれものEGFR-siRNAも野生型EGFRを有するHeLa細胞に対しては細胞増殖及び生存活性の抑制効果を示さなかった。
　以上の結果から、本発明のEGFR-siRNAは、野生型EGFRの発現にはほとんど影響を及ぼさず（すなわち、副作用の影響がないか、又は限りなく小さく）、かつゲフィチニブ耐性、感受性のどちらのEGFR変異であっても、ゲフィチニブよりも低濃度で極めて特異性の高い細胞増殖抑制及び生存活性低下を誘導できることが立証された。
＜実施例７：ヒト非小細胞肺癌由来株化細胞の異種異所性移植によるモデルマウスの作製とそれに対するEGFR-siRNAの効果＞
　細胞レベルで検証したEGFR-siRNAの効果を個体レベルで検証した。
［方法］
　ヌードマウスの皮下にPC3細胞を移植し、マウス皮下腫瘍モデルを作出し、そのモデルマウスを用いてEGFR-siRNA投与による腫瘍成長阻害効果を検証した。
（１）ヒト非小細胞肺癌由来PC3細胞の異種異所性移植によるモデルマウスの作出
　（ｉ）細胞培養
　前記「実施例２：（１）」と同様の方法でPC3細胞を培養した。
　（ｉｉ）PC3細胞の移植
　培養したPC3細胞を、トリプシン消化によって分散させた後、遠心（120G、５分間）によって回収し、血清及び抗生物質不含の培養液（RPMI-1640、Wako社）で再懸濁し、細胞数1×107cells/mLに調製した。この細胞懸濁液と、BDマトリゲル基底膜マトリックス（ベクトン・ディッキンソン社）を等量混ぜ合わせ、細胞数5×106cells/mLに調製した。これを、免疫不全モデルのヌードマウス（５週齢、BALB/cAJcl-nu/nu、日本クレア株式会社）の右側腹部に100μL(0.5×106cells)で皮下投与した。
（２）マウスの皮下腫瘍へのEGFR-siRNAの投与
　（ｉ）EGFR-siRNAの調製と投与
　アテロコラーゲンを主成分とする核酸デリバリー媒体であるAteloGene（登録商標） Local Use（株式会社　高研）と、実施例１～３でPC3細胞に対して効果的な細胞増殖抑制効果を示したsi747/49-3D19、又はsi747/49(A)-8D19との複合体を調製した。調製法は、添付されたプロトコールに従い、EGFR-siRNA（si747/49-3D19、又はsi747/49(A)-8D19）の終濃度は、0.1mg/mLとした。対照実験としてRNAiを誘導しないsiRNA（siControl; QIAGEN社）も同様に調製し、siRNAを含まないアテロコラーゲン液も調製した。
　（ｉｉ）皮下腫瘍に対するsiRNAの投与
　PC3細胞を移植して１週間後（６週齢）に腫瘍径より腫瘍体積を算出し、約50mm3に達した腫瘍に対して、前記で調製した３つのサンプル、すなわちsiRNA不含のアテロコラーゲン溶液、siControl及びEGFR-siRNAの20μg/200μL溶液を、それぞれ1.0mg/kg体重で腫瘍に直接単回投与した。腫瘍体積は、以下の式を用いて計算した。
　　　体積＝（短径）2×（長径）×0.5
　（ｉｉｉ）siRNA投与後の経過観察
　siRNA等の投与３週目（９週齢）（図２５A、si747/49-3D19；図２８A、si747/49(A)-8D19）に、前記計算式により腫瘍体積を測定し、さらに腫瘍を取り出して（図２５B、si747/49-3D19；図２８B、si747/49(A)-8D19）、湿重量を計測した。
［結果］
　EGFR-siRNAの投与による腫瘍体積の時間経過を図２６（si747/49-3D19投与）、図２９（si747/49(A)-8D19投与）に、摘出した腫瘍の湿重量を図２７（si747/49-3D19投与）、図３０（si747/49(A)-8D19投与）に、それぞれ示す。EGFR-siRNA（si747/49-3D19、又はsi747/49(A)-8D19）を投与した個体群は、アテロコラーゲン溶液のみ及びsiControlを投与した個体群と比較して、皮下腫瘍の肥大が有意に抑制されることが示された。さらに、腫瘍の湿重量もそれらと比較して有意に低下していた。
　以上の結果より、本発明のEGFR-siRNAは、細胞レベルのみならず、個体レベルにおいても癌細胞増殖の抑制に有効であることが確認された。本発明のEGFR-siRNAは、ゲフィチニブの投与では副作用が大きく、これまで使用できなかったゲフィチニブ耐性のEGFR変異に対しても、極めて有効に、かつ安全に癌細胞の増殖及び生存活性を抑制することができることが立証された。
　非小細胞肺癌患者の癌細胞が変異EGFR遺伝子を有するか否かは、LNA-PNA-PCR clamp法（特許4216266号）等の高感度検出方法によって検査することできる。患者のEGFR遺伝子がdel(E746-A750)変異のようなゲフィチニブ感受性変異を有していた場合には、ゲフィチニブが極めて有効な治療剤となり得る。しかし、del(L747-E749)-A750Pのような変異を有していてもゲフィチニブ耐性を獲得した癌細胞の場合には、有効かつ副作用のない薬剤は、現在まで知られていない。本発明のEGFR-siRNAは、その様な有効な治療方法が確立されていなかったゲフィチニブ耐性のEGFR遺伝子変異を有する非小細胞肺癌患者に対しても、非常に効果的な抗癌剤となり得ることが示された。
＜実施例８：内在性野生型EGFR遺伝子発現抑制による副作用の検証＞
　上述の実施例で立証したように、本発明のEGFR-siRNAは変異型のEGFR遺伝子のみを特異的に発現抑制するのに対して、従来のsiRNAは野生型及び変異型のEGFR遺伝子を区別せず両者を強く発現抑制する。そこで、本発明のEGFR-siRNAと従来のsiRNAをマウス個体に投与した場合の副作用の有無について検証した。
［方法］
　ICRマウス（雄、10週齢）の腹腔内に各種siRNAを投与した。実験群は、siRNAを投与しないアテロコラーゲン溶液のみの群（siRNAなし）と、RNAiを誘導しないsiRNA（siControl; QIAGEN社）、変異型EGFR遺伝子を特異的に発現抑制するsi747/49-3D19、及びマウス生体内で発現している内在性野生型EGFR遺伝子を発現抑制するsiEgfrをぞれぞれ投与した、計4群である。これらは、前記実施例７と同様の方法で調製し、マウス腹腔内に投与した。なお、本実施例で設計し、使用したsiEgfrの具体的な塩基配列を表１１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
投与３日後、各マウスより採血を行い、採取した全血を遠心分離（1200×ｇ、10分）して血漿を得た。続いて、血漿中の全ビリルビン、間接ビリルビン、直接ビリルビンの量をQuantiChromTM Bilirubin Assay Kit (BioAssay Systems社)を用いて、またアルカリホスファターゼの量をラボアッセイTM ALP（Wako社）を用いて、測定した。実験操作は、各キットに添付されたプロトコールに従った。
［結果］
　図３１に結果を示す。血漿中の全ビリルビン（A）、直接ビリルビン（B）、間接ビリルビン（C）、及びアルカリホスファターゼ（D）の量に関して、siRNAなし群及びsiControl投与群と比較すると、内在性野生型EGFR遺伝子を発現抑制するsiEgfr投与群では、有意な上昇が観察された。一方、本発明のEGFR-siRNA(si747/49-3D19)投与群では、有意な変化は観察されなかった。この血中パラメーターの有意な上昇は、siEgfrの投与によって内在性野生型EGFRの発現が抑制されたことに起因し、変化した血中パラメーターのデータから肝胆道系の障害が惹起されたことが示唆された。また、内在性野生型EGFR遺伝子が肝細胞の再生に必要であることから（Natarajan et al., 2007, Proc Natl Acad Sci U S A., Vol. 104: 17081-17086）、まとめると、内在性野生型EGFR遺伝子の発現抑制は重篤な副作用をひき起こす危険性があることが示唆された。それに対して、本発明のEGFR-siRNAの投与は、血中パラメーターに全く影響せず、内在性野生型EGFR遺伝子の発現にほとんど影響を及ぼさないことが立証された。この結果は、本発明のEGFR-siRNAが、従来のEGFR-siRNAとは異なり、上記のような肝胆道系の障害等の副作用を生じる危険性がないか、又は極めて低いことを示唆している。これにより、本発明の優性変異遺伝子の発現抑制剤のRNA干渉技術の有用性が立証された。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (23)

  1. 　ASPスコア値が０．４以上であるRNAi分子を有効成分として含む、優性変異遺伝子の発現抑制剤であって、
    　前記ASPスコアは、以下の式から算出され、
    　　ASPスコア＝[（対照RNAi分子で処理した正常型遺伝子の標準化した発現量に対する前記RNAi分子で処理した正常型遺伝子の標準化した発現量の相対比）－（対照RNAi分子で処理した変異遺伝子の標準化した発現量に対する前記RNAi分子で処理した変異遺伝子の標準化した発現量の相対比）]×（１－対照RNAi分子で処理した変異遺伝子の標準化した発現量に対する前記RNAi分子で処理した変異遺伝子の標準化した発現量の相対比）
    　　（式中、対照RNAi分子は、前記正常型遺伝子及び変異遺伝子の発現に影響を及ぼさないRNAi分子である）
    　前記RNAi分子が
    　標的である優性変異遺伝子の転写産物上に生じる少なくとも一つの不連続接合点、及び該転写産物の連続する１６～３０塩基の配列に一致する塩基配列を含むRNAiセンス鎖領域、並びにそれに相補的な塩基配列を含むRNAiアンチセンス鎖領域を含み、かつ
    　前記RNAiセンス鎖領域上のいずれか一の不連続接合点に隣接する3’側の塩基から下流側に向かって４～１５番目のいずれか一の塩基が該RNAiセンス鎖領域の3’末端塩基を構成する、
    前記遺伝子発現抑制剤。
  2. 　ASPスコア値が０．４以上であるRNAi分子をコードするDNAを動作可能なように連結した発現ベクターを有効成分として含む、優性変異遺伝子の発現抑制剤であって、
    　前記ASPスコアは、
    以下の式から算出され、
    　　ASPスコア＝[（対照RNAi分子で処理した正常型遺伝子の標準化した発現量に対する前記RNAi分子で処理した正常型遺伝子の標準化した発現量の相対比）－（対照RNAi分子で処理した変異遺伝子の標準化した発現量に対する前記RNAi分子で処理した変異遺伝子の標準化した発現量の相対比）]×（１－対照RNAi分子で処理した変異遺伝子の標準化した発現量に対する前記RNAi分子で処理した変異遺伝子の標準化した発現量の相対比）
    　　（式中、対照RNAi分子は、前記正常型遺伝子及び変異遺伝子の発現に影響を及ぼさないRNAi分子である）
    　前記RNAi分子が
    　標的である優性変異遺伝子の転写産物上に生じる少なくとも一つの不連続接合点、及び該転写産物の連続する１６～３０塩基の配列に一致する塩基配列を含むRNAiセンス鎖領域、並びにそれに相補的な塩基配列を含むRNAiアンチセンス鎖領域を含み、かつ
    　前記RNAiセンス鎖領域上のいずれか一の不連続接合点に隣接する3’側の塩基から下流側に向かって４～１５番目のいずれか一の塩基が該RNAiセンス鎖領域の3’末端塩基を構成する、
    前記遺伝子発現抑制剤。
  3. 　RNAiセンス鎖領域及びRNAiアンチセンス鎖領域の3’末端にさらにTT又はUUを付加する、請求項１又は２に記載の抑制剤。
  4. 　RNAi分子がsiRNAである、請求項１～３のいずれか一項に記載の抑制剤。
  5. 　RNAi分子がshRNAである、請求項１～３のいずれか一項に記載の抑制剤。
  6. 　優性変異遺伝子における変異が塩基の欠失、塩基の挿入、スプライス部位を破壊し得る塩基の置換、遺伝子の重複、遺伝子の転座、及び染色体の逆位からなる一群から選択される、請求項１～５のいずれか一項に記載の抑制剤。
  7. 　優性変異遺伝子が機能獲得型である、請求項１～６のいずれか一項に記載の抑制剤。
  8. 　優性変異遺伝子が疾患の発症に関与する、請求項１～７のいずれか一項に記載の抑制剤。
  9. 　疾患が悪性新生物である、請求項８に記載の抑制剤。
  10. 　悪性新生物が非小細胞肺癌で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子が変異型EGFR遺伝子であるか、悪性新生物が大腸癌で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子が変異型CTNNB1遺伝子であるか、悪性新生物が胃癌で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子が変異型CDH1遺伝子であるか、悪性新生物が乳癌で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子が変異型BRCA1遺伝子若しくは変異型BRCA2遺伝子であるか、悪性新生物が多腺性自己免疫性内分泌不全症I型で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子が変異型AIRE遺伝子であるか、悪性新生物が自己免疫性リンパ増殖症候群で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子が変異型TNFRSF6/APT1/FAS遺伝子であるか、悪性新生物が慢性骨髄性白血病又は急性リンパ性白血病で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がBCR-ABLキメラ遺伝子であるか、悪性新生物がバーキットリンパ腫で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がc-myc-IgH-キメラ遺伝子であるか、悪性新生物が未分化型大細胞リンパ腫で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がNPM-ALK-キメラ遺伝子であるか、悪性新生物が肺癌で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がEML4-ALK-キメラ遺伝子であるか、悪性新生物が隆起性皮膚線維肉腫で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がPDGFB-COL1A1キメラ遺伝子であるか、悪性新生物が先天性線維肉腫で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がETV6-NTRK3キメラ遺伝子であるか、悪性新生物が低悪性線維粘液肉腫で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がFUS-CREB3L2キメラ遺伝子であるか、悪性新生物が骨外性粘液型軟骨肉腫で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がEWS-CHNキメラ遺伝子であるか、悪性新生物がユーイング肉腫若しくは線維形成性小細胞腫瘍で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がEWSR1遺伝子を転座パートナーとするキメラ遺伝子であるか、悪性新生物が胞巣型横紋筋肉腫で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がSYT遺伝子若しくはSSX遺伝子を転座パートナーとするキメラ遺伝子であるか、悪性新生物が炎症性筋線維芽細胞性腫瘍で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がALK遺伝子を転座パートナーとするキメラ遺伝子であるか、悪性新生物が脂肪肉腫で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がCHOP遺伝子を転座パートナーとするキメラ遺伝子であるか、又は悪性新生物が軟部明細胞肉腫若しくは悪性線維性組織球腫で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がATF1遺伝子を転座パートナーとするキメラ遺伝子である、請求項９に記載の抑制剤。
  11. 　悪性新生物が非小細胞肺癌で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子が変異型EGFR遺伝子である、請求項１０に記載の抑制剤。
  12. 　RNAi分子のセンス鎖領域が、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５３、５５、５９、６１、６３、６５、６７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３又は１４５で示されるヌクレオチドからなる、請求項１１に記載の抑制剤。
  13. 　悪性新生物が慢性骨髄性白血病又は急性リンパ性白血病で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がBCR-ABLキメラ遺伝子である、請求項１０に記載の抑制剤。
  14. 　RNAi分子のセンス鎖領域が、配列番号９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１又は１１３で示されるヌクレオチドからなる、請求項１３に記載の抑制剤。
  15. 　疾患がヒト常染色体優性変異疾患である、請求項８に記載の抑制剤。
  16. 　ヒト常染色体優性変異疾患が先天性夜盲症で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がRHO遺伝子であるか、ヒト常染色体優性変異疾患が難聴遺伝子領域DFNA2で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がKCNQ4遺伝子若しくはGJB遺伝子であるか、ヒト常染色体優性変異疾患がワールデンブルグ症候群で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がMITF遺伝子であるか、ヒト常染色体優性変異疾患が非症候性難聴で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がDIAPH1/DFNA1遺伝子若しくはPOU4F3遺伝子であるか、ヒト常染色体優性変異疾患が肥大型心筋症で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がTNNT2遺伝子であるか、ヒト常染色体優性変異疾患が家族性肥大型心筋症で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がMYBPC3遺伝子であるか、ヒト常染色体優性変異疾患が心尖部肥大型心筋症で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がTNNI3遺伝子であるか、ヒト常染色体優性変異疾患がシャルコー・マリー・トゥース病1A型で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がPMP22遺伝子であるか、ヒト常染色体優性変異疾患がシャルコー・マリー・トゥース病1B型で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がMPZ遺伝子であるか、ヒト常染色体優性変異疾患がQT延長症候群で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がKCNQ1遺伝子若しくはKCNH2遺伝子若しくはSCN5A遺伝子若しくはANK2遺伝子若しくはKCNE1遺伝子若しくはKCNE2遺伝子若しくはKCNJ2遺伝子若しくはCAV3遺伝子若しくはSCN48遺伝子若しくはAKAP9遺伝子若しくはANTA1遺伝子であるか、ヒト常染色体優性変異疾患がQT短縮症候群で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がKCNH2遺伝子若しくはKCNJ2遺伝子であるか、ヒト常染色体優性変異疾患がブルガタ症候群で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がSCN5A遺伝子若しくはGPD1L遺伝子若しくはCACNA1C遺伝子若しくはCACNB2B遺伝子若しくはSCN1B遺伝子であるか、ヒト常染色体優性変異疾患がカテコラミン誘発性多形性心室頻拍で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がRYR2遺伝子であるか、ヒト常染色体優性変異疾患が心伝導障害で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がSCN5A遺伝子若しくはSCN1B遺伝子であるか、ヒト常染色体優性変異疾患が筋萎縮性側索硬化症で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がTDP43遺伝子であるか、ヒト常染色体優性変異疾患がヌーナン症候群で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がPTPN11遺伝子であるか、又はヒト常染色体優性変異疾患が低カルシウム血症で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がCaR遺伝子である、請求項１５に記載の抑制剤。
  17. 　疾患が筋硬直性ジストロフィーで、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がDMPK遺伝子であるか、疾患が脊髄性筋萎縮症で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がSMN1遺伝子であるか、疾患が先天性筋無力症候群で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がCHRNE遺伝子であるか、疾患が前頭側頭葉型痴呆症で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がMAPT遺伝子であるか、又は疾患が成長ホルモン単独欠損症II型で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がGH1遺伝子である、請求項８に記載の抑制剤。
  18. 　請求項１～１７のいずれか一項に記載の抑制剤を有効成分として少なくとも一つ含有する医薬組成物。
  19. 　センス鎖領域が、配列番号８３又は８５で示されるヌクレオチドからなるRNAi分子、及び／又はそのヌクレオチドをコードするDNAを動作可能なように連結した発現ベクター、並びに／あるいはセンス鎖領域が、配列番号８９で示されるヌクレオチドからなるRNAi分子、及び／又はそのRNAi分子をコードするDNAを動作可能なように連結した発現ベクターを有効成分としてさらに含有する、請求項１１又は１２に従属する請求項１８に記載の医薬組成物。
  20. 　センス鎖領域が、配列番号８９で示されるヌクレオチドからなるRNAi分子、及び／又はそのRNAi分子をコードするDNAを動作可能なように連結した発現ベクターを含む、点突然変異型EGFR遺伝子発現抑制剤。
  21. 　転写産物上に不連続接合点を有する優性変異遺伝子の発現を選択的に抑制するRNAi分子の設計方法であって、
    　（ａ）該転写産物上の不連続接合点に隣接する5’側及び3’側の塩基をそれぞれ第１及び第２基準塩基として設定する工程、
    　（ｂ）前記転写産物において、前記第２基準塩基に対応する塩基から下流側に向かって４～１５番目の塩基がRNAiセンス鎖の3’末端塩基に対応するように設定する工程、
    　（ｃ）前記優性変異遺伝子において、その転写産物の第１及び第２基準塩基を含む連続する１６～３０塩基を含む塩基配列をRNAiセンス鎖領域として設定する工程、
    　（ｄ）設定されたRNAiセンス鎖領域の塩基配列に相補的な塩基配列を含む塩基配列をRNAiアンチセンス鎖領域として設定する工程
    を含む、前記設計方法。
  22. 　（ｅ）ASPスコア値が０．４以上あるRNAi分子を選別する工程をさらに含む、請求項２１に記載の設計方法であって、
    　ASPスコアは、以下の式から算出される、前記設計方法。
    　　ASPスコア＝[（対照RNAi分子で処理した正常型遺伝子の標準化した発現量に対する前記RNAi分子で処理した正常型遺伝子の標準化した発現量の相対比）－（対照RNAi分子で処理した変異遺伝子の標準化した発現量に対する前記RNAi分子で処理した変異遺伝子の標準化した発現量の相対比）]×（１－対照RNAi分子で処理した変異遺伝子の標準化した発現量に対する前記RNAi分子で処理した変異遺伝子の標準化した発現量の相対比）
    　　（式中、対照RNAi分子は、前記正常型遺伝子及び変異遺伝子の発現に影響を及ぼさないRNAi分子である）
  23. 　RNAiセンス鎖領域及びRNAiアンチセンス鎖領域の3’末端にさらにTT又はUUを付加する、請求項２１又は２２に記載の設計方法。
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